リストセチン非存在下のフォンビルブラント因子活性の測定方法及びＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼの測定方法
本発明は、凝固診断の分野にあり、そして試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）活性をインビトロで測定する方法に関する。本方法はＧＰＩｂαタンパク質の突然変異機能獲得型変異の使用を含み、従ってリストセチン、ボトロセチン又は別のリストセチン−又はボトロセチン−等価物質の使用を省略することを可能にする。本発明は、更にＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断の分野にあり、そして試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の活性をインビトロで測定する方法に関する。本方法は、ＧＰＩｂαタンパク質の突然変異機能獲得型変異体の使用を含み、それによりリストセチン、ボトロセチン、又は別のリストセチン−若しくはボトロセチン−等価物質の使用を省略することを可能にする。本発明は、更に、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）は、一次止血の過程において重要な機能を有する、血漿中の高分子量多量体糖タンパク質である。ＶＷＦは、とりわけ血小板表面に位置するコラーゲン及び糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）に対する結合部位を有する。ＧＰＩｂは内在性膜タンパク質であり、それは、別の内在性膜タンパク質、糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）と共に、血小板膜において糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ−受容体複合体を形成する。ＧＰＩｂは、約１４５ｋＤａの見かけの分子量を有する重鎖（同義語：α鎖又はＧＰＩｂα）、及び約２２ｋＤａの見かけの分子量を有する軽鎖（同義語：β鎖又はＧＰＩｂβ）を含む２重鎖分子であり、互いにジスルフィド結合により連結されている［非特許文献１］。
【０００３】
血管損傷の場合、コラーゲン表面は露出し、そこにＶＷＦが結合する。コラーゲンへのその結合に因り、そしてコラーゲン結合ＶＷＦに作用するずり応力増加の影響下で、ＶＷＦは、それが血小板膜のＧＰＩｂ−ＩＸ−受容体複合体中のＧＰＩｂ重鎖（ＧＰＩｂα）のアミノ末端に結合し得るように変化し又は活性化される。このようにして、活性化ＶＷＦは通過する血小板を捕捉し、損傷部位でＶＷＦ、コラーゲン及び血小板の最初の凝集形成をもたらす。続いて、血小板が活性化され、それにより、複数の増幅カスケード及び更なる血小板の付着後に、最終的に創傷閉塞をもたらす血漿凝固が開始する。
【０００４】
定性的又は定量的ＶＷＦ障害は、最も一般的な遺伝性出血性病態の１つとして、「フォンビルブラント症候群」（同義語：フォンビルブラント病、ＶＷＤ）の原因である。種々のスクリーニング法が、例えば出血時間（ＢＴ）を測定することなど、例えばＥＬＩＳＡ法などのＶＷＦ抗原濃度（ＶＷＦ：Ａｇ）を測定する定量法、及び例えばリストセチン誘発血小板凝集（ＶＷＦ：ＲＣｏ）などのＶＷＦを測定する方法など、フォンビルブラント症候群を診断するのに利用可能である。
【０００５】
リストセチン補因子分析ともいわれる、安定化血小板のリストセチン誘発凝集方法は、ＶＷＦ抗原濃度を測定する定量法によって検出されないＶＷＦタンパク質のそれらの機能的欠陥も識別する。従って、フォンビルブラント症候群の完全診断には、リストセチン補因子活性を測定するためのリストセチン補因子分析を行なうことが必要になる。リストセチン補因子分析は、通常患者血漿試料を固定血小板と、及びリストセチンと混合することにより行われる。リストセチンは、試料中に存在するＶＷＦの、加えた血小板のＧＰＩｂ受容体への結合を誘発し、血小板の凝集をもたらす。この凝集反応の程度は患者試料中に存在する活性ＶＷＦの量と相関する。該凝集反応は、例えば、透過率の増加を測定することにより光学的に記録され、それによりＶＷＦ：ＲＣｏ活性を定量化し得る。
【０００６】
ＶＷＦ抗原分析に比べて、リストセチン補因子分析はＶＷＦ活性を測定する利点を有し、従って機能的ＶＷＦ障害を、及びフォンビルブラント症候群の種々サブタイプの分類を、そのうちのいくつかだけはＶＷＦ抗原濃度低下を伴うが、識別することを可能にする。該サブタイプは、しばしばＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）とＶＷＦ抗原濃度（ＶＷＦ：Ａｇ）の比を計算することによって分類される。１未満のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比は、フォンビルブラント症候群サブタイプ２Ａ、２Ｂ及び２Ｍに特徴的である。通常推奨される閾値は０.７の比である。
【０００７】
古典的リストセチン補因子分析の欠点は、分析ミックス中の血小板を測定中常時撹拌しなければならないことから、自動化が困難なことである。もう１つの欠点は、分析の相対的精度の悪さ、及び標準変量の０％と２０％の間の範囲内の低いＶＷＦ活性に対する不十分な定量性である。
【０００８】
最近では、アミノ末端ＶＷＦ結合領域を含有する組換えＧＰＩｂαフラグメント（それぞれ１〜２８９及び１〜２９０）を利用する、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡが開発されている［特許文献１又は非特許文献２、非特許文献３］。これらの分析は、特異的な抗体を用いて組換えＧＰＩｂαフラグメントをＥＬＩＳＡプレートに結合することを必要とする。患者試料のＶＷＦが組換えＧＰＩｂαフラグメントに結合できるように、患者試料及びリストセチンが添加される。最後に、結合したＶＷＦは、抗ＶＷＦ抗体を用いて定量的に検出される。この種のＶＷＦのＥＬＩＳＡは、古典的な血小板ベースのＶＷＦリストセチン補因子活性分析の結果と非常によく相関し、そしてより高感度でかつより高精度でもあることが示されている。
【０００９】
非特許文献４は、位置２３３及び２３９に突然変異を有する組換えＧＰＩｂαフラグメント（１〜４８３）を利用する、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡを記載している。これらの突然変異は、低濃度リストセチンの存在下にＶＷＦに対して高親和性を有し、そして野生型ＧＰＩｂαタンパク質よりも強くＶＷＦと相互作用することが知られている機能獲得型変異である（特許文献２）。前記の突然変異は、ＧＰＩｂα鎖のよく知られた突然変異体である。バリン残基によるＧＰＩｂα鎖の位置２３３のグリシン残基の置換（Ｇ２３３Ｖ）は、Millerら（特許文献３）により記載されている。該突然変異は、常染色体優性遺伝性出血病態である、血小板型フォンビルブラント症候群（ＰＩ−ＶＷＤ）の原因である。バリン残基によるＧＰＩｂα鎖の位置２３９のメチオニンン残基の置換（Ｍ２３９Ｖ）は、Russell & Roth［非特許文献５］により記載されている。この突然変異はＰＴ−ＶＷＤも引き起こす。
【００１０】
不利なことには、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡ及びリストセチン補因子分析も、また、リストセチン又はＧＰＩｂα鎖へのＶＷＦの結合を仲介する他の内因性の非生理学的モジュレータの使用をベースとすることである。細菌Nocardia lurida の糖タンパク質系抗生物質のリストセチン、及びBothrops属蛇毒のボトロセチン（同義語: 共同凝集素）は、血小板又は単離したＧＰＩｂαタンパク質若しくはそのフラグメントに対するＶＷＦの結合を、インビトロで誘発するのに用いられることが知られている。リストセチンの使用は、それがＶＷＦだけでなく、多くの他のタンパク質、例えばフィブリノーゲン又はさもなければ抗ＧＰＩｂα抗体にも結合し得るという欠点を有する（幾つかの実験で認められている）。従って、ＶＷＦ分析におけるリストセチンの使用は、試験結果を歪め得る非特異結合反応又は沈降反応が起こるリスクがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開公報第０１／０２８５３（Ａ２）号
【特許文献２】国際公開公報第９３／１６７１２号
【特許文献３】Miller et al. 米国特許第５３１７０９７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Lopez, J.A. et al. (1987), Cloning of the α chain of human platelet glycoprotein Ib: A transmembrane protein with homology to leucine-rich α2-glycoprotein（ヒト血小板糖タンパク質Ｉｂのα鎖のクローニング：ロイシンに富むα2糖タンパク質と相同性の膜貫通タンパク質）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5615-5619
【非特許文献２】Vanhoorelbeke, K. et al. (2002), A reliable von Willebrand factor: Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type 1 and type 2 von Willebrand disease（信頼性の高いフォンビルブラント因子：１型及び２型フォンビルブラント病を鑑別するリストセチン補因子酵素免疫吸着法）, Semin Thromb Hemost. 28(2): 161-165
【非特許文献３】Federici, A.B. et al. (2004), A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein Ibα for the diagnosis of patients with low von Willebrand factor levels（低レベルのフォンビルブラント因子を有する患者の診断用の組換え糖タンパク質Ｉｂαによるリストセチンの高感度補因子活性分析）, Haematologica 89(1): 77-85
【非特許文献４】Hui et al. (Abstract, ISTH 2007)
【非特許文献５】Russell, S.D. & Roth, G.J. (1993), Pseudo-von Willebrand Disease: A mutation in the platelet glycoprotein Ibα gene associated with a hyperactive surface receptor（仮性フォンビルブラント病：高活性表面受容体に関連する血小板糖タンパク質Ｉｂα遺伝子の突然変異）, Blood 81(7), 1787-1791
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、リストセチンの非存在下に実施し得る、ＶＷＦの活性を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、ヒトＧＰＩｂα受容体のアミノ酸配列に基づき、位置２３３及び２３９に２点の突然変異を有するＧＰＩｂα鎖の機能獲得型変異体を用いることにより達成された。ＧＰＩｂα鎖の機能獲得型変異体は、本発明に従って、ＶＷＦに有意により高い親和性を有し、そして低濃度リストセチンの存在下に野生型ＧＰＩｂαタンパク質より強くＶＷＦと相互作用することが知られている突然変異体を意味する。
【００１５】
本発明の主題は、試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の活性を測定する方法であって、該試料を単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合して分析試料を得、かつ、その分析ミックスにリストセチンもボトロセチンも加えないことを含む方法である。使用するＧＰＩｂαタンパク質は、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列に比べて、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そして位置２３３及び２３９に置換Ｘａａを有するアミノ酸配列（配列番号１）を含む。ＧＰＩｂαの位置２３３のグリシン残基及び位置２３９のメチオニン残基の置換Ｘａａは、バリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｖ及びＭ２３９Ｖ）又はセリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｓ及びＭ２３９Ｓ）であることが好ましい。２つの位置における該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。本発明の明細書におけるＧＰＩｂαタンパク質への言及は、このような突然変異体への言及を意味する。
【００１６】
更に、「リストセチン−又はボトロセチン−等価物質」が、分析混合物に加えられないことが好ましい。用語「リストセチン−又はボトロセチン−等価物質」は、本発明に従って、野生型ＧＰＩｂα鎖又はそのフラグメントに対する溶解ＶＷＦのインビトロ結合を誘導することができる、外因性、即ち、非生理的物質を意味する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の利点は、ＧＰＩｂαの機能獲得型変異体を用いることにより、例えば、流動、撹拌又は振盪で分析ミックスにせん断応力をかけることをなくし得ることである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「試料」は、ＶＷＦ活性の測定法に関する限りでは、検出すべき物質、即ち、ＶＷＦを含むことが疑われる材料を意味する。用語「試料」は、例えば血液、血漿又は血清などの、特にヒト及び動物の生体液、及びまた例えばＶＷＦ標準物質若しくはＶＷＦ対照、又は例えばフォンビルブラント症候群患者の補充療法のために設計される高濃縮のＶＷＦ濃縮物などの工業生産製品をも含む（例えば、Haemate P（登録商標））。適切な場合、試料は検体を検出方法に利用し易く、そして妨害する試料成分を取り除くために前処理する必要がある。そのような試料の前処理方法としては、細胞の除去及び／又は溶解又は試料の遠心分離を含んでもよい。用語「試料」は、上記試料材料の任意のものを含む反応混合物をも含み、それに対して単離ＶＷＦがＶＷＦ修飾因子の活性を測定する基質として加えられ、そして残存ＶＷＦ活性が該ＶＷＦ修飾因子と該ＶＷＦ基質のインキュベーション後に測定される。そのような混合物の例は、例えば血漿試料におけるＶＷＦ切断性ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを測定するための、分離高分子量ＶＷＦと血漿試料の混合物である。血漿試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼは、添加されたＶＷＦ基質を切断し、従って試料のＶＷＦ活性を低下させる。
【００１９】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂα鎖は、組換え的又は合成的に生産されるＧＰＩｂαタンパク質であってよい。例えば、細菌（例えば、 E. coli)、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)、植物、動物又はヒト細胞培養での発現などの公知の原核生物又は真核生物の発現系は、組換えＧＰＩｂαタンパク質を生産するのに有用である。例えば、固相合成（例えば、メリフィールド合成）などのインビトロタンパク質合成の公知技術は、合成的ＧＰＩｂαタンパク質を生産するのに好適である。本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくはヒト細胞の培養、好ましくはヒト胚性腎臓細胞（HEK細胞）の培養で生産されている、組換え生産ＧＰＩｂαタンパク質である。
【００２０】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で相同ヒトＧＰＩｂαシグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号２、アミノ酸残基−１６から−１とも呼ばれる）に融合してもよい。或いはまた、使用するＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で異種シグナル配列に、即ち、通常はヒトＧＰＩｂαポリペプチドに存在せず、選択された発現系において組換え発現したＧＰＩｂαタンパク質の発現及び／又は分泌に対して有利な影響を有するポリペプチドに融合してもよい。好適な異種シグナル配列は、例えば、ＭＰＬＱＬＬＬＬＬＩＬＬＧＰＧＮＳＬＱＬＷＤＴＷＡＤＥＡＥＫＡＬＧＰＬＬＡＲＤＲＲ（配列番号３）である。
【００２１】
更に、本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｃ末端で、例えば、組換え発現タンパク質が親和性担体に結合することを可能にするような、それにより、例えば、組換え発現ＧＰＩｂαタンパク質を精製するか、さもなければ組換えＧＰＩｂαタンパク質が固相に結合するのを可能にするような、１つ又はそれ以上の親和性タグに融合してもよい。わずか１２アミノ酸長さの小さい親和性タグが好ましい。Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ及びＳｔｒｅｐタグから成る群からの親和性タグが特に好ましい。高親和性を有する親和性タグに結合する好適な親和性担体の例は、特異抗体、固定化カチオン（例えば、Ｈｉｓタグに親和性を有するＮｉ2+）又は他のタイプの結合パートナー（例えば、Ｓｔｒｅｐタグに親和性を有するストレプトアビジン）である。
【００２２】
本発明の１つの実施態様では、ＧＰＩｂαタンパク質は固相で結合する。用語「結合」は広い意味を有し、そして、例えば、共有及び非共有結合、直接及び間接結合、表面への吸着及び窪みへの包接を含む。共有結合では、単離ＧＰＩｂαタンパク質は固相へ化学結合を経て結合する。非共有結合の例は表面吸着である。固相への直接結合に加えて、単離ＧＰＩｂαタンパク質は、固相への他の特異的結合パートナーとの特異的な相互作用を経て、例えば、抗体と、好ましくは抗ＧＰＩｂα抗体と、又は−単離ＧＰＩｂαタンパク質が親和性タグを有する場合−抗親和性タグ抗体との特異的な相互作用を経て、間接的にも結合し得る。
【００２３】
本発明による用語「固相」は、多孔性及び／又は非多孔性、水不溶性材料から成り、かつ、例えば、容器、チューブ、ミクロ滴定プレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ビーズ、微粒子、ロッド、ストリップ、濾紙、クロマトグラフィーペーパーなどの非常に様々な形状を有してもよい物を含む。固相の表面は、標準的には親水性であるか又は親水性にし得るものである。固相は、例えば、無機及び／又は有機材料、合成材料、天然及び修飾天然材料などの非常に様々な材料から成り得る。固相材料の例は、例えば、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレート又はナイロンなどのポリマー；ラテックス；セラミックス；ガラス；金属、特に金及び銀などの貴金属；マグネタイト；それらの混合物又は組み合わせである。
【００２４】
固相は、例えば、固相に対する試料成分の非特異的な結合を抑制又は防止するために、又は例えば微粒子固相の懸濁安定性、保存安定性、デザイン安定性又はＵＶ光、微生物若しくは他の破壊剤への抵抗性を向上させるために、１つ又はそれ以上の層、例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー又はそれらの混合物のコーティングを有してもよい。
【００２５】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の好ましい実施態様は、粒子結合ＧＰＩｂαタンパク質、好ましくはラテックス粒子結合ＧＰＩｂαタンパク質の使用、及び微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づく該ＶＷＦ活性の測定を含む。抗体を経て微粒子固相に結合したＧＰＩｂαタンパク質の使用が好ましい。この目的に好適なものは、抗ＧＰＩｂα抗体、特にモノクローナル抗体ＶＭ１６ｄ［Mazurov, A.V. et al. (1991), Characterization of an antiglycoprotein Ib monoclonal antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction（血小板−トロンビン相互作用を特異的に阻害する抗糖タンパク質Ｉｂモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション）, Thromb Res. 62(6), 673-684; 例えば、 Sanbio B.V., Uden, Netherlandsから市販: 製品番号 MON 1146］、及びＳＺ−２ ［Ruan, C. et al. (1987), A murine antiglycoprotein Ib complex monoclonal antibody, SZ 2, inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen （マウス抗糖タンパク質Ｉｂ複合体モノクローナル抗体、ＳＺ−２はリストセチン及びコラーゲンの両方により誘発される血小板凝集を阻害する）, Blood 69(2), 570-577; 例えば、Beckman Coulter Inc., Fullerton, USAから市販: 製品番号 IM0409］である。使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合している場合、抗Ｆｌａｇ抗体は同様に好適である［例えば、 米国特許第５０１１９１２号を参照; 例えば、Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germanyから市販］。試料中に存在するＶＷＦの量又は活性と相関する凝集反応は、例えば、散乱光の強度を測定することを介して（比濁法）、又は培地の濁度を測定することを介して（混濁度法）、粒子凝集体へ光散乱を用いることにより定量的に測定し得る。
【００２６】
界面活性剤の存在下に、好ましくは、ツィーン（Tween）（登録商標）20、テシット（Thesit）、トリトン（Triton）界面活性剤 (例えば、トリトン X-100（登録商標）又はトリトン X-405（登録商標）) 及びドデシル硫酸ナトリウム (ＳＤＳ)から成る群からの界面活性剤の存在下に、微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づくＶＷＦ活性を測定することが好ましい。界面活性剤の存在は、微粒子固相の、特にラテックス粒子のＶＷＦに依存した凝集速度に影響することが見出された。
【００２７】
凝集速度を、種々のＶＷＦ濃度で、そしてツィーン（登録商標）20の濃度を増加させて測定した（図４を参照、実施例５に類似の方法で測定）。反応の増幅は、特に相対的に低濃度（０．０２〜０.１ｇ／ｌ）のツィーン（登録商標）20で顕著であり、ツィーン（登録商標）20の濃度の増加と共に再び減少し、そして安定レベルに達することが明らかである。例えば、１４９.６％ＶＷＦでは、安定な増幅レベルはおよそ１ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20で到達し、その時の増幅はツィーン（登録商標）20なしでの初期値の８５％である。従って、界面活性剤としてツィーン（登録商標）20を用いる場合２つの可能性がある。第一に、ツィーン（登録商標）20濃度は、特定のＶＷＦ濃度を２０％まで特に強く増幅させるために低く（０．０２〜０.１ｇ／ｌ）設定し得る。例えば、０．０５ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20（分析混合物中で）では、凝集速度は３０.４％のＶＷＦにより２１６％増幅される。低いＶＷＦ濃度は特に測定が難しいことから、反応の増幅はこの場合非常に有用である。第二に、測定系をすべての適切なＶＷＦ濃度に対して界面活性剤の飽和領域で実施する場合に、一般的により安定である。これは、例えば、０．０５ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20以上の場合である。この変形は、広範囲のＶＷＦ濃度に対するスクリーニング分析に対して好適である。０．６〜２０．０ｇ／ｌ、好ましくは１ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20濃度は、２０％を超えるＶＷＦ濃度を測定するために、凝集反応を増幅させるべき場合に有利である。
【００２８】
テシット（同義語: Polidocanol, Schaerer & Schlaepfer Ltd., Rothrist, Switzerland）、トリトン界面活性剤（例えば、トリトン X-100（登録商標）又はトリトン X-405（登録商標）)、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの他の界面活性剤は、凝集反応の増幅において、定常的な濃度依存性増加を示す（図５を参照、実施例５に類似の方法で測定：４５μｌの試料、しかしツィーン（登録商標）20の代わりにテシットを使用）。
【００２９】
血漿試料のＶＷＦ活性は、あらかじめ該試料を希釈することにより、通常緩衝液又はＶＷＦ欠乏血漿を用いて測定される。検量線を作成するために、同じことが標準血漿（例えば、標準ヒト血漿）に当てはまる。しかしながら、ＶＷＦ欠乏血漿による希釈及び常用界面活性剤濃度（分析ミックス中１ｇ／ｌ）は、十分な界面活性剤により抑制し得るＧＰＩｂαラテックス粒子凝集の望ましくない増幅をもたらすことが見出された。図６に示されるように、４５μｌの試料を含有する分析ミックス中の試料（この場合、標準ヒト血漿）をＶＷＦ欠乏血漿で又は緩衝液で希釈する場合、高い凝集速度が、ＶＷＦ欠乏血漿の存在下の試料中において特定のＶＷＦ濃度で起こる。対照的に、分析系における界面活性剤の完全除去、及びＶＷＦ欠乏血漿による標準ヒト血漿の希釈は、緩衝液での希釈のように低い凝集速度をもたらす。しかしながら、十分な界面活性剤が加えられる場合（例えば、≧３ｇ／ｌテシット）、緩衝液又は欠乏血漿による希釈での凝集速度は同じようになる。このことは、緩衝液での血漿試料の希釈が適切なことを確実にする。分析にとって、標準血漿（標準物質として）の希釈用としても患者試料の起こり得る希釈用としても、ＶＷＦ欠乏血漿を使用しなければならない場合よりもむしろ、単純な緩衝液を使用できることは極めて有利である。緩衝液は安価であり、良好な保存安定性を確実にし、そして多くの自動分析機器は複合分析に対して単一の緩衝液を使用している。更に、ＶＷＦ欠乏血漿は、すべてのラボラトリーにはしばしば利用不能である。ＶＷＦ濃縮物の測定は特に高希釈を必要とし、緩衝液での適切な希釈は同様に非常に有利である。
【００３０】
分析ミックス中ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在下に、好ましくは０.１％から１.０％までのポリビニルピロリドン濃度で、及び／又は分析ミックス中デキストランＴ５００の存在下に、好ましくは０.１％から３％までのデキストランＴ５００濃度で、及び／又は分析ミックス中アルギネート５００〜６００ｃＰの存在下に、好ましくは０.０１％から０．２％までのアルギネート５００〜６００ｃＰ濃度で、微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づきＶＷＦ活性を測定することは更に好ましい。
【００３１】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の別の好ましい実施態様は、競合分析フォーマットである。該方法は、粒子結合抗ＧＰＩｂα抗体、好ましくはＶＭ１６ｄ、及び粒子結合ＶＷＦを反応ミックスに使用すること、並びにＧＰＩｂαタンパク質の添加である。該粒子は、ＧＰＩｂαタンパク質の存在下、及びリストセチン、ボトロセチン又は等価物質の非存在下に凝集する。この凝集反応は、ＶＷＦを含む試料の添加により阻害される。凝集反応の該阻害は、該試料中に存在するＶＷＦの量又は活性と相関する。
【００３２】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の別の好ましい実施態様は、非微粒子固相に結合した、好ましくはマイクロタイタープレートの表面に結合したＧＰＩｂαタンパク質の使用、及び該ＧＰＩｂαタンパク質に結合したＶＷＦ量の測定に基づき、該ＶＷＦ活性を測定することを含む。非微粒子固相に抗体を介して結合したＧＰＩｂαタンパク質を用いることが好ましい。この目的に好適なものは、抗ＧＰＩｂα抗体、特にモノクローナル抗体ＶＭ１６ｄ（上記を参照）及びＭＢ４５ [例えば、 Modderman, P.W. et al. (1992), Glycoproteins form a noncovalent complex in the platelet membrane（糖タンパク質Ｖ及びＩｂ−ＩＸは血小板膜において非共有複合体を形成する）, J. Biol. Chem. 267(1), 364-369、及びその中に引用された２６の参考文献を参照; 例えば、Sanguin, Amsterdam, Netherlandsから市販: PeliCluster CD42b、製品番号 M9142］である。使用されるＧＰＩｂαタンパク質が、Ｃ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合する場合、抗Ｆｌａｇ抗体は同様に好適である［上記を参照］。ＧＰＩｂαタンパク質に結合したＶＷＦの量は、例えば、シグナル生成系の成分と直接的又は間接的に結合する抗ＶＷＦ抗体を用いることにより測定することができ、それによりＧＰＩｂα結合ＶＷＦの量を定量することを可能にする。「活性な」（機能的に無傷の）ＶＷＦのみがＧＰＩｂα受容体に結合することから、この原理に従って算出したＶＷＦ抗原濃度は、ＶＷＦ活性と相関する。
【００３３】
本発明は更に本発明の方法で用いる検査キットであって、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有し、そしてＧＰＩｂαタンパク質が微粒子固相と結合する、アミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質を含有する少なくとも１つの試薬を含む検査キットに関する。ラテックス粒子と結合するＧＰＩｂαタンパク質を含有する試薬を含む検査キットが好ましい。ＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくは抗体を介して微粒子固相に結合する。試薬（reaction）は、液体又は凍結乾燥の形態で提供されてもよい。試薬が凍結乾燥物の場合、検査キットは、更に、例えば、蒸留水又は適切な緩衝液などの該凍結乾燥物を懸濁するのに必要な溶媒を含んでもよい。
【００３４】
本発明は、更に本発明の方法で用いる検査キットであって、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質が結合する、非微粒子固相、好ましくはミクロ滴定プレートを含む検査キットに関する。抗体を介して非微粒子固相に結合しているＧＰＩｂαタンパク質が好ましい。検査キットは、更に、抗ＶＷＦ抗体、好ましくはシグナル生成系の成分と直接的又は間接的に結合している抗ＶＷＦ抗体を含有する試薬を含んでもよい。抗ＶＷＦ抗体を含む試薬は、液体又は凍結乾燥の形態で与えられてもよい。試薬が凍結乾燥物の場合、検査キットは、更に、例えば、蒸留水又は適切な緩衝液などの該凍結乾燥物を懸濁するのに必要な溶媒を含んでもよい。
【００３５】
本発明は、更に、インビトロでフォンビルブラント（ＶＷＦ）活性を測定する方法において、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、いずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の使用であって、該ＶＷＦ活性の測定法においてリストセチンもボトロセチンも用いられない使用に関する。
【００３６】
位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、単離ＧＰＩｂαタンパク質を用いることが好ましい。２つの位置において該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。
【００３７】
本発明は、更に、ヒトＧＰＩｂαタンパク質（配列番号１）の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の取得方法であって、該ＧＰＩｂαタンパク質を組換え技術により原核細胞又は真核細胞の培養で発現させること、そして親和性担体を用いる親和性クロマトグラフィーにより、細胞溶解物又は細胞培養上清から上記ＧＰＩｂαタンパク質を単離することを含む方法に関する。
【００３８】
位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、単離ＧＰＩｂαタンパク質を取得する方法が好ましい。２つの位置において該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。
【００３９】
本発明の別の主題は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法である。
【００４０】
ＡＤＡＭＴＳ−１３（トロンボスポンジンモチーフを有するジスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）は、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をタンパク質分解的に切断し、それによりその活性を低下させるメタロプロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ−１３酵素活性の先天性及び後天性欠乏症は公知であり、例えば、微小循環に悪影響を及ぼす生命にかかわる血栓塞栓性疾患として、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）など種々の疾患を引き起こす。ＶＷＦの過大マルチマーはＴＴＰ患者の血漿中に認められ、そしてＶＷＦに富む血栓及び血小板の形成原因と考えられる。従って、患者試料におけるＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断プロテアーゼ活性を測定することは、診断上重要となる。
【００４１】
先行技術は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定し、そしてＡＤＡＭＴＳ−１３欠乏症を診断する種々の方法を開示している。
【００４２】
Furlan et al. (1996) は、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含有する試料を基質としての精製ヒトＶＷＦとインキュベートし、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動を用いてのＶＷＦマルチマーのその後の分析により、又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）及びその後の免疫ブロット法を用いてのＶＷＦフラグメントの分析により、検出する方法を記載している［Furlan, M., Robles, R. and Laemmle, B. (1996), Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis（フォンビルブラント因子をインビボタンパク質分解によって生産されるフラグメントに切断するヒト血漿由来のプロテアーゼの部分精製及びキャラクタリゼーション）, Blood 87, 10: 4223-4234］。ゲル電気泳動によるこの種類のマルチマー分析は莫大な作業量と時間を必要とし、従って臨床ラボラトリーでの使用には適さない。
【００４３】
他の機能的分析法では、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を基質としてのＶＷＦとインキュベートし、そして次に該ＶＷＦ基質の活性の欠失を測定することにより測定する。ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼが試料中に存在すればするほど、ＶＷＦ基質はますます切断され、従ってＶＷＦ活性はますます反応混合物中に検出し得なくなる。これらの機能的方法の利点は、ＶＷＦ基質を用いること、そして大きなマルチマーの機能の欠失を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのインビボ関連機能を、インビトロでシミュレートする点である。
【００４４】
国際公開公報第２００４／００５４５１（Ａ２）号は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を精製ヒトＶＷＦ基質とインキュベートし、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、リストセチン補因子分析を用いて反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性をその後に測定することによって検出する方法を開示している。或いはまた、反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性は、コラーゲン結合分析（例えば、国際公開公報第００／５０９０４号を参照）を用いて分析してもよい。不利なことに、ＶＷＦの十分なタンパク質分解をもたらすために、反応混合物を非常に長時間、時には一夜インキュベートしなければならないことである。６０分という短縮したインキュベーション時間の改良法が、Kostousov, V., Fehr, J., Bombeli, T. (2006), Novel, semi-automated, 60-min-assay to determine von Willebrand factor cleaving activity of ADAMTS-13（ＡＤＡＭＴＳ−１３のフォンビルブラント因子切断活性を測定する新規な半自動６０分の分析）, Thrombosis Res. 118: 723-731に記載されている。
【００４５】
米国特許公開公報第２００７／００６５８９５（Ａ１）号及び米国特許公開公報第２００５／０１８６６４６（Ａ１）号は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼに対し特異的切断部位を有するペプチドと、又は基質としてのＶＷＦペプチド（フラグメント）とインキュベートし、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いてその後に得られるペプチドを分析することにより、そして場合によりその後の免疫ブロット法により検出する方法を開示している。
【００４６】
公知の分析方法は、それらが、例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥによるタンパク質分解から由来する基質フラグメントの分析などの複雑な技術を必要とするか、又は天然のＶＷＦ基質を使用しない点で不利であり、それによりＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼの特定の機能異常が検出し得なくなる可能性がある。
【００４７】
従って、本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法であって、できるだけ多くのＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼの機能異常を該方法により検出することを可能とし、従来の臨床分析機で時間節約的にかつ自動的に行ない得る方法を提供することである。
【００４８】
この目的は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含むことが疑われる試料を、基質としての単離ＶＷＦと混合して反応混合物を得ることにより達成され、該ＶＷＦ基質は、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異（多型又は突然変異）を有し、その結果該ＶＷＦ基質がいずれの場合も促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解されるＶＷＦモノマーを含む、高分子量マルチマーＶＷＦである。
【００４９】
ヒトＶＷＦモノマーは、インビボにおいて、最初に２８１３アミノ酸前駆タンパク質として合成される。細胞内プロセシングは、２０，０００ｋＤａより大きいサイズとなり得るＶＷＦマルチマーを生成する。これらのマルチマーは、ジスルフィド結合を介して互いに連結した直線状に配列した２７５ｋＤａ、２，０５０アミノ酸ＶＷＦモノマーを含む。ＶＷＦは、約５００ｋＤａ（ダイマー）から１５，０００ｋＤａを超える種々サイズの球状マルチマーの形態で血漿中に循環する。
【００５０】
「高分子量マルチマーＶＷＦ基質」は、本発明に関する限り、１０を超える二量化ＶＷＦ分子を含み、そして当業者に周知のゲル電気泳動法により立証できる、５，０００ｋＤａより大きいサイズのＶＷＦタンパク質を意味する。更に、高分子量マルチマーＶＷＦは、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有し、その結果、いずれの場合にも該ＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解される、ＶＷＦモノマーを含む。
【００５１】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼによるタンパク質分解切断に対するＶＷＦの感受性を増加させる、ＶＷＦタンパク質のアミノ酸配列変異は、先行技術の一部である［例えば、 Hassenpflug, W.A., Budde, U., Obser, T., Angerhaus, D., Drewke, E., Schneppenheim, S., Schneppenheim, R. (2006), Impact of mutations in the von Willebrand factor A2 domain on ADAMTS 13-dependent proteolysis,（ＡＤＡＭＴＳ−１３依存性タンパク質分解に及ぼすフォンビルブラント因子Ａ２ドメインの突然変異の影響）, Blood 107: 2339-2345、又はRayes, J., Hommais, A., Legendre, P., Tout, H., Veyradier, A., Obert, B., Ribba, A.S., Girma, J.P. (2006), Effect of von Willebrand disease type 2B and type 2M mutations on the susceptibility of von Willebrand factor to ADAMTS-13（ＡＤＡＭＴＳ−１３に対するフォンビルブラント因子の感受性に及ぼすＡＤＡＭＴＳ−１３依存性タンパク質分解に及ぼすフォンビルブラント病２Ｂ型及び２Ｍ型の影響）, J. Thromb Haemost. 5: 321-328を参照］。本発明に特に好適なＶＷＦ基質は、以下の群：Ｐ１６４８Ｓ、Ｅ１６３８Ｋ、Ｇ１５０５Ｒ、Ｓ１５０６Ｌ、Ｍ１５２８Ｖ、Ｒ１５６９ｄｅｌ、Ｒ１５９７Ｗ、Ｖ１６０７Ｄ、Ｇ１６０９Ｒ、Ｇ１６２９Ｅ、Ｇ１６３１Ｄ、Ｒ１５９７Ｑ、Ｖ１４９９Ｅ及びＹ１５８４Ｃ；からの少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有するＶＷＦモノマーを含む、高分子量マルチマーＶＷＦを含む。
【００５２】
表示されたアミノ酸の位置は、ＶＷＦ前駆タンパク質（例えば、ＮＣＢＩ登録Ｎｏ.ＡＡＢ５９４５７８、バージョンＡＡ５９４５８.１、ＧＩ：３４０３５６を参照）の２８１３アミノ酸配列を示す。略語「ｄｅｌ」は、対応するアミノ酸残基の欠失を意味する。フォンビルブラント因子の突然変異及び多型の命名法については、Goodeve, A.C., Eikenboom, J.C.J., Ginsburg, D., Hilbert, L., Mazurier, C., Peake, I.R., Sadler, J.E. and Rodeghiero, F. (2001), A standard nomenclature for von Willebrand factor gene mutations and polymorphisms（フォンビルブラント因子の遺伝子突然変異及び多型の標準命名法）, Thromb Haemost. 85: 929-931をも参照されたい。
【００５３】
ＶＷＦの天然に存在する又は人工生成アミノ酸配列変異は、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、それらがいずれの場合にも、得られたＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解される結果をもたらす、即ち、得られたＶＷＦ基質がＡＤＡＭＴＳ−１３に対する高められた感受性を有する結果をもたらす限り、同じように好適であり得る。高分子量マルチマーＶＷＦ基質が、純粋に野生型の高分子量マルチマーＶＷＦ基質よりも速くＡＤＡＭＴＳ−１３によりインビトロでタンパク質分解される場合、即ち、ＶＷＦ基質のより大きなフラグメント化が、例えば、当業者に公知のゲル電気泳動法によって立証し得る、同じインキュベーション条件下で引き起こされる場合、ＡＤＡＭＴＳ−１３タンパク質分解に対する感受性は増加する。
【００５４】
本発明の方法で用いられる単離高分子量マルチマーＶＷＦ基質は、好適なＶＷＦアミノ酸配列変異のヘテロ接合性又はホモ接合性キャリアのドナー血漿から得られるか、又は当業者に公知の方法を用いて組換え発現させてもよい。組換え生産ＶＷＦ基質は、それが分析ミックスに導入される場合に、試験結果を歪め得るようなＡＤＡＭＴＳ−１３汚染が一切ないという点、それが完全に多量体化されている点、そして血漿から単離したＶＷＦの場合にあり得る、それがタンパク質分解されていない点で有利である。
【００５５】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する、本発明の方法の好ましい実施態様では、ＶＷＦ基質の分解は、試料を更にヘパリンと及び／又は単離天然ＧＰＩｂαタンパク質及び／又は組換え野生型ＧＰＩｂαタンパク質と、及びリストセチン又はボトロセチンと混合することにより更に促進され得る。同じ目的で、代わりに、試料は、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含む、組換え又は合成ＧＰＩｂαタンパク質と混合してもよい。好ましくは、使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａは、バリン又はセリン残基を含む。試料をＶＷＦ基質とインキュベートした後に反応ミックス中に残存しているＶＷＦ活性は、種々の方法で、例えば、リストセチン−補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）を測定することにより、又は他の公知の方法により測定してもよい。好ましい実施態様では、反応ミックス中に残存しているＶＷＦ活性は、反応ミックス又はそのアリコートを、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａ（好ましくはＸａａ＝バリン又はセリン残基）を有するアミノ酸配列を含む単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合することにより、そしてリストセチン及びボトロセチンのいずれも加えないことにより測定される。該ＧＰＩｂαタンパク質を、残存ＶＷＦ活性に応じて凝集する微粒子固相に結合させることが特に好ましい。反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性は、凝集反応に基づいて測定することができ、その活性がひいては試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ−１３活性に関する情報を提供する。
【００５６】
試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する、本発明の方法の格別な利点は、ＶＷＦ基質を尿素で処理することを省略することができるということであり、尿素の適用は、前処理時のインキュベーションの間、時間を厳守しない場合に、その後ＶＷＦ活性を過度に低く測定するリスクをもたらす。先行技術の種々の方法は、最初にＶＷＦをＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼによる分解がし易くするために、尿素又は類似の変性物質によるＶＷＦ基質の前処理を必要とする（例えば、国際公開公報第２００４／００５４５１（Ａ２）号を参照）。
【００５７】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する予定の各々のヒト血漿試料は、試料固有のＶＷＦを含むことから、実際の分析ミックスと並行して第２の分析ミックスの測定を実施することが有利であり、その場合、同じ試料の第２のアリコートは本発明の方法を用いるが、ただしＶＷＦ基質と混合した試料を実際の分析ミックスと同じ時間インキュベートせずに分析され、第２の分析ミックスのＶＷＦ活性は、試料及びＶＷＦ基質を混合した直後に測定される。従って、第２の分析ミックスのＶＷＦ活性（インキュベーション工程なし）と実際の分析ミックスのＶＷＦ活性（タンパク質分解性ＶＷＦ分解のためのインキュベーション工程あり）との差は、実際の分析ミックス中でＡＤＡＭＴＳ−１３により分解されるＶＷＦ活性を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＶＷＦの測定用に本発明で適用されるＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）及び野生型ＧＰＩｂαのＥＬＩＳＡ分析法のデザインは、実施例４に記載されている。ＶＷＦ／因子ＶＩＩＩ濃縮物ヘマート（Haemate）（登録商標）の４つの異なる希釈倍率の希釈を試料として使用した。リストセチンの非存在下（０ｍｇ／ｍｌ）に、ＶＷＦの強い濃度依存性の結合は、突然変異体ＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）を用いた場合に生じる（上図）。該結合はリストセチンを添加することにより若干増加し得るが、これは恐らくＧＰＩｂαなしでも起こる非特異結合によるものである。対照的に、同様に強いＶＷＦ結合は、１.２ｍｇ／ｍｌのリストセチンを添加することによってのみ野生型ＧＰＩｂαで達成し得る。リストセチンの添加なしでは、野生型ＧＰＩｂαの使用でも結合は見られない（下図）。
【図２】リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析による、ヒトシトレート血漿試料中のＶＷＦ活性（１０％〜２００％ＶＷＦ活性）を測定する検量線（実施例５を参照）。粒子凝集速度は、ＶＷＦ活性の関数として表される。
【図３】リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析による、ヒトシトレート血漿試料中の低いＶＷＦ活性（≧３％ＶＷＦ活性）を測定する検量線（実施例５を参照、試料：４５μｌ）。粒子凝集速度は、ＶＷＦ活性の関数として表される。
【図４】異なるＶＷＦ濃度（１４.９％から１４９.６％まで）の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるツィーン(登録商標) 20濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、ツィーン（登録商標）20濃度の変動、試料：１５μｌ）。
【図５】異なるＶＷＦ濃度（８％から４０％）の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるテシット濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、しかしツィーン（登録商標） 20の代わりテシット、試料：４５μｌ）。
【図６】試料がＶＷＦ欠乏血漿又は緩衝液で予備希釈された、異なるＶＷＦ濃度の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるテシット濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、しかしツィーン（登録商標）20の代わりにテシット、試料：４５μｌ）。
【００５９】
下記に記載の実施例は、本発明の個々の態様を実例により説明するために使用するものであり、それに限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００６０】
〔実施例１〕
ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）構成体のクローニング
ｐＩＲＥＳのｎｅｏ２発現ベクター(BD Biosciences, Clontech, Art. No.: 6938-1) を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限切断部位間に３×Ｆｌａｇタグ及び６×Ｈｉｓタグを組み込むように修飾した。シグナルペプチド（配列番号２）及びヒトＧＰＩｂα受容体(配列番号１)のアミノ酸１〜２８５をコードし、そしてアミノ酸位置２３３と２３９をコードする部位でのバリンコード化コドンを含むフラグメントを、タグ配列の上流（５′）に挿入した。
【００６１】
〔実施例２〕
ＨＥＫ細胞における組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞；ＡＴＣＣ番号；ＣＲＬ−１５７３；Cell Lines
Service CLS, Heidelberg, Germany）を、実施例１に記載の構成体でトランスフォーム
した。
【００６２】
細胞は以下の培地で培養した：
ＤＭＥＭ（Art. No.: 31966-021, Invitrogen)；
＋１０％ＦＢＳ Origin EU (Art. No.: 10270-106, Invitrogen)、熱不活化；或いは１０％ＦＢＳ Origin USA (Art. No.: A15-003, Lot No.: A01123-678, PAA) ；
＋１％抗生物質抗真菌性溶液 (１００×) (Art. No.: P11-002, PAA)；
＋０．１％ゲンタマシン溶液５０ｍｇ／ｍｌ (Art. No.: P11-005, PAA)；
＋５００μｇ／ｍｌゲネチシン(Ｇ４１８) 溶液５０ｍｇ／ｍｌ活性ゲネチシン (Art. No. 10131-027, Invitrogen)。
【００６３】
発現(生産)用として：
OPTIPRO-SFM (Art. No.: 12309-019, Invitrogen)；
＋０．５％抗生物質抗真菌性溶液 (１００×) (Art. No.: P11-002, PAA)；
＋０．０５％ゲンタマシン溶液５０ｍｇ／ｍｌ (Art. No.: P11-005, PAA)；
＋２％ Glutamax I (１００×) (Art. No.: 35050-038, Invitrogen)；
及びゲネチシンなし。
【００６４】
操作は以下の通り：
１)細胞（５〜１０×１０6細胞を含有する１「Kryo」）の解凍、そして血清含有培地中Ｔ１７５での９６時間の培養；
２）４×Ｔ１７５へ分割、そして７２〜９６時間の培養；
３）２５×Ｔ１７５へ分割、そして７２〜９６時間の培養；
４）１つのＴ１７５の分割、そして予備としてのその持続的培養。残りの２４×Ｔ１７５の３×CellStack Corning (CellStack当り１０レベル、合計で６，３６０ｃｍ2) への分割、そして７２時間の培養；
５）培地の除去、ＦＢＳのないＤＭＥＭによる単層の１〜２×洗浄及び無血清OPTIPRO-SFM (CellStack当り１.８リットル) の添加、そして９６時間の培養；
６）培地の採取。遠心分離による上清の除去及び剥離細胞ペレットの再懸濁、及び新鮮OPTIPRO-SFM によるCellStackへのそれらの戻し、そして９６時間の培養；
７）６）に同じ；
８）培地の最終採取及び培養停止。
【００６５】
〔実施例３〕
親和性クロマトグラフィーによる組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質の単離
実施例２で得られたＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）含有培地にまだ残存している細胞又は細胞残屑は、遠心分離によって除去した(３５分、１０，０００ｒｐｍ、Beckman J2-21, Beckman Coulter GmbH, Germany)。このようにして得られた無細胞上清は、１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過カセットを用いて接線フロー限外濾過により、当初の容積の１／１０に濃縮した（PES 10, Schleicher & Schull, Germany)。
【００６６】
精製は、メーカー資料により、Ｎｉ2+−Sepharose (His Prep FF16/10, GE Healthcare, Sweden) を用いて親和性クロマトグラフィーで実施した。ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、濃縮上清に５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4及び５ｍＭのイミダゾールを加え、そして５ＭＨＣｌを加えることによりｐＨ７．４にｐＨ調整して結合させた。非結合成分は、５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭのイミダゾールのｐＨ７．４緩衝液でカラムを洗浄処理することにより洗い流した。結合したＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4、５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、５００ｍｍｏｌのイミダゾールのｐＨ７．４緩衝液で溶離した。このようにして得られた溶離液は、１０ｋＤａのカットオフの限外濾過膜（OMEGA 10 K, Pall Life Sciences, USA）により撹拌限界濾過セル中で当初の容積の１／１０に濃縮した。更なる精製及び不純物の除去は、Superdex 200 prep grade 35/600 (GE Healthcare, Sweden) クロマトグラフィーカラムを用いたゲル濾過により、メーカー資料に従って実施した。クロマトグラフィーは、０．０４８ｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０．０２ｍｏｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、０．１４５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、０．０１５ｍｏｌ／ｌのＮａＮ3のｐＨ７．２緩衝液を用いて５.０ｍｌ／分の流速で実施した。試料を注入後、ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、ほぼ３００ｍｌの溶離容積後のピーク中に、使用クロマトグラフィーカラムから溶離した。
【００６７】
〔実施例４〕
リストセチンなしの抗ＦＬＡＧ／ＧＰＩｂαのＥＬＩＳＡにおけるＶＷＦ活性を測定する本発明の方法
Ｆｌａｇタグ（Sigma, Saint Louis, USA, ANTI-FLAG HS, M2 コーティング９６ウェルプレート(透明)、製造番号 Ｐ２９８３）に対する抗体で前もってコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、１００ｍｌの組換え野生型ＧＰＩｂα−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質（細胞沈降後の培養培地の１：１０希釈上清）を含むリン酸緩衝液、又は単離ＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質（実施例３を参照）を２.４μｇ／ｍｌの濃度で充填し、その後２〜８℃で一夜インキュベーションした。リン酸緩衝液(＋０.０１％のツィーン（登録商標）20)で４回洗浄後、リン酸緩衝液＋０.１％ウシ血清アルブミン中での５０μlのヘマート（Haemate）（登録商標）(ZLB Behring, Marburg, Germany)の希釈液、及びリン酸緩衝液＋０.１％ウシ血清アルブミン中での５０μlのリストセチン希釈液を加えた。続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。上記のように４回洗浄後、１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ＶＷＦ抗体（ウサギ抗ヒトＶＷＦ／ＨＲＰ、DAKO, Ref. P0226）を加え、その後室温で１時間インキュベーションして引き続き上記のように洗浄した。その後、基質として１００μｌのテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ基質、Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany, Ref. 450684）を加え、続いて室温で４分間インキュベーションした。反応は１００μｌの０.５Ｎ硫酸を加えることにより停止させた。５０４ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。
【００６８】
リストセチンの非存在下、実施例１〜３により調製した突然変異体ＧＰＩｂαの使用時に、ＶＷＦの強い濃度依存性結合が生じた。リストセチンの添加は該結合を若干増加させたが、これは恐らくＧＰＩｂαなしでも起こる非特異結合に起因し得る。対照的に、同様に強いＶＷＦ結合が、１.２ｍｇ／ｍｌのリストセチンを加えることによってのみ野生型ＧＰＩｂαで達成し得た。リストセチンの添加なしでは、野生型ＧＰＩｂαの使用でも結合は見られなかった（図１）。
【００６９】
〔実施例５〕
リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析におけるＶＷＦ活性を測定する本発明の方法
３種の試薬を調製した。
試薬１：
モノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体のＶＭ１６ｄ（Sanbio B.V., Uden, Netherlands: 製品番号ＭＯＮ１１４６）をラテックス粒子表面に結合し、そして後者を長期保存のために緩衝液（０.６ｇ／ｌＴＲＩＳ、１.１％ロイシン、１２．５％蔗糖、０．０５％ＨＳＡ、６．２５ｍｇ／ｌゲンタマイシン及び０.６２５ｍｇ／ｌアンホテリシン、ｐＨ８．２５、ラテックス濃度０．２２％）中に再懸濁した。
【００７０】
試薬２：
ＶＷＦ欠乏血漿。
試薬３：
以下の成分を混合して総量３０ｍｌの試薬３を得た：
２．５ｍｌのリン酸緩衝液中ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）(Fluka, Germany) の７.５％強度溶液（ｐＨ７．１）；
１２.９ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．１）中１２.９ｍｌ（０.６２５ｍｇ／ｍｌ）のヘテロフィリック遮断試薬１(Scantibodies Laboratory Inc, Santee, CA 92071, USA)；
３.４ｍｌのリン酸緩衝液中２１ｇ／ｌのツィーン（登録商標） 20 (Sigma, St. Louis, Missouri, USA）を含有する溶液（ｐＨ７．２）；
０．０８６ｍｌのリン酸緩衝液中５.５９ｍｇ／ｍｌの組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）（実施例３を参照）の溶液（ｐＨ７．１）；及び
１１.２ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）。
【００７１】
分析は、BCS（登録商標）自動凝固分析計 (Behring Coagulation System, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany）で実施した。１５μｌのヒトシトレート血漿試料、３０μｌの試薬２及び７０μｌの試薬３を混合した。反応は４０μｌの試薬３を混合しながら加えることにより開始させた。反応混合物の吸光度を５７５ｎｍで連続的に測定した。ラテックス粒子凝集速度は、試料中のＶＷＦ活性の関数であった。
【００７２】
ＶＷＦ活性は、標準ヒト血漿（Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany）を用いて検量線を作成することによって算出した。使用したＶＷＦの目標値はBCS（登録商標）システムに対する公表リストセチン補因子値であった。標準ヒト血漿量を増加し、そして同時に対応する量の試薬２を減少させることによって、２００％までのＶＷＦ活性が生じた。標準ヒト血漿を試薬２で希釈することにより、低いＶＷＦ活性が生じた。図２は標準的な検量線を表す。試料のＶＷＦ活性は、測定した反応速度を用いて検量線から読み取ることができた。
【００７３】
試料中の特に低いＶＷＦ活性を測定するために、１５又は３０μｌの試料よりはむしろ４５μｌの試料（上記を参照）が分析ミックスで使用された。キャリブレーションには、３％までの低いＶＷＦ活性が生じるように、標準ヒト血漿を試薬２で希釈した。この方法は、分析において極端に低いＶＷＦ活性を正確に測定することができ、これはフォンビルブラント症候群のサブタイプを分類するためにＶＷＦ活性／抗原比を算出するのに特に重要である。ＶＷＦ依存性凝集は、反応混合物においてＰＶＰ濃度を０.３５％に、そして試料量を６０μｌに増加させることにより更に増幅することができ、ひいては１％ＶＷＦ及び０％ＶＷＦでも識別することを可能にした。結果として、タイプ３フォンビルブラント病（０％ＶＷＦ）を、他のタイプの大規模欠乏症（例えば１〜５％）と高い信頼性で識別し得た。
【００７４】
〔実施例６〕
ＶＷＦ基質として尿素前処理した高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する本発明の方法
１．反応緩衝液：１ｍｍｏｌ／ｌのPefabloc SC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)、１２.５ｍｍｏｌ／ｌのＢａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ、ｐＨ８.０；
２．基質緩衝液の調製及び室温で正確に５分間のインキュベーション：８.３Ｕ／ｍｌ
（８３０％）の高分子量多量体組換え生産ＶＷＦ−Ｐ１６４８Ｓ、４．６ｍｏｌ／ｌの尿素、４．６ｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０；
３．１５μｌのヒト血漿試料を３００μｌの反応緩衝液と混合し、次いで１５０μｌの基質緩衝液と混合する；
４．３７℃で４から８時間の分析混合物のインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７５】
〔実施例７〕
ＶＷＦ基質として尿素前処理した組換え高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する本発明の方法
１．６μｌのヒト血漿試料（反応緩衝液で１：６に希釈、実施例６を参照）を２０μｌの反応緩衝液と混合する；
２．ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを活性化するために、３７℃で５分間の混合物のインキュベーション：
３．１２μｌの基質緩衝液（５Ｕ／ｍｌ（５００％）の組換え高分子量多量体ＶＷＦ−Ｐ１６４８Ｓ、５ｍｏｌ／ｌの尿素、５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の添加；
４．３７℃で２０分間の分析ミックスのインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７６】
〔実施例８〕
ＶＷＦ基質として高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いてＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定し、そしてＡＤＡＭＴＳ−１３分解あり／なしとの差を算出する本発明の方法
分析１：
１．１０μｌのヒト血漿試料を、２０μｌのＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼ活性化緩衝液（１８.７５ｍｍｏｌ／ｌのＢａＣｌ2、ｐＨ８．０、５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１.５ｍｍｏｌ／ｌのPefabloc SC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)）と混合する；
２．３７℃で５分間の混合物のインキュベーション：
３．５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、ｐＨ８．０で１．２５Ｕ／ｍｌ（１２５％）の組換えＶＷＦ基質（Ｐ１６４８Ｓ）を含む２０μｌの添加；
４．３７℃で２０分間の分析ミックスのインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７７】
分析２：
別の１０μｌの同じヒト血漿試料を分析１のように処理したが、３７℃で２０分のインキュベーション工程（工程番号４を参照）を行なわず、ＶＷＦ活性を、ＶＷＦ基質（Ｐ１６４８Ｓ）の添加直後に、この反応混合物を試料として用いて実施例５のように測定するという点が異なった。分析１及び分析２のＶＷＦ活性の差は、分解したＶＷＦ活性の量、従って、ＡＤＡＭＴＳ−１３の活性を与えた。血漿試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３の活性は、その値からキャリブレーションに基づき定量した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断の分野にあり、そして試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の活性をインビトロで測定する方法に関する。本方法は、ＧＰＩｂαタンパク質の突然変異機能獲得型変異体の使用を含み、それによりリストセチン、ボトロセチン、又は別のリストセチン−若しくはボトロセチン−等価物質の使用を省略することを可能にする。本発明は、更に、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）は、一次止血の過程において重要な機能を有する、血漿中の高分子量多量体糖タンパク質である。ＶＷＦは、とりわけ血小板表面に位置するコラーゲン及び糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）に対する結合部位を有する。ＧＰＩｂは内在性膜タンパク質であり、それは、別の内在性膜タンパク質、糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）と共に、血小板膜において糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ−受容体複合体を形成する。ＧＰＩｂは、約１４５ｋＤａの見かけの分子量を有する重鎖（同義語：α鎖又はＧＰＩｂα）、及び約２２ｋＤａの見かけの分子量を有する軽鎖（同義語：β鎖又はＧＰＩｂβ）を含む２重鎖分子であり、互いにジスルフィド結合により連結されている［非特許文献１］。
【０００３】
血管損傷の場合、コラーゲン表面は露出し、そこにＶＷＦが結合する。コラーゲンへのその結合に因り、そしてコラーゲン結合ＶＷＦに作用するずり応力増加の影響下で、ＶＷＦは、それが血小板膜のＧＰＩｂ−ＩＸ−受容体複合体中のＧＰＩｂ重鎖（ＧＰＩｂα）のアミノ末端に結合し得るように変化し又は活性化される。このようにして、活性化ＶＷＦは通過する血小板を捕捉し、損傷部位でＶＷＦ、コラーゲン及び血小板の最初の凝集形成をもたらす。続いて、血小板が活性化され、それにより、複数の増幅カスケード及び更なる血小板の付着後に、最終的に創傷閉塞をもたらす血漿凝固が開始する。
【０００４】
定性的又は定量的ＶＷＦ障害は、最も一般的な遺伝性出血性病態の１つとして、「フォンビルブラント症候群」（同義語：フォンビルブラント病、ＶＷＤ）の原因である。種々のスクリーニング法が、例えば出血時間（ＢＴ）を測定することなど、例えばＥＬＩＳＡ法などのＶＷＦ抗原濃度（ＶＷＦ：Ａｇ）を測定する定量法、及び例えばリストセチン誘発血小板凝集（ＶＷＦ：ＲＣｏ）などのＶＷＦを測定する方法など、フォンビルブラント症候群を診断するのに利用可能である。
【０００５】
リストセチン補因子分析ともいわれる、安定化血小板のリストセチン誘発凝集方法は、ＶＷＦ抗原濃度を測定する定量法によって検出されないＶＷＦタンパク質のそれらの機能的欠陥も識別する。従って、フォンビルブラント症候群の完全診断には、リストセチン補因子活性を測定するためのリストセチン補因子分析を行なうことが必要になる。リストセチン補因子分析は、通常患者血漿試料を固定血小板と、及びリストセチンと混合することにより行われる。リストセチンは、試料中に存在するＶＷＦの、加えた血小板のＧＰＩｂ受容体への結合を誘発し、血小板の凝集をもたらす。この凝集反応の程度は患者試料中に存在する活性ＶＷＦの量と相関する。該凝集反応は、例えば、透過率の増加を測定することにより光学的に記録され、それによりＶＷＦ：ＲＣｏ活性を定量化し得る。
【０００６】
ＶＷＦ抗原分析に比べて、リストセチン補因子分析はＶＷＦ活性を測定する利点を有し、従って機能的ＶＷＦ障害を、及びフォンビルブラント症候群の種々サブタイプの分類を、そのうちのいくつかだけはＶＷＦ抗原濃度低下を伴うが、識別することを可能にする。該サブタイプは、しばしばＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）とＶＷＦ抗原濃度（ＶＷＦ：Ａｇ）の比を計算することによって分類される。１未満のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比は、フォンビルブラント症候群サブタイプ２Ａ、２Ｂ及び２Ｍに特徴的である。通常推奨される閾値は０.７の比である。
【０００７】
古典的リストセチン補因子分析の欠点は、分析ミックス中の血小板を測定中常時撹拌しなければならないことから、自動化が困難なことである。もう１つの欠点は、分析の相対的精度の悪さ、及び標準変量の０％と２０％の間の範囲内の低いＶＷＦ活性に対する不十分な定量性である。
【０００８】
最近では、アミノ末端ＶＷＦ結合領域を含有する組換えＧＰＩｂαフラグメント（それぞれ１〜２８９及び１〜２９０）を利用する、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡが開発されている［特許文献１又は非特許文献２、非特許文献３］。これらの分析は、特異的な抗体を用いて組換えＧＰＩｂαフラグメントをＥＬＩＳＡプレートに結合することを必要とする。患者試料のＶＷＦが組換えＧＰＩｂαフラグメントに結合できるように、患者試料及びリストセチンが添加される。最後に、結合したＶＷＦは、抗ＶＷＦ抗体を用いて定量的に検出される。この種のＶＷＦのＥＬＩＳＡは、古典的な血小板ベースのＶＷＦリストセチン補因子活性分析の結果と非常によく相関し、そしてより高感度でかつより高精度でもあることが示されている。
【０００９】
非特許文献４は、位置２３３及び２３９に突然変異を有する組換えＧＰＩｂαフラグメント（１〜４８３）を利用する、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡを記載している。これらの突然変異は、低濃度リストセチンの存在下にＶＷＦに対して高親和性を有し、そして野生型ＧＰＩｂαタンパク質よりも強くＶＷＦと相互作用することが知られている機能獲得型変異である（特許文献２）。前記の突然変異は、ＧＰＩｂα鎖のよく知られた突然変異体である。バリン残基によるＧＰＩｂα鎖の位置２３３のグリシン残基の置換（Ｇ２３３Ｖ）は、Millerら（特許文献３）により記載されている。該突然変異は、常染色体優性遺伝性出血病態である、血小板型フォンビルブラント症候群（ＰＩ−ＶＷＤ）の原因である。バリン残基によるＧＰＩｂα鎖の位置２３９のメチオニンン残基の置換（Ｍ２３９Ｖ）は、Russell & Roth［非特許文献５］により記載されている。この突然変異はＰＴ−ＶＷＤも引き起こす。
【００１０】
不利なことには、ＧＰＩｂαベースのＶＷＦのＥＬＩＳＡ及びリストセチン補因子分析も、また、リストセチン又はＧＰＩｂα鎖へのＶＷＦの結合を仲介する他の内因性の非生理学的モジュレータの使用をベースとすることである。細菌Nocardia lurida の糖タンパク質系抗生物質のリストセチン、及びBothrops属蛇毒のボトロセチン（同義語: 共同凝集素）は、血小板又は単離したＧＰＩｂαタンパク質若しくはそのフラグメントに対するＶＷＦの結合を、インビトロで誘発するのに用いられることが知られている。リストセチンの使用は、それがＶＷＦだけでなく、多くの他のタンパク質、例えばフィブリノーゲン又はさもなければ抗ＧＰＩｂα抗体にも結合し得るという欠点を有する（幾つかの実験で認められている）。従って、ＶＷＦ分析におけるリストセチンの使用は、試験結果を歪め得る非特異結合反応又は沈降反応が起こるリスクがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開公報第０１／０２８５３（Ａ２）号
【特許文献２】国際公開公報第９３／１６７１２号
【特許文献３】Miller et al. 米国特許第５３１７０９７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Lopez, J.A. et al. (1987), Cloning of the α chain of human platelet glycoprotein Ib: A transmembrane protein with homology to leucine-rich α2-glycoprotein（ヒト血小板糖タンパク質Ｉｂのα鎖のクローニング：ロイシンに富むα2糖タンパク質と相同性の膜貫通タンパク質）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5615-5619
【非特許文献２】Vanhoorelbeke, K. et al. (2002), A reliable von Willebrand factor: Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type 1 and type 2 von Willebrand disease（信頼性の高いフォンビルブラント因子：１型及び２型フォンビルブラント病を鑑別するリストセチン補因子酵素免疫吸着法）, Semin Thromb Hemost. 28(2): 161-165
【非特許文献３】Federici, A.B. et al. (2004), A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein Ibα for the diagnosis of patients with low von Willebrand factor levels（低レベルのフォンビルブラント因子を有する患者の診断用の組換え糖タンパク質Ｉｂαによるリストセチンの高感度補因子活性分析）, Haematologica 89(1): 77-85
【非特許文献４】Hui et al. (Abstract, ISTH 2007)
【非特許文献５】Russell, S.D. & Roth, G.J. (1993), Pseudo-von Willebrand Disease: A mutation in the platelet glycoprotein Ibα gene associated with a hyperactive surface receptor（仮性フォンビルブラント病：高活性表面受容体に関連する血小板糖タンパク質Ｉｂα遺伝子の突然変異）, Blood 81(7), 1787-1791
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、リストセチンの非存在下に実施し得る、ＶＷＦの活性を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、ヒトＧＰＩｂα受容体のアミノ酸配列に基づき、位置２３３及び２３９に２点の突然変異を有するＧＰＩｂα鎖の機能獲得型変異体を用いることにより達成された。ＧＰＩｂα鎖の機能獲得型変異体は、本発明に従って、ＶＷＦに有意により高い親和性を有し、そして低濃度リストセチンの存在下に野生型ＧＰＩｂαタンパク質より強くＶＷＦと相互作用することが知られている突然変異体を意味する。
【００１５】
本発明の主題は、試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の活性を測定する方法であって、該試料を単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合して分析試料を得、かつ、その分析ミックスにリストセチンもボトロセチンも加えないことを含む方法である。使用するＧＰＩｂαタンパク質は、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列に比べて、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そして位置２３３及び２３９に置換Ｘａａを有するアミノ酸配列（配列番号１）を含む。ＧＰＩｂαの位置２３３のグリシン残基及び位置２３９のメチオニン残基の置換Ｘａａは、バリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｖ及びＭ２３９Ｖ）又はセリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｓ及びＭ２３９Ｓ）であることが好ましい。２つの位置における該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。本発明の明細書におけるＧＰＩｂαタンパク質への言及は、このような突然変異体への言及を意味する。
【００１６】
更に、「リストセチン−又はボトロセチン−等価物質」が、分析混合物に加えられないことが好ましい。用語「リストセチン−又はボトロセチン−等価物質」は、本発明に従って、野生型ＧＰＩｂα鎖又はそのフラグメントに対する溶解ＶＷＦのインビトロ結合を誘導することができる、外因性、即ち、非生理的物質を意味する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の利点は、ＧＰＩｂαの機能獲得型変異体を用いることにより、例えば、流動、撹拌又は振盪で分析ミックスにせん断応力をかけることをなくし得ることである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「試料」は、ＶＷＦ活性の測定法に関する限りでは、検出すべき物質、即ち、ＶＷＦを含むことが疑われる材料を意味する。用語「試料」は、例えば血液、血漿又は血清などの、特にヒト及び動物の生体液、及びまた例えばＶＷＦ標準物質若しくはＶＷＦ対照、又は例えばフォンビルブラント症候群患者の補充療法のために設計される高濃縮のＶＷＦ濃縮物などの工業生産製品をも含む（例えば、Haemate P（登録商標））。適切な場合、試料は検体を検出方法に利用し易く、そして妨害する試料成分を取り除くために前処理する必要がある。そのような試料の前処理方法としては、細胞の除去及び／又は溶解又は試料の遠心分離を含んでもよい。用語「試料」は、上記試料材料の任意のものを含む反応混合物をも含み、それに対して単離ＶＷＦがＶＷＦ修飾因子の活性を測定する基質として加えられ、そして残存ＶＷＦ活性が該ＶＷＦ修飾因子と該ＶＷＦ基質のインキュベーション後に測定される。そのような混合物の例は、例えば血漿試料におけるＶＷＦ切断性ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを測定するための、分離高分子量ＶＷＦと血漿試料の混合物である。血漿試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼは、添加されたＶＷＦ基質を切断し、従って試料のＶＷＦ活性を低下させる。
【００１９】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂα鎖は、組換え的又は合成的に生産されるＧＰＩｂαタンパク質であってよい。例えば、細菌（例えば、 E. coli)、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)、植物、動物又はヒト細胞培養での発現などの公知の原核生物又は真核生物の発現系は、組換えＧＰＩｂαタンパク質を生産するのに有用である。例えば、固相合成（例えば、メリフィールド合成）などのインビトロタンパク質合成の公知技術は、合成的ＧＰＩｂαタンパク質を生産するのに好適である。本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくはヒト細胞の培養、好ましくはヒト胚性腎臓細胞（HEK細胞）の培養で生産されている、組換え生産ＧＰＩｂαタンパク質である。
【００２０】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で相同ヒトＧＰＩｂαシグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号２、アミノ酸残基−１６から−１とも呼ばれる）に融合してもよい。或いはまた、使用するＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で異種シグナル配列に、即ち、通常はヒトＧＰＩｂαポリペプチドに存在せず、選択された発現系において組換え発現したＧＰＩｂαタンパク質の発現及び／又は分泌に対して有利な影響を有するポリペプチドに融合してもよい。好適な異種シグナル配列は、例えば、ＭＰＬＱＬＬＬＬＬＩＬＬＧＰＧＮＳＬＱＬＷＤＴＷＡＤＥＡＥＫＡＬＧＰＬＬＡＲＤＲＲ（配列番号３）である。
【００２１】
更に、本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｃ末端で、例えば、組換え発現タンパク質が親和性担体に結合することを可能にするような、それにより、例えば、組換え発現ＧＰＩｂαタンパク質を精製するか、さもなければ組換えＧＰＩｂαタンパク質が固相に結合するのを可能にするような、１つ又はそれ以上の親和性タグに融合してもよい。わずか１２アミノ酸長さの小さい親和性タグが好ましい。Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ及びＳｔｒｅｐタグから成る群からの親和性タグが特に好ましい。高親和性を有する親和性タグに結合する好適な親和性担体の例は、特異抗体、固定化カチオン（例えば、Ｈｉｓタグに親和性を有するＮｉ2+）又は他のタイプの結合パートナー（例えば、Ｓｔｒｅｐタグに親和性を有するストレプトアビジン）である。
【００２２】
本発明の１つの実施態様では、ＧＰＩｂαタンパク質は固相で結合する。用語「結合」は広い意味を有し、そして、例えば、共有及び非共有結合、直接及び間接結合、表面への吸着及び窪みへの包接を含む。共有結合では、単離ＧＰＩｂαタンパク質は固相へ化学結合を経て結合する。非共有結合の例は表面吸着である。固相への直接結合に加えて、単離ＧＰＩｂαタンパク質は、固相への他の特異的結合パートナーとの特異的な相互作用を経て、例えば、抗体と、好ましくは抗ＧＰＩｂα抗体と、又は−単離ＧＰＩｂαタンパク質が親和性タグを有する場合−抗親和性タグ抗体との特異的な相互作用を経て、間接的にも結合し得る。
【００２３】
本発明による用語「固相」は、多孔性及び／又は非多孔性、水不溶性材料から成り、かつ、例えば、容器、チューブ、ミクロ滴定プレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ビーズ、微粒子、ロッド、ストリップ、濾紙、クロマトグラフィーペーパーなどの非常に様々な形状を有してもよい物を含む。固相の表面は、標準的には親水性であるか又は親水性にし得るものである。固相は、例えば、無機及び／又は有機材料、合成材料、天然及び修飾天然材料などの非常に様々な材料から成り得る。固相材料の例は、例えば、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレート又はナイロンなどのポリマー；ラテックス；セラミックス；ガラス；金属、特に金及び銀などの貴金属；マグネタイト；それらの混合物又は組み合わせである。
【００２４】
固相は、例えば、固相に対する試料成分の非特異的な結合を抑制又は防止するために、又は例えば微粒子固相の懸濁安定性、保存安定性、デザイン安定性又はＵＶ光、微生物若しくは他の破壊剤への抵抗性を向上させるために、１つ又はそれ以上の層、例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー又はそれらの混合物のコーティングを有してもよい。
【００２５】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の好ましい実施態様は、粒子結合ＧＰＩｂαタンパク質、好ましくはラテックス粒子結合ＧＰＩｂαタンパク質の使用、及び微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づく該ＶＷＦ活性の測定を含む。抗体を経て微粒子固相に結合したＧＰＩｂαタンパク質の使用が好ましい。この目的に好適なものは、抗ＧＰＩｂα抗体、特にモノクローナル抗体ＶＭ１６ｄ［Mazurov, A.V. et al. (1991), Characterization of an antiglycoprotein Ib monoclonal antibody that specifically inhibits platelet-thrombin interaction（血小板−トロンビン相互作用を特異的に阻害する抗糖タンパク質Ｉｂモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション）, Thromb Res. 62(6), 673-684; 例えば、 Sanbio B.V., Uden, Netherlandsから市販: 製品番号 MON 1146］、及びＳＺ−２ ［Ruan, C. et al. (1987), A murine antiglycoprotein Ib complex monoclonal antibody, SZ 2, inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen （マウス抗糖タンパク質Ｉｂ複合体モノクローナル抗体、ＳＺ−２はリストセチン及びコラーゲンの両方により誘発される血小板凝集を阻害する）, Blood 69(2), 570-577; 例えば、Beckman Coulter Inc., Fullerton, USAから市販: 製品番号 IM0409］である。使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合している場合、抗Ｆｌａｇ抗体は同様に好適である［例えば、 米国特許第５０１１９１２号を参照; 例えば、Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germanyから市販］。試料中に存在するＶＷＦの量又は活性と相関する凝集反応は、例えば、散乱光の強度を測定することを介して（比濁法）、又は培地の濁度を測定することを介して（混濁度法）、粒子凝集体へ光散乱を用いることにより定量的に測定し得る。
【００２６】
界面活性剤の存在下に、好ましくは、ツィーン（Tween）（登録商標）20、テシット（Thesit）、トリトン（Triton）界面活性剤 (例えば、トリトン X-100（登録商標）又はトリトン X-405（登録商標）) 及びドデシル硫酸ナトリウム (ＳＤＳ)から成る群からの界面活性剤の存在下に、微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づくＶＷＦ活性を測定することが好ましい。界面活性剤の存在は、微粒子固相の、特にラテックス粒子のＶＷＦに依存した凝集速度に影響することが見出された。
【００２７】
凝集速度を、種々のＶＷＦ濃度で、そしてツィーン（登録商標）20の濃度を増加させて測定した（図４を参照、実施例５に類似の方法で測定）。反応の増幅は、特に相対的に低濃度（０．０２〜０.１ｇ／ｌ）のツィーン（登録商標）20で顕著であり、ツィーン（登録商標）20の濃度の増加と共に再び減少し、そして安定レベルに達することが明らかである。例えば、１４９.６％ＶＷＦでは、安定な増幅レベルはおよそ１ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20で到達し、その時の増幅はツィーン（登録商標）20なしでの初期値の８５％である。従って、界面活性剤としてツィーン（登録商標）20を用いる場合２つの可能性がある。第一に、ツィーン（登録商標）20濃度は、特定のＶＷＦ濃度を２０％まで特に強く増幅させるために低く（０．０２〜０.１ｇ／ｌ）設定し得る。例えば、０．０５ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20（分析混合物中で）では、凝集速度は３０.４％のＶＷＦにより２１６％増幅される。低いＶＷＦ濃度は特に測定が難しいことから、反応の増幅はこの場合非常に有用である。第二に、測定系をすべての適切なＶＷＦ濃度に対して界面活性剤の飽和領域で実施する場合に、一般的により安定である。これは、例えば、０．０５ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20以上の場合である。この変形は、広範囲のＶＷＦ濃度に対するスクリーニング分析に対して好適である。０．６〜２０．０ｇ／ｌ、好ましくは１ｇ／ｌのツィーン（登録商標）20濃度は、２０％を超えるＶＷＦ濃度を測定するために、凝集反応を増幅させるべき場合に有利である。
【００２８】
テシット（同義語: Polidocanol, Schaerer & Schlaepfer Ltd., Rothrist, Switzerland）、トリトン界面活性剤（例えば、トリトン X-100（登録商標）又はトリトン X-405（登録商標）)、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの他の界面活性剤は、凝集反応の増幅において、定常的な濃度依存性増加を示す（図５を参照、実施例５に類似の方法で測定：４５μｌの試料、しかしツィーン（登録商標）20の代わりにテシットを使用）。
【００２９】
血漿試料のＶＷＦ活性は、あらかじめ該試料を希釈することにより、通常緩衝液又はＶＷＦ欠乏血漿を用いて測定される。検量線を作成するために、同じことが標準血漿（例えば、標準ヒト血漿）に当てはまる。しかしながら、ＶＷＦ欠乏血漿による希釈及び常用界面活性剤濃度（分析ミックス中１ｇ／ｌ）は、十分な界面活性剤により抑制し得るＧＰＩｂαラテックス粒子凝集の望ましくない増幅をもたらすことが見出された。図６に示されるように、４５μｌの試料を含有する分析ミックス中の試料（この場合、標準ヒト血漿）をＶＷＦ欠乏血漿で又は緩衝液で希釈する場合、高い凝集速度が、ＶＷＦ欠乏血漿の存在下の試料中において特定のＶＷＦ濃度で起こる。対照的に、分析系における界面活性剤の完全除去、及びＶＷＦ欠乏血漿による標準ヒト血漿の希釈は、緩衝液での希釈のように低い凝集速度をもたらす。しかしながら、十分な界面活性剤が加えられる場合（例えば、≧３ｇ／ｌテシット）、緩衝液又は欠乏血漿による希釈での凝集速度は同じようになる。このことは、緩衝液での血漿試料の希釈が適切なことを確実にする。分析にとって、標準血漿（標準物質として）の希釈用としても患者試料の起こり得る希釈用としても、ＶＷＦ欠乏血漿を使用しなければならない場合よりもむしろ、単純な緩衝液を使用できることは極めて有利である。緩衝液は安価であり、良好な保存安定性を確実にし、そして多くの自動分析機器は複合分析に対して単一の緩衝液を使用している。更に、ＶＷＦ欠乏血漿は、すべてのラボラトリーにはしばしば利用不能である。ＶＷＦ濃縮物の測定は特に高希釈を必要とし、緩衝液での適切な希釈は同様に非常に有利である。
【００３０】
分析ミックス中ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在下に、好ましくは０.１％から１.０％までのポリビニルピロリドン濃度で、及び／又は分析ミックス中デキストランＴ５００の存在下に、好ましくは０.１％から３％までのデキストランＴ５００濃度で、及び／又は分析ミックス中アルギネート５００〜６００ｃＰの存在下に、好ましくは０.０１％から０．２％までのアルギネート５００〜６００ｃＰ濃度で、微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づきＶＷＦ活性を測定することは更に好ましい。
【００３１】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の別の好ましい実施態様は、競合分析フォーマットである。該方法は、粒子結合抗ＧＰＩｂα抗体、好ましくはＶＭ１６ｄ、及び粒子結合ＶＷＦを反応ミックスに使用すること、並びにＧＰＩｂαタンパク質の添加である。該粒子は、ＧＰＩｂαタンパク質の存在下、及びリストセチン、ボトロセチン又は等価物質の非存在下に凝集する。この凝集反応は、ＶＷＦを含む試料の添加により阻害される。凝集反応の該阻害は、該試料中に存在するＶＷＦの量又は活性と相関する。
【００３２】
ＶＷＦ活性を測定するための本発明の方法の別の好ましい実施態様は、非微粒子固相に結合した、好ましくはマイクロタイタープレートの表面に結合したＧＰＩｂαタンパク質の使用、及び該ＧＰＩｂαタンパク質に結合したＶＷＦ量の測定に基づき、該ＶＷＦ活性を測定することを含む。非微粒子固相に抗体を介して結合したＧＰＩｂαタンパク質を用いることが好ましい。この目的に好適なものは、抗ＧＰＩｂα抗体、特にモノクローナル抗体ＶＭ１６ｄ（上記を参照）及びＭＢ４５ [例えば、 Modderman, P.W. et al. (1992), Glycoproteins form a noncovalent complex in the platelet membrane（糖タンパク質Ｖ及びＩｂ−ＩＸは血小板膜において非共有複合体を形成する）, J. Biol. Chem. 267(1), 364-369、及びその中に引用された２６の参考文献を参照; 例えば、Sanguin, Amsterdam, Netherlandsから市販: PeliCluster CD42b、製品番号 M9142］である。使用されるＧＰＩｂαタンパク質が、Ｃ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合する場合、抗Ｆｌａｇ抗体は同様に好適である［上記を参照］。ＧＰＩｂαタンパク質に結合したＶＷＦの量は、例えば、シグナル生成系の成分と直接的又は間接的に結合する抗ＶＷＦ抗体を用いることにより測定することができ、それによりＧＰＩｂα結合ＶＷＦの量を定量することを可能にする。「活性な」（機能的に無傷の）ＶＷＦのみがＧＰＩｂα受容体に結合することから、この原理に従って算出したＶＷＦ抗原濃度は、ＶＷＦ活性と相関する。
【００３３】
本発明は更に本発明の方法で用いる検査キットであって、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有し、そしてＧＰＩｂαタンパク質が微粒子固相と結合する、アミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質を含有する少なくとも１つの試薬を含む検査キットに関する。ラテックス粒子と結合するＧＰＩｂαタンパク質を含有する試薬を含む検査キットが好ましい。ＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくは抗体を介して微粒子固相に結合する。試薬（reaction）は、液体又は凍結乾燥の形態で提供されてもよい。試薬が凍結乾燥物の場合、検査キットは、更に、例えば、蒸留水又は適切な緩衝液などの該凍結乾燥物を懸濁するのに必要な溶媒を含んでもよい。
【００３４】
本発明は、更に本発明の方法で用いる検査キットであって、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質が結合する、非微粒子固相、好ましくはミクロ滴定プレートを含む検査キットに関する。抗体を介して非微粒子固相に結合しているＧＰＩｂαタンパク質が好ましい。検査キットは、更に、抗ＶＷＦ抗体、好ましくはシグナル生成系の成分と直接的又は間接的に結合している抗ＶＷＦ抗体を含有する試薬を含んでもよい。抗ＶＷＦ抗体を含む試薬は、液体又は凍結乾燥の形態で与えられてもよい。試薬が凍結乾燥物の場合、検査キットは、更に、例えば、蒸留水又は適切な緩衝液などの該凍結乾燥物を懸濁するのに必要な溶媒を含んでもよい。
【００３５】
本発明は、更に、インビトロでフォンビルブラント（ＶＷＦ）活性を測定する方法において、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、いずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の使用であって、該ＶＷＦ活性の測定法においてリストセチンもボトロセチンも用いられない使用に関する。
【００３６】
位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、単離ＧＰＩｂαタンパク質を用いることが好ましい。２つの位置において該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。
【００３７】
本発明は、更に、ヒトＧＰＩｂαタンパク質（配列番号１）の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の取得方法であって、該ＧＰＩｂαタンパク質を組換え技術により原核細胞又は真核細胞の培養で発現させること、そして親和性担体を用いる親和性クロマトグラフィーにより、細胞溶解物又は細胞培養上清から上記ＧＰＩｂαタンパク質を単離することを含む方法に関する。
【００３８】
位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、単離ＧＰＩｂαタンパク質を取得する方法が好ましい。２つの位置において該異なる置換Ｘａａのいずれの組み合わせも可能である。
【００３９】
本発明の別の主題は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法である。
【００４０】
ＡＤＡＭＴＳ−１３（トロンボスポンジンモチーフを有するジスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）は、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をタンパク質分解的に切断し、それによりその活性を低下させるメタロプロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ−１３酵素活性の先天性及び後天性欠乏症は公知であり、例えば、微小循環に悪影響を及ぼす生命にかかわる血栓塞栓性疾患として、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）など種々の疾患を引き起こす。ＶＷＦの過大マルチマーはＴＴＰ患者の血漿中に認められ、そしてＶＷＦに富む血栓及び血小板の形成原因と考えられる。従って、患者試料におけるＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断プロテアーゼ活性を測定することは、診断上重要となる。
【００４１】
先行技術は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定し、そしてＡＤＡＭＴＳ−１３欠乏症を診断する種々の方法を開示している。
【００４２】
Furlan et al. (1996) は、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含有する試料を基質としての精製ヒトＶＷＦとインキュベートし、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動を用いてのＶＷＦマルチマーのその後の分析により、又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）及びその後の免疫ブロット法を用いてのＶＷＦフラグメントの分析により、検出する方法を記載している［Furlan, M., Robles, R. and Laemmle, B. (1996), Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis（フォンビルブラント因子をインビボタンパク質分解によって生産されるフラグメントに切断するヒト血漿由来のプロテアーゼの部分精製及びキャラクタリゼーション）, Blood 87, 10: 4223-4234］。ゲル電気泳動によるこの種類のマルチマー分析は莫大な作業量と時間を必要とし、従って臨床ラボラトリーでの使用には適さない。
【００４３】
他の機能的分析法では、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を基質としてのＶＷＦとインキュベートし、そして次に該ＶＷＦ基質の活性の欠失を測定することにより測定する。ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼが試料中に存在すればするほど、ＶＷＦ基質はますます切断され、従ってＶＷＦ活性はますます反応混合物中に検出し得なくなる。これらの機能的方法の利点は、ＶＷＦ基質を用いること、そして大きなマルチマーの機能の欠失を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのインビボ関連機能を、インビトロでシミュレートする点である。
【００４４】
国際公開公報第２００４／００５４５１（Ａ２）号は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を精製ヒトＶＷＦ基質とインキュベートし、該ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、リストセチン補因子分析を用いて反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性をその後に測定することによって検出する方法を開示している。或いはまた、反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性は、コラーゲン結合分析（例えば、国際公開公報第００／５０９０４号を参照）を用いて分析してもよい。不利なことに、ＶＷＦの十分なタンパク質分解をもたらすために、反応混合物を非常に長時間、時には一夜インキュベートしなければならないことである。６０分という短縮したインキュベーション時間の改良法が、Kostousov, V., Fehr, J., Bombeli, T. (2006), Novel, semi-automated, 60-min-assay to determine von Willebrand factor cleaving activity of ADAMTS-13（ＡＤＡＭＴＳ−１３のフォンビルブラント因子切断活性を測定する新規な半自動６０分の分析）, Thrombosis Res. 118: 723-731に記載されている。
【００４５】
米国特許公開公報第２００７／００６５８９５（Ａ１）号及び米国特許公開公報第２００５／０１８６６４６（Ａ１）号は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含む試料を、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼに対し特異的切断部位を有するペプチドと、又は基質としてのＶＷＦペプチド（フラグメント）とインキュベートし、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのタンパク質分解活性を、ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いてその後に得られるペプチドを分析することにより、そして場合によりその後の免疫ブロット法により検出する方法を開示している。
【００４６】
公知の分析方法は、それらが、例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥによるタンパク質分解から由来する基質フラグメントの分析などの複雑な技術を必要とするか、又は天然のＶＷＦ基質を使用しない点で不利であり、それによりＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼの特定の機能異常が検出し得なくなる可能性がある。
【００４７】
従って、本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法であって、できるだけ多くのＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼの機能異常を該方法により検出することを可能とし、従来の臨床分析機で時間節約的にかつ自動的に行ない得る方法を提供することである。
【００４８】
この目的は、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含むことが疑われる試料を、基質としての単離ＶＷＦと混合して反応混合物を得ることにより達成され、該ＶＷＦ基質は、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異（多型又は突然変異）を有し、その結果該ＶＷＦ基質がいずれの場合も促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解されるＶＷＦモノマーを含む、高分子量マルチマーＶＷＦである。
【００４９】
ヒトＶＷＦモノマーは、インビボにおいて、最初に２８１３アミノ酸前駆タンパク質として合成される。細胞内プロセシングは、２０，０００ｋＤａより大きいサイズとなり得るＶＷＦマルチマーを生成する。これらのマルチマーは、ジスルフィド結合を介して互いに連結した直線状に配列した２７５ｋＤａ、２，０５０アミノ酸ＶＷＦモノマーを含む。ＶＷＦは、約５００ｋＤａ（ダイマー）から１５，０００ｋＤａを超える種々サイズの球状マルチマーの形態で血漿中に循環する。
【００５０】
「高分子量マルチマーＶＷＦ基質」は、本発明に関する限り、１０を超える二量化ＶＷＦ分子を含み、そして当業者に周知のゲル電気泳動法により立証できる、５，０００ｋＤａより大きいサイズのＶＷＦタンパク質を意味する。更に、高分子量マルチマーＶＷＦは、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有し、その結果、いずれの場合にも該ＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解される、ＶＷＦモノマーを含む。
【００５１】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼによるタンパク質分解切断に対するＶＷＦの感受性を増加させる、ＶＷＦタンパク質のアミノ酸配列変異は、先行技術の一部である［例えば、 Hassenpflug, W.A., Budde, U., Obser, T., Angerhaus, D., Drewke, E., Schneppenheim, S., Schneppenheim, R. (2006), Impact of mutations in the von Willebrand factor A2 domain on ADAMTS 13-dependent proteolysis,（ＡＤＡＭＴＳ−１３依存性タンパク質分解に及ぼすフォンビルブラント因子Ａ２ドメインの突然変異の影響）, Blood 107: 2339-2345、又はRayes, J., Hommais, A., Legendre, P., Tout, H., Veyradier, A., Obert, B., Ribba, A.S., Girma, J.P. (2006), Effect of von Willebrand disease type 2B and type 2M mutations on the susceptibility of von Willebrand factor to ADAMTS-13（ＡＤＡＭＴＳ−１３に対するフォンビルブラント因子の感受性に及ぼすＡＤＡＭＴＳ−１３依存性タンパク質分解に及ぼすフォンビルブラント病２Ｂ型及び２Ｍ型の影響）, J. Thromb Haemost. 5: 321-328を参照］。本発明に特に好適なＶＷＦ基質は、以下の群：Ｐ１６４８Ｓ、Ｅ１６３８Ｋ、Ｇ１５０５Ｒ、Ｓ１５０６Ｌ、Ｍ１５２８Ｖ、Ｒ１５６９ｄｅｌ、Ｒ１５９７Ｗ、Ｖ１６０７Ｄ、Ｇ１６０９Ｒ、Ｇ１６２９Ｅ、Ｇ１６３１Ｄ、Ｒ１５９７Ｑ、Ｖ１４９９Ｅ及びＹ１５８４Ｃ；からの少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有するＶＷＦモノマーを含む、高分子量マルチマーＶＷＦを含む。
【００５２】
表示されたアミノ酸の位置は、ＶＷＦ前駆タンパク質（例えば、ＮＣＢＩ登録Ｎｏ.ＡＡＢ５９４５７８、バージョンＡＡ５９４５８.１、ＧＩ：３４０３５６を参照）の２８１３アミノ酸配列を示す。略語「ｄｅｌ」は、対応するアミノ酸残基の欠失を意味する。フォンビルブラント因子の突然変異及び多型の命名法については、Goodeve, A.C., Eikenboom, J.C.J., Ginsburg, D., Hilbert, L., Mazurier, C., Peake, I.R., Sadler, J.E. and Rodeghiero, F. (2001), A standard nomenclature for von Willebrand factor gene mutations and polymorphisms（フォンビルブラント因子の遺伝子突然変異及び多型の標準命名法）, Thromb Haemost. 85: 929-931をも参照されたい。
【００５３】
ＶＷＦの天然に存在する又は人工生成アミノ酸配列変異は、野生型ＶＷＦモノマーから成る高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、それらがいずれの場合にも、得られたＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解される結果をもたらす、即ち、得られたＶＷＦ基質がＡＤＡＭＴＳ−１３に対する高められた感受性を有する結果をもたらす限り、同じように好適であり得る。高分子量マルチマーＶＷＦ基質が、純粋に野生型の高分子量マルチマーＶＷＦ基質よりも速くＡＤＡＭＴＳ−１３によりインビトロでタンパク質分解される場合、即ち、ＶＷＦ基質のより大きなフラグメント化が、例えば、当業者に公知のゲル電気泳動法によって立証し得る、同じインキュベーション条件下で引き起こされる場合、ＡＤＡＭＴＳ−１３タンパク質分解に対する感受性は増加する。
【００５４】
本発明の方法で用いられる単離高分子量マルチマーＶＷＦ基質は、好適なＶＷＦアミノ酸配列変異のヘテロ接合性又はホモ接合性キャリアのドナー血漿から得られるか、又は当業者に公知の方法を用いて組換え発現させてもよい。組換え生産ＶＷＦ基質は、それが分析ミックスに導入される場合に、試験結果を歪め得るようなＡＤＡＭＴＳ−１３汚染が一切ないという点、それが完全に多量体化されている点、そして血漿から単離したＶＷＦの場合にあり得る、それがタンパク質分解されていない点で有利である。
【００５５】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する、本発明の方法の好ましい実施態様では、ＶＷＦ基質の分解は、試料を更にヘパリンと及び／又は単離天然ＧＰＩｂαタンパク質及び／又は組換え野生型ＧＰＩｂαタンパク質と、及びリストセチン又はボトロセチンと混合することにより更に促進され得る。同じ目的で、代わりに、試料は、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含む、組換え又は合成ＧＰＩｂαタンパク質と混合してもよい。好ましくは、使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａは、バリン又はセリン残基を含む。試料をＶＷＦ基質とインキュベートした後に反応ミックス中に残存しているＶＷＦ活性は、種々の方法で、例えば、リストセチン−補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）を測定することにより、又は他の公知の方法により測定してもよい。好ましい実施態様では、反応ミックス中に残存しているＶＷＦ活性は、反応ミックス又はそのアリコートを、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａ（好ましくはＸａａ＝バリン又はセリン残基）を有するアミノ酸配列を含む単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合することにより、そしてリストセチン及びボトロセチンのいずれも加えないことにより測定される。該ＧＰＩｂαタンパク質を、残存ＶＷＦ活性に応じて凝集する微粒子固相に結合させることが特に好ましい。反応混合物中に残存しているＶＷＦ活性は、凝集反応に基づいて測定することができ、その活性がひいては試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ−１３活性に関する情報を提供する。
【００５６】
試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する、本発明の方法の格別な利点は、ＶＷＦ基質を尿素で処理することを省略することができるということであり、尿素の適用は、前処理時のインキュベーションの間、時間を厳守しない場合に、その後ＶＷＦ活性を過度に低く測定するリスクをもたらす。先行技術の種々の方法は、最初にＶＷＦをＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼによる分解がし易くするために、尿素又は類似の変性物質によるＶＷＦ基質の前処理を必要とする（例えば、国際公開公報第２００４／００５４５１（Ａ２）号を参照）。
【００５７】
ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する予定の各々のヒト血漿試料は、試料固有のＶＷＦを含むことから、実際の分析ミックスと並行して第２の分析ミックスの測定を実施することが有利であり、その場合、同じ試料の第２のアリコートは本発明の方法を用いるが、ただしＶＷＦ基質と混合した試料を実際の分析ミックスと同じ時間インキュベートせずに分析され、第２の分析ミックスのＶＷＦ活性は、試料及びＶＷＦ基質を混合した直後に測定される。従って、第２の分析ミックスのＶＷＦ活性（インキュベーション工程なし）と実際の分析ミックスのＶＷＦ活性（タンパク質分解性ＶＷＦ分解のためのインキュベーション工程あり）との差は、実際の分析ミックス中でＡＤＡＭＴＳ−１３により分解されるＶＷＦ活性を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＶＷＦの測定用に本発明で適用されるＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）及び野生型ＧＰＩｂαのＥＬＩＳＡ分析法のデザインは、実施例４に記載されている。ＶＷＦ／因子ＶＩＩＩ濃縮物ヘマート（Haemate）（登録商標）の４つの異なる希釈倍率の希釈を試料として使用した。リストセチンの非存在下（０ｍｇ／ｍｌ）に、ＶＷＦの強い濃度依存性の結合は、突然変異体ＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）を用いた場合に生じる（上図）。該結合はリストセチンを添加することにより若干増加し得るが、これは恐らくＧＰＩｂαなしでも起こる非特異結合によるものである。対照的に、同様に強いＶＷＦ結合は、１.２ｍｇ／ｍｌのリストセチンを添加することによってのみ野生型ＧＰＩｂαで達成し得る。リストセチンの添加なしでは、野生型ＧＰＩｂαの使用でも結合は見られない（下図）。
【図２】リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析による、ヒトシトレート血漿試料中のＶＷＦ活性（１０％〜２００％ＶＷＦ活性）を測定する検量線（実施例５を参照）。粒子凝集速度は、ＶＷＦ活性の関数として表される。
【図３】リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析による、ヒトシトレート血漿試料中の低いＶＷＦ活性（≧３％ＶＷＦ活性）を測定する検量線（実施例５を参照、試料：４５μｌ）。粒子凝集速度は、ＶＷＦ活性の関数として表される。
【図４】異なるＶＷＦ濃度（１４.９％から１４９.６％まで）の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるツィーン(登録商標) 20濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、ツィーン（登録商標）20濃度の変動、試料：１５μｌ）。
【図５】異なるＶＷＦ濃度（８％から４０％）の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるテシット濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、しかしツィーン（登録商標） 20の代わりテシット、試料：４５μｌ）。
【図６】試料がＶＷＦ欠乏血漿又は緩衝液で予備希釈された、異なるＶＷＦ濃度の試料中に、リストセチンなしで、そして分析ミックス中に異なるテシット濃度の存在下でのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析（実施例５を参照、しかしツィーン（登録商標）20の代わりにテシット、試料：４５μｌ）。
【００５９】
下記に記載の実施例は、本発明の個々の態様を実例により説明するために使用するものであり、それに限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００６０】
〔実施例１〕
ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）構成体のクローニング
ｐＩＲＥＳのｎｅｏ２発現ベクター(BD Biosciences, Clontech, Art. No.: 6938-1) を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限切断部位間に３×Ｆｌａｇタグ及び６×Ｈｉｓタグを組み込むように修飾した。シグナルペプチド（配列番号２）及びヒトＧＰＩｂα受容体(配列番号１)のアミノ酸１〜２８５をコードし、そしてアミノ酸位置２３３と２３９をコードする部位でのバリンコード化コドンを含むフラグメントを、タグ配列の上流（５′）に挿入した。
【００６１】
〔実施例２〕
ＨＥＫ細胞における組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞；ＡＴＣＣ番号；ＣＲＬ−１５７３；Cell Lines
Service CLS, Heidelberg, Germany）を、実施例１に記載の構成体でトランスフォーム
した。
【００６２】
細胞は以下の培地で培養した：
ＤＭＥＭ（Art. No.: 31966-021, Invitrogen)；
＋１０％ＦＢＳ Origin EU (Art. No.: 10270-106, Invitrogen)、熱不活化；或いは１０％ＦＢＳ Origin USA (Art. No.: A15-003, Lot No.: A01123-678, PAA) ；
＋１％抗生物質抗真菌性溶液 (１００×) (Art. No.: P11-002, PAA)；
＋０．１％ゲンタマシン溶液５０ｍｇ／ｍｌ (Art. No.: P11-005, PAA)；
＋５００μｇ／ｍｌゲネチシン(Ｇ４１８) 溶液５０ｍｇ／ｍｌ活性ゲネチシン (Art. No. 10131-027, Invitrogen)。
【００６３】
発現(生産)用として：
OPTIPRO-SFM (Art. No.: 12309-019, Invitrogen)；
＋０．５％抗生物質抗真菌性溶液 (１００×) (Art. No.: P11-002, PAA)；
＋０．０５％ゲンタマシン溶液５０ｍｇ／ｍｌ (Art. No.: P11-005, PAA)；
＋２％ Glutamax I (１００×) (Art. No.: 35050-038, Invitrogen)；
及びゲネチシンなし。
【００６４】
操作は以下の通り：
１)細胞（５〜１０×１０6細胞を含有する１「Kryo」）の解凍、そして血清含有培地中Ｔ１７５での９６時間の培養；
２）４×Ｔ１７５へ分割、そして７２〜９６時間の培養；
３）２５×Ｔ１７５へ分割、そして７２〜９６時間の培養；
４）１つのＴ１７５の分割、そして予備としてのその持続的培養。残りの２４×Ｔ１７５の３×CellStack Corning (CellStack当り１０レベル、合計で６，３６０ｃｍ2) への分割、そして７２時間の培養；
５）培地の除去、ＦＢＳのないＤＭＥＭによる単層の１〜２×洗浄及び無血清OPTIPRO-SFM (CellStack当り１.８リットル) の添加、そして９６時間の培養；
６）培地の採取。遠心分離による上清の除去及び剥離細胞ペレットの再懸濁、及び新鮮OPTIPRO-SFM によるCellStackへのそれらの戻し、そして９６時間の培養；
７）６）に同じ；
８）培地の最終採取及び培養停止。
【００６５】
〔実施例３〕
親和性クロマトグラフィーによる組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質の単離
実施例２で得られたＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）含有培地にまだ残存している細胞又は細胞残屑は、遠心分離によって除去した(３５分、１０，０００ｒｐｍ、Beckman J2-21, Beckman Coulter GmbH, Germany)。このようにして得られた無細胞上清は、１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過カセットを用いて接線フロー限外濾過により、当初の容積の１／１０に濃縮した（PES 10, Schleicher & Schull, Germany)。
【００６６】
精製は、メーカー資料により、Ｎｉ2+−Sepharose (His Prep FF16/10, GE Healthcare, Sweden) を用いて親和性クロマトグラフィーで実施した。ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、濃縮上清に５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4及び５ｍＭのイミダゾールを加え、そして５ＭＨＣｌを加えることによりｐＨ７．４にｐＨ調整して結合させた。非結合成分は、５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭのイミダゾールのｐＨ７．４緩衝液でカラムを洗浄処理することにより洗い流した。結合したＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、２０ｍｍｏｌのＮａ2ＨＰＯ4、５００ｍｍｏｌのＮａＣｌ、５００ｍｍｏｌのイミダゾールのｐＨ７．４緩衝液で溶離した。このようにして得られた溶離液は、１０ｋＤａのカットオフの限外濾過膜（OMEGA 10 K, Pall Life Sciences, USA）により撹拌限界濾過セル中で当初の容積の１／１０に濃縮した。更なる精製及び不純物の除去は、Superdex 200 prep grade 35/600 (GE Healthcare, Sweden) クロマトグラフィーカラムを用いたゲル濾過により、メーカー資料に従って実施した。クロマトグラフィーは、０．０４８ｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０．０２ｍｏｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、０．１４５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、０．０１５ｍｏｌ／ｌのＮａＮ3のｐＨ７．２緩衝液を用いて５.０ｍｌ／分の流速で実施した。試料を注入後、ＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）は、ほぼ３００ｍｌの溶離容積後のピーク中に、使用クロマトグラフィーカラムから溶離した。
【００６７】
〔実施例４〕
リストセチンなしの抗ＦＬＡＧ／ＧＰＩｂαのＥＬＩＳＡにおけるＶＷＦ活性を測定する本発明の方法
Ｆｌａｇタグ（Sigma, Saint Louis, USA, ANTI-FLAG HS, M2 コーティング９６ウェルプレート(透明)、製造番号 Ｐ２９８３）に対する抗体で前もってコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、１００ｍｌの組換え野生型ＧＰＩｂα−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質（細胞沈降後の培養培地の１：１０希釈上清）を含むリン酸緩衝液、又は単離ＧＰＩｂα−（ａａ１〜２８５Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）融合タンパク質（実施例３を参照）を２.４μｇ／ｍｌの濃度で充填し、その後２〜８℃で一夜インキュベーションした。リン酸緩衝液(＋０.０１％のツィーン（登録商標）20)で４回洗浄後、リン酸緩衝液＋０.１％ウシ血清アルブミン中での５０μlのヘマート（Haemate）（登録商標）(ZLB Behring, Marburg, Germany)の希釈液、及びリン酸緩衝液＋０.１％ウシ血清アルブミン中での５０μlのリストセチン希釈液を加えた。続いてこれを室温で１時間インキュベーションした。上記のように４回洗浄後、１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ＶＷＦ抗体（ウサギ抗ヒトＶＷＦ／ＨＲＰ、DAKO, Ref. P0226）を加え、その後室温で１時間インキュベーションして引き続き上記のように洗浄した。その後、基質として１００μｌのテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ基質、Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany, Ref. 450684）を加え、続いて室温で４分間インキュベーションした。反応は１００μｌの０.５Ｎ硫酸を加えることにより停止させた。５０４ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。
【００６８】
リストセチンの非存在下、実施例１〜３により調製した突然変異体ＧＰＩｂαの使用時に、ＶＷＦの強い濃度依存性結合が生じた。リストセチンの添加は該結合を若干増加させたが、これは恐らくＧＰＩｂαなしでも起こる非特異結合に起因し得る。対照的に、同様に強いＶＷＦ結合が、１.２ｍｇ／ｍｌのリストセチンを加えることによってのみ野生型ＧＰＩｂαで達成し得た。リストセチンの添加なしでは、野生型ＧＰＩｂαの使用でも結合は見られなかった（図１）。
【００６９】
〔実施例５〕
リストセチンなしのＧＰＩｂαラテックス粒子凝集分析におけるＶＷＦ活性を測定する本発明の方法
３種の試薬を調製した。
試薬１：
モノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体のＶＭ１６ｄ（Sanbio B.V., Uden, Netherlands: 製品番号ＭＯＮ１１４６）をラテックス粒子表面に結合し、そして後者を長期保存のために緩衝液（０.６ｇ／ｌＴＲＩＳ、１.１％ロイシン、１２．５％蔗糖、０．０５％ＨＳＡ、６．２５ｍｇ／ｌゲンタマイシン及び０.６２５ｍｇ／ｌアンホテリシン、ｐＨ８．２５、ラテックス濃度０．２２％）中に再懸濁した。
【００７０】
試薬２：
ＶＷＦ欠乏血漿。
試薬３：
以下の成分を混合して総量３０ｍｌの試薬３を得た：
２．５ｍｌのリン酸緩衝液中ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）(Fluka, Germany) の７.５％強度溶液（ｐＨ７．１）；
１２.９ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．１）中１２.９ｍｌ（０.６２５ｍｇ／ｍｌ）のヘテロフィリック遮断試薬１(Scantibodies Laboratory Inc, Santee, CA 92071, USA)；
３.４ｍｌのリン酸緩衝液中２１ｇ／ｌのツィーン（登録商標） 20 (Sigma, St. Louis, Missouri, USA）を含有する溶液（ｐＨ７．２）；
０．０８６ｍｌのリン酸緩衝液中５.５９ｍｇ／ｍｌの組換えＧＰＩｂα−（Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖ）−（３×Ｆｌａｇ）−（６×Ｈｉｓ）（実施例３を参照）の溶液（ｐＨ７．１）；及び
１１.２ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）。
【００７１】
分析は、BCS（登録商標）自動凝固分析計 (Behring Coagulation System, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany）で実施した。１５μｌのヒトシトレート血漿試料、３０μｌの試薬２及び７０μｌの試薬３を混合した。反応は４０μｌの試薬３を混合しながら加えることにより開始させた。反応混合物の吸光度を５７５ｎｍで連続的に測定した。ラテックス粒子凝集速度は、試料中のＶＷＦ活性の関数であった。
【００７２】
ＶＷＦ活性は、標準ヒト血漿（Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany）を用いて検量線を作成することによって算出した。使用したＶＷＦの目標値はBCS（登録商標）システムに対する公表リストセチン補因子値であった。標準ヒト血漿量を増加し、そして同時に対応する量の試薬２を減少させることによって、２００％までのＶＷＦ活性が生じた。標準ヒト血漿を試薬２で希釈することにより、低いＶＷＦ活性が生じた。図２は標準的な検量線を表す。試料のＶＷＦ活性は、測定した反応速度を用いて検量線から読み取ることができた。
【００７３】
試料中の特に低いＶＷＦ活性を測定するために、１５又は３０μｌの試料よりはむしろ４５μｌの試料（上記を参照）が分析ミックスで使用された。キャリブレーションには、３％までの低いＶＷＦ活性が生じるように、標準ヒト血漿を試薬２で希釈した。この方法は、分析において極端に低いＶＷＦ活性を正確に測定することができ、これはフォンビルブラント症候群のサブタイプを分類するためにＶＷＦ活性／抗原比を算出するのに特に重要である。ＶＷＦ依存性凝集は、反応混合物においてＰＶＰ濃度を０.３５％に、そして試料量を６０μｌに増加させることにより更に増幅することができ、ひいては１％ＶＷＦ及び０％ＶＷＦでも識別することを可能にした。結果として、タイプ３フォンビルブラント病（０％ＶＷＦ）を、他のタイプの大規模欠乏症（例えば１〜５％）と高い信頼性で識別し得た。
【００７４】
〔実施例６〕
ＶＷＦ基質として尿素前処理した高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する本発明の方法
１．反応緩衝液：１ｍｍｏｌ／ｌのPefabloc SC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)、１２.５ｍｍｏｌ／ｌのＢａＣｌ2、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ、ｐＨ８.０；
２．基質緩衝液の調製及び室温で正確に５分間のインキュベーション：８.３Ｕ／ｍｌ
（８３０％）の高分子量多量体組換え生産ＶＷＦ−Ｐ１６４８Ｓ、４．６ｍｏｌ／ｌの尿素、４．６ｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０；
３．１５μｌのヒト血漿試料を３００μｌの反応緩衝液と混合し、次いで１５０μｌの基質緩衝液と混合する；
４．３７℃で４から８時間の分析混合物のインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７５】
〔実施例７〕
ＶＷＦ基質として尿素前処理した組換え高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いた、ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定する本発明の方法
１．６μｌのヒト血漿試料（反応緩衝液で１：６に希釈、実施例６を参照）を２０μｌの反応緩衝液と混合する；
２．ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを活性化するために、３７℃で５分間の混合物のインキュベーション：
３．１２μｌの基質緩衝液（５Ｕ／ｍｌ（５００％）の組換え高分子量多量体ＶＷＦ−Ｐ１６４８Ｓ、５ｍｏｌ／ｌの尿素、５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の添加；
４．３７℃で２０分間の分析ミックスのインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７６】
〔実施例８〕
ＶＷＦ基質として高分子量多量体ＶＷＦ（Ｐ１６４８Ｓ）を用いてＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのＶＷＦ切断活性を測定し、そしてＡＤＡＭＴＳ−１３分解あり／なしとの差を算出する本発明の方法
分析１：
１．１０μｌのヒト血漿試料を、２０μｌのＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼ活性化緩衝液（１８.７５ｍｍｏｌ／ｌのＢａＣｌ2、ｐＨ８．０、５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１.５ｍｍｏｌ／ｌのPefabloc SC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)）と混合する；
２．３７℃で５分間の混合物のインキュベーション：
３．５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、ｐＨ８．０で１．２５Ｕ／ｍｌ（１２５％）の組換えＶＷＦ基質（Ｐ１６４８Ｓ）を含む２０μｌの添加；
４．３７℃で２０分間の分析ミックスのインキュベーション；
５．実施例５に記載の試料として、本反応混合物を用いたＶＷＦ活性の測定。
【００７７】
分析２：
別の１０μｌの同じヒト血漿試料を分析１のように処理したが、３７℃で２０分のインキュベーション工程（工程番号４を参照）を行なわず、ＶＷＦ活性を、ＶＷＦ基質（Ｐ１６４８Ｓ）の添加直後に、この反応混合物を試料として用いて実施例５のように測定するという点が異なった。分析１及び分析２のＶＷＦ活性の差は、分解したＶＷＦ活性の量、従って、ＡＤＡＭＴＳ−１３の活性を与えた。血漿試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３の活性は、その値からキャリブレーションに基づき定量した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合されて分析ミックスを与える試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）活性を測定する方法であって、
ａ）ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を含む単離ＧＰＩｂαタンパク質を使用すること；及び
ｂ）その分析ミックスにリストセチンもボトロセチンも加えないこと；
を含む、方法。
【請求項２】
分析ミックスにリストセチン−又はボトロセチン−等価物質が加えられない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が組換え的又は合成的に調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＮ末端で相同ヒトＧＰＩｂαシグナル配列（配列番号２）又は異種シグナル配列に融合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上の親和性タグに融合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端でＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ及びＳｔｒｅｐタグから成る群からの１つ又はそれ以上の親和性タグに融合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が固相と結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が抗体を介して固相と結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用するＧＰＩｂα蛋白質が抗ＧＰＩｂα抗体を介して固相と結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＩｂαタンパク質が抗親和性タグ抗体を介して固相と結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
固相が微粒子固相である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
微粒子固相がラテックスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＷＦ活性が微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づいて測定される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が、ＶＭ１６ｄ及びＳＺ２から成る群からのモノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体を介して微粒子固相と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合し、そして抗Ｆｌａｇ抗体を介して微粒子固相と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
分析ミックスが界面活性剤、好ましくはツィーン（登録商標）20、テシット、トリトン界面活性剤及びドデシル硫酸ナトリムから成る群からの界面活性剤を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
分析ミックスが０．０２ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌの濃度のツィーン（登録商標）20を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固相が非微粒子固相である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
固相がミクロ滴定プレートの表面である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が、ＶＭ１６ｄ及びＭＢ４５から成る群からのモノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体を介して非微粒子固相と結合する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合し、そして抗Ｆｌａｇ抗体を介して非微粒子固相と結合する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
試料がヒト又は動物起源の生体液である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料が基質として単離ＶＷＦを加えられている生体液を含む反応混合物である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有し、そしてＧＰＩｂαタンパク質が微粒子固相と結合する、アミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質を含有する試薬を含む、請求項１に記載の方法を行なうための検査キット。
【請求項２６】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質が結合する非微粒子固相を含む、請求項１に記載の方法を行なうための検査キット。
【請求項２７】
ＧＰＩｂαタンパク質が抗体を介して非微粒子固相に結合する、請求項２６に記載の検査キット。
【請求項２８】
非微粒子固相がミクロ滴定プレートである、請求項２７に記載の検査キット。
【請求項２９】
抗ＶＷＦ抗体を含有する試薬を更に含む、請求項２７に記載の検査キット。
【請求項３０】
インビトロでフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）活性を測定する方法における、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の使用であって、ここでリストセチンもボトロセチンもＶＷＦ活性を測定する該方法において用いない使用。
【請求項３１】
ＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の取得方法であって、該ＧＰＩｂαタンパク質を組換え技術により原核細胞又は真核細胞の培養で発現させること；及び親和性担体を用いる親和性クロマトグラフィーにより、細胞溶解物又は細胞培養上清から上記ＧＰＩｂαタンパク質を単離すること；を含む方法。
【請求項３３】
以下の工程：
ａ）ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含むことが疑われる試料を、基質としての単離ＶＷＦと混合して反応ミックスを得ること；
ｂ）該反応ミックスをインキュベートすること；そして
ｃ）反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定すること；
を含む、試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法であって、野生型ＶＷＦモノマーで構成される高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有し、上記ＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解されることをもたらすＶＷＦモノマーを含む高分子量マルチマーＶＷＦである、ＶＷＦ基質を含む方法。
【請求項３４】
高分子量マルチマーＶＷＦで構成されるＶＷＦ基質のＶＷＦモノマーが、以下の群：
Ｐ１６４８Ｓ、Ｅ１６３８Ｋ、Ｇ１５０５Ｒ、Ｓ１５０６Ｌ、Ｍ１５２８Ｖ、Ｒ１５６９ｄｅｌ、Ｒ１５９７Ｗ、Ｖ１６０７Ｄ、Ｇ１６０９Ｒ、Ｇ１６２９Ｅ、Ｇ１６３１Ｄ、Ｒ１５９７Ｑ、Ｖ１４９９Ｅ及びＹ１５８４Ｃ；
からの少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
高分子量マルチマーＶＷＦ基質が組換え法で生産される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
高分子量マルチマーＶＷＦ基質が、適したＶＷＦアミノ酸配列変異のヘテロ接合性又はホモ接合性キャリアのドナー血漿から単離されている、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
工程ａ）が試料を更にヘパリンと混合することを含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
工程ａ）が、試料を、単離天然ＧＰＩｂαタンパク質及び／又は組換え野生型ＧＰＩｂαタンパク質、及びリストセチン又はボトロセチンと更に混合することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
工程ａ）が、試料を、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含む、組換え又は合成ＧＰＩｂαタンパク質と更に混合することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｃ）が、リストセチン補因子活性を測定することにより反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｃ）が、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
単離ＧＰＩｂαタンパク質と混合されて分析ミックスを与える試料中のフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）活性を測定する方法であって、
ａ）ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を含む単離ＧＰＩｂαタンパク質を使用すること；及び
ｂ）その分析ミックスにリストセチンもボトロセチンも加えないこと；
を含む、方法。
【請求項２】
分析ミックスにリストセチン−又はボトロセチン−等価物質が加えられない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９におけるアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が組換え的又は合成的に調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＮ末端で相同ヒトＧＰＩｂαシグナル配列（配列番号２）又は異種シグナル配列に融合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上の親和性タグに融合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端でＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ及びＳｔｒｅｐタグから成る群からの１つ又はそれ以上の親和性タグに融合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が固相と結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が抗体を介して固相と結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用するＧＰＩｂα蛋白質が抗ＧＰＩｂα抗体を介して固相と結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＩｂαタンパク質が抗親和性タグ抗体を介して固相と結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
固相が微粒子固相である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
微粒子固相がラテックスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＷＦ活性が微粒子固相のＧＰＩｂα仲介凝集に基づいて測定される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が、ＶＭ１６ｄ及びＳＺ２から成る群からのモノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体を介して微粒子固相と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合し、そして抗Ｆｌａｇ抗体を介して微粒子固相と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
分析ミックスが界面活性剤、好ましくはツィーン（登録商標）20、テシット、トリトン界面活性剤及びドデシル硫酸ナトリムから成る群からの界面活性剤を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
分析ミックスが０．０２ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌの濃度のツィーン（登録商標）20を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固相が非微粒子固相である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
固相がミクロ滴定プレートの表面である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
使用するＧＰＩｂαタンパク質が、ＶＭ１６ｄ及びＭＢ４５から成る群からのモノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体を介して非微粒子固相と結合する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
使用するＧＰＩｂαタンパク質がＣ末端で１つ又はそれ以上のＦｌａｇタグに融合し、そして抗Ｆｌａｇ抗体を介して非微粒子固相と結合する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
試料がヒト又は動物起源の生体液である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料が基質として単離ＶＷＦを加えられている生体液を含む反応混合物である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有し、そしてＧＰＩｂαタンパク質が微粒子固相と結合する、アミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質を含有する試薬を含む、請求項１に記載の方法を行なうための検査キット。
【請求項２６】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含むＧＰＩｂαタンパク質が結合する非微粒子固相を含む、請求項１に記載の方法を行なうための検査キット。
【請求項２７】
ＧＰＩｂαタンパク質が抗体を介して非微粒子固相に結合する、請求項２６に記載の検査キット。
【請求項２８】
非微粒子固相がミクロ滴定プレートである、請求項２７に記載の検査キット。
【請求項２９】
抗ＶＷＦ抗体を含有する試薬を更に含む、請求項２７に記載の検査キット。
【請求項３０】
インビトロでフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）活性を測定する方法における、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の使用であって、ここでリストセチンもボトロセチンもＶＷＦ活性を測定する該方法において用いない使用。
【請求項３１】
ＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有する、アミノ酸配列を有する単離ＧＰＩｂαタンパク質の取得方法であって、該ＧＰＩｂαタンパク質を組換え技術により原核細胞又は真核細胞の培養で発現させること；及び親和性担体を用いる親和性クロマトグラフィーにより、細胞溶解物又は細胞培養上清から上記ＧＰＩｂαタンパク質を単離すること；を含む方法。
【請求項３３】
以下の工程：
ａ）ＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼを含むことが疑われる試料を、基質としての単離ＶＷＦと混合して反応ミックスを得ること；
ｂ）該反応ミックスをインキュベートすること；そして
ｃ）反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定すること；
を含む、試料中のＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼのフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）切断活性を測定する方法であって、野生型ＶＷＦモノマーで構成される高分子量マルチマーＶＷＦであるＶＷＦ基質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有し、上記ＶＷＦ基質が促進的にＡＤＡＭＴＳ−１３によって分解されることをもたらすＶＷＦモノマーを含む高分子量マルチマーＶＷＦである、ＶＷＦ基質を含む方法。
【請求項３４】
高分子量マルチマーＶＷＦで構成されるＶＷＦ基質のＶＷＦモノマーが、以下の群：
Ｐ１６４８Ｓ、Ｅ１６３８Ｋ、Ｇ１５０５Ｒ、Ｓ１５０６Ｌ、Ｍ１５２８Ｖ、Ｒ１５６９ｄｅｌ、Ｒ１５９７Ｗ、Ｖ１６０７Ｄ、Ｇ１６０９Ｒ、Ｇ１６２９Ｅ、Ｇ１６３１Ｄ、Ｒ１５９７Ｑ、Ｖ１４９９Ｅ及びＹ１５８４Ｃ；
からの少なくとも１つのアミノ酸配列変異を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
高分子量マルチマーＶＷＦ基質が組換え法で生産される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
高分子量マルチマーＶＷＦ基質が、適したＶＷＦアミノ酸配列変異のヘテロ接合性又はホモ接合性キャリアのドナー血漿から単離されている、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
工程ａ）が試料を更にヘパリンと混合することを含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
工程ａ）が、試料を、単離天然ＧＰＩｂαタンパク質及び／又は組換え野生型ＧＰＩｂαタンパク質、及びリストセチン又はボトロセチンと更に混合することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
工程ａ）が、試料を、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、そしていずれの場合にも位置２３３及び２３９に１つのアミノ酸置換Ｘａａを有するアミノ酸配列を含む、組換え又は合成ＧＰＩｂαタンパク質と更に混合することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
使用するＧＰＩｂαタンパク質の位置２３３及び／又は２３９のアミノ酸置換Ｘａａがバリン又はセリン残基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｃ）が、リストセチン補因子活性を測定することにより反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｃ）が、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により反応ミックス中の残存ＶＷＦ活性を測定することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５３２４６７（Ｐ２０１０−５３２４６７Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３７８１（Ｐ２０１０−５１３７８１）
【出願日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００７０５１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９８０３２７５１）シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・プロダクツ・ゲーエムベーハー (36)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００７０５１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９８０３２７５１）シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・プロダクツ・ゲーエムベーハー (36)
【Ｆターム（参考）】
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