レンチウイルスベクターおよびその使用
本発明は、ウイルス粒子および／または真核細胞の表面上にて融合ポリペプチドをコードする核酸を発現し得るポリヌクレオチドベクターを含む構築物に関する。本発明の方法は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターを使用する。この融合タンパク質は、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の一部、および膜貫通部分を含有する。必要に応じて、この融合タンパク質はさらに、候補ポリペプチドの発現をウイルス粒子表面（あるいはエンベロープ、ｅｎｖ）上へ向ける、エンベロープ組み込みシグナルを含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス粒子および／または哺乳動物細胞の表面上における候補ポリペプチドの発現を提供する組成物、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
抗体ライブラリは、目的の抗体の同定、および新規の抗体−抗原複合体のスクリーニングに有用である。例えば、Ｍｅｈｔａ Ｉ、およびＭｅｈｔａ ＩＩ単鎖抗体ライブラリは、２７０億もの非免疫性ヒト抗体を包含する。これまでこのようなライブラリは、ファージディスプレイを用いてスクリーニングされていた。抗体表示法をファージ提示から哺乳動物提示へ適応させるには、新規のベクター送達系が必要となる。
【０００３】
外来核酸を送達するのに用いられてきたベクターとしては、ＤＮＡウイルスベクターおよびＲＮＡウイルスベクターの双方が挙げられる。例えば、ＤＮＡベクターとしては、オルトポックスベクターまたはアビポックスベクターのような水痘ベクター（例えば米国特許第５，６５６，４６５号を参照のこと）、単純疱疹ウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクター等のヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；アデノウイルスベクター（Ｌｅｇａｌ Ｌａｓａｌｌｅら、Ｓｃｉ．２５９−９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：２００４（１９９５））；およびアデノ関連ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．， ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照のこと）が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から得られるベクターが含まれる（米国特許第５，６６５，５７７号を参照のこと）。
【０００４】
様々なベクターが、自身が特定の利用法に所望されるものとなる特性を有している。例えば、レトロウイルスベクターは、宿主に感染させるために使用することができ、且つ高い効率で宿主細胞内に組み込まれる遺伝物質を有している。そのようなベクターの例は、修飾モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であり、元々は、レトロウイルスゲノムの全体がパッケージングされるのを防ぐために削除されたパッケージング配列を有していた。しかしながら、このレトロウイルスは休止細胞には形質導入しない。加えて、代表的に、特異的なレセプターを介して細胞に入るレトロウイルスが多いことから、その特異的なレセプターが細胞上に存在しないかまたは十分な数では存在しない場合、感染は不可能となるかまたは効率が悪い。また、組換えＭＭＬＶを産生する細胞株から野生型ウイルスが発生した後（すなわち、復帰変異）には、安全性の問題もまた生じる。
【０００５】
アデノウイルス由来のベクターは、広範な細胞に感染することができる。しかしながら、転移された遺伝物質は組み込まれない。故に、あらゆる発現あるいはスクリーニングの操作は、転移された遺伝物質がエピソーム性であるときに限られる。したがって、比較的短い期間にしか研究を行うことができない。
【０００６】
最近、霊長類レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））を基礎とするもののような、レンチウイルスベクターに焦点が当てられている。偽型ベクター（すなわち、別種由来のエンベロープタンパク質が使用されるベクター）を使用することにより、感染させる細胞の種類に基づいて特定のエンベロープタンパク質を選択することによって、広範囲な細胞種に感染させる際に生じる問題を克服することができる。加えて、ＨＩＶのようなレンチウイルスにおいて見られる複雑な遺伝子スプライシング様式の観点から、ＨＩＶコアのようなレンチウイルスコアを有する多価ベクター（例えば、多数の遺伝子を発現するもベクター）が、目的の核酸をより効率的に発現することが期待される。
【０００７】
大規模な哺乳動物への形質移入を実行するための、霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶ）を基礎とするもののようなレンチウイルスベクターの使用により、レトロウイルスベクターに勝るいくつかの利点が得られる。抗体をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、インビボおよびインビトロにて、静止期細胞および増殖期細胞の双方に感染することができる（非特許文献１；非特許文献２を参照のこと）。加えて、レンチウイルスベクターによって異種由来のペプチドの構成的発現または誘導発現が可能であり、それによって、培養物中および動物体内での抗体の産生が提供される。
【０００８】
近年、代表的にモノクローナル抗体またはペプチドから構成される、大規模ライブラリの開発に注意が向けられている。例えば、抗原結合抗体フラグメントが、線状ファージの表面上にて発現されており（非特許文献３）、ファージディスプレイライブラリと呼ばれる、例えば１０７個以上の抗体のような大型ライブラリを産生するのに使用されている。ファージディスプレイライブラリでは、ＦｄあるいはＦｖ領域のカルボキシル末端がファージのコートタンパク質のフラグメントに繋ぎとめられ、これによって、例えばＦａｂフラグメントをそのファージの表面上に固定する。抗体提示系は、Ｅ．ｃｏｌｉ（非特許文献４）、酵母（非特許文献５）およびＳｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス感染のような、非哺乳動物細胞において記載されている。ファージまたは非哺乳動物細胞の表面上にて抗体を発現させることができるという利点にも関わらず、発現される抗体は、その結合活性を完全には保持していない可能性がしばしばあることが認識されている（非特許文献６；非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｒｅｉｓｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：１５２６６−１５２７１
【非特許文献２】Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７２：２６３−２６７
【非特許文献３】Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１３１５
【非特許文献４】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９９，１２：６１３−６２１
【非特許文献５】Ｓｈｕｓｔａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００，１８：７５４−７５９
【非特許文献６】Ｃｈｏｅら、Ｃｅｌｌ ２００３，１１４；１６１−１７０
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇら、ＰＮＡＳ ２００４，１０１：２７０６−２７１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（本発明の要旨）
本発明は、抗体またはそのフラグメントのような候補ポリペプチドの、哺乳動物細胞またはウイルス粒子の表面上での提示を提供する組成物および方法の発見に、一部基づいている。
【００１０】
本発明の方法は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターを使用する。この融合タンパク質は、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の一部、および膜貫通部分を含有する。必要に応じて、この融合タンパク質はさらに、候補ポリペプチドの発現をウイルス粒子表面（あるいはエンベロープ、ｅｎｖ）上へ向ける、エンベロープ組み込みシグナルを含有する。
【００１１】
適切な候補ポリペプチドとしては、モノクローナル抗体可変領域、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、あるいはＦａｂ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。候補ポリペプチドは、ヒト単鎖抗体ライブラリ（例えばＭｅｈｔａＩあるいはＭｅｈｔａＩＩライブラリ等）、天然ペプチドライブラリ、あるいはランダムペプチドライブラリのようなライブラリに由来し得る。
【００１２】
免疫グロブリン分子の一部は、Ｉｇ分子の定常領域部分またはその機能的フラグメントを含有する。例えば、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有し得る。
【００１３】
膜貫通部分としては、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分が挙げられる。例えば、膜貫通部分は、レンチウイルスｇｐ４１、ＣＤ２８、ＣＤ８またはＩｇＭ膜貫通部分あるいはその機能的フラグメントである。
【００１４】
融合タンパク質は、構成性プロモーターあるいは誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。構成性プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、またはＣＤＫ９が挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、または温度誘導性プロモーターが挙げられる。
【００１５】
種々の局面において、ウイルス提示ベクターは、選択マーカーまたは毒素のような一つ以上のさらなる核酸配列を含有する。選択マーカーとしては、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼファミリーのメンバー、またはエクオリンファミリーのメンバーが挙げられる。
【００１６】
ウイルス提示ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から得られるベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
パッケージング細胞が、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する１つ以上のウイルス粒子を産生するような条件下で、パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターとを接触させることによって、候補ポリペプチドが哺乳動物細胞の表面上に提示される。必要に応じて、この候補ポリペプチドは、ウイルス粒子の表面上で発現される。哺乳動物細胞の表面上で融合タンパク質が提示されるよう、融合タンパク質が哺乳動物細胞内で発現するのに十分な条件下で、ウイルス粒子と哺乳動物提示細胞とを接触させる。
【００１８】
パッケージング細胞は、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、および／またはｒｅｖのようなウイルス構成遺伝子を１つ以上含有するヘルパーベクター、ならびにｅｎｖ遺伝子（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された機能性エンベロープタンパク質をコードする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子）を含有するエンベロープベクターを含み得る。
【００１９】
パッケージング細胞としては、例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、例えば、ラモス−バーキットリンパ腫細胞のようなヒトＢ細胞株が挙げられる。他の実施形態では、細胞は、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えばＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞である。
【００２０】
標的抗原に結合する候補ペプチドは、哺乳動物提示細胞一つ一つが細胞表面上に提示される単一種の候補ポリペプチドを産生するような条件下で、ウイルス粒子と１つ以上の哺乳動物提示細胞とを接触させることによって同定される。その哺乳動物細胞の表面上に１種類の候補ポリペプチドを提示する哺乳動物細胞を、候補ポリペプチドを発現しない哺乳動物細胞から単離する（すなわち、分別する）。分別された哺乳動物細胞を標的抗原に接触させて、標的抗原に結合する細胞を選別する。この分別工程および抗原結合工程は、１回以上繰り返される。本発明の様々な局面では、この哺乳動物細胞を漸減する濃度の標的抗原に接触させ、それによって標的抗原に結合する候補ポリペプチドを濃縮して親和性成熟させる。
【００２１】
哺乳動物提示細胞は、さらに、クラゲＡｅｑｕｏｒｉａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のエクオリンタンパク質のような、カルシウム感受性生物発光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含有し得る。本発明の実施形態において、この融合タンパク質は、標的抗原と結合したときに細胞内カルシウムを上昇させ、これによってエクオリンを発光させる（Ｒｉｄｅｒら、２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：２１３−１５を参照のこと）。細胞内カルシウムの上昇を促すため、免疫グロブリンレセプター（例えば免疫グロブリンＩｇＭレセプター）の膜貫通領域および細胞内領域が含まれる。
【００２２】
可溶性候補ポリペプチドは、膜貫通部分をｌｏｘＰ部位に隣接させて、ウイルス提示ベクター内に誘導性プロモーターに作動可能に連結させたｃｒｅリコンビナーゼをコードする第２核酸配列を挿入することによって作製される。例示的なｌｏｘＰ部位としては、ポリペプチドＩＴＳＹＳＩＨＹＴＫＬ（配列番号１３）として発現される、ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡ（配列番号１２）が挙げられる。
【００２３】
本発明はさらに、本発明の任意のウイルス提示ベクター；機能性エンベロープタンパク質をコードする、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含むエンベロープベクター；ならびに１つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、を含むベクター系を提供する。必要に応じて、このベクター系は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むｃｒｅベクターを含み得る。
【００２４】
本発明はまた、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の一部、およびｌｏｘＰ部位に隣接した膜貫通部分を含有する融合タンパク質をコードする核酸、毒素をコードする核酸、ｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする配列、侵入部分をコードする核酸を含有する、ウイルス標的ベクターを提供する。侵入部分は、融合活性を有するウイルスエンベロープタンパク質である。好ましくは、この侵入部分は結合活性を有さない。例えば、この侵入部分は、結合能欠損型インフルエンザ血球凝集素タンパク質またはそのフラグメント、あるいはＶＳＶ−Ｇタンパク質またはそのフラグメントである。必要に応じて、ウイルス標的ベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列を含有し得る。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価な方法または物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適した方法および物質が以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、その全体が参考として援用される。対立する場合は、定義も含めて本明細書が優先される。さらに、物質、方法および実施例は単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明と特許請求の範囲から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ウイルス粒子（即ちビリオン）、または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）の表面上で候補ポリペプチドを提示させるための方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、候補ポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターを使用する。パッケージング細胞が、融合タンパク質をコードする核酸を含有し、かつウイルス粒子の表面上に候補ポリペプチドを提示するウイルス粒子を１つ以上産生するように、このベクターはパッケージング細胞に導入される。候補ポリペプチドがその細胞の表面上に提示されるように、哺乳動物細胞が融合タンパク質を発現するよう（即ち、一過的または安定に）、哺乳動物提示細胞をこのウイルス粒子に接触させる。
【００２８】
哺乳動物細胞表面上での候補ポリペプチドの発現には、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、およびＳｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス感染株のような他の発現様式に比べて、多くの利点が存在する。例えば、哺乳動物細胞内に導入された候補ポリペプチドは、これら他の発現系では起こらない、グルコシル化および硫酸化のような翻訳後修飾を含有する。さらに、シャペロンタンパク質および正確なタンパク質折り畳みを促進する他の成分を欠く細胞と比較して、哺乳動物細胞において折り畳みの正確性が増す。さらに、この候補ポリペプチドには、細菌、酵母、あるいはバキュロウイルスの夾雑物がない。
【００２９】
本発明の方法は、例えば、標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定するために、ポリペプチドをコードする核酸を含有するライブラリをスクリーニングするのに有用である。
【００３０】
（ウイルス提示ベクター）
本発明のウイルス提示ベクターは、構成的にかまたは誘導によって、融合タンパク質を発現することのできる核酸ベクターである。例えば、ウイルス提示ベクターとしては、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターには、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。
【００３１】
好ましいレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１から得られる。ＨＩＶ−１ベクターは、インビトロ（Ｊ．Ｒｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１５２６６−１５２７１（１９９６）を参照のこと）およびインビボ（Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（１９９６）を参照のこと）にて、非分裂細胞を定常的に形質転換することが例証されている。従って、これらのベクターは、長期的な発現が可能である。適切なウイルスとこれを感染させる細胞の一覧は、米国特許出願第２００３／００４４９８１号（この内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される）にて提供されている。
【００３２】
融合タンパク質をコードする核酸配列は、一般に、調節エレメントの制御下にある。「調節エレメント」によって、転写を指揮するのに十分な核酸配列が意味される。調節エレメントとしては、例えばプロモーターが挙げられる。調節エレメントは、構成的または誘導的であり、さらなる配列または「エレメント」に結合され得、これはプロモーター依存的遺伝子発現を、細胞種特異的、組織特異的、あるいは外来シグナルまたは薬物誘導性のものに変える。そのようなエレメントは、天然遺伝子の５’領域あるいは３’領域内、もしくはイントロン内に位置し得る。
【００３３】
調節エレメントは、融合タンパク質と作動可能に連結される。「作動可能に連結」によって、適当な分子（例えば転写活性化タンパク質）が調節配列に結合したときに、遺伝子の発現が可能となるような様式で、コード配列と調節配列とが連結されていることを意味する。
【００３４】
適切な構成性プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＤＫ９、ＰＧＫ、およびユビキチンＣが挙げられる。例示的なＣＭＶプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＤ０１５３７６およびＢＤ０１５３７７である。
【００３５】
誘導性プロモーター系としては、テトラサイクリンレセプター（ｔｅｔＲ）が挙げられ、ここでは本発明の融合タンパク質をコードする核酸の発現は、誘導性転写活性因子の活性に依存する（Ｙａｏら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１９２９−１９５０（１９９８）を参照のこと）。Ｂａｒｔｏｎら、Ｔｅｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２７：４０１−２１（２０００）を参照のこと。
【００３６】
ｔｅｔ発現系としては、Ｔｅｔ−Ｏｎ系およびＴｅｔ−Ｏｆｆ系が挙げられる。Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、テトラサイクリン（Ｔｃ）誘導体であるドキシサクリン（Ｄｏｘ）存在下で、転写が活性となる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系では、テトラサイクリンまたはＤｏｘが存在すると、転写は不活性となる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ発現系では、強力な転写活性化領域である単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６領域に融合されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉトランスポゾンＴｎ１０のＴｃ耐性オペロン由来のＴｅｔレセプターＤＮＡ結合タンパク質（ＴｅｔＲ）から構成される、テトラサイクリン調節転写活性化タンパク質（ｔＴＡ）が、テトラサイクリン反応性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の転写制御下にある標的遺伝子の発現を制御する。ＴＲＥは、最小プロモーター（一般的に、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター由来の最小プロモーター配列）と融合したＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列コンカテマーから構成されている。ＴｃまたはＤｏｘの非存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化する。ＴｃあるいはＤｏｘの存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合することができず、標的遺伝子の発現は不活性なままである。
【００３７】
Ｔｅｔ−Ｏｎ系は、テトラサイクリン調節型逆転写活性物であるｒｔＴＡに基づく。ｔＴＡのように、ｒｔＴＡは、ＴｅｔＲリプレッサーおよびＶＰ１６転写活性化領域から構成される融合タンパク質である。しかし、ｔｅｔＲのＤＮＡ結合部分における４つのアミノ酸の変化によって、Ｄｏｘエフェクターの存在下で、標的導入遺伝子のＴＲＥ内のｔｅｔＯ配列のみが認識できるように、ｒｔＴＡの結合特性が改変されている。従って、Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、ＴＲＥ調節標的遺伝子の転写は、Ｄｏｘが存在している場合にのみ、ｒｔＴＡによって刺激される。
【００３８】
あるいは、誘導性プロモーター系はＥ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃリプレッサー系である（Ｂｒｏｗｎら、Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２（１９８７）を参照のこと）。ｌａｃリプレッサー系は、ｌａｃレセプター（ｌａｃＲ）が結合する核酸配列であるｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含有する哺乳動物細胞プロモーターを有する核酸の転写を制御することによって機能し、ｌａｃＯを含有するプロモーターによって制御される標的核酸の転写を妨げる。標的核酸の発現は、イソプロピル‐β‐Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）処理によって誘導される。例えば、抗体融合タンパク質をコードする核酸とｅＧＦＰをコードする核酸（双方ともｌａｃＯを有する調節性ＣＭＶプロモーターの下にある核酸である）とを含有するレンチウイルス提示ベクターを、２９３Ｔ細胞に、例えばエレクトロポレーションによって形質移入する。ＩＰＴＧ処理（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）の前後で、ウエスタンブロット分析またはそのような分野で周知の他の測定技術によって、抗体の誘導レベルを試験する。
【００３９】
他の誘導系としては、ＦＫ５０６二量体、エストラジオールを使用するＶＰ１６もしくはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、ラパマイシン、およびエクジソン誘導系が挙げられる。
【００４０】
器官／組織特異的プロモーターとしては、例えば、プリオンタンパク質プロモーターまたはニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＣａＭＫＩＩ−αプロモーター、ＬＡＰプロモーター、肺特異的発現のための使用され得るクララ細胞１０ｋＤタンパク質（ＣＣ１０）プロモーター、マウス乳腺癌ウイルス長末端反復、ヒトケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター、ウシケラチン６（Ｋ６）プロモーター／制御領域、ＴｅｋまたはＴｉｅプロモーターおよびホエー酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターあるいはβラクトグロブリンプロモーターが挙げられる。
【００４１】
必要に応じて、本発明のウイルス提示ベクターは、選択マーカーを含有する。一般的に、提示ベクターを保有する細胞の選択を可能にする遺伝子産物をコードする任意の遺伝子を、選択マーカーをして使用することができる。そのような選択系は当該分野で周知であり、これには、栄養素または抗生物質のような刺激に対する細胞の感受性を変える遺伝子が含まれる。選択マーカーの例としては、アミノグリコシド系抗生物質（例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、およびＧ４１８が含まれる）等の抗生物質耐性をコードすることが知られている遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｏｒｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−１８８を参照のこと）。他の選択マーカーには、メトトレキセートに対する耐性を供与するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子が含まれる（Ｔｈｉｌｌｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２５００−１２５０８（１９８８）を参照のこと）。他の選択マーカーは、構成的に、またはある化合物と接触することによって、直接的あるいは間接的に光を生じるタンパク質を発現する遺伝子である。例えば、他の選択マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼファミリーのメンバー、またはエクオリンファミリーのメンバーが挙げられる。
【００４２】
選択マーカーは、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を利用することによって、候補ポリペプチドと連結される（Ｍａｒａｓｃｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと）。ＩＲＥＳ配列が存在することによって、融合タンパク質と、存在する場合には選択マーカーとが、ほぼ同時に産生されるように指揮される。ほぼ同時に共発現することによって、選択マーカーの検出に基づいた、融合タンパク質を発現する細胞の選択が可能となる。ＩＲＥＳ配列は当該分野で周知であり、これには脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のもの（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８−５８４９（１９９１））、ＢｉＰタンパク質（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９１（１９９１））、ショウジョウバエＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エクソンｄおよびエクソンｅ）（Ｏｈら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，６：１６４３−１６５３（１９９２））、ポリオウイルスのもの（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２５（１９８８）、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ，１１：１７９−１８４（１９８５）を参照のこと）が挙げられる。
【００４３】
レンチウイルス提示ベクターはまた、例えば、ＲＮＡパッケージングシグナルを含有することが実証されていて、一般に遺伝子運搬に十分な、Ｃｌａ Ｉ部位に結合したｇａｇ遺伝子（例えば図１を参照のこと）の５’末端の約４１ヌクレオチドのような、ｇａｇ遺伝子の一部（「ｇａｇ」は、分裂細胞および非分裂細胞の遺伝子移入を可能にする）を含むさらなる核酸配列も含有し得る（Ｐａｒｏｌｉｎら、１９９４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３８８８−９５を参照のこと）。レンチウイルス提示ベクターはまた、それぞれ、ベクターの転写を調節し、ポリアデニル化シグナルを保有し、そしてウイルスをゲノムに組み込ませる、翻訳後に導入遺伝子の発現を刺激するシス作用性ウッドチャック肝炎ウイルス調節後調節エレメント（ＷＲＲＥ）、ならびにウイルスＬＴＲ配列ＲおよびＵ５も含有し得る。ＷＰＲＥは、誘導性プロモーターを利用した時の融合タンパク質の発現を増進するのに特に有用である。代表的に、Ｕ３領域（自己不活性化）および全てのＨＩＶ−１付随遺伝子は欠失されている。さらに、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｋ；中央ポリプリン追跡）領域が付加される。レンチウイルス提示ベクターは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する。あるいは、レンチウイルス提示ベクターは、エンベロープタンパク質をコードする核酸を含有せず、タンパク質は別のベクター上にて提供される。必要に応じて、ウイルス粒子を、レンチウイルスのキャプシドとは異なるエンベロープタンパク質を有する偽型である。エンベロープタンパク質を適切に選択することによって、実質的にあらゆる細胞に「感染させる」ことができる。このように、容易にベクターを特定の細胞に標的化させることができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、αウイルスのメンバー（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルスのメンバー（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルスのメンバー（ダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、あるいはオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）に由来するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。他のエンベロープは、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶのようなモロニー白血病ウイルスに由来するものである。また、組成物を、脳または血管内皮のような、所望する宿主細胞または組織へ標的化させるために、特定のエンベロープが選択される。
【００４４】
ベクターに多数の改変を用いることができ、これは、さらに、野生型への復帰が生じる機会を最小にするためのウイルス粒子を産生するのに使用される。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域削除、ｔａｔ削除、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられる。
【００４５】
例示的なレンチウイルス提示ベクターを、図１において模式図で示す。この図において、ｓＦｖ−ＩｇＧと記されている融合タンパク質は、サイトメガロウイルスプロモーター「ＣＭＶ」の制御下にある。選択マーカー（例えば、ｅＧＦＰ）は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流に提供される（Ｍａｒａｓｃｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと）。
【００４６】
レンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するのに必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。例えば、パッケージング細胞には、さらにウイルス粒子を産生するのに必要な全てのウイルスタンパク質をコードする１つ以上のさらなるベクターが移入される。さらに別のベクターとしては、１つ以上のウイルス構造遺伝子を含有するヘルパーベクターが挙げられる。作動可能にプロモーターに連結された、逆転写および組み込みに必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが、少なくとも１つ存在することが好ましい。このｐｏｌタンパク質は、多数のベクターによって発現されることが好ましい。また、作動可能にプロモーターに連結されたウイルスキャプシドを形成するのに必要なレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターも存在する。このｇａｇ核酸配列は、少なくとも一部のｐｏｌ核酸配列とは別のベクター上にあることが好ましく、ｐｏｌタンパク質をコードするｐｏｌ核酸配列全てと別個のベクター上にあることがさらにより好ましい。
【００４７】
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージするレンチウイルスゲノム由来の核酸を含有しない。ＨＩＶでは、この領域は、５’主要スプライスドナーとｇａｇ遺伝子開始コドンとの間の領域に相当する（３０１〜３１９番ヌクレオチド）。
【００４８】
粒子を形成するベクターは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しないことが好ましい。別のベクター（例えば作動可能にプロモーターに連結された、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有するエンベロープベクター）を使用することが好ましい。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。このエンベロープタンパク質はレンチウイルス由来であり、これからレンチウイルス提示ベクターが由来する。あるいは、このエンベロープタンパク質は、レンチウイルス提示ベクターが由来するレンチウイルスに由来するものではなく、異なるウイルスに由来する。得られるウイルス粒子は、偽型粒子と呼ばれる。
【００４９】
図１にて示したように、ヘルパー構築物であるｐＣＭＶｄＲ８．２は、ｉｅＣＭＶプロモーターの制御下にあるｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子を含有する。ｇａｇ遺伝子は、ウイルスマトリックス、キャプシド、およびヌクレオキャプシドポリペプチドをコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス逆転写酵素およびインテグラーゼ酵素をコードする。ｔａｔ遺伝子は、ウイルス遺伝子の発現とウイルスタンパク質の合成を誘導する。ｒｅｖ遺伝子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の発現を制御する。
【００５０】
図１に示したように、エンベロープベクターは、水疱性口内炎ウイルス（「ＶＳＶ−Ｇ」）のＧタンパク質を含有し、これはｉｅＣＭＶおよびＡｎ（ポリアデニル化配列）に作動可能に連結されている。前初期ＣＭＶ（ｉｅＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｉｅとしても公知）は、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡエレメント下流に、テトラサイクリンプロモーターを含有し得る。他の有用なエンベロープタンパク質としては、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶのようなモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。他のｅｎｖポリペプチドは、宿主細胞に応じて選択される。細胞結合特性を保持するｅｎｖポリペプチドのフラグメントもまた、提供される。例えば、ＨＩＶ ｇｐ１６０前駆体が、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を形成するように処理される。
【００５１】
ウイルス提示ベクター、エンベロープベクター、およびヘルパーベクターのパッケージング細胞への導入は、有用である（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス粒子を産生するために）。あるいは、エンベロープベクターおよび／またはヘルパーベクター核酸の一部（または全部）が、ウイルス提示ベクター内に含まれ得る。
【００５２】
適切なパッケージングとしては、レンチウイルス粒子を産生することのできる任意の細胞が挙げられる。パッケージング細胞としては、初代細胞、胚性幹細胞、および細胞株が挙げられる。好ましいパッケージング細胞としては、例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞が挙げられる。そのような培養細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）から入手可能である。
【００５３】
（融合タンパク質）
融合タンパク質は、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および膜貫通部分を含有する。必要に応じて、融合タンパク質はエンベロープ組み込みシグナルを含有する。リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および膜貫通部分は、作動可能に連結されている。「作動可能に連結される」によって、対象とする核酸配列が、（例えば、ベクターが宿主細胞に導入されたときにその宿主細胞内で）その核酸配列の発現を可能にする様式で存在していることが意味される。リーダーペプチドをコードする核酸は、膜貫通部分の核酸に作動可能に連結された、候補ポリペプチドをコードする核酸に、作動可能に連結されていることが好ましい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」という語は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の全部あるいは一部を含有するポリペプチドが含まれる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という語は、この明細書中で交換可能に使用される。「部分」という語は、完全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含有する、フラグメント（例えば、タンパク質分解もしくはそれ以外の方法で得られたもの）またはドメイン（例えば酵素活性または抗原結合活性もしくはＤＮＡ結合活性のような活性を有するポリペプチドの一領域）の任意の領域を包含する。当業者は、用語「部分」または「フラグメント」もまた、交換可能に使用されることを認識する。
【００５５】
（リーダーペプチド）
リーダーペプチドには、リボソームにて新たに合成されたタンパク質を、細胞膜あるいは細胞外へ輸送するために、ゴルジ体へ向かわせるペプチドが含まれる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１０巻、第１号、ｐ．１−６，１９９７を参照のこと）。リーダーポリペプチドは、シグナルペプチドあるいはシグナルポリペプチドとしても公知である。リーダーペプチドは、一般に、線状の疎水性アミノ酸を含む。リーダーペプチドとしては、免疫グロブリンリーダー配列、ポリヒスチジンまたはポリバリン配列、および、当業者に周知の他のものが挙げられる。例示的なリーダーペプチドを表１に示す。
【００５６】
リーダーペプチドには、シグナルペプチドＮ末端の正に荷電した領域（配列の「左端」）であるｎ領域；必要に応じて、シグナルペプチド中央部にある、疎水性中心部を有するｈ領域；および−１位および−３位に一般的に小さな中性アミノ酸を有する、リーダー配列Ｃ末端の一般的には極性領域であるｃ領域、の３つの領域を有するペプチドが含まれる。
【００５７】
本発明のリーダーペプチドには、小胞体シス面上に存在する特異的なプロテアーゼである、シグナルペプチダーゼによって活性化され得るペプチドが含まれる。本発明のリーダーポリペプチドはまた、ＳＩＧＦＩＮＤプログラムを使用して同定されるポリペプチドを含む。ＳＩＧＦＩＮＤプログラムは、タンパク質配列の開始部分でシグナルペプチドを予測し、核酸配列内にコードされているシグナルペプチドの可能性のある部分でオープンリーディングフレームを検索する（「Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」（２００２）、Ｒｅｃｚｋｏら、Ｉｎ Ｒ．Ｇｕｉｏ ａｎｄ Ｄ．Ｇｕｓｆｉｅｌｄ（編）：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２ｎｄ Ｉｎｔ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ＷＡＢＩ ２００２，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ，９月１６日〜２１日、Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｎｏｔｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４５２，ｐｐ．６０−６７を参照のこと）。
【００５８】
ＳＩＧＦＩＮＤプログラムは、シグナルペプチドの位置およびサイズを示す、配列にわたるスコア（ｓｉｇ．ｐｅｐスコア、０（シグナルペプチドなし）から９（シグナルペプチド存在に関する最大スコア）の範囲）を提供する。一般に、ｓｉｇ．ｐｅｐスコアが高いものから低いものへ減少することで、シグナルペプチド開裂部位のおおよその位置が示される。
【００５９】
【表１】
（候補ポリペプチド）
候補ポリペプチドは、ウイルスキャプシドあるいは哺乳動物細胞表面上での発現が所望される任意のポリペプチドあるいはそのフラグメントである。候補ポリペプチドは、天然の細胞表面ポリペプチドである。あるいは、候補ポリペプチドは、天然の細胞表面ポリペプチドではない。候補ポリペプチドは、抗体あるいはそのフラグメント、毒素、ホルモン、成長因子、レセプター、あるいはシグナル分子である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「その機能的フラグメント」という語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）の免疫学的活性部分（すなわち、抗体に特異的に結合する（免疫相互作用する）抗原結合部位を含有する分子）をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。
【００６１】
「特異的結合」あるいは「免疫相互作用」によって、抗体が、所望する抗原の１つ以上の抗原決定基と相互作用し、他のポリペプチドとは反応（即ち、結合）しないか、もしくは非常に小さな親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することが意味される。
【００６２】
本明細書中で使用される「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という語は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異性を示す抗原との間で発生する型の、非共有結合的相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、その相互間の解離定数（Ｋｄ）という語で表すことができ、より小さなＫｄはより大きな親和性を示す。選択したポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の手法を用いて定量される。そのような手法のうちの１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成速度および解離速度の測定であり、これらの速度は、対になって複合体を形成するものの濃度、相互作用の親和性、両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的媒介変数によって異なる。このように、「結合速度定数（Ｋｏｎ）」および「解離速度定数（Ｋｏｆｆ）」は両方、濃度、ならびに結合および解離の実測速度の算出によって決定され得る（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−８７（１９９３）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比によって、親和性に関係しない変数を全て相殺することが可能となり、これは解離定数Ｋｄと等しい。（全般的なことは、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９−４７３を参照のこと）。
【００６３】
候補ポリペプチドは、ライブラリから得ることができる。好ましいライブラリとしては、ヒト単鎖抗体ライブラリ、天然ペプチドライブラリ、およびランダムペプチドライブラリが挙げられる。例示的なライブラリには、Ｍｅｈｔａ ＩおよびＭｅｈｔａ ＩＩファージライブラリが含まれる（Ｇｅｎｎａｒｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５（１）：１９３−２０７（２００４）を参照のこと）。Ｍｅｈｔａ Ｉライブラリは、１５０億のｓＦｖ挿入フラグメントを含有し、Ｍｅｈｔａ ＩＩは１２０億のｓＦｖ挿入フラグメントを含有する。天然ペプチドライブラリは、当該分野で周知である（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（２）：８３７−４６（２００２）を参照のこと）。天然ペプチドライブラリは、約２５から約２００アミノ酸の長さのペプチドを含有することが好ましく、これはこの大きさのペプチドが天然の抗原決定基であることが例証されているためである（Ｆａｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：４３（１９９７）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：８３７（２００２）を参照のこと）。ランダムペプチドライブラリは、当該分野で周知であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および他の供給元から入手可能である。ライブラリ挿入フラグメントは、増幅して本発明のウイルス提示ベクターに連結させることもできるし、この挿入フラグメントを宿主ライブラリから切り出して、ウイルス提示ベクター内に連結させることもできる。
【００６４】
（免疫グロブリンポリペプチド）
融合タンパク質はさらに、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含有する。「少なくとも一領域」によって、免疫グロブリン分子の任意の一部が含まれることが意味され、これは例えば、軽鎖、重鎖、Ｆｃ領域、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域、あるいはこれらの任意のフラグメントもしくは組み合わせである。好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１）のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含有する。
【００６５】
（膜貫通部分）
膜貫通部分（または膜貫通ドメイン）は、細胞膜あるいは細胞小器官の膜のような、細胞の生体膜を横切って伸びることのできる複数のアミノ酸である。膜貫通部分は、ウイルスキャプシド表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜の内部に入っていき、繋ぎ留められたままになることができるポリペプチドである。本発明の融合タンパク質に含まれる場合、膜貫通部分は、その融合タンパク質を、ウイルスキャプシド表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜に局在させることができる。膜貫通部分は、レンチウイルス膜貫通部分のようなウイルスの膜貫通部分である。レンチウイルス膜貫通部分としては、例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＣＡＥＶ、ＢＬＶ、およびＦＩＶあるいはこれらの機能的フラグメントに由来するエンベロープポリペプチドが挙げられる。
【００６６】
ＨＩＶ−１ ｇｐ６０エンベロープポリペプチドは、約８５６アミノ酸からなるポリペプチドであって（表２の配列番号１およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ４０７８３、ＡＡＡ７６６７１、ＢＡＡ１２９９５、およびＰ０３３７７を参照のこと）、タンパク質分解酵素によってプロセシングされてｇｐ１２０とｇｐ４１ポリペプチドとなる。ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０エンベロープポリペプチドのアミノ酸配列を、表２の配列番号１にて提供する。ｇｐ４１ポリペプチドは、配列番号１の５１２〜８５６番アミノ酸を含む（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０５７８５６も参照のこと）。ｇｐ４１の膜貫通部分は、一般に、ｇｐ１６０ポリペプチドのおよそ６７５〜７１５番アミノ酸の間に位置する。加えて、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号において、ＳＩＶ由来のＡＡＴ４１７２９、ＣＡＥＶ由来のＰ３１６２７、ＢＩＶ由来のＰ１９５５７、ＢＬＶ由来のＰ０３３８０、およびＦＩＶ由来のエンベロープであるＮＰ＿０４０９７６によって提供される。
【００６７】
【表２】
あるいは、膜貫通部分は、ＣＤ２８、ＣＤ８、もしくはＩｇＭ膜貫通部分または機能的フラグメントのような、哺乳動物の膜貫通部分である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、膜貫通部分の「機能的フラグメント」には、ウイルス粒子の表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜へ融合タンパク質を局在させることのできる膜貫通部分の任意の部分あるいはフラグメントが含まれる。例えば、膜貫通ドメインには、アミノ酸配列ＮＲＶＲＱＧＹＳ（配列番号１４）あるいはＧＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１５）が含まれる。
【００６９】
一般に、膜貫通部分は、その末端に正に荷電したアミノ酸（リジンおよびアルギニン等）を有し、非荷電アミノ酸を中央に有する。膜貫通部分は、これらのポリペプチドを小胞体へ標的化させるＮ末端シグナル配列を有することができる。通常、２５以上のアミノ酸長からなるαヘリックス膜貫通ドメインは、細胞膜の両端に渡るのに十分なものである。あるいは、膜貫通部分は、１つ以上のβバレル構造を有するポリペプチドを含み得る。例示的な一膜貫通部分としては、グリコホリンＡ
【００７０】
【数１】
由来の膜貫通ドメインが含まれる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインには、２つ以上のβシートを有するポリペプチド配列が含まれる。
【００７１】
膜貫通部分は、膜貫通タンパク質およびこれらの膜貫通ドメインのＴＭｂａｓｅにおいて提供されるポリペプチドを含む（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ（１９９３）、ＴＭｂａｓｅ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４，１６６を参照のこと）。ＴＭｂａｓｅデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよび他のデータベース源に由来する情報を含有している。本発明の膜貫通部分には、ＴＭｐｒｅｄプログラムを使用して同定されるポリペプチドが含まれる。ＴＭｐｒｅｄプログラムは、天然膜貫通タンパク質のＴＭｂａｓｅデータベースの統計的分析に基づくアルゴリズムを用いて、膜貫通領域およびそれらの方向性の予測を行う。ポリペプチド中の膜貫通領域を判定することのできる他のプログラムとしては、ＧＲＥＡＳＥ、ＴＭＨＭＭ、およびＴＭＡＰが含まれる。
【００７２】
（ウイルスキャプシド上に候補ポリペプチドを提示する方法）
融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス提示ベクターを、パッケージング細胞に導入する。本明細書中で使用する場合、細胞へのＤＮＡの導入は形質導入と呼ばれ、あるときは形質移入または感染としても公知である。
【００７３】
一般に、提示ベクターは、１つ以上の連結させていないベクターと組み合わせて形質移入によって導入するが、当業者は、本発明の手法に、核酸ベクターをレシピエント細胞に導入する他の方法（マイクロインジェクションが挙げられるが、これに限定されない）を採用することができることを認識する。好ましい形質移入手段は、リン酸カルシウム、ＦＵＧＥＮＥ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、およびＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）である。パッケージング細胞は、さらに、エンベロープベクターおよびヘルパーベクターで形質移入する。提示ベクター：エンベロープベクター：ヘルパーベクターの比は、約２：１：２である。あるいは、提示ベクター：エンベロープベクター：ヘルパーベクターの比は、約１：２：１である。
【００７４】
ベクターをパッケージング細胞に導入した後、パッケージング細胞は、ウイルスキャプシド上の融合タンパク質および候補ポリペプチドをコードする核酸を含有する１つ以上のウイルス粒子を産生する。必要に応じて、パッケージング細胞が産生したウイルス粒子を、当業者に周知の任意の手段によって精製および／または濃縮する。例えば、続いて、選択マーカー（例えばｅＧＦＰ）をコードする核酸を発現するウイルス粒子を、発現された選択マーカーを検出することによって蛍光補助細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によって分別する。あるいは、ウイルス粒子を濾過（例えば０．４５μｍおよび／または０．２２μｍのフィルターを通す濾過）することによって回収し、１００，０００×ｇの遠心分離によって沈殿させる。
【００７５】
その表面上に候補ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させたウイルス粒子を使用して、対象となる抗原（例えば標的抗原）に結合する候補ポリペプチドを同定することができる。本発明の融合タンパク質を含有する１つ以上のウイルス粒子を標識した（例えばＦＩＴＣ等の蛍光標識を抗原に化学的に接着させた）標的抗原に接触させる。ウイルス粒子は溶液中で提供される。あるいは、ウイルス粒子は固体支持体に接着されている。固体支持体としては、例えば、チップ、ビーズ、紙、またはポリスチレンが挙げられる。標識標的抗原は、候補ポリペプチドと接触して結合し、標的抗原が結合した候補ポリペプチドを有するウイルス粒子を、ＦＡＣＳまたは当業者に周知の他の適切な手段によって選別する。候補ポリペプチドをコードする核酸配列は、直接、または増殖後に、配列決定され得る。このようにして、標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定することができる。
【００７６】
（哺乳動物細胞の表面上にて候補ポリペプチドを提示させる方法）
本発明はまた、哺乳動物細胞の表面上にて候補ポリペプチドを提示させるための方法を提供する。これは、例えば、ポリペプチド、抗体、あるいは抗体フラグメントを含むライブラリをスクリーニングするのに有用である。ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化、ならびに硫酸化）が、重要な構造的役割を果たしていることが、近年認識されている。したがって、本発明の用法によって産生されたポリペプチドは、こうした翻訳後修飾を含有し、一方、細菌内で産生されたポリペプチド（例えばファージディスプレイ法を使用したもの）は、こうした翻訳後修飾を欠くこととなる。
【００７７】
上記のように融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス提示ベクターでパッケージング細胞を形質移入することによって、候補ポリペプチドは哺乳動物細胞の表面上に提示される。必要に応じて、融合タンパク質をコードする核酸は、ウイルスキャプシドの表面上で候補ポリペプチドが提示されるように発現される。しかし、ウイルスキャプシドの表面上での融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞の表面上での融合タンパク質の発現を達成するのに必須ではないことを、当業者は認識する。
【００７８】
続いて、哺乳動物提示細胞にウイルス粒子が感染するように、パッケージング細胞によって産生されたウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。細胞１個当たり平均してわずか０〜１個の取り込みしか提供しないこととなる感染の多重度（ＭＯＩ）で、ウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。例えば、感染の多重度およそ１で、ウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。一般に、ウイルスベクターは構成的に哺乳動物細胞に取り込まれる。あるいは、この取り込みは、一過性のものである。融合ポリペプチドの膜貫通部分が存在することによって、哺乳動物細胞表面に発現する融合タンパク質は、候補ポリペプチドが細胞膜上で提示されるように標的化される。ＭＯＩに基づいて、各哺乳動物細胞は、融合タンパク質をコードする独自の核酸を含有し、それによって独自の候補ポリペプチドをその表面上に有する。例えば、抗体ライブラリ（例えばＭｅｈｔａライブラリの一方あるいは両方）を使用する場合、ウイルスベクターを産生するのに、各々が独自の抗体をその細胞表面に発現させる、２７０億の哺乳動物細胞を得ることが可能なはずである。
【００７９】
例示的な哺乳動物提示細胞としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞株が挙げられる。別の例示的な哺乳動物提示細胞としては、Ｍ１２ｇ３Ｒ（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞株が挙げられる（Ｒｅｉｄｅｒら、２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：２１３−１５を参照のこと）。
【００８０】
哺乳動物提示細胞は、細胞に構成的あるいは一過的にのいずれかで形質移入された核酸を構成的に変異させ得る細胞株である（Ｃｕｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：１１２９，（２００２）およびＰｒｅｓｔａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１０９６（２００２）の編集者総説を参照のこと）。例えば、哺乳動物提示細胞は、ラモス−バーキットリンパ腫細胞株、ＢＬ−２細胞、ＣＬ−０１細胞（Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４１５：８０２，２００２）またはニワトリＤＴ−４０Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｓａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ４１２：９２１，２００１）である。あるいは、活性化誘導性シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）タンパク質（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，２０００；Ｄｉ Ｎｏｉａ，２００２；Ｐｅｒｔｅｒｓｅｎ−Ｍａｈｒｔ，２００２；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，２００２およびＧｅａｒｈａｒｔ，２００２の編集者総説）、ＤＮＡポリメラーゼι（Ｆａｉｌｉ，２００２）、あるいは免疫グロブリンミュータソーム（ｍｕｔａｓｏｍｅ）の構成要素であるＴＬＳポリメラーゼファミリーの他のメンバーを過剰発現するように、哺乳動物細胞は修飾されている。ＡＩＤタンパク質は、哺乳動物および他の高等脊椎動物における抗体の成熟に必要とされ、体細胞超変異（ＳＨＭ）、クラススイッチ組換え、および遺伝子変換を促進する。
【００８１】
哺乳動物提示細胞による融合タンパク質の変異は、対象とする標的抗原に対する結合親和性および／または特異性が変化、増加、または減少した候補ポリペプチドをもたらす。例えば、候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである場合、変異は抗体の超変異を模倣する。
【００８２】
必要に応じて、候補ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞（例えば、感染した細胞）は、候補ポリペプチドを発現しない哺乳動物細胞から分離（例えば選別）される。感染した哺乳動物細胞を選別することによって、細胞集団から感染していない細胞を除去することが可能となり、次いで、標識抗原との非特異的な結合相互作用の発生頻度を減らす。さらに、哺乳動物提示細胞が上記のように核酸を変異させることができる場合、細胞を選別することにより、例えば、生体内免疫反応の過程でのＢ細胞の親和性成熟の過程を繰り返す。
【００８３】
感染した哺乳動物細胞は、ｅＧＦＰのような選択マーカーを検出することによって選別される。あるいは、感染した哺乳動物細胞は、抗原に結合する細胞を識別することによって選別される。例えば、細胞を、ある濃度で、標識された標的抗原に接触させる。標識された標的抗原を、溶液中あるいは固体支持体上にて、哺乳動物細胞と混合する。固体支持体としては、例えば、チップ、ビーズ、紙、プラスチック、あるいは他の固体もしくは半固体の手段が挙げられる。標的抗原と哺乳動物細胞とが溶液内に存在する場合、ＦＡＣＳまたは他の適切な選別手段を使用して結合した抗原と候補ポリペプチドとの複合体を識別し、結合していない標識標的抗原および結合していない哺乳動物細胞に結合した複合体を分離する。対照的に、標的抗原が固体支持体上にある場合、カラムクロマトグラフィーを使用して、標識した抗原に結合している候補ポリペプチドまたは抗体を提示している哺乳動物細胞を分離する。その抗原は、クロマトグラフィーカラム内でビーズ（例えばセルロースまたはセファロースビーズ）に結合し、哺乳動物細胞を含有する溶液をカラムに加える。結合していない哺乳動物細胞は１回以上の洗浄によって、カラムから除去される。次いで、結合した哺乳動物細胞は、高ｐＨあるいは低ｐＨ溶液、界面活性剤溶液、高塩溶液、あるいはカオトロピック剤（例えば尿素および（あるいは）グアニジン）等で、カラムから溶出される。
【００８４】
好ましくは、哺乳動物細胞は、選択マーカーの発現と抗原結合の両方によって選別される。
【００８５】
必要に応じて、選別手順の間に感染した哺乳動物細胞を培養液中で増殖させる。この増殖は、本質的に、クローン的であっても非クローン的であってもよい。続く選別手順にて使用する抗体の量は、減らされる。例えば、標的抗原の濃度を、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、あるいは９９．９９９％減らす。即ち、このような様式で、本発明の方法を用いて、親和性選択工程前の候補ポリペプチドの平均親和性と比較して、高い特異性および親和性で標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する。
【００８６】
選択された候補ポリペプチドをコードする核酸配列を決定する。例えば、選択した哺乳動物細胞集団を界面活性剤等で溶解し、候補ポリペプチドをコードする核酸をＰＣＲによって増幅して、適切なベクター内にクローニングする。必要に応じて、増幅した挿入フラグメントをレンチウイルス提示ベクター内にクローニングし、上記のようにこれを使用して新規のウイルス粒子を産生する。これらの粒子を使用してさらなる哺乳動物細胞を感染させることが可能であり、候補ポリペプチド提示法は、１回以上繰り返すことができる。
【００８７】
本発明の方法によって、可溶性候補ポリペプチドの産生もまた可能となる。ウイルス粒子または哺乳動物細胞の表面上に融合タンパク質が発現した後に、融合タンパク質の膜貫通領域をコードする核酸を削除することによって、可溶性候補ポリペプチドが生成される。例えば、これらの方法は、膜結合抗体を使用して、抗体産生細胞を標的細胞あるいは標的組織に局在化させ、続いて、インビボで特定の細胞型または組織（例えば、癌細胞）へ可溶性抗体を送達するのに有用である。この可溶性抗体は、細胞毒性、細胞分裂阻害性、またはアポトーシス誘導性であり得る。
【００８８】
例えば、上記のウイルス提示ベクターは、さらに、例えばＣｒｅリコンビナーゼが認識するｌｏｘＰ等、２つ以上のシグナル部位（あるいはシグナル配列）を含有し得る。Ｃｒｅ−ｌｏｘ反応は、以下のように機能する。Ｐ１バクテリオファージ環化組換え（Ｃｒｅ）リコンビナーゼは、対象とする核酸分子の両端に隣接する一対のｌｏｘＰ結合部位を認識する。ここで、ｌｏｘＰ部位は、融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸配列に隣接し得る。必要に応じて、膜貫通部分（「スペーサーアミノ酸」と名付ける）に隣接する１つ以上のアミノ酸をコードする核酸を使用する。スペーサーアミノ酸は、融合タンパク質の正確な折り畳みを促進する。ＬｏｘＰ部位は、３４ｂｐの長さで、回文構造（相補的）配列である１３ｂｐが隣接する、８ｂｐのコアから構成されており、このコアは方向性を決定する。ｌｏｘＰが隣接する配列は、「ｆｌｏｘｅｄ（ｌｏｘＰが導入された）」と呼ばれる。Ｃｒｅ酵素は、相補的な配列を有する２つのｌｏｘＰ部位を繋げる。対となっているｌｏｘＰの向きに応じて、異なる結果が達成される場合がある。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系では、２つのシグナル部位間の核酸配列が削除される、あるいは、このシグナル部位が同じ核酸分子上にある場合には反転される。介在するＤＮＡは、削除もしくは環化されるか、または反転もしくは転位置され得る。必要に応じて、ウイルス提示ベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸を含有する場合もある。テトラサイクリン／ドキシサイクリン等の誘導性プロモーターが、Ｃｒｅの発現を駆動することができる。必要に応じて、ｌｏｘＰ部位は、融合タンパク質の膜貫通部の両端に隣接するのに加えて、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列の両端に隣接する。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列は、ｌｏｘＰ部位の上流（５’方向）あるいは下流（３’方向）に位置する。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導することができることによって、可溶性抗体を産生する能力が提供される。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を別のベクターに配置し得るか、または宿主細胞のゲノムに構成的に組み込まれている。
【００８９】
部位特異的リコンビナーゼ系の別の例は、酵母由来のｆｌｐ系である。Ｆｌｐリコンビナーゼは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミドがコードする４５ｋＤのタンパク質である。上記のウイルス提示ベクターは、ＦＬＰリコンビナーゼが認識する２つ以上の組換え標的（ＦＲＴ）をさらに含有し得る。例えば、２つのＦＲＴは融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸の両端に隣接する。
【００９０】
組換え活性を上昇させた修飾ＦＬＰリコンビナーゼもまた、記載されている（Ｂｕｃｈｏｌｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６．６５７−６６２（１９９８）を参照のこと）。適切なＦＲＴ配列は、：
【００９１】
【数２】
である。ＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴに結合し、その結果、膜貫通部分をコードする核酸部分が切除され、可溶性抗体が産生される。
【００９２】
例えば、癌細胞の表面上で腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に免疫特異的に結合する抗体を発現する哺乳動物提示細胞が、本発明の哺乳動物抗体提示法を用いて同定される。抗体産生哺乳動物細胞は、哺乳動物被験体（例えば、癌に罹患したヒト患者あるいはその抗体を必要とする患者）に提供され、哺乳動物細胞表面上の抗体は腫瘍抗原へ向かい、これと特異的に結合する。抗体産生細胞の検出および局在は、検出可能なタンパク質部分の発現を検出することによって決定される。抗体産生哺乳動物細胞が、腫瘍抗原を提示する細胞に局在化（および結合）すると、Ｃｒｅリコンビナーゼが融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸を除去するように、（例えば、化学的手段、光、酸素、あるいは他の誘導手段によって）Ｃｒｅリコンビナーゼが誘導される。膜貫通領域の存在しないときは、その融合タンパク質はリーダーペプチドによってＥＲに向けられ、可溶性抗体として細胞外へ分泌される。次いで、この分泌された可溶性抗体は、標的腫瘍細胞上で局所的に作用する。必要に応じて、抗体産生哺乳動物細胞は、毒素をコードする核酸も含有し得、この毒素も哺乳動物提示細胞によって産生される。この毒素は、可溶性抗体と作動可能に連結され得る。
【実施例】
【００９３】
（実施例１ ウイルス提示ベクターとベクター系の産生）
ウイルス提示ベクター（図１に概説される）を、以下のように構築する。ＭｅｈｔａＩ／ＩＩライブラリ由来の、候補ペプチドをコードする１つ以上の挿入フラグメントを増幅することによって、融合タンパク質をコードする核酸を産生する。例示的なｓＦｖ挿入フラグメントとしては、ヒトサイクリンＴ１のＴＲＭモチーフに免疫特異的に結合するｓＦｖである「ＰＳ１１」；ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質のアルギニンに富む領域に免疫特異的に結合するｓＦｖである「Ｅ４６」；ＣＣＲ５のＮ末端に免疫特異的に結合するｓＦｖである「Ａ８」；およびＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒのα鎖）に免疫特異的に結合するｓＦｖである「抗Ｔａｃ」が挙げられる。これらの挿入フラグメントを、免疫グロブリンリーダータンパク質をコードする核酸の下流、かつヒトＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域をコードする核酸の上流に連結させ、その結果、発現した核酸が翻訳されたときに、候補ポリペプチドはリーダーポリペプチドおよび免疫グロブリン分子と作動可能に連結される。核酸分子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって制御される。免疫グロブリン分子をコードする核酸の下流は、ｇｐ４１の膜貫通部分をコードする核酸である。高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする核酸分子を、ＣＭＶプロモーターによって制御されるＩＲＥＳの下流に置く。
【００９４】
ウイルス提示ベクターのタンパク質発現分析を、ＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭのような当業者に周知の形質移入方法を用いて２９３Ｔ細胞に一過的に形質移入し、続いてｇｐ４１に特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析を行うことによって実施する。図４Ｂにて示されるように、本発明の融合タンパク質は、一過的に形質移入した２９３Ｔ細胞にて発現される。レーン１は、モック処理した細胞（ＤＮＡは加えされていない）を示し、レーン２は、ＰＳ１１ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示す。レーン３は、ＰＳ１１ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、これはｇｐ４１膜貫通部分をｌｏｘＰ配列の一方の端に隣接させてある。レーン４は、Ｅ４６ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、レーン５は、Ｅ４６ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、これはｇｐ４１膜貫通部分をｌｏｘＰ配列の一方の端に隣接させてある。
【００９５】
融合タンパク質の細胞膜への局在は、ＦＡＣＳ分析を用いて確認する。例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）ＰＥ結合体が、ｓＦｖ−ＩｇＧ−ｇｐ４１融合タンパク質の細胞表面発現の検出に有用である。典型的なＦＡＣＳ分析の結果を表３にて示す。
【００９６】
【表３】
蛍光標識した抗体を使用するＦＡＣＳ分析によって、細胞表面上で発現した融合タンパク質が、標的抗原に免疫特異的に結合し得ることが確認された。例えば、ビオチン化ＴＲＭペプチド（２ｍＭ、ＭＷ４１４６．７、Ｅｘｔｒａｓｖｉｄｉｎ ＰＥ（Ｓｉｇｍａ Ｅ−４０１１）と組み合わせる）を、ＦＡＣＳ実験において使用した。その結果を、表４に示す。これらの結果は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現した含ＰＳ１１融合タンパク質がその標的抗原に結合し得ることを示した。
【００９７】
【表４】
ヘルパーベクターｐＣＭＶΔＲ８．２およびエンベロープベクターもまた、図１に示される。ヘルパーベクターは、ｉｅＣＭＶプロモーターの制御下にあるｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子を含有する。エンベロープベクターは、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（「ＶＳＶ−Ｇ」）を含有し、これはｉｅＣＭＶとＡｎ（ポリアデニル化配列）とに、作動可能に連結されている。
【００９８】
（実施例２ ウイルスキャプシド上の抗体提示）
ＣａＣｌ２またはＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭ形質移入剤を使用して、ＭｅｈｔａＩ／ＩＩライブラリ由来のｓＦｖ挿入フラグメントを含有するウイルス提示ベクターの集団を、ヘルパーベクターおよびエンベロープベクターと一緒に２９３Ｔ細胞へ同時形質移入する。あるいは、構成的にＶＳＶ−ｇを発現する２３９Ｔ細胞株を使用する。融合タンパク質ウイルス粒子を産生するために、８０％〜１００％のコンフルエンスにまで増殖した２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍのプレート上にて、２倍ＨｅＢＳ溶液において約１２μｇのウイルス提示ベクター（１．０μｇ／μｌ）、約１２μｇのエンベロープベクター（１．０μｇ／μｌ）、約６μｇのヘルパーベクターｐＣＭＶΔＲ８．２（０．５μｇ／μｌ）、６２μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を含有する形質移入カクテルを用いて形質移入する。感染後約３７時間および６１時間において、ウイルス粒子が含まれる上清（マスターウイルスストック）を回収し、濾過して−８０℃で保存する。あるいは、感染後４８時間、７２時間、９６時間目に、マスターウイルスストックを回収する。必要であれば、ＳＷ２８ローターにて１７，０００ｒｐｍで２時間遠心分離することによって、ウイルス粒子上清を濃縮する。沈殿物を、１／１０量の培地に再懸濁する。ウイルス粒子は、蛍光補助細胞選別器（ＦＡＣＳ）でｅＧＦＰを検出することによって分別する。多重感染度（ｍｏｉ）は、２９３Ｔ細胞を感染させ、続いてｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリー定量することによって決定する。ウイルス粒子への融合タンパク質の取り込みは、ウエスタン分析を用いて測定する。遠心分離によってウイルスストックを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を加え、続いてＰＡＧＥによって分離し、メンブランに移して、抗ｇｐ４１または抗ヒトＩｇＧでブロッティングする。
【００９９】
融合タンパク質の標的抗原への特異的結合は、ウイルス粒子捕捉実験によって実証する。標的抗原でマルチウェルプレートをコーティングし、（例えば、１％ＢＳＡで）ブロッキングする。これを、上記のように調製したウイルス粒子と一緒にインキュベートする。融合タンパク質の標的抗原への特異的結合の指標である逆転写活性は、３Ｈを使用して測定し、値（ＲＴ値）を割り当てる。一連のウイルス粒子捕捉実験の結果を、表５に示す。この結果は、ＰＳ１１含有融合タンパク質を発現するレンチウイルス粒子が、その標的抗原と特異的に結合することを示している。図４Ｃにて示したように、捕捉された抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して染色した。
【０１００】
【表５】
（実施例３ 哺乳動物細胞抗体提示）
マスターウイルスストックに、哺乳動物提示細胞の懸濁液を、約１のＭＯＩで一晩接触させる。抗Ｆｃ抗体結合能またはｅＧＦＰ含量に基づいて、この哺乳動物細胞をＦＡＣＳで選別する。選別した細胞を、あらかじめ標識した標的抗原に接触させる。適切な標識としては、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン／ビオチン、および常磁性ビーズが挙げられる（図１１を参照のこと）。続いて、結合した抗原を有する選別された哺乳動物細胞を選択する。選択後、次回の選択のため、選択した細胞集団を培地中で増殖させる。あるいは、選択した細胞の集団から核酸を採取し、候補ポリペプチドをコードする核酸を増幅して、１回以上のさらなる選択のために提示ベクター内に挿入する。抗原に結合する目的の候補ポリペプチドの配列を得るために、選択した細胞を溶解し、抗原結合哺乳動物細胞内に含有される、候補ポリペプチドをコードする核酸配列をベクターにクローニングし、次いで配列決定する。
【０１０１】
２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上での融合タンパク質の細胞表面発現を実証するために、実験を行った。１×１０６個の２９６Ｔ細胞を、６ウェルのマルチウェルプレートに播種した。表６に示したように、細胞は、リポフェクタミンを使用して、２つのベクター（本発明の候補ポリペプチド含有する融合タンパク質を発現するベクターおよびＣＭＶプロモーターの制御下にてＧＦＰを発現するベクター）で同時形質移入した。感染後約４８時間にて、感染させた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡで収集した。
【０１０２】
【表６】
収集した形質移入細胞を、ＧＦＰの発現について分析し、抗ヒトＩｇ−ＡＰＣ結合体で染色して、Ｆｃの細胞表面での発現を実証した。
【０１０３】
サンプル１は、非感染細胞を含有する。サンプル２は、挿入物を有さないｐＣＤＮＡベクターを含有する。サンプル３は、Ｃ９タグを有さないｐＣＤＮＡ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１を含有する。サンプル４は、ＧＦＰコントロール挿入物を含有する。サンプル５は、レンチウイルスｇｐ４１膜貫通領域の一部（ＴＭ領域の１〜５０番アミノ酸に相当する）を含有する。サンプル６は、ヒトＣＤ８膜貫通領域を含有する。サンプル７は、完全長のレンチウイルスｇｐ４１膜貫通領域を含有する。サンプル８は、ヒトＣＤ２８膜貫通領域を含有する。
【０１０４】
図１２Ｄに示したように、ＣＤ８およびＣＤ２８膜貫通領域によって、融合タンパク質は確固として提示細胞表面へ標的化される。
【０１０５】
２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上にて融合タンパク質が細胞表面発現することを実証するために、さらなる実験を行った。１×１０６個の２９３T細胞を、６ウェルのマルチウェルプレートに播種した。表７に示したように、リポフェクタミンを使用して、ＩＲＥＳを含有する多機能ベクターで細胞を同時形質移入した。感染後約４８時間にて、感染させた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡで収集した。
【０１０６】
【表７】
収集した形質移入細胞をＧＦＰの発現について分析し、抗ヒトＩｇ−ＡＰＣ結合体で染色して、Ｆｃの細胞表面発現を実証した。
【０１０７】
サンプル１は非感染細胞を含有する。サンプル２は、ＣＭＶプロモーター制御下にてＧＦＰを発現するｐＳＩＮベクターを含有する。サンプル３は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＺｎＧｒｅｅｎを含有し、ここでＩＲＥＳ配列はｐＳＩＮ−ｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターから得た。サンプル４は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有し、よってＧＦＰを発現する。サンプル５は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＺｎＧｒｅｅｎを含有し、ここでＩＲＥＳ配列は、ＨＡ−ＺｓＧｒｅｅｎｓベクターから得たＩＲＥＳ配列から得た。サンプル３〜５の膜貫通領域は、レンチウイルスｇｐ４１の完全長膜貫通ドメインである。
【０１０８】
図１３Ｄに示したように、本発明の多機能ベクターによって、融合タンパク質は確固として提示細胞の表面に標的化される。
【０１０９】
（実施例４ ヒト抗体の親和性選択）
選択した抗原結合哺乳動物細胞を、非結合哺乳動物細胞から分離し、培地中で増殖させて、標的抗原特異的抗体を産生する哺乳動物細胞の数を増やす。標的抗原濃度を、５０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、あるいはそれ以上減らして、実施例４の抗体提示法を繰り返す。例えば、第１回目の選択では、約２００ｎｇ／ｍｌの抗原濃度を使用し、第２回目の選択ではこの濃度を約１ｎｇ／ｍｌに減らす。
【０１１０】
（実施例５ ヒト抗体の親和性成熟）
非常に高い特異性および非常に高い結合親和性（Ｋｄが小さい）で標的抗原に結合する候補ポリペプチド（例えば、抗体）を同定することが望ましい。本発明は、親和性成熟による特異性の高い抗体の産生を提供する。
【０１１１】
親和性成熟の１つの方法は、高い変異速度を有する提示細胞株の使用を包含する。変異しやすい細胞株の例は、例えばラモス−バーキットリンパ腫細胞株のようなリンパ腫細胞株である。上記実施例４に記載した提示親和性選択法を利用して、標的抗原に対する親和性が増大した変異融合タンパク質由来の抗体を発現する哺乳動物細胞を選択する。
【０１１２】
親和性成熟の別の方法は、提示細胞内での活性化誘導導シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）の発現誘導を包含する。ＡＩＤ活性の上昇は、候補ポリペプチドの高い変異速度をもたらす。図１に示したウイルス提示ベクターを、プロモーターの制御下にてＡＩＤタンパク質をコードする核酸を含むように、改変し得る。あるいは、本発明は、構成的または誘導性プロモーターの制御下に、安定に組み込まれたＡＩＤ遺伝子を有する提示細胞を提供する。
【０１１３】
（実施例６ 抗体発現の誘導）
実施例１にて作製したウイルス提示ベクターを、ｔｅｔＲ誘導性エレメントの挿入によって改変する。２つのｔｅｔＯ配列鎖状体を、ＣＭＶ最小プロモーターに融合させる。ｔｅｔＲ配列は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の下流に挿入する。こうして、融合タンパク質の産生は、テトラサイクリンを添加することによって調節される。
【０１１４】
（実施例７ Ｃ９タグを使用する抗体細胞表面発現の定量）
本発明は、哺乳動物提示細胞表面上で発現した抗体の密度を測定するための方法を提供する。抗体の細胞表面発現の定量によって、抗体提示の効率、および、例えばウイルス提示ベクター内のプロモーターおよび／またはエンハンサーの変更による、改善の判定が可能となる。
【０１１５】
抗体細胞表面発現の定量は、発現した融合タンパク質に含まれるタグを使用して実施される。あるいは、定量は、単鎖抗体に結合する標識ペプチド（例えば、ビオチン化ペプチド）を使用して行われる。本発明において、任意の手段（例えば、ＦＡＣＳ）によって測定することが可能なもので検出することが可能な任意のタグを使用することができる。例示的なタグの１つは、Ｃ９ペプチドタグ（ＧＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ、配列番号１６）である。Ｃ９タグは、モノクローナル抗体１Ｄ４によって認識される。この抗体を検出できる任意の手段（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、発現量を定量することができる。Ｃ９タグは、免疫グロブリン分子部分のＣ末端、かつ膜貫通部分のＮ末端に位置する。本発明の実施形態において、Ｃ９タグは、リンカー（例えばＳＧＧＳＳ（配列番号１７）のような可動性リンカー）によって免疫グロブリン分子部分に接続される。Ｃ９タグはリンカーのＣ末端にＸｂａＩ部位を挿入することによってリンカーのＣ末端（１個のアミノ酸、アルギニン（Ｒ）をコードする）に連結される。Ｃ９リンカーを含有する例示的なウイルス提示ベクターを、以下の表８に示す。ｇｐ４１の細胞外領域は１８残基を有し、膜貫通部分は２４残基、細胞内領域は８残基を有する（配列番号１４のｇｐ４１タグ）。提示ベクター４は、１〜５０番のアミノ酸を含有する切断されたｇｐ４１ポリペプチドをコードし、提示ベクター６は、完全長のｇｐ４１ポリペプチドをコードする。ＣＤ８の細胞外領域は１２残基を有し、膜貫通領域は２１残基、細胞内領域は１１残基を有する（ＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶ、配列番号１７）。ＣＤ２８の細胞外領域は３９残基を有し、膜貫通領域は２７残基、細胞内領域は１３残基を有する。コントロールとして、融合タンパク質をコードする核酸を有さないｐＣＤＮＡ３ベクターを使用した。ｓｃＦｖ−４８は、ヒトＣＸＣＲ４に対する単鎖抗体である。
【０１１６】
【表８】
代表的な抗体の細胞表面発現の定量を、以下の通り実施した。２９３Ｔ細胞を、形質移入の約２４時間前に、６ウェルプレートに播種した（各ウェルに１×１０６個の細胞）。リポフェクタミン２０００ＴＭを使用して、ウイルス提示ベクターＤＮＡ（４μｇ）を形質移入した。形質移入後約４８時間にて、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、ＦＡＣＳのために細胞を収集した。抗体検出のため、α−Ｃ９一次抗体（ＩＤ４）を、１×１０５個の細胞当たり２μｌで使用し、α−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ標識二次抗体を１：５０希釈で使用した。ＦＡＣＳ分析は、上記のように、かつ当該分野で公知の通り実施した。この分析結果を、図１４および図１５に示す。図１４Ａは、ＦＡＣＳによって測定した、Ｃ９タグの発現に関して陽性であった細胞の割合を示す。Ｃ９を含有する融合構築物を発現する細胞の大部分（９４％以上）がＦＡＣＳを用いて同定されるが、Ｃ９タグを有さないコントロールベクターで形質移入した細胞集団で見られた陽性細胞は、極めて少数であった。図１４Ｂは、表８に列挙したウイルス提示ベクターで形質移入した細胞についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。切断されたか、または完全長のｇｐ４１ポリペプチドのいずれかを含有する融合タンパク質、およびＣＤ８またはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインを含有するタンパク質の発現を、形質移入した細胞のＭＦＩ値を測定することによって定量した。図１５Ａ〜Ｇは、表８にて記載したウイルス提示ベクターで形質移入した細胞についてのＦＡＣＳプロットを示す。
【０１１７】
（実施例８ エンベロープ組み込みシグナルを含有する構築物における抗体の細胞表面発現の定量）
本発明は、ｇｐ４１エンベロープ（ｅｎｖ）組み込みシグナルを含有する融合ウイルス提示ベクターを提供する。図１６は、いくつかの融合タンパク質構築物を示す。構築物１は、ｇｐ４１ ＴＭ領域の１〜５０番アミノ酸を含有する。構築物２は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含有する。構築物３は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含有する。構築物４は、作動可能にｇｐ４１ ｅｎｖ組み込みシグナルに連結されたＣＤ８膜貫通ドメインを含有する。構築物３は、ｇｐ４１ ｅｎｖ組み込みシグナルに作動可能に連結されたＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。表９に列挙した構築物を、以下のように２９３Ｔ細胞に形質移入した。２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート上に播種した（１×１０６個／ウェル）。リポフェクタミンを使用して細胞に形質移入し、形質移入から４８時間後に、５ｍＭ ＥＤＴＡで細胞を収集し、ＧＦＰおよびＦｃの細胞表面発現について、α−ヒトＩｇＧ−ＡＰＣを使用して分析した。結果を図１７および１８に示す。この結果は、ＣＤ８、ＣＤ２８、およびｇｐ４１ ＴＭドメインが、実質的に、形質移入された融合タンパク質の細胞表面発現をもたらすことを実証し；エンベロープ取り込みシグナルが存在するにせよ存在しないにせよ、ＣＤ８およびＣＤ２８は、ｇｐ４１ ＴＭよりも高レベルの細胞表面発現をもたらすことを実証している。
【０１１８】
【表９】
（実施例９ レンチウイルスで形質移入した細胞における抗体の細胞表面発現）
切断した（１〜５０番アミノ酸）か、または完全長のｇｐ４１ ＴＭ、ＣＤ８ ＴＭ、もしくはＣＤ２８ ＴＭのいずれかを含有するウイルス提示構築物（表１０に列挙）を、ｐＳＩＮレンチウイルス提示ベクターに導入し、哺乳動物細胞の表面上の融合タンパク質の発現を確認した。このレンチウイルスベクターは、検出を助けるためにＧＦＰの形態のＺｓＧｒｅｅｎを含有し、これを上記のように２９３Ｔ細胞に形質移入した。結果を図１９および図２０に示す。この結果は、レンチウイルスベクターに含まれるウイルス提示構築物が効率よく２９３Ｔ細胞内で発現され、融合タンパク質の細胞表面発現をもたらすことを実証している。
【０１１９】
【表１０】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載された具体的な手順の多数の等価物を、単に慣習的な実験を使用して、認識するかまたは認識することができる。そのような等価物は、本発明の範囲内であり、以下の請求項に包含されるとみなされる。本願にわたって引用された全ての引用文献、査定された特許、および公開された特許出願は、本明細書中に参考として援用される。これらの特許、出願および他の文献の適切な成分、プロセスおよび方法は、本発明およびその実施形態に対して、選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、本発明の例示的なウイルス提示ベクター、ヘルパーベクターおよびエンベロープ構築物の模式図である。
【図２】図２は、哺乳動物細胞による候補ポリペプチド提示を使用する、候補ポリペプチドの選択に関するプロセスの模式図である。
【図３】図３は、哺乳動物細胞による候補ポリペプチド提示を使用する、候補ポリペプチドの親和性成熟に関するプロセスの模式図である。
【図４】図４Ａは、抗体を含有する本発明の融合タンパク質の模式図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞における本発明の融合タンパク質の発現を示す、ウエスタンブロットの写真画像である。図４Ｃは、ウイルスキャプシド表面上でｓＦｖを発現するウイルス粒子を使用する、ウイルス捕捉実験の捕捉された抗原を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真画像である。
【図５】図５Ａ〜Ｈは、フローサイトメトリーによって測定されたｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１抗体のＣ８１６６−４５細胞への免疫特異的結合の検出を示す一連のグラフである。ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。各実験で使用したＤＮＡ量をグラフ下側に示す。
【図６】図６は、未処理細胞（Ｄｏｘ−）と比較した、ドキシサイクリン処理（Ｄｏｘ＋）による本発明のヒト単鎖抗体（ｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１）の誘導発現を示す棒グラフである。
【図７】図７は、Ｄｏｘ処理後の本発明のヒト単鎖抗体（ｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１）の誘導発現が、薬物の除去によって可逆性であることを示す棒グラフである。
【図８】図８は、ｃｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰ部位を含むレンチウイルス提示ベクターの図解である。
【図９】図９は、本発明の機能的プロテオミクススクリーニングを用いる標的タンパク質の同定を示す、模式図である。
【図１０】図１０は、機能的プロテオミクスに有用な本発明のデータベースの作製を示す模式図である。
【図１１】図１１は、本発明のレンチウイルスおよび／または哺乳動物提示選択法のための、常磁性タンパクリポソームの使用を示す模式図である。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、候補ポリペプチドを発現するベクターおよびＧＦＰを発現するベクターを同時形質移入した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、ＩＲＥＳを含有する多機能ベクターを形質移入した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、Ｃ９タグで検出した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１５】図１５Ａ〜Ｇは、Ｃ９タグで検出した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【図１６】図１６は、例示的な融合タンパク質の模式図である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、形質移入効率、ＭＦＩ値、および２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連の棒グラフである。
【図１８】図１８Ａ〜Ｉは、ＭＦＩ値、および、抗ヒトＩｇＧで染色された２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【図１９】図１９Ａ〜Ｄは、形質移入効率、ＭＦＩ値、および２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連の棒グラフである。
【図２０】図２０Ａ〜Ｇは、ＭＦＩ値、および抗ヒトＩｇＧで染色された２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス粒子および／または哺乳動物細胞の表面上における候補ポリペプチドの発現を提供する組成物、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
抗体ライブラリは、目的の抗体の同定、および新規の抗体−抗原複合体のスクリーニングに有用である。例えば、Ｍｅｈｔａ Ｉ、およびＭｅｈｔａ ＩＩ単鎖抗体ライブラリは、２７０億もの非免疫性ヒト抗体を包含する。これまでこのようなライブラリは、ファージディスプレイを用いてスクリーニングされていた。抗体表示法をファージ提示から哺乳動物提示へ適応させるには、新規のベクター送達系が必要となる。
【０００３】
外来核酸を送達するのに用いられてきたベクターとしては、ＤＮＡウイルスベクターおよびＲＮＡウイルスベクターの双方が挙げられる。例えば、ＤＮＡベクターとしては、オルトポックスベクターまたはアビポックスベクターのような水痘ベクター（例えば米国特許第５，６５６，４６５号を参照のこと）、単純疱疹ウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクター等のヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；アデノウイルスベクター（Ｌｅｇａｌ Ｌａｓａｌｌｅら、Ｓｃｉ．２５９−９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：２００４（１９９５））；およびアデノ関連ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．， ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照のこと）が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から得られるベクターが含まれる（米国特許第５，６６５，５７７号を参照のこと）。
【０００４】
様々なベクターが、自身が特定の利用法に所望されるものとなる特性を有している。例えば、レトロウイルスベクターは、宿主に感染させるために使用することができ、且つ高い効率で宿主細胞内に組み込まれる遺伝物質を有している。そのようなベクターの例は、修飾モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であり、元々は、レトロウイルスゲノムの全体がパッケージングされるのを防ぐために削除されたパッケージング配列を有していた。しかしながら、このレトロウイルスは休止細胞には形質導入しない。加えて、代表的に、特異的なレセプターを介して細胞に入るレトロウイルスが多いことから、その特異的なレセプターが細胞上に存在しないかまたは十分な数では存在しない場合、感染は不可能となるかまたは効率が悪い。また、組換えＭＭＬＶを産生する細胞株から野生型ウイルスが発生した後（すなわち、復帰変異）には、安全性の問題もまた生じる。
【０００５】
アデノウイルス由来のベクターは、広範な細胞に感染することができる。しかしながら、転移された遺伝物質は組み込まれない。故に、あらゆる発現あるいはスクリーニングの操作は、転移された遺伝物質がエピソーム性であるときに限られる。したがって、比較的短い期間にしか研究を行うことができない。
【０００６】
最近、霊長類レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））を基礎とするもののような、レンチウイルスベクターに焦点が当てられている。偽型ベクター（すなわち、別種由来のエンベロープタンパク質が使用されるベクター）を使用することにより、感染させる細胞の種類に基づいて特定のエンベロープタンパク質を選択することによって、広範囲な細胞種に感染させる際に生じる問題を克服することができる。加えて、ＨＩＶのようなレンチウイルスにおいて見られる複雑な遺伝子スプライシング様式の観点から、ＨＩＶコアのようなレンチウイルスコアを有する多価ベクター（例えば、多数の遺伝子を発現するもベクター）が、目的の核酸をより効率的に発現することが期待される。
【０００７】
大規模な哺乳動物への形質移入を実行するための、霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶ）を基礎とするもののようなレンチウイルスベクターの使用により、レトロウイルスベクターに勝るいくつかの利点が得られる。抗体をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、インビボおよびインビトロにて、静止期細胞および増殖期細胞の双方に感染することができる（非特許文献１；非特許文献２を参照のこと）。加えて、レンチウイルスベクターによって異種由来のペプチドの構成的発現または誘導発現が可能であり、それによって、培養物中および動物体内での抗体の産生が提供される。
【０００８】
近年、代表的にモノクローナル抗体またはペプチドから構成される、大規模ライブラリの開発に注意が向けられている。例えば、抗原結合抗体フラグメントが、線状ファージの表面上にて発現されており（非特許文献３）、ファージディスプレイライブラリと呼ばれる、例えば１０７個以上の抗体のような大型ライブラリを産生するのに使用されている。ファージディスプレイライブラリでは、ＦｄあるいはＦｖ領域のカルボキシル末端がファージのコートタンパク質のフラグメントに繋ぎとめられ、これによって、例えばＦａｂフラグメントをそのファージの表面上に固定する。抗体提示系は、Ｅ．ｃｏｌｉ（非特許文献４）、酵母（非特許文献５）およびＳｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス感染のような、非哺乳動物細胞において記載されている。ファージまたは非哺乳動物細胞の表面上にて抗体を発現させることができるという利点にも関わらず、発現される抗体は、その結合活性を完全には保持していない可能性がしばしばあることが認識されている（非特許文献６；非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｒｅｉｓｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：１５２６６−１５２７１
【非特許文献２】Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７２：２６３−２６７
【非特許文献３】Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１３１５
【非特許文献４】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９９，１２：６１３−６２１
【非特許文献５】Ｓｈｕｓｔａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００，１８：７５４−７５９
【非特許文献６】Ｃｈｏｅら、Ｃｅｌｌ ２００３，１１４；１６１−１７０
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇら、ＰＮＡＳ ２００４，１０１：２７０６−２７１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（本発明の要旨）
本発明は、抗体またはそのフラグメントのような候補ポリペプチドの、哺乳動物細胞またはウイルス粒子の表面上での提示を提供する組成物および方法の発見に、一部基づいている。
【００１０】
本発明の方法は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターを使用する。この融合タンパク質は、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の一部、および膜貫通部分を含有する。必要に応じて、この融合タンパク質はさらに、候補ポリペプチドの発現をウイルス粒子表面（あるいはエンベロープ、ｅｎｖ）上へ向ける、エンベロープ組み込みシグナルを含有する。
【００１１】
適切な候補ポリペプチドとしては、モノクローナル抗体可変領域、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、あるいはＦａｂ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。候補ポリペプチドは、ヒト単鎖抗体ライブラリ（例えばＭｅｈｔａＩあるいはＭｅｈｔａＩＩライブラリ等）、天然ペプチドライブラリ、あるいはランダムペプチドライブラリのようなライブラリに由来し得る。
【００１２】
免疫グロブリン分子の一部は、Ｉｇ分子の定常領域部分またはその機能的フラグメントを含有する。例えば、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有し得る。
【００１３】
膜貫通部分としては、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分が挙げられる。例えば、膜貫通部分は、レンチウイルスｇｐ４１、ＣＤ２８、ＣＤ８またはＩｇＭ膜貫通部分あるいはその機能的フラグメントである。
【００１４】
融合タンパク質は、構成性プロモーターあるいは誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。構成性プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、またはＣＤＫ９が挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、または温度誘導性プロモーターが挙げられる。
【００１５】
種々の局面において、ウイルス提示ベクターは、選択マーカーまたは毒素のような一つ以上のさらなる核酸配列を含有する。選択マーカーとしては、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼファミリーのメンバー、またはエクオリンファミリーのメンバーが挙げられる。
【００１６】
ウイルス提示ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から得られるベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
パッケージング細胞が、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する１つ以上のウイルス粒子を産生するような条件下で、パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターとを接触させることによって、候補ポリペプチドが哺乳動物細胞の表面上に提示される。必要に応じて、この候補ポリペプチドは、ウイルス粒子の表面上で発現される。哺乳動物細胞の表面上で融合タンパク質が提示されるよう、融合タンパク質が哺乳動物細胞内で発現するのに十分な条件下で、ウイルス粒子と哺乳動物提示細胞とを接触させる。
【００１８】
パッケージング細胞は、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、および／またはｒｅｖのようなウイルス構成遺伝子を１つ以上含有するヘルパーベクター、ならびにｅｎｖ遺伝子（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された機能性エンベロープタンパク質をコードする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子）を含有するエンベロープベクターを含み得る。
【００１９】
パッケージング細胞としては、例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、例えば、ラモス−バーキットリンパ腫細胞のようなヒトＢ細胞株が挙げられる。他の実施形態では、細胞は、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えばＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞である。
【００２０】
標的抗原に結合する候補ペプチドは、哺乳動物提示細胞一つ一つが細胞表面上に提示される単一種の候補ポリペプチドを産生するような条件下で、ウイルス粒子と１つ以上の哺乳動物提示細胞とを接触させることによって同定される。その哺乳動物細胞の表面上に１種類の候補ポリペプチドを提示する哺乳動物細胞を、候補ポリペプチドを発現しない哺乳動物細胞から単離する（すなわち、分別する）。分別された哺乳動物細胞を標的抗原に接触させて、標的抗原に結合する細胞を選別する。この分別工程および抗原結合工程は、１回以上繰り返される。本発明の様々な局面では、この哺乳動物細胞を漸減する濃度の標的抗原に接触させ、それによって標的抗原に結合する候補ポリペプチドを濃縮して親和性成熟させる。
【００２１】
哺乳動物提示細胞は、さらに、クラゲＡｅｑｕｏｒｉａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のエクオリンタンパク質のような、カルシウム感受性生物発光タンパク質をコードする核酸配列をさらに含有し得る。本発明の実施形態において、この融合タンパク質は、標的抗原と結合したときに細胞内カルシウムを上昇させ、これによってエクオリンを発光させる（Ｒｉｄｅｒら、２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：２１３−１５を参照のこと）。細胞内カルシウムの上昇を促すため、免疫グロブリンレセプター（例えば免疫グロブリンＩｇＭレセプター）の膜貫通領域および細胞内領域が含まれる。
【００２２】
可溶性候補ポリペプチドは、膜貫通部分をｌｏｘＰ部位に隣接させて、ウイルス提示ベクター内に誘導性プロモーターに作動可能に連結させたｃｒｅリコンビナーゼをコードする第２核酸配列を挿入することによって作製される。例示的なｌｏｘＰ部位としては、ポリペプチドＩＴＳＹＳＩＨＹＴＫＬ（配列番号１３）として発現される、ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡ（配列番号１２）が挙げられる。
【００２３】
本発明はさらに、本発明の任意のウイルス提示ベクター；機能性エンベロープタンパク質をコードする、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含むエンベロープベクター；ならびに１つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、を含むベクター系を提供する。必要に応じて、このベクター系は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むｃｒｅベクターを含み得る。
【００２４】
本発明はまた、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の一部、およびｌｏｘＰ部位に隣接した膜貫通部分を含有する融合タンパク質をコードする核酸、毒素をコードする核酸、ｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする配列、侵入部分をコードする核酸を含有する、ウイルス標的ベクターを提供する。侵入部分は、融合活性を有するウイルスエンベロープタンパク質である。好ましくは、この侵入部分は結合活性を有さない。例えば、この侵入部分は、結合能欠損型インフルエンザ血球凝集素タンパク質またはそのフラグメント、あるいはＶＳＶ−Ｇタンパク質またはそのフラグメントである。必要に応じて、ウイルス標的ベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列を含有し得る。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価な方法または物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適した方法および物質が以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、その全体が参考として援用される。対立する場合は、定義も含めて本明細書が優先される。さらに、物質、方法および実施例は単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明と特許請求の範囲から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ウイルス粒子（即ちビリオン）、または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）の表面上で候補ポリペプチドを提示させるための方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、候補ポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルス提示ベクターを使用する。パッケージング細胞が、融合タンパク質をコードする核酸を含有し、かつウイルス粒子の表面上に候補ポリペプチドを提示するウイルス粒子を１つ以上産生するように、このベクターはパッケージング細胞に導入される。候補ポリペプチドがその細胞の表面上に提示されるように、哺乳動物細胞が融合タンパク質を発現するよう（即ち、一過的または安定に）、哺乳動物提示細胞をこのウイルス粒子に接触させる。
【００２８】
哺乳動物細胞表面上での候補ポリペプチドの発現には、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、およびＳｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス感染株のような他の発現様式に比べて、多くの利点が存在する。例えば、哺乳動物細胞内に導入された候補ポリペプチドは、これら他の発現系では起こらない、グルコシル化および硫酸化のような翻訳後修飾を含有する。さらに、シャペロンタンパク質および正確なタンパク質折り畳みを促進する他の成分を欠く細胞と比較して、哺乳動物細胞において折り畳みの正確性が増す。さらに、この候補ポリペプチドには、細菌、酵母、あるいはバキュロウイルスの夾雑物がない。
【００２９】
本発明の方法は、例えば、標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定するために、ポリペプチドをコードする核酸を含有するライブラリをスクリーニングするのに有用である。
【００３０】
（ウイルス提示ベクター）
本発明のウイルス提示ベクターは、構成的にかまたは誘導によって、融合タンパク質を発現することのできる核酸ベクターである。例えば、ウイルス提示ベクターとしては、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターには、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。
【００３１】
好ましいレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１から得られる。ＨＩＶ−１ベクターは、インビトロ（Ｊ．Ｒｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１５２６６−１５２７１（１９９６）を参照のこと）およびインビボ（Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（１９９６）を参照のこと）にて、非分裂細胞を定常的に形質転換することが例証されている。従って、これらのベクターは、長期的な発現が可能である。適切なウイルスとこれを感染させる細胞の一覧は、米国特許出願第２００３／００４４９８１号（この内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される）にて提供されている。
【００３２】
融合タンパク質をコードする核酸配列は、一般に、調節エレメントの制御下にある。「調節エレメント」によって、転写を指揮するのに十分な核酸配列が意味される。調節エレメントとしては、例えばプロモーターが挙げられる。調節エレメントは、構成的または誘導的であり、さらなる配列または「エレメント」に結合され得、これはプロモーター依存的遺伝子発現を、細胞種特異的、組織特異的、あるいは外来シグナルまたは薬物誘導性のものに変える。そのようなエレメントは、天然遺伝子の５’領域あるいは３’領域内、もしくはイントロン内に位置し得る。
【００３３】
調節エレメントは、融合タンパク質と作動可能に連結される。「作動可能に連結」によって、適当な分子（例えば転写活性化タンパク質）が調節配列に結合したときに、遺伝子の発現が可能となるような様式で、コード配列と調節配列とが連結されていることを意味する。
【００３４】
適切な構成性プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＤＫ９、ＰＧＫ、およびユビキチンＣが挙げられる。例示的なＣＭＶプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＤ０１５３７６およびＢＤ０１５３７７である。
【００３５】
誘導性プロモーター系としては、テトラサイクリンレセプター（ｔｅｔＲ）が挙げられ、ここでは本発明の融合タンパク質をコードする核酸の発現は、誘導性転写活性因子の活性に依存する（Ｙａｏら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１９２９−１９５０（１９９８）を参照のこと）。Ｂａｒｔｏｎら、Ｔｅｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２７：４０１−２１（２０００）を参照のこと。
【００３６】
ｔｅｔ発現系としては、Ｔｅｔ−Ｏｎ系およびＴｅｔ−Ｏｆｆ系が挙げられる。Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、テトラサイクリン（Ｔｃ）誘導体であるドキシサクリン（Ｄｏｘ）存在下で、転写が活性となる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系では、テトラサイクリンまたはＤｏｘが存在すると、転写は不活性となる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ発現系では、強力な転写活性化領域である単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６領域に融合されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉトランスポゾンＴｎ１０のＴｃ耐性オペロン由来のＴｅｔレセプターＤＮＡ結合タンパク質（ＴｅｔＲ）から構成される、テトラサイクリン調節転写活性化タンパク質（ｔＴＡ）が、テトラサイクリン反応性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の転写制御下にある標的遺伝子の発現を制御する。ＴＲＥは、最小プロモーター（一般的に、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター由来の最小プロモーター配列）と融合したＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列コンカテマーから構成されている。ＴｃまたはＤｏｘの非存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化する。ＴｃあるいはＤｏｘの存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合することができず、標的遺伝子の発現は不活性なままである。
【００３７】
Ｔｅｔ−Ｏｎ系は、テトラサイクリン調節型逆転写活性物であるｒｔＴＡに基づく。ｔＴＡのように、ｒｔＴＡは、ＴｅｔＲリプレッサーおよびＶＰ１６転写活性化領域から構成される融合タンパク質である。しかし、ｔｅｔＲのＤＮＡ結合部分における４つのアミノ酸の変化によって、Ｄｏｘエフェクターの存在下で、標的導入遺伝子のＴＲＥ内のｔｅｔＯ配列のみが認識できるように、ｒｔＴＡの結合特性が改変されている。従って、Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、ＴＲＥ調節標的遺伝子の転写は、Ｄｏｘが存在している場合にのみ、ｒｔＴＡによって刺激される。
【００３８】
あるいは、誘導性プロモーター系はＥ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃリプレッサー系である（Ｂｒｏｗｎら、Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２（１９８７）を参照のこと）。ｌａｃリプレッサー系は、ｌａｃレセプター（ｌａｃＲ）が結合する核酸配列であるｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含有する哺乳動物細胞プロモーターを有する核酸の転写を制御することによって機能し、ｌａｃＯを含有するプロモーターによって制御される標的核酸の転写を妨げる。標的核酸の発現は、イソプロピル‐β‐Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）処理によって誘導される。例えば、抗体融合タンパク質をコードする核酸とｅＧＦＰをコードする核酸（双方ともｌａｃＯを有する調節性ＣＭＶプロモーターの下にある核酸である）とを含有するレンチウイルス提示ベクターを、２９３Ｔ細胞に、例えばエレクトロポレーションによって形質移入する。ＩＰＴＧ処理（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）の前後で、ウエスタンブロット分析またはそのような分野で周知の他の測定技術によって、抗体の誘導レベルを試験する。
【００３９】
他の誘導系としては、ＦＫ５０６二量体、エストラジオールを使用するＶＰ１６もしくはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、ラパマイシン、およびエクジソン誘導系が挙げられる。
【００４０】
器官／組織特異的プロモーターとしては、例えば、プリオンタンパク質プロモーターまたはニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＣａＭＫＩＩ−αプロモーター、ＬＡＰプロモーター、肺特異的発現のための使用され得るクララ細胞１０ｋＤタンパク質（ＣＣ１０）プロモーター、マウス乳腺癌ウイルス長末端反復、ヒトケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター、ウシケラチン６（Ｋ６）プロモーター／制御領域、ＴｅｋまたはＴｉｅプロモーターおよびホエー酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターあるいはβラクトグロブリンプロモーターが挙げられる。
【００４１】
必要に応じて、本発明のウイルス提示ベクターは、選択マーカーを含有する。一般的に、提示ベクターを保有する細胞の選択を可能にする遺伝子産物をコードする任意の遺伝子を、選択マーカーをして使用することができる。そのような選択系は当該分野で周知であり、これには、栄養素または抗生物質のような刺激に対する細胞の感受性を変える遺伝子が含まれる。選択マーカーの例としては、アミノグリコシド系抗生物質（例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、およびＧ４１８が含まれる）等の抗生物質耐性をコードすることが知られている遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｏｒｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−１８８を参照のこと）。他の選択マーカーには、メトトレキセートに対する耐性を供与するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子が含まれる（Ｔｈｉｌｌｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２５００−１２５０８（１９８８）を参照のこと）。他の選択マーカーは、構成的に、またはある化合物と接触することによって、直接的あるいは間接的に光を生じるタンパク質を発現する遺伝子である。例えば、他の選択マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼファミリーのメンバー、またはエクオリンファミリーのメンバーが挙げられる。
【００４２】
選択マーカーは、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を利用することによって、候補ポリペプチドと連結される（Ｍａｒａｓｃｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと）。ＩＲＥＳ配列が存在することによって、融合タンパク質と、存在する場合には選択マーカーとが、ほぼ同時に産生されるように指揮される。ほぼ同時に共発現することによって、選択マーカーの検出に基づいた、融合タンパク質を発現する細胞の選択が可能となる。ＩＲＥＳ配列は当該分野で周知であり、これには脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のもの（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８−５８４９（１９９１））、ＢｉＰタンパク質（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９１（１９９１））、ショウジョウバエＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エクソンｄおよびエクソンｅ）（Ｏｈら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，６：１６４３−１６５３（１９９２））、ポリオウイルスのもの（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２５（１９８８）、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ，１１：１７９−１８４（１９８５）を参照のこと）が挙げられる。
【００４３】
レンチウイルス提示ベクターはまた、例えば、ＲＮＡパッケージングシグナルを含有することが実証されていて、一般に遺伝子運搬に十分な、Ｃｌａ Ｉ部位に結合したｇａｇ遺伝子（例えば図１を参照のこと）の５’末端の約４１ヌクレオチドのような、ｇａｇ遺伝子の一部（「ｇａｇ」は、分裂細胞および非分裂細胞の遺伝子移入を可能にする）を含むさらなる核酸配列も含有し得る（Ｐａｒｏｌｉｎら、１９９４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３８８８−９５を参照のこと）。レンチウイルス提示ベクターはまた、それぞれ、ベクターの転写を調節し、ポリアデニル化シグナルを保有し、そしてウイルスをゲノムに組み込ませる、翻訳後に導入遺伝子の発現を刺激するシス作用性ウッドチャック肝炎ウイルス調節後調節エレメント（ＷＲＲＥ）、ならびにウイルスＬＴＲ配列ＲおよびＵ５も含有し得る。ＷＰＲＥは、誘導性プロモーターを利用した時の融合タンパク質の発現を増進するのに特に有用である。代表的に、Ｕ３領域（自己不活性化）および全てのＨＩＶ−１付随遺伝子は欠失されている。さらに、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｋ；中央ポリプリン追跡）領域が付加される。レンチウイルス提示ベクターは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する。あるいは、レンチウイルス提示ベクターは、エンベロープタンパク質をコードする核酸を含有せず、タンパク質は別のベクター上にて提供される。必要に応じて、ウイルス粒子を、レンチウイルスのキャプシドとは異なるエンベロープタンパク質を有する偽型である。エンベロープタンパク質を適切に選択することによって、実質的にあらゆる細胞に「感染させる」ことができる。このように、容易にベクターを特定の細胞に標的化させることができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、αウイルスのメンバー（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルスのメンバー（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルスのメンバー（ダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、あるいはオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）に由来するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。他のエンベロープは、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶのようなモロニー白血病ウイルスに由来するものである。また、組成物を、脳または血管内皮のような、所望する宿主細胞または組織へ標的化させるために、特定のエンベロープが選択される。
【００４４】
ベクターに多数の改変を用いることができ、これは、さらに、野生型への復帰が生じる機会を最小にするためのウイルス粒子を産生するのに使用される。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域削除、ｔａｔ削除、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられる。
【００４５】
例示的なレンチウイルス提示ベクターを、図１において模式図で示す。この図において、ｓＦｖ−ＩｇＧと記されている融合タンパク質は、サイトメガロウイルスプロモーター「ＣＭＶ」の制御下にある。選択マーカー（例えば、ｅＧＦＰ）は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流に提供される（Ｍａｒａｓｃｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６５３１を参照のこと）。
【００４６】
レンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するのに必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。例えば、パッケージング細胞には、さらにウイルス粒子を産生するのに必要な全てのウイルスタンパク質をコードする１つ以上のさらなるベクターが移入される。さらに別のベクターとしては、１つ以上のウイルス構造遺伝子を含有するヘルパーベクターが挙げられる。作動可能にプロモーターに連結された、逆転写および組み込みに必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが、少なくとも１つ存在することが好ましい。このｐｏｌタンパク質は、多数のベクターによって発現されることが好ましい。また、作動可能にプロモーターに連結されたウイルスキャプシドを形成するのに必要なレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターも存在する。このｇａｇ核酸配列は、少なくとも一部のｐｏｌ核酸配列とは別のベクター上にあることが好ましく、ｐｏｌタンパク質をコードするｐｏｌ核酸配列全てと別個のベクター上にあることがさらにより好ましい。
【００４７】
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージするレンチウイルスゲノム由来の核酸を含有しない。ＨＩＶでは、この領域は、５’主要スプライスドナーとｇａｇ遺伝子開始コドンとの間の領域に相当する（３０１〜３１９番ヌクレオチド）。
【００４８】
粒子を形成するベクターは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しないことが好ましい。別のベクター（例えば作動可能にプロモーターに連結された、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有するエンベロープベクター）を使用することが好ましい。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。このエンベロープタンパク質はレンチウイルス由来であり、これからレンチウイルス提示ベクターが由来する。あるいは、このエンベロープタンパク質は、レンチウイルス提示ベクターが由来するレンチウイルスに由来するものではなく、異なるウイルスに由来する。得られるウイルス粒子は、偽型粒子と呼ばれる。
【００４９】
図１にて示したように、ヘルパー構築物であるｐＣＭＶｄＲ８．２は、ｉｅＣＭＶプロモーターの制御下にあるｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子を含有する。ｇａｇ遺伝子は、ウイルスマトリックス、キャプシド、およびヌクレオキャプシドポリペプチドをコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス逆転写酵素およびインテグラーゼ酵素をコードする。ｔａｔ遺伝子は、ウイルス遺伝子の発現とウイルスタンパク質の合成を誘導する。ｒｅｖ遺伝子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の発現を制御する。
【００５０】
図１に示したように、エンベロープベクターは、水疱性口内炎ウイルス（「ＶＳＶ−Ｇ」）のＧタンパク質を含有し、これはｉｅＣＭＶおよびＡｎ（ポリアデニル化配列）に作動可能に連結されている。前初期ＣＭＶ（ｉｅＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｉｅとしても公知）は、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡエレメント下流に、テトラサイクリンプロモーターを含有し得る。他の有用なエンベロープタンパク質としては、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶのようなモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。他のｅｎｖポリペプチドは、宿主細胞に応じて選択される。細胞結合特性を保持するｅｎｖポリペプチドのフラグメントもまた、提供される。例えば、ＨＩＶ ｇｐ１６０前駆体が、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を形成するように処理される。
【００５１】
ウイルス提示ベクター、エンベロープベクター、およびヘルパーベクターのパッケージング細胞への導入は、有用である（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス粒子を産生するために）。あるいは、エンベロープベクターおよび／またはヘルパーベクター核酸の一部（または全部）が、ウイルス提示ベクター内に含まれ得る。
【００５２】
適切なパッケージングとしては、レンチウイルス粒子を産生することのできる任意の細胞が挙げられる。パッケージング細胞としては、初代細胞、胚性幹細胞、および細胞株が挙げられる。好ましいパッケージング細胞としては、例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞が挙げられる。そのような培養細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）から入手可能である。
【００５３】
（融合タンパク質）
融合タンパク質は、リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および膜貫通部分を含有する。必要に応じて、融合タンパク質はエンベロープ組み込みシグナルを含有する。リーダーペプチド、候補ポリペプチド、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および膜貫通部分は、作動可能に連結されている。「作動可能に連結される」によって、対象とする核酸配列が、（例えば、ベクターが宿主細胞に導入されたときにその宿主細胞内で）その核酸配列の発現を可能にする様式で存在していることが意味される。リーダーペプチドをコードする核酸は、膜貫通部分の核酸に作動可能に連結された、候補ポリペプチドをコードする核酸に、作動可能に連結されていることが好ましい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」という語は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の全部あるいは一部を含有するポリペプチドが含まれる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という語は、この明細書中で交換可能に使用される。「部分」という語は、完全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含有する、フラグメント（例えば、タンパク質分解もしくはそれ以外の方法で得られたもの）またはドメイン（例えば酵素活性または抗原結合活性もしくはＤＮＡ結合活性のような活性を有するポリペプチドの一領域）の任意の領域を包含する。当業者は、用語「部分」または「フラグメント」もまた、交換可能に使用されることを認識する。
【００５５】
（リーダーペプチド）
リーダーペプチドには、リボソームにて新たに合成されたタンパク質を、細胞膜あるいは細胞外へ輸送するために、ゴルジ体へ向かわせるペプチドが含まれる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１０巻、第１号、ｐ．１−６，１９９７を参照のこと）。リーダーポリペプチドは、シグナルペプチドあるいはシグナルポリペプチドとしても公知である。リーダーペプチドは、一般に、線状の疎水性アミノ酸を含む。リーダーペプチドとしては、免疫グロブリンリーダー配列、ポリヒスチジンまたはポリバリン配列、および、当業者に周知の他のものが挙げられる。例示的なリーダーペプチドを表１に示す。
【００５６】
リーダーペプチドには、シグナルペプチドＮ末端の正に荷電した領域（配列の「左端」）であるｎ領域；必要に応じて、シグナルペプチド中央部にある、疎水性中心部を有するｈ領域；および−１位および−３位に一般的に小さな中性アミノ酸を有する、リーダー配列Ｃ末端の一般的には極性領域であるｃ領域、の３つの領域を有するペプチドが含まれる。
【００５７】
本発明のリーダーペプチドには、小胞体シス面上に存在する特異的なプロテアーゼである、シグナルペプチダーゼによって活性化され得るペプチドが含まれる。本発明のリーダーポリペプチドはまた、ＳＩＧＦＩＮＤプログラムを使用して同定されるポリペプチドを含む。ＳＩＧＦＩＮＤプログラムは、タンパク質配列の開始部分でシグナルペプチドを予測し、核酸配列内にコードされているシグナルペプチドの可能性のある部分でオープンリーディングフレームを検索する（「Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」（２００２）、Ｒｅｃｚｋｏら、Ｉｎ Ｒ．Ｇｕｉｏ ａｎｄ Ｄ．Ｇｕｓｆｉｅｌｄ（編）：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２ｎｄ Ｉｎｔ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ＷＡＢＩ ２００２，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ，９月１６日〜２１日、Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｎｏｔｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４５２，ｐｐ．６０−６７を参照のこと）。
【００５８】
ＳＩＧＦＩＮＤプログラムは、シグナルペプチドの位置およびサイズを示す、配列にわたるスコア（ｓｉｇ．ｐｅｐスコア、０（シグナルペプチドなし）から９（シグナルペプチド存在に関する最大スコア）の範囲）を提供する。一般に、ｓｉｇ．ｐｅｐスコアが高いものから低いものへ減少することで、シグナルペプチド開裂部位のおおよその位置が示される。
【００５９】
【表１】
（候補ポリペプチド）
候補ポリペプチドは、ウイルスキャプシドあるいは哺乳動物細胞表面上での発現が所望される任意のポリペプチドあるいはそのフラグメントである。候補ポリペプチドは、天然の細胞表面ポリペプチドである。あるいは、候補ポリペプチドは、天然の細胞表面ポリペプチドではない。候補ポリペプチドは、抗体あるいはそのフラグメント、毒素、ホルモン、成長因子、レセプター、あるいはシグナル分子である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「その機能的フラグメント」という語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）の免疫学的活性部分（すなわち、抗体に特異的に結合する（免疫相互作用する）抗原結合部位を含有する分子）をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。
【００６１】
「特異的結合」あるいは「免疫相互作用」によって、抗体が、所望する抗原の１つ以上の抗原決定基と相互作用し、他のポリペプチドとは反応（即ち、結合）しないか、もしくは非常に小さな親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することが意味される。
【００６２】
本明細書中で使用される「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という語は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異性を示す抗原との間で発生する型の、非共有結合的相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、その相互間の解離定数（Ｋｄ）という語で表すことができ、より小さなＫｄはより大きな親和性を示す。選択したポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の手法を用いて定量される。そのような手法のうちの１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成速度および解離速度の測定であり、これらの速度は、対になって複合体を形成するものの濃度、相互作用の親和性、両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的媒介変数によって異なる。このように、「結合速度定数（Ｋｏｎ）」および「解離速度定数（Ｋｏｆｆ）」は両方、濃度、ならびに結合および解離の実測速度の算出によって決定され得る（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−８７（１９９３）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比によって、親和性に関係しない変数を全て相殺することが可能となり、これは解離定数Ｋｄと等しい。（全般的なことは、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９−４７３を参照のこと）。
【００６３】
候補ポリペプチドは、ライブラリから得ることができる。好ましいライブラリとしては、ヒト単鎖抗体ライブラリ、天然ペプチドライブラリ、およびランダムペプチドライブラリが挙げられる。例示的なライブラリには、Ｍｅｈｔａ ＩおよびＭｅｈｔａ ＩＩファージライブラリが含まれる（Ｇｅｎｎａｒｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５（１）：１９３−２０７（２００４）を参照のこと）。Ｍｅｈｔａ Ｉライブラリは、１５０億のｓＦｖ挿入フラグメントを含有し、Ｍｅｈｔａ ＩＩは１２０億のｓＦｖ挿入フラグメントを含有する。天然ペプチドライブラリは、当該分野で周知である（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（２）：８３７−４６（２００２）を参照のこと）。天然ペプチドライブラリは、約２５から約２００アミノ酸の長さのペプチドを含有することが好ましく、これはこの大きさのペプチドが天然の抗原決定基であることが例証されているためである（Ｆａｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：４３（１９９７）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：８３７（２００２）を参照のこと）。ランダムペプチドライブラリは、当該分野で周知であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および他の供給元から入手可能である。ライブラリ挿入フラグメントは、増幅して本発明のウイルス提示ベクターに連結させることもできるし、この挿入フラグメントを宿主ライブラリから切り出して、ウイルス提示ベクター内に連結させることもできる。
【００６４】
（免疫グロブリンポリペプチド）
融合タンパク質はさらに、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含有する。「少なくとも一領域」によって、免疫グロブリン分子の任意の一部が含まれることが意味され、これは例えば、軽鎖、重鎖、Ｆｃ領域、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域、あるいはこれらの任意のフラグメントもしくは組み合わせである。好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１）のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含有する。
【００６５】
（膜貫通部分）
膜貫通部分（または膜貫通ドメイン）は、細胞膜あるいは細胞小器官の膜のような、細胞の生体膜を横切って伸びることのできる複数のアミノ酸である。膜貫通部分は、ウイルスキャプシド表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜の内部に入っていき、繋ぎ留められたままになることができるポリペプチドである。本発明の融合タンパク質に含まれる場合、膜貫通部分は、その融合タンパク質を、ウイルスキャプシド表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜に局在させることができる。膜貫通部分は、レンチウイルス膜貫通部分のようなウイルスの膜貫通部分である。レンチウイルス膜貫通部分としては、例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＣＡＥＶ、ＢＬＶ、およびＦＩＶあるいはこれらの機能的フラグメントに由来するエンベロープポリペプチドが挙げられる。
【００６６】
ＨＩＶ−１ ｇｐ６０エンベロープポリペプチドは、約８５６アミノ酸からなるポリペプチドであって（表２の配列番号１およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ４０７８３、ＡＡＡ７６６７１、ＢＡＡ１２９９５、およびＰ０３３７７を参照のこと）、タンパク質分解酵素によってプロセシングされてｇｐ１２０とｇｐ４１ポリペプチドとなる。ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０エンベロープポリペプチドのアミノ酸配列を、表２の配列番号１にて提供する。ｇｐ４１ポリペプチドは、配列番号１の５１２〜８５６番アミノ酸を含む（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０５７８５６も参照のこと）。ｇｐ４１の膜貫通部分は、一般に、ｇｐ１６０ポリペプチドのおよそ６７５〜７１５番アミノ酸の間に位置する。加えて、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号において、ＳＩＶ由来のＡＡＴ４１７２９、ＣＡＥＶ由来のＰ３１６２７、ＢＩＶ由来のＰ１９５５７、ＢＬＶ由来のＰ０３３８０、およびＦＩＶ由来のエンベロープであるＮＰ＿０４０９７６によって提供される。
【００６７】
【表２】
あるいは、膜貫通部分は、ＣＤ２８、ＣＤ８、もしくはＩｇＭ膜貫通部分または機能的フラグメントのような、哺乳動物の膜貫通部分である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、膜貫通部分の「機能的フラグメント」には、ウイルス粒子の表面および／または哺乳動物細胞の細胞膜へ融合タンパク質を局在させることのできる膜貫通部分の任意の部分あるいはフラグメントが含まれる。例えば、膜貫通ドメインには、アミノ酸配列ＮＲＶＲＱＧＹＳ（配列番号１４）あるいはＧＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１５）が含まれる。
【００６９】
一般に、膜貫通部分は、その末端に正に荷電したアミノ酸（リジンおよびアルギニン等）を有し、非荷電アミノ酸を中央に有する。膜貫通部分は、これらのポリペプチドを小胞体へ標的化させるＮ末端シグナル配列を有することができる。通常、２５以上のアミノ酸長からなるαヘリックス膜貫通ドメインは、細胞膜の両端に渡るのに十分なものである。あるいは、膜貫通部分は、１つ以上のβバレル構造を有するポリペプチドを含み得る。例示的な一膜貫通部分としては、グリコホリンＡ
【００７０】
【数１】
由来の膜貫通ドメインが含まれる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインには、２つ以上のβシートを有するポリペプチド配列が含まれる。
【００７１】
膜貫通部分は、膜貫通タンパク質およびこれらの膜貫通ドメインのＴＭｂａｓｅにおいて提供されるポリペプチドを含む（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ（１９９３）、ＴＭｂａｓｅ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４，１６６を参照のこと）。ＴＭｂａｓｅデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよび他のデータベース源に由来する情報を含有している。本発明の膜貫通部分には、ＴＭｐｒｅｄプログラムを使用して同定されるポリペプチドが含まれる。ＴＭｐｒｅｄプログラムは、天然膜貫通タンパク質のＴＭｂａｓｅデータベースの統計的分析に基づくアルゴリズムを用いて、膜貫通領域およびそれらの方向性の予測を行う。ポリペプチド中の膜貫通領域を判定することのできる他のプログラムとしては、ＧＲＥＡＳＥ、ＴＭＨＭＭ、およびＴＭＡＰが含まれる。
【００７２】
（ウイルスキャプシド上に候補ポリペプチドを提示する方法）
融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス提示ベクターを、パッケージング細胞に導入する。本明細書中で使用する場合、細胞へのＤＮＡの導入は形質導入と呼ばれ、あるときは形質移入または感染としても公知である。
【００７３】
一般に、提示ベクターは、１つ以上の連結させていないベクターと組み合わせて形質移入によって導入するが、当業者は、本発明の手法に、核酸ベクターをレシピエント細胞に導入する他の方法（マイクロインジェクションが挙げられるが、これに限定されない）を採用することができることを認識する。好ましい形質移入手段は、リン酸カルシウム、ＦＵＧＥＮＥ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、およびＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）である。パッケージング細胞は、さらに、エンベロープベクターおよびヘルパーベクターで形質移入する。提示ベクター：エンベロープベクター：ヘルパーベクターの比は、約２：１：２である。あるいは、提示ベクター：エンベロープベクター：ヘルパーベクターの比は、約１：２：１である。
【００７４】
ベクターをパッケージング細胞に導入した後、パッケージング細胞は、ウイルスキャプシド上の融合タンパク質および候補ポリペプチドをコードする核酸を含有する１つ以上のウイルス粒子を産生する。必要に応じて、パッケージング細胞が産生したウイルス粒子を、当業者に周知の任意の手段によって精製および／または濃縮する。例えば、続いて、選択マーカー（例えばｅＧＦＰ）をコードする核酸を発現するウイルス粒子を、発現された選択マーカーを検出することによって蛍光補助細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によって分別する。あるいは、ウイルス粒子を濾過（例えば０．４５μｍおよび／または０．２２μｍのフィルターを通す濾過）することによって回収し、１００，０００×ｇの遠心分離によって沈殿させる。
【００７５】
その表面上に候補ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させたウイルス粒子を使用して、対象となる抗原（例えば標的抗原）に結合する候補ポリペプチドを同定することができる。本発明の融合タンパク質を含有する１つ以上のウイルス粒子を標識した（例えばＦＩＴＣ等の蛍光標識を抗原に化学的に接着させた）標的抗原に接触させる。ウイルス粒子は溶液中で提供される。あるいは、ウイルス粒子は固体支持体に接着されている。固体支持体としては、例えば、チップ、ビーズ、紙、またはポリスチレンが挙げられる。標識標的抗原は、候補ポリペプチドと接触して結合し、標的抗原が結合した候補ポリペプチドを有するウイルス粒子を、ＦＡＣＳまたは当業者に周知の他の適切な手段によって選別する。候補ポリペプチドをコードする核酸配列は、直接、または増殖後に、配列決定され得る。このようにして、標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定することができる。
【００７６】
（哺乳動物細胞の表面上にて候補ポリペプチドを提示させる方法）
本発明はまた、哺乳動物細胞の表面上にて候補ポリペプチドを提示させるための方法を提供する。これは、例えば、ポリペプチド、抗体、あるいは抗体フラグメントを含むライブラリをスクリーニングするのに有用である。ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化、ならびに硫酸化）が、重要な構造的役割を果たしていることが、近年認識されている。したがって、本発明の用法によって産生されたポリペプチドは、こうした翻訳後修飾を含有し、一方、細菌内で産生されたポリペプチド（例えばファージディスプレイ法を使用したもの）は、こうした翻訳後修飾を欠くこととなる。
【００７７】
上記のように融合タンパク質をコードする核酸を含有するウイルス提示ベクターでパッケージング細胞を形質移入することによって、候補ポリペプチドは哺乳動物細胞の表面上に提示される。必要に応じて、融合タンパク質をコードする核酸は、ウイルスキャプシドの表面上で候補ポリペプチドが提示されるように発現される。しかし、ウイルスキャプシドの表面上での融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞の表面上での融合タンパク質の発現を達成するのに必須ではないことを、当業者は認識する。
【００７８】
続いて、哺乳動物提示細胞にウイルス粒子が感染するように、パッケージング細胞によって産生されたウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。細胞１個当たり平均してわずか０〜１個の取り込みしか提供しないこととなる感染の多重度（ＭＯＩ）で、ウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。例えば、感染の多重度およそ１で、ウイルス粒子を哺乳動物細胞に接触させる。一般に、ウイルスベクターは構成的に哺乳動物細胞に取り込まれる。あるいは、この取り込みは、一過性のものである。融合ポリペプチドの膜貫通部分が存在することによって、哺乳動物細胞表面に発現する融合タンパク質は、候補ポリペプチドが細胞膜上で提示されるように標的化される。ＭＯＩに基づいて、各哺乳動物細胞は、融合タンパク質をコードする独自の核酸を含有し、それによって独自の候補ポリペプチドをその表面上に有する。例えば、抗体ライブラリ（例えばＭｅｈｔａライブラリの一方あるいは両方）を使用する場合、ウイルスベクターを産生するのに、各々が独自の抗体をその細胞表面に発現させる、２７０億の哺乳動物細胞を得ることが可能なはずである。
【００７９】
例示的な哺乳動物提示細胞としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４細胞株が挙げられる。別の例示的な哺乳動物提示細胞としては、Ｍ１２ｇ３Ｒ（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞株が挙げられる（Ｒｅｉｄｅｒら、２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：２１３−１５を参照のこと）。
【００８０】
哺乳動物提示細胞は、細胞に構成的あるいは一過的にのいずれかで形質移入された核酸を構成的に変異させ得る細胞株である（Ｃｕｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：１１２９，（２００２）およびＰｒｅｓｔａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１０９６（２００２）の編集者総説を参照のこと）。例えば、哺乳動物提示細胞は、ラモス−バーキットリンパ腫細胞株、ＢＬ−２細胞、ＣＬ−０１細胞（Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４１５：８０２，２００２）またはニワトリＤＴ−４０Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｓａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ４１２：９２１，２００１）である。あるいは、活性化誘導性シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）タンパク質（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，２０００；Ｄｉ Ｎｏｉａ，２００２；Ｐｅｒｔｅｒｓｅｎ−Ｍａｈｒｔ，２００２；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，２００２およびＧｅａｒｈａｒｔ，２００２の編集者総説）、ＤＮＡポリメラーゼι（Ｆａｉｌｉ，２００２）、あるいは免疫グロブリンミュータソーム（ｍｕｔａｓｏｍｅ）の構成要素であるＴＬＳポリメラーゼファミリーの他のメンバーを過剰発現するように、哺乳動物細胞は修飾されている。ＡＩＤタンパク質は、哺乳動物および他の高等脊椎動物における抗体の成熟に必要とされ、体細胞超変異（ＳＨＭ）、クラススイッチ組換え、および遺伝子変換を促進する。
【００８１】
哺乳動物提示細胞による融合タンパク質の変異は、対象とする標的抗原に対する結合親和性および／または特異性が変化、増加、または減少した候補ポリペプチドをもたらす。例えば、候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである場合、変異は抗体の超変異を模倣する。
【００８２】
必要に応じて、候補ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞（例えば、感染した細胞）は、候補ポリペプチドを発現しない哺乳動物細胞から分離（例えば選別）される。感染した哺乳動物細胞を選別することによって、細胞集団から感染していない細胞を除去することが可能となり、次いで、標識抗原との非特異的な結合相互作用の発生頻度を減らす。さらに、哺乳動物提示細胞が上記のように核酸を変異させることができる場合、細胞を選別することにより、例えば、生体内免疫反応の過程でのＢ細胞の親和性成熟の過程を繰り返す。
【００８３】
感染した哺乳動物細胞は、ｅＧＦＰのような選択マーカーを検出することによって選別される。あるいは、感染した哺乳動物細胞は、抗原に結合する細胞を識別することによって選別される。例えば、細胞を、ある濃度で、標識された標的抗原に接触させる。標識された標的抗原を、溶液中あるいは固体支持体上にて、哺乳動物細胞と混合する。固体支持体としては、例えば、チップ、ビーズ、紙、プラスチック、あるいは他の固体もしくは半固体の手段が挙げられる。標的抗原と哺乳動物細胞とが溶液内に存在する場合、ＦＡＣＳまたは他の適切な選別手段を使用して結合した抗原と候補ポリペプチドとの複合体を識別し、結合していない標識標的抗原および結合していない哺乳動物細胞に結合した複合体を分離する。対照的に、標的抗原が固体支持体上にある場合、カラムクロマトグラフィーを使用して、標識した抗原に結合している候補ポリペプチドまたは抗体を提示している哺乳動物細胞を分離する。その抗原は、クロマトグラフィーカラム内でビーズ（例えばセルロースまたはセファロースビーズ）に結合し、哺乳動物細胞を含有する溶液をカラムに加える。結合していない哺乳動物細胞は１回以上の洗浄によって、カラムから除去される。次いで、結合した哺乳動物細胞は、高ｐＨあるいは低ｐＨ溶液、界面活性剤溶液、高塩溶液、あるいはカオトロピック剤（例えば尿素および（あるいは）グアニジン）等で、カラムから溶出される。
【００８４】
好ましくは、哺乳動物細胞は、選択マーカーの発現と抗原結合の両方によって選別される。
【００８５】
必要に応じて、選別手順の間に感染した哺乳動物細胞を培養液中で増殖させる。この増殖は、本質的に、クローン的であっても非クローン的であってもよい。続く選別手順にて使用する抗体の量は、減らされる。例えば、標的抗原の濃度を、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、あるいは９９．９９９％減らす。即ち、このような様式で、本発明の方法を用いて、親和性選択工程前の候補ポリペプチドの平均親和性と比較して、高い特異性および親和性で標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する。
【００８６】
選択された候補ポリペプチドをコードする核酸配列を決定する。例えば、選択した哺乳動物細胞集団を界面活性剤等で溶解し、候補ポリペプチドをコードする核酸をＰＣＲによって増幅して、適切なベクター内にクローニングする。必要に応じて、増幅した挿入フラグメントをレンチウイルス提示ベクター内にクローニングし、上記のようにこれを使用して新規のウイルス粒子を産生する。これらの粒子を使用してさらなる哺乳動物細胞を感染させることが可能であり、候補ポリペプチド提示法は、１回以上繰り返すことができる。
【００８７】
本発明の方法によって、可溶性候補ポリペプチドの産生もまた可能となる。ウイルス粒子または哺乳動物細胞の表面上に融合タンパク質が発現した後に、融合タンパク質の膜貫通領域をコードする核酸を削除することによって、可溶性候補ポリペプチドが生成される。例えば、これらの方法は、膜結合抗体を使用して、抗体産生細胞を標的細胞あるいは標的組織に局在化させ、続いて、インビボで特定の細胞型または組織（例えば、癌細胞）へ可溶性抗体を送達するのに有用である。この可溶性抗体は、細胞毒性、細胞分裂阻害性、またはアポトーシス誘導性であり得る。
【００８８】
例えば、上記のウイルス提示ベクターは、さらに、例えばＣｒｅリコンビナーゼが認識するｌｏｘＰ等、２つ以上のシグナル部位（あるいはシグナル配列）を含有し得る。Ｃｒｅ−ｌｏｘ反応は、以下のように機能する。Ｐ１バクテリオファージ環化組換え（Ｃｒｅ）リコンビナーゼは、対象とする核酸分子の両端に隣接する一対のｌｏｘＰ結合部位を認識する。ここで、ｌｏｘＰ部位は、融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸配列に隣接し得る。必要に応じて、膜貫通部分（「スペーサーアミノ酸」と名付ける）に隣接する１つ以上のアミノ酸をコードする核酸を使用する。スペーサーアミノ酸は、融合タンパク質の正確な折り畳みを促進する。ＬｏｘＰ部位は、３４ｂｐの長さで、回文構造（相補的）配列である１３ｂｐが隣接する、８ｂｐのコアから構成されており、このコアは方向性を決定する。ｌｏｘＰが隣接する配列は、「ｆｌｏｘｅｄ（ｌｏｘＰが導入された）」と呼ばれる。Ｃｒｅ酵素は、相補的な配列を有する２つのｌｏｘＰ部位を繋げる。対となっているｌｏｘＰの向きに応じて、異なる結果が達成される場合がある。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系では、２つのシグナル部位間の核酸配列が削除される、あるいは、このシグナル部位が同じ核酸分子上にある場合には反転される。介在するＤＮＡは、削除もしくは環化されるか、または反転もしくは転位置され得る。必要に応じて、ウイルス提示ベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸を含有する場合もある。テトラサイクリン／ドキシサイクリン等の誘導性プロモーターが、Ｃｒｅの発現を駆動することができる。必要に応じて、ｌｏｘＰ部位は、融合タンパク質の膜貫通部の両端に隣接するのに加えて、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列の両端に隣接する。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列は、ｌｏｘＰ部位の上流（５’方向）あるいは下流（３’方向）に位置する。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導することができることによって、可溶性抗体を産生する能力が提供される。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を別のベクターに配置し得るか、または宿主細胞のゲノムに構成的に組み込まれている。
【００８９】
部位特異的リコンビナーゼ系の別の例は、酵母由来のｆｌｐ系である。Ｆｌｐリコンビナーゼは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミドがコードする４５ｋＤのタンパク質である。上記のウイルス提示ベクターは、ＦＬＰリコンビナーゼが認識する２つ以上の組換え標的（ＦＲＴ）をさらに含有し得る。例えば、２つのＦＲＴは融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸の両端に隣接する。
【００９０】
組換え活性を上昇させた修飾ＦＬＰリコンビナーゼもまた、記載されている（Ｂｕｃｈｏｌｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６．６５７−６６２（１９９８）を参照のこと）。適切なＦＲＴ配列は、：
【００９１】
【数２】
である。ＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴに結合し、その結果、膜貫通部分をコードする核酸部分が切除され、可溶性抗体が産生される。
【００９２】
例えば、癌細胞の表面上で腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に免疫特異的に結合する抗体を発現する哺乳動物提示細胞が、本発明の哺乳動物抗体提示法を用いて同定される。抗体産生哺乳動物細胞は、哺乳動物被験体（例えば、癌に罹患したヒト患者あるいはその抗体を必要とする患者）に提供され、哺乳動物細胞表面上の抗体は腫瘍抗原へ向かい、これと特異的に結合する。抗体産生細胞の検出および局在は、検出可能なタンパク質部分の発現を検出することによって決定される。抗体産生哺乳動物細胞が、腫瘍抗原を提示する細胞に局在化（および結合）すると、Ｃｒｅリコンビナーゼが融合タンパク質の膜貫通部分をコードする核酸を除去するように、（例えば、化学的手段、光、酸素、あるいは他の誘導手段によって）Ｃｒｅリコンビナーゼが誘導される。膜貫通領域の存在しないときは、その融合タンパク質はリーダーペプチドによってＥＲに向けられ、可溶性抗体として細胞外へ分泌される。次いで、この分泌された可溶性抗体は、標的腫瘍細胞上で局所的に作用する。必要に応じて、抗体産生哺乳動物細胞は、毒素をコードする核酸も含有し得、この毒素も哺乳動物提示細胞によって産生される。この毒素は、可溶性抗体と作動可能に連結され得る。
【実施例】
【００９３】
（実施例１ ウイルス提示ベクターとベクター系の産生）
ウイルス提示ベクター（図１に概説される）を、以下のように構築する。ＭｅｈｔａＩ／ＩＩライブラリ由来の、候補ペプチドをコードする１つ以上の挿入フラグメントを増幅することによって、融合タンパク質をコードする核酸を産生する。例示的なｓＦｖ挿入フラグメントとしては、ヒトサイクリンＴ１のＴＲＭモチーフに免疫特異的に結合するｓＦｖである「ＰＳ１１」；ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質のアルギニンに富む領域に免疫特異的に結合するｓＦｖである「Ｅ４６」；ＣＣＲ５のＮ末端に免疫特異的に結合するｓＦｖである「Ａ８」；およびＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒのα鎖）に免疫特異的に結合するｓＦｖである「抗Ｔａｃ」が挙げられる。これらの挿入フラグメントを、免疫グロブリンリーダータンパク質をコードする核酸の下流、かつヒトＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域をコードする核酸の上流に連結させ、その結果、発現した核酸が翻訳されたときに、候補ポリペプチドはリーダーポリペプチドおよび免疫グロブリン分子と作動可能に連結される。核酸分子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって制御される。免疫グロブリン分子をコードする核酸の下流は、ｇｐ４１の膜貫通部分をコードする核酸である。高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする核酸分子を、ＣＭＶプロモーターによって制御されるＩＲＥＳの下流に置く。
【００９４】
ウイルス提示ベクターのタンパク質発現分析を、ＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭのような当業者に周知の形質移入方法を用いて２９３Ｔ細胞に一過的に形質移入し、続いてｇｐ４１に特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析を行うことによって実施する。図４Ｂにて示されるように、本発明の融合タンパク質は、一過的に形質移入した２９３Ｔ細胞にて発現される。レーン１は、モック処理した細胞（ＤＮＡは加えされていない）を示し、レーン２は、ＰＳ１１ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示す。レーン３は、ＰＳ１１ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、これはｇｐ４１膜貫通部分をｌｏｘＰ配列の一方の端に隣接させてある。レーン４は、Ｅ４６ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、レーン５は、Ｅ４６ ｓＦｖを含有する融合タンパク質の発現を示し、これはｇｐ４１膜貫通部分をｌｏｘＰ配列の一方の端に隣接させてある。
【００９５】
融合タンパク質の細胞膜への局在は、ＦＡＣＳ分析を用いて確認する。例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）ＰＥ結合体が、ｓＦｖ−ＩｇＧ−ｇｐ４１融合タンパク質の細胞表面発現の検出に有用である。典型的なＦＡＣＳ分析の結果を表３にて示す。
【００９６】
【表３】
蛍光標識した抗体を使用するＦＡＣＳ分析によって、細胞表面上で発現した融合タンパク質が、標的抗原に免疫特異的に結合し得ることが確認された。例えば、ビオチン化ＴＲＭペプチド（２ｍＭ、ＭＷ４１４６．７、Ｅｘｔｒａｓｖｉｄｉｎ ＰＥ（Ｓｉｇｍａ Ｅ−４０１１）と組み合わせる）を、ＦＡＣＳ実験において使用した。その結果を、表４に示す。これらの結果は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現した含ＰＳ１１融合タンパク質がその標的抗原に結合し得ることを示した。
【００９７】
【表４】
ヘルパーベクターｐＣＭＶΔＲ８．２およびエンベロープベクターもまた、図１に示される。ヘルパーベクターは、ｉｅＣＭＶプロモーターの制御下にあるｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子を含有する。エンベロープベクターは、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（「ＶＳＶ−Ｇ」）を含有し、これはｉｅＣＭＶとＡｎ（ポリアデニル化配列）とに、作動可能に連結されている。
【００９８】
（実施例２ ウイルスキャプシド上の抗体提示）
ＣａＣｌ２またはＰＯＬＹＦＥＣＴＴＭ形質移入剤を使用して、ＭｅｈｔａＩ／ＩＩライブラリ由来のｓＦｖ挿入フラグメントを含有するウイルス提示ベクターの集団を、ヘルパーベクターおよびエンベロープベクターと一緒に２９３Ｔ細胞へ同時形質移入する。あるいは、構成的にＶＳＶ−ｇを発現する２３９Ｔ細胞株を使用する。融合タンパク質ウイルス粒子を産生するために、８０％〜１００％のコンフルエンスにまで増殖した２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍのプレート上にて、２倍ＨｅＢＳ溶液において約１２μｇのウイルス提示ベクター（１．０μｇ／μｌ）、約１２μｇのエンベロープベクター（１．０μｇ／μｌ）、約６μｇのヘルパーベクターｐＣＭＶΔＲ８．２（０．５μｇ／μｌ）、６２μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を含有する形質移入カクテルを用いて形質移入する。感染後約３７時間および６１時間において、ウイルス粒子が含まれる上清（マスターウイルスストック）を回収し、濾過して−８０℃で保存する。あるいは、感染後４８時間、７２時間、９６時間目に、マスターウイルスストックを回収する。必要であれば、ＳＷ２８ローターにて１７，０００ｒｐｍで２時間遠心分離することによって、ウイルス粒子上清を濃縮する。沈殿物を、１／１０量の培地に再懸濁する。ウイルス粒子は、蛍光補助細胞選別器（ＦＡＣＳ）でｅＧＦＰを検出することによって分別する。多重感染度（ｍｏｉ）は、２９３Ｔ細胞を感染させ、続いてｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリー定量することによって決定する。ウイルス粒子への融合タンパク質の取り込みは、ウエスタン分析を用いて測定する。遠心分離によってウイルスストックを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を加え、続いてＰＡＧＥによって分離し、メンブランに移して、抗ｇｐ４１または抗ヒトＩｇＧでブロッティングする。
【００９９】
融合タンパク質の標的抗原への特異的結合は、ウイルス粒子捕捉実験によって実証する。標的抗原でマルチウェルプレートをコーティングし、（例えば、１％ＢＳＡで）ブロッキングする。これを、上記のように調製したウイルス粒子と一緒にインキュベートする。融合タンパク質の標的抗原への特異的結合の指標である逆転写活性は、３Ｈを使用して測定し、値（ＲＴ値）を割り当てる。一連のウイルス粒子捕捉実験の結果を、表５に示す。この結果は、ＰＳ１１含有融合タンパク質を発現するレンチウイルス粒子が、その標的抗原と特異的に結合することを示している。図４Ｃにて示したように、捕捉された抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して染色した。
【０１００】
【表５】
（実施例３ 哺乳動物細胞抗体提示）
マスターウイルスストックに、哺乳動物提示細胞の懸濁液を、約１のＭＯＩで一晩接触させる。抗Ｆｃ抗体結合能またはｅＧＦＰ含量に基づいて、この哺乳動物細胞をＦＡＣＳで選別する。選別した細胞を、あらかじめ標識した標的抗原に接触させる。適切な標識としては、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン／ビオチン、および常磁性ビーズが挙げられる（図１１を参照のこと）。続いて、結合した抗原を有する選別された哺乳動物細胞を選択する。選択後、次回の選択のため、選択した細胞集団を培地中で増殖させる。あるいは、選択した細胞の集団から核酸を採取し、候補ポリペプチドをコードする核酸を増幅して、１回以上のさらなる選択のために提示ベクター内に挿入する。抗原に結合する目的の候補ポリペプチドの配列を得るために、選択した細胞を溶解し、抗原結合哺乳動物細胞内に含有される、候補ポリペプチドをコードする核酸配列をベクターにクローニングし、次いで配列決定する。
【０１０１】
２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上での融合タンパク質の細胞表面発現を実証するために、実験を行った。１×１０６個の２９６Ｔ細胞を、６ウェルのマルチウェルプレートに播種した。表６に示したように、細胞は、リポフェクタミンを使用して、２つのベクター（本発明の候補ポリペプチド含有する融合タンパク質を発現するベクターおよびＣＭＶプロモーターの制御下にてＧＦＰを発現するベクター）で同時形質移入した。感染後約４８時間にて、感染させた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡで収集した。
【０１０２】
【表６】
収集した形質移入細胞を、ＧＦＰの発現について分析し、抗ヒトＩｇ−ＡＰＣ結合体で染色して、Ｆｃの細胞表面での発現を実証した。
【０１０３】
サンプル１は、非感染細胞を含有する。サンプル２は、挿入物を有さないｐＣＤＮＡベクターを含有する。サンプル３は、Ｃ９タグを有さないｐＣＤＮＡ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１を含有する。サンプル４は、ＧＦＰコントロール挿入物を含有する。サンプル５は、レンチウイルスｇｐ４１膜貫通領域の一部（ＴＭ領域の１〜５０番アミノ酸に相当する）を含有する。サンプル６は、ヒトＣＤ８膜貫通領域を含有する。サンプル７は、完全長のレンチウイルスｇｐ４１膜貫通領域を含有する。サンプル８は、ヒトＣＤ２８膜貫通領域を含有する。
【０１０４】
図１２Ｄに示したように、ＣＤ８およびＣＤ２８膜貫通領域によって、融合タンパク質は確固として提示細胞表面へ標的化される。
【０１０５】
２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上にて融合タンパク質が細胞表面発現することを実証するために、さらなる実験を行った。１×１０６個の２９３T細胞を、６ウェルのマルチウェルプレートに播種した。表７に示したように、リポフェクタミンを使用して、ＩＲＥＳを含有する多機能ベクターで細胞を同時形質移入した。感染後約４８時間にて、感染させた細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡで収集した。
【０１０６】
【表７】
収集した形質移入細胞をＧＦＰの発現について分析し、抗ヒトＩｇ−ＡＰＣ結合体で染色して、Ｆｃの細胞表面発現を実証した。
【０１０７】
サンプル１は非感染細胞を含有する。サンプル２は、ＣＭＶプロモーター制御下にてＧＦＰを発現するｐＳＩＮベクターを含有する。サンプル３は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＺｎＧｒｅｅｎを含有し、ここでＩＲＥＳ配列はｐＳＩＮ−ｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターから得た。サンプル４は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有し、よってＧＦＰを発現する。サンプル５は、ｐＳＩＮ−ｍｄｅｌｔａＵ３−ＣＭＶ−ＰＳ１１−Ｆｃ−ｇｐ４１−ＩＲＥＳ−ＺｎＧｒｅｅｎを含有し、ここでＩＲＥＳ配列は、ＨＡ−ＺｓＧｒｅｅｎｓベクターから得たＩＲＥＳ配列から得た。サンプル３〜５の膜貫通領域は、レンチウイルスｇｐ４１の完全長膜貫通ドメインである。
【０１０８】
図１３Ｄに示したように、本発明の多機能ベクターによって、融合タンパク質は確固として提示細胞の表面に標的化される。
【０１０９】
（実施例４ ヒト抗体の親和性選択）
選択した抗原結合哺乳動物細胞を、非結合哺乳動物細胞から分離し、培地中で増殖させて、標的抗原特異的抗体を産生する哺乳動物細胞の数を増やす。標的抗原濃度を、５０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、あるいはそれ以上減らして、実施例４の抗体提示法を繰り返す。例えば、第１回目の選択では、約２００ｎｇ／ｍｌの抗原濃度を使用し、第２回目の選択ではこの濃度を約１ｎｇ／ｍｌに減らす。
【０１１０】
（実施例５ ヒト抗体の親和性成熟）
非常に高い特異性および非常に高い結合親和性（Ｋｄが小さい）で標的抗原に結合する候補ポリペプチド（例えば、抗体）を同定することが望ましい。本発明は、親和性成熟による特異性の高い抗体の産生を提供する。
【０１１１】
親和性成熟の１つの方法は、高い変異速度を有する提示細胞株の使用を包含する。変異しやすい細胞株の例は、例えばラモス−バーキットリンパ腫細胞株のようなリンパ腫細胞株である。上記実施例４に記載した提示親和性選択法を利用して、標的抗原に対する親和性が増大した変異融合タンパク質由来の抗体を発現する哺乳動物細胞を選択する。
【０１１２】
親和性成熟の別の方法は、提示細胞内での活性化誘導導シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）の発現誘導を包含する。ＡＩＤ活性の上昇は、候補ポリペプチドの高い変異速度をもたらす。図１に示したウイルス提示ベクターを、プロモーターの制御下にてＡＩＤタンパク質をコードする核酸を含むように、改変し得る。あるいは、本発明は、構成的または誘導性プロモーターの制御下に、安定に組み込まれたＡＩＤ遺伝子を有する提示細胞を提供する。
【０１１３】
（実施例６ 抗体発現の誘導）
実施例１にて作製したウイルス提示ベクターを、ｔｅｔＲ誘導性エレメントの挿入によって改変する。２つのｔｅｔＯ配列鎖状体を、ＣＭＶ最小プロモーターに融合させる。ｔｅｔＲ配列は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の下流に挿入する。こうして、融合タンパク質の産生は、テトラサイクリンを添加することによって調節される。
【０１１４】
（実施例７ Ｃ９タグを使用する抗体細胞表面発現の定量）
本発明は、哺乳動物提示細胞表面上で発現した抗体の密度を測定するための方法を提供する。抗体の細胞表面発現の定量によって、抗体提示の効率、および、例えばウイルス提示ベクター内のプロモーターおよび／またはエンハンサーの変更による、改善の判定が可能となる。
【０１１５】
抗体細胞表面発現の定量は、発現した融合タンパク質に含まれるタグを使用して実施される。あるいは、定量は、単鎖抗体に結合する標識ペプチド（例えば、ビオチン化ペプチド）を使用して行われる。本発明において、任意の手段（例えば、ＦＡＣＳ）によって測定することが可能なもので検出することが可能な任意のタグを使用することができる。例示的なタグの１つは、Ｃ９ペプチドタグ（ＧＧＴＥＴＳＱＶＡＰＡ、配列番号１６）である。Ｃ９タグは、モノクローナル抗体１Ｄ４によって認識される。この抗体を検出できる任意の手段（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、発現量を定量することができる。Ｃ９タグは、免疫グロブリン分子部分のＣ末端、かつ膜貫通部分のＮ末端に位置する。本発明の実施形態において、Ｃ９タグは、リンカー（例えばＳＧＧＳＳ（配列番号１７）のような可動性リンカー）によって免疫グロブリン分子部分に接続される。Ｃ９タグはリンカーのＣ末端にＸｂａＩ部位を挿入することによってリンカーのＣ末端（１個のアミノ酸、アルギニン（Ｒ）をコードする）に連結される。Ｃ９リンカーを含有する例示的なウイルス提示ベクターを、以下の表８に示す。ｇｐ４１の細胞外領域は１８残基を有し、膜貫通部分は２４残基、細胞内領域は８残基を有する（配列番号１４のｇｐ４１タグ）。提示ベクター４は、１〜５０番のアミノ酸を含有する切断されたｇｐ４１ポリペプチドをコードし、提示ベクター６は、完全長のｇｐ４１ポリペプチドをコードする。ＣＤ８の細胞外領域は１２残基を有し、膜貫通領域は２１残基、細胞内領域は１１残基を有する（ＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶ、配列番号１７）。ＣＤ２８の細胞外領域は３９残基を有し、膜貫通領域は２７残基、細胞内領域は１３残基を有する。コントロールとして、融合タンパク質をコードする核酸を有さないｐＣＤＮＡ３ベクターを使用した。ｓｃＦｖ−４８は、ヒトＣＸＣＲ４に対する単鎖抗体である。
【０１１６】
【表８】
代表的な抗体の細胞表面発現の定量を、以下の通り実施した。２９３Ｔ細胞を、形質移入の約２４時間前に、６ウェルプレートに播種した（各ウェルに１×１０６個の細胞）。リポフェクタミン２０００ＴＭを使用して、ウイルス提示ベクターＤＮＡ（４μｇ）を形質移入した。形質移入後約４８時間にて、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、ＦＡＣＳのために細胞を収集した。抗体検出のため、α−Ｃ９一次抗体（ＩＤ４）を、１×１０５個の細胞当たり２μｌで使用し、α−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ標識二次抗体を１：５０希釈で使用した。ＦＡＣＳ分析は、上記のように、かつ当該分野で公知の通り実施した。この分析結果を、図１４および図１５に示す。図１４Ａは、ＦＡＣＳによって測定した、Ｃ９タグの発現に関して陽性であった細胞の割合を示す。Ｃ９を含有する融合構築物を発現する細胞の大部分（９４％以上）がＦＡＣＳを用いて同定されるが、Ｃ９タグを有さないコントロールベクターで形質移入した細胞集団で見られた陽性細胞は、極めて少数であった。図１４Ｂは、表８に列挙したウイルス提示ベクターで形質移入した細胞についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。切断されたか、または完全長のｇｐ４１ポリペプチドのいずれかを含有する融合タンパク質、およびＣＤ８またはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインを含有するタンパク質の発現を、形質移入した細胞のＭＦＩ値を測定することによって定量した。図１５Ａ〜Ｇは、表８にて記載したウイルス提示ベクターで形質移入した細胞についてのＦＡＣＳプロットを示す。
【０１１７】
（実施例８ エンベロープ組み込みシグナルを含有する構築物における抗体の細胞表面発現の定量）
本発明は、ｇｐ４１エンベロープ（ｅｎｖ）組み込みシグナルを含有する融合ウイルス提示ベクターを提供する。図１６は、いくつかの融合タンパク質構築物を示す。構築物１は、ｇｐ４１ ＴＭ領域の１〜５０番アミノ酸を含有する。構築物２は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含有する。構築物３は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含有する。構築物４は、作動可能にｇｐ４１ ｅｎｖ組み込みシグナルに連結されたＣＤ８膜貫通ドメインを含有する。構築物３は、ｇｐ４１ ｅｎｖ組み込みシグナルに作動可能に連結されたＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。表９に列挙した構築物を、以下のように２９３Ｔ細胞に形質移入した。２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート上に播種した（１×１０６個／ウェル）。リポフェクタミンを使用して細胞に形質移入し、形質移入から４８時間後に、５ｍＭ ＥＤＴＡで細胞を収集し、ＧＦＰおよびＦｃの細胞表面発現について、α−ヒトＩｇＧ−ＡＰＣを使用して分析した。結果を図１７および１８に示す。この結果は、ＣＤ８、ＣＤ２８、およびｇｐ４１ ＴＭドメインが、実質的に、形質移入された融合タンパク質の細胞表面発現をもたらすことを実証し；エンベロープ取り込みシグナルが存在するにせよ存在しないにせよ、ＣＤ８およびＣＤ２８は、ｇｐ４１ ＴＭよりも高レベルの細胞表面発現をもたらすことを実証している。
【０１１８】
【表９】
（実施例９ レンチウイルスで形質移入した細胞における抗体の細胞表面発現）
切断した（１〜５０番アミノ酸）か、または完全長のｇｐ４１ ＴＭ、ＣＤ８ ＴＭ、もしくはＣＤ２８ ＴＭのいずれかを含有するウイルス提示構築物（表１０に列挙）を、ｐＳＩＮレンチウイルス提示ベクターに導入し、哺乳動物細胞の表面上の融合タンパク質の発現を確認した。このレンチウイルスベクターは、検出を助けるためにＧＦＰの形態のＺｓＧｒｅｅｎを含有し、これを上記のように２９３Ｔ細胞に形質移入した。結果を図１９および図２０に示す。この結果は、レンチウイルスベクターに含まれるウイルス提示構築物が効率よく２９３Ｔ細胞内で発現され、融合タンパク質の細胞表面発現をもたらすことを実証している。
【０１１９】
【表１０】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載された具体的な手順の多数の等価物を、単に慣習的な実験を使用して、認識するかまたは認識することができる。そのような等価物は、本発明の範囲内であり、以下の請求項に包含されるとみなされる。本願にわたって引用された全ての引用文献、査定された特許、および公開された特許出願は、本明細書中に参考として援用される。これらの特許、出願および他の文献の適切な成分、プロセスおよび方法は、本発明およびその実施形態に対して、選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、本発明の例示的なウイルス提示ベクター、ヘルパーベクターおよびエンベロープ構築物の模式図である。
【図２】図２は、哺乳動物細胞による候補ポリペプチド提示を使用する、候補ポリペプチドの選択に関するプロセスの模式図である。
【図３】図３は、哺乳動物細胞による候補ポリペプチド提示を使用する、候補ポリペプチドの親和性成熟に関するプロセスの模式図である。
【図４】図４Ａは、抗体を含有する本発明の融合タンパク質の模式図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞における本発明の融合タンパク質の発現を示す、ウエスタンブロットの写真画像である。図４Ｃは、ウイルスキャプシド表面上でｓＦｖを発現するウイルス粒子を使用する、ウイルス捕捉実験の捕捉された抗原を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真画像である。
【図５】図５Ａ〜Ｈは、フローサイトメトリーによって測定されたｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１抗体のＣ８１６６−４５細胞への免疫特異的結合の検出を示す一連のグラフである。ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。各実験で使用したＤＮＡ量をグラフ下側に示す。
【図６】図６は、未処理細胞（Ｄｏｘ−）と比較した、ドキシサイクリン処理（Ｄｏｘ＋）による本発明のヒト単鎖抗体（ｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１）の誘導発現を示す棒グラフである。
【図７】図７は、Ｄｏｘ処理後の本発明のヒト単鎖抗体（ｓＦｖＴａｃ−ＩｇＧ１）の誘導発現が、薬物の除去によって可逆性であることを示す棒グラフである。
【図８】図８は、ｃｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰ部位を含むレンチウイルス提示ベクターの図解である。
【図９】図９は、本発明の機能的プロテオミクススクリーニングを用いる標的タンパク質の同定を示す、模式図である。
【図１０】図１０は、機能的プロテオミクスに有用な本発明のデータベースの作製を示す模式図である。
【図１１】図１１は、本発明のレンチウイルスおよび／または哺乳動物提示選択法のための、常磁性タンパクリポソームの使用を示す模式図である。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、候補ポリペプチドを発現するベクターおよびＧＦＰを発現するベクターを同時形質移入した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、ＩＲＥＳを含有する多機能ベクターを形質移入した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、Ｃ９タグで検出した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す一連の棒グラフである。
【図１５】図１５Ａ〜Ｇは、Ｃ９タグで検出した２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【図１６】図１６は、例示的な融合タンパク質の模式図である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、形質移入効率、ＭＦＩ値、および２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連の棒グラフである。
【図１８】図１８Ａ〜Ｉは、ＭＦＩ値、および、抗ヒトＩｇＧで染色された２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【図１９】図１９Ａ〜Ｄは、形質移入効率、ＭＦＩ値、および２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連の棒グラフである。
【図２０】図２０Ａ〜Ｇは、ＭＦＩ値、および抗ヒトＩｇＧで染色された２９３Ｔ哺乳動物提示細胞の表面上における融合タンパク質の細胞表面発現を示す、一連のＦＡＣＳ分析である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の表面上で候補ポリペプチドを提示する方法であって、
ａ） パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含むウイルス粒子を１つ以上産生するような条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；
ｉｖ）膜貫通部分、
を含む、工程；ならびに
ｂ）該ウイルス粒子と哺乳動物細胞とを、該哺乳動物細胞内で該融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で接触させる工程であって、該候補ポリペプチドが、該哺乳動物細胞の表面上で提示させる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記免疫グロブリン分子が、前記哺乳動物細胞の表面上にさらに提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、またはＣＨ３領域、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記候補ポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記パッケージング細胞が、
（ｉ） プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含む、ヘルパーベクター、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記候補ポリペプチドが、前記ウイルス粒子と前記哺乳動物細胞とを接触させる前に、該ウイルス粒子の表面上にて発現させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通部分が、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞が、ラモス−バーキットリンパ腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス粒子の表面上に候補ポリペプチドを提示する方法であって、該ウイルス粒子上に該候補ポリペプチドが提示されるように、パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が該融合タンパク質を含むウイルス粒子を１つ以上産生するような条件下で接触させる工程を包含し、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド；
ｉｉ） 候補ポリペプチド；
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部；
ｉｖ） 膜貫通部分；および
ｖ） エンベロープ組み込みシグナル、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記候補ポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはこれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記膜貫通部分が、ウイルス膜貫通部分あるいは哺乳動物膜貫通部分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記パッケージング細胞が、さらに、
（ｉ） プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含む、ヘルパーベクター、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ）パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含む１つ以上のウイルス粒子を生成するような条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド；
ｉｉ） 候補ポリペプチド；
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｉｖ） 膜貫通部分、
を含む、工程；
ｂ）該ウイルス粒子と１つ以上の哺乳動物細胞とを、該１つ以上の哺乳動物細胞がそれぞれ、該哺乳動物細胞の表面上にて提示される単一種の該候補ポリペプチドを産生するような条件下で接触させる、工程；
ｃ）該哺乳動物細胞の表面上で該単一種の候補ポリペプチドを提示している該哺乳動物細胞を、選別する工程；
ｄ）該選別した哺乳動物細胞と、標的抗原とを接触させる工程；ならびに
ｅ）該標的抗原に結合する哺乳動物細胞を同定し、それによって該標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
工程ｄ）およびｅ）を１回以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パッケージング細胞がさらに、
（ｉ） プロモーターにプロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸ベクターが、選択マーカーをコードする核酸をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜貫通部分は、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
候補ポリペプチドを親和性成熟させる方法であって、
ａ）パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含む１つ以上のウイルス粒子を生成するよな条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド、
ｉｉ） 候補ポリペプチド、
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および
ｉｖ） 膜貫通部分、
を含む、工程；
ｂ）該１つ以上のウイルス粒子と１つ以上の第２の哺乳動物細胞とを、該１つ以上の哺乳動物細胞がそれぞれ、該１つ以上の哺乳動物細胞の表面上にて提示される単一種の該候補ポリペプチドを産生するような条件下で接触させる工程；
ｃ）該哺乳動物細胞の表面上で単一種の該候補ポリペプチドを提示している該１つ以上の哺乳動物細胞を選別する工程；
ｄ）該選別された１つ以上哺乳動物細胞と標的抗原とを接触させる工程；
ｅ）該標的抗原に結合する哺乳動物細胞を同定する工程、
ｆ）該同定した哺乳動物細胞と漸減する濃度の該標的抗原とを接触させる工程；ならびに
ｇ）工程ｅ）およびｆ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記パッケージング細胞がさらに、
（ｉ） プロモーターにプロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物細胞が活性化誘導シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）タンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物細胞がラモス−バーキットリンパ腫細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸ベクターが選択マーカーを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
可溶性候補ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）パッケージング細胞とウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が１つ以上のウイルス粒子を生成するような条件下で接触させる工程であって、該ウイルスベクターは、
ｉ）ａ）リーダーペプチド；
ｂ）候補ポリペプチド；
ｃ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｄ）ｌｏｘＰ部位に隣接する膜貫通部分、
を含む融合タンパク質をコードする第１核酸配列；
ｉｉ）誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする第２核酸配列、
を含む、工程；
ｂ）該ウイルス粒子と哺乳動物細胞とを、該哺乳動物細胞において該融合タンパク質および該ｃｒｅリコンビナーゼを発現するのに十分な条件下で接触させ、それによって可溶性候補ポリペプチドが該哺乳動物細胞によって産生される、工程；
という手順から成る可溶性候補ポリペプチドを産生する方法。
【請求項４３】
前記候補ポリペプチドが抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ウイルス提示ベクターであって、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｉｖ）膜貫通部分、
を含む融合タンパク質をコードする第１核酸配列を含む、ウイルス提示ベクター。
【請求項４９】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５０】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５１】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項５０に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５２】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５３】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５４】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５５】
前記第１核酸が、選択マーカーをさらに含む、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５６】
前記選択マーカーが生物発光タンパク質部分である、請求項５５に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５７】
前記生物発光タンパク質部分が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項５６に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５８】
さらに２つ以上のｌｏｘＰ部位を含み、該ｌｏｘＰ部位が前記膜貫通部分に隣接する、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５９】
作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする第２核酸配列をさらに含む、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６０】
前記第１核酸配列が、作動可能に誘導性プロモーターに連結されている、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６１】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、および温度誘導性プロモーターから成る群から選択される、請求項６０に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６２】
ベクター系であって、
ａ）請求項５３に記載のウイルス提示ベクター、
ｂ）プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
ｃ）１つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、ベクター系。
【請求項６３】
前記ｅｎｖ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子を含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６４】
前記１つ以上のウイルス構造遺伝子が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖから成る群から選択される、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６５】
核酸ウイルス標的ベクターであって、
ａ）融合タンパク質をコードする第１核酸であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分、および
ｉｖ）ｌｏｘＰに隣接した膜貫通部分、
を含む、第１核酸配列；
ｂ）毒素を含む、第２核酸配列；
ｃ）作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼをコードする、第３核酸配列；ならびに
ｄ）侵入部分をコードする、第４核酸配列、
を含む、核酸ウイルス標的ベクター。
【請求項６６】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６５に記載のウイルス標的ベクター。
【請求項６７】
核酸ウイルス標的ベクターであって、
ａ）融合タンパク質をコードする第１核酸であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分；
ｉｖ）毒素、および
ｖ）ｌｏｘＰに隣接する膜貫通部分、
を含む、第１核酸配列；
ｂ）作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼをコードする、第２核酸配列；および
ｃ）侵入部分をコードする、第３核酸配列、
を含む、核酸ウイルス標的ベクター。
【請求項６８】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６７に記載のウイルス標的ベクター。
【請求項６９】
被験体における核酸配列の標的化送達のための方法であって、該核酸配列は融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分；
ｉｖ）膜貫通部分；および
ｖ）侵入部分、
を含み、
ここで、該核酸はウイルス粒子の表面上で発現され、該候補ポリペプチドは標的細胞表面の抗原に特異的に結合する方法であって、
該方法は、該候補ポリペプチドが該細胞に選択的に結合し、該核酸が該細胞を形質導入するような条件下で、該ウイルス粒子が該標的細胞の抗原を発現する細胞に接触するように、該ウイルス粒子を該被験体内に導入する工程を包含する、方法。
【請求項７０】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つ以上の哺乳動物細胞がカルシウム感受性生物発光タンパク質を発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項７２】
前記カルシウム感受性生物発光タンパク質がエクオリンである、請求項７１に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物細胞の表面上で候補ポリペプチドを提示する方法であって、
ａ） パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含むウイルス粒子を１つ以上産生するような条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；
ｉｖ）膜貫通部分、
を含む、工程；ならびに
ｂ）該ウイルス粒子と哺乳動物細胞とを、該哺乳動物細胞内で該融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で接触させる工程であって、該候補ポリペプチドが、該哺乳動物細胞の表面上で提示させる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記免疫グロブリン分子が、前記哺乳動物細胞の表面上にさらに提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、またはＣＨ３領域、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記候補ポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記パッケージング細胞が、
（ｉ） プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含む、ヘルパーベクター、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記候補ポリペプチドが、前記ウイルス粒子と前記哺乳動物細胞とを接触させる前に、該ウイルス粒子の表面上にて発現させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通部分が、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞が、ラモス−バーキットリンパ腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス粒子の表面上に候補ポリペプチドを提示する方法であって、該ウイルス粒子上に該候補ポリペプチドが提示されるように、パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が該融合タンパク質を含むウイルス粒子を１つ以上産生するような条件下で接触させる工程を包含し、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド；
ｉｉ） 候補ポリペプチド；
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部；
ｉｖ） 膜貫通部分；および
ｖ） エンベロープ組み込みシグナル、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記候補ポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはこれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記膜貫通部分が、ウイルス膜貫通部分あるいは哺乳動物膜貫通部分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記パッケージング細胞が、さらに、
（ｉ） プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含む、ヘルパーベクター、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ）パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含む１つ以上のウイルス粒子を生成するような条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド；
ｉｉ） 候補ポリペプチド；
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｉｖ） 膜貫通部分、
を含む、工程；
ｂ）該ウイルス粒子と１つ以上の哺乳動物細胞とを、該１つ以上の哺乳動物細胞がそれぞれ、該哺乳動物細胞の表面上にて提示される単一種の該候補ポリペプチドを産生するような条件下で接触させる、工程；
ｃ）該哺乳動物細胞の表面上で該単一種の候補ポリペプチドを提示している該哺乳動物細胞を、選別する工程；
ｄ）該選別した哺乳動物細胞と、標的抗原とを接触させる工程；ならびに
ｅ）該標的抗原に結合する哺乳動物細胞を同定し、それによって該標的抗原に結合する候補ポリペプチドを同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
工程ｄ）およびｅ）を１回以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パッケージング細胞がさらに、
（ｉ） プロモーターにプロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸ベクターが、選択マーカーをコードする核酸をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜貫通部分は、ウイルス膜貫通部分または哺乳動物膜貫通部分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
候補ポリペプチドを親和性成熟させる方法であって、
ａ）パッケージング細胞と、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターとを、該パッケージング細胞が該核酸配列を含む１つ以上のウイルス粒子を生成するよな条件下で接触させる工程であって、該融合タンパク質は、
ｉ） リーダーペプチド、
ｉｉ） 候補ポリペプチド、
ｉｉｉ） 免疫グロブリン分子の少なくとも一部、および
ｉｖ） 膜貫通部分、
を含む、工程；
ｂ）該１つ以上のウイルス粒子と１つ以上の第２の哺乳動物細胞とを、該１つ以上の哺乳動物細胞がそれぞれ、該１つ以上の哺乳動物細胞の表面上にて提示される単一種の該候補ポリペプチドを産生するような条件下で接触させる工程；
ｃ）該哺乳動物細胞の表面上で単一種の該候補ポリペプチドを提示している該１つ以上の哺乳動物細胞を選別する工程；
ｄ）該選別された１つ以上哺乳動物細胞と標的抗原とを接触させる工程；
ｅ）該標的抗原に結合する哺乳動物細胞を同定する工程、
ｆ）該同定した哺乳動物細胞と漸減する濃度の該標的抗原とを接触させる工程；ならびに
ｇ）工程ｅ）およびｆ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記パッケージング細胞がさらに、
（ｉ） プロモーターにプロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
（ｉｉ） １つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物細胞が活性化誘導シトシン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）タンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物細胞がラモス−バーキットリンパ腫細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸ベクターが選択マーカーを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
可溶性候補ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）パッケージング細胞とウイルス提示ベクターとを、該パッケージング細胞が１つ以上のウイルス粒子を生成するような条件下で接触させる工程であって、該ウイルスベクターは、
ｉ）ａ）リーダーペプチド；
ｂ）候補ポリペプチド；
ｃ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｄ）ｌｏｘＰ部位に隣接する膜貫通部分、
を含む融合タンパク質をコードする第１核酸配列；
ｉｉ）誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする第２核酸配列、
を含む、工程；
ｂ）該ウイルス粒子と哺乳動物細胞とを、該哺乳動物細胞において該融合タンパク質および該ｃｒｅリコンビナーゼを発現するのに十分な条件下で接触させ、それによって可溶性候補ポリペプチドが該哺乳動物細胞によって産生される、工程；
という手順から成る可溶性候補ポリペプチドを産生する方法。
【請求項４３】
前記候補ポリペプチドが抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ウイルス提示ベクターであって、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも一部；および
ｉｖ）膜貫通部分、
を含む融合タンパク質をコードする第１核酸配列を含む、ウイルス提示ベクター。
【請求項４９】
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５０】
前記候補ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５１】
前記抗体が、単鎖抗体、ドメイン抗体、二重特異性抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項５０に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５２】
前記候補ポリペプチドがライブラリに由来する、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５３】
前記ウイルス提示ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５４】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）から成る群から選択されるレンチウイルスから得られる、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５５】
前記第１核酸が、選択マーカーをさらに含む、請求項４８に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５６】
前記選択マーカーが生物発光タンパク質部分である、請求項５５に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５７】
前記生物発光タンパク質部分が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フェレドキシンＩＶタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、およびエクオリンタンパク質から成る群から選択される、請求項５６に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５８】
さらに２つ以上のｌｏｘＰ部位を含み、該ｌｏｘＰ部位が前記膜貫通部分に隣接する、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項５９】
作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする第２核酸配列をさらに含む、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６０】
前記第１核酸配列が、作動可能に誘導性プロモーターに連結されている、請求項５３に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６１】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、および温度誘導性プロモーターから成る群から選択される、請求項６０に記載のウイルス提示ベクター。
【請求項６２】
ベクター系であって、
ａ）請求項５３に記載のウイルス提示ベクター、
ｂ）プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたｅｎｖ遺伝子を含み、ここで該ｅｎｖ遺伝子は、機能性エンベロープ遺伝子をコードする、エンベロープベクター；および
ｃ）１つ以上のウイルス構造遺伝子を含むヘルパーベクター、
を含む、ベクター系。
【請求項６３】
前記ｅｎｖ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子を含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６４】
前記１つ以上のウイルス構造遺伝子が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖから成る群から選択される、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６５】
核酸ウイルス標的ベクターであって、
ａ）融合タンパク質をコードする第１核酸であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分、および
ｉｖ）ｌｏｘＰに隣接した膜貫通部分、
を含む、第１核酸配列；
ｂ）毒素を含む、第２核酸配列；
ｃ）作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼをコードする、第３核酸配列；ならびに
ｄ）侵入部分をコードする、第４核酸配列、
を含む、核酸ウイルス標的ベクター。
【請求項６６】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６５に記載のウイルス標的ベクター。
【請求項６７】
核酸ウイルス標的ベクターであって、
ａ）融合タンパク質をコードする第１核酸であって、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分；
ｉｖ）毒素、および
ｖ）ｌｏｘＰに隣接する膜貫通部分、
を含む、第１核酸配列；
ｂ）作動可能に誘導性プロモーターに連結されたｃｒｅリコンビナーゼをコードする、第２核酸配列；および
ｃ）侵入部分をコードする、第３核酸配列、
を含む、核酸ウイルス標的ベクター。
【請求項６８】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６７に記載のウイルス標的ベクター。
【請求項６９】
被験体における核酸配列の標的化送達のための方法であって、該核酸配列は融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質は、
ｉ）リーダーペプチド；
ｉｉ）候補ポリペプチド；
ｉｉｉ）免疫グロブリン分子の少なくとも１部分；
ｉｖ）膜貫通部分；および
ｖ）侵入部分、
を含み、
ここで、該核酸はウイルス粒子の表面上で発現され、該候補ポリペプチドは標的細胞表面の抗原に特異的に結合する方法であって、
該方法は、該候補ポリペプチドが該細胞に選択的に結合し、該核酸が該細胞を形質導入するような条件下で、該ウイルス粒子が該標的細胞の抗原を発現する細胞に接触するように、該ウイルス粒子を該被験体内に導入する工程を包含する、方法。
【請求項７０】
前記侵入部分が、ウイルスエンベロープタンパク質、融合活性を有する真核生物タンパク質、結合能欠損型赤血球凝集タンパク質、および結合能欠損型インフルエンザ赤血球凝集タンパク質から成る群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つ以上の哺乳動物細胞がカルシウム感受性生物発光タンパク質を発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項７２】
前記カルシウム感受性生物発光タンパク質がエクオリンである、請求項７１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５０７２７２（Ｐ２００８−５０７２７２Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２４９７（Ｐ２００７−５２２４９７）
【出願日】平成１７年５月２３日（２００５．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２２９４４
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２３日（２００５．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８３３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２２９４４
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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