レーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法
【課題】レーザ光を走査することにより取得される蛍光画像の空間分解能を変化させることなく、瞬時に取得する蛍光画像の焦点深度を調節する。
【解決手段】レーザ光源８と、該レーザ光源８からのレーザ光を走査するスキャナ９と、該スキャナ９により走査されたレーザ光を標本Ａに照射し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１０と、標本Ａを面照明する面照明光源１８と、レーザ光の照射により発生した蛍光をレーザ光の光路から分岐させる蛍光分岐部１１と、該蛍光分岐部１１で分岐された蛍光を検出する光検出器１４と、対物レンズ１０とスキャナ９との間において蛍光を分岐する光路分岐部２１と、該光路分岐部２１において分岐された蛍光を撮影する撮像素子２６と、該撮像素子２６と光路分岐部２１との間の対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞り２３とを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡１を提供する。
【解決手段】レーザ光源８と、該レーザ光源８からのレーザ光を走査するスキャナ９と、該スキャナ９により走査されたレーザ光を標本Ａに照射し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１０と、標本Ａを面照明する面照明光源１８と、レーザ光の照射により発生した蛍光をレーザ光の光路から分岐させる蛍光分岐部１１と、該蛍光分岐部１１で分岐された蛍光を検出する光検出器１４と、対物レンズ１０とスキャナ９との間において蛍光を分岐する光路分岐部２１と、該光路分岐部２１において分岐された蛍光を撮影する撮像素子２６と、該撮像素子２６と光路分岐部２１との間の対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞り２３とを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡１を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、レーザ光を走査するスキャナと、対物レンズの間の光路に配置したビームスプリッタによって、対物レンズによって集光された蛍光を分岐し、分岐された光路にＣＣＤカメラを配置した共焦点レーザ顕微鏡が知られている。この共焦点レーザ顕微鏡は、スキャナを介して戻る蛍光を共焦点ピンホールに通過させることによって、対物レンズの焦点位置近傍の空間分解能の高い共焦点画像を取得する一方、ＣＣＤカメラによって２次元的な非共焦点画像を瞬時に取得するようになっている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１４８５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＣＤカメラによる撮影は、一般に対物レンズの倍率（開口数）に応じた焦点深度があるために、厚さ方向を含めた標本の全体像を把握するのに有利である。しかしながら、例えば、１０μｍ程度の厚さのある生細胞の観察に際し、倍率４０倍、開口数１．２の水浸対物レンズを用いてＣＣＤで蛍光観察する場合、焦点深度は約０．５μｍとなる。したがって、生細胞の厚さに対して焦点深度が浅すぎるため、生細胞の表面から内部の構造までを一度に観察することができない。
【０００５】
従来の共焦点レーザ顕微鏡は、空間分解能の高い（被写界深度の低い）共焦点画像と、それよりも空間分解能の低い（被写界深度の高い）非共焦点画像とを取得することができるものの、ＣＣＤカメラにより取得される非共焦点画像の焦点深度をより深く設定するために、例えば対物レンズに可変開口絞りを設けてこの開口絞りを絞ると、レーザ光のビーム径も絞られてしまうために共焦点画像の分解能が低くなるという不都合がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光を走査することにより取得される蛍光画像の空間分解能を変化させることなく、瞬時に取得する蛍光画像の焦点深度を調節することができるレーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記標本を面照明する面照明光源と、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記対物レンズと前記スキャナとの間において蛍光を分岐する光路分岐部と、該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、レーザ光源から出射されスキャナで走査されたレーザ光が標本に照射されることにより、標本内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光が対物レンズにより集光され、光検出器により検出される。スキャナによる走査位置と光検出器により検出された蛍光の強度とを対応づけて記憶しておくことにより蛍光画像が取得される。この場合には、対物レンズの開口数を十分に大きく確保しておくことにより、焦点深度が小さく、空間分解能の高い蛍光画像を得ることができる。
【０００９】
一方、面照明光源により標本が面照明されると、標本の広い範囲において一度に蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズによって集光され、対物レンズとスキャナとの間において光路分岐部により分岐される。光路分岐部によりスキャナへの光路とは別の光路に分岐された蛍光は、可変絞りを通過した後に撮像素子により撮影される。これにより、瞬時に広い視野範囲の蛍光画像が取得される。
【００１０】
この場合において、本発明によれば、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像の焦点深度を深くする場合には、光路分岐部と撮像素子との間に配置されている可変絞りを絞る。これにより、撮像素子に入射する蛍光の開口数を小さくすることができ、蛍光画像の焦点深度が深くなる。したがって、このようにすることで、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像には、標本の厚さ方向の広い範囲から発生する蛍光が撮影されるので、蛍光発生部位の所在を瞬時に確認することができる。
【００１１】
そして、この場合に、可変絞りが、光路分岐部と撮像素子との間に配置されているので、光路分岐部において別の光路に分岐された蛍光から取得する蛍光画像については、可変絞りの影響を受けることがなく、高い空間分解能を保持することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記レーザ光源と前記スキャナとの間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部と、該蛍光分岐部と前記光検出器との間の前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置された共焦点ピンホールとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズにより集光されて、スキャナを介して戻り、共焦点ピンホールを通過した蛍光を光検出器により検出することができる。スキャナを介して戻る光路における対物レンズと光学的に共役な位置に共焦点ピンホールを配置することで、空間分解能の高い共焦点蛍光画像を取得することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記対物レンズと前記光路分岐部との間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部を備え、前記光検出器が、前記蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズにより集光され、蛍光分岐部において分岐された蛍光がスキャナに戻る前に光検出器により検出される。例えば、レーザ光源として極短（フェムト秒）パルスレーザ光源を使用した場合等には、共焦点ピンホールを介すことなく空間分解能の高い多光子蛍光画像を取得することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記対物レンズと前記光路分岐部との間の前記対物レンズに向かう光路に前記面照明光源からの照明光を合流させる面照明光合流部を備えていてもよい。
このようにすることで、面照明光源から出射された面照明光が、面照明合流部によってレーザ光と同一の光路に合流させられる。これにより、面照明光を照射して瞬時に得られる広い視野範囲の落射蛍光画像と、レーザ光を走査して得られる空間分解能の高い蛍光画像とを同時に得ることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側から前記面照明光源からの照明光を標本に照射するコンデンサレンズを備えていてもよい。
このようにすることで、面照明光源からの面照明光をコンデンサレンズによって集光して対物レンズとは反対側から標本を照明し、標本を透過する方向に発せられる蛍光を対物レンズによって集光することにより、透過蛍光画像を得ることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、光刺激用レーザ光源と、該光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の標本における照射位置を調節する刺激位置調節部と、該刺激位置調節部により位置調節された光刺激用レーザ光を前記スキャナと前記対物レンズとの間の該対物レンズに向かう光路に合流させる刺激光合流部とを備えていてもよい。
【００１７】
このようにすることで、光刺激用レーザ光源から発せられた光刺激用レーザ光が、刺激位置調節部によりその照射位置を調節されて、刺激光合流部によってスキャナと対物レンズとの間の光路に合流される。これにより、刺激位置調節部により調節された照射位置に光刺激用レーザ光を照射して刺激を与え、その反応を蛍光画像取得用のレーザ光または面照明光を照射して得られる蛍光画像によって観察することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の光束径を調節する光束径調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、光束径調節部の作動により標本に照射される光刺激用レーザ光のＮＡを調節して焦点深度を調節することができる。すなわち、焦点深度の深い蛍光画像を取得した場合に、深さ方向のどの位置から発生した蛍光であるのかを判別できないので、光刺激用レーザ光の焦点深度を深くして、蛍光画像の焦点深度をカバーする範囲に刺激を与えることができる。また、焦点深度の浅い蛍光画像を取得して、刺激を与えたい部位の深さ方向位置を厳密に特定できる場合には、光束径調節部により光刺激用レーザ光のＮＡを大きくして焦点深度を浅くし、狭い範囲に刺激を与えることができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記撮像素子により取得された標本の蛍光画像を表示する表示部と、該表示部に表示された蛍光画像内の領域を指定する領域指定部と、該領域指定部により指定された領域の蛍光画像を取得するように前記スキャナを制御する制御部とを備えていてもよい。
このようにすることで、撮像素子により瞬時に取得された標本の蛍光画像を表示部により表示し、領域指定部によって表示された蛍光画像内の領域を指定すると、制御部がスキャナを制御して、指定された領域の分解能の高い蛍光画像を取得することができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、焦点深度の深い蛍光画像を取得するために可変絞りを絞ると撮像素子に入射する蛍光量が低減するため、感度調節部により撮像素子の感度を高くして、取得される蛍光画像が暗くならないようにすることができる。また、可変絞りを開けて、撮像素子に入射する蛍光量を増大させたときには、感度調節部により撮像素子の感度を低下させて、取得される蛍光画像が明るくなり過ぎないようにすることができる。
【００２１】
また、上記発明においては、前記対物レンズを切り替える対物切替部を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズの種類および／または前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、対物切替部の作動により対物レンズを切り替えた場合に、対物レンズの種類によって、対物レンズの開口数が異なるため、可変絞りの絞り量に基づく撮像素子の感度調節とは独立して、対物レンズの種類により撮像素子の感度調節を行って、蛍光画像が明るくなり過ぎたり暗くなり過ぎたりしないようにすることができる。
【００２２】
また、本発明は、対物レンズを介して標本にスポット状のレーザ光を照射し、該レーザ光の前記標本上における照射位置を走査し、前記標本において発生し前記対物レンズにより集光された蛍光を検出し、検出された蛍光と走査位置とに基づいて蛍光画像を生成する画像生成ステップと、前記標本に対して面照明光を照射して、該標本において発生した蛍光を前記対物レンズにより集光し、集光された蛍光を前記レーザ光の光路から分岐した後に撮影する撮影ステップと、前記対物レンズにより集光された蛍光の絞り量を、前記レーザ光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップとを含む蛍光観察方法を提供する。
【００２３】
本発明によれば、画像生成ステップにおいて、スポット状のレーザ光を標本上において走査して、各位置において発生した蛍光を対物レンズによって集光して検出することにより、空間分解能の高い蛍光画像を取得することができる。撮影ステップにおいて、面照明光を標本に照射して、標本上の比較的広い範囲において発生した蛍光を対物レンズにより集光して撮影することにより、画像生成ステップにおいて取得される蛍光画像よりも空間分解能の低い蛍光画像を瞬時に取得することができる。そして、絞り調節ステップにおいて、蛍光の絞り量を調節することにより、撮影ステップにおいて取得される蛍光画像の焦点深度を調節することができる。この場合に、蛍光の絞り量をレーザ光の光路から分岐した後の対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節することにより、画像生成ステップにより取得される蛍光画像の空間分解能に影響を与えることなく、撮影ステップにおいて取得される蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、レーザ光を走査することにより取得される蛍光画像の空間分解能を変化させることなく、瞬時に取得する蛍光画像の焦点深度を調節することができるレーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１のレーザ走査型蛍光顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。
【図３】図１のレーザ走査型蛍光顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および蛍光観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１は、図１に示されるように、ステージ２に載置された標本Ａを観察する装置であって、ＬＳＭ観察光学系３と、ＣＣＤ観察光学系４と、これらを制御する制御部５と、モニタ６および入力部７とを備えている。ステージ２は、載置した標本Ａを３次元方向に移動可能に設けられている。
【００２７】
ＬＳＭ観察光学系３は、レーザ光を出射するレーザ光源８と、該レーザ光源８から出射されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ９と、該スキャナ９により走査されたレーザ光を標本Ａ上に集光し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１０と、該対物レンズ１０により集光されスキャナ９を介して戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１１と、該ダイクロイックミラー１１により分岐された蛍光を集光する集光レンズ１２と、該集光レンズ１２の焦点位置に配置された共焦点ピンホール１３と、該共焦点ピンホール１３を通過した蛍光を検出する光検出器（ＰＭＴ：光電子増倍管）１４とを備えている。図中、符号１５は瞳投影レンズ、符号１６は結像レンズ、符号１７はバリアフィルタである。
【００２８】
ＣＣＤ観察光学系４は、白色光を発生する水銀ランプのような面照明光源１８と、該面照明光源１８から発せられた白色光から所定の波長範囲の励起光を選択する励起フィルタ１９と、該励起フィルタ１９により選択された励起光を結像レンズ１６と対物レンズ１０との間の光路に合流させるダイクロイックミラー２０と、励起光を照射して標本Ａにおいて発生し対物レンズ１０により集光された蛍光を、結像レンズ１６と瞳投影レンズ１５との間でスキャナ９への光路から分岐するダイクロイックミラー２１と、該ダイクロイックミラー２１により分岐された光路内に配置された瞳投影レンズ２２と、可変絞り２３と、測光フィルタ２４と、結像レンズ２５と、ＣＣＤカメラ２６とを備えている。
【００２９】
図中、符号２７は、コンデンサレンズであって、面照明光源１８からの白色光を略平行光に変換するようになっている。
励起フィルタ１９は、例えば、異なる通過波長帯域を有する複数種のフィルタを択一的に光路に配置可能なフィルタターレットである。
【００３０】
可変絞り２３は、結像レンズ１６および瞳投影レンズ２２によってリレーされた対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されており、その位置を通過する蛍光の光束径を無段階で調節することができるようになっている。
測光フィルタ２４も、例えば、フィルタターレットであり、瞳投影レンズ２２により集光された蛍光の内から、ＣＣＤカメラ２６によって撮影させる蛍光の波長帯域を選択することができるようになっている。
【００３１】
制御部５は、スキャナ９を制御して、レーザ光の走査範囲、走査位置および走査速度を調節するようになっている。また、制御部５は、可変絞り２３の開口径を制御して、蛍光の光束径を調節し、ＣＣＤカメラ２６に入射させる蛍光の入射ＮＡ（開口数）を調節するようになっている。さらに、制御部５は、励起フィルタ１９および測光フィルタ２４を制御して、標本Ａに照射する面照明光の波長範囲を調節し、ＣＣＤカメラ２６により撮像する蛍光の波長範囲を調節するようになっている。
【００３２】
また、制御部５は、光検出器１４により検出した蛍光の強度を受けて、スキャナ９によるレーザ光の照射位置と対応づけて記憶することにより、ＬＳＭ蛍光画像を生成するようになっている。また、制御部５は、ＣＣＤカメラ２６により瞬時に取得された画像情報に基づいてＣＣＤ蛍光画像を生成するようになっている。
【００３３】
モニタ６は、制御部５により生成されたＬＳＭ蛍光画像およびＣＣＤ蛍光画像を表示するとともに、ＧＵＩ用の表示を行うようになっている。入力部７は、モニタ６上のＧＵＩ表示に従って種々の観察条件を入力したり、例えば、モニタ６に表示されているＣＣＤ蛍光画像中においてＬＳＭ蛍光画像を取得したい範囲をカーソルによって指定したりすることができるようになっている。
【００３４】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１を用いた蛍光観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、観察者が入力部７から観察条件を入力する。観察条件としては、まず、面照明光として照射する励起光の波長範囲およびＣＣＤカメラ２６により取得される蛍光の波長範囲を挙げることができる。
【００３５】
入力部７から観察条件が入力されると、制御部５は、入力された観察条件に従って、励起フィルタ１９および測光フィルタ２４を制御し、通過波長帯域および撮影波長範囲を設定する。また、制御部５は初期状態において可変絞り２３を、所定の開口径、例えば、対物レンズ１０の瞳径より十分に小さな最小開口径に設定する。
【００３６】
各種設定が行われた後に、制御部５は面照明光源を作動させて白色光を出射させる。これにより、励起フィルタ１９によって選択された波長帯域の励起光がダイクロイックミラー２０により反射され対物レンズ１０を介して標本Ａの比較的広い範囲に照射される。
【００３７】
標本Ａにおいては、励起光が照射された領域に存在する蛍光物質が励起されることにより蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズ１０によって集光され、結像レンズ１６によって集光され、ダイクロイックミラー２１を透過させられる。ダイクロイックミラー２１を透過させられることにより、後述するレーザ光源８からのレーザ光の光路から分岐させられ、瞳投影レンズ２２により集光される。
【００３８】
そして、瞳投影レンズ２２により集光された蛍光は、対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている可変絞り２３を通過して、測光フィルタ２４により波長範囲が選択された後に、結像レンズ２５によって集光されＣＣＤカメラ２６によって撮影される。
ＣＣＤカメラ２６によって瞬時に取得された標本Ａの比較的広い視野範囲にわたる蛍光画像情報は、制御部５に送られて、ＣＣＤ蛍光画像として生成され（撮影ステップ）、モニタ６に表示される。
【００３９】
観察者は、モニタ６上に表示された標本Ａの比較的広い範囲にわたるＣＣＤ蛍光画像を確認して、特に詳細に観察したい部位を探す。可変絞り２３が最小開口径に絞られているので、ＣＣＤ蛍光画像は暗く、かつコントラストが低くなっている。すなわち、可変絞り２３が対物レンズ１０の瞳径より十分に小さく絞られることにより、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度が深くなり、対物レンズ１０の焦点位置を中心とした深さ方向に比較的広い範囲から発生した蛍光が重なり合ったコントラストの低いＣＣＤ蛍光画像が取得される。制御部５は必要により、ＣＣＤカメラ２６の感度を増大させ、あるいは、蛍光画像情報に乗算するゲインを増大させる。
【００４０】
この場合において、観察者は、必要により、入力部７を操作して可変絞り２３の開口径を対物レンズ１０の瞳径より小さい範囲で調節する。可変絞り２３の開口径を大きくしていくと、ＣＣＤカメラ２６への入射ＮＡが増大していくので、ＣＣＤ蛍光画像は明るく、かつコントラストが高くなっていく反面、焦点深度が小さくなっていく。観察者は、可変絞り２３の開口径を適宜調節することにより、コントラストと焦点深度とのトレードオフにより、対物レンズ１０の光軸に交差する方向における蛍光の発生位置が特定できるような開口径に設定する（絞り調節ステップ）。
【００４１】
すなわち、可変絞り２３の開口径を対物レンズ１０の瞳径より小さく絞ることにより、焦点深度の深いＣＣＤ蛍光画像を得ることができ、対物レンズ１０の焦点面とは深さ方向に異なる部位において蛍光が発生していてもこれをＣＣＤ蛍光画像に含めることができる。したがって、観察者は、モニタ６上に表示されたＣＣＤ蛍光画像において蛍光が発生している箇所を特定して、入力部７の操作により、その位置にＬＳＭ蛍光画像の取得範囲を設定する。
【００４２】
制御部５は、入力部７から入力された取得範囲においてレーザ光が走査されるように、スキャナ９の走査位置および走査範囲を設定し、レーザ光源８からレーザ光を出射させる。レーザ光源８から出射されたレーザ光は、スキャナ９によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ１５、ダイクロイックミラー２１、結像レンズ１６および対物レンズ１０を介して標本Ａ上に集光される。これにより、レーザ光は、標本Ａ上における上記取得範囲内において走査される。
【００４３】
レーザ光が照射されることにより標本Ａにおいて蛍光が発生すると、該蛍光は対物レンズ１０により集光され、結像レンズ１６、ダイクロイックミラー２１、瞳投影レンズ１５およびスキャナ９を介してレーザ光と同一光路を戻り、ダイクロイックミラー１１によって分岐される。そして、分岐された蛍光は、バリアフィルタ１７によってレーザ光成分が除去された後に、集光レンズ１２によって集光され、その焦点位置に配置されている共焦点ピンホール１３を通過したもののみが光検出器１４によって検出される。
【００４４】
制御部５は、スキャナ９によるレーザ光の照射位置と、各照射位置における光検出器１４により検出された蛍光の強度とを対応付けて記憶しておき、各蛍光の強度を照射位置の情報に従って並べることによりＬＳＭ蛍光画像を生成することができる。これにより、対物レンズ１０の焦点面に広がる光軸方向に高い空間分解能を有するＬＳＭ蛍光画像を取得することができる（画像生成ステップ）。
【００４５】
観察者は、モニタ６に表示されたＬＳＭ蛍光画像において所望の蛍光領域が確認できない場合には、ステージ２を上下方向に作動させて、標本Ａ内における対物レンズ１０の焦点面を上下方向に移動させることにより蛍光領域を探索することができる。
【００４６】
このように、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および蛍光観察方法によれば、ＣＣＤ蛍光画像によって広い視野範囲にわたる標本Ａの観察を瞬時に行うとともに、ＬＳＭ蛍光画像によって、標本Ａの特定部位の詳細かつ空間分解能の高い観察を行うことができる。この場合に、対物レンズ１０により集光された蛍光をスキャナ９に戻す前に分岐した光路に可変絞り２３を配置しているので、ＬＳＭ蛍光画像の空間分解能を低下させることなく、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【００４７】
特に、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を深くすることにより、深さ方向のいずれかの位置において発生した蛍光をＣＣＤ蛍光画像に含めることができる。したがって、ステージ２を上下方向に移動させて蛍光強度の高い領域を探索することなく、一度に全体的な観察を行うことができる。例えば、標本Ａが生細胞である場合には、焦点深度を深くして生細胞の大部分の領域を全体的に一度に観察することができる。これにより、細胞周期の進行を観察し、細胞の変化が発生した時点で、高ＮＡのＬＳＭ蛍光画像によって、対物レンズ１０の焦点面に広がるスライス画像や、光軸方向に焦点位置をずらしながら複数枚のスライス画像を撮影して得られる積層画像を取得して詳細観察を行うことができる。
【００４８】
なお、本実施形態においては、ＬＳＭ観察光学系３として、対物レンズ１０により集光した蛍光をディスキャンする共焦点観察光学系を例示したが、これに限定されるものではない。例えば、図２に示されるように、レーザ光源８としてパルスレーザ光源を用い、対物レンズ１０により集光した蛍光を対物レンズ１０の後段において、ダイクロイックミラー２８によりすぐに光路から分岐して光検出器１４により検出する多光子励起方式のＬＳＭ観察光学系３’を採用してもよい。この場合においても、上記と同様に、ＬＳＭ蛍光画像の空間分解能を損なうことなく、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【００４９】
また、本実施形態においては、面照明光源１８からの励起光を標本Ａに一方向から照射し、その照射方向に戻る蛍光を観察する、いわゆる落射照明方式のレーザ走査型蛍光顕微鏡１を例示したが、これに代えて、図３に示されるように、透過照明方式のレーザ走査型蛍光顕微鏡１’を採用してもよい。
すなわち、標本Ａを挟んで対物レンズ１０とは反対側、図３では下側に面照明光源１８を配置して、標本Ａに下側から励起光を照射し、それによって発生した蛍光のうち、上方に発せられた蛍光を対物レンズ１０によって集光し検出するようになっている。
【００５０】
このようにすることで、落射照明方式の場合のダイクロイックミラー２０をなくすことができ、さらに簡易に構成することができる。図３に示されるミラー２９としては、特別は波長特性を備えさせる必要がなく、安価に構成することができる。
【００５１】
また、可変絞り２３の絞り量に基づいてＣＣＤカメラ２６の感度を調節する感度調節部（図示略）を備えていてもよい。このようにすることで、焦点深度の深い蛍光画像を取得するために可変絞り２３を絞るとＣＣＤカメラ２６に入射する蛍光量が低減するため、感度調節部によりＣＣＤカメラ２６の感度を高くして、取得される蛍光画像が暗くならないようにすることができる。また、可変絞り２３を開けて、ＣＣＤカメラ２６に入射する蛍光量を増大させたときには、感度調節部によりＣＣＤカメラ２６の感度を低下させて、取得される蛍光画像が明るくなり過ぎないようにすることができる。
【００５２】
また、対物レンズ１０を切り替える対物切替部（図示略）を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズ１０の種類および／または可変絞り２３の絞り量に基づいてＣＣＤカメラ２６の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
【００５３】
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０および蛍光観察方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５４】
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０は、図４に示されるように、光刺激光学系３１を備えている。光刺激光学系３１は、光刺激用のレーザ光源３２と、該レーザ光源３２から発せられたレーザ光の光軸方向に直交する方向の位置を調節するスキャナ３３と、該スキャナ３３により位置調節されたレーザ光を、ＬＳＭ観察光学系３の光路に合流させるダイクロイックミラー３４とを備えている。図中符号３５は、光刺激用のレーザ光の光束径を調節する光束径調節部、符号３６はミラーである。
【００５５】
光束径調節部３５は、例えば、光軸方向に配列された複数のレンズを備え、そのレンズの少なくとも１つを光軸方向に移動させることで、光束径を変更するビームエキスパンダによって構成されている。光刺激用のレーザ光の光束径を調節することにより、対物レンズ１０を介して標本Ａに入射される光刺激用のレーザ光の入射ＮＡを調節することができる。
【００５６】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０によれば、可変絞り２３を絞ることにより得られた焦点深度の深いＣＣＤ蛍光画像によって高輝度の蛍光が発生している領域を特定することができた場合に、その特定された位置に、光束径調節部３５によって入射ＮＡを小さくして焦点深度を深くした光刺激用のレーザ光を入射させて、蛍光が発生している部位に確実に光刺激を与えることができる。すなわち、ＣＣＤ蛍光画像上で光刺激用のレーザ光の照射位置を特定するだけで、深さ方向の照射位置を特定することなく、所望の領域に光刺激を与えることができるという利点がある。そして、光刺激を与える前後の反応を、ＣＣＤ蛍光画像およびＬＳＭ蛍光画像の両方で観察することができる。
【符号の説明】
【００５７】
Ａ 標本
１，３０ レーザ走査型蛍光顕微鏡
５ 制御部
６ モニタ（表示部）
７ 入力部（領域指定部）
８ レーザ光源
９ スキャナ
１０ 対物レンズ
１１ ダイクロイックミラー（蛍光分岐部）
１３ 共焦点ピンホール
１４ 光検出器
１５ 光路分岐部
１８ 面照明光源
２０ 面照明光合流部
２１ ダイクロイックミラー（光路分岐部）
２３ 可変絞り
２６ ＣＣＤカメラ（撮像素子）
２７ コンデンサレンズ
３２ 光刺激用レーザ光源
３３ スキャナ（刺激位置調節部）
３４ ダイクロイックミラー（刺激光合流部）
３５ 光束径調節部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、レーザ光を走査するスキャナと、対物レンズの間の光路に配置したビームスプリッタによって、対物レンズによって集光された蛍光を分岐し、分岐された光路にＣＣＤカメラを配置した共焦点レーザ顕微鏡が知られている。この共焦点レーザ顕微鏡は、スキャナを介して戻る蛍光を共焦点ピンホールに通過させることによって、対物レンズの焦点位置近傍の空間分解能の高い共焦点画像を取得する一方、ＣＣＤカメラによって２次元的な非共焦点画像を瞬時に取得するようになっている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１４８５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＣＤカメラによる撮影は、一般に対物レンズの倍率（開口数）に応じた焦点深度があるために、厚さ方向を含めた標本の全体像を把握するのに有利である。しかしながら、例えば、１０μｍ程度の厚さのある生細胞の観察に際し、倍率４０倍、開口数１．２の水浸対物レンズを用いてＣＣＤで蛍光観察する場合、焦点深度は約０．５μｍとなる。したがって、生細胞の厚さに対して焦点深度が浅すぎるため、生細胞の表面から内部の構造までを一度に観察することができない。
【０００５】
従来の共焦点レーザ顕微鏡は、空間分解能の高い（被写界深度の低い）共焦点画像と、それよりも空間分解能の低い（被写界深度の高い）非共焦点画像とを取得することができるものの、ＣＣＤカメラにより取得される非共焦点画像の焦点深度をより深く設定するために、例えば対物レンズに可変開口絞りを設けてこの開口絞りを絞ると、レーザ光のビーム径も絞られてしまうために共焦点画像の分解能が低くなるという不都合がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光を走査することにより取得される蛍光画像の空間分解能を変化させることなく、瞬時に取得する蛍光画像の焦点深度を調節することができるレーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記標本を面照明する面照明光源と、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記対物レンズと前記スキャナとの間において蛍光を分岐する光路分岐部と、該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、レーザ光源から出射されスキャナで走査されたレーザ光が標本に照射されることにより、標本内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光が対物レンズにより集光され、光検出器により検出される。スキャナによる走査位置と光検出器により検出された蛍光の強度とを対応づけて記憶しておくことにより蛍光画像が取得される。この場合には、対物レンズの開口数を十分に大きく確保しておくことにより、焦点深度が小さく、空間分解能の高い蛍光画像を得ることができる。
【０００９】
一方、面照明光源により標本が面照明されると、標本の広い範囲において一度に蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズによって集光され、対物レンズとスキャナとの間において光路分岐部により分岐される。光路分岐部によりスキャナへの光路とは別の光路に分岐された蛍光は、可変絞りを通過した後に撮像素子により撮影される。これにより、瞬時に広い視野範囲の蛍光画像が取得される。
【００１０】
この場合において、本発明によれば、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像の焦点深度を深くする場合には、光路分岐部と撮像素子との間に配置されている可変絞りを絞る。これにより、撮像素子に入射する蛍光の開口数を小さくすることができ、蛍光画像の焦点深度が深くなる。したがって、このようにすることで、瞬時に取得される広い視野範囲の蛍光画像には、標本の厚さ方向の広い範囲から発生する蛍光が撮影されるので、蛍光発生部位の所在を瞬時に確認することができる。
【００１１】
そして、この場合に、可変絞りが、光路分岐部と撮像素子との間に配置されているので、光路分岐部において別の光路に分岐された蛍光から取得する蛍光画像については、可変絞りの影響を受けることがなく、高い空間分解能を保持することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記レーザ光源と前記スキャナとの間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部と、該蛍光分岐部と前記光検出器との間の前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置された共焦点ピンホールとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズにより集光されて、スキャナを介して戻り、共焦点ピンホールを通過した蛍光を光検出器により検出することができる。スキャナを介して戻る光路における対物レンズと光学的に共役な位置に共焦点ピンホールを配置することで、空間分解能の高い共焦点蛍光画像を取得することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記対物レンズと前記光路分岐部との間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部を備え、前記光検出器が、前記蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズにより集光され、蛍光分岐部において分岐された蛍光がスキャナに戻る前に光検出器により検出される。例えば、レーザ光源として極短（フェムト秒）パルスレーザ光源を使用した場合等には、共焦点ピンホールを介すことなく空間分解能の高い多光子蛍光画像を取得することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記対物レンズと前記光路分岐部との間の前記対物レンズに向かう光路に前記面照明光源からの照明光を合流させる面照明光合流部を備えていてもよい。
このようにすることで、面照明光源から出射された面照明光が、面照明合流部によってレーザ光と同一の光路に合流させられる。これにより、面照明光を照射して瞬時に得られる広い視野範囲の落射蛍光画像と、レーザ光を走査して得られる空間分解能の高い蛍光画像とを同時に得ることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側から前記面照明光源からの照明光を標本に照射するコンデンサレンズを備えていてもよい。
このようにすることで、面照明光源からの面照明光をコンデンサレンズによって集光して対物レンズとは反対側から標本を照明し、標本を透過する方向に発せられる蛍光を対物レンズによって集光することにより、透過蛍光画像を得ることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、光刺激用レーザ光源と、該光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の標本における照射位置を調節する刺激位置調節部と、該刺激位置調節部により位置調節された光刺激用レーザ光を前記スキャナと前記対物レンズとの間の該対物レンズに向かう光路に合流させる刺激光合流部とを備えていてもよい。
【００１７】
このようにすることで、光刺激用レーザ光源から発せられた光刺激用レーザ光が、刺激位置調節部によりその照射位置を調節されて、刺激光合流部によってスキャナと対物レンズとの間の光路に合流される。これにより、刺激位置調節部により調節された照射位置に光刺激用レーザ光を照射して刺激を与え、その反応を蛍光画像取得用のレーザ光または面照明光を照射して得られる蛍光画像によって観察することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の光束径を調節する光束径調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、光束径調節部の作動により標本に照射される光刺激用レーザ光のＮＡを調節して焦点深度を調節することができる。すなわち、焦点深度の深い蛍光画像を取得した場合に、深さ方向のどの位置から発生した蛍光であるのかを判別できないので、光刺激用レーザ光の焦点深度を深くして、蛍光画像の焦点深度をカバーする範囲に刺激を与えることができる。また、焦点深度の浅い蛍光画像を取得して、刺激を与えたい部位の深さ方向位置を厳密に特定できる場合には、光束径調節部により光刺激用レーザ光のＮＡを大きくして焦点深度を浅くし、狭い範囲に刺激を与えることができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記撮像素子により取得された標本の蛍光画像を表示する表示部と、該表示部に表示された蛍光画像内の領域を指定する領域指定部と、該領域指定部により指定された領域の蛍光画像を取得するように前記スキャナを制御する制御部とを備えていてもよい。
このようにすることで、撮像素子により瞬時に取得された標本の蛍光画像を表示部により表示し、領域指定部によって表示された蛍光画像内の領域を指定すると、制御部がスキャナを制御して、指定された領域の分解能の高い蛍光画像を取得することができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、焦点深度の深い蛍光画像を取得するために可変絞りを絞ると撮像素子に入射する蛍光量が低減するため、感度調節部により撮像素子の感度を高くして、取得される蛍光画像が暗くならないようにすることができる。また、可変絞りを開けて、撮像素子に入射する蛍光量を増大させたときには、感度調節部により撮像素子の感度を低下させて、取得される蛍光画像が明るくなり過ぎないようにすることができる。
【００２１】
また、上記発明においては、前記対物レンズを切り替える対物切替部を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズの種類および／または前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、対物切替部の作動により対物レンズを切り替えた場合に、対物レンズの種類によって、対物レンズの開口数が異なるため、可変絞りの絞り量に基づく撮像素子の感度調節とは独立して、対物レンズの種類により撮像素子の感度調節を行って、蛍光画像が明るくなり過ぎたり暗くなり過ぎたりしないようにすることができる。
【００２２】
また、本発明は、対物レンズを介して標本にスポット状のレーザ光を照射し、該レーザ光の前記標本上における照射位置を走査し、前記標本において発生し前記対物レンズにより集光された蛍光を検出し、検出された蛍光と走査位置とに基づいて蛍光画像を生成する画像生成ステップと、前記標本に対して面照明光を照射して、該標本において発生した蛍光を前記対物レンズにより集光し、集光された蛍光を前記レーザ光の光路から分岐した後に撮影する撮影ステップと、前記対物レンズにより集光された蛍光の絞り量を、前記レーザ光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップとを含む蛍光観察方法を提供する。
【００２３】
本発明によれば、画像生成ステップにおいて、スポット状のレーザ光を標本上において走査して、各位置において発生した蛍光を対物レンズによって集光して検出することにより、空間分解能の高い蛍光画像を取得することができる。撮影ステップにおいて、面照明光を標本に照射して、標本上の比較的広い範囲において発生した蛍光を対物レンズにより集光して撮影することにより、画像生成ステップにおいて取得される蛍光画像よりも空間分解能の低い蛍光画像を瞬時に取得することができる。そして、絞り調節ステップにおいて、蛍光の絞り量を調節することにより、撮影ステップにおいて取得される蛍光画像の焦点深度を調節することができる。この場合に、蛍光の絞り量をレーザ光の光路から分岐した後の対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節することにより、画像生成ステップにより取得される蛍光画像の空間分解能に影響を与えることなく、撮影ステップにおいて取得される蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、レーザ光を走査することにより取得される蛍光画像の空間分解能を変化させることなく、瞬時に取得する蛍光画像の焦点深度を調節することができるレーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１のレーザ走査型蛍光顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。
【図３】図１のレーザ走査型蛍光顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および蛍光観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１は、図１に示されるように、ステージ２に載置された標本Ａを観察する装置であって、ＬＳＭ観察光学系３と、ＣＣＤ観察光学系４と、これらを制御する制御部５と、モニタ６および入力部７とを備えている。ステージ２は、載置した標本Ａを３次元方向に移動可能に設けられている。
【００２７】
ＬＳＭ観察光学系３は、レーザ光を出射するレーザ光源８と、該レーザ光源８から出射されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ９と、該スキャナ９により走査されたレーザ光を標本Ａ上に集光し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１０と、該対物レンズ１０により集光されスキャナ９を介して戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１１と、該ダイクロイックミラー１１により分岐された蛍光を集光する集光レンズ１２と、該集光レンズ１２の焦点位置に配置された共焦点ピンホール１３と、該共焦点ピンホール１３を通過した蛍光を検出する光検出器（ＰＭＴ：光電子増倍管）１４とを備えている。図中、符号１５は瞳投影レンズ、符号１６は結像レンズ、符号１７はバリアフィルタである。
【００２８】
ＣＣＤ観察光学系４は、白色光を発生する水銀ランプのような面照明光源１８と、該面照明光源１８から発せられた白色光から所定の波長範囲の励起光を選択する励起フィルタ１９と、該励起フィルタ１９により選択された励起光を結像レンズ１６と対物レンズ１０との間の光路に合流させるダイクロイックミラー２０と、励起光を照射して標本Ａにおいて発生し対物レンズ１０により集光された蛍光を、結像レンズ１６と瞳投影レンズ１５との間でスキャナ９への光路から分岐するダイクロイックミラー２１と、該ダイクロイックミラー２１により分岐された光路内に配置された瞳投影レンズ２２と、可変絞り２３と、測光フィルタ２４と、結像レンズ２５と、ＣＣＤカメラ２６とを備えている。
【００２９】
図中、符号２７は、コンデンサレンズであって、面照明光源１８からの白色光を略平行光に変換するようになっている。
励起フィルタ１９は、例えば、異なる通過波長帯域を有する複数種のフィルタを択一的に光路に配置可能なフィルタターレットである。
【００３０】
可変絞り２３は、結像レンズ１６および瞳投影レンズ２２によってリレーされた対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されており、その位置を通過する蛍光の光束径を無段階で調節することができるようになっている。
測光フィルタ２４も、例えば、フィルタターレットであり、瞳投影レンズ２２により集光された蛍光の内から、ＣＣＤカメラ２６によって撮影させる蛍光の波長帯域を選択することができるようになっている。
【００３１】
制御部５は、スキャナ９を制御して、レーザ光の走査範囲、走査位置および走査速度を調節するようになっている。また、制御部５は、可変絞り２３の開口径を制御して、蛍光の光束径を調節し、ＣＣＤカメラ２６に入射させる蛍光の入射ＮＡ（開口数）を調節するようになっている。さらに、制御部５は、励起フィルタ１９および測光フィルタ２４を制御して、標本Ａに照射する面照明光の波長範囲を調節し、ＣＣＤカメラ２６により撮像する蛍光の波長範囲を調節するようになっている。
【００３２】
また、制御部５は、光検出器１４により検出した蛍光の強度を受けて、スキャナ９によるレーザ光の照射位置と対応づけて記憶することにより、ＬＳＭ蛍光画像を生成するようになっている。また、制御部５は、ＣＣＤカメラ２６により瞬時に取得された画像情報に基づいてＣＣＤ蛍光画像を生成するようになっている。
【００３３】
モニタ６は、制御部５により生成されたＬＳＭ蛍光画像およびＣＣＤ蛍光画像を表示するとともに、ＧＵＩ用の表示を行うようになっている。入力部７は、モニタ６上のＧＵＩ表示に従って種々の観察条件を入力したり、例えば、モニタ６に表示されているＣＣＤ蛍光画像中においてＬＳＭ蛍光画像を取得したい範囲をカーソルによって指定したりすることができるようになっている。
【００３４】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１を用いた蛍光観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、観察者が入力部７から観察条件を入力する。観察条件としては、まず、面照明光として照射する励起光の波長範囲およびＣＣＤカメラ２６により取得される蛍光の波長範囲を挙げることができる。
【００３５】
入力部７から観察条件が入力されると、制御部５は、入力された観察条件に従って、励起フィルタ１９および測光フィルタ２４を制御し、通過波長帯域および撮影波長範囲を設定する。また、制御部５は初期状態において可変絞り２３を、所定の開口径、例えば、対物レンズ１０の瞳径より十分に小さな最小開口径に設定する。
【００３６】
各種設定が行われた後に、制御部５は面照明光源を作動させて白色光を出射させる。これにより、励起フィルタ１９によって選択された波長帯域の励起光がダイクロイックミラー２０により反射され対物レンズ１０を介して標本Ａの比較的広い範囲に照射される。
【００３７】
標本Ａにおいては、励起光が照射された領域に存在する蛍光物質が励起されることにより蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズ１０によって集光され、結像レンズ１６によって集光され、ダイクロイックミラー２１を透過させられる。ダイクロイックミラー２１を透過させられることにより、後述するレーザ光源８からのレーザ光の光路から分岐させられ、瞳投影レンズ２２により集光される。
【００３８】
そして、瞳投影レンズ２２により集光された蛍光は、対物レンズ１０の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている可変絞り２３を通過して、測光フィルタ２４により波長範囲が選択された後に、結像レンズ２５によって集光されＣＣＤカメラ２６によって撮影される。
ＣＣＤカメラ２６によって瞬時に取得された標本Ａの比較的広い視野範囲にわたる蛍光画像情報は、制御部５に送られて、ＣＣＤ蛍光画像として生成され（撮影ステップ）、モニタ６に表示される。
【００３９】
観察者は、モニタ６上に表示された標本Ａの比較的広い範囲にわたるＣＣＤ蛍光画像を確認して、特に詳細に観察したい部位を探す。可変絞り２３が最小開口径に絞られているので、ＣＣＤ蛍光画像は暗く、かつコントラストが低くなっている。すなわち、可変絞り２３が対物レンズ１０の瞳径より十分に小さく絞られることにより、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度が深くなり、対物レンズ１０の焦点位置を中心とした深さ方向に比較的広い範囲から発生した蛍光が重なり合ったコントラストの低いＣＣＤ蛍光画像が取得される。制御部５は必要により、ＣＣＤカメラ２６の感度を増大させ、あるいは、蛍光画像情報に乗算するゲインを増大させる。
【００４０】
この場合において、観察者は、必要により、入力部７を操作して可変絞り２３の開口径を対物レンズ１０の瞳径より小さい範囲で調節する。可変絞り２３の開口径を大きくしていくと、ＣＣＤカメラ２６への入射ＮＡが増大していくので、ＣＣＤ蛍光画像は明るく、かつコントラストが高くなっていく反面、焦点深度が小さくなっていく。観察者は、可変絞り２３の開口径を適宜調節することにより、コントラストと焦点深度とのトレードオフにより、対物レンズ１０の光軸に交差する方向における蛍光の発生位置が特定できるような開口径に設定する（絞り調節ステップ）。
【００４１】
すなわち、可変絞り２３の開口径を対物レンズ１０の瞳径より小さく絞ることにより、焦点深度の深いＣＣＤ蛍光画像を得ることができ、対物レンズ１０の焦点面とは深さ方向に異なる部位において蛍光が発生していてもこれをＣＣＤ蛍光画像に含めることができる。したがって、観察者は、モニタ６上に表示されたＣＣＤ蛍光画像において蛍光が発生している箇所を特定して、入力部７の操作により、その位置にＬＳＭ蛍光画像の取得範囲を設定する。
【００４２】
制御部５は、入力部７から入力された取得範囲においてレーザ光が走査されるように、スキャナ９の走査位置および走査範囲を設定し、レーザ光源８からレーザ光を出射させる。レーザ光源８から出射されたレーザ光は、スキャナ９によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ１５、ダイクロイックミラー２１、結像レンズ１６および対物レンズ１０を介して標本Ａ上に集光される。これにより、レーザ光は、標本Ａ上における上記取得範囲内において走査される。
【００４３】
レーザ光が照射されることにより標本Ａにおいて蛍光が発生すると、該蛍光は対物レンズ１０により集光され、結像レンズ１６、ダイクロイックミラー２１、瞳投影レンズ１５およびスキャナ９を介してレーザ光と同一光路を戻り、ダイクロイックミラー１１によって分岐される。そして、分岐された蛍光は、バリアフィルタ１７によってレーザ光成分が除去された後に、集光レンズ１２によって集光され、その焦点位置に配置されている共焦点ピンホール１３を通過したもののみが光検出器１４によって検出される。
【００４４】
制御部５は、スキャナ９によるレーザ光の照射位置と、各照射位置における光検出器１４により検出された蛍光の強度とを対応付けて記憶しておき、各蛍光の強度を照射位置の情報に従って並べることによりＬＳＭ蛍光画像を生成することができる。これにより、対物レンズ１０の焦点面に広がる光軸方向に高い空間分解能を有するＬＳＭ蛍光画像を取得することができる（画像生成ステップ）。
【００４５】
観察者は、モニタ６に表示されたＬＳＭ蛍光画像において所望の蛍光領域が確認できない場合には、ステージ２を上下方向に作動させて、標本Ａ内における対物レンズ１０の焦点面を上下方向に移動させることにより蛍光領域を探索することができる。
【００４６】
このように、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および蛍光観察方法によれば、ＣＣＤ蛍光画像によって広い視野範囲にわたる標本Ａの観察を瞬時に行うとともに、ＬＳＭ蛍光画像によって、標本Ａの特定部位の詳細かつ空間分解能の高い観察を行うことができる。この場合に、対物レンズ１０により集光された蛍光をスキャナ９に戻す前に分岐した光路に可変絞り２３を配置しているので、ＬＳＭ蛍光画像の空間分解能を低下させることなく、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【００４７】
特に、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を深くすることにより、深さ方向のいずれかの位置において発生した蛍光をＣＣＤ蛍光画像に含めることができる。したがって、ステージ２を上下方向に移動させて蛍光強度の高い領域を探索することなく、一度に全体的な観察を行うことができる。例えば、標本Ａが生細胞である場合には、焦点深度を深くして生細胞の大部分の領域を全体的に一度に観察することができる。これにより、細胞周期の進行を観察し、細胞の変化が発生した時点で、高ＮＡのＬＳＭ蛍光画像によって、対物レンズ１０の焦点面に広がるスライス画像や、光軸方向に焦点位置をずらしながら複数枚のスライス画像を撮影して得られる積層画像を取得して詳細観察を行うことができる。
【００４８】
なお、本実施形態においては、ＬＳＭ観察光学系３として、対物レンズ１０により集光した蛍光をディスキャンする共焦点観察光学系を例示したが、これに限定されるものではない。例えば、図２に示されるように、レーザ光源８としてパルスレーザ光源を用い、対物レンズ１０により集光した蛍光を対物レンズ１０の後段において、ダイクロイックミラー２８によりすぐに光路から分岐して光検出器１４により検出する多光子励起方式のＬＳＭ観察光学系３’を採用してもよい。この場合においても、上記と同様に、ＬＳＭ蛍光画像の空間分解能を損なうことなく、ＣＣＤ蛍光画像の焦点深度を調節することができる。
【００４９】
また、本実施形態においては、面照明光源１８からの励起光を標本Ａに一方向から照射し、その照射方向に戻る蛍光を観察する、いわゆる落射照明方式のレーザ走査型蛍光顕微鏡１を例示したが、これに代えて、図３に示されるように、透過照明方式のレーザ走査型蛍光顕微鏡１’を採用してもよい。
すなわち、標本Ａを挟んで対物レンズ１０とは反対側、図３では下側に面照明光源１８を配置して、標本Ａに下側から励起光を照射し、それによって発生した蛍光のうち、上方に発せられた蛍光を対物レンズ１０によって集光し検出するようになっている。
【００５０】
このようにすることで、落射照明方式の場合のダイクロイックミラー２０をなくすことができ、さらに簡易に構成することができる。図３に示されるミラー２９としては、特別は波長特性を備えさせる必要がなく、安価に構成することができる。
【００５１】
また、可変絞り２３の絞り量に基づいてＣＣＤカメラ２６の感度を調節する感度調節部（図示略）を備えていてもよい。このようにすることで、焦点深度の深い蛍光画像を取得するために可変絞り２３を絞るとＣＣＤカメラ２６に入射する蛍光量が低減するため、感度調節部によりＣＣＤカメラ２６の感度を高くして、取得される蛍光画像が暗くならないようにすることができる。また、可変絞り２３を開けて、ＣＣＤカメラ２６に入射する蛍光量を増大させたときには、感度調節部によりＣＣＤカメラ２６の感度を低下させて、取得される蛍光画像が明るくなり過ぎないようにすることができる。
【００５２】
また、対物レンズ１０を切り替える対物切替部（図示略）を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズ１０の種類および／または可変絞り２３の絞り量に基づいてＣＣＤカメラ２６の感度を調節する感度調節部を備えていてもよい。
【００５３】
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０および蛍光観察方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５４】
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０は、図４に示されるように、光刺激光学系３１を備えている。光刺激光学系３１は、光刺激用のレーザ光源３２と、該レーザ光源３２から発せられたレーザ光の光軸方向に直交する方向の位置を調節するスキャナ３３と、該スキャナ３３により位置調節されたレーザ光を、ＬＳＭ観察光学系３の光路に合流させるダイクロイックミラー３４とを備えている。図中符号３５は、光刺激用のレーザ光の光束径を調節する光束径調節部、符号３６はミラーである。
【００５５】
光束径調節部３５は、例えば、光軸方向に配列された複数のレンズを備え、そのレンズの少なくとも１つを光軸方向に移動させることで、光束径を変更するビームエキスパンダによって構成されている。光刺激用のレーザ光の光束径を調節することにより、対物レンズ１０を介して標本Ａに入射される光刺激用のレーザ光の入射ＮＡを調節することができる。
【００５６】
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０によれば、可変絞り２３を絞ることにより得られた焦点深度の深いＣＣＤ蛍光画像によって高輝度の蛍光が発生している領域を特定することができた場合に、その特定された位置に、光束径調節部３５によって入射ＮＡを小さくして焦点深度を深くした光刺激用のレーザ光を入射させて、蛍光が発生している部位に確実に光刺激を与えることができる。すなわち、ＣＣＤ蛍光画像上で光刺激用のレーザ光の照射位置を特定するだけで、深さ方向の照射位置を特定することなく、所望の領域に光刺激を与えることができるという利点がある。そして、光刺激を与える前後の反応を、ＣＣＤ蛍光画像およびＬＳＭ蛍光画像の両方で観察することができる。
【符号の説明】
【００５７】
Ａ 標本
１，３０ レーザ走査型蛍光顕微鏡
５ 制御部
６ モニタ（表示部）
７ 入力部（領域指定部）
８ レーザ光源
９ スキャナ
１０ 対物レンズ
１１ ダイクロイックミラー（蛍光分岐部）
１３ 共焦点ピンホール
１４ 光検出器
１５ 光路分岐部
１８ 面照明光源
２０ 面照明光合流部
２１ ダイクロイックミラー（光路分岐部）
２３ 可変絞り
２６ ＣＣＤカメラ（撮像素子）
２７ コンデンサレンズ
３２ 光刺激用レーザ光源
３３ スキャナ（刺激位置調節部）
３４ ダイクロイックミラー（刺激光合流部）
３５ 光束径調節部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記標本を面照明する面照明光源と、
前記レーザ光の照射により発生した蛍光を前記レーザ光の光路から分岐させる蛍光分岐部と、
該蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出する光検出器と、
前記対物レンズと前記スキャナとの間の光路において蛍光を分岐する光路分岐部と、
該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影する撮像素子と、
該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記蛍光分岐部は前記レーザ光源と前記スキャナとの間の光路において前記蛍光を分岐し、
該蛍光分岐部と前記光検出器との間の前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置された共焦点ピンホールとを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記対物レンズと前記光路分岐部との間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部を備え、
前記光検出器が、前記蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出する請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記対物レンズと前記光路分岐部との間の前記対物レンズに向かう光路に前記面照明光源からの照明光を合流させる面照明光合流部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側から前記面照明光源からの照明光を標本に照射するコンデンサレンズを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項６】
光刺激用レーザ光源と、該光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の標本における照射位置を調節する刺激位置調節部と、該刺激位置調節部により位置調節された光刺激用レーザ光を前記スキャナと前記対物レンズとの間の該対物レンズに向かう光路に合流させる刺激光合流部とを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の光束径を調節する光束径調節部を備える請求項６に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項８】
前記撮像素子により取得された標本の蛍光画像を表示する表示部と、
該表示部に表示された蛍光画像内の領域を指定する領域指定部と、
該領域指定部により指定された領域の蛍光画像を取得するように前記スキャナを制御する制御部とを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
前記対物レンズを切り替える対物切替部を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズの種類および／または前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
対物レンズを介して標本にスポット状のレーザ光を照射し、該レーザ光の前記標本上における照射位置を走査し、前記標本において発生し前記対物レンズにより集光された蛍光を検出し、検出された蛍光と走査位置とに基づいて蛍光画像を生成する画像生成ステップと、
前記標本に対して面照明光を照射して、該標本において発生した蛍光を前記対物レンズにより集光し、集光された蛍光を前記レーザ光の光路から分岐した後に撮影する撮影ステップと、
前記対物レンズにより集光された蛍光の絞り量を、前記レーザ光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップとを含む蛍光観察方法。
【請求項１】
レーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記標本を面照明する面照明光源と、
前記レーザ光の照射により発生した蛍光を前記レーザ光の光路から分岐させる蛍光分岐部と、
該蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出する光検出器と、
前記対物レンズと前記スキャナとの間の光路において蛍光を分岐する光路分岐部と、
該光路分岐部において分岐された蛍光を撮影する撮像素子と、
該撮像素子と前記光路分岐部との間の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された可変絞りとを備えるレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記蛍光分岐部は前記レーザ光源と前記スキャナとの間の光路において前記蛍光を分岐し、
該蛍光分岐部と前記光検出器との間の前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置された共焦点ピンホールとを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記対物レンズと前記光路分岐部との間の光路において蛍光を分岐する蛍光分岐部を備え、
前記光検出器が、前記蛍光分岐部によって分岐された蛍光を検出する請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記対物レンズと前記光路分岐部との間の前記対物レンズに向かう光路に前記面照明光源からの照明光を合流させる面照明光合流部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側から前記面照明光源からの照明光を標本に照射するコンデンサレンズを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項６】
光刺激用レーザ光源と、該光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の標本における照射位置を調節する刺激位置調節部と、該刺激位置調節部により位置調節された光刺激用レーザ光を前記スキャナと前記対物レンズとの間の該対物レンズに向かう光路に合流させる刺激光合流部とを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記光刺激用レーザ光源からの光刺激用レーザ光の光束径を調節する光束径調節部を備える請求項６に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項８】
前記撮像素子により取得された標本の蛍光画像を表示する表示部と、
該表示部に表示された蛍光画像内の領域を指定する領域指定部と、
該領域指定部により指定された領域の蛍光画像を取得するように前記スキャナを制御する制御部とを備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
前記対物レンズを切り替える対物切替部を備え、該対物切替部により切り替えられた対物レンズの種類および／または前記可変絞りの絞り量に基づいて前記撮像素子の感度を調節する感度調節部を備える請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
対物レンズを介して標本にスポット状のレーザ光を照射し、該レーザ光の前記標本上における照射位置を走査し、前記標本において発生し前記対物レンズにより集光された蛍光を検出し、検出された蛍光と走査位置とに基づいて蛍光画像を生成する画像生成ステップと、
前記標本に対して面照明光を照射して、該標本において発生した蛍光を前記対物レンズにより集光し、集光された蛍光を前記レーザ光の光路から分岐した後に撮影する撮影ステップと、
前記対物レンズにより集光された蛍光の絞り量を、前記レーザ光の光路から分岐した後の前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置において調節する絞り調節ステップとを含む蛍光観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２８６５６６（Ｐ２０１０−２８６５６６Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３８５８９（Ｐ２００９−１３８５８９）
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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