レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤
【課題】安全性が高く、継続して摂取しても副作用の無くレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）を活性化する物質で、肥満、動脈硬化や白血病の予防若しくは治療に用いられるＲＡＲ活性化剤を提供すると共に、それらを含有する飲食品、医療品、サプリメント、食品添加物、飼料を提供する。
【解決手段】クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含むことを特徴とするレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤であり、好ましくはクリプトキサンチンがカンキツ類由来のものである。
【解決手段】クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含むことを特徴とするレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤であり、好ましくはクリプトキサンチンがカンキツ類由来のものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の活性化剤、ならびにそれを用いた飲食品、医薬品、および飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
内臓脂肪の蓄積は脂肪細胞が分泌している物質を変化させ、この変化が様々な疾病の原因となっている可能性が近年の研究で示唆されてきた。日本では近年、食の欧米化による摂取脂質の上昇や運動不足、ストレスなどによって肥満の人の割合が増えてきている。肥満は内臓脂肪の蓄積によって起こる。内臓脂肪は体の内臓周囲に存在し、皮下脂肪などに比べ、増加しやすく減少しやすい人体の恒常性をたもつ器官である。元来この内臓脂肪は血圧の調節や、血糖値の調整、脂質の調整などを行っているが、肥満状態に陥るとその調節機構に破綻をきたし、分泌する物質が変化することで体への脂肪の蓄積を促進し、血糖値や血圧、血中脂質などが上昇してメタボリックシンドロームと呼ばれる複合症状が発症することが知られている。
【０００３】
一方、脂肪に関する研究で核内受容体の一種であるレチノイン酸受容体（以下、ＲＡＲという。）を活性化すると脂肪の分化が抑制されることが明らかとなってきた（非特許文献１）。体内におけるＲＡＲの活性化因子として知られているのがレチノイン酸である。レチノイン酸はビタミンＡより合成されるレチノイドで、体内で細胞の分化やアポトーシス、細胞の成長の抑制などの効果が知られている物質である。これはＲＡＲを介した作用で、ＲＡＲにレチノイン酸が結合するとこれら関連の深い遺伝子の転写を促進することで効果を示す。
【０００４】
また、ＲＡＲにはサブタイプが存在し、α、β、γ型が知られている。α型はほとんどの組織で発現しているが、β、γ型は発現する組織が限定されていることが知られている。また一部の白血病では、染色体の相互転座によってキメラタンパク質が合成され、ＲＡＲの働きを失うと発病するものなども知られているが、これもレチノイン酸によってＲＡＲを活性化することで寛解できる場合があることが知られている。（非特許文献２）
以上のようにＲＡＲは、内臓脂肪の蓄積を含め様々な遺伝子発現に密接に関与しており、これを活性化することによって上記のような効果が得られる。しかしながらレチノイン酸を用いると、レチノイン酸を体外へ排出するタンパク質の発現が上昇し、レチノイン酸の効果が薄れる場合やレチノイン酸症候群といわれる発熱、呼吸困難、胸水貯留、肝不全、腎不全を伴う副作用を引き起こし、時には生命も失うことがある。またＲＡＲを活性化する合成のレチノイドであるカフェ酸誘導体（特許文献１）やＡＭ８０（商品名：タミバロテン、非特許文献３）も販売されているが、使用を続けた場合の安全性に問題がある。またレチノイン酸や合成レチノイドは生体に対する吸収性が低く、効果を得るためには投与量を増やさなければならない。
【０００５】
ところで、同様の効果を示す遺伝子の活性化としてぺルオキシソーム増殖剤応答性受容体（以下、ＰＰＡＲという。）の活性化が挙げられ、β−クリプトキサンチンのＰＰＡＲ活性化作用を報告したものもある（特許文献２）。また従来、クリプトキサンチンにＲＡＲ活性化作用があることについては全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０９２３２２
【特許文献２】特再表２００５／１１２９０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＳＣＨＷＡＲＺ ｅｔａｌ．， ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，１７，１５５２−１５６１（１９９７）
【非特許文献２】Ｏｔａｋｅ ｅｔａｌ．， Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，３１９−３２６（２００５）
【非特許文献３】ＦＵＫＡＳＡＷＡ ｅｔａｌ．， Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９（３），１１４〜１２６（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少量の摂取を連続して行うことでＲＡＲの活性化作用を長期間維持し、かつ既成品に見られるような副作用が無いＲＡＲ活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることによりＲＡＲを活性化しうることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第一は、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするＲＡＲ活性化剤を要旨とするものであり、好ましくは、ＲＡＲが、脂肪細胞、血管内皮細胞及び／又は白血病細胞の核内に存在するものであり、また好ましくは、クリプトキサンチンが、カンキツ類由来のものであり、さらに好ましくは、カンキツ類が、温州みかんであるものであり、また、好ましくは、肥満、動脈硬化又は白血病の少なくとも１つの予防又は治療のための前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤である。
【００１１】
本発明の第二は、カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化作剤の製造方法を要旨とするものであり、又は、カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤の製造方法を要旨とするものであり、又は、カンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出することを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤の製造方法を要旨とするものである。
【００１２】
本発明の第三は、前記したいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤を含有する飲食品、医薬品、又は飼料を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＲＡＲ活性化作用が高いクリプトキサンチンを有効成分としているため、少量の摂取で効果が得られ、血中に長期間存在しても副作用が無いことから安全性が高く、また、飲食品に配合した場合に配合設計が容易であるという作用効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＲＡＲα活性化作用の有無を示す図である。
【図２】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＲＸＲα活性化作用の有無を示す図である。
【図３】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＰＰＡＲγ活性化作用の有無を示す図である。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１の分化に対するβ−クリプトキサンチンとＬＥ５４０の作用を示す図である。
【図５】ＨＬ−６０細胞に対するみかん抽出物のアポトーシスの誘導作用を示す図である。
【図６】ＨＬ−６０細胞に対するみかん抽出物とＬＥ５４０を添加したときのアポトーシス誘導の抑制作用を示す図である。
【図７】ＨＬ−６０細胞に対するβ−クリプトキサンチンを使用したときのアポトーシス誘導作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。最初に第一の本発明であるＲＡＲ活性化剤について説明する。本発明で用いられるクリプトキサンチンは、α型でもβ型でもよく、特に限定されるものではない。また、本発明で用いられるクリプトキサンチンの誘導体としては、クリプトキサンチンから誘導される化合物であれば特に限定されず、例えばクリプトキサンチンの脂肪酸エステルなどが挙げられ、具体的には、パルミトイルエステル、ミリストイルエステル、ラウリルエステルなどの誘導体も含まれる。
【００１６】
本発明で用いられるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体は、その由来については特に限定されないが、中でもカンキツ類が好ましい。カンキツ類の果実とは、温州みかん、伊予柑、夏みかん、八朔、ポンカン、ネーブルオレンジ、レモン、バレンシアオレンジ、グレープフルーツ（これらと同等又は類似の品種のものも含む）などの果実をいい、その中でも温州みかんがクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含有率が高く望ましい。
【００１７】
本発明のＲＡＲ活性化剤においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチンを０．００００１質量％以上１００％以下、好ましくは０．０００１質量％以上５０％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上１０％以下の割合で含有しておればよい。
【００１８】
本発明のＲＡＲ活性化剤はクリプトキサンチンを含んでいれば良く、クリプトキサンチン以外の成分は、その効果を阻害しない限りいずれを用いても良い。例えば、オリーブオイルやごま油、サフラワー油などがクリプトキサンチンとの相溶性が高く好ましい。
【００１９】
本発明のＲＡＲ活性化剤はクリプトキサンチンを含有していれば、他のＲＡＲ活性化作用を有する物質と混合してもよく、例えば、合成レチノイドやフコキサンチンなどのカロテノイドなどが適宜含有されるが、副作用を起こさない程度であることが必要である。またその他の成分を添加物として含んでいても良く、特に限定されるものではないが、例えば、ビタミンＣなどの各種ビタミン類や、アミノ酸およびオリゴ糖、ミネラル等などが適宜含有されている。
【００２０】
以上のような本発明のＲＡＲ活性化剤は、経口で摂取することによりＲＡＲの活性化作用を有するものである。
【００２１】
本発明のＲＡＲ活性化剤を摂取する方法としては、本組成物を単独でそのまま摂取しても良いし、粉末、錠剤、顆粒、カプセル剤、ソフトカプセル剤、ゲル、ペースト、シロップ、懸濁液、乳化液、ドリンク剤などに加工して摂取してもよい。
【００２２】
次に、上記したＲＡＲ活性化剤の製造方法について説明する。そのような製造方法としては、カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を得る方法、カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を得る方法、及びカンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を抽出する方法が挙げられる。以下、順次これらの方法について説明する。
【００２３】
カンキツ類植物を搾汁した残さ、すなわち搾汁粕は、カンキツ類の果実をインライン搾汁機、チョッパーヘルパー搾汁機、ブラウン搾汁機などにより搾汁した後、パドル型又はスクリュー型のフィニシャーなどでろ過又は篩別、または遠心分離によって果汁を調製した搾汁残渣を集めることにより調製される。
【００２４】
酵素処理は、カンキツ類植物の果実そのまま、あるいはすりつぶし、破砕、粉砕、加熱、脱水、乾燥などの物理的処理を行なったもの、さらに上記のようにして得られる搾汁残さに対して酵素を添加することにより行なわれる。
【００２５】
酵素処理使用する酵素としては、カンキツ類植物に含まれる有機物、特に細胞壁などを構成する生体高分子などを分解できることが出来るものであれば、特に限定されず、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、プロテアーゼ、ペプチターゼ、リパーゼ、マレーションエンザイム（細胞壁崩壊酵素）などが用いられる。これらの中でも、糖質加水分解酵素であるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、マレーションエンザイムが、有効成分であるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体含有量を高める効率が高く望ましい。
【００２６】
添加する酵素剤は、これらの精製酵素を用いても良いし、これらの活性を示す微生物菌体や培養物、これらの粗精製物を用いても良い。これらの酵素は単独で用いても良いし、２種類以上の酵素を混合して用いてもよい。添加する酵素の量は特に限定されず、酵素の反応性に応じて添加すればよい。例えば、ペクチナーゼを用いる場合であれば、被処理物１００ｇに対して１〜１００，０００ユニットであることが好ましく、更に１０〜１０，０００ユニットであることが好ましい。
【００２７】
上記酵素を添加した後、攪拌などにより酵素と被処理物を均一に混合して酵素反応を進行させる。このときの反応温度としては酵素が失活せず、かつ腐敗の起こりにくい条件、またクリプトキサンチン及びその誘導体が喪失しない条件化で行うことが望ましい。具体的には、温度は０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、更に好ましくは０〜７０℃が良い。反応のｐＨとしては酵素の至適条件下で行うのが望ましいことは言うまでもなく、ｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ２．５〜８とするのが良い。反応時間は使用する搾汁残渣と酵素の量に依存するが、通常１〜４８時間に設定するのが作業上好ましい。反応の際、この反応物を攪拌しながら反応を行っても良いし、静置反応でも良い。
【００２８】
酵素処理終了後、酵素処理された反応物をそのまま本発明のＲＡＲ活性化剤として用いてもよいし、何らかの加工を行ってもよい。具体的には、反応物を固液分離した残さ、あるいはその残さを乾燥させたもの、固液分離せず反応物をそのまま乾燥させたものなどを用いてもよい。また溶剤や水、超臨界二酸化炭素などを用いて成分などを抽出したものを用いてもよい。更に、引き続いて不純物類を取り除いてもよい。不純物の除去方法としては、例えば水洗浄、有機溶媒洗浄、シリカゲルカラムや樹脂カラム、逆相カラムなどを通す方法、活性炭処理、極性の異なる溶媒による分配、再結晶法、真空蒸留法などが挙げられる。特に酵素処理反応物を固液分離した後、固形分に再度水を添加・攪拌した後に固液分離する水洗浄は、酵素処理で生成した糖などの反応性生物を容易に除去できるため好ましい方法である。
【００２９】
カンキツ類植物及び／又は上述したカンキツ類植物の酵素処理物に、有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出する方法において用いられる溶剤としては、原料であるカンキツ類又はその加工品よりＲＡＲ活性化作用を持つ画分が得られ、本発明を損なうものでなければいかなるものでもよい。また、一種類の溶剤を単独で用いても複数の溶剤を混合して用いてもよい。そのような溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、へキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ピリジン類等が使用できる。これらのうち、エタノールは抽出されるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の抽出効率が高く好ましい。また、これらの有機溶媒で抽出する際には抽出効率を上げるために、例えば水、界面活性剤等の添加物を本発明効果を損なわない範囲で加えることが出来る。さらに、上記有機溶媒による抽出のほか、超臨界抽出法も利用することができる。
【００３０】
本発明の別の発明は、上記したようなＲＡＲ活性化剤を含有する飲食品、医薬品、及び飼料である。医薬品としては、注射剤、輸液、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、懸濁剤、シロップ剤、内服液剤、トローチ剤、乳剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、座剤、経腸利用剤などの形態で摂取することが出来る。
【００３１】
また、本発明の飲食品とは、一般飲食品に加えて、サプリメント、食品添加物、特定保健用食品、健康食品、機能性食品、医薬部外品など、すべての食品及び／又は飲料が含まれる。該食品及び／又は飲料は特に限定されるものではなく、例えば上記の医薬品的な形態のものに加え、パン、うどん、そば、ご飯等、主食となるもの、チーズ、ウインナー、ソーセージ、ハム、魚肉加工品等の食品類、アイスクリーム、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、チューインガム、ヨーグルト、グミ、チョコレート、ビスケットなどの菓子類、ジャムなどの調味料類、果汁飲料、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンク、コーヒー飲料、茶、牛乳などの飲料が挙げられる。
【００３２】
本発明の飼料とは、本発明のＲＡＲ活性化剤に、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦などの穀類、ふすま、米ぬかなどのぬか類、コーングルテンミール、コーンジャムミールなどの粕類、脱脂粉乳、ホエー、魚類、骨粉などの動物性飼料類、ビール酵母などの酵母類、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム類、ビタミン類、油脂類、アミノ酸類、糖類などを配合することにより製造することができる。飼料の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養殖魚用飼料などに用いることができる。またペットフードとして用いる場合には、上記飲食品と同じ形態のものを用いても何ら問題がない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に示す。なお本発明はこの実施例によりその範囲を限定するものではない。
【００３４】
なお、実施例中、β−クリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含量の測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なった。すなわち、ＨＰＬＣ装置として、ＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）を用い、ＲｅｓｏｌｖｅＣ１８（φ３．９×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）カラムを接続し、メタノールを等量加えた試料を導入した。移動相には、メタノール：酢酸エチル＝７：３、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長４５０ｎｍで分析した。
【００３５】
実施例１
試薬のβ−クリプトキサンチン（四国八洲薬品社製）を購入し、ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）に溶解させた。溶解後、β−クリプトキサンチン濃度は吸光光度計にて４５２ｎｍにて測定を行い、β−クリプトキサンチン濃度が０．５、１、５、１０及び５０μＭとなるように調製して本発明のＲＡＲ活性化剤１とした。
【００３６】
試験例１〔各種受容体に対する活性化作用〕
試験例１−１〔ＲＡＲの活性化作用〕
ＲＡＲα活性測定キット（Ｍｙｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、以下のようにしてＲＡＲα活性化作用を試験した。すなわち、ＲＡＲαを付属の０．１Ｍ氷冷緩衝液Ａ１０ｍｌに混和し、このＲＡＲα溶液を１００μｌ／ウェルとなるように分注を行いプレートにＲＡＲαを固定化させる。２〜８℃で一晩静置して、氷冷緩衝液Ａを１２０μｌ／ウェル加え３回洗浄する。そこにＴＩＦ２−ＢＡＰ液を１００μｌ／ウェル添加し、本発明の本発明のＲＡＲ活性化剤１を１μｌ添加し、４℃で１時間静置する。その後、氷冷緩衝液Ｂを１２０μｌ／ウェルとなるように加え、３回洗浄し、基質液を１００μｌ／ウェルとなるように加え、３７℃で３〜５時間反応させる。０．５Ｎの水酸化ナトリウム２５μｌ／ウェルを加えて反応を終了させ、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。比較として、比較例１（β−カロテン）についてもあわせて試験した。
【００３７】
得られた結果を図１に示す。図１から明らかなように本発明のＲＡＲ活性化剤では濃度依存的に吸光度が増加していることから、ＲＡＲαの活性化作用を有していることが明らかになった。なお、比較例１（β−カロチン）にはＲＡＲα活性化作用が認められなかった。
【００３８】
比較例１
試薬のβ−カロテン（和光純薬社製）を購入し、ヘキサン（ナカライテスク社製）に溶解させた。溶解後、β−カロテン濃度は吸光光度計にて４７０ｎｍでの測定を行い、β‐クリプトキサンチンと同様の濃度になるよう調製し、試験を行った。
【００３９】
試験例１−２〔ＲＸＲαの活性化作用〕
ＲＡＲは体内ではレチノイドＸ受容体（以下、ＲＸＲという。）と２量体を作って遺伝子の活性を左右している。よってβ−クリプトキサンチンがＲＸＲαに結合し活性化するかを確認するために、ＲＸＲα活性測定キット（ＥｎＢｉｏＴｅｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて試験を行った。すなわち、Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＣｏｆａｃｔｏｒ溶液をプレートに１００μｌ／ウェルで分注し、プレートをシーリングし室温で１時間振とう反応させる。その後ウェルの溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを２００〜３００μｌ／ウェルとなるように加え、３回洗浄する。次に標的タンパク質であるＲＸＲαを含む溶液をウ９５μｌ／ウェルとなるように添加し、陽性コントロールであるＴｒｉｂｕｔｙｌｔｉｎ Ｃｌｏｒｉｄｅとサンプルを５μｌ／ウェルとなるように添加する。プレートをシーリングした後、室温にて１時間振とう反応をさせる。その後ウェルの溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ２００〜３００μｌ／ウェルにて３回洗浄を行う。次に活性型を認識する抗体を１００μｌ／ウェルとなるように添加し、プレートをシーリングした後室温で３０分間振とう反応をさせる。その後、抗体溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒにて２００〜３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。発色溶液を１００μｌずつ添加し、室温で２０分間反応後、１００μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）にて４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４０】
得られた結果を図２に示す。図２から明らかなようにβ−クリプトキサンチンはＲＸＲαの活性化作用を持たないことが分かった。
【００４１】
試験例１−３〔ＰＰＡＲγの活性化作用〕
また、ＲＡＲは体内ではＲＸＲと２量体を作って遺伝子の活性を左右すると同時にＰＰＡＲγもこのＲＸＲに結合することが出来る。よってβ−クリプトキサンチンがＰＰＡＲγに結合し活性化するかを確認するために、ＰＰＡＲγ活性測定キット（ＥｎＢｉｏＴｅｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、試験例２と同様な操作を行い、ＰＰＡＲγ活性化作用を試験した。なおキット付属の陽性コントロールであるＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅに関しても同様の操作を行い、活性化の有無の指標とした。
【００４２】
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、β−クリプトキサンチンはＰＰＡＲγの活性化作用を持たないことが分かった。
【００４３】
実施例２
温州みかんから果汁を絞った後の残さ（みかんジュース粕、水分率約９０％）８００ｇに飲食品加工用のペクチナーゼ酵素剤であるスミチームＰＸ（新日本化学工業株式会社製、ペクチナーゼ５，０００ユニット／ｇ、アラバナーゼ９０ユニット／ｇ）１ｇとセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素剤であるセルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト薬品工業株式会社製セルラーゼ３０，０００ユニット／ｇ）１ｇを添加し、よくかき混ぜて室温８時間静置反応を行った。この反応液を遠心分離して上清を除去した後、水を添加して攪拌し、再度遠心分離により上清を除去した。この沈殿物を凍結乾燥機により乾燥し、ミキサー型粉砕機で粉砕・粉末化した。本粉末中にはβ−クリプトキサンチン（フリー体換算）が０．５質量％が含まれていた。
得られた温州みかん粉末を重量の３倍量のエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮後の残存物を本発明のＲＡＲ活性化剤２とした。このＲＡＲ活性化剤２にはβ−クリプトキサンチンが１％含有されていた。
【００４４】
試験例２〔脂肪細胞の分化抑制作用〕
ＲＡＲとの結合が確認されたβ−クリプトキサンチンの脂肪への作用を確認するために以下の試験を行った。
【００４５】
マウス由来の脂肪前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣより分譲）へのβ−クリプトキサンチンの作用を確かめた。前駆脂肪細胞である３Ｔ３−Ｌ１に誘導用の培地（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（和光純薬製）含有ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬製）培地）を加えると脂肪細胞様に分化を起こし、細胞の内部に脂肪の蓄積を引き起こす。そこで３Ｔ３−Ｌ１に分化誘導時に本発明のＲＡＲ活性化剤１を添加し、分化時におけるβ−クリプトキサンチンの効果を確認した。またＲＡＲの活性化を抑制するアンタゴニストであるＬＥ５４０（和光純薬製）を同時に添加することでβ−クリプトキサンチンの脂肪細胞での効果がＲＡＲを介するかの確認を行った。
【００４６】
実験には２４ウェルの細胞培養用プラスチックプレートを使用し、これに３Ｔ３−Ｌ１を播種する。コンフルエントに達し２日後に分化誘導用の培地５００μｌに交換し、これを分化誘導操作とする。その後培地交換は２日に一度行って１０日まで培養を継続し、細胞中の油滴を染色することが出来るオイルレッド染色法にて脂肪細胞へ分化した割合を測定した。培養終了後、培地を除去し細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）溶液で洗浄する。その後１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液（ナカライテスク社製）を５００μｌ／ウェルとなるように加え、一晩４℃で固定を行う。固定後細胞を蒸留水５００μｌ／ウェルで洗浄し、そこへオイルレッド染色用のリピッドアッセイキット（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ社製）の染色液と蒸留水の混和物を加え、室温にて１５分間静置する。時間経過後、混合溶液を捨て、蒸留水で３回以上洗浄後、細胞を観察する。また細胞中の油滴に蓄積した染色液はキット付属のイソプロパノール ５００μｌ／ウェルを加え、室温１５分間の静置で抽出する。抽出液は９６ウェルプレートに２００μｌを移し、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）にて５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４７】
誘導培地およびβ−クリプトキサンチンおよび、ＬＥ５４０によって培養した結果を図４に示す。β−クリプトキサンチンが存在するとＰｉｏｇｔａｌｉｚｏｎｅによって誘導された脂肪細胞分化が抑制されることが分かった。また単独では効力を持たないＬＥ５４０を、Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅとβ−クリプトキサンチンと共培養をするとβ−クリプトキサンチンの効果を阻害できることが分かった。以上の結果よりβ−クリプトキサンチンの３Ｔ３−Ｌ１の分化抑制作用はＲＡＲを解していることが分かった。脂肪細胞の分化を抑制することで新規の脂肪細胞の合成を抑制し、抗肥満効果を持っていることが明らかとなった。
【００４８】
試験例３〔白血病細胞のアポトーシス誘導作用〕
急性前骨髄性白血病のモデル細胞として確立されているＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣより購入）はＲＡＲを活性化するオールトランスレチノイン酸によって、アポトーシスを起こすことが知られている。よって本発明のＲＡＲ活性化剤を用いて同様の実験を行い、アポトーシスを誘導できるかどうかを確かめた。
【００４９】
まず、２４ウェルプレートにＨＬ−６０を２．０×１０４個播種し、実施例２で得られたＲＡＲ活性化剤２及びβ−クリプトキサンチン、またはＲＡＲ活性化阻害剤であるＬＥ５４０を表記の濃度で添加した。添加後７２時間作用させ、細胞数の生存数を比較できるＣＣＫ８（同人化学製）を添加して３時間後に４５０ｎｍの波長を測定し、生存細胞数を割り出した。
【００５０】
実施例２で得られたＲＡＲ活性化剤２の結果を図５に示す。みかん抽出物濃度の上昇と共に細胞生存率が減少しており、みかん抽出物中にはＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘導活性があることが明らかとなった。
【００５１】
次にＲＡＲの活性化を阻害するＬＥ５４０を共作用させた結果を図６に示す。ＬＥ５４０の濃度の上昇に比例して細胞の生存数が上昇しており、みかん抽出物による細胞のアポトーシス誘導がＲＡＲを介したものだということが分かった。
【００５２】
次に試薬のβ−クリプトキサンチンを使用してＨＬ−６０の生存率を測定したものを図７に示す。β−クリプトキサンチンの濃度の上昇に比例して、細胞の生存率が減少しており、ＨＬ−６０細胞のアポトーシス誘導作用が明らかとなった。
【００５３】
実施例３
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料と配合割合でよく混合した後に成型し、オーブンで焼き上げてみかんフレーバーを有するビスケットを整合した。
原料 粉末組成物 ５％
小麦粉 ５０％
砂糖 ２０％
液卵 ５％
バター １８．５％
炭酸カルシウム １％
食塩 ０．５％
【００５４】
実施例４
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料との配合割合でよく混合した後、打錠し、錠剤を製造した。
原料 粉末組成物 ４０％
卵殻カルシウム ５％
結晶セルロース １０％
還元麦芽糖 ４３％
ショ糖脂肪酸エステル ２％
【００５５】
実施例５
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料との配合割合でよく混合し、養豚用飼料を製造した。ただし、ビタミン・ミネラル混合物は１ｋｇ中に硝酸チアミン１．５ｍｇ、リボフラビン１０．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン０．７５ｍｇ、ニコチン酸アミド９ｍｇ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１６．４ｍｇ、塩酸コリン８６．４ｍｇ、ビタミンＡ１０，０００ＩＵ、ビタミンＤ３２，０００ＩＵ、酢酸トコフェロール１０ｍｇ、Ｍｎ５０ｍｇ、Ｆｅ５０ｍｇ、Ｃｕ１０ｍｇ，Ｚｎ５０ｍｇ、Ｉ１ｍｇを含む
原料 粉末組成物 ２％
トウモロコシ ６５％
大豆粕 １６．５％
フスマ １５．２％
炭酸カルシウム ０．６％
リン酸二石灰 ０．０５％
塩酸ナトリウム ０．３％
ビタミン・ミネラル混合物 ０．３５％
【００５６】
実施例６
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２の１００ｇにエタノール１Ｌを加え、１時間攪拌した後にろ過してエタノール可溶成分（β−クリプトキサンチンなど）を抽出・分離した。この画分をエバポレーターでエタノールを留去・濃縮し、温州みかんエキスを得た。このエキス中にはβ−クリプトキサンチン（フリー体換算）が５％、β―カロテンが０．５％含まれていた。
このエキスと以下の原料をよく混合して１００ｍｌとし、ドリンク剤を製造した。
原料 温州みかんエキス １０ｍｇ
ブドウ糖加糖液糖 ５００ｍｇ
ニコチン酸アミド ２０ｍｇ
ビタミンＢ１硝酸酸 ５ｍｇ
ビタミンＢ２リン酸エステル ５ｍｇ
ビタミンＢ６ ５ｍｇ
無水カフェイン ５０ｍｇ
α―グルコシルヘスペリジン ５ｍｇ
【００５７】
実施例７
実施例６で製造したみかんエキスと以下の材料をよく混合して１００ｍｌとし、みかん風味のゼリーを製造した。
原料 温州みかんエキス ２０ｍｇ
グラニュー糖 ２０ｇ
ゼラチン ４ｇ
α―グルコシルヘスペリジン １０ｍｇ
【００５８】
実施例８
実施例６で製造した温州みかんエキスと以下の材料をよく混合し、β−クリプトキサンチンを強化した低カロリーアイスクリームを製造した。
原料 温州みかんエキス ２０ｍｇ
豆腐 ８０ｇ
牛乳 ３０ｍｌ
卵黄 ２５ｇ
コーンスターチ ２０ｇ
還元水あめ １０ｇ
スクラロース ４０ｍｇ
α―グルコシルヘスペリジン ２０ｍｇ
β−クリプトキサンチン ２ｍｇ
バニラエッセンス ０．０１ｍｇ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の活性化剤、ならびにそれを用いた飲食品、医薬品、および飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
内臓脂肪の蓄積は脂肪細胞が分泌している物質を変化させ、この変化が様々な疾病の原因となっている可能性が近年の研究で示唆されてきた。日本では近年、食の欧米化による摂取脂質の上昇や運動不足、ストレスなどによって肥満の人の割合が増えてきている。肥満は内臓脂肪の蓄積によって起こる。内臓脂肪は体の内臓周囲に存在し、皮下脂肪などに比べ、増加しやすく減少しやすい人体の恒常性をたもつ器官である。元来この内臓脂肪は血圧の調節や、血糖値の調整、脂質の調整などを行っているが、肥満状態に陥るとその調節機構に破綻をきたし、分泌する物質が変化することで体への脂肪の蓄積を促進し、血糖値や血圧、血中脂質などが上昇してメタボリックシンドロームと呼ばれる複合症状が発症することが知られている。
【０００３】
一方、脂肪に関する研究で核内受容体の一種であるレチノイン酸受容体（以下、ＲＡＲという。）を活性化すると脂肪の分化が抑制されることが明らかとなってきた（非特許文献１）。体内におけるＲＡＲの活性化因子として知られているのがレチノイン酸である。レチノイン酸はビタミンＡより合成されるレチノイドで、体内で細胞の分化やアポトーシス、細胞の成長の抑制などの効果が知られている物質である。これはＲＡＲを介した作用で、ＲＡＲにレチノイン酸が結合するとこれら関連の深い遺伝子の転写を促進することで効果を示す。
【０００４】
また、ＲＡＲにはサブタイプが存在し、α、β、γ型が知られている。α型はほとんどの組織で発現しているが、β、γ型は発現する組織が限定されていることが知られている。また一部の白血病では、染色体の相互転座によってキメラタンパク質が合成され、ＲＡＲの働きを失うと発病するものなども知られているが、これもレチノイン酸によってＲＡＲを活性化することで寛解できる場合があることが知られている。（非特許文献２）
以上のようにＲＡＲは、内臓脂肪の蓄積を含め様々な遺伝子発現に密接に関与しており、これを活性化することによって上記のような効果が得られる。しかしながらレチノイン酸を用いると、レチノイン酸を体外へ排出するタンパク質の発現が上昇し、レチノイン酸の効果が薄れる場合やレチノイン酸症候群といわれる発熱、呼吸困難、胸水貯留、肝不全、腎不全を伴う副作用を引き起こし、時には生命も失うことがある。またＲＡＲを活性化する合成のレチノイドであるカフェ酸誘導体（特許文献１）やＡＭ８０（商品名：タミバロテン、非特許文献３）も販売されているが、使用を続けた場合の安全性に問題がある。またレチノイン酸や合成レチノイドは生体に対する吸収性が低く、効果を得るためには投与量を増やさなければならない。
【０００５】
ところで、同様の効果を示す遺伝子の活性化としてぺルオキシソーム増殖剤応答性受容体（以下、ＰＰＡＲという。）の活性化が挙げられ、β−クリプトキサンチンのＰＰＡＲ活性化作用を報告したものもある（特許文献２）。また従来、クリプトキサンチンにＲＡＲ活性化作用があることについては全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０９２３２２
【特許文献２】特再表２００５／１１２９０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＳＣＨＷＡＲＺ ｅｔａｌ．， ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，１７，１５５２−１５６１（１９９７）
【非特許文献２】Ｏｔａｋｅ ｅｔａｌ．， Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，３１９−３２６（２００５）
【非特許文献３】ＦＵＫＡＳＡＷＡ ｅｔａｌ．， Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９（３），１１４〜１２６（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少量の摂取を連続して行うことでＲＡＲの活性化作用を長期間維持し、かつ既成品に見られるような副作用が無いＲＡＲ活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることによりＲＡＲを活性化しうることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第一は、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするＲＡＲ活性化剤を要旨とするものであり、好ましくは、ＲＡＲが、脂肪細胞、血管内皮細胞及び／又は白血病細胞の核内に存在するものであり、また好ましくは、クリプトキサンチンが、カンキツ類由来のものであり、さらに好ましくは、カンキツ類が、温州みかんであるものであり、また、好ましくは、肥満、動脈硬化又は白血病の少なくとも１つの予防又は治療のための前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤である。
【００１１】
本発明の第二は、カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化作剤の製造方法を要旨とするものであり、又は、カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤の製造方法を要旨とするものであり、又は、カンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出することを特徴とする前記のいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤の製造方法を要旨とするものである。
【００１２】
本発明の第三は、前記したいずれかに記載のＲＡＲ活性化剤を含有する飲食品、医薬品、又は飼料を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＲＡＲ活性化作用が高いクリプトキサンチンを有効成分としているため、少量の摂取で効果が得られ、血中に長期間存在しても副作用が無いことから安全性が高く、また、飲食品に配合した場合に配合設計が容易であるという作用効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＲＡＲα活性化作用の有無を示す図である。
【図２】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＲＸＲα活性化作用の有無を示す図である。
【図３】β−クリプトキサンチンの濃度依存的なＰＰＡＲγ活性化作用の有無を示す図である。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１の分化に対するβ−クリプトキサンチンとＬＥ５４０の作用を示す図である。
【図５】ＨＬ−６０細胞に対するみかん抽出物のアポトーシスの誘導作用を示す図である。
【図６】ＨＬ−６０細胞に対するみかん抽出物とＬＥ５４０を添加したときのアポトーシス誘導の抑制作用を示す図である。
【図７】ＨＬ−６０細胞に対するβ−クリプトキサンチンを使用したときのアポトーシス誘導作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。最初に第一の本発明であるＲＡＲ活性化剤について説明する。本発明で用いられるクリプトキサンチンは、α型でもβ型でもよく、特に限定されるものではない。また、本発明で用いられるクリプトキサンチンの誘導体としては、クリプトキサンチンから誘導される化合物であれば特に限定されず、例えばクリプトキサンチンの脂肪酸エステルなどが挙げられ、具体的には、パルミトイルエステル、ミリストイルエステル、ラウリルエステルなどの誘導体も含まれる。
【００１６】
本発明で用いられるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体は、その由来については特に限定されないが、中でもカンキツ類が好ましい。カンキツ類の果実とは、温州みかん、伊予柑、夏みかん、八朔、ポンカン、ネーブルオレンジ、レモン、バレンシアオレンジ、グレープフルーツ（これらと同等又は類似の品種のものも含む）などの果実をいい、その中でも温州みかんがクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含有率が高く望ましい。
【００１７】
本発明のＲＡＲ活性化剤においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチンを０．００００１質量％以上１００％以下、好ましくは０．０００１質量％以上５０％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上１０％以下の割合で含有しておればよい。
【００１８】
本発明のＲＡＲ活性化剤はクリプトキサンチンを含んでいれば良く、クリプトキサンチン以外の成分は、その効果を阻害しない限りいずれを用いても良い。例えば、オリーブオイルやごま油、サフラワー油などがクリプトキサンチンとの相溶性が高く好ましい。
【００１９】
本発明のＲＡＲ活性化剤はクリプトキサンチンを含有していれば、他のＲＡＲ活性化作用を有する物質と混合してもよく、例えば、合成レチノイドやフコキサンチンなどのカロテノイドなどが適宜含有されるが、副作用を起こさない程度であることが必要である。またその他の成分を添加物として含んでいても良く、特に限定されるものではないが、例えば、ビタミンＣなどの各種ビタミン類や、アミノ酸およびオリゴ糖、ミネラル等などが適宜含有されている。
【００２０】
以上のような本発明のＲＡＲ活性化剤は、経口で摂取することによりＲＡＲの活性化作用を有するものである。
【００２１】
本発明のＲＡＲ活性化剤を摂取する方法としては、本組成物を単独でそのまま摂取しても良いし、粉末、錠剤、顆粒、カプセル剤、ソフトカプセル剤、ゲル、ペースト、シロップ、懸濁液、乳化液、ドリンク剤などに加工して摂取してもよい。
【００２２】
次に、上記したＲＡＲ活性化剤の製造方法について説明する。そのような製造方法としては、カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を得る方法、カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を得る方法、及びカンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体とを含有する組成物を抽出する方法が挙げられる。以下、順次これらの方法について説明する。
【００２３】
カンキツ類植物を搾汁した残さ、すなわち搾汁粕は、カンキツ類の果実をインライン搾汁機、チョッパーヘルパー搾汁機、ブラウン搾汁機などにより搾汁した後、パドル型又はスクリュー型のフィニシャーなどでろ過又は篩別、または遠心分離によって果汁を調製した搾汁残渣を集めることにより調製される。
【００２４】
酵素処理は、カンキツ類植物の果実そのまま、あるいはすりつぶし、破砕、粉砕、加熱、脱水、乾燥などの物理的処理を行なったもの、さらに上記のようにして得られる搾汁残さに対して酵素を添加することにより行なわれる。
【００２５】
酵素処理使用する酵素としては、カンキツ類植物に含まれる有機物、特に細胞壁などを構成する生体高分子などを分解できることが出来るものであれば、特に限定されず、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、プロテアーゼ、ペプチターゼ、リパーゼ、マレーションエンザイム（細胞壁崩壊酵素）などが用いられる。これらの中でも、糖質加水分解酵素であるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、マレーションエンザイムが、有効成分であるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体含有量を高める効率が高く望ましい。
【００２６】
添加する酵素剤は、これらの精製酵素を用いても良いし、これらの活性を示す微生物菌体や培養物、これらの粗精製物を用いても良い。これらの酵素は単独で用いても良いし、２種類以上の酵素を混合して用いてもよい。添加する酵素の量は特に限定されず、酵素の反応性に応じて添加すればよい。例えば、ペクチナーゼを用いる場合であれば、被処理物１００ｇに対して１〜１００，０００ユニットであることが好ましく、更に１０〜１０，０００ユニットであることが好ましい。
【００２７】
上記酵素を添加した後、攪拌などにより酵素と被処理物を均一に混合して酵素反応を進行させる。このときの反応温度としては酵素が失活せず、かつ腐敗の起こりにくい条件、またクリプトキサンチン及びその誘導体が喪失しない条件化で行うことが望ましい。具体的には、温度は０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、更に好ましくは０〜７０℃が良い。反応のｐＨとしては酵素の至適条件下で行うのが望ましいことは言うまでもなく、ｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ２．５〜８とするのが良い。反応時間は使用する搾汁残渣と酵素の量に依存するが、通常１〜４８時間に設定するのが作業上好ましい。反応の際、この反応物を攪拌しながら反応を行っても良いし、静置反応でも良い。
【００２８】
酵素処理終了後、酵素処理された反応物をそのまま本発明のＲＡＲ活性化剤として用いてもよいし、何らかの加工を行ってもよい。具体的には、反応物を固液分離した残さ、あるいはその残さを乾燥させたもの、固液分離せず反応物をそのまま乾燥させたものなどを用いてもよい。また溶剤や水、超臨界二酸化炭素などを用いて成分などを抽出したものを用いてもよい。更に、引き続いて不純物類を取り除いてもよい。不純物の除去方法としては、例えば水洗浄、有機溶媒洗浄、シリカゲルカラムや樹脂カラム、逆相カラムなどを通す方法、活性炭処理、極性の異なる溶媒による分配、再結晶法、真空蒸留法などが挙げられる。特に酵素処理反応物を固液分離した後、固形分に再度水を添加・攪拌した後に固液分離する水洗浄は、酵素処理で生成した糖などの反応性生物を容易に除去できるため好ましい方法である。
【００２９】
カンキツ類植物及び／又は上述したカンキツ類植物の酵素処理物に、有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出する方法において用いられる溶剤としては、原料であるカンキツ類又はその加工品よりＲＡＲ活性化作用を持つ画分が得られ、本発明を損なうものでなければいかなるものでもよい。また、一種類の溶剤を単独で用いても複数の溶剤を混合して用いてもよい。そのような溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、へキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ピリジン類等が使用できる。これらのうち、エタノールは抽出されるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の抽出効率が高く好ましい。また、これらの有機溶媒で抽出する際には抽出効率を上げるために、例えば水、界面活性剤等の添加物を本発明効果を損なわない範囲で加えることが出来る。さらに、上記有機溶媒による抽出のほか、超臨界抽出法も利用することができる。
【００３０】
本発明の別の発明は、上記したようなＲＡＲ活性化剤を含有する飲食品、医薬品、及び飼料である。医薬品としては、注射剤、輸液、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、懸濁剤、シロップ剤、内服液剤、トローチ剤、乳剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、座剤、経腸利用剤などの形態で摂取することが出来る。
【００３１】
また、本発明の飲食品とは、一般飲食品に加えて、サプリメント、食品添加物、特定保健用食品、健康食品、機能性食品、医薬部外品など、すべての食品及び／又は飲料が含まれる。該食品及び／又は飲料は特に限定されるものではなく、例えば上記の医薬品的な形態のものに加え、パン、うどん、そば、ご飯等、主食となるもの、チーズ、ウインナー、ソーセージ、ハム、魚肉加工品等の食品類、アイスクリーム、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、チューインガム、ヨーグルト、グミ、チョコレート、ビスケットなどの菓子類、ジャムなどの調味料類、果汁飲料、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンク、コーヒー飲料、茶、牛乳などの飲料が挙げられる。
【００３２】
本発明の飼料とは、本発明のＲＡＲ活性化剤に、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦などの穀類、ふすま、米ぬかなどのぬか類、コーングルテンミール、コーンジャムミールなどの粕類、脱脂粉乳、ホエー、魚類、骨粉などの動物性飼料類、ビール酵母などの酵母類、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム類、ビタミン類、油脂類、アミノ酸類、糖類などを配合することにより製造することができる。飼料の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養殖魚用飼料などに用いることができる。またペットフードとして用いる場合には、上記飲食品と同じ形態のものを用いても何ら問題がない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に示す。なお本発明はこの実施例によりその範囲を限定するものではない。
【００３４】
なお、実施例中、β−クリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含量の測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なった。すなわち、ＨＰＬＣ装置として、ＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）を用い、ＲｅｓｏｌｖｅＣ１８（φ３．９×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）カラムを接続し、メタノールを等量加えた試料を導入した。移動相には、メタノール：酢酸エチル＝７：３、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長４５０ｎｍで分析した。
【００３５】
実施例１
試薬のβ−クリプトキサンチン（四国八洲薬品社製）を購入し、ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）に溶解させた。溶解後、β−クリプトキサンチン濃度は吸光光度計にて４５２ｎｍにて測定を行い、β−クリプトキサンチン濃度が０．５、１、５、１０及び５０μＭとなるように調製して本発明のＲＡＲ活性化剤１とした。
【００３６】
試験例１〔各種受容体に対する活性化作用〕
試験例１−１〔ＲＡＲの活性化作用〕
ＲＡＲα活性測定キット（Ｍｙｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、以下のようにしてＲＡＲα活性化作用を試験した。すなわち、ＲＡＲαを付属の０．１Ｍ氷冷緩衝液Ａ１０ｍｌに混和し、このＲＡＲα溶液を１００μｌ／ウェルとなるように分注を行いプレートにＲＡＲαを固定化させる。２〜８℃で一晩静置して、氷冷緩衝液Ａを１２０μｌ／ウェル加え３回洗浄する。そこにＴＩＦ２−ＢＡＰ液を１００μｌ／ウェル添加し、本発明の本発明のＲＡＲ活性化剤１を１μｌ添加し、４℃で１時間静置する。その後、氷冷緩衝液Ｂを１２０μｌ／ウェルとなるように加え、３回洗浄し、基質液を１００μｌ／ウェルとなるように加え、３７℃で３〜５時間反応させる。０．５Ｎの水酸化ナトリウム２５μｌ／ウェルを加えて反応を終了させ、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。比較として、比較例１（β−カロテン）についてもあわせて試験した。
【００３７】
得られた結果を図１に示す。図１から明らかなように本発明のＲＡＲ活性化剤では濃度依存的に吸光度が増加していることから、ＲＡＲαの活性化作用を有していることが明らかになった。なお、比較例１（β−カロチン）にはＲＡＲα活性化作用が認められなかった。
【００３８】
比較例１
試薬のβ−カロテン（和光純薬社製）を購入し、ヘキサン（ナカライテスク社製）に溶解させた。溶解後、β−カロテン濃度は吸光光度計にて４７０ｎｍでの測定を行い、β‐クリプトキサンチンと同様の濃度になるよう調製し、試験を行った。
【００３９】
試験例１−２〔ＲＸＲαの活性化作用〕
ＲＡＲは体内ではレチノイドＸ受容体（以下、ＲＸＲという。）と２量体を作って遺伝子の活性を左右している。よってβ−クリプトキサンチンがＲＸＲαに結合し活性化するかを確認するために、ＲＸＲα活性測定キット（ＥｎＢｉｏＴｅｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて試験を行った。すなわち、Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＣｏｆａｃｔｏｒ溶液をプレートに１００μｌ／ウェルで分注し、プレートをシーリングし室温で１時間振とう反応させる。その後ウェルの溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを２００〜３００μｌ／ウェルとなるように加え、３回洗浄する。次に標的タンパク質であるＲＸＲαを含む溶液をウ９５μｌ／ウェルとなるように添加し、陽性コントロールであるＴｒｉｂｕｔｙｌｔｉｎ Ｃｌｏｒｉｄｅとサンプルを５μｌ／ウェルとなるように添加する。プレートをシーリングした後、室温にて１時間振とう反応をさせる。その後ウェルの溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ２００〜３００μｌ／ウェルにて３回洗浄を行う。次に活性型を認識する抗体を１００μｌ／ウェルとなるように添加し、プレートをシーリングした後室温で３０分間振とう反応をさせる。その後、抗体溶液を除去し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒにて２００〜３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。発色溶液を１００μｌずつ添加し、室温で２０分間反応後、１００μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）にて４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４０】
得られた結果を図２に示す。図２から明らかなようにβ−クリプトキサンチンはＲＸＲαの活性化作用を持たないことが分かった。
【００４１】
試験例１−３〔ＰＰＡＲγの活性化作用〕
また、ＲＡＲは体内ではＲＸＲと２量体を作って遺伝子の活性を左右すると同時にＰＰＡＲγもこのＲＸＲに結合することが出来る。よってβ−クリプトキサンチンがＰＰＡＲγに結合し活性化するかを確認するために、ＰＰＡＲγ活性測定キット（ＥｎＢｉｏＴｅｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、試験例２と同様な操作を行い、ＰＰＡＲγ活性化作用を試験した。なおキット付属の陽性コントロールであるＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅに関しても同様の操作を行い、活性化の有無の指標とした。
【００４２】
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、β−クリプトキサンチンはＰＰＡＲγの活性化作用を持たないことが分かった。
【００４３】
実施例２
温州みかんから果汁を絞った後の残さ（みかんジュース粕、水分率約９０％）８００ｇに飲食品加工用のペクチナーゼ酵素剤であるスミチームＰＸ（新日本化学工業株式会社製、ペクチナーゼ５，０００ユニット／ｇ、アラバナーゼ９０ユニット／ｇ）１ｇとセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素剤であるセルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト薬品工業株式会社製セルラーゼ３０，０００ユニット／ｇ）１ｇを添加し、よくかき混ぜて室温８時間静置反応を行った。この反応液を遠心分離して上清を除去した後、水を添加して攪拌し、再度遠心分離により上清を除去した。この沈殿物を凍結乾燥機により乾燥し、ミキサー型粉砕機で粉砕・粉末化した。本粉末中にはβ−クリプトキサンチン（フリー体換算）が０．５質量％が含まれていた。
得られた温州みかん粉末を重量の３倍量のエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮後の残存物を本発明のＲＡＲ活性化剤２とした。このＲＡＲ活性化剤２にはβ−クリプトキサンチンが１％含有されていた。
【００４４】
試験例２〔脂肪細胞の分化抑制作用〕
ＲＡＲとの結合が確認されたβ−クリプトキサンチンの脂肪への作用を確認するために以下の試験を行った。
【００４５】
マウス由来の脂肪前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣより分譲）へのβ−クリプトキサンチンの作用を確かめた。前駆脂肪細胞である３Ｔ３−Ｌ１に誘導用の培地（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（和光純薬製）含有ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬製）培地）を加えると脂肪細胞様に分化を起こし、細胞の内部に脂肪の蓄積を引き起こす。そこで３Ｔ３−Ｌ１に分化誘導時に本発明のＲＡＲ活性化剤１を添加し、分化時におけるβ−クリプトキサンチンの効果を確認した。またＲＡＲの活性化を抑制するアンタゴニストであるＬＥ５４０（和光純薬製）を同時に添加することでβ−クリプトキサンチンの脂肪細胞での効果がＲＡＲを介するかの確認を行った。
【００４６】
実験には２４ウェルの細胞培養用プラスチックプレートを使用し、これに３Ｔ３−Ｌ１を播種する。コンフルエントに達し２日後に分化誘導用の培地５００μｌに交換し、これを分化誘導操作とする。その後培地交換は２日に一度行って１０日まで培養を継続し、細胞中の油滴を染色することが出来るオイルレッド染色法にて脂肪細胞へ分化した割合を測定した。培養終了後、培地を除去し細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）溶液で洗浄する。その後１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液（ナカライテスク社製）を５００μｌ／ウェルとなるように加え、一晩４℃で固定を行う。固定後細胞を蒸留水５００μｌ／ウェルで洗浄し、そこへオイルレッド染色用のリピッドアッセイキット（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ社製）の染色液と蒸留水の混和物を加え、室温にて１５分間静置する。時間経過後、混合溶液を捨て、蒸留水で３回以上洗浄後、細胞を観察する。また細胞中の油滴に蓄積した染色液はキット付属のイソプロパノール ５００μｌ／ウェルを加え、室温１５分間の静置で抽出する。抽出液は９６ウェルプレートに２００μｌを移し、プレートリーダー（大日本住友製薬社製）にて５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４７】
誘導培地およびβ−クリプトキサンチンおよび、ＬＥ５４０によって培養した結果を図４に示す。β−クリプトキサンチンが存在するとＰｉｏｇｔａｌｉｚｏｎｅによって誘導された脂肪細胞分化が抑制されることが分かった。また単独では効力を持たないＬＥ５４０を、Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅとβ−クリプトキサンチンと共培養をするとβ−クリプトキサンチンの効果を阻害できることが分かった。以上の結果よりβ−クリプトキサンチンの３Ｔ３−Ｌ１の分化抑制作用はＲＡＲを解していることが分かった。脂肪細胞の分化を抑制することで新規の脂肪細胞の合成を抑制し、抗肥満効果を持っていることが明らかとなった。
【００４８】
試験例３〔白血病細胞のアポトーシス誘導作用〕
急性前骨髄性白血病のモデル細胞として確立されているＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣより購入）はＲＡＲを活性化するオールトランスレチノイン酸によって、アポトーシスを起こすことが知られている。よって本発明のＲＡＲ活性化剤を用いて同様の実験を行い、アポトーシスを誘導できるかどうかを確かめた。
【００４９】
まず、２４ウェルプレートにＨＬ−６０を２．０×１０４個播種し、実施例２で得られたＲＡＲ活性化剤２及びβ−クリプトキサンチン、またはＲＡＲ活性化阻害剤であるＬＥ５４０を表記の濃度で添加した。添加後７２時間作用させ、細胞数の生存数を比較できるＣＣＫ８（同人化学製）を添加して３時間後に４５０ｎｍの波長を測定し、生存細胞数を割り出した。
【００５０】
実施例２で得られたＲＡＲ活性化剤２の結果を図５に示す。みかん抽出物濃度の上昇と共に細胞生存率が減少しており、みかん抽出物中にはＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘導活性があることが明らかとなった。
【００５１】
次にＲＡＲの活性化を阻害するＬＥ５４０を共作用させた結果を図６に示す。ＬＥ５４０の濃度の上昇に比例して細胞の生存数が上昇しており、みかん抽出物による細胞のアポトーシス誘導がＲＡＲを介したものだということが分かった。
【００５２】
次に試薬のβ−クリプトキサンチンを使用してＨＬ−６０の生存率を測定したものを図７に示す。β−クリプトキサンチンの濃度の上昇に比例して、細胞の生存率が減少しており、ＨＬ−６０細胞のアポトーシス誘導作用が明らかとなった。
【００５３】
実施例３
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料と配合割合でよく混合した後に成型し、オーブンで焼き上げてみかんフレーバーを有するビスケットを整合した。
原料 粉末組成物 ５％
小麦粉 ５０％
砂糖 ２０％
液卵 ５％
バター １８．５％
炭酸カルシウム １％
食塩 ０．５％
【００５４】
実施例４
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料との配合割合でよく混合した後、打錠し、錠剤を製造した。
原料 粉末組成物 ４０％
卵殻カルシウム ５％
結晶セルロース １０％
還元麦芽糖 ４３％
ショ糖脂肪酸エステル ２％
【００５５】
実施例５
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２を以下の原料との配合割合でよく混合し、養豚用飼料を製造した。ただし、ビタミン・ミネラル混合物は１ｋｇ中に硝酸チアミン１．５ｍｇ、リボフラビン１０．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン０．７５ｍｇ、ニコチン酸アミド９ｍｇ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１６．４ｍｇ、塩酸コリン８６．４ｍｇ、ビタミンＡ１０，０００ＩＵ、ビタミンＤ３２，０００ＩＵ、酢酸トコフェロール１０ｍｇ、Ｍｎ５０ｍｇ、Ｆｅ５０ｍｇ、Ｃｕ１０ｍｇ，Ｚｎ５０ｍｇ、Ｉ１ｍｇを含む
原料 粉末組成物 ２％
トウモロコシ ６５％
大豆粕 １６．５％
フスマ １５．２％
炭酸カルシウム ０．６％
リン酸二石灰 ０．０５％
塩酸ナトリウム ０．３％
ビタミン・ミネラル混合物 ０．３５％
【００５６】
実施例６
実施例２で製造したＲＡＲ活性化剤２の１００ｇにエタノール１Ｌを加え、１時間攪拌した後にろ過してエタノール可溶成分（β−クリプトキサンチンなど）を抽出・分離した。この画分をエバポレーターでエタノールを留去・濃縮し、温州みかんエキスを得た。このエキス中にはβ−クリプトキサンチン（フリー体換算）が５％、β―カロテンが０．５％含まれていた。
このエキスと以下の原料をよく混合して１００ｍｌとし、ドリンク剤を製造した。
原料 温州みかんエキス １０ｍｇ
ブドウ糖加糖液糖 ５００ｍｇ
ニコチン酸アミド ２０ｍｇ
ビタミンＢ１硝酸酸 ５ｍｇ
ビタミンＢ２リン酸エステル ５ｍｇ
ビタミンＢ６ ５ｍｇ
無水カフェイン ５０ｍｇ
α―グルコシルヘスペリジン ５ｍｇ
【００５７】
実施例７
実施例６で製造したみかんエキスと以下の材料をよく混合して１００ｍｌとし、みかん風味のゼリーを製造した。
原料 温州みかんエキス ２０ｍｇ
グラニュー糖 ２０ｇ
ゼラチン ４ｇ
α―グルコシルヘスペリジン １０ｍｇ
【００５８】
実施例８
実施例６で製造した温州みかんエキスと以下の材料をよく混合し、β−クリプトキサンチンを強化した低カロリーアイスクリームを製造した。
原料 温州みかんエキス ２０ｍｇ
豆腐 ８０ｇ
牛乳 ３０ｍｌ
卵黄 ２５ｇ
コーンスターチ ２０ｇ
還元水あめ １０ｇ
スクラロース ４０ｍｇ
α―グルコシルヘスペリジン ２０ｍｇ
β−クリプトキサンチン ２ｍｇ
バニラエッセンス ０．０１ｍｇ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項２】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）が、脂肪細胞、血管内皮細胞及び／又は白血病細胞の核内に存在するものである請求項１記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項３】
クリプトキサンチンが、カンキツ類由来のものである請求項１又は２記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項４】
カンキツ類が、温州みかんである請求項３記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項５】
肥満、動脈硬化又は白血病の少なくとも１つの予防又は治療のための請求項１〜４のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項６】
カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化作剤の製造方法。
【請求項７】
カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸（ＲＡＲ）活性化剤の製造方法。
【請求項８】
カンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸（ＲＡＲ）活性化剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する医薬品。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する飼料。
【請求項１】
クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項２】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）が、脂肪細胞、血管内皮細胞及び／又は白血病細胞の核内に存在するものである請求項１記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項３】
クリプトキサンチンが、カンキツ類由来のものである請求項１又は２記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項４】
カンキツ類が、温州みかんである請求項３記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項５】
肥満、動脈硬化又は白血病の少なくとも１つの予防又は治療のための請求項１〜４のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤。
【請求項６】
カンキツ類植物を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化作剤の製造方法。
【請求項７】
カンキツ類植物に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得ることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸（ＲＡＲ）活性化剤の製造方法。
【請求項８】
カンキツ類植物に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のレチノイン酸（ＲＡＲ）活性化剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する医薬品。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性化剤を含有する飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２０２５５３（Ｐ２０１０−２０２５５３Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４８５１１（Ｐ２００９−４８５１１）
【出願日】平成２１年３月２日（２００９．３．２）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２日（２００９．３．２）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
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