乾燥血小板組成物
本発明は、乾燥血小板組成物ならびに凍結乾燥血小板組成物を作出および使用する方法を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乾燥血小板組成物に関し、具体的には１以上の血小板活性化阻害剤を含有する乾燥血小板組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、例えば、創傷、血小板欠乏症（例えば、血小板減少症）、種々の遺伝性または後天性異常、および大量失血のような、種々の病態の治療に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、その高い需要にもかかわらず、血小板の利用可能性は、少なくとも一つには、その短い有効期間および現行法では比較的長い期間の保存後に正常な血小板機能を維持できないことで限定されている。それ故に、有効期間を高めた血小板組成物を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、一つには、３種の血小板活性化阻害剤および凍結保護物質を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）の存在下において乾燥されかつ再水和された血小板が正常機能の、全ての、またはかなりのレベルを保持しているという発見に基づいている。これらの所見により、乾燥血小板組成物（例えば、凍結乾燥血小板組成物）の基礎および凍結乾燥血小板組成物を作出する方法が得られる。さらに、本発明は治療方法を特徴とする。
【０００５】
さらに具体的には、本発明は乾燥血小板組成物を提供する。該組成物は複数の乾燥血小板、および１以上の血小板活性化阻害剤を含む。１以上の血小板活性化阻害剤は、例えば、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、および／または環状グアノシン５’一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクターとすることができる。１以上の血小板活性化阻害剤は、例えば、アデノシン、アミロリド、および／またはニトロプルシドナトリウムを含むことができる。組成物の水和後、該組成物中の、アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭとすることができ、アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭとすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭとすることができる。ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、イロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、および／またはオウラノフィンとすることができる。ナトリウムチャネル阻害剤は、例えば、アミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、および／またはプラジュナリウムとすることができる。ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および／または三硝酸グリセリルとすることができる。該組成物は1以上の凍結保護剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、および／またはマンニトールをさらに含むことができる。該組成物は同様に、乾燥血漿をさらに含むことができる。加えて、該組成物は１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含有することができる。ＥＣＭ成分は粒状の無細胞組織マトリックス（particulate acellular tissue matrix）の粒子、例えば、粒状の無細胞皮膚マトリックス（particulate acellular dermal matrix）の粒子の成分とすることができる。この１以上のＥＣＭ成分は、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、および／またはヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、もしくはデルマタン硫酸プロテオグリカンのようなプロテオグリカンとすることができる。
【０００６】
さらに、乾燥血小板組成物の水和は、該乾燥血小板組成物が得られた新鮮な血小板サンプルの保有する少なくとも１つの血小板機能と実質的に同じレベルを有する再水和血小板組成物をもたらすことができる。少なくとも１つの血小板機能は、凝集する能力または１以上の成長因子、１以上のサイトカイン、もしくは１以上のケモカインを放出する能力とすることができる。成長因子またはケモカインは、例えば、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、および／またはチモシンβ４とすることができる。あるいは、少なくとも１つの血小板機能は、細胞（例えば、線維芽細胞）増殖を誘導する能力とすることができる。この組成物の血小板はヒト血小板とすることができる。
【０００７】
本明細書において記述されている血小板組成物のどれも、医薬として使用することができる。さらに、本明細書において記述されている血小板組成物のどれも、被験者内または被験者上の創傷（例えば、血小板（すなわち、本明細書において記述されている血小板組成物のいずれか）の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷）の治療のための医薬組成物（すなわち、医薬）の調製に使用することもできる。創傷は、例えば、内部創傷または皮膚創傷とすることができ、下記の創傷のタイプのいずれかを含むことができるが、それらに限定されることはない。
【０００８】
本発明の別の態様は、凍結乾燥血小板組成物を作出する方法である。この方法は、血小板を含有するサンプルを用意するステップ；血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含有する混合物を作出するステップ；ならびに混合物を乾燥するステップを含む。１以上の血小板活性化阻害剤は上記のもののいずれかとすることができる。該混合物中、アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭとすることができ、アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭとすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭとすることができる。該混合物は、上記のもののいずれかのような１以上の凍結保護剤をさらに含むことができる。該混合物は同様に、血漿をさらに含むことができる。混合物を乾燥するステップは、例えば、混合物を凍結乾燥するステップによることができる。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は治療方法を特徴とする。この方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；および上記の乾燥血小板組成物を創傷に適用するステップを含む。別の治療方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；上記の乾燥血小板組成物を再水和して、再水和血小板組成物を作出するステップ；および再水和血小板組成物を創傷に適用するステップを含む。
【００１０】
どちらの治療方法でも、創傷は皮膚創傷（例えば、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷（injury wound）、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による創傷、または壊疽した傷）あるいは内部創傷（例えば、皮膚の直下または下の創傷）とすることができる。内部創傷は、打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、または内部器官の負傷を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
血小板組成物、血小板、および組成物の他の成分（例えば、血漿）に関して用いられる「乾燥」という用語は、血小板組成物、血小板、または組成物の他の成分が水を実質的に含まないことを意味する。本明細書において用いられる「水を実質的に含まない」とは、５重量パーセント未満（例えば、４重量パーセント未満、３重量パーセント未満、１重量パーセント未満、０．５重量パーセント未満、０．２重量パーセント未満、０．１重量パーセント未満、０．０１重量パーセント未満、または０．００１重量パーセント未満）の水（結合水および非結合水を含む）を含有することを意味する。
【００１２】
本明細書において用いられる「対照の創傷」は、本発明の血小板組成物が適用されなかった創傷である。そのような対照の創傷は、本発明の血小板組成物が適用された創傷を共に有する被験者にあってもよい。あるいは、対照の創傷は別の被験者にあってもよい。対照の創傷は、本発明の血小板組成物が適用される創傷と、同じタイプおよびサイズのものならびに同じ組織または器官中であることが好ましい。
【００１３】
特に規定のない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。好ましい方法および材料を以下に記述するが、本明細書に記述のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書において言及されている刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。本明細書において開示されている材料、方法、および実施例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点、例えば、乾燥血小板組成物は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
血小板は、血小板減少および／もしくは血小板機能不全を伴うさまざまな血小板の疾患または異常(例えば、血小板減少症)に、ならびに種々の創傷の治療に重要な治療用物質の構成要素となる。しかしながら、保存の間の血小板の生存性および機能の急激な喪失によって、血液バンクでは有効な血小板在庫の管理が大いに複雑になっている。多くの場面で、血小板の保存寿命の制限によりその用途が大幅に減っている。
【００１６】
現行のガイドラインによっては２０℃〜２４℃で最大５日間しか血小板の保存ができず、病院および血液バンクに在庫管理の問題をもたらしている[Lazarus et al. (1982) Transfusion 22:39-43; Murphy (1985) Seminars in Hematology 22:165-177]。この時間制限は、少なくとも一つには、室温での血小板の保存の間に微生物汚染の可能性があるという懸念のため、確立された。その一方で、血小板の保存寿命を伸ばす種々の凍結保存法の利用は、非常に効果的であるということが証明されていない。そのような方法は、例えば、正常な血小板の円盤状形態の喪失、血小板細胞数の減少、および血小板の機能的活動の低下を引き起こす[Balduni et al. (1993) Haematologia. 78:101-104; Bock et al. (1995) Transfusion. 35:921-924]。それ故に、長時間の保存後にも機能を保持している血小板を得ることが望まれている。
【００１７】
本発明者らは、血小板活性化阻害剤を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液の存在下において凍結乾燥および再水和された血小板が、その機能特性を保持していることを見出した。ＣＰＡとともに凍結乾燥および再水和された血小板は、ＣＰＡ無しで凍結乾燥および再水和された血小板と比べてアゴニスト誘導性の凝集増大を示し、その成長因子分泌能を保持していた。ＴＧＦ−βの場合（代表的な成長因子として）、実質的に全てのＴＧＦ−β特異的な抗体によって、ＣＰＡ凍結乾燥および再水和後の血小板により産生されたタンパク質が活性を有することが検出された。さらに、ＣＰＡ凍結乾燥および再水和後の血小板は、線維芽細胞の増殖を誘発する因子、つまり正常な創傷封鎖および再形成に重要な決定因子を分泌した。糖尿病マウス創傷モデルにおいて、肉芽形成、創傷封鎖、血管増生および細胞増殖の程度により評価した場合、ＣＰＡの存在下で凍結乾燥された血小板の創傷への送達によって創傷治癒の増大が起こった。
【００１８】
これらの所見は、以下に記述される本発明の組成物および方法に寄与する。
【００１９】
乾燥血小板組成物
本発明は乾燥血小板組成物を提供する。この組成物は、１以上の（例えば、２以上の、３以上の、４以上の、５以上の、６以上の、７以上の、８以上の、９以上の、１０以上の、または１２以上の）血小板活性化阻害剤の存在下にて、単離された血小板または血小板を含有する調製物もしくはサンプル（例えば、多血小板血漿）を乾燥する（例えば、凍結乾燥する）ことにより作出される。本明細書において用いられる「血小板活性化」は、血小板の形状（円盤状〜球状〜無定形状）の変化、および／または血小板からの顆粒放出、および／または血小板凝集を引き起こす生物学的（例えば、トロンビンを介した）または物理的（例えば、低温、例えば、４℃への曝露）過程をいう。「血小板活性化阻害剤」は、血小板活性化を完全に阻止できるまたは部分的に低減できる作用物質である。
【００２０】
本発明の組成物を作出するのに有用な血小板を含有する調製物またはサンプルは、血小板以外の細胞を含まないことが好ましい。しかしながら、それらは少数のそのような細胞、例えば、赤血球、リンパ球、顆粒球、単球、および／またはマクロファージのような血球を含有してもよい。それらは、関連する血小板調製物またはサンプルが作出された血液中に存在する血小板以外の細胞種のいずれかを１０％未満（例えば、５％；２％；１％；０．１％；０．０１％；０．００１％；または０．０００１％未満）含有することが好ましいであろう。
【００２１】
本発明の乾燥血小板組成物は、複数の乾燥血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含有する。１以上の血小板活性化阻害剤は、１以上の、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター（アクチベーターもしくはエンハンサー）、１以上のナトリウムチャネル阻害剤、および／または１以上の、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター（アクチベーターもしくはエンハンサー）を含む。その他の血小板活性化阻害剤は、シクロオキシゲナーゼ二次メッセンジャー系の阻害剤、リポキシゲナーゼ経路の阻害剤、ホスホリパーゼ経路の阻害剤、カルシウムカスケードの阻害剤、プロテアーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤、ならびに膜改変物質を含む。
【００２２】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、アデノシン、イロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンを含む。ナトリウムチャネル阻害剤は、例えば、アミロリド、アミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムを含む。ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、ニトロプルシドナトリウム、Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１（３−モルホリノシドノンイミン）、ＳＩＮ−１Ａ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−モルホリノアミノ−アセトニトリル）、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルを含む。シクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤は、アスピリン、ジピリダモール、フルルビプロフェン、チクロピジン、ケトプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スルフィンピラゾン、グアナベンズ、ウルソル酸およびベンゾヒドロキノンとすることができる。リポキシゲナーゼ経路の阻害剤は、アスピリン、チクロピジン、ウルソル酸、ウンベリフェロン、５，８，１１，１４エイコサテトラエン酸およびエスクレチンを含む。ホスホリパーゼ経路の阻害剤は、キナクリンおよびメパクリンを含む。カルシウムカスケードの阻害剤は、プロテインキナーゼＣエフェクター、カルシウムチャネル遮断薬、カルシウム濃度改変物質、カルモジュリンエフェクター、カルシウムイオノフォア、およびＡＴＰａｓｅ刺激物質を含む。プロテアーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤は、ヘパリンおよびアプロチニン（apoprotinin）を含む。膜改変物質は、アマンタジン、ヘパリン、チクロピジン、ペントキシフィリン、およびアホエンを含む。血小板活性化阻害剤は、米国特許第５，９１９，６１４号にさらに詳細に記述されており、この開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
本発明の乾燥血小板組成物は、アデノシンをｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターとして、アミロリドをナトリウムチャネル阻害剤として、およびニトロプルシドナトリウムをｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターとして含むことができる。血小板が乾燥される溶液中の、または（それらが再水和されるなら）再水和後のこれらの血小板活性化阻害剤の濃度は、次のようにすることができる：アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭ（例えば、約１００μＭ〜約１ｍＭまたは約１０μＭ〜約０．１ｍＭ）とすることができ；アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭまたは約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ）とすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭ（例えば、約２５μＭ〜約２５０μＭまたは約２．５μＭ〜約２５μＭ）とすることができる。例えば、好ましい実施形態において、アデノシンの濃度は０．１ｍＭであり、アミロリドの濃度は０．２５ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は５０μＭである。
【００２４】
血小板活性化阻害剤および凍結保護物質（下記参照）の濃度に関して使用される「約」という用語は、言及されている作用物質の濃度が表示濃度の２０％まで（例えば、１５％；１０％；５％；２．５％；または１％まで）変化しうることを示す。
【００２５】
１以上の血小板活性化阻害剤に加えて、１以上の凍結保護剤（本明細書において凍結保護物質とも称される）を乾燥前に血小板に添加することができる。このような凍結保護剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せとすることができる。ＤＭＳＯ濃度は約０．５％〜約１０％（例えば、約１．０％〜約１０％；または約０．５％〜約１％）とすることができる。１つの好ましい実施形態において、ＤＭＳＯの濃度は０．５％とすることができる。このように、１以上の凍結保護剤が乾燥前に血小板調製物に添加されている場合、得られる乾燥血小板組成物は適切な１以上の凍結保護剤を含有するであろう。
【００２６】
乾燥の前に血小板に添加される血小板活性化阻害剤または凍結保護剤がその純粋な形態において液体（例えば、ＤＭＳＯ）である場合、乾燥血小板組成物（およびその再水和形態）は乾燥の前よりも血小板活性化阻害剤または凍結保護剤を少なく含有する可能性が高い。
【００２７】
血小板活性化阻害剤および凍結保護剤に加えて、本発明の乾燥血小板組成物は１以上のタンパク質を含むことができる。例えば、該組成物は乾燥血漿、例えば、血小板の供与者に由来する乾燥血漿を含むことができる。これは本質的に、組成物を作出するために使用される血小板調製物として多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて、組成物が作出される場合であろう。さらに、組成物中のタンパク質は乾燥血清として存在することができる。または、タンパク質は１以上の（例えば、全ての）単離された血漿由来タンパク質または血清由来タンパク質（例えば、アルブミンまたはガンマグロブリン）の形態で乾燥の前に血小板混合物に添加されてもよい。血漿、血清、またはどちらかに由来するタンパク質は、血小板と同じ供与者（すなわち、自己）、同一種の１以上の供与者、または１以上の他の種の１以上の供与者に由来することができる。これらのタンパク質供給源が得られる種は、組成物用の血小板の供給源として以下に記載されているもののいずれかとすることができる（下記参照）。さらに、血液または血清タンパク質は組換えタンパク質とすることができる。
【００２８】
乾燥血小板組成物はまた、１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えば、いずれかの型のコラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型コラーゲンまたはＶ〜ＸＶＩＩ型コラーゲンのいずれかのような）、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、デコリン、フィブリリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、および／またはヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、もしくはデルマタン硫酸プロテオグリカンのようなプロテオグリカンを含むことができる。これらの成分は乾燥前に血小板を含有する混合物に添加されてもよく、またはそれらは乾燥後に添加されてもよい。そのようなＥＣＭ成分は、投与された血小板によって放出される因子のためのスキャホールド構造および局所結合部位を提供することにより創傷修復を促進することができる。さらに、ＥＣＭ成分（上記のタンパク質添加物のような）は、凍結乾燥による乾燥の前に血小板混合物に添加される場合、血小板混合物中の多量の水と置き換わり、それによって血小板混合物の凍結時に形成される氷の量を減らし、それ故に氷を介した血小板への損傷を減らすことができる。ＥＣＭ成分は、血漿、血清、またはどちらかに由来するタンパク質について上述した供与者のいずれかより得ることができる。さらに、タンパク質であるＥＣＭは、組換えタンパク質とすることができる。ＥＣＭ成分は、例えば、さまざまなコラーゲン含有組織のいずれか、例えば、真皮から作出された粒状の無細胞組織マトリックスの形態で添加することができる。粒状の無細胞組織マトリックスは、米国特許第６，９３３，３２６号、米国特許出願第１０／２７３，７８０号、および米国特許出願第１０／９５９，７８０号に詳細に記述されており、これらの全ての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
かなりの割合の、乾燥血小板組成物の血小板が再水和時に（インビトロにおいてまたはインビボにおいて）少なくとも１つの血小板機能（例えば、少なくとも２つの、３つのまたは４つの血小板機能）を回復する。乾燥および再水和後に、本発明の血小板組成物は、対応する（同じ供与者由来の、乾燥および再水和されておらず、本発明の血小板組成物と同じ数の血小板を含有する）新鮮な血小板調製物が有すると思われる少なくとも１つの血小板機能のレベルの少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）を有する。さらに、本発明の乾燥血小板組成物の血小板の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）が、再水和時に、少なくとも１つの血小板機能を有する。関連する血小板機能は、例えば、活性化による成長因子、サイトカイン、およびケモカインの産生；活性化による細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、または上皮細胞（例えば、角化細胞））増殖の刺激能；ならびに活性化による凝集能を含む。血小板機能のアッセイは当技術分野において公知であり、以下の実施例に記述されているものを含む。血小板によって産生される成長因子、サイトカインおよびケモカインは、非限定的に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＡ／Ｂ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子のメンバー（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄ）、ならびにチモシン−β４を含む。試験できる無傷の血小板機能のさらなる兆候は、非限定的に、形態スコア（円盤状、球状、および／または無定形状である血小板の割合）、形態変化の程度（ＥＳＣ）、低張ショック反応（ＨＳＲ）、血小板凝集（血小板凝集能測定によって測定される）、血液凝固を誘導する効率（トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によって測定される）、ならびに血小板アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを含む。血小板の表面上のＰ−セレクチン発現は、それが脱顆粒されたことを示唆する。脱顆粒は、例えば、凝集なしに起こりうる。
【００３０】
再水和後の乾燥血小板組成物における血小板機能の評価は、定量的、半定量的、または定性的とすることができる。すなわちそれは、例えば、離散値として測定されてもよく、またはベースラインに対してもしくは対照サンプル（例えば、新鮮な血小板）での同様の測定の結果に対して表現されてもよい。血小板機能は、当技術分野において公知の種々の半定量的／定性的な系のいずれかを用いて評価および表現することができる。このように、血小板の生存能および／または機能は、例えば（ａ）「優」、「良」、「並」および／もしくは「不良」の１以上；（ｂ）「非常に高い」、「高い」、「平均」、「低い」および／もしくは「非常に低い」の１以上；または（ｃ）「＋＋＋＋」、「＋＋＋」、「＋＋」、「＋」、「＋／−」および／もしくは「−」の１以上として表現することができる。
【００３１】
血小板はさまざまな哺乳類種（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ、もしくはチンパンジー）、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、またはマウス）のいずれかの１以上の個体から得ることができるが、それらが投与されることになる被験者と同じ種のものであることが好ましい。乾燥血小板組成物はインビトロまたはインビボにおいて使用することができる。乾燥血小板組成物のインビトロでの使用は、例えば、止血促進活性を有するもの、止血阻害活性を有するもの、または創傷治癒を促進するものについて、関心対象の化合物をインビトロでスクリーニングアッセイまたは試験するための標的としてのその使用を含む。乾燥血小板組成物は再水和され（例えば、生理食塩水または培地のような生理溶液を用いて）、組織培養皿に播種されてもよい。
【００３２】
乾燥血小板組成物はインビトロでの産生および血小板によって発現される可溶性因子のその後の単離に使用することもできる（上記参照）。このような因子はそれ自体が診断手段として有用であり、または診断用の抗体を作出するための抗原として使用することができる。さらに、再水和された本発明の乾燥血小板はインビトロでの薬物の有効性または毒性アッセイに使用することができる。乾燥血小板組成物は、その他の血小板保存組成物を開発するための手順のなかで「陽性対照」として使用することもできる。
【００３３】
本発明の乾燥血小板組成物を再水和することにより得られる血小板を用いて、培養液中の非血小板細胞の成長および／または分化を補助することもできる。このような血小板は活性化により、例えば、細胞培養液中の線維芽細胞または他の細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、もしくは上皮細胞（例えば、角化細胞））の生存および／または成長を促進することができる。乾燥血小板組成物は、血小板機能のインビトロおよびインビボでの基礎科学研究に使用することもできる。
【００３４】
乾燥血小板組成物の、またはそれから得られる血小板のインビボでの用途としては、例えば、動物モデルでの（例えば、上記の哺乳類のいずれかでの）またはヒト被験者での研究が挙げられる。このような研究は、例えば、血小板それ自体のまたは血小板機能を調節する（アップもしくはダウンレギュレートする）化合物および生体分子の治療的および／または予防的有効性を評価するために行うことができる。本発明の血小板組成物の他の用途としては、治療方法が挙げられる（下記参照）。
【００３５】
血小板を単離する方法は当技術分野において周知である。例えば、血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）法またはバフィーコート法のいずれかによる全血液の遠心分離によって調製することができる。さらに、血小板は、当技術分野において利用可能な種々のアフェレーシス技術によって収集することができる。
【００３６】
凍結乾燥血小板組成物を作出する方法
また、本発明によって、凍結乾燥血小板組成物を作出する方法が具体化される。この方法は（ａ）血小板の調製物またはサンプルを用意するステップ；（ｂ）血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含む混合物を作出するステップ；ならびに（ｃ）混合物を乾燥するステップを含む。該混合物は必要に応じて、１以上の凍結保護物質、１以上のタンパク質（例えば、血漿）、および／または上記のＥＣＭ成分を含んでもよい。
【００３７】
血小板の調製物またはサンプル、血小板活性化阻害剤、ならびに任意の凍結保護物質、タンパク質およびＥＣＭ成分は、上記のもののいずれかとすることができる。混合物の乾燥は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、空気乾燥、不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の、雰囲気の中でのもしくは流れの下での乾燥、または凍結乾燥によるものとすることができる。凍結乾燥法は当技術分野において周知である（例えば、Labconco, 2004による業界サービス誌「A Guide to Freeze-drying for the Laboratory」；Franks (1994) Proc. Inst. Refrigeration. 91: 32-39、ならびに米国特許第４，６１９，２５７号、同第４，６７６，０７０号、同第４，７９９，３６１号、同第４，８６５，８７１号、同第４，９６４，２８０号、同第５，０２４，８３８号、同第５，０４４，１６５号、同第５，１５４，００７号、同第６，１９４，１３６号、同第５，３３６，６１６号、同第５，３６４，７５６号、および同第５，７８０，２９５号を参照されたく、これらの全ての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３８】
１以上の血小板活性化阻害剤、および必要に応じて１以上の凍結保護物質を用いての血小板の凍結乾燥では、たとえあっても、血小板に対して最小限の機能的損傷しか起こらない。適当な凍結乾燥装置は商業的供給源、例えば、Labconco（Kansas City, MO）およびVirTis（Gardiner, NY）から入手可能である。液体（例えば、水）含有サンプルの凍結乾燥は、サンプルの凍結およびその後の、昇華と呼ばれる過程による凍結サンプルからの液体（例えば、水）の除去を含む。凍結は、例えば、凍結乾燥器中または−８０℃の冷凍庫中とすることができる。サンプル中の液体が凝固するまで（視覚的に評価されるように）、サンプルを冷却する。凍結は、例えば１分あたり１℃〜５℃の冷却速度ですることができ、「即時冷凍」ではないことが好ましい。凍結法は、凍結乾燥に関して引用されている上記の参考文献の中に広く記述されている。昇華は、凍結した液体が液相を通過せず直接的に気相状態に進むときに起こる。凍結乾燥は、例えば、マニホールド法、バッチ法、またはバルク法を含めて、各種の方法のいずれかによって行うことができる。
【００３９】
治療方法
本発明はまた、治療方法を提供する。この方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い被験者を特定するステップおよび該被験者に上記の血小板組成物のいずれかを投与するステップを含むことができる。
【００４０】
乾燥血小板組成物は、それ自体が被験者に投与されてもよい。この場合、血小板の再水和は被験者内で行われる。または、該血小板組成物を再水和し、その後で被験者に投与してもよい。後者の場合、該組成物は必要に応じて、投与される前に、全てのまたはかなりの量の１以上の血小板活性化阻害剤および、関連する組成物に使用されているなら、１以上の凍結保護物質を除去するため、洗浄過程に供されてもよい。このような洗浄方法は、当技術分野において公知であり、一般に１以上の（例えば、２つの、３つの、または４つの）遠心分離ステップを含む。使用される血小板活性化阻害剤および／または凍結保護物質が有毒である場合、そのような洗浄ステップを行うことが特に望ましい。この場合、洗浄は、有毒な成分が全く、または許容される低レベルの有毒な成分しか、組成物の中に残らなくなるまで、行われる。
【００４１】
再水和（および必要に応じて洗浄）は、血小板が１以上のその機能（上記参照）を保持するような任意の生理溶液（例えば、水、生理食塩水、組織培地、または以下の実施例１および実施例７に記述の生理溶液）を用いてすることができる。乾燥された血小板組成物は必要に応じて、血小板が適切な被験者に投与されることになる製薬上許容される担体（下記参照）の中で再水和されてもよい。再水和は、関連する担体中での血小板の速やかな浸漬によってもまたは乾燥血小板への担体の緩やかな、例えば、滴下によってもよい。
【００４２】
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い被験者は、創傷している。創傷は、血小板を用いて治療されることから恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高いものとすることができる。創傷は、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による組織創傷、および壊疽した傷でありうる皮膚創傷、またはそれらの結果でありうる皮膚創傷とすることができる。創傷はまた、任意の内部器官または組織、例えば、胃腸組織、肺性（肺または気管支）組織、心臓組織、結合組織（例えば、腱、靱帯、および軟骨）、骨組織、神経（中枢および末梢神経系）組織、ならびに血管（静脈および動脈）組織の内部創傷とすることができる。関心対象の内部創傷は、非限定的に、打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、または内部器官の損傷（例えば、腸、脾臓、肝臓、肺、もしくは心臓の損傷）を含む。創傷は、例えば、複雑骨折、銃創、または事故による擦り傷を含めて、外傷により引き起こされうる。
【００４３】
乾燥（または再水和）血小板組成物は、発生直後の創傷またはその自然治癒過程の任意の段階にある創傷に送達することができる。血小板組成物は、被験者において創傷が検出または形成された後に、または検出または形成されてからすぐに、創傷に送達されることが好ましいであろう。血小板組成物を用いて治療される創傷は、さまざまな外観、サイズ、奥行き（すなわち、段階）、および色を持つことがあり、例えば、血腫、血清腫、創傷浸出液、壊死組織、および痂皮の存在を含むことがある。
【００４４】
乾燥（または再水和）血小板組成物は局所的に、すなわち、創傷に直接的に適用することができる。これは任意の適当な手段により、例えば、血小板を創傷に振り掛けるもしくは吹き掛けることにより、血小板を創傷の中に詰め込むことにより、または以下に論じられる外科的補助によって創傷に適用することができる。噴霧可能なエアロゾル調製物は、血小板組成物を固体または液体の不活性な担体材料と組み合わせることができ、スクイーズボトルの中にまたは加圧された揮発性の、通常は高圧ガス、例えば、フレオンとの混合物の中に含めることができる。
【００４５】
乾燥血小板は、例えば、創傷被覆材もしくは包帯、縫合糸、編物、または人工装具のような、外科的補助によって創傷に適用されてもよい。そのような補助は、例えば、生理学上許容される固体基材および該基材上のまたは中の（例えば、該基材上のコーティングとして適用されたまたは該基材中に含浸された）血小板を含むことができる。典型的には、そのような外科的補助は、滅菌容器の中に詰められた滅菌形態で提供される。外科的補助の基材は、例えば、乾燥血小板を該材料に振り掛けることによりまたは外科的補助の基材に１以上の血小板活性化阻害剤（および必要に応じて１以上の凍結保護物質）を含有する新鮮な血小板の液体懸濁液を含浸し、もしくはその表面に１以上の血小板活性化阻害剤（および必要に応じて１以上の凍結保護物質）を含有する新鮮な血小板の液体懸濁液を適用し、血小板が外科的補助の基材に接着するように外科的補助／血小板の混合物を乾燥する（例えば、凍結乾燥する）ことにより、血小板でコーティングすることができる。あるいは、乾燥血小板は適当な接着性材料により外科的補助の基材に接着されてもよく、または被験者への外科的補助の適用の前に外科的補助に単純に振り掛けられてもよい。
【００４６】
外科的補助は任意の適当な形状およびサイズのものとすることができ、生理学上許容される、疎水性または親水性の、任意の適当な固体材料からなることができる。例えば、縫合糸は、単繊維で編まれていてもよく、生分解性とすることができ、および例えば、ナイロンシルク、ポリエステル、または綿のような材料からなることができる。人工装具は例えば、動脈、静脈、管の修復において使用される織物または押出管状構造体；ヘルニア治療においておよび損傷した肝臓、腎臓、またはその他の内部器官の補助において外科的に有用な編物；ピン、スクリュー、および補強板；心臓弁、人工腱、または軟骨材料を含む。包帯は、綿または創傷にもしくは創傷を覆うように適用するのに適したその他の織物のような、任意の適当な基材からなることができ、必要に応じて裏当て材を含んでもよく、および必要に応じて創傷を覆う包帯を固定するためそのフェース面に１以上の接着領域を含んでもよい。
【００４７】
本発明の血小板組成物は、製薬上許容される担体を含んだ製薬上許容される処方物中に含めて被験者に投与される。製薬上許容される担体、例えば、生理食塩水、賦形剤、または安定剤は、それらが被験者に投与される前に細胞に添加することができる。「製薬上許容される」という語句は、ヒトに投与される場合、使用される濃度で、細胞に有害でなく、生理学的に寛容され、かつ通常は異常亢進、目まいなどのような、アレルギー反応または類似の有害反応を生じない、分子的実体および組成物をいう。
【００４８】
適当な処方物は、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、膏薬、およびエアロゾルを含むが、これらに限定されることはなく、これらは必要に応じて、滅菌されあるいは助剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、抗菌剤（例えば、過酸化水素、ベタジン、もしくは酢酸）、または浸透圧に影響を与えるための緩衝液もしくは塩と混合される。多種多様な製薬上許容される担体、賦形剤または安定剤は、当技術分野において公知である[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol, A. Ed. 1980]。製薬上許容される担体、賦形剤または安定剤は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の無毒性の有機酸緩衝液のような、緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の糖質；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール、もしくはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性化剤を含む。
【００４９】
必要とされる血小板組成物の投与量は、処方物の性質、創傷の性質または治療される創傷のタイプおよび重症度、被験者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別、投与される他の治療薬、ならびに主治医の判断に依る。さまざまな投与経路の有効性の違いを考慮して、必要とされる投与量の幅は大きいと予想される。血小板組成物は、再水和組成物およそ１ｍｌが各およそ１ｃｍ３の創傷に適用されるように、創傷に適用することができる。これらの投与量レベルは、当技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準的な実験手順により調整することができる。
【００５０】
血小板組成物は被験者に１回または複数回投与することができる。すなわち、該組成物は１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１７回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、６０回、７０回、８０回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３５０回、４００回、４５０回、５００回、７００回、１０００回、またはそれ以上の回数、投与することができる。複数回の投与が行われる場合、投与は任意の適切な時間、例えば、３０秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、１０ヶ月間、１年間、１８ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間で区切られてもよい。
【００５１】
血小板は、血小板組成物が投与される個体（受容者）から得ることができ、すなわち、血小板は自家性とすることができる。あるいは、それらは受容者と同種の１以上の個体から得ることができ、例えば、血小板組成物は、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）の被験者、例えば、ヒトボランティアから調製された血小板サンプルのプールから作出することができる。受容者は供与者以外の種のものとすることもできる。さらに、血小板は成人、幼児の血液、または１以上の個体の胎児血液から単離することができる。血小板の受容者および供与者は、上記のその他任意の種のものとすることができる。
【００５２】
本明細書において用いられる「治療（の）」または「治療（法）」は、病態（例えば、創傷）の症状の完全な消失または病態の症状の重症度の軽減を意味する。「予防」は、病態の症状が本質的にないことを意味する。本明細書において用いられる「予防（法）」は、病態の症状の完全な阻止、病態の症状の発症の遅延、または後に現れる病態症状の重症度の緩和を意味する。
【００５３】
以下の例は本発明を例示し、限定はしないよう意図される。
【実施例】
【００５４】
実施例１−実施例１〜６において使用される血小板組成物の調製
ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）の収集
ヒト血小板の無作為供与者単位（random donor unit；ＲＤＵ）の形態でのＰＲＰサンプルを米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）公認の血液バンクから購入し、室温で撹拌しながら保存し、提供から５日以内に使用した。必要とされる全ての供与者スクリーニングおよび放出試験は、ＡＡＢＢの要件[MEB Technical Manual 14th ed. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks (2002)]にしたがい該血液バンクによって行われた。
【００５５】
ＰＲＰの凍結乾燥
ＰＲＰのアリコートを代謝阻害剤アミロリド、アデノシン、およびニトロプルシドナトリウムならびに凍結保護物質ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、マンニトール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液と混合した。これらの化合物を全て、等張緩衝液（実施例７に記述の緩衝液Ｂ）に希釈した。別個の対照ＰＲＰアリコートは等張緩衝液のみと混合した。処理されたＰＲＰサンプルおよび対照ＰＲＰサンプル中の血小板の終濃度は細胞９×１０５個／μｌとし、代謝阻害剤および凍結保護物質の終濃度は次のとおりであった：アミロリド（０．２５ｍＭ）、アデノシン（０．１ｍＭ）、ニトロプルシドナトリウム（５０μＭ）、ポリビニルピロリドン（４％ ｗ／ｖ）、マンニトール（５０ｍＭ）、およびジメチルスルホキシド（０．５％ ｖ／ｖ）。
【００５６】
両血小板サンプルを１分あたり１℃〜５℃の冷却速度で凍結し、次に標準的な条件の下で凍結乾燥した。凍結乾燥した後に、ＰＲＰサンプルを５日未満の間−８０℃で保存し、次いで凍結乾燥前の量まで緩衝液Ｂの迅速な全量添加により再水和した。
【００５７】
実施例２−ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、血小板凝集の増大を示す
ＣＰＡとともに凍結乾燥されかつ再水和された血小板が止血の重要な機能を媒介できるかどうかを判定するため、ＣＰＡ有りまたは無しで凍結乾燥されかつ再水和されたサンプルの凝集能をアデノシン二リン酸（１０μＭ）およびＩ型ウマコラーゲン（２μｇ／ｍｌ；Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）の存在下において試験した。これらの試験の場合、下記の他の実験とは対照的に、ＣＰＡ処理および対照の凍結乾燥サンプルを緩衝液Ｂで１回洗浄した。両サンプル中の血小板の濃度を次に、緩衝液Ｂで血小板３×１０５個／μｌに調整し、両サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、その後アデノシンおよびコラーゲンを表示の濃度で添加した。サンプル温度を３７℃に維持しながら、凝集を光学的血小板凝集計で測定した。データは新鮮な血小板の（凍結乾燥サンプルを作出するために使用されたＰＲＰサンプルの）凝集反応の割合で表された、凍結乾燥および再水和血小板の凝集反応として示されている。
【００５８】
ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、対照の凍結乾燥血小板に比べて凝集能の増大を示した（図１）。
【００５９】
実施例３−血小板成長因子放出アッセイ
トロンビン活性化血小板からの成長因子の放出を測定するためのアッセイの初期確認において、新鮮な血小板懸濁液（凍結または凍結乾燥および再水和されていない）を試験した。新鮮な血小板ＰＲＰサンプルを緩衝液Ｂで細胞３×１０５個／μｌの濃度に希釈し、室温で５分間トロンビン（１単位／ｍｌ）により活性化した。得られた血小板凝集塊を遠心分離し、上清をペレット状の凝集塊から分離した。市販のキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造元の指示にしたがって用い、４種の成長因子の上清中濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。これらの成長因子は形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ Ａ／Ｂ）、上皮由来成長因子（ＥＧＦ）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）であった。
【００６０】
データは、同じ血小板の対応サンプルの超音波処理によって放出された成長因子の量の割合で表された、トロンビン活性化上清中に放出された成長因子の量として示されている（表１）。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【００６１】
表１に示されるように、全４種の成長因子に対し、超音波処理により放出される成長因子のおよそ５０％がトロンビン活性化により新鮮な血小板から放出された。
【００６２】
（表１）新鮮なヒト血小板からの成長因子の放出
【表１】
【００６３】
実施例４−ＣＰＡ含有の凍結乾燥されかつ再水和された血小板の成長因子放出
ＣＰＡの存在下および非存在下での血小板の凍結乾燥および再水和による血小板成長因子の放出に及ぼす影響を調べた。代表的な成長因子としてＴＧＦ−βについて得られたデータを表２に示す。ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例３にあるように）を以下のサンプルで行った：
（ａ）凍結乾燥に使用されるＰＲＰサンプルの遠心分離によって得られた上清（「新鮮な」「血漿」）、
（ｂ）超音波処理後の同じＰＲＰサンプル（「新鮮な」「超音波処理物」）；この測定では、ＰＲＰサンプルの血漿中のＴＧＦ−βに加えて、ＰＲＰサンプル中の血小板から放出可能な全ＴＧＦ−βが得られた、
（ｃ）（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰサンプルの遠心分離によって得られた上清（「Ｆ／Ｄ／Ｒ」「血漿」）、
（ｄ）超音波処理後の、（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰサンプル（「Ｆ／Ｄ／Ｒ」「超音波処理物」）、
（ｅ）トロンビン処理され（実施例３にあるように）、（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰの遠心分離によって得られた上清；（ｃ）において検出された量を差し引いた、これらの上清中において検出された量を（ｃ）において検出された量を差し引いた、（ｄ）において検出された量の関数（割合）として表した（「放出」）。
【００６４】
ＣＰＡ成分は試験の前にサンプルから流し去られなかった。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【００６５】
（表２）（ＣＰＡ有りまたは無しで）凍結乾燥されかつ再水和された血小板によるＴＧＦ−βの放出
【表２】
Ｆ／Ｄ／Ｒ；凍結乾燥されかつ再水和された
【００６６】
ＣＰＡ処理および未処理の両血小板の凍結乾燥および／または再水和により、新鮮な血小板懸濁液に比べて顕著なレベルの自発的なＴＧＦ−β漏出が起こった（表２）。しかしながら、この自発的な漏出は、ＣＰＡが無いよりも有る状態で凍結乾燥された血小板において若干低かった。最も重要なことには、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和された血小板よりもＴＧＦ−βを放出する能力がかなり高い。同様の結果が、上記のその他３種の成長因子についても認められた。
【００６７】
実施例５−ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板により産生されるＴＧＦ−βは活性している
超音波処理された新鮮なＰＲＰおよび超音波処理され、ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ）ＰＲＰ由来の上清における、細胞アッセイ（下記参照）により測定される活性ＴＧＦ−βのレベル、およびＥＬＩＳＡにより測定される全ＴＧＦ−βタンパク質のレベルを比較した（表３）。これらの上清は、表２に示されているもののいくつかと同じであった。ＴＧＦ−β活性を測定するのに使われた細胞培養アッセイは、Ａｂｅら[(1994) Anal. Biochem. 216 (2):276-284]に記述のものとし、この文献の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験における３回の反復の平均値の平均である。
【００６８】
超音波処理された新鮮な血小板および超音波処理され、ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板から放出された実質的に全てのＴＧＦ−βが活性していた（表３）。同じ結果が、超音波処理され、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和された血小板で得られた。
【００６９】
（表３）ヒト血小板におけるＴＧＦ−β活性の測定
【表３】
【００７０】
実施例６−細胞増殖アッセイ
アッセイのデザインと検証
トロンビン活性化血小板により放出された可溶性因子の細胞増殖誘導活性を試験するため、インビトロの「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系を使用した。図２Ａはこの「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系の図表示である。Ｓｗｉｓｓ Ａｌｂｉｎｏマウス３Ｔ３線維芽細胞を増殖培地（ＧＭ；４ｍＭグルタミン、４０５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中にて２４ウェル組織培養プレートの培養ウェルの底面に１ウェルあたり細胞１０，０００個の密度で播種し、５％ＣＯ２の加湿環境中３７℃で１６時間培養した。活性化または超音波処理血小板を添加した培養物（および対応する対照培養物）において（下記参照）、ＧＭを低血清培地（ＳＲＭ；ＧＭと同じだが、１０％ではなく０．５％のウシ血清を添加）と交換した。超音波処理またはトロンビン活性化（３７℃で５分間１単位／ｍｌ）血小板（血小板１．２×１０６個／μｌ ７５μｌ中）およびＳＲＭ（血小板１．２×１０６個／μｌ ２２５μｌ）を、半透膜（８μｍの細孔を有する）からなる底部を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに添加し、チャンバーの底部が培養ウェル中の培地に浸かるように、該チャンバーを適切な培養ウェル中の細胞の上方に置いた（図２Ａ参照）。この培養系では、培地および可溶性因子（しかし全血小板または不溶性血小板物質ではない）が半透膜を通して拡散し、培養ウェル底部の線維芽細胞に接触することができた。「陽性対照」培養物にはＧＭが含まれ、血小板物質が含まれなかった。これらの培養物を表示の時間インキュベートし、その後、増殖をＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］代謝的変換アッセイにより測定した。これには：（ａ）培養ウェルからのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーおよび培地の除去；（ｂ）ウェルへの新鮮なＳＲＭ ０．５ｍｌおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ） １００μｌの添加；ならびに（ｃ）３時間のさらなるインキュベーション（上記の同一条件下での）が含まれた。各培養物の上清（１００μｌ）を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、各々のＯＤ５４０（相対的細胞増殖の指標として）をマイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。
【００７１】
培養容器ウェルへの試験血小板物質を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーの導入後から計７２時間の間、２４時間毎に細胞増殖の測定値を個々の培養ウェルにおいて記録した（図２Ｂ）。図２Ｂにおいて、グラフ縦棒はベースラインレベル（０時点、すなわち、血小板物質を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーが培養物に添加された時点で測定された）に対するＭＴＳレベルの増大の割合（ｙ軸左側）を表し、グラフ線は実際の細胞計数（ｙ軸右側）を表す。水平の破線は０時点の細胞数（ｙ軸右側）を示す。超音波処理された血小板および１単位／ｍｌのトロンビンで活性化された血小板は、時間依存的に線維芽細胞の増殖を増大した（ＳＲＭしか含まない培養と比較して）。
【００７２】
細胞増殖の最低レベル（ＳＲＭしか含まない培養において認められた）を差し引いた、超音波処理およびトロンビン活性化血小板により７２時間の時点で得られた細胞増殖レベルを、細胞増殖の最低レベル（ＳＲＭしか含まない培養において認められた）を差し引いた、細胞増殖の最高レベル（ＧＭしか含まない培養において認められた）の割合として表した。得られた値は「誘導％」と称されている（図２Ｃ）。
【００７３】
ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板により産生される可溶性因子は、細胞増殖誘導能を保持する
上記のインビトロ細胞増殖アッセイを用いて、ＣＰＡの存在下での凍結乾燥および再水和による、血小板の細胞増殖誘導能に及ぼす影響を判定した。実施例１に記述されているように血小板をＣＰＡ溶液と混合し、凍結乾燥し、緩衝液Ｂに再懸濁した。図２に示した実験に記述されているのと同じ対照実験を行い、データを図２Ｃに記述されているように算出した。ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板調製物は、トロンビンで活性化した後の新鮮な血小板とほぼ同じ増殖誘導％を示した（図３）。
【００７４】
遠心分離された新鮮な血小板ＰＲＰ、ＣＰＡの非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板およびＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（図４中の「血漿」のデータ）由来の上清、ならびにトロンビン活性化後のその同じ３サンプル由来の上清を、図２に描かれている実験におけるアッセイと実質的に同じアッセイにおいて試験した（図４中の「血小板」のデータ）。ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、新鮮な血小板の細胞増殖誘導能を保持したが、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和されたものは保持していなかった（図４）。図４中の破線は、線維芽細胞増殖を誘導する血漿サンプルの平均的能力を示す。
【００７５】
さらに、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されたＰＲＰサンプルをいくつかのアリコートに分割し、これらを２４週までの種々の期間−８０℃で保存した。これらのサンプルを該当の時点で再水和し、上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養系においてその線維芽細胞増殖誘導能を試験した。全てのサンプルが、保存なしで試験された対照サンプルと同じ線維芽細胞増殖誘導能を示した。
【００７６】
凍結乾燥された血小板の細胞増殖誘導能は、用量依存的である
上記のように血小板をトロンビンにより活性化し、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥しかつ再水和した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーへの再水和された血小板サンプルの添加により、さまざまな量のサンプル（同じ血小板濃度）を上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）線維芽細胞増殖アッセイ系において試験した（図５）。活性化血小板の存在下で７２時間培養した後に測定を行った。トロンビンにより活性化され、凍結乾燥された血小板の線維芽細胞の増殖を誘導する能力は、アッセイ系に添加された再水和血小板の量に用量依存的であった。
【００７７】
実施例７−ＣＰＡ処理により凍結乾燥された血小板は糖尿病マウス創傷モデルにおいて創傷治癒を増大する
材料および方法
血小板治療用物質の調製
ヒト血小板の単一供与者単位（Single donor units；ＳＤＵ）を米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）公認の血液バンクから購入し、室温で撹拌しながら保存し、提供から５日以内に使用した。必要とされる全ての供与者スクリーニングおよび放出試験は、ＡＡＢＢの要件[MEB Technical Manual 14th ed. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks (2002)]にしたがい該血液バンクによって行われた。各ＳＤＵを３つのアリコートに分割して、３つの特異な血小板に基づく治療用物質を調製した。第１のアリコートは溶媒として生理的緩衝液［緩衝液Ｂ；１３６ｍＭ ＮａＣｌ、１１．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭグルコース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４］を用いてＣＰＡ含有溶液により血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、凍結乾燥し、これによってＣＰＡ安定保存の凍結乾燥多血小板血漿（ＦＤＰ−ＣＰＡ）を作出した。第２のアリコートは緩衝液Ｂを用いて血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、凍結乾燥して、凍結乾燥多血小板血漿（ＦＤＰ）サンプルを作出した。第３のアリコートは緩衝液Ｂを用いて血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、１０秒間超音波処理して細胞構造を破壊し、細胞内構成要素を放出させ、−８０℃で凍結し、新鮮な凍結血小板（ＦＦＰ）サンプルを作出した。ＣＰＡ保護物質溶液の添加により、２５０μＭアミロリド（amilioride）、１００μＭアデノシン、５０μＭニトロプルシドナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、４％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）Ｃ−１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）、および５０ｍＭマンニトールの最終の処理組成物を得た。血小板物質の操作は全て標準的な無菌法を用いて行い、溶液は全て孔径０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてろ過滅菌した。血小板濃度はＣｅｌｌＤｙｎ（登録商標）１７００血球分析装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いて確認した。乾燥された血小板産物を乾燥窒素下、熱融着アルミ箔袋の中に包装し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７８】
創傷モデルおよび治療法
ホモ接合性の、遺伝的に糖尿病の８〜１２週齢Ｌｅｐ／ｒ−ｄｂ／ｄｂ雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−Ｌｅｐｒｄｂ系統）をＡＡＡＬＡＣ公認の施設において、認可済の動物プロトコルの下で使用した。外科治療の前日に、毛を剪定し、脱毛した（Ｎａｉｒ（登録商標）；Ｃｈｕｒｃｈ ＆ Ｄｗｉｇｈｔ Ｃｏ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）。外科治療当日（術後第０日；ＰＯＤ ０）に、動物を計量し、６０ｍｇ／ｋｇのネンブタール（登録商標）（ペントバルビタールナトリウム）で麻酔した。背面の皮膚領域１．０ｃｍ２および筋肉層を切除し、創傷を撮影した。同時に、以下の血小板ベースの治療剤を調製した：ＦＦＰサンプルを融解し、その一方で凍結乾燥サンプル（ＦＤＰおよびＦＤＰ−ＣＰＡ）をその元の量まで滅菌ｄＨ２Ｏで再水和した。前処理測定に基づき、等価な血小板濃度で、３種の異なる血小板治療剤を２５０μｌのアリコートに分割した。各アリコートを使用の直前に１Ｕ／ｍｌトロンビン（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）で処理し、in situにて凝固させ、それにより創傷での血小板物質の残存を促進した。各血小板実験群（ＮＴ（未治療）、ＦＦＰ、ＦＤＰおよびＦＤＰ−ＣＰＡ）には１５の創傷が含まれた。全ての創傷を半閉鎖ポリウレタン包帯（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標），３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で覆った。術後第９日（ＰＯＤ ９）に、動物を安楽死させ、創傷を撮影し、切除し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【００７９】
創傷封鎖分析
ＰＯＤ ９に記録されたデジタル写真は面積測定法（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて、治療様式に盲目の、２人の独立した観察者により初期の写真（ＰＯＤ ０）と比較された。元の創傷面積の割合として収縮、再上皮化、および開放創を測定することにより、創傷封鎖を定量化した。収縮、再上皮化および開放創の面積の合計は、元の創傷サイズの１００％に等しい[Sullivan et al. (2004) Plast. Reconstr. Surg. 113(3):953]。
【００８０】
顕微分析
創傷生検試料を二等分し、加工処理し、通常のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）プロトコルにしたがって染色した。デジタル写真を倍率４０×で顕微鏡用創傷切片を撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて各創傷のパノラマ式の横断面合成画像を作出した。肉芽組織の面積および厚さを定量化するため、実験的な治療様式に盲目の、２人の独立した観察者がＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（商標）ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）によりデジタル画像を分析した。毛細血管密度は、倍率２００×で表示されたスライド１枚につき３視野を用いて：１つは創傷の中央においておよび１つは各創縁の位置で評価した。これらの画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳソフトウェアで表示し、各高倍率視野内の血管に印を付け、これを計測した。
【００８１】
統計分析
値は本文および図の中で平均＋／−標準偏差として表した。一元配置分散分析およびａｄ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔｓ検定を用いて、治療様式間の有意差を判定した。
【００８２】
結果
創傷封鎖
創傷治癒は創傷の収縮（contration）および再上皮化の組合せにより全ての群で起こった。先の研究から、糖尿病マウスにおいて１．０ｃｍ２の創傷が外科治療から約８〜１２日の時点で５０％の封鎖点に到達することや、いったん治癒したら、糖尿病マウスおよび対照の非糖尿病マウスにおける創傷の組織像または外観に差異のないことが明らかにされている（データは示されていない）。図６から、再上皮化は全治療群において同様であったものの、他の群に比べてＦＤＰ−ＣＰＡ群では創傷の収縮が著しく低下していたことが明らかである。
【００８３】
肉芽組織
各創傷のパノラマ式の横断面デジタル画像を用意して、肉芽組織の面積および厚さを分析した（図７）。ＦＤＰ−ＣＰＡもＦＤＰもともにＮＴ群に比べて肉芽組織の面積の有意な（ｐ＜０．０１）２．３倍の増大を誘導した（図７）。ＦＦＰを用いた治療も未治療の創傷と比較した場合、肉芽組織の形成を刺激したが（ｐ＜０．０５）、いずれの凍結乾燥条件よりも目に見えて高い浮腫性を示した。同様の結果が肉芽組織の厚さに対して認められた（図７）。ＦＤＰ−ＣＰＡおよびＦＤＰ治療はＮＴ群と比べて、創傷の中央で測定された肉芽組織の厚さの有意な（ｐ＜０．０１）、それぞれ、３．１倍および３．２倍の増大を誘導した。ＦＦＰ治療に応じて組織の厚さもＮＴに比べ有意に上昇した（ｐ＜０．０１）が、凍結乾燥治療の条件に匹敵する結果を達成することはできなかった。
【００８４】
新生血管
血小板物質による治療に応じた組織血管の増大は、標準的なＨ＆Ｅ染色創傷切片の測定で明らかであった。ＦＤＰ−ＣＰＡ治療はＮＴ群およびＦＦＰ群に比べて、高倍率視野あたりの平均血管数の有意な（ｐ＜０．０１）、それぞれ、２．２倍および１．８倍の増大をもたらした。ＦＤＰ治療はＮＴ群に比べて１．６倍の増大を誘導した（ｐ＜０．０１）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】血小板活性化阻害剤および凍結保護剤を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液の存在下または非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板の凝集能の回復を示す棒グラフである。血小板凝集反応は、アデノシン二リン酸（１０ｍＭ）およびコラーゲン（２μｇ／ｍｌ）の組合せによって活性化された。データは、凍結乾燥血小板を作出するために使用された同じサンプル由来の新鮮な血小板の凝集反応の割合として、凍結乾燥および再水和血小板サンプルの凝集反応として示されている。実験は、各実験に対し別個の供与者由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて３回行った。示されているデータは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図２Ａ】血小板により放出された可溶性因子に応じた線維芽細胞の増殖を測定するために使用された「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系の図表示である。線維芽細胞を２４ウェル組織培養プレートのウェルの底面に播種し、可溶性因子（しかし全血小板または不溶性血小板物質ではない）の、それらが線維芽細胞と接触する培養ウェルへのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーからの拡散を可能にする半透膜からなる床面を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに、試験血小板物質を添加した。
【図２Ｂ】増殖培地単独、低血清培地単独、または低血清培地および超音波処理血小板もしくは図２Ａに記述のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養系の中で１単位／ｍｌのトロンビンにより活性化された血小板から放出された可溶性因子、への曝露から２４時間、４８時間、および７２時間の時点での線維芽細胞の増殖の誘導を示す棒グラフおよび線グラフである。グラフ棒はベースラインに対する、基質ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］の代謝的変換により産生された着色生成物の量の増大の割合（相対細胞数の指標として）（ｙ軸左側）を表し、グラフ線は実際の細胞数（ｙ軸右側）を表す。水平の破線は血小板物質への線維芽細胞の初期曝露時（すなわち、０時）の細胞数を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図２Ｃ】超音波処理および活性化血小板から放出された可溶性因子への曝露から７２時間後の線維芽細胞増殖の誘導の割合を示す棒グラフである。データは、図２Ｂに示した実験の７２時間の時点での観察結果から得られた。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図３】新鮮な血小板およびＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ ＣＰＡ）血小板に応じた線維芽細胞増殖の誘導の割合（図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて得られたデータから計算された）を示す棒グラフである。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図４】新鮮な血小板、ＣＰＡの存在下（ｗ／ＣＰＡ）もしくはＣＰＡの非存在下（ｗ／ｏ ＣＰＡ）において凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ）血小板、または凍結乾燥血小板調製物を作出するのに使用された血小板の供給源とされた多血小板血漿（ＰＲＰ）の遠心分離によりもしくは２種の再水和凍結乾燥サンプルの遠心分離により得られた血漿による処理後の線維芽細胞増殖の誘導の割合（図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて得られたデータから計算された）を示す棒グラフである。破線は、３種全ての血漿サンプルによる線維芽細胞増殖の平均的な誘導の割合を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図５】図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて評価した場合の、線維芽細胞増殖を誘導するさまざまな量の血小板（ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された）の能力を示す棒グラフである。凡例は、培養系のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに添加された血小板の相対量を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験における３回の反復の平均である。
【図６Ａ】治療されなかった（ＮＴ）または新鮮な凍結血小板（ＦＦＰ）、ＣＰＡの非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（ＦＤＰ）、もしくはＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（ＦＤＰ−ＣＰＡ）により治療された、創傷後の糖尿病マウス創傷の一連の写真である。スケールバー，５００ｍｍ。
【図６Ｂ】図６Ａに示した創傷の上皮化の割合（％）を示す棒グラフである。スケールバー，５ｍｍ。
【図６Ｃ】図６Ａに示した創傷の収縮の割合（％）を示す棒グラフである。スケールバー，５ｍｍ。
【図７Ａ】図６Ａに示した創傷の下側面の組織切片における異なる量の肉芽組織沈着を示す一連の顕微鏡写真である。矢印は上皮周縁部を示し、囲い枠は、組織の面積および厚さの測定が行われた場所を示す（図７Ｂおよび７Ｃ参照）。スケールバー，１００μｍ。
【図７Ｂ】図７Ａ中の囲い枠により示された創傷の領域における肉芽組織の面積を示す棒グラフである。＊はｐ＜０．０１を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ中の囲い枠により示された創傷の領域における肉芽組織の厚さを示す棒グラフである。＊はｐ＜０．０１を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は乾燥血小板組成物に関し、具体的には１以上の血小板活性化阻害剤を含有する乾燥血小板組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、例えば、創傷、血小板欠乏症（例えば、血小板減少症）、種々の遺伝性または後天性異常、および大量失血のような、種々の病態の治療に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、その高い需要にもかかわらず、血小板の利用可能性は、少なくとも一つには、その短い有効期間および現行法では比較的長い期間の保存後に正常な血小板機能を維持できないことで限定されている。それ故に、有効期間を高めた血小板組成物を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、一つには、３種の血小板活性化阻害剤および凍結保護物質を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）の存在下において乾燥されかつ再水和された血小板が正常機能の、全ての、またはかなりのレベルを保持しているという発見に基づいている。これらの所見により、乾燥血小板組成物（例えば、凍結乾燥血小板組成物）の基礎および凍結乾燥血小板組成物を作出する方法が得られる。さらに、本発明は治療方法を特徴とする。
【０００５】
さらに具体的には、本発明は乾燥血小板組成物を提供する。該組成物は複数の乾燥血小板、および１以上の血小板活性化阻害剤を含む。１以上の血小板活性化阻害剤は、例えば、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、および／または環状グアノシン５’一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクターとすることができる。１以上の血小板活性化阻害剤は、例えば、アデノシン、アミロリド、および／またはニトロプルシドナトリウムを含むことができる。組成物の水和後、該組成物中の、アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭとすることができ、アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭとすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭとすることができる。ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、イロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、および／またはオウラノフィンとすることができる。ナトリウムチャネル阻害剤は、例えば、アミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、および／またはプラジュナリウムとすることができる。ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および／または三硝酸グリセリルとすることができる。該組成物は1以上の凍結保護剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、および／またはマンニトールをさらに含むことができる。該組成物は同様に、乾燥血漿をさらに含むことができる。加えて、該組成物は１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含有することができる。ＥＣＭ成分は粒状の無細胞組織マトリックス（particulate acellular tissue matrix）の粒子、例えば、粒状の無細胞皮膚マトリックス（particulate acellular dermal matrix）の粒子の成分とすることができる。この１以上のＥＣＭ成分は、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、および／またはヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、もしくはデルマタン硫酸プロテオグリカンのようなプロテオグリカンとすることができる。
【０００６】
さらに、乾燥血小板組成物の水和は、該乾燥血小板組成物が得られた新鮮な血小板サンプルの保有する少なくとも１つの血小板機能と実質的に同じレベルを有する再水和血小板組成物をもたらすことができる。少なくとも１つの血小板機能は、凝集する能力または１以上の成長因子、１以上のサイトカイン、もしくは１以上のケモカインを放出する能力とすることができる。成長因子またはケモカインは、例えば、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、および／またはチモシンβ４とすることができる。あるいは、少なくとも１つの血小板機能は、細胞（例えば、線維芽細胞）増殖を誘導する能力とすることができる。この組成物の血小板はヒト血小板とすることができる。
【０００７】
本明細書において記述されている血小板組成物のどれも、医薬として使用することができる。さらに、本明細書において記述されている血小板組成物のどれも、被験者内または被験者上の創傷（例えば、血小板（すなわち、本明細書において記述されている血小板組成物のいずれか）の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷）の治療のための医薬組成物（すなわち、医薬）の調製に使用することもできる。創傷は、例えば、内部創傷または皮膚創傷とすることができ、下記の創傷のタイプのいずれかを含むことができるが、それらに限定されることはない。
【０００８】
本発明の別の態様は、凍結乾燥血小板組成物を作出する方法である。この方法は、血小板を含有するサンプルを用意するステップ；血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含有する混合物を作出するステップ；ならびに混合物を乾燥するステップを含む。１以上の血小板活性化阻害剤は上記のもののいずれかとすることができる。該混合物中、アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭとすることができ、アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭとすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭとすることができる。該混合物は、上記のもののいずれかのような１以上の凍結保護剤をさらに含むことができる。該混合物は同様に、血漿をさらに含むことができる。混合物を乾燥するステップは、例えば、混合物を凍結乾燥するステップによることができる。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は治療方法を特徴とする。この方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；および上記の乾燥血小板組成物を創傷に適用するステップを含む。別の治療方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；上記の乾燥血小板組成物を再水和して、再水和血小板組成物を作出するステップ；および再水和血小板組成物を創傷に適用するステップを含む。
【００１０】
どちらの治療方法でも、創傷は皮膚創傷（例えば、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷（injury wound）、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による創傷、または壊疽した傷）あるいは内部創傷（例えば、皮膚の直下または下の創傷）とすることができる。内部創傷は、打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、または内部器官の負傷を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
血小板組成物、血小板、および組成物の他の成分（例えば、血漿）に関して用いられる「乾燥」という用語は、血小板組成物、血小板、または組成物の他の成分が水を実質的に含まないことを意味する。本明細書において用いられる「水を実質的に含まない」とは、５重量パーセント未満（例えば、４重量パーセント未満、３重量パーセント未満、１重量パーセント未満、０．５重量パーセント未満、０．２重量パーセント未満、０．１重量パーセント未満、０．０１重量パーセント未満、または０．００１重量パーセント未満）の水（結合水および非結合水を含む）を含有することを意味する。
【００１２】
本明細書において用いられる「対照の創傷」は、本発明の血小板組成物が適用されなかった創傷である。そのような対照の創傷は、本発明の血小板組成物が適用された創傷を共に有する被験者にあってもよい。あるいは、対照の創傷は別の被験者にあってもよい。対照の創傷は、本発明の血小板組成物が適用される創傷と、同じタイプおよびサイズのものならびに同じ組織または器官中であることが好ましい。
【００１３】
特に規定のない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。好ましい方法および材料を以下に記述するが、本明細書に記述のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書において言及されている刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。本明細書において開示されている材料、方法、および実施例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点、例えば、乾燥血小板組成物は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
血小板は、血小板減少および／もしくは血小板機能不全を伴うさまざまな血小板の疾患または異常(例えば、血小板減少症)に、ならびに種々の創傷の治療に重要な治療用物質の構成要素となる。しかしながら、保存の間の血小板の生存性および機能の急激な喪失によって、血液バンクでは有効な血小板在庫の管理が大いに複雑になっている。多くの場面で、血小板の保存寿命の制限によりその用途が大幅に減っている。
【００１６】
現行のガイドラインによっては２０℃〜２４℃で最大５日間しか血小板の保存ができず、病院および血液バンクに在庫管理の問題をもたらしている[Lazarus et al. (1982) Transfusion 22:39-43; Murphy (1985) Seminars in Hematology 22:165-177]。この時間制限は、少なくとも一つには、室温での血小板の保存の間に微生物汚染の可能性があるという懸念のため、確立された。その一方で、血小板の保存寿命を伸ばす種々の凍結保存法の利用は、非常に効果的であるということが証明されていない。そのような方法は、例えば、正常な血小板の円盤状形態の喪失、血小板細胞数の減少、および血小板の機能的活動の低下を引き起こす[Balduni et al. (1993) Haematologia. 78:101-104; Bock et al. (1995) Transfusion. 35:921-924]。それ故に、長時間の保存後にも機能を保持している血小板を得ることが望まれている。
【００１７】
本発明者らは、血小板活性化阻害剤を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液の存在下において凍結乾燥および再水和された血小板が、その機能特性を保持していることを見出した。ＣＰＡとともに凍結乾燥および再水和された血小板は、ＣＰＡ無しで凍結乾燥および再水和された血小板と比べてアゴニスト誘導性の凝集増大を示し、その成長因子分泌能を保持していた。ＴＧＦ−βの場合（代表的な成長因子として）、実質的に全てのＴＧＦ−β特異的な抗体によって、ＣＰＡ凍結乾燥および再水和後の血小板により産生されたタンパク質が活性を有することが検出された。さらに、ＣＰＡ凍結乾燥および再水和後の血小板は、線維芽細胞の増殖を誘発する因子、つまり正常な創傷封鎖および再形成に重要な決定因子を分泌した。糖尿病マウス創傷モデルにおいて、肉芽形成、創傷封鎖、血管増生および細胞増殖の程度により評価した場合、ＣＰＡの存在下で凍結乾燥された血小板の創傷への送達によって創傷治癒の増大が起こった。
【００１８】
これらの所見は、以下に記述される本発明の組成物および方法に寄与する。
【００１９】
乾燥血小板組成物
本発明は乾燥血小板組成物を提供する。この組成物は、１以上の（例えば、２以上の、３以上の、４以上の、５以上の、６以上の、７以上の、８以上の、９以上の、１０以上の、または１２以上の）血小板活性化阻害剤の存在下にて、単離された血小板または血小板を含有する調製物もしくはサンプル（例えば、多血小板血漿）を乾燥する（例えば、凍結乾燥する）ことにより作出される。本明細書において用いられる「血小板活性化」は、血小板の形状（円盤状〜球状〜無定形状）の変化、および／または血小板からの顆粒放出、および／または血小板凝集を引き起こす生物学的（例えば、トロンビンを介した）または物理的（例えば、低温、例えば、４℃への曝露）過程をいう。「血小板活性化阻害剤」は、血小板活性化を完全に阻止できるまたは部分的に低減できる作用物質である。
【００２０】
本発明の組成物を作出するのに有用な血小板を含有する調製物またはサンプルは、血小板以外の細胞を含まないことが好ましい。しかしながら、それらは少数のそのような細胞、例えば、赤血球、リンパ球、顆粒球、単球、および／またはマクロファージのような血球を含有してもよい。それらは、関連する血小板調製物またはサンプルが作出された血液中に存在する血小板以外の細胞種のいずれかを１０％未満（例えば、５％；２％；１％；０．１％；０．０１％；０．００１％；または０．０００１％未満）含有することが好ましいであろう。
【００２１】
本発明の乾燥血小板組成物は、複数の乾燥血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含有する。１以上の血小板活性化阻害剤は、１以上の、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター（アクチベーターもしくはエンハンサー）、１以上のナトリウムチャネル阻害剤、および／または１以上の、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター（アクチベーターもしくはエンハンサー）を含む。その他の血小板活性化阻害剤は、シクロオキシゲナーゼ二次メッセンジャー系の阻害剤、リポキシゲナーゼ経路の阻害剤、ホスホリパーゼ経路の阻害剤、カルシウムカスケードの阻害剤、プロテアーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤、ならびに膜改変物質を含む。
【００２２】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、アデノシン、イロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンを含む。ナトリウムチャネル阻害剤は、例えば、アミロリド、アミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムを含む。ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターは、例えば、ニトロプルシドナトリウム、Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１（３−モルホリノシドノンイミン）、ＳＩＮ−１Ａ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−モルホリノアミノ−アセトニトリル）、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルを含む。シクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤は、アスピリン、ジピリダモール、フルルビプロフェン、チクロピジン、ケトプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スルフィンピラゾン、グアナベンズ、ウルソル酸およびベンゾヒドロキノンとすることができる。リポキシゲナーゼ経路の阻害剤は、アスピリン、チクロピジン、ウルソル酸、ウンベリフェロン、５，８，１１，１４エイコサテトラエン酸およびエスクレチンを含む。ホスホリパーゼ経路の阻害剤は、キナクリンおよびメパクリンを含む。カルシウムカスケードの阻害剤は、プロテインキナーゼＣエフェクター、カルシウムチャネル遮断薬、カルシウム濃度改変物質、カルモジュリンエフェクター、カルシウムイオノフォア、およびＡＴＰａｓｅ刺激物質を含む。プロテアーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤は、ヘパリンおよびアプロチニン（apoprotinin）を含む。膜改変物質は、アマンタジン、ヘパリン、チクロピジン、ペントキシフィリン、およびアホエンを含む。血小板活性化阻害剤は、米国特許第５，９１９，６１４号にさらに詳細に記述されており、この開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
本発明の乾燥血小板組成物は、アデノシンをｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターとして、アミロリドをナトリウムチャネル阻害剤として、およびニトロプルシドナトリウムをｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターとして含むことができる。血小板が乾燥される溶液中の、または（それらが再水和されるなら）再水和後のこれらの血小板活性化阻害剤の濃度は、次のようにすることができる：アデノシンの濃度は約１０μＭ〜約１ｍＭ（例えば、約１００μＭ〜約１ｍＭまたは約１０μＭ〜約０．１ｍＭ）とすることができ；アミロリドの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭまたは約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ）とすることができ、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は約２．５μＭ〜約２５０μＭ（例えば、約２５μＭ〜約２５０μＭまたは約２．５μＭ〜約２５μＭ）とすることができる。例えば、好ましい実施形態において、アデノシンの濃度は０．１ｍＭであり、アミロリドの濃度は０．２５ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度は５０μＭである。
【００２４】
血小板活性化阻害剤および凍結保護物質（下記参照）の濃度に関して使用される「約」という用語は、言及されている作用物質の濃度が表示濃度の２０％まで（例えば、１５％；１０％；５％；２．５％；または１％まで）変化しうることを示す。
【００２５】
１以上の血小板活性化阻害剤に加えて、１以上の凍結保護剤（本明細書において凍結保護物質とも称される）を乾燥前に血小板に添加することができる。このような凍結保護剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せとすることができる。ＤＭＳＯ濃度は約０．５％〜約１０％（例えば、約１．０％〜約１０％；または約０．５％〜約１％）とすることができる。１つの好ましい実施形態において、ＤＭＳＯの濃度は０．５％とすることができる。このように、１以上の凍結保護剤が乾燥前に血小板調製物に添加されている場合、得られる乾燥血小板組成物は適切な１以上の凍結保護剤を含有するであろう。
【００２６】
乾燥の前に血小板に添加される血小板活性化阻害剤または凍結保護剤がその純粋な形態において液体（例えば、ＤＭＳＯ）である場合、乾燥血小板組成物（およびその再水和形態）は乾燥の前よりも血小板活性化阻害剤または凍結保護剤を少なく含有する可能性が高い。
【００２７】
血小板活性化阻害剤および凍結保護剤に加えて、本発明の乾燥血小板組成物は１以上のタンパク質を含むことができる。例えば、該組成物は乾燥血漿、例えば、血小板の供与者に由来する乾燥血漿を含むことができる。これは本質的に、組成物を作出するために使用される血小板調製物として多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて、組成物が作出される場合であろう。さらに、組成物中のタンパク質は乾燥血清として存在することができる。または、タンパク質は１以上の（例えば、全ての）単離された血漿由来タンパク質または血清由来タンパク質（例えば、アルブミンまたはガンマグロブリン）の形態で乾燥の前に血小板混合物に添加されてもよい。血漿、血清、またはどちらかに由来するタンパク質は、血小板と同じ供与者（すなわち、自己）、同一種の１以上の供与者、または１以上の他の種の１以上の供与者に由来することができる。これらのタンパク質供給源が得られる種は、組成物用の血小板の供給源として以下に記載されているもののいずれかとすることができる（下記参照）。さらに、血液または血清タンパク質は組換えタンパク質とすることができる。
【００２８】
乾燥血小板組成物はまた、１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えば、いずれかの型のコラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型コラーゲンまたはＶ〜ＸＶＩＩ型コラーゲンのいずれかのような）、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、デコリン、フィブリリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、および／またはヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、もしくはデルマタン硫酸プロテオグリカンのようなプロテオグリカンを含むことができる。これらの成分は乾燥前に血小板を含有する混合物に添加されてもよく、またはそれらは乾燥後に添加されてもよい。そのようなＥＣＭ成分は、投与された血小板によって放出される因子のためのスキャホールド構造および局所結合部位を提供することにより創傷修復を促進することができる。さらに、ＥＣＭ成分（上記のタンパク質添加物のような）は、凍結乾燥による乾燥の前に血小板混合物に添加される場合、血小板混合物中の多量の水と置き換わり、それによって血小板混合物の凍結時に形成される氷の量を減らし、それ故に氷を介した血小板への損傷を減らすことができる。ＥＣＭ成分は、血漿、血清、またはどちらかに由来するタンパク質について上述した供与者のいずれかより得ることができる。さらに、タンパク質であるＥＣＭは、組換えタンパク質とすることができる。ＥＣＭ成分は、例えば、さまざまなコラーゲン含有組織のいずれか、例えば、真皮から作出された粒状の無細胞組織マトリックスの形態で添加することができる。粒状の無細胞組織マトリックスは、米国特許第６，９３３，３２６号、米国特許出願第１０／２７３，７８０号、および米国特許出願第１０／９５９，７８０号に詳細に記述されており、これらの全ての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
かなりの割合の、乾燥血小板組成物の血小板が再水和時に（インビトロにおいてまたはインビボにおいて）少なくとも１つの血小板機能（例えば、少なくとも２つの、３つのまたは４つの血小板機能）を回復する。乾燥および再水和後に、本発明の血小板組成物は、対応する（同じ供与者由来の、乾燥および再水和されておらず、本発明の血小板組成物と同じ数の血小板を含有する）新鮮な血小板調製物が有すると思われる少なくとも１つの血小板機能のレベルの少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）を有する。さらに、本発明の乾燥血小板組成物の血小板の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）が、再水和時に、少なくとも１つの血小板機能を有する。関連する血小板機能は、例えば、活性化による成長因子、サイトカイン、およびケモカインの産生；活性化による細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、または上皮細胞（例えば、角化細胞））増殖の刺激能；ならびに活性化による凝集能を含む。血小板機能のアッセイは当技術分野において公知であり、以下の実施例に記述されているものを含む。血小板によって産生される成長因子、サイトカインおよびケモカインは、非限定的に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＡ／Ｂ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子のメンバー（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄ）、ならびにチモシン−β４を含む。試験できる無傷の血小板機能のさらなる兆候は、非限定的に、形態スコア（円盤状、球状、および／または無定形状である血小板の割合）、形態変化の程度（ＥＳＣ）、低張ショック反応（ＨＳＲ）、血小板凝集（血小板凝集能測定によって測定される）、血液凝固を誘導する効率（トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によって測定される）、ならびに血小板アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを含む。血小板の表面上のＰ−セレクチン発現は、それが脱顆粒されたことを示唆する。脱顆粒は、例えば、凝集なしに起こりうる。
【００３０】
再水和後の乾燥血小板組成物における血小板機能の評価は、定量的、半定量的、または定性的とすることができる。すなわちそれは、例えば、離散値として測定されてもよく、またはベースラインに対してもしくは対照サンプル（例えば、新鮮な血小板）での同様の測定の結果に対して表現されてもよい。血小板機能は、当技術分野において公知の種々の半定量的／定性的な系のいずれかを用いて評価および表現することができる。このように、血小板の生存能および／または機能は、例えば（ａ）「優」、「良」、「並」および／もしくは「不良」の１以上；（ｂ）「非常に高い」、「高い」、「平均」、「低い」および／もしくは「非常に低い」の１以上；または（ｃ）「＋＋＋＋」、「＋＋＋」、「＋＋」、「＋」、「＋／−」および／もしくは「−」の１以上として表現することができる。
【００３１】
血小板はさまざまな哺乳類種（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ、もしくはチンパンジー）、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、またはマウス）のいずれかの１以上の個体から得ることができるが、それらが投与されることになる被験者と同じ種のものであることが好ましい。乾燥血小板組成物はインビトロまたはインビボにおいて使用することができる。乾燥血小板組成物のインビトロでの使用は、例えば、止血促進活性を有するもの、止血阻害活性を有するもの、または創傷治癒を促進するものについて、関心対象の化合物をインビトロでスクリーニングアッセイまたは試験するための標的としてのその使用を含む。乾燥血小板組成物は再水和され（例えば、生理食塩水または培地のような生理溶液を用いて）、組織培養皿に播種されてもよい。
【００３２】
乾燥血小板組成物はインビトロでの産生および血小板によって発現される可溶性因子のその後の単離に使用することもできる（上記参照）。このような因子はそれ自体が診断手段として有用であり、または診断用の抗体を作出するための抗原として使用することができる。さらに、再水和された本発明の乾燥血小板はインビトロでの薬物の有効性または毒性アッセイに使用することができる。乾燥血小板組成物は、その他の血小板保存組成物を開発するための手順のなかで「陽性対照」として使用することもできる。
【００３３】
本発明の乾燥血小板組成物を再水和することにより得られる血小板を用いて、培養液中の非血小板細胞の成長および／または分化を補助することもできる。このような血小板は活性化により、例えば、細胞培養液中の線維芽細胞または他の細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、もしくは上皮細胞（例えば、角化細胞））の生存および／または成長を促進することができる。乾燥血小板組成物は、血小板機能のインビトロおよびインビボでの基礎科学研究に使用することもできる。
【００３４】
乾燥血小板組成物の、またはそれから得られる血小板のインビボでの用途としては、例えば、動物モデルでの（例えば、上記の哺乳類のいずれかでの）またはヒト被験者での研究が挙げられる。このような研究は、例えば、血小板それ自体のまたは血小板機能を調節する（アップもしくはダウンレギュレートする）化合物および生体分子の治療的および／または予防的有効性を評価するために行うことができる。本発明の血小板組成物の他の用途としては、治療方法が挙げられる（下記参照）。
【００３５】
血小板を単離する方法は当技術分野において周知である。例えば、血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）法またはバフィーコート法のいずれかによる全血液の遠心分離によって調製することができる。さらに、血小板は、当技術分野において利用可能な種々のアフェレーシス技術によって収集することができる。
【００３６】
凍結乾燥血小板組成物を作出する方法
また、本発明によって、凍結乾燥血小板組成物を作出する方法が具体化される。この方法は（ａ）血小板の調製物またはサンプルを用意するステップ；（ｂ）血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含む混合物を作出するステップ；ならびに（ｃ）混合物を乾燥するステップを含む。該混合物は必要に応じて、１以上の凍結保護物質、１以上のタンパク質（例えば、血漿）、および／または上記のＥＣＭ成分を含んでもよい。
【００３７】
血小板の調製物またはサンプル、血小板活性化阻害剤、ならびに任意の凍結保護物質、タンパク質およびＥＣＭ成分は、上記のもののいずれかとすることができる。混合物の乾燥は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、空気乾燥、不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の、雰囲気の中でのもしくは流れの下での乾燥、または凍結乾燥によるものとすることができる。凍結乾燥法は当技術分野において周知である（例えば、Labconco, 2004による業界サービス誌「A Guide to Freeze-drying for the Laboratory」；Franks (1994) Proc. Inst. Refrigeration. 91: 32-39、ならびに米国特許第４，６１９，２５７号、同第４，６７６，０７０号、同第４，７９９，３６１号、同第４，８６５，８７１号、同第４，９６４，２８０号、同第５，０２４，８３８号、同第５，０４４，１６５号、同第５，１５４，００７号、同第６，１９４，１３６号、同第５，３３６，６１６号、同第５，３６４，７５６号、および同第５，７８０，２９５号を参照されたく、これらの全ての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３８】
１以上の血小板活性化阻害剤、および必要に応じて１以上の凍結保護物質を用いての血小板の凍結乾燥では、たとえあっても、血小板に対して最小限の機能的損傷しか起こらない。適当な凍結乾燥装置は商業的供給源、例えば、Labconco（Kansas City, MO）およびVirTis（Gardiner, NY）から入手可能である。液体（例えば、水）含有サンプルの凍結乾燥は、サンプルの凍結およびその後の、昇華と呼ばれる過程による凍結サンプルからの液体（例えば、水）の除去を含む。凍結は、例えば、凍結乾燥器中または−８０℃の冷凍庫中とすることができる。サンプル中の液体が凝固するまで（視覚的に評価されるように）、サンプルを冷却する。凍結は、例えば１分あたり１℃〜５℃の冷却速度ですることができ、「即時冷凍」ではないことが好ましい。凍結法は、凍結乾燥に関して引用されている上記の参考文献の中に広く記述されている。昇華は、凍結した液体が液相を通過せず直接的に気相状態に進むときに起こる。凍結乾燥は、例えば、マニホールド法、バッチ法、またはバルク法を含めて、各種の方法のいずれかによって行うことができる。
【００３９】
治療方法
本発明はまた、治療方法を提供する。この方法は、血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い被験者を特定するステップおよび該被験者に上記の血小板組成物のいずれかを投与するステップを含むことができる。
【００４０】
乾燥血小板組成物は、それ自体が被験者に投与されてもよい。この場合、血小板の再水和は被験者内で行われる。または、該血小板組成物を再水和し、その後で被験者に投与してもよい。後者の場合、該組成物は必要に応じて、投与される前に、全てのまたはかなりの量の１以上の血小板活性化阻害剤および、関連する組成物に使用されているなら、１以上の凍結保護物質を除去するため、洗浄過程に供されてもよい。このような洗浄方法は、当技術分野において公知であり、一般に１以上の（例えば、２つの、３つの、または４つの）遠心分離ステップを含む。使用される血小板活性化阻害剤および／または凍結保護物質が有毒である場合、そのような洗浄ステップを行うことが特に望ましい。この場合、洗浄は、有毒な成分が全く、または許容される低レベルの有毒な成分しか、組成物の中に残らなくなるまで、行われる。
【００４１】
再水和（および必要に応じて洗浄）は、血小板が１以上のその機能（上記参照）を保持するような任意の生理溶液（例えば、水、生理食塩水、組織培地、または以下の実施例１および実施例７に記述の生理溶液）を用いてすることができる。乾燥された血小板組成物は必要に応じて、血小板が適切な被験者に投与されることになる製薬上許容される担体（下記参照）の中で再水和されてもよい。再水和は、関連する担体中での血小板の速やかな浸漬によってもまたは乾燥血小板への担体の緩やかな、例えば、滴下によってもよい。
【００４２】
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い被験者は、創傷している。創傷は、血小板を用いて治療されることから恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高いものとすることができる。創傷は、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による組織創傷、および壊疽した傷でありうる皮膚創傷、またはそれらの結果でありうる皮膚創傷とすることができる。創傷はまた、任意の内部器官または組織、例えば、胃腸組織、肺性（肺または気管支）組織、心臓組織、結合組織（例えば、腱、靱帯、および軟骨）、骨組織、神経（中枢および末梢神経系）組織、ならびに血管（静脈および動脈）組織の内部創傷とすることができる。関心対象の内部創傷は、非限定的に、打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、または内部器官の損傷（例えば、腸、脾臓、肝臓、肺、もしくは心臓の損傷）を含む。創傷は、例えば、複雑骨折、銃創、または事故による擦り傷を含めて、外傷により引き起こされうる。
【００４３】
乾燥（または再水和）血小板組成物は、発生直後の創傷またはその自然治癒過程の任意の段階にある創傷に送達することができる。血小板組成物は、被験者において創傷が検出または形成された後に、または検出または形成されてからすぐに、創傷に送達されることが好ましいであろう。血小板組成物を用いて治療される創傷は、さまざまな外観、サイズ、奥行き（すなわち、段階）、および色を持つことがあり、例えば、血腫、血清腫、創傷浸出液、壊死組織、および痂皮の存在を含むことがある。
【００４４】
乾燥（または再水和）血小板組成物は局所的に、すなわち、創傷に直接的に適用することができる。これは任意の適当な手段により、例えば、血小板を創傷に振り掛けるもしくは吹き掛けることにより、血小板を創傷の中に詰め込むことにより、または以下に論じられる外科的補助によって創傷に適用することができる。噴霧可能なエアロゾル調製物は、血小板組成物を固体または液体の不活性な担体材料と組み合わせることができ、スクイーズボトルの中にまたは加圧された揮発性の、通常は高圧ガス、例えば、フレオンとの混合物の中に含めることができる。
【００４５】
乾燥血小板は、例えば、創傷被覆材もしくは包帯、縫合糸、編物、または人工装具のような、外科的補助によって創傷に適用されてもよい。そのような補助は、例えば、生理学上許容される固体基材および該基材上のまたは中の（例えば、該基材上のコーティングとして適用されたまたは該基材中に含浸された）血小板を含むことができる。典型的には、そのような外科的補助は、滅菌容器の中に詰められた滅菌形態で提供される。外科的補助の基材は、例えば、乾燥血小板を該材料に振り掛けることによりまたは外科的補助の基材に１以上の血小板活性化阻害剤（および必要に応じて１以上の凍結保護物質）を含有する新鮮な血小板の液体懸濁液を含浸し、もしくはその表面に１以上の血小板活性化阻害剤（および必要に応じて１以上の凍結保護物質）を含有する新鮮な血小板の液体懸濁液を適用し、血小板が外科的補助の基材に接着するように外科的補助／血小板の混合物を乾燥する（例えば、凍結乾燥する）ことにより、血小板でコーティングすることができる。あるいは、乾燥血小板は適当な接着性材料により外科的補助の基材に接着されてもよく、または被験者への外科的補助の適用の前に外科的補助に単純に振り掛けられてもよい。
【００４６】
外科的補助は任意の適当な形状およびサイズのものとすることができ、生理学上許容される、疎水性または親水性の、任意の適当な固体材料からなることができる。例えば、縫合糸は、単繊維で編まれていてもよく、生分解性とすることができ、および例えば、ナイロンシルク、ポリエステル、または綿のような材料からなることができる。人工装具は例えば、動脈、静脈、管の修復において使用される織物または押出管状構造体；ヘルニア治療においておよび損傷した肝臓、腎臓、またはその他の内部器官の補助において外科的に有用な編物；ピン、スクリュー、および補強板；心臓弁、人工腱、または軟骨材料を含む。包帯は、綿または創傷にもしくは創傷を覆うように適用するのに適したその他の織物のような、任意の適当な基材からなることができ、必要に応じて裏当て材を含んでもよく、および必要に応じて創傷を覆う包帯を固定するためそのフェース面に１以上の接着領域を含んでもよい。
【００４７】
本発明の血小板組成物は、製薬上許容される担体を含んだ製薬上許容される処方物中に含めて被験者に投与される。製薬上許容される担体、例えば、生理食塩水、賦形剤、または安定剤は、それらが被験者に投与される前に細胞に添加することができる。「製薬上許容される」という語句は、ヒトに投与される場合、使用される濃度で、細胞に有害でなく、生理学的に寛容され、かつ通常は異常亢進、目まいなどのような、アレルギー反応または類似の有害反応を生じない、分子的実体および組成物をいう。
【００４８】
適当な処方物は、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、膏薬、およびエアロゾルを含むが、これらに限定されることはなく、これらは必要に応じて、滅菌されあるいは助剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、抗菌剤（例えば、過酸化水素、ベタジン、もしくは酢酸）、または浸透圧に影響を与えるための緩衝液もしくは塩と混合される。多種多様な製薬上許容される担体、賦形剤または安定剤は、当技術分野において公知である[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol, A. Ed. 1980]。製薬上許容される担体、賦形剤または安定剤は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の無毒性の有機酸緩衝液のような、緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の糖質；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール、もしくはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性化剤を含む。
【００４９】
必要とされる血小板組成物の投与量は、処方物の性質、創傷の性質または治療される創傷のタイプおよび重症度、被験者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別、投与される他の治療薬、ならびに主治医の判断に依る。さまざまな投与経路の有効性の違いを考慮して、必要とされる投与量の幅は大きいと予想される。血小板組成物は、再水和組成物およそ１ｍｌが各およそ１ｃｍ３の創傷に適用されるように、創傷に適用することができる。これらの投与量レベルは、当技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準的な実験手順により調整することができる。
【００５０】
血小板組成物は被験者に１回または複数回投与することができる。すなわち、該組成物は１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１７回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、６０回、７０回、８０回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３５０回、４００回、４５０回、５００回、７００回、１０００回、またはそれ以上の回数、投与することができる。複数回の投与が行われる場合、投与は任意の適切な時間、例えば、３０秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、１０ヶ月間、１年間、１８ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間で区切られてもよい。
【００５１】
血小板は、血小板組成物が投与される個体（受容者）から得ることができ、すなわち、血小板は自家性とすることができる。あるいは、それらは受容者と同種の１以上の個体から得ることができ、例えば、血小板組成物は、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）の被験者、例えば、ヒトボランティアから調製された血小板サンプルのプールから作出することができる。受容者は供与者以外の種のものとすることもできる。さらに、血小板は成人、幼児の血液、または１以上の個体の胎児血液から単離することができる。血小板の受容者および供与者は、上記のその他任意の種のものとすることができる。
【００５２】
本明細書において用いられる「治療（の）」または「治療（法）」は、病態（例えば、創傷）の症状の完全な消失または病態の症状の重症度の軽減を意味する。「予防」は、病態の症状が本質的にないことを意味する。本明細書において用いられる「予防（法）」は、病態の症状の完全な阻止、病態の症状の発症の遅延、または後に現れる病態症状の重症度の緩和を意味する。
【００５３】
以下の例は本発明を例示し、限定はしないよう意図される。
【実施例】
【００５４】
実施例１−実施例１〜６において使用される血小板組成物の調製
ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）の収集
ヒト血小板の無作為供与者単位（random donor unit；ＲＤＵ）の形態でのＰＲＰサンプルを米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）公認の血液バンクから購入し、室温で撹拌しながら保存し、提供から５日以内に使用した。必要とされる全ての供与者スクリーニングおよび放出試験は、ＡＡＢＢの要件[MEB Technical Manual 14th ed. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks (2002)]にしたがい該血液バンクによって行われた。
【００５５】
ＰＲＰの凍結乾燥
ＰＲＰのアリコートを代謝阻害剤アミロリド、アデノシン、およびニトロプルシドナトリウムならびに凍結保護物質ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、マンニトール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液と混合した。これらの化合物を全て、等張緩衝液（実施例７に記述の緩衝液Ｂ）に希釈した。別個の対照ＰＲＰアリコートは等張緩衝液のみと混合した。処理されたＰＲＰサンプルおよび対照ＰＲＰサンプル中の血小板の終濃度は細胞９×１０５個／μｌとし、代謝阻害剤および凍結保護物質の終濃度は次のとおりであった：アミロリド（０．２５ｍＭ）、アデノシン（０．１ｍＭ）、ニトロプルシドナトリウム（５０μＭ）、ポリビニルピロリドン（４％ ｗ／ｖ）、マンニトール（５０ｍＭ）、およびジメチルスルホキシド（０．５％ ｖ／ｖ）。
【００５６】
両血小板サンプルを１分あたり１℃〜５℃の冷却速度で凍結し、次に標準的な条件の下で凍結乾燥した。凍結乾燥した後に、ＰＲＰサンプルを５日未満の間−８０℃で保存し、次いで凍結乾燥前の量まで緩衝液Ｂの迅速な全量添加により再水和した。
【００５７】
実施例２−ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、血小板凝集の増大を示す
ＣＰＡとともに凍結乾燥されかつ再水和された血小板が止血の重要な機能を媒介できるかどうかを判定するため、ＣＰＡ有りまたは無しで凍結乾燥されかつ再水和されたサンプルの凝集能をアデノシン二リン酸（１０μＭ）およびＩ型ウマコラーゲン（２μｇ／ｍｌ；Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）の存在下において試験した。これらの試験の場合、下記の他の実験とは対照的に、ＣＰＡ処理および対照の凍結乾燥サンプルを緩衝液Ｂで１回洗浄した。両サンプル中の血小板の濃度を次に、緩衝液Ｂで血小板３×１０５個／μｌに調整し、両サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、その後アデノシンおよびコラーゲンを表示の濃度で添加した。サンプル温度を３７℃に維持しながら、凝集を光学的血小板凝集計で測定した。データは新鮮な血小板の（凍結乾燥サンプルを作出するために使用されたＰＲＰサンプルの）凝集反応の割合で表された、凍結乾燥および再水和血小板の凝集反応として示されている。
【００５８】
ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、対照の凍結乾燥血小板に比べて凝集能の増大を示した（図１）。
【００５９】
実施例３−血小板成長因子放出アッセイ
トロンビン活性化血小板からの成長因子の放出を測定するためのアッセイの初期確認において、新鮮な血小板懸濁液（凍結または凍結乾燥および再水和されていない）を試験した。新鮮な血小板ＰＲＰサンプルを緩衝液Ｂで細胞３×１０５個／μｌの濃度に希釈し、室温で５分間トロンビン（１単位／ｍｌ）により活性化した。得られた血小板凝集塊を遠心分離し、上清をペレット状の凝集塊から分離した。市販のキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造元の指示にしたがって用い、４種の成長因子の上清中濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。これらの成長因子は形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ Ａ／Ｂ）、上皮由来成長因子（ＥＧＦ）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）であった。
【００６０】
データは、同じ血小板の対応サンプルの超音波処理によって放出された成長因子の量の割合で表された、トロンビン活性化上清中に放出された成長因子の量として示されている（表１）。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【００６１】
表１に示されるように、全４種の成長因子に対し、超音波処理により放出される成長因子のおよそ５０％がトロンビン活性化により新鮮な血小板から放出された。
【００６２】
（表１）新鮮なヒト血小板からの成長因子の放出
【表１】
【００６３】
実施例４−ＣＰＡ含有の凍結乾燥されかつ再水和された血小板の成長因子放出
ＣＰＡの存在下および非存在下での血小板の凍結乾燥および再水和による血小板成長因子の放出に及ぼす影響を調べた。代表的な成長因子としてＴＧＦ−βについて得られたデータを表２に示す。ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例３にあるように）を以下のサンプルで行った：
（ａ）凍結乾燥に使用されるＰＲＰサンプルの遠心分離によって得られた上清（「新鮮な」「血漿」）、
（ｂ）超音波処理後の同じＰＲＰサンプル（「新鮮な」「超音波処理物」）；この測定では、ＰＲＰサンプルの血漿中のＴＧＦ−βに加えて、ＰＲＰサンプル中の血小板から放出可能な全ＴＧＦ−βが得られた、
（ｃ）（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰサンプルの遠心分離によって得られた上清（「Ｆ／Ｄ／Ｒ」「血漿」）、
（ｄ）超音波処理後の、（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰサンプル（「Ｆ／Ｄ／Ｒ」「超音波処理物」）、
（ｅ）トロンビン処理され（実施例３にあるように）、（ＣＰＡの存在下および非存在下において）凍結乾燥されかつ再水和されたＰＲＰの遠心分離によって得られた上清；（ｃ）において検出された量を差し引いた、これらの上清中において検出された量を（ｃ）において検出された量を差し引いた、（ｄ）において検出された量の関数（割合）として表した（「放出」）。
【００６４】
ＣＰＡ成分は試験の前にサンプルから流し去られなかった。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【００６５】
（表２）（ＣＰＡ有りまたは無しで）凍結乾燥されかつ再水和された血小板によるＴＧＦ−βの放出
【表２】
Ｆ／Ｄ／Ｒ；凍結乾燥されかつ再水和された
【００６６】
ＣＰＡ処理および未処理の両血小板の凍結乾燥および／または再水和により、新鮮な血小板懸濁液に比べて顕著なレベルの自発的なＴＧＦ−β漏出が起こった（表２）。しかしながら、この自発的な漏出は、ＣＰＡが無いよりも有る状態で凍結乾燥された血小板において若干低かった。最も重要なことには、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和された血小板よりもＴＧＦ−βを放出する能力がかなり高い。同様の結果が、上記のその他３種の成長因子についても認められた。
【００６７】
実施例５−ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板により産生されるＴＧＦ−βは活性している
超音波処理された新鮮なＰＲＰおよび超音波処理され、ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ）ＰＲＰ由来の上清における、細胞アッセイ（下記参照）により測定される活性ＴＧＦ−βのレベル、およびＥＬＩＳＡにより測定される全ＴＧＦ−βタンパク質のレベルを比較した（表３）。これらの上清は、表２に示されているもののいくつかと同じであった。ＴＧＦ−β活性を測定するのに使われた細胞培養アッセイは、Ａｂｅら[(1994) Anal. Biochem. 216 (2):276-284]に記述のものとし、この文献の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験における３回の反復の平均値の平均である。
【００６８】
超音波処理された新鮮な血小板および超音波処理され、ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板から放出された実質的に全てのＴＧＦ−βが活性していた（表３）。同じ結果が、超音波処理され、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和された血小板で得られた。
【００６９】
（表３）ヒト血小板におけるＴＧＦ−β活性の測定
【表３】
【００７０】
実施例６−細胞増殖アッセイ
アッセイのデザインと検証
トロンビン活性化血小板により放出された可溶性因子の細胞増殖誘導活性を試験するため、インビトロの「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系を使用した。図２Ａはこの「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系の図表示である。Ｓｗｉｓｓ Ａｌｂｉｎｏマウス３Ｔ３線維芽細胞を増殖培地（ＧＭ；４ｍＭグルタミン、４０５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中にて２４ウェル組織培養プレートの培養ウェルの底面に１ウェルあたり細胞１０，０００個の密度で播種し、５％ＣＯ２の加湿環境中３７℃で１６時間培養した。活性化または超音波処理血小板を添加した培養物（および対応する対照培養物）において（下記参照）、ＧＭを低血清培地（ＳＲＭ；ＧＭと同じだが、１０％ではなく０．５％のウシ血清を添加）と交換した。超音波処理またはトロンビン活性化（３７℃で５分間１単位／ｍｌ）血小板（血小板１．２×１０６個／μｌ ７５μｌ中）およびＳＲＭ（血小板１．２×１０６個／μｌ ２２５μｌ）を、半透膜（８μｍの細孔を有する）からなる底部を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに添加し、チャンバーの底部が培養ウェル中の培地に浸かるように、該チャンバーを適切な培養ウェル中の細胞の上方に置いた（図２Ａ参照）。この培養系では、培地および可溶性因子（しかし全血小板または不溶性血小板物質ではない）が半透膜を通して拡散し、培養ウェル底部の線維芽細胞に接触することができた。「陽性対照」培養物にはＧＭが含まれ、血小板物質が含まれなかった。これらの培養物を表示の時間インキュベートし、その後、増殖をＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］代謝的変換アッセイにより測定した。これには：（ａ）培養ウェルからのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーおよび培地の除去；（ｂ）ウェルへの新鮮なＳＲＭ ０．５ｍｌおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ） １００μｌの添加；ならびに（ｃ）３時間のさらなるインキュベーション（上記の同一条件下での）が含まれた。各培養物の上清（１００μｌ）を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、各々のＯＤ５４０（相対的細胞増殖の指標として）をマイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。
【００７１】
培養容器ウェルへの試験血小板物質を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーの導入後から計７２時間の間、２４時間毎に細胞増殖の測定値を個々の培養ウェルにおいて記録した（図２Ｂ）。図２Ｂにおいて、グラフ縦棒はベースラインレベル（０時点、すなわち、血小板物質を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーが培養物に添加された時点で測定された）に対するＭＴＳレベルの増大の割合（ｙ軸左側）を表し、グラフ線は実際の細胞計数（ｙ軸右側）を表す。水平の破線は０時点の細胞数（ｙ軸右側）を示す。超音波処理された血小板および１単位／ｍｌのトロンビンで活性化された血小板は、時間依存的に線維芽細胞の増殖を増大した（ＳＲＭしか含まない培養と比較して）。
【００７２】
細胞増殖の最低レベル（ＳＲＭしか含まない培養において認められた）を差し引いた、超音波処理およびトロンビン活性化血小板により７２時間の時点で得られた細胞増殖レベルを、細胞増殖の最低レベル（ＳＲＭしか含まない培養において認められた）を差し引いた、細胞増殖の最高レベル（ＧＭしか含まない培養において認められた）の割合として表した。得られた値は「誘導％」と称されている（図２Ｃ）。
【００７３】
ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板により産生される可溶性因子は、細胞増殖誘導能を保持する
上記のインビトロ細胞増殖アッセイを用いて、ＣＰＡの存在下での凍結乾燥および再水和による、血小板の細胞増殖誘導能に及ぼす影響を判定した。実施例１に記述されているように血小板をＣＰＡ溶液と混合し、凍結乾燥し、緩衝液Ｂに再懸濁した。図２に示した実験に記述されているのと同じ対照実験を行い、データを図２Ｃに記述されているように算出した。ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板調製物は、トロンビンで活性化した後の新鮮な血小板とほぼ同じ増殖誘導％を示した（図３）。
【００７４】
遠心分離された新鮮な血小板ＰＲＰ、ＣＰＡの非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板およびＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（図４中の「血漿」のデータ）由来の上清、ならびにトロンビン活性化後のその同じ３サンプル由来の上清を、図２に描かれている実験におけるアッセイと実質的に同じアッセイにおいて試験した（図４中の「血小板」のデータ）。ＣＰＡ有りで凍結乾燥されかつ再水和された血小板は、新鮮な血小板の細胞増殖誘導能を保持したが、ＣＰＡ無しで凍結乾燥されかつ再水和されたものは保持していなかった（図４）。図４中の破線は、線維芽細胞増殖を誘導する血漿サンプルの平均的能力を示す。
【００７５】
さらに、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されたＰＲＰサンプルをいくつかのアリコートに分割し、これらを２４週までの種々の期間−８０℃で保存した。これらのサンプルを該当の時点で再水和し、上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養系においてその線維芽細胞増殖誘導能を試験した。全てのサンプルが、保存なしで試験された対照サンプルと同じ線維芽細胞増殖誘導能を示した。
【００７６】
凍結乾燥された血小板の細胞増殖誘導能は、用量依存的である
上記のように血小板をトロンビンにより活性化し、ＣＰＡの存在下において凍結乾燥しかつ再水和した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーへの再水和された血小板サンプルの添加により、さまざまな量のサンプル（同じ血小板濃度）を上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）線維芽細胞増殖アッセイ系において試験した（図５）。活性化血小板の存在下で７２時間培養した後に測定を行った。トロンビンにより活性化され、凍結乾燥された血小板の線維芽細胞の増殖を誘導する能力は、アッセイ系に添加された再水和血小板の量に用量依存的であった。
【００７７】
実施例７−ＣＰＡ処理により凍結乾燥された血小板は糖尿病マウス創傷モデルにおいて創傷治癒を増大する
材料および方法
血小板治療用物質の調製
ヒト血小板の単一供与者単位（Single donor units；ＳＤＵ）を米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）公認の血液バンクから購入し、室温で撹拌しながら保存し、提供から５日以内に使用した。必要とされる全ての供与者スクリーニングおよび放出試験は、ＡＡＢＢの要件[MEB Technical Manual 14th ed. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks (2002)]にしたがい該血液バンクによって行われた。各ＳＤＵを３つのアリコートに分割して、３つの特異な血小板に基づく治療用物質を調製した。第１のアリコートは溶媒として生理的緩衝液［緩衝液Ｂ；１３６ｍＭ ＮａＣｌ、１１．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭグルコース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４］を用いてＣＰＡ含有溶液により血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、凍結乾燥し、これによってＣＰＡ安定保存の凍結乾燥多血小板血漿（ＦＤＰ−ＣＰＡ）を作出した。第２のアリコートは緩衝液Ｂを用いて血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、凍結乾燥して、凍結乾燥多血小板血漿（ＦＤＰ）サンプルを作出した。第３のアリコートは緩衝液Ｂを用いて血小板１．２×１０６個／μｌに調整し、１０秒間超音波処理して細胞構造を破壊し、細胞内構成要素を放出させ、−８０℃で凍結し、新鮮な凍結血小板（ＦＦＰ）サンプルを作出した。ＣＰＡ保護物質溶液の添加により、２５０μＭアミロリド（amilioride）、１００μＭアデノシン、５０μＭニトロプルシドナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド、４％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｐｌａｓｄｏｎｅ（商標）Ｃ−１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）、および５０ｍＭマンニトールの最終の処理組成物を得た。血小板物質の操作は全て標準的な無菌法を用いて行い、溶液は全て孔径０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてろ過滅菌した。血小板濃度はＣｅｌｌＤｙｎ（登録商標）１７００血球分析装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いて確認した。乾燥された血小板産物を乾燥窒素下、熱融着アルミ箔袋の中に包装し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７８】
創傷モデルおよび治療法
ホモ接合性の、遺伝的に糖尿病の８〜１２週齢Ｌｅｐ／ｒ−ｄｂ／ｄｂ雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−Ｌｅｐｒｄｂ系統）をＡＡＡＬＡＣ公認の施設において、認可済の動物プロトコルの下で使用した。外科治療の前日に、毛を剪定し、脱毛した（Ｎａｉｒ（登録商標）；Ｃｈｕｒｃｈ ＆ Ｄｗｉｇｈｔ Ｃｏ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）。外科治療当日（術後第０日；ＰＯＤ ０）に、動物を計量し、６０ｍｇ／ｋｇのネンブタール（登録商標）（ペントバルビタールナトリウム）で麻酔した。背面の皮膚領域１．０ｃｍ２および筋肉層を切除し、創傷を撮影した。同時に、以下の血小板ベースの治療剤を調製した：ＦＦＰサンプルを融解し、その一方で凍結乾燥サンプル（ＦＤＰおよびＦＤＰ−ＣＰＡ）をその元の量まで滅菌ｄＨ２Ｏで再水和した。前処理測定に基づき、等価な血小板濃度で、３種の異なる血小板治療剤を２５０μｌのアリコートに分割した。各アリコートを使用の直前に１Ｕ／ｍｌトロンビン（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）で処理し、in situにて凝固させ、それにより創傷での血小板物質の残存を促進した。各血小板実験群（ＮＴ（未治療）、ＦＦＰ、ＦＤＰおよびＦＤＰ−ＣＰＡ）には１５の創傷が含まれた。全ての創傷を半閉鎖ポリウレタン包帯（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標），３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で覆った。術後第９日（ＰＯＤ ９）に、動物を安楽死させ、創傷を撮影し、切除し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【００７９】
創傷封鎖分析
ＰＯＤ ９に記録されたデジタル写真は面積測定法（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて、治療様式に盲目の、２人の独立した観察者により初期の写真（ＰＯＤ ０）と比較された。元の創傷面積の割合として収縮、再上皮化、および開放創を測定することにより、創傷封鎖を定量化した。収縮、再上皮化および開放創の面積の合計は、元の創傷サイズの１００％に等しい[Sullivan et al. (2004) Plast. Reconstr. Surg. 113(3):953]。
【００８０】
顕微分析
創傷生検試料を二等分し、加工処理し、通常のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）プロトコルにしたがって染色した。デジタル写真を倍率４０×で顕微鏡用創傷切片を撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて各創傷のパノラマ式の横断面合成画像を作出した。肉芽組織の面積および厚さを定量化するため、実験的な治療様式に盲目の、２人の独立した観察者がＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（商標）ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）によりデジタル画像を分析した。毛細血管密度は、倍率２００×で表示されたスライド１枚につき３視野を用いて：１つは創傷の中央においておよび１つは各創縁の位置で評価した。これらの画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳソフトウェアで表示し、各高倍率視野内の血管に印を付け、これを計測した。
【００８１】
統計分析
値は本文および図の中で平均＋／−標準偏差として表した。一元配置分散分析およびａｄ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔｓ検定を用いて、治療様式間の有意差を判定した。
【００８２】
結果
創傷封鎖
創傷治癒は創傷の収縮（contration）および再上皮化の組合せにより全ての群で起こった。先の研究から、糖尿病マウスにおいて１．０ｃｍ２の創傷が外科治療から約８〜１２日の時点で５０％の封鎖点に到達することや、いったん治癒したら、糖尿病マウスおよび対照の非糖尿病マウスにおける創傷の組織像または外観に差異のないことが明らかにされている（データは示されていない）。図６から、再上皮化は全治療群において同様であったものの、他の群に比べてＦＤＰ−ＣＰＡ群では創傷の収縮が著しく低下していたことが明らかである。
【００８３】
肉芽組織
各創傷のパノラマ式の横断面デジタル画像を用意して、肉芽組織の面積および厚さを分析した（図７）。ＦＤＰ−ＣＰＡもＦＤＰもともにＮＴ群に比べて肉芽組織の面積の有意な（ｐ＜０．０１）２．３倍の増大を誘導した（図７）。ＦＦＰを用いた治療も未治療の創傷と比較した場合、肉芽組織の形成を刺激したが（ｐ＜０．０５）、いずれの凍結乾燥条件よりも目に見えて高い浮腫性を示した。同様の結果が肉芽組織の厚さに対して認められた（図７）。ＦＤＰ−ＣＰＡおよびＦＤＰ治療はＮＴ群と比べて、創傷の中央で測定された肉芽組織の厚さの有意な（ｐ＜０．０１）、それぞれ、３．１倍および３．２倍の増大を誘導した。ＦＦＰ治療に応じて組織の厚さもＮＴに比べ有意に上昇した（ｐ＜０．０１）が、凍結乾燥治療の条件に匹敵する結果を達成することはできなかった。
【００８４】
新生血管
血小板物質による治療に応じた組織血管の増大は、標準的なＨ＆Ｅ染色創傷切片の測定で明らかであった。ＦＤＰ−ＣＰＡ治療はＮＴ群およびＦＦＰ群に比べて、高倍率視野あたりの平均血管数の有意な（ｐ＜０．０１）、それぞれ、２．２倍および１．８倍の増大をもたらした。ＦＤＰ治療はＮＴ群に比べて１．６倍の増大を誘導した（ｐ＜０．０１）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】血小板活性化阻害剤および凍結保護剤を含有する凍結保存性の添加物（ＣＰＡ）液の存在下または非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板の凝集能の回復を示す棒グラフである。血小板凝集反応は、アデノシン二リン酸（１０ｍＭ）およびコラーゲン（２μｇ／ｍｌ）の組合せによって活性化された。データは、凍結乾燥血小板を作出するために使用された同じサンプル由来の新鮮な血小板の凝集反応の割合として、凍結乾燥および再水和血小板サンプルの凝集反応として示されている。実験は、各実験に対し別個の供与者由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて３回行った。示されているデータは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図２Ａ】血小板により放出された可溶性因子に応じた線維芽細胞の増殖を測定するために使用された「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）」細胞培養系の図表示である。線維芽細胞を２４ウェル組織培養プレートのウェルの底面に播種し、可溶性因子（しかし全血小板または不溶性血小板物質ではない）の、それらが線維芽細胞と接触する培養ウェルへのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーからの拡散を可能にする半透膜からなる床面を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに、試験血小板物質を添加した。
【図２Ｂ】増殖培地単独、低血清培地単独、または低血清培地および超音波処理血小板もしくは図２Ａに記述のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養系の中で１単位／ｍｌのトロンビンにより活性化された血小板から放出された可溶性因子、への曝露から２４時間、４８時間、および７２時間の時点での線維芽細胞の増殖の誘導を示す棒グラフおよび線グラフである。グラフ棒はベースラインに対する、基質ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］の代謝的変換により産生された着色生成物の量の増大の割合（相対細胞数の指標として）（ｙ軸左側）を表し、グラフ線は実際の細胞数（ｙ軸右側）を表す。水平の破線は血小板物質への線維芽細胞の初期曝露時（すなわち、０時）の細胞数を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図２Ｃ】超音波処理および活性化血小板から放出された可溶性因子への曝露から７２時間後の線維芽細胞増殖の誘導の割合を示す棒グラフである。データは、図２Ｂに示した実験の７２時間の時点での観察結果から得られた。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図３】新鮮な血小板およびＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ ＣＰＡ）血小板に応じた線維芽細胞増殖の誘導の割合（図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて得られたデータから計算された）を示す棒グラフである。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図４】新鮮な血小板、ＣＰＡの存在下（ｗ／ＣＰＡ）もしくはＣＰＡの非存在下（ｗ／ｏ ＣＰＡ）において凍結乾燥されかつ再水和された（Ｆ／Ｄ／Ｒ）血小板、または凍結乾燥血小板調製物を作出するのに使用された血小板の供給源とされた多血小板血漿（ＰＲＰ）の遠心分離によりもしくは２種の再水和凍結乾燥サンプルの遠心分離により得られた血漿による処理後の線維芽細胞増殖の誘導の割合（図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて得られたデータから計算された）を示す棒グラフである。破線は、３種全ての血漿サンプルによる線維芽細胞増殖の平均的な誘導の割合を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験群における３回の反復の平均値の平均である。
【図５】図２Ａに示したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養系を用いて評価した場合の、線維芽細胞増殖を誘導するさまざまな量の血小板（ＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された）の能力を示す棒グラフである。凡例は、培養系のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバーに添加された血小板の相対量を示す。実験は、各実験に対し別個の供与者由来のＰＲＰを用いて３回行った。データは３回の実験から得られた平均であり、標準偏差が示されている。これらの平均は各実験における３回の反復の平均である。
【図６Ａ】治療されなかった（ＮＴ）または新鮮な凍結血小板（ＦＦＰ）、ＣＰＡの非存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（ＦＤＰ）、もしくはＣＰＡの存在下において凍結乾燥されかつ再水和された血小板（ＦＤＰ−ＣＰＡ）により治療された、創傷後の糖尿病マウス創傷の一連の写真である。スケールバー，５００ｍｍ。
【図６Ｂ】図６Ａに示した創傷の上皮化の割合（％）を示す棒グラフである。スケールバー，５ｍｍ。
【図６Ｃ】図６Ａに示した創傷の収縮の割合（％）を示す棒グラフである。スケールバー，５ｍｍ。
【図７Ａ】図６Ａに示した創傷の下側面の組織切片における異なる量の肉芽組織沈着を示す一連の顕微鏡写真である。矢印は上皮周縁部を示し、囲い枠は、組織の面積および厚さの測定が行われた場所を示す（図７Ｂおよび７Ｃ参照）。スケールバー，１００μｍ。
【図７Ｂ】図７Ａ中の囲い枠により示された創傷の領域における肉芽組織の面積を示す棒グラフである。＊はｐ＜０．０１を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ中の囲い枠により示された創傷の領域における肉芽組織の厚さを示す棒グラフである。＊はｐ＜０．０１を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥血小板組成物であって、以下を含む組成物：
複数の乾燥血小板；および
１以上の血小板活性化阻害剤。
【請求項２】
１以上の血小板活性化阻害剤が環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、および環状グアノシン５’一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクターより選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１以上の血小板活性化阻害剤がアデノシン、アミロリド、およびニトロプルシドナトリウムを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物の水和後、該組成物中の、アデノシンの濃度が約１０μＭ〜約１ｍＭであり、アミロリドの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度が約２．５μＭ〜約２５０μＭである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがイロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
ナトリウムチャネル阻害剤がアミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがＬ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
１以上の凍結保護剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
凍結保護剤がジメチルスルホキシド、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
乾燥血漿をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
１以上のＥＣＭ成分がコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、およびプロテオグリカンからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＥＣＭ成分が粒状の無細胞組織マトリックス（particulate acellular tissue matrix）の粒子中に存在する、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
粒状の無細胞組織マトリックスが粒状の無細胞皮膚マトリックス（particulate acellular dermal matrix）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
乾燥血小板組成物の水和は、該乾燥血小板組成物が得られた新鮮な血小板サンプルの保有する少なくとも１つの血小板機能と実質的に同じレベルを有する再水和血小板組成物をもたらす、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの血小板機能が凝集する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの血小板機能が１以上の成長因子またはケモカインを放出する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
成長因子またはケモカインが形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、およびチモシンβ４からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの血小板機能が細胞増殖を誘導する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞増殖が線維芽細胞増殖である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
血小板がヒト血小板である、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
凍結乾燥血小板組成物を作出する方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板を含むサンプルを用意するステップ；
血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含む混合物を作出するステップ；ならびに
混合物を乾燥するステップ。
【請求項２３】
１以上の血小板活性化阻害剤がｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、およびｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターより選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１以上の血小板活性化阻害剤がアデノシン、アミロリド、およびニトロプルシドナトリウムを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
混合物中、アデノシンの濃度が約１０μＭ〜約１ｍＭであり、アミロリドの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度が約２．５μＭ〜約２５０μＭである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがイロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ナトリウムチャネル阻害剤がアミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがＬ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
混合物が１以上の凍結保護剤をさらに含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
１以上の凍結保護剤がジメチルスルホキシド、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
混合物が１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含む、請求項２２〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
１以上のＥＣＭ成分がコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、およびプロテオグリカンからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＣＭ成分が粒状の無細胞組織マトリックスの粒子中に存在する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
粒状の無細胞組織マトリックスが粒状の無細胞皮膚マトリックスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
混合物が血漿をさらに含む、請求項２２〜３４に記載の方法。
【請求項３６】
混合物を乾燥するステップが混合物を凍結乾燥するステップを含む、請求項２２〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
医薬として用いるための請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
創傷の治療のための医薬組成物の製造に用いるための請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
治療方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；および
請求項１〜２１のいずれかに記載の乾燥血小板組成物を創傷に適用するステップ。
【請求項４０】
治療方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；
請求項１〜２１のいずれかに記載の乾燥血小板組成物を再水和して、再水和血小板組成物を作出するステップ；および
再水和血小板組成物を創傷に適用するステップ。
【請求項４１】
創傷が皮膚創傷である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４２】
皮膚創傷が褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による創傷、および壊疽した傷からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法または使用。
【請求項４３】
創傷が内部創傷である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４４】
内部創傷が打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、および内部器官の負傷（injury wound）からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法または使用。
【請求項１】
乾燥血小板組成物であって、以下を含む組成物：
複数の乾燥血小板；および
１以上の血小板活性化阻害剤。
【請求項２】
１以上の血小板活性化阻害剤が環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、および環状グアノシン５’一リン酸（ｃＧＭＰ）二次メッセンジャー系のエフェクターより選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１以上の血小板活性化阻害剤がアデノシン、アミロリド、およびニトロプルシドナトリウムを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物の水和後、該組成物中の、アデノシンの濃度が約１０μＭ〜約１ｍＭであり、アミロリドの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度が約２．５μＭ〜約２５０μＭである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがイロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
ナトリウムチャネル阻害剤がアミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがＬ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
１以上の凍結保護剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
凍結保護剤がジメチルスルホキシド、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
乾燥血漿をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
１以上のＥＣＭ成分がコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、およびプロテオグリカンからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＥＣＭ成分が粒状の無細胞組織マトリックス（particulate acellular tissue matrix）の粒子中に存在する、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
粒状の無細胞組織マトリックスが粒状の無細胞皮膚マトリックス（particulate acellular dermal matrix）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
乾燥血小板組成物の水和は、該乾燥血小板組成物が得られた新鮮な血小板サンプルの保有する少なくとも１つの血小板機能と実質的に同じレベルを有する再水和血小板組成物をもたらす、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの血小板機能が凝集する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの血小板機能が１以上の成長因子またはケモカインを放出する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
成長因子またはケモカインが形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、およびチモシンβ４からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの血小板機能が細胞増殖を誘導する能力である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞増殖が線維芽細胞増殖である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
血小板がヒト血小板である、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
凍結乾燥血小板組成物を作出する方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板を含むサンプルを用意するステップ；
血小板および１以上の血小板活性化阻害剤を含む混合物を作出するステップ；ならびに
混合物を乾燥するステップ。
【請求項２３】
１以上の血小板活性化阻害剤がｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクター、ナトリウムチャネル阻害剤、およびｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターより選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１以上の血小板活性化阻害剤がアデノシン、アミロリド、およびニトロプルシドナトリウムを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
混合物中、アデノシンの濃度が約１０μＭ〜約１ｍＭであり、アミロリドの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、およびニトロプルシドナトリウムの濃度が約２．５μＭ〜約２５０μＭである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがイロプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ２、ホルスコリン、コレラ毒素、イソプロテレノール、８−ブロモ環状アデノシン一リン酸、ジブチル環状アデノシン一リン酸、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、チロトロピン、およびオウラノフィンからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ナトリウムチャネル阻害剤がアミロリド類似体、ベプリジル、フレカイニド、サキシトキシン、ベンザミル、およびプラジュナリウムからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ｃＧＭＰ二次メッセンジャー系のエフェクターがＬ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房性ナトリウム利尿因子、バソプレッシン、オキシトシン、および三硝酸グリセリルからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
混合物が１以上の凍結保護剤をさらに含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
１以上の凍結保護剤がジメチルスルホキシド、マルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、ポリビニルピロリドン、マンニトール、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
混合物が１以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分をさらに含む、請求項２２〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
１以上のＥＣＭ成分がコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、デコリン、フィブロモジュリン、ヒアルロン酸、およびプロテオグリカンからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＣＭ成分が粒状の無細胞組織マトリックスの粒子中に存在する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
粒状の無細胞組織マトリックスが粒状の無細胞皮膚マトリックスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
混合物が血漿をさらに含む、請求項２２〜３４に記載の方法。
【請求項３６】
混合物を乾燥するステップが混合物を凍結乾燥するステップを含む、請求項２２〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
医薬として用いるための請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
創傷の治療のための医薬組成物の製造に用いるための請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
治療方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；および
請求項１〜２１のいずれかに記載の乾燥血小板組成物を創傷に適用するステップ。
【請求項４０】
治療方法であって、以下のステップを含む方法：
血小板の投与から恩恵を受けうる、または恩恵を受ける可能性が高い創傷を有する被験者を特定するステップ；
請求項１〜２１のいずれかに記載の乾燥血小板組成物を再水和して、再水和血小板組成物を作出するステップ；および
再水和血小板組成物を創傷に適用するステップ。
【請求項４１】
創傷が皮膚創傷である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４２】
皮膚創傷が褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、負傷、火傷、複合軟組織創傷、植皮もしくは皮弁の失敗、放射線による創傷、および壊疽した傷からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法または使用。
【請求項４３】
創傷が内部創傷である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４４】
内部創傷が打撲傷、骨折、瘻孔、潰瘍、および内部器官の負傷（injury wound）からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法または使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５０９９７６（Ｐ２００９−５０９９７６Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２５０３（Ｐ２００８−５３２５０３）
【出願日】平成１８年９月２６日（２００６．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３７７４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８６２９
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０４１５４１４８）ライフセル コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２６日（２００６．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３７７４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８６２９
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０４１５４１４８）ライフセル コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]