リンホトキシン経路インヒビターによる免疫学的腎障害の処置
本開示は、免疫グロブリンの沈着を伴う腎機能異常を含むがこれに限定されない、免疫障害の処置に関する。本開示はさらに、リンホトキシン経路に関する。リンホトキシン経路の阻害因子を含む組成物が記載される。本発明は、ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与し、それによって哺乳動物を処置する工程を含む、腎臓の免疫障害を有している哺乳動物を処置する方法もまた提供する。その障害は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびＩｇＡ腎症からなる群より選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００２年１０月３１日に提出された米国仮特許出願番号６０／４２２５８８に関する。その開示全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明の技術分野は、免疫グロブリンの沈着を伴う腎臓の免疫障害を含むがこれに限定されない免疫障害の処置に関する。この分野はさらに、リンホトキシン経路の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は自己抗原に対する異常な免疫応答によって生じる。親和性が高く、体細胞において高度に変異した（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）自己抗体の作成が、自己免疫症状の顕著な特徴の１つである。ほとんどの自己免疫障害に、腎臓での自己反応性免疫グロブリンの沈着を伴う腎臓の兆候が含まれる。これらの障害のいくつかは最終的には腎不全に至る。免疫グロブリンの沈着を伴う糸球体腎炎は、慢性肝炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびベルジェ病としても知られているＩｇＡ腎症において特に顕著である。これらの疾患の共通の構成は、糸球体の損傷を伴う、肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿およびメサンギウムＩｇＡ沈着物の存在である。ＩｇＡ免疫複合体の沈着は、腎不全の高い発生率を伴うヒトの糸球体腎炎の最も一般的な形態を引き起こす（Ｂｅｒｇｅｒ（１９６９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１：９３９）。ＳＬＥには、米国だけにおいても２００万人を超えるヒトが罹患している。ＩｇＡ腎症は世界中で見られるが、日本、オーストラリア、東南アジア、および南ヨーロッパで多く見られる。米国では、罹患率は全ての腎生検のおよそ４％であるが、日本では罹患率は生検の４５％にものぼる。これらの疾患の病原因子についてはほとんど理解されていない。これらの疾患については、現在は有効な処置がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この問題に対する１つのアプローチは、種々の疾患を駆動する機構を使用する種々の動物モデルの経路の阻害因子を試験することである。これらの疾患を理解し、処置することにおける進展は、疾患状態のあらゆる局面と類似した症状を呈する動物モデルが利用できないことにより制約されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、腎臓での免疫グロブリン（Ｉｇ）の沈着を伴う病状を含む免疫障害を処置するための方法を提供する。本発明は、可溶性形態のＬＴ−β受容体（ＬＴＢＲ）でのリンホトキシン（ＬＴ）経路の阻害により、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて狼瘡様の疾患の改善が導かれることの発見に、一部基づく。本発明はさらに、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎機能障害が、腎臓でのＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の蓄積に関係していることの発見に、一部基づく。
【０００６】
したがって、本発明の１つの態様は、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることによって引き起こされる疾患を含む、免疫障害を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物が、糸球体腎炎を含むがこれに限定されない免疫グロブリンの沈着を伴う腎機能障害を伴う病状を予防または処置するために使用される。本発明はまた、ＩｇＡ腎症および関連する病状の処置のために、ヒト以外の動物において治療用化合物を同定し、そして／またはその効力を試験するためのアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、このアッセイには、ＢＡＦＦトランスジェニック動物に対して試験される化合物を投与する工程、およびＢＡＦＦトランスジェニックの腎臓でのＩｇＡの沈着のレベルを決定する工程が含まれる。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明の方法において使用されるＬＴ経路の阻害因子として、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ免疫グロブリン融合体）のようなＬＴＢＲ誘導体、ＬＴＢＲに対する抗体、またはＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体が挙げられる。本発明の１つの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子は、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含むがこれに限定されない、１つ以上の異種タンパク質ドメインに対して融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む。別の実施形態では、阻害因子は、配列番号１のアミノ酸から選択されるアミノ酸の機能的配列を含む可溶性ＬＴＢＲを含む。さらに別の実施形態では、可溶性ＬＴＢＲは、少なくとも１つのＬＴβサブユニットを含むリンホトキシン（ＬＴ）リガンドに対して選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む。さらに別の実施形態では、可溶性ＬＴＢＲは、ＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む。
【０００８】
上記の概要の記載および以下の詳細な説明のいずれもが例であり、説明的なものにすぎず、請求される本発明を限定するものではないことが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリンまたはその一部を意味し、これには、供給源、生産方法、および他の特徴にはかかわらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドが含まれる。この用語には、ポリクローナル、モノクローナル、、単特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異、ＣＤＲ移植抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全体に特異的に結合するか、またはそれに相補的であるドメインを含む抗体分子の部分をいう。抗原が大きい場合には、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合する場合がある。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用に関与している抗原分子の部分である。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体の可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインから構成されるいわゆるＦｄ抗体断片）によって提供される場合がある。抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。用語「ＬＴＢＲ抗体」または「ＬＴＢＲに対する抗体」は、ＬＴＢＲの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するあらゆる抗体をいう。用語「ＬＴ抗体」、「ＬＴに対する抗体」、または「ＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体」は、ＬＴの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するあらゆる抗体をいう。
【００１０】
用語「治療用化合物」または「治療薬」は、本明細書中で使用される場合は、転写、翻訳、もしくは翻訳後の工程でＬＴＢＲまたはＬＴの発現を阻害することによるか、あるいはＬＴＢＲまたはその機能的リガンドであるＬＴの生物学的活性を阻害することのいずれかによってＬＴ経路を「阻害する」ことができるあらゆる化合物を意味する。
【００１１】
用語「阻害因子」、「阻害する」、「中和する」、「アンタゴナイズする」、およびそれらの同族語は、特定の反応または活性のアンタゴニストとして作用する化合物の能力をいう。用語「阻害する」は、治療用化合物の存在下で、同じ化合物が存在しない条件下での発現または活性と比較して、ＬＴＢＲもしくはＬＴの発現、またはＬＴＢＲもしくはＬＴの活性を低下させることをいう。発現レベルまたは活性の低下は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。ＬＴＢＲもしくはＬＴの発現レベルまたは活性は、本明細書中に記載されるように、または当該分野で公知の技術によって測定することができる（例えば、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３および米国特許第６４０３０８７号を参照）。
【００１２】
用語「処置」、「治療用化合物」、およびそれらの同族語は、治療的処置および予防的／防御的措置の両方をいう。処置が必要であるものとしては、特定の内科的疾患をすでに有している個体、さらには最終的にそのような疾患に至るであろう個体を挙げることができる。
【００１３】
用語「腎臓の免疫障害」は、無調節な免疫グロブリンの生産を含み、結果として腎臓の病状を生じる疾患または症状をいう。このような障害としては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ならびに臨床的な兆候として肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿および腎臓での免疫グロブリンの沈着が挙げられる他の疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１４】
用語「有効用量」または「有効量」は、患者の症状の改善、または所望される生物学的結果（例えば、ＬＴ経路の阻害）を生じる化合物の量をいう。有効量は、以下のセクションに記載されるように決定することができる。
【００１５】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「ＤＮＡ」は本明細書中では同義的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、そして適切である場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体、および一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例として、プラスミドＤＮＡまたはその断片、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「プラスミドＤＮＡ」は、環状の二本鎖ＤＮＡをいう。「アンチセンス」核酸は、本明細書中で使用される場合は、ある程度の配列相補性によりｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部にハイブリダイズすることができ、それによってｍＲＮＡからの翻訳を妨害する核酸をいう。
【００１６】
本明細書中で使用される場合は、用語「定義された条件下でのハイブリダイゼーション」は、互いに極めて同一であるかまたは相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記載するように意図される。これらの条件は、少なくとも５０、１００、１５０、３００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくともの約８５〜９０％が同一である配列が、互いに結合したままである条件である。パーセント同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記載されているように決定することができる。低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の限定的ではない例が続くセクションに提供される。
【００１７】
用語「特異的相互作用」または「特異的に結合する」などは、２つの分子が生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、高い親和性によって特徴づけられ、これは、能力を抑えるには低い。非特異的結合は、通常は低い親和性を有して、高い能力を抑える。一般的には、結合は、親和定数Ｋａが１０６Ｍ−１よりも高い、または好ましくは１０８Ｍ−１よりも高い場合に特異的とみなされる。必要な場合には、結合条件を変更することによって、特異的結合には実質的に影響を与えることなく非特異的結合を減少させることができる。このような条件は当該分野で公知であり、当業者は、日常的に行われる技術を使用して、適切な条件を選択することができる。これらの条件は通常、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させるための時間、無関係な分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して定義される。
【００１８】
語句「実質的に示されているとおり」は、関連するアミノ酸配列が、所定の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。例として、このような配列は、様々な種に由来する変異体である場合があり、またこのような配列は、短縮、欠失、アミノ酸置換、または付加によって所定の配列から導かれる場合もある。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ等（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムのような、標準的なアラインメントアルゴリズムによって決定される。
【００１９】
用語「胚中心」は、本明細書中で使用される場合は、抗原免疫後に形成される二次Ｂ細胞濾胞をいう。この組織部位の出現は、最適な記憶の形成、イソ型の切り替え、体細胞超変異、およびこれによる抗体応答の親和性の成熟に関係しており、胚中心は当該分野で十分に特徴付けられている。
【００２０】
用語「辺縁帯」は、辺縁帯マクロファージ（ＭＺＭ）、金属親和性マクロファージ（ＭＭ）、辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞、および細網細胞、そしてさらにはＴ細胞と樹上細胞から主に構成される二次リンパ系組織の組織学的に記載される成分をいう。動脈の血流は周辺静脈洞の内部に向かって開いており、したがってこれにより抗原をこれらの細胞に直接接近させて、この部位での抗原に対する細胞性の反応を促進する。
【００２１】
用語「ＬＴ経路」は、ＬＴＢＲとその機能的なリガンドであるＬＴとの結合の結果として生体内で生じる相互に関係のある分子事象をいう。ＬＴ経路は、米国特許第６４０３０８７号、およびＦｕ等（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３９９；Ｒｕｄｄｌｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１９：１１９；Ｌｕｔｈｅｒ等（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：４７１；およびＷｅｙａｎｄ等（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５９：７８７に概説されている。表面リンホトキシン（ＬＴ）は、ＬＴ−αとＬＴ−βのヘテロ複合体から構成され、これはＬＴＢＲにのみ結合する（Ｗａｒｅ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８：１７５）。二次リガンドであるＬＩＧＨＴも存在する。これは、ＬＴＢＲに結合するだけではなく、ヘルペスウイルス侵入調節因子（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ））と呼ばれる別の受容体にも結合する。用語「ＬＴＢＲリガンド」または「ＬＴ」は、他に明記されない限りは、ＬＴ−α／βヘテロ三量体、ＬＴ−β、ＬＴ−α、およびＬＩＧＨＴをいう。用語「ＬＴＢＲリガンド結合ドメイン」は、ＬＴとの相互作用の特異的な認識に関係しているＬＴＢＲの部分（単数または複数）をいう。
【００２２】
用語「哺乳動物」は、ヒトを含む、そのように分類されるあらゆる動物をいう。
【００２３】
用語「ＢＡＦＦトランスジェニック動物」は、ＢＡＦＦＦまたはその機能的に同等の断片を過剰に発現するように遺伝子修飾されている哺乳動物をいう。ＢＡＦＦトランスジェニック動物を作成する具体的な方法は、本開示において後に記載される。
【００２４】
ＬＴＢＲは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、その機能性リガンドであるＬＴを通じた情報伝達によってリンパ系の器官形成において重要な役割を果たす。受容体は、広範囲の細胞型（例えば、線維芽細胞および単球）上で発現される。リガンドは活性化されたＴ、Ｂ、およびＮＫ細胞上でのみ発現される。ＬＴ経路は、二次リンパ系の発生、および慢性的な炎症の部位で異所に形成されたリンパ系構造の確立の両方において重要な役割を果たす（Ｆｕ等（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３９９；Ｒｕｄｄｌｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１９：１１９；Ｌｕｔｈｅｒ等（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：４７１；およびＷｅｙａｎｄ等（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５９：７８７）。
【００２５】
本発明は、可溶性形態のＬＴ−β受容体（ＬＴＢＲ）を用いたリンホトキシン（ＬＴ）経路の阻害によりＢＡＦＦトランスジェニックマウスの狼瘡様疾患の改善が導かれることの発見に、一部基づく。本発明はさらに、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎機能障害が、腎臓でのＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の蓄積に関係していることの発見に、一部基づく。
【００２６】
本発明はまた、ＬＴ経路の阻害因子を投与する工程を含む、糸球体腎炎を処置または予防するための方法を記載する。１つの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子が、自己免疫疾患を伴う糸球体腎炎の処置または予防のために投与される。用語「糸球体腎炎」は、腎臓の糸球体の炎症によって特徴付けられる腎機能障害をいう。糸球体腎炎は、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような、自己免疫症状によって引き起こされるか、またはそのような症状に関係している場合がある。本発明の１つの実施形態では、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、糸球体腎炎を処置または予防するために使用される。
【００２７】
本発明は、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることによって引き起こされる疾患を含む、免疫障害を処置または予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、免疫グロブリンの沈着を伴う腎機能障害に関係している病状を予防または処置するために使用され得る。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路の阻害因子を含む。いくつかの実施形態では、阻害因子はタンパク質性である。すなわちこれらは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含む。タンパク質性のＬＴ経路の阻害因子としては、ＬＴＢＲ−Ｉｇを含む可溶性形態のＬＴＢＲ、ＬＴＢＲに対する抗体、またはＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路のタンパク質性ではない阻害因子、例えば、核酸、低分子阻害因子、ＬＴ模倣物などを含む。
【００２９】
ＬＴＢＲおよびＬＴ、それらの断片または他の誘導体、あるいはそれらの類似体は、ＬＴＢＲまたはＬＴに特異的に結合する抗体を作成するために使用することができる。抗体の生産においては、所望される抗体のスクリーニングは、当該分野で公知の技術によって、最も一般的には、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって行うことができる（アッセイの例については、例えば、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３を参照）。
【００３０】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ等（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）によって作成することができる。種々の他の抗体生産技術については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ等編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。１つの実施形態では、本発明の方法において使用される抗体は、ヒトＬＴＢＲの細胞外部分の少なくとも一部に対する抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＬＴ経路を、例えば、ＬＴのＬＴＢＲへの結合をブロックすることによって阻害することができる。別の実施形態では、抗体は全体がヒトのものである。ＬＴＢＲに対する抗体の例としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第５９２５３５１号および同第６４０３０８７号に記載されているような、可溶性ＬＴとＬＴＢＲとの相互作用をブロックするヒトＬＴＢＲに対するＢＤＡ８モノクローナル抗体、および細胞表面ＬＴ−α／βとＬＴＢＲ−Ｉｇとの間での相互作用をブロックする、ヒトＬＴに対するモノクローナルＢ９抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＢＲに対する抗体もまた、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第６３１２６９１号に記載されている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、これらの方法には、ＬＴに結合し、それによって生体内のＬＴ経路を阻害する、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド）の使用が含まれる。具体的には、本明細書中に開示される可溶性形態のＬＴＢＲは、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産の無調節に関係している、内因性ＬＴＢＲ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＬＴＢＲ−Ｉｇは、これを治療上での使用に適切にする薬物動態特性、例えば、長い血液循環半減期および／またはタンパク質溶解性の分解に対する好ましい防御を有する。
【００３２】
ヒトＬＴＢＲの細胞外部分の配列は配列番号１に示され、これは、米国特許第５９２５３５１号の図１に示されている。配列番号１の配列情報と、当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＬＴＢＲのリガンド結合ドメインをコードする機能性断片をベクター中にクローニングし、適切な宿主中で発現させて、可溶性ＬＴＢＲ分子を生産させることができる。ＬＴリガンドへの結合について自然界に存在しているＬＴＢ受容体と競合することができる可溶性ＬＴＢＲ分子が、本明細書中および米国特許第６４０３０８７号に記載されているアッセイにしたがって、ＬＴＢＲ遮断因子として選択される。
【００３３】
配列番号１に記載されている配列から選択されるアミノ酸配列を含む可溶性ＬＴＢＲは、受容体融合タンパク質の生体内での安定性を高めるために、またはその生物学的活性もしくは局在性を調節するために、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（「融合ドメイン」）に結合させられる場合がある。１つの実施形態では、安定な血漿タンパク質（これは、通常は、血液循環において２０時間より長い半減期を有する）が、受容体融合タンパク質を構築するために使用される。このような血漿タンパク質としては、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の細胞または組織型に対して可溶性ＬＴＢＲ分子を標的化することができる配列もまた、特異的に局在化する可溶性ＬＴＢＲ融合タンパク質を作成するためにＬＴＢＲリガンド結合ドメインに結合させられる場合がある。
【００３４】
ＬＴＢＲリガンド結合ドメインを含むＬＴＢＲ細胞外領域（配列番号１）全体またはその機能性部分が、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのような免疫グロブリン定常領域に融合させられる場合もある（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐｐ．３３−４６（１９９５））。可溶性受容体−ＩｇＧ融合タンパク質は一般的な免疫学的試薬であり、それらの構築のための方法は当該分野で公知である（例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第５２２５５３８号を参照）。
【００３５】
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法において使用されるＬＴＢＲ−Ｉｇは、（ａ）ＬＴＢＲの細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体の定常領域に由来する第２のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
第１のアミノ酸配列は、ＬＴＢＲの細胞外ドメイン全体またはその一部に由来し、ＬＴに特異的に結合することができる。ヒトＬＴＢＲの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１に示される。特定の実施形態では、第１のアミノ酸配列は配列番号１と同一であるか、または実質的に配列番号１に示されているものそのものである。このような配列は、短縮された配列がＬＴに特異的に結合する能力を保持している限りは、短縮することができる。いくつかの他の実施形態では、第１のアミノ酸配列は、配列番号１の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、または１８０個の連続するアミノ酸を含む。
【００３７】
第２のアミノ酸配列は、抗体の定常領域、具体的には、Ｆｃ部分から誘導されるか、またはこのような配列の変異体である。いくつかの実施形態では、第２のアミノ酸配列はＩｇＧのＦｃ部分から誘導される。関連する実施形態では、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、または別のＩｇＧイソ型であるＩｇＧから誘導される。特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む。ここでは、Ｆｃはエフェクター機能を最小にするように修飾される。このような修飾としては、Ｆｃ受容体の結合のようなエフェクター機能を変化させることができる特異的な変化用のアミノ酸残基を含めること（Ｌｕｎｄ等（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ等（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４）、または定常領域を供給する種を変更することが含まれる。抗体は、エフェクター機能、すなわち、Ｆｃレセプターの結合および補体活性化を低下させる変異を、重鎖のＣＨ２領域に有することができる。例えば、抗体は、米国特許第５６２４８２１号および同第５６４８２６０号に記載されている変異のような変異を有することができる。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖においては、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列中のアミノ酸２３４および２３７に対応するアミノ酸残基で作成することができる。抗体はまた、Ａｎｇａｌ等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に開示されているように、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化させる変異、例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域中に変異を有することもできる。
【００３８】
種々のＩｇクラスおよびサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、様々な二次エフェクター機能を活性化することができる。活性化は、Ｆｃドメインが同種のＦｃ受容体に結合されると生じる。二次エフェクター機能としては、補体系を活性化させる能力、胎盤を通過する能力、および種々の微生物タンパク質に結合する能力が挙げられる。免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの特性は、Ｒｏｉｔｔ等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐ．４．８（Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，第３版，１９９３）に記載されている。
【００３９】
補体酵素のカスケードは、抗ｇｐｒｉ追跡（ａｎｔｉｇｐｒｉ−ｈｏｕｎｄ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ抗体のＦｃドメインによって活性化することができる。ＩｇＧ２のＦｃドメインはあまり有効ではないようであり、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのＦｃドメインは補体を活性化することについては全く効果がない。したがって、当業者は、それに伴う二次エフェクター機能がＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質で処置される特定の免疫応答または疾患について望ましいかどうかに基づいて、Ｆｃドメインを選択することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結され、これにはリンカー配列によって連結される場合も、リンカー配列を伴わない場合もある。リンカーの正確な長さおよび配列、さらには連結される配列に対するその方向は様々である。リンカーは、例えば、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒを含む。リンカーは、２、１０、２０、３０、またはそれ以上のアミノ酸の長さであり得、可溶性、長さ、立体構造の区別、免疫原性などのような望まれる特性に基づいて選択される。任意のタンパク質の配列中の特定のアミノ酸を、タンパク質の活性に有害な影響を与えることなく他のアミノ酸で置換することができることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、種々の変更を、タンパク質性である本発明のＬＴ経路の阻害因子のアミノ酸配列に対して、またはその生物学的活性または有用性を感知できるほどには損なうことなくそれらをコードするＤＮＡ配列に対して行うことができることが想定される。
【００４１】
ＬＴＢＲに関連する誘導体および類似体の使用は、本発明の範囲内である。特異的な実施形態では、誘導体または類似体は機能的に活性である、すなわち、例えば、配列番号１に示されるような野生型ＬＴＢＲのＬＴ結合ドメインに関係している１つ以上の活性を示すことができる。この結合を保持しているか、またはＬＴ経路を阻害する誘導体または類似体は、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３、米国特許第６４０３０８７号、または実施例に記載されるアッセイを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の手順によって望まれる活性について試験することができる。
【００４２】
ＬＴＢＲ−Ｉｇ、ＬＴＢＲ抗体、またはＬＴ抗体の誘導体は、機能的に同等の分子を生じる置換、付加、および／または欠失／短縮によってそれらのアミノ酸配列を変化させることによって作成することができる。ヌクレオチドコドンの縮重により、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施において使用することもできる。これらとしては、配列内のアミノ酸と機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンでの置換によって変化させられ、したがって「サイレントな」変化を生じるヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。例えば、無極性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性のある中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有している（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有している（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属しているクラスの他のメンバーから選択することができる（表１を参照）。さらに、ポリペプチド中の任意の天然の残基が、アラニンで置換される場合もある（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ等（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉ等（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照）。
【００４３】
本発明のＬＴＢＲ誘導体および類似体は、組み換え法および合成法を含む当該分野で周知の種々の技術によって生産することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，およびＢｏｄａｎｓｋｙ等（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００４４】
【表１】
特定の実施形態では、他のタンパク質に由来するアミノ酸配列に対する本発明のＬＴＢＲ−Ｉｇのいずれかのさらなる融合体を、本発明の方法での使用のために構築することができる。望ましい融合配列は、ＬＴＢＲの活性とは異なる生物学的活性を有しているタンパク質、例えば、サイトカイン、成長因子および分化因子、酵素、ホルモン、他の受容体成分などに由来する。また、ＬＴＢＲ−Ｉｇを、他のタンパク質および薬学的な因子に対して化学的にカップリングさせるか、または結合させることもできる。このような修飾は、得られる組成物の薬物動態および／または生体分布を変化させるように設計することができる。本発明のＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体はまた、米国特許第４６４０８３５号、同第４４９６６８９号、同第４３０１１４４号、同第４６７０４１７号、同第４７９１１９２号、または同第４１７９３３７号に示されている様式で、グリコシル化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）することができ、また、別のタンパク質性ではない高分子、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレンに連結することもできる。ＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体は、例えば、それらの血液循環における半減期を延長するために、高分子に共有結合させることによって化学的に修飾することもできる。ペプチドにそれらを結合させるための例示的な高分子および方法はまた、米国特許第４７６６１０６号、同第４１７９３３７号、同第４４９５２８５号、および同第４６０９５４６号に示されている。
【００４５】
本発明の方法において使用されるＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体はまた、検出可能な標識または機能性標識でタグをつけることもできる。検出可能な標識として、１３１Ｉまたは９９Ｔｃのような放射標識が挙げられる。これは、従来の化学方法を使用して結合させることができる。検出可能な標識としてはさらに酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼ）およびビオチンまたはアビジンのような検出可能な部分が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法には、核酸またはこのような核酸によってコードされるポリペプチドの投与が含まれる。ここでは、ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｂ）少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであり、定義された条件下で（ａ）の核酸にハイブリダイズすることができる核酸から選択される。ここでは、核酸の発現産物は、Ｂ細胞による免疫グロブリンの分泌を阻害することができる。１つの実施形態では、定義された条件は低ストリンジェンシーの条件である。別の実施形態では、定義された条件は中程度のストリンジェンシーの条件である。さらに別の実施形態では、定義された条件は、高ストリンジェンシーの条件である。
【００４７】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２，４，ａｎｄ ６に説明されているように、最小限の実験によって当業者が選択することができる。さらに、ストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，第７、９、および１１章に記載されている。定義される低ストリンジェンシーの条件の限定的ではない例は以下である。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ，０．１％のＰＶＰ、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４０℃で６時間、前処理する。ハイブリダイゼーションを以下の変更を加えた同じ溶液中で行う：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のデキストラン硫酸、および５〜２０×１０６の３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で４０℃で１８〜２０時間インキュベートし、その後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ，および０．１％のＳＤＳを含む溶液中で５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と交換し、さらに１．５時間、６０℃でインキュベートする。フィルターをブロットして乾燥させ、オートラジオグラフィーのために感光させる。当該分野で周知の低ストリンジェンシーの他の条件を使用することができる（例えば、種間ハイブリダイゼーションのために使用される場合）。
【００４８】
定義される高ストリンジェンシーの条件の限定的ではない例は以下である。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で６５℃で８時間から一晩行う。フィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液中で３７℃で１時間行う。これを、その後、０．１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗浄する。
【００４９】
様々な種々の宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは周知である。適切な宿主細胞として、細菌、哺乳動物細胞、ならびに酵母およびバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用することができる哺乳動物細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇを生産させるために適切な他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００５０】
適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および適切である場合には他の配列を含む）を含む適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、ファージ）である場合も、また適切である場合にはファージミドである場合もある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作についての多くの公知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ等編，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００５１】
発現後、ＬＴＢＲ−Ｉｇが単離および／または精製される（ＬＴＢＲ−Ｉｇ、ＬＴ（ＬＴ−α、ＬＴ−β、およびＬＴ−α／βを含む）の発現および精製のための例示的な手順は、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３に記載されている）。特異的なＬＴＢＲ−Ｉｇ、およびそれをコードする核酸分子、および本発明のベクターは、例えば、それらが自然界において存在している環境から、実質的に純粋であるかまたは均質な形態で、あるいは核酸の場合には、必要な機能を有しているポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子の起源を含まないかまたは実質的に含まない状態で、得る、単離する、および／または精製することができる。
【００５２】
本発明は、治療用化合物（「治療薬」）の投与により種々の疾患および障害を処置または予防するための方法を提供する。適切な治療薬として、ＬＴＢＲ、その類似体および誘導体（断片を含む）；ＬＴＢＲタンパク質をコードする核酸、類似体、または誘導体；ＬＴＢＲアンチセンス核酸、ＬＴＢＲ抗体、ＬＴ抗体、ならびに他のＬＴＢＲ／ＬＴアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の方法による処置に敏感である免疫障害の例として、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような自己免疫症状が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧのような免疫グロブリンの生産の無調節を含む、Ｂ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になる免疫障害は、本明細書中に開示される治療薬の投与によって処置されるかまたは予防される。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＩｇＡを過剰生産するＢ−１細胞である。いくつかの実施形態では、疾患は、高い（正常な濃度または望ましい濃度と比較して）自己免疫抗体濃度によって特徴付けられる。いくつかの他の実施形態では、免疫グロブリンの無調節な生産により、腎臓中でＩｇＡの病理学的な沈着が生じる。このような障害としては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ならびに臨床的な兆候として肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿およびＩｇＡの沈着の存在が挙げられる他の疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、本発明の方法は、ＧＣとは無関係な機構を有する自己免疫障害を処置するために使用される。さらに他の実施形態では、これらの方法は、例えば、シェーグレン症候群のような、高いレベル（正常なレベルまたは望ましいレベルと比較して）のＭＺ Ｂ細胞を特徴とする疾患を処置するために利用される。さらに別の実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子が、例えば、自己免疫症状を伴う糸球体腎炎を含む、糸球体腎炎の被験体を処置するために使用される。
【００５４】
特異的な実施形態では、ＬＴＢＲ機能を阻害する治療薬が、（１）ＬＴＢＲもしくはＬＴの高い発現レベル（すなわち、正常レベルもしくは望まれるレベルと比較して）、または高いＬＴＢＲもしくはＬＴの機能的活性に関係している疾患または障害において、あるいは（２）生体外または生体内でのアッセイによりＬＴ経路の阻害因子の投与の有効性が明らかにされている疾患または障害において投与される。高い発現または活性のレベルは、例えば、患者から生物学的試料（例えば、尿試料）を採取し、そして肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿の存在について試料をアッセイすることによって、容易に検出することができる。ＬＴＢＲタンパク質を検出および／または視覚化するためのキナーゼアッセイ、免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫細胞化学など）、ならびに／あるいはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲなど）を含むがこれらに限定されない、当該分野で標準的である多くの方法を使用することができる。
【００５５】
本発明の１つの実施形態は、腎臓でのＩｇの沈着を伴う疾患を含む、自己免疫障害を処置するための治療薬として有効である、ＬＴ経路の阻害因子を同定するためのアッセイを提供する。このスクリーニングアッセイでは、第１の結合混合物が、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドとリガンド（例えば、ＬＴ）を結合させることによって形成され；そして第１の結合混合物中での結合の量（Ｍ０）が測定される。第２の結合混合物もまた、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド、リガンド、およびスクリーニングされる化合物または試薬を結合させることによって形成させられ、第２の結合混合物中での結合の量（Ｍ１）が測定される。その後、第１の結合混合物と第２の結合混合物中での結合の量が、例えば、Ｍ１／Ｍ０比を計算することによって比較される。化合物または試薬は、第１の結合混合物と比較して、第２の結合混合物中での結合において減少が観察される場合に、Ｉｇ媒介性の腎臓病を阻害することができるとみなされる。結合混合物の構成および最適化は当業者のレベルの範囲内であり、このような結合混合物には、結合を促進または最適化するために必要な緩衝液および塩が含まれる場合もあり、さらに対照アッセイが本発明のスクリーニングアッセイに含まれる場合もある。したがって、ＬＴＢＲ／ＬＴ結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％減少させることが明らかになった化合物を同定することができ、その後、必要である場合には、以下に記載されるような他のアッセイまたは動物モデルにおいて自己免疫障害を改善する能力についての二次スクリーニングが行われる。受容体とリガンドとの間での結合の強度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴に基づく技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定することができる。これらの全てが当該分野で周知の技術である。
【００５６】
ＬＴ経路の阻害因子は、ノックアウトモデルにおいて複雑な発育不全が観察されることなく、ＢＡＦＦトランスジェニックモデルにおいて腎機能障害を緩和することが明らかにされる。したがって、このような動物モデルを、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることに関係している障害について、治療用化合物を同定し、そして／またはその効力を試験するためのアッセイにおいて使用することができる。免疫に関係している腎臓の病状の特定の態様は、ＢＡＦＦトランスジェニック動物において観察することができる。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、尿中のタンパク質濃度を記録することによって評価されるように、６ヶ月齢またはそれ以降で狼瘡のような症状を発症し始める。ＢＡＦＦトランスジェニック動物のＩｇ力価の上昇は、ＩｇＡサブクラスについて最も顕著であり、集めたデータから、腎臓ではＩｇＧ分泌細胞よりもＩｇＡ分泌細胞のほうが多く存在することが明らかである。さらに、マウスへのＢＡＦＦの注射により、ニューモバックス抗原に対する過剰な応答が生じ、最も劇的な影響を受けるイソ型がＩｇＡである。したがって、特定の実施形態では、ＢＡＦＦトランスジェニック動物が、ＩｇＡ腎症を含むＩｇＡに関連する免疫障害、またはＩｇＡ成分が強い他の障害の処置について化合物の効力を評価するために使用される。ＢＡＦＦトランスジェニック動物はまた、濾胞性Ｂ細胞およびＧＣ反応が重要ではない疾患状態に似た症状を呈するために使用することもできる。ＢＡＦＦトランスジェニック動物モデルは、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような免疫障害を処置または予防する能力について、分子をスクリーニングまたは試験するために使用することができる。
【００５７】
ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、肝臓特異的調節配列の制御下で全長のマウスＢＡＦＦを発現する。このトランスジェニックマウスは、以前に記載されているように作成される（Ｍａｃｋａｙ等（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６９７）。マウスは、トランスジェニックの雄をＣ５７ＢＬ／６雌に戻し交配させることによって、コロニーを発現させ続けることにより作成することができる。トランスジェニック状態は、テールチップから回収したＤＮＡについてＰＣＲを行うことによって検出することができる。トランスジェニック方法については、一般的には、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｏｆｋｅｒ等編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２を参照のこと。簡単に言うと、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは以下のようにして作成された。全長のマウスＢＡＦＦをコードするＰＣＲ断片を、以前に記載された配列情報（Ｓｃｈｅｉｄｅｒ等（１９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：１７４７−１７５６）を使用して逆転写ＰＣＲによって作成した。第１鎖ｃＤＮＡを、製造業者によるプロトコール（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に従ってオリゴｄＴを使用してマウスの肺のポリＡ＋（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から合成した。ＰＣＲ反応には、１×ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０％のＤＭＳＯ、１２．５ｐＭのプライマー、５単位のｐｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、および以下のプライマーＮｏｔ１制限部位を含めた：
５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡ−３’（配列番号２）
５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡ−３’（配列番号３）。
【００５８】
鋳型を、９４℃で１分間、５４℃で２分間、および７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル増幅し、その後７２℃で１０分間の伸張を行った。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋファイルＡＦ１１９３８３のヌクレオチド２１４−１１７１に対応する。ＰＣＲ断片をＮｏｔ１で消化し、改良型ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）にクローニングした。その後、得られたベクターをＸｂａ１で消化して、ＢＡＦＦとＳＶ４０ポリＡ付加部位の配列を切り出した。プラスミドクローン５４０Ｂから予め精製しておいたヒトＡｐｏＥエンハンサーとＡＡＴ（α−抗トリプシン）を含む１ｋｂの平滑末端Ｂｇｌ２−Ｎｏｔ１断片であるプロモーターをＥｃｏＲＶ部位にさらに挿入したｐＵＣ系のベクターに、この断片をクローニングした。ＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌ２断片を最後のベクターから精製して、トランスジェニックマウスの作成のために使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌×ＤＢＡ／２Ｊ雄Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスの注射した子を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。マイクロインジェクションおよびトランスジェニックマウスの作成の技術は、以前に記載されている（Ｍｃｋｎｉｇｈｔｓ等（１９８３）Ｃｅｌｌ，３４：３３５−３４１）。
【００５９】
当業者は、化合物が必要に応じて、例えば以下のような少なくとも１つの別の動物モデルにおいて試験される場合があることを理解している（概要については、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｒｓｈｗｉｎ等編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１を参照）：ＳＷＲ×ＮＺＢ（ＳＮＦ１）トランスジェニックマウスモデル（Ｕｎｅｒ等（１９９８）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ．１１（３）：２３３−２４０）、ＫＲＮトランスジェニックマウス（Ｋ／Ｂ×Ｎ）モデル（Ｊｉ等（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：１３９）；ＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ）マウス、ＳＬＥのモデル（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ等（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４４（１０）：２４３５−２４４５）；マウスの実験用自己免疫脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症のモデル（Ｔｕｏｈｙ等（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１１２６−１１３０，Ｓｏｂｅｌ等（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２３９３−２４０１、およびＴｒａｕｇｏｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４−１２９）；糖尿病のＮＯＤマウスモデル（Ｂａｘｔｅｒ等（１９９１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，９（１）：６１−６７など）。
【００６０】
特定の実施形態では、試験される化合物には、例えば、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇ）のようなＬＴ経路の阻害因子、ＬＴＢＲに対する抗体、およびＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体；それらの類似体、誘導体、および断片；それらをコードする核酸およびアンチセンス核酸（ならびにそれらの相補配列および相同配列）が含まれる。例示的な実施形態では、マウスに、約１μｇから約１ｍｇ、好ましくは約１０μｇから約５００μｇ、またはさらに好ましくは約１００μｇの、ＬＴＢＲ−ＩｇあるいはＩｇ対照が、５週間の期間にわたって腹腔内に注射される。腎機能が、以下の少なくとも１つによって評価される：タンパク尿、免疫組織分析、脾臓の重量、脾細胞の数、濾胞性Ｂ細胞の数、辺縁帯Ｂ細胞の数（例えば、Ｂ２２０＋脾細胞の割合）、Ｂ−１ｂ細胞に対するＢ−１ａ細胞の割合、血漿細胞の数およびＩｇＡ＋血漿細胞の数、ならびに脾臓、骨髄、または腎臓中でのＩｇＡまたはＩｇＧ分泌因子の頻度など。血清もまた、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、複雑な結合組織の障害（ＭＣＴＤ）、および全身性硬化症を含む全身性リウマチ疾患の典型的なマーカーとして細胞性の核抗原に結合することが知られている、自己抗核抗体（ＡＮＡ）の存在について評価される場合がある。
【００６１】
例えば、動物試験にしたがって決定されるような仮の用量、およびヒトへの投与についての投与量のスケーリングは、当該分野での慣例にしたがって行われる。毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬理学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
【００６２】
治療有効用量は、細胞培養アッセイによって最初に概算することができる。用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルにおいて決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する治療薬の濃度）を含む、血液循環中での血漿濃度の範囲が得られるように、動物モデルについて処方され得る。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切な生体アッセイによってモニターすることができる。投与量の例は、約０．１×ＩＣ５０、約０．５×ＩＣ５０、約１×ＩＣ５０、約５×ＩＣ５０、１０×ＩＣ５０、約５０×ＩＣ５０、および約１００×ＩＣ５０である。
【００６３】
細胞培養アッセイまたは動物実験によって得られたデータを使用して、ヒトでの使用のための投与量の範囲を計算することができる。１つの動物モデルにおいて得られた治療有効投与量を、ヒトを含む別の動物での使用のために、当該分野で公知の換算係数を使用して変換することができる（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ等（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４、および相当する表面積投与量係数についての表２を参照）。
【００６４】
【表２】
このような化合物の投与量は、ほとんど毒性がないかまたは毒性がまったくなくＥＤ５０を含む血液循環の濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。通常は、治療有効量は、被験体の年齢、症状、および性別、さらには被験体の医学的症状の重篤度によって変化し得る。投与量は医師によって決定され、必要である場合には、観察される処置の効果に適応するように調節することができる。一般的には、組成物は、ＬＴ経路の阻害因子がおよそ１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまで、１００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、および５００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与される。組成物は、投与後もっとも長い時間にわたって血液循環中での濃度が最大となるように、注射（ｂｏｌｕｓ ｄｏｓｅ）で投与される場合がある。注射（ｂｏｌｕｓ ｄｏｓｅ）後に、静注も使用される場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路の１つ以上の阻害因子と、薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合は、語句「薬学的に許容される賦形剤」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などをいい、これらは薬学的投与に適合するものである。このような媒体および薬剤を薬学的活性のある物質に使用することは当該分野で周知である。組成物には、さらに、補助的な、それ以上の、または高い治療作用を提供する他の活性のある物質が含まれる場合もある。また、薬学的組成物は、箱、パック、ディスペンサー型の容器中に、投与についての説明書とともに含まれる場合もある。
【００６６】
薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与を行うための方法は当該分野で公知である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、洞内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下、または皮膚を通じて行われ得る。局所または経口投与することができる組成物を得ることが可能である場合もある。
【００６７】
皮内または皮下での適用に使用される溶液または懸濁液には、通常、以下の成分の１つ以上が含まれる：注射のための水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成の溶媒のような滅菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝物質；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張力の調節のための試薬。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて調節することができる。このような調製物は、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用のバイアル中に封入することができる。
【００６８】
注射に適切な薬学的組成物として、滅菌の水溶液または分散液、および滅菌の注射可能な溶液または分散液を即座に調製するための滅菌の粉末が挙げられる。静脈内投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌のものでなければならず、容易にシリンジ中に存在できる程度に流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は溶媒または分散媒体であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって得ることができる。多くの場合には、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００６９】
経口組成物は、通常、不活性な希釈剤または食用の担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入することができ、また錠剤になるように圧縮して固めることもできる。経口による治療的投与の目的のためには、ＬＴ阻害因子を賦形剤とともに組み入れることができ、これは錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用される。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分の任意のもの、または同様の性質の化合物を含むことができる；微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンのような結合剤；澱粉または乳糖のような賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシ澱粉のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味剤のような香味剤。
【００７０】
吸入による投与については、ＬＴ阻害因子は、適切な圧縮ガス、例えば、二酸化炭素のような気体を含む加圧型容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で投与される。
【００７１】
全身投与は、粘膜を通じるか、皮膚を通じる手段によっても行うことができる。例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇと抗体の場合には、組成物は、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される経路を通じて粘膜（例えば、腸粘膜、口腔粘膜、または肺粘膜）を透過することができる（米国特許第６０３０６１３号）。粘膜を通じる投与は、例えば、薬用キャンディー、鼻腔スプレー、吸入器、または坐剤の使用によって行うことができる。皮膚を通じる投与のためには、活性のある化合物は、当該分野で一般的に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、またはクリーム剤に処方される。粘膜を通じる投与または皮膚を通じる投与については、浸透させられるバリアに適切である浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は当該分野で一般的に知られており、例えば、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【００７２】
ＬＴ阻害因子は、化合物が体から迅速に排出されてしまわないように保護する担体とともに、例えば移植片およびマイクロカプセル化された送達システムを含む徐放処方物のように、調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は当業者に明らかである。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【００７３】
投与を容易にし、投与量を均一にするためには、投与量単位の形態に経口組成物または非経口組成物を処方することが有効であり得る。投与量単位の形態は、本明細書中で使用される場合は、処置される被験体についての単位投与量として適応させられた物理的に分けられている単位をいう。個々の単位は、必要な薬学的担体と組み合わせて、望ましい治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性のある化合物を含む。
【００７４】
タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸、例えば、ＬＴＢＲ全体もしくはその一部をコードする核酸、またはそれらに対応するアンチセンス核酸を、組織、器官、または生物体の細胞に導入することができ、その結果、コードされるポリペプチドを発現させることができる。特異的なプロトコールについては、Ｍｏｒｇａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照のこと。この方法論は、例えば、個体の組織および器官に対するタンパク質性のＬＴ阻害因子の効果を評価することにおいて有用であり得る。特定の実施形態では、タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸は、組織特異的な発現制御配列に連結される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列を、哺乳動物に全身的または局所的に注射することができる、ウイルスまたはプラスミドベクター中に挿入できることを理解している。また、宿主細胞を回収することができ、タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸を、そのような細胞に生体外でトランスフェクトして、その後、当該分野で公知の方法を使用して再度移植することもできる。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等編，１９９９に記載されているように、核酸を単細胞である胚にトランスフェクトして、トランスジェニック動物を作成することもできる。
【実施例１】
【００７５】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により腎機能が改善する
肝臓特異的調節配列の制御下で全長のマウスＢＡＦＦを発現するＢＡＦＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、以前に記載されたように作成した（Ｍａｃｋａｙ等（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６９７）。使用した全てのマウスを、Ｔｇの雄をＣ５７ＢＬ／６雌に戻し交配させることによって、コロニーを発現させ続けることにより作成した。トランスジェニック状態は、テールチップから回収したＤＮＡについてＰＣＲを行うことによって決定した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、尿中のタンパク質濃度を記録することによって評価すると、６ヶ月齢およびそれ以降に狼瘡のような症状を発症しはじめた。
【００７６】
ＬＴＢＲ−ＩｇがＢＡＦＦトランスジェニックマウスの処置において有効であるかどうかを評価するために、１＋／２＋またはそれよりも高いタンパク尿（ＰＵ）スコアを示す６ヶ月齢またはそれ以上の動物を、５週間の処置レジュメに登録するために選択した。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスと、トランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。最後の注射の４日後にマウスを安楽死させ、組織分析のために腎臓を採取した。
【００７７】
４回の別々の実験において、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、５週間の処置期間の後のタンパク尿スコアが明らかに低下した（処置前のＰＵレベル対処置後のＰＵレベル、Ｐ＜０．０００４、ｎ＝２６）。しかし、対照である対応するタンパク質での処置によっては、腎機能の改善はできなかった（Ｐ＝０．８、ｎ＝２３）（図１Ａ）。トランス遺伝子を含まない同腹子から記録したＰＵスコアは、処置期間全体にわたって穏やかに変化したが、スコアは処置レジュメ全体について＋１（疾患ではない）を下回ったままであり、したがってＰＵスコアにおけるこれらの機能は意味のないものであることになる（図１Ｂ）。さらに、ＬＴＢＲ−ＩｇとｈｕＩｇＧ対照で処置したトランス遺伝子を含まない同腹子との間には観察できるほどの差はなく、したがってそれらのスコアは重ね合わさった。
【００７８】
ＢＡＦＦトランスジェニックモデルの特徴を別の狼瘡モデルと比較するために、ＳＮＦ１マウスを、ＬＴＢＲ−Ｉｇで治療的または予防的のいずれかで処置した。これらの動物の糸球体腎炎（ＧＮ）は、ＭＲ１での処置により顕著に改善された。これはおそらく、ＧＣ反応に対するその効果によるものである。マウスを、そのタンパク尿スコアがおよそ＋１である場合には疾患の発症前に処置し、またスコアが＋３／＋４に達していた場合には、マウスを治療的に処置した。いずれの場合にも、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては、タンパク尿の測定値または腎臓の病状には全く効果がなかった。これらの動物にＬＴＢＲ−Ｉｇを投与した場合には、生存性においていくらかの効果があったが、これはＧＮの状態とは無関係である。したがって、ＬＴ経路はＢＡＦＦトランスジェニックマウスのＳＬＥ様疾患においては重要であるが、この経路は、ＭＲ１がさらに有効であるＳＮＦ１モデルにおいてはあまり重要ではないようである。
【実施例２】
【００７９】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により腎臓の糸球体の損傷が改善される
タンパク尿によって評価される腎機能不全には、複数の腎臓病の側面が伴う。腎炎の腎臓においては、いくつかの病状を見ることができる。糸球体は、大きくなっており過形成しているように見え、糸球体の内部にコラーゲンの沈着を見ることができる。さらに、多くの場合に、糸球体周辺に浸潤が観察され、さらに重篤な腎炎の症例では、タンパク質性の円柱に気づくことができる。
【００８０】
ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスとトランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）対照を、実施例１に記載したようにＬＴＢＲ−ＩｇまたはｈｕＩｇＧで処置した。コラーゲンの沈着を評価するためのパス（ＰＡＳ）染色を使用して、４回の別々の研究による腎臓を評価した。腎臓の病状における統計学的有意性（Ｐ＜０．００２）の低下が、ｈｕＩｇＧ対照動物と比較して、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって観察された（図２Ｇ）。個々の動物についての病状の範囲は広く、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は全ての動物の病状を予防するものではなかった。典型的な組織化学的試料を図２Ａ〜２Ｆに示す。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置はおそらく、腎臓の病状が早くすすむことを妨げるが、開始時のＰＵスコアが３よりも高いマウスは、処置に対してあまり反応しないようであり、処置後には最も大きな腎臓の病変を示した（図２Ｇ、三角）。
【実施例３】
【００８１】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により自己抗体力価が低下する
ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスの血清Ｉｇ濃度が、トランスジェニックではない同腹子と比較して高いことが示された。図３Ａに示すように、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスを使用すると、ＩｇＭ力価（７．３倍）およびＩｇＡ力価（１０．６倍）の両方が顕著に増大し、ＩｇＧ２ａ力価（２．４倍）は中程度に増大した。全ＩｇＧ力価については、わずかに１．２倍の増大が見られただけであった。
【００８２】
ｈｙｐｅｒ−ＩｇＡマウスのＬＴ経路の阻害がＩｇＡレベル全体に影響があるかどうかを決定するために、自己抗体力価の試験をＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて行った。５週間にわたるＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は、ＩｇＡを含む全てのＩｇイソ型に対してまったく影響がなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。わずかおよそ３０％のＢＡＦＦトランスジェニックが抗ＤＮＡ力価の兆候を有していただけであり、これらは非常に弱かった。抗クロマチン力価は、トランスジェニックマウスの血清中にもっと確実に存在していた。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、抗クロマチン力価は、５週間にわたる処置期間の間に３６％低下した。しかし、ＩｇＧで処置したトランスジェニックマウスは、同じ処置期間の間に抗クロマチン力価において２５％の低下を示した。
【００８３】
自己抗体力価は、多数の動物モデルにおいて疾患と必ずしも関係していない。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおける低い抗ＤＮＡ抗体力価は、観察される腎臓の病状と必ずしも一致していない。したがって、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置が抗ＤＮＡ抗体の生産をより確実に生じるシステムにおいて、これらの自己抗体の作成を加速させることができるかどうかを決定することが望まれた。プリスタンの１回の注射により、種々のバックグラウンドマウス株において抗ＤＮＡ抗体が誘導されることが示されているが、作用機構は明らかではない。プリスタンを注射したマウスにおけるＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の効果を評価した。ＤＢＡ−１マウスへのプリスタンの注射の４週間後、測定できる程度の抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ力価および抗一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ力価が、これらの動物の血清中で観察された（図３Ｄ）。しかし、注射をしていないマウスは抗ＤＮＡ力価を生じなかった。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、抗ｄｓＤＮＡ力価および抗ｓｓＤＮＡ力価の誘導は完全に妨げられた。したがって、自己抗体力価がより高いシステムにおいては、これらの力価をＬＴＢＲ−Ｉｇ処置によって妨げることができる。
【実施例４】
【００８４】
免疫複合体はＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎臓中に沈着する
ＳＬＥを伴う腎臓の病状には、多くの場合に糸球体内部での免疫複合体の沈着が伴う。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、血液循環中に高いレベルの免疫複合体を有していることが示されている。これらのマウスはまた、糸球体内での免疫複合体の沈着の兆候も示す。
【００８５】
ＢＡＦＦトランスジェニックの腎臓中のＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の存在を試験した。凍結した腎臓切片をアセトンで固定し、風乾させ、そして１０％のＦｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、５％のラットの血清、および５％のＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液とともにインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。切片をビオチン結合ラット抗マウスＩｇＡ特異的モノクローナル抗体とともに３０分間インキュベートし、その後、ストレプトアビジン−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションを、加湿チャンバー内で室温で行った。糸球体を、ＵＶ線下で試験し、ＩｇＡの沈着が存在するかどうかについて記録した。血清ＩｇＡの力価は５週間のＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては変化しなかったが、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの糸球体中のＩｇＡ免疫複合体の状況は明らかに減少した（対照で処置したＢＡＦＦトランスジェニックと比較してＰ＜０．０１）（図４Ａおよび４Ｃ）。ＩｇＧ免疫複合体の沈着については、処置を用いても有意な差は検出されなかった（図４Ｂおよび４Ｃ）。このことは、この疾患のパラメーターの縮小が、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって観察される効力には寄与していないことを示唆している。
【実施例５】
【００８６】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により辺縁帯Ｂ細胞が減少する
ＢＡＦＦトランスジェニックマウスはＴ２過渡期のＢ細胞、ＭＺ Ｂ細胞、成熟濾胞性Ｂ細胞、およびいくつかの場合にはＢ−１細胞の拡大を示す。この拡大には、脾臓の重量の増加、および細胞充実性の増大が伴う。マウスを実施例１に記載したように処置した。５週間の処置期間の後、これらのパラメーターを、ＬＴ阻害によって調節されるそれらの能力について分析した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの脾臓の重量は、トランス遺伝子を含まない同腹子よりも平均して１．５倍重く、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置はこの脾腫には効果がなかった（図５Ａ）。さらに、脾臓の細胞充実性だけではなく成熟ＣＤ２３＋濾胞性Ｂ細胞の数もまた、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって変化せず（図５Ｂ）、同様であった（図５Ｃ）。ＭＺ Ｂ細胞の数を、ＣＤ２３−ＣＤ１ｈｉＣＤ２１ｈｉ Ｂ細胞を数えることによって評価した。トランスジェニックではない同腹子に対してＢＡＦＦトランスジェニックの脾臓においてはおよそ４倍に増加した濾胞性Ｂ細胞のサブセットに対して、ＭＺ Ｂ細胞の数はおよそ１３倍に増大した。この非常な増加にもかかわらず、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、対照での処置と比較してＭＺ Ｂ細胞の数は劇的に減少した（Ｐ＜０．００００６）（図５Ｄ）。さらに、ＭＺ Ｂ細胞成分の減少は、抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＤを含む脾臓切片を含むことによる、免疫組織化学的分析によっても観察された。この場合、Ｂ細胞濾胞の外側にある、ＩｇＭのみが陽性であるＭＺは、トランスジェニックとトランスジェニックではない同腹子の両方において、処置によって大幅に減少した（図５Ｅ）。したがって、脾腫と濾胞性Ｂ細胞成分の増加はＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては変化しなかったが、ＭＺ Ｂ細胞成分が処置に敏感であった。
【００８７】
Ｂ−１細胞は、それらが応答する抗原の種類に関してＭＺ Ｂ細胞と多くの類似点を示し、これらは、ＲａｇまたはＩＬ−７の発現が成体マウスにおいてオフに変換されると長期間持続することができることが示されている。Ｂ−１細胞のサブセットは自己反応性Ｂ細胞受容体を発現することができるので、ＬＴＢＲ−Ｉｇがこのサブセットに対して効果があるかどうか、そしてこのサブセットがＢＡＦＦトランスジェニックマウスの疾患に必要であるかどうかを決定することが目的であった。Ｂ−１サブセットは、同腹子の対照と比較して、高齢のＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいておよそ２〜３倍拡大していることが明らかになった。さらに、Ｂ−１ａサブセットは、わずかに優先して拡大するようであった（表３にまとめる）。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は、これらのマウスの腹腔洗浄法によって分析したＣＤ２３−ＣＤ５＋Ｂ−１ａ細胞の非常な増加に対しては効果がないことが明らかになった。したがって、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によるＢＡＦＦトランスジェニックマウスのＧＮの改善は、Ｂ−１ａ細胞の減少によっては説明することはできない。
【００８８】
他のＢ細胞エフェクター成分もまた、処置したＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて増加した（表３にまとめる）。免疫応答の後、血漿細胞は骨髄（ＢＭ）へと戻ったが、脾臓およびリンパ節では検出することができた。血漿細胞の数を、シンデカン−１についての染色によりＦＡＣＳによって評価した。ＢＡＦＦトランスジェニック動物においては、血漿細胞は、トランスジェニックではない同腹子と比較して、脾臓においておよそ６倍に増加した。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては脾臓の血漿細胞の数は減少しなかった−実際には、これらは数はわずかに増加した。このことはおそらく、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置が、多くの場合に穏やかな脾腫を誘導し、これが次いでこれらの細胞のさらなる増加を生じるという事実が原因である。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腸間膜のリンパ節（ＭＬＮ）においては、ＩｇＡを分泌する血漿細胞の非常に大きな増加（３５倍）が記録された。これらは、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっておよそ２倍に減少した。ＢＭにおいて、Ｉｇ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴ（商標）分析によって評価した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、トランスジェニックではない同腹子と比較して、ＩｇＧ分泌細胞の４６倍の増加、およびＩｇＡ分泌細胞の５倍の増加を示した。しかし、ＩｇＧ分泌細胞とＩｇＡ分泌細胞の数は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては減少しなかった。
【００８９】
最後に、ＳＬＥ動物において、血漿細胞が腎臓中で観察された。おそらくこれは、この炎症した器官でのケモカインの発現が原因である。したがって、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいては、有意な数のＩｇＡ分泌細胞、およびあまり有意ではない数のＩｇＧ分泌細胞が、ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）によって腎臓で検出された。ＩｇＡ分泌細胞は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっておよそ２倍減少した。まとめると、試験した全ての細胞のサブセットのうち、ＭＺ Ｂ細胞だけをＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって明らかに調節することができたが、腎臓中およびＭＬＮ中のＩｇＡ分泌細胞は、部分的にＬＴ制御下にある場合もあった。このことはまた、これらのエフェクター細胞の炎症組織への移動ができないことを示唆している。ケモカインの発現の破壊が、おそらくこの表現形の原因であり、ＳＬＥを処置することにおいて重要な治療上の利点を有している可能性があった。実際、ＣＸＣＲ３リガンドは、最近、血漿細胞の移動において重要であることが示されている。血漿細胞の移動におけるＬＴ経路の役割と一致して、本発明者らは、ＣＸＣＲ３リガンドをＩＦＮ−γの存在下でのＬＴＢＲでの刺激によって誘導できることを見出した。
【００９０】
【表３】
【実施例６】
【００９１】
疾患状態のＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおけるＧＣの役割の評価
濾胞性樹状細胞（ＦＤＣ）は、マウスにおいても霊長類においてもＬＴ経路によって厳密に調節されている。ＦＤＣはＧＣ中に存在し、抗原を保持する能力を有しているので、この種の細胞は免疫応答の間に親和性の高いＢ細胞を選択することにおいて役割を果たすことができる。ＬＴ欠損動物とＬＴＢＲ−Ｉｇで処置した動物での体液性応答の親和性の成熟の試験により、抗原の用量と投与経路におそらく依存する種々の結論が得られた。いずれの場合にも、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の結果としてのＦＤＣネットワークの排除が、処置を用いて観察された糸球体腎炎（ＧＮ）の改善についての１つの説明である可能性がある。マウスを実施例１に記載したように処置した。処置の５週間後、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスに由来する脾臓を、ＧＣを数えるためにＰＮＡ染色について評価した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは有意な数のＧＣを有していることが観察されたが、これらは全く免疫化されていなかった（図６Ａ（ｉｉｉ））。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、ＢＡＦＦトランスジェニックの脾臓中のＰＮＡ陽性ＧＣの数は一部減少した（Ｐ＜０．００６）（図６Ｂ）。しかし、脾臓をＦＤＣ特異的マーカーであるＭ−１で染色すると、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によるＦＤＣネットワークにおける減少は完全であった。したがって、ＰＮＡ陽性ＧＣにおいては完全には減少しないが、ＦＤＣネットワークはＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって排除される。
【００９２】
ＰＮＡ陽性ＧＣにおけるこの部分的な減少がＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて観察された疾患の縮小と関係があるかどうかを決定するために、ＣＤ４０経路を遮断する効果を評価した。ＣＤ４０欠損動物はＰＮＡ陽性ＧＣを形成することができず、Ｔ依存性免疫応答はこれらの動物においては完全に失われている。さらに、成体マウスの抗ＣＤ４０リガンド抗体（ＭＲ１）での処置は、ＧＣおよびＴ依存性免疫応答に対して同様の効果を有する。ＬＴＢＲ−Ｉｇで処置した動物と同様に、ＭＲ１での処置は脾腫に対して効果がなかった（図７Ａ）だけではなく、増加した濾胞性Ｂ細胞成分に対しても効果がなかった（図７Ｂ）。しかし、ＭＲ１また、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの増加したＢＺ Ｂ細胞成分に対しても全く効果がなかった（図７Ｃ）。ＭＲ１で処置したＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、それらの脾臓においては、観察できる程度にはＰＮＡ陽性ＧＣを有していなかった（対照で処置したＢＡＦＦトランスジェニックと比較してＰ＜０．００１）（図７Ｄおよび７Ｅ）。ＧＣに対するこの効果にもかかわらず、ＭＲ１での処置は、タンパク尿によって測定したように、疾患状態にあるトランスジェニックマウスの腎機能を改善できなかった（図７Ｆ）だけではなく、腎臓の病状を有意に改善することもできなかった。まとめると、ＧＣ反応およびＴ依存性応答に対するこの十分に研究された効果にもかかわらず、ＣＤ４０経路の阻害は、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの疾患には効果がなかった。
【００９３】
本明細書は、参照により本明細書中に組み込まれる、明細書中で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例を提供し、本発明の範囲を限定するようには解釈されるべきではない。当業者には、多くの他の実施形態が本発明に含まれることが理解される。本開示において引用された全ての刊行物および特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書中の全ての参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であると自認するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、疾患状態にあるＢＡＦＦトランスジェニック（ＢＡＦＦ Ｔｇ）マウスのＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、タンパク尿（ＰＵ）スコアによって示されるように腎機能の改善が生じたことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ Ｔｇマウスとトランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。図１Ａは、処置の終了時点でのＰＵスコアにおける絶対的変化を示す。図１ＢはＰＵスコアにおける相対的変化を示す。
【図２】図２は、疾患状態にあるＢＡＦＦ−ＴｇマウスのＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、腎臓のパス（ＰＡＳ）組織化学的染色によって示されるように、糸球体の病状の改善が生じたことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組試料を、図２Ａ〜２Ｆに示す。糸球体の病状のスコアを図２Ｇに示す。
【図３】図３は、自己抗体の力価に対するＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の効果を示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。血清Ｉｇ濃度を測定し、組織分析のために腎臓を採取した。図３Ａは、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスが、野生型の同腹子である対照と比較して、高い血清ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ濃度を示したことを明らかにしている。図３Ｂ〜３Ｃは、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によりＢＡＦＦ Ｔｇマウスの自己抗体力価が低下したことを示す。
【図４】図４は、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスの腎臓での免疫複合体の沈着を示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組織化学的試料を図４Ｃに示す。ＢＡＦＦ−ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの糸球体中のＩｇＡ（図４Ａ）およびＩｇＧ（図４Ｂ）免疫複合体の状況を記録した。
【図５】図５は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞が減少したことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。ＢＡＦＦ ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの脾臓重量を図５Ａに示す。脾臓細胞の数、成熟ＣＤ２３＋濾胞性Ｂ細胞の数、およびＭＺ Ｂ細胞の数を、それぞれ図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄに示す。典型的な組織化学的試料を図５Ｅに示す。
【図６】図６は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によりＢＡＦＦ Ｔｇの脾臓中のＰＮＡ陽性ＧＣの数が減少したことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組織化学的試料を図６Ａに示す。ＬＴＢＲ−ＩｇまたはｈｕＩｇＧでの処置を行った総数に対するＰＮＡ陽性濾胞の割合を、図６Ｂに示す。
【図７】図７は、ＰＮＡ陽性ＧＣの部分的な減少がＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおいて観察された疾患の縮小に関係していることを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇの抗ＣＤ４０リガンド抗体（ＭＲ１）または１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。ＢＡＦＦ ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの脾臓の重量を図７Ａに示す。濾胞性Ｂ細胞の数、ＭＺ Ｂ細胞の数、および脾臓中のＰＮＡ陽性ＣＧの割合を、それぞれ図７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄに示す。典型的な組織化学的試料を図７Ｅに示す。腎機能は、図７Ｆに示すようにタンパク尿によって評価した。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００２年１０月３１日に提出された米国仮特許出願番号６０／４２２５８８に関する。その開示全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明の技術分野は、免疫グロブリンの沈着を伴う腎臓の免疫障害を含むがこれに限定されない免疫障害の処置に関する。この分野はさらに、リンホトキシン経路の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は自己抗原に対する異常な免疫応答によって生じる。親和性が高く、体細胞において高度に変異した（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）自己抗体の作成が、自己免疫症状の顕著な特徴の１つである。ほとんどの自己免疫障害に、腎臓での自己反応性免疫グロブリンの沈着を伴う腎臓の兆候が含まれる。これらの障害のいくつかは最終的には腎不全に至る。免疫グロブリンの沈着を伴う糸球体腎炎は、慢性肝炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびベルジェ病としても知られているＩｇＡ腎症において特に顕著である。これらの疾患の共通の構成は、糸球体の損傷を伴う、肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿およびメサンギウムＩｇＡ沈着物の存在である。ＩｇＡ免疫複合体の沈着は、腎不全の高い発生率を伴うヒトの糸球体腎炎の最も一般的な形態を引き起こす（Ｂｅｒｇｅｒ（１９６９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１：９３９）。ＳＬＥには、米国だけにおいても２００万人を超えるヒトが罹患している。ＩｇＡ腎症は世界中で見られるが、日本、オーストラリア、東南アジア、および南ヨーロッパで多く見られる。米国では、罹患率は全ての腎生検のおよそ４％であるが、日本では罹患率は生検の４５％にものぼる。これらの疾患の病原因子についてはほとんど理解されていない。これらの疾患については、現在は有効な処置がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この問題に対する１つのアプローチは、種々の疾患を駆動する機構を使用する種々の動物モデルの経路の阻害因子を試験することである。これらの疾患を理解し、処置することにおける進展は、疾患状態のあらゆる局面と類似した症状を呈する動物モデルが利用できないことにより制約されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、腎臓での免疫グロブリン（Ｉｇ）の沈着を伴う病状を含む免疫障害を処置するための方法を提供する。本発明は、可溶性形態のＬＴ−β受容体（ＬＴＢＲ）でのリンホトキシン（ＬＴ）経路の阻害により、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて狼瘡様の疾患の改善が導かれることの発見に、一部基づく。本発明はさらに、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎機能障害が、腎臓でのＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の蓄積に関係していることの発見に、一部基づく。
【０００６】
したがって、本発明の１つの態様は、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることによって引き起こされる疾患を含む、免疫障害を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物が、糸球体腎炎を含むがこれに限定されない免疫グロブリンの沈着を伴う腎機能障害を伴う病状を予防または処置するために使用される。本発明はまた、ＩｇＡ腎症および関連する病状の処置のために、ヒト以外の動物において治療用化合物を同定し、そして／またはその効力を試験するためのアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、このアッセイには、ＢＡＦＦトランスジェニック動物に対して試験される化合物を投与する工程、およびＢＡＦＦトランスジェニックの腎臓でのＩｇＡの沈着のレベルを決定する工程が含まれる。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明の方法において使用されるＬＴ経路の阻害因子として、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ免疫グロブリン融合体）のようなＬＴＢＲ誘導体、ＬＴＢＲに対する抗体、またはＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体が挙げられる。本発明の１つの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子は、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含むがこれに限定されない、１つ以上の異種タンパク質ドメインに対して融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む。別の実施形態では、阻害因子は、配列番号１のアミノ酸から選択されるアミノ酸の機能的配列を含む可溶性ＬＴＢＲを含む。さらに別の実施形態では、可溶性ＬＴＢＲは、少なくとも１つのＬＴβサブユニットを含むリンホトキシン（ＬＴ）リガンドに対して選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む。さらに別の実施形態では、可溶性ＬＴＢＲは、ＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む。
【０００８】
上記の概要の記載および以下の詳細な説明のいずれもが例であり、説明的なものにすぎず、請求される本発明を限定するものではないことが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリンまたはその一部を意味し、これには、供給源、生産方法、および他の特徴にはかかわらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドが含まれる。この用語には、ポリクローナル、モノクローナル、、単特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異、ＣＤＲ移植抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全体に特異的に結合するか、またはそれに相補的であるドメインを含む抗体分子の部分をいう。抗原が大きい場合には、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合する場合がある。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用に関与している抗原分子の部分である。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体の可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインから構成されるいわゆるＦｄ抗体断片）によって提供される場合がある。抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。用語「ＬＴＢＲ抗体」または「ＬＴＢＲに対する抗体」は、ＬＴＢＲの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するあらゆる抗体をいう。用語「ＬＴ抗体」、「ＬＴに対する抗体」、または「ＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体」は、ＬＴの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するあらゆる抗体をいう。
【００１０】
用語「治療用化合物」または「治療薬」は、本明細書中で使用される場合は、転写、翻訳、もしくは翻訳後の工程でＬＴＢＲまたはＬＴの発現を阻害することによるか、あるいはＬＴＢＲまたはその機能的リガンドであるＬＴの生物学的活性を阻害することのいずれかによってＬＴ経路を「阻害する」ことができるあらゆる化合物を意味する。
【００１１】
用語「阻害因子」、「阻害する」、「中和する」、「アンタゴナイズする」、およびそれらの同族語は、特定の反応または活性のアンタゴニストとして作用する化合物の能力をいう。用語「阻害する」は、治療用化合物の存在下で、同じ化合物が存在しない条件下での発現または活性と比較して、ＬＴＢＲもしくはＬＴの発現、またはＬＴＢＲもしくはＬＴの活性を低下させることをいう。発現レベルまたは活性の低下は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。ＬＴＢＲもしくはＬＴの発現レベルまたは活性は、本明細書中に記載されるように、または当該分野で公知の技術によって測定することができる（例えば、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３および米国特許第６４０３０８７号を参照）。
【００１２】
用語「処置」、「治療用化合物」、およびそれらの同族語は、治療的処置および予防的／防御的措置の両方をいう。処置が必要であるものとしては、特定の内科的疾患をすでに有している個体、さらには最終的にそのような疾患に至るであろう個体を挙げることができる。
【００１３】
用語「腎臓の免疫障害」は、無調節な免疫グロブリンの生産を含み、結果として腎臓の病状を生じる疾患または症状をいう。このような障害としては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ならびに臨床的な兆候として肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿および腎臓での免疫グロブリンの沈着が挙げられる他の疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１４】
用語「有効用量」または「有効量」は、患者の症状の改善、または所望される生物学的結果（例えば、ＬＴ経路の阻害）を生じる化合物の量をいう。有効量は、以下のセクションに記載されるように決定することができる。
【００１５】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「ＤＮＡ」は本明細書中では同義的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、そして適切である場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体、および一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例として、プラスミドＤＮＡまたはその断片、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「プラスミドＤＮＡ」は、環状の二本鎖ＤＮＡをいう。「アンチセンス」核酸は、本明細書中で使用される場合は、ある程度の配列相補性によりｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部にハイブリダイズすることができ、それによってｍＲＮＡからの翻訳を妨害する核酸をいう。
【００１６】
本明細書中で使用される場合は、用語「定義された条件下でのハイブリダイゼーション」は、互いに極めて同一であるかまたは相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記載するように意図される。これらの条件は、少なくとも５０、１００、１５０、３００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくともの約８５〜９０％が同一である配列が、互いに結合したままである条件である。パーセント同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記載されているように決定することができる。低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の限定的ではない例が続くセクションに提供される。
【００１７】
用語「特異的相互作用」または「特異的に結合する」などは、２つの分子が生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、高い親和性によって特徴づけられ、これは、能力を抑えるには低い。非特異的結合は、通常は低い親和性を有して、高い能力を抑える。一般的には、結合は、親和定数Ｋａが１０６Ｍ−１よりも高い、または好ましくは１０８Ｍ−１よりも高い場合に特異的とみなされる。必要な場合には、結合条件を変更することによって、特異的結合には実質的に影響を与えることなく非特異的結合を減少させることができる。このような条件は当該分野で公知であり、当業者は、日常的に行われる技術を使用して、適切な条件を選択することができる。これらの条件は通常、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させるための時間、無関係な分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して定義される。
【００１８】
語句「実質的に示されているとおり」は、関連するアミノ酸配列が、所定の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。例として、このような配列は、様々な種に由来する変異体である場合があり、またこのような配列は、短縮、欠失、アミノ酸置換、または付加によって所定の配列から導かれる場合もある。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ等（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムのような、標準的なアラインメントアルゴリズムによって決定される。
【００１９】
用語「胚中心」は、本明細書中で使用される場合は、抗原免疫後に形成される二次Ｂ細胞濾胞をいう。この組織部位の出現は、最適な記憶の形成、イソ型の切り替え、体細胞超変異、およびこれによる抗体応答の親和性の成熟に関係しており、胚中心は当該分野で十分に特徴付けられている。
【００２０】
用語「辺縁帯」は、辺縁帯マクロファージ（ＭＺＭ）、金属親和性マクロファージ（ＭＭ）、辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞、および細網細胞、そしてさらにはＴ細胞と樹上細胞から主に構成される二次リンパ系組織の組織学的に記載される成分をいう。動脈の血流は周辺静脈洞の内部に向かって開いており、したがってこれにより抗原をこれらの細胞に直接接近させて、この部位での抗原に対する細胞性の反応を促進する。
【００２１】
用語「ＬＴ経路」は、ＬＴＢＲとその機能的なリガンドであるＬＴとの結合の結果として生体内で生じる相互に関係のある分子事象をいう。ＬＴ経路は、米国特許第６４０３０８７号、およびＦｕ等（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３９９；Ｒｕｄｄｌｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１９：１１９；Ｌｕｔｈｅｒ等（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：４７１；およびＷｅｙａｎｄ等（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５９：７８７に概説されている。表面リンホトキシン（ＬＴ）は、ＬＴ−αとＬＴ−βのヘテロ複合体から構成され、これはＬＴＢＲにのみ結合する（Ｗａｒｅ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８：１７５）。二次リガンドであるＬＩＧＨＴも存在する。これは、ＬＴＢＲに結合するだけではなく、ヘルペスウイルス侵入調節因子（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ））と呼ばれる別の受容体にも結合する。用語「ＬＴＢＲリガンド」または「ＬＴ」は、他に明記されない限りは、ＬＴ−α／βヘテロ三量体、ＬＴ−β、ＬＴ−α、およびＬＩＧＨＴをいう。用語「ＬＴＢＲリガンド結合ドメイン」は、ＬＴとの相互作用の特異的な認識に関係しているＬＴＢＲの部分（単数または複数）をいう。
【００２２】
用語「哺乳動物」は、ヒトを含む、そのように分類されるあらゆる動物をいう。
【００２３】
用語「ＢＡＦＦトランスジェニック動物」は、ＢＡＦＦＦまたはその機能的に同等の断片を過剰に発現するように遺伝子修飾されている哺乳動物をいう。ＢＡＦＦトランスジェニック動物を作成する具体的な方法は、本開示において後に記載される。
【００２４】
ＬＴＢＲは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、その機能性リガンドであるＬＴを通じた情報伝達によってリンパ系の器官形成において重要な役割を果たす。受容体は、広範囲の細胞型（例えば、線維芽細胞および単球）上で発現される。リガンドは活性化されたＴ、Ｂ、およびＮＫ細胞上でのみ発現される。ＬＴ経路は、二次リンパ系の発生、および慢性的な炎症の部位で異所に形成されたリンパ系構造の確立の両方において重要な役割を果たす（Ｆｕ等（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３９９；Ｒｕｄｄｌｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１９：１１９；Ｌｕｔｈｅｒ等（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：４７１；およびＷｅｙａｎｄ等（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５９：７８７）。
【００２５】
本発明は、可溶性形態のＬＴ−β受容体（ＬＴＢＲ）を用いたリンホトキシン（ＬＴ）経路の阻害によりＢＡＦＦトランスジェニックマウスの狼瘡様疾患の改善が導かれることの発見に、一部基づく。本発明はさらに、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎機能障害が、腎臓でのＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の蓄積に関係していることの発見に、一部基づく。
【００２６】
本発明はまた、ＬＴ経路の阻害因子を投与する工程を含む、糸球体腎炎を処置または予防するための方法を記載する。１つの実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子が、自己免疫疾患を伴う糸球体腎炎の処置または予防のために投与される。用語「糸球体腎炎」は、腎臓の糸球体の炎症によって特徴付けられる腎機能障害をいう。糸球体腎炎は、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような、自己免疫症状によって引き起こされるか、またはそのような症状に関係している場合がある。本発明の１つの実施形態では、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、糸球体腎炎を処置または予防するために使用される。
【００２７】
本発明は、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることによって引き起こされる疾患を含む、免疫障害を処置または予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、免疫グロブリンの沈着を伴う腎機能障害に関係している病状を予防または処置するために使用され得る。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路の阻害因子を含む。いくつかの実施形態では、阻害因子はタンパク質性である。すなわちこれらは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含む。タンパク質性のＬＴ経路の阻害因子としては、ＬＴＢＲ−Ｉｇを含む可溶性形態のＬＴＢＲ、ＬＴＢＲに対する抗体、またはＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路のタンパク質性ではない阻害因子、例えば、核酸、低分子阻害因子、ＬＴ模倣物などを含む。
【００２９】
ＬＴＢＲおよびＬＴ、それらの断片または他の誘導体、あるいはそれらの類似体は、ＬＴＢＲまたはＬＴに特異的に結合する抗体を作成するために使用することができる。抗体の生産においては、所望される抗体のスクリーニングは、当該分野で公知の技術によって、最も一般的には、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって行うことができる（アッセイの例については、例えば、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３を参照）。
【００３０】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ等（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）によって作成することができる。種々の他の抗体生産技術については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ等編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。１つの実施形態では、本発明の方法において使用される抗体は、ヒトＬＴＢＲの細胞外部分の少なくとも一部に対する抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＬＴ経路を、例えば、ＬＴのＬＴＢＲへの結合をブロックすることによって阻害することができる。別の実施形態では、抗体は全体がヒトのものである。ＬＴＢＲに対する抗体の例としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第５９２５３５１号および同第６４０３０８７号に記載されているような、可溶性ＬＴとＬＴＢＲとの相互作用をブロックするヒトＬＴＢＲに対するＢＤＡ８モノクローナル抗体、および細胞表面ＬＴ−α／βとＬＴＢＲ−Ｉｇとの間での相互作用をブロックする、ヒトＬＴに対するモノクローナルＢ９抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＢＲに対する抗体もまた、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第６３１２６９１号に記載されている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、これらの方法には、ＬＴに結合し、それによって生体内のＬＴ経路を阻害する、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド）の使用が含まれる。具体的には、本明細書中に開示される可溶性形態のＬＴＢＲは、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産の無調節に関係している、内因性ＬＴＢＲ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＬＴＢＲ−Ｉｇは、これを治療上での使用に適切にする薬物動態特性、例えば、長い血液循環半減期および／またはタンパク質溶解性の分解に対する好ましい防御を有する。
【００３２】
ヒトＬＴＢＲの細胞外部分の配列は配列番号１に示され、これは、米国特許第５９２５３５１号の図１に示されている。配列番号１の配列情報と、当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＬＴＢＲのリガンド結合ドメインをコードする機能性断片をベクター中にクローニングし、適切な宿主中で発現させて、可溶性ＬＴＢＲ分子を生産させることができる。ＬＴリガンドへの結合について自然界に存在しているＬＴＢ受容体と競合することができる可溶性ＬＴＢＲ分子が、本明細書中および米国特許第６４０３０８７号に記載されているアッセイにしたがって、ＬＴＢＲ遮断因子として選択される。
【００３３】
配列番号１に記載されている配列から選択されるアミノ酸配列を含む可溶性ＬＴＢＲは、受容体融合タンパク質の生体内での安定性を高めるために、またはその生物学的活性もしくは局在性を調節するために、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（「融合ドメイン」）に結合させられる場合がある。１つの実施形態では、安定な血漿タンパク質（これは、通常は、血液循環において２０時間より長い半減期を有する）が、受容体融合タンパク質を構築するために使用される。このような血漿タンパク質としては、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の細胞または組織型に対して可溶性ＬＴＢＲ分子を標的化することができる配列もまた、特異的に局在化する可溶性ＬＴＢＲ融合タンパク質を作成するためにＬＴＢＲリガンド結合ドメインに結合させられる場合がある。
【００３４】
ＬＴＢＲリガンド結合ドメインを含むＬＴＢＲ細胞外領域（配列番号１）全体またはその機能性部分が、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのような免疫グロブリン定常領域に融合させられる場合もある（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐｐ．３３−４６（１９９５））。可溶性受容体−ＩｇＧ融合タンパク質は一般的な免疫学的試薬であり、それらの構築のための方法は当該分野で公知である（例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第５２２５５３８号を参照）。
【００３５】
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法において使用されるＬＴＢＲ−Ｉｇは、（ａ）ＬＴＢＲの細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体の定常領域に由来する第２のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
第１のアミノ酸配列は、ＬＴＢＲの細胞外ドメイン全体またはその一部に由来し、ＬＴに特異的に結合することができる。ヒトＬＴＢＲの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１に示される。特定の実施形態では、第１のアミノ酸配列は配列番号１と同一であるか、または実質的に配列番号１に示されているものそのものである。このような配列は、短縮された配列がＬＴに特異的に結合する能力を保持している限りは、短縮することができる。いくつかの他の実施形態では、第１のアミノ酸配列は、配列番号１の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、または１８０個の連続するアミノ酸を含む。
【００３７】
第２のアミノ酸配列は、抗体の定常領域、具体的には、Ｆｃ部分から誘導されるか、またはこのような配列の変異体である。いくつかの実施形態では、第２のアミノ酸配列はＩｇＧのＦｃ部分から誘導される。関連する実施形態では、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、または別のＩｇＧイソ型であるＩｇＧから誘導される。特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む。ここでは、Ｆｃはエフェクター機能を最小にするように修飾される。このような修飾としては、Ｆｃ受容体の結合のようなエフェクター機能を変化させることができる特異的な変化用のアミノ酸残基を含めること（Ｌｕｎｄ等（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ等（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４）、または定常領域を供給する種を変更することが含まれる。抗体は、エフェクター機能、すなわち、Ｆｃレセプターの結合および補体活性化を低下させる変異を、重鎖のＣＨ２領域に有することができる。例えば、抗体は、米国特許第５６２４８２１号および同第５６４８２６０号に記載されている変異のような変異を有することができる。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖においては、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列中のアミノ酸２３４および２３７に対応するアミノ酸残基で作成することができる。抗体はまた、Ａｎｇａｌ等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に開示されているように、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化させる変異、例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域中に変異を有することもできる。
【００３８】
種々のＩｇクラスおよびサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、様々な二次エフェクター機能を活性化することができる。活性化は、Ｆｃドメインが同種のＦｃ受容体に結合されると生じる。二次エフェクター機能としては、補体系を活性化させる能力、胎盤を通過する能力、および種々の微生物タンパク質に結合する能力が挙げられる。免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの特性は、Ｒｏｉｔｔ等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐ．４．８（Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，第３版，１９９３）に記載されている。
【００３９】
補体酵素のカスケードは、抗ｇｐｒｉ追跡（ａｎｔｉｇｐｒｉ−ｈｏｕｎｄ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ抗体のＦｃドメインによって活性化することができる。ＩｇＧ２のＦｃドメインはあまり有効ではないようであり、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのＦｃドメインは補体を活性化することについては全く効果がない。したがって、当業者は、それに伴う二次エフェクター機能がＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質で処置される特定の免疫応答または疾患について望ましいかどうかに基づいて、Ｆｃドメインを選択することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結され、これにはリンカー配列によって連結される場合も、リンカー配列を伴わない場合もある。リンカーの正確な長さおよび配列、さらには連結される配列に対するその方向は様々である。リンカーは、例えば、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒを含む。リンカーは、２、１０、２０、３０、またはそれ以上のアミノ酸の長さであり得、可溶性、長さ、立体構造の区別、免疫原性などのような望まれる特性に基づいて選択される。任意のタンパク質の配列中の特定のアミノ酸を、タンパク質の活性に有害な影響を与えることなく他のアミノ酸で置換することができることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、種々の変更を、タンパク質性である本発明のＬＴ経路の阻害因子のアミノ酸配列に対して、またはその生物学的活性または有用性を感知できるほどには損なうことなくそれらをコードするＤＮＡ配列に対して行うことができることが想定される。
【００４１】
ＬＴＢＲに関連する誘導体および類似体の使用は、本発明の範囲内である。特異的な実施形態では、誘導体または類似体は機能的に活性である、すなわち、例えば、配列番号１に示されるような野生型ＬＴＢＲのＬＴ結合ドメインに関係している１つ以上の活性を示すことができる。この結合を保持しているか、またはＬＴ経路を阻害する誘導体または類似体は、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３、米国特許第６４０３０８７号、または実施例に記載されるアッセイを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の手順によって望まれる活性について試験することができる。
【００４２】
ＬＴＢＲ−Ｉｇ、ＬＴＢＲ抗体、またはＬＴ抗体の誘導体は、機能的に同等の分子を生じる置換、付加、および／または欠失／短縮によってそれらのアミノ酸配列を変化させることによって作成することができる。ヌクレオチドコドンの縮重により、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施において使用することもできる。これらとしては、配列内のアミノ酸と機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンでの置換によって変化させられ、したがって「サイレントな」変化を生じるヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。例えば、無極性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性のある中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有している（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有している（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属しているクラスの他のメンバーから選択することができる（表１を参照）。さらに、ポリペプチド中の任意の天然の残基が、アラニンで置換される場合もある（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ等（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉ等（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照）。
【００４３】
本発明のＬＴＢＲ誘導体および類似体は、組み換え法および合成法を含む当該分野で周知の種々の技術によって生産することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，およびＢｏｄａｎｓｋｙ等（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００４４】
【表１】
特定の実施形態では、他のタンパク質に由来するアミノ酸配列に対する本発明のＬＴＢＲ−Ｉｇのいずれかのさらなる融合体を、本発明の方法での使用のために構築することができる。望ましい融合配列は、ＬＴＢＲの活性とは異なる生物学的活性を有しているタンパク質、例えば、サイトカイン、成長因子および分化因子、酵素、ホルモン、他の受容体成分などに由来する。また、ＬＴＢＲ−Ｉｇを、他のタンパク質および薬学的な因子に対して化学的にカップリングさせるか、または結合させることもできる。このような修飾は、得られる組成物の薬物動態および／または生体分布を変化させるように設計することができる。本発明のＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体はまた、米国特許第４６４０８３５号、同第４４９６６８９号、同第４３０１１４４号、同第４６７０４１７号、同第４７９１１９２号、または同第４１７９３３７号に示されている様式で、グリコシル化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）することができ、また、別のタンパク質性ではない高分子、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレンに連結することもできる。ＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体は、例えば、それらの血液循環における半減期を延長するために、高分子に共有結合させることによって化学的に修飾することもできる。ペプチドにそれらを結合させるための例示的な高分子および方法はまた、米国特許第４７６６１０６号、同第４１７９３３７号、同第４４９５２８５号、および同第４６０９５４６号に示されている。
【００４５】
本発明の方法において使用されるＬＴＢＲ−Ｉｇおよび抗体はまた、検出可能な標識または機能性標識でタグをつけることもできる。検出可能な標識として、１３１Ｉまたは９９Ｔｃのような放射標識が挙げられる。これは、従来の化学方法を使用して結合させることができる。検出可能な標識としてはさらに酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼ）およびビオチンまたはアビジンのような検出可能な部分が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法には、核酸またはこのような核酸によってコードされるポリペプチドの投与が含まれる。ここでは、ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｂ）少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであり、定義された条件下で（ａ）の核酸にハイブリダイズすることができる核酸から選択される。ここでは、核酸の発現産物は、Ｂ細胞による免疫グロブリンの分泌を阻害することができる。１つの実施形態では、定義された条件は低ストリンジェンシーの条件である。別の実施形態では、定義された条件は中程度のストリンジェンシーの条件である。さらに別の実施形態では、定義された条件は、高ストリンジェンシーの条件である。
【００４７】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２，４，ａｎｄ ６に説明されているように、最小限の実験によって当業者が選択することができる。さらに、ストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，第７、９、および１１章に記載されている。定義される低ストリンジェンシーの条件の限定的ではない例は以下である。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ，０．１％のＰＶＰ、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４０℃で６時間、前処理する。ハイブリダイゼーションを以下の変更を加えた同じ溶液中で行う：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のデキストラン硫酸、および５〜２０×１０６の３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で４０℃で１８〜２０時間インキュベートし、その後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ，および０．１％のＳＤＳを含む溶液中で５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と交換し、さらに１．５時間、６０℃でインキュベートする。フィルターをブロットして乾燥させ、オートラジオグラフィーのために感光させる。当該分野で周知の低ストリンジェンシーの他の条件を使用することができる（例えば、種間ハイブリダイゼーションのために使用される場合）。
【００４８】
定義される高ストリンジェンシーの条件の限定的ではない例は以下である。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で６５℃で８時間から一晩行う。フィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液中で３７℃で１時間行う。これを、その後、０．１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗浄する。
【００４９】
様々な種々の宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは周知である。適切な宿主細胞として、細菌、哺乳動物細胞、ならびに酵母およびバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用することができる哺乳動物細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇを生産させるために適切な他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００５０】
適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および適切である場合には他の配列を含む）を含む適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、ファージ）である場合も、また適切である場合にはファージミドである場合もある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作についての多くの公知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ等編，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００５１】
発現後、ＬＴＢＲ−Ｉｇが単離および／または精製される（ＬＴＢＲ−Ｉｇ、ＬＴ（ＬＴ−α、ＬＴ−β、およびＬＴ−α／βを含む）の発現および精製のための例示的な手順は、Ｒｏｏｎｅｙ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２２：３４５−３６３に記載されている）。特異的なＬＴＢＲ−Ｉｇ、およびそれをコードする核酸分子、および本発明のベクターは、例えば、それらが自然界において存在している環境から、実質的に純粋であるかまたは均質な形態で、あるいは核酸の場合には、必要な機能を有しているポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子の起源を含まないかまたは実質的に含まない状態で、得る、単離する、および／または精製することができる。
【００５２】
本発明は、治療用化合物（「治療薬」）の投与により種々の疾患および障害を処置または予防するための方法を提供する。適切な治療薬として、ＬＴＢＲ、その類似体および誘導体（断片を含む）；ＬＴＢＲタンパク質をコードする核酸、類似体、または誘導体；ＬＴＢＲアンチセンス核酸、ＬＴＢＲ抗体、ＬＴ抗体、ならびに他のＬＴＢＲ／ＬＴアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の方法による処置に敏感である免疫障害の例として、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような自己免疫症状が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧのような免疫グロブリンの生産の無調節を含む、Ｂ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になる免疫障害は、本明細書中に開示される治療薬の投与によって処置されるかまたは予防される。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＩｇＡを過剰生産するＢ−１細胞である。いくつかの実施形態では、疾患は、高い（正常な濃度または望ましい濃度と比較して）自己免疫抗体濃度によって特徴付けられる。いくつかの他の実施形態では、免疫グロブリンの無調節な生産により、腎臓中でＩｇＡの病理学的な沈着が生じる。このような障害としては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、およびＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ならびに臨床的な兆候として肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿およびＩｇＡの沈着の存在が挙げられる他の疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、本発明の方法は、ＧＣとは無関係な機構を有する自己免疫障害を処置するために使用される。さらに他の実施形態では、これらの方法は、例えば、シェーグレン症候群のような、高いレベル（正常なレベルまたは望ましいレベルと比較して）のＭＺ Ｂ細胞を特徴とする疾患を処置するために利用される。さらに別の実施形態では、ＬＴ経路の阻害因子が、例えば、自己免疫症状を伴う糸球体腎炎を含む、糸球体腎炎の被験体を処置するために使用される。
【００５４】
特異的な実施形態では、ＬＴＢＲ機能を阻害する治療薬が、（１）ＬＴＢＲもしくはＬＴの高い発現レベル（すなわち、正常レベルもしくは望まれるレベルと比較して）、または高いＬＴＢＲもしくはＬＴの機能的活性に関係している疾患または障害において、あるいは（２）生体外または生体内でのアッセイによりＬＴ経路の阻害因子の投与の有効性が明らかにされている疾患または障害において投与される。高い発現または活性のレベルは、例えば、患者から生物学的試料（例えば、尿試料）を採取し、そして肉眼で見えるかまたは顕微鏡でしか見えないほどの血尿の存在について試料をアッセイすることによって、容易に検出することができる。ＬＴＢＲタンパク質を検出および／または視覚化するためのキナーゼアッセイ、免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫細胞化学など）、ならびに／あるいはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲなど）を含むがこれらに限定されない、当該分野で標準的である多くの方法を使用することができる。
【００５５】
本発明の１つの実施形態は、腎臓でのＩｇの沈着を伴う疾患を含む、自己免疫障害を処置するための治療薬として有効である、ＬＴ経路の阻害因子を同定するためのアッセイを提供する。このスクリーニングアッセイでは、第１の結合混合物が、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドとリガンド（例えば、ＬＴ）を結合させることによって形成され；そして第１の結合混合物中での結合の量（Ｍ０）が測定される。第２の結合混合物もまた、ＬＴＢＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド、リガンド、およびスクリーニングされる化合物または試薬を結合させることによって形成させられ、第２の結合混合物中での結合の量（Ｍ１）が測定される。その後、第１の結合混合物と第２の結合混合物中での結合の量が、例えば、Ｍ１／Ｍ０比を計算することによって比較される。化合物または試薬は、第１の結合混合物と比較して、第２の結合混合物中での結合において減少が観察される場合に、Ｉｇ媒介性の腎臓病を阻害することができるとみなされる。結合混合物の構成および最適化は当業者のレベルの範囲内であり、このような結合混合物には、結合を促進または最適化するために必要な緩衝液および塩が含まれる場合もあり、さらに対照アッセイが本発明のスクリーニングアッセイに含まれる場合もある。したがって、ＬＴＢＲ／ＬＴ結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％減少させることが明らかになった化合物を同定することができ、その後、必要である場合には、以下に記載されるような他のアッセイまたは動物モデルにおいて自己免疫障害を改善する能力についての二次スクリーニングが行われる。受容体とリガンドとの間での結合の強度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴に基づく技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定することができる。これらの全てが当該分野で周知の技術である。
【００５６】
ＬＴ経路の阻害因子は、ノックアウトモデルにおいて複雑な発育不全が観察されることなく、ＢＡＦＦトランスジェニックモデルにおいて腎機能障害を緩和することが明らかにされる。したがって、このような動物モデルを、ＩｇＡまたはＩｇＧの生産の無調節を含むＢ細胞による免疫グロブリンの生産が無調節になることに関係している障害について、治療用化合物を同定し、そして／またはその効力を試験するためのアッセイにおいて使用することができる。免疫に関係している腎臓の病状の特定の態様は、ＢＡＦＦトランスジェニック動物において観察することができる。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、尿中のタンパク質濃度を記録することによって評価されるように、６ヶ月齢またはそれ以降で狼瘡のような症状を発症し始める。ＢＡＦＦトランスジェニック動物のＩｇ力価の上昇は、ＩｇＡサブクラスについて最も顕著であり、集めたデータから、腎臓ではＩｇＧ分泌細胞よりもＩｇＡ分泌細胞のほうが多く存在することが明らかである。さらに、マウスへのＢＡＦＦの注射により、ニューモバックス抗原に対する過剰な応答が生じ、最も劇的な影響を受けるイソ型がＩｇＡである。したがって、特定の実施形態では、ＢＡＦＦトランスジェニック動物が、ＩｇＡ腎症を含むＩｇＡに関連する免疫障害、またはＩｇＡ成分が強い他の障害の処置について化合物の効力を評価するために使用される。ＢＡＦＦトランスジェニック動物はまた、濾胞性Ｂ細胞およびＧＣ反応が重要ではない疾患状態に似た症状を呈するために使用することもできる。ＢＡＦＦトランスジェニック動物モデルは、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、慢性活動性肝炎、複雑な結合組織系の障害、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、突発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑、関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡、潰瘍性大腸炎、またはデンスデポジット病のような免疫障害を処置または予防する能力について、分子をスクリーニングまたは試験するために使用することができる。
【００５７】
ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、肝臓特異的調節配列の制御下で全長のマウスＢＡＦＦを発現する。このトランスジェニックマウスは、以前に記載されているように作成される（Ｍａｃｋａｙ等（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６９７）。マウスは、トランスジェニックの雄をＣ５７ＢＬ／６雌に戻し交配させることによって、コロニーを発現させ続けることにより作成することができる。トランスジェニック状態は、テールチップから回収したＤＮＡについてＰＣＲを行うことによって検出することができる。トランスジェニック方法については、一般的には、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｏｆｋｅｒ等編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２を参照のこと。簡単に言うと、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは以下のようにして作成された。全長のマウスＢＡＦＦをコードするＰＣＲ断片を、以前に記載された配列情報（Ｓｃｈｅｉｄｅｒ等（１９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：１７４７−１７５６）を使用して逆転写ＰＣＲによって作成した。第１鎖ｃＤＮＡを、製造業者によるプロトコール（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に従ってオリゴｄＴを使用してマウスの肺のポリＡ＋（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から合成した。ＰＣＲ反応には、１×ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０％のＤＭＳＯ、１２．５ｐＭのプライマー、５単位のｐｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、および以下のプライマーＮｏｔ１制限部位を含めた：
５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡ−３’（配列番号２）
５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡ−３’（配列番号３）。
【００５８】
鋳型を、９４℃で１分間、５４℃で２分間、および７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル増幅し、その後７２℃で１０分間の伸張を行った。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋファイルＡＦ１１９３８３のヌクレオチド２１４−１１７１に対応する。ＰＣＲ断片をＮｏｔ１で消化し、改良型ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）にクローニングした。その後、得られたベクターをＸｂａ１で消化して、ＢＡＦＦとＳＶ４０ポリＡ付加部位の配列を切り出した。プラスミドクローン５４０Ｂから予め精製しておいたヒトＡｐｏＥエンハンサーとＡＡＴ（α−抗トリプシン）を含む１ｋｂの平滑末端Ｂｇｌ２−Ｎｏｔ１断片であるプロモーターをＥｃｏＲＶ部位にさらに挿入したｐＵＣ系のベクターに、この断片をクローニングした。ＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌ２断片を最後のベクターから精製して、トランスジェニックマウスの作成のために使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌×ＤＢＡ／２Ｊ雄Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスの注射した子を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。マイクロインジェクションおよびトランスジェニックマウスの作成の技術は、以前に記載されている（Ｍｃｋｎｉｇｈｔｓ等（１９８３）Ｃｅｌｌ，３４：３３５−３４１）。
【００５９】
当業者は、化合物が必要に応じて、例えば以下のような少なくとも１つの別の動物モデルにおいて試験される場合があることを理解している（概要については、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｒｓｈｗｉｎ等編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１を参照）：ＳＷＲ×ＮＺＢ（ＳＮＦ１）トランスジェニックマウスモデル（Ｕｎｅｒ等（１９９８）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ．１１（３）：２３３−２４０）、ＫＲＮトランスジェニックマウス（Ｋ／Ｂ×Ｎ）モデル（Ｊｉ等（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：１３９）；ＮＺＢ×ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ）マウス、ＳＬＥのモデル（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎ等（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４４（１０）：２４３５−２４４５）；マウスの実験用自己免疫脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症のモデル（Ｔｕｏｈｙ等（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１１２６−１１３０，Ｓｏｂｅｌ等（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２３９３−２４０１、およびＴｒａｕｇｏｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４−１２９）；糖尿病のＮＯＤマウスモデル（Ｂａｘｔｅｒ等（１９９１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，９（１）：６１−６７など）。
【００６０】
特定の実施形態では、試験される化合物には、例えば、可溶性形態のＬＴＢＲ（例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇ）のようなＬＴ経路の阻害因子、ＬＴＢＲに対する抗体、およびＬＴＢＲリガンドであるＬＴに対する抗体；それらの類似体、誘導体、および断片；それらをコードする核酸およびアンチセンス核酸（ならびにそれらの相補配列および相同配列）が含まれる。例示的な実施形態では、マウスに、約１μｇから約１ｍｇ、好ましくは約１０μｇから約５００μｇ、またはさらに好ましくは約１００μｇの、ＬＴＢＲ−ＩｇあるいはＩｇ対照が、５週間の期間にわたって腹腔内に注射される。腎機能が、以下の少なくとも１つによって評価される：タンパク尿、免疫組織分析、脾臓の重量、脾細胞の数、濾胞性Ｂ細胞の数、辺縁帯Ｂ細胞の数（例えば、Ｂ２２０＋脾細胞の割合）、Ｂ−１ｂ細胞に対するＢ−１ａ細胞の割合、血漿細胞の数およびＩｇＡ＋血漿細胞の数、ならびに脾臓、骨髄、または腎臓中でのＩｇＡまたはＩｇＧ分泌因子の頻度など。血清もまた、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、複雑な結合組織の障害（ＭＣＴＤ）、および全身性硬化症を含む全身性リウマチ疾患の典型的なマーカーとして細胞性の核抗原に結合することが知られている、自己抗核抗体（ＡＮＡ）の存在について評価される場合がある。
【００６１】
例えば、動物試験にしたがって決定されるような仮の用量、およびヒトへの投与についての投与量のスケーリングは、当該分野での慣例にしたがって行われる。毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬理学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
【００６２】
治療有効用量は、細胞培養アッセイによって最初に概算することができる。用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルにおいて決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する治療薬の濃度）を含む、血液循環中での血漿濃度の範囲が得られるように、動物モデルについて処方され得る。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切な生体アッセイによってモニターすることができる。投与量の例は、約０．１×ＩＣ５０、約０．５×ＩＣ５０、約１×ＩＣ５０、約５×ＩＣ５０、１０×ＩＣ５０、約５０×ＩＣ５０、および約１００×ＩＣ５０である。
【００６３】
細胞培養アッセイまたは動物実験によって得られたデータを使用して、ヒトでの使用のための投与量の範囲を計算することができる。１つの動物モデルにおいて得られた治療有効投与量を、ヒトを含む別の動物での使用のために、当該分野で公知の換算係数を使用して変換することができる（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ等（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４、および相当する表面積投与量係数についての表２を参照）。
【００６４】
【表２】
このような化合物の投与量は、ほとんど毒性がないかまたは毒性がまったくなくＥＤ５０を含む血液循環の濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。通常は、治療有効量は、被験体の年齢、症状、および性別、さらには被験体の医学的症状の重篤度によって変化し得る。投与量は医師によって決定され、必要である場合には、観察される処置の効果に適応するように調節することができる。一般的には、組成物は、ＬＴ経路の阻害因子がおよそ１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、１０μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまで、１００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで、および５００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与される。組成物は、投与後もっとも長い時間にわたって血液循環中での濃度が最大となるように、注射（ｂｏｌｕｓ ｄｏｓｅ）で投与される場合がある。注射（ｂｏｌｕｓ ｄｏｓｅ）後に、静注も使用される場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用される組成物は、ＬＴ経路の１つ以上の阻害因子と、薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合は、語句「薬学的に許容される賦形剤」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などをいい、これらは薬学的投与に適合するものである。このような媒体および薬剤を薬学的活性のある物質に使用することは当該分野で周知である。組成物には、さらに、補助的な、それ以上の、または高い治療作用を提供する他の活性のある物質が含まれる場合もある。また、薬学的組成物は、箱、パック、ディスペンサー型の容器中に、投与についての説明書とともに含まれる場合もある。
【００６６】
薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与を行うための方法は当該分野で公知である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、洞内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下、または皮膚を通じて行われ得る。局所または経口投与することができる組成物を得ることが可能である場合もある。
【００６７】
皮内または皮下での適用に使用される溶液または懸濁液には、通常、以下の成分の１つ以上が含まれる：注射のための水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成の溶媒のような滅菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝物質；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張力の調節のための試薬。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて調節することができる。このような調製物は、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用のバイアル中に封入することができる。
【００６８】
注射に適切な薬学的組成物として、滅菌の水溶液または分散液、および滅菌の注射可能な溶液または分散液を即座に調製するための滅菌の粉末が挙げられる。静脈内投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌のものでなければならず、容易にシリンジ中に存在できる程度に流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は溶媒または分散媒体であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって得ることができる。多くの場合には、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００６９】
経口組成物は、通常、不活性な希釈剤または食用の担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入することができ、また錠剤になるように圧縮して固めることもできる。経口による治療的投与の目的のためには、ＬＴ阻害因子を賦形剤とともに組み入れることができ、これは錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用される。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分の任意のもの、または同様の性質の化合物を含むことができる；微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンのような結合剤；澱粉または乳糖のような賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシ澱粉のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味剤のような香味剤。
【００７０】
吸入による投与については、ＬＴ阻害因子は、適切な圧縮ガス、例えば、二酸化炭素のような気体を含む加圧型容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で投与される。
【００７１】
全身投与は、粘膜を通じるか、皮膚を通じる手段によっても行うことができる。例えば、ＬＴＢＲ−Ｉｇと抗体の場合には、組成物は、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される経路を通じて粘膜（例えば、腸粘膜、口腔粘膜、または肺粘膜）を透過することができる（米国特許第６０３０６１３号）。粘膜を通じる投与は、例えば、薬用キャンディー、鼻腔スプレー、吸入器、または坐剤の使用によって行うことができる。皮膚を通じる投与のためには、活性のある化合物は、当該分野で一般的に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、またはクリーム剤に処方される。粘膜を通じる投与または皮膚を通じる投与については、浸透させられるバリアに適切である浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は当該分野で一般的に知られており、例えば、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【００７２】
ＬＴ阻害因子は、化合物が体から迅速に排出されてしまわないように保護する担体とともに、例えば移植片およびマイクロカプセル化された送達システムを含む徐放処方物のように、調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は当業者に明らかである。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【００７３】
投与を容易にし、投与量を均一にするためには、投与量単位の形態に経口組成物または非経口組成物を処方することが有効であり得る。投与量単位の形態は、本明細書中で使用される場合は、処置される被験体についての単位投与量として適応させられた物理的に分けられている単位をいう。個々の単位は、必要な薬学的担体と組み合わせて、望ましい治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性のある化合物を含む。
【００７４】
タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸、例えば、ＬＴＢＲ全体もしくはその一部をコードする核酸、またはそれらに対応するアンチセンス核酸を、組織、器官、または生物体の細胞に導入することができ、その結果、コードされるポリペプチドを発現させることができる。特異的なプロトコールについては、Ｍｏｒｇａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照のこと。この方法論は、例えば、個体の組織および器官に対するタンパク質性のＬＴ阻害因子の効果を評価することにおいて有用であり得る。特定の実施形態では、タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸は、組織特異的な発現制御配列に連結される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列を、哺乳動物に全身的または局所的に注射することができる、ウイルスまたはプラスミドベクター中に挿入できることを理解している。また、宿主細胞を回収することができ、タンパク質性のＬＴ阻害因子をコードする核酸を、そのような細胞に生体外でトランスフェクトして、その後、当該分野で公知の方法を使用して再度移植することもできる。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等編，１９９９に記載されているように、核酸を単細胞である胚にトランスフェクトして、トランスジェニック動物を作成することもできる。
【実施例１】
【００７５】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により腎機能が改善する
肝臓特異的調節配列の制御下で全長のマウスＢＡＦＦを発現するＢＡＦＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、以前に記載されたように作成した（Ｍａｃｋａｙ等（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６９７）。使用した全てのマウスを、Ｔｇの雄をＣ５７ＢＬ／６雌に戻し交配させることによって、コロニーを発現させ続けることにより作成した。トランスジェニック状態は、テールチップから回収したＤＮＡについてＰＣＲを行うことによって決定した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、尿中のタンパク質濃度を記録することによって評価すると、６ヶ月齢およびそれ以降に狼瘡のような症状を発症しはじめた。
【００７６】
ＬＴＢＲ−ＩｇがＢＡＦＦトランスジェニックマウスの処置において有効であるかどうかを評価するために、１＋／２＋またはそれよりも高いタンパク尿（ＰＵ）スコアを示す６ヶ月齢またはそれ以上の動物を、５週間の処置レジュメに登録するために選択した。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスと、トランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。最後の注射の４日後にマウスを安楽死させ、組織分析のために腎臓を採取した。
【００７７】
４回の別々の実験において、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、５週間の処置期間の後のタンパク尿スコアが明らかに低下した（処置前のＰＵレベル対処置後のＰＵレベル、Ｐ＜０．０００４、ｎ＝２６）。しかし、対照である対応するタンパク質での処置によっては、腎機能の改善はできなかった（Ｐ＝０．８、ｎ＝２３）（図１Ａ）。トランス遺伝子を含まない同腹子から記録したＰＵスコアは、処置期間全体にわたって穏やかに変化したが、スコアは処置レジュメ全体について＋１（疾患ではない）を下回ったままであり、したがってＰＵスコアにおけるこれらの機能は意味のないものであることになる（図１Ｂ）。さらに、ＬＴＢＲ−ＩｇとｈｕＩｇＧ対照で処置したトランス遺伝子を含まない同腹子との間には観察できるほどの差はなく、したがってそれらのスコアは重ね合わさった。
【００７８】
ＢＡＦＦトランスジェニックモデルの特徴を別の狼瘡モデルと比較するために、ＳＮＦ１マウスを、ＬＴＢＲ−Ｉｇで治療的または予防的のいずれかで処置した。これらの動物の糸球体腎炎（ＧＮ）は、ＭＲ１での処置により顕著に改善された。これはおそらく、ＧＣ反応に対するその効果によるものである。マウスを、そのタンパク尿スコアがおよそ＋１である場合には疾患の発症前に処置し、またスコアが＋３／＋４に達していた場合には、マウスを治療的に処置した。いずれの場合にも、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては、タンパク尿の測定値または腎臓の病状には全く効果がなかった。これらの動物にＬＴＢＲ−Ｉｇを投与した場合には、生存性においていくらかの効果があったが、これはＧＮの状態とは無関係である。したがって、ＬＴ経路はＢＡＦＦトランスジェニックマウスのＳＬＥ様疾患においては重要であるが、この経路は、ＭＲ１がさらに有効であるＳＮＦ１モデルにおいてはあまり重要ではないようである。
【実施例２】
【００７９】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により腎臓の糸球体の損傷が改善される
タンパク尿によって評価される腎機能不全には、複数の腎臓病の側面が伴う。腎炎の腎臓においては、いくつかの病状を見ることができる。糸球体は、大きくなっており過形成しているように見え、糸球体の内部にコラーゲンの沈着を見ることができる。さらに、多くの場合に、糸球体周辺に浸潤が観察され、さらに重篤な腎炎の症例では、タンパク質性の円柱に気づくことができる。
【００８０】
ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスとトランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）対照を、実施例１に記載したようにＬＴＢＲ−ＩｇまたはｈｕＩｇＧで処置した。コラーゲンの沈着を評価するためのパス（ＰＡＳ）染色を使用して、４回の別々の研究による腎臓を評価した。腎臓の病状における統計学的有意性（Ｐ＜０．００２）の低下が、ｈｕＩｇＧ対照動物と比較して、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって観察された（図２Ｇ）。個々の動物についての病状の範囲は広く、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は全ての動物の病状を予防するものではなかった。典型的な組織化学的試料を図２Ａ〜２Ｆに示す。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置はおそらく、腎臓の病状が早くすすむことを妨げるが、開始時のＰＵスコアが３よりも高いマウスは、処置に対してあまり反応しないようであり、処置後には最も大きな腎臓の病変を示した（図２Ｇ、三角）。
【実施例３】
【００８１】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により自己抗体力価が低下する
ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスの血清Ｉｇ濃度が、トランスジェニックではない同腹子と比較して高いことが示された。図３Ａに示すように、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスを使用すると、ＩｇＭ力価（７．３倍）およびＩｇＡ力価（１０．６倍）の両方が顕著に増大し、ＩｇＧ２ａ力価（２．４倍）は中程度に増大した。全ＩｇＧ力価については、わずかに１．２倍の増大が見られただけであった。
【００８２】
ｈｙｐｅｒ−ＩｇＡマウスのＬＴ経路の阻害がＩｇＡレベル全体に影響があるかどうかを決定するために、自己抗体力価の試験をＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて行った。５週間にわたるＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は、ＩｇＡを含む全てのＩｇイソ型に対してまったく影響がなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。わずかおよそ３０％のＢＡＦＦトランスジェニックが抗ＤＮＡ力価の兆候を有していただけであり、これらは非常に弱かった。抗クロマチン力価は、トランスジェニックマウスの血清中にもっと確実に存在していた。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、抗クロマチン力価は、５週間にわたる処置期間の間に３６％低下した。しかし、ＩｇＧで処置したトランスジェニックマウスは、同じ処置期間の間に抗クロマチン力価において２５％の低下を示した。
【００８３】
自己抗体力価は、多数の動物モデルにおいて疾患と必ずしも関係していない。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおける低い抗ＤＮＡ抗体力価は、観察される腎臓の病状と必ずしも一致していない。したがって、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置が抗ＤＮＡ抗体の生産をより確実に生じるシステムにおいて、これらの自己抗体の作成を加速させることができるかどうかを決定することが望まれた。プリスタンの１回の注射により、種々のバックグラウンドマウス株において抗ＤＮＡ抗体が誘導されることが示されているが、作用機構は明らかではない。プリスタンを注射したマウスにおけるＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の効果を評価した。ＤＢＡ−１マウスへのプリスタンの注射の４週間後、測定できる程度の抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ力価および抗一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ力価が、これらの動物の血清中で観察された（図３Ｄ）。しかし、注射をしていないマウスは抗ＤＮＡ力価を生じなかった。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、抗ｄｓＤＮＡ力価および抗ｓｓＤＮＡ力価の誘導は完全に妨げられた。したがって、自己抗体力価がより高いシステムにおいては、これらの力価をＬＴＢＲ−Ｉｇ処置によって妨げることができる。
【実施例４】
【００８４】
免疫複合体はＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腎臓中に沈着する
ＳＬＥを伴う腎臓の病状には、多くの場合に糸球体内部での免疫複合体の沈着が伴う。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、血液循環中に高いレベルの免疫複合体を有していることが示されている。これらのマウスはまた、糸球体内での免疫複合体の沈着の兆候も示す。
【００８５】
ＢＡＦＦトランスジェニックの腎臓中のＩｇＡおよびＩｇＧ免疫複合体の存在を試験した。凍結した腎臓切片をアセトンで固定し、風乾させ、そして１０％のＦｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、５％のラットの血清、および５％のＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液とともにインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。切片をビオチン結合ラット抗マウスＩｇＡ特異的モノクローナル抗体とともに３０分間インキュベートし、その後、ストレプトアビジン−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションを、加湿チャンバー内で室温で行った。糸球体を、ＵＶ線下で試験し、ＩｇＡの沈着が存在するかどうかについて記録した。血清ＩｇＡの力価は５週間のＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては変化しなかったが、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの糸球体中のＩｇＡ免疫複合体の状況は明らかに減少した（対照で処置したＢＡＦＦトランスジェニックと比較してＰ＜０．０１）（図４Ａおよび４Ｃ）。ＩｇＧ免疫複合体の沈着については、処置を用いても有意な差は検出されなかった（図４Ｂおよび４Ｃ）。このことは、この疾患のパラメーターの縮小が、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって観察される効力には寄与していないことを示唆している。
【実施例５】
【００８６】
ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により辺縁帯Ｂ細胞が減少する
ＢＡＦＦトランスジェニックマウスはＴ２過渡期のＢ細胞、ＭＺ Ｂ細胞、成熟濾胞性Ｂ細胞、およびいくつかの場合にはＢ−１細胞の拡大を示す。この拡大には、脾臓の重量の増加、および細胞充実性の増大が伴う。マウスを実施例１に記載したように処置した。５週間の処置期間の後、これらのパラメーターを、ＬＴ阻害によって調節されるそれらの能力について分析した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの脾臓の重量は、トランス遺伝子を含まない同腹子よりも平均して１．５倍重く、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置はこの脾腫には効果がなかった（図５Ａ）。さらに、脾臓の細胞充実性だけではなく成熟ＣＤ２３＋濾胞性Ｂ細胞の数もまた、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって変化せず（図５Ｂ）、同様であった（図５Ｃ）。ＭＺ Ｂ細胞の数を、ＣＤ２３−ＣＤ１ｈｉＣＤ２１ｈｉ Ｂ細胞を数えることによって評価した。トランスジェニックではない同腹子に対してＢＡＦＦトランスジェニックの脾臓においてはおよそ４倍に増加した濾胞性Ｂ細胞のサブセットに対して、ＭＺ Ｂ細胞の数はおよそ１３倍に増大した。この非常な増加にもかかわらず、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、対照での処置と比較してＭＺ Ｂ細胞の数は劇的に減少した（Ｐ＜０．００００６）（図５Ｄ）。さらに、ＭＺ Ｂ細胞成分の減少は、抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＤを含む脾臓切片を含むことによる、免疫組織化学的分析によっても観察された。この場合、Ｂ細胞濾胞の外側にある、ＩｇＭのみが陽性であるＭＺは、トランスジェニックとトランスジェニックではない同腹子の両方において、処置によって大幅に減少した（図５Ｅ）。したがって、脾腫と濾胞性Ｂ細胞成分の増加はＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては変化しなかったが、ＭＺ Ｂ細胞成分が処置に敏感であった。
【００８７】
Ｂ−１細胞は、それらが応答する抗原の種類に関してＭＺ Ｂ細胞と多くの類似点を示し、これらは、ＲａｇまたはＩＬ−７の発現が成体マウスにおいてオフに変換されると長期間持続することができることが示されている。Ｂ−１細胞のサブセットは自己反応性Ｂ細胞受容体を発現することができるので、ＬＴＢＲ−Ｉｇがこのサブセットに対して効果があるかどうか、そしてこのサブセットがＢＡＦＦトランスジェニックマウスの疾患に必要であるかどうかを決定することが目的であった。Ｂ−１サブセットは、同腹子の対照と比較して、高齢のＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいておよそ２〜３倍拡大していることが明らかになった。さらに、Ｂ−１ａサブセットは、わずかに優先して拡大するようであった（表３にまとめる）。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置は、これらのマウスの腹腔洗浄法によって分析したＣＤ２３−ＣＤ５＋Ｂ−１ａ細胞の非常な増加に対しては効果がないことが明らかになった。したがって、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によるＢＡＦＦトランスジェニックマウスのＧＮの改善は、Ｂ−１ａ細胞の減少によっては説明することはできない。
【００８８】
他のＢ細胞エフェクター成分もまた、処置したＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて増加した（表３にまとめる）。免疫応答の後、血漿細胞は骨髄（ＢＭ）へと戻ったが、脾臓およびリンパ節では検出することができた。血漿細胞の数を、シンデカン−１についての染色によりＦＡＣＳによって評価した。ＢＡＦＦトランスジェニック動物においては、血漿細胞は、トランスジェニックではない同腹子と比較して、脾臓においておよそ６倍に増加した。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては脾臓の血漿細胞の数は減少しなかった−実際には、これらは数はわずかに増加した。このことはおそらく、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置が、多くの場合に穏やかな脾腫を誘導し、これが次いでこれらの細胞のさらなる増加を生じるという事実が原因である。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの腸間膜のリンパ節（ＭＬＮ）においては、ＩｇＡを分泌する血漿細胞の非常に大きな増加（３５倍）が記録された。これらは、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっておよそ２倍に減少した。ＢＭにおいて、Ｉｇ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴ（商標）分析によって評価した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、トランスジェニックではない同腹子と比較して、ＩｇＧ分泌細胞の４６倍の増加、およびＩｇＡ分泌細胞の５倍の増加を示した。しかし、ＩｇＧ分泌細胞とＩｇＡ分泌細胞の数は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっては減少しなかった。
【００８９】
最後に、ＳＬＥ動物において、血漿細胞が腎臓中で観察された。おそらくこれは、この炎症した器官でのケモカインの発現が原因である。したがって、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいては、有意な数のＩｇＡ分泌細胞、およびあまり有意ではない数のＩｇＧ分泌細胞が、ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）によって腎臓で検出された。ＩｇＡ分泌細胞は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によっておよそ２倍減少した。まとめると、試験した全ての細胞のサブセットのうち、ＭＺ Ｂ細胞だけをＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって明らかに調節することができたが、腎臓中およびＭＬＮ中のＩｇＡ分泌細胞は、部分的にＬＴ制御下にある場合もあった。このことはまた、これらのエフェクター細胞の炎症組織への移動ができないことを示唆している。ケモカインの発現の破壊が、おそらくこの表現形の原因であり、ＳＬＥを処置することにおいて重要な治療上の利点を有している可能性があった。実際、ＣＸＣＲ３リガンドは、最近、血漿細胞の移動において重要であることが示されている。血漿細胞の移動におけるＬＴ経路の役割と一致して、本発明者らは、ＣＸＣＲ３リガンドをＩＦＮ−γの存在下でのＬＴＢＲでの刺激によって誘導できることを見出した。
【００９０】
【表３】
【実施例６】
【００９１】
疾患状態のＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおけるＧＣの役割の評価
濾胞性樹状細胞（ＦＤＣ）は、マウスにおいても霊長類においてもＬＴ経路によって厳密に調節されている。ＦＤＣはＧＣ中に存在し、抗原を保持する能力を有しているので、この種の細胞は免疫応答の間に親和性の高いＢ細胞を選択することにおいて役割を果たすことができる。ＬＴ欠損動物とＬＴＢＲ−Ｉｇで処置した動物での体液性応答の親和性の成熟の試験により、抗原の用量と投与経路におそらく依存する種々の結論が得られた。いずれの場合にも、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の結果としてのＦＤＣネットワークの排除が、処置を用いて観察された糸球体腎炎（ＧＮ）の改善についての１つの説明である可能性がある。マウスを実施例１に記載したように処置した。処置の５週間後、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスに由来する脾臓を、ＧＣを数えるためにＰＮＡ染色について評価した。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは有意な数のＧＣを有していることが観察されたが、これらは全く免疫化されていなかった（図６Ａ（ｉｉｉ））。ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、ＢＡＦＦトランスジェニックの脾臓中のＰＮＡ陽性ＧＣの数は一部減少した（Ｐ＜０．００６）（図６Ｂ）。しかし、脾臓をＦＤＣ特異的マーカーであるＭ−１で染色すると、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によるＦＤＣネットワークにおける減少は完全であった。したがって、ＰＮＡ陽性ＧＣにおいては完全には減少しないが、ＦＤＣネットワークはＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によって排除される。
【００９２】
ＰＮＡ陽性ＧＣにおけるこの部分的な減少がＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおいて観察された疾患の縮小と関係があるかどうかを決定するために、ＣＤ４０経路を遮断する効果を評価した。ＣＤ４０欠損動物はＰＮＡ陽性ＧＣを形成することができず、Ｔ依存性免疫応答はこれらの動物においては完全に失われている。さらに、成体マウスの抗ＣＤ４０リガンド抗体（ＭＲ１）での処置は、ＧＣおよびＴ依存性免疫応答に対して同様の効果を有する。ＬＴＢＲ−Ｉｇで処置した動物と同様に、ＭＲ１での処置は脾腫に対して効果がなかった（図７Ａ）だけではなく、増加した濾胞性Ｂ細胞成分に対しても効果がなかった（図７Ｂ）。しかし、ＭＲ１また、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの増加したＢＺ Ｂ細胞成分に対しても全く効果がなかった（図７Ｃ）。ＭＲ１で処置したＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、それらの脾臓においては、観察できる程度にはＰＮＡ陽性ＧＣを有していなかった（対照で処置したＢＡＦＦトランスジェニックと比較してＰ＜０．００１）（図７Ｄおよび７Ｅ）。ＧＣに対するこの効果にもかかわらず、ＭＲ１での処置は、タンパク尿によって測定したように、疾患状態にあるトランスジェニックマウスの腎機能を改善できなかった（図７Ｆ）だけではなく、腎臓の病状を有意に改善することもできなかった。まとめると、ＧＣ反応およびＴ依存性応答に対するこの十分に研究された効果にもかかわらず、ＣＤ４０経路の阻害は、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの疾患には効果がなかった。
【００９３】
本明細書は、参照により本明細書中に組み込まれる、明細書中で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例を提供し、本発明の範囲を限定するようには解釈されるべきではない。当業者には、多くの他の実施形態が本発明に含まれることが理解される。本開示において引用された全ての刊行物および特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書中の全ての参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であると自認するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、疾患状態にあるＢＡＦＦトランスジェニック（ＢＡＦＦ Ｔｇ）マウスのＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、タンパク尿（ＰＵ）スコアによって示されるように腎機能の改善が生じたことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ Ｔｇマウスとトランスジェニックではない（Ｔｇ ｎｅｇ．）同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。図１Ａは、処置の終了時点でのＰＵスコアにおける絶対的変化を示す。図１ＢはＰＵスコアにおける相対的変化を示す。
【図２】図２は、疾患状態にあるＢＡＦＦ−ＴｇマウスのＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により、腎臓のパス（ＰＡＳ）組織化学的染色によって示されるように、糸球体の病状の改善が生じたことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組試料を、図２Ａ〜２Ｆに示す。糸球体の病状のスコアを図２Ｇに示す。
【図３】図３は、自己抗体の力価に対するＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置の効果を示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。血清Ｉｇ濃度を測定し、組織分析のために腎臓を採取した。図３Ａは、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスが、野生型の同腹子である対照と比較して、高い血清ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ濃度を示したことを明らかにしている。図３Ｂ〜３Ｃは、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によりＢＡＦＦ Ｔｇマウスの自己抗体力価が低下したことを示す。
【図４】図４は、ＢＡＦＦ−Ｔｇマウスの腎臓での免疫複合体の沈着を示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組織化学的試料を図４Ｃに示す。ＢＡＦＦ−ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの糸球体中のＩｇＡ（図４Ａ）およびＩｇＧ（図４Ｂ）免疫複合体の状況を記録した。
【図５】図５は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置により辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞が減少したことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。ＢＡＦＦ ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの脾臓重量を図５Ａに示す。脾臓細胞の数、成熟ＣＤ２３＋濾胞性Ｂ細胞の数、およびＭＺ Ｂ細胞の数を、それぞれ図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄに示す。典型的な組織化学的試料を図５Ｅに示す。
【図６】図６は、ＬＴＢＲ−Ｉｇでの処置によりＢＡＦＦ Ｔｇの脾臓中のＰＮＡ陽性ＧＣの数が減少したことを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇのＬＴＢＲ−Ｉｇまたは１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。典型的な組織化学的試料を図６Ａに示す。ＬＴＢＲ−ＩｇまたはｈｕＩｇＧでの処置を行った総数に対するＰＮＡ陽性濾胞の割合を、図６Ｂに示す。
【図７】図７は、ＰＮＡ陽性ＧＣの部分的な減少がＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおいて観察された疾患の縮小に関係していることを示す。６ヶ月齢のＢＡＦＦ ＴｇマウスとＴｇ ｎｅｇ．同腹子の対照に、１００μｇの抗ＣＤ４０リガンド抗体（ＭＲ１）または１００μｇのｈｕＩｇＧのｉ．ｐ．注射を、５週間にわたって１週間に１回投与した。組織分析のために腎臓を採取した。ＢＡＦＦ ＴｇマウスおよびＴｇ ｎｅｇ．マウスの脾臓の重量を図７Ａに示す。濾胞性Ｂ細胞の数、ＭＺ Ｂ細胞の数、および脾臓中のＰＮＡ陽性ＣＧの割合を、それぞれ図７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄに示す。典型的な組織化学的試料を図７Ｅに示す。腎機能は、図７Ｆに示すようにタンパク尿によって評価した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与し、それによって哺乳動物を処置する工程を含む、腎臓の免疫障害を有している哺乳動物を処置する方法。
【請求項２】
前記障害が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびＩｇＡ腎症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害がＩｇＡ腎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害因子がＬＴＢＲ抗体またはＬＴ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害因子がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列またはその一部を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；または
（ｂ）少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであり、定義された条件下で（ａ）をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、
前記ポリペプチドがＢ細胞による免疫グロブリンの分泌を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記定義された条件に、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃で８時間の前処理；６５℃で４８時間のハイブリダイズ；ならびに２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液中での３７℃で１時間、さらに０．１×ＳＳＣを含む溶液中での５０℃で４５分間の洗浄が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＩｇＧ１のＦｃ断片またはＩｇＧ４のＦｃ断片をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害因子が、１つ以上の異種タンパク質ドメインに融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶性ＬＴＢＲが、少なくとも１つのＬＴ βサブユニットを含むリンホトキシン（ＬＴ）リガンドに選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性ＬＴＢＲがＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性ＬＴＢＲがヒトＬＴ−β−Ｒである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種タンパク質ドメインがヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物の有効量を被験体に投与し、それによって糸球体腎炎を処置する工程を含む、糸球体腎炎を有する被験体を処置する方法。
【請求項１７】
前記糸球体腎炎が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびＩｇＡ腎症から選択される障害に関連している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害因子が１つ以上の異種タンパク質ドメインに融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害因子が配列番号１のアミノ酸から選択されるアミノ酸の機能的配列を含む可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記可溶性ＬＴＢＲが、少なくとも１つのＬＴβサブユニットを含む表面リンホトキシン（ＬＴ）リガンドに選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶性ＬＴＢＲがＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記可溶性ＬＴＢＲがヒトＬＴ−β−Ｒである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種タンパク質ドメインがヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＡＦＦトランスジェニック動物に化合物を投与する工程；投与後の該動物の腎臓中でのＩｇＡの沈着の試験レベルを決定する工程；該レベルを閾値と比較する工程を含み、該閾値よりも低い試験レベルにより該化合物が有効であることが示される、ＩｇＡ腎症の処置に対する化合物の効力を評価する方法。
【請求項２５】
前記動物が齧歯動物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与し、それによって哺乳動物を処置する工程を含む、腎臓の免疫障害を有している哺乳動物を処置する方法。
【請求項２】
前記障害が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびＩｇＡ腎症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害がＩｇＡ腎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害因子がＬＴＢＲ抗体またはＬＴ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害因子がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列またはその一部を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；または
（ｂ）少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであり、定義された条件下で（ａ）をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、
前記ポリペプチドがＢ細胞による免疫グロブリンの分泌を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記定義された条件に、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃で８時間の前処理；６５℃で４８時間のハイブリダイズ；ならびに２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液中での３７℃で１時間、さらに０．１×ＳＳＣを含む溶液中での５０℃で４５分間の洗浄が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＩｇＧ１のＦｃ断片またはＩｇＧ４のＦｃ断片をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害因子が、１つ以上の異種タンパク質ドメインに融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶性ＬＴＢＲが、少なくとも１つのＬＴ βサブユニットを含むリンホトキシン（ＬＴ）リガンドに選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性ＬＴＢＲがＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性ＬＴＢＲがヒトＬＴ−β−Ｒである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種タンパク質ドメインがヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＴ経路の阻害因子を含む組成物の有効量を被験体に投与し、それによって糸球体腎炎を処置する工程を含む、糸球体腎炎を有する被験体を処置する方法。
【請求項１７】
前記糸球体腎炎が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、慢性肝炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびＩｇＡ腎症から選択される障害に関連している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害因子が１つ以上の異種タンパク質ドメインに融合させられた可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害因子が配列番号１のアミノ酸から選択されるアミノ酸の機能的配列を含む可溶性ＬＴＢＲを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記可溶性ＬＴＢＲが、少なくとも１つのＬＴβサブユニットを含む表面リンホトキシン（ＬＴ）リガンドに選択的に結合することができるリガンド結合ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶性ＬＴＢＲがＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記可溶性ＬＴＢＲがヒトＬＴ−β−Ｒである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種タンパク質ドメインがヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＡＦＦトランスジェニック動物に化合物を投与する工程；投与後の該動物の腎臓中でのＩｇＡの沈着の試験レベルを決定する工程；該レベルを閾値と比較する工程を含み、該閾値よりも低い試験レベルにより該化合物が有効であることが示される、ＩｇＡ腎症の処置に対する化合物の効力を評価する方法。
【請求項２５】
前記動物が齧歯動物である、請求項２４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５０４７７５（Ｐ２００６−５０４７７５Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８６１８（Ｐ２００４−５４８６１８）
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９３２９
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９３２９
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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