中性ｐＨで可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンの製造
中性ｐHで可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンは、医学的用途に有用である。本発明は、前記終末的に滅菌されたコラーゲンを調製する方法にも関連する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、コラーゲン組成物およびその製造方法に関する。より詳細には、天然コラーゲンの当初の性質のほとんど、特に粘度特性を維持しながらも、中性ｐＨで完全に可溶性のままである、終末的に滅菌されたコラーゲンについて記載する。
【０００２】
この開示において、「可溶性」の語がコラーゲンに関して使用されるとき、コラーゲンが水に可溶性であることを意味する。
【０００３】
コラーゲンの製造および滅菌技術は公知である。滅菌は、コラーゲンの製造方法の最終段階の前に行われる場合がある。しかしながら、このような場合に、製造方法の最終段階の間、厳格に滅菌状態を維持することは困難である。
【０００４】
コラーゲンの終末的な滅菌を用いるコラーゲンの製造方法において、困難も生じる。前記方法によっては、天然コラーゲンの生理学的性質、効力および有効性を保持しながら中性ｐＨで完全に可溶性のコラーゲンが製造されないことが多い。以前に開示された終末的に滅菌されたコラーゲン組成物は、天然コラーゲンの性質を維持するよりむしろ、架橋され、変性され、および／または中性ｐＨで完全には可溶性でない。
【０００５】
しかし、例えば、コラーゲンの溶解度が重要となるかもしれない接着剤の成分として使用するために、天然コラーゲンの性質を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンを近い将来得ることは、興味深い。さらに、天然状態の特性を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンを得て、例えば、皺や尿失禁の治療のため、欠陥（例えば、骨の欠陥）を満たすために使用できる注射可能な製品としての前記溶液の使用を可能にする粘度を有する、滅菌されたコラーゲン溶液の製造を可能にすることもまた興味深い。
【０００６】
天然コラーゲンの特性を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンをもたらす方法を提供することは有利だろう。
【発明の概要】
【０００７】
コラーゲン製剤を製造する方法は、コラーゲンを化学的に修飾して生理的ｐＨでコラーゲンを可溶性とすることと、当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを任意に乾燥することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを密閉単位に包装することと、当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを放射線量、例えば約２５ＫＧｙ以下のベータ線によって照射することとを含む。実施形態において、コラーゲンは、コラーゲンを水溶性脂肪族アルコールと反応させることによって化学的に修飾され、当該コラーゲンをエステル化する。
【０００８】
実施形態において、コラーゲン製剤を製造する方法は、コラーゲンを化学的に修飾し、生理的ｐＨにおいて当該コラーゲンを可溶性とすることと、当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを任意に乾燥することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを包装することと、当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを放射線量、例えば約２５ＫＧｙ以下のベータ線によって照射することとを含む。
【０００９】
実施形態において、当該化学的に修飾され、中和され、乾燥したコラーゲンは、当該照射工程の前に、約３０℃以下で保管される。
【００１０】
実施形態において、当該照射はベータ線、例えば約６ＫＧｙから約２５ＫＧｙの線量、好ましくは約６ＫＧｙから約１５ＫＧｙの線量、より好ましくは約１０ＫＧｙから約１５ＫＧｙの線量で照射される。実施形態において、ベータ線による照射は、約１５ＫＧｙ未満の線量、好ましくは約１０ＫＧｙ未満の線量で照射される。
【００１１】
実施形態において、照射は、複数の周期の照射線量として行われ、総照射線量は、約２５ＫＧｙ以下である。
【００１２】
実施形態において、照射は０℃未満で行われる。
【００１３】
実施形態において、コラーゲンを化学的に修飾することは、例えば、コラーゲンを水溶性の脂肪族アルコールと反応させることによってコラーゲンをエステル化することを含む。
【００１４】
実施形態において、包装することは、化学的に修飾され、中和されたコラーゲンをシリンジに密封することを含む。
【００１５】
本発明の別の側面は、生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤である。実施形態において、コラーゲンは、少なくとも部分的に完全な三重らせん構造を有する。実施形態において、コラーゲンはブタ由来である。
【００１６】
本発明の別の側面は、上述のコラーゲン製剤から形成される線維である。本発明の別の側面は、上述のコラーゲン製剤を含む組織密封剤または組織接着剤である。組織密封剤または組織接着剤はさらに酸化デンプンを含んでよい。
【００１７】
本発明の別の側面は、生物活性物質と組み合わせた上述のコラーゲン製剤である。
【００１８】
本発明の別の側面は、注射可能であり、且つシリンジに含まれる上述のコラーゲン製剤である。
【００１９】
本発明の別の側面は、一以上の骨形態形成タンパク質を含み、注射可能であり、且つシリンジに含まれる上述のコラーゲン製剤を含む骨充填剤（bone filler）である。
【００２０】
本発明の別の側面は、生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤を、生物活性物質を含む滅菌組成物と組み合わせ、組織への適用に適した製剤を提供することを含む方法である。本発明は、ｉ）生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤と、ｉｉ）生物活性物質を含む滅菌組成物とを含む製剤に関する。
【００２１】
実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、注射可能に処方され、シリンジに詰められてよい。実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、組織密封剤および組織接着剤としての使用に適するよう処方される。実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、一以上の骨形態形成タンパク質を含むよう処方され、骨または軟骨の障害の修復に適したものになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていない酸性コラーゲンのＤＳＣ（示差走査熱量測定）プロファイルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けた酸性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けた酸性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていないエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていない中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けた中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けた中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図４】図４は、β線照射を受けたコラーゲン、特に：β線照射を受けた中性コラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＥ０００１５および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１６）；β線照射を受けた酸性コラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１７および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１８）；β線照射を受けたエステル化されたコラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１９および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００２０）；β線照射を受けていないコラーゲン（コントロールサンプルＣＨＥ００３４１）；およびβ線照射を受けていないエステル化されたコラーゲン（コントロールサンプルＲＨＨ０００３２）の電気泳動パターンを示す。
【図５】図５は、γ線照射を受けたコラーゲン、特に：γ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン（８−９ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ００００８、ドライアイス中６−８ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ００００９、１４−１５ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１０、ドライアイス中１１−１４ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１１、２９−３４ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１２、およびドライアイス中２８−３０ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１３）の電気泳動パターンを示す。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明に従うコラーゲン製剤は、例えば化学的に修飾されたコラーゲンを、滅菌を達成するために十分なベータ線照射線量に曝露することにより製造される。まず、生理的ｐＨおよび体温で可溶性のコラーゲンを提供するために、コラーゲン材料を化学的に修飾する。次に、生理的ｐＨで中和し、終末的に滅菌する前に任意に乾燥する。コラーゲンを製造および照射する方法を、以下でさらに詳しく記載する。
【００２４】
いずれかのタイプのコラーゲンが用いられてよく、これは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ、少数派のコラーゲンの型、またはこれらのいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定されない。コラーゲンは、いずれかの供給源、例えばヒト、ウシまたはブタなどに由来してよく、皮膚、腱、筋肉、結合組織、または高いコラーゲン含有率を有する他のいずれかの天然に発生する構造要素に由来してよい。コラーゲンは、組み換え技術によって、またはそうでなければ、例えば組織工学によって製造された合成コラーゲンであってもよい。実施形態において、タイプＩのブタまたはウシコラーゲンが用いられる。他の実施形態において、異なる動物起源、例えば、ウシ、ブタ、ヒトなどに由来するタイプＩおよびタイプＩＩＩコラーゲン、またはそれらのタイプのいずれかの割合での混合物が用いられる。
【００２５】
コラーゲンとは、コラーゲンの全ての形態を言い、これは加工された、あるいはそうでなければ修飾されたものを含む。天然のコラーゲンは、非らせん状の末端部分を有する三重らせん構造に巻かれた３本のポリペプチド鎖で構成される、長く硬い（rigid）棒状構造の線維状タンパク質として特徴付けられる。実施形態において、用いられるコラーゲンは、完全な三重らせん構造を有し、溶液中で非常に高い粘度を示し、熱変性したコラーゲンよりも酵素による分解を受けにくいコラーゲン製剤を提供する。実施形態において、通常ゼラチンとして既知であり、少なくとも部分的にそのらせん構造を失った熱変性したコラーゲンが用いられてよい。
【００２６】
アテロペプチドまたはテロペプチド含有コラーゲンが用いられてもよい。コラーゲンの非らせん末端部分であるテロペプチドは、コラーゲン分子のアミノ末端およびカルボキシ末端からランダムコイルとして伸長する。テロペプチドは、分子内および分子間架橋のための主要な部位として働き、免疫原生部位である。実施形態において、それらの低減した免疫原生のため、ウシまたはブタなどの動物供給源由来のアテロコラーゲンが用いられる。
【００２７】
用いられるコラーゲンの免疫原生を最小化するため、テロペプチドが除去されてよい。アテロコラーゲンは、当該分野の当業者に既知のいずれかの技術によって製造され、これはタンパク質分解酵素を用いた方法を含むがこれに限定されない。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ４，１６４，５５９においてＭｉｙａｔａらによって記載される通り、ペプシンが用いられてよく、その全内容がこの引用によってここに組み込まれる。要するに、この技術は、コラーゲン原料をペプシンによって可溶化すること、およびｐＨ約１０．０でアルカリ処理によって酵素活性を不活性化した後に可溶性コラーゲンをｐＨ約７．０で沈殿させることに関係する。コラーゲンは、ｐＨ約２．０から約４．０の酸性水中で再溶解およびｐＨ約７．０で再沈殿を繰り返すことによって精製される。
【００２８】
例えば、生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンを製造するために、例えば、皮膚または腱などのコラーゲン原料またはコラーゲン供給源を洗浄し、非コラーゲン成分、例えば、毛髪、脂肪、炭水化物、ムコ多糖類などを除去する。次にコラーゲン原料を可溶化する。生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンは、上述の通り、生理的ｐＨおよび体温で可溶性となるような方法で、既知の方法、例えば酸抽出またはペプシンなどのタンパク質分解酵素などによって、化学的に修飾されるコラーゲンを言う。特定のコラゲナーゼではない、多くのタンパク質分解酵素が用いられ、変性させることなくコラーゲンを可溶化させてよい。ペプシンに加え、例えばトリプシン、キモトリプシンまたはパパインが用いられてよい。
【００２９】
生理的ｐＨで可溶性コラーゲンを提供するコラーゲンの化学的修飾は、例えば、水溶性脂肪族アルコール、例えば、メタノール、エタノールなどの酸性化アルコールによる反応を含む、何れかの既知の方法によるコラーゲンのカルボキシル基のエステル化によって達成されてよい。コラーゲンを化学的に修飾し、生理的ｐＨでコラーゲンを可溶にするための適切な技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，１６４，５５９に記載され、その全体の内容は、この引用によってここに組み込まれる。例えば、タイプＩアテロコラーゲンのエチル化は、それらをｐＨ約５．５〜約９．０、特に７．０〜７．５の範囲で可溶にする。非修飾アテロコラーゲンは、５．０未満の酸性ｐＨ、または９．０を超えるアルカリ性ｐＨにおいてのみ可溶性である。
【００３０】
生理的ｐＨにおいて可溶性のコラーゲンが一旦得られると、それは、例えば約６．０〜約８．０のｐＨ、実施形態においては生理的ｐＨで中和される。生理的ｐＨとは、ヒト体液内で通常生ずる比較的狭い範囲、一般的には、約７．０〜約７．５の範囲にあるｐＨを言う。
【００３１】
次に生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンは、何れかの既知の関連する方法によって任意に乾燥されてよく、これは真空下オーブン中で乾燥すること、凍結乾燥すること、およびアセトンなどの溶媒によって脱水することを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
任意に乾燥されたコラーゲンは、前記コラーゲンの最終的な使用に関連したいずれかの適切な既知の密閉または閉鎖された単位で包装される。包装単位は、シリンジ、バイアル、パウチ、プレート、ジャー、チューブ、および製品の最終的使用に適した他のいずれかの包装を含む。終末的に包装されたコラーゲンは次に、それがベータ線照射によって滅菌されるまで３０℃未満の温度で保管されてよい。
【００３３】
滅菌は一般的に、終末的に包装されたコラーゲンについて放射線照射によって行われる。滅菌とは、コラーゲンが保管および／または流通する条件においてコラーゲン中で増殖可能な微生物の数を低減し、且つ標準化された滅菌プロトコールおよび／または妥当性検査により決定されたレベル以下の単一の工程、または工程の組み合わせによって処理されたコラーゲンを言う。終末的な滅菌とは、使用前の保管および流通のための最終的な包装中で、上で定義された通り滅菌されたコラーゲンを言う。
【００３４】
滅菌処理は、例えば、いずれかの既知の適切な方法に従って、室温または室温よりも低いいずれかの温度で行われる。室温とは、放射線照射施設で一般的に記録される温度を言い、実施形態において、室温は５０℃未満、より一般的には２５℃±５℃である。実施形態において、滅菌はドライアイス上、０℃未満で達成される。
【００３５】
滅菌は、滅菌総線量２５ｋＧｙ以下で行われる。実施形態において、滅菌は、滅菌総線量１５ＫＧｙ未満のベータ線照射により行われる。滅菌線量は、総累計線量が上述の値以下であること以外は、一以上の照射サイクルを含んでよい。
【００３６】
生理的ｐＨで可溶性のコラーゲン、特にエステル化されたコラーゲンは、ベータ線照射滅菌処理によって大幅には分解されない。コラーゲンは、当初の性質（例えば、分子量プロファイル、粘度、熱的性質など）の大部分を保持している。例えば、エチル化されたタイプＩアテロコラーゲンは、ベータ線照射による滅菌の後、生理的ｐＨで可溶性のままである。エチル化されたタイプＩアテロコラーゲンの溶液は、ベータ線照射の前と同様に粘着性である。対照的に、タイプＩコラーゲンは、もはや可溶性でない程度にまで分解される。
【００３７】
ベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンの使用は、関連分野の専門家が、天然コラーゲンと同様の特徴を有する終末的に滅菌されたコラーゲンを使用することを有利に考慮するかもしれないどんな場合も、制限無く想定されてよい。ベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンがどのように使用されるかという非限定的な例は、密封剤、接着剤、組織および器官の治癒および再生のためのマトリックス、創傷の包帯剤、造骨製剤、軟骨形成製剤、薬物送達のためのマトリックス、止血製品、化粧品製剤、皺および唇の充填剤、スキンクリームの成分、ならびに細胞培養のための培養液、微生物培養のための培養液、インビトロおよびインビボ試験のための試薬を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
実施形態において、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンは、線維形成および前記線維から作られるデバイスにおいて用いられてよい。本発明のコラーゲンから作られ、ここに記載される方法に従って製造されるマトリックス、足場および網目は、内科的および外科的用途において特に有用な性質を有する。例えば、用途には、外科的縫合、血管移植、カテーテル、および一般的に、外科的プロテーゼおよび人工臓器が含まれるが、これらに限定されない。コラーゲンから線維を作る技術は、当該分野の当業者の認識範囲内であり、この引用によってその全体がここに組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎ Ｎｏｓ．６，９９７，２３１および６，３６１，５５１に開示される技術を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
処理の後および使用の直前に、ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンは、シリンジ、チューブ、または適切なプランジャー、噴霧器、もしくは針またはノズルなどを経てコラーゲン内容物を押し出すよう設計されたシステムを具備する他の容器に含まれる、均質または不均質なペースト、ゲル、溶液または、懸濁液の形態で用いられてよい。コラーゲンは、注射されるか、外套針を経て外科的に適用されるか、あるいは直接創傷の表面に適用される。コラーゲンペースト、ゲル、溶液、または懸濁液は、完全に可溶性のままであるため、その終末的な滅菌の前後で同様の粘度を有する。
【００４０】
実施形態において、少なくとも一つの生物活性物質が、本発明の組成物において使用されるためにコラーゲンと組み合わされてよい。これらの実施例において、コラーゲン製剤はまた、生物活性物質の送達のための賦形剤として働く。「生物活性物質」の語は、ここで用いられる通り、その最も広い意味において用いられ、臨床的用途を有するいずれかの物質または物質の混合物を含む。結果として、生物活性物質はそれ自体、薬学的活性を有していても、あるいは例えば染料または香料のように薬学的活性を有していなくてもよい。あるいは、生物活性物質は、治療的または予防的効果を提供するいずれかの物質、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を及ぼすか、または関与する化合物、付着防止剤、免疫応答などの生物学的作用を誘発することができるか、または一以上の生物学的方法において他の何れかの役割を果たしてよい化合物であってよい。
【００４１】
実施形態において、使用前に生物活性物質を、照射を受けたエステル化されたコラーゲンに添加してよい。前記実施形態において、生物活性物質は、既知のタイプの無菌包装、例えばシリンジ内に別に提供されてよい。一例として、滅菌コラーゲンのシリンジの内容物を、滅菌の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むシリンジの内容物と混合し、骨の修復に適した製剤を提供してよい。
【００４２】
他の実施形態において、一以上の生物活性物質がコラーゲンの滅菌前にコラーゲン製剤に添加される。
【００４３】
本発明に従って利用されてよい生物活性物質の種類の例は、付着防止剤、抗菌剤、鎮痛剤、解熱剤、麻酔剤、抗てんかん剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、心臓血管薬、診断用薬、交感神経様作用薬、コリン様作動薬、抗ムスカリン薬、鎮痙薬、ホルモン、成長因子、筋肉弛緩剤、アドレナリン作働性ニューロン遮断薬、抗腫瘍薬、免疫原性剤、免疫抑制剤、胃腸薬、利尿薬、ステロイド、脂質、リポ多糖類、多糖類および酵素を含む。生物活性剤との組み合わせが用いられることも意図される。
【００４４】
付着防止剤を用いて、移植可能な医療用具と標的組織でない周囲の組織との間の付着を防止してよい。本発明の組成物に含まれてよいこれらの物質のいくつかの例は、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の組成物中に生物活性物質として含まれてよい適切な抗菌剤は、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテルとしても既知のトリクロサン、クロルヘキシジン、およびクロロヘキシジンアセテート、クロロヘキシジングルコナート、クロロヘキシジンハイドロクロリドとクロロヘキシジンサルフェートを含むその塩、銀、および酢酸銀、安息香酸銀、酢酸銀、クエン酸銀、ヨウ素酸銀、ヨウ化銀、乳酸銀、ラウリン酸銀、硝酸銀、酸化銀、パルミチン酸銀、タンパク銀とスルファジアジン銀を含むその塩、ポリミキシン、テトラサイクリン、トブラマイシンやゲンタマイシンなどのアミノグルコシド、リファンピシン、バシトラシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、ミコナゾール、オキソリン酸、ノルフロキサシン、ナリジクス酸、ペフロキサシン、エノキサシンやシプロフロキサシンなどのキノリン、オキサシリンやピプラシルなどのペニシリン、ノノキシノール９、フシジン酸、セファロスポリン、ならびにこれらの組み合わせを含む。さらに、例えばウシラクトフェリンやラクロフェリシンＢなどの抗菌性タンパク質およびペプチド、ならびにフカンや誘導体などの抗菌性多糖類が、本発明の生物活性コーティング中に生物活性物質として含まれてよい。
【００４６】
本発明に従う組成物中に生物活性物質として含まれてもよい他の生物活性物質は：局所麻酔薬；非ステロイド避妊薬；副交感神経興奮薬；精神治療薬；精神安定薬；鬱血除去薬；催眠鎮静薬；ステロイド；スルホンアミド；交感神経様作用薬；ワクチン；ビタミン；抗マラリア薬；抗偏頭痛薬；Ｌ−ドーパなどの抗パーキンソン病薬；鎮痙薬；抗コリン作用薬（例えば、オキシブチニン）；鎮咳薬；気管支拡張剤；冠動脈拡張薬やニトログリセリンなどの心臓血管薬；アルカロイド；鎮痛薬；コデイン、ジヒドロコデイノン、メペリジン、やモルホリンなどの麻酔薬；サリチル酸塩、アスピリン、アセトアミノフェン、ｄ−プロポキシフェンなどの非麻酔薬；ナルトレキソンやナロキソンなどのオピオイドレセプターアンタゴニスト；抗癌剤；抗けいれん薬；制吐薬；抗ヒスタミン薬；ホルモン剤、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、非ホルモン剤、アロプリノール、インドメタシン、フェニルブタゾンなどの抗炎症剤；プロスタグランジンや細胞毒性薬；エストロゲン；抗菌剤；抗生剤；抗真菌剤；抗ウイルス剤；抗凝結剤；抗けいれん薬；抗うつ薬；抗ヒスタミン剤；および免疫薬を含む。
【００４７】
本発明の組成物に含まれてよい適切な生物活性物質の他の例は、ウイルスおよび細胞、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、類似体、ムテイン、およびその活性断片、例えば、免疫グロブリン、抗体、サイトカイン（例えば、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン）、血液凝固因子、造血因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、インターフェロン（３−ＩＦＮ（ａ−ＩＦＮおよびｙ−ＩＦＮ）、エリスロポエチン、ヌクレアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（例えば、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ）、インスリン、抗腫瘍剤および腫瘍抑制因子、血液タンパク質、ゴナドトロピン（例えば、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧなど）、ホルモンおよびホルモンの類似体（例えば、成長ホルモン）、ワクチン（例えば、腫瘍性、細菌性およびウイルス性抗原）；ソマトスタチン；抗原；血液凝固因子；成長因子（例えば、神経成長因子、インスリン様成長因子）；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの骨または軟骨の修復に有用な因子；タンパク質阻害剤、タンパク質アンタゴニストおよびタンパク質アゴニスト；アンチセンス分子などの核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ；オリゴヌクレオチド；ポリヌクレオチドならびにリボソームを含む。
【００４８】
以下の非限定的な例は、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの性質と、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンとベータ線照射を受けた酸性および中性コラーゲンとの比較、ならびにガンマ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンとの比較を示す。
【００４９】
例１
コラーゲンの調製
タイプＩブタコラーゲンをブタ真皮から抽出し、種々の技術によって可溶化し、酸性コラーゲン、中性コラーゲンおよびエステル化されたコラーゲンを製造する：
１°）酸性コラーゲン
タイプＩブタコラーゲンを酸性ｐＨで、またはペプシン消化によって可溶化し、次に慣習的な技術を用いた生理食塩水沈殿によって精製する。ＮａＣｌを添加し、次に８０％から１００％まで増加する濃度を有するアセトンの水溶液によって得られる沈殿物を洗浄および乾燥することにより、乾燥コラーゲン線維をコラーゲンの酸性溶液の沈殿によって得る。
【００５０】
２°）中性コラーゲン
上記１°）に記載される通り得られるタイプＩブタコラーゲンを、３０ｇ／ｌの濃度で水に可溶化する。その後、希釈水酸化ナトリウム溶液を添加することにより、コラーゲン製剤のｐＨをｐＨ７．０〜７．５の間に中和する。次にコラーゲンをアセトン洗浄または凍結乾燥のいずれかによって乾燥する。
【００５１】
３°）エステル化されたコラーゲン
上記１°）の通り得られた乾燥コラーゲン線維２０ｇを密閉容器中、室温で７日間、０．１Ｎ ＨＣｌを含む無水エタノール１リットルに浸漬する。コラーゲン添加前、ＨＣｌを含むエタノールの脱水は、過剰な無水硫酸ナトリウムとともに断続的に攪拌することによって行われる。エチル化後、溶媒を除去する。
【００５２】
当該エステル化されたコラーゲン線維をアセトンによって数回洗浄する。次に、それらを乾燥し、水中で最終濃度１％ｗ／ｖに溶解する。当該溶液のｐＨを、７．０〜７．５の間に調節し、コラーゲンを凍結乾燥する。
【００５３】
コラーゲンの滅菌
上記の通り得られた酸性コラーゲン、中性コラーゲン、およびエステル化されたコラーゲンを個々にシリンジに充填する。次にシリンジを密封されたバッグに詰める。コラーゲンのシリンジを、６ＫＧｙから２５ＫＧｙの範囲の異なる線量でベータ線照射によって滅菌する。
【００５４】
上述のエステル化コラーゲンもまた、ドライアイス上、０℃未満の温度で、６ＫＧｙから２５ＫＧｙの範囲の異なる線量でベータ線照射によって滅菌する。
【００５５】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの分析
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンについて個々に、またベータ線照射を受けた酸性コラーゲン、中性コラーゲンおよびエステル化されたコラーゲンについて比較して、ベータ線照射を受けたコラーゲンの性質を示す。
【００５６】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの滅菌性
欧州薬局方の滅菌性基準にしたがって、上述の通り調製した照射を受けたエステル化コラーゲンの異なるバッチについて滅菌性試験を行った。試験された全てのバッチは表１に示す通り、無菌であることがわかった：
【表１】
【００５７】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの溶解度および粘度
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの溶解度を以下の通り、評価した：
まず、乾燥コラーゲン１５０ｍｇ（残留水分含有率：１０％と仮定）を中性ｐＨで１００ｍｌの水に混合することにより、コラーゲンを可溶化した。当該試料を１００００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清中のコラーゲン総量は、ビウレット法によって添加され、遠心分離の前に当該試料中に最初に存在したコラーゲン総量と比較した。表２に示す通り、照射を受けたエステル化コラーゲンは、照射を受けていないエステル化コラーゲンと同程度、可溶性であった。
【表２】
【００５８】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの種々のバッチの塑性粘度および降伏応力を、溶液中、２％ｗ／ｖの濃度、＋２５℃でビンガムモデル（Ｂｉｎｇｈａｍ’ｓ ｍｏｄｅｌ）に従って測定した。数値は、３００〜６００ｒｐｍでＴＶｅ−０５Ｌａｍｙ粘度計によって得られた。表３に示される通り、数値は、６ＫＧｙおよび１０ＫＧｙのベータ線照射の前後で同じ範囲であった。照射を受けたエステル化されたコラーゲンは、６ＫＧｙおよび１０ＫＧｙでベータ線照射した場合、完全に可溶性のままであり、２５ＫＧｙでは部分的にのみ可溶性であった。
【表３】
【００５９】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの比較溶解度および粘度
ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンおよびベータ線照射を受けた酸性コラーゲンの種々のバッチの粘度を、上述の通り、溶液中、２％ｗ／ｖの濃度、＋２５℃で測定した。粘度測定もまた、中性コラーゲンについて＋５０℃の温度まで熱し、ゼラチンを得た後行った。
【００６０】
ベータ線照射を受けた中性コラーゲンは、酸性ｐＨにおいて、あるいは＋４２℃に加熱した後中性ｐＨにおいて、いずれのベータ線照射の線量でも不溶性であった。加熱後、溶液は、４％ｗ／ｖ以下の濃度でも、室温でゲルを形成しなかったが、一方、加熱後、ベータ線照射を受けていない中性コラーゲンは室温で１％ｗ／ｖ未満の濃度でゲルを提供した。照射を受けた酸性コラーゲンは可溶性であり、＋４２℃に加熱した後、ゲル化しなかった。照射を受けたエステル化コラーゲンは、照射を受けていないエステル化コラーゲンと同程度可溶性であった。
【表４】
【００６１】
ベータ線照射したコラーゲンの熱的性質
Ｍｉｃｒｏ−ＤＳＣＩＩＩ装置（Ｔｉａｎ−Ｃａｌｖｅｔ Ｔｙｐｅ）を用い、速度０．５ Ｋ／ｍｉｎで１５℃から６５℃まで示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって熱的性質を測定した。５００μｌの脱塩水中で１５ｍｇのコラーゲン線維を膨潤させることにより調製したコラーゲン線維のウェット・サンプルから、読み込みを得た。
【００６２】
１０ＫＧｙ以下のベータ線照射後、エステル化されたコラーゲンについて熱的性質は実質的に変化しなかったが、一方、照射を受けた酸性および中性コラーゲンについては低下し、後者についてはより大きく低下した。
【００６３】
以下の表５に示される結果は、ベータ線照射による熱的性質の変化をより明確に示している。
【表５】
【００６４】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの電気泳動特性
コラーゲンの電気泳動は、ランニングバッファＸＴトリシンランニングバッファ２０ｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いることによって、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（登録商標）ＸＴ７％トリスアセテートのプレキャストゲル上で行われた。サンプル試料には、ＸＴ還元剤（ＢｉｏＲａｄ）が含まれていた。ＢｉｏＲａｄの説明書に従い、ゲルをＢｉｏＳａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＢｉｏＲａｄ）で染色した。
【００６５】
ベータ線照射を受けた中性コラーゲンは、明白なバンドを持たないが、広範囲にわたる痕跡を有する大きく変化した電気泳動特性を示した。エステル化されたコラーゲンおよび酸性コラーゲンの電気泳動特性は、１０ＫＧｙ以下の線量のベータ線照射後、実質的に変化しなかった。
【００６６】
機能性試験：ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンに基づく試料の付着強度
外科的および／または治療的用途のため、特に、生物学的組織を互いに、または移植された生体材料と接着するための付着性コラーゲンに基づく組成物は、ＴａｒｄｙらによってＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１６５，４８８に記載される通り調製されてよく、この引用によって、この全体の内容はここにおいて組み込まれる。要するに、一般的に組成物は、酸化デンプンの水溶液、生分解性多糖類、および加熱されたコラーゲンの水溶液（即ち、ゼラチン）を含む。
【００６７】
酸化デンプンとコラーゲンを一緒に混合することによって、中性ｐＨで空気の泡を取り込むことによってまたは取り込まないことによって、当該組成物を得る。混合することによって、組織および／または生物材料に迅速に適用されるゲルを提供し、接着を達成する。接着性は、酸化デンプンアルデヒドとコラーゲンの遊離アミノ酸基との化学反応の組合せ、ならびにコラーゲン特有の性質（例えば、粘度または疎水性親水性特性）の結果である。
【００６８】
機能性試験のため、加熱されたコラーゲンは、６ＫＧｙの線量でベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンに置き換えた。
【００６９】
濃度８％以下で、熱を加えることなく、コラーゲンをあるシリンジから他のシリンジへと１分未満、数回行ったり来たり移動させることにより、照射を受けたコラーゲンの完全に半透明な溶液を得た。酸化デンプンと反応させる場合、照射を受けたコラーゲンおよびデンプンは架橋し、粘性の高い泡を形成する。
【００７０】
エクスビボの接着試験
脱脂したブタ真皮の正方形、２５ ｍｍ×２５ ｍｍを、以下に記載する試験に供される生成物（試料Ａ、Ｂ、Ｃ）とともに接着する。次に、それらを＋３７℃で４５分インキュベートする。接着強度は、卓上材料試験機器（Ｔｉｎｉｕｓ Ｏｌｓｅｎ， ＥＣＭＥ２３０）を用いることにより、一方の真皮の断片を他方からはがすことによって測定する。剥離カーブをＱＭａｔ−Ｐｒｏソフトウエアによって分析する。
【００７１】
生成物の調製
試料Ａ：ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン−バッチＲＧＫ０００２６−を４％ｗ／ｖの濃度で可溶化した。第一のシリンジ中の当該溶液２ｍｌを、あるシリンジから別のシリンジへと数回言ったり来たりと移動させることにより、第二のシリンジ中で希釈した０．７ｍｌの１．５％ｗ／ｖの酸化デンプン−バッチＺＦＥ００５２３ｘ２−と混合した。
【００７２】
試料Ｂ：ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン−バッチＲＧＫ０００２６−が、酸化デンプンを用いることなくそれだけで、濃度８％ｗ／ｖで用いられた。
【００７３】
試料Ｃ：Ｐｒｅｖａｄｈ（登録商標） Ｆｏａｍは、ＳＯＦＲＡＤＩＭ市販キットからの使用説明書から調製した。濃度１６％ｗ／ｖの加熱したコラーゲン２ｍｌ−バッチＳＣＣ２３３３０−を、濃度３％ｗ／ｖの酸化デンプン０．７ｍｌ−バッチＳＡ０２４０１６−と架橋した。
【００７４】
接着強度
接着強度の結果を以下の表６に示す。市販の製品Ｐｒｅｖａｄｈ（登録商標） Ｆｏａｍと比較した場合、エステル化コラーゲンは酸化デンプンと架橋し、非常に有効に働く接着製品を製造した。しかし、架橋剤を用いずそれだけでは、エステル化コラーゲンの接着特性は低かった。
【００７５】
接着強度が、より高濃度のコラーゲン（１６％ｗ／ｖ）と架橋剤（３％ｗ／ｖ）によってその接着性を獲得するＰｒｅｖａｄｈ Ｆｏａｍの接着強度の６０％に達したので、酸化デンプンと架橋したエステル化されたコラーゲンの接着性は満足なものであった。したがって、市販のＰｒｅｖａｄｈ Ｆｏａｍ製品と比較してわずか２５％のコラーゲンおよび５０％の架橋剤を有する本発明のコラーゲン製剤は、市販製品の接着強度の６０％を提供した。
【表６】
【００７６】
エステル化されたコラーゲンは、酸性および中性コラーゲンと比較した場合、２５ＫＧｙ未満の線量のベータ線照射によって安全に滅菌される唯一のコラーゲンであった。分析結果は、照射を受けたエステル化された特性は、照射を受けていない対応物と同様であることを示した。
【００７７】
例２
コラーゲンの調製
エステル化されたコラーゲンについては、例１で上述した通りコラーゲンを調製した。
【００７８】
コラーゲンの滅菌
エステル化されたコラーゲンのシリンジを例１で上述した通り調製したが、室温または０℃未満のいずれかで、ドライアイス中、６ＫＧｙから３０ＫＧｙの範囲の種々の線量で、ガンマ線照射することにより滅菌した。
【００７９】
ガンマ線照射を受けたコラーゲンの分析
エステル化されたコラーゲンは、いくらかの粘度を示す半透明の溶液を提供するが、γ線照射の線量が増加すると、完全に分解されていると想定される２５ＫＧｙを超える線量で照射を受けたコラーゲンを除いて、明らかにその粘度が低下する。これは、電気泳動分析と一致し、ガンマ線照射線量が増加することにより、より明らかな分解の兆候を示す。
【００８０】
ガンマ線照射は、エステル化されたコラーゲンの当初の特性を保つことについてベータ線照射よりも効果が少ない。ガンマ線照射によって滅菌された場合、約１０ＫＧｙの低い線量でさえ、エステル化コラーゲンは明らかに変化した。エステル化コラーゲンの滅菌試料を調製するためにガンマ線を照射することは、ベータ線を照射することに比べて有利ではない。
【００８１】
ここで開示される実施形態に種々の変更が行われてよいことが理解されるだろう。したがって上述の記載は、好ましい実施形態の例示に過ぎず、限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲および精神の中で他の修正を想定するだろう。前記修正および変更は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、コラーゲン組成物およびその製造方法に関する。より詳細には、天然コラーゲンの当初の性質のほとんど、特に粘度特性を維持しながらも、中性ｐＨで完全に可溶性のままである、終末的に滅菌されたコラーゲンについて記載する。
【０００２】
この開示において、「可溶性」の語がコラーゲンに関して使用されるとき、コラーゲンが水に可溶性であることを意味する。
【０００３】
コラーゲンの製造および滅菌技術は公知である。滅菌は、コラーゲンの製造方法の最終段階の前に行われる場合がある。しかしながら、このような場合に、製造方法の最終段階の間、厳格に滅菌状態を維持することは困難である。
【０００４】
コラーゲンの終末的な滅菌を用いるコラーゲンの製造方法において、困難も生じる。前記方法によっては、天然コラーゲンの生理学的性質、効力および有効性を保持しながら中性ｐＨで完全に可溶性のコラーゲンが製造されないことが多い。以前に開示された終末的に滅菌されたコラーゲン組成物は、天然コラーゲンの性質を維持するよりむしろ、架橋され、変性され、および／または中性ｐＨで完全には可溶性でない。
【０００５】
しかし、例えば、コラーゲンの溶解度が重要となるかもしれない接着剤の成分として使用するために、天然コラーゲンの性質を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンを近い将来得ることは、興味深い。さらに、天然状態の特性を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンを得て、例えば、皺や尿失禁の治療のため、欠陥（例えば、骨の欠陥）を満たすために使用できる注射可能な製品としての前記溶液の使用を可能にする粘度を有する、滅菌されたコラーゲン溶液の製造を可能にすることもまた興味深い。
【０００６】
天然コラーゲンの特性を保持しながらも中性ｐＨで完全に可溶性の終末的に滅菌されたコラーゲンをもたらす方法を提供することは有利だろう。
【発明の概要】
【０００７】
コラーゲン製剤を製造する方法は、コラーゲンを化学的に修飾して生理的ｐＨでコラーゲンを可溶性とすることと、当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを任意に乾燥することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを密閉単位に包装することと、当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを放射線量、例えば約２５ＫＧｙ以下のベータ線によって照射することとを含む。実施形態において、コラーゲンは、コラーゲンを水溶性脂肪族アルコールと反応させることによって化学的に修飾され、当該コラーゲンをエステル化する。
【０００８】
実施形態において、コラーゲン製剤を製造する方法は、コラーゲンを化学的に修飾し、生理的ｐＨにおいて当該コラーゲンを可溶性とすることと、当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを任意に乾燥することと、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを包装することと、当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを放射線量、例えば約２５ＫＧｙ以下のベータ線によって照射することとを含む。
【０００９】
実施形態において、当該化学的に修飾され、中和され、乾燥したコラーゲンは、当該照射工程の前に、約３０℃以下で保管される。
【００１０】
実施形態において、当該照射はベータ線、例えば約６ＫＧｙから約２５ＫＧｙの線量、好ましくは約６ＫＧｙから約１５ＫＧｙの線量、より好ましくは約１０ＫＧｙから約１５ＫＧｙの線量で照射される。実施形態において、ベータ線による照射は、約１５ＫＧｙ未満の線量、好ましくは約１０ＫＧｙ未満の線量で照射される。
【００１１】
実施形態において、照射は、複数の周期の照射線量として行われ、総照射線量は、約２５ＫＧｙ以下である。
【００１２】
実施形態において、照射は０℃未満で行われる。
【００１３】
実施形態において、コラーゲンを化学的に修飾することは、例えば、コラーゲンを水溶性の脂肪族アルコールと反応させることによってコラーゲンをエステル化することを含む。
【００１４】
実施形態において、包装することは、化学的に修飾され、中和されたコラーゲンをシリンジに密封することを含む。
【００１５】
本発明の別の側面は、生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤である。実施形態において、コラーゲンは、少なくとも部分的に完全な三重らせん構造を有する。実施形態において、コラーゲンはブタ由来である。
【００１６】
本発明の別の側面は、上述のコラーゲン製剤から形成される線維である。本発明の別の側面は、上述のコラーゲン製剤を含む組織密封剤または組織接着剤である。組織密封剤または組織接着剤はさらに酸化デンプンを含んでよい。
【００１７】
本発明の別の側面は、生物活性物質と組み合わせた上述のコラーゲン製剤である。
【００１８】
本発明の別の側面は、注射可能であり、且つシリンジに含まれる上述のコラーゲン製剤である。
【００１９】
本発明の別の側面は、一以上の骨形態形成タンパク質を含み、注射可能であり、且つシリンジに含まれる上述のコラーゲン製剤を含む骨充填剤（bone filler）である。
【００２０】
本発明の別の側面は、生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤を、生物活性物質を含む滅菌組成物と組み合わせ、組織への適用に適した製剤を提供することを含む方法である。本発明は、ｉ）生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤と、ｉｉ）生物活性物質を含む滅菌組成物とを含む製剤に関する。
【００２１】
実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、注射可能に処方され、シリンジに詰められてよい。実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、組織密封剤および組織接着剤としての使用に適するよう処方される。実施形態において、ここで記載されるコラーゲン製剤は、一以上の骨形態形成タンパク質を含むよう処方され、骨または軟骨の障害の修復に適したものになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていない酸性コラーゲンのＤＳＣ（示差走査熱量測定）プロファイルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けた酸性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けた酸性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていないエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、コントロールとしてのβ線照射を受けていない中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６ＫＧｙでβ線照射を受けた中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１０ＫＧｙでβ線照射を受けた中性コラーゲンのＤＳＣプロファイルを示す。
【図４】図４は、β線照射を受けたコラーゲン、特に：β線照射を受けた中性コラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＥ０００１５および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１６）；β線照射を受けた酸性コラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１７および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１８）；β線照射を受けたエステル化されたコラーゲン（６ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００１９および１０ＫＧｙでβ線照射を受けたサンプルＲＨＩ０００２０）；β線照射を受けていないコラーゲン（コントロールサンプルＣＨＥ００３４１）；およびβ線照射を受けていないエステル化されたコラーゲン（コントロールサンプルＲＨＨ０００３２）の電気泳動パターンを示す。
【図５】図５は、γ線照射を受けたコラーゲン、特に：γ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン（８−９ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ００００８、ドライアイス中６−８ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ００００９、１４−１５ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１０、ドライアイス中１１−１４ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１１、２９−３４ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１２、およびドライアイス中２８−３０ＫＧｙでγ線照射を受けたサンプルＲＧＩ０００１３）の電気泳動パターンを示す。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明に従うコラーゲン製剤は、例えば化学的に修飾されたコラーゲンを、滅菌を達成するために十分なベータ線照射線量に曝露することにより製造される。まず、生理的ｐＨおよび体温で可溶性のコラーゲンを提供するために、コラーゲン材料を化学的に修飾する。次に、生理的ｐＨで中和し、終末的に滅菌する前に任意に乾燥する。コラーゲンを製造および照射する方法を、以下でさらに詳しく記載する。
【００２４】
いずれかのタイプのコラーゲンが用いられてよく、これは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ、少数派のコラーゲンの型、またはこれらのいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定されない。コラーゲンは、いずれかの供給源、例えばヒト、ウシまたはブタなどに由来してよく、皮膚、腱、筋肉、結合組織、または高いコラーゲン含有率を有する他のいずれかの天然に発生する構造要素に由来してよい。コラーゲンは、組み換え技術によって、またはそうでなければ、例えば組織工学によって製造された合成コラーゲンであってもよい。実施形態において、タイプＩのブタまたはウシコラーゲンが用いられる。他の実施形態において、異なる動物起源、例えば、ウシ、ブタ、ヒトなどに由来するタイプＩおよびタイプＩＩＩコラーゲン、またはそれらのタイプのいずれかの割合での混合物が用いられる。
【００２５】
コラーゲンとは、コラーゲンの全ての形態を言い、これは加工された、あるいはそうでなければ修飾されたものを含む。天然のコラーゲンは、非らせん状の末端部分を有する三重らせん構造に巻かれた３本のポリペプチド鎖で構成される、長く硬い（rigid）棒状構造の線維状タンパク質として特徴付けられる。実施形態において、用いられるコラーゲンは、完全な三重らせん構造を有し、溶液中で非常に高い粘度を示し、熱変性したコラーゲンよりも酵素による分解を受けにくいコラーゲン製剤を提供する。実施形態において、通常ゼラチンとして既知であり、少なくとも部分的にそのらせん構造を失った熱変性したコラーゲンが用いられてよい。
【００２６】
アテロペプチドまたはテロペプチド含有コラーゲンが用いられてもよい。コラーゲンの非らせん末端部分であるテロペプチドは、コラーゲン分子のアミノ末端およびカルボキシ末端からランダムコイルとして伸長する。テロペプチドは、分子内および分子間架橋のための主要な部位として働き、免疫原生部位である。実施形態において、それらの低減した免疫原生のため、ウシまたはブタなどの動物供給源由来のアテロコラーゲンが用いられる。
【００２７】
用いられるコラーゲンの免疫原生を最小化するため、テロペプチドが除去されてよい。アテロコラーゲンは、当該分野の当業者に既知のいずれかの技術によって製造され、これはタンパク質分解酵素を用いた方法を含むがこれに限定されない。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ４，１６４，５５９においてＭｉｙａｔａらによって記載される通り、ペプシンが用いられてよく、その全内容がこの引用によってここに組み込まれる。要するに、この技術は、コラーゲン原料をペプシンによって可溶化すること、およびｐＨ約１０．０でアルカリ処理によって酵素活性を不活性化した後に可溶性コラーゲンをｐＨ約７．０で沈殿させることに関係する。コラーゲンは、ｐＨ約２．０から約４．０の酸性水中で再溶解およびｐＨ約７．０で再沈殿を繰り返すことによって精製される。
【００２８】
例えば、生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンを製造するために、例えば、皮膚または腱などのコラーゲン原料またはコラーゲン供給源を洗浄し、非コラーゲン成分、例えば、毛髪、脂肪、炭水化物、ムコ多糖類などを除去する。次にコラーゲン原料を可溶化する。生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンは、上述の通り、生理的ｐＨおよび体温で可溶性となるような方法で、既知の方法、例えば酸抽出またはペプシンなどのタンパク質分解酵素などによって、化学的に修飾されるコラーゲンを言う。特定のコラゲナーゼではない、多くのタンパク質分解酵素が用いられ、変性させることなくコラーゲンを可溶化させてよい。ペプシンに加え、例えばトリプシン、キモトリプシンまたはパパインが用いられてよい。
【００２９】
生理的ｐＨで可溶性コラーゲンを提供するコラーゲンの化学的修飾は、例えば、水溶性脂肪族アルコール、例えば、メタノール、エタノールなどの酸性化アルコールによる反応を含む、何れかの既知の方法によるコラーゲンのカルボキシル基のエステル化によって達成されてよい。コラーゲンを化学的に修飾し、生理的ｐＨでコラーゲンを可溶にするための適切な技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，１６４，５５９に記載され、その全体の内容は、この引用によってここに組み込まれる。例えば、タイプＩアテロコラーゲンのエチル化は、それらをｐＨ約５．５〜約９．０、特に７．０〜７．５の範囲で可溶にする。非修飾アテロコラーゲンは、５．０未満の酸性ｐＨ、または９．０を超えるアルカリ性ｐＨにおいてのみ可溶性である。
【００３０】
生理的ｐＨにおいて可溶性のコラーゲンが一旦得られると、それは、例えば約６．０〜約８．０のｐＨ、実施形態においては生理的ｐＨで中和される。生理的ｐＨとは、ヒト体液内で通常生ずる比較的狭い範囲、一般的には、約７．０〜約７．５の範囲にあるｐＨを言う。
【００３１】
次に生理的ｐＨで可溶性のコラーゲンは、何れかの既知の関連する方法によって任意に乾燥されてよく、これは真空下オーブン中で乾燥すること、凍結乾燥すること、およびアセトンなどの溶媒によって脱水することを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
任意に乾燥されたコラーゲンは、前記コラーゲンの最終的な使用に関連したいずれかの適切な既知の密閉または閉鎖された単位で包装される。包装単位は、シリンジ、バイアル、パウチ、プレート、ジャー、チューブ、および製品の最終的使用に適した他のいずれかの包装を含む。終末的に包装されたコラーゲンは次に、それがベータ線照射によって滅菌されるまで３０℃未満の温度で保管されてよい。
【００３３】
滅菌は一般的に、終末的に包装されたコラーゲンについて放射線照射によって行われる。滅菌とは、コラーゲンが保管および／または流通する条件においてコラーゲン中で増殖可能な微生物の数を低減し、且つ標準化された滅菌プロトコールおよび／または妥当性検査により決定されたレベル以下の単一の工程、または工程の組み合わせによって処理されたコラーゲンを言う。終末的な滅菌とは、使用前の保管および流通のための最終的な包装中で、上で定義された通り滅菌されたコラーゲンを言う。
【００３４】
滅菌処理は、例えば、いずれかの既知の適切な方法に従って、室温または室温よりも低いいずれかの温度で行われる。室温とは、放射線照射施設で一般的に記録される温度を言い、実施形態において、室温は５０℃未満、より一般的には２５℃±５℃である。実施形態において、滅菌はドライアイス上、０℃未満で達成される。
【００３５】
滅菌は、滅菌総線量２５ｋＧｙ以下で行われる。実施形態において、滅菌は、滅菌総線量１５ＫＧｙ未満のベータ線照射により行われる。滅菌線量は、総累計線量が上述の値以下であること以外は、一以上の照射サイクルを含んでよい。
【００３６】
生理的ｐＨで可溶性のコラーゲン、特にエステル化されたコラーゲンは、ベータ線照射滅菌処理によって大幅には分解されない。コラーゲンは、当初の性質（例えば、分子量プロファイル、粘度、熱的性質など）の大部分を保持している。例えば、エチル化されたタイプＩアテロコラーゲンは、ベータ線照射による滅菌の後、生理的ｐＨで可溶性のままである。エチル化されたタイプＩアテロコラーゲンの溶液は、ベータ線照射の前と同様に粘着性である。対照的に、タイプＩコラーゲンは、もはや可溶性でない程度にまで分解される。
【００３７】
ベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンの使用は、関連分野の専門家が、天然コラーゲンと同様の特徴を有する終末的に滅菌されたコラーゲンを使用することを有利に考慮するかもしれないどんな場合も、制限無く想定されてよい。ベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンがどのように使用されるかという非限定的な例は、密封剤、接着剤、組織および器官の治癒および再生のためのマトリックス、創傷の包帯剤、造骨製剤、軟骨形成製剤、薬物送達のためのマトリックス、止血製品、化粧品製剤、皺および唇の充填剤、スキンクリームの成分、ならびに細胞培養のための培養液、微生物培養のための培養液、インビトロおよびインビボ試験のための試薬を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
実施形態において、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンは、線維形成および前記線維から作られるデバイスにおいて用いられてよい。本発明のコラーゲンから作られ、ここに記載される方法に従って製造されるマトリックス、足場および網目は、内科的および外科的用途において特に有用な性質を有する。例えば、用途には、外科的縫合、血管移植、カテーテル、および一般的に、外科的プロテーゼおよび人工臓器が含まれるが、これらに限定されない。コラーゲンから線維を作る技術は、当該分野の当業者の認識範囲内であり、この引用によってその全体がここに組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎ Ｎｏｓ．６，９９７，２３１および６，３６１，５５１に開示される技術を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
処理の後および使用の直前に、ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンは、シリンジ、チューブ、または適切なプランジャー、噴霧器、もしくは針またはノズルなどを経てコラーゲン内容物を押し出すよう設計されたシステムを具備する他の容器に含まれる、均質または不均質なペースト、ゲル、溶液または、懸濁液の形態で用いられてよい。コラーゲンは、注射されるか、外套針を経て外科的に適用されるか、あるいは直接創傷の表面に適用される。コラーゲンペースト、ゲル、溶液、または懸濁液は、完全に可溶性のままであるため、その終末的な滅菌の前後で同様の粘度を有する。
【００４０】
実施形態において、少なくとも一つの生物活性物質が、本発明の組成物において使用されるためにコラーゲンと組み合わされてよい。これらの実施例において、コラーゲン製剤はまた、生物活性物質の送達のための賦形剤として働く。「生物活性物質」の語は、ここで用いられる通り、その最も広い意味において用いられ、臨床的用途を有するいずれかの物質または物質の混合物を含む。結果として、生物活性物質はそれ自体、薬学的活性を有していても、あるいは例えば染料または香料のように薬学的活性を有していなくてもよい。あるいは、生物活性物質は、治療的または予防的効果を提供するいずれかの物質、組織成長、細胞成長、細胞分化に影響を及ぼすか、または関与する化合物、付着防止剤、免疫応答などの生物学的作用を誘発することができるか、または一以上の生物学的方法において他の何れかの役割を果たしてよい化合物であってよい。
【００４１】
実施形態において、使用前に生物活性物質を、照射を受けたエステル化されたコラーゲンに添加してよい。前記実施形態において、生物活性物質は、既知のタイプの無菌包装、例えばシリンジ内に別に提供されてよい。一例として、滅菌コラーゲンのシリンジの内容物を、滅菌の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むシリンジの内容物と混合し、骨の修復に適した製剤を提供してよい。
【００４２】
他の実施形態において、一以上の生物活性物質がコラーゲンの滅菌前にコラーゲン製剤に添加される。
【００４３】
本発明に従って利用されてよい生物活性物質の種類の例は、付着防止剤、抗菌剤、鎮痛剤、解熱剤、麻酔剤、抗てんかん剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、心臓血管薬、診断用薬、交感神経様作用薬、コリン様作動薬、抗ムスカリン薬、鎮痙薬、ホルモン、成長因子、筋肉弛緩剤、アドレナリン作働性ニューロン遮断薬、抗腫瘍薬、免疫原性剤、免疫抑制剤、胃腸薬、利尿薬、ステロイド、脂質、リポ多糖類、多糖類および酵素を含む。生物活性剤との組み合わせが用いられることも意図される。
【００４４】
付着防止剤を用いて、移植可能な医療用具と標的組織でない周囲の組織との間の付着を防止してよい。本発明の組成物に含まれてよいこれらの物質のいくつかの例は、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の組成物中に生物活性物質として含まれてよい適切な抗菌剤は、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテルとしても既知のトリクロサン、クロルヘキシジン、およびクロロヘキシジンアセテート、クロロヘキシジングルコナート、クロロヘキシジンハイドロクロリドとクロロヘキシジンサルフェートを含むその塩、銀、および酢酸銀、安息香酸銀、酢酸銀、クエン酸銀、ヨウ素酸銀、ヨウ化銀、乳酸銀、ラウリン酸銀、硝酸銀、酸化銀、パルミチン酸銀、タンパク銀とスルファジアジン銀を含むその塩、ポリミキシン、テトラサイクリン、トブラマイシンやゲンタマイシンなどのアミノグルコシド、リファンピシン、バシトラシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、ミコナゾール、オキソリン酸、ノルフロキサシン、ナリジクス酸、ペフロキサシン、エノキサシンやシプロフロキサシンなどのキノリン、オキサシリンやピプラシルなどのペニシリン、ノノキシノール９、フシジン酸、セファロスポリン、ならびにこれらの組み合わせを含む。さらに、例えばウシラクトフェリンやラクロフェリシンＢなどの抗菌性タンパク質およびペプチド、ならびにフカンや誘導体などの抗菌性多糖類が、本発明の生物活性コーティング中に生物活性物質として含まれてよい。
【００４６】
本発明に従う組成物中に生物活性物質として含まれてもよい他の生物活性物質は：局所麻酔薬；非ステロイド避妊薬；副交感神経興奮薬；精神治療薬；精神安定薬；鬱血除去薬；催眠鎮静薬；ステロイド；スルホンアミド；交感神経様作用薬；ワクチン；ビタミン；抗マラリア薬；抗偏頭痛薬；Ｌ−ドーパなどの抗パーキンソン病薬；鎮痙薬；抗コリン作用薬（例えば、オキシブチニン）；鎮咳薬；気管支拡張剤；冠動脈拡張薬やニトログリセリンなどの心臓血管薬；アルカロイド；鎮痛薬；コデイン、ジヒドロコデイノン、メペリジン、やモルホリンなどの麻酔薬；サリチル酸塩、アスピリン、アセトアミノフェン、ｄ−プロポキシフェンなどの非麻酔薬；ナルトレキソンやナロキソンなどのオピオイドレセプターアンタゴニスト；抗癌剤；抗けいれん薬；制吐薬；抗ヒスタミン薬；ホルモン剤、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、非ホルモン剤、アロプリノール、インドメタシン、フェニルブタゾンなどの抗炎症剤；プロスタグランジンや細胞毒性薬；エストロゲン；抗菌剤；抗生剤；抗真菌剤；抗ウイルス剤；抗凝結剤；抗けいれん薬；抗うつ薬；抗ヒスタミン剤；および免疫薬を含む。
【００４７】
本発明の組成物に含まれてよい適切な生物活性物質の他の例は、ウイルスおよび細胞、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、類似体、ムテイン、およびその活性断片、例えば、免疫グロブリン、抗体、サイトカイン（例えば、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン）、血液凝固因子、造血因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、インターフェロン（３−ＩＦＮ（ａ−ＩＦＮおよびｙ−ＩＦＮ）、エリスロポエチン、ヌクレアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（例えば、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ）、インスリン、抗腫瘍剤および腫瘍抑制因子、血液タンパク質、ゴナドトロピン（例えば、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧなど）、ホルモンおよびホルモンの類似体（例えば、成長ホルモン）、ワクチン（例えば、腫瘍性、細菌性およびウイルス性抗原）；ソマトスタチン；抗原；血液凝固因子；成長因子（例えば、神経成長因子、インスリン様成長因子）；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの骨または軟骨の修復に有用な因子；タンパク質阻害剤、タンパク質アンタゴニストおよびタンパク質アゴニスト；アンチセンス分子などの核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ；オリゴヌクレオチド；ポリヌクレオチドならびにリボソームを含む。
【００４８】
以下の非限定的な例は、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの性質と、ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンとベータ線照射を受けた酸性および中性コラーゲンとの比較、ならびにガンマ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンとの比較を示す。
【００４９】
例１
コラーゲンの調製
タイプＩブタコラーゲンをブタ真皮から抽出し、種々の技術によって可溶化し、酸性コラーゲン、中性コラーゲンおよびエステル化されたコラーゲンを製造する：
１°）酸性コラーゲン
タイプＩブタコラーゲンを酸性ｐＨで、またはペプシン消化によって可溶化し、次に慣習的な技術を用いた生理食塩水沈殿によって精製する。ＮａＣｌを添加し、次に８０％から１００％まで増加する濃度を有するアセトンの水溶液によって得られる沈殿物を洗浄および乾燥することにより、乾燥コラーゲン線維をコラーゲンの酸性溶液の沈殿によって得る。
【００５０】
２°）中性コラーゲン
上記１°）に記載される通り得られるタイプＩブタコラーゲンを、３０ｇ／ｌの濃度で水に可溶化する。その後、希釈水酸化ナトリウム溶液を添加することにより、コラーゲン製剤のｐＨをｐＨ７．０〜７．５の間に中和する。次にコラーゲンをアセトン洗浄または凍結乾燥のいずれかによって乾燥する。
【００５１】
３°）エステル化されたコラーゲン
上記１°）の通り得られた乾燥コラーゲン線維２０ｇを密閉容器中、室温で７日間、０．１Ｎ ＨＣｌを含む無水エタノール１リットルに浸漬する。コラーゲン添加前、ＨＣｌを含むエタノールの脱水は、過剰な無水硫酸ナトリウムとともに断続的に攪拌することによって行われる。エチル化後、溶媒を除去する。
【００５２】
当該エステル化されたコラーゲン線維をアセトンによって数回洗浄する。次に、それらを乾燥し、水中で最終濃度１％ｗ／ｖに溶解する。当該溶液のｐＨを、７．０〜７．５の間に調節し、コラーゲンを凍結乾燥する。
【００５３】
コラーゲンの滅菌
上記の通り得られた酸性コラーゲン、中性コラーゲン、およびエステル化されたコラーゲンを個々にシリンジに充填する。次にシリンジを密封されたバッグに詰める。コラーゲンのシリンジを、６ＫＧｙから２５ＫＧｙの範囲の異なる線量でベータ線照射によって滅菌する。
【００５４】
上述のエステル化コラーゲンもまた、ドライアイス上、０℃未満の温度で、６ＫＧｙから２５ＫＧｙの範囲の異なる線量でベータ線照射によって滅菌する。
【００５５】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの分析
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンについて個々に、またベータ線照射を受けた酸性コラーゲン、中性コラーゲンおよびエステル化されたコラーゲンについて比較して、ベータ線照射を受けたコラーゲンの性質を示す。
【００５６】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの滅菌性
欧州薬局方の滅菌性基準にしたがって、上述の通り調製した照射を受けたエステル化コラーゲンの異なるバッチについて滅菌性試験を行った。試験された全てのバッチは表１に示す通り、無菌であることがわかった：
【表１】
【００５７】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの溶解度および粘度
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの溶解度を以下の通り、評価した：
まず、乾燥コラーゲン１５０ｍｇ（残留水分含有率：１０％と仮定）を中性ｐＨで１００ｍｌの水に混合することにより、コラーゲンを可溶化した。当該試料を１００００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清中のコラーゲン総量は、ビウレット法によって添加され、遠心分離の前に当該試料中に最初に存在したコラーゲン総量と比較した。表２に示す通り、照射を受けたエステル化コラーゲンは、照射を受けていないエステル化コラーゲンと同程度、可溶性であった。
【表２】
【００５８】
ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲンの種々のバッチの塑性粘度および降伏応力を、溶液中、２％ｗ／ｖの濃度、＋２５℃でビンガムモデル（Ｂｉｎｇｈａｍ’ｓ ｍｏｄｅｌ）に従って測定した。数値は、３００〜６００ｒｐｍでＴＶｅ−０５Ｌａｍｙ粘度計によって得られた。表３に示される通り、数値は、６ＫＧｙおよび１０ＫＧｙのベータ線照射の前後で同じ範囲であった。照射を受けたエステル化されたコラーゲンは、６ＫＧｙおよび１０ＫＧｙでベータ線照射した場合、完全に可溶性のままであり、２５ＫＧｙでは部分的にのみ可溶性であった。
【表３】
【００５９】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの比較溶解度および粘度
ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンおよびベータ線照射を受けた酸性コラーゲンの種々のバッチの粘度を、上述の通り、溶液中、２％ｗ／ｖの濃度、＋２５℃で測定した。粘度測定もまた、中性コラーゲンについて＋５０℃の温度まで熱し、ゼラチンを得た後行った。
【００６０】
ベータ線照射を受けた中性コラーゲンは、酸性ｐＨにおいて、あるいは＋４２℃に加熱した後中性ｐＨにおいて、いずれのベータ線照射の線量でも不溶性であった。加熱後、溶液は、４％ｗ／ｖ以下の濃度でも、室温でゲルを形成しなかったが、一方、加熱後、ベータ線照射を受けていない中性コラーゲンは室温で１％ｗ／ｖ未満の濃度でゲルを提供した。照射を受けた酸性コラーゲンは可溶性であり、＋４２℃に加熱した後、ゲル化しなかった。照射を受けたエステル化コラーゲンは、照射を受けていないエステル化コラーゲンと同程度可溶性であった。
【表４】
【００６１】
ベータ線照射したコラーゲンの熱的性質
Ｍｉｃｒｏ−ＤＳＣＩＩＩ装置（Ｔｉａｎ−Ｃａｌｖｅｔ Ｔｙｐｅ）を用い、速度０．５ Ｋ／ｍｉｎで１５℃から６５℃まで示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって熱的性質を測定した。５００μｌの脱塩水中で１５ｍｇのコラーゲン線維を膨潤させることにより調製したコラーゲン線維のウェット・サンプルから、読み込みを得た。
【００６２】
１０ＫＧｙ以下のベータ線照射後、エステル化されたコラーゲンについて熱的性質は実質的に変化しなかったが、一方、照射を受けた酸性および中性コラーゲンについては低下し、後者についてはより大きく低下した。
【００６３】
以下の表５に示される結果は、ベータ線照射による熱的性質の変化をより明確に示している。
【表５】
【００６４】
ベータ線照射を受けたコラーゲンの電気泳動特性
コラーゲンの電気泳動は、ランニングバッファＸＴトリシンランニングバッファ２０ｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いることによって、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（登録商標）ＸＴ７％トリスアセテートのプレキャストゲル上で行われた。サンプル試料には、ＸＴ還元剤（ＢｉｏＲａｄ）が含まれていた。ＢｉｏＲａｄの説明書に従い、ゲルをＢｉｏＳａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＢｉｏＲａｄ）で染色した。
【００６５】
ベータ線照射を受けた中性コラーゲンは、明白なバンドを持たないが、広範囲にわたる痕跡を有する大きく変化した電気泳動特性を示した。エステル化されたコラーゲンおよび酸性コラーゲンの電気泳動特性は、１０ＫＧｙ以下の線量のベータ線照射後、実質的に変化しなかった。
【００６６】
機能性試験：ベータ線照射を受けたエステル化コラーゲンに基づく試料の付着強度
外科的および／または治療的用途のため、特に、生物学的組織を互いに、または移植された生体材料と接着するための付着性コラーゲンに基づく組成物は、ＴａｒｄｙらによってＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１６５，４８８に記載される通り調製されてよく、この引用によって、この全体の内容はここにおいて組み込まれる。要するに、一般的に組成物は、酸化デンプンの水溶液、生分解性多糖類、および加熱されたコラーゲンの水溶液（即ち、ゼラチン）を含む。
【００６７】
酸化デンプンとコラーゲンを一緒に混合することによって、中性ｐＨで空気の泡を取り込むことによってまたは取り込まないことによって、当該組成物を得る。混合することによって、組織および／または生物材料に迅速に適用されるゲルを提供し、接着を達成する。接着性は、酸化デンプンアルデヒドとコラーゲンの遊離アミノ酸基との化学反応の組合せ、ならびにコラーゲン特有の性質（例えば、粘度または疎水性親水性特性）の結果である。
【００６８】
機能性試験のため、加熱されたコラーゲンは、６ＫＧｙの線量でベータ線照射されたエステル化されたコラーゲンに置き換えた。
【００６９】
濃度８％以下で、熱を加えることなく、コラーゲンをあるシリンジから他のシリンジへと１分未満、数回行ったり来たり移動させることにより、照射を受けたコラーゲンの完全に半透明な溶液を得た。酸化デンプンと反応させる場合、照射を受けたコラーゲンおよびデンプンは架橋し、粘性の高い泡を形成する。
【００７０】
エクスビボの接着試験
脱脂したブタ真皮の正方形、２５ ｍｍ×２５ ｍｍを、以下に記載する試験に供される生成物（試料Ａ、Ｂ、Ｃ）とともに接着する。次に、それらを＋３７℃で４５分インキュベートする。接着強度は、卓上材料試験機器（Ｔｉｎｉｕｓ Ｏｌｓｅｎ， ＥＣＭＥ２３０）を用いることにより、一方の真皮の断片を他方からはがすことによって測定する。剥離カーブをＱＭａｔ−Ｐｒｏソフトウエアによって分析する。
【００７１】
生成物の調製
試料Ａ：ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン−バッチＲＧＫ０００２６−を４％ｗ／ｖの濃度で可溶化した。第一のシリンジ中の当該溶液２ｍｌを、あるシリンジから別のシリンジへと数回言ったり来たりと移動させることにより、第二のシリンジ中で希釈した０．７ｍｌの１．５％ｗ／ｖの酸化デンプン−バッチＺＦＥ００５２３ｘ２−と混合した。
【００７２】
試料Ｂ：ベータ線照射を受けたエステル化されたコラーゲン−バッチＲＧＫ０００２６−が、酸化デンプンを用いることなくそれだけで、濃度８％ｗ／ｖで用いられた。
【００７３】
試料Ｃ：Ｐｒｅｖａｄｈ（登録商標） Ｆｏａｍは、ＳＯＦＲＡＤＩＭ市販キットからの使用説明書から調製した。濃度１６％ｗ／ｖの加熱したコラーゲン２ｍｌ−バッチＳＣＣ２３３３０−を、濃度３％ｗ／ｖの酸化デンプン０．７ｍｌ−バッチＳＡ０２４０１６−と架橋した。
【００７４】
接着強度
接着強度の結果を以下の表６に示す。市販の製品Ｐｒｅｖａｄｈ（登録商標） Ｆｏａｍと比較した場合、エステル化コラーゲンは酸化デンプンと架橋し、非常に有効に働く接着製品を製造した。しかし、架橋剤を用いずそれだけでは、エステル化コラーゲンの接着特性は低かった。
【００７５】
接着強度が、より高濃度のコラーゲン（１６％ｗ／ｖ）と架橋剤（３％ｗ／ｖ）によってその接着性を獲得するＰｒｅｖａｄｈ Ｆｏａｍの接着強度の６０％に達したので、酸化デンプンと架橋したエステル化されたコラーゲンの接着性は満足なものであった。したがって、市販のＰｒｅｖａｄｈ Ｆｏａｍ製品と比較してわずか２５％のコラーゲンおよび５０％の架橋剤を有する本発明のコラーゲン製剤は、市販製品の接着強度の６０％を提供した。
【表６】
【００７６】
エステル化されたコラーゲンは、酸性および中性コラーゲンと比較した場合、２５ＫＧｙ未満の線量のベータ線照射によって安全に滅菌される唯一のコラーゲンであった。分析結果は、照射を受けたエステル化された特性は、照射を受けていない対応物と同様であることを示した。
【００７７】
例２
コラーゲンの調製
エステル化されたコラーゲンについては、例１で上述した通りコラーゲンを調製した。
【００７８】
コラーゲンの滅菌
エステル化されたコラーゲンのシリンジを例１で上述した通り調製したが、室温または０℃未満のいずれかで、ドライアイス中、６ＫＧｙから３０ＫＧｙの範囲の種々の線量で、ガンマ線照射することにより滅菌した。
【００７９】
ガンマ線照射を受けたコラーゲンの分析
エステル化されたコラーゲンは、いくらかの粘度を示す半透明の溶液を提供するが、γ線照射の線量が増加すると、完全に分解されていると想定される２５ＫＧｙを超える線量で照射を受けたコラーゲンを除いて、明らかにその粘度が低下する。これは、電気泳動分析と一致し、ガンマ線照射線量が増加することにより、より明らかな分解の兆候を示す。
【００８０】
ガンマ線照射は、エステル化されたコラーゲンの当初の特性を保つことについてベータ線照射よりも効果が少ない。ガンマ線照射によって滅菌された場合、約１０ＫＧｙの低い線量でさえ、エステル化コラーゲンは明らかに変化した。エステル化コラーゲンの滅菌試料を調製するためにガンマ線を照射することは、ベータ線を照射することに比べて有利ではない。
【００８１】
ここで開示される実施形態に種々の変更が行われてよいことが理解されるだろう。したがって上述の記載は、好ましい実施形態の例示に過ぎず、限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲および精神の中で他の修正を想定するだろう。前記修正および変更は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンを化学的に修飾し、当該コラーゲンを生理的ｐＨで可溶化することと；
当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと；
当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを密閉単位に包装することと；
当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを約２５ＫＧｙ以下の放射線線量で放射線照射することと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを、包装する前に乾燥することをさらに含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、当該化学的に修飾され、中和され、乾燥されたコラーゲンを、当該放射線を照射する工程の前に約３０℃以下で保管することをさらに含む方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射がベータ線による照射である方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、当該ベータ線による照射が約６KGｙ〜約２５KGｙ、好ましくは１０KGｙ〜約１５KGｙの線量である方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、当該ベータ線による照射が約１５KGｙ未満、好ましくは約１０KGｙ未満の線量である方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射が照射線量の複数のサイクルとして行われ、総照射線量が２５KGｙ以下である方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射が０℃未満の温度で行われる方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、コラーゲンを化学的に修飾することがコラーゲンをエステル化することを含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、コラーゲンをエステル化することが、コラーゲンを水溶性脂肪族アルコールと反応させることを含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、包装することが、化学的に修飾され、中和されたコラーゲンをシリンジに密閉することを含む方法。
【請求項１２】
生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤であって、当該コラーゲンが少なくとも一部に完全な三重らせん構造を有するコラーゲン製剤。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のコラーゲン製剤であって、当該コラーゲンがブタ由来であるコラーゲン製剤。
【請求項１５】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤から形成される線維。
【請求項１６】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤を更に含む、組織密封剤または組織接着剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組織密封剤または組織接着剤であって、酸化デンプンを更に含む組織密封剤または組織接着剤。
【請求項１８】
生物活性物質と組み合わせた請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む組成物。
【請求項１９】
注射可能であり、シリンジ内に含まれる請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む、組織充填剤。
【請求項２０】
一以上の骨形態形成タンパク質を含み、注射可能であり、シリンジ内に含まれる
請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む、骨充填剤（bone filler）。
【請求項２１】
生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤を、生物活性物質を含む滅菌組成物と組み合わせ、組織への適用に適した製剤を提供することを含む方法。
【請求項１】
コラーゲンを化学的に修飾し、当該コラーゲンを生理的ｐＨで可溶化することと；
当該化学的に修飾されたコラーゲンを生理的ｐＨに中和することと；
当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを密閉単位に包装することと；
当該化学的に修飾され、中和され、包装されたコラーゲンを約２５ＫＧｙ以下の放射線線量で放射線照射することと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該化学的に修飾され、中和されたコラーゲンを、包装する前に乾燥することをさらに含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、当該化学的に修飾され、中和され、乾燥されたコラーゲンを、当該放射線を照射する工程の前に約３０℃以下で保管することをさらに含む方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射がベータ線による照射である方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、当該ベータ線による照射が約６KGｙ〜約２５KGｙ、好ましくは１０KGｙ〜約１５KGｙの線量である方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、当該ベータ線による照射が約１５KGｙ未満、好ましくは約１０KGｙ未満の線量である方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射が照射線量の複数のサイクルとして行われ、総照射線量が２５KGｙ以下である方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、放射線照射が０℃未満の温度で行われる方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、コラーゲンを化学的に修飾することがコラーゲンをエステル化することを含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、コラーゲンをエステル化することが、コラーゲンを水溶性脂肪族アルコールと反応させることを含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、包装することが、化学的に修飾され、中和されたコラーゲンをシリンジに密閉することを含む方法。
【請求項１２】
生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤であって、当該コラーゲンが少なくとも一部に完全な三重らせん構造を有するコラーゲン製剤。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のコラーゲン製剤であって、当該コラーゲンがブタ由来であるコラーゲン製剤。
【請求項１５】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤から形成される線維。
【請求項１６】
請求項１２に記載のコラーゲン製剤を更に含む、組織密封剤または組織接着剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組織密封剤または組織接着剤であって、酸化デンプンを更に含む組織密封剤または組織接着剤。
【請求項１８】
生物活性物質と組み合わせた請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む組成物。
【請求項１９】
注射可能であり、シリンジ内に含まれる請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む、組織充填剤。
【請求項２０】
一以上の骨形態形成タンパク質を含み、注射可能であり、シリンジ内に含まれる
請求項１２に記載のコラーゲン製剤を含む、骨充填剤（bone filler）。
【請求項２１】
生理的ｐＨで可溶性の、化学的に修飾され、中和され、終末的に滅菌されたコラーゲンを含むコラーゲン製剤を、生物活性物質を含む滅菌組成物と組み合わせ、組織への適用に適した製剤を提供することを含む方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５１０９７１（Ｐ２０１１−５１０９７１Ａ）
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４８１５（Ｐ２０１０−５４４８１５）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０００３２５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５７９０
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０５４５３６３１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０００３２５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５７９０
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０５４５３６３１）
【Ｆターム（参考）】
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