ルシリア・セリカータの幼虫から得られるキモトリプシン及び創傷の治療のためのその使用
【課題】組織再生及び創傷治癒において有用であるキモトリプシンおよびその使用の提供。
【解決手段】ルシリア・セリカータ(Lucilia sericata)から取得する幼虫の酵素。創傷郭清のための及び細胞再生のための創傷の治療において、この酵素を使用する。
【解決手段】ルシリア・セリカータ(Lucilia sericata)から取得する幼虫の酵素。創傷郭清のための及び細胞再生のための創傷の治療において、この酵素を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幼虫の酵素に関する。より具体的には、本発明は、ルシリア・セリカータ(Lucilia sericata)から取得することができる1つ又はそれ以上の幼虫の酵素に関し、該酵素は組織再生及び創傷治癒において有用である。
【背景技術】
【0002】
幾つかの創傷の幼虫の繁殖の有益な効果が長年にわたって観察されてきた。しかしながら、感染の抗生物質耐性株の蔓延が、医学、特に創傷治癒の分野において問題となるまで、このプロセスに関与する機序についてのさらなる調査は実施されなかった。
【0003】
以前の研究は、旧来の抗生物質への添加物又は補助剤としての、創傷郭清(創傷から壊死性物質、被感染物質又は外来物質を除去すること)、感染管理(感染の予防又は治療)における幼虫の酵素の役割、より最近では、創傷中の新しい組織を増殖させ、創傷を閉じさせる(治癒)ための組織の再生の促進における幼虫の役割を観察してきた。使用される幼虫の酵素は、予め幼虫を洗浄して又は洗浄せずに、完全な幼虫の血リンパから又はホモジネートから、幼虫の表面上に見出されるあらゆる排出産物又は分泌産物を除去するために、幼虫を洗浄することによって取得し得る。以前の研究は、無菌又は非無菌条件で幼虫を育てることの効果、幼虫のホモジネート、血リンパ又は排泄/分泌を使用することの効果及び幼虫の年齢(新たに孵化した、又は第一若しくは第二齢)の効果についても調査した。これらの要因の全ては、幼虫から得られた産物の性質又は活性に影響を与えることが見出されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
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【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、最近、組織増殖を促進することによって創傷の閉鎖を促進する幼虫の産物の成分である幼虫の産物、特に酵素の創傷治癒特性に焦点を当ててきた。驚くべきことに、本発明者らは、ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物(表面洗浄)中に見出される1つ又はそれ以上のキモトリプシン酵素が組織形成において重大な役割を果たしていることを見出した。このような酵素は、通常、組織の破壊に関連している。
【0006】
従って、本発明は、昆虫の幼虫由来の単離されたキモトリプシン又はその類縁体若しくは合成様式を提供する。
【0007】
有利なことに、本発明のキモトリプシンは、プロテアーゼの予想される特性であり得る創傷郭清(壊死性物質、被感染物質又は外来物質の除去)において有用であるのみならず、繊維芽細胞の接着(すなわち、組織増殖)を促進する上でも有用である(これは、プロテアーゼ酵素に関しては、全く予想されない特性である。)という点で、相反する二重の特性を発揮することが示された。本発明のキモトリプシンは選択的な活性を有する。本発明のキモトリプシンは、創傷痂皮などの幾つかの組織を除去又は分解するが、健康な組織又は新たな組織など、全ての組織を除去又は分解するわけではない。このプロテアーゼ又は各プロテアーゼが、壊死性組織と健康な組織が分解されるルシリア・キュプリナによって引き起こされるハエ幼虫症で起こるような、種類に関わらずに組織を分解又は除去することが合理的に予想され得る。同じ酵素における創傷郭清と細胞増殖の促進という二重の特性は一般的でなく、これらの特性は相反することが予想されるので、当業者にとって驚くべきものである。
【0008】
本明細書において使用される「痂皮」という用語は、やけど、壊疽、潰瘍(特に、褥瘡)、感染(特に、真菌感染)、炭そ菌又は他の何れかの壊死性組織への後期曝露後のものなど、皮膚の表面から排出されたあらゆる死亡した組織を定義するものとする。
【0009】
昆虫は、好ましくは、クロバエ類であるルシリア・セリカータである。
【0010】
本発明のキモトリプシンは、好ましくは、昆虫の幼虫の排泄物/分泌物から取得され、又は取得可能である。しかしながら、同じ成分が血リンパ中に又はホモジネート中に存在し得、これらの採取源から取得できる可能性がある。キモトリプシンは、例えば、幼虫を洗浄し、洗浄媒体を集めることによって取得され得る。本発明者らは、昆虫の幼虫の排泄物/分泌物(ES)が、酵素、ホルモンなどを含む恒常的に発現される成分と誘導性成分の両方を含むことを以前に見出した。この理由のために、幼虫の増殖条件は一定に保たれることが好ましい。本発明の最も好ましい実施形態において、無菌条件中で増殖された新たに孵化した幼虫から排泄物/分泌物が収集され、使用される。
【0011】
キモトリプシンは、図1、図2若しくは図13中に示されている配列又は天然の若しくは完全なキモトリプシンの活性を保持する生物学的に活性なこれらのペプチド断片を有することが好ましく、図1、2及び13中には、活性部位が特定されている。好ましくは、断片は図1、2及び13に特定されている活性部位に対して、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするDNAと高い相同性を有し、例えば、活性部位に対する相同性は少なくとも90%、好ましくは95%超、より好ましくは99%の相同性であるべきである。理想的には、断片は、ペプチドの活性部位と同一性を有するべきであり、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするDNAと同一性を有するべきである。関連するDNA配列が、図1、2及び12に示されている。
【0012】
これらの配列のキモトリプシンは、組織再生特性及び創傷郭清活性を有するが、健康な組織又は生きた組織を分解又は消化せず、これは、ルシリア・キュプリナに由来するキモトリプシン(健康な組織又は生きた組織に対してさえ周知の組織分解特性を有する、ハエ幼虫症(組織変性性のプロセス)の原因因子)に対するその高い相同性に鑑みれば特に驚くべきである。この相同性は、図1及び2にも示されている。
【0013】
本発明者らは、トリプシン様及びキモトリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するセリンプロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)とともに温置した後に、ESの組織再構築及び再生特性が喪失又は阻害されるが、トリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するに過ぎない4−(アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリド(APMSF)との温置後には喪失/阻害されないことを見出した。
【0014】
従って、細胞外マトリックスの再構築又は組織再構築及び組織再生活性に必要なESの重要な成分又は不可欠でさえある成分はキモトリプシン又はキモトリプシン様酵素であると結論付けられた。これは、以下に記載されているように、二重特性を有するキモトリプシンの配列が同定された配列決定によって確認された。実施例が示すように、このキモトリプシンが除去されると、ESの組織再生特性は失われ、このキモトリプシンは創傷の痂皮を郭清するので、同じキモトリプシン酵素が組織再生及び創傷郭清という二重活性を有する。
【0015】
本発明のキモトリプシンは、創傷郭清又は創傷郭清の改善によるのみならず、繊維芽細胞の遊走、マトリックス再構築及び繊維芽細胞形態の修飾を促進することによっても、創傷の治癒を促進するために創傷の治療において使用することができる。特に、壊死性組織と生きた組織の両方を破壊する疾病であるハエ幼虫症を引き起こすルシリア・セリカータ由来のキモトリプシンに対する高い相同性に鑑みれば、これらの反対の効果(タンパク質分解及びタンパク質生成)が同じ酵素中に存在するという事実は当業者にとって驚くべきことであり、従来技術からは予測することができない。
【0016】
従って、本発明は、創傷を治癒するための組成物におけるキモトリプシンの使用を提供する。
【0017】
本発明は、創傷の治癒のための医薬の調製におけるキモトリプシンの使用及びキモトリプシンを用いて創傷を治療する方法も提供する。好ましくは、組成物又は医薬中で使用されるキモトリプシンは、図1、図2若しくは図13の配列を有し、図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる。
【0018】
あるいは、キモトリプシンの活性断片をこのような組成物又は医薬中に使用し得る。キモトリプシン又はその断片は、天然又は合成であり得る。キモトリプシン又はその断片は、ルシリア・セリカータの幼虫から好ましく取得される。本発明の創傷は以下に定義されており、感染していてもよく、又は感染していなくてもよい。好ましくは、創傷は慢性的な創傷であり、旧来の治療に対して抵抗性であり得る。
【0019】
創傷は繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、又は繊維芽細胞の形態の修飾によって治療され得る。好ましくは、創傷は、本発明のキモトリプシンによって創傷郭清される。
【0020】
さらなる態様において、本発明は、創傷に対する包帯も提供し、該包帯は本発明の一部を形成するものとして記載されているキモトリプシンを含有する。従って、本発明は、治療を必要としている創傷に上記包帯を適用する工程を含む、創傷を治療する方法も包含する。
【0021】
本発明者らは、大豆のトリプシン阻害剤(STI)とともにESを温置することによって、繊維芽細胞の遊走を増強するESの能力及び細胞外マトリックスタンパク質を分解するESの能力が除去されることを見出した。同様に、キモトリプシン活性が除去されると、タンパク質分解(創傷郭清)活性は変化したが、以下に示されているように、いくらかのトリプシン活性は残存していた。STIによって除去されたタンパク質の配列を決定した。配列は図1、2及び13に示されているキモトリプシン又はキモトリプシン様配列であることが見出され、この酵素及びその相同体が本明細書に記載されている活性のために必要であることを確認する。
【0022】
従って、本発明は、図1、図2又は図13中に示されている配列を有するキモトリプシンも提供する。本発明は、図1、2及び13に示されているキモトリプシンをコードするDNA配列並びにpBac−3ベクター多重クローニング部位DNA配列中のL.セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すDNA配列(図12)も提供する。キモトリプシンの活性部位をコードするDNAの断片(図13参照)も、本発明の一部を構成する。
【0023】
本明細書において使用される「創傷」という用語は、傷害によるか又は疾病によるかを問わず、皮膚、表皮又は結合組織に対するあらゆる損傷を定義することが意図され、従って、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど(熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。)、皮膚の擦過又は暴行(assault)、骨髄炎並びに整形外科的創傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。創傷は、感染された状態であり得る。さらに、創傷は、慢性又は急性であり得る。慢性的な創傷は、様々な症状に起因し、糖尿病性の足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、感染性手術創、整形外科的創傷、骨髄炎及び褥瘡が含まれる。
【0024】
本発明のキモトリプシンは天然であり得、又は図13に示されているものなど、天然の酵素の合成様式であり得る。酵素の合成様式は、例えば、組み換えベクター発現系を用いて、又は以下の実施例中に示されているように何れかの公知のペプチド合成法又は装置の使用によって、慣用の様式で、与えられた配列から作製され得る。酵素の活性な断片(すなわち、酵素の機能を維持する酵素の断片、特に、図13に特定されている活性部位を含む断片)も、これらをコードするDNA断片と同様に、本発明の一部であると考えられる。
【0025】
本発明のキモトリプシンは、未精製であり得若しくは精製され得る抽出物として使用され得、又は溶媒、希釈剤、緩衝剤、ビヒクル、安定化剤、保湿剤、賦形剤、結合剤、補助剤、防腐剤、抗ケーキ剤、酸性化剤、ゲル化剤、乳化剤、着色剤、香料などの、特に局所製剤中で使用されるものなど、慣用の添加物を含む医薬組成物中へ取り込まれ得る。好ましい実施形態において、キモトリプシンは局所的に適用されるが、本発明の範囲から投与の経口様式又は他の非経口様式が除外されることを意図するものではない。従って、投与の好ましい様式、局所投与において、本発明のキモトリプシンは、洗浄溶液、懸濁液、洗浄液、クリーム、ローション、ゲル、軟膏(unguent)、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、粉末又は固体又は流体送達ビヒクル中に存在し得る。あるいは、キモトリプシンは、徐放様式で、又は調節された放出様式で、キモトリプシンを創傷中に送達することができる適切な材料中に取り込まれ、又は封入され得る。このような適切な材料の例は、調節された放出様式でペプチドを放出するように調合され得るポリ(ラクチド−コグリコリド)又はPLGA粒子である。最も好ましくは、キモトリプシンは、創傷に適用されるべき包帯中に取り込まれ得る。このような包帯の例には、キモトリプシンを含有する徐放性親水コロイド粒子を取り込んだ段階化された又は層状化された包帯又は旧来の包帯によって場合によって重層されたキモトリプシンを含有するスポンジが含まれる。例えば、Smithら2006に記載されているものを参照されたい。現在使用されているこの種の親水コロイド包帯、例えば、「Granuflex」の商品名で販売されているものは、キモトリプシンを創傷中に放出するように改変され得る。
【0026】
本発明のキモトリプシンは未精製であり得、又は慣用のタンパク質精製法を用いて精製され得る。キモトリプシンは、例えば、COOHでのアミド化、非コード異常アミノ酸を用いた置換及び/又は同配体(isotere)によるCO−NHアミド結合の置換によって、アミノペプチダーゼ又はその他の酵素活性に対して保護され得る。さらに、キモトリプシン、特に合成されたキモトリプシン又はその他の新生キモトリプシンは、特に、ヒドロキシル化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化され得、又は、特に二次若しくは三次プロセシングが酵素に安定性を与え、若しくは酵素に改善された溶解度若しくは他の望ましい特性を与える場合には、その他二次若しくは三次プロセッシングを受け得る。二次又は三次プロセシングを施すことが酵素の活性を低減しなければ、酵素の合成様式は、天然酵素の立体構造に近い立体構造に到達させるために、二次又は三次プロセシングを施されることが特に好ましい。
【0027】
さらに、本発明者らは、細胞を維持するために、組織培養又は組織マトリックスモデル化において、昆虫の幼虫、特にルシリア・セリカータの排泄/分泌産物を使用できることを見出した。すなわち、ルシリア・セリカータの排泄/分泌産物は、細胞の生存性を維持するために、ウシ血清などの血清の代わりに使用することができる。これは、血清を使用する必要性をなくすことによって、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)に関連するプリオンなどの潜在的感染源又は潜在的な疾病転移源を除去するので、このような細胞が創傷上に又は創傷中に移植され又は植えつけられるべき場合に、これは特に重要である。
【0028】
従って、本発明は、昆虫の幼虫の排泄/分泌産物を含む、生きた細胞の維持において使用するための培地も提供する。好ましくは、幼虫はルシリア・セリカータの幼虫である。
【0029】
典型的には、ルシリア・セリカータの幼虫又はクロバエ類のウジは、旧来の治療が奏効しない慢性的な創傷に適用される。臨床的な観察は、ウジが壊死性組織を除去し(創傷郭清)、消毒を促進し、肉芽組織の形成を加速するという証拠を提供する(Sherman et al,2000;Wollina et al,2002)。これらの効果の背後に存在する機序を解明するために、本発明者らは、ウジの分泌物及び/又は排泄物(ES)(ウジが継続的に滲出する物質は分泌及び/又は排泄物を起源とし得るので、このように称される。)内に存在する別の研究が示した酵素活性が創傷中に放出されることを調べた(Schmidtchen et al,2003)。セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ及びアスパルチルプロテイナーゼ活性の証拠が見出された(Chambers et al,2003)。さらに、ES内に存在するセリンプロテイナーゼ活性は、様々な一般的な細胞外マトリックス(ECM)成分を分解することが示された(Chambers et al,2003)。
【0030】
本発明者らは、ウジのESが組織形成において重大な役割を果たすので(Eckes et al,2000)、ヒト皮膚の繊維芽細胞及び細胞外マトリックス(ECM)成分間の相互作用に対するウジのESの効果も調べた。細胞膜受容体(Giancotti and Ruoslahti,1999)との結合を通じて、細胞外マトリックスは接触を誘導するための足場を提供し、繊維芽細胞の接着を調節し、細胞の遊走を誘導する(Clark,1996;Greiling and Clark,1997)。繊維芽細胞を含む多くの源から得られるプロテアーゼは、このような相互作用を調節する。これは、繊維芽細胞の増殖(Abe et al,2000;Dery and Bunnett,1999)及び血管新生(Blair et al,1997)に影響を与える細胞表面受容体の直接的な活性化を介するものであり得、又は細胞外マトリックス成分(最も顕著なものは、フィブロネクチン)のタンパク分解性分解産物が繊維芽細胞の遊走及び走化性(Greiling and Clark,1997;Livant et al,2000)、再上皮化(Gianelli et al,1997)及び組織再構築(Gould et al,1997;Werb et al,1980)を誘導する間接的な方法によるものであり得る。本発明者らの結果は、ESの存在下で、フィブロネクチン及びコラーゲンに被覆された表面への繊維芽細胞の接着が低下することを示した(Horobin et al,2003)。より最近になって、二次元インビトロアッセイを用いて、本発明者らは、ES内に存在するセリンプロテイナーゼによって、フィブロネクチンを横切る繊維芽細胞の遊走が加速されることを示した(Horobin et al,2005)。すなわち、本発明者らは、平面を横切る強化された繊維芽細胞の遊走とこのような酵素活性を関連付けた。しかしながら、記載されているものなどの証拠は、二次元内において、細胞は、細胞の一般的な三次元インビボ環境内とは異なる挙動を示すことを示唆する(Abbott,2003;Cukierman et al,2001;Friedl and Brocker,2000)。例えば、平面上で、細胞は平坦な層状の外観を呈する。これに対して、原位置で観察される細胞は星状の形状を採り、伸長突起の樹状ネットワークを突出する。細胞は三次元マトリックス接着と名付けられた、周囲のマトリックスへの異なる付着も示す(Cukierman et al,2001)。平面上の前進する細胞体に対する抵抗が欠如しているので、二次元では、表面を横切る遊走は、主に、接着及び脱接着現象の関数である。しかしながら、三次元内では、マトリックス障壁は細胞がそれらの形態を採るように強制し、運動を促進するために、細胞に形状を変化させ、及び/又は細胞外マトリックス成分を酵素的に分解させる。従って、本発明者らは、ESに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイを開発した。
【0031】
従って、本発明者らは、ESに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイの推進を目指して研究を行った。細胞がインビボで存在する微小環境により近いこのようなモデルの確立は、創傷治癒プロセス中での細胞外マトリックス、常在性細胞及びES間の相互作用の重要性のよりよい理解を与える。このようなモデルの確立は、治癒を促進するために、支持性の、水和された、生物分解性の及び生物活性な組織様マトリックス内に保たれた生きた皮膚及び上皮細胞が開放創へ送達されるシステムを開発するための基礎も与える。(何れも、遊走に最適と考えられる濃度の)コラーゲン及びフィブロネクチンから構成されるゲル内に包埋された初代ヒト包皮繊維芽細胞(HFF)の単離された集団を含有するアッセイが開発された(Greiling and Clark,1997;Friedl and Brocker,2000)。コラーゲンゲルはインビボ様の細胞培養に対して広く使用されており、表皮の生物物理学的構造を正しく再生したものであると考えられている(Friedl and Brocker,2000)。さらに、コラーゲンゲル内に包埋された細胞は、原位置様形態と幾分の類似性を共有する伸長突起の樹状ネットワークを採ることが示されている(Cukierman et al,2001)。フィブロネクチンは創傷空間中に細胞遊走を誘導する上で主要な役割を果たしているので、フィブロネクチンが含められた(Greiling and Clark,1997)。結果は、用量依存的な様式で、ESがゲルを通じた繊維芽細胞の遊走を加速することを示した。これは、マトリックス再構築の強化及びより十分に広がった細胞形態の誘導によって促進された可能性がある。以下の実施例中に示されているように、適切な対照と比較して、1及び5μg/mLのES濃度は遊走している細胞の数及びそれらが細胞小滴から移動した距離をともに著しく増加させた。ESのこれらの濃度は十分に広がった細胞形態も誘導し、低い集団密度で、5μg/mLのESは細胞間のマトリックス原繊維の並列を促進した。これに対して、10μg/mLのES(検査された最高濃度)は細胞の遊走を阻害したが、細胞の形態を変化させた。0.1μg/mLの濃度のESは、調べた温置期間にわたって、ほとんど効果を示さなかった。
【0032】
これらの観察から、ESはマトリックスの再構成及び細胞の牽引力の発揮を促進したと結論付け得る。遊走アッセイの中で、牽引が生じたことは、5μg/mLのESを含有するゲルの剥離後における及び10μg/mLのESに曝露されたゲルの液状化の間における細胞小滴サイズの収縮によって表される。より低い播種密度で細胞が観察される場合には、牽引力の存在は、反対方向の牽引力の発揮によって、おそらくこのようにして組織化された、細胞間で緊張した状態に保たれた真っ直ぐな整列されたマトリックス原繊維の出現によって示される。牽引力の存在は、十分に広がった細胞形態によっても示される。Harris及び共同研究者(1981)は、「・・・繊維芽細胞が細胞周囲のコラーゲンを圧縮及び伸展するにつれて、細胞は短縮されずに伸長するので」、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞では、繊維芽細胞の牽引は、「筋肉の収縮のような単純な収縮とは異なる」ことを観察した。
【0033】
ESが繊維芽細胞によるマトリックス再構築を強化したこと、及びこのようにすることによって、遊走の促進を実施することは、おそらく、Bellowsら(1981)によって提案されたゲル圧縮のモデルによって明らかにされる。異なる細胞種がコラーゲンゲルを収縮し、組織化する能力を比較する際に、これらの研究者は、表1に示されているように、ゲル圧縮の一連の連続する段階を同定した。本発明者らの観察から、ESが、細胞付着及び広がりを促進し、並びにマトリックス(コラーゲンである可能性が最も高い)繊維の整列を促進するというゲル圧縮の最初の3つの段階を開始させることが明らかである。このようにすることにより、細胞遊走の第四段階に到達した。マトリックス再構築と細胞遊走間の関連は、コラーゲンゲル内に包埋された細胞の集団間でのコラーゲン「ストラップ」(整列されたコラーゲン原繊維のパターン)形成が細胞の前進を引き起こし、細胞遊走を隣接する細胞集団の方向に誘導する(接触誘導)ことを見出したSawhney及びHoward(2002)の研究によってさらに強化される。
【0034】
【表1】
【0035】
これらの比較から、ESの存在下にある細胞は、他の研究者によって、コラーゲンゲル内に包埋された細胞について観察されたものと類似の形態特性及びマトリックスの再構成を示した。他の研究はウジ由来の産物を含んでいなかったので、ESが存在しない本発明者らの対照中の細胞に対してこのような挙動が観察されなかった理由が問われなければならない。比較研究は血清を含有するアッセイを含んでいたのに対して、ここでは、血清が除外されたので、答えは血清と関連している可能性がある。血清による細胞−マトリックス相互作用の促進に対する証拠は、係留された繊維芽細胞が集合したコラーゲンゲルの放出の直前に血清を除去することが、常在性細胞によるその後のゲル収縮の程度を阻害することを見出したTomasekら(1992)によって与えられている。一旦ゲルが放出された後にゲルに血清を添加することによって、直ちに収縮が引き起こされた。他の研究者らも、マトリックスの再構成に関して、血清への依存を観察している(Steinberg et al,1980;Guidry and Grinnell,1985)。血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子β(TGFβ)及び生物活性脂質媒介物質リゾホスファチジン酸(LPA)が血清中に見出されており、全て、マトリックス再構成の刺激に関与していると推定されている(Montesano and Orci,1988;Grinnell et al,1999;Roy et al,1999;Toews et al,2002;Kondo et al,2004)。
【0036】
従って、ウジのESが血清中にも見出される活性成分を含有している可能性がある。別の可能性は、本発明者らが以前に繊維芽細胞の遊走を加速することを示したES内に存在するセリンプロテイナーゼ(Horobin et al,2005)は、膜結合型プロテアーゼ活性化受容体(PAR)の切断を通じて寄与し得ることである。Gタンパク質共役型受容体のこのファミリーは、トロンビン及びトリプシン様酵素などのセリンプロテイナーゼによるそれらの酵素的切断後に活性化される。このような作用は、受容体上のN末端係留されたリガンドを露出させ、次いで、露出されたリガンドは切断された受容体を結合し、活性化させる。活性化されたPARは、細胞の形状、分泌、インテグリン活性化、代謝性応答、転写応答及び細胞の移動性に影響を与えるシグナル伝達カスケードに共役している(Cottrell et al,2002)。以前の研究は、PARのプロテイナーゼ活性化を通じて、トロンビンがコラーゲンゲル中の胎児性ニワトリ繊維芽細胞内の等尺性張力の発生を促進することを示している(Kolodney and Wysolmerski,1992;Pilcher et al,1994;Chang et al,2001)。ES内に存在するセリンプロテイナーゼは、トロンビンとプラスミン基質であるトシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対して活性を示し(Chambers et al,2003)、これは、ESがトロンビンと同様の効果を繊維芽細胞に対して発揮し得ることを意味することに注目するのが興味深い。プラスミンは細胞によって分泌される様々なマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)のチモーゲン前駆体を活性化させ、従って、局所化されたマトリックス再構成に寄与する(Mignatti et al,1996)ことが示されているので、何らかのプラスミン様活性が関連している可能性もあり得る。
【0037】
ウジのESは、ウロキナーゼ様活性に対して不安定なペプチドに対して活性を有することも示されている。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)の別称でも知られるセリンプロテイナーゼであるウロキナーゼは、その活性形態であるプラスミンへとプラスミノーゲンを転化させる。ウロキナーゼはプラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)とも結合し、この研究は繊維芽細胞によって発現されることを示した(Mignatti et al,1996;Ellis et al,1993;Behrendt et al,1993)。一旦結合されると、uPARは局所的な接着部位に局在化し、インテグリンによって媒介される機能を調節し(Wang et al,1995;Chapman and Wei,2001;Porter and Hogg,1998)、従って、より誘導性が高い細胞表現型を誘導するための機序を与える。実際に、uPARは細胞遊走、接着及び走化性において、シグナル伝達の役割を有することが報告されている(Odekon et al,1992;Waltz et al,1993;Gyetko et al,1994)。従って、ES内のウロキナーゼ様活性は細胞挙動の変化にも寄与している可能性があると推測することは合理的である。
【0038】
繊維芽細胞−マトリックス相互作用を促進した可能性があるESの他の作用は、ゲルマトリックス成分を分解するその能力と関連し得る。これは、存在するESの濃度が高いほど、ゲルがその外観をより素早く変化させ、より半透明の状態となり、最高のES濃度では液体様になるという観察によって示される。これは、ES内のセリンプロテイナーゼがコラーゲン及びフィブロネクチンを分解することを本発明者らが示した以前の研究によっても示されている(Chambers et al,2003)。マトリックス原繊維と組織培養皿表面間の接触が侵食され、原繊維ネットワークが破壊されるにつれて、ゲルの分解は機械的張力の緩和をもたらしたであろう。緊張性の培養力モニターを開発した研究者による多数の研究は、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞が機械的張力の変化を感知し、機械的張力の変化に対して反応することができるという証拠を与えている。これらの研究者は、繊維芽細胞が活性な張力性ホメオスタシスを維持し、外的に適用された負荷とは反対方向に内在性マトリックスの張力を修飾するように反応する(Brown et al,1998;Eastwood et al,1994)。従って、適用された負荷の増加は細胞によって媒介される収縮の減少を引き起こし、逆も同様である。おそらく、この応答に寄与しているのは、機械的張力がMMP産生のレベルに影響を与え、従って、周囲のマトリックスを再構築するためにプロテイナーゼを放出することによって細胞を反応させるという知見である(Lambert et al,2001)。従って、ゲルのタンパク分解性分解によって引き起こされる機械的張力の緩和は、細胞周囲のマトリックスを収縮及び再構築し、より高い移動性の表現型を採るように細胞を刺激した可能性がある。別の帰結は、繊維芽細胞の接着と遊走に影響を与えることが示されている分解されたコラーゲンとフィブロネクチンからの生物活性ペプチドの放出であった可能性がある(Greiling and Clark,1997;Livant et al,2000)。
【0039】
繊維芽細胞は機械的張力の変化を検出し、この変化に応答することができるので、マトリックスを再構築するために、ESがどれだけ繊維芽細胞を刺激しても、細胞間の連絡の強化がもたらされ得ることは本発明者らの観察から明らかである。これは、マトリックス原繊維の配列を引き起こす別の細胞からの反対方向の牽引力によって、各細胞がマトリックスの機械的張力の局所的な差を検出することができたからである。隣接する細胞のこのような増強された認識は、比較的長距離に対してさえ、細胞間の作用の改善された協調をもたらし、増強された遊走に寄与した可能性がある。実際には、Sheetz、Felsenfeld及びGabraith(1998)は、細胞外マトリックスタンパク質繊維の配向及び硬直性に従って、細胞がその運動を誘導するという協調された細胞遊走の同様の機序を提案している(Sheetz et al,1998)。
【0040】
遊走及びマトリックス再構築を強化する上でのESの利点にも関わらず、ES内に存在するプロテイナーゼの作用はマトリックスの広範囲な破壊を引き起こすので、ES内に存在するプロテイナーゼの活性は過剰なものではないことは重要である。接触誘導及び転位を促進するために、十分な原繊維構造が残存する必要があることは、10μg/mLという最高のES濃度を含有した本発明者らのアッセイによって示される。ここでは、ESは遊走を阻害したのみならず、粘性のある液体状態へゲルを素早く分解した。従って、明らかに、創傷治癒に貢献し得る細胞の活動を促進するためのESの最適な濃度が存在する。
【0041】
要約すれば、本発明者らの結果は、第一に、ESが繊維芽細胞の遊走を促進することを見出した。第二に、血清の不存在下において、細胞が十分に広がった形態を維持し、拡張するのを補助するためにESが必要であった。第三に、同じく血清の不存在下において、ESは、特に細胞間での細胞外マトリックスの再構成を促進した。第四に、ESは、細胞外マトリックスの直接的なタンパク分解性修飾によって、及び/又は細胞の受容体との相互作用による繊維芽細胞表現型の表現型の直接的な変化により、血清を不要とすることによってこれらの効果を付与した。本発明者らは、ESから活性な要素を単離するための技術的能力を有しており(Chambers et al,2003;Horobin et al,2003,2005)、従って、関与する活性及び機序の同定に進む。
【0042】
実施例2のデータが示すように、創傷の痂皮中のタンパク質を溶解する点で、幼虫のESから抽出されたキモトリプシンは創傷郭清活性を有している(図21参照)。阻害剤研究によって、及び配列決定によって、これはキモトリプシンであることが明らかとなっている。
【0043】
ここで、添付の図面を参照しながら、添付の図面によって例示されているように、本発明の実施例を記載する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】図1は、タンパク質翻訳及びL・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、L.セリカータ遺伝子配列を示す完全な(1)及び部分的な(2)配列表を示している。ここで、DNAコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のL.キュプリナ配列と比較した場合の、L.セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域(UTR)を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図2】図2は、タンパク質翻訳及びL・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、L.セリカータ遺伝子配列を示す完全な(1)及び部分的な(2)配列表を示している。ここで、DNAコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のL.キュプリナ配列と比較した場合の、L.セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域(UTR)を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図3】図3は、三次元インビトロアッセイがどのようにして組み立てられたかの図解である。1.1.5mg/mLコラーゲンと30μg/mLフィブロネクチンを含有するダルベッコの改変イーグル培地(D−MEM)を58mmの組織培養皿の中に注ぎ、薄い均一な層中に37℃でゲル化した。2.1×107個のHFF細胞/mLを含有するD−MEM/コラーゲン/フィブロネクチンの小滴を第一のゲル層の上に置き、37℃でゲル化した。3.D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチン溶液の第二の層を細胞小滴の上に注ぎ、37℃でゲル化した。4.次いで、FCS−遊離細胞培地をゲルの上に注いだ。5.完全に組み立てられたアッセイが断面図で示されており、小滴中の全ての細胞がマトリックスゲルによってどのようにして完全に取り囲まれているか、従って、三次元に遊走しなければならないかについて図示している。
【図4】図4は、三次元インビトロアッセイ内の2μLのゲル小滴からの繊維芽細胞の遊走が、位相差顕微鏡画像からどのようにして定量されたかの図解である。1.アッセイ組み立ての直後における、繊維芽細胞が播種された小滴(0時間の温置)。2.24時間の温置後の同じ小滴。3.コントラストを付けるために黒で着色され、24時間の温置から得られた画像に対して重ね合わせられた、繊維芽細胞が播種された0時間温置時点での小滴。4.24時間にわたって小滴から遊走した細胞のみが示されたままとなっており、従って、それらを計数することが可能となる。各細胞の先端から重ね合わされた0時間画像の周囲へ引かれたベクトルの長さを測定することによって、各細胞が移動した距離を計算した。0時間の温置時における繊維芽細胞が播種された小滴の周囲距離も、重ね合わされた0時間画像周囲に線を引くことによって測定された。ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図5a】図5は、a.ESの不存在下(0ES)若しくは0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下で、又はb.ESの不存在下(0ES)若しくは1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下で、アッセイ組み立て直後に(0時間)又は24時間若しくは48時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図5b】図5は、a.ESの不存在下(0ES)若しくは0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下で、又はb.ESの不存在下(0ES)若しくは1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下で、アッセイ組み立て直後に(0時間)又は24時間若しくは48時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図6a】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6b】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6c】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6d】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図7a】図7は、24時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴2μLからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲mm当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差(n=5)として表されている。a.ESの不存在下(対照)又は0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下での遊走。
【図7b】図7は、24時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴2μLからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲mm当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差(n=5)として表されている。b.ESの不存在下(対照)又は1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下での遊走。
【図8】図8は、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種された各2μLのゲル小滴から遊走する繊維芽細胞が移動した距離の中央値を示している。5つの反復小滴から得られた値が示されている。黒塗りの記号(実験1)は、ESの不存在下(対照#1)又は0.1μg/mLES若しくは5μg/mESの存在下で移動した距離を表している。白い記号(実験2)は、ESの不存在下(対照#2)又は1μg/mLES若しくは10μg/mESの存在下で移動した距離を表している。
【図9】図9は、アッセイ組み立て直後(0時間の温置)又は24時間若しくは48時間の温置後における、20μLのゲル小滴内の、3×105細胞/mLの播種密度の繊維芽細胞を示す代表的な位相差画像を示す。ESの不存在下(0ES)又は1μg/mLES(1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下での細胞の外観。黒い矢印は、並列されている場合、細胞間の鎖状結合性原繊維が可視的になっていることを示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、20μmに相当する。
【図10】図10は、24時間の温置後における、各酵素濃度のタンパク質分解活性に関連した、FN被覆された表面への繊維芽細胞接着に対するES、トリプシン、キモトリプシン及びトリプシン/キモトリプシン混合物の効果を示す2つのグラフである。このような活性は、a.トリプシン又はb.キモトリプシンに対する合成ペプチド基質からの7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の放出をモニタリングすることによって評価された。細胞の接着は、蛍ルシフェラーゼをベースとする発光アデノシン三リン酸(ATP)アッセイを用いて測定された。結果は、対照の平均%細胞接着±1SDとして表した(n=3)。
【図11】図11は、37℃で24時間の温置後のフィブロネクチンのゲル電気泳動の写真である。値は、分子量標準(kDa)を示している。1.FN単独。2.FN+try/chy。3.FN+chy。4.FN+try。5.FN+ES。各酵素濃度は、適切なトリプシン又はキモトリプシン基質に対する活性の同じレベルを示した。Try=0.32μg/mLトリプシン。Chy=0.02μg/mLキモトリプシン。ES=1μg/mL。
【図12】図12は、pBac−3ベクター多重クローニング部位DNA配列中のL.セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すDNA配列表であり、pbac−3ベクターの配列に下線が付されている。
【図13】図13は、活性部位の残基が太字で示されている図12のDNA配列の予想されるタンパク質配列である。
【図14】図14は、S300ゲルろ過後のトリプシン/キモトリプシン活性を示すグラフである。
【図15】図15は、ゼラチンSDS−PAGE基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性を示す一連の写真である。
【図16】図16は、C1プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図17】図17は、C1プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図18】図18は、T2プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図19】図19は、T2プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図20】図20は、L.セリカータのES産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す2つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図20aは処理されていない痂皮を示しており、図20bは一晩処理された痂皮を示している。
【図21】図21は、L.セリカータのES産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す4つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図21aは処理されていない痂皮を示しており、20bはキモトリプシンピーク(C1)で処理され、20cは第一のトリプシンピーク(T1)で処理され、20dは第二のトリプシンピーク(T2)で処理された。
【実施例】
【0045】
(実施例1)
組織の再生
繊維芽細胞の接着の促進
ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物の収集及び性質決定
排泄物/分泌物(ES)を、以前に記載されているとおりに(Horobin et al,2003)、孵化した直後の無菌のルシリア・セリカータの幼虫(LarvETM,Zoobiotic Ltd,UK)から収集した。簡潔に述べると、ES産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)1mL中において、室温で(RT)30分間、400個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Bio−Rad(Hercules,CA)タンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナート(FITC)−カゼイン消化アッセイ(Horobin et al,2003)を用いて、ESのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、161.74μg/mLのタンパク質濃度及び6.04×106相対蛍光単位/mgESタンパク質の比活性であることを明らかにした。
【0046】
初代ヒト包皮繊維芽細胞(HFF)細胞培養
ダルベッコの改変イーグル培地(D−MEM)(GibcoTM,Invitrogen Ltd,UK)、10%ウシ胎児血清(FCS)(Sigma(R),UK)、抗生物質/抗真菌溶液(Sigma(R))(100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び0.25μg/mLアムフォテリシンB)及び2mML−グルタミン(Sigma(R))を含有するT75フラスコ(Nunc,Life Technologies Ltd,UK)内で、HFF細胞(TCS Cellworks(R),UK)を単層培養した。5%CO2を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を37℃に維持した。
【0047】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
通常の細胞培養(上記参照)に対して使用した濃度の2倍のD−MEM、抗生物質/抗真菌物質及びL−グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、1:1の比で、3mg/mLウシコラーゲンI型(ICN Biomedicals,Ohio,USA)、60μg/mLウシフィブロネクチン(Sigma(R))及び幼虫のES又はPBSブランクを含有する冷溶液と原溶液を氷上で混合した。1×D−MEM、1.5mg/mLコラーゲン及び30μg/mLフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のESの最終タンパク質濃度は、表記されているように、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml又は10μg/mlであった。図3に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、58mm組織培養皿(Nunc,Life Technologies Ltd)の中に、D−MEM−コラーゲン/フィブロネクチン混合物1000μLを注ぎ、均一な薄い連続層の中に37℃でゲル化した。HFF細胞(継代6)をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、10%FCSを含有するD−MEM中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、FCSを含まないD−MEM中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、1×107細胞/mLの密度で、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物2μLを含有する5つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、37℃で温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチン混合物をさらに1000μLに注ぎ、ゲル化させるために37℃で放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質/抗真菌物質、L−グルタミン及びPBSブランク又は幼虫のESを含有する、FCSを含まないD−MEMを添加した。次いで、表記の時間、加湿された5%CO2雰囲気中、37℃で、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。
【0048】
各実験を通じて、計48時間の期間にわたって、位相差を用いる倒立Leica(UK)DMIRB顕微鏡を通して、細胞を観察した。24時間の温置後に細胞遊走を定量するために、各ゲル内に包埋された各細胞小滴の領域全体を示す低倍率画像を使用した。ここで、24時間の温置後の同じ小滴の画像上に0時間の時点での各細胞小滴の画像を重ね合わせるために、MicrosoftPaintShopPro6を使用した。図4に示されているように、次いで、LeicaQUIPSソフトウェアを用いて、これらの複合画像を分析した。最初に、0時間での、各細胞小滴を取り囲む周囲の距離を計算した。この後、24時間の期間にわたって、元の細胞小滴周囲を横切り、元の細胞小滴周囲から離れるように遊走した細胞の数を計数した。変動する小滴周囲距離を補正するために、遊走する細胞の数は、元の細胞小滴境界のmm周囲長当りの細胞として表された。各細胞が周囲から離れるように遊走した直線距離も測定した。
【0049】
48時間の温置後、4%パラホルムアルデヒド(TAAB,Aldermaston,UK)中に、20分間、完全な状態のゲルを固定した後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma(R))を含有するPBSで3回洗浄した。次いで、20mMN−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸);4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、300mMスクロース、50mMNaCl、3mMMgCl2及び0.5%TritonX−100(全てSigma(R)から)を含有する氷冷した透過溶液(pH7.4)を添加し、10分間放置した。再度、1%BSAでゲルを洗浄した。(エタノール中の)0.08%FITC−ファロイジン(Sigma(R))溶液を1%BSAで1:100希釈し、次いで、ゲルに添加した。30分後、先述のように、ゲルを洗浄した。10μg/mLヨウ化プロピジウム(PI)(Sigma(R))を含有するBSA(1%)を添加し、ゲルを再度洗浄する前に、1分間放置した。
【0050】
FITC−ファロイジン/PI染色後、過剰な液体を除去するために、ゲルを慎重に吸収転移させ、Bio−Rad蛍光搭載培地及びカバーガラスを載せた。LeicaDMRBE直立蛍光顕微鏡を内蔵した共焦点LeicaTCS4Dシステムを用いてゲルを可視化した。遊走している細胞の形態を観察するために、細胞小滴の縁の最大強度画像を撮影した。ゲルの光学的断面のZシリーズも撮影し、組み立て直後に固定及び染色された別のアッセイの撮影された光学的断面(0時間温置)と比較した。これは、小滴から全ての方向に細胞遊走が起こったことを示すために行われた。
【0051】
統計解析
各処理内において各細胞小滴反復のmm周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、GraphPadPrismTMソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析(ANOVA)及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。GraphPadPrismTMソフトウェア内で使用できる一元配置のANOVA及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をP<0.05と定義した。
【0052】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化I
別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、3×105細胞/mLのより低い細胞密度を含有する1つの20μL小滴を各アッセイ中に組み込んだ。1μg/mLES、5μg/mLES又はPBSブランク(対照)の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、0、24及び48時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。
【0053】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後(0時間)又は48時間の温置後(48時間)に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、0時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、48時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認した(HorobinAJPhDthesis,2004)。
【0054】
幼虫のESに応答する細胞の遊走を定量する上で、2つの別個の実験を行った。一方の実験は、ESが存在しない対照に対して0.1μg/mLES及び5μg/mLESの効果を比較した。他方の実験は、別の対照と比較した場合の1μg/mLES及び10μg/mLESの効果を調べた。各実験において、同じフラスコ及び継代からの細胞を使用した。
【0055】
各小滴からの細胞遊走を調べるために画像を撮影した。24時間の温置で、5μg/mLのESの存在下での細胞の遊走が最も大規模であるように見受けられることが視覚的観察によって明らかとなった(図5a)。形態的には、これらの細胞は、対照内の細胞より十分に広がっているようにも見受けられ、周囲のゲル中に、より長く、より多数の伸長突起を突出させていた(図6a)。48時間の温置までに、5μg/mLESに曝露されたゲルは半透明であり、皿の表面から剥離された状態となった。細胞小滴は収縮し、マトリックスを内側に引っ張り、小滴間のマトリックス内の張力を増加させた。この時点までに、1μg/mLESに曝露された細胞は、それぞれの対照よりさらに遊走するように見受けられ(図5b)、周囲のゲル中に長い伸長突起を有する十分に広がった形態も採っていた(図6b)。これに対して、10μg/mLESの存在下の細胞小滴はサイズが低下し、細胞の幾つかの領域は緊密な暗い塊へ収縮していた(図5b)。これは、予めゲル化された溶液の、この時点で、透明な粘性のある液体状態と関連していた可能性がある。対照と比較すると、10μg/mLESに曝露された細胞の形態は明確に異なっていた。ここでは、24時間の温置において、細胞は多数の細い伸長突起を呈し、それらの幾つかは極めて長かった(図6c)。48時間の温置では、細胞は収縮して、丸くなるが、長く、細い細胞間伸長突起の突出を通じた他の細胞との直接的な物理的接触を維持していた(図6d)。
【0056】
各小滴の全体を見ることができる低倍率画像を用いて、各小滴からの細胞遊走の合計を定量した。24時間の温置で、適切な対照と比べて、遊走している細胞の数(P<0.01)(図7)及び移動した距離(P<0.001)(図8)の両方の観点で、5μg/mLESは細胞の遊走を有意に増強したことが分析によって確認された。1μg/mLのESも、その対照を上回って、細胞遊走を有意に増強した(細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.05)(図7、8)。これに対して、10μg/mLのESは、その対照と比べて、細胞遊走を有意に阻害した(細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.001)(図7、8)。0.1μg/mLESへの曝露は、遊走する細胞の数を僅かに阻害するように見受けられた(対照に対してP<0.05)(図7)。しかしながら、0.1μg/mLESは、対照と比べて、遊走距離に対して有意な影響を有さず(P>0.05)(図8)、細胞の形態にも影響を与えないように見受けられた(データは示さず)。実験1の対照(図7a)中で遊走する細胞の数は実験2の対照(図7b)中より高いことにも注目し得る。実験間のこのような差は、血球計測器を用いて細胞数を推定する場合に避けることができない誤差水準によってもたらされる細胞小滴内の細胞密度の僅かな差によるものであり得る。しかしながら、このような潜在的な変動源は実験間に存在するに過ぎず、(各実験内の各アッセイを組み立てるために、多数の細胞の計数に同じものが使用されたので)実験内には存在しない。従って、各実験内で結果を比較することはなお妥当であるが、実験間で結果を比較することは妥当でない。
【0057】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化II
繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ESの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた(図9)。しかしながら、24時間の温置までに、1μg/mLES、特に5μg/mLESの存在下の細胞は、ESの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。5μg/mLのESが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。48時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ESの不存在下では、細胞はより丸い状態となった(図9)。一方、1μg/mLのES又は5μg/mLのESに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。5μg/mLのESに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。
【0058】
(比較例1)
本発明者らは、ESキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するESの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ES、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大48時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたATPの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸(ATP)アッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するES及びトリプシンの効果を比較すると、ESは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、24時間の温置後、5μg/mLのESは、対照の16.6%まで細胞接着を低下させた(図10a)。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対するESの活性の103.2%を示した市販のトリプシン(1.6μg/mL)は、対照の34.9%まで細胞接着を低下させた。48時間の温置後、5μg/mLESの存在下での細胞接着は対照の9.3%まで減少したのに対して、1.6μg/mLの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の24.7%まで低下させた。
【0059】
キモトリプシン特異的な蛍光発生基質(Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC)に対する5μg/mLのESの活性の94.1%を示した市販のキモトリプシン(0.1μg/mL)は、繊維芽細胞の接着を修飾する能力を示さなかった(図10b)。キモトリプシン特異的な基質に対する5μg/mLのESの活性の204.9%を示す0.2μg/mLの市販のキモトリプシンでさえ、繊維芽細胞接着に対して効果を有していなかった。市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの両方に曝露された繊維芽細胞は、市販のトリプシンのみの同様の濃度に曝露された細胞を上回る接着の修飾を同時に一切示さなかった。
【0060】
これらの結果は、繊維芽細胞接着を修飾する上で、ES内に存在するキモトリプシンなどの酵素が市販のトリプシン若しくは市販のキモトリプシン単独又は組み合わせより有効であることを示している。ESが繊維芽細胞の接着を修飾する能力が、タンパク質分解を介して、フィブロネクチンで被覆された表面を修飾するその能力と関連していることが以前の研究によって示されている(Horobin et al2003、上記)。従って、これらの結果は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する上で、ESは、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンより有効であり得ることを示唆している。これは、ゲル電気泳動を用いて確認される。ここでは、トリプシン特異的又はキモトリプシン特異的な基質に対して類似の活性を有する溶液を得るために、幼虫のES、市販のトリプシン、市販のキモトリプシン又は市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの組み合わせの試料を希釈した。次いで、12%ポリアクリルアミドゲル上で分離する前に、24時間、ウシフィブロネクチン(100μg/mL)を、37℃で、これらの溶液に曝露した。図示されているように、ESは、市販の両酵素と比較した場合に、フィブロネクチンを主により小さな断片へより大規模に分解した(図11)。さらに、ES内に存在するタンパク質分解性酵素は繊維芽細胞の遊走を強化することが示された(Horobin et al2005上記)。これは、繊維芽細胞の接着の変化と関連し得る。創傷の中で、繊維外細胞の遊走の加速は、創傷空間中への肉芽組織増殖を促進し得る。このように、ES由来の酵素は、現在市販されている酵素より有効な創傷郭清因子であることが明らかとなり得るのみならず、創傷治癒応答も同時に増強し得る。
【0061】
(実施例2)
創傷郭清
ウジのキモトリプシンの精製
L.セリカータES産物のSephacrylS300クロマトグラフィー。
【0062】
ガラスクロマトグラフィーカラム(1.5cm×50cm)にSephacrylS−300HRを充填し、PBSで平衡化した(流速0.33mL/分)。幅広い範囲のゲルろ過標準物質(200−12.5kDa,Sigma)を用いて、カラムを較正し、空隙容量を求めた。L.セリカータのES産物約2mL(0.5mg)をカラムにかけ、空隙容量50画分の溶出後(2mL/画分)を集め、それぞれ、蛍光性基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC及びトリス−Gly−Pro−Arg−AMCを用いて、キモトリプシン及びトリプシン活性に関してアッセイを行った。S300ゲルろ過後のキモトリプシン/トリプシン活性を示す図14及び15を参照されたい。典型的には、トリプシンが濃縮された2つのピーク(T1及びT2と名付けられた。)及びキモトリプシン活性が濃縮された1つのピーク(C1と名付けられた。)というタンパク質分解活性の3つのピークが観察された。図15は、ゼラチンSDS−PAGE基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性も示す。
【0063】
蛍光性合成ペプチド基質を用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイ
7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC(キモトリプシン)及びトシル−Gly−Pro−Arg−AMC(トリプシン)からの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン/トリプシン活性を評価した。PBS中に希釈された基質150μL(5μM)とともに各画分50μLを温置した。37℃で30分間、試料を温置し、その後、DynexMFXマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した(励起365nm、発光検出465nm)。ゼロ時点の読み取りの推測後、30分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。
【0064】
ゼラチン基質SDS−PAGEを用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイ
Kumar&Pritchard(1992)によって記載された方法を用いて、基質SDS−PAGEを実施した。分離ゲル中に0.1%(w/v)ゼラチンを含めて、12%(w/v)SDS−PAGEゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを55℃まで加温した。各画分10μLを非還元試料緩衝液(0.5MTris、pH6.8、5%SDS(w/v)、20%グリセロール(w/v)、0.01 %ブロモフェノールブルー)の等容量と混合し、37℃で30分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、20mAの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、Lacks&Springhorn(1980)によって記載されたように酵素を再生するために、室温で20分間、2.5%TritonX−100中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で20分間、ゲルを洗浄し、最後に、PBS中において、37℃で一晩温置した。Coomassie brilliant blueR250でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。
【0065】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるキモトリプシンの精製
キモトリプシン活性のC1プールの塩濃度を0.5MNaClに調整し、PBS、0.5MNaClで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム3mL(流速0.2mL/分)にかけた。カラムを通過する緩衝液の280nmでの吸光度がゼロになるまで、PBS、0.5MNaClでカラムを洗浄した。0.7%エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、1mL画分を集め、2MTris−Cl(1:1v/v)で直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図16)。蛍光性基質及びゼラチンSDS−PAGEを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした(図17)。
【0066】
図17は、C1プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はキモトリプシンの基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−Arg−AMCを切断し、PMSFによってのみ阻害され得ることが示された。トリプシンの基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS−PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも3つの異なる領域が観察された(矢印が付されている。)。
【0067】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトリプシンの精製
同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のT2プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図19)。
【0068】
図19は、T2プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はトリプシンの基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCを切断し、PMSF及びAPMSFによって阻害され得ることが示された。キモトリプシンの基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−Arg−AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS−PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも1つの明瞭な領域が観察された(矢印が付されている。)。
【0069】
創傷痂皮に対するES産物の効果
L.セリカータES産物10μgとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、Biorad等電点電気泳動再水和緩衝液(8M尿素、2%CHAPS、50mMDTT、0.2%Ampholytes)中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Biorad2Dタンパク質「クリーンアップ」キットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。
【0070】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するES産物の効果を調べた。製造業者によって記載された条件下で、「ReadyStrip」7cmIPG片pH3から10(Biorad)を用いて、タンパク質約100μgを一次元に集中させた。10%トリセンゲルを用いて、二次元SDS−PAGEを実施した(Schagger and Vonjagow,1987)。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図20。
【0071】
創傷痂皮に対するキモトリプシン/トリプシンプールの効果
L.セリカータC1、T1又はT2プール100μLとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。
【0072】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するC1、T1又はT2プールの効果を調べた。上記のように、タンパク質約100μgを二次元に集中させた。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図21。
【0073】
L.セリカータのキモトリプシン遺伝子をクローニングする
NcoI制限部位(5’−CTGCCATGGTCATGAAATTCTTAATAGTT−3’)を付加するフォワードプライマー及びNheI部位(5’−GACGCTAGCATAAGAAATTCCGGTGTG−3’)を付加するリバースプライマーを使用するPCRによって、cDNAライブラリーからL.セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域(ORF)を増幅した。生じた断片をpBac−3中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し(図12)、アミノ酸配列を予想した(図13)。
【0074】
従って、ルシリア・セリカータのESが本明細書に示されているアミノ酸及びDNA配列を有するキモトリプシン酵素を含有し、この酵素は創傷を郭清するとともに、繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、及び繊維芽細胞の形態の修飾によって創傷の治癒を促進すると結論付けることができる。
【技術分野】
【0001】
本発明は、幼虫の酵素に関する。より具体的には、本発明は、ルシリア・セリカータ(Lucilia sericata)から取得することができる1つ又はそれ以上の幼虫の酵素に関し、該酵素は組織再生及び創傷治癒において有用である。
【背景技術】
【0002】
幾つかの創傷の幼虫の繁殖の有益な効果が長年にわたって観察されてきた。しかしながら、感染の抗生物質耐性株の蔓延が、医学、特に創傷治癒の分野において問題となるまで、このプロセスに関与する機序についてのさらなる調査は実施されなかった。
【0003】
以前の研究は、旧来の抗生物質への添加物又は補助剤としての、創傷郭清(創傷から壊死性物質、被感染物質又は外来物質を除去すること)、感染管理(感染の予防又は治療)における幼虫の酵素の役割、より最近では、創傷中の新しい組織を増殖させ、創傷を閉じさせる(治癒)ための組織の再生の促進における幼虫の役割を観察してきた。使用される幼虫の酵素は、予め幼虫を洗浄して又は洗浄せずに、完全な幼虫の血リンパから又はホモジネートから、幼虫の表面上に見出されるあらゆる排出産物又は分泌産物を除去するために、幼虫を洗浄することによって取得し得る。以前の研究は、無菌又は非無菌条件で幼虫を育てることの効果、幼虫のホモジネート、血リンパ又は排泄/分泌を使用することの効果及び幼虫の年齢(新たに孵化した、又は第一若しくは第二齢)の効果についても調査した。これらの要因の全ては、幼虫から得られた産物の性質又は活性に影響を与えることが見出されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Abbott A:Biology’s new dimension.Nature 424:870−872,2003
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【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、最近、組織増殖を促進することによって創傷の閉鎖を促進する幼虫の産物の成分である幼虫の産物、特に酵素の創傷治癒特性に焦点を当ててきた。驚くべきことに、本発明者らは、ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物(表面洗浄)中に見出される1つ又はそれ以上のキモトリプシン酵素が組織形成において重大な役割を果たしていることを見出した。このような酵素は、通常、組織の破壊に関連している。
【0006】
従って、本発明は、昆虫の幼虫由来の単離されたキモトリプシン又はその類縁体若しくは合成様式を提供する。
【0007】
有利なことに、本発明のキモトリプシンは、プロテアーゼの予想される特性であり得る創傷郭清(壊死性物質、被感染物質又は外来物質の除去)において有用であるのみならず、繊維芽細胞の接着(すなわち、組織増殖)を促進する上でも有用である(これは、プロテアーゼ酵素に関しては、全く予想されない特性である。)という点で、相反する二重の特性を発揮することが示された。本発明のキモトリプシンは選択的な活性を有する。本発明のキモトリプシンは、創傷痂皮などの幾つかの組織を除去又は分解するが、健康な組織又は新たな組織など、全ての組織を除去又は分解するわけではない。このプロテアーゼ又は各プロテアーゼが、壊死性組織と健康な組織が分解されるルシリア・キュプリナによって引き起こされるハエ幼虫症で起こるような、種類に関わらずに組織を分解又は除去することが合理的に予想され得る。同じ酵素における創傷郭清と細胞増殖の促進という二重の特性は一般的でなく、これらの特性は相反することが予想されるので、当業者にとって驚くべきものである。
【0008】
本明細書において使用される「痂皮」という用語は、やけど、壊疽、潰瘍(特に、褥瘡)、感染(特に、真菌感染)、炭そ菌又は他の何れかの壊死性組織への後期曝露後のものなど、皮膚の表面から排出されたあらゆる死亡した組織を定義するものとする。
【0009】
昆虫は、好ましくは、クロバエ類であるルシリア・セリカータである。
【0010】
本発明のキモトリプシンは、好ましくは、昆虫の幼虫の排泄物/分泌物から取得され、又は取得可能である。しかしながら、同じ成分が血リンパ中に又はホモジネート中に存在し得、これらの採取源から取得できる可能性がある。キモトリプシンは、例えば、幼虫を洗浄し、洗浄媒体を集めることによって取得され得る。本発明者らは、昆虫の幼虫の排泄物/分泌物(ES)が、酵素、ホルモンなどを含む恒常的に発現される成分と誘導性成分の両方を含むことを以前に見出した。この理由のために、幼虫の増殖条件は一定に保たれることが好ましい。本発明の最も好ましい実施形態において、無菌条件中で増殖された新たに孵化した幼虫から排泄物/分泌物が収集され、使用される。
【0011】
キモトリプシンは、図1、図2若しくは図13中に示されている配列又は天然の若しくは完全なキモトリプシンの活性を保持する生物学的に活性なこれらのペプチド断片を有することが好ましく、図1、2及び13中には、活性部位が特定されている。好ましくは、断片は図1、2及び13に特定されている活性部位に対して、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするDNAと高い相同性を有し、例えば、活性部位に対する相同性は少なくとも90%、好ましくは95%超、より好ましくは99%の相同性であるべきである。理想的には、断片は、ペプチドの活性部位と同一性を有するべきであり、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするDNAと同一性を有するべきである。関連するDNA配列が、図1、2及び12に示されている。
【0012】
これらの配列のキモトリプシンは、組織再生特性及び創傷郭清活性を有するが、健康な組織又は生きた組織を分解又は消化せず、これは、ルシリア・キュプリナに由来するキモトリプシン(健康な組織又は生きた組織に対してさえ周知の組織分解特性を有する、ハエ幼虫症(組織変性性のプロセス)の原因因子)に対するその高い相同性に鑑みれば特に驚くべきである。この相同性は、図1及び2にも示されている。
【0013】
本発明者らは、トリプシン様及びキモトリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するセリンプロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)とともに温置した後に、ESの組織再構築及び再生特性が喪失又は阻害されるが、トリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するに過ぎない4−(アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリド(APMSF)との温置後には喪失/阻害されないことを見出した。
【0014】
従って、細胞外マトリックスの再構築又は組織再構築及び組織再生活性に必要なESの重要な成分又は不可欠でさえある成分はキモトリプシン又はキモトリプシン様酵素であると結論付けられた。これは、以下に記載されているように、二重特性を有するキモトリプシンの配列が同定された配列決定によって確認された。実施例が示すように、このキモトリプシンが除去されると、ESの組織再生特性は失われ、このキモトリプシンは創傷の痂皮を郭清するので、同じキモトリプシン酵素が組織再生及び創傷郭清という二重活性を有する。
【0015】
本発明のキモトリプシンは、創傷郭清又は創傷郭清の改善によるのみならず、繊維芽細胞の遊走、マトリックス再構築及び繊維芽細胞形態の修飾を促進することによっても、創傷の治癒を促進するために創傷の治療において使用することができる。特に、壊死性組織と生きた組織の両方を破壊する疾病であるハエ幼虫症を引き起こすルシリア・セリカータ由来のキモトリプシンに対する高い相同性に鑑みれば、これらの反対の効果(タンパク質分解及びタンパク質生成)が同じ酵素中に存在するという事実は当業者にとって驚くべきことであり、従来技術からは予測することができない。
【0016】
従って、本発明は、創傷を治癒するための組成物におけるキモトリプシンの使用を提供する。
【0017】
本発明は、創傷の治癒のための医薬の調製におけるキモトリプシンの使用及びキモトリプシンを用いて創傷を治療する方法も提供する。好ましくは、組成物又は医薬中で使用されるキモトリプシンは、図1、図2若しくは図13の配列を有し、図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる。
【0018】
あるいは、キモトリプシンの活性断片をこのような組成物又は医薬中に使用し得る。キモトリプシン又はその断片は、天然又は合成であり得る。キモトリプシン又はその断片は、ルシリア・セリカータの幼虫から好ましく取得される。本発明の創傷は以下に定義されており、感染していてもよく、又は感染していなくてもよい。好ましくは、創傷は慢性的な創傷であり、旧来の治療に対して抵抗性であり得る。
【0019】
創傷は繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、又は繊維芽細胞の形態の修飾によって治療され得る。好ましくは、創傷は、本発明のキモトリプシンによって創傷郭清される。
【0020】
さらなる態様において、本発明は、創傷に対する包帯も提供し、該包帯は本発明の一部を形成するものとして記載されているキモトリプシンを含有する。従って、本発明は、治療を必要としている創傷に上記包帯を適用する工程を含む、創傷を治療する方法も包含する。
【0021】
本発明者らは、大豆のトリプシン阻害剤(STI)とともにESを温置することによって、繊維芽細胞の遊走を増強するESの能力及び細胞外マトリックスタンパク質を分解するESの能力が除去されることを見出した。同様に、キモトリプシン活性が除去されると、タンパク質分解(創傷郭清)活性は変化したが、以下に示されているように、いくらかのトリプシン活性は残存していた。STIによって除去されたタンパク質の配列を決定した。配列は図1、2及び13に示されているキモトリプシン又はキモトリプシン様配列であることが見出され、この酵素及びその相同体が本明細書に記載されている活性のために必要であることを確認する。
【0022】
従って、本発明は、図1、図2又は図13中に示されている配列を有するキモトリプシンも提供する。本発明は、図1、2及び13に示されているキモトリプシンをコードするDNA配列並びにpBac−3ベクター多重クローニング部位DNA配列中のL.セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すDNA配列(図12)も提供する。キモトリプシンの活性部位をコードするDNAの断片(図13参照)も、本発明の一部を構成する。
【0023】
本明細書において使用される「創傷」という用語は、傷害によるか又は疾病によるかを問わず、皮膚、表皮又は結合組織に対するあらゆる損傷を定義することが意図され、従って、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど(熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。)、皮膚の擦過又は暴行(assault)、骨髄炎並びに整形外科的創傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。創傷は、感染された状態であり得る。さらに、創傷は、慢性又は急性であり得る。慢性的な創傷は、様々な症状に起因し、糖尿病性の足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、感染性手術創、整形外科的創傷、骨髄炎及び褥瘡が含まれる。
【0024】
本発明のキモトリプシンは天然であり得、又は図13に示されているものなど、天然の酵素の合成様式であり得る。酵素の合成様式は、例えば、組み換えベクター発現系を用いて、又は以下の実施例中に示されているように何れかの公知のペプチド合成法又は装置の使用によって、慣用の様式で、与えられた配列から作製され得る。酵素の活性な断片(すなわち、酵素の機能を維持する酵素の断片、特に、図13に特定されている活性部位を含む断片)も、これらをコードするDNA断片と同様に、本発明の一部であると考えられる。
【0025】
本発明のキモトリプシンは、未精製であり得若しくは精製され得る抽出物として使用され得、又は溶媒、希釈剤、緩衝剤、ビヒクル、安定化剤、保湿剤、賦形剤、結合剤、補助剤、防腐剤、抗ケーキ剤、酸性化剤、ゲル化剤、乳化剤、着色剤、香料などの、特に局所製剤中で使用されるものなど、慣用の添加物を含む医薬組成物中へ取り込まれ得る。好ましい実施形態において、キモトリプシンは局所的に適用されるが、本発明の範囲から投与の経口様式又は他の非経口様式が除外されることを意図するものではない。従って、投与の好ましい様式、局所投与において、本発明のキモトリプシンは、洗浄溶液、懸濁液、洗浄液、クリーム、ローション、ゲル、軟膏(unguent)、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、粉末又は固体又は流体送達ビヒクル中に存在し得る。あるいは、キモトリプシンは、徐放様式で、又は調節された放出様式で、キモトリプシンを創傷中に送達することができる適切な材料中に取り込まれ、又は封入され得る。このような適切な材料の例は、調節された放出様式でペプチドを放出するように調合され得るポリ(ラクチド−コグリコリド)又はPLGA粒子である。最も好ましくは、キモトリプシンは、創傷に適用されるべき包帯中に取り込まれ得る。このような包帯の例には、キモトリプシンを含有する徐放性親水コロイド粒子を取り込んだ段階化された又は層状化された包帯又は旧来の包帯によって場合によって重層されたキモトリプシンを含有するスポンジが含まれる。例えば、Smithら2006に記載されているものを参照されたい。現在使用されているこの種の親水コロイド包帯、例えば、「Granuflex」の商品名で販売されているものは、キモトリプシンを創傷中に放出するように改変され得る。
【0026】
本発明のキモトリプシンは未精製であり得、又は慣用のタンパク質精製法を用いて精製され得る。キモトリプシンは、例えば、COOHでのアミド化、非コード異常アミノ酸を用いた置換及び/又は同配体(isotere)によるCO−NHアミド結合の置換によって、アミノペプチダーゼ又はその他の酵素活性に対して保護され得る。さらに、キモトリプシン、特に合成されたキモトリプシン又はその他の新生キモトリプシンは、特に、ヒドロキシル化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化され得、又は、特に二次若しくは三次プロセシングが酵素に安定性を与え、若しくは酵素に改善された溶解度若しくは他の望ましい特性を与える場合には、その他二次若しくは三次プロセッシングを受け得る。二次又は三次プロセシングを施すことが酵素の活性を低減しなければ、酵素の合成様式は、天然酵素の立体構造に近い立体構造に到達させるために、二次又は三次プロセシングを施されることが特に好ましい。
【0027】
さらに、本発明者らは、細胞を維持するために、組織培養又は組織マトリックスモデル化において、昆虫の幼虫、特にルシリア・セリカータの排泄/分泌産物を使用できることを見出した。すなわち、ルシリア・セリカータの排泄/分泌産物は、細胞の生存性を維持するために、ウシ血清などの血清の代わりに使用することができる。これは、血清を使用する必要性をなくすことによって、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)に関連するプリオンなどの潜在的感染源又は潜在的な疾病転移源を除去するので、このような細胞が創傷上に又は創傷中に移植され又は植えつけられるべき場合に、これは特に重要である。
【0028】
従って、本発明は、昆虫の幼虫の排泄/分泌産物を含む、生きた細胞の維持において使用するための培地も提供する。好ましくは、幼虫はルシリア・セリカータの幼虫である。
【0029】
典型的には、ルシリア・セリカータの幼虫又はクロバエ類のウジは、旧来の治療が奏効しない慢性的な創傷に適用される。臨床的な観察は、ウジが壊死性組織を除去し(創傷郭清)、消毒を促進し、肉芽組織の形成を加速するという証拠を提供する(Sherman et al,2000;Wollina et al,2002)。これらの効果の背後に存在する機序を解明するために、本発明者らは、ウジの分泌物及び/又は排泄物(ES)(ウジが継続的に滲出する物質は分泌及び/又は排泄物を起源とし得るので、このように称される。)内に存在する別の研究が示した酵素活性が創傷中に放出されることを調べた(Schmidtchen et al,2003)。セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ及びアスパルチルプロテイナーゼ活性の証拠が見出された(Chambers et al,2003)。さらに、ES内に存在するセリンプロテイナーゼ活性は、様々な一般的な細胞外マトリックス(ECM)成分を分解することが示された(Chambers et al,2003)。
【0030】
本発明者らは、ウジのESが組織形成において重大な役割を果たすので(Eckes et al,2000)、ヒト皮膚の繊維芽細胞及び細胞外マトリックス(ECM)成分間の相互作用に対するウジのESの効果も調べた。細胞膜受容体(Giancotti and Ruoslahti,1999)との結合を通じて、細胞外マトリックスは接触を誘導するための足場を提供し、繊維芽細胞の接着を調節し、細胞の遊走を誘導する(Clark,1996;Greiling and Clark,1997)。繊維芽細胞を含む多くの源から得られるプロテアーゼは、このような相互作用を調節する。これは、繊維芽細胞の増殖(Abe et al,2000;Dery and Bunnett,1999)及び血管新生(Blair et al,1997)に影響を与える細胞表面受容体の直接的な活性化を介するものであり得、又は細胞外マトリックス成分(最も顕著なものは、フィブロネクチン)のタンパク分解性分解産物が繊維芽細胞の遊走及び走化性(Greiling and Clark,1997;Livant et al,2000)、再上皮化(Gianelli et al,1997)及び組織再構築(Gould et al,1997;Werb et al,1980)を誘導する間接的な方法によるものであり得る。本発明者らの結果は、ESの存在下で、フィブロネクチン及びコラーゲンに被覆された表面への繊維芽細胞の接着が低下することを示した(Horobin et al,2003)。より最近になって、二次元インビトロアッセイを用いて、本発明者らは、ES内に存在するセリンプロテイナーゼによって、フィブロネクチンを横切る繊維芽細胞の遊走が加速されることを示した(Horobin et al,2005)。すなわち、本発明者らは、平面を横切る強化された繊維芽細胞の遊走とこのような酵素活性を関連付けた。しかしながら、記載されているものなどの証拠は、二次元内において、細胞は、細胞の一般的な三次元インビボ環境内とは異なる挙動を示すことを示唆する(Abbott,2003;Cukierman et al,2001;Friedl and Brocker,2000)。例えば、平面上で、細胞は平坦な層状の外観を呈する。これに対して、原位置で観察される細胞は星状の形状を採り、伸長突起の樹状ネットワークを突出する。細胞は三次元マトリックス接着と名付けられた、周囲のマトリックスへの異なる付着も示す(Cukierman et al,2001)。平面上の前進する細胞体に対する抵抗が欠如しているので、二次元では、表面を横切る遊走は、主に、接着及び脱接着現象の関数である。しかしながら、三次元内では、マトリックス障壁は細胞がそれらの形態を採るように強制し、運動を促進するために、細胞に形状を変化させ、及び/又は細胞外マトリックス成分を酵素的に分解させる。従って、本発明者らは、ESに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイを開発した。
【0031】
従って、本発明者らは、ESに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイの推進を目指して研究を行った。細胞がインビボで存在する微小環境により近いこのようなモデルの確立は、創傷治癒プロセス中での細胞外マトリックス、常在性細胞及びES間の相互作用の重要性のよりよい理解を与える。このようなモデルの確立は、治癒を促進するために、支持性の、水和された、生物分解性の及び生物活性な組織様マトリックス内に保たれた生きた皮膚及び上皮細胞が開放創へ送達されるシステムを開発するための基礎も与える。(何れも、遊走に最適と考えられる濃度の)コラーゲン及びフィブロネクチンから構成されるゲル内に包埋された初代ヒト包皮繊維芽細胞(HFF)の単離された集団を含有するアッセイが開発された(Greiling and Clark,1997;Friedl and Brocker,2000)。コラーゲンゲルはインビボ様の細胞培養に対して広く使用されており、表皮の生物物理学的構造を正しく再生したものであると考えられている(Friedl and Brocker,2000)。さらに、コラーゲンゲル内に包埋された細胞は、原位置様形態と幾分の類似性を共有する伸長突起の樹状ネットワークを採ることが示されている(Cukierman et al,2001)。フィブロネクチンは創傷空間中に細胞遊走を誘導する上で主要な役割を果たしているので、フィブロネクチンが含められた(Greiling and Clark,1997)。結果は、用量依存的な様式で、ESがゲルを通じた繊維芽細胞の遊走を加速することを示した。これは、マトリックス再構築の強化及びより十分に広がった細胞形態の誘導によって促進された可能性がある。以下の実施例中に示されているように、適切な対照と比較して、1及び5μg/mLのES濃度は遊走している細胞の数及びそれらが細胞小滴から移動した距離をともに著しく増加させた。ESのこれらの濃度は十分に広がった細胞形態も誘導し、低い集団密度で、5μg/mLのESは細胞間のマトリックス原繊維の並列を促進した。これに対して、10μg/mLのES(検査された最高濃度)は細胞の遊走を阻害したが、細胞の形態を変化させた。0.1μg/mLの濃度のESは、調べた温置期間にわたって、ほとんど効果を示さなかった。
【0032】
これらの観察から、ESはマトリックスの再構成及び細胞の牽引力の発揮を促進したと結論付け得る。遊走アッセイの中で、牽引が生じたことは、5μg/mLのESを含有するゲルの剥離後における及び10μg/mLのESに曝露されたゲルの液状化の間における細胞小滴サイズの収縮によって表される。より低い播種密度で細胞が観察される場合には、牽引力の存在は、反対方向の牽引力の発揮によって、おそらくこのようにして組織化された、細胞間で緊張した状態に保たれた真っ直ぐな整列されたマトリックス原繊維の出現によって示される。牽引力の存在は、十分に広がった細胞形態によっても示される。Harris及び共同研究者(1981)は、「・・・繊維芽細胞が細胞周囲のコラーゲンを圧縮及び伸展するにつれて、細胞は短縮されずに伸長するので」、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞では、繊維芽細胞の牽引は、「筋肉の収縮のような単純な収縮とは異なる」ことを観察した。
【0033】
ESが繊維芽細胞によるマトリックス再構築を強化したこと、及びこのようにすることによって、遊走の促進を実施することは、おそらく、Bellowsら(1981)によって提案されたゲル圧縮のモデルによって明らかにされる。異なる細胞種がコラーゲンゲルを収縮し、組織化する能力を比較する際に、これらの研究者は、表1に示されているように、ゲル圧縮の一連の連続する段階を同定した。本発明者らの観察から、ESが、細胞付着及び広がりを促進し、並びにマトリックス(コラーゲンである可能性が最も高い)繊維の整列を促進するというゲル圧縮の最初の3つの段階を開始させることが明らかである。このようにすることにより、細胞遊走の第四段階に到達した。マトリックス再構築と細胞遊走間の関連は、コラーゲンゲル内に包埋された細胞の集団間でのコラーゲン「ストラップ」(整列されたコラーゲン原繊維のパターン)形成が細胞の前進を引き起こし、細胞遊走を隣接する細胞集団の方向に誘導する(接触誘導)ことを見出したSawhney及びHoward(2002)の研究によってさらに強化される。
【0034】
【表1】
【0035】
これらの比較から、ESの存在下にある細胞は、他の研究者によって、コラーゲンゲル内に包埋された細胞について観察されたものと類似の形態特性及びマトリックスの再構成を示した。他の研究はウジ由来の産物を含んでいなかったので、ESが存在しない本発明者らの対照中の細胞に対してこのような挙動が観察されなかった理由が問われなければならない。比較研究は血清を含有するアッセイを含んでいたのに対して、ここでは、血清が除外されたので、答えは血清と関連している可能性がある。血清による細胞−マトリックス相互作用の促進に対する証拠は、係留された繊維芽細胞が集合したコラーゲンゲルの放出の直前に血清を除去することが、常在性細胞によるその後のゲル収縮の程度を阻害することを見出したTomasekら(1992)によって与えられている。一旦ゲルが放出された後にゲルに血清を添加することによって、直ちに収縮が引き起こされた。他の研究者らも、マトリックスの再構成に関して、血清への依存を観察している(Steinberg et al,1980;Guidry and Grinnell,1985)。血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子β(TGFβ)及び生物活性脂質媒介物質リゾホスファチジン酸(LPA)が血清中に見出されており、全て、マトリックス再構成の刺激に関与していると推定されている(Montesano and Orci,1988;Grinnell et al,1999;Roy et al,1999;Toews et al,2002;Kondo et al,2004)。
【0036】
従って、ウジのESが血清中にも見出される活性成分を含有している可能性がある。別の可能性は、本発明者らが以前に繊維芽細胞の遊走を加速することを示したES内に存在するセリンプロテイナーゼ(Horobin et al,2005)は、膜結合型プロテアーゼ活性化受容体(PAR)の切断を通じて寄与し得ることである。Gタンパク質共役型受容体のこのファミリーは、トロンビン及びトリプシン様酵素などのセリンプロテイナーゼによるそれらの酵素的切断後に活性化される。このような作用は、受容体上のN末端係留されたリガンドを露出させ、次いで、露出されたリガンドは切断された受容体を結合し、活性化させる。活性化されたPARは、細胞の形状、分泌、インテグリン活性化、代謝性応答、転写応答及び細胞の移動性に影響を与えるシグナル伝達カスケードに共役している(Cottrell et al,2002)。以前の研究は、PARのプロテイナーゼ活性化を通じて、トロンビンがコラーゲンゲル中の胎児性ニワトリ繊維芽細胞内の等尺性張力の発生を促進することを示している(Kolodney and Wysolmerski,1992;Pilcher et al,1994;Chang et al,2001)。ES内に存在するセリンプロテイナーゼは、トロンビンとプラスミン基質であるトシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対して活性を示し(Chambers et al,2003)、これは、ESがトロンビンと同様の効果を繊維芽細胞に対して発揮し得ることを意味することに注目するのが興味深い。プラスミンは細胞によって分泌される様々なマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)のチモーゲン前駆体を活性化させ、従って、局所化されたマトリックス再構成に寄与する(Mignatti et al,1996)ことが示されているので、何らかのプラスミン様活性が関連している可能性もあり得る。
【0037】
ウジのESは、ウロキナーゼ様活性に対して不安定なペプチドに対して活性を有することも示されている。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)の別称でも知られるセリンプロテイナーゼであるウロキナーゼは、その活性形態であるプラスミンへとプラスミノーゲンを転化させる。ウロキナーゼはプラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)とも結合し、この研究は繊維芽細胞によって発現されることを示した(Mignatti et al,1996;Ellis et al,1993;Behrendt et al,1993)。一旦結合されると、uPARは局所的な接着部位に局在化し、インテグリンによって媒介される機能を調節し(Wang et al,1995;Chapman and Wei,2001;Porter and Hogg,1998)、従って、より誘導性が高い細胞表現型を誘導するための機序を与える。実際に、uPARは細胞遊走、接着及び走化性において、シグナル伝達の役割を有することが報告されている(Odekon et al,1992;Waltz et al,1993;Gyetko et al,1994)。従って、ES内のウロキナーゼ様活性は細胞挙動の変化にも寄与している可能性があると推測することは合理的である。
【0038】
繊維芽細胞−マトリックス相互作用を促進した可能性があるESの他の作用は、ゲルマトリックス成分を分解するその能力と関連し得る。これは、存在するESの濃度が高いほど、ゲルがその外観をより素早く変化させ、より半透明の状態となり、最高のES濃度では液体様になるという観察によって示される。これは、ES内のセリンプロテイナーゼがコラーゲン及びフィブロネクチンを分解することを本発明者らが示した以前の研究によっても示されている(Chambers et al,2003)。マトリックス原繊維と組織培養皿表面間の接触が侵食され、原繊維ネットワークが破壊されるにつれて、ゲルの分解は機械的張力の緩和をもたらしたであろう。緊張性の培養力モニターを開発した研究者による多数の研究は、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞が機械的張力の変化を感知し、機械的張力の変化に対して反応することができるという証拠を与えている。これらの研究者は、繊維芽細胞が活性な張力性ホメオスタシスを維持し、外的に適用された負荷とは反対方向に内在性マトリックスの張力を修飾するように反応する(Brown et al,1998;Eastwood et al,1994)。従って、適用された負荷の増加は細胞によって媒介される収縮の減少を引き起こし、逆も同様である。おそらく、この応答に寄与しているのは、機械的張力がMMP産生のレベルに影響を与え、従って、周囲のマトリックスを再構築するためにプロテイナーゼを放出することによって細胞を反応させるという知見である(Lambert et al,2001)。従って、ゲルのタンパク分解性分解によって引き起こされる機械的張力の緩和は、細胞周囲のマトリックスを収縮及び再構築し、より高い移動性の表現型を採るように細胞を刺激した可能性がある。別の帰結は、繊維芽細胞の接着と遊走に影響を与えることが示されている分解されたコラーゲンとフィブロネクチンからの生物活性ペプチドの放出であった可能性がある(Greiling and Clark,1997;Livant et al,2000)。
【0039】
繊維芽細胞は機械的張力の変化を検出し、この変化に応答することができるので、マトリックスを再構築するために、ESがどれだけ繊維芽細胞を刺激しても、細胞間の連絡の強化がもたらされ得ることは本発明者らの観察から明らかである。これは、マトリックス原繊維の配列を引き起こす別の細胞からの反対方向の牽引力によって、各細胞がマトリックスの機械的張力の局所的な差を検出することができたからである。隣接する細胞のこのような増強された認識は、比較的長距離に対してさえ、細胞間の作用の改善された協調をもたらし、増強された遊走に寄与した可能性がある。実際には、Sheetz、Felsenfeld及びGabraith(1998)は、細胞外マトリックスタンパク質繊維の配向及び硬直性に従って、細胞がその運動を誘導するという協調された細胞遊走の同様の機序を提案している(Sheetz et al,1998)。
【0040】
遊走及びマトリックス再構築を強化する上でのESの利点にも関わらず、ES内に存在するプロテイナーゼの作用はマトリックスの広範囲な破壊を引き起こすので、ES内に存在するプロテイナーゼの活性は過剰なものではないことは重要である。接触誘導及び転位を促進するために、十分な原繊維構造が残存する必要があることは、10μg/mLという最高のES濃度を含有した本発明者らのアッセイによって示される。ここでは、ESは遊走を阻害したのみならず、粘性のある液体状態へゲルを素早く分解した。従って、明らかに、創傷治癒に貢献し得る細胞の活動を促進するためのESの最適な濃度が存在する。
【0041】
要約すれば、本発明者らの結果は、第一に、ESが繊維芽細胞の遊走を促進することを見出した。第二に、血清の不存在下において、細胞が十分に広がった形態を維持し、拡張するのを補助するためにESが必要であった。第三に、同じく血清の不存在下において、ESは、特に細胞間での細胞外マトリックスの再構成を促進した。第四に、ESは、細胞外マトリックスの直接的なタンパク分解性修飾によって、及び/又は細胞の受容体との相互作用による繊維芽細胞表現型の表現型の直接的な変化により、血清を不要とすることによってこれらの効果を付与した。本発明者らは、ESから活性な要素を単離するための技術的能力を有しており(Chambers et al,2003;Horobin et al,2003,2005)、従って、関与する活性及び機序の同定に進む。
【0042】
実施例2のデータが示すように、創傷の痂皮中のタンパク質を溶解する点で、幼虫のESから抽出されたキモトリプシンは創傷郭清活性を有している(図21参照)。阻害剤研究によって、及び配列決定によって、これはキモトリプシンであることが明らかとなっている。
【0043】
ここで、添付の図面を参照しながら、添付の図面によって例示されているように、本発明の実施例を記載する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】図1は、タンパク質翻訳及びL・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、L.セリカータ遺伝子配列を示す完全な(1)及び部分的な(2)配列表を示している。ここで、DNAコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のL.キュプリナ配列と比較した場合の、L.セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域(UTR)を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図2】図2は、タンパク質翻訳及びL・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、L.セリカータ遺伝子配列を示す完全な(1)及び部分的な(2)配列表を示している。ここで、DNAコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のL.キュプリナ配列と比較した場合の、L.セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域(UTR)を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。
【図3】図3は、三次元インビトロアッセイがどのようにして組み立てられたかの図解である。1.1.5mg/mLコラーゲンと30μg/mLフィブロネクチンを含有するダルベッコの改変イーグル培地(D−MEM)を58mmの組織培養皿の中に注ぎ、薄い均一な層中に37℃でゲル化した。2.1×107個のHFF細胞/mLを含有するD−MEM/コラーゲン/フィブロネクチンの小滴を第一のゲル層の上に置き、37℃でゲル化した。3.D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチン溶液の第二の層を細胞小滴の上に注ぎ、37℃でゲル化した。4.次いで、FCS−遊離細胞培地をゲルの上に注いだ。5.完全に組み立てられたアッセイが断面図で示されており、小滴中の全ての細胞がマトリックスゲルによってどのようにして完全に取り囲まれているか、従って、三次元に遊走しなければならないかについて図示している。
【図4】図4は、三次元インビトロアッセイ内の2μLのゲル小滴からの繊維芽細胞の遊走が、位相差顕微鏡画像からどのようにして定量されたかの図解である。1.アッセイ組み立ての直後における、繊維芽細胞が播種された小滴(0時間の温置)。2.24時間の温置後の同じ小滴。3.コントラストを付けるために黒で着色され、24時間の温置から得られた画像に対して重ね合わせられた、繊維芽細胞が播種された0時間温置時点での小滴。4.24時間にわたって小滴から遊走した細胞のみが示されたままとなっており、従って、それらを計数することが可能となる。各細胞の先端から重ね合わされた0時間画像の周囲へ引かれたベクトルの長さを測定することによって、各細胞が移動した距離を計算した。0時間の温置時における繊維芽細胞が播種された小滴の周囲距離も、重ね合わされた0時間画像周囲に線を引くことによって測定された。ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図5a】図5は、a.ESの不存在下(0ES)若しくは0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下で、又はb.ESの不存在下(0ES)若しくは1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下で、アッセイ組み立て直後に(0時間)又は24時間若しくは48時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図5b】図5は、a.ESの不存在下(0ES)若しくは0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下で、又はb.ESの不存在下(0ES)若しくは1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下で、アッセイ組み立て直後に(0時間)又は24時間若しくは48時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、300μmに相当する。
【図6a】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6b】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6c】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図6d】図6は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴2μLの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。a.ESが存在しない(0ES)対照中の細胞と、24時間の温置後に5μg/mLのESに曝露された細胞(5ES)との比較;b.対照中の細胞(0ES)と、48時間の温置後に1μg/mLのESに曝露された細胞(1ES)との比較−zシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、FITC−ファロイジン(アクチン)及びヨウ化プロピジウム(核)で染色された細胞;対照中の細胞(0ES)と24時間(c)又は48時間の温置後に10μg/mLESに曝露された細胞(10ES)との比較。(d)a、c、d中のミクロンのバーは50μm(上)又は20μm(下)を表し、bでは、50μmを表す。
【図7a】図7は、24時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴2μLからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲mm当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差(n=5)として表されている。a.ESの不存在下(対照)又は0.1μg/mLES(0.1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下での遊走。
【図7b】図7は、24時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴2μLからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲mm当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差(n=5)として表されている。b.ESの不存在下(対照)又は1μg/mLES(1ES)若しくは10μg/mLES(10ES)の存在下での遊走。
【図8】図8は、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種された各2μLのゲル小滴から遊走する繊維芽細胞が移動した距離の中央値を示している。5つの反復小滴から得られた値が示されている。黒塗りの記号(実験1)は、ESの不存在下(対照#1)又は0.1μg/mLES若しくは5μg/mESの存在下で移動した距離を表している。白い記号(実験2)は、ESの不存在下(対照#2)又は1μg/mLES若しくは10μg/mESの存在下で移動した距離を表している。
【図9】図9は、アッセイ組み立て直後(0時間の温置)又は24時間若しくは48時間の温置後における、20μLのゲル小滴内の、3×105細胞/mLの播種密度の繊維芽細胞を示す代表的な位相差画像を示す。ESの不存在下(0ES)又は1μg/mLES(1ES)若しくは5μg/mLES(5ES)の存在下での細胞の外観。黒い矢印は、並列されている場合、細胞間の鎖状結合性原繊維が可視的になっていることを示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、20μmに相当する。
【図10】図10は、24時間の温置後における、各酵素濃度のタンパク質分解活性に関連した、FN被覆された表面への繊維芽細胞接着に対するES、トリプシン、キモトリプシン及びトリプシン/キモトリプシン混合物の効果を示す2つのグラフである。このような活性は、a.トリプシン又はb.キモトリプシンに対する合成ペプチド基質からの7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の放出をモニタリングすることによって評価された。細胞の接着は、蛍ルシフェラーゼをベースとする発光アデノシン三リン酸(ATP)アッセイを用いて測定された。結果は、対照の平均%細胞接着±1SDとして表した(n=3)。
【図11】図11は、37℃で24時間の温置後のフィブロネクチンのゲル電気泳動の写真である。値は、分子量標準(kDa)を示している。1.FN単独。2.FN+try/chy。3.FN+chy。4.FN+try。5.FN+ES。各酵素濃度は、適切なトリプシン又はキモトリプシン基質に対する活性の同じレベルを示した。Try=0.32μg/mLトリプシン。Chy=0.02μg/mLキモトリプシン。ES=1μg/mL。
【図12】図12は、pBac−3ベクター多重クローニング部位DNA配列中のL.セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すDNA配列表であり、pbac−3ベクターの配列に下線が付されている。
【図13】図13は、活性部位の残基が太字で示されている図12のDNA配列の予想されるタンパク質配列である。
【図14】図14は、S300ゲルろ過後のトリプシン/キモトリプシン活性を示すグラフである。
【図15】図15は、ゼラチンSDS−PAGE基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性を示す一連の写真である。
【図16】図16は、C1プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図17】図17は、C1プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図18】図18は、T2プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。
【図19】図19は、T2プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。
【図20】図20は、L.セリカータのES産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す2つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図20aは処理されていない痂皮を示しており、図20bは一晩処理された痂皮を示している。
【図21】図21は、L.セリカータのES産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す4つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図21aは処理されていない痂皮を示しており、20bはキモトリプシンピーク(C1)で処理され、20cは第一のトリプシンピーク(T1)で処理され、20dは第二のトリプシンピーク(T2)で処理された。
【実施例】
【0045】
(実施例1)
組織の再生
繊維芽細胞の接着の促進
ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物の収集及び性質決定
排泄物/分泌物(ES)を、以前に記載されているとおりに(Horobin et al,2003)、孵化した直後の無菌のルシリア・セリカータの幼虫(LarvETM,Zoobiotic Ltd,UK)から収集した。簡潔に述べると、ES産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)1mL中において、室温で(RT)30分間、400個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Bio−Rad(Hercules,CA)タンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナート(FITC)−カゼイン消化アッセイ(Horobin et al,2003)を用いて、ESのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、161.74μg/mLのタンパク質濃度及び6.04×106相対蛍光単位/mgESタンパク質の比活性であることを明らかにした。
【0046】
初代ヒト包皮繊維芽細胞(HFF)細胞培養
ダルベッコの改変イーグル培地(D−MEM)(GibcoTM,Invitrogen Ltd,UK)、10%ウシ胎児血清(FCS)(Sigma(R),UK)、抗生物質/抗真菌溶液(Sigma(R))(100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び0.25μg/mLアムフォテリシンB)及び2mML−グルタミン(Sigma(R))を含有するT75フラスコ(Nunc,Life Technologies Ltd,UK)内で、HFF細胞(TCS Cellworks(R),UK)を単層培養した。5%CO2を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を37℃に維持した。
【0047】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
通常の細胞培養(上記参照)に対して使用した濃度の2倍のD−MEM、抗生物質/抗真菌物質及びL−グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、1:1の比で、3mg/mLウシコラーゲンI型(ICN Biomedicals,Ohio,USA)、60μg/mLウシフィブロネクチン(Sigma(R))及び幼虫のES又はPBSブランクを含有する冷溶液と原溶液を氷上で混合した。1×D−MEM、1.5mg/mLコラーゲン及び30μg/mLフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のESの最終タンパク質濃度は、表記されているように、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml又は10μg/mlであった。図3に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、58mm組織培養皿(Nunc,Life Technologies Ltd)の中に、D−MEM−コラーゲン/フィブロネクチン混合物1000μLを注ぎ、均一な薄い連続層の中に37℃でゲル化した。HFF細胞(継代6)をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、10%FCSを含有するD−MEM中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、FCSを含まないD−MEM中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、1×107細胞/mLの密度で、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物2μLを含有する5つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、37℃で温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチン混合物をさらに1000μLに注ぎ、ゲル化させるために37℃で放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質/抗真菌物質、L−グルタミン及びPBSブランク又は幼虫のESを含有する、FCSを含まないD−MEMを添加した。次いで、表記の時間、加湿された5%CO2雰囲気中、37℃で、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。
【0048】
各実験を通じて、計48時間の期間にわたって、位相差を用いる倒立Leica(UK)DMIRB顕微鏡を通して、細胞を観察した。24時間の温置後に細胞遊走を定量するために、各ゲル内に包埋された各細胞小滴の領域全体を示す低倍率画像を使用した。ここで、24時間の温置後の同じ小滴の画像上に0時間の時点での各細胞小滴の画像を重ね合わせるために、MicrosoftPaintShopPro6を使用した。図4に示されているように、次いで、LeicaQUIPSソフトウェアを用いて、これらの複合画像を分析した。最初に、0時間での、各細胞小滴を取り囲む周囲の距離を計算した。この後、24時間の期間にわたって、元の細胞小滴周囲を横切り、元の細胞小滴周囲から離れるように遊走した細胞の数を計数した。変動する小滴周囲距離を補正するために、遊走する細胞の数は、元の細胞小滴境界のmm周囲長当りの細胞として表された。各細胞が周囲から離れるように遊走した直線距離も測定した。
【0049】
48時間の温置後、4%パラホルムアルデヒド(TAAB,Aldermaston,UK)中に、20分間、完全な状態のゲルを固定した後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma(R))を含有するPBSで3回洗浄した。次いで、20mMN−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸);4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、300mMスクロース、50mMNaCl、3mMMgCl2及び0.5%TritonX−100(全てSigma(R)から)を含有する氷冷した透過溶液(pH7.4)を添加し、10分間放置した。再度、1%BSAでゲルを洗浄した。(エタノール中の)0.08%FITC−ファロイジン(Sigma(R))溶液を1%BSAで1:100希釈し、次いで、ゲルに添加した。30分後、先述のように、ゲルを洗浄した。10μg/mLヨウ化プロピジウム(PI)(Sigma(R))を含有するBSA(1%)を添加し、ゲルを再度洗浄する前に、1分間放置した。
【0050】
FITC−ファロイジン/PI染色後、過剰な液体を除去するために、ゲルを慎重に吸収転移させ、Bio−Rad蛍光搭載培地及びカバーガラスを載せた。LeicaDMRBE直立蛍光顕微鏡を内蔵した共焦点LeicaTCS4Dシステムを用いてゲルを可視化した。遊走している細胞の形態を観察するために、細胞小滴の縁の最大強度画像を撮影した。ゲルの光学的断面のZシリーズも撮影し、組み立て直後に固定及び染色された別のアッセイの撮影された光学的断面(0時間温置)と比較した。これは、小滴から全ての方向に細胞遊走が起こったことを示すために行われた。
【0051】
統計解析
各処理内において各細胞小滴反復のmm周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、GraphPadPrismTMソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析(ANOVA)及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。GraphPadPrismTMソフトウェア内で使用できる一元配置のANOVA及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をP<0.05と定義した。
【0052】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化I
別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、3×105細胞/mLのより低い細胞密度を含有する1つの20μL小滴を各アッセイ中に組み込んだ。1μg/mLES、5μg/mLES又はPBSブランク(対照)の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、0、24及び48時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。
【0053】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後(0時間)又は48時間の温置後(48時間)に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、0時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、48時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認した(HorobinAJPhDthesis,2004)。
【0054】
幼虫のESに応答する細胞の遊走を定量する上で、2つの別個の実験を行った。一方の実験は、ESが存在しない対照に対して0.1μg/mLES及び5μg/mLESの効果を比較した。他方の実験は、別の対照と比較した場合の1μg/mLES及び10μg/mLESの効果を調べた。各実験において、同じフラスコ及び継代からの細胞を使用した。
【0055】
各小滴からの細胞遊走を調べるために画像を撮影した。24時間の温置で、5μg/mLのESの存在下での細胞の遊走が最も大規模であるように見受けられることが視覚的観察によって明らかとなった(図5a)。形態的には、これらの細胞は、対照内の細胞より十分に広がっているようにも見受けられ、周囲のゲル中に、より長く、より多数の伸長突起を突出させていた(図6a)。48時間の温置までに、5μg/mLESに曝露されたゲルは半透明であり、皿の表面から剥離された状態となった。細胞小滴は収縮し、マトリックスを内側に引っ張り、小滴間のマトリックス内の張力を増加させた。この時点までに、1μg/mLESに曝露された細胞は、それぞれの対照よりさらに遊走するように見受けられ(図5b)、周囲のゲル中に長い伸長突起を有する十分に広がった形態も採っていた(図6b)。これに対して、10μg/mLESの存在下の細胞小滴はサイズが低下し、細胞の幾つかの領域は緊密な暗い塊へ収縮していた(図5b)。これは、予めゲル化された溶液の、この時点で、透明な粘性のある液体状態と関連していた可能性がある。対照と比較すると、10μg/mLESに曝露された細胞の形態は明確に異なっていた。ここでは、24時間の温置において、細胞は多数の細い伸長突起を呈し、それらの幾つかは極めて長かった(図6c)。48時間の温置では、細胞は収縮して、丸くなるが、長く、細い細胞間伸長突起の突出を通じた他の細胞との直接的な物理的接触を維持していた(図6d)。
【0056】
各小滴の全体を見ることができる低倍率画像を用いて、各小滴からの細胞遊走の合計を定量した。24時間の温置で、適切な対照と比べて、遊走している細胞の数(P<0.01)(図7)及び移動した距離(P<0.001)(図8)の両方の観点で、5μg/mLESは細胞の遊走を有意に増強したことが分析によって確認された。1μg/mLのESも、その対照を上回って、細胞遊走を有意に増強した(細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.05)(図7、8)。これに対して、10μg/mLのESは、その対照と比べて、細胞遊走を有意に阻害した(細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.001)(図7、8)。0.1μg/mLESへの曝露は、遊走する細胞の数を僅かに阻害するように見受けられた(対照に対してP<0.05)(図7)。しかしながら、0.1μg/mLESは、対照と比べて、遊走距離に対して有意な影響を有さず(P>0.05)(図8)、細胞の形態にも影響を与えないように見受けられた(データは示さず)。実験1の対照(図7a)中で遊走する細胞の数は実験2の対照(図7b)中より高いことにも注目し得る。実験間のこのような差は、血球計測器を用いて細胞数を推定する場合に避けることができない誤差水準によってもたらされる細胞小滴内の細胞密度の僅かな差によるものであり得る。しかしながら、このような潜在的な変動源は実験間に存在するに過ぎず、(各実験内の各アッセイを組み立てるために、多数の細胞の計数に同じものが使用されたので)実験内には存在しない。従って、各実験内で結果を比較することはなお妥当であるが、実験間で結果を比較することは妥当でない。
【0057】
三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化II
繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ESの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた(図9)。しかしながら、24時間の温置までに、1μg/mLES、特に5μg/mLESの存在下の細胞は、ESの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。5μg/mLのESが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。48時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ESの不存在下では、細胞はより丸い状態となった(図9)。一方、1μg/mLのES又は5μg/mLのESに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。5μg/mLのESに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。
【0058】
(比較例1)
本発明者らは、ESキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するESの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ES、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大48時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたATPの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸(ATP)アッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するES及びトリプシンの効果を比較すると、ESは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、24時間の温置後、5μg/mLのESは、対照の16.6%まで細胞接着を低下させた(図10a)。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対するESの活性の103.2%を示した市販のトリプシン(1.6μg/mL)は、対照の34.9%まで細胞接着を低下させた。48時間の温置後、5μg/mLESの存在下での細胞接着は対照の9.3%まで減少したのに対して、1.6μg/mLの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の24.7%まで低下させた。
【0059】
キモトリプシン特異的な蛍光発生基質(Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC)に対する5μg/mLのESの活性の94.1%を示した市販のキモトリプシン(0.1μg/mL)は、繊維芽細胞の接着を修飾する能力を示さなかった(図10b)。キモトリプシン特異的な基質に対する5μg/mLのESの活性の204.9%を示す0.2μg/mLの市販のキモトリプシンでさえ、繊維芽細胞接着に対して効果を有していなかった。市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの両方に曝露された繊維芽細胞は、市販のトリプシンのみの同様の濃度に曝露された細胞を上回る接着の修飾を同時に一切示さなかった。
【0060】
これらの結果は、繊維芽細胞接着を修飾する上で、ES内に存在するキモトリプシンなどの酵素が市販のトリプシン若しくは市販のキモトリプシン単独又は組み合わせより有効であることを示している。ESが繊維芽細胞の接着を修飾する能力が、タンパク質分解を介して、フィブロネクチンで被覆された表面を修飾するその能力と関連していることが以前の研究によって示されている(Horobin et al2003、上記)。従って、これらの結果は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する上で、ESは、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンより有効であり得ることを示唆している。これは、ゲル電気泳動を用いて確認される。ここでは、トリプシン特異的又はキモトリプシン特異的な基質に対して類似の活性を有する溶液を得るために、幼虫のES、市販のトリプシン、市販のキモトリプシン又は市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの組み合わせの試料を希釈した。次いで、12%ポリアクリルアミドゲル上で分離する前に、24時間、ウシフィブロネクチン(100μg/mL)を、37℃で、これらの溶液に曝露した。図示されているように、ESは、市販の両酵素と比較した場合に、フィブロネクチンを主により小さな断片へより大規模に分解した(図11)。さらに、ES内に存在するタンパク質分解性酵素は繊維芽細胞の遊走を強化することが示された(Horobin et al2005上記)。これは、繊維芽細胞の接着の変化と関連し得る。創傷の中で、繊維外細胞の遊走の加速は、創傷空間中への肉芽組織増殖を促進し得る。このように、ES由来の酵素は、現在市販されている酵素より有効な創傷郭清因子であることが明らかとなり得るのみならず、創傷治癒応答も同時に増強し得る。
【0061】
(実施例2)
創傷郭清
ウジのキモトリプシンの精製
L.セリカータES産物のSephacrylS300クロマトグラフィー。
【0062】
ガラスクロマトグラフィーカラム(1.5cm×50cm)にSephacrylS−300HRを充填し、PBSで平衡化した(流速0.33mL/分)。幅広い範囲のゲルろ過標準物質(200−12.5kDa,Sigma)を用いて、カラムを較正し、空隙容量を求めた。L.セリカータのES産物約2mL(0.5mg)をカラムにかけ、空隙容量50画分の溶出後(2mL/画分)を集め、それぞれ、蛍光性基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC及びトリス−Gly−Pro−Arg−AMCを用いて、キモトリプシン及びトリプシン活性に関してアッセイを行った。S300ゲルろ過後のキモトリプシン/トリプシン活性を示す図14及び15を参照されたい。典型的には、トリプシンが濃縮された2つのピーク(T1及びT2と名付けられた。)及びキモトリプシン活性が濃縮された1つのピーク(C1と名付けられた。)というタンパク質分解活性の3つのピークが観察された。図15は、ゼラチンSDS−PAGE基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性も示す。
【0063】
蛍光性合成ペプチド基質を用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイ
7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC(キモトリプシン)及びトシル−Gly−Pro−Arg−AMC(トリプシン)からの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン/トリプシン活性を評価した。PBS中に希釈された基質150μL(5μM)とともに各画分50μLを温置した。37℃で30分間、試料を温置し、その後、DynexMFXマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した(励起365nm、発光検出465nm)。ゼロ時点の読み取りの推測後、30分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。
【0064】
ゼラチン基質SDS−PAGEを用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイ
Kumar&Pritchard(1992)によって記載された方法を用いて、基質SDS−PAGEを実施した。分離ゲル中に0.1%(w/v)ゼラチンを含めて、12%(w/v)SDS−PAGEゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを55℃まで加温した。各画分10μLを非還元試料緩衝液(0.5MTris、pH6.8、5%SDS(w/v)、20%グリセロール(w/v)、0.01 %ブロモフェノールブルー)の等容量と混合し、37℃で30分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、20mAの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、Lacks&Springhorn(1980)によって記載されたように酵素を再生するために、室温で20分間、2.5%TritonX−100中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で20分間、ゲルを洗浄し、最後に、PBS中において、37℃で一晩温置した。Coomassie brilliant blueR250でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。
【0065】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるキモトリプシンの精製
キモトリプシン活性のC1プールの塩濃度を0.5MNaClに調整し、PBS、0.5MNaClで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム3mL(流速0.2mL/分)にかけた。カラムを通過する緩衝液の280nmでの吸光度がゼロになるまで、PBS、0.5MNaClでカラムを洗浄した。0.7%エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、1mL画分を集め、2MTris−Cl(1:1v/v)で直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図16)。蛍光性基質及びゼラチンSDS−PAGEを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした(図17)。
【0066】
図17は、C1プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はキモトリプシンの基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−Arg−AMCを切断し、PMSFによってのみ阻害され得ることが示された。トリプシンの基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS−PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも3つの異なる領域が観察された(矢印が付されている。)。
【0067】
大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトリプシンの精製
同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のT2プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図19)。
【0068】
図19は、T2プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はトリプシンの基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCを切断し、PMSF及びAPMSFによって阻害され得ることが示された。キモトリプシンの基質Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−Arg−AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS−PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも1つの明瞭な領域が観察された(矢印が付されている。)。
【0069】
創傷痂皮に対するES産物の効果
L.セリカータES産物10μgとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、Biorad等電点電気泳動再水和緩衝液(8M尿素、2%CHAPS、50mMDTT、0.2%Ampholytes)中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Biorad2Dタンパク質「クリーンアップ」キットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。
【0070】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するES産物の効果を調べた。製造業者によって記載された条件下で、「ReadyStrip」7cmIPG片pH3から10(Biorad)を用いて、タンパク質約100μgを一次元に集中させた。10%トリセンゲルを用いて、二次元SDS−PAGEを実施した(Schagger and Vonjagow,1987)。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図20。
【0071】
創傷痂皮に対するキモトリプシン/トリプシンプールの効果
L.セリカータC1、T1又はT2プール100μLとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。
【0072】
次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するC1、T1又はT2プールの効果を調べた。上記のように、タンパク質約100μgを二次元に集中させた。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図21。
【0073】
L.セリカータのキモトリプシン遺伝子をクローニングする
NcoI制限部位(5’−CTGCCATGGTCATGAAATTCTTAATAGTT−3’)を付加するフォワードプライマー及びNheI部位(5’−GACGCTAGCATAAGAAATTCCGGTGTG−3’)を付加するリバースプライマーを使用するPCRによって、cDNAライブラリーからL.セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域(ORF)を増幅した。生じた断片をpBac−3中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し(図12)、アミノ酸配列を予想した(図13)。
【0074】
従って、ルシリア・セリカータのESが本明細書に示されているアミノ酸及びDNA配列を有するキモトリプシン酵素を含有し、この酵素は創傷を郭清するとともに、繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、及び繊維芽細胞の形態の修飾によって創傷の治癒を促進すると結論付けることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
昆虫の幼虫から得られる単離されたキモトリプシン又はその合成様式。
【請求項2】
キモトリプシンが図1若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項1に記載のキモトリプシン。
【請求項3】
請求項1又は請求項2に記載のキモトリプシンと同じ活性を有するキモトリプシンの断片。
【請求項4】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫から得られる、請求項1から3の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項5】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物から得られる、請求項1から4の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項6】
幼虫が新たに孵化されている、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項7】
幼虫が初齢である、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項8】
幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項1から7の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項9】
創傷の治療において使用するための、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む組成物。
【請求項10】
創傷の治療用医薬の調製における、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンの使用。
【請求項11】
キモトリプシンが図1、図2若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項9又は請求項10に記載の使用。
【請求項12】
キモトリプシンの活性な断片が使用される、請求項9から11の何れかに記載の使用。
【請求項13】
キモトリプシンが合成である、請求項9から12の何れか一項に記載の使用。
【請求項14】
キモトリプシンがルシリア・セリカータから得られる、請求項9から13の何れか一項に記載の使用。
【請求項15】
創傷が、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど(熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。)、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎並びに整形外科的創傷を含む群から選択される、請求項9から14の何れか一項に記載の使用。
【請求項16】
創傷が感染状態である、請求項9から15の何れか一項に記載の使用。
【請求項17】
創傷が慢性的である、請求項9から16の何れか一項に記載の使用。
【請求項18】
創傷が繊維芽細胞遊走の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項19】
創傷がマトリックス再構築の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項20】
創傷が繊維芽細胞形態の修飾によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項21】
創傷がキモトリプシンによって郭清される、請求項9から20の何れか一項に記載の使用。
【請求項22】
請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む、創傷用の包帯。
【請求項23】
請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む医薬組成物。
【請求項24】
治療を必要としている創傷に、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを適用することを含む、創傷を治療する方法。
【請求項25】
請求項22に記載の包帯、請求項9に記載の組成物又は請求項23に記載の医薬組成物を、治療を必要としている創傷に適用する段階を含む、創傷を治療する方法。
【請求項1】
昆虫の幼虫から得られる単離されたキモトリプシン又はその合成様式。
【請求項2】
キモトリプシンが図1若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項1に記載のキモトリプシン。
【請求項3】
請求項1又は請求項2に記載のキモトリプシンと同じ活性を有するキモトリプシンの断片。
【請求項4】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫から得られる、請求項1から3の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項5】
キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物から得られる、請求項1から4の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項6】
幼虫が新たに孵化されている、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項7】
幼虫が初齢である、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項8】
幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項1から7の何れか一項に記載のキモトリプシン。
【請求項9】
創傷の治療において使用するための、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む組成物。
【請求項10】
創傷の治療用医薬の調製における、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンの使用。
【請求項11】
キモトリプシンが図1、図2若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項9又は請求項10に記載の使用。
【請求項12】
キモトリプシンの活性な断片が使用される、請求項9から11の何れかに記載の使用。
【請求項13】
キモトリプシンが合成である、請求項9から12の何れか一項に記載の使用。
【請求項14】
キモトリプシンがルシリア・セリカータから得られる、請求項9から13の何れか一項に記載の使用。
【請求項15】
創傷が、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど(熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。)、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎並びに整形外科的創傷を含む群から選択される、請求項9から14の何れか一項に記載の使用。
【請求項16】
創傷が感染状態である、請求項9から15の何れか一項に記載の使用。
【請求項17】
創傷が慢性的である、請求項9から16の何れか一項に記載の使用。
【請求項18】
創傷が繊維芽細胞遊走の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項19】
創傷がマトリックス再構築の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項20】
創傷が繊維芽細胞形態の修飾によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。
【請求項21】
創傷がキモトリプシンによって郭清される、請求項9から20の何れか一項に記載の使用。
【請求項22】
請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む、創傷用の包帯。
【請求項23】
請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む医薬組成物。
【請求項24】
治療を必要としている創傷に、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを適用することを含む、創傷を治療する方法。
【請求項25】
請求項22に記載の包帯、請求項9に記載の組成物又は請求項23に記載の医薬組成物を、治療を必要としている創傷に適用する段階を含む、創傷を治療する方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【公開番号】特開2011−155974(P2011−155974A)
【公開日】平成23年8月18日(2011.8.18)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2011−28630(P2011−28630)
【出願日】平成23年2月14日(2011.2.14)
【分割の表示】特願2009−512683(P2009−512683)の分割
【原出願日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【出願人】(390040604)イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER BRITANNIC MAJESTY’S GOVERNMENT OF THE UNETED KINGDOM OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN IRELAND
【Fターム(参考)】
【公開日】平成23年8月18日(2011.8.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−28630(P2011−28630)
【出願日】平成23年2月14日(2011.2.14)
【分割の表示】特願2009−512683(P2009−512683)の分割
【原出願日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【出願人】(390040604)イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER BRITANNIC MAJESTY’S GOVERNMENT OF THE UNETED KINGDOM OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN IRELAND
【Fターム(参考)】
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