リステリア・モノサイトゲネス検出のためのプライマーセットおよび方法
【課題】環境や食品検査などにおいてリステリア・モノサイトゲネスを迅速にかつ特異的に検出する方法を提供する。
【解決手段】リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子及びｉａｐ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な複数の特定の配列からなる塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる複数種のプライマーのセット、あるいは、(iｉ) 該(i)のプライマーセットの組み合わせ、を含むことを特徴とするLAMPプライマーセット、ならびに、このプライマーセットを用いてリステリア・モノサイトゲネスを検出するための方法からなる。
【解決手段】リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子及びｉａｐ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な複数の特定の配列からなる塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる複数種のプライマーのセット、あるいは、(iｉ) 該(i)のプライマーセットの組み合わせ、を含むことを特徴とするLAMPプライマーセット、ならびに、このプライマーセットを用いてリステリア・モノサイトゲネスを検出するための方法からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア・モノサイトゲネスを迅速かつ正確に検出するためのプライマーセットおよび方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)法によりリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の増幅を検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出のための方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００３】
リステリア属菌のなかでもリステリア・モノサイトゲネスは病原性の面で非常に重要な菌種であると考えられている(非特許文献１)。この細菌は、哺乳動物、鳥類をはじめ食肉、乳および乳製品、試料さらに土壌や水などの各種環境に広く分布している。感染源としては、環境中に広く分布している(非特許文献２)。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネスは、グラム陽性の好気性短桿菌で芽胞は形成しない。従来、リステリア・モノサイトゲネスを生化学性状で判定する場合、グラム染色や運動性、カタラーゼ試験、オキシダーゼ試験、VP反応、糖分解性試験、溶血性などを行い判定していた(非特許文献１)。
【０００５】
リステリア・モノサイトゲネスの検出には増菌や分離培養などを経て各種生化学試験などを行うが、これらの手法は結果を得るまでに時間を要することから、遺伝子を用いた試験法が注目されている。例えば、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子領域を増幅し、その有無を確認するPCR (Polymerase Chain Reaction) 法が広く用いられている(非特許文献３)。しかし、PCR法を用いた細菌の検出法は反応を行うために特別な機器を必要とし、最終判定方法のひとつであるアガロースゲル電気泳動法などに多大な時間と労力を要する。
【０００６】
近年、新しい遺伝子増幅法の一つとしてLAMP反応が栄研化学社（栃木）によって開発された。LAMP法は等温核酸増幅法であり、高い特異性および増幅効率を有し、反応から検出まで1時間程度で行うことが出来る(特許文献１；非特許文献４)。
【０００７】
このLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子領域にアニーリングする該細菌を検出するためのプライマーセットが開示されている（特許文献２）。
【０００８】
【特許文献１】特開2002-330796
【特許文献２】特開2005-95105
【非特許文献１】防菌防黴, 2003, Vol.31, No3, 159〜168
【非特許文献２】食品汚染病原微生物, 2003, 327-354
【非特許文献３】Let. Appl. Microbiol., 1990,11,158-162
【非特許文献４】T. Notomiら, Nucleic Acids research, 2000, 28(12), e63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、LAMP法によってリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出可能であるプライマーセットを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、上記プライマーセットを用いてリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの合計３種類を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてLAMP法により増幅することにより、リステリア・モノサイトゲネスを検体中から特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
１．リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、
(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(ii)リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(iii)リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、あるいは、
(iv)該(i)〜(iii)のプライマーセットの組み合わせ、
を含むことを特徴とする、上記LAMPプライマーセット。
２．前記(i)の４種のプライマーに加えて、配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
３．前記(ii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
４．前記(iii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
５．リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
６．配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記５に記載のLAMPプライマーセット。
７．リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
８．配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記７に記載のLAMPプライマーセット。
９．リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
１０．配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記９に記載のLAMPプライマーセット。
１１．上記１〜１０のいずれかに記載のLAMPプライマーセットを使用してリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子からなる少なくとも１つの遺伝子の増幅をLAMP法により検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
１２．リステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
１３．リステリア・モノサイトゲネスactA遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
１４．リステリア・モノサイトゲネスiap遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の増幅用プライマーセットはいずれも、LAMP法によりリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出可能である（後述の表１）。多数のこの細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべてのリステリア・モノサイトゲネス株が陽性に検出された。一方、他のリステリア属細菌種及び他の細菌に対してはいずれも陰性の結果が得られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子産物はリステリオリシンO(Listeriolysin O)であり、このタンパク質は細胞膜を融解する働きをもつ毒素タンパクとして知られている(埼玉医科大学雑誌, 2003, 30, 80-90)。また、actA遺伝子産物は細胞内でのアクチンの重合に必要なタンパク質であり、このタンパク質により菌体が細胞質内を動き回ることができ、細胞から細胞へ伝播することが可能となる(埼玉医科大学雑誌, 2003, 30, 80-90)。さらに、iap遺伝子は、リステリア属菌に共通して存在する遺伝子で、主要な細胞外タンパク質として知られているが、その塩基配列はリステリア属菌によって異なる(Appl. Environ. Microbiol,Oct.1999,4688-4692)。
【００１５】
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子の塩基配列を、他のリステリア属菌、例えばリステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・ウエルシュメリ(Listeria welshimeri)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)など、の塩基配列と比較し、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を特定し、本発明のLAMPプライマーを設計した。この細菌のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子の塩基配列は、例えばGenBankなどから入手可能であり、それぞれM24199、X59723、M80351の登録番号を有している。
【００１６】
リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な領域として決定された塩基配列はそれぞれ、(i)配列番号１〜４、５〜６に示される塩基配列、(ii)配列番号７〜１０、１１〜１２に示される塩基配列、および(iii)配列番号１３〜１６、１７〜１８に示される塩基配列である。
【００１７】
これらの配列のプライマーセットを用いてLAMP法を実施するときには、リステリア・モノサイトゲネスを他のリステリア属細菌種および非リステリア属細菌から区別して（すなわち特異的に）検出することができる。
【００１８】
したがって、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F３およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するために２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで１セットとしてもよい。
【００１９】
また、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F3およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するための２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで1セットとしてもよい。
【００２０】
さらに、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F３およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するための２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで1セットとしてもよい。
【００２１】
上記のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子検出用の３種類のプライマーセットは、それぞれ単独で使用することもできるし、あるいはこれらのプライマーセットを任意に組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
本発明により、リステリア・モノサイトゲネスを検出するための方法には、LAMP法が使用される。
【００２３】
LAMP法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４つのプライマー(一般にFIP、BIP、F３およびB3と称する)を設定し、鎖置換反応を利用して等温で核酸を増幅させることが可能な手法である(特開2002-330796；T. Notomiら, Nucleic Acids research, 2000, 28(12), e63)。
【００２４】
まず、標的遺伝子について、３'末端側からF3c、F2c、F1cという３つの領域を、標的遺伝子の５'末端側に向かってB1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を設計する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1であり、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cである。
【００２５】
FIPは、標的遺伝子のF2c領域と相補的なF2領域を３'末端側にもち、５'末端側に標的遺伝子のF1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、FIPプライマーのF1cとF2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
F3は、標的遺伝子のF3c領域と相補的なF3領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２６】
BIPは、標的遺伝子のB2c領域と相補的なB2領域を３'末端側にもち、５'末端側に標的遺伝子のB1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、BIPプライマーのB1cとB2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
B3は、標的遺伝子のB3c領域と相補的なB3領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２７】
FIPおよびBIPプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的DNAに制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２８】
また、Loop-FおよびLoop-Bプライマーを使用するときには、これらのプライマーが核酸増幅過程で利用されていないループ部分に結合することにより全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸の増幅反応が加速される(特開2002-345499)。
【００２９】
LAMP反応は、サンプル遺伝子、プライマー、鎖置換型DNA合成酵素、基質等を一緒に一定温度(約60〜65℃)で保温することにより、検出まで１ステップの工程で行うことができる。
【００３０】
この反応では鎖置換型DNA合成酵素が使用されるが、この酵素は、PCR法における耐熱性DNAポリメラーゼと異なり安価であるうえに、鋳型DNAの二本鎖をほどきながらDNA合成を行うことができる。このため、LAMP法では、PCR法のようにあらかじめ二本鎖DNAを一本鎖に熱変性する必要がない。
【００３１】
LAMP反応試薬は、栄研化学社から市販のLoopamp DNA増幅試薬キット（但し、プライマーセットを除く）を利用すると便利である。具体的には、反応液の例は次のとおりである。2倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP；DNAポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl；本発明の各プライマーの終濃度、FIP、BIP：40μM、F3、B3：5μM、Loop-F、Loop-B：20μM。
【００３２】
LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を3.5μｌ、2倍濃度反応用緩衝液を12.5μｌ、FIP、BIP、F3、B3、Loop-FおよびLoop-Bの各プライマーを1μｌ加え、DNAポリメラーゼ1μｌ、検体液（鋳型DNA）2μlを加え、全量25μｌの反応液を調製する。
【００３３】
反応は、次のような工程を経て行われる。
(i) 鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の３'末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成される。
(ii) FIPの外側に、F3プライマーがアニールし、その３'末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(iii)F3プライマーから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが二本鎖となる。
(iv) FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3プライマーからのDNA鎖によって剥がされて一本鎖DNAとなるが、このDNA鎖は、５'末端側に相補的な領域F1c、F1をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
(v) 上記(iv)の過程でループを形成したDNA鎖に対し、BIPがアニールし、このBIPの３'末端を起点として相補的なDNA合成が行われる。さらに、BIPの外側にB3プライマーがアニールし、その３'末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されたBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(vi) 上記(v)の過程で二本鎖DNAが形成される。
(vii)上記(v)の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のDNA鎖を起点として、FIP次いでBIPのアニーリングを介して所望DNAの増幅サイクルが行われる。
【００３４】
本発明の各プライマーセットは、約60〜65℃（例えば63℃）においてアニ−リングと同時にDNA鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびDNA鎖合成により約1時間反応を行うことにより109〜1010倍に核酸を増幅させることが可能である。
【００３５】
リステリア・モノサイトゲネスの特定のDNA領域が増幅されると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる、あるいは濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定することもできる。また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してDNA断片の有無を確認し検出することもできる。
【００３６】
核酸増幅によるリステリア・モノサイトゲネスの同定のための検体としては、食品検体、たとえば乳製品、食肉製品、野菜類、魚介類など、また環境検体たとえば土壌、水など、また臨床検体、たとえば血液、組織、髄液などでもよい。
【００３７】
これら検体をLAMP法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うことも出来る。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが、知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、100℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にTE緩衝液などに再溶解させ鋳型DNAとして試験に供してもよい(J. Appl. Bacteriol, 1991,70,121-126)。
【００３８】
たとえば食品中に存在すると考えられるリステリア・モノサイトゲネスを適切な培地で増菌培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して上記プライマーを用いたLAMP反応を行い、リステリア・モノサイトゲネスの特定遺伝子領域を増幅する。
【００３９】
増幅反応により副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響により反応液は、上述のとおり、白濁するので、反応液の濁度を目視または濁度測定装置などを用いた光学的手法により核酸増幅の有無を簡単に確認できる。核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてリステリア・モノサイトゲネス陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてリステリア・モノサイトゲネス陰性（−）を表す。
【００４０】
上で説明したように、本発明により、hlyA遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号１〜４、および適宜追加して実施可能な配列番号５〜６、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいは、actA遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号７〜１０、および適宜追加して実施可能な配列番号１１〜１２、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいはiap遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号１３〜１６、および適宜追加して実施可能な配列番号１７〜１８、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいはこれらのプライマーセットの任意の組み合わせ、のいずれかをLAMPプライマーセットとして用いることによって、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出することができる。ここで、「特異的に」とは、検出反応が他のリステリア属細菌種や非リステリア属細菌に対して陰性であることを意味する。
【００４１】
本発明のLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスの検出法は、食品や環境試料などの検査対象物に存在するリステリア・モノサイトゲネスの有無を迅速に判別することができる検出法として用いることができ、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでのリステリア・モノサイトゲネスの汚染などの検出のために使用することができる。
【００４２】
本発明は、特開2005-95105（特許文献２）で示されているプライマー配列(hlyA領域)とは異なる配列を持ったプライマーセットにより構成されており、またactA遺伝子およびiap遺伝子を増幅することによっても、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出できるという点において有利な方法である。
【００４３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
１．LAMP反応
LAMP反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、LAMP反応試薬は栄研化学社製のLoopamp DNA増幅試薬キットを用いた。2倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM Mg SO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。DNAポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl。本発明の各プライマーの終濃度、FIP、BIP：40μM、F3、B3：5μM、Loop-F、Loop-B：20μM。(栄研化学社、DNA増幅試薬キットLMP201添付説明書)
LAMP反応液は、滅菌蒸留水を3.5μｌ、2倍濃度反応用緩衝液を12.5μｌ、FIP、BIP、F3、B3、Loop-FおよびLoop-Bの各プライマーを1μｌ加え、DNAポリメラーゼ1μｌ、上記より得られた検体液（鋳型DNA）2μlを加え、全量25μｌの反応液を調製した。
【００４５】
LAMP反応は、テラメックス社製の濁度測定装置LA-200Fを用い、63℃の等温反応を60分間行い、その後80℃、2分間の酵素失活処理行った。濁度測定装置は、LAMP反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをリステリア・モノサイトゲネスについて陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００４６】
２．プライマーの設計
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子と他のリステリア属菌5菌種、リステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・ウエルシュメリ(Listeria welshimeri)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)の塩基配列とを比較し、リステリア・モノサイトゲネスに特異的なLAMPプライマーを設計した。
設計に際して、プライマーのGC含量を、特開2005-95105（特許文献２）に示されているプライマー配列のGC含量（41〜50％）よりも高い46〜50％とした。
【００４７】
３．結果
配列番号１〜４(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号５〜６(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットは、hlyA遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００４８】
配列番号７〜１０(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号11〜12(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットは、actA遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００４９】
配列番号１３〜１６(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号１７〜１８(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットはiap遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、iap遺伝子増幅用プライマーセットはいずれも、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出することが可能であり、またいずれのプライマーセットも1時間以内に増幅反応を確認することができた。
【００５２】
hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、iap遺伝子増幅用プライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネス以外の他の属菌との交差性や、その他の細菌との交差性も認められなかったことから、リステリア・モノサイトゲネス以外の細菌を誤って検出する可能性が非常に低いと考えられる。因みに、特開2005-95105（特許文献２）では、リステリア属菌以外の他の細菌との交差性については評価を行っていない。
【００５３】
このことから、hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、およびiap遺伝子増幅用プライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出するためのプライマーとして有効であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスの検出法は、食品や環境試料などの検査対象物に存在するリステリア・モノサイトゲネスの有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検出法として用いることが出来るため、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでのリステリア・モノサイトゲネスの汚染の検出に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア・モノサイトゲネスを迅速かつ正確に検出するためのプライマーセットおよび方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)法によりリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の増幅を検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出のための方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００３】
リステリア属菌のなかでもリステリア・モノサイトゲネスは病原性の面で非常に重要な菌種であると考えられている(非特許文献１)。この細菌は、哺乳動物、鳥類をはじめ食肉、乳および乳製品、試料さらに土壌や水などの各種環境に広く分布している。感染源としては、環境中に広く分布している(非特許文献２)。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネスは、グラム陽性の好気性短桿菌で芽胞は形成しない。従来、リステリア・モノサイトゲネスを生化学性状で判定する場合、グラム染色や運動性、カタラーゼ試験、オキシダーゼ試験、VP反応、糖分解性試験、溶血性などを行い判定していた(非特許文献１)。
【０００５】
リステリア・モノサイトゲネスの検出には増菌や分離培養などを経て各種生化学試験などを行うが、これらの手法は結果を得るまでに時間を要することから、遺伝子を用いた試験法が注目されている。例えば、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子領域を増幅し、その有無を確認するPCR (Polymerase Chain Reaction) 法が広く用いられている(非特許文献３)。しかし、PCR法を用いた細菌の検出法は反応を行うために特別な機器を必要とし、最終判定方法のひとつであるアガロースゲル電気泳動法などに多大な時間と労力を要する。
【０００６】
近年、新しい遺伝子増幅法の一つとしてLAMP反応が栄研化学社（栃木）によって開発された。LAMP法は等温核酸増幅法であり、高い特異性および増幅効率を有し、反応から検出まで1時間程度で行うことが出来る(特許文献１；非特許文献４)。
【０００７】
このLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子領域にアニーリングする該細菌を検出するためのプライマーセットが開示されている（特許文献２）。
【０００８】
【特許文献１】特開2002-330796
【特許文献２】特開2005-95105
【非特許文献１】防菌防黴, 2003, Vol.31, No3, 159〜168
【非特許文献２】食品汚染病原微生物, 2003, 327-354
【非特許文献３】Let. Appl. Microbiol., 1990,11,158-162
【非特許文献４】T. Notomiら, Nucleic Acids research, 2000, 28(12), e63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、LAMP法によってリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出可能であるプライマーセットを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、上記プライマーセットを用いてリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの合計３種類を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてLAMP法により増幅することにより、リステリア・モノサイトゲネスを検体中から特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
１．リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、
(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(ii)リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(iii)リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、あるいは、
(iv)該(i)〜(iii)のプライマーセットの組み合わせ、
を含むことを特徴とする、上記LAMPプライマーセット。
２．前記(i)の４種のプライマーに加えて、配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
３．前記(ii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
４．前記(iii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記１に記載のLAMPプライマーセット。
５．リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
６．配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記５に記載のLAMPプライマーセット。
７．リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
８．配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記７に記載のLAMPプライマーセット。
９．リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
１０．配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、上記９に記載のLAMPプライマーセット。
１１．上記１〜１０のいずれかに記載のLAMPプライマーセットを使用してリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子からなる少なくとも１つの遺伝子の増幅をLAMP法により検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
１２．リステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
１３．リステリア・モノサイトゲネスactA遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
１４．リステリア・モノサイトゲネスiap遺伝子の増幅を検出する、上記１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の増幅用プライマーセットはいずれも、LAMP法によりリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出可能である（後述の表１）。多数のこの細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべてのリステリア・モノサイトゲネス株が陽性に検出された。一方、他のリステリア属細菌種及び他の細菌に対してはいずれも陰性の結果が得られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子産物はリステリオリシンO(Listeriolysin O)であり、このタンパク質は細胞膜を融解する働きをもつ毒素タンパクとして知られている(埼玉医科大学雑誌, 2003, 30, 80-90)。また、actA遺伝子産物は細胞内でのアクチンの重合に必要なタンパク質であり、このタンパク質により菌体が細胞質内を動き回ることができ、細胞から細胞へ伝播することが可能となる(埼玉医科大学雑誌, 2003, 30, 80-90)。さらに、iap遺伝子は、リステリア属菌に共通して存在する遺伝子で、主要な細胞外タンパク質として知られているが、その塩基配列はリステリア属菌によって異なる(Appl. Environ. Microbiol,Oct.1999,4688-4692)。
【００１５】
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子の塩基配列を、他のリステリア属菌、例えばリステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・ウエルシュメリ(Listeria welshimeri)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)など、の塩基配列と比較し、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を特定し、本発明のLAMPプライマーを設計した。この細菌のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子の塩基配列は、例えばGenBankなどから入手可能であり、それぞれM24199、X59723、M80351の登録番号を有している。
【００１６】
リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な領域として決定された塩基配列はそれぞれ、(i)配列番号１〜４、５〜６に示される塩基配列、(ii)配列番号７〜１０、１１〜１２に示される塩基配列、および(iii)配列番号１３〜１６、１７〜１８に示される塩基配列である。
【００１７】
これらの配列のプライマーセットを用いてLAMP法を実施するときには、リステリア・モノサイトゲネスを他のリステリア属細菌種および非リステリア属細菌から区別して（すなわち特異的に）検出することができる。
【００１８】
したがって、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F３およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するために２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで１セットとしてもよい。
【００１９】
また、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F3およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するための２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで1セットとしてもよい。
【００２０】
さらに、本発明のリステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー4種類(FIP、BIP、F３およびB3)を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するための２種類(Loop-F、Loop-B)のプライマーを追加した、合計６種類のプライマーで1セットとしてもよい。
【００２１】
上記のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子検出用の３種類のプライマーセットは、それぞれ単独で使用することもできるし、あるいはこれらのプライマーセットを任意に組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
本発明により、リステリア・モノサイトゲネスを検出するための方法には、LAMP法が使用される。
【００２３】
LAMP法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４つのプライマー(一般にFIP、BIP、F３およびB3と称する)を設定し、鎖置換反応を利用して等温で核酸を増幅させることが可能な手法である(特開2002-330796；T. Notomiら, Nucleic Acids research, 2000, 28(12), e63)。
【００２４】
まず、標的遺伝子について、３'末端側からF3c、F2c、F1cという３つの領域を、標的遺伝子の５'末端側に向かってB1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を設計する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1であり、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cである。
【００２５】
FIPは、標的遺伝子のF2c領域と相補的なF2領域を３'末端側にもち、５'末端側に標的遺伝子のF1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、FIPプライマーのF1cとF2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
F3は、標的遺伝子のF3c領域と相補的なF3領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２６】
BIPは、標的遺伝子のB2c領域と相補的なB2領域を３'末端側にもち、５'末端側に標的遺伝子のB1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、BIPプライマーのB1cとB2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
B3は、標的遺伝子のB3c領域と相補的なB3領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２７】
FIPおよびBIPプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的DNAに制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２８】
また、Loop-FおよびLoop-Bプライマーを使用するときには、これらのプライマーが核酸増幅過程で利用されていないループ部分に結合することにより全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸の増幅反応が加速される(特開2002-345499)。
【００２９】
LAMP反応は、サンプル遺伝子、プライマー、鎖置換型DNA合成酵素、基質等を一緒に一定温度(約60〜65℃)で保温することにより、検出まで１ステップの工程で行うことができる。
【００３０】
この反応では鎖置換型DNA合成酵素が使用されるが、この酵素は、PCR法における耐熱性DNAポリメラーゼと異なり安価であるうえに、鋳型DNAの二本鎖をほどきながらDNA合成を行うことができる。このため、LAMP法では、PCR法のようにあらかじめ二本鎖DNAを一本鎖に熱変性する必要がない。
【００３１】
LAMP反応試薬は、栄研化学社から市販のLoopamp DNA増幅試薬キット（但し、プライマーセットを除く）を利用すると便利である。具体的には、反応液の例は次のとおりである。2倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP；DNAポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl；本発明の各プライマーの終濃度、FIP、BIP：40μM、F3、B3：5μM、Loop-F、Loop-B：20μM。
【００３２】
LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を3.5μｌ、2倍濃度反応用緩衝液を12.5μｌ、FIP、BIP、F3、B3、Loop-FおよびLoop-Bの各プライマーを1μｌ加え、DNAポリメラーゼ1μｌ、検体液（鋳型DNA）2μlを加え、全量25μｌの反応液を調製する。
【００３３】
反応は、次のような工程を経て行われる。
(i) 鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の３'末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成される。
(ii) FIPの外側に、F3プライマーがアニールし、その３'末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(iii)F3プライマーから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが二本鎖となる。
(iv) FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3プライマーからのDNA鎖によって剥がされて一本鎖DNAとなるが、このDNA鎖は、５'末端側に相補的な領域F1c、F1をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
(v) 上記(iv)の過程でループを形成したDNA鎖に対し、BIPがアニールし、このBIPの３'末端を起点として相補的なDNA合成が行われる。さらに、BIPの外側にB3プライマーがアニールし、その３'末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されたBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(vi) 上記(v)の過程で二本鎖DNAが形成される。
(vii)上記(v)の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のDNA鎖を起点として、FIP次いでBIPのアニーリングを介して所望DNAの増幅サイクルが行われる。
【００３４】
本発明の各プライマーセットは、約60〜65℃（例えば63℃）においてアニ−リングと同時にDNA鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびDNA鎖合成により約1時間反応を行うことにより109〜1010倍に核酸を増幅させることが可能である。
【００３５】
リステリア・モノサイトゲネスの特定のDNA領域が増幅されると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる、あるいは濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定することもできる。また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してDNA断片の有無を確認し検出することもできる。
【００３６】
核酸増幅によるリステリア・モノサイトゲネスの同定のための検体としては、食品検体、たとえば乳製品、食肉製品、野菜類、魚介類など、また環境検体たとえば土壌、水など、また臨床検体、たとえば血液、組織、髄液などでもよい。
【００３７】
これら検体をLAMP法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うことも出来る。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが、知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、100℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にTE緩衝液などに再溶解させ鋳型DNAとして試験に供してもよい(J. Appl. Bacteriol, 1991,70,121-126)。
【００３８】
たとえば食品中に存在すると考えられるリステリア・モノサイトゲネスを適切な培地で増菌培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して上記プライマーを用いたLAMP反応を行い、リステリア・モノサイトゲネスの特定遺伝子領域を増幅する。
【００３９】
増幅反応により副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響により反応液は、上述のとおり、白濁するので、反応液の濁度を目視または濁度測定装置などを用いた光学的手法により核酸増幅の有無を簡単に確認できる。核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてリステリア・モノサイトゲネス陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてリステリア・モノサイトゲネス陰性（−）を表す。
【００４０】
上で説明したように、本発明により、hlyA遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号１〜４、および適宜追加して実施可能な配列番号５〜６、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいは、actA遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号７〜１０、および適宜追加して実施可能な配列番号１１〜１２、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいはiap遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する配列番号１３〜１６、および適宜追加して実施可能な配列番号１７〜１８、に示される塩基配列からなるプライマーセット、あるいはこれらのプライマーセットの任意の組み合わせ、のいずれかをLAMPプライマーセットとして用いることによって、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出することができる。ここで、「特異的に」とは、検出反応が他のリステリア属細菌種や非リステリア属細菌に対して陰性であることを意味する。
【００４１】
本発明のLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスの検出法は、食品や環境試料などの検査対象物に存在するリステリア・モノサイトゲネスの有無を迅速に判別することができる検出法として用いることができ、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでのリステリア・モノサイトゲネスの汚染などの検出のために使用することができる。
【００４２】
本発明は、特開2005-95105（特許文献２）で示されているプライマー配列(hlyA領域)とは異なる配列を持ったプライマーセットにより構成されており、またactA遺伝子およびiap遺伝子を増幅することによっても、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出できるという点において有利な方法である。
【００４３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
１．LAMP反応
LAMP反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、LAMP反応試薬は栄研化学社製のLoopamp DNA増幅試薬キットを用いた。2倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM Mg SO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。DNAポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl。本発明の各プライマーの終濃度、FIP、BIP：40μM、F3、B3：5μM、Loop-F、Loop-B：20μM。(栄研化学社、DNA増幅試薬キットLMP201添付説明書)
LAMP反応液は、滅菌蒸留水を3.5μｌ、2倍濃度反応用緩衝液を12.5μｌ、FIP、BIP、F3、B3、Loop-FおよびLoop-Bの各プライマーを1μｌ加え、DNAポリメラーゼ1μｌ、上記より得られた検体液（鋳型DNA）2μlを加え、全量25μｌの反応液を調製した。
【００４５】
LAMP反応は、テラメックス社製の濁度測定装置LA-200Fを用い、63℃の等温反応を60分間行い、その後80℃、2分間の酵素失活処理行った。濁度測定装置は、LAMP反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをリステリア・モノサイトゲネスについて陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００４６】
２．プライマーの設計
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhlyA遺伝子、actA遺伝子、iap遺伝子と他のリステリア属菌5菌種、リステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)、リステリア・ウエルシュメリ(Listeria welshimeri)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)の塩基配列とを比較し、リステリア・モノサイトゲネスに特異的なLAMPプライマーを設計した。
設計に際して、プライマーのGC含量を、特開2005-95105（特許文献２）に示されているプライマー配列のGC含量（41〜50％）よりも高い46〜50％とした。
【００４７】
３．結果
配列番号１〜４(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号５〜６(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットは、hlyA遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００４８】
配列番号７〜１０(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号11〜12(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットは、actA遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００４９】
配列番号１３〜１６(FIP、BIP、F３およびB3)および追加可能な配列番号１７〜１８(Loop-F、Loop-B)によるプライマーセットはiap遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表1に示したリステリア・モノサイトゲネスを37株、およびその他のリステリア属菌を13株用いてLAMP反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみに増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。またその他の細菌でも増幅反応は見られなかった。結果を表1に示した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、iap遺伝子増幅用プライマーセットはいずれも、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出することが可能であり、またいずれのプライマーセットも1時間以内に増幅反応を確認することができた。
【００５２】
hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、iap遺伝子増幅用プライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネス以外の他の属菌との交差性や、その他の細菌との交差性も認められなかったことから、リステリア・モノサイトゲネス以外の細菌を誤って検出する可能性が非常に低いと考えられる。因みに、特開2005-95105（特許文献２）では、リステリア属菌以外の他の細菌との交差性については評価を行っていない。
【００５３】
このことから、hlyA遺伝子増幅用プライマーセット、actA遺伝子増幅用プライマーセット、およびiap遺伝子増幅用プライマーセットは、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出するためのプライマーとして有効であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のLAMP法によるリステリア・モノサイトゲネスの検出法は、食品や環境試料などの検査対象物に存在するリステリア・モノサイトゲネスの有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検出法として用いることが出来るため、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでのリステリア・モノサイトゲネスの汚染の検出に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、
(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(ii)リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(iii)リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、あるいは、
(iv)該(i)〜(iii)のプライマーセットの組み合わせ、
を含むことを特徴とする、上記LAMPプライマーセット。
【請求項２】
前記(i)の４種のプライマーに加えて、配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項３】
前記(ii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項４】
前記(iii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項５】
リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項６】
配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項７】
リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項９】
リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のLAMPプライマーセットを使用してリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子からなる少なくとも１つの遺伝子の増幅をLAMP法により検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
【請求項１２】
リステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リステリア・モノサイトゲネスactA遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
リステリア・モノサイトゲネスiap遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセットであって、
(i)リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(ii)リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、
(iii)リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーのセット、あるいは、
(iv)該(i)〜(iii)のプライマーセットの組み合わせ、
を含むことを特徴とする、上記LAMPプライマーセット。
【請求項２】
前記(i)の４種のプライマーに加えて、配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項３】
前記(ii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項４】
前記(iii)の４種のプライマーに加えて、配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項５】
リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項６】
配列番号５および６に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項７】
リステリア・モノサイトゲネスのactA遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号７〜１０に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１１および１２に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項９】
リステリア・モノサイトゲネスのiap遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１３〜１６に示される塩基配列FIP、BIP、F３およびB3からなる４種のプライマーを含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネス検出用LAMPプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号１７および１８に示される塩基配列Loop-FおよびLoop-Bからなる２種のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のLAMPプライマーセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のLAMPプライマーセットを使用してリステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子、actA遺伝子およびiap遺伝子からなる少なくとも１つの遺伝子の増幅をLAMP法により検出することを含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
【請求項１２】
リステリア・モノサイトゲネスhlyA遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リステリア・モノサイトゲネスactA遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
リステリア・モノサイトゲネスiap遺伝子の増幅を検出する、請求項１１に記載の方法。
【公開番号】特開２００７−１１７０２２（Ｐ２００７−１１７０２２Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１５２９６（Ｐ２００５−３１５２９６）
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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