ローソニア・イントラセルラーリスの２６ｋＤサブユニットワクチン
本発明はとりわけ、新規のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子、および生きた組み換え担体に関する。本発明は、このような核酸、ＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子、および生きた組み換え担体を含む宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、これらのヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質、およびワクチンの調製のためのそれらの使用に関する。本発明は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチン、およびその調製のための使用にも関する。最後に、本発明は、ローソニア・イントラセルラーリス抗原およびローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体を検出するための診断用検査に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、新規のローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）のタンパク質をコードする核酸、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子および生きた組み換え担体、このような核酸、ＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子および生きた組み換え担体を含む宿主細胞、これらのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質およびワクチンの製造のためのそれらの使用、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンおよびその調製方法、並びにローソニア・イントラセルラーリス抗原の検出およびローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥまたはＰＥ）は世界的に、現代の養豚産業の重要な疾病となっている。前記疾病は成育集団の１５〜５０％、および既定の問題の集団における個々の動物の３０％にまで影響を及ぼす。今日、年間経済損失は影響を受けたブタ一匹につき余分な食餌と設備時間コストは、５〜１０米国ドルと概算されている。ＰＰＥは広く異なる臨床徴候（死亡、青白くおよび貧血の動物、水っぽく濃いまたは明るい赤色の下痢、鬱、食欲減退および鈍い動き、成長の遅延、およびＦＣＲの上昇）の一群の慢性および急性疾患である。しかしながら、二つの一貫した特徴がある。第一に、剖検でのみ観察できる病理学的変化は小腸および結腸の粘膜の肥厚症である。第二は、影響を受けた腸の腸細胞における細胞質内のわずかに曲がったバクテリアの存在である。これらのバクテリアは今やＰＰＥの病因論学的因子として確立されており、ローソニア・イントラセルラーリスと名づけられている。
【０００３】
何年にもわたり、ローソニア・イントラセルラーリスは、サル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、およびダチョウおよびエモー（ｅｍｏｅ）と同じ程度分化した他の動物を含む大きなグループの動物に影響を及ぼすことがわかってきた。ローソニア・イントラセルラーリスは真核生物腸細胞において繁殖する、グラム陰性の鞭毛を有するバクテリアであり、無細胞培養はこれまで記述されていない。細胞内において存続・繁殖するため、ローソニア・イントラセルラーリスは分割している腺窩細胞に浸潤しなければならない。バクテリアは細胞膜と会合し、入り口空胞を介して腸細胞へ迅速に進入する。これは次に迅速にくずれ（３時間以内）、およびバクテリアが繁茂し、細胞質中で自由に繁殖する。バクテリアがそれに感染した細胞に成長しそこなわせ、有糸分裂を行い続けさせ、および形成不全性腺窩細胞を形成し続けさせるメカニズムはまだわかっていない。
【０００４】
疾病に関するローソニア・イントラセルラーリス感染、治療、および駆除についての最新の理解は、ローソニア・イントラセルラーリスが無細胞培地中で培養できないという事実によって妨げられてきた。ラット腸細胞においてローソニア・イントラセルラーリスをうまく共培養することに関する報告があるが、このことはローソニア・イントラセルラーリスを撲滅するための不活性化されたワクチンの開発には至っていない。このようなワクチンに対する必要性は明らかに存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、ローソニア・イントラセルラーリスがローソニア・イントラセルラーリスに対する保護的な免疫性を誘導できる新規のタンパク質を生成することが、本発明によって発見された。
【０００７】
前記新規タンパク質は２６ｋＤタンパク質と称される。
【０００８】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で記される。このタンパク質をコードする遺伝子は配列決定されており、およびその核酸配列は配列番号１において示される。この遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５６０８」と称される。
【０００９】
多くの異なる核酸配列が、一つの同一タンパク質をコードできることは本分野で周知である。この現象は、アミノ酸をコードする各トリプレットの第二塩基および特に第三塩基における動揺として共通して知られる。この現象は、同一のタンパク質をコードする二つの核酸配列に約３０％の相違をもたらす。それゆえ、約７０％の配列相同性を有する二つの核酸配列は一つおよび同一タンパク質をさらにコードできる。
【００１０】
したがって、一つの実施態様は、配列が配列番号１の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコードする核酸および前記タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸の一部に関する。
【００１１】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコードする核酸または前記核酸の一部は配列番号１に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％または１００％もの相同性レベルである。
【００１２】
ヌクレオチド相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００１３】
このプログラムについての参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａ， Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４： ２４７−２５０ （１９９９）である。用いられる因子はデフォルト因子であり、適合についての報酬は＋１、ミスマッチについての罰則は−２、開いた間隙は５、伸長間隙は２、間隙ｘ 低下は５０である。
【００１４】
ある核酸が本発明の核酸であるか否かを決定するための別のアプローチは、その核酸がストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズするかどうかという質問に関する。
【００１５】
ある核酸が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に図示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズすれば、本発明の核酸であると考えられる。
【００１６】
ストリンジェントな条件の定義は、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式から得られる（１９８４． Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８： ２６７−２８４．）。
【００１７】
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ。
【００１８】
この式において、Ｍは一価の陽イオンの重量モル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドの割合であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【００１９】
ストリンジェントな条件は、核酸またはその断片が最大１０％のミスマッチを有する場合に、それらが配列番号１に示される配列を有する核酸となおハイブリダイズするという条件である。
【００２０】
本発明は、新規ローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコードする核酸を開示するので、これらのタンパク質を十分量で得ることが初めて可能となる。このことは例えば、前記タンパク質をコードする遺伝子を発現する発現システムを用いることによってなされうる。
【００２１】
それゆえ、より好ましい実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含むＤＮＡ断片に関する。このようなＤＮＡ断片は、例えば、その中に本発明の核酸がクローニングされるプラスミドであり得る。このようなＤＮＡ断片は、例えば、以下に記述されるように、プライマーとして使用するためのＤＮＡの量を増大するのに有用である。
【００２２】
核酸の発現のための不可欠な必要条件は、核酸がプロモーターの調節下にあるように、核酸へ機能的に連結された適切なプロモーターである。プロモーターの選択が、タンパク質発現用の宿主細胞として使用される細胞中で遺伝子転写を誘導することのできる任意の真核細胞プロモーター、原核細胞プロモーター、またはウィルスプロモーターに及ぶことは、当業者に自明である。
【００２３】
それゆえ、本実施態様のさらにより好ましい形態は、機能的に連結されたプロモーターの下に置かれた本発明のＤＮＡ断片または核酸を含む組み換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準的な分子生物学的技術によって達成できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｗ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５７７−３）。
【００２４】
機能的に連結されるプロモーターとは、それらが連結される核酸の転写を調節できるプロモーターである。
【００２５】
このようなプロモーターはローソニアプロモーター例えば前記プロモーターは２６ｋＤ遺伝子をコードする遺伝子の生体内発現に関与するプロモーターとすることができる(但し、前記プロモーターは、発現に使用される細胞中で機能的である。)。前記プロモーターは、異種性プロモーターでもありうる。宿主細胞がバクテリアである場合には、使用され得る有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモーターおよびオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８， ４０５７，１９８０）、ｌａｃプロモーターおよびオペレーター（Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２７５， ６１５， １９７８）、外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ， Ｍ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １，７７１−７７５， １９８２）、バクテリオファージλプロモーターおよびオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， ４６７７−４６８８， １９８３）、α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーターおよびオペレーター、終結配列、並びに選択される宿主と互換性のある他の発現亢進および調節配列が含まれる。
【００２６】
宿主細胞が酵母であるとき、実用的な発現調節配列には例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞について、ポリヘドリンまたはバキュロウィルスのｐ１０プロモーターが使用できる（（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３， ２１５６−６５， １９８３）宿主細胞が哺乳類由来である場合には、実例となる実用的な発現調節配列には、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｗ． ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２２，５２４−５２７， １９８３）、またはメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， Ｒ． Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９６，３９−４２， １９８２）、または熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ４９４９−５３， １９８５）が含まれる。
【００２７】
バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞の発現システムは非常に頻繁に用いられるシステムである。このようなシステムは本分野において周知であり、一般に例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．）、Ｎｏｖａｇｅｎ（ｗｗｗ． ｍｅｒｃｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ）、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７， ＵＳＡを通じて商業的に入手可能である。これらの発現システムについで、寄生生物ベースの発現システムは非常に興味ある発現システムである。このようなシステムは例えば、発行番号２７１４０７４の仏国特許出願および発行番号ＵＳ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ， Ｗ．： Ｐｕｂｌｉｃ． Ｄａｔｅ １ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）の米国ＮＴＩＳにおいて記述されている。
【００２８】
本発明の前記実施態様のさらに好ましい形態は、本発明の２６ｋＤタンパク質若しくはその免疫原性断片、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組み換えＤＮＡ分子をコードする核酸を含む、生きた組み換え担体（ＬＲＣ）に関する。このような担体は例えばバクテリアおよびウィルスである。これらのＬＲＣは、さらなる遺伝情報、この場合本発明の２６ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸がクローニングされた微生物またはウィルスである。このようなＬＲＣによって感染された動物は担体の免疫原に対してのみでなく、遺伝コードがＬＲＣへとさらにクローニングされるタンパク質、例えば２６ｋＤタンパク質の免疫原性部分に対しても免疫原性反応を生じるだろう。
【００２９】
バクテリアＬＲＣの一例として、本分野において既知の弱毒化サルモネラ系が興味深く使用できる。
【００３０】
生きた組み換え担体寄生生物はとりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ， Ａ． Ｎ． （Ｉｎｔ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２８： １１２１−１１３０ （１９９８））によって記述されている。
【００３１】
また、ＬＲＣウィルスは前記核酸を標的細胞へと輸送する方法として使用されてもよい。生きた組み換え担体ウィルスはまたベクターウィルスとも呼ばれる。ベクターとしてしばしば用いられるウィルスは、ワクチニアウィルス（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９： ４９２７ （１９８２））、ヘルペスウィルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、およびレトロウィルス（Ｖａｌｅｒｉｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．； ｉｎ Ｂａｕｍ， Ｓ． Ｊ．， Ｄｉｃｋｅ， Ｋ． Ａ． ， Ｌｏｔｚｏｖａ， Ｅ． ａｎｄ Ｐｌｕｚｎｉｋ， Ｄ． Ｈ． （Ｅｄｓ．）， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ − １９８８． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ｐｐ． ９２−９９ （１９８９））である。
【００３２】
本分野で周知の生体内相同性組み換えの技術は、宿主動物において本発明に記載の挿入される核酸の発現を誘導できるよう選択されたバクテリア、寄生生物、またはウィルスへと組み換え核酸を導入するのに使用できる。
【００３３】
最後に、本発明のこの実施態様の別の形態は、本発明に記載のタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含むＤＮＡ断片、または機能的に連結されるプロモーターの調節下でこのような核酸を含む組み換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は、本発明の２６ｋＤタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を含む、生きた組み換え担体を含む宿主細胞にも関する。
【００３４】
宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のようなバクテリアベースのプラスミド、またはｐＧＥＸのようなバクテリア発現ベクターと組み合わせた、またはバクテリオファージとの組み合わせた、バクテリア由来、例えば大腸菌種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来の細胞であってもよい。宿主細胞は、酵母特異的ベクター分子との組み合わせの真核生物由来、例えば酵母細胞由来のものであるか、またはベクター若しくは組み換えバキュロウィルスと組み合わせた、昆虫細胞のようなより高等の真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ； Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ４７−５５ （１９８８））、Ｔｉプラスミドベースのベクターまたは植物ウィルスベクターとの組み合わせの植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．； Ｃｅｌｌ ３２： １０３３ （１９８３））、これもまた適切なベクターまたは組み換えウィルスとの組み合わせのＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはクランデルフェリン（Ｃｒａｎｄｅｌｌ Ｆｅｌｉｎｅ）腎細胞のような哺乳類細胞に属していてもよい。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、本発明の前記新規タンパク質およびその免疫原性断片に関する。
【００３６】
免疫原性断片の概念は以下に定義される。
【００３７】
この実施態様の一つの形式はとりわけ、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、および前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３８】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、およびこのようなタンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３９】
さらにより好ましくは、９８％または１００％までもの相同性レベルである。
【００４０】
タンパク質相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００４１】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４： ２４７−２５０ （１９９９）である。用いられるマトリクスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。用いられる因子はデフォルト因子であり、開いた間隙は１１、伸長間隙は１、間隙ｘ＿低下は５０である。
【００４２】
本明細書に含まれる特定のタンパク質について、天然のバリエーションが個々のローソニア・イントラセルラーリス系の間に存在しうることは理解される。これらのバリエーションは総体的な配列におけるアミノ酸の差異によって、または前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転、または付加によって示され得る。生物学的および免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ ｉｎ “Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７９）によって述べられている。関連するアミノ酸の間のアミノ酸置換または進化において頻繁に生じた置換はとりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ． Ｄ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ． ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ． Ｃ．， １９７８， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３参照）。他のアミノ酸置換にはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、およびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは迅速かつ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １９８５）、相同性のあるタンパク質間の機能的類似性を決定するための方法を開発した。本発明の典型的な実施態様に関するこのようなアミノ酸置換並びに欠失及び／又は挿入を有するバリエーション、結果として生じるタンパク質も、それらの免疫反応性を保持する限り、本発明の範囲に属する。このことは、異なる場の単離物から単離されるとき、本発明のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質が同じ免疫学的特徴を有する同一タンパク質を呈しながらも、約９０％の相同性レベルを有し得る理由を説明する。
【００４３】
ローソニア・イントラセルラーリスによる感染に対する、または前記感染の少なくとも臨床的症状に対する免疫反応を誘導できるタンパク質をなお提供する、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列における前記バリエーションは「免疫原性に本質的には影響しない」と考慮される。
【００４４】
タンパク質が例えば抗体を上昇させるための予防接種の目的に使用されるとき、全タンパク質を使用することはしかしながら必要ではない。また、いわゆる免疫原性断片である当該タンパク質に対する免疫反応を、そのまままたは例えばＫＬＨのような担体へ連結されて誘導できる当該タンパク質の断片を使用することができる。「免疫原性断片」は宿主において免疫反応を誘導する能力をなお保持し、すなわちＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを含む全長のタンパク質の断片であると理解される。このとき、多様な技術が抗原性断片（決定因子）をコードするＤＮＡ断片を簡単に同定するために利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ （特許出願ＷＯ ８４／０３５６４， 特許出願ＷＯ ８６／０６４８７， 米国特許４，８３３，０９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１ ： ３９９８−４００２ （１９８４）， Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈ． １０２， ２５９−２７４ （１９８７）によって記述される方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出のための迅速かつ十分に確立された方法を実行するための簡易法である。前記方法は世界的に用いられており、このこと自体は当業者に周知である。この（実証的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられたとき、コンピュータアルゴリズムは、今や既知のエピトープを有する特定のタンパク質断片の配列及び／又は構造の一致に基づいて、タンパク質断片を免疫学的に重要なエピトープとして示すことができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ３８２４８−３８２８ （１９８１））にしたがった親水性基準および、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７： ４５−１４８ （１９８７）および米国特許４，５５４， １０１）にしたがった二次構造の見解の組み合わせに基づいている。Ｔ細胞のエピトープはＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準を活用してコンピュータによって配列から同様に推定できる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１０５９−１０６２ （１９８７）および米国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ ０７／００５，８８５）。凝縮された概説は、共通原理に関してはＳｈａｎ Ｌｕ， Ｔｉｂｔｅｃｈ． ９： ２３８−２４２ （１９９１）で、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５： １０５９−１０６２ （１９８７）で、総説についてはＬｕ， Ｖａｃｃｉｎｅ １０： ３−７ （１９９２）、ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ， Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ５： ２４１２−２４１８ （１９９１）で見られる。
【００４５】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様の一つの形式は、上述のような本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を含み、医薬的に許容できる担体とともに、ローソニア・イントラセルラーリス感染に対してブタを保護できるワクチンに関する。
【００４６】
本発明のさらに別の実施態様は、ワクチンにおける使用のための本発明のタンパク質に関する。
【００４７】
さらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンの製造向けの、本発明のタンパク質の使用に関する。
【００４８】
本発明のワクチンを作製する一つの方法は本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片を、感染した腸壁から採取された粘膜剥離物を通じて得られるバクテリアから生化学的に精製することによる。このことはしかしながら、ワクチンを作製するのに非常に時間を消費する方法である。
【００４９】
それゆえ、ワクチンにおいて本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子の発現産物を使用することが非常により簡便である。前記２６ｋＤタンパク質をコードする遺伝子の核酸は本発明によって提供される。
【００５０】
これらの遺伝子の発現産物に基づいたこのようなワクチンは、本発明のタンパク質または本発明の免疫原性断片を、後述のように医薬的に許容できる担体と混合することによって簡単に作製できる。
【００５１】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片を発現できる、上述のような、生きた組み換え担体を含むことができる。例えば腸上皮組織または例えば呼吸器系上皮組織を感染させるサルモネラ担体またはウィルス担体に基づいたこのようなワクチンは、ローソニア・イントラセルラーリスの感染の自然な方法をよりよく模倣するサブユニットワクチンにわたる利点を有する。さらに、自己増殖は、少量の組み換え担体のみが免疫性の付与に必要であるため有利である。
【００５２】
上述のワクチンはすべて活発な予防接種に関与し、すなわち、宿主の免疫系は本発明のタンパク質またはその免疫原性断片によって惹起され、これらのタンパク質に対する抗体を産生する。
【００５３】
あるいは、このような抗体は、例えばウサギにおいて上昇できるか、または後述のように抗体産生細胞系から得られることができる。このような抗体は次に、宿主動物へ投与できる。この方法の予防接種、すなわち受動的予防接種は、動物がすでに感染しており、および自然な免疫反応が惹起できる時間がないときに選択される予防接種である。それはまた、免疫が危険に暴露された動物を予防接種するための好ましい方法でもある。投与される、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体はこれらの場合、バクテリアへ直接結合できる。このことはローソニア・イントラセルラーリスの成長を即時低下または停止する利点を有する。
【００５４】
それゆえ、本発明のこの実施態様の他の一つの形式は本発明の２６ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質に対する抗体を含むワクチンに関する。
【００５５】
ワクチンは本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片を含む、上述のような宿主細胞に基づいていることができる。
【００５６】
予防接種の別のおよび効率のよい方法は前記関連抗原をコードするＤＮＡによる直接的な予防接種である。タンパク質をコードするＤＮＡによる直接的な予防接種は、多くの異なるタンパク質にとって成功している（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２： ２０−２６ （１９９３）において総説されるように）。
【００５７】
この方法の予防接種はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの予防接種にとって非常に興味深い。
【００５８】
それゆえ、本発明の実施態様のさらに他の形式は、本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片をコードする核酸を含むワクチン、およびこのような核酸を含むＤＮＡ断片を含むワクチンに関する。
【００５９】
この実施態様のさらに他の形式は、本発明の組み換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【００６０】
ＤＮＡワクチンは皮内適用を通じて、例えば針なし注射器を使用して簡単に投与できる。この方法の投与はＤＮＡを、予防接種される動物の細胞へ直接送達する。１〜１００μｇの間の範囲の微生物中のＤＮＡの量は、非常によい結果を提供する。
【００６１】
さらなる実施態様において、本発明のワクチンはさらに、他のブタ病原性生命体およびウィルスに由来する一つ以上の抗原、またはこのような抗原をコードする遺伝情報をさらに含む。
【００６２】
このような生命体およびウィルスは、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パストゥレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオプヌーモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラ・ハイオダイセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、およびアクチノバチラス・プレウロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のグループから好んで選択される。
【００６３】
本発明のすべてのワクチンは医薬的に許容できる担体を含む。医薬的に許容できる担体は、例えば滅菌水または滅菌生理塩類溶液でありうる。より複雑な形式において、担体は例えば緩衝液でありうる。
【００６４】
ワクチンの調製のための方法は、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片、および医薬的に許容できる担体の混合物を含む。
【００６５】
本発明のワクチンは、好ましい呈示において、アジュバントも含む。アジュバントは一般に、非特異的な様式で宿主の免疫反応を惹起する物質を含む。多くの異なるアジュバントが本分野において既知である。
【００６６】
アジュバントの例は、Ｆｒｅｕｎｄｓの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、クィルＡ（Ｒ）、鉱油例えばバイヨール（Ｒ）またはマルコール（Ｒ）、野菜油、およびカルボポール（Ｒ）（ホモポリマー）、またはディルバック（Ｒ）フォルトである。
【００６７】
ワクチンは、いわゆる「担体」も含有してもよい。担体は、ある化合物へ共有結合せずにポリペプチドが接着する化合物である。しばしば使用される担体化合物は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸化アルミニウム、または酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、およびベントナイトである。
【００６８】
抗原が担体に部分的に組み込まれるこのような担体の特殊な形式は、いわゆるＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２、ＥＰ１８０．５６４、ＥＰ２４２．３８０）である。さらに、ワクチンは一つ以上の適切な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパンまたはトゥイーンを含有してもよい。
【００６９】
しばしば、ワクチンは安定化剤と混合され、例えば分解傾向性ポリペプチドを分解されることから保護し、ワクチンの有効期間を延長し、または凍結乾燥の効率性を亢進する。実用的な安定化剤はとりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ ； Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９： ５０９ （１９５０））、炭水化物例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストラン、またはブドウ糖、アルブミンまたはカゼインのようなタンパク質、またはそれらの分解産物、およびアルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
【００７０】
さらに、ワクチンは生理学的に許容できる希釈剤中に懸濁され得る。アジュバント処理し、担体化合物または希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳化または安定化させることに関する他の方法も、本発明において具現化されることは言うまでもない。
【００７１】
本発明のワクチンは１〜１００μｇの間の範囲にある量で非常に適切に投与できるが、より少量の投与量は原理上使用できる。１００μｇを超える投与量は免疫学的に非常に適切ではあるが、商業上の理由のためあまり興味深くはないだろう。
【００７２】
ＬＲＣウィルスおよび上述のバクテリアのような生きた弱毒化された組み換え担体に基づいたワクチンは、感染期間中ワクチンがそれ自体を繁殖させるため、非常により少量の投与量で投与できる。それゆえ、非常に適切な量はバクテリアおよびウィルスについてそれぞれ、１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの範囲になるであろう。
【００７３】
多くの投与方法が適用できる。経口適用は、感染が消化管の感染であるため、非常に興味深い方法の投与である。経口投与の好ましい方法は、本分野において既知でありかつ頻繁に使用され、カプセル入りのワクチンが胃の非常に酸性の環境を通過した後で崩壊するだけであるカプセル入りのワクチンの包装である。また、ワクチンは胃のｐＨを一時的に亢進するため、本分野において既知である化合物と混合されてもよい。
【００７４】
全身性適用も適切であり、例えばワクチンの筋内適用によって行われる。もしこの経路にしたがえば、全身性適用についての本分野で既知の標準的な手法が適切である。
【００７５】
疾病に対する保護の観点から、ローソニア・イントラセルラーリス感染の迅速かつ正確な診断は重要である。それゆえ、本発明の別の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断ツールを提供することである。
【００７６】
血清中のローソニア・イントラセルラーリス抗体の検出のための診断用検査は、例えば、本発明の２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁へコーティングされる単純で標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ検査でありうる。このような抗体の検出のための方法は、例えば、検査される哺乳類由来の血清とともに２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片を定温放置した後、例えば、関連哺乳類抗体に対する標識された抗体とともに定温放置することである。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の有無を評価できる。診断用検査システムの別の例は、例えば本発明の２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片を含むウェスタンブロットを、検査される哺乳類の血清とともに定温放置した後、ブロットを分析することである。
【００７７】
したがって、本発明の別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質またはその断片を含む。
【００７８】
ローソニア・イントラセルラーリス抗原の特異的２６ｋＤタンパク質に関する抗原性材料の検出に基づいた、およびそれゆえローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断用検査は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ検査でもありうる。このような検査の一例において、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁は、前記２６ｋＤタンパク質に対して向かう抗体でコーティングされる。検査される材料とともに定温放置した後、標識されたローソニア・イントラセルラーリス抗体がウェルへ添加される。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリス由来の抗原性材料の存在を評価する。
【００７９】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスの抗原性材料の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体を含む。
【００８０】
上述に特徴付けられるように表現された本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ポリクローナル、モノ特異的、またはモノクローナル（またはそれらの誘導体）であってもよい抗体を産生するのに使用できる。もしポリクローナル抗体が望まれれば、ポリクローナル血清を産生・処理するための技術が本分野において周知である（例、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ， ｅｄｓ． Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）。
【００８１】
本発明のポリペプチド（または本発明のその変異体または断片）に対して反応するモノクローナル抗体は、本分野でこれもまた既知の技術によって近交系のマウスを免疫付与することによって調製できる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−４９７， １９７５）。
【００８２】
本発明の抗体の大規模な産生のための方法も本分野で既知である。このような方法は、ファージディスプレイのための糸状ファージにおいて、本発明の前記タンパク質をコードする遺伝情報の（断片の）クローニングに依存する。このような技術はとりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌにおける「ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」の下での「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｇｅ」で、および、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２： ２６２−２６７のＣｏｒｔｅｓｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４）によって、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２： １７３−１８３のＣｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ． ＆ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ． （１９９４）によって、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １６００７−１６０１０のＭａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （１９９２）によって、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ４３３−４５５のＷｉｎｔｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．によって、およびＬｉｔｔｌｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． Ａｄｖ． １２： ５３９−５５５によって記述されている。ファージはその後、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリをスクリーニングするのに使用される（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｓ． ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ， Ｍ．， Ｊｏｕｒｎ． Ｍｏｌｅｃ． Ｒｅｃｏｇｎ． １２： １３１−１４０ （１９９９）およびＧｈａｈｒｏｕｄｉ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４： ５１２−５２６ （１９９７））。望まれる抗体を発現するライブラリからの細胞は複製でき、その後、抗体の大規模発現のために使用できる。
【００８３】
実施例
【実施例１】
【００８４】
感染したブタ回腸からのローソニア・イントラセルラーリスの単離。
【００８５】
組織病理学および抗酸性Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色によって確認されるローソニア・イントラセルラーリスに感染した回腸がＰＥで死亡したブタから回収され、−８０℃で保存された。融解後、ローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを、感染した腸壁から採取した粘膜剥離物から単離した。前記回腸剥離物をオムニミキサー中のＰＢＳにおいて繰り返し均質化し、Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０： ３０３−３２３ （１９８５））によって記述されるように細胞内バクテリアを放出した。低速遠心分離で細胞くずを除去した後に得られる上清を、５．０μｍ、３．０μｍ、１．２μｍ、および０．８μｍのフィルター（ミリポア）でろ過した。前記ろ液をその後、８０００ｇで３０分間遠心分離し、小さなペレットのローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを得た。これらのバクテリアをさらにＰｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して精製した。前記精製されたバクテリアの同定はＰＣＲにより査定され（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： ２６１１−２６１５）、一方で、単離されたバクテリアの精製度（＞９５％）は位相差顕微鏡により査定し、いずれかの夾雑するバクテリアまたは存在する腸のくずを評価した。
【００８６】
バクテリア株およびプラスミド
ローソニア・イントラセルラーリス細胞を上述のように、感染した回腸材料から単離した。ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅおよびプラスミドｐＥＴ２２ｂを含む大腸菌宿主系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）をＮｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン市）から購入し、大腸菌系ＴＯＰ１０Ｆ’をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（オランダ国フローニンゲン）から購入した。３０％グリセロールを含有しているすべてのバクテリア株のストックは−７０℃で保存した。ＬＢ培地およびＬＢプレートを標準的な手技にしたがって調製した。
【００８７】
ＤＮＡ単離
高度に精製されたローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを得るため、Ｂｉｏｒａｄ染色体ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｒａｄ、オランダ国 フェーネンダール）を使用してＤＮＡをバクテリア細胞から調製した。Ｑｉａｇｅｎ製品を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。
【００８８】
ＰＣＲ増幅
５２Ｕ／ｍｌ伸長高忠実度酵素ミックス、２．５ｍＭＭｇＣｌ２、１６ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）、２０ｐｍｏｌのプライマー、およびテンプレートとしての１５ｎｇのローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを含む伸長ＨＦ緩衝液を含有しているＰＣＲ混合物を用いて、ＰＣＲ増幅を実行した。
【００８９】
標準的な適用（つまり、コロニーＰＣＲ）のため、前記ＰＣＲ混合物は、２０Ｕ／ｍｌスーパータック（ＨＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ケンブリッジ）および、８ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）、１０ｐｍｏｌのプライマー、および１５ｎｇのテンプレートを含有するスーパータック緩衝液（ＨＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ケンブリッジ）を含有した。
【００９０】
ライゲーションおよび形質変換
ライゲーションは１単位のライゲーション酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を有する１×ライゲーション緩衝液中で、１６℃で一晩実行した。１μｌのライゲーション反応液を大腸菌コンピテント細胞へ、熱ショックにより形質変換した。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞およびＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌コンピテント細胞は標準的な方法を使用して形質変換受容性にした。
【００９１】
１０×ＨＩＳ融合タンパク質の発現
発現ベクターのＤＮＡ配列を確認した後、ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ発現ベクターを形質変換した。生じた株を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５ｍｌＬＢ中で一晩、３７℃、２００ｒｐｍで生育させた。前記一晩の培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５０ｍｌＬＢ中で１：１００に希釈した。この培養物を同一条件下で、ＯＤ６００が０．５に到達するまで生育させた。前記培養物をＩＰＴＧにより終濃度１ｍＭになるよう誘導し、その後３時間生育させ続けた。１００μｌの試料を分析用に採取した。ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有する大腸菌系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を同一条件下で生育させ誘導し、試料をネガティブコントロールとして採取した。前記試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）からの４〜１２％ビス−トリスゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ウェスタンブロッティングはセミドライブロッティング手法を使用して実行した。ウェスタンブロットは水：油が４５：５５の乳化剤中の全細胞調製物に対して上昇するニワトリ抗ローソニアポリクローナル血清を使用して、または精製したローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験し、ローソニア・イントラセルラーリス感染に対して典型的な臨床知見および死後の障害を発現した動物から得られたブタ血清を使用して現像した。４℃で４時間、ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）由来の等量の細胞粗抽出物を使用して、前記血清をあらかじめ吸着させた。
【００９３】
結果
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８のクローニング
プライマー２１７９（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＡＧ）およびプライマー２１８０（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＴＴＣＧＡＴＡＣ）を使用して、遺伝子５６０８を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩおよび３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の二つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへライゲートした。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、および３７℃で一晩定温放置した。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの一つを選択し、ｐＥＴ５６０８と命名した。
【００９４】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８の発現
プラスミドｐＥＴ５６０８をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。生じた株を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料および対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図１Ａ）。約２６ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図１Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図１Ａ、レーン３）において観察された。
【００９５】
前記同一試料をまた、ブタおよびニワトリの血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。タンパク質５６０８との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリスで経口試験したブタ由来の血清（図１Ｂ、レーン３）およびニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清で経口試験したブタ由来の血清（図１Ｃ、レーン３）を使用して観察された。
【００９６】
結論
前記２６ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、および、ブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清およびニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清の両者とも経口試験することによって実際に明らかに認識される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および、ポリクローナルブタ血清（Ｂ）およびポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによる大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ５６０８、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ５６０８、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、新規のローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）のタンパク質をコードする核酸、これらの配列を含むＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子および生きた組み換え担体、このような核酸、ＤＮＡ断片、組み換えＤＮＡ分子および生きた組み換え担体を含む宿主細胞、これらのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質およびワクチンの製造のためのそれらの使用、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンおよびその調製方法、並びにローソニア・イントラセルラーリス抗原の検出およびローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥまたはＰＥ）は世界的に、現代の養豚産業の重要な疾病となっている。前記疾病は成育集団の１５〜５０％、および既定の問題の集団における個々の動物の３０％にまで影響を及ぼす。今日、年間経済損失は影響を受けたブタ一匹につき余分な食餌と設備時間コストは、５〜１０米国ドルと概算されている。ＰＰＥは広く異なる臨床徴候（死亡、青白くおよび貧血の動物、水っぽく濃いまたは明るい赤色の下痢、鬱、食欲減退および鈍い動き、成長の遅延、およびＦＣＲの上昇）の一群の慢性および急性疾患である。しかしながら、二つの一貫した特徴がある。第一に、剖検でのみ観察できる病理学的変化は小腸および結腸の粘膜の肥厚症である。第二は、影響を受けた腸の腸細胞における細胞質内のわずかに曲がったバクテリアの存在である。これらのバクテリアは今やＰＰＥの病因論学的因子として確立されており、ローソニア・イントラセルラーリスと名づけられている。
【０００３】
何年にもわたり、ローソニア・イントラセルラーリスは、サル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、およびダチョウおよびエモー（ｅｍｏｅ）と同じ程度分化した他の動物を含む大きなグループの動物に影響を及ぼすことがわかってきた。ローソニア・イントラセルラーリスは真核生物腸細胞において繁殖する、グラム陰性の鞭毛を有するバクテリアであり、無細胞培養はこれまで記述されていない。細胞内において存続・繁殖するため、ローソニア・イントラセルラーリスは分割している腺窩細胞に浸潤しなければならない。バクテリアは細胞膜と会合し、入り口空胞を介して腸細胞へ迅速に進入する。これは次に迅速にくずれ（３時間以内）、およびバクテリアが繁茂し、細胞質中で自由に繁殖する。バクテリアがそれに感染した細胞に成長しそこなわせ、有糸分裂を行い続けさせ、および形成不全性腺窩細胞を形成し続けさせるメカニズムはまだわかっていない。
【０００４】
疾病に関するローソニア・イントラセルラーリス感染、治療、および駆除についての最新の理解は、ローソニア・イントラセルラーリスが無細胞培地中で培養できないという事実によって妨げられてきた。ラット腸細胞においてローソニア・イントラセルラーリスをうまく共培養することに関する報告があるが、このことはローソニア・イントラセルラーリスを撲滅するための不活性化されたワクチンの開発には至っていない。このようなワクチンに対する必要性は明らかに存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、ローソニア・イントラセルラーリスがローソニア・イントラセルラーリスに対する保護的な免疫性を誘導できる新規のタンパク質を生成することが、本発明によって発見された。
【０００７】
前記新規タンパク質は２６ｋＤタンパク質と称される。
【０００８】
前記新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で記される。このタンパク質をコードする遺伝子は配列決定されており、およびその核酸配列は配列番号１において示される。この遺伝子はまた、実施例において「遺伝子５６０８」と称される。
【０００９】
多くの異なる核酸配列が、一つの同一タンパク質をコードできることは本分野で周知である。この現象は、アミノ酸をコードする各トリプレットの第二塩基および特に第三塩基における動揺として共通して知られる。この現象は、同一のタンパク質をコードする二つの核酸配列に約３０％の相違をもたらす。それゆえ、約７０％の配列相同性を有する二つの核酸配列は一つおよび同一タンパク質をさらにコードできる。
【００１０】
したがって、一つの実施態様は、配列が配列番号１の少なくとも９０％に与えられる核酸とあるレベルの相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコードする核酸および前記タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸の一部に関する。
【００１１】
好ましくは、このローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質をコードする核酸または前記核酸の一部は配列番号１に与えられる配列を有する核酸と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する。さらに好ましくは、９８％または１００％もの相同性レベルである。
【００１２】
ヌクレオチド相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００１３】
このプログラムについての参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａ， Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４： ２４７−２５０ （１９９９）である。用いられる因子はデフォルト因子であり、適合についての報酬は＋１、ミスマッチについての罰則は−２、開いた間隙は５、伸長間隙は２、間隙ｘ 低下は５０である。
【００１４】
ある核酸が本発明の核酸であるか否かを決定するための別のアプローチは、その核酸がストリンジェントな条件下で配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズするかどうかという質問に関する。
【００１５】
ある核酸が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に図示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズすれば、本発明の核酸であると考えられる。
【００１６】
ストリンジェントな条件の定義は、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式から得られる（１９８４． Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８： ２６７−２８４．）。
【００１７】
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ。
【００１８】
この式において、Ｍは一価の陽イオンの重量モル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドの割合であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【００１９】
ストリンジェントな条件は、核酸またはその断片が最大１０％のミスマッチを有する場合に、それらが配列番号１に示される配列を有する核酸となおハイブリダイズするという条件である。
【００２０】
本発明は、新規ローソニア・イントラセルラーリスタンパク質をコードする核酸を開示するので、これらのタンパク質を十分量で得ることが初めて可能となる。このことは例えば、前記タンパク質をコードする遺伝子を発現する発現システムを用いることによってなされうる。
【００２１】
それゆえ、より好ましい実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含むＤＮＡ断片に関する。このようなＤＮＡ断片は、例えば、その中に本発明の核酸がクローニングされるプラスミドであり得る。このようなＤＮＡ断片は、例えば、以下に記述されるように、プライマーとして使用するためのＤＮＡの量を増大するのに有用である。
【００２２】
核酸の発現のための不可欠な必要条件は、核酸がプロモーターの調節下にあるように、核酸へ機能的に連結された適切なプロモーターである。プロモーターの選択が、タンパク質発現用の宿主細胞として使用される細胞中で遺伝子転写を誘導することのできる任意の真核細胞プロモーター、原核細胞プロモーター、またはウィルスプロモーターに及ぶことは、当業者に自明である。
【００２３】
それゆえ、本実施態様のさらにより好ましい形態は、機能的に連結されたプロモーターの下に置かれた本発明のＤＮＡ断片または核酸を含む組み換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準的な分子生物学的技術によって達成できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｗ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５７７−３）。
【００２４】
機能的に連結されるプロモーターとは、それらが連結される核酸の転写を調節できるプロモーターである。
【００２５】
このようなプロモーターはローソニアプロモーター例えば前記プロモーターは２６ｋＤ遺伝子をコードする遺伝子の生体内発現に関与するプロモーターとすることができる(但し、前記プロモーターは、発現に使用される細胞中で機能的である。)。前記プロモーターは、異種性プロモーターでもありうる。宿主細胞がバクテリアである場合には、使用され得る有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモーターおよびオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８， ４０５７，１９８０）、ｌａｃプロモーターおよびオペレーター（Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２７５， ６１５， １９７８）、外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ， Ｍ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １，７７１−７７５， １９８２）、バクテリオファージλプロモーターおよびオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， ４６７７−４６８８， １９８３）、α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーターおよびオペレーター、終結配列、並びに選択される宿主と互換性のある他の発現亢進および調節配列が含まれる。
【００２６】
宿主細胞が酵母であるとき、実用的な発現調節配列には例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞について、ポリヘドリンまたはバキュロウィルスのｐ１０プロモーターが使用できる（（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３， ２１５６−６５， １９８３）宿主細胞が哺乳類由来である場合には、実例となる実用的な発現調節配列には、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｗ． ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２２，５２４−５２７， １９８３）、またはメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， Ｒ． Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９６，３９−４２， １９８２）、または熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ４９４９−５３， １９８５）が含まれる。
【００２７】
バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞の発現システムは非常に頻繁に用いられるシステムである。このようなシステムは本分野において周知であり、一般に例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．）、Ｎｏｖａｇｅｎ（ｗｗｗ． ｍｅｒｃｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ）、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７， ＵＳＡを通じて商業的に入手可能である。これらの発現システムについで、寄生生物ベースの発現システムは非常に興味ある発現システムである。このようなシステムは例えば、発行番号２７１４０７４の仏国特許出願および発行番号ＵＳ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ， Ｗ．： Ｐｕｂｌｉｃ． Ｄａｔｅ １ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）の米国ＮＴＩＳにおいて記述されている。
【００２８】
本発明の前記実施態様のさらに好ましい形態は、本発明の２６ｋＤタンパク質若しくはその免疫原性断片、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組み換えＤＮＡ分子をコードする核酸を含む、生きた組み換え担体（ＬＲＣ）に関する。このような担体は例えばバクテリアおよびウィルスである。これらのＬＲＣは、さらなる遺伝情報、この場合本発明の２６ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸がクローニングされた微生物またはウィルスである。このようなＬＲＣによって感染された動物は担体の免疫原に対してのみでなく、遺伝コードがＬＲＣへとさらにクローニングされるタンパク質、例えば２６ｋＤタンパク質の免疫原性部分に対しても免疫原性反応を生じるだろう。
【００２９】
バクテリアＬＲＣの一例として、本分野において既知の弱毒化サルモネラ系が興味深く使用できる。
【００３０】
生きた組み換え担体寄生生物はとりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ， Ａ． Ｎ． （Ｉｎｔ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２８： １１２１−１１３０ （１９９８））によって記述されている。
【００３１】
また、ＬＲＣウィルスは前記核酸を標的細胞へと輸送する方法として使用されてもよい。生きた組み換え担体ウィルスはまたベクターウィルスとも呼ばれる。ベクターとしてしばしば用いられるウィルスは、ワクチニアウィルス（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９： ４９２７ （１９８２））、ヘルペスウィルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、およびレトロウィルス（Ｖａｌｅｒｉｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．； ｉｎ Ｂａｕｍ， Ｓ． Ｊ．， Ｄｉｃｋｅ， Ｋ． Ａ． ， Ｌｏｔｚｏｖａ， Ｅ． ａｎｄ Ｐｌｕｚｎｉｋ， Ｄ． Ｈ． （Ｅｄｓ．）， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ − １９８８． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ｐｐ． ９２−９９ （１９８９））である。
【００３２】
本分野で周知の生体内相同性組み換えの技術は、宿主動物において本発明に記載の挿入される核酸の発現を誘導できるよう選択されたバクテリア、寄生生物、またはウィルスへと組み換え核酸を導入するのに使用できる。
【００３３】
最後に、本発明のこの実施態様の別の形態は、本発明に記載のタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含むＤＮＡ断片、または機能的に連結されるプロモーターの調節下でこのような核酸を含む組み換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は、本発明の２６ｋＤタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を含む、生きた組み換え担体を含む宿主細胞にも関する。
【００３４】
宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のようなバクテリアベースのプラスミド、またはｐＧＥＸのようなバクテリア発現ベクターと組み合わせた、またはバクテリオファージとの組み合わせた、バクテリア由来、例えば大腸菌種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来の細胞であってもよい。宿主細胞は、酵母特異的ベクター分子との組み合わせの真核生物由来、例えば酵母細胞由来のものであるか、またはベクター若しくは組み換えバキュロウィルスと組み合わせた、昆虫細胞のようなより高等の真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ； Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ４７−５５ （１９８８））、Ｔｉプラスミドベースのベクターまたは植物ウィルスベクターとの組み合わせの植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．； Ｃｅｌｌ ３２： １０３３ （１９８３））、これもまた適切なベクターまたは組み換えウィルスとの組み合わせのＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはクランデルフェリン（Ｃｒａｎｄｅｌｌ Ｆｅｌｉｎｅ）腎細胞のような哺乳類細胞に属していてもよい。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、本発明の前記新規タンパク質およびその免疫原性断片に関する。
【００３６】
免疫原性断片の概念は以下に定義される。
【００３７】
この実施態様の一つの形式はとりわけ、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性のあるアミノ酸配列を有するローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、および前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３８】
好ましい形態において、前記実施態様は配列番号２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性のある配列相同性を有するようなローソニア・イントラセルラーリスタンパク質、およびこのようなタンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３９】
さらにより好ましくは、９８％または１００％までもの相同性レベルである。
【００４０】
タンパク質相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で見つけることができるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによってコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」により決定できる。
【００４１】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４： ２４７−２５０ （１９９９）である。用いられるマトリクスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。用いられる因子はデフォルト因子であり、開いた間隙は１１、伸長間隙は１、間隙ｘ＿低下は５０である。
【００４２】
本明細書に含まれる特定のタンパク質について、天然のバリエーションが個々のローソニア・イントラセルラーリス系の間に存在しうることは理解される。これらのバリエーションは総体的な配列におけるアミノ酸の差異によって、または前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転、または付加によって示され得る。生物学的および免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ ｉｎ “Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７９）によって述べられている。関連するアミノ酸の間のアミノ酸置換または進化において頻繁に生じた置換はとりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ． Ｄ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ． ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ． Ｃ．， １９７８， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３参照）。他のアミノ酸置換にはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、およびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは迅速かつ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １９８５）、相同性のあるタンパク質間の機能的類似性を決定するための方法を開発した。本発明の典型的な実施態様に関するこのようなアミノ酸置換並びに欠失及び／又は挿入を有するバリエーション、結果として生じるタンパク質も、それらの免疫反応性を保持する限り、本発明の範囲に属する。このことは、異なる場の単離物から単離されるとき、本発明のローソニア・イントラセルラーリスタンパク質が同じ免疫学的特徴を有する同一タンパク質を呈しながらも、約９０％の相同性レベルを有し得る理由を説明する。
【００４３】
ローソニア・イントラセルラーリスによる感染に対する、または前記感染の少なくとも臨床的症状に対する免疫反応を誘導できるタンパク質をなお提供する、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列における前記バリエーションは「免疫原性に本質的には影響しない」と考慮される。
【００４４】
タンパク質が例えば抗体を上昇させるための予防接種の目的に使用されるとき、全タンパク質を使用することはしかしながら必要ではない。また、いわゆる免疫原性断片である当該タンパク質に対する免疫反応を、そのまままたは例えばＫＬＨのような担体へ連結されて誘導できる当該タンパク質の断片を使用することができる。「免疫原性断片」は宿主において免疫反応を誘導する能力をなお保持し、すなわちＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを含む全長のタンパク質の断片であると理解される。このとき、多様な技術が抗原性断片（決定因子）をコードするＤＮＡ断片を簡単に同定するために利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ （特許出願ＷＯ ８４／０３５６４， 特許出願ＷＯ ８６／０６４８７， 米国特許４，８３３，０９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１ ： ３９９８−４００２ （１９８４）， Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈ． １０２， ２５９−２７４ （１９８７）によって記述される方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出のための迅速かつ十分に確立された方法を実行するための簡易法である。前記方法は世界的に用いられており、このこと自体は当業者に周知である。この（実証的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられたとき、コンピュータアルゴリズムは、今や既知のエピトープを有する特定のタンパク質断片の配列及び／又は構造の一致に基づいて、タンパク質断片を免疫学的に重要なエピトープとして示すことができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ３８２４８−３８２８ （１９８１））にしたがった親水性基準および、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７： ４５−１４８ （１９８７）および米国特許４，５５４， １０１）にしたがった二次構造の見解の組み合わせに基づいている。Ｔ細胞のエピトープはＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準を活用してコンピュータによって配列から同様に推定できる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１０５９−１０６２ （１９８７）および米国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ ０７／００５，８８５）。凝縮された概説は、共通原理に関してはＳｈａｎ Ｌｕ， Ｔｉｂｔｅｃｈ． ９： ２３８−２４２ （１９９１）で、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５： １０５９−１０６２ （１９８７）で、総説についてはＬｕ， Ｖａｃｃｉｎｅ １０： ３−７ （１９９２）、ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ， Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ５： ２４１２−２４１８ （１９９１）で見られる。
【００４５】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様の一つの形式は、上述のような本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を含み、医薬的に許容できる担体とともに、ローソニア・イントラセルラーリス感染に対してブタを保護できるワクチンに関する。
【００４６】
本発明のさらに別の実施態様は、ワクチンにおける使用のための本発明のタンパク質に関する。
【００４７】
さらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンの製造向けの、本発明のタンパク質の使用に関する。
【００４８】
本発明のワクチンを作製する一つの方法は本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片を、感染した腸壁から採取された粘膜剥離物を通じて得られるバクテリアから生化学的に精製することによる。このことはしかしながら、ワクチンを作製するのに非常に時間を消費する方法である。
【００４９】
それゆえ、ワクチンにおいて本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子の発現産物を使用することが非常により簡便である。前記２６ｋＤタンパク質をコードする遺伝子の核酸は本発明によって提供される。
【００５０】
これらの遺伝子の発現産物に基づいたこのようなワクチンは、本発明のタンパク質または本発明の免疫原性断片を、後述のように医薬的に許容できる担体と混合することによって簡単に作製できる。
【００５１】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片を発現できる、上述のような、生きた組み換え担体を含むことができる。例えば腸上皮組織または例えば呼吸器系上皮組織を感染させるサルモネラ担体またはウィルス担体に基づいたこのようなワクチンは、ローソニア・イントラセルラーリスの感染の自然な方法をよりよく模倣するサブユニットワクチンにわたる利点を有する。さらに、自己増殖は、少量の組み換え担体のみが免疫性の付与に必要であるため有利である。
【００５２】
上述のワクチンはすべて活発な予防接種に関与し、すなわち、宿主の免疫系は本発明のタンパク質またはその免疫原性断片によって惹起され、これらのタンパク質に対する抗体を産生する。
【００５３】
あるいは、このような抗体は、例えばウサギにおいて上昇できるか、または後述のように抗体産生細胞系から得られることができる。このような抗体は次に、宿主動物へ投与できる。この方法の予防接種、すなわち受動的予防接種は、動物がすでに感染しており、および自然な免疫反応が惹起できる時間がないときに選択される予防接種である。それはまた、免疫が危険に暴露された動物を予防接種するための好ましい方法でもある。投与される、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体はこれらの場合、バクテリアへ直接結合できる。このことはローソニア・イントラセルラーリスの成長を即時低下または停止する利点を有する。
【００５４】
それゆえ、本発明のこの実施態様の他の一つの形式は本発明の２６ｋＤローソニア・イントラセルラーリスタンパク質に対する抗体を含むワクチンに関する。
【００５５】
ワクチンは本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片を含む、上述のような宿主細胞に基づいていることができる。
【００５６】
予防接種の別のおよび効率のよい方法は前記関連抗原をコードするＤＮＡによる直接的な予防接種である。タンパク質をコードするＤＮＡによる直接的な予防接種は、多くの異なるタンパク質にとって成功している（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２： ２０−２６ （１９９３）において総説されるように）。
【００５７】
この方法の予防接種はローソニア・イントラセルラーリス感染に対するブタの予防接種にとって非常に興味深い。
【００５８】
それゆえ、本発明の実施態様のさらに他の形式は、本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片をコードする核酸を含むワクチン、およびこのような核酸を含むＤＮＡ断片を含むワクチンに関する。
【００５９】
この実施態様のさらに他の形式は、本発明の組み換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【００６０】
ＤＮＡワクチンは皮内適用を通じて、例えば針なし注射器を使用して簡単に投与できる。この方法の投与はＤＮＡを、予防接種される動物の細胞へ直接送達する。１〜１００μｇの間の範囲の微生物中のＤＮＡの量は、非常によい結果を提供する。
【００６１】
さらなる実施態様において、本発明のワクチンはさらに、他のブタ病原性生命体およびウィルスに由来する一つ以上の抗原、またはこのような抗原をコードする遺伝情報をさらに含む。
【００６２】
このような生命体およびウィルスは、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パストゥレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオプヌーモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラ・ハイオダイセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、およびアクチノバチラス・プレウロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のグループから好んで選択される。
【００６３】
本発明のすべてのワクチンは医薬的に許容できる担体を含む。医薬的に許容できる担体は、例えば滅菌水または滅菌生理塩類溶液でありうる。より複雑な形式において、担体は例えば緩衝液でありうる。
【００６４】
ワクチンの調製のための方法は、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片、および医薬的に許容できる担体の混合物を含む。
【００６５】
本発明のワクチンは、好ましい呈示において、アジュバントも含む。アジュバントは一般に、非特異的な様式で宿主の免疫反応を惹起する物質を含む。多くの異なるアジュバントが本分野において既知である。
【００６６】
アジュバントの例は、Ｆｒｅｕｎｄｓの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、クィルＡ（Ｒ）、鉱油例えばバイヨール（Ｒ）またはマルコール（Ｒ）、野菜油、およびカルボポール（Ｒ）（ホモポリマー）、またはディルバック（Ｒ）フォルトである。
【００６７】
ワクチンは、いわゆる「担体」も含有してもよい。担体は、ある化合物へ共有結合せずにポリペプチドが接着する化合物である。しばしば使用される担体化合物は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸化アルミニウム、または酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、およびベントナイトである。
【００６８】
抗原が担体に部分的に組み込まれるこのような担体の特殊な形式は、いわゆるＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２、ＥＰ１８０．５６４、ＥＰ２４２．３８０）である。さらに、ワクチンは一つ以上の適切な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパンまたはトゥイーンを含有してもよい。
【００６９】
しばしば、ワクチンは安定化剤と混合され、例えば分解傾向性ポリペプチドを分解されることから保護し、ワクチンの有効期間を延長し、または凍結乾燥の効率性を亢進する。実用的な安定化剤はとりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ ； Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９： ５０９ （１９５０））、炭水化物例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストラン、またはブドウ糖、アルブミンまたはカゼインのようなタンパク質、またはそれらの分解産物、およびアルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
【００７０】
さらに、ワクチンは生理学的に許容できる希釈剤中に懸濁され得る。アジュバント処理し、担体化合物または希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳化または安定化させることに関する他の方法も、本発明において具現化されることは言うまでもない。
【００７１】
本発明のワクチンは１〜１００μｇの間の範囲にある量で非常に適切に投与できるが、より少量の投与量は原理上使用できる。１００μｇを超える投与量は免疫学的に非常に適切ではあるが、商業上の理由のためあまり興味深くはないだろう。
【００７２】
ＬＲＣウィルスおよび上述のバクテリアのような生きた弱毒化された組み換え担体に基づいたワクチンは、感染期間中ワクチンがそれ自体を繁殖させるため、非常により少量の投与量で投与できる。それゆえ、非常に適切な量はバクテリアおよびウィルスについてそれぞれ、１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの範囲になるであろう。
【００７３】
多くの投与方法が適用できる。経口適用は、感染が消化管の感染であるため、非常に興味深い方法の投与である。経口投与の好ましい方法は、本分野において既知でありかつ頻繁に使用され、カプセル入りのワクチンが胃の非常に酸性の環境を通過した後で崩壊するだけであるカプセル入りのワクチンの包装である。また、ワクチンは胃のｐＨを一時的に亢進するため、本分野において既知である化合物と混合されてもよい。
【００７４】
全身性適用も適切であり、例えばワクチンの筋内適用によって行われる。もしこの経路にしたがえば、全身性適用についての本分野で既知の標準的な手法が適切である。
【００７５】
疾病に対する保護の観点から、ローソニア・イントラセルラーリス感染の迅速かつ正確な診断は重要である。それゆえ、本発明の別の目的は、ローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断ツールを提供することである。
【００７６】
血清中のローソニア・イントラセルラーリス抗体の検出のための診断用検査は、例えば、本発明の２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁へコーティングされる単純で標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ検査でありうる。このような抗体の検出のための方法は、例えば、検査される哺乳類由来の血清とともに２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片を定温放置した後、例えば、関連哺乳類抗体に対する標識された抗体とともに定温放置することである。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の有無を評価できる。診断用検査システムの別の例は、例えば本発明の２６ｋＤタンパク質またはその抗原性断片を含むウェスタンブロットを、検査される哺乳類の血清とともに定温放置した後、ブロットを分析することである。
【００７７】
したがって、本発明の別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスに対する抗体の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質またはその断片を含む。
【００７８】
ローソニア・イントラセルラーリス抗原の特異的２６ｋＤタンパク質に関する抗原性材料の検出に基づいた、およびそれゆえローソニア・イントラセルラーリス感染の検出に適した診断用検査は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ検査でもありうる。このような検査の一例において、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁は、前記２６ｋＤタンパク質に対して向かう抗体でコーティングされる。検査される材料とともに定温放置した後、標識されたローソニア・イントラセルラーリス抗体がウェルへ添加される。次に、呈色反応はローソニア・イントラセルラーリス由来の抗原性材料の存在を評価する。
【００７９】
それゆえ、本発明のさらに別の実施態様は、ローソニア・イントラセルラーリスの抗原性材料の検出のための診断用検査に関する。このような検査は本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体を含む。
【００８０】
上述に特徴付けられるように表現された本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ポリクローナル、モノ特異的、またはモノクローナル（またはそれらの誘導体）であってもよい抗体を産生するのに使用できる。もしポリクローナル抗体が望まれれば、ポリクローナル血清を産生・処理するための技術が本分野において周知である（例、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ， ｅｄｓ． Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）。
【００８１】
本発明のポリペプチド（または本発明のその変異体または断片）に対して反応するモノクローナル抗体は、本分野でこれもまた既知の技術によって近交系のマウスを免疫付与することによって調製できる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−４９７， １９７５）。
【００８２】
本発明の抗体の大規模な産生のための方法も本分野で既知である。このような方法は、ファージディスプレイのための糸状ファージにおいて、本発明の前記タンパク質をコードする遺伝情報の（断片の）クローニングに依存する。このような技術はとりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌにおける「ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」の下での「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｇｅ」で、および、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２： ２６２−２６７のＣｏｒｔｅｓｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４）によって、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２： １７３−１８３のＣｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ． ＆ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ． （１９９４）によって、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １６００７−１６０１０のＭａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （１９９２）によって、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ４３３−４５５のＷｉｎｔｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．によって、およびＬｉｔｔｌｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． Ａｄｖ． １２： ５３９−５５５によって記述されている。ファージはその後、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリをスクリーニングするのに使用される（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｓ． ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ， Ｍ．， Ｊｏｕｒｎ． Ｍｏｌｅｃ． Ｒｅｃｏｇｎ． １２： １３１−１４０ （１９９９）およびＧｈａｈｒｏｕｄｉ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４： ５１２−５２６ （１９９７））。望まれる抗体を発現するライブラリからの細胞は複製でき、その後、抗体の大規模発現のために使用できる。
【００８３】
実施例
【実施例１】
【００８４】
感染したブタ回腸からのローソニア・イントラセルラーリスの単離。
【００８５】
組織病理学および抗酸性Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色によって確認されるローソニア・イントラセルラーリスに感染した回腸がＰＥで死亡したブタから回収され、−８０℃で保存された。融解後、ローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを、感染した腸壁から採取した粘膜剥離物から単離した。前記回腸剥離物をオムニミキサー中のＰＢＳにおいて繰り返し均質化し、Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０： ３０３−３２３ （１９８５））によって記述されるように細胞内バクテリアを放出した。低速遠心分離で細胞くずを除去した後に得られる上清を、５．０μｍ、３．０μｍ、１．２μｍ、および０．８μｍのフィルター（ミリポア）でろ過した。前記ろ液をその後、８０００ｇで３０分間遠心分離し、小さなペレットのローソニア・イントラセルラーリスバクテリアを得た。これらのバクテリアをさらにＰｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して精製した。前記精製されたバクテリアの同定はＰＣＲにより査定され（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： ２６１１−２６１５）、一方で、単離されたバクテリアの精製度（＞９５％）は位相差顕微鏡により査定し、いずれかの夾雑するバクテリアまたは存在する腸のくずを評価した。
【００８６】
バクテリア株およびプラスミド
ローソニア・イントラセルラーリス細胞を上述のように、感染した回腸材料から単離した。ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅおよびプラスミドｐＥＴ２２ｂを含む大腸菌宿主系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）をＮｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン市）から購入し、大腸菌系ＴＯＰ１０Ｆ’をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（オランダ国フローニンゲン）から購入した。３０％グリセロールを含有しているすべてのバクテリア株のストックは−７０℃で保存した。ＬＢ培地およびＬＢプレートを標準的な手技にしたがって調製した。
【００８７】
ＤＮＡ単離
高度に精製されたローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを得るため、Ｂｉｏｒａｄ染色体ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｒａｄ、オランダ国 フェーネンダール）を使用してＤＮＡをバクテリア細胞から調製した。Ｑｉａｇｅｎ製品を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。
【００８８】
ＰＣＲ増幅
５２Ｕ／ｍｌ伸長高忠実度酵素ミックス、２．５ｍＭＭｇＣｌ２、１６ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）、２０ｐｍｏｌのプライマー、およびテンプレートとしての１５ｎｇのローソニア・イントラセルラーリス染色体ＤＮＡを含む伸長ＨＦ緩衝液を含有しているＰＣＲ混合物を用いて、ＰＣＲ増幅を実行した。
【００８９】
標準的な適用（つまり、コロニーＰＣＲ）のため、前記ＰＣＲ混合物は、２０Ｕ／ｍｌスーパータック（ＨＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ケンブリッジ）および、８ｍＭｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）、１０ｐｍｏｌのプライマー、および１５ｎｇのテンプレートを含有するスーパータック緩衝液（ＨＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ケンブリッジ）を含有した。
【００９０】
ライゲーションおよび形質変換
ライゲーションは１単位のライゲーション酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を有する１×ライゲーション緩衝液中で、１６℃で一晩実行した。１μｌのライゲーション反応液を大腸菌コンピテント細胞へ、熱ショックにより形質変換した。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞およびＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌コンピテント細胞は標準的な方法を使用して形質変換受容性にした。
【００９１】
１０×ＨＩＳ融合タンパク質の発現
発現ベクターのＤＮＡ配列を確認した後、ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ発現ベクターを形質変換した。生じた株を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５ｍｌＬＢ中で一晩、３７℃、２００ｒｐｍで生育させた。前記一晩の培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の５０ｍｌＬＢ中で１：１００に希釈した。この培養物を同一条件下で、ＯＤ６００が０．５に到達するまで生育させた。前記培養物をＩＰＴＧにより終濃度１ｍＭになるよう誘導し、その後３時間生育させ続けた。１００μｌの試料を分析用に採取した。ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有する大腸菌系ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を同一条件下で生育させ誘導し、試料をネガティブコントロールとして採取した。前記試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）からの４〜１２％ビス−トリスゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ウェスタンブロッティングはセミドライブロッティング手法を使用して実行した。ウェスタンブロットは水：油が４５：５５の乳化剤中の全細胞調製物に対して上昇するニワトリ抗ローソニアポリクローナル血清を使用して、または精製したローソニア・イントラセルラーリス細胞で経口試験し、ローソニア・イントラセルラーリス感染に対して典型的な臨床知見および死後の障害を発現した動物から得られたブタ血清を使用して現像した。４℃で４時間、ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含有するＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）由来の等量の細胞粗抽出物を使用して、前記血清をあらかじめ吸着させた。
【００９３】
結果
Ｔ７ベースの発現ベクターにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８のクローニング
プライマー２１７９（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＡＧ）およびプライマー２１８０（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＴＴＣＧＡＴＡＣ）を使用して、遺伝子５６０８を増幅した。前記処理において、５’ＮｃｏＩおよび３’ＸｈｏＩの部位を前記ＰＣＲ産物へ導入した。前記得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを使用して消化した。前記消化したＰＣＲ産物をその後、前記同一の二つの制限酵素で切断しておいたｐＥＴ２２ｂへライゲートした。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆへ形質変換し、および３７℃で一晩定温放置した。推定上の形質変換因子を、コロニーＰＣＲを使用して正確なプラスミドについてチェックした。コロニーＰＣＲ陽性の形質変換因子の前記プラスミドインサートを、ヌクレオチド配列分析によりチェックした。クローン戦略に基づいて期待される配列を含有したクローンのうちの一つを選択し、ｐＥＴ５６０８と命名した。
【００９４】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８の発現
プラスミドｐＥＴ５６０８をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅへ形質変換した。生じた株を、上述のように組み換えタンパク質産生のために検査した。前記誘導される培養物の試料および対照試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図１Ａ）。約２６ｋＤａの透明なタンパク質のバンドが、誘導されていない試料（図１Ａ、レーン２）と比較して、誘導３時間後に採取した試料（図１Ａ、レーン３）において観察された。
【００９５】
前記同一試料をまた、ブタおよびニワトリの血清を使用したウェスタンブロットにより分析した。タンパク質５６０８との反応は、精製されたローソニア・イントラセルラーリスで経口試験したブタ由来の血清（図１Ｂ、レーン３）およびニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清で経口試験したブタ由来の血清（図１Ｃ、レーン３）を使用して観察された。
【００９６】
結論
前記２６ｋＤワクチン成分は、多量にうまく発現でき、および、ブタ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清およびニワトリ抗ローソニア・イントラセルラーリス血清の両者とも経口試験することによって実際に明らかに認識される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および、ポリクローナルブタ血清（Ｂ）およびポリクローナルニワトリ血清（Ｃ）を使用するウェスタンブロッティングによる大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるローソニア・イントラセルラーリス遺伝子５６０８の過剰発現の分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ５６０８、Ｔ＝０；レーン３、ｐＥＴ５６０８、Ｔ＝３。矢印は発現産物の位置を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の２６ｋＤのタンパク質をコードする核酸または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含むＤＮＡ断片。
【請求項３】
機能的に連結されたプロモーターの調節下にある、請求項１に記載の核酸または請求項２に記載のＤＮＡ断片を含む組み換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、または請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、生きた組み換え担体。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、または請求項４に記載の生きた組み換え担体を含む、宿主細胞。
【請求項６】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含むローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の２６ｋＤのタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項７】
ワクチンにおいて使用するための、請求項６に記載のローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質。
【請求項８】
ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを製造のための、請求項６に記載のローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項４に記載の生きた組み換え担体、請求項５に記載の宿主細胞または請求項６に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項１０】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ブタに対して病原性のあるウィルスまたは微生物に由来するさらなる抗原または前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
ブタに対して病原性のある前記ウィルスまたは微生物が、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、感染性胃腸炎、ロタウィルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラチスピラ・ハイオダイセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）およびアクチノバチラス・プレウロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項６に記載のタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項４に記載の生きた組み換え担体、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質、または請求項６に記載のタンパク質に対する抗体と、薬学的に許容される担体とを混合することを含む、請求項９ないし１３に記載のワクチンを調製する方法。
【請求項１５】
前記検査が請求項６に記載のタンパク質またはその断片を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の検出のための診断用検査。
【請求項１６】
前記検査が請求項６に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の抗原性材料の検出のための診断用検査。
【請求項１】
配列番号１に記載されている配列を有する核酸と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％の相同性を有する、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の２６ｋＤのタンパク質をコードする核酸または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含むＤＮＡ断片。
【請求項３】
機能的に連結されたプロモーターの調節下にある、請求項１に記載の核酸または請求項２に記載のＤＮＡ断片を含む組み換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、または請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、生きた組み換え担体。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、または請求項４に記載の生きた組み換え担体を含む、宿主細胞。
【請求項６】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、さらにより好ましくは９６％相同であるアミノ酸配列を含むローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の２６ｋＤのタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項７】
ワクチンにおいて使用するための、請求項６に記載のローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質。
【請求項８】
ローソニア・イントラセルラーリス感染を撲滅するためのワクチンを製造のための、請求項６に記載のローソニア・イントラセルラーリスのタンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項４に記載の生きた組み換え担体、請求項５に記載の宿主細胞または請求項６に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項１０】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ブタに対して病原性のあるウィルスまたは微生物に由来するさらなる抗原または前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
ブタに対して病原性のある前記ウィルスまたは微生物が、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、感染性胃腸炎、ロタウィルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラチスピラ・ハイオダイセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）およびアクチノバチラス・プレウロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項６に記載のタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸、請求項２に記載のＤＮＡ断片、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項４に記載の生きた組み換え担体、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質、または請求項６に記載のタンパク質に対する抗体と、薬学的に許容される担体とを混合することを含む、請求項９ないし１３に記載のワクチンを調製する方法。
【請求項１５】
前記検査が請求項６に記載のタンパク質またはその断片を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体の検出のための診断用検査。
【請求項１６】
前記検査が請求項６に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体を含むことを特徴とする、ローソニア・イントラセルラーリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の抗原性材料の検出のための診断用検査。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５３７７１５（Ｐ２００７−５３７７１５Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３５４４（Ｐ２００６−５４３５４４）
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５３３４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６５８６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５３３４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６５８６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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