レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法
【課題】光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することのできるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】標本Ｐに光刺激を与えるための刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源１５と、刺激用レーザ光Ｌ２を走査する第２のスキャナ１７と、第２のスキャナ１７を制御する制御装置２０と、第２のスキャナ１７により走査された刺激用レーザ光Ｌ２を集光して標本Ｐに照射する対物レンズ５とを有し、第２のスキャナ１７が、刺激用レーザ光Ｌ２の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子１７ａ，１７ｂを備え、制御装置２０が、光刺激領域の位置および範囲に基づいて一または複数の周波数を決定し、決定した一または複数の周波数の高周波信号を、音響光学素子１７ａ，１７ｂに取り付けられている各振動子１８ａ，１８ｂに対して、同時に印加するレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本Ｐに光刺激を与えるための刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源１５と、刺激用レーザ光Ｌ２を走査する第２のスキャナ１７と、第２のスキャナ１７を制御する制御装置２０と、第２のスキャナ１７により走査された刺激用レーザ光Ｌ２を集光して標本Ｐに照射する対物レンズ５とを有し、第２のスキャナ１７が、刺激用レーザ光Ｌ２の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子１７ａ，１７ｂを備え、制御装置２０が、光刺激領域の位置および範囲に基づいて一または複数の周波数を決定し、決定した一または複数の周波数の高周波信号を、音響光学素子１７ａ，１７ｂに取り付けられている各振動子１８ａ，１８ｂに対して、同時に印加するレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に係り、特に、音響光学効果を用いて刺激用レーザ光を走査するレーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本を観察するための観察用走査光学系と、標本に光刺激を与える刺激用走査光学系とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特開平１０−２０６７４２号公報参照。）。
このようなレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光源から発せられた刺激用レーザ光をガルバノミラーによるスキャナによって２次元的に走査し、標本に照射することで、光刺激領域に対して光刺激を与えている。
【特許文献１】特開平１０−２０６７４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、上述した光刺激は、光刺激領域の全域に対して略同時に与えることが好ましい。しかしながら、上述した従来のレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光をガルバノミラーにより標本上で２次元的に走査させて光刺激を行うことから、光刺激の開始から終了までに時間がかかるという問題があった。
【０００４】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することのできるレーザ走査型顕微鏡よび顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示するレーザ走査型顕微鏡であって、前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光を射出する刺激用レーザ光源と、前記刺激用レーザ光を走査する刺激用走査部と、前記刺激用走査部を制御する制御部と、前記刺激用走査部により走査された前記刺激用レーザ光を集光して標本に照射する対物レンズとを有し、前記刺激用走査部が、前記刺激用レーザ光の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子を備え、前記制御部が、光刺激を与える領域の位置および範囲に基づいて複数の周波数を決定し、決定した複数の周波数の高周波信号を、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、同時に印加することにより、前記領域に同時に前記刺激用レーザ光を照射するレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【０００６】
上記構成によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、刺激用走査部が備える音響光学素子によって走査され、対物レンズを介して標本に照射されることとなる。この場合において、音響光学素子に取り付けられている振動子には、光刺激領域の位置および範囲に基づいて決定された複数の周波数の高周波信号が制御部から同時に印加される。
複数の周波数の高周波信号が同時に振動子に印加された場合には、音響光学素子に入射した刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることにより、一方向に配列された複数のスポット光として出射されることとなる。ここで、振動子に与えられる高周波信号の周波数間隔が狭いほど、一列に配列された各スポット光間の距離も狭くなる。これにより、高周波信号の周波数間隔を調節することにより、スポット光の間隔を調整することができ、また、周波数間隔をある程度狭くすることで、一列に配列された各スポット光に重なり合う部分を持たせ、ライン状のレーザ光を生成することも可能である。
本発明によれば、標本に対して複数のスポット光を同時に照射することが可能となるので、単一のスポット光を２次元的に走査させる場合に比べて、光刺激を効率的に行うことができる。
【０００７】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査部が、入射された刺激用レーザ光を第１の方向に回折させる第１の音響光学素子と、入射された刺激用レーザ光を前記第１の方向と交わる方向に回折させる第２の音響光学素子とを具備することとしてもよい。
【０００８】
上記構成によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、第１及び第２の音響光学素子により第１の方向および第１の方向と交わる方向、例えば、水平方向及び垂直方向に回折されることとなる。これにより、例えば、第１及び第２の音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、複数の周波数の高周波信号が同時に印加されていた場合には、２次元的な分布を有するレーザ光を生成させることができる。この結果、２次元的な領域を同時に照射することができるので、光刺激を更に効率的に行うことができる。
【０００９】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子のそれぞれの振動子に対して、それぞれ複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の二次元の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。このようにすると、例えば、矩形等の二次元の領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１０】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線上の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。このようにすると、例えば、所定長さの線分に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１１】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加するとともに、他の振動子に少なくとも一つで時間的に変化する周波数の高周波信号を印加することにより、前記一方の振動子によって駆動される音響光学素子から射出される一直線状の照射領域を前記他方の振動子により駆動される音響光学素子によって切り替え、これにより標本上の二次元領域に刺激レーザ光を照射することとしてもよい。
【００１２】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記一方の振動子に印加される高周波信号が有する周波数は、時間的に変化してもよい。このようにすると、例えば、円形等の二次元領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１３】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査部は、入射された刺激用レーザ光を水平方向または垂直方向に回折させる音響光学素子と、前記音響光学素子の回折方向に略直交する方向に、入射された刺激用レーザ光を走査する走査用ミラーとを具備することとしてもよい。
【００１４】
このような構成によれば、音響光学素子によりスポット光である刺激用レーザ光を一方向に配列された複数のスポット光（なお、高周波信号の周波数間隔がある程度狭ければ、ライン状のレーザ光とすることが可能である）とすることができ、また、走査用ミラーによって、光刺激用レーザ光を該一方向に直交する方向に走査することができる。これにより、標本上において、複数のスポット光をその配列に直交する方向に走査することができる。この結果、光刺激を効率的に実行することができる。また、音響光学素子に取り付けられた振動子に印加する高周波信号の周波数を光刺激領域の形状に応じて変化させることにより、四角形だけではなく、円や、楕円などのさまざまな形状に対しても効率的に光刺激を実行することができる。
【００１５】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線状の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。該一直線状の領域は、例えば、所定長さの線分である。
【００１６】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加し、前記音響光学素子によって同時に照射される一直線状の領域の照射位置を走査ミラーによって走査することにより、標本上の二次元領域に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。
【００１７】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記振動子に印加される高周波信号が有する周波数を時間的に変化させてもよい。このようにすることで、例えば、円形等の二次元領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射させることが可能となる。
【００１８】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部が、前記刺激用レーザ光の波長を考慮して前記高周波信号の周波数を決定することとしてもよい。
【００１９】
このような構成によれば、刺激用レーザ光の波長に応じて、高周波信号の周波数が決定されることとなるので、刺激用レーザ光の波長が切り替えられた場合でも、所望の回折角度で入射光を回折することができ、一定の走査精度を保つことができる。
【００２０】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部が、前記音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、前記高周波信号の振幅を補正することとしてもよい。
【００２１】
このような構成によれば、音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、高周波信号の振幅が補正されるので、音響光学素子から出射される刺激用レーザ光の光強度を所望の強度に制御することが可能となる。これにより、光刺激領域の全域において、刺激用レーザ光の光強度を均一にすることや、或いは、刺激用レーザ光の光強度を局部的に異ならせることが可能となる。
【００２２】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記観察用レーザ光を前記標本上で走査する走査部を備えることとしてもよい。
【００２３】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用レーザ光が照射される前記領域は、観察用レーザ光の照射によって予め取得された画像上で指定可能とされていてもよい。
【００２４】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記高周波信号の複数の周波数の間隔を所定値より狭めることで、前記刺激用レーザ光が同時に照射される領域を空間的に連続となるようにしてもよい。
【００２５】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部は、前記決定した複数の周波数ごとに振幅の異なる高周波信号を前記振動子に同時に印加することにより、前記領域ごとの前記刺激用レーザ光の照射強度を異ならせることとしてもよい。
【００２６】
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示する顕微鏡観察方法であって、前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光の光路上に少なくとも１つの音響光学素子を配置し、各前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、光刺激領域の位置および範囲に応じて決定される複数の周波数の高周波信号を同時に印加する顕微鏡観察方法を提供する。
【００２７】
このような方法によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、刺激用走査部が備える音響光学素子によって走査され、対物レンズを介して標本に照射されることとなる。この場合において、音響光学素子に取り付けられている振動子には、光刺激領域の位置および範囲に基づいて決定された一または複数の周波数の高周波信号が同時に印加される。
複数の周波数の高周波信号が同時に振動子に印加された場合には、音響光学素子に入射した刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることにより、一方向に配列された複数のスポット光として出射されることとなる。ここで、振動子に与えられる高周波信号の周波数間隔が狭いほど、一列に配列された各スポット光間の距離も狭くなる。これにより、高周波信号の周波数間隔を調節することにより、スポット光の間隔を調整することができ、また、周波数間隔をある程度狭くすることで、一列に配列された各スポット光に重なり合う部分を持たせ、ライン状のレーザ光を生成することも可能である。
本発明によれば、標本に対して複数のスポット光を同時に照射することが可能となるので、単一のスポット光を２次元的に走査させる場合に比べて、光刺激を効率的に行うことができる。
【００２８】
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射する観察用走査光学系と、前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、前記標本に光刺激を与えるための刺激用走査光学系とを有し、該刺激用走査光学系が少なくとも１つの音響光学素子を有するレーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査光学系の制御を行うための光刺激制御プログラムであって、光刺激領域の位置および範囲に応じて、前記音響光学素子の回折範囲を設定する処理と、前記回折範囲に対応する一または複数の周波数を求める処理と、前記一または複数の周波数を有する高周波信号を同時に、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して印加させる処理とをコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラムをコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラムを提供する。
【００２９】
このような光刺激制御プログラムがハードウェア資源によって実行されることにより、光刺激領域の位置および範囲に応じて音響光学素子の回折範囲が設定され、該回折範囲に対応する一または複数の周波数が算出され、この一または複数の周波数の高周波信号が同時に音響光学素子に取り付けられている振動子に印加されることとなる。これにより、音響光学素子に入射された刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることとなる。これにより、一方向に配列された複数のスポットレーザ光、或いは、上記高周波信号の周波数間隔によっては、ライン状とされた刺激用レーザ光、または、音響光学効果を利用することにより高速走査された刺激用レーザ光を標本に照射させることが可能となる。この結果、光刺激を効率的に行うことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の実施形態について、図を参照して説明する。
【００３２】
〔第１の実施形態〕
図１に示すように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。図１中、各種レンズおよびピンホール等の光学部品は、説明の簡略化のために省略している。
本発明の第１の本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ１を走査する観察用走査光学系２と、刺激用レーザ光Ｌ２を走査する刺激用走査光学系３と、観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を合波するダイクロイックミラー４と、合波された観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を集光して標本Ｐに照射する一方、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐに照射することにより、標本Ｐ内の蛍光物質が励起されて発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備えている。
【００３３】
観察用走査光学系２は、観察用レーザ光Ｌ１を出射する観察用レーザ光源８と、観察用レーザ光源８から発せられた観察用レーザ光Ｌ１を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第１のスキャナ９とを備えている。
【００３４】
観察用走査光学系２の観察用レーザ光源８と第１のスキャナ９との間には、標本Ｐにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、ダイクロイックミラー４、および第１のスキャナ９を経由して戻る蛍光Ｆを観察用レーザ光Ｌ１から分岐して光検出器６に向かわせるダイクロイックミラー１２が備えられている。
第１のスキャナ９は、後述する蛍光画像の左右方向に対応する水平方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第１のガルバノミラー９ａと、蛍光画像の上下方向に対応する垂直方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第２のガルバノミラー９ｂとを備える、いわゆる近接ガルバノミラーである。これにより、観察用レーザ光Ｌ１がラスタスキャン方式で標本Ｐ上に２次元的に走査されるようになっている。
【００３５】
刺激用走査光学系３は、刺激用レーザ光Ｌ２を出射する刺激用レーザ光源１５と、該刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第２のスキャナ（刺激用走査部）１７とを備えている。この刺激用走査光学系３の詳細については後述する。
【００３６】
光検出器６は、共焦点ピンホール３１、ダイクロイックミラー３２，３３、第１の光検出部３４、及び第２の光検出部３５を備えて構成されている。
第１の光検出部３４は、分散素子３６、レンズ３７、スリット３８、および光電変換素子３９を備えている。また、第２の光検出部３５は、測光フィルタ４０、光電変換素子４１を備えている。本実施形態では、分散素子３６として平面回折格子を用い、この平面回折格子を回転させることにより検出する波長帯域の中心を選択するようにしたものである。測光フィルタ４０は、特定波長の光のみを透過する特性を持つ。
【００３７】
各光電変換素子３９，４１は、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）を介して制御装置２０に接続されている。制御装置２０は、記憶装置２１、ＣＰＵ２２、メモリ２３を備えている。この制御装置２０は、いわゆるパーソナルコンピュータにより構成されていてもよい。ＣＰＵ２２は、記憶装置２１に格納されている各種データならびに各種プログラムをメモリ２３に読み出し、情報の加工・演算処理を実行することにより、種々の制御内容を実現させる。記憶装置２１は、例えば、ＨＤ(Hard Disc)，ＲＯＭ（Read Only Memory）等である。メモリ２３は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）等である。
ＣＰＵ２２は、第１のスキャナ９による観察用レーザ光Ｌ１の標本Ｐ上における走査位置情報と、光検出器６により検出された蛍光Ｆの光強度情報とに基づいて、２次元的な蛍光画像を構築し、表示装置２４に表示するようになっている。
また、制御装置２０には、入力装置２５が接続されている。この入力装置２５は、オペレータによる各種入力操作に用いられる。
【００３８】
上記刺激用走査光学系３において、第２のスキャナ１７は、後述する蛍光画像の左右方向に対応する水平方向に刺激用レーザ光Ｌ２を回折させる第１の音響光学素子１７ａと、蛍光画像の上下方向に対応する垂直方向に刺激用レーザ光Ｌ２を回折させる第２の音響光学素子１７ｂとを備えている。
本実施形態において、第１の音響光学素子１７ａ、第２の音響光学素子１７ｂは、音響光学偏光器（ＡＯＤ：acousto optical deflector）である。
これら各音響光学素子１７ａ、１７ｂには、後述する走査制御部１９によって印加される高周波信号で駆動する振動子（振動供給部）１８ａ，１８ｂが取り付けられている。
走査制御部１９は、制御装置２０と接続されており、制御装置２０からの信号制御情報に応じた周波数帯域の高周波信号を振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ印加する。
【００３９】
上記制御装置２０の記憶装置２１は、各音響光学素子１７ａ，１７ｂの１次回折角度θと周波数ｆとの対応関係を記憶している。例えば、走査制御部１９は、以下の（１）式に示す関係式を記憶している。
【００４０】
θ＝λ・ｆ／Ｖａ （１）
【００４１】
上記（１）式において、θは、図２に示すように、音響光学素子１７ａ，１７ｂの基準線と１次回折光とがなす角度（以下、「回折角度」という。）であり、λは刺激用レーザ光Ｌ２の波長であり、ｆは振動子に与える高周波信号の周波数であり、Ｖａは音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける結晶内の音速速度である。このＶａは、固体差があり、個々の音響光学素子１７ａ，１７ｂによって異なる値である。
更に、制御装置２０は、表示装置２４に表示した蛍光画像の各画素位置と各音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける回折角度θとを対応付けて記憶している。これにより、表示装置２４に表示した蛍光画像上において、オペレータにより光刺激領域が指定された場合には、ＣＰＵ２２が、その光刺激領域に刺激用レーザ光Ｌ２が照射されるように、各音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角度θの範囲を決定し、この回折角度θの範囲に対応する複数の周波数の高周波信号を走査制御部１９を介して同時に振動子１８ａ，１８ｂに印加させることが可能となる。
【００４２】
これにより、各振動子１８ａ，１８ｂの振動に応じた屈折率変化を第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂ内で生じさせ、図３に示すように、第１の音響光学素子１７ａに入射した刺激用レーザ光Ｌ２を水平方向の異なる回折角度に同時に回折させることにより、水平方向に配列された複数のスポット光、換言すると、１次元分布のスポット光とすることができる。なお、振動子１８aに印加する高周波信号の周波数間隔を狭くすればするほど、スポット光間の距離が短くなる。したがって、高周波信号の周波数間隔をある一定値よりも狭めることにより、隣接する各スポット光に重なり部分を持たせ、水平方向に伸びるライン状のレーザ光とすることも可能である。なお、以下の第２の音響光学素子１７ｂについても同様である。
そして、更に、この水平方向に配列された複数のスポット光を第２の音響光学素子１７ｂによって垂直方向に対して複数の回折角度に同時に回折させることにより、２次元分布のスポット光とすることができる。
【００４３】
〔光刺激領域；四角形〕
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。ここでは、後述する光刺激領域Ｂとして「四角形」が指定された場合について説明する。
【００４４】
まず、実験開始の前段階として、プレスキャンが行われる（図４のステップＳＡ１）。このプレスキャンでは、ＣＰＵ２２が観察用走査光学系２および光検出器６を作動させることにより、標本Ｐの蛍光画像を表示装置２４に表示させる。具体的には、ＣＰＵ２２は、観察用レーザ光源８、第１のスキャナ９を作動させる。これにより、観察用レーザ光源８から出射された観察用レーザ光Ｌ１が、第１のスキャナ９によって２次元的に走査され、ダイクロイックミラー４、および対物レンズ５を経て、標本Ｐに照射される。標本Ｐに観察用レーザ光Ｌ１が照射されると、標本Ｐ内に存在する蛍光物質が観察用レーザ光Ｌ１によって励起され、蛍光Ｆが発生する。標本Ｐにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ５、ダイクロイックミラー４および第１のスキャナ９を経由して観察用レーザ光Ｌ１と同じ経路を戻り、ダイクロイックミラー１２によって観察用レーザ光Ｌ１と分離されて、光検出器６に導かれる。
【００４５】
光検出器６において、蛍光Ｆは、共焦点ピンホール３１で結像し、ダイクロイックミラー３２に入射し、ここで波長に応じて２つに分岐される。ダイクロイックミラー３２によって反射された蛍光Ｆ１は、分散素子３６により波長ごとに異なる角度に反射される。この状態で分散素子３６を回転させると、分散素子３６の回転角度に応じた各波長中心の光がレンズ３７によりスリット３８に集光され、スリット３８を通過した波長の光のみが光変換素子３９に入射される。
【００４６】
一方、ダイクロイックミラー３２を透過した蛍光Ｆ２は、ダイクロイックミラー３３によって第２の光検出部３５に導かれる。第２の光検出部３５において、蛍光Ｆ２は、測光フィルタ４０により特定の波長の光が選択透過され、光電変換素子４１に入射される。
光電変換素子３９，４０に入射された蛍光Ｆ１、Ｆ２は、それぞれ輝度に応じた電気信号として出力され、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）によってディジタル信号に変換されて、制御装置２０に送られる。
制御装置２０では、ＣＰＵ２２により、このディジタル信号に基づいて２次元的な蛍光画像が構築され、表示装置２４に表示される。これにより、表示装置２４には、図５に示すように、観察面における蛍光画像Ｃが表示されることとなる。
【００４７】
次に、表示装置２４に表示された蛍光画像Ｃにおいて、図５に示すように、オペレータにより画像取得領域Ａおよび光刺激領域Ｂが指定されると（図４のステップＳＡ２）、制御装置２０のＣＰＵ２２は、指定された画像取得領域Ａの位置および範囲に応じて第１のスキャナ９の走査範囲を設定するとともに（図４のステップＳＡ３）、指定された光刺激領域Ｂの位置および範囲に応じて振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数を算出する（図４のステップＳＡ４）。
以下、図４のステップＳＡ４において行われる周波数帯域の設定手順について、図６を用いて詳しく説明する。
【００４８】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す（図６のステップＳＢ１）。
続いて、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂにおける水平方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｈ１〜Ｐｈ２）に基づいて、第１の音響光学素子１７ａの回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２を決定し（図６のステップＳＢ２）、この回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２にそれぞれ対応する複数の周波数ｆｈ１〜ｆｈ２を上記（１）式に基づいて決定する（図６のステップＳＢ３）。
【００４９】
例えば、回折角度θｈ１に対応する周波数ｆｈ１、及び、回折角度θｈ２に対応する周波数ｆｈ２は、以下のように求められる。
ｆｈ１＝θｈ１・Ｖａ１／λ
ｆｈ２＝θｈ２・Ｖａ１／λ
同様に、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂにおける垂直方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｖ１〜Ｐｖ２）に基づいて、第２の音響光学素子１７ｂの回折角度の範囲θｖ１〜θｖ２を決定し（図６のステップＳＢ４）、この回折角度の範囲θｖ１〜θｖ２にそれぞれ対応する複数の周波数ｆｖ１〜ｆｖ２を上記（１）式に基づいて決定する（図６のステップＳＢ５）。
例えば、回折角度θｖ１に対応する周波数ｆｖ１、及び、回折角度θｖ２に対応する周波数ｆｖ２は、以下のように求められる。
ｆｖ１＝θｖ１・Ｖａ２／λ
ｆｖ２＝θｖ２・Ｖａ２／λ
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、複数の周波数を求めると、これらの情報を走査制御部１９に出力する（図６のステップＳＢ６）。
【００５０】
このようにして、画像取得および光刺激の準備が完了すると、ＣＰＵ２２は、観察用レーザ光源８を作動させるとともに、第１のスキャナ９を上記走査範囲で走査することで、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐの画像取得領域Ａに２次元的に照射させ、これにより発生する蛍光を検出することにより、画像取得領域Ａにおける蛍光画像を構築して、表示装置２４に表示させる。また、上記画像取得と並行して、走査制御部１９は、ＣＰＵ２２から取得した上記周波数ｆｈ１〜ｆｈ２およびｆｖ１〜ｆｖ２の範囲における複数の周波数を予め設定されている周波数間隔で決定し、離散的に分布する各周波数からなる高周波信号を各振動子１８ａ、１８ｂに同時に印加する（図４のステップＳＡ５）。なお、周波数間隔は、予め一意に決められていてもよいし、複数の周波数間隔が候補として予め登録されており、これらの候補の中から１つを走査制御部１９が選択して設定することとしてもよい。また、オペレータが入力装置２５から周波数間隔を設定できるような構成としてもよい。
【００５１】
これにより、各周波数の高周波信号に基づいて振動子１８ａ，１８ｂがそれぞれ振動することにより、この振動が第１の音響光学素子１７ａおよび第２の音響光学素子１７ｂにそれぞれ伝搬して、各音響光学結晶内に周期的な屈折率変化が生じることとなる。この状態で、ＣＰＵ２２により刺激用レーザ光源１５が作動されると、刺激用レーザ光源１５から刺激用レーザ光Ｌ２が出射され、光路上に設けられた第１の音響光学素子１７ａに入射することとなる。
【００５２】
第１の音響光学素子１７ａに入射した刺激用レーザ光Ｌ２は、高周波信号の各周波数（ｆｈ１からｆｈ２までの離散的な周波数の値）に応じた回折角度でほぼ同時に回折されることにより、図３に示すように、光刺激領域Ｂの水平方向に配列される複数のスポット光、換言すると、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２とされて、第２の音響光学素子１７ｂに導かれる。第２の音響光学素子１７ｂに入射された１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、高周波信号の各周波数（ｆｖ１〜ｆｖ２までの離散的な周波数の値）に応じた回折角度でほぼ同時に回折される。これにより、光刺激領域Ｂの垂直方向に配列される複数のスポット光が生成され、図３に示すように、第２の音響光学素子１７ｂからは、水平方向および垂直方向に配列された複数のスポット光、換言すると、２次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が出射されることとなる。
【００５３】
２次元分布とされた刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。これにより、刺激用領域Ｂの全域に対してほぼ同時に光刺激を実施することが可能となる。ＣＰＵ２２は、このような光刺激を指定された光刺激時間にわたって実行すると、光刺激を終了する。また、光刺激を行われている間もＣＰＵ２２が観察用走査光学系２の第１のスキャナ９等を継続的に作動させることにより、光刺激前後の蛍光画像が取得され、表示装置２４に連続的に表示されることとなる。
【００５４】
〔光刺激領域；楕円形〕
次に、上述した図４のステップＳＡ２において、図７に示すように、光刺激領域Ｂとして楕円形が指定された場合における高周波信号の周波数の設定手順について説明する。なお、光刺激領域Ｂとして楕円形が設定された場合には、上述した四角形のときのように、同時に全ての領域を照射することは不可能である。そこで、楕円形の場合には、時間に応じてその照射範囲が変化する１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査することにより、楕円形の光刺激領域Ｂ全体を照射することとする。本実施形態では、第１の音響光学素子１７ａを走査用の光学素子として用い、第２の音響光学素子１７ｂにより、スポット光である刺激用レーザ光Ｌ２を垂直方向に配列される複数のスポット光に変換するとともに、この複数のスポット光の端から端までの距離を時間に応じて変化させることする。なお、以下の説明においては、複数の周波数において最小周波数から最大周波数までの幅を「周波数帯域」と定義する。
【００５５】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す。
続いて、ＣＰＵ２２は、この光刺激領域Ｂの全域を刺激するのに要する時間Ｔｗ、換言すると、この光刺激領域Ｂに対する光刺激開始から終了までの光刺激時間Ｔｗを決定し、この光刺激時間Ｔｗ内の任意の時間ｔｋにおける第１の音響光学素子の回折角度をθｈ(ｔｋ)を求め、このｔｋを光刺激開始時ｔ０から終了時ｔｗまで微小時間Δｔで変化させることにより、光刺激時間Ｔｗ内における微小時間Δｔ毎の第１の音響光学素子１７ａの回折角度θｈ（ｔｋ：k＝０，・・・，ｗ）を求める。
【００５６】
続いて、微小時間Δｔ毎に求めた回折角度の範囲θｈ（ｔ０），・・・，θｈ（ｔｗ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ（ｔ０），・・・，ｆｈ（ｔｗ）を上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、時刻ｔｋにおける回折角度θｈ（ｔｋ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ（ｔｋ）は、以下のように求められる。
ｆｈ（ｔｋ）＝θｈ（ｔｋ）・Ｖａ１／λ
この結果、図８に示すように、周波数が時間に比例して、ｆｈ（ｔ０）からｆｈ（ｔｗ）まで離散的に増加する高周波信号が印加されることとなる。
【００５７】
続いて、ＣＰＵ２２は、上記光刺激時間Ｔｗ内の任意の時間ｔｋにおける第２の音響光学素子の回折角度の範囲θｈ１(ｔｋ)〜θｈ２（ｔｋ）を光刺激領域Ｂの垂直方向における位置及び範囲に基づいて求め、このｔｋを光刺激開始時ｔ０から終了時ｔｗまで微小時間Δｔで変化させることにより、光刺激時間Ｔｗ内における微小時間Δｔ毎の第２の音響光学素子の回折角度の範囲θｖ１（ｔ０）〜θｖ２（ｔ０），・・・θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）・・・，θｖ１（ｔｗ）〜θｖ２（ｔｗ）を求める。
【００５８】
続いて、微小時間Δｔ毎に求めた回折角度の範囲θｖ１（ｔ０）〜θｖ２（ｔ０）（ここでは、θｖ１（ｔ０）＝θｖ２（ｔ０）），・・・θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）・・・，θｖ１（ｔｗ）〜θｖ２（ｔｗ）（ここでは、θｖ１（ｔｗ）＝θｖ２（ｔｗ））に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖ１（ｔ０）〜ｆｖ２（ｔ０），・・・，ｆｖ１（ｔｗ）〜ｆｖ２（ｔｗ）を上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、時刻ｔｋにおける回折角度の範囲θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖ１（ｔｋ）〜ｆｖ２（ｔｋ）は、以下のように求められる。
ｆｖ１（ｔｋ）＝θｖ１（ｔｋ）・Ｖａ２／λ
ｆｖ２（ｔｋ）＝θｖ２（ｔｋ）・Ｖａ２／λ
この結果、図９に示すように、周波数帯域が時間に応じて変化する高周波信号が印加されることとなる。
【００５９】
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ与える高周波信号の周波数帯域を求めると、これらの周波数情報を走査制御部１９に出力する。
この結果、上述した光刺激実行時においては、上記周波数情報に基づく高周波信号が、振動子１８ａ，１８ｂに対して印加され、この高周波信号に応じて第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂの音響光学結晶内に屈折率変化が生ずる。刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａに入射されることにより、蛍光画像における水平方向に周波数に応じた角度分、回折されて第２の音響光学素子１７ｂに入射する。第２の音響光学素子１７ｂでは、周波数帯ｆｖ１（ｔｋ）〜ｆｖ２（ｔｋ）の範囲でほぼ同時に回折されることにより、蛍光画像の垂直方向に配列される複数のスポット光が生成される。換言すると、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２に変換される。
【００６０】
この１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。そして、第１及び第２の振動子１８ａ，１８ｂに印加される高周波信号の周波数や周波数帯域が時間とともに変化することにより、標本Ｐ上で、時間に応じて垂直方向の長さが変化する１次分布の刺激用レーザ光が水平方向に走査されることとなる。この結果、図７に示した楕円形の光刺激領域Ｂの全域に対して刺激用レーザ光Ｌ２が照射されることとなる。
【００６１】
〔光刺激領域；直線〕
次に、上述したステップＳＡ２において、図１０に示すように、光刺激領域Ｂとして蛍光画像の水平方向に沿った直線が指定された場合における高周波信号の周波数の設定手順について説明する。
【００６２】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す。
続いて、ＣＰＵ２２は、この光刺激領域Ｂにおける水平方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｈ１からＰｈ２）に基づいて、第１の音響光学素子１７ａの回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２を決定し、この回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ１〜ｆｈ２を上記（１）式に基づいて決定する。
【００６３】
例えば、回折角度θｈ１に対応する周波数ｆｈ１、及び、回折角度θｈ２に対応する周波数ｆｈ２は、以下のように求められる。
ｆｈ１＝θｈ１・Ｖａ１／λ
ｆｈ２＝θｈ２・Ｖａ１／λ
同様に、ＣＰＵは、光刺激領域Ｂにおける垂直方向の位置に基づいて、第２の音響光学素子１７ｂの回折角度θｖを決定し、この回折角度θｖに対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖを上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、回折角度θｖに対応する周波数ｆｖは以下のように求められる。
ｆｖ＝θｖ・Ｖａ２／λ
【００６４】
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ与える高周波信号の周波数帯域を求めると、これらの情報を走査制御部１９に出力する。
この結果、上述した光刺激実行時においては、上記周波数情報に基づく各周波数の高周波信号が、振動子１８ａ，１８ｂに対して印加され、この高周波信号に応じて第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂの音響光学結晶内に屈折率変化が生ずる。刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａに入射されることにより、蛍光画像における水平方向に周波数に応じた角度分、同時に回折されて１次元分布のレーザ光に変換されて、第２の音響光学素子１７ｂに入射する。第２の音響光学素子１７ｂでは、周波数帯ｆｖで回折されることにより、蛍光画像の垂直方向における位置調整がなされる。位置調整された１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。
この結果、図１０に示した直線状の光刺激領域全域に対して刺激用レーザ光Ｌ２が複数のスポット光として同時に照射されることとなる。
【００６５】
以上、説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、刺激用走査光学系３が、入射された刺激用レーザ光Ｌ２を水平方向に回折させる第１の音響光学素子１７ａと、入射された刺激用レーザ光を垂直方向に回折させる第２の音響光学素子１７ｂとを備えているので、２次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐに照射させることが可能となる。これにより、光刺激領域Ｂの全域に対して略同時に光刺激を実行することが可能となる。この結果、光刺激が開始されてから終了するまでの光刺激実行時間を短縮することができる。また、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数の間隔を狭くすることにより、より決め細やかな光照射を行うことが可能となる。
【００６６】
また、光刺激領域Ｂが円、楕円状に設定された場合には、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂのいずれか一方を走査用の光学素子として用いて、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査することにより、円、楕円状の光刺激領域Ｂの全域に光刺激を実行することができる。このように、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査する場合でも、音響光学効果を利用して刺激用レーザ光を走査することとなるので、ガルバノミラーなどを利用して刺激用レーザ光を走査する場合に比べて、走査時間を短縮することができる。
【００６７】
なお、上記音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角特性、つまり、高周波信号の周波数と音響光学素子１７ａ，１７ｂから出射される刺激用レーザ光Ｌ２の回折角度θとの対応関係は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長によって変化する。したがって、刺激用レーザ光Ｌ２の波長と音響光学素子の回折角特性とを対応付けて制御装置２０内の記憶装置２１に予め保存しておき、刺激用レーザ光Ｌ２の波長に対応する回折角特性をそのつど参照することにより、ＣＰＵ２２が上記高周波信号の周波数範囲を決定することとしてもよい。このように、刺激用レーザ光Ｌ２の波長と音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角特性とをそれぞれ対応付けて記憶装置２１に保存しておくことで、刺激用レーザ光Ｌ２の波長を切り替えた場合でも、同じ位置に刺激用レーザ光Ｌ２を照射させることが可能となる。
【００６８】
また、本実施形態においては、光刺激領域Ｂが四角形、円、及び直線の場合についてそれぞれ説明したが、例えば、曲線、複数の点の集合等の光刺激領域Ｂが指定された場合も、ＣＰＵ２２がこの光刺激領域Ｂの位置および範囲に応じて振動子１８ａ，１８ｂに印加する周波数または周波数帯域を決定することにより、同様に、該光刺激領域Ｂに対して光刺激を実行することができる。
また、本実施形態では、観察用走査光学系２と刺激用走査光学系３とを同時に作動させる場合について述べたが、この作動態様に限られず、例えば、刺激用走査光学系３を作動させている間は、観察用走査光学系２を停止させていてもよい。
更に、本実施形態では、音響光学素子として音響光学偏光器を用いる場合について述べたが、これに限れず、例えば、音響光学変調器などの他の音響光学素子を用いることとしてもよい。
また、上記実施形態では、走査制御部１９がＣＰＵ２２から与えられた周波数情報に基づいて、この周波数の範囲に属する各周波数を所定の周波数間隔で決定することとしたが、走査制御部１９ではなくＣＰＵ２２が各周波数範囲に属する離散的な周波数を決定することとしてもよい。
【００６９】
また、本実施形態では、２つの音響光学素子１７ａ，１７ｂの組み合わせにより第２のスキャンを構成することとしたが、これに代えて、いずれか一方の音響光学素子１７ａ，１７ｂにより構成することとしてもよい。このような構成では、１次元的な刺激用レーザ光が標本Ｐに照射されることとなる。
また、音響光学素子１７ａと１７ｂの配置を逆にしてもよい。
【００７０】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、ＣＰＵ２２が振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の振幅についても制御する点で第１の実施形態と異なる。
以下、本実施形態のレーザ走査型顕微鏡について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７１】
図１において、第２のスキャナ１７に採用される音響光学素子１７ａ，１７ｂは、振動子１８ａ、１８ｂに印加される高周波信号の周波数帯域に応じて、回折後、つまり出射される刺激用レーザ光Ｌ２の強度にばらつきが生ずるという特質を持つ。ここで、音響光学素子１７ａ，１７ｂから出射される刺激用レーザ光Ｌ２の強度と振動子１８ａ，１８ｂに印加される高周波信号の振幅とは比例関係にある。そこで、本実施形態においては、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の振幅を補正することにより、高周波信号の周波数帯域に応じて発生するレーザ光の強度のばらつきを解消することとしている。
【００７２】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡において、記憶装置２３には、上述した情報に加えて、第１及び第２の音響光学素子の回折光強度特性が保存されている（図１１参照）。
ＣＰＵ２２は、上述した第１の実施形態と同様の手順により、光刺激領域Ｂに応じて各振動子１８ａ、１８ｂに印加する高周波信号の周波数または周波数帯域を設定すると、この設定した周波数または周波数帯域に応じて、高周波信号の振幅を補正する。
具体的には、以下の（２）式を用いて、高周波信号の振幅を補正する。
【００７３】
Ｐｆ´＝（Ｐｍａｘ／Ｐｃｕｒ）・Ｐｆ （２）
上記（２）式において、Ｐｆ´は補正後の高周波信号の振幅、Ｐｍａｘは回折後におけるレーザ光の最大強度、Ｐｃｕｒは補正の対象となる周波数におけるレーザ光の強度、Ｐｆは補正前の高周波信号の振幅である。
【００７４】
ＣＰＵ２２は、上記（２）を用いて、各高周波信号の振幅を補正し、補正後の振幅情報と設定した周波数情報とを走査制御部１９に出力する。これにより、補正された振幅の高周波信号が各振動子１８ａ，１８ｂに印加されることとなり、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂから出力される刺激用レーザ光Ｌ２の光強度は、振動子に印加される周波数に依存せず、つまり、刺激用レーザ光Ｌ２の回折角度θにかかわらずに、同じ光強度を維持することが可能となる。
【００７５】
以上説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数に応じて振幅を補正するので、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂから出力される刺激用レーザ光Ｌ２の強度を回折角度に依存することなく同じ強度にすることができる。これにより、均一な強度を有する２次元的な刺激用レーザ光を標本Ｐに照射することができる。
【００７６】
なお、本実施形態では、音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける回折角度θによらずに、刺激用レーザ光Ｌ２の強度を均一にする場合について述べたが、図１１に示した回折光強度特性を用いることにより、意図的に光強度を制御することもできる。具体的には、光刺激領域Ｂの一部に対して他の部分よりも強い光を照射したい場合には、その部分に関する周波数の高周波信号の振幅を大きく設定すればよい。このように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、標本Ｐに照射させる刺激用レーザ光Ｌ２の強度制御の精度を向上させることができる。
【００７７】
例えば、図５に示した矩形状の光刺激領域Ｂにおいて、水平方向に対して光強度を変化させたい場合には、水平方向に対応する第１の音響光学素子１７ａの第１の振動子１８ａに与える各周波数の高周波信号の振幅を位置に応じて変化させればよい。
【００７８】
例えば、図１２に示すように、光刺激領域Ｂにおいて、左側の領域Ａ１、中央の領域Ａ２、右側の領域Ａ３の順で段階的に光強度を低くする場合には、図１３に示されるように、左側の領域に対応する周波数の高周波信号の振幅を最も高くし、中央の領域Ａ２に対応する周波数の高周波信号の振幅を中間的な値とし、右側の領域に対応する周波数の高周波信号の振幅を最も低くするとよい。なお、ここでは、水平方向に沿って光強度を変化させたい場合について説明したが、同様に、第２の音響光学素子１７ｂに対応する第２の振動子１８ｂに印加する高周波信号の振幅を周波数に応じて変化させることで、２次元的に光強度を変化させることが可能となる。これにより、より細やかな強度制御が実現できる。
【００７９】
また、例えば、図１４に示すように、楕円型の光刺激領域Ｂの中央部に刺激用レーザ光Ｌ２を照射させたくない場合、つまり、ドーナツ型の光刺激領域Ｂに刺激用レーザ光Ｌ２を照射させる場合には、第２の音響光学素子１７ｂにおいて、光刺激を実施させたくない領域に対応する周波数帯域の振幅をゼロとすることにより、光照射を回避させることが可能となる。例えば、図１５に示すように、ある時刻ｔｋにおいては、ｆｖａからｆｖｄの周波数帯域において、ｆｖｂからｆｖｃの周波数帯域については、光強度をゼロにすることで、この周波数ｆｖｂからｆｖｃに対応する領域への刺激用レーザＬ２の照射を回避することが可能となる。そして、時間に応じて、振幅をゼロにする周波数帯域を変化させることで、図１４に示すようなドーナツ型の光刺激領域Ｂに対して光刺激を行うことが可能となる。
【００８０】
このように、高周波信号の振幅について制御することにより、各位置における光強度を調節することで、図１４に示したようなドーナツ型の光刺激領域Ｂをはじめ、様々な形状の光刺激領域Ｂに対応することが可能となる。これにより、生細胞等の非幾何学的形状の対象物であっても、その形状に合せて光刺激を行うことが可能となる。例えば、神経等の１つの細胞全体において、細胞核の部分だけを除いて光刺激することが可能となる。
【００８１】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡が、第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１と異なる点は、図１６に示すように、上記第２の音響光学素子１７ｂに代えて、ガルバノミラー５１を配置し、このガルバノミラー５１を機械的に振動させて光偏向を行う点である。
このガルバノミラー５１は、第１の音響光学素子１７ａにより蛍光画像の水平方向における位置調整等がされた刺激用レーザ光Ｌ２を、蛍光画像の垂直方向に走査するものである。
【００８２】
例えば、このようなレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光源１５から出射された刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａによって水平方向における１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２とされてガルバノミラー５１に導かれる。ガルバノミラー５１では、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が垂直方向に走査され、ミラー５２を介してダイクロイックミラー４に導かれ、観察用レーザ光Ｌ１と合波されて、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射される。これにより、水平方向における１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が垂直方向に走査されることにより、所望の光刺激領域Ｂに対して効率的に光刺激を実行することができる。
【００８３】
なお、上記実施形態において、ガルバノミラー５１と第１の音響光学素子１７ａとの配置を入れ替えてもよく、また、ガルバノミラー５１とミラー５２との配置を入れ替えてもよい。また、第２のスキャン１７を第２の音響光学素子１７ｂとガルバノミラー５１との組み合わせによって構成することとしてもよい。
【００８４】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１に示した音響光学素子の作用を説明するための説明図である。
【図３】図１に示した第２のスキャナの作用を説明するための説明図である。
【図４】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の処理手順の一例を示したフローチャートである。
【図５】蛍光画像において画像取得領域と四角形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図６】刺激用走査条件設定において、高周波信号の周波数を決定するための処理手順の一例を示したフローチャートである。
【図７】蛍光画像において画像取得領域と楕円形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図８】楕円形の光刺激領域が指定されたときの第１の振動子に印加される高周波信号の周波数と時間との関係を示した図である。
【図９】楕円形の光刺激領域が指定されたときの第２の振動子に印加される高周波信号の周波数と時間との関係を示した図である。
【図１０】蛍光画像において画像取得領域と楕円形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図１１】回折光強度特性の一例を示した図である。
【図１２】光刺激領域内の光強度を変化させる場合の一例を示した図である。
【図１３】図１２に示した光強度となるように刺激用レーザ光を照射させる場合において、第１の振動子に印加される周波数と振幅との関係を示した図である。
【図１４】ドーナツ型の光刺激領域を示した図である。
【図１５】図１４に示したドーナツ型の光刺激領域が指定されたときの時刻ｔｋにおいて第２の振動子に印加される高周波信号の周波数と振幅の関係を示した図である。
【図１６】本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡における第２のスキャナの構成の一例を示した図である。
【符号の説明】
【００８６】
Ｐ 標本
Ｆ 蛍光
Ｌ１ 観察用レーザ光
Ｌ２ 刺激用レーザ光
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 観察用走査光学系
３ 刺激用走査光学系
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ 光検出器
８ 観察用レーザ光源
９ 第１のスキャナ
９ａ 第１のガルバノミラー
９ｂ 第２のガルバノミラー
１５ 刺激用レーザ光源
１７ 第２のスキャナ
１７ａ，１７ｂ 音響光学素子
１８ａ，１８ｂ 振動子
１９ 走査制御部
２０ 制御装置
２１ 記憶装置
２２ ＣＰＵ
２３ メモリ
２４ 表示装置
２５ 入力装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に係り、特に、音響光学効果を用いて刺激用レーザ光を走査するレーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本を観察するための観察用走査光学系と、標本に光刺激を与える刺激用走査光学系とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特開平１０−２０６７４２号公報参照。）。
このようなレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光源から発せられた刺激用レーザ光をガルバノミラーによるスキャナによって２次元的に走査し、標本に照射することで、光刺激領域に対して光刺激を与えている。
【特許文献１】特開平１０−２０６７４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、上述した光刺激は、光刺激領域の全域に対して略同時に与えることが好ましい。しかしながら、上述した従来のレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光をガルバノミラーにより標本上で２次元的に走査させて光刺激を行うことから、光刺激の開始から終了までに時間がかかるという問題があった。
【０００４】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することのできるレーザ走査型顕微鏡よび顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示するレーザ走査型顕微鏡であって、前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光を射出する刺激用レーザ光源と、前記刺激用レーザ光を走査する刺激用走査部と、前記刺激用走査部を制御する制御部と、前記刺激用走査部により走査された前記刺激用レーザ光を集光して標本に照射する対物レンズとを有し、前記刺激用走査部が、前記刺激用レーザ光の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子を備え、前記制御部が、光刺激を与える領域の位置および範囲に基づいて複数の周波数を決定し、決定した複数の周波数の高周波信号を、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、同時に印加することにより、前記領域に同時に前記刺激用レーザ光を照射するレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【０００６】
上記構成によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、刺激用走査部が備える音響光学素子によって走査され、対物レンズを介して標本に照射されることとなる。この場合において、音響光学素子に取り付けられている振動子には、光刺激領域の位置および範囲に基づいて決定された複数の周波数の高周波信号が制御部から同時に印加される。
複数の周波数の高周波信号が同時に振動子に印加された場合には、音響光学素子に入射した刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることにより、一方向に配列された複数のスポット光として出射されることとなる。ここで、振動子に与えられる高周波信号の周波数間隔が狭いほど、一列に配列された各スポット光間の距離も狭くなる。これにより、高周波信号の周波数間隔を調節することにより、スポット光の間隔を調整することができ、また、周波数間隔をある程度狭くすることで、一列に配列された各スポット光に重なり合う部分を持たせ、ライン状のレーザ光を生成することも可能である。
本発明によれば、標本に対して複数のスポット光を同時に照射することが可能となるので、単一のスポット光を２次元的に走査させる場合に比べて、光刺激を効率的に行うことができる。
【０００７】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査部が、入射された刺激用レーザ光を第１の方向に回折させる第１の音響光学素子と、入射された刺激用レーザ光を前記第１の方向と交わる方向に回折させる第２の音響光学素子とを具備することとしてもよい。
【０００８】
上記構成によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、第１及び第２の音響光学素子により第１の方向および第１の方向と交わる方向、例えば、水平方向及び垂直方向に回折されることとなる。これにより、例えば、第１及び第２の音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、複数の周波数の高周波信号が同時に印加されていた場合には、２次元的な分布を有するレーザ光を生成させることができる。この結果、２次元的な領域を同時に照射することができるので、光刺激を更に効率的に行うことができる。
【０００９】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子のそれぞれの振動子に対して、それぞれ複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の二次元の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。このようにすると、例えば、矩形等の二次元の領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１０】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線上の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。このようにすると、例えば、所定長さの線分に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１１】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加するとともに、他の振動子に少なくとも一つで時間的に変化する周波数の高周波信号を印加することにより、前記一方の振動子によって駆動される音響光学素子から射出される一直線状の照射領域を前記他方の振動子により駆動される音響光学素子によって切り替え、これにより標本上の二次元領域に刺激レーザ光を照射することとしてもよい。
【００１２】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記一方の振動子に印加される高周波信号が有する周波数は、時間的に変化してもよい。このようにすると、例えば、円形等の二次元領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射することが可能となる。
【００１３】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査部は、入射された刺激用レーザ光を水平方向または垂直方向に回折させる音響光学素子と、前記音響光学素子の回折方向に略直交する方向に、入射された刺激用レーザ光を走査する走査用ミラーとを具備することとしてもよい。
【００１４】
このような構成によれば、音響光学素子によりスポット光である刺激用レーザ光を一方向に配列された複数のスポット光（なお、高周波信号の周波数間隔がある程度狭ければ、ライン状のレーザ光とすることが可能である）とすることができ、また、走査用ミラーによって、光刺激用レーザ光を該一方向に直交する方向に走査することができる。これにより、標本上において、複数のスポット光をその配列に直交する方向に走査することができる。この結果、光刺激を効率的に実行することができる。また、音響光学素子に取り付けられた振動子に印加する高周波信号の周波数を光刺激領域の形状に応じて変化させることにより、四角形だけではなく、円や、楕円などのさまざまな形状に対しても効率的に光刺激を実行することができる。
【００１５】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線状の領域に同時に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。該一直線状の領域は、例えば、所定長さの線分である。
【００１６】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加し、前記音響光学素子によって同時に照射される一直線状の領域の照射位置を走査ミラーによって走査することにより、標本上の二次元領域に刺激用レーザ光を照射することとしてもよい。
【００１７】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記振動子に印加される高周波信号が有する周波数を時間的に変化させてもよい。このようにすることで、例えば、円形等の二次元領域に対して刺激用レーザ光を効率的に照射させることが可能となる。
【００１８】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部が、前記刺激用レーザ光の波長を考慮して前記高周波信号の周波数を決定することとしてもよい。
【００１９】
このような構成によれば、刺激用レーザ光の波長に応じて、高周波信号の周波数が決定されることとなるので、刺激用レーザ光の波長が切り替えられた場合でも、所望の回折角度で入射光を回折することができ、一定の走査精度を保つことができる。
【００２０】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部が、前記音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、前記高周波信号の振幅を補正することとしてもよい。
【００２１】
このような構成によれば、音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、高周波信号の振幅が補正されるので、音響光学素子から出射される刺激用レーザ光の光強度を所望の強度に制御することが可能となる。これにより、光刺激領域の全域において、刺激用レーザ光の光強度を均一にすることや、或いは、刺激用レーザ光の光強度を局部的に異ならせることが可能となる。
【００２２】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記観察用レーザ光を前記標本上で走査する走査部を備えることとしてもよい。
【００２３】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用レーザ光が照射される前記領域は、観察用レーザ光の照射によって予め取得された画像上で指定可能とされていてもよい。
【００２４】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記高周波信号の複数の周波数の間隔を所定値より狭めることで、前記刺激用レーザ光が同時に照射される領域を空間的に連続となるようにしてもよい。
【００２５】
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記制御部は、前記決定した複数の周波数ごとに振幅の異なる高周波信号を前記振動子に同時に印加することにより、前記領域ごとの前記刺激用レーザ光の照射強度を異ならせることとしてもよい。
【００２６】
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示する顕微鏡観察方法であって、前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光の光路上に少なくとも１つの音響光学素子を配置し、各前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、光刺激領域の位置および範囲に応じて決定される複数の周波数の高周波信号を同時に印加する顕微鏡観察方法を提供する。
【００２７】
このような方法によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、刺激用走査部が備える音響光学素子によって走査され、対物レンズを介して標本に照射されることとなる。この場合において、音響光学素子に取り付けられている振動子には、光刺激領域の位置および範囲に基づいて決定された一または複数の周波数の高周波信号が同時に印加される。
複数の周波数の高周波信号が同時に振動子に印加された場合には、音響光学素子に入射した刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることにより、一方向に配列された複数のスポット光として出射されることとなる。ここで、振動子に与えられる高周波信号の周波数間隔が狭いほど、一列に配列された各スポット光間の距離も狭くなる。これにより、高周波信号の周波数間隔を調節することにより、スポット光の間隔を調整することができ、また、周波数間隔をある程度狭くすることで、一列に配列された各スポット光に重なり合う部分を持たせ、ライン状のレーザ光を生成することも可能である。
本発明によれば、標本に対して複数のスポット光を同時に照射することが可能となるので、単一のスポット光を２次元的に走査させる場合に比べて、光刺激を効率的に行うことができる。
【００２８】
本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射する観察用走査光学系と、前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、前記標本に光刺激を与えるための刺激用走査光学系とを有し、該刺激用走査光学系が少なくとも１つの音響光学素子を有するレーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査光学系の制御を行うための光刺激制御プログラムであって、光刺激領域の位置および範囲に応じて、前記音響光学素子の回折範囲を設定する処理と、前記回折範囲に対応する一または複数の周波数を求める処理と、前記一または複数の周波数を有する高周波信号を同時に、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して印加させる処理とをコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラムをコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラムを提供する。
【００２９】
このような光刺激制御プログラムがハードウェア資源によって実行されることにより、光刺激領域の位置および範囲に応じて音響光学素子の回折範囲が設定され、該回折範囲に対応する一または複数の周波数が算出され、この一または複数の周波数の高周波信号が同時に音響光学素子に取り付けられている振動子に印加されることとなる。これにより、音響光学素子に入射された刺激用レーザ光は、高周波信号の各周波数に応じた回折角度でそれぞれ同時に回折されることとなる。これにより、一方向に配列された複数のスポットレーザ光、或いは、上記高周波信号の周波数間隔によっては、ライン状とされた刺激用レーザ光、または、音響光学効果を利用することにより高速走査された刺激用レーザ光を標本に照射させることが可能となる。この結果、光刺激を効率的に行うことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の実施形態について、図を参照して説明する。
【００３２】
〔第１の実施形態〕
図１に示すように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。図１中、各種レンズおよびピンホール等の光学部品は、説明の簡略化のために省略している。
本発明の第１の本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ１を走査する観察用走査光学系２と、刺激用レーザ光Ｌ２を走査する刺激用走査光学系３と、観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を合波するダイクロイックミラー４と、合波された観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を集光して標本Ｐに照射する一方、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐに照射することにより、標本Ｐ内の蛍光物質が励起されて発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備えている。
【００３３】
観察用走査光学系２は、観察用レーザ光Ｌ１を出射する観察用レーザ光源８と、観察用レーザ光源８から発せられた観察用レーザ光Ｌ１を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第１のスキャナ９とを備えている。
【００３４】
観察用走査光学系２の観察用レーザ光源８と第１のスキャナ９との間には、標本Ｐにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、ダイクロイックミラー４、および第１のスキャナ９を経由して戻る蛍光Ｆを観察用レーザ光Ｌ１から分岐して光検出器６に向かわせるダイクロイックミラー１２が備えられている。
第１のスキャナ９は、後述する蛍光画像の左右方向に対応する水平方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第１のガルバノミラー９ａと、蛍光画像の上下方向に対応する垂直方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第２のガルバノミラー９ｂとを備える、いわゆる近接ガルバノミラーである。これにより、観察用レーザ光Ｌ１がラスタスキャン方式で標本Ｐ上に２次元的に走査されるようになっている。
【００３５】
刺激用走査光学系３は、刺激用レーザ光Ｌ２を出射する刺激用レーザ光源１５と、該刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第２のスキャナ（刺激用走査部）１７とを備えている。この刺激用走査光学系３の詳細については後述する。
【００３６】
光検出器６は、共焦点ピンホール３１、ダイクロイックミラー３２，３３、第１の光検出部３４、及び第２の光検出部３５を備えて構成されている。
第１の光検出部３４は、分散素子３６、レンズ３７、スリット３８、および光電変換素子３９を備えている。また、第２の光検出部３５は、測光フィルタ４０、光電変換素子４１を備えている。本実施形態では、分散素子３６として平面回折格子を用い、この平面回折格子を回転させることにより検出する波長帯域の中心を選択するようにしたものである。測光フィルタ４０は、特定波長の光のみを透過する特性を持つ。
【００３７】
各光電変換素子３９，４１は、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）を介して制御装置２０に接続されている。制御装置２０は、記憶装置２１、ＣＰＵ２２、メモリ２３を備えている。この制御装置２０は、いわゆるパーソナルコンピュータにより構成されていてもよい。ＣＰＵ２２は、記憶装置２１に格納されている各種データならびに各種プログラムをメモリ２３に読み出し、情報の加工・演算処理を実行することにより、種々の制御内容を実現させる。記憶装置２１は、例えば、ＨＤ(Hard Disc)，ＲＯＭ（Read Only Memory）等である。メモリ２３は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）等である。
ＣＰＵ２２は、第１のスキャナ９による観察用レーザ光Ｌ１の標本Ｐ上における走査位置情報と、光検出器６により検出された蛍光Ｆの光強度情報とに基づいて、２次元的な蛍光画像を構築し、表示装置２４に表示するようになっている。
また、制御装置２０には、入力装置２５が接続されている。この入力装置２５は、オペレータによる各種入力操作に用いられる。
【００３８】
上記刺激用走査光学系３において、第２のスキャナ１７は、後述する蛍光画像の左右方向に対応する水平方向に刺激用レーザ光Ｌ２を回折させる第１の音響光学素子１７ａと、蛍光画像の上下方向に対応する垂直方向に刺激用レーザ光Ｌ２を回折させる第２の音響光学素子１７ｂとを備えている。
本実施形態において、第１の音響光学素子１７ａ、第２の音響光学素子１７ｂは、音響光学偏光器（ＡＯＤ：acousto optical deflector）である。
これら各音響光学素子１７ａ、１７ｂには、後述する走査制御部１９によって印加される高周波信号で駆動する振動子（振動供給部）１８ａ，１８ｂが取り付けられている。
走査制御部１９は、制御装置２０と接続されており、制御装置２０からの信号制御情報に応じた周波数帯域の高周波信号を振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ印加する。
【００３９】
上記制御装置２０の記憶装置２１は、各音響光学素子１７ａ，１７ｂの１次回折角度θと周波数ｆとの対応関係を記憶している。例えば、走査制御部１９は、以下の（１）式に示す関係式を記憶している。
【００４０】
θ＝λ・ｆ／Ｖａ （１）
【００４１】
上記（１）式において、θは、図２に示すように、音響光学素子１７ａ，１７ｂの基準線と１次回折光とがなす角度（以下、「回折角度」という。）であり、λは刺激用レーザ光Ｌ２の波長であり、ｆは振動子に与える高周波信号の周波数であり、Ｖａは音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける結晶内の音速速度である。このＶａは、固体差があり、個々の音響光学素子１７ａ，１７ｂによって異なる値である。
更に、制御装置２０は、表示装置２４に表示した蛍光画像の各画素位置と各音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける回折角度θとを対応付けて記憶している。これにより、表示装置２４に表示した蛍光画像上において、オペレータにより光刺激領域が指定された場合には、ＣＰＵ２２が、その光刺激領域に刺激用レーザ光Ｌ２が照射されるように、各音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角度θの範囲を決定し、この回折角度θの範囲に対応する複数の周波数の高周波信号を走査制御部１９を介して同時に振動子１８ａ，１８ｂに印加させることが可能となる。
【００４２】
これにより、各振動子１８ａ，１８ｂの振動に応じた屈折率変化を第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂ内で生じさせ、図３に示すように、第１の音響光学素子１７ａに入射した刺激用レーザ光Ｌ２を水平方向の異なる回折角度に同時に回折させることにより、水平方向に配列された複数のスポット光、換言すると、１次元分布のスポット光とすることができる。なお、振動子１８aに印加する高周波信号の周波数間隔を狭くすればするほど、スポット光間の距離が短くなる。したがって、高周波信号の周波数間隔をある一定値よりも狭めることにより、隣接する各スポット光に重なり部分を持たせ、水平方向に伸びるライン状のレーザ光とすることも可能である。なお、以下の第２の音響光学素子１７ｂについても同様である。
そして、更に、この水平方向に配列された複数のスポット光を第２の音響光学素子１７ｂによって垂直方向に対して複数の回折角度に同時に回折させることにより、２次元分布のスポット光とすることができる。
【００４３】
〔光刺激領域；四角形〕
このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。ここでは、後述する光刺激領域Ｂとして「四角形」が指定された場合について説明する。
【００４４】
まず、実験開始の前段階として、プレスキャンが行われる（図４のステップＳＡ１）。このプレスキャンでは、ＣＰＵ２２が観察用走査光学系２および光検出器６を作動させることにより、標本Ｐの蛍光画像を表示装置２４に表示させる。具体的には、ＣＰＵ２２は、観察用レーザ光源８、第１のスキャナ９を作動させる。これにより、観察用レーザ光源８から出射された観察用レーザ光Ｌ１が、第１のスキャナ９によって２次元的に走査され、ダイクロイックミラー４、および対物レンズ５を経て、標本Ｐに照射される。標本Ｐに観察用レーザ光Ｌ１が照射されると、標本Ｐ内に存在する蛍光物質が観察用レーザ光Ｌ１によって励起され、蛍光Ｆが発生する。標本Ｐにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ５、ダイクロイックミラー４および第１のスキャナ９を経由して観察用レーザ光Ｌ１と同じ経路を戻り、ダイクロイックミラー１２によって観察用レーザ光Ｌ１と分離されて、光検出器６に導かれる。
【００４５】
光検出器６において、蛍光Ｆは、共焦点ピンホール３１で結像し、ダイクロイックミラー３２に入射し、ここで波長に応じて２つに分岐される。ダイクロイックミラー３２によって反射された蛍光Ｆ１は、分散素子３６により波長ごとに異なる角度に反射される。この状態で分散素子３６を回転させると、分散素子３６の回転角度に応じた各波長中心の光がレンズ３７によりスリット３８に集光され、スリット３８を通過した波長の光のみが光変換素子３９に入射される。
【００４６】
一方、ダイクロイックミラー３２を透過した蛍光Ｆ２は、ダイクロイックミラー３３によって第２の光検出部３５に導かれる。第２の光検出部３５において、蛍光Ｆ２は、測光フィルタ４０により特定の波長の光が選択透過され、光電変換素子４１に入射される。
光電変換素子３９，４０に入射された蛍光Ｆ１、Ｆ２は、それぞれ輝度に応じた電気信号として出力され、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）によってディジタル信号に変換されて、制御装置２０に送られる。
制御装置２０では、ＣＰＵ２２により、このディジタル信号に基づいて２次元的な蛍光画像が構築され、表示装置２４に表示される。これにより、表示装置２４には、図５に示すように、観察面における蛍光画像Ｃが表示されることとなる。
【００４７】
次に、表示装置２４に表示された蛍光画像Ｃにおいて、図５に示すように、オペレータにより画像取得領域Ａおよび光刺激領域Ｂが指定されると（図４のステップＳＡ２）、制御装置２０のＣＰＵ２２は、指定された画像取得領域Ａの位置および範囲に応じて第１のスキャナ９の走査範囲を設定するとともに（図４のステップＳＡ３）、指定された光刺激領域Ｂの位置および範囲に応じて振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数を算出する（図４のステップＳＡ４）。
以下、図４のステップＳＡ４において行われる周波数帯域の設定手順について、図６を用いて詳しく説明する。
【００４８】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す（図６のステップＳＢ１）。
続いて、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂにおける水平方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｈ１〜Ｐｈ２）に基づいて、第１の音響光学素子１７ａの回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２を決定し（図６のステップＳＢ２）、この回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２にそれぞれ対応する複数の周波数ｆｈ１〜ｆｈ２を上記（１）式に基づいて決定する（図６のステップＳＢ３）。
【００４９】
例えば、回折角度θｈ１に対応する周波数ｆｈ１、及び、回折角度θｈ２に対応する周波数ｆｈ２は、以下のように求められる。
ｆｈ１＝θｈ１・Ｖａ１／λ
ｆｈ２＝θｈ２・Ｖａ１／λ
同様に、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂにおける垂直方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｖ１〜Ｐｖ２）に基づいて、第２の音響光学素子１７ｂの回折角度の範囲θｖ１〜θｖ２を決定し（図６のステップＳＢ４）、この回折角度の範囲θｖ１〜θｖ２にそれぞれ対応する複数の周波数ｆｖ１〜ｆｖ２を上記（１）式に基づいて決定する（図６のステップＳＢ５）。
例えば、回折角度θｖ１に対応する周波数ｆｖ１、及び、回折角度θｖ２に対応する周波数ｆｖ２は、以下のように求められる。
ｆｖ１＝θｖ１・Ｖａ２／λ
ｆｖ２＝θｖ２・Ｖａ２／λ
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、複数の周波数を求めると、これらの情報を走査制御部１９に出力する（図６のステップＳＢ６）。
【００５０】
このようにして、画像取得および光刺激の準備が完了すると、ＣＰＵ２２は、観察用レーザ光源８を作動させるとともに、第１のスキャナ９を上記走査範囲で走査することで、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐの画像取得領域Ａに２次元的に照射させ、これにより発生する蛍光を検出することにより、画像取得領域Ａにおける蛍光画像を構築して、表示装置２４に表示させる。また、上記画像取得と並行して、走査制御部１９は、ＣＰＵ２２から取得した上記周波数ｆｈ１〜ｆｈ２およびｆｖ１〜ｆｖ２の範囲における複数の周波数を予め設定されている周波数間隔で決定し、離散的に分布する各周波数からなる高周波信号を各振動子１８ａ、１８ｂに同時に印加する（図４のステップＳＡ５）。なお、周波数間隔は、予め一意に決められていてもよいし、複数の周波数間隔が候補として予め登録されており、これらの候補の中から１つを走査制御部１９が選択して設定することとしてもよい。また、オペレータが入力装置２５から周波数間隔を設定できるような構成としてもよい。
【００５１】
これにより、各周波数の高周波信号に基づいて振動子１８ａ，１８ｂがそれぞれ振動することにより、この振動が第１の音響光学素子１７ａおよび第２の音響光学素子１７ｂにそれぞれ伝搬して、各音響光学結晶内に周期的な屈折率変化が生じることとなる。この状態で、ＣＰＵ２２により刺激用レーザ光源１５が作動されると、刺激用レーザ光源１５から刺激用レーザ光Ｌ２が出射され、光路上に設けられた第１の音響光学素子１７ａに入射することとなる。
【００５２】
第１の音響光学素子１７ａに入射した刺激用レーザ光Ｌ２は、高周波信号の各周波数（ｆｈ１からｆｈ２までの離散的な周波数の値）に応じた回折角度でほぼ同時に回折されることにより、図３に示すように、光刺激領域Ｂの水平方向に配列される複数のスポット光、換言すると、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２とされて、第２の音響光学素子１７ｂに導かれる。第２の音響光学素子１７ｂに入射された１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、高周波信号の各周波数（ｆｖ１〜ｆｖ２までの離散的な周波数の値）に応じた回折角度でほぼ同時に回折される。これにより、光刺激領域Ｂの垂直方向に配列される複数のスポット光が生成され、図３に示すように、第２の音響光学素子１７ｂからは、水平方向および垂直方向に配列された複数のスポット光、換言すると、２次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が出射されることとなる。
【００５３】
２次元分布とされた刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。これにより、刺激用領域Ｂの全域に対してほぼ同時に光刺激を実施することが可能となる。ＣＰＵ２２は、このような光刺激を指定された光刺激時間にわたって実行すると、光刺激を終了する。また、光刺激を行われている間もＣＰＵ２２が観察用走査光学系２の第１のスキャナ９等を継続的に作動させることにより、光刺激前後の蛍光画像が取得され、表示装置２４に連続的に表示されることとなる。
【００５４】
〔光刺激領域；楕円形〕
次に、上述した図４のステップＳＡ２において、図７に示すように、光刺激領域Ｂとして楕円形が指定された場合における高周波信号の周波数の設定手順について説明する。なお、光刺激領域Ｂとして楕円形が設定された場合には、上述した四角形のときのように、同時に全ての領域を照射することは不可能である。そこで、楕円形の場合には、時間に応じてその照射範囲が変化する１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査することにより、楕円形の光刺激領域Ｂ全体を照射することとする。本実施形態では、第１の音響光学素子１７ａを走査用の光学素子として用い、第２の音響光学素子１７ｂにより、スポット光である刺激用レーザ光Ｌ２を垂直方向に配列される複数のスポット光に変換するとともに、この複数のスポット光の端から端までの距離を時間に応じて変化させることする。なお、以下の説明においては、複数の周波数において最小周波数から最大周波数までの幅を「周波数帯域」と定義する。
【００５５】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す。
続いて、ＣＰＵ２２は、この光刺激領域Ｂの全域を刺激するのに要する時間Ｔｗ、換言すると、この光刺激領域Ｂに対する光刺激開始から終了までの光刺激時間Ｔｗを決定し、この光刺激時間Ｔｗ内の任意の時間ｔｋにおける第１の音響光学素子の回折角度をθｈ(ｔｋ)を求め、このｔｋを光刺激開始時ｔ０から終了時ｔｗまで微小時間Δｔで変化させることにより、光刺激時間Ｔｗ内における微小時間Δｔ毎の第１の音響光学素子１７ａの回折角度θｈ（ｔｋ：k＝０，・・・，ｗ）を求める。
【００５６】
続いて、微小時間Δｔ毎に求めた回折角度の範囲θｈ（ｔ０），・・・，θｈ（ｔｗ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ（ｔ０），・・・，ｆｈ（ｔｗ）を上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、時刻ｔｋにおける回折角度θｈ（ｔｋ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ（ｔｋ）は、以下のように求められる。
ｆｈ（ｔｋ）＝θｈ（ｔｋ）・Ｖａ１／λ
この結果、図８に示すように、周波数が時間に比例して、ｆｈ（ｔ０）からｆｈ（ｔｗ）まで離散的に増加する高周波信号が印加されることとなる。
【００５７】
続いて、ＣＰＵ２２は、上記光刺激時間Ｔｗ内の任意の時間ｔｋにおける第２の音響光学素子の回折角度の範囲θｈ１(ｔｋ)〜θｈ２（ｔｋ）を光刺激領域Ｂの垂直方向における位置及び範囲に基づいて求め、このｔｋを光刺激開始時ｔ０から終了時ｔｗまで微小時間Δｔで変化させることにより、光刺激時間Ｔｗ内における微小時間Δｔ毎の第２の音響光学素子の回折角度の範囲θｖ１（ｔ０）〜θｖ２（ｔ０），・・・θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）・・・，θｖ１（ｔｗ）〜θｖ２（ｔｗ）を求める。
【００５８】
続いて、微小時間Δｔ毎に求めた回折角度の範囲θｖ１（ｔ０）〜θｖ２（ｔ０）（ここでは、θｖ１（ｔ０）＝θｖ２（ｔ０）），・・・θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）・・・，θｖ１（ｔｗ）〜θｖ２（ｔｗ）（ここでは、θｖ１（ｔｗ）＝θｖ２（ｔｗ））に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖ１（ｔ０）〜ｆｖ２（ｔ０），・・・，ｆｖ１（ｔｗ）〜ｆｖ２（ｔｗ）を上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、時刻ｔｋにおける回折角度の範囲θｖ１（ｔｋ）〜θｖ２（ｔｋ）に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖ１（ｔｋ）〜ｆｖ２（ｔｋ）は、以下のように求められる。
ｆｖ１（ｔｋ）＝θｖ１（ｔｋ）・Ｖａ２／λ
ｆｖ２（ｔｋ）＝θｖ２（ｔｋ）・Ｖａ２／λ
この結果、図９に示すように、周波数帯域が時間に応じて変化する高周波信号が印加されることとなる。
【００５９】
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ与える高周波信号の周波数帯域を求めると、これらの周波数情報を走査制御部１９に出力する。
この結果、上述した光刺激実行時においては、上記周波数情報に基づく高周波信号が、振動子１８ａ，１８ｂに対して印加され、この高周波信号に応じて第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂの音響光学結晶内に屈折率変化が生ずる。刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａに入射されることにより、蛍光画像における水平方向に周波数に応じた角度分、回折されて第２の音響光学素子１７ｂに入射する。第２の音響光学素子１７ｂでは、周波数帯ｆｖ１（ｔｋ）〜ｆｖ２（ｔｋ）の範囲でほぼ同時に回折されることにより、蛍光画像の垂直方向に配列される複数のスポット光が生成される。換言すると、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２に変換される。
【００６０】
この１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。そして、第１及び第２の振動子１８ａ，１８ｂに印加される高周波信号の周波数や周波数帯域が時間とともに変化することにより、標本Ｐ上で、時間に応じて垂直方向の長さが変化する１次分布の刺激用レーザ光が水平方向に走査されることとなる。この結果、図７に示した楕円形の光刺激領域Ｂの全域に対して刺激用レーザ光Ｌ２が照射されることとなる。
【００６１】
〔光刺激領域；直線〕
次に、上述したステップＳＡ２において、図１０に示すように、光刺激領域Ｂとして蛍光画像の水平方向に沿った直線が指定された場合における高周波信号の周波数の設定手順について説明する。
【００６２】
まず、制御装置２０のＣＰＵ２２は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長λ、第１の音響光学素子１７ａにおける結晶内の音波速度Ｖａ１、第２の音響光学素子１７ｂにおける結晶内の音波速度Ｖａ２を記憶装置２１からメモリ２３に読み出す。
続いて、ＣＰＵ２２は、この光刺激領域Ｂにおける水平方向の位置および範囲（図５におけるポイントＰｈ１からＰｈ２）に基づいて、第１の音響光学素子１７ａの回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２を決定し、この回折角度の範囲θｈ１〜θｈ２に対応する高周波信号の周波数帯域ｆｈ１〜ｆｈ２を上記（１）式に基づいて決定する。
【００６３】
例えば、回折角度θｈ１に対応する周波数ｆｈ１、及び、回折角度θｈ２に対応する周波数ｆｈ２は、以下のように求められる。
ｆｈ１＝θｈ１・Ｖａ１／λ
ｆｈ２＝θｈ２・Ｖａ１／λ
同様に、ＣＰＵは、光刺激領域Ｂにおける垂直方向の位置に基づいて、第２の音響光学素子１７ｂの回折角度θｖを決定し、この回折角度θｖに対応する高周波信号の周波数帯域ｆｖを上記（１）式に基づいて決定する。
例えば、回折角度θｖに対応する周波数ｆｖは以下のように求められる。
ｆｖ＝θｖ・Ｖａ２／λ
【００６４】
このようにして、ＣＰＵ２２は、光刺激領域Ｂの位置および範囲に基づいて、振動子１８ａ，１８ｂにそれぞれ与える高周波信号の周波数帯域を求めると、これらの情報を走査制御部１９に出力する。
この結果、上述した光刺激実行時においては、上記周波数情報に基づく各周波数の高周波信号が、振動子１８ａ，１８ｂに対して印加され、この高周波信号に応じて第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂの音響光学結晶内に屈折率変化が生ずる。刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａに入射されることにより、蛍光画像における水平方向に周波数に応じた角度分、同時に回折されて１次元分布のレーザ光に変換されて、第２の音響光学素子１７ｂに入射する。第２の音響光学素子１７ｂでは、周波数帯ｆｖで回折されることにより、蛍光画像の垂直方向における位置調整がなされる。位置調整された１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４において上述した観察用レーザ光Ｌ１と合波され、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されることとなる。
この結果、図１０に示した直線状の光刺激領域全域に対して刺激用レーザ光Ｌ２が複数のスポット光として同時に照射されることとなる。
【００６５】
以上、説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、刺激用走査光学系３が、入射された刺激用レーザ光Ｌ２を水平方向に回折させる第１の音響光学素子１７ａと、入射された刺激用レーザ光を垂直方向に回折させる第２の音響光学素子１７ｂとを備えているので、２次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐに照射させることが可能となる。これにより、光刺激領域Ｂの全域に対して略同時に光刺激を実行することが可能となる。この結果、光刺激が開始されてから終了するまでの光刺激実行時間を短縮することができる。また、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数の間隔を狭くすることにより、より決め細やかな光照射を行うことが可能となる。
【００６６】
また、光刺激領域Ｂが円、楕円状に設定された場合には、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂのいずれか一方を走査用の光学素子として用いて、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査することにより、円、楕円状の光刺激領域Ｂの全域に光刺激を実行することができる。このように、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２を走査する場合でも、音響光学効果を利用して刺激用レーザ光を走査することとなるので、ガルバノミラーなどを利用して刺激用レーザ光を走査する場合に比べて、走査時間を短縮することができる。
【００６７】
なお、上記音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角特性、つまり、高周波信号の周波数と音響光学素子１７ａ，１７ｂから出射される刺激用レーザ光Ｌ２の回折角度θとの対応関係は、刺激用レーザ光Ｌ２の波長によって変化する。したがって、刺激用レーザ光Ｌ２の波長と音響光学素子の回折角特性とを対応付けて制御装置２０内の記憶装置２１に予め保存しておき、刺激用レーザ光Ｌ２の波長に対応する回折角特性をそのつど参照することにより、ＣＰＵ２２が上記高周波信号の周波数範囲を決定することとしてもよい。このように、刺激用レーザ光Ｌ２の波長と音響光学素子１７ａ，１７ｂの回折角特性とをそれぞれ対応付けて記憶装置２１に保存しておくことで、刺激用レーザ光Ｌ２の波長を切り替えた場合でも、同じ位置に刺激用レーザ光Ｌ２を照射させることが可能となる。
【００６８】
また、本実施形態においては、光刺激領域Ｂが四角形、円、及び直線の場合についてそれぞれ説明したが、例えば、曲線、複数の点の集合等の光刺激領域Ｂが指定された場合も、ＣＰＵ２２がこの光刺激領域Ｂの位置および範囲に応じて振動子１８ａ，１８ｂに印加する周波数または周波数帯域を決定することにより、同様に、該光刺激領域Ｂに対して光刺激を実行することができる。
また、本実施形態では、観察用走査光学系２と刺激用走査光学系３とを同時に作動させる場合について述べたが、この作動態様に限られず、例えば、刺激用走査光学系３を作動させている間は、観察用走査光学系２を停止させていてもよい。
更に、本実施形態では、音響光学素子として音響光学偏光器を用いる場合について述べたが、これに限れず、例えば、音響光学変調器などの他の音響光学素子を用いることとしてもよい。
また、上記実施形態では、走査制御部１９がＣＰＵ２２から与えられた周波数情報に基づいて、この周波数の範囲に属する各周波数を所定の周波数間隔で決定することとしたが、走査制御部１９ではなくＣＰＵ２２が各周波数範囲に属する離散的な周波数を決定することとしてもよい。
【００６９】
また、本実施形態では、２つの音響光学素子１７ａ，１７ｂの組み合わせにより第２のスキャンを構成することとしたが、これに代えて、いずれか一方の音響光学素子１７ａ，１７ｂにより構成することとしてもよい。このような構成では、１次元的な刺激用レーザ光が標本Ｐに照射されることとなる。
また、音響光学素子１７ａと１７ｂの配置を逆にしてもよい。
【００７０】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、ＣＰＵ２２が振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の振幅についても制御する点で第１の実施形態と異なる。
以下、本実施形態のレーザ走査型顕微鏡について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７１】
図１において、第２のスキャナ１７に採用される音響光学素子１７ａ，１７ｂは、振動子１８ａ、１８ｂに印加される高周波信号の周波数帯域に応じて、回折後、つまり出射される刺激用レーザ光Ｌ２の強度にばらつきが生ずるという特質を持つ。ここで、音響光学素子１７ａ，１７ｂから出射される刺激用レーザ光Ｌ２の強度と振動子１８ａ，１８ｂに印加される高周波信号の振幅とは比例関係にある。そこで、本実施形態においては、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の振幅を補正することにより、高周波信号の周波数帯域に応じて発生するレーザ光の強度のばらつきを解消することとしている。
【００７２】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡において、記憶装置２３には、上述した情報に加えて、第１及び第２の音響光学素子の回折光強度特性が保存されている（図１１参照）。
ＣＰＵ２２は、上述した第１の実施形態と同様の手順により、光刺激領域Ｂに応じて各振動子１８ａ、１８ｂに印加する高周波信号の周波数または周波数帯域を設定すると、この設定した周波数または周波数帯域に応じて、高周波信号の振幅を補正する。
具体的には、以下の（２）式を用いて、高周波信号の振幅を補正する。
【００７３】
Ｐｆ´＝（Ｐｍａｘ／Ｐｃｕｒ）・Ｐｆ （２）
上記（２）式において、Ｐｆ´は補正後の高周波信号の振幅、Ｐｍａｘは回折後におけるレーザ光の最大強度、Ｐｃｕｒは補正の対象となる周波数におけるレーザ光の強度、Ｐｆは補正前の高周波信号の振幅である。
【００７４】
ＣＰＵ２２は、上記（２）を用いて、各高周波信号の振幅を補正し、補正後の振幅情報と設定した周波数情報とを走査制御部１９に出力する。これにより、補正された振幅の高周波信号が各振動子１８ａ，１８ｂに印加されることとなり、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂから出力される刺激用レーザ光Ｌ２の光強度は、振動子に印加される周波数に依存せず、つまり、刺激用レーザ光Ｌ２の回折角度θにかかわらずに、同じ光強度を維持することが可能となる。
【００７５】
以上説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、振動子１８ａ，１８ｂに印加する高周波信号の周波数に応じて振幅を補正するので、第１及び第２の音響光学素子１７ａ，１７ｂから出力される刺激用レーザ光Ｌ２の強度を回折角度に依存することなく同じ強度にすることができる。これにより、均一な強度を有する２次元的な刺激用レーザ光を標本Ｐに照射することができる。
【００７６】
なお、本実施形態では、音響光学素子１７ａ，１７ｂにおける回折角度θによらずに、刺激用レーザ光Ｌ２の強度を均一にする場合について述べたが、図１１に示した回折光強度特性を用いることにより、意図的に光強度を制御することもできる。具体的には、光刺激領域Ｂの一部に対して他の部分よりも強い光を照射したい場合には、その部分に関する周波数の高周波信号の振幅を大きく設定すればよい。このように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、標本Ｐに照射させる刺激用レーザ光Ｌ２の強度制御の精度を向上させることができる。
【００７７】
例えば、図５に示した矩形状の光刺激領域Ｂにおいて、水平方向に対して光強度を変化させたい場合には、水平方向に対応する第１の音響光学素子１７ａの第１の振動子１８ａに与える各周波数の高周波信号の振幅を位置に応じて変化させればよい。
【００７８】
例えば、図１２に示すように、光刺激領域Ｂにおいて、左側の領域Ａ１、中央の領域Ａ２、右側の領域Ａ３の順で段階的に光強度を低くする場合には、図１３に示されるように、左側の領域に対応する周波数の高周波信号の振幅を最も高くし、中央の領域Ａ２に対応する周波数の高周波信号の振幅を中間的な値とし、右側の領域に対応する周波数の高周波信号の振幅を最も低くするとよい。なお、ここでは、水平方向に沿って光強度を変化させたい場合について説明したが、同様に、第２の音響光学素子１７ｂに対応する第２の振動子１８ｂに印加する高周波信号の振幅を周波数に応じて変化させることで、２次元的に光強度を変化させることが可能となる。これにより、より細やかな強度制御が実現できる。
【００７９】
また、例えば、図１４に示すように、楕円型の光刺激領域Ｂの中央部に刺激用レーザ光Ｌ２を照射させたくない場合、つまり、ドーナツ型の光刺激領域Ｂに刺激用レーザ光Ｌ２を照射させる場合には、第２の音響光学素子１７ｂにおいて、光刺激を実施させたくない領域に対応する周波数帯域の振幅をゼロとすることにより、光照射を回避させることが可能となる。例えば、図１５に示すように、ある時刻ｔｋにおいては、ｆｖａからｆｖｄの周波数帯域において、ｆｖｂからｆｖｃの周波数帯域については、光強度をゼロにすることで、この周波数ｆｖｂからｆｖｃに対応する領域への刺激用レーザＬ２の照射を回避することが可能となる。そして、時間に応じて、振幅をゼロにする周波数帯域を変化させることで、図１４に示すようなドーナツ型の光刺激領域Ｂに対して光刺激を行うことが可能となる。
【００８０】
このように、高周波信号の振幅について制御することにより、各位置における光強度を調節することで、図１４に示したようなドーナツ型の光刺激領域Ｂをはじめ、様々な形状の光刺激領域Ｂに対応することが可能となる。これにより、生細胞等の非幾何学的形状の対象物であっても、その形状に合せて光刺激を行うことが可能となる。例えば、神経等の１つの細胞全体において、細胞核の部分だけを除いて光刺激することが可能となる。
【００８１】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡が、第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１と異なる点は、図１６に示すように、上記第２の音響光学素子１７ｂに代えて、ガルバノミラー５１を配置し、このガルバノミラー５１を機械的に振動させて光偏向を行う点である。
このガルバノミラー５１は、第１の音響光学素子１７ａにより蛍光画像の水平方向における位置調整等がされた刺激用レーザ光Ｌ２を、蛍光画像の垂直方向に走査するものである。
【００８２】
例えば、このようなレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光源１５から出射された刺激用レーザ光Ｌ２は、第１の音響光学素子１７ａによって水平方向における１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２とされてガルバノミラー５１に導かれる。ガルバノミラー５１では、１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が垂直方向に走査され、ミラー５２を介してダイクロイックミラー４に導かれ、観察用レーザ光Ｌ１と合波されて、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射される。これにより、水平方向における１次元分布の刺激用レーザ光Ｌ２が垂直方向に走査されることにより、所望の光刺激領域Ｂに対して効率的に光刺激を実行することができる。
【００８３】
なお、上記実施形態において、ガルバノミラー５１と第１の音響光学素子１７ａとの配置を入れ替えてもよく、また、ガルバノミラー５１とミラー５２との配置を入れ替えてもよい。また、第２のスキャン１７を第２の音響光学素子１７ｂとガルバノミラー５１との組み合わせによって構成することとしてもよい。
【００８４】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１に示した音響光学素子の作用を説明するための説明図である。
【図３】図１に示した第２のスキャナの作用を説明するための説明図である。
【図４】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の処理手順の一例を示したフローチャートである。
【図５】蛍光画像において画像取得領域と四角形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図６】刺激用走査条件設定において、高周波信号の周波数を決定するための処理手順の一例を示したフローチャートである。
【図７】蛍光画像において画像取得領域と楕円形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図８】楕円形の光刺激領域が指定されたときの第１の振動子に印加される高周波信号の周波数と時間との関係を示した図である。
【図９】楕円形の光刺激領域が指定されたときの第２の振動子に印加される高周波信号の周波数と時間との関係を示した図である。
【図１０】蛍光画像において画像取得領域と楕円形の光刺激領域とが指定されたときの表示画面の一例を示した図である。
【図１１】回折光強度特性の一例を示した図である。
【図１２】光刺激領域内の光強度を変化させる場合の一例を示した図である。
【図１３】図１２に示した光強度となるように刺激用レーザ光を照射させる場合において、第１の振動子に印加される周波数と振幅との関係を示した図である。
【図１４】ドーナツ型の光刺激領域を示した図である。
【図１５】図１４に示したドーナツ型の光刺激領域が指定されたときの時刻ｔｋにおいて第２の振動子に印加される高周波信号の周波数と振幅の関係を示した図である。
【図１６】本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡における第２のスキャナの構成の一例を示した図である。
【符号の説明】
【００８６】
Ｐ 標本
Ｆ 蛍光
Ｌ１ 観察用レーザ光
Ｌ２ 刺激用レーザ光
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 観察用走査光学系
３ 刺激用走査光学系
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ 光検出器
８ 観察用レーザ光源
９ 第１のスキャナ
９ａ 第１のガルバノミラー
９ｂ 第２のガルバノミラー
１５ 刺激用レーザ光源
１７ 第２のスキャナ
１７ａ，１７ｂ 音響光学素子
１８ａ，１８ｂ 振動子
１９ 走査制御部
２０ 制御装置
２１ 記憶装置
２２ ＣＰＵ
２３ メモリ
２４ 表示装置
２５ 入力装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示するレーザ走査型顕微鏡であって、
前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光を射出する刺激用レーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を走査する刺激用走査部と、
前記刺激用走査部を制御する制御部と、
前記刺激用走査部により走査された前記刺激用レーザ光を集光して標本に照射する対物レンズと
を有し、
前記刺激用走査部が、前記刺激用レーザ光の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子を備え、
前記制御部が、光刺激を与える領域の位置および範囲に基づいて複数の周波数を決定し、決定した複数の周波数の高周波信号を、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、同時に印加することにより、前記領域に同時に前記刺激用レーザ光を照射するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記刺激用走査部が、
入射された刺激用レーザ光を第１の方向に回折させる第１の音響光学素子と、
入射された刺激用レーザ光を前記第１の方向と交わる方向に回折させる第２の音響光学素子と
を具備する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子のそれぞれの振動子に対して、それぞれ複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の二次元の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記刺激用レーザ光に照射される二次元の領域は矩形である請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線上の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記刺激用レーザ光に照射される一直線上の領域は、所定長さの線分である請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加するとともに、他の振動子に少なくとも一つで時間的に変化する周波数の高周波信号を印加することにより、前記一方の振動子によって駆動される音響光学素子から射出される一直線状の照射領域を前記他方の振動子により駆動される音響光学素子によって切り替え、これにより標本上の二次元領域に刺激レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記一方の振動子に印加される高周波信号が有する周波数は、時間的に変化する請求項７に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記刺激用レーザ光が照射される標本上の二次元領域は円形である請求項８に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記刺激用走査部は、
入射された刺激用レーザ光を水平方向または垂直方向に回折させる音響光学素子と、
前記音響光学素子の回折方向に略直交する方向に、入射された刺激用レーザ光を走査する走査用ミラーと
を具備する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線状の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項１０に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記刺激用レーザ光に照射される一直線状の領域は所定長さの線分である請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加し、前記音響光学素子によって同時に照射される一直線状の領域の照射位置を走査ミラーによって走査することにより、標本上の二次元領域に刺激用レーザ光を照射する請求項１０に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記振動子に印加される高周波信号が有する周波数は時間的に変化する請求項１３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記刺激用レーザ光が照射される標本上の二次元領域は円形である請求項１４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記制御部が、前記刺激用レーザ光の波長を考慮して前記高周波信号の周波数を決定する請求項１から請求項１５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記制御部が、前記音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、前記高周波信号の振幅を補正する請求項１から請求項１６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１８】
前記観察用レーザ光を前記標本上で走査する走査部を備える請求項１から請求項１７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１９】
前記刺激用レーザ光が照射される前記領域が、観察用レーザ光の照射によって予め取得された画像上で指定可能とされている請求項１から請求項１８のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２０】
前記高周波信号の複数の周波数の間隔を所定値より狭めることで、前記刺激用レーザ光を同時に照射する領域が空間的に連続する請求項１から請求項１９のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２１】
前記制御部は、前記決定した複数の周波数ごとに振幅の異なる高周波信号を前記振動子に同時に印加することにより、前記領域ごとの前記刺激用レーザ光の照射強度を異ならせる請求項１から請求項２０のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２２】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示する顕微鏡観察方法であって、
前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光の光路上に少なくとも１つの音響光学素子を配置し、各前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、光刺激領域の位置および範囲に応じて決定される複数の周波数の高周波信号を同時に印加する顕微鏡観察方法。
【請求項２３】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射する観察用走査光学系と、前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、前記標本に光刺激を与えるための刺激用走査光学系とを有し、該刺激用走査光学系が少なくとも１つの音響光学素子を有するレーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査光学系の制御を行うための光刺激制御プログラムであって、
光刺激領域の位置および範囲に応じて、前記音響光学素子の回折範囲を設定する処理と、
前記回折範囲に対応する一または複数の周波数を求める処理と、
前記一または複数の周波数を有する高周波信号を同時に、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して印加させる処理と
をコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラム。
【請求項１】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示するレーザ走査型顕微鏡であって、
前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光を射出する刺激用レーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を走査する刺激用走査部と、
前記刺激用走査部を制御する制御部と、
前記刺激用走査部により走査された前記刺激用レーザ光を集光して標本に照射する対物レンズと
を有し、
前記刺激用走査部が、前記刺激用レーザ光の光路上に配置された少なくとも１つの音響光学素子を備え、
前記制御部が、光刺激を与える領域の位置および範囲に基づいて複数の周波数を決定し、決定した複数の周波数の高周波信号を、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、同時に印加することにより、前記領域に同時に前記刺激用レーザ光を照射するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記刺激用走査部が、
入射された刺激用レーザ光を第１の方向に回折させる第１の音響光学素子と、
入射された刺激用レーザ光を前記第１の方向と交わる方向に回折させる第２の音響光学素子と
を具備する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子のそれぞれの振動子に対して、それぞれ複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の二次元の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記刺激用レーザ光に照射される二次元の領域は矩形である請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線上の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記刺激用レーザ光に照射される一直線上の領域は、所定長さの線分である請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記第１の音響光学素子と前記第２の音響光学素子の一方の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加するとともに、他の振動子に少なくとも一つで時間的に変化する周波数の高周波信号を印加することにより、前記一方の振動子によって駆動される音響光学素子から射出される一直線状の照射領域を前記他方の振動子により駆動される音響光学素子によって切り替え、これにより標本上の二次元領域に刺激レーザ光を照射する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記一方の振動子に印加される高周波信号が有する周波数は、時間的に変化する請求項７に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記刺激用レーザ光が照射される標本上の二次元領域は円形である請求項８に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記刺激用走査部は、
入射された刺激用レーザ光を水平方向または垂直方向に回折させる音響光学素子と、
前記音響光学素子の回折方向に略直交する方向に、入射された刺激用レーザ光を走査する走査用ミラーと
を具備する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加することにより、標本上の一直線状の領域に同時に刺激用レーザ光を照射する請求項１０に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記刺激用レーザ光に照射される一直線状の領域は所定長さの線分である請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記音響光学素子の振動子に対して複数の周波数の高周波信号を同時に印加し、前記音響光学素子によって同時に照射される一直線状の領域の照射位置を走査ミラーによって走査することにより、標本上の二次元領域に刺激用レーザ光を照射する請求項１０に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記振動子に印加される高周波信号が有する周波数は時間的に変化する請求項１３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記刺激用レーザ光が照射される標本上の二次元領域は円形である請求項１４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記制御部が、前記刺激用レーザ光の波長を考慮して前記高周波信号の周波数を決定する請求項１から請求項１５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記制御部が、前記音響光学素子の回折光強度の回折角度特性に応じて、前記高周波信号の振幅を補正する請求項１から請求項１６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１８】
前記観察用レーザ光を前記標本上で走査する走査部を備える請求項１から請求項１７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１９】
前記刺激用レーザ光が照射される前記領域が、観察用レーザ光の照射によって予め取得された画像上で指定可能とされている請求項１から請求項１８のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２０】
前記高周波信号の複数の周波数の間隔を所定値より狭めることで、前記刺激用レーザ光を同時に照射する領域が空間的に連続する請求項１から請求項１９のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２１】
前記制御部は、前記決定した複数の周波数ごとに振幅の異なる高周波信号を前記振動子に同時に印加することにより、前記領域ごとの前記刺激用レーザ光の照射強度を異ならせる請求項１から請求項２０のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２２】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射し、前記標本から発せられる光を検出して、蛍光画像を構築し、表示する顕微鏡観察方法であって、
前記標本に光刺激を与えるための刺激用レーザ光の光路上に少なくとも１つの音響光学素子を配置し、各前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して、光刺激領域の位置および範囲に応じて決定される複数の周波数の高周波信号を同時に印加する顕微鏡観察方法。
【請求項２３】
標本を観察するための観察用レーザ光をステージに載置された標本に対して２次元的に照射する観察用走査光学系と、前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、前記標本に光刺激を与えるための刺激用走査光学系とを有し、該刺激用走査光学系が少なくとも１つの音響光学素子を有するレーザ走査型顕微鏡において、前記刺激用走査光学系の制御を行うための光刺激制御プログラムであって、
光刺激領域の位置および範囲に応じて、前記音響光学素子の回折範囲を設定する処理と、
前記回折範囲に対応する一または複数の周波数を求める処理と、
前記一または複数の周波数を有する高周波信号を同時に、前記音響光学素子に取り付けられている振動子に対して印加させる処理と
をコンピュータに実行させるための光刺激制御プログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−９３９５（Ｐ２００８−９３９５Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３７３７３（Ｐ２００７−１３７３７３）
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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