乳中に安定して産生される改変抗体およびその製造方法
本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体の製造方法に関するものである。該方法は、体細胞および生殖細胞が、外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域をコードし、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している配列を有するトランスジェニック哺乳動物を提供することを含む。該ヒンジ領域は重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。また本発明は、トランスジェニック哺乳動物、そのような動物の作製法、およびそのような抗体および抗体をコードする核酸を含む組成物に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体の製造方法を提供する。本方法は、体細胞および生殖細胞が少なくとも一つずつの重鎖および軽鎖およびヒンジ領域をコードする配列をもつトランスジェニック哺乳動物を提供することを含み、該ヒンジ領域は、生じた組み換え抗体の安定性と折りたたみ特性を改善するために、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧはヒト成人の血清中に最も多量にあるアイソタイプ抗体で、全血清免疫グロブリンの約８０％を占める。ＩｇＧは、二つのＰＵ重鎖と二つの（Ｐ２およびＳＥ）の軽鎖からなる４量体構造の単量体分子である。重鎖および軽鎖は一般にジスルフィド結合により相互連結されている。さらに抗体には、分子に部分的な柔軟性を与えるプロリン残基が多量なヒンジ領域がある。ＩｇＧは、抗原の凝集、オプソニン作用、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、胎盤の通過、補体の活性、毒の中和、バクテリアの不動化、ウイルスの中和等、さまざまな生物学的機能を示す。
【０００３】
ＩｇＧ４抗体は、エフェクター機能がないため治療用剤として使用することができる。しかし、ＩｇＧ４抗体は、酸処理または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）上で“不安定”な特性を有し、結果的に８０ＫＤａのタンパク質になってしまう（“半分子(half molecule)”としても知られる）。二つの重鎖がジスルフィド結合で連結しなくなると、この半分子が生じる。
【０００４】
組織培養でのＩｇＧ４の産生は各種成功している。細胞株によって、ＩｇＧ４の“半分子”の割合は５〜２５％とさまざまである。ＩｇＧ４分子を作る際の問題点の一つは、全ＩｇＧ４分子からこの半分子型を分離する簡便な方法がないことである。多くの生産現場では、工程で生じる“半分子”がさまざまなレベルで存在することを単純に受け入れている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は一部には、トランスジェニック動物の乳中で抗体を製造すると、結果的に５０％以下の抗体が半分子型になり、その抗体のヒンジ領域の改変によって、そのような動物の乳中で、会合抗体(assembled antibody)が増加することの発見に基づく。理論による裏づけは求めていないが、トランスジェニック動物の乳中で見られる半分子の増加は、一部には、乳腺が、十分な分泌をもたらしはているが、抗体の重鎖間の適切な折りたたみおよび／またはジスルフィド結合の形成をもたらすことができないためであろう。そのような抗体のヒンジ領域の改変で、半分子のレベルが低減される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、一実施態様において、本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体の製造方法に関するものである。該方法は、外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも１つの重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域をコードし、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している配列を有する体細胞および生殖細胞をもつトランスジェニック哺乳動物を提供することを含み、このヒンジ領域は重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。
【０００７】
一実施形態では、少なくとも抗体の７０％、７５％、８０％、９０％、９５％が、会合型として乳中に存在している。他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の体細胞および生殖細胞はさらに、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗体結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含む。
【０００８】
他の実施形態では、本方法は、抗体成分を供給するために、トランスジェニック哺乳動物から乳を得る工程を含むことができる。さらに、本方法は、乳中から外因性抗体を精製する工程も含むことができる。
【０００９】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。好適な実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００１０】
抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等、どのようなクラスの抗体からでも作製できる。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００１１】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域が、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換される。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換される。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００１２】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００１３】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の好適な実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００１４】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態は、重鎖または軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変を含むことができる。
【００１５】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００１６】
例えば、この抗体は、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体、あるいはそれらの断片であってもよい。
【００１７】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、体細胞および生殖細胞が改変抗体のコード配列を含むトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関するものであり、その改変抗体のコード配列は改変ヒンジ領域をもつ抗体分子またはその一部をコードしている。本方法は、哺乳動物に構成物を導入する工程を含み、該構成物は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその機能断片およびヒンジ領域をコードする配列を含む。該ヒンジ領域は、産生される抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、構成物は、軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含み、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している。
【００１９】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。一実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００２０】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００２１】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、重鎖定常領域またはその一部はＩｇＧ由来であり、その抗体のヒンジ領域はＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００２２】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００２３】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００２４】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態は、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変を含むことができる。
【００２５】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００２６】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００２７】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。好適な一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域が改変されている。
【００２８】
本発明は、抗体のコード配列をトランスジェニック動物に導入するための、当業者にとって既知である全ての方法を企図している。例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域等、抗体の一部をコードしているコード配列は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーター等の別個のプロモーターの支配下で、それぞれの構成物として導入することができる。各プロモーターは、同種の哺乳類上皮細胞プロモーター（二つともカゼインプロモーターを含んだ構成物等）であっても、または異なる種類の哺乳類上皮細胞プロモーター（カゼインプロモーターとβラクトグロブリンプロモーターをそれぞれ含んだ構成物等）であってもよい。従って、関連する一実施形態では、本発明は、会合外因性抗体またはその一部を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに連結した外因性抗体の軽鎖をコードした配列を含む構成物、または哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに連結した外因性抗体の変異した重鎖をコードする配列を含む構成物を哺乳動物に導入する工程も含んでいる。他の実施形態では、構成物には、変異した重鎖、軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列も含まれる。変異重鎖および軽鎖またはその一部をコードした配列は哺乳類上皮細胞で発現を導く各種プロモーターに連結され、その支配下におかれる。例えば、改変抗体のコード配列はポリシストロニックが可能で、例えば、重鎖コード配列と軽鎖コード配列等は、その間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有することができる。各プロモーターの支配下にある場合、プロモーターは哺乳類上皮細胞の同種プロモーターの支配下にあってもよく（二つの配列がβカゼインプロモーターの支配下にある等）、またはそれぞれが異なる哺乳類上皮細胞プロモーターの支配化にある（一つの配列はβカゼインプロモーターで、もう一つはβラクトグロブリンプロモーター等）。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、会合外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、生殖細胞および体細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードした配列を含むトランスジェニック哺乳動物からの細胞を提供する工程と、その細胞に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列からなる構成物を導入する工程とを含む。さらにこの重鎖またはその一部には、重鎖定常領域と通常連結しているヒンジ領域を改変したヒンジ領域も含まれる。また他の実施形態では、本発明は、会合外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、生殖細胞および体細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列を含むトランスジェニック哺乳動物からの細胞を提供する工程と、その細胞に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列からなる構成物を導入する工程とを含む。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明では、外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物が特徴であり、その体細胞および生殖細胞は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片、およびヒンジ領域をコードする改変抗体のコード配列を含む。このヒンジ領域は、産生される抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域を改変した。
【００３１】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。好適な一実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００３２】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００３３】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域が、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換される。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換される。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域が、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換される。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００３５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。より好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００３６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００３７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００３８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００３９】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００４０】
好適な一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域は改変されている。他の実施形態では、改変抗体のコード配列には、さらに軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含む。軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結して、外因性重鎖可変領域、重鎖定常領域（またはその一部）、およびヒンジ領域をコードする配列と同じプロモーターの支配下にできる。例えば、改変抗体のコード配列はポリシストロニックが可能で、重鎖コード配列と軽鎖コード配列等は、その間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有することができる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は乳成分と本明細書中に記載する抗体成分を含む組成物を提供する。好適には、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％の外因性抗体が会合型として存在する。他の実施形態では、組成物中の外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるようにヒンジ領域が改変された。
【００４２】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００４３】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００４４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００４５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。さらに好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００４６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００４７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００４８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００４９】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００５０】
別の好適な実施形態では、組成物は実質的に乳成分が無く、例えば、乳成分は、重量パーセントで１０％、５％、３％、２％、１％、０.５％、０.２％未満となっている。乳成分には、カゼイン、脂質（可溶性脂質およびリン脂質等）、ラクトース、他の低分子（ガラクトース、グルコース等）、小ペプチド（微生物ペプチド、抗菌ペプチド等）、および他の乳タンパク質（βラクトグルブリンおよびαラクトアルブミン、ラクトフェリン、および血清アルブミン等の乳清タンパク質）が含まれる。
【００５１】
さらに別の実施態様では、本発明は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターと作動可能に連結している重鎖可変領域またはその抗原結合部位、重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域をコードする配列を含む核酸を提供する。このヒンジ領域は、重鎖定常領域と通常連結しているものから改変されている。
【００５２】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。重鎖可変領域またはその抗原結合部位、重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等、任意の抗体クラスの任意の抗体から作成することができる。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００５３】
本発明では、ヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態で、ヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、ヒンジ領域の全部または一部が、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、ヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００５５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の好適な実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００５６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００５７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００５８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態で、核酸はポリシストロニックが可能である。例えば、重鎖コード配列と軽鎖コード配列は、その間に内部リボソーム挿入部位（ＩＲＥＳ）を入れること等によって同じプロモーターの支配下における。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本明細書において、以下の略語は指定の意味を有する：
主な略語
体細胞核移植 （ＳＣＮＴ）
培養内部細胞塊細胞 （ＣＩＣＭ）
核移植 （ＮＴ）
合成卵管液 （ＳＯＦ）
ウシ胎児血清 （ＦＢＳ）
ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）
ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）
高圧液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）
用語解説
ウシの（Ｂｏｖｉｎｅ）―雌ウシのおよび各種雌ウシに関すること
ヤギの（Ｃａｐｒｉｎｅ）―ヤギのおよび各種ヤギに関すること
細胞カプレット―融合および／または活性化前の除核卵母細胞および体細胞または胎児の核体
サイトカラシンＢ―ある種の真菌の代謝産物で、核分裂に影響が無く細胞分裂を選択的かつ可逆的に阻害する
細胞質体―真核細胞の細胞質の物質
融合スライド―離れて固定された平行電極用のスライドグラス。細胞カプレットが電極間に置かれ、融合および活性化のための電流を受ける
核体―細胞から除核処理で得られ、細胞質と細胞膜の狭い縁によって囲まれている細胞の核
核移植―ドナー細胞からの核を除核された卵母細胞へ移植しクローニングする方法
ヒツジの（Ｏｖｉｎｅ）―ヒツジおよび各種ヒツジに関すること
単為生殖の―精子の侵入が無い卵からの胚発生
ブタの（Ｐｏｒｃｈｉｎｅ）―ブタおよび各種ブタに関すること
再構成胚―再構成胚とは、除核処理で遺伝物質を除いた卵母細胞。成体または胎児の体細胞の遺伝物質をこの卵母細胞に入れ、融合させることで“再構成”される
選択試薬―適した抵抗性遺伝子を持たない微生物または細胞を死滅および／またはその成長を阻害するように働く選択マーカーとして機能する化合物、混合物、または分子。本発明によるとこのような試薬は現在たくさん有り、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ガンシクロビル、ＦＩＡＵ等がある。好適には、本発明では選択試薬量を増加させて、一つのインテグレーション部位だけをもつ全細胞株（異型接合動物および／または細胞等）を死滅させる
体細胞―生殖細胞以外の生物の体の全ての細胞
体細胞核移植―治療用クローニングとも呼ばれ、体細胞を除核した卵母細胞に融合させる過程。体細胞の核はその遺伝情報を提供し、卵母細胞は胚発生に必要な栄養素とエネルギー生産物質を提供する。融合が起こると細胞は全能性を示し、最終的に胞胚になる。その時点で内部細胞塊を単離する
トランスジェニック生物―別の生物由来の遺伝物質を実験的に移植した生物で、宿主は自分の遺伝情報に加えて、その染色体に移植された遺伝子の遺伝情報を獲得する
有蹄類―蹄をもつ典型的な草食四足獣の哺乳類、およびこれに関すること。ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびウマ等多種存在する
異種移植―一つの動物由来の生きた細胞、組織、器官を使用し、別種の動物（一般的にはヒト）に移植または挿入する手技、または、臨床体外環流で使用される。
【００６１】
本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体産生に関する。本発明のさまざまな態様は、抗体とその断片、抗体とその断片のトランスジェニック哺乳動物の乳中での産生法、および体細胞および生殖細胞が改変抗体のコード配列を含むトランスジェニック哺乳動物の作製法に関する。哺乳類上皮細胞で改変抗体のコード配列を発現させる核酸配列も提供される。
【００６２】
本発明をより容易に理解するために、ある種の用語が定義される。定義は“詳細な説明”中の全般にわたって使用されている。
【００６３】
抗体とその断片
本明細書中で使用する抗体の“クラス”とは、抗体の５つの主要なアイソタイプを示し、それにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがある。抗体の“サブクラス”とは、各クラスの中のアミノ酸の差異に基づく抗体の下位分類を示す。例えば、ＩｇＧと指定される抗体のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４等のサブクラスへと分けることができ、ＩｇＡと指定される抗体のクラスは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスへと分けることができる。
【００６４】
“抗体”とは、少なくとも一つおよび好適には二つの重鎖（Ｈ鎖）可変領域（ＶＨ）と、少なくとも一つおよび好適には二つの軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（ＶＬ）と、少なくとも一つおよび好適には二つの重鎖定常領域から成るタンパク質を示す。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、“フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれる比較的安定した領域と、そこに散在する“相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分類できる。ＦＲとＣＤＲの大きさは正確に決定されている（参照によって本明細書に組み込まれるKabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Intrest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publicaition No.91-3242; Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917を参照）。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから成り、アミノ末端からカルボキシル末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。
【００６５】
抗体はさらに軽鎖定常領域を含むことができ、それによって重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖が形成される。一実施形態では、抗体が二つの重鎖と二つの軽鎖の４量体で、重鎖および軽鎖はジスルフィド結合で内部連結している。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインからなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬからなる。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインがある。抗体の定常領域は一般に宿主組織または因子への結合を媒介する。これには免疫系の各種細胞（エフェクター細胞等）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）が含まれる。
【００６６】
抗体はさらに以下に詳しく記述するヒンジ領域を含むことができる。本明細書中で使用する“会合(assembled)”抗体とは、ジスルフィド結合の内部結合によって重鎖が互いに連結している抗体を示す。各重鎖のヒンジ領域は、少なくとも一つ、またはしばしばいくつかのシステイン残基を含む。会合抗体では重鎖のシステイン残基は整列しているので、二つの重鎖および軽鎖の４量体全体に共有結合するヒンジ領域内のシステイン残基の間にジスルフィド結合は形成される。従って、完全に会合抗体が二つの抗原結合部位を有し二価となる。本明細書中で使用する“抗体”（または“免疫グロブリン”）とは、完全長抗体の断片も指す。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結した二つのＦａｂ断片から成り、二価である。これらの抗体断片は従来の手法を用いて得られ、元の抗体と同様の有効性があることが検証されている。
【００６７】
抗体の“抗原結合断片”（または“機能断片”）とは、抗原と特異的に結合できる抗体の一つ以上の部分を示す。“抗原結合断片”という用語には、一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）も含まれる。
【００６８】
本明細書中で使用する“キメラ抗体重鎖”とは、ある抗体重鎖の一部を有す抗体重鎖を示す。例えば、可変領域が少なくとも８５％、好適には９０％、９５％、９９％、またはこれ以上、特定の生物種の抗体重鎖の対応するアミノ酸配列と一致する場合、または特定の抗体のクラスまたは型に属しながら、残りの抗体重鎖の一部（定常領域等）が別の抗体分子の対応するアミノ酸配列に実質的に一致する場合である。例えば、重鎖可変領域はある生物種の抗体の重鎖可変領域に実質的に一致する配列をもつが（“供与”抗体、げっ歯類抗体等）、定常領域は別の生物種の抗体の定常領域に実質的に一致する（“受容”抗体、ヒト抗体等）。供与抗体が試験管内で生成、またはファージ提示法によって作られる。
【００６９】
“ヒト化”または“ＣＤＲ移植”軽鎖可変領域とは、一つ以上のＣＤＲから成る抗体の軽鎖、またはわずか一つまたは二つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列がある生物種または抗体クラスまたは型からの一つ以上の対応するＣＤＲに一致する軽鎖を示す。例えば“供与”抗体（非ヒト（一般的にはマウスまたはラット）免疫グロブリン、または試験管内生成免疫グロブリン）、および天然の免疫グロブリンフレームワーク（ヒトフレームワーク等）または共通フレームワーク等、アミノ酸配列の約８５％以上および好適には９０％、９５％、９９％またはそれ以上が、別の生物種または抗体のクラスまたは型からの対応する受容抗体の一部に一致するフレームワーク領域である。一実施形態では、フレームワーク領域には少なくとも約６０、より好適には約７０の天然の抗体のフレームワーク（ヒトフレームワーク）または共通フレームワーク等の受容抗体軽鎖可変領域のフレームワークと一致するアミノ酸残基が含まれる。
【００７０】
“非相同抗体”または“外因性抗体”とは、その哺乳動物で通常作られない抗体、乳腺で通常作られない抗体（抗体が血清のみに存在等）、または乳腺で作られるがその生産過程で発現レベルが増加する抗体を示す。
【００７１】
キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体等本明細書中に記載されたどの抗体も、さらにその配列が改変されることもある。例えば配列は付加、欠失、保存性置換等の置換によって変更できる。
【００７２】
抗体のヒンジ領域
本発明に記載の方法は、トランスジェニック動物の乳中での抗体を産生することにかかわり、その抗体のヒンジ領域は、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変された。このような定常領域は、本明細書中では“変異重鎖定常領域”と呼ばれる。“通常連結”とは、天然の抗体のヒンジ領域と重鎖定常領域の間の連結を示す。本明細書中で言う“天然の”とは、天然の微生物中等、天然に検出される抗体を示す。例えば、天然微生物中に存在し、人工的に改変されていない抗体またはその断片が、自然に生じたものである。この用語はヒンジ領域と抗体の重鎖定常領域（ＣＨ１領域等）の少なくとも一部分の間の連結についても示す。本明細書中で、この重鎖定常領域の一部とヒンジ領域は一つの抗体中にともに“自然に生じて”検出される。この用語は天然に発見される重鎖定常領域だけに限るのではない。定常領域は、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失等の改変したものも含むことができる。互いに“通常連結”しているＩｇＧヒンジ領域と重鎖定常領域（またはその一部）の例には、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ２抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ３抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ３抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域（またはその一部）である。これらの例に限りは無く、この用語はまた他のクラスの抗体にも適用できる。
【００７３】
本明細書中で使用する抗体の“ヒンジ領域”とは、抗体のＣＨ１とＣＨ２ドメイン間にある伸縮性ペプチドを示す。ヒンジ領域は抗体のＦａｂとＦｃ部分の間に生じる。ヒンジ領域は一般的に単一のエクソンでコードされ、抗体の二つの重鎖断片をジスルフィド結合でつなぐ（Paul et al.,Fundamental Imunology,3rd Ed. (1993)を参照のこと）。ヒンジ領域のアミノ酸配列は一般的にプロリン、セリンおよびスレオニン残基が多い。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡのＣＨ１とＣＨ２ドメイン間の延長ペプチド配列はプロリンに富んでいる。ＩｇＭとＩｇＥ抗体が、ヒンジ様特徴をもつ約１１０のアミノ酸ドメインを含んでおり（Ruby,J.,Immunology(1992)）、本明細書中で使用する“ヒンジ領域”という用語に含まれる。
【００７４】
ヒンジ領域のアミノ酸配列にはシステイン残基を含むこともできる。システイン残基は分子間鎖のジスルフィド結合の形成に関与する。抗体のクラスによるが、抗体のヒンジ領域の２と１１の位置の重鎖内ジスルフィド結合の間に存在できる。このジスルフィド結合は完全な抗体分子の二つの部分を一つに合わせるのに必要である。抗体のさまざまなクラスおよびサブクラスのヒンジ領域が当業においてすでに既知である。
【００７５】
標準的分子生物学の技術が、ヒンジ領域を改変した抗体を提供するために使用することができる。これらの技術は、抗体のヒンジ領域（または抗体の配列の別の部分）の既知のアミノ酸配列の欠失、挿入、置換等の改変に使用することができる。“改変”とは、抗体のヒンジ領域内、またはその一部におこす変化を示す。このような改変は限りなく、ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換がある。直接またはランダムな突然変異技術のような優れた技術が、ヒンジ領域に特定の配列または変異を与えるために使用することができることを当業者は認識している。このような技術はまた、抗体の他の領域の改変にも使用することができる。例えば、重鎖および／または軽鎖の定常領域および／または可変領域である。
【００７６】
例えば、オリゴヌクレオチド媒介変異法は、置換、欠失、挿入した変異型ＤＮＡを作製するのに適している(Adelman,et al., DNA2: 183, 1983を参照のこと)。端的には、変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズして目的のＤＮＡを改変する。本明細書中でこの鋳型は、目的のタンパク質の改変無しの天然のＤＮＡ配列を含むプラスミドあるいはバクテリオファージの一本鎖である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型の完全な２本目の相補鎖を合成しようと、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込む。そして、目的のタンパク質のＤＮＡに必要な改変が加わる。一般に、少なくとも全長２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異ヌクレオチドの両側で鋳型と完全に相補的になる１２〜１５個のオリゴヌクレオチドである。これによって、オリゴヌクレオチドが適切に一本鎖ＤＮＡの鋳型分子とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドはクレアらによる方法（Crea et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5765 (1978)）等で、簡単に合成できる。
【００７７】
例えば一実施形態では、抗体のヒンジ領域またはその断片は、抗体の異なるクラスまたはサブクラス等の別の抗体のヒンジ領域またはその断片で置換される。好適な実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ領域はＩｇＧ２ヒンジ領域等の違うクラスのヒンジ領域で置換される。このような置換は、例えばＩｇＧ２ヒンジ領域を含むエクソンをコードするオリゴを用いたオリゴヌクレオチド媒介変異法を使って行うことができる。別の実施形態では、ＩｇＧ４のヒンジ領域等のヒンジ領域内の一つのアミノ酸は、異なるアミノ酸、例えばＩｇＧ２等の別のサブクラスのヒンジ領域の対応する位置で発見されるアミノ酸等で置換する。例えば、アミノ酸２４１のセリンは（ＩｇＧ２ヒンジ領域で対応する）プロリンで置換することができる。オリゴヌクレオチド媒介変異法は、アミノ酸変化（オリゴＳ２４１Ｐ）を起こすオリゴを使用して置換することができる。さらに別の実施形態では、ＩｇＧ４等の抗体の糖鎖付加部位を糖鎖付加部位として機能しないように改変された。例えば、Ｎ‐結合型糖鎖付加部位はアスパラギンをグルタミンに変えることで改変できる。オリゴヌクレオチド媒介変異法は、例えばアミノ酸変化を起こすオリゴを使っても、このような改変に使用することができる。
【００７８】
タンパク質を改変するカセット変異法の他の例は、Wells et al.,Gene,34:315(1985)による技術に基づく。最初の物質は、変異させるタンパク質サブユニットのＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異されるタンパク質サブユニットのＤＮＡにあるコドンは同定される。同定される変異部位の両側には、特定の制限酵素切断部位が必ずある。もしその部位がない場合は、目的のタンパク質サブユニットのＤＮＡの適当な位置にその部位を挿入するため、上記のオリゴヌクレオチド媒介変異法でその部位を作製する。制限部位がプラスミドに導入されると、プラスミドはこの部位で切断され直鎖になる。制限部位の間に目的の変異をはさんだＤＮＡ配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドが標準的な方法で合成される。二本の鎖は標準的な方法でそれぞれ合成され、その後ハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、直鎖プラスミドの両端に一致する３’と５’末端をもつように設計するので、プラスミドに直接連結できる。従って、このプラスミドには、目的のタンパク質サブユニットの変異したＤＮＡ配列が含まれる。
【００７９】
さらに本発明では、抗体またはその断片をコードするＤＮＡにランダム変異法で改変したヒンジ領域をもつ抗体の作製が企図されている。簡便な方法には、ＰＣＲ変異法、飽和変異法、および変性オリゴヌクレオチド配列セットを用いた作製法があるが、これに制限されない。これらの方法は既に知られている。
【００８０】
トランスジェニック哺乳動物
本明細書中で使用する“トランスジェニック哺乳動物”とは、その動物の細胞の一つ以上、または好適には実質的に全てに、既知のトランスジェニック技術等の人工的な方法で導入された異種核酸を含んでいる非ヒト動物を示す。前駆細胞への導入、マイクロインジェクションや組換えウイルスの感染等の緻密な遺伝子操作によって、トランスジーンを細胞に直接または間接的に導入することができる。
【００８１】
“トランスジーン”とは（一つ以上の抗体ポリペプチドかその一部をコードする）核酸配列を意味し、この核酸は、導入されるトランスジェニック動物や細胞に対して、部分的または全体が非相同すなわち異種となる。または、この核酸は、導入されるトランスジェニック動物や細胞に内在する遺伝子に対して同種であるが、その動物のゲノムを改変するように挿入されるか、挿入が設計されている（自然な遺伝子とは異なる位置にこれを挿入する等）。トランスジーンは、一つ以上の転写制御配列と、イントロン等の目的の抗体をコードする核酸の最適な発現や分泌に必要だと思われる他の核酸も含むことができる。例えば乳腺では、選択した抗体の核酸に実際関係する全ての核酸、またエンハンサー配列および／またはインスレーター配列を含むこともある。抗体の配列は組織特異的プロモーターと作動可能に連結させることができる。例えば、乳腺特異的プロモーター配列はトランスジェニック動物の乳中にタンパク質を分泌させる。
【００８２】
本明細書中で使用する“トランスジェニック細胞”とはトランスジーンを含む細胞を示す。哺乳動物とは乳腺を持ち乳を産生するヒト以外の全ての動物を示す。全ての非ヒト哺乳動物が本発明に利用できる。好適な非ヒト哺乳類は反芻動物で、雌ウシ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ等である。好適な非ヒト哺乳類は反芻動物の追加的な例は、雄ウシ、ウマ、ラマ、ブタである。例えば、トランスジェニックヤギの作製法は当業において既知である。トランスジーンは、例えば参照によって本明細書に含められたEbert et al.,(1994) Bio/Technology12:699に記載されるように、マイクロインジェクションによってヤギの生殖細胞系に導入することができる。本発明を実践するために使用される全ての特定の細胞系は、健康で、良い胚を産出し、胚の前核期が観察しやすく、生殖に適応しやすいという条件で選択される。さらに、ハプロタイプが重要な選択因子である。
【００８３】
非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製法は当業において既知である。このような方法には、トランスジェニック哺乳動物を作るために哺乳動物の生殖細胞系へのＤＮＡ構成物を導入することを含むことができる。例えば、構成物の一個または数個のコピーが標準的なトランスジェニック技術によって哺乳動物の胚のゲノムに挿入されてもよい。さらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物は体細胞をドナー細胞として作製できる。体細胞のゲノムは卵母細胞に挿入され、その卵母細胞は融合および活性化され、再構成された胚を形成することができる。例えば、体細胞を使ったトランスジェニック動物の作製法は、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット；Baguisi et al.,Nature Biotech., vol.17 [1999]456-461; Campbell et al.,Nature,vol.380[1996]64-66;Cibelli et al., Science, vol.280[1998]; Kato et al.,Science,vol.282[1998]2095-2098;Schnieke et al., Science, vol.278 [1997]2130-2133; Wakayama et al.,Nature、vol.394[1998]369-374; Well et al., Biol. Reprod.,vol.57[1997]385-393に記載されている。
【００８４】
トランスフェクト細胞株
遺伝子操作を受けた細胞株がトランスジェニック動物の作製に使用することができる。遺伝子操作された構成物は従来の形質転換あるいはトランスフェクション技術によって細胞に導入することができる。本明細書中で使用する“トランスフェクション”および“形質転換”には、宿主細胞にトランスジェニック配列を導入する各種の技術が含まれ、それにはリン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法等がある。さらに、ウイルスベクター等の生物学的ベクターが以下のように使用することができる。宿主細胞への適切な形質転換または質移入については、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989および他の適当な実験室マニュアルに記載されている。
【００８５】
有用な二つのアプローチは、電気穿孔法とリポフェクション法である。以下にそれぞれを簡単に説明する。
【００８６】
ＤＮＡ構成物は次の手順に従い、電気穿孔法によってドナー細胞株に安定して導入することができる。まず繊維芽細胞、特に胚性繊維芽細胞等の体細胞を約４×１０６個／ｍｌの細胞密度でＰＢＳに再浮遊させる。直鎖ＤＮＡ５０μｇを０．５ｍｌのこの細胞浮遊液に加え、０．４ｃｍの電極ギャップキュベット（バイオラッド社）に入れる。バイオラッド・ジーンパルサーエレクトロポレーターを用い、２５ｍＡで３３０ボルトパルス、１０００μＦａｒａｄ、および電気抵抗無限で電気穿孔する。ＤＮＡ構成物が選別のためにネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ場合、３５０μｇ／ｍｌでＧ４１８（ギブコＢＲＬ社）を添加し１５日間培養すると、ネオマイシン抵抗クローンが選別される。
【００８７】
ＤＮＡ構成物は次の手順に従い、リポフェクション法によってドナー体細胞株に安定して導入することができる。約２×１０５個／ｍｌで細胞を直径３．５ｃｍのシャーレに撒き、２μｇの直鎖ＤＮＡを、ＬｉｐｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（ギブコＢＲＬ社）を用いてトランスフェクトする。４８時間後、細胞は１：１０００と１：５０００に分け、ＤＮＡ構成物が選別のためにネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ場合、Ｇ４１８を終濃度０．３５ｍｇ／ｍｌで加えると、ネオマイシン抵抗性クローンが単離され、凍結保存および核移植のために使用することができる。
【００８８】
ＤＮＡ構成物
異種タンパク質をコードするカセットは、哺乳類上皮細胞用に、カゼインプロモーター、ヤギβカゼインプロモーター、乳特異的シグナル配列、カゼインシグナル配列、βカゼインシグナル配列、および異種タンパク質をコードするＤＮＡ等の特定の組織用のプロモーターを合わせて含んだ構成物として会合することができる。
【００８９】
構成物は、非分泌タンパク質のＤＮＡ配列の下流にある３’非翻訳領域も含むことができる。このような領域は発現系のＲＮＡ転写産物を安定化し、発現系からの目的のタンパク質の生産量を増加できる。本発明で使用される構成物で有用な３’非翻訳領域には、ポリＡシグナルを提供する配列がある。このような配列はＳＶ４０スモールｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域または他の既知の３’非翻訳配列等に由来している可能性がある。一実施形態では、３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質に由来している。３’非翻訳領域の長さは重要ではないが、ポリＡ転写物の効果を安定化することが配列の発現によるＲＮＡの安定化に重要であると思われる。
【００９０】
状況に応じて、構成物はプロモーターとシグナル配列をコードしたＤＮＡ配列の間に５’非翻訳領域を含むことができる。このような非翻訳領域はプロモーターが得られた部分と同じ制御領域から成るか、または他の合成、半合成、または天然由来の異なる遺伝子から成る。本明細書中でもその特定の長さは問題ではないが、発現レベルの改善には有効と思われる。
【００９１】
構成物はまた、哺乳類上皮細胞で選択的に発現する遺伝子のＮ末端コード領域を約１０％、２０％、３０％、またはそれ以上含むことができる。例えば、Ｎ末端コード領域は、ヤギβカゼインＮ末端コード領域等の使用したプロモーターと同じにできる。
【００９２】
構成物は既知の方法を使用して作成できる。構成物は大きなプラスミドの一部として作製することができる。このような作成によって、正しく構成物のクローニングおよび選別が可能になる。構成物はプラスミドの便利な制限部位の間に位置するので、プラスミド配列から簡単に単離し、所望の哺乳動物へ導入することができる。
【００９３】
インスレーター配列
トランスジェニック動物作製に使用されるＤＮＡ構成物は、少なくとも一つのインスレーター配列を含むことができる。“インスレーター”、“インスレーター配列”、および“インスレーター要素”を本明細書中では同義で使用する。インスレーター要素は、正負いずれにも遺伝子発現を乱さず、その範囲内にある遺伝子の転写を遮断する制御要素である。好適には、インスレーター配列は転写されるＤＮＡ配列の両側に挿入される。例えば、インスレーターは約２００ｋｂから１ｋｂで、少なくともプロモーターから約１ｋｂ〜５ｋｂの５’側と、目的となる遺伝子の３’末端に挿入する。プロモーターからのと、目的の遺伝子の３’末端でのインスレーター配列の長さは、既知の技術で決定でき、その目的の遺伝子と構成物で用いるプロモーターとエンハンサーの相対的な大きさに依存する。さらに、一つ以上のインスレーター配列がプロモーターからの５’側、またはトランスジーンの３’末端に挿入される。例えば、二つ以上のインスレーター配列をプロモーターからの５’側に挿入できる。トランスジーンの３’末端のインスレーターまたは複数のインスレーターは、目的の遺伝子の３’末端、または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’フランキング配列等の３’制御配列の３’末端に挿入できる。
【００９４】
好適なインスレーターは、国際公開第９４／２３０４６号パンフレット（内容が参照により本明細書中に含められる）の記載のように、ニワトリβグロビン遺伝子座の５’末端を含み、ニワトリ５’構造性高感受性部位に一致するＤＮＡ区分である。
【００９５】
乳腺でのタンパク質の発現
トランジェニック動物の特定の組織または乳などの体液中での抗体等の異種タンパク質の発現が望まれている。異種タンパク質はそれが発現している組織または体液から回収できる。例えば、本発明の異種タンパク質（抗体等）はトランスジェニック動物の乳中に発現することができる。乳腺特異的プロモーターを使った異種タンパク質の作製法を以下に示す。
【００９６】
乳腺特異的プロモーターとシグナル配列
有用な転写プロモーターは哺乳類上皮細胞で選択的に活性化できるプロモーターで、これには、カゼイン、βラクトグロブリン（Clark et al.,[1989]Bio/Technology,7:487-492）、乳清酸性タンパク質（Gordon et al.,[1987]Bio/Technology,5:1183-1187）、ラクトアルブミン（Soulier et al.,[1992]GEBS letts.,297:13）等の乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターが含まれる。カゼインプロモーターは全哺乳類でα、β、γ、κのカゼイン遺伝子から成り、好適なプロモーターはヤギβカゼイン遺伝子（DiTullio[1992]Bio/Technology,10:74-77）由来である。プロモーターはラクトフェリンまたはブチロフィン由来もある。乳腺特異的タンパク質プロモーター、または哺乳類組織で特異的に活性化されるプロモーターはｃＤＮＡまたはゲノム配列から入手できる。好適には、それは元のゲノムにある。
【００９７】
ＤＮＡ配列の情報が、少なくとも一つあるいは数種の生物で、上に挙げた乳腺特異的遺伝子に利用できる。例えば、Richards et al.,J.Biol.Chem.,256,526-532[1981]（αラクトアルブミン ラット）；Campbell et al.,Nucleic Acids Res.,12,8685-8697[1984]（ラットＷＡＰ））；Jones et al.,J.Biol.Chem.,260,7042-7050[1985]（ラットβカゼイン））；Yu-Lee&Rosen,J.Biol.Chem.,258,10794-10804[1983]（ラットγカゼイン））；Hall,Biochem.J.,242,735-742[1987]（αラクトアルブミン ヒト）；Stewart,Nucleic Acids Res.,12,389[1984]（ウシαＳ１とκカゼインｃＤＮＡｓ）；Gorodetsky et al.,Gene,66,87-96[1988]（ウシβカゼイン）；Alexander et al.,Eur.J.Biochem.,178,395-401[1988]（ウシκカゼイン）；Brignon et al.,FEBS Lett.,188,48-55[1977]（ウシαＳ２カゼイン）；Jamieson et al.,Gene,61,85-90[1987], Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369,425-429[1988], Alexander et al.,Nucleic Acids Res.,17,6739[1989]（ウシβラクトグロブリン）；Vilotte et al.,Biochemie,69,609-620[1987]（ウシαラクトアルブミン）を参照のこと。さまざまな乳タンパク質遺伝子の構造と機能はMercier&Vilotte,J.Dairy Sci.,76,3079-3098[1993]（全目的のため参照により全文が本明細書に含まれる）にまとめられている。追加的なフランキング配列が異種タンパク質の発現を最適化するために有用な場合、この配列はプローブとして存在する配列を使ってクローン化できる。異なる生物からの乳腺特異的制御配列は、既知の同種のヌクレオチド配列、または同種タンパク質へのプローブとしての抗体を使って、そのような生物のライブラリーをスクリーニングすることで得られる。
【００９８】
有用なシグナル配列は、乳特異的シグナル配列か、真核性または原核性タンパク質を分泌させる他のシグナル配列である。好適には、シグナル配列は乳特異的シグナル配列から選択される。すなわち、それは乳中に分泌される産物をコードする遺伝子由来である。好適には、乳特異的シグナル配列は構成物で使用する乳腺特異的プロモーターに関連しており、以下に詳細を示す。シグナル配列の大きさは重要ではない。必要なのは哺乳類組織等で、所望の組換えタンパク質を効果的に分泌させるのに十分な大きさである。例えば、α、β、γまたはκカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質、ラクトアルブミンの遺伝子からのシグナル配列が使用することができる。
【００９９】
改変ＩｇＧ４抗体等の非相同抗体をコードするカセットは、複数を合わせた構成物にする。例えば構成物は、哺乳類上皮細胞用に、カゼインプロモーター、乳特異的シグナル配列、カゼインシグナル配列、および改変ＩｇＧ４抗体等の非相同抗体をコードするＤＮＡ等を含んでいてもよい。構成物は当業において既知の方法で作成できる。構成物は大きなプラスミドの一部として作製することができる。このような作成によって正しい構成物を効率的にクローニングおよび選別することができる。構成物はプラスミドの便利な制限部位の間に位置するので、プラスミド配列から簡単に単離し、所望の哺乳動物へ導入することができる。
【０１００】
卵母細胞
卵母細胞は動物の生殖周期に従い、さまざまな回数で採取できる。細胞周期の各段階の卵母細胞が採取され、減数分裂の特定の段階に進むように試験管内で誘導される。例えば、無血清培地で培養した卵母細胞は分裂中期で停止する。さらに分裂停止卵母細胞は、血清添加によって終期への進行を誘導することができる。
【０１０１】
卵母細胞は再構成胚の形成に使用される前に試験管内で成熟させることができる。この工程には通常、ヤギの卵巣等の哺乳類の卵巣からの未成熟な卵母細胞を採取し、除核前に卵母細胞が中期または終期等の所望の減数分裂段階に達するまで培地中で成熟させることが必要である。また、体内で成熟させた卵母細胞も再構成胚の形成用に使用することができる。
【０１０２】
卵母細胞は過剰排卵する雌から入手できる。端的には、ヤギ卵母細胞等の卵母細胞は雌のドナー動物の卵管から卵母細胞を追い出すことで外科的に採取できる。ヤギに過剰排卵を誘導する方法とヤギ卵母細胞の採取法も本明細書中に記述する。
【０１０３】
再構成胚の移植
再構成胚はレシピエント動物に移植され、クローン化されるかトランスジェニック哺乳動物まで成長する。例えば、再構成胚は各レシピエント動物のフィンブリアを通して卵管内腔に移植される。さらに、レシピエント動物への胚の移植法は当業において既に知られており、例えば参照文献８に記載されている。
【０１０４】
乳からのタンパク質の精製
本明細書中で使用した精製物は二つ以上の抗体分子を含んでいる。精製物はトランスジェニック動物１個体またはそれ以上によって産生される。これは、糖鎖付加の異なる分子または同じ分子を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書中で使用する“精製された物質”、“実質上純粋な抗体物質”、または“単離された抗体”とは、トランスジェニック哺乳動物の乳中に生じた他の物質が実質的に無い抗体を示す。また抗体が精製に使用されたアクリルアミド等のゲル基質等の物質からも好適に分離される。一実施形態では、“実質的に無い”とは、約３０％（乾重）未満の非抗体物質（本明細書中ではまた“乳不純物”“乳成分”とも言う。）を含む抗体精製物が得られたことを示し、より好適には非抗体物質は２０％未満となり、さらに好適には非抗体物質は１０％未満となり、最も好適には非抗体物質は５％未満である。非抗体物質には、カゼイン、脂質（可溶性脂質およびリン脂質等）、ラクトース、他の低分子（ガラクトース、グルコース等）、小ペプチド（微生物ペプチド、抗菌ペプチド等）、および他の乳タンパク質（βラクトグルブリンおよびαラクトアルブミン、ラクトフェリン、および血清アルブミン等の乳清タンパク質）が含まれる。好適には、抗体が少なくとも乾重量で１０、２０、５０、７０、８０、９５％の精製物質として得られる。また、精製物には少なくとも１、１０、１００μｇの抗体、または１、１０、１００ｍｇの抗体が含まれる。さらに、精製物には７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の会合抗体が含まれる。
【０１０６】
抗体（およびその断片）は当業において既知の標準タンパク質精製法によって乳から単離できる。例えば、Kutzko et al.,米国特許第６，２６８，４８７号の方法によって、本発明の抗体および／または断片を精製できる。
【０１０７】
乳タンパク質は工程を組み合わせることによって多くの場合単離される。例えば、上澄みの除去、遠心分離、沈降（H.E.Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry,in:Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers,NY,[1982]）、酸による沈降（米国特許第４，６４４，０５６号）、またはレンニンまたはキモトリプシンによる酵素的凝固（上記Swaisgood）によって、最初に生乳から脂質を除去することができる。次に、主要な乳タンパク質は、上清または沈殿に分画され、ある種のタンパク質は簡単に精製できることもある。他の例では、仏国特許第２，４８７，６４２号には、ウルトラフィルトレーションをサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーと併用し、脱脂乳または乳清からの乳タンパク質を単離することを記載している。乳清は最初、レンニンまたは乳酸での凝固によりカゼインを除去することで得られる。米国特許第４，４８５，０４０号では、２つの連続するウルトラフィルトレーション工程によって、乳清から保持物質内に多量のαラクトグロブリン精製物を単離する方法を記載している。米国特許第４，６４４，０５６号では、ｐＨ４．０〜５．５の酸による沈降、続く精製物の透明度を上げるための孔経０．１〜１．２μｍの膜によるクロスフローのウルトラフィルトレーション、さらに濃縮のための５〜８０ｋＤの分子で分ける膜を使用し、乳または初乳から免疫グロブリンを精製する方法を提供している。米国特許第４，８９７，４６５号では、血清、卵黄、または乳清からの免疫グロブリン等のタンパク質を、ｐＨシフトによる金属酸化物膜での連続ウルトラフィルトレーションによって濃縮することを教示している。最初にタンパク質保持物質から多量な不純物を除くために、目的のタンパク質の等電点（ｐＩ）より低いｐＨでウルトラフィルトレーションを行う。次に、その等電点よりも高いｐＨで行い、不純物を保持し、目的のタンパク質を透過させる。ＥＰ４６７ ４８２ Ｂ１では、異なるウルトラフィルトレーションによる濃縮法が教示され、カゼインと乳清タンパク質の両方を可溶化するために、乳タンパク質の等電点よりも低いｐＨ３〜４に下げて行う。３連続のウルトラフィルトレーションまたはダイアフィルトレーションでタンパク質を濃縮することで、タンパク質９０％の固体を１５〜２０％含む保持物質が得られる。
【０１０８】
他の実施例では、乳は最初に透明化することができる。一般的な透明化法は以下の工程を含むことができる：
（ａ）乳を２：１の割合で、２．０Ｍアルギニン塩酸（ｐＨ５．５）で希釈する；
（ｂ）希釈試料を約２０分間４〜８℃で遠心分離する；
（ｃ）約５分間氷上で試料を冷却し、脂質を上層で固める；
（ｄ）ピペット先端で固形脂質を“はじいて”上層から取り除く；
（ｅ）上清を新しい試験管に移す。
【０１０９】
例えば上述の方法など、当業において既知の任意のタンパク質精製法を用いて、さらなるタンパク質の精製を達成することができる。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：抗体の改変
抗体重鎖はオリゴヌクレオチド変異法で改変できる。端的には、変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、所望のＤＮＡを改変する。ここでこの鋳型は、所望のタンパク質の改変の無い天然のＤＮＡ配列を含むプラスミドあるいはバクテリオファージの一本鎖である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型の完全な２本目の相補鎖を合成しようと、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込む。そして、所望のタンパク質のＤＮＡに必要な改変が加わる。一般に、少なくとも全長２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異ヌクレオチドの両側で鋳型と完全に相補的になる１２〜１５個のオリゴヌクレオチドである。これによって、オリゴヌクレオチドが適切に一本鎖ＤＮＡの鋳型分子とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、Crea et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765[1978])に記載の方法のような、当業界で公知の技術を用いて簡単に合成できる。
【０１１１】
ヒンジ領域のアミノ酸２４１のセリンをプロリンで置換を有効にするために、セリンをプロリンで置換するオリゴＳ２４１Ｐによるオリゴヌクレオチド変異法を用いる。得られた変異体はトランスジェニックマウス作製に使用することができる。トランスジェニックマウスは搾乳され、乳中の抗体の存在と“半分子”の相対量が検証される。ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の配列と、変異に使用することができるオリゴヌクレオチドＳ２４１Ｐは以下の通りである。
【０１１２】
ＩｇＧ４ヒンジ領域
１６６８ ＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴ
残基１ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｓ２４１Ｐオリゴ
ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＣＡ
ＲＳ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
さらに、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域全体を、別の抗体のヒンジ領域で置換することができる。この変化を達成するために、置換するヒンジ領域を含むエクソンをコードするオリゴヌクレオチドが使用することができる。ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の配列、およびＩｇＧ２置換ヒンジ領域を含むオリゴヌクレオチドを以下に示す。
【０１１３】
ＩｇＧ４ヒンジ領域
１６６２ ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣ
残基１ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
ＩｇＧ２ヒンジ領域
１７２９ ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣ
残基１ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
共通部位でアスパラギンからグルタミンへ置換させるオリゴによるオリゴヌクレオチド変異法を用いて、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２にあるＮ−結合型糖鎖付加部位が除去できる。このような改変を達成するオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１１４】
２０１４ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＧＡ ＧＴＧ ＧＴＣ
残基１ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ
抗体変異型の検証
軽鎖と変異した重鎖をカゼインプロモーターに結合し、トランスジェニックマウスの作製に使用する。その後、そのマウスの抗体の発現と半分子を検証する。
【０１１５】
トランスジェニック動物
構成物をマイクロインジェクションしたヤギ受精卵の移植によって、初代（Ｆ０）トランスジェニックヤギを作製できる。トランスジェニックヤギの作製には、以下本節に記載の方法を使用することができる。この改変法によって他の動物にも使用することができることを当業者は理解するであろう。
【０１１６】
ヤギの種類と繁殖
アルパイン種、ザーネン種、トッゲンブルグ種等のスイス原産のヤギが、トランスジェニックヤギの作製には有用である。
【０１１７】
本節は、トランスジェニックヤギの作製に必要な工程を端的に記述する。これらの工程には、雌ヤギの過剰排卵、受胎のための雄との交尾、および受精した胚の採取が含まれる。採取後、受精した１細胞期の胚の前核にＤＮＡ構成物をマイクロインジェクションする。１頭のドナー雌ヤギから得られた全ての胚は一緒にされ、可能であれば単独のレシピエント雌ヤギに移植する。
【０１１８】
ヤギの過剰排卵
ドナー動物の発情期は、実験初日にノルジェストメット剤（シンクロメートＢ、ＣＥＶＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＫＳ）６ｍｇを耳の皮下に埋め込むことで同調させる。７日から９日後、プロゲステロンの体内合成を遮断するために、プロスタグランジンを投与する。１３日目から卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ,ＮＪ）を全量で１８ｍｇとなるように１日２回３日間筋肉注射する。１４日目に埋め込み剤を除去する。除去２４時間後、ドナー動物を２日間にわたって雄と交尾させる（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１１９】
胚の採取
交尾２日目（または埋め込み剤除去から７２時間後）に胚を外科的に採取する。過剰排卵させたヤギは手術前３６時間断食断水させる。ジアゼパム（登録商標バリウム）を体重１ｋｇ当たり０．８ｍｇ静脈注射し、続いてすぐにケタミン（ケタセット）を体重１ｋｇ当たり５．０ｍｇ静脈注射する。術中、毎分２Ｌの酸素とハロタン（２．５％）を気管内チューブで投与する。生殖管を中線開腹手術によって摘出する。過剰排卵を評価するために、黄体、直径６ｍｍ以上の非破裂卵胞、および卵巣嚢腫の個数を数え、卵管から採取できる胚の数を予測する。卵管小孔にカニューレを挿入し、３．０プロレンで１箇所を一時的に結紮する。２０ゲージの針を卵管接合部から約０．５ｃｍの子宮内に挿入する。滅菌リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１０〜２０ｍｌでカニューレを装着した卵管内を洗い出し、洗浄液をシャーレに回収する。この操作をもう一方の生殖管で行った後、これらを腹部に戻す。閉腹前に、癒着防止のため腹腔に滅菌グリセロール塩類溶液１０〜２０ｍｌを注入する。白線を２．０ポリジオキサノンまたはスプラミッドで単純結節縫合し、皮膚は滅菌傷クリップで閉じる。
【０１２０】
ヤギ受精卵は実体顕微鏡下でＰＢＳ卵管洗浄液から回収し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：シグマ社、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）添加のＨａｍ'ｓＦ１２倍地（シグマ社）で洗浄する。前核が見えれば、胚に直ちにマイクロインジェクションを行う。前核が見えない場合は、見えるようになるまで、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿培養器で短期間培養する（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２１】
マイクロインジェクション
１細胞期のヤギ胚を窪み付きスライドグラス上に培地とともに滴下し、上にオイルをのせる。二つの可視化前核をもつ受精卵を、ツァイス社製ノマルスキー固定ステージ付き正立顕微鏡でフレームポリッシュ保持マイクロピペットに固定する。ヤギβカゼイン遺伝子制御配列に作動可能に連結している目的のコード配列を含むＢＣ３５５ベクター等、目的のＤＮＡ構成物を、インジェクション用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）で細いガラスマイクロ針を用いて、前核にマイクロインジェクションする（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２２】
胚発生
マイクロインジェクション後、生残胚は、胚移植用のレシピエント動物が準備されるまで、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿培養器で培養する（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２３】
レシピエント動物の準備
レシピエント動物の耳にノルジェストメット剤６ｍｇを埋め込み（シンクロメートＢ）、発情が同調される。１３日目に埋め込み剤を除去し、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、シグマ社）による非過剰排卵注射（４００Ｉ．Ｕ．）を１回行う。レシピエント動物は発情同調を補強するために去勢雄と交尾させる（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２４】
胚移植
１頭のドナー動物からの全ての胚は一緒にされ、できるだけ１頭のレシピエント動物に移植する。手術手順は卵管へのカニューレ挿入以外、上記の胚採取で述べた方法と同じである。胚はガラスマイクロピペットでフィンブリアを通して卵管内腔に、最小量の１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地とともに移植する。卵巣に６〜８以上の排卵点をもつ動物はレシピエント動物として不適当である。閉腹および術後処置はドナー動物の場合と同じである（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２５】
妊娠分娩の監視
発情を停止した日から４５日目に、超音波検査によって妊娠を確認する。１１０日目に、妊娠の確定と胎児ストレス検査のために２回目の超音波検査を行う。１３０日目、妊娠したレシピエント動物に破傷風トキソイドとクロストリジウムＣ＆Ｄで予防接種する。セレンとビタミンＥ（Ｂｏ−Ｓｅ）を筋肉注射で、イベルメクチンを皮下注射で投与する。１４５日目、妊娠ヤギを滅菌室に移し、約１４７日目の陣痛の誘発を前に環境に順応させる。１４７日目に、ＰＧＦ２ａ（登録商標ルタライズ、アップジョン社（Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ Ｍｉｃｈｉｇａｎ））４０ｍｇで分娩を誘発する。この投与は筋肉注射で２回に分けて行う。１回目２０ｍｇ投与の４時間後に２回目２０ｍｇを投与する。初回投与時から昼夜を通して定期的に観察する。翌朝には観察は３０分毎にまで増やす。初回投与から３０〜４０時間後に分娩がおきる。出産後、初乳を回収するため搾乳し、胎盤の排泄を確認する。
【０１２６】
Ｆ０動物のトランスジェニック性質の検証
トランスジェニックＦ０動物を調べるために二つの異なる細胞株からゲノムＤＮＡを単離する。これはモザイクトランスジェニックを見逃さないためである。モザイク動物とは、少なくとも１コピーのトランスジーンもない細胞をもつヤギとして定義される。従って、耳組織試料（中胚葉）と血液試料を生後２日目のＦ０動物から採取し、ゲノムＤＮＡを単離する（Lacy et al.,A laboratory Manual[1986]Cold Springs Harbor,NY；Methods Enzymology[1987]152,180-183）。ＤＮＡ試料は、ヒトデコリン遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（Gould et al.,Pro.Natl.Acad.Sci.[1989]86,1934-1938）と、ランダムプライマー法によるヒトデコリンｃＤＮＡプローブ（Feinberg and Vogelstein,Anal.Bioc.[1983]132,6-13）を用いたサザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. [1980] 77:5201-5205）によって分析される。分析感度を１０％の体細胞におけるトランスジーン１コピーの検出によって推定する。
【０１２７】
作製ヤギの継代と選別
上記手順は、トランスジェニック初代（Ｆ０）ヤギだけでなく他のトランスジェニックヤギの作製にも使用することができる。例えば、トランスジェニックＦ０初代ヤギは、雌の場合、乳を産生するようになる。また雄の場合、トランスジェニックの雌の子孫を産出できる。このトランスジェニック初代雄を非トランスジェニックの雌と交配させて、トランスジェニックの雌の仔を作れる。
【０１２８】
トランスジーンの伝播と関連特性
ヤギ系統における目的のトランスジーンの伝播を、耳組織と血液のＰＣＲ法およびサザンブロット法によって分析する。例えば、初代雌と３頭のトランスジェニックの仔のサザンブロット分析では、世代間での再改変またはコピー数の変化は全く見られない。サザンブロット分析はヒトデコリンｃＤＮＡプローブを用いる。ブロットはベータスコープ６０３（Ｂｅｔａｓｃｏｐｅ６０３）上で分析し、対照にヤギβカゼイン内因性遺伝子を用いて、トランスジーンのコピー数を決定する。
【０１２９】
発現レベルの評価
トランスジェニック動物の乳中にあるトランスジェニックタンパク質の発現レベルは、酵素法かウェスタンブロット法で決定する。
【０１３０】
実施例２：抗体ヒンジ領域を改変したマウスモデル
トランスジェニック動物での治療用組換え抗体の生産の可能性を検証するために、ＫＭＫ９１７抗体のｃＤＮＡをトランスジェニックマウスの乳腺で発現させた。そして、ＫＭＫ９１７をマウス乳から精製し、ＫＭＫ９１７をトランスフェクトしたＳｐ２／０細胞のフェッドバッチ培養液由来のＫＭＫ９１７と比較した。ＫＭＫ９１７トランスジェニックマウスはＧＴＣバイオセラピューティック社（ＧＴＣ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で作製した。続く精製と評価分析は下請会社で行われた。
【０１３１】
ＫＭＫ９１７トランスジェニックマウスの継代
３種類のＫＭＫ９１７をコードする構成物が作製された。
【０１３２】
１．１０９９／２０１０ ＫＭＫ９１７野生型
２．２０１２／２０１４ ＫＭＫ９１７ヒンジ変異型（２２９Ｓｅｒ→Ｐｒｏ）
３．２０１２／２０１７ ＫＭＫ９１７ヒンジ＋Ｃｈ２変異型（２２９Ｓｅｒ→Ｐ
ｒｏ、２３６Ｌｅｕ→Ｇｌｕ）
変異型構成物は、野生型構成物由来のＫＭＫ９１７物質で見られる半分子抗体の割合を減少させる目的で作製された。これらの構成物をもとに、全１５系統のトランスジェニックマウスが作製された（系統名と概要は表１ａ〜ｃを参照）。表１にはウェスタンブロット法によるマウス系統でのＫＭＫ９１７の発現レベルの推定値が示されている。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【表１ｃ】
トランスジェニックマウスの乳由来ＫＭＫ９１７の精製と評価
全１５系統のトランスジェニックマウスの乳試料を採取（Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２世代）し、ＰＢＳで希釈した（詳細は表１を参照）。そして、試料からＫＭＫ９１７抗体が精製され分析評価した。分析の概要は図２を参照のこと。
【０１３３】
コロイド状乳成分の除去のため、希釈乳試料はソーバル社製高速遠心分離機で３０分間遠沈させた（ＳＳ−３４ローター、２０，０００ｒｐｍ）。次に、上清を沈殿物から吸い上げ、上層の脂肪分をシリンジで除去した。かすかに乳白色の上清を０．２２μｍマイレックスＧＶ膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）で濾過し、プロテインＡカラム（マブセレクト、ＡＰＢ社（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＡＰＢ））１ｍｌにのせる。結合した抗体をｐＨ３．２の２０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液で溶出する。抗体分画はｐＨ５．５に調整し、フィルター滅菌後４℃で保存した。
【０１３４】
トランスジェニックマウスの乳中ＫＭＫ９１７含有量の決定
ヒトＩｇＧ４の検出には市販のＥＬＩＳＡキットを使用し、希釈乳試料のＫＭＫ９１７の濃度を測定した。未希釈のマウス乳におけるＫＭＫ９１７の濃度を表２に示す。
【表２】
【０１３５】
次に、選択したマウス系統（各構成物の２または３系統）のＫＭＫ９１７を、３．２に記載のプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。その後、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）で、抗体分画中のＫＭＫ９１７含有量が決定された（表２）。他の分析に利用できるＫＭＫ９１７の全量も表２に示す。
【０１３６】
ＳＥＣ分析により、全抗体試料は９５％以上の単量体抗体を含むことがわかった。測定された抗体分画中のＫＭＫ９１７量とプロテインＡ精製での使用量をもとに、マウス乳試料中のＫＭＫ９１７の含有量が逆算された。逆算されたＫＭＫ９１７のマウス乳中濃度は３．２〜２２．１ｍｇ／ｍＬで、ＩｇＧ４ＥＬＩＳＡ法による直接測定による値と非常に近似していた（表２）。
【０１３７】
精製ＫＭＫ９１７物質中のマウス抗体の存在
プロテインＡによる精製では、ヒトＩｇＧアイソタイプだけでなく、乳中に含まれる可能性があるマウス抗体の類似型も濃縮してしまう。そこで、精製ＫＭＫ９１７中のマウス免疫グロブリンの存在が調べられた。ＳＰＲ法（バイアコア３０００）と“捕獲分子”として固定した抗マウスＩｇＧの有無を用いて、非常に少量のマウスＩｇＧサブクラスが精製ＫＭＫ９１７物質で検出された（≦０．１％）。また、ＳＥＣ法とヒトＩｇＧ４ＥＬＩＳＡ法による精製物の濃度測定からも同様な結果が得られた（表２）。ＳＥＣ法ではＫＭＫ９１７だけでなくマウス抗体も測定できるので、著しい量のマウス免疫グロブリンは、ＳＥＣ法での高濃度によって示されるだろう。対照的に、ＥＬＩＳＡ法はヒトＩｇＧのみを対象としているのでＫＭＫ９１７のみを検出できる。
【０１３８】
“半分子抗体”の存在とその量
トランスジェニックマウス系統の精製ＫＭＫ９１７物質にある半分子抗体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＤＳＣＥ法を用いて決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、野生型構成物をトランスフェクトしたマウス試料が、変異型をトランスフェクトしたマウス試料よりも半分子抗体の割合が高いことを明らかにした。
【０１３９】
この結果をＳＤＳ−ＤＳＣＥ法によって確認した結果、野生型の構成物によるトランスジェニック系統由来のＫＭＫ９１７物質の半分子抗体は２４と３４％であった。変異型の構成物からのＫＭＫ９１７物質では、半分子抗体の割合は５％未満であった。特に、単一変異型構成物由来において低かった（表３のまとめを参照）。
【０１４０】
異なる構成物由来のＫＭＫ９１７の生物学的活性を検証するために、蛍光法を使った細胞分析法を用いた。細胞のある受容体がその対象物と結合する際に、ＫＭＫ９１７と競合させる。細胞培養（Ｓｐ２／０）由来のＫＭＫ９１７と比較した結果、野生型と変異型をトランスフェクトしたマウス由来のＫＭＫ９１７は、どちらも十分な生物学的活性を示した（表３を参照）。
【０１４１】
他の特性として、ＫＭＫ９１７のリガンドターゲットとの結合および解離の速度定数を、ＳＰＲ法（バイアコア３０００）によって決定した。全試料で、トランスジェニックマウス由来物質の定数はＳｐ２／０由来のＫＭＫ９１７で得られた値と一致した。これは、ＫＭＫ９１７の結合親和性と生物学的活性が、（１）発現される場合、トランスジェニックマウスまたは細胞株Ｓｐ２／０で類似しており、さらに（２）ｃＤＮＡに導入した変異による影響を受けないことを示唆する。
【表３】
【０１４２】
糖鎖付加の様式
陽イオン交換ＨＰＬＣによって精製ＫＭＫ９１７物質を分析した。特殊法を用いて、Ｃ末端デスモシン―リシン（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）変異抗体（変異型Ｋ０、変異型Ｋ１、変異型ｋ２）の分離、抗体の異なる糖鎖型の解析を成し遂げた。例えば、シアル酸非付加型糖鎖とシアル酸付加型糖鎖、複合型糖鎖とマンノース型糖鎖の分離である。
【０１４３】
図３ａ〜３ｇは、細胞培養から得られたＫＭＫ標準試料と、乳試料から得られた抗体のクロマトグラムである。基準試料の３つの主要ピークはＫ０、Ｋ１、およびＫ２変異型と一致した。
【０１４４】
トランスジェニック乳から得られた試料はより不均質である。二つの野生型試料では、基準試料よりも早く溶出されるピークが見られる。これはシアル酸付加型のためだと思われる。変異型系統由来の抗体試料は非常に不均質であり、基準試料よりも遅く溶出される異なるピークがある。
【０１４５】
異なる糖鎖型がどの程度観察された不均質性の原因となっているかを解明するために、野生型と変異型の試料の糖鎖をＮ−グリコシダーゼ処理によって除去した。図４ａ〜４ｄは、グリコシダーゼ処理前後の野生型試料のＣＥｘ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。野生型試料は糖鎖除去後、非常に高い均質性を示した。４：１の割合で得られた二つのピークは、抗体のＫ０およびＫ１型に非常によく一致している。これらの結果から、野生型抗体で見られた不均質性は主に糖鎖型の違いによるものであると結論付けられる。
【０１４６】
系統１〜３６由来の変異抗体もまた、同様な割合で二つのピークを示す。しかし、二つのピークは非常に離れて溶出されており、それぞれサイドピークも伴っている（図３ｂ）。このようなピークは、変異型の中に異なる抗体の型が存在することを示唆し、部分的な折りたたみのゆるみによる可能性が考えられる。従って、変異抗体のＣＥｘ−ＨＰＬＣ分析で見られる広範な不均質性は、糖鎖型の多様性だけでなく、他の原因によるようにも思われる。
【０１４７】
さらに、精製ＫＭＫ９１７の糖側鎖の構造が解析された。糖側鎖をペプチド・Ｎ−グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で酵素切断した後単離し、２−アミノベンズアミドで標識した。個々の糖鎖構造はＧｌｙｃｏ Ｓｅｐ Ｎ-カラムを用いてＨＰＬＣで分離し、蛍光検出によって定量した。図５ａ〜ｃは、下記由来のＫＭＫ９１７の分析クロマトグラムである：
ａ）野生型トランスジェニックマウス
ｂ）変異型トランスジェニックマウス
ｃ）培養細胞
クロマトグラムでは、トランスジェニックマウス由来ＫＭＫ９１７の糖鎖パターンが、培養細胞由来の抗体とは有意に異なることを示している。変異型の様式は野生型と質的には一致するが、量的には幾分異なっている。他のよく知られている糖鎖構造と比較すると、いくつかのピークはＨＰＬＣクロマトグラムによって同定することができる。分子構造は表４に示す。
【表４】
【０１４８】
ＨＰＬＣから得られた分子構造を確認し、溶出の遅いピークについてさらに解析するために、糖鎖混合液をマススペクトロメトリーＭＡＬＤＩ−ＭＳ陰イオンモードで分析し、シアル酸含有糖鎖ＢｉＧ２Ｓ１が得られた。
【０１４９】
トランスジェニックマウスの乳腺でのＫＭＫ９１７の発現量は、３．２〜２２．１ｍｇ／ｍＬと測定された。３種の構成物由来のＫＭＫ９１７の性質をさらに解析すると、“半分子抗体”の量は野生型構成物１０９９／２０１０由来物質で高かった（各２４と３４％）。２２９のセリンをプロリンに変異したことで（構成物２０１２／２０１４ヒンジ変異型と２０１２／２０１７ヒンジ＋Ｃｈ２変異型）、“半分子抗体”量は有意に減少し、２０１２／２０１４では２％未満、２０１２／２０１７では５％未満となった。３種の構成物由来物質の生物学的活性は、培養細胞由来ＫＭＫ９１７と比較した場合差異は見られなかった。
【０１５０】
本発明は、本発明の詳細な説明と関連して説明してきたが、上記説明は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を解説することを意図しており、その範囲を制限するものでないことが理解されるべきである。他の実施態様、利点、および改変は続く請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】核移植によるクローン動物作製工程の略図
【図２】ヒンジ領域改変に関するＫＭＫ９１７による分析の概要
【図３Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｄ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｅ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｆ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｇ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図４Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±野生型エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±野生型エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±ヒンジおよびＣＨ２変異体エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｄ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±ヒンジおよびＣＨ２変異体エンドグリコシダーゼＦ処理
【図５Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７ １０９９／２０１０ 野生型の糖鎖パターン
【図５Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７ ２０１２／２０１４ ヒンジ＋Ｃｈ２変異体の糖鎖パターン
【図５Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７のフルスケールの糖鎖パターン
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体の製造方法を提供する。本方法は、体細胞および生殖細胞が少なくとも一つずつの重鎖および軽鎖およびヒンジ領域をコードする配列をもつトランスジェニック哺乳動物を提供することを含み、該ヒンジ領域は、生じた組み換え抗体の安定性と折りたたみ特性を改善するために、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧはヒト成人の血清中に最も多量にあるアイソタイプ抗体で、全血清免疫グロブリンの約８０％を占める。ＩｇＧは、二つのＰＵ重鎖と二つの（Ｐ２およびＳＥ）の軽鎖からなる４量体構造の単量体分子である。重鎖および軽鎖は一般にジスルフィド結合により相互連結されている。さらに抗体には、分子に部分的な柔軟性を与えるプロリン残基が多量なヒンジ領域がある。ＩｇＧは、抗原の凝集、オプソニン作用、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、胎盤の通過、補体の活性、毒の中和、バクテリアの不動化、ウイルスの中和等、さまざまな生物学的機能を示す。
【０００３】
ＩｇＧ４抗体は、エフェクター機能がないため治療用剤として使用することができる。しかし、ＩｇＧ４抗体は、酸処理または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）上で“不安定”な特性を有し、結果的に８０ＫＤａのタンパク質になってしまう（“半分子(half molecule)”としても知られる）。二つの重鎖がジスルフィド結合で連結しなくなると、この半分子が生じる。
【０００４】
組織培養でのＩｇＧ４の産生は各種成功している。細胞株によって、ＩｇＧ４の“半分子”の割合は５〜２５％とさまざまである。ＩｇＧ４分子を作る際の問題点の一つは、全ＩｇＧ４分子からこの半分子型を分離する簡便な方法がないことである。多くの生産現場では、工程で生じる“半分子”がさまざまなレベルで存在することを単純に受け入れている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は一部には、トランスジェニック動物の乳中で抗体を製造すると、結果的に５０％以下の抗体が半分子型になり、その抗体のヒンジ領域の改変によって、そのような動物の乳中で、会合抗体(assembled antibody)が増加することの発見に基づく。理論による裏づけは求めていないが、トランスジェニック動物の乳中で見られる半分子の増加は、一部には、乳腺が、十分な分泌をもたらしはているが、抗体の重鎖間の適切な折りたたみおよび／またはジスルフィド結合の形成をもたらすことができないためであろう。そのような抗体のヒンジ領域の改変で、半分子のレベルが低減される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、一実施態様において、本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体の製造方法に関するものである。該方法は、外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも１つの重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域をコードし、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している配列を有する体細胞および生殖細胞をもつトランスジェニック哺乳動物を提供することを含み、このヒンジ領域は重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。
【０００７】
一実施形態では、少なくとも抗体の７０％、７５％、８０％、９０％、９５％が、会合型として乳中に存在している。他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の体細胞および生殖細胞はさらに、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗体結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含む。
【０００８】
他の実施形態では、本方法は、抗体成分を供給するために、トランスジェニック哺乳動物から乳を得る工程を含むことができる。さらに、本方法は、乳中から外因性抗体を精製する工程も含むことができる。
【０００９】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。好適な実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００１０】
抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等、どのようなクラスの抗体からでも作製できる。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００１１】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域が、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換される。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換される。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００１２】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００１３】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の好適な実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００１４】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態は、重鎖または軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変を含むことができる。
【００１５】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００１６】
例えば、この抗体は、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体、あるいはそれらの断片であってもよい。
【００１７】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、体細胞および生殖細胞が改変抗体のコード配列を含むトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関するものであり、その改変抗体のコード配列は改変ヒンジ領域をもつ抗体分子またはその一部をコードしている。本方法は、哺乳動物に構成物を導入する工程を含み、該構成物は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその機能断片およびヒンジ領域をコードする配列を含む。該ヒンジ領域は、産生される抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されている。一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、構成物は、軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含み、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している。
【００１９】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。一実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００２０】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００２１】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、重鎖定常領域またはその一部はＩｇＧ由来であり、その抗体のヒンジ領域はＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００２２】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００２３】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００２４】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態は、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変を含むことができる。
【００２５】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００２６】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００２７】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。好適な一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域が改変されている。
【００２８】
本発明は、抗体のコード配列をトランスジェニック動物に導入するための、当業者にとって既知である全ての方法を企図している。例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域等、抗体の一部をコードしているコード配列は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーター等の別個のプロモーターの支配下で、それぞれの構成物として導入することができる。各プロモーターは、同種の哺乳類上皮細胞プロモーター（二つともカゼインプロモーターを含んだ構成物等）であっても、または異なる種類の哺乳類上皮細胞プロモーター（カゼインプロモーターとβラクトグロブリンプロモーターをそれぞれ含んだ構成物等）であってもよい。従って、関連する一実施形態では、本発明は、会合外因性抗体またはその一部を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに連結した外因性抗体の軽鎖をコードした配列を含む構成物、または哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに連結した外因性抗体の変異した重鎖をコードする配列を含む構成物を哺乳動物に導入する工程も含んでいる。他の実施形態では、構成物には、変異した重鎖、軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列も含まれる。変異重鎖および軽鎖またはその一部をコードした配列は哺乳類上皮細胞で発現を導く各種プロモーターに連結され、その支配下におかれる。例えば、改変抗体のコード配列はポリシストロニックが可能で、例えば、重鎖コード配列と軽鎖コード配列等は、その間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有することができる。各プロモーターの支配下にある場合、プロモーターは哺乳類上皮細胞の同種プロモーターの支配下にあってもよく（二つの配列がβカゼインプロモーターの支配下にある等）、またはそれぞれが異なる哺乳類上皮細胞プロモーターの支配化にある（一つの配列はβカゼインプロモーターで、もう一つはβラクトグロブリンプロモーター等）。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、会合外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、生殖細胞および体細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードした配列を含むトランスジェニック哺乳動物からの細胞を提供する工程と、その細胞に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列からなる構成物を導入する工程とを含む。さらにこの重鎖またはその一部には、重鎖定常領域と通常連結しているヒンジ領域を改変したヒンジ領域も含まれる。また他の実施形態では、本発明は、会合外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物の作製法を提供し、該方法は、生殖細胞および体細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列を含むトランスジェニック哺乳動物からの細胞を提供する工程と、その細胞に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列からなる構成物を導入する工程とを含む。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明では、外因性抗体を乳中に発現するトランスジェニック哺乳動物が特徴であり、その体細胞および生殖細胞は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片、およびヒンジ領域をコードする改変抗体のコード配列を含む。このヒンジ領域は、産生される抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域を改変した。
【００３１】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。好適な一実施形態では、トランスジェニック動物は、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウサギであってよい。
【００３２】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００３３】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域が、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換される。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換される。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域が、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換される。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００３５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。より好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００３６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００３７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００３８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００３９】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００４０】
好適な一実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるように、ヒンジ領域は改変されている。他の実施形態では、改変抗体のコード配列には、さらに軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列を含む。軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結して、外因性重鎖可変領域、重鎖定常領域（またはその一部）、およびヒンジ領域をコードする配列と同じプロモーターの支配下にできる。例えば、改変抗体のコード配列はポリシストロニックが可能で、重鎖コード配列と軽鎖コード配列等は、その間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有することができる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は乳成分と本明細書中に記載する抗体成分を含む組成物を提供する。好適には、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％の外因性抗体が会合型として存在する。他の実施形態では、組成物中の外因性抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が会合型であるようにヒンジ領域が改変された。
【００４２】
本抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等任意のクラスの抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００４３】
本発明では、抗体のヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域の全部または一部は、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００４４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、抗体の重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００４５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。さらに好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００４６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００４７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００４８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００４９】
他の実施形態では、トランスジェニック哺乳動物の乳には実質的に外因性抗体の半分子型が存在しない。好適には、トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはそれ以上となる（例えば２０：１）。
【００５０】
別の好適な実施形態では、組成物は実質的に乳成分が無く、例えば、乳成分は、重量パーセントで１０％、５％、３％、２％、１％、０.５％、０.２％未満となっている。乳成分には、カゼイン、脂質（可溶性脂質およびリン脂質等）、ラクトース、他の低分子（ガラクトース、グルコース等）、小ペプチド（微生物ペプチド、抗菌ペプチド等）、および他の乳タンパク質（βラクトグルブリンおよびαラクトアルブミン、ラクトフェリン、および血清アルブミン等の乳清タンパク質）が含まれる。
【００５１】
さらに別の実施態様では、本発明は、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターと作動可能に連結している重鎖可変領域またはその抗原結合部位、重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域をコードする配列を含む核酸を提供する。このヒンジ領域は、重鎖定常領域と通常連結しているものから改変されている。
【００５２】
使用されるプロモーターは、例えば、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター等、哺乳類上皮細胞で発現を導く任意の既知のプロモーターであってよい。重鎖可変領域またはその抗原結合部位、重鎖定常領域またはその機能断片、およびヒンジ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、またはこれらの断片等、任意の抗体クラスの任意の抗体から作成することができる。好適な一実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。他の好適な実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００５３】
本発明では、ヒンジ領域でのさまざまな改変が企図されている。例えば、一実施形態で、ヒンジ領域の全部または一部が改変されている。他の実施形態では、ヒンジ領域の全部または一部が、例えば重鎖定常領域および／または可変領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換される。好適な一実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体のヒンジ領域またはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。他の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体の重鎖定常領域またはその一部をもつ抗体のヒンジ領域またはその一部は、別のＩｇＧ抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換することができる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、別のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域で置換することができる。さらに他の好適な実施形態では、ＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域をもつ抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３由来のヒンジ領域で置換することができる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域で天然の核酸配列とは異なるように、該ヒンジ領域が改変された。他の実施形態では、ヒンジ領域のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が、抗体の重鎖定常領域に伴ったヒンジ領域で天然のアミノ酸配列とは異なる。
【００５５】
好適な一実施形態では、重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、異なるクラスまたはサブクラスの抗体の重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の同じ位置にあるアミノ酸で置換されるように、ヒンジ領域が改変された。好適には、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ抗体の一つのヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。他の好適な実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４等のＩｇＧ抗体由来で、ヒンジ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体等の異なるサブクラスの抗体のヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸で置換されている。
【００５６】
他の実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸をシステイン残基で置換することができる。変更形態には、重鎖および軽鎖、または抗体の重鎖のヒンジ領域等で、抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位の改変が含まれる。
【００５７】
他の実施形態では、産生される抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４由来で、ヒンジ領域のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。例えば、ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基をプロリン残基で置換することができる。
【００５８】
例えば、この抗体はキメラ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの断片であってもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態で、核酸はポリシストロニックが可能である。例えば、重鎖コード配列と軽鎖コード配列は、その間に内部リボソーム挿入部位（ＩＲＥＳ）を入れること等によって同じプロモーターの支配下における。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本明細書において、以下の略語は指定の意味を有する：
主な略語
体細胞核移植 （ＳＣＮＴ）
培養内部細胞塊細胞 （ＣＩＣＭ）
核移植 （ＮＴ）
合成卵管液 （ＳＯＦ）
ウシ胎児血清 （ＦＢＳ）
ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）
ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）
高圧液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）
用語解説
ウシの（Ｂｏｖｉｎｅ）―雌ウシのおよび各種雌ウシに関すること
ヤギの（Ｃａｐｒｉｎｅ）―ヤギのおよび各種ヤギに関すること
細胞カプレット―融合および／または活性化前の除核卵母細胞および体細胞または胎児の核体
サイトカラシンＢ―ある種の真菌の代謝産物で、核分裂に影響が無く細胞分裂を選択的かつ可逆的に阻害する
細胞質体―真核細胞の細胞質の物質
融合スライド―離れて固定された平行電極用のスライドグラス。細胞カプレットが電極間に置かれ、融合および活性化のための電流を受ける
核体―細胞から除核処理で得られ、細胞質と細胞膜の狭い縁によって囲まれている細胞の核
核移植―ドナー細胞からの核を除核された卵母細胞へ移植しクローニングする方法
ヒツジの（Ｏｖｉｎｅ）―ヒツジおよび各種ヒツジに関すること
単為生殖の―精子の侵入が無い卵からの胚発生
ブタの（Ｐｏｒｃｈｉｎｅ）―ブタおよび各種ブタに関すること
再構成胚―再構成胚とは、除核処理で遺伝物質を除いた卵母細胞。成体または胎児の体細胞の遺伝物質をこの卵母細胞に入れ、融合させることで“再構成”される
選択試薬―適した抵抗性遺伝子を持たない微生物または細胞を死滅および／またはその成長を阻害するように働く選択マーカーとして機能する化合物、混合物、または分子。本発明によるとこのような試薬は現在たくさん有り、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ガンシクロビル、ＦＩＡＵ等がある。好適には、本発明では選択試薬量を増加させて、一つのインテグレーション部位だけをもつ全細胞株（異型接合動物および／または細胞等）を死滅させる
体細胞―生殖細胞以外の生物の体の全ての細胞
体細胞核移植―治療用クローニングとも呼ばれ、体細胞を除核した卵母細胞に融合させる過程。体細胞の核はその遺伝情報を提供し、卵母細胞は胚発生に必要な栄養素とエネルギー生産物質を提供する。融合が起こると細胞は全能性を示し、最終的に胞胚になる。その時点で内部細胞塊を単離する
トランスジェニック生物―別の生物由来の遺伝物質を実験的に移植した生物で、宿主は自分の遺伝情報に加えて、その染色体に移植された遺伝子の遺伝情報を獲得する
有蹄類―蹄をもつ典型的な草食四足獣の哺乳類、およびこれに関すること。ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびウマ等多種存在する
異種移植―一つの動物由来の生きた細胞、組織、器官を使用し、別種の動物（一般的にはヒト）に移植または挿入する手技、または、臨床体外環流で使用される。
【００６１】
本発明はトランスジェニック哺乳動物の乳中での抗体産生に関する。本発明のさまざまな態様は、抗体とその断片、抗体とその断片のトランスジェニック哺乳動物の乳中での産生法、および体細胞および生殖細胞が改変抗体のコード配列を含むトランスジェニック哺乳動物の作製法に関する。哺乳類上皮細胞で改変抗体のコード配列を発現させる核酸配列も提供される。
【００６２】
本発明をより容易に理解するために、ある種の用語が定義される。定義は“詳細な説明”中の全般にわたって使用されている。
【００６３】
抗体とその断片
本明細書中で使用する抗体の“クラス”とは、抗体の５つの主要なアイソタイプを示し、それにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがある。抗体の“サブクラス”とは、各クラスの中のアミノ酸の差異に基づく抗体の下位分類を示す。例えば、ＩｇＧと指定される抗体のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４等のサブクラスへと分けることができ、ＩｇＡと指定される抗体のクラスは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスへと分けることができる。
【００６４】
“抗体”とは、少なくとも一つおよび好適には二つの重鎖（Ｈ鎖）可変領域（ＶＨ）と、少なくとも一つおよび好適には二つの軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（ＶＬ）と、少なくとも一つおよび好適には二つの重鎖定常領域から成るタンパク質を示す。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、“フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれる比較的安定した領域と、そこに散在する“相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分類できる。ＦＲとＣＤＲの大きさは正確に決定されている（参照によって本明細書に組み込まれるKabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Intrest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publicaition No.91-3242; Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917を参照）。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから成り、アミノ末端からカルボキシル末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。
【００６５】
抗体はさらに軽鎖定常領域を含むことができ、それによって重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖が形成される。一実施形態では、抗体が二つの重鎖と二つの軽鎖の４量体で、重鎖および軽鎖はジスルフィド結合で内部連結している。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインからなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬからなる。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインがある。抗体の定常領域は一般に宿主組織または因子への結合を媒介する。これには免疫系の各種細胞（エフェクター細胞等）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）が含まれる。
【００６６】
抗体はさらに以下に詳しく記述するヒンジ領域を含むことができる。本明細書中で使用する“会合(assembled)”抗体とは、ジスルフィド結合の内部結合によって重鎖が互いに連結している抗体を示す。各重鎖のヒンジ領域は、少なくとも一つ、またはしばしばいくつかのシステイン残基を含む。会合抗体では重鎖のシステイン残基は整列しているので、二つの重鎖および軽鎖の４量体全体に共有結合するヒンジ領域内のシステイン残基の間にジスルフィド結合は形成される。従って、完全に会合抗体が二つの抗原結合部位を有し二価となる。本明細書中で使用する“抗体”（または“免疫グロブリン”）とは、完全長抗体の断片も指す。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結した二つのＦａｂ断片から成り、二価である。これらの抗体断片は従来の手法を用いて得られ、元の抗体と同様の有効性があることが検証されている。
【００６７】
抗体の“抗原結合断片”（または“機能断片”）とは、抗原と特異的に結合できる抗体の一つ以上の部分を示す。“抗原結合断片”という用語には、一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）も含まれる。
【００６８】
本明細書中で使用する“キメラ抗体重鎖”とは、ある抗体重鎖の一部を有す抗体重鎖を示す。例えば、可変領域が少なくとも８５％、好適には９０％、９５％、９９％、またはこれ以上、特定の生物種の抗体重鎖の対応するアミノ酸配列と一致する場合、または特定の抗体のクラスまたは型に属しながら、残りの抗体重鎖の一部（定常領域等）が別の抗体分子の対応するアミノ酸配列に実質的に一致する場合である。例えば、重鎖可変領域はある生物種の抗体の重鎖可変領域に実質的に一致する配列をもつが（“供与”抗体、げっ歯類抗体等）、定常領域は別の生物種の抗体の定常領域に実質的に一致する（“受容”抗体、ヒト抗体等）。供与抗体が試験管内で生成、またはファージ提示法によって作られる。
【００６９】
“ヒト化”または“ＣＤＲ移植”軽鎖可変領域とは、一つ以上のＣＤＲから成る抗体の軽鎖、またはわずか一つまたは二つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列がある生物種または抗体クラスまたは型からの一つ以上の対応するＣＤＲに一致する軽鎖を示す。例えば“供与”抗体（非ヒト（一般的にはマウスまたはラット）免疫グロブリン、または試験管内生成免疫グロブリン）、および天然の免疫グロブリンフレームワーク（ヒトフレームワーク等）または共通フレームワーク等、アミノ酸配列の約８５％以上および好適には９０％、９５％、９９％またはそれ以上が、別の生物種または抗体のクラスまたは型からの対応する受容抗体の一部に一致するフレームワーク領域である。一実施形態では、フレームワーク領域には少なくとも約６０、より好適には約７０の天然の抗体のフレームワーク（ヒトフレームワーク）または共通フレームワーク等の受容抗体軽鎖可変領域のフレームワークと一致するアミノ酸残基が含まれる。
【００７０】
“非相同抗体”または“外因性抗体”とは、その哺乳動物で通常作られない抗体、乳腺で通常作られない抗体（抗体が血清のみに存在等）、または乳腺で作られるがその生産過程で発現レベルが増加する抗体を示す。
【００７１】
キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体等本明細書中に記載されたどの抗体も、さらにその配列が改変されることもある。例えば配列は付加、欠失、保存性置換等の置換によって変更できる。
【００７２】
抗体のヒンジ領域
本発明に記載の方法は、トランスジェニック動物の乳中での抗体を産生することにかかわり、その抗体のヒンジ領域は、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変された。このような定常領域は、本明細書中では“変異重鎖定常領域”と呼ばれる。“通常連結”とは、天然の抗体のヒンジ領域と重鎖定常領域の間の連結を示す。本明細書中で言う“天然の”とは、天然の微生物中等、天然に検出される抗体を示す。例えば、天然微生物中に存在し、人工的に改変されていない抗体またはその断片が、自然に生じたものである。この用語はヒンジ領域と抗体の重鎖定常領域（ＣＨ１領域等）の少なくとも一部分の間の連結についても示す。本明細書中で、この重鎖定常領域の一部とヒンジ領域は一つの抗体中にともに“自然に生じて”検出される。この用語は天然に発見される重鎖定常領域だけに限るのではない。定常領域は、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失等の改変したものも含むことができる。互いに“通常連結”しているＩｇＧヒンジ領域と重鎖定常領域（またはその一部）の例には、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ２抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ３抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ３抗体の重鎖定常領域（またはその一部）、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域と同じＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域（またはその一部）である。これらの例に限りは無く、この用語はまた他のクラスの抗体にも適用できる。
【００７３】
本明細書中で使用する抗体の“ヒンジ領域”とは、抗体のＣＨ１とＣＨ２ドメイン間にある伸縮性ペプチドを示す。ヒンジ領域は抗体のＦａｂとＦｃ部分の間に生じる。ヒンジ領域は一般的に単一のエクソンでコードされ、抗体の二つの重鎖断片をジスルフィド結合でつなぐ（Paul et al.,Fundamental Imunology,3rd Ed. (1993)を参照のこと）。ヒンジ領域のアミノ酸配列は一般的にプロリン、セリンおよびスレオニン残基が多い。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡのＣＨ１とＣＨ２ドメイン間の延長ペプチド配列はプロリンに富んでいる。ＩｇＭとＩｇＥ抗体が、ヒンジ様特徴をもつ約１１０のアミノ酸ドメインを含んでおり（Ruby,J.,Immunology(1992)）、本明細書中で使用する“ヒンジ領域”という用語に含まれる。
【００７４】
ヒンジ領域のアミノ酸配列にはシステイン残基を含むこともできる。システイン残基は分子間鎖のジスルフィド結合の形成に関与する。抗体のクラスによるが、抗体のヒンジ領域の２と１１の位置の重鎖内ジスルフィド結合の間に存在できる。このジスルフィド結合は完全な抗体分子の二つの部分を一つに合わせるのに必要である。抗体のさまざまなクラスおよびサブクラスのヒンジ領域が当業においてすでに既知である。
【００７５】
標準的分子生物学の技術が、ヒンジ領域を改変した抗体を提供するために使用することができる。これらの技術は、抗体のヒンジ領域（または抗体の配列の別の部分）の既知のアミノ酸配列の欠失、挿入、置換等の改変に使用することができる。“改変”とは、抗体のヒンジ領域内、またはその一部におこす変化を示す。このような改変は限りなく、ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換がある。直接またはランダムな突然変異技術のような優れた技術が、ヒンジ領域に特定の配列または変異を与えるために使用することができることを当業者は認識している。このような技術はまた、抗体の他の領域の改変にも使用することができる。例えば、重鎖および／または軽鎖の定常領域および／または可変領域である。
【００７６】
例えば、オリゴヌクレオチド媒介変異法は、置換、欠失、挿入した変異型ＤＮＡを作製するのに適している(Adelman,et al., DNA2: 183, 1983を参照のこと)。端的には、変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズして目的のＤＮＡを改変する。本明細書中でこの鋳型は、目的のタンパク質の改変無しの天然のＤＮＡ配列を含むプラスミドあるいはバクテリオファージの一本鎖である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型の完全な２本目の相補鎖を合成しようと、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込む。そして、目的のタンパク質のＤＮＡに必要な改変が加わる。一般に、少なくとも全長２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異ヌクレオチドの両側で鋳型と完全に相補的になる１２〜１５個のオリゴヌクレオチドである。これによって、オリゴヌクレオチドが適切に一本鎖ＤＮＡの鋳型分子とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドはクレアらによる方法（Crea et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5765 (1978)）等で、簡単に合成できる。
【００７７】
例えば一実施形態では、抗体のヒンジ領域またはその断片は、抗体の異なるクラスまたはサブクラス等の別の抗体のヒンジ領域またはその断片で置換される。好適な実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ領域はＩｇＧ２ヒンジ領域等の違うクラスのヒンジ領域で置換される。このような置換は、例えばＩｇＧ２ヒンジ領域を含むエクソンをコードするオリゴを用いたオリゴヌクレオチド媒介変異法を使って行うことができる。別の実施形態では、ＩｇＧ４のヒンジ領域等のヒンジ領域内の一つのアミノ酸は、異なるアミノ酸、例えばＩｇＧ２等の別のサブクラスのヒンジ領域の対応する位置で発見されるアミノ酸等で置換する。例えば、アミノ酸２４１のセリンは（ＩｇＧ２ヒンジ領域で対応する）プロリンで置換することができる。オリゴヌクレオチド媒介変異法は、アミノ酸変化（オリゴＳ２４１Ｐ）を起こすオリゴを使用して置換することができる。さらに別の実施形態では、ＩｇＧ４等の抗体の糖鎖付加部位を糖鎖付加部位として機能しないように改変された。例えば、Ｎ‐結合型糖鎖付加部位はアスパラギンをグルタミンに変えることで改変できる。オリゴヌクレオチド媒介変異法は、例えばアミノ酸変化を起こすオリゴを使っても、このような改変に使用することができる。
【００７８】
タンパク質を改変するカセット変異法の他の例は、Wells et al.,Gene,34:315(1985)による技術に基づく。最初の物質は、変異させるタンパク質サブユニットのＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異されるタンパク質サブユニットのＤＮＡにあるコドンは同定される。同定される変異部位の両側には、特定の制限酵素切断部位が必ずある。もしその部位がない場合は、目的のタンパク質サブユニットのＤＮＡの適当な位置にその部位を挿入するため、上記のオリゴヌクレオチド媒介変異法でその部位を作製する。制限部位がプラスミドに導入されると、プラスミドはこの部位で切断され直鎖になる。制限部位の間に目的の変異をはさんだＤＮＡ配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドが標準的な方法で合成される。二本の鎖は標準的な方法でそれぞれ合成され、その後ハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、直鎖プラスミドの両端に一致する３’と５’末端をもつように設計するので、プラスミドに直接連結できる。従って、このプラスミドには、目的のタンパク質サブユニットの変異したＤＮＡ配列が含まれる。
【００７９】
さらに本発明では、抗体またはその断片をコードするＤＮＡにランダム変異法で改変したヒンジ領域をもつ抗体の作製が企図されている。簡便な方法には、ＰＣＲ変異法、飽和変異法、および変性オリゴヌクレオチド配列セットを用いた作製法があるが、これに制限されない。これらの方法は既に知られている。
【００８０】
トランスジェニック哺乳動物
本明細書中で使用する“トランスジェニック哺乳動物”とは、その動物の細胞の一つ以上、または好適には実質的に全てに、既知のトランスジェニック技術等の人工的な方法で導入された異種核酸を含んでいる非ヒト動物を示す。前駆細胞への導入、マイクロインジェクションや組換えウイルスの感染等の緻密な遺伝子操作によって、トランスジーンを細胞に直接または間接的に導入することができる。
【００８１】
“トランスジーン”とは（一つ以上の抗体ポリペプチドかその一部をコードする）核酸配列を意味し、この核酸は、導入されるトランスジェニック動物や細胞に対して、部分的または全体が非相同すなわち異種となる。または、この核酸は、導入されるトランスジェニック動物や細胞に内在する遺伝子に対して同種であるが、その動物のゲノムを改変するように挿入されるか、挿入が設計されている（自然な遺伝子とは異なる位置にこれを挿入する等）。トランスジーンは、一つ以上の転写制御配列と、イントロン等の目的の抗体をコードする核酸の最適な発現や分泌に必要だと思われる他の核酸も含むことができる。例えば乳腺では、選択した抗体の核酸に実際関係する全ての核酸、またエンハンサー配列および／またはインスレーター配列を含むこともある。抗体の配列は組織特異的プロモーターと作動可能に連結させることができる。例えば、乳腺特異的プロモーター配列はトランスジェニック動物の乳中にタンパク質を分泌させる。
【００８２】
本明細書中で使用する“トランスジェニック細胞”とはトランスジーンを含む細胞を示す。哺乳動物とは乳腺を持ち乳を産生するヒト以外の全ての動物を示す。全ての非ヒト哺乳動物が本発明に利用できる。好適な非ヒト哺乳類は反芻動物で、雌ウシ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ等である。好適な非ヒト哺乳類は反芻動物の追加的な例は、雄ウシ、ウマ、ラマ、ブタである。例えば、トランスジェニックヤギの作製法は当業において既知である。トランスジーンは、例えば参照によって本明細書に含められたEbert et al.,(1994) Bio/Technology12:699に記載されるように、マイクロインジェクションによってヤギの生殖細胞系に導入することができる。本発明を実践するために使用される全ての特定の細胞系は、健康で、良い胚を産出し、胚の前核期が観察しやすく、生殖に適応しやすいという条件で選択される。さらに、ハプロタイプが重要な選択因子である。
【００８３】
非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製法は当業において既知である。このような方法には、トランスジェニック哺乳動物を作るために哺乳動物の生殖細胞系へのＤＮＡ構成物を導入することを含むことができる。例えば、構成物の一個または数個のコピーが標準的なトランスジェニック技術によって哺乳動物の胚のゲノムに挿入されてもよい。さらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物は体細胞をドナー細胞として作製できる。体細胞のゲノムは卵母細胞に挿入され、その卵母細胞は融合および活性化され、再構成された胚を形成することができる。例えば、体細胞を使ったトランスジェニック動物の作製法は、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット；Baguisi et al.,Nature Biotech., vol.17 [1999]456-461; Campbell et al.,Nature,vol.380[1996]64-66;Cibelli et al., Science, vol.280[1998]; Kato et al.,Science,vol.282[1998]2095-2098;Schnieke et al., Science, vol.278 [1997]2130-2133; Wakayama et al.,Nature、vol.394[1998]369-374; Well et al., Biol. Reprod.,vol.57[1997]385-393に記載されている。
【００８４】
トランスフェクト細胞株
遺伝子操作を受けた細胞株がトランスジェニック動物の作製に使用することができる。遺伝子操作された構成物は従来の形質転換あるいはトランスフェクション技術によって細胞に導入することができる。本明細書中で使用する“トランスフェクション”および“形質転換”には、宿主細胞にトランスジェニック配列を導入する各種の技術が含まれ、それにはリン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法等がある。さらに、ウイルスベクター等の生物学的ベクターが以下のように使用することができる。宿主細胞への適切な形質転換または質移入については、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989および他の適当な実験室マニュアルに記載されている。
【００８５】
有用な二つのアプローチは、電気穿孔法とリポフェクション法である。以下にそれぞれを簡単に説明する。
【００８６】
ＤＮＡ構成物は次の手順に従い、電気穿孔法によってドナー細胞株に安定して導入することができる。まず繊維芽細胞、特に胚性繊維芽細胞等の体細胞を約４×１０６個／ｍｌの細胞密度でＰＢＳに再浮遊させる。直鎖ＤＮＡ５０μｇを０．５ｍｌのこの細胞浮遊液に加え、０．４ｃｍの電極ギャップキュベット（バイオラッド社）に入れる。バイオラッド・ジーンパルサーエレクトロポレーターを用い、２５ｍＡで３３０ボルトパルス、１０００μＦａｒａｄ、および電気抵抗無限で電気穿孔する。ＤＮＡ構成物が選別のためにネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ場合、３５０μｇ／ｍｌでＧ４１８（ギブコＢＲＬ社）を添加し１５日間培養すると、ネオマイシン抵抗クローンが選別される。
【００８７】
ＤＮＡ構成物は次の手順に従い、リポフェクション法によってドナー体細胞株に安定して導入することができる。約２×１０５個／ｍｌで細胞を直径３．５ｃｍのシャーレに撒き、２μｇの直鎖ＤＮＡを、ＬｉｐｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（ギブコＢＲＬ社）を用いてトランスフェクトする。４８時間後、細胞は１：１０００と１：５０００に分け、ＤＮＡ構成物が選別のためにネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ場合、Ｇ４１８を終濃度０．３５ｍｇ／ｍｌで加えると、ネオマイシン抵抗性クローンが単離され、凍結保存および核移植のために使用することができる。
【００８８】
ＤＮＡ構成物
異種タンパク質をコードするカセットは、哺乳類上皮細胞用に、カゼインプロモーター、ヤギβカゼインプロモーター、乳特異的シグナル配列、カゼインシグナル配列、βカゼインシグナル配列、および異種タンパク質をコードするＤＮＡ等の特定の組織用のプロモーターを合わせて含んだ構成物として会合することができる。
【００８９】
構成物は、非分泌タンパク質のＤＮＡ配列の下流にある３’非翻訳領域も含むことができる。このような領域は発現系のＲＮＡ転写産物を安定化し、発現系からの目的のタンパク質の生産量を増加できる。本発明で使用される構成物で有用な３’非翻訳領域には、ポリＡシグナルを提供する配列がある。このような配列はＳＶ４０スモールｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域または他の既知の３’非翻訳配列等に由来している可能性がある。一実施形態では、３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質に由来している。３’非翻訳領域の長さは重要ではないが、ポリＡ転写物の効果を安定化することが配列の発現によるＲＮＡの安定化に重要であると思われる。
【００９０】
状況に応じて、構成物はプロモーターとシグナル配列をコードしたＤＮＡ配列の間に５’非翻訳領域を含むことができる。このような非翻訳領域はプロモーターが得られた部分と同じ制御領域から成るか、または他の合成、半合成、または天然由来の異なる遺伝子から成る。本明細書中でもその特定の長さは問題ではないが、発現レベルの改善には有効と思われる。
【００９１】
構成物はまた、哺乳類上皮細胞で選択的に発現する遺伝子のＮ末端コード領域を約１０％、２０％、３０％、またはそれ以上含むことができる。例えば、Ｎ末端コード領域は、ヤギβカゼインＮ末端コード領域等の使用したプロモーターと同じにできる。
【００９２】
構成物は既知の方法を使用して作成できる。構成物は大きなプラスミドの一部として作製することができる。このような作成によって、正しく構成物のクローニングおよび選別が可能になる。構成物はプラスミドの便利な制限部位の間に位置するので、プラスミド配列から簡単に単離し、所望の哺乳動物へ導入することができる。
【００９３】
インスレーター配列
トランスジェニック動物作製に使用されるＤＮＡ構成物は、少なくとも一つのインスレーター配列を含むことができる。“インスレーター”、“インスレーター配列”、および“インスレーター要素”を本明細書中では同義で使用する。インスレーター要素は、正負いずれにも遺伝子発現を乱さず、その範囲内にある遺伝子の転写を遮断する制御要素である。好適には、インスレーター配列は転写されるＤＮＡ配列の両側に挿入される。例えば、インスレーターは約２００ｋｂから１ｋｂで、少なくともプロモーターから約１ｋｂ〜５ｋｂの５’側と、目的となる遺伝子の３’末端に挿入する。プロモーターからのと、目的の遺伝子の３’末端でのインスレーター配列の長さは、既知の技術で決定でき、その目的の遺伝子と構成物で用いるプロモーターとエンハンサーの相対的な大きさに依存する。さらに、一つ以上のインスレーター配列がプロモーターからの５’側、またはトランスジーンの３’末端に挿入される。例えば、二つ以上のインスレーター配列をプロモーターからの５’側に挿入できる。トランスジーンの３’末端のインスレーターまたは複数のインスレーターは、目的の遺伝子の３’末端、または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’フランキング配列等の３’制御配列の３’末端に挿入できる。
【００９４】
好適なインスレーターは、国際公開第９４／２３０４６号パンフレット（内容が参照により本明細書中に含められる）の記載のように、ニワトリβグロビン遺伝子座の５’末端を含み、ニワトリ５’構造性高感受性部位に一致するＤＮＡ区分である。
【００９５】
乳腺でのタンパク質の発現
トランジェニック動物の特定の組織または乳などの体液中での抗体等の異種タンパク質の発現が望まれている。異種タンパク質はそれが発現している組織または体液から回収できる。例えば、本発明の異種タンパク質（抗体等）はトランスジェニック動物の乳中に発現することができる。乳腺特異的プロモーターを使った異種タンパク質の作製法を以下に示す。
【００９６】
乳腺特異的プロモーターとシグナル配列
有用な転写プロモーターは哺乳類上皮細胞で選択的に活性化できるプロモーターで、これには、カゼイン、βラクトグロブリン（Clark et al.,[1989]Bio/Technology,7:487-492）、乳清酸性タンパク質（Gordon et al.,[1987]Bio/Technology,5:1183-1187）、ラクトアルブミン（Soulier et al.,[1992]GEBS letts.,297:13）等の乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターが含まれる。カゼインプロモーターは全哺乳類でα、β、γ、κのカゼイン遺伝子から成り、好適なプロモーターはヤギβカゼイン遺伝子（DiTullio[1992]Bio/Technology,10:74-77）由来である。プロモーターはラクトフェリンまたはブチロフィン由来もある。乳腺特異的タンパク質プロモーター、または哺乳類組織で特異的に活性化されるプロモーターはｃＤＮＡまたはゲノム配列から入手できる。好適には、それは元のゲノムにある。
【００９７】
ＤＮＡ配列の情報が、少なくとも一つあるいは数種の生物で、上に挙げた乳腺特異的遺伝子に利用できる。例えば、Richards et al.,J.Biol.Chem.,256,526-532[1981]（αラクトアルブミン ラット）；Campbell et al.,Nucleic Acids Res.,12,8685-8697[1984]（ラットＷＡＰ））；Jones et al.,J.Biol.Chem.,260,7042-7050[1985]（ラットβカゼイン））；Yu-Lee&Rosen,J.Biol.Chem.,258,10794-10804[1983]（ラットγカゼイン））；Hall,Biochem.J.,242,735-742[1987]（αラクトアルブミン ヒト）；Stewart,Nucleic Acids Res.,12,389[1984]（ウシαＳ１とκカゼインｃＤＮＡｓ）；Gorodetsky et al.,Gene,66,87-96[1988]（ウシβカゼイン）；Alexander et al.,Eur.J.Biochem.,178,395-401[1988]（ウシκカゼイン）；Brignon et al.,FEBS Lett.,188,48-55[1977]（ウシαＳ２カゼイン）；Jamieson et al.,Gene,61,85-90[1987], Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369,425-429[1988], Alexander et al.,Nucleic Acids Res.,17,6739[1989]（ウシβラクトグロブリン）；Vilotte et al.,Biochemie,69,609-620[1987]（ウシαラクトアルブミン）を参照のこと。さまざまな乳タンパク質遺伝子の構造と機能はMercier&Vilotte,J.Dairy Sci.,76,3079-3098[1993]（全目的のため参照により全文が本明細書に含まれる）にまとめられている。追加的なフランキング配列が異種タンパク質の発現を最適化するために有用な場合、この配列はプローブとして存在する配列を使ってクローン化できる。異なる生物からの乳腺特異的制御配列は、既知の同種のヌクレオチド配列、または同種タンパク質へのプローブとしての抗体を使って、そのような生物のライブラリーをスクリーニングすることで得られる。
【００９８】
有用なシグナル配列は、乳特異的シグナル配列か、真核性または原核性タンパク質を分泌させる他のシグナル配列である。好適には、シグナル配列は乳特異的シグナル配列から選択される。すなわち、それは乳中に分泌される産物をコードする遺伝子由来である。好適には、乳特異的シグナル配列は構成物で使用する乳腺特異的プロモーターに関連しており、以下に詳細を示す。シグナル配列の大きさは重要ではない。必要なのは哺乳類組織等で、所望の組換えタンパク質を効果的に分泌させるのに十分な大きさである。例えば、α、β、γまたはκカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質、ラクトアルブミンの遺伝子からのシグナル配列が使用することができる。
【００９９】
改変ＩｇＧ４抗体等の非相同抗体をコードするカセットは、複数を合わせた構成物にする。例えば構成物は、哺乳類上皮細胞用に、カゼインプロモーター、乳特異的シグナル配列、カゼインシグナル配列、および改変ＩｇＧ４抗体等の非相同抗体をコードするＤＮＡ等を含んでいてもよい。構成物は当業において既知の方法で作成できる。構成物は大きなプラスミドの一部として作製することができる。このような作成によって正しい構成物を効率的にクローニングおよび選別することができる。構成物はプラスミドの便利な制限部位の間に位置するので、プラスミド配列から簡単に単離し、所望の哺乳動物へ導入することができる。
【０１００】
卵母細胞
卵母細胞は動物の生殖周期に従い、さまざまな回数で採取できる。細胞周期の各段階の卵母細胞が採取され、減数分裂の特定の段階に進むように試験管内で誘導される。例えば、無血清培地で培養した卵母細胞は分裂中期で停止する。さらに分裂停止卵母細胞は、血清添加によって終期への進行を誘導することができる。
【０１０１】
卵母細胞は再構成胚の形成に使用される前に試験管内で成熟させることができる。この工程には通常、ヤギの卵巣等の哺乳類の卵巣からの未成熟な卵母細胞を採取し、除核前に卵母細胞が中期または終期等の所望の減数分裂段階に達するまで培地中で成熟させることが必要である。また、体内で成熟させた卵母細胞も再構成胚の形成用に使用することができる。
【０１０２】
卵母細胞は過剰排卵する雌から入手できる。端的には、ヤギ卵母細胞等の卵母細胞は雌のドナー動物の卵管から卵母細胞を追い出すことで外科的に採取できる。ヤギに過剰排卵を誘導する方法とヤギ卵母細胞の採取法も本明細書中に記述する。
【０１０３】
再構成胚の移植
再構成胚はレシピエント動物に移植され、クローン化されるかトランスジェニック哺乳動物まで成長する。例えば、再構成胚は各レシピエント動物のフィンブリアを通して卵管内腔に移植される。さらに、レシピエント動物への胚の移植法は当業において既に知られており、例えば参照文献８に記載されている。
【０１０４】
乳からのタンパク質の精製
本明細書中で使用した精製物は二つ以上の抗体分子を含んでいる。精製物はトランスジェニック動物１個体またはそれ以上によって産生される。これは、糖鎖付加の異なる分子または同じ分子を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書中で使用する“精製された物質”、“実質上純粋な抗体物質”、または“単離された抗体”とは、トランスジェニック哺乳動物の乳中に生じた他の物質が実質的に無い抗体を示す。また抗体が精製に使用されたアクリルアミド等のゲル基質等の物質からも好適に分離される。一実施形態では、“実質的に無い”とは、約３０％（乾重）未満の非抗体物質（本明細書中ではまた“乳不純物”“乳成分”とも言う。）を含む抗体精製物が得られたことを示し、より好適には非抗体物質は２０％未満となり、さらに好適には非抗体物質は１０％未満となり、最も好適には非抗体物質は５％未満である。非抗体物質には、カゼイン、脂質（可溶性脂質およびリン脂質等）、ラクトース、他の低分子（ガラクトース、グルコース等）、小ペプチド（微生物ペプチド、抗菌ペプチド等）、および他の乳タンパク質（βラクトグルブリンおよびαラクトアルブミン、ラクトフェリン、および血清アルブミン等の乳清タンパク質）が含まれる。好適には、抗体が少なくとも乾重量で１０、２０、５０、７０、８０、９５％の精製物質として得られる。また、精製物には少なくとも１、１０、１００μｇの抗体、または１、１０、１００ｍｇの抗体が含まれる。さらに、精製物には７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の会合抗体が含まれる。
【０１０６】
抗体（およびその断片）は当業において既知の標準タンパク質精製法によって乳から単離できる。例えば、Kutzko et al.,米国特許第６，２６８，４８７号の方法によって、本発明の抗体および／または断片を精製できる。
【０１０７】
乳タンパク質は工程を組み合わせることによって多くの場合単離される。例えば、上澄みの除去、遠心分離、沈降（H.E.Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry,in:Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers,NY,[1982]）、酸による沈降（米国特許第４，６４４，０５６号）、またはレンニンまたはキモトリプシンによる酵素的凝固（上記Swaisgood）によって、最初に生乳から脂質を除去することができる。次に、主要な乳タンパク質は、上清または沈殿に分画され、ある種のタンパク質は簡単に精製できることもある。他の例では、仏国特許第２，４８７，６４２号には、ウルトラフィルトレーションをサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーと併用し、脱脂乳または乳清からの乳タンパク質を単離することを記載している。乳清は最初、レンニンまたは乳酸での凝固によりカゼインを除去することで得られる。米国特許第４，４８５，０４０号では、２つの連続するウルトラフィルトレーション工程によって、乳清から保持物質内に多量のαラクトグロブリン精製物を単離する方法を記載している。米国特許第４，６４４，０５６号では、ｐＨ４．０〜５．５の酸による沈降、続く精製物の透明度を上げるための孔経０．１〜１．２μｍの膜によるクロスフローのウルトラフィルトレーション、さらに濃縮のための５〜８０ｋＤの分子で分ける膜を使用し、乳または初乳から免疫グロブリンを精製する方法を提供している。米国特許第４，８９７，４６５号では、血清、卵黄、または乳清からの免疫グロブリン等のタンパク質を、ｐＨシフトによる金属酸化物膜での連続ウルトラフィルトレーションによって濃縮することを教示している。最初にタンパク質保持物質から多量な不純物を除くために、目的のタンパク質の等電点（ｐＩ）より低いｐＨでウルトラフィルトレーションを行う。次に、その等電点よりも高いｐＨで行い、不純物を保持し、目的のタンパク質を透過させる。ＥＰ４６７ ４８２ Ｂ１では、異なるウルトラフィルトレーションによる濃縮法が教示され、カゼインと乳清タンパク質の両方を可溶化するために、乳タンパク質の等電点よりも低いｐＨ３〜４に下げて行う。３連続のウルトラフィルトレーションまたはダイアフィルトレーションでタンパク質を濃縮することで、タンパク質９０％の固体を１５〜２０％含む保持物質が得られる。
【０１０８】
他の実施例では、乳は最初に透明化することができる。一般的な透明化法は以下の工程を含むことができる：
（ａ）乳を２：１の割合で、２．０Ｍアルギニン塩酸（ｐＨ５．５）で希釈する；
（ｂ）希釈試料を約２０分間４〜８℃で遠心分離する；
（ｃ）約５分間氷上で試料を冷却し、脂質を上層で固める；
（ｄ）ピペット先端で固形脂質を“はじいて”上層から取り除く；
（ｅ）上清を新しい試験管に移す。
【０１０９】
例えば上述の方法など、当業において既知の任意のタンパク質精製法を用いて、さらなるタンパク質の精製を達成することができる。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：抗体の改変
抗体重鎖はオリゴヌクレオチド変異法で改変できる。端的には、変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、所望のＤＮＡを改変する。ここでこの鋳型は、所望のタンパク質の改変の無い天然のＤＮＡ配列を含むプラスミドあるいはバクテリオファージの一本鎖である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型の完全な２本目の相補鎖を合成しようと、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込む。そして、所望のタンパク質のＤＮＡに必要な改変が加わる。一般に、少なくとも全長２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異ヌクレオチドの両側で鋳型と完全に相補的になる１２〜１５個のオリゴヌクレオチドである。これによって、オリゴヌクレオチドが適切に一本鎖ＤＮＡの鋳型分子とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、Crea et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765[1978])に記載の方法のような、当業界で公知の技術を用いて簡単に合成できる。
【０１１１】
ヒンジ領域のアミノ酸２４１のセリンをプロリンで置換を有効にするために、セリンをプロリンで置換するオリゴＳ２４１Ｐによるオリゴヌクレオチド変異法を用いる。得られた変異体はトランスジェニックマウス作製に使用することができる。トランスジェニックマウスは搾乳され、乳中の抗体の存在と“半分子”の相対量が検証される。ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の配列と、変異に使用することができるオリゴヌクレオチドＳ２４１Ｐは以下の通りである。
【０１１２】
ＩｇＧ４ヒンジ領域
１６６８ ＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴ
残基１ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｓ２４１Ｐオリゴ
ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＣＡ
ＲＳ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
さらに、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域全体を、別の抗体のヒンジ領域で置換することができる。この変化を達成するために、置換するヒンジ領域を含むエクソンをコードするオリゴヌクレオチドが使用することができる。ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の配列、およびＩｇＧ２置換ヒンジ領域を含むオリゴヌクレオチドを以下に示す。
【０１１３】
ＩｇＧ４ヒンジ領域
１６６２ ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣ
残基１ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
ＩｇＧ２ヒンジ領域
１７２９ ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＣＡ
ＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣ
残基１ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
共通部位でアスパラギンからグルタミンへ置換させるオリゴによるオリゴヌクレオチド変異法を用いて、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２にあるＮ−結合型糖鎖付加部位が除去できる。このような改変を達成するオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１１４】
２０１４ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＧＡ ＧＴＧ ＧＴＣ
残基１ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ
抗体変異型の検証
軽鎖と変異した重鎖をカゼインプロモーターに結合し、トランスジェニックマウスの作製に使用する。その後、そのマウスの抗体の発現と半分子を検証する。
【０１１５】
トランスジェニック動物
構成物をマイクロインジェクションしたヤギ受精卵の移植によって、初代（Ｆ０）トランスジェニックヤギを作製できる。トランスジェニックヤギの作製には、以下本節に記載の方法を使用することができる。この改変法によって他の動物にも使用することができることを当業者は理解するであろう。
【０１１６】
ヤギの種類と繁殖
アルパイン種、ザーネン種、トッゲンブルグ種等のスイス原産のヤギが、トランスジェニックヤギの作製には有用である。
【０１１７】
本節は、トランスジェニックヤギの作製に必要な工程を端的に記述する。これらの工程には、雌ヤギの過剰排卵、受胎のための雄との交尾、および受精した胚の採取が含まれる。採取後、受精した１細胞期の胚の前核にＤＮＡ構成物をマイクロインジェクションする。１頭のドナー雌ヤギから得られた全ての胚は一緒にされ、可能であれば単独のレシピエント雌ヤギに移植する。
【０１１８】
ヤギの過剰排卵
ドナー動物の発情期は、実験初日にノルジェストメット剤（シンクロメートＢ、ＣＥＶＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＫＳ）６ｍｇを耳の皮下に埋め込むことで同調させる。７日から９日後、プロゲステロンの体内合成を遮断するために、プロスタグランジンを投与する。１３日目から卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ,ＮＪ）を全量で１８ｍｇとなるように１日２回３日間筋肉注射する。１４日目に埋め込み剤を除去する。除去２４時間後、ドナー動物を２日間にわたって雄と交尾させる（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１１９】
胚の採取
交尾２日目（または埋め込み剤除去から７２時間後）に胚を外科的に採取する。過剰排卵させたヤギは手術前３６時間断食断水させる。ジアゼパム（登録商標バリウム）を体重１ｋｇ当たり０．８ｍｇ静脈注射し、続いてすぐにケタミン（ケタセット）を体重１ｋｇ当たり５．０ｍｇ静脈注射する。術中、毎分２Ｌの酸素とハロタン（２．５％）を気管内チューブで投与する。生殖管を中線開腹手術によって摘出する。過剰排卵を評価するために、黄体、直径６ｍｍ以上の非破裂卵胞、および卵巣嚢腫の個数を数え、卵管から採取できる胚の数を予測する。卵管小孔にカニューレを挿入し、３．０プロレンで１箇所を一時的に結紮する。２０ゲージの針を卵管接合部から約０．５ｃｍの子宮内に挿入する。滅菌リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１０〜２０ｍｌでカニューレを装着した卵管内を洗い出し、洗浄液をシャーレに回収する。この操作をもう一方の生殖管で行った後、これらを腹部に戻す。閉腹前に、癒着防止のため腹腔に滅菌グリセロール塩類溶液１０〜２０ｍｌを注入する。白線を２．０ポリジオキサノンまたはスプラミッドで単純結節縫合し、皮膚は滅菌傷クリップで閉じる。
【０１２０】
ヤギ受精卵は実体顕微鏡下でＰＢＳ卵管洗浄液から回収し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：シグマ社、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）添加のＨａｍ'ｓＦ１２倍地（シグマ社）で洗浄する。前核が見えれば、胚に直ちにマイクロインジェクションを行う。前核が見えない場合は、見えるようになるまで、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿培養器で短期間培養する（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２１】
マイクロインジェクション
１細胞期のヤギ胚を窪み付きスライドグラス上に培地とともに滴下し、上にオイルをのせる。二つの可視化前核をもつ受精卵を、ツァイス社製ノマルスキー固定ステージ付き正立顕微鏡でフレームポリッシュ保持マイクロピペットに固定する。ヤギβカゼイン遺伝子制御配列に作動可能に連結している目的のコード配列を含むＢＣ３５５ベクター等、目的のＤＮＡ構成物を、インジェクション用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）で細いガラスマイクロ針を用いて、前核にマイクロインジェクションする（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２２】
胚発生
マイクロインジェクション後、生残胚は、胚移植用のレシピエント動物が準備されるまで、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿培養器で培養する（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２３】
レシピエント動物の準備
レシピエント動物の耳にノルジェストメット剤６ｍｇを埋め込み（シンクロメートＢ）、発情が同調される。１３日目に埋め込み剤を除去し、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、シグマ社）による非過剰排卵注射（４００Ｉ．Ｕ．）を１回行う。レシピエント動物は発情同調を補強するために去勢雄と交尾させる（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２４】
胚移植
１頭のドナー動物からの全ての胚は一緒にされ、できるだけ１頭のレシピエント動物に移植する。手術手順は卵管へのカニューレ挿入以外、上記の胚採取で述べた方法と同じである。胚はガラスマイクロピペットでフィンブリアを通して卵管内腔に、最小量の１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地とともに移植する。卵巣に６〜８以上の排卵点をもつ動物はレシピエント動物として不適当である。閉腹および術後処置はドナー動物の場合と同じである（Selgrath, et al., Theriogenology, [1990] 1195-1205）。
【０１２５】
妊娠分娩の監視
発情を停止した日から４５日目に、超音波検査によって妊娠を確認する。１１０日目に、妊娠の確定と胎児ストレス検査のために２回目の超音波検査を行う。１３０日目、妊娠したレシピエント動物に破傷風トキソイドとクロストリジウムＣ＆Ｄで予防接種する。セレンとビタミンＥ（Ｂｏ−Ｓｅ）を筋肉注射で、イベルメクチンを皮下注射で投与する。１４５日目、妊娠ヤギを滅菌室に移し、約１４７日目の陣痛の誘発を前に環境に順応させる。１４７日目に、ＰＧＦ２ａ（登録商標ルタライズ、アップジョン社（Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ Ｍｉｃｈｉｇａｎ））４０ｍｇで分娩を誘発する。この投与は筋肉注射で２回に分けて行う。１回目２０ｍｇ投与の４時間後に２回目２０ｍｇを投与する。初回投与時から昼夜を通して定期的に観察する。翌朝には観察は３０分毎にまで増やす。初回投与から３０〜４０時間後に分娩がおきる。出産後、初乳を回収するため搾乳し、胎盤の排泄を確認する。
【０１２６】
Ｆ０動物のトランスジェニック性質の検証
トランスジェニックＦ０動物を調べるために二つの異なる細胞株からゲノムＤＮＡを単離する。これはモザイクトランスジェニックを見逃さないためである。モザイク動物とは、少なくとも１コピーのトランスジーンもない細胞をもつヤギとして定義される。従って、耳組織試料（中胚葉）と血液試料を生後２日目のＦ０動物から採取し、ゲノムＤＮＡを単離する（Lacy et al.,A laboratory Manual[1986]Cold Springs Harbor,NY；Methods Enzymology[1987]152,180-183）。ＤＮＡ試料は、ヒトデコリン遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（Gould et al.,Pro.Natl.Acad.Sci.[1989]86,1934-1938）と、ランダムプライマー法によるヒトデコリンｃＤＮＡプローブ（Feinberg and Vogelstein,Anal.Bioc.[1983]132,6-13）を用いたサザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. [1980] 77:5201-5205）によって分析される。分析感度を１０％の体細胞におけるトランスジーン１コピーの検出によって推定する。
【０１２７】
作製ヤギの継代と選別
上記手順は、トランスジェニック初代（Ｆ０）ヤギだけでなく他のトランスジェニックヤギの作製にも使用することができる。例えば、トランスジェニックＦ０初代ヤギは、雌の場合、乳を産生するようになる。また雄の場合、トランスジェニックの雌の子孫を産出できる。このトランスジェニック初代雄を非トランスジェニックの雌と交配させて、トランスジェニックの雌の仔を作れる。
【０１２８】
トランスジーンの伝播と関連特性
ヤギ系統における目的のトランスジーンの伝播を、耳組織と血液のＰＣＲ法およびサザンブロット法によって分析する。例えば、初代雌と３頭のトランスジェニックの仔のサザンブロット分析では、世代間での再改変またはコピー数の変化は全く見られない。サザンブロット分析はヒトデコリンｃＤＮＡプローブを用いる。ブロットはベータスコープ６０３（Ｂｅｔａｓｃｏｐｅ６０３）上で分析し、対照にヤギβカゼイン内因性遺伝子を用いて、トランスジーンのコピー数を決定する。
【０１２９】
発現レベルの評価
トランスジェニック動物の乳中にあるトランスジェニックタンパク質の発現レベルは、酵素法かウェスタンブロット法で決定する。
【０１３０】
実施例２：抗体ヒンジ領域を改変したマウスモデル
トランスジェニック動物での治療用組換え抗体の生産の可能性を検証するために、ＫＭＫ９１７抗体のｃＤＮＡをトランスジェニックマウスの乳腺で発現させた。そして、ＫＭＫ９１７をマウス乳から精製し、ＫＭＫ９１７をトランスフェクトしたＳｐ２／０細胞のフェッドバッチ培養液由来のＫＭＫ９１７と比較した。ＫＭＫ９１７トランスジェニックマウスはＧＴＣバイオセラピューティック社（ＧＴＣ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で作製した。続く精製と評価分析は下請会社で行われた。
【０１３１】
ＫＭＫ９１７トランスジェニックマウスの継代
３種類のＫＭＫ９１７をコードする構成物が作製された。
【０１３２】
１．１０９９／２０１０ ＫＭＫ９１７野生型
２．２０１２／２０１４ ＫＭＫ９１７ヒンジ変異型（２２９Ｓｅｒ→Ｐｒｏ）
３．２０１２／２０１７ ＫＭＫ９１７ヒンジ＋Ｃｈ２変異型（２２９Ｓｅｒ→Ｐ
ｒｏ、２３６Ｌｅｕ→Ｇｌｕ）
変異型構成物は、野生型構成物由来のＫＭＫ９１７物質で見られる半分子抗体の割合を減少させる目的で作製された。これらの構成物をもとに、全１５系統のトランスジェニックマウスが作製された（系統名と概要は表１ａ〜ｃを参照）。表１にはウェスタンブロット法によるマウス系統でのＫＭＫ９１７の発現レベルの推定値が示されている。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【表１ｃ】
トランスジェニックマウスの乳由来ＫＭＫ９１７の精製と評価
全１５系統のトランスジェニックマウスの乳試料を採取（Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２世代）し、ＰＢＳで希釈した（詳細は表１を参照）。そして、試料からＫＭＫ９１７抗体が精製され分析評価した。分析の概要は図２を参照のこと。
【０１３３】
コロイド状乳成分の除去のため、希釈乳試料はソーバル社製高速遠心分離機で３０分間遠沈させた（ＳＳ−３４ローター、２０，０００ｒｐｍ）。次に、上清を沈殿物から吸い上げ、上層の脂肪分をシリンジで除去した。かすかに乳白色の上清を０．２２μｍマイレックスＧＶ膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）で濾過し、プロテインＡカラム（マブセレクト、ＡＰＢ社（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＡＰＢ））１ｍｌにのせる。結合した抗体をｐＨ３．２の２０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液で溶出する。抗体分画はｐＨ５．５に調整し、フィルター滅菌後４℃で保存した。
【０１３４】
トランスジェニックマウスの乳中ＫＭＫ９１７含有量の決定
ヒトＩｇＧ４の検出には市販のＥＬＩＳＡキットを使用し、希釈乳試料のＫＭＫ９１７の濃度を測定した。未希釈のマウス乳におけるＫＭＫ９１７の濃度を表２に示す。
【表２】
【０１３５】
次に、選択したマウス系統（各構成物の２または３系統）のＫＭＫ９１７を、３．２に記載のプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。その後、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）で、抗体分画中のＫＭＫ９１７含有量が決定された（表２）。他の分析に利用できるＫＭＫ９１７の全量も表２に示す。
【０１３６】
ＳＥＣ分析により、全抗体試料は９５％以上の単量体抗体を含むことがわかった。測定された抗体分画中のＫＭＫ９１７量とプロテインＡ精製での使用量をもとに、マウス乳試料中のＫＭＫ９１７の含有量が逆算された。逆算されたＫＭＫ９１７のマウス乳中濃度は３．２〜２２．１ｍｇ／ｍＬで、ＩｇＧ４ＥＬＩＳＡ法による直接測定による値と非常に近似していた（表２）。
【０１３７】
精製ＫＭＫ９１７物質中のマウス抗体の存在
プロテインＡによる精製では、ヒトＩｇＧアイソタイプだけでなく、乳中に含まれる可能性があるマウス抗体の類似型も濃縮してしまう。そこで、精製ＫＭＫ９１７中のマウス免疫グロブリンの存在が調べられた。ＳＰＲ法（バイアコア３０００）と“捕獲分子”として固定した抗マウスＩｇＧの有無を用いて、非常に少量のマウスＩｇＧサブクラスが精製ＫＭＫ９１７物質で検出された（≦０．１％）。また、ＳＥＣ法とヒトＩｇＧ４ＥＬＩＳＡ法による精製物の濃度測定からも同様な結果が得られた（表２）。ＳＥＣ法ではＫＭＫ９１７だけでなくマウス抗体も測定できるので、著しい量のマウス免疫グロブリンは、ＳＥＣ法での高濃度によって示されるだろう。対照的に、ＥＬＩＳＡ法はヒトＩｇＧのみを対象としているのでＫＭＫ９１７のみを検出できる。
【０１３８】
“半分子抗体”の存在とその量
トランスジェニックマウス系統の精製ＫＭＫ９１７物質にある半分子抗体の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＤＳＣＥ法を用いて決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、野生型構成物をトランスフェクトしたマウス試料が、変異型をトランスフェクトしたマウス試料よりも半分子抗体の割合が高いことを明らかにした。
【０１３９】
この結果をＳＤＳ−ＤＳＣＥ法によって確認した結果、野生型の構成物によるトランスジェニック系統由来のＫＭＫ９１７物質の半分子抗体は２４と３４％であった。変異型の構成物からのＫＭＫ９１７物質では、半分子抗体の割合は５％未満であった。特に、単一変異型構成物由来において低かった（表３のまとめを参照）。
【０１４０】
異なる構成物由来のＫＭＫ９１７の生物学的活性を検証するために、蛍光法を使った細胞分析法を用いた。細胞のある受容体がその対象物と結合する際に、ＫＭＫ９１７と競合させる。細胞培養（Ｓｐ２／０）由来のＫＭＫ９１７と比較した結果、野生型と変異型をトランスフェクトしたマウス由来のＫＭＫ９１７は、どちらも十分な生物学的活性を示した（表３を参照）。
【０１４１】
他の特性として、ＫＭＫ９１７のリガンドターゲットとの結合および解離の速度定数を、ＳＰＲ法（バイアコア３０００）によって決定した。全試料で、トランスジェニックマウス由来物質の定数はＳｐ２／０由来のＫＭＫ９１７で得られた値と一致した。これは、ＫＭＫ９１７の結合親和性と生物学的活性が、（１）発現される場合、トランスジェニックマウスまたは細胞株Ｓｐ２／０で類似しており、さらに（２）ｃＤＮＡに導入した変異による影響を受けないことを示唆する。
【表３】
【０１４２】
糖鎖付加の様式
陽イオン交換ＨＰＬＣによって精製ＫＭＫ９１７物質を分析した。特殊法を用いて、Ｃ末端デスモシン―リシン（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）変異抗体（変異型Ｋ０、変異型Ｋ１、変異型ｋ２）の分離、抗体の異なる糖鎖型の解析を成し遂げた。例えば、シアル酸非付加型糖鎖とシアル酸付加型糖鎖、複合型糖鎖とマンノース型糖鎖の分離である。
【０１４３】
図３ａ〜３ｇは、細胞培養から得られたＫＭＫ標準試料と、乳試料から得られた抗体のクロマトグラムである。基準試料の３つの主要ピークはＫ０、Ｋ１、およびＫ２変異型と一致した。
【０１４４】
トランスジェニック乳から得られた試料はより不均質である。二つの野生型試料では、基準試料よりも早く溶出されるピークが見られる。これはシアル酸付加型のためだと思われる。変異型系統由来の抗体試料は非常に不均質であり、基準試料よりも遅く溶出される異なるピークがある。
【０１４５】
異なる糖鎖型がどの程度観察された不均質性の原因となっているかを解明するために、野生型と変異型の試料の糖鎖をＮ−グリコシダーゼ処理によって除去した。図４ａ〜４ｄは、グリコシダーゼ処理前後の野生型試料のＣＥｘ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。野生型試料は糖鎖除去後、非常に高い均質性を示した。４：１の割合で得られた二つのピークは、抗体のＫ０およびＫ１型に非常によく一致している。これらの結果から、野生型抗体で見られた不均質性は主に糖鎖型の違いによるものであると結論付けられる。
【０１４６】
系統１〜３６由来の変異抗体もまた、同様な割合で二つのピークを示す。しかし、二つのピークは非常に離れて溶出されており、それぞれサイドピークも伴っている（図３ｂ）。このようなピークは、変異型の中に異なる抗体の型が存在することを示唆し、部分的な折りたたみのゆるみによる可能性が考えられる。従って、変異抗体のＣＥｘ−ＨＰＬＣ分析で見られる広範な不均質性は、糖鎖型の多様性だけでなく、他の原因によるようにも思われる。
【０１４７】
さらに、精製ＫＭＫ９１７の糖側鎖の構造が解析された。糖側鎖をペプチド・Ｎ−グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で酵素切断した後単離し、２−アミノベンズアミドで標識した。個々の糖鎖構造はＧｌｙｃｏ Ｓｅｐ Ｎ-カラムを用いてＨＰＬＣで分離し、蛍光検出によって定量した。図５ａ〜ｃは、下記由来のＫＭＫ９１７の分析クロマトグラムである：
ａ）野生型トランスジェニックマウス
ｂ）変異型トランスジェニックマウス
ｃ）培養細胞
クロマトグラムでは、トランスジェニックマウス由来ＫＭＫ９１７の糖鎖パターンが、培養細胞由来の抗体とは有意に異なることを示している。変異型の様式は野生型と質的には一致するが、量的には幾分異なっている。他のよく知られている糖鎖構造と比較すると、いくつかのピークはＨＰＬＣクロマトグラムによって同定することができる。分子構造は表４に示す。
【表４】
【０１４８】
ＨＰＬＣから得られた分子構造を確認し、溶出の遅いピークについてさらに解析するために、糖鎖混合液をマススペクトロメトリーＭＡＬＤＩ−ＭＳ陰イオンモードで分析し、シアル酸含有糖鎖ＢｉＧ２Ｓ１が得られた。
【０１４９】
トランスジェニックマウスの乳腺でのＫＭＫ９１７の発現量は、３．２〜２２．１ｍｇ／ｍＬと測定された。３種の構成物由来のＫＭＫ９１７の性質をさらに解析すると、“半分子抗体”の量は野生型構成物１０９９／２０１０由来物質で高かった（各２４と３４％）。２２９のセリンをプロリンに変異したことで（構成物２０１２／２０１４ヒンジ変異型と２０１２／２０１７ヒンジ＋Ｃｈ２変異型）、“半分子抗体”量は有意に減少し、２０１２／２０１４では２％未満、２０１２／２０１７では５％未満となった。３種の構成物由来物質の生物学的活性は、培養細胞由来ＫＭＫ９１７と比較した場合差異は見られなかった。
【０１５０】
本発明は、本発明の詳細な説明と関連して説明してきたが、上記説明は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を解説することを意図しており、その範囲を制限するものでないことが理解されるべきである。他の実施態様、利点、および改変は続く請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】核移植によるクローン動物作製工程の略図
【図２】ヒンジ領域改変に関するＫＭＫ９１７による分析の概要
【図３Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｄ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｅ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｆ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図３Ｇ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによる単離ＫＭＫ抗体試料のクロマトグラム
【図４Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±野生型エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±野生型エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±ヒンジおよびＣＨ２変異体エンドグリコシダーゼＦ処理
【図４Ｄ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ野生型試料±ヒンジおよびＣＨ２変異体エンドグリコシダーゼＦ処理
【図５Ａ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７ １０９９／２０１０ 野生型の糖鎖パターン
【図５Ｂ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７ ２０１２／２０１４ ヒンジ＋Ｃｈ２変異体の糖鎖パターン
【図５Ｃ】ＣＥｘ−ＨＰＬＣによるＫＭＫ９１７のフルスケールの糖鎖パターン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック哺乳動物の乳中で抗体を製造する方法であって、
体細胞および生殖細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片およびヒンジ領域をコードする配列を含む、トランスジェニック哺乳動物を提供する工程を含み、前記ヒンジ領域が、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
乳中に存在する抗体の少なくとも７０％が会合型(assembled form)であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記トランスジェニック哺乳動物が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記トランスジェニック哺乳動物から乳を入手して、抗体組成物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記トランスジェニック動物によって産生された乳から外因性抗体を精製する工程をさらに含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーターおよび乳清タンパク質プロモーターより成る群から選択されるプロモーターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジェニック哺乳動物が、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタおよびウサギより成る群から選択される哺乳動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、前記重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域のアミノ酸配列と、少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の天然の核酸配列とは異なることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基が、プロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸が、システイン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がキメラ化されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３０】
トランスジェニック哺乳動物の乳が、実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が、少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３２】
体細胞および生殖細胞が、乳中で発現可能である改変ヒンジ領域を含む抗体またはその一部をコードする改変抗体のコード配列を含む、トランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
哺乳動物上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片、およびヒンジ領域をコードする配列を含む構成物を、哺乳動物に導入する工程を含み、前記ヒンジ領域が重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記改変抗体のコード配列が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗原結合断片および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列をさらに含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記プロモーターが、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーターおよび乳清タンパク質プロモーターより成る群から選択されるプロモーターであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記トランスジェニック哺乳動物が、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、およびウサギより成る群から選択される哺乳動物であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、前記重鎖可変領域または前記定常領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域のアミノ酸配列と、少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の核酸配列とは異なることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５２】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５４】
重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体がキメラ化されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５９】
トランスジェニック哺乳動物の乳が実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項６０】
トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が、少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
乳中に会合型の外因性抗体またはその一部を発現可能であるトランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
哺乳動物に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列を含む構成物を導入し、さらに
前記哺乳動物に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列を含む構成物を導入する工程を含み、前記重鎖またはその一部が、乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
乳中に会合型の外因性抗体を発現可能であるトランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
生殖細胞および体細胞が哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列を含むトランスジェニック哺乳動物から、細胞を提供し、さらに
前記細胞に、哺乳動物上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体またはその一部の変異した重鎖をコードする配列を含む構成物を導入する工程を含み、前記重鎖またはその一部が外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
ヒンジ領域を有する外因性抗体またはその断片を含む抗体成分、および乳成分を含有し、前記ヒンジ領域が抗体に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする組成物。
【請求項６５】
組成物中に存在する前記外因性抗体の少なくとも７０％が会合型であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６６】
組成物中に存在する前記外因性抗体の少なくとも７０％が会合型であるように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６７】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６８】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６９】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項６８の組成物。
【請求項７０】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、抗体に通常連結している天然のヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７２】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、天然の抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７３】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７４】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項７３記載の組成物。
【請求項７５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項７３記載の組成物。
【請求項７６】
前記ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７７】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項７６の組成物。
【請求項７８】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項７６の組成物。
【請求項７９】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８０】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８１】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８２】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８３】
前記抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８４】
前記抗体の重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項８３記載の組成物。
【請求項８５】
前期抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８６】
前期抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８７】
組成物が実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８８】
組成物中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８９】
哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする配列を含み、重鎖またはその一部が、乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする核酸。
【請求項１】
トランスジェニック哺乳動物の乳中で抗体を製造する方法であって、
体細胞および生殖細胞が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片およびヒンジ領域をコードする配列を含む、トランスジェニック哺乳動物を提供する工程を含み、前記ヒンジ領域が、重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
乳中に存在する抗体の少なくとも７０％が会合型(assembled form)であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記トランスジェニック哺乳動物が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記トランスジェニック哺乳動物から乳を入手して、抗体組成物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記トランスジェニック動物によって産生された乳から外因性抗体を精製する工程をさらに含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーターおよび乳清タンパク質プロモーターより成る群から選択されるプロモーターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジェニック哺乳動物が、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタおよびウサギより成る群から選択される哺乳動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、前記重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域のアミノ酸配列と、少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の天然の核酸配列とは異なることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基が、プロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸が、システイン残基で置換されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がキメラ化されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３０】
トランスジェニック哺乳動物の乳が、実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が、少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３２】
体細胞および生殖細胞が、乳中で発現可能である改変ヒンジ領域を含む抗体またはその一部をコードする改変抗体のコード配列を含む、トランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
哺乳動物上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性重鎖可変領域またはその抗原結合断片、少なくとも一つの重鎖定常領域またはその断片、およびヒンジ領域をコードする配列を含む構成物を、哺乳動物に導入する工程を含み、前記ヒンジ領域が重鎖定常領域に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記改変抗体のコード配列が、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している軽鎖可変領域またはその抗原結合断片および軽鎖定常領域またはその機能断片をコードする配列をさらに含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記プロモーターが、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、βラクトグロブリンプロモーターおよび乳清タンパク質プロモーターより成る群から選択されるプロモーターであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記トランスジェニック哺乳動物が、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、およびウサギより成る群から選択される哺乳動物であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、前記重鎖可変領域または前記定常領域に通常連結しているヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域のアミノ酸配列と、少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列の少なくとも一つの核酸残基が、前記重鎖定常領域に自然に連結しているヒンジ領域の核酸配列とは異なることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５２】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項５４】
重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体がキメラ化されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項５９】
トランスジェニック哺乳動物の乳が実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項６０】
トランスジェニック哺乳動物の乳中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が、少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
乳中に会合型の外因性抗体またはその一部を発現可能であるトランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
哺乳動物に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列を含む構成物を導入し、さらに
前記哺乳動物に、哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の変異した重鎖またはその一部をコードする配列を含む構成物を導入する工程を含み、前記重鎖またはその一部が、乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
乳中に会合型の外因性抗体を発現可能であるトランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、
生殖細胞および体細胞が哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体の軽鎖をコードする配列を含むトランスジェニック哺乳動物から、細胞を提供し、さらに
前記細胞に、哺乳動物上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している外因性抗体またはその一部の変異した重鎖をコードする配列を含む構成物を導入する工程を含み、前記重鎖またはその一部が外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
ヒンジ領域を有する外因性抗体またはその断片を含む抗体成分、および乳成分を含有し、前記ヒンジ領域が抗体に通常連結しているヒンジ領域から改変されていることを特徴とする組成物。
【請求項６５】
組成物中に存在する前記外因性抗体の少なくとも７０％が会合型であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６６】
組成物中に存在する前記外因性抗体の少なくとも７０％が会合型であるように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６７】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６８】
前記抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項６９】
前記抗体がＩｇＧ４抗体であることを特徴とする請求項６８の組成物。
【請求項７０】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７１】
前記抗体のヒンジ領域の全部または一部が、抗体に通常連結している天然のヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７２】
前記抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列が、天然の抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基において異なることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７３】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７４】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項７３記載の組成物。
【請求項７５】
前記抗体のヒンジ領域またはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体由来のヒンジ領域またはその一部で置換されていることを特徴とする請求項７３記載の組成物。
【請求項７６】
前記ヒンジ領域の一つ以上のアミノ酸が、ＩｇＧ４抗体以外の抗体の対応する位置のアミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項７７】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥより成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項７６の組成物。
【請求項７８】
ＩｇＧ４抗体以外の抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３より成る群から選択される抗体であることを特徴とする請求項７６の組成物。
【請求項７９】
ヒンジ領域のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８０】
ヒンジ領域のアミノ酸番号２４１のセリン残基がプロリン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８１】
ヒンジ領域のシステイン残基以外の少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８２】
前記抗体の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８３】
前記抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８４】
前記抗体の重鎖ヒンジ領域の少なくとも一つの糖鎖付加部位が改変されていることを特徴とする請求項８３記載の組成物。
【請求項８５】
前期抗体がヒト化されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８６】
前期抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８７】
組成物が実質的に外因性抗体の半分子型を含有しないように前記ヒンジ領域が改変されていることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８８】
組成物中に存在する外因性抗体の会合型と半分子型の比率が少なくとも２：１、３：１、４：１、または５：１であることを特徴とする請求項６４記載の組成物。
【請求項８９】
哺乳類上皮細胞で発現を導くプロモーターに作動可能に連結している重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする配列を含み、重鎖またはその一部が、乳中に存在する外因性抗体の少なくとも７０％が会合型になるように改変されているヒンジ領域を含むことを特徴とする核酸。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【公表番号】特表２００６−５０７８３９（Ｐ２００６−５０７８３９Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５７４５６（Ｐ２００４−５５７４５６）
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３８１９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０８４７
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５０４２６７６２２）ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＴＣ ＢＩＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３８１９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０８４７
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５０４２６７６２２）ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＴＣ ＢＩＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]