酵母及び糸状真菌などの下等真核生物の表面上に組換えタンパク質又はタンパク質ライブラリーをディスプレイするための方法が記載されている。この方法は、ライブラリー中のタンパク質のアレイから所望の特性を有する特定のタンパク質を同定するために、下等真核生物中の組換えタンパク質のライブラリーをスクリーニングするのに有用である。前記方法は、下等真核生物中に抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングするのに特に有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
下等真核生物宿主細胞表面上へのディスプレイ可能性に関してタンパク質を選択する方法であって、
（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
（ｂ）前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されたタンパク質をコードする核酸で前記宿主細胞を形質転換すること（タンパク質の変異体の多様化された集団をコードする宿主細胞の複数を作製するために、突然変異誘発が使用される。）；
（ｃ）前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされているタンパク質へ特異的に結合し及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていないタンパク質に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに
（ｄ）前記検出手段が結合している宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上のタンパク質に結合された前記検出手段の存在は、前記タンパク質が下等真核生物細胞表面上にディスプレイ可能であることを示唆する。）；
を含む、方法。
【請求項２】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項１の方法。
【請求項３】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項２の方法。
【請求項４】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用可能なＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項３の方法。
【請求項５】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項６】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、ＣＷｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項７】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項１の方法。
【請求項８】
下等真核生物が酵母である、請求項１の方法。
【請求項９】
酵母がピキア・パストリスである、請求項８の方法。
【請求項１０】
タンパク質が抗体である、請求項１の方法。
【請求項１１】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項１の方法。
【請求項１２】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項１の方法。
【請求項１３】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項１の方法。
【請求項１４】
宿主細胞の表面上に所望のタンパク質をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法であって、
（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
（ｂ）少なくとも１つの宿主細胞が細胞表面上に所望のタンパク質をディスプレイしていると考えられる宿主細胞の複数を作製するために、細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分にそれぞれ融合されているタンパク質をコードする核酸によって宿主細胞を形質転換すること；
（ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望のタンパク質に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに
（ｄ）所望のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること；
を含む、方法。
【請求項１５】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用を行うことができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項１４の方法。
【請求項１９】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、ＣＷｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項２０】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項１４の方法。
【請求項２１】
下等真核生物が酵母である、請求項１４の方法。
【請求項２２】
酵母がピキア・パストリスである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
所望のタンパク質が抗体又はその断片である、請求項１４の方法。
【請求項２４】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項１４の方法。
【請求項２５】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項１４の方法。
【請求項２６】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項１４の方法。
【請求項２７】
抗体を産生する方法であって、
（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
（ｂ）抗体の前記重鎖及び軽鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること（重鎖は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されおり、抗体の変異体の変化を受けた集団をコードする宿主細胞の複数を作製するために、突然変異誘発が使用される。）；
（ｃ）前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされている抗体へ特異的に結合し、及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていない抗体に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに
（ｄ）前記検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上の抗体に結合された前記検出手段の存在は、前記宿主細胞が抗体を産生することを示唆する。）；
を含む、方法。
【請求項２８】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項２７の方法。
【請求項３２】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、ＣＷｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項２７の方法。
【請求項３３】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項２７の方法。
【請求項３４】
下等真核生物が酵母である、請求項２７の方法。
【請求項３５】
酵母がピキア・パストリスである、請求項３７の方法。
【請求項３６】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項２７の方法。
【請求項３７】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項２７の方法。
【請求項３８】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項２７の方法。
【請求項３９】
宿主細胞の表面上に所望の抗体をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法であって、
（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
（ｂ）少なくとも１つの宿主細胞が細胞表面上に所望のタンパク質をディスプレイしていると考えられる宿主細胞の複数を作製するために、抗体の前記重鎖及び軽鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること（重鎖は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されている。）；
（ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望の抗体に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに
（ｄ）所望の抗体をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること；
を含む、方法。
【請求項４０】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項３９の方法。
【請求項４１】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項４０の方法。
【請求項４２】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項３９の方法。
【請求項４４】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項３９の方法。
【請求項４５】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項３９の方法。
【請求項４６】
下等真核生物が酵母である、請求項３９の方法。
【請求項４７】
酵母がピキア・パストリスである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項３９の方法。
【請求項４９】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項３９の方法。
【請求項５０】
捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項３９の方法。
【請求項５１】
特異的結合対の一員（該特異的結合対の一員は、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、及び目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片である。）を作製する方法であって、
（ａ）その表面上に特異的な結合対の一員をディスプレイしている下等真核生物宿主細胞のライブラリーを準備すること、（特異的な結合対の一員は合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片であり、（前記ライブラリーは、
（ｉ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備すること；
（ｉｉ）特異的結合対の一員の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備すること（前記特異的結合対の一員の前記遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して偏っており、及び前記特異的結合対の一員は前記細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分を含む。）；
（ｉｉｉ）前記下等真核生物宿主細胞中で核酸配列の前記ライブラリーを発現させること（各特異的結合対の一員は下等真核生物宿主細胞の前記表面にディスプレイされている。）；
によって作製される。）；
（ｂ）１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を目的の抗原と結合させることによって、目的の抗原に対して結合特異性を有する１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を選択すること（このようにして選択された各特異的結合対の一員は下等真核生物宿主細胞上にディスプレイされている。）；
を含む、方法。
【請求項５２】
特異的結合対要素の一員が合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインがフレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初の２つの超可変ループが実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインが変化されたＣＤＲ３ループを有する、請求項５１の方法。
【請求項５３】
変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインが他のＣＤＲループ中に変異を含有する、請求項５２の方法。
【請求項５４】
各ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが無作為配列のものである、請求項５１の方法。
【請求項５５】
ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが公知の標準構造のものであり、及び無作為配列要素を取り込む、請求項５１の方法。
【請求項５６】
ディスプレイされた特異的結合対の一員が一本鎖Ｆｖ抗体断片を含む、請求項５１の方法。
【請求項５７】
ディスプレイされた特異的結合対の一員が抗体を含む、請求項５１の方法。
【請求項５８】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項５１の方法。
【請求項５９】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項５８の方法。
【請求項６０】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項５９の方法。
【請求項６１】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項５１の方法。
【請求項６２】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項６１の方法。
【請求項６３】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項５１の方法。
【請求項６４】
下等真核生物が酵母である、請求項５１の方法。
【請求項６５】
酵母がピキア・パストリスである、請求項６４の方法。
【請求項６６】
抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、並びに目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片を作製する方法であって、
（ａ）合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片をその表面上にディスプレイする下等真核生物宿主細胞のライブラリーを準備すること（該ライブラリーは、
（ｉ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備すること；
（ｉｉ）抗体又は抗体断片の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備すること（前記抗体又は抗体断片の前記遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して偏っており、及び前記抗体又は抗体断片は前記細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分を含む。）；
（ｉｉｉ）前記下等真核生物宿主細胞中で核酸配列の前記ライブラリーを発現させること（各抗体又は抗体断片は下等真核生物宿主細胞の前記表面にディスプレイされている。）；
（ｂ）１つ又はそれ以上の抗体又は抗体断片を目的の抗原と結合させることによって、目的の抗原に対して結合特異性を有する１つ又はそれ以上の抗体又は抗体断片を選択すること（このようにして選択された各抗体又は抗体断片は下等真核生物宿主細胞上にディスプレイされている。）；
を含む、方法。
【請求項６７】
抗体又は抗体断片が合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインがフレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初の２つの超可変ループが実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインが変化されたＣＤＲ３ループを有する、請求項６６の方法。
【請求項６８】
変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインが他のＣＤＲループ中に変異を含有する、請求項６７の方法。
【請求項６９】
各ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが無作為配列のものである、請求項６６の方法。
【請求項７０】
ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが公知の標準構造のものであり、及び無作為配列要素を取り込む、請求項６６の方法。
【請求項７１】
第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、並びに第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、並びに第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用を行うことができる、請求項６６の方法。
【請求項７２】
第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項７１の方法。
【請求項７３】
コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである、請求項７２の方法。
【請求項７４】
細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項６６の方法。
【請求項７５】
細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項７４の方法。
【請求項７６】
細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項６６の方法。
【請求項７７】
下等真核生物が酵母である、請求項６６の方法。
【請求項７８】
酵母がピキア・パストリスである、請求項７７の方法。
【請求項７９】
結合部分を含むポリペプチドのＮ末端へ、そのＣ末端が融合された所望のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸（該核酸は、前記所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の間に単一の停止コドンを含む。）を含むベクター。
【請求項８０】
所望のタンパク質が抗体の重鎖である、請求項７９に記載のベクター。
【請求項８１】
請求項２７の方法によって作製された抗体。
【請求項８２】
請求項３９の方法によって作製された抗体。
【請求項８３】
請求項５１の方法によって作製された抗体。
【請求項８４】
請求項６６の方法によって作製された抗体。
【請求項８５】
第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分をコードする核酸並びに抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含む下等真核生物宿主細胞（前記重鎖は、細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されている。）。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図８Ｆ】

【図８Ｇ】

【図８Ｈ】

【図８Ｉ】

【図８Ｊ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【図１４Ｆ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１５Ｄ】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【公表番号】特表２０１１−５１４８０７（Ｐ２０１１−５１４８０７Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４９７０９（Ｐ２０１０−５４９７０９）
【出願日】平成２１年２月２０日（２００９．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３４６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１１１８３
【国際公開日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ，　インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】