リソソーム蓄積症の早期検出方法
【課題】リソソーム蓄積症を発見するための診断用薬を提供すること。
【解決手段】リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検知し、ＬＳＤあるいはヒトまたは動物の患者におけるの治療の効能の進行をモニタリングする方法において、前記方法は前記患者から得られる生体試料におけるＬＳＤマーカーの水準を検定することを含み、前記ＬＳＤマーカーは前記ＬＳＤの発生，成長あるいは発症に関係する酵素，ポリペプチドまたはタンパク質であるか、それらの免疫相互作用的な同族体，類似体または誘導体であることを特徴とする方法。
【解決手段】リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検知し、ＬＳＤあるいはヒトまたは動物の患者におけるの治療の効能の進行をモニタリングする方法において、前記方法は前記患者から得られる生体試料におけるＬＳＤマーカーの水準を検定することを含み、前記ＬＳＤマーカーは前記ＬＳＤの発生，成長あるいは発症に関係する酵素，ポリペプチドまたはタンパク質であるか、それらの免疫相互作用的な同族体，類似体または誘導体であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】
【背景技術】
【０００２】
【数１−２】
【０００３】
【数２】
【０００４】
【数３】
【０００５】
【数４−１】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
【数４−１−１】
【０００７】
【数４−１−２】
【０００８】
【数４−１−３】
【０００９】
【数４−１−４】
【００１０】
【数４−１−５】
【００１１】
【数４−１−６】
【００１２】
【数４−１−７】
【００１３】
【数４−２】
【００１４】
【数５】
【００１５】
【数６】
【００１６】
【数７】
【００１７】
【数８】
【００１８】
【数９】
【００１９】
【数１０】
【００２０】
【数１１】
【００２１】
【数１２】
【００２２】
【数１３】
【００２３】
【数１４】
【００２４】
【数１５】
【００２５】
【数１６】
【実施例】
【００２６】
【数１９】
【００２７】
【数２０】
【００２８】
【数２１】
【００２９】
【数２２】
【００３０】
【数２３】
【００３１】
【数２４】
【００３２】
【数２５】
【００３３】
【数２６】
【００３４】
【数２７】
【００３５】
【数２８】
【００３６】
【数２９】
【００３７】
【数３０】
【００３８】
【数３１】
【００３９】
【数３２】
【００４０】
【数３３】
【００４１】
【数３４】
【００４２】
【数３５】
【００４３】
【数３６】
【００４４】
【数３７】
【００４５】
【数３８】
【００４６】
【数３９】
【００４７】
【数４０】
【００４８】
【数４１】
【００４９】
【数４２】
【００５０】
【数４３】
【００５１】
【数４４】
【００５２】
【数４５】
【００５３】
【数４６】
【００５４】
【数４７】
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は免疫精製された(immunopurified)Lamp-1に対して産出されたポリクローナル抗血清の交差感受性をを示すグラフ図である。マイクロタイターウェルは、実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて、ポリクローナル抗体が５μg/ml（白丸）または１０μg/ml（白四角）の水準で被覆されている。
【図２】図２はLamp-1に対するＥｕ3+標識化抗体の交差感受性を示すグラフ図である。１０ng/ml（黒丸），２０ng/ml（白四角）または４０ng/ml（白丸）のいずれがを含むLamp-1の標準溶液が調製され、各サンプルへの蛍光反応は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて遅延時間(time-delayed)蛍光免疫検定法におけるＥｕ3+標識化抗体の濃度範囲で測定される。
【図３】図３は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて測定される１８６人の新生児から得られる血斑中のLamp-1の水準を示すグラフ図である。ｘ軸はLamp-1の水準（ng/血斑(blood spot)）を表している。Lamp-1水準の各範囲内の個体数はｙ軸に表される。
【図４】図４は２５種類のリソソーム蓄積症を表す３２０人のＬＳＤ罹患者と１５２人の非罹患者から得られる血漿中のLamp-1水準を示すグラフ図である。Lamp-1水準は実施例３に記載される第２ステップ定量方法において５〜１０μlの試料を用いて測定される。中央の棒は各疾患におけるLamp-1水準の中央値を表し、陰影部分は百分位数の２５番目と７５番目を表し、上部および下部の棒は範囲の境界を表している。異常値（白丸）ならびに極度の異常値（*）も表示する。GM1＝GM1ガングリオシドーシス；MLD＝異染性白質ジストロフィー；MSD＝複数のスルファターゼ欠損症；N-P＝ニーマン・ピック病；SAS＝シアル酸蓄積；TSD＝テイ・サックス病。
【図５】図５は１４人のＬＳＤ罹患者および４人の（正常な）非罹患者から得られる血漿試料中のLamp-2水準を示すグラフ図である。個体の状態はｘ軸に表される。
【図６】図６はスクロソームモデル(Sucrosome Model)からの繊維芽細胞の電子顕微鏡および免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。パネルＡ，Ｂ，ＣおよびＤは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の電子顕微鏡写真である。パネルＥ，Ｆ，ＧおよびＨは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の免疫蛍光検査顕微鏡写真である。免疫蛍光検査写真は、相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scalebar)は電子顕微鏡写真においては４μで、免疫蛍光顕微鏡写真においては２０μである。
【図７】図７はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における相対的なLamp-1タンパク質水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞を１００mMスクロースの存在または非存在下で２８日間成長させた。細胞は所定の時点で回収され、Lamp-1はスクロースの存在下（黒四角）および非存在下（白四角）で成長した細胞内で測定される。Lamp-1の値は総蛋白含有量に対して正常化される。
【図８】図８はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。正常な培地（パネルＡ）またはスクロースを含むメディア（パネルＢ〜Ｈ）において成長した繊維芽細胞の電子顕微鏡写真。細胞を１４日間成長させ、すぐに回収（パネルＡおよびＢ），BME培地に移しかえられ、１日（パネルＣ）；３日（パネルＥ）および７日（パネルＧ）後に回収、あるいは、転化酵素を含むメディアに移しかえられ、１日（パネルＤ）；３日（パネルＦ）および７日（パネルＨ）後に回収される。スケールバー(scale bar)は２μである。
【図９】図９はスクロソームモデルに関する蓄積補正後のLamp-1蛋白の相対的水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞は貯蔵液胞を蓄積するためにスクロースの存在下で１４日間成長させた。細胞は、さらに２１日目まで、スクロースを含む培地内で成長を続けるか、あるいは細胞をBME培地もしくは転化酵素を含むBME培地に移しかえることによって補正されるLamp-1は２１日を経た時点で測定され、プロットされる。細胞はスクロースのみを含む培地上（黒四角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後BME培地に配置される（黒三角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後転化酵素を含む培地に配置される（黒丸）または期間−コースを通じてBME培地上（□）で成長させられる。
【図１０】図１０は抗-Lamp-1モノクローナル抗体を用いて標識化した罹患細胞系からの繊維芽細胞を示す免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。繊維芽細胞はポンペ（パネルＡ），サッラ（パネルＢ），MPS-II（パネルＣ）およびMPS-VI（パネルＤ）の罹患細胞系からである。写真は相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scale bar)は２０μである。
【図１１】図１１は患者の細胞系における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。細胞系はポンペに罹患した細胞（パネルＡ）；ポンペを補正した細胞（パネルＢ）；ＭPS-IIに罹患した細胞（パネルＣ）；MPS-IIを補正した細胞（パネルＤ）；MPS-VIに罹患した細胞（パネルＥ）；MPS-VIを補正した細胞（パネルＦ）からである。電子顕微鏡写真は、酵素の添加後７日以内に貯蔵液胞の大きさが劇的に縮小した（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）ということから、ポンペ（パネルＡおよびＢ），MPS-II（パネルＣおよびＤ）およびMPS-VI（パネルＥおよびＦ）に罹患した細胞において補正を確認した。スケールバー(scale bar)は２μである。
【図１２】図１２はポンペに罹患した繊維芽細胞および補正されたポンペ繊維芽細胞における相対的なLamp-1の水準を示すグラフ図である。ポンペに罹患した繊維芽細胞および正常な皮膚の繊維芽細胞は融合(confluency)まで成長させられ、さらに１４日間まで正常な培地で続けられるかもしくは、細胞をα−グルコシダーゼを含む培地に移しかえることで補正される。相対的なLamp-1の水準は２度目の１４日間の期間が経過した時点で測定され、プロットされる。通常の細胞は（黒三角）で、BME培地のポンペ罹患細胞は（黒四角）で、α−グルコシダーゼを含むポンペ罹患細胞は（白四角）で表される。
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】
【背景技術】
【０００２】
【数１−２】
【０００３】
【数２】
【０００４】
【数３】
【０００５】
【数４−１】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
【数４−１−１】
【０００７】
【数４−１−２】
【０００８】
【数４−１−３】
【０００９】
【数４−１−４】
【００１０】
【数４−１−５】
【００１１】
【数４−１−６】
【００１２】
【数４−１−７】
【００１３】
【数４−２】
【００１４】
【数５】
【００１５】
【数６】
【００１６】
【数７】
【００１７】
【数８】
【００１８】
【数９】
【００１９】
【数１０】
【００２０】
【数１１】
【００２１】
【数１２】
【００２２】
【数１３】
【００２３】
【数１４】
【００２４】
【数１５】
【００２５】
【数１６】
【実施例】
【００２６】
【数１９】
【００２７】
【数２０】
【００２８】
【数２１】
【００２９】
【数２２】
【００３０】
【数２３】
【００３１】
【数２４】
【００３２】
【数２５】
【００３３】
【数２６】
【００３４】
【数２７】
【００３５】
【数２８】
【００３６】
【数２９】
【００３７】
【数３０】
【００３８】
【数３１】
【００３９】
【数３２】
【００４０】
【数３３】
【００４１】
【数３４】
【００４２】
【数３５】
【００４３】
【数３６】
【００４４】
【数３７】
【００４５】
【数３８】
【００４６】
【数３９】
【００４７】
【数４０】
【００４８】
【数４１】
【００４９】
【数４２】
【００５０】
【数４３】
【００５１】
【数４４】
【００５２】
【数４５】
【００５３】
【数４６】
【００５４】
【数４７】
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は免疫精製された(immunopurified)Lamp-1に対して産出されたポリクローナル抗血清の交差感受性をを示すグラフ図である。マイクロタイターウェルは、実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて、ポリクローナル抗体が５μg/ml（白丸）または１０μg/ml（白四角）の水準で被覆されている。
【図２】図２はLamp-1に対するＥｕ3+標識化抗体の交差感受性を示すグラフ図である。１０ng/ml（黒丸），２０ng/ml（白四角）または４０ng/ml（白丸）のいずれがを含むLamp-1の標準溶液が調製され、各サンプルへの蛍光反応は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて遅延時間(time-delayed)蛍光免疫検定法におけるＥｕ3+標識化抗体の濃度範囲で測定される。
【図３】図３は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて測定される１８６人の新生児から得られる血斑中のLamp-1の水準を示すグラフ図である。ｘ軸はLamp-1の水準（ng/血斑(blood spot)）を表している。Lamp-1水準の各範囲内の個体数はｙ軸に表される。
【図４】図４は２５種類のリソソーム蓄積症を表す３２０人のＬＳＤ罹患者と１５２人の非罹患者から得られる血漿中のLamp-1水準を示すグラフ図である。Lamp-1水準は実施例３に記載される第２ステップ定量方法において５〜１０μlの試料を用いて測定される。中央の棒は各疾患におけるLamp-1水準の中央値を表し、陰影部分は百分位数の２５番目と７５番目を表し、上部および下部の棒は範囲の境界を表している。異常値（白丸）ならびに極度の異常値（*）も表示する。GM1＝GM1ガングリオシドーシス；MLD＝異染性白質ジストロフィー；MSD＝複数のスルファターゼ欠損症；N-P＝ニーマン・ピック病；SAS＝シアル酸蓄積；TSD＝テイ・サックス病。
【図５】図５は１４人のＬＳＤ罹患者および４人の（正常な）非罹患者から得られる血漿試料中のLamp-2水準を示すグラフ図である。個体の状態はｘ軸に表される。
【図６】図６はスクロソームモデル(Sucrosome Model)からの繊維芽細胞の電子顕微鏡および免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。パネルＡ，Ｂ，ＣおよびＤは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の電子顕微鏡写真である。パネルＥ，Ｆ，ＧおよびＨは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の免疫蛍光検査顕微鏡写真である。免疫蛍光検査写真は、相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scalebar)は電子顕微鏡写真においては４μで、免疫蛍光顕微鏡写真においては２０μである。
【図７】図７はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における相対的なLamp-1タンパク質水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞を１００mMスクロースの存在または非存在下で２８日間成長させた。細胞は所定の時点で回収され、Lamp-1はスクロースの存在下（黒四角）および非存在下（白四角）で成長した細胞内で測定される。Lamp-1の値は総蛋白含有量に対して正常化される。
【図８】図８はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。正常な培地（パネルＡ）またはスクロースを含むメディア（パネルＢ〜Ｈ）において成長した繊維芽細胞の電子顕微鏡写真。細胞を１４日間成長させ、すぐに回収（パネルＡおよびＢ），BME培地に移しかえられ、１日（パネルＣ）；３日（パネルＥ）および７日（パネルＧ）後に回収、あるいは、転化酵素を含むメディアに移しかえられ、１日（パネルＤ）；３日（パネルＦ）および７日（パネルＨ）後に回収される。スケールバー(scale bar)は２μである。
【図９】図９はスクロソームモデルに関する蓄積補正後のLamp-1蛋白の相対的水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞は貯蔵液胞を蓄積するためにスクロースの存在下で１４日間成長させた。細胞は、さらに２１日目まで、スクロースを含む培地内で成長を続けるか、あるいは細胞をBME培地もしくは転化酵素を含むBME培地に移しかえることによって補正されるLamp-1は２１日を経た時点で測定され、プロットされる。細胞はスクロースのみを含む培地上（黒四角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後BME培地に配置される（黒三角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後転化酵素を含む培地に配置される（黒丸）または期間−コースを通じてBME培地上（□）で成長させられる。
【図１０】図１０は抗-Lamp-1モノクローナル抗体を用いて標識化した罹患細胞系からの繊維芽細胞を示す免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。繊維芽細胞はポンペ（パネルＡ），サッラ（パネルＢ），MPS-II（パネルＣ）およびMPS-VI（パネルＤ）の罹患細胞系からである。写真は相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scale bar)は２０μである。
【図１１】図１１は患者の細胞系における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。細胞系はポンペに罹患した細胞（パネルＡ）；ポンペを補正した細胞（パネルＢ）；ＭPS-IIに罹患した細胞（パネルＣ）；MPS-IIを補正した細胞（パネルＤ）；MPS-VIに罹患した細胞（パネルＥ）；MPS-VIを補正した細胞（パネルＦ）からである。電子顕微鏡写真は、酵素の添加後７日以内に貯蔵液胞の大きさが劇的に縮小した（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）ということから、ポンペ（パネルＡおよびＢ），MPS-II（パネルＣおよびＤ）およびMPS-VI（パネルＥおよびＦ）に罹患した細胞において補正を確認した。スケールバー(scale bar)は２μである。
【図１２】図１２はポンペに罹患した繊維芽細胞および補正されたポンペ繊維芽細胞における相対的なLamp-1の水準を示すグラフ図である。ポンペに罹患した繊維芽細胞および正常な皮膚の繊維芽細胞は融合(confluency)まで成長させられ、さらに１４日間まで正常な培地で続けられるかもしくは、細胞をα−グルコシダーゼを含む培地に移しかえることで補正される。相対的なLamp-1の水準は２度目の１４日間の期間が経過した時点で測定され、プロットされる。通常の細胞は（黒三角）で、BME培地のポンペ罹患細胞は（黒四角）で、α−グルコシダーゼを含むポンペ罹患細胞は（白四角）で表される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００６−６１１６１（Ｐ２００６−６１１６１Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８３１４３（Ｐ２００５−２８３１４３）
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【分割の表示】特願平９−５４１２６４の分割
【原出願日】平成９年５月１６日（１９９７．５．１６）
【出願人】（３９９０３１６０９）チルドレン・ユース・アンド・ウィメンズ・ヘルス・サービス・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ， Ｙｏｕｔｈ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【分割の表示】特願平９−５４１２６４の分割
【原出願日】平成９年５月１６日（１９９７．５．１６）
【出願人】（３９９０３１６０９）チルドレン・ユース・アンド・ウィメンズ・ヘルス・サービス・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ， Ｙｏｕｔｈ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]