二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け
【課題】核酸を特徴付ける新規の方法。
【解決手段】核酸を、二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、色素および核酸内の１つ以上の二本鎖構造の間に、検出可能な複合体を形成する。次いで、組合せを可変温度に暴露し、色素の蛍光発光を測定して、二本鎖構造の融解温度を決定する。次いで、いくつかの具体例において、融解温度プロファイルを、他の核酸につき発生させた融解温度プロファイルと比較して、比較された核酸間の差異を識別する。
【解決手段】核酸を、二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、色素および核酸内の１つ以上の二本鎖構造の間に、検出可能な複合体を形成する。次いで、組合せを可変温度に暴露し、色素の蛍光発光を測定して、二本鎖構造の融解温度を決定する。次いで、いくつかの具体例において、融解温度プロファイルを、他の核酸につき発生させた融解温度プロファイルと比較して、比較された核酸間の差異を識別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の同定および特徴付けならびにその修飾に関し、これを使用して、そのような核酸および／または表現型を含有する細胞および／または生物またはこれらの核酸またはそのような修飾と関連する疾患状態を同定することができる。
【背景技術】
【０００２】
核酸の二次構造への洞察は、突然変異検出および生物同定の強力なツールを得た。いくつかの分析用技術が開発され、これは１つの試料および次の試料の間に存在する異なる二次構造を活用する。これらの技術のいくつかは、一本鎖高次構造的多形性（ＳＳＣＰ）（Oritaら, PNAS(USA) 86: 2766-2770(1989))、ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）(Espejoら, Microbiology 144: 1611-1617(1998))、リボタイピング(Grimont and Grimont, Ann.lest.Pasteur Microbiol. 137B (2): 165-175 (1989))および産物融解温度（Ｔｍ）によるＰＣＲ後産物同定(Ririeら, Anal. Biochem. 245154-160(1997))を含む。
【０００３】
二次構造分析法は、核酸特徴の検出に焦点を合わせ、これは特定の配列がどのようにお互いと相互作用するかによるものである。１９８９年に、Oritaらは、単一の塩基対欠失または改変は、核酸ゲル電気泳動において明白な一本鎖高次構造的多形性によって検出可能であることを示した(Oritaら 1989)。実質的に、彼女は、主要な核酸配列における小さな差が、結果的に、二次構造立体配座にわずかな差をもたらし、これが電気泳動ゲルマトリックス内で異なって移動することを発見した。ＳＳＣＰ分析は、非常に感度が高く、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）方法よりもさらに特異的である(Oritaら 1989)。
【０００４】
ヘテロ二本鎖移動度アッセイまたはＨＭＡは、ＳＳＣＰに似ている。ＨＭＡでは、非−完全にマッチングしたＤＮＡ標的−プローブ二本鎖の電気泳動移動度がモニターされる(Espejoら, 1998)。標的−プローブ二本鎖内のミスマッチングは、二次構造に歪みを起こし、これは結果的に二本鎖の移動度変化を起こす。標的配列の差は、すなわち、電気泳動ゲルマトリックスにおける差動的産物移動によって明白になる(Espejoら, 1998)。
【０００５】
リボタイピングは、ゲル電気泳動によって観察されるリボソーム性核酸遺伝子制限パターンの同定である(Grimont and Grimont, 1989)。リボタイピングは、リボソームの偏在性質、核酸成分内で見受けられる高頻度可変領域および制限酵素の特異性を利用する。この方法では、保存領域によって隣接した高頻度可変領域を含有するｒＲＮＡの遺伝子コードが、ＰＣＲを用いて増幅され、生成されたＤＮＡは、続いて、酵素的に消化される。特異的な制限酵素は、高頻度可変領域内の制限部位に選択される。これらの酵素によるＤＮＡ開裂によって、結果的に、可変長のＤＮＡのセグメントが得られる。酵素的開裂に引き続いて、ＤＮＡ断片はゲル上に流され、分析される。すなわち、ＤＮＡセグメントの特定の組合せ（パターン）は、主要な配列の指標である。もし酵素が適切に選択されれば、各生物タイプは、制限断片のユニークな組合せを有するだろう(Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, Curr. Microbiol. 27 (3): 147-151 (1993))。
【０００６】
リボソーム核酸（ｒＲＮＡ）の配列は、高度に保存された領域によって囲まれた多くの高頻度可変領域を同定した(De Rijkら, Nuc. Acids Res. 20 (Supplement): 2075-2089 (1992); Edwardsら, Nuc. Acids Res., 17 (19): 7843-7853 (1989); Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, 1993)。実に、広範囲の生物からのＤＮＡを増幅することが可能な多くの普遍的な主要部位が同定され、ＳＳＣＰまたはリボタイピング分析用に適合された(Van Camp, 1993; Weisburgら, J. Bacteriol. 173 (2): 697-703(1991) ; Stubbsら, J. Clin. Microbiot 37 (2): 461-463 (1999); Anthonyら,J. Clin.Microbiol. 38 (2): 781-788 (2000);Rantakokko-Jalavaら, J. Clin. Microbiol. 38(1) : 32-39 (2000); Widjojoatmodjoら, J. Clin. Microbiol. 32 (12): 3002-3007 (1994))。これらのリサーチ群によって実施された研究は、高頻度可変領域セグメント内に二次構造を含有する１６ｓおよび２３ｓ遺伝子内に、医学的に有意な領域を発見した。Van Campおよび同僚らは、２３ｓ遺伝子内の高頻度可変領域を増幅するのに使用できるいくつかの普遍的な主要箇所を同定した（1993）。Widjojoatmodjoによって行われた研究は、１０８ｂｐないし３００ｂｐの範囲の小さなアンプリコンサイズを持つＳＳＣＰによる良好な種タイピングを示す（1994）。Erik Avaniss-Aghajaniらは、リボタイピング技術を用いて、細菌タイピング用の「実質的に全ての細菌からのＳＳＵ［小さなサブユニット］ｒＲＮＡを増幅することが可能な」主要な組を同定し、テストした(Biotechiques. 17(1):144-146,148-149(1994))。
【０００７】
上記した分析方法の各々において（ＳＳＣＰ、ＨＭＡおよびリボタイピング）、核酸配列は二次構造分析によって同定される。これらのプロセスのうち３つ全ては、配列変動に対して非常に敏感であり、これらを使用して、生物間に存在する核酸配列の差を同定することができる。しかしながら、アッセイは、全て、ゲル電気泳動によって決定され、リボタイピングは、酵素開裂のさらなる工程を必要とする。ゲル電気泳動および酵素開裂は、共に、時間を要する増幅後工程である。
【０００８】
核酸の二次構造的分析のもう１つの形態内の主要な配列変動は、二本鎖核酸融解特徴を観察することによって、明白になる。核酸の融解は、二本−らせん状態から一本鎖状態への高次構造的転移を指す。核酸鎖の半分が二本−らせん状態にあり、半分が「ランダムコイル」（一本鎖）状態にある温度は、融解温度（Ｔｍ）として定義される(Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465(1998))。すなわち、核酸鎖の所与の対のＴｍは、鎖結合に対する鎖の安定性の指標であり、鎖の相補性、配列長、ＧＣ含有量および環境状態によって決定される(Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998)。
【０００９】
核酸融解の分析は、多くの方法で達成された。核酸変性転移を観察および分析する方法は：示差熱量測定（ＤＳＣ）によって変性する時に、試料中のエンタルピー変化を測定し(Kulinskiら, Nucleic Acids Res. 19 (9): 2449- 2455 (1991); Panerら, Biopolymers 29: 1715-1734 (1990); Volkerら, Biopolymers 50: 303-318 (1999))、フルオロフォアの共有結合対の蛍光を測定し(Vamosi and Clegg, Biochemistry 37: 14300-14316 (1998))、次いで核酸の濃色性の変化をモニターすること(Haugland,"In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes", in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,dh ed. , Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) pp. 161-174)を含む。ＤＳＣは、化学薬品の純度を測定するのに最初に使用された技術である。プロセスは、化学反応または転移の間に進化または吸収された熱を測定する(Plato, Anal. Chem. 41 (2): 330-336 (1969))。核酸転移の理論的モデルの詳細な分析および発展は、ＤＳＣ技術を用いて、可能であった(Panerら, 1990)。Kulinskiは、ルピナス種子および麦芽から入手した２つの植物５Ｓ ｒＲＮＡの異なる融解プロファイルを、ＤＳＣを用いて観察した(Kulinski,1991）。残念ながら、光学的（濃色性）およびＤＳＣ分析は、両方とも、実質的な量の核酸を必要とし、分析は遅く、通常、一度につき、単一試料のみが研究できる。対のフルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー転移の測定は、Vamosi and Clegg (1998)に記載のごとく、二本鎖核酸の末端にて、フルオロフォアの共有結合を必要とし、その末端は、核酸が有効な測定用に二本鎖化される時、隣接していなければならない。
【００１０】
また、二本鎖核酸のＴｍ値は、核酸と合わせた二本鎖ＤＮＡ−特異的色素の蛍光をモニタリングすることによって観察できる(Wittwerら, 1996)。二本鎖−特異的色素は、核酸−結合フルオロフォアである。典型的には、これらの色素の蛍光は、二本鎖核酸に結合する時、増加する(Wittwerら, BioTechniques 22 : 176-181(1997))。Ririeらは、二本鎖核酸結合色素ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて、ＰＣＲ後産物を、融解曲線分析によって識別することが可能であることを示した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉは、優先的に、二本鎖核酸に結合する(Haugland, 1996)。
【００１１】
Ｔｍ分析のプロセスは、さらなるＰＣＲ後の取り扱いを必要としない。しかしながら、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉといった二本鎖ＤＮＡ−特異的色素を使用する本出願は、配列特異的ではなく、生物を１つのプライマー組で識別するのに使用されていなかった。さらに、これらの色素は、核酸の別々の相補的鎖の分析に使用されてきただけであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Oritaら, PNAS(USA) 86: 2766-2770(1989)
【非特許文献２】Espejoら, Microbiology 144: 1611-1617(1998)
【非特許文献３】Grimont and Grimont、Ann.lest.Pasteur Microbiol. 137B (2): 165-175 (1989)
【非特許文献４】Ririeら, Anal. Biochem. 245154-160(1997)
【非特許文献５】Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, Curr. Microbiol. 27 (3): 147-151 (1993)
【非特許文献６】De Rijkら, Nuc. Acids Res. 20 (Supplement): 2075-2089 (1992)
【非特許文献７】Edwardsら, Nuc. Acids Res., 17 (19): 7843-7853 (1989)
【非特許文献８】Weisburgら, J. Bacteriol. 173 (2): 697-703(1991)
【非特許文献９】Stubbsら, J. Clin. Microbiot 37 (2): 461-463 (1999)
【非特許文献１０】Anthonyら,J. Clin.Microbiol. 38 (2): 781-788 (2000)
【非特許文献１１】Rantakokko-Jalavaら, J. Clin. Microbiol. 38(1) : 32-39 (2000)
【非特許文献１２】Widjojoatmodjoら, J. Clin. Microbiol. 32 (12): 3002-3007 (1994)
【非特許文献１３】Erik Avaniss-Aghajaniら、Biotechiques. 17(1):144-146,148-149(1994)
【非特許文献１４】Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465(1998)
【非特許文献１５】Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998
【非特許文献１６】Kulinskiら, Nucleic Acids Res. 19 (9): 2449- 2455 (1991)
【非特許文献１７】Panerら, Biopolymers 29: 1715-1734 (1990)
【非特許文献１８】Volkerら, Biopolymers 50: 303-318 (1999)
【非特許文献１９】Vamosi and Clegg, Biochemistry 37: 14300-14316 (1998))、
【非特許文献２０】Haugland,"In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes", in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,dh ed. , Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) pp. 161-174
【非特許文献２１】Plato, Anal. Chem. 41 (2): 330-336 (1969)
【非特許文献２２】Wittwerら, BioTechniques 22 : 176-181(1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これまでの議論に徴し、一本鎖核酸のより迅速かつ単純な分析方法への必要性が存在することは明らかである。そのような方法は、ＳＳＣＰおよびＨＭＡといった配列の変動を同定すること、リボタイピングのような生物をタイピングすることの両方に適用可能であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
先に従って、本発明は、核酸を特徴付ける方法を提供し、ここに核酸の一本鎖形態は、二本鎖核酸−特異的色素と合わせられ、該組合せは、可変温度に暴露されて、一本鎖核酸内で可逆的に形成される二本鎖二次構造に対する融解温度プロファイルを発生させる。
【００１５】
好ましい具体例において、二本鎖核酸−特異的色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、臭化プロピジウム、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＹＯ−ＰＲＯ−ＩおよびＹＯ−ＹＯ−Ｉよりなる群から選択される。
【００１６】
さらなる好ましい具体例において、１つの核酸の融解温度プロファイルは、第２の核酸の融解温度プロファイルと比較され、ここにプロファイルの差は、該第１および第２の核酸の間の配列の差を示す。
【００１７】
もう１つの好ましい具体例において、本発明は、核酸の突然変異の検出方法を提供する。この具体例において、一本鎖核酸試料の融解温度プロファイルは、二本鎖核酸−特異的色素を用いて決定され、核酸試料の融解温度プロファイルおよび野生型核酸融解温度プロファイルの差は、可逆的に二本鎖二次構造を形成することが可能な一本鎖核酸の１つ以上の領域内の核酸試料における１つ以上の突然変異の存在を示す。
【００１８】
さらに好ましい具体例において、本発明は、細胞の特異的型を同定する方法を提供する。この具体例において、細胞からの試料ｒＲＮＡ、またはその断片の融解温度プロファイルが、二本鎖核酸−特異的色素を用いて、決定される。次いで、プロファイルは、１つ以上の細胞につき、既知のｒＲＮＡプロファイルと比較され、マッチは、試料ｒＲＮＡは既知のｒＲＮＡ細胞型からのものであることを示す。そのような細胞は、動物細胞、細菌細胞、または植物細胞であってもよい。
【００１９】
もう１つの好ましい具体例において、一本鎖核酸は、増幅された遺伝子またはその断片から由来する。
【００２０】
さらに好ましい具体例において、増幅された試料ｒＲＮＡは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、増幅に基づく核酸配列（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、非対称的ＰＣＲ増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅よりなる群から選択される方法によって生成される。
【００２１】
さらなる好ましい具体例において、融解温度プロファイルの決定は、一本鎖核酸試料を二本鎖核酸−特異的色素と合わせて、色素および該核酸内に形成する１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し、温度を変動させる間に色素の蛍光発光を測定することによって、達成される。
【００２２】
本発明のもう１つの態様において、様々な蛍光色素が、二次構造検出につき同定される。これらの色素は、ＰＣＲ適用での使用につき最初に同定された。増幅の間または後のＤＮＡに関して、これらの「飽和色素」は、ＰＣＲの阻害を最小化しつつ、十分に飽和な状態にて存在可能である。例えば、最大のＰＣＲ−適合濃度にて、ｄｓＤＮＡ結合色素は、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する。他の具体例において、パーセント飽和は、少なくとも８０％であり、より具体的には、少なくとも９０％である。さらに他の具体例において、パーセント飽和は少なくとも９９％である。パーセント飽和は、飽和濃度の同じ色素の蛍光と比較したパーセント蛍光であり、つまり、ｄｓＤＮＡの先に決定された量の存在下で可能な最も高い傾向強度を提供する濃度であると理解されている。これらの色素は、特定の核酸反応と有意に干渉することなしに、有意により高い濃度にて存在することが可能であるため、これらの色素は、一本鎖核酸の立体配座をモニタリングするのに、特に有用であり得ると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、高速ＤＮＡ増幅およびＰＣＲおよび蛍光モニタリングによる分析に使用される標準の２色ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの構成要素を表す。器具（１）は、空気注入口（２）、円試料カルーセル（３）、ステッパーモーター（４）、チャンバーファン（５）、およびオプティクス／フィルターアセンブリ（６）よりなる。試料（７）を、ガラスキャピラリー内に置き、２４ブラスオフセットガイド（９）を持つ反応チャンバー（８）内に、垂直試料整列で維持する。ステッパーモーター（４）を使用して、試料カルーセル（３）を回転させ、試料（７）を励起および収集オプティクス（１０）上に置く。高ワット数加熱コイル（１１）および連続的気流を使用することによって、高速温度回転を達成する。チャンバーを通る空気の一般的な動きは、矢印によって示され、それはファン（５）の回転主導である。ガラスキャピラリーを使用することにより、試料（７）への熱転移速度が増加し、また、高められた蛍光モニタリングに対する総内部反射が得られる。次いで、反応混合物中に存在するフルオロフォアを励起させ、キャピラリーチップの落射によってモニターする。青ＬＥＤ（１２）は、励起に使用され、２つのフォトダイオード（１３）は、蛍光モニタリングに使用される。フィルターアセンブリ（６）は、示されたナノメーター切断を持つ２つの二色性（１４−１５）を含有して、蛍光発光を、データ収集用に、２つのチャンネルに分離する。
【図２】図２は、２４試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに施された小さなチャンバー修飾を示す図である。現在の試料配置および蛍光モニタリングシステムの整合性を維持するために、少しの修飾のみが望ましかった。標準加熱コイルおよび空気注入口パイプを除去し、元の放射状のチャンバーファンを、軸ファン（３０）で置き換えた。チャンバーファンへの電力を、半分減少させた。さらなる絶縁体（３１）を、反応チャンバーおよび試料カルーセル（わずかに陰影を付した領域）の全てのセクションに加えて、チャンバーの熱負荷を減少させた。
【図３】図３は、冷却上部ヒートシンク温度を維持するのに使用されるアルミニウム冷却浴（４０）の描写である。２つのブラスコネクター（４１−４２）（冷却浴の縁から延びている）を使用して、１０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ冷却剤を持つゴム管を接続する。冷却浴の縁から下方に延び、浴の底部に達しているのは、ゴム管（４３）の短いセクションであり、これにより、外部空気圧縮機を使用して、冷却浴のほぼ完全な排出が可能になった。接合の位置の直下（この図では見えない）のゴム管セクションの小さな穴によって、チャンバーを再度充填する際に、空気を逃がすことができる。冷却浴の底部から延びているのは、ペルチエモジュール（４４）および付随するヒートシンク（４５）である。４つのネジを使用して、下部ヒートシンクおよびペルチエモジュールを、浴の底部にしっかりと固定した。３つのネジを使用して、チャンバーを蓋で密閉した。
【図４】図４は修飾されたＬＣ２４器具の最終的な組織図である。付属するヒートシンク（４４）およびペルチエモジュール（４５）を持つ冷却浴（４０）を組み込むため、試料カルーセル（３）の頂部開口を広くし、支柱（４６）を付加して、冷却浴（４０）に対してカルーセルが回転できるようにした。ブラス冷却剤採取（４１）および吐出口取付具（４２）、ならびにチャンバー−冷却剤排出を可能にするためのチャンバー（４０）の底部に延びるゴム吐出口管（４３）が記される。下部ヒートシンク（４４）は、上部ヒートシンク（４７）と同一に機械化されたが、ファン（３０）を回転させるのに、いくつかのさらなる改変が必要であった。最終的な器具修飾は、完全に閉鎖され、冷凍状態を許容するよく絶縁されたシステムを作る。１つの外部調節されたペルチエモジュール（４５）は、活性冷却および加熱インプットの両方を供給する。チャンバー修飾は、標準蛍光モニタリング経路（４８）に全く影響を及ぼさなかった。
【図５】図５は、反応チャンバー温度を調節するのに使用される外部制御システムの基本的な構成成分の図である。１つのコンピューター（６０）、稼働中のＬａｂ Ｖｉｅｗ５．１(National Instruments)を使用して、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ制御ソフトウェアならびに新たなカスタム設計された制御エレクトロニクスを制御する。チャンバー温度フィードバックおよび制御回路は、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内で統合される。Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）からポンプ（６２）および圧縮機（６３）へと延びる黒い線は、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内の回路から生じる制御インプットを示す。制御ボックス（６１）の右底部から延びる二本の線は、ペルチエモジュール（６４）への電力インプットを表す。冷却管（６５−６７）は、ポンプ（６２）および圧縮機（６３）の両方から、アルミニウム冷却浴（６８）の頂部へ延びる線によって示される。２つの一方向チェック弁（圧縮機およびポンプから延びる管と線で繋がる小さな灰色の箱）（６９−７０）を使用して、適切な空気および液体冷却剤の流れる方向を維持した。Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内に配置された１つの１００Ｗ電力供給（７１）は、制御回路に電力を供給し、ならびにペルチエモジュール（６４）に主導電力を供給する。
【図６】図６は、チャンバー温度を制御するのに使用される制御回路の具体的な電子工学構成成分を示す。制御回路は３つのセクションに分けられる：モジュール（９０）を通る電流極性制御、モジュール（９１）への直線状電力調節および圧縮機−ポンプ調節（９２）。極性制御（９０）。ペルチエモジュール（示されていない）を通る電流極性（上部陰影を付した領域）は、１２ボルト６−リード機械的リレー（９３）の状態によって調節され、これは、低電力ＮＰＮトランジスタ（９４）の状態によって制御される。リード配置は、コイル活性化が、モジュール（示されていない）を通る電流方向を逆にするものである。リレーコイル（９３）活性化は、リレーリード配置を切り換え、ＮＰＮトランジスタ（９４）の底部末端（９７）にバイアスを導入することによって開始される。バイアスは、トランジスタ（９５）のコンダクタンスを増加させ、リレーコイル（９６）から地面（９９）への電力供給（９８）から回路を実質的に閉鎖する。１つのダイオード（１００）を使用して、リレーコイル（９６）（誘導的負荷）を活性化および不活性化させることによって発生する小さな電位からコンピューター（１０１）を保護する。それぞれ１ｋΩ（１０２）および２００Ω（１０３）のレジスタは、コンピューター（１０１）からの電力出力を減少させ、適切なトランジスタ（９５）およびリレーコイル（９６）活性化用の源電位を下げる。電力調節（９１）。ペルチエモジュール（９３）を通る電力調節は、電位−フィードバック配置の作業増幅器（１０５）と合わせて、高ワット数ＮＰＮトランジスタ（１０４）を使用する。（ＯＰアンプ（１０５）の陽性末端に接続された）コンピューター（１１２）からの最大アナログ−制御電位は２０ｋΩＰＯＴ（１０７）を用いる（可変レジスタ）（ＯＰアンプ（１０５）の陰性末端に接続された）０．１オームレジスタ（１０６）を横切る最大電位低下に整合される。このように接続されると、０．１オームレジスタ（１０６）を横切る電位低下がコンピューター発生制御電位に整合するまで、ＯＰアンプ（１０５）は、トランジスタ（１０４）の底部電位を調節する。すなわち、コンピューター出力は、ペルチエモジュール（９３）を通る電力を変調し、最終的にはチャンバー温度を変調する。さらなる制御（９２）。陰影を付した領域外の回路は、冷却剤ポンプ（１１０）および空気圧縮機（１１１）の活性を調節するリレー制御（１０８−１０９）を含む。両方のリレー（１０８−１０９）は、「シンク」配置に繋がれるか、あるいは偽論理を使用する。コンピューターボードからのより高いワット数出力は、シンク配置で可能である。
【図７】図７は、標準ＬＣ２４（ａ）、修飾されたＬＣ２４（ｃ）、およびＬＣ３２（ｄ）が４０℃ないし９０℃の標的温度ランプに従う能力を示す誤差対温度プロットを示す。個々のランプ速度は、修飾されたＬＣ２４につき、０．０５℃／秒であり、ＬＣ２４およびＬＣ３２につき、０．１℃／秒であった。誤差プロットは、いずれかの所与の時間の標的温度から実際のチャンバー温度を差し引き、次いで、標的温度に対して誤差シグナルをプロットすることによって作成された。３つの機械の間、修飾されたＬＣ２４は、より標的温度中心の誤差で最も良く実行した。ＬＣ２４およびＬＣ３２の両方は、標的温度から実質的に外れた。
【図８】図８は、正確な配列および使用された全１３のモデルオリゴヌクレオチドの提案された二次構造の両方の図である。対応する配列および右に与えられた構造のすぐ上に、特有の名前と共に、配列を左にリストする。左の配列の下の陰影を付された領域は、右のヘアピン形成に関与した配列を同定する。配列長は１０ヌクレオチドないし５６ヌクレオチドの範囲である。オリゴは、ヘアピン長によって名付けられ、また、テールまたはミスマッチといった修飾の存在を示す。９−１２ヘアピンと名付けられたオリゴは、９ｂｐおよび１２ｂｐの二本鎖領域を形成する２つのヘアピンを含有する。
【図９】図９は、Ｍｆｏｌｄソフトウェアによって計算されたごとく、モデルオリゴ（９−１２ヘアピン）を含有する２つのヘアピンの二次構造を示す。５’および３’端ならびにステム長が示される。www.mfold.burnet.edu.au/rna_formにてオンラインで入手可能なＭｆｏｌｄソフトウェアは、最も近い隣接計算によって、二次構造を予測する(SantaLucia,1998)。２０℃の所与の構造の遊離エネルギー計算は、図の直下で与えられる。
【図１０】図１０は、１３のモデルオリゴヌクレオチドの各々の代表的な融解曲線の編集を示す。この図では、蛍光の陰性誘導体は、温度に対してプロットされる。器具融解温度範囲は最小化されて、各配列の融解転移を強調するため、曲線は断片化される。オリゴヌクレオチドの各々につき収集された全てのデータポイントが含まれる。融解ピークは、１７．７℃ないし７８．６℃の範囲である。ミスマッチ、テールまたは複数のドメインを含まないオリゴヌクレオチドの典型的な融解曲線は、上方のプロット（ａ）で与えられる。ミスマッチ、テールおよび２つのヘアピンを持つオリゴを有するオリゴヌクレオチドから発生された曲線は、下方のプロット（ｂ）で与えられる。低温度へのＴｍシフトは、テールまたはミスマッチを有するヘアピンにつき、明白である。二本ヘアピンオリゴ内の９ｂｐおよび１２ｂｐのヘアピン（９−１２ヘアピン）の安定性は、下方のプロットで示される。
【図１１】図１１は、モデル核酸システムの各配列の平均Ｔｍ値の圧密を、ステムサイズによって示す。複数の集団が、テール、ミスマッチおよび複数の融解ドメインといった配列変動を有するステムサイズと共に見受けられる。すなわち、９−１２ヘアピンからのデータは、構成成分ステムサイズデータ（ステムサイズ９および１２）と共に含まれる。テール、ミスマッチまたは複数のステムを含まない平均Ｔｍ値は、丸で確認され、ここに、Ｔｍ値およびステムサイズの間の対数関係を計算するのに使用される。
【図１２】図１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光によって観察された単離された５Ｓ ｒＲＮＡの代表的な融解プロファイルを示す。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下で、７０ないし９６℃の０．０５℃／秒温度ランプに、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を付し、蛍光をモニタリングすることによって、融解データは収集された。図では、蛍光の陰性誘導体は、温度に対してプロットされる。８つの融解プロファイル構成成分が同定される。テスト（ｎ＝８）を繰り返すと、最大の変動を示す２、５および６と数を付けられたピークを持つ同様の結果を得た。使用された濃度は、１．０ｍＭ ＲＮＡ、ＳＹＢＲの１：１５，０００原液希釈液、および１．０ｍＭ Ｍｇ＋２緩衝液であった。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｉｌ ５Ｓ ｒＲＮＡセグメントの二次構造の図である。セグメントの二次構造は、特異的なループまたは大文字で標識されたヘアピンを持つアルファ、ベータおよびガンマに分けられる。太い数字を使用して、特異的な二本鎖セグメントを確認する。より小さい数字は、潜在的な、命名者−同定、サブ−ドメインを同定する。図１２に示される融解プロファイルの８つの観察された構成成分のうち７つは、このように、５Ｓセグメントをサブ−分割することによって説明できる。残りの融解転移は、内部Ｅループ内でしばしば起こる非−ワトソン−クリック相互作用の融解を反映するかもしれない。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、二本鎖の領域で現れる二次構造を有する一本鎖核酸の分析方法を提供する。一本鎖セグメントおよび二本鎖セグメントを含有する核酸分子は、二本鎖核酸セクションの各々につき、特異的な測定可能な融解温度またはＴｍを有するだろう。二本鎖セグメントの融解転移は、二本鎖核酸−特定的（ｄｓＮＡ−Ｓ）色素の蛍光強度をモニタリングすることによって決定可能であることを示すのは、本発明が最初である。さらに、もし二本鎖領域内に種−特異的配列変動が存在するならば、種−依存性融解プロファイルは入手可能であることを、本発明は示す。核酸融解転移をモニタリングすることによって二次構造分析を行うこの分析技術は、改変または突然変異核酸およびあまり改変されていない核酸またはあまり突然変異していない核酸といった非−同一核酸を識別することが可能である。リボソームＲＮＡといった種−特異的配列またはそれらをコードする遺伝子を有する相同的核酸を使用して、そのような核酸が採取される細胞の種を同定することができる。さらに、既知の技術に必須な通常の増幅後プロセスなしに、本発明を用いて、増幅された核酸を特徴付けることができる。
【００２５】
従って、本明細書中で提供されるのは、一本鎖核酸を特徴付ける方法である。この特徴付けは、核酸の環境温度の変化に応答して、一本鎖核酸の二次構造の変化をモニタリングすることを含む。さらに具体的には、該方法は、二本鎖または一本鎖核酸の二次高次構造から得られる明白な二本鎖領域の融解温度（Ｔｍ）を決定することを含む。二本鎖核酸−特異的色素を使用して、変動する温度に応答する二次構造のこれらの転移をモニターすることができる。理論に制限されることなしに、一本鎖核酸の異なるセグメント間の水素結合および他の非共有相互作用のため、二本鎖領域は、相補的およびほぼ相補的な領域間で、主にハイブリダイゼーションを介して形成する。上記記載のごとく、一本鎖核酸の二本鎖領域は、本明細書中で、「二本鎖二次構造」として呼ばれる。
【００２６】
広い意味で、本明細書中の「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に同等のものは、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の分析に影響されやすい核酸は、直線状配列の少なくとも２つの領域間で十分な相補性を有し、少なくとも１つの二本鎖二次構造を形成するのに十分な長さを有する。一般に、核酸は、天然に生じるヌクレオチドよりなる。しかしながら、当業者は、本発明はゲノムおよびｃＤＮＡ双方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドである核酸に適用可能であり、ここに核酸配列はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれかの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基のいずれかの組合せを含有する。本明細書中で使用されるごとく、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、およびアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾されたヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、非−天然に生じるアナログ構造を含む。すなわち、例えば、各々が塩基を含有するペプチド核酸配列の個々のユニットは、本明細書中で、ヌクレオシドと呼ばれる。
【００２７】
当業者は、例えば、ホスホルアミデート(Beaucageら, Tetrahedron 49(10) :1925(1993)およびその中の引用; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzlら, Eur.J. Biochem. 81 : 579 (1977); Letsingerら,Nucl. Acids Res. 14 : 3487(1986); Sawaiら, Chem. Lett. 805(1984), Letsingerら, J. Am. Chem.Soc. 110: 4470(1988);およびPauwelsら, Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Magら, Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991);および米国特許第５，６４４，０４８号)、ホスホロジチオエート(Briuら,J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989))、Ｏ−メチルホスホルアミデート結合(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)、およびペプチド核酸骨格および結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meierら, Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992);Nielsen, Nature, 365: 566 (1993);Carlssonら, Nature 380: 207 (1996)参照）,これら全ては引用によって組み込まれる)を含む代替の骨格を有する核酸アナログに、本発明は適用可能であることを理解するだろうが、本発明の核酸配列は、一般に、リン酸ジエステル結合を含有するだろう。本発明を使用して分析することができる他のアナログ核酸は、陽性の骨格（Denpcyら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995);非イオン性骨格(米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号; Kiedrowshiら, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsingerら, J. Am. Chem. Soc.110 : 4470(1988); Letsingerら, Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaekerら, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffsら, J.BiomolecularNMR 34 : 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))および米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook記載のものを含む非−リボース骨格を含む。また、１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸は、核酸の一つの定義内に含まれる(Jenkinsら, Chem. Soc. Rev. (1995)pp 169-176参照)。いくつかの核酸アナログは、Rawls, C & E News June 2,1997ページ35に記載されている。これらの引用の全ては、引用によって、ここに明白に組み込まれる。
【００２８】
当業者によって理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明における利用法を見つけるだろう。加えて、天然に生じる核酸およびアナログの混合物ならびに異なる核酸アナログの混合物、および天然に生じる核酸およびアナログの混合物は、本発明を用いて分析可能である。
【００２９】
本発明の好ましい具体例において、一本鎖核酸は、二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせられる。「組み合わせる」およびその文法的に同等のものによって意味されるのは、核酸および色素は、相互作用するように十分に近接されるということである。例えば、核酸および色素は、同じ溶液に、同時に、またはいずれかの順序で引き続いて添加されてもよい。特に下記の論議から当業者は認識するであろうごとく、例えば核酸が増幅産物である時、一本鎖核酸は、色素の存在下で生成される。また、本明細書中で使用するように、もう１つの成分の存在下での一方の成分の生成は、用語「組み合わせる」によって網羅される。
【００３０】
二本鎖核酸−特異的色素は、当該分野でよく知られている。一般に、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、好ましくは、二本鎖核酸と複合体化した存在下にある時に検出可能であるいずれかの物質である。典型的には、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、好ましくは、二本鎖核酸と結合されるか、あるいは複合体化されているだろう。
【００３１】
好ましくは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は蛍光色素であり、二本鎖核酸と複合体化された時のその蛍光特徴は、それがあまり複合体化されていない時から区別可能である。典型的には、二本鎖核酸と複合体化されている時の方がされていない時よりも、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、より強い（より大きい）蛍光シグナル（蛍光発光）を生成するだろう。しかしながら、二本鎖核酸に結合すると、そのような色素はより弱い（より小さい）蛍光シグナルを生成することがあり、あるいはそれらは、例えば異なる波長のシグナルといった異なる蛍光シグナルを生成するかもしれない。そのような区別可能なシグナルは本発明において有用である。
【００３２】
本明細書中に開示する方法で有用な色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、臭化プロピジウム、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０、Ｙ−ＰＲＯ（登録商標）−ＩおよびＹＯＹＯ（登録商標）−Ｉを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、the Molecular Probes (Eugene, OR) catalog Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 第８版(on CD-ROM, May,2001；引用によって、本明細書中に組み込まれる）のChapter 8は、本発明で使用可能な色素のホストをリストする。
【００３３】
また、飽和色素は、本発明の方法において使用可能である。多くの飽和色素は、シアニン族に属する。しかしながら、ｄｓＤＮＡ結合色素の他の族は有用であると考えられ、これはフェナントリジニウムインターカレーターおよびフェナントロリン系メタロインターカレーターを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法で有用なシアニン色素は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＧｒｅｅｎおよびＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯ ４３、ＳＹＴＯ ４４、ＳＹＴＯ ４５、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−１、およびＢＯＢＯ−３(分子プローブ)を含むが、これらに限定されるものではなく、これらは：
【化１】
［式中、
部位Ｙは、所望により置換された縮合単環式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し；
Ｘは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはＣ（ＣＨ３）２、およびＮＲ１よりなる群から選択され、ここにＲ１は水素またはＣ１−６アルキルである；
Ｒ２は所望により置換されたＣ１−６アルキル、または環式または非環式ヘテロ原子含有部位である］
として一般に記載されるピリジニウム核構造との非対称性シアニンのモノマーまたはダイマーである。例示的なヘテロ原子含有部位は、所望により置換されたヘテロアルキル、ヘテロシクリル、スルホネート、アミノ、カルボキシ、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、エステル、アミン、アミド、リン−酸素、およびリン−硫黄結合を含む。例示的なヘテロ原子含有部位は、米国特許第５，６５８，７５１号およびＷＯ００／６６６６４で論議され、これらは引用によって本明細書中に組み込まれる。
ｔ＝０または１であり；
ｚは０または１から選択される電荷であり、但し、ｚ＝ｔであり；
Ｒ３、Ｒ９、およびＲ１０は、独立して、水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎ＝０、１、または２であり；
Ｑは：
【化２】
［式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル（これらは全て所望により置換される）；他のヘテロ原子含有部位；ＢＲＩＤＧＥ−ＤＹＥ（ダイマーを含む）；および反応性基（これらは各々、所望により、第四級アンモニウムといった荷電基を含む）よりなる群から選択される］
よりなる構造の群から選択される芳香環である。ＢＲＩＤＧＥは、ＷＯ００／６６６６４で定義され、既に引用によって組み込まれている。ＤＹＥは、式Ｉの化合物である。立体異性体は、特記しない限り、シアニン色素構造の記載に含まれる。
【００３４】
本発明での使用に対して例示的な色素は、式Ｉのシアニン色素であり、これは、ピリジニウムまたはピリミジニウム核構造を有し、ここに部位Ｙは、所望により置換されたベンゼンを形成し、それにより、ベンザゾリウム環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝０または１であり；Ｒ２はメチルであり；Ｑは：
【化３】
よりなる構造の群から選択される芳香環であり、
好ましくは、Ｑは：
【化４】
［式中、
Ｒ４は水素、アルコキシ（例えばＯＭｅ）、アルキルチオ（例えばＳＭｅ）、またはヘテロシクロアルキル（例えばピペラジニル）、または荷電基（例えば４，４−ジメチルピペラジニウム−１−イル）を含むヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ５はＣ１−６アルキル、（例えばＭｅ）、またはフェニル、（ＣＨ２）３Ｎ＋（Ｍｅ）３、または（ＣＨ２）３Ｎ＋Ｍｅ２（ＣＨ２）３Ｎ＋Ｍｅ２（ＣＨ２）３であり、加えて、これは第２の４−ピリジニウムの窒素に結合しており、それにより、ダイマーを形成し、ここに第２のピリミジニウムは式Ｉの第２の化合物の部分であり；Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は水素である］
である。
【００３５】
ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯ １１、ＳＹＴＯ １３、ＳＹＴＯ １５、ＳＹＴＯ １６、ＳＹＴＯ ２０、ＳＹＴＯ ２３、ＴＯＴＯ−３、ＹＯＹＯ−３(Molecular Probes,Inc.)、ＧｅｌＳタール(Cambrex Bio ScienceRockland Inc., Rockland, ME)、およびチアゾールオレンジ(Aldrich)に限定されるものではないが、こういったキノリニウム核構造との非対称性シアニンもまた有用である。４−キノリニウム（式ＩＩとして下記に示す）または２−キノリニウムのいずれかが、ピリジニウムの代わりに分子の右部分を占有することを除いては、キノリニウム核構造は、ピリミジニウム系シアニンのそれと似ている。
【化５】
［式中、
部位Ｙは、所望により置換された縮合単式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し；
Ｘは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはＣ（ＣＨ３）２、およびＮＲ１から選択される基であり、ここにＲ１は水素またはＣ１−６アルキルである；
Ｒ２は所望により置換されたＣ１−６アルキルであり、あるいは環式または非環式ヘテロ原子含有部位である］
ｔ＝０または１であり；
ｚは０または１から選択される電荷であり、但し、ｚ＝ｔであり；
Ｒ３、Ｒ９、およびＲ１０は、独立して、水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎ＝０、１、または２であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル（これら全ては所望により置換される）；他のヘテロ原子含有部位；および反応性基、（もしＲ４は１１５未満、より好ましくは１０５未満の分子量であるならば、これらは各々所望により第四級アンモニウムといった荷電基を含む）である。代わりに、Ｒ４、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は上記定義通りであり、式ＩＩの２つの化合物は一緒になって、ダイマーを形成し、ここに、もし色素がキノリニウムシアニンｎ＝１または２のダイマーであるならば、式ＩＩの各々の基Ｒ５は一緒になって、二価部位を形成する。
【００３６】
本発明における使用のための例示的な色素は、式ＩＩのシアニン色素を含み、ここに部位Ｙは所望により置換されたベンゼンを形成し、それにより、ベンザゾリウム環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝０または１であり；Ｒ２はメチルであり；
Ｒ４は水素、（Ｍｅといった）Ｃ１−６アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり；
Ｒ５は、（メチルのような）Ｃ１−６アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり；次いで
Ｒ８は水素であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は水素または（メトキシといった）アルコキシである。
また、本発明における使用のための例示的な色素は、例示的に、式ＩＩのシアニン色素を含み、ここに部位Ｙは、所望により置換された（１−メチルピリジニウムまたは３−ブロモ−１−メチルピリジニウムといった）複素環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝ｚ＝０であり；
Ｒ４は水素、または（Ｍｅといった）Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ５は、（Ｍｅのような）Ｃ１−６アルキル、所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルまたは（基−（ＣＨ２）３Ｎ（Ｍｅ）３）といった）荷電基を含むヘテロアルキルであり；次いで
Ｒ８は水素であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は水素、（メチルのような）アルキル、または（メトキシのごとき）アルコキシである。
【００３７】
上記のシアニン色素は例示的なものであって、他のシアニン色素もまたここに記載される方法において有用であり得る。
【００３８】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを含むキノリニウム系非対称性シアニンのいくつかは、「飽和色素」の定義内に含まれていない。色素が、キノリニウム系シアニンのモノマーである時、キノロニウム環（Ｒ４と同等の位置）の窒素に隣接した炭素でのかさ高い置換は、色素が高飽和レベルで結合する能力を妨害する。かさ高い置換は、例えば、ＭＷ＝１５０より大きい脂肪族分岐で置換された長分岐ヘテロ−原子−含有脂肪族鎖または芳香族部位である。しかしながら、この制限は、先に言及したピリジニウムシアニンには適用しない。キノリニウム系シアニンダイマーの場合、（基−ＣＲ３（＝ＣＲ９−ＣＲ１０）ｎ＝によって決定される）左および右環系間の長さは、また、官能性を決定するようである。これらの色素は「飽和色素」の定義内に含まれず、特定の適用に適していないが、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉといった色素は、本開示の方法と適合する。
【００３９】
好ましい具体例において、一本鎖およびｄｓＮＡ−Ｓ色素の組合せは、結果的に、核酸内の色素および１つ以上の二本鎖二次構造間に検出可能な複合体を形成する。理論によって制限されることなしに言えば、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、二本鎖核酸に対して優先的な親和性を有し、しばしば核酸の二つの鎖の間に介入することによって、二本鎖核酸に結合、あるいはさもなければそれと連結する。色素および核酸の連結は、結果的に、二本鎖核酸とあまり連結していない色素から色素を識別する。すなわち、本明細書中で使用するごとく、「検出可能な複合体」は、二本鎖二次構造を意味し、ここに一本鎖核酸およびｄｓＮＡ−Ｓ色素は一緒になって、二本鎖二次構造と連結していないｄｓＮＡ−Ｓ色素から識別可能な複合体を形成する。
【００４０】
好ましくは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、蛍光色素である。好ましくは、検出は、ｄｓＮＡ−Ｓ色素からの蛍光発光の測定によるものである。一般的に、「励起」波長と呼ばれる特定の周波数または周波数のバンドへの露出に応答して、フルオロフォアは、特定の周波数または周波数のバンドにて、蛍光発光（フォトン発光）を生成する。本発明において、色素が検出可能な複合体にない時と区別することができる検出可能な複合体の二本鎖二次構造と連結する時に、各ｄｓＮＡ−Ｓ色素は蛍光発光を生成する。好ましくは、検出可能な複合体の色素の発光は、発光の強さおよび／または発光のスペクトル含有量によって区別できる。いくつかの場合、色素は検出可能な複合体内にない場合、実質的に全く蛍光発光を有しない。典型的には、色素の発光は、検出可能な複合体内にある時により大きい（より強い）が；しかしながら、検出可能な複合体の形成は、いくつかの色素の発光を減少させ、および／または、発光のスペクトル含有量を改変する。
【００４１】
蛍光ｄｓＮＡ−Ｓ色素のごとき、フルオロフォアからの蛍光発光（ルミネセンス）の測定は、当該分野でよく知られている。典型的には、励起照明はフルオロフォアを含有する試料に提供され、関心のある周波数または周波数バンドは、１つ以上のフィルターおよび光学検出器、たとえばフォトダイオードを用いて測定される。
【００４２】
本発明の好ましい具体例において、分析下にある一本鎖核酸の温度は変動する。「温度を変動させる」によって意味されるのは、温度を上昇させるおよび／または減少させることである。好ましい具体例において、一本鎖核酸は、１つ以上のその二本鎖二次構造の融解温度（下記定義される）以下の温度にて提供され、二本鎖二次構造のＴｍを超える温度まで上昇される。核酸試料の温度を変動させる多くの手段は、当該分野で知られ、入手可能である。
【００４３】
本発明の好ましい具体例において、変動が起こる間の温度は、約１０°および１００℃であり、より好ましくは約２０°および９５℃であり、さらにより好ましくは約３０°および９５℃である。
【００４４】
好ましい具体例において、一本鎖核酸の温度は、約０．００５°および０．０５℃／秒間、より好ましくは０．００１°および０．１℃／秒間、よりさらに好ましくは約０．０００１°および１℃／秒間の率にて変動する。特に好ましい具体例において、一本鎖核酸の温度は約０．０１℃／秒またはそれ未満の率にて変動する。
【００４５】
好ましい具体例において、一本鎖核酸の１つ以上の二本鎖二次構造の融解温度（Ｔｍ）は、決定される。一般に、核酸の融解は、二重らせん状態から一本鎖状態への高次的転移を指す。核酸鎖の半分が二重らせん状態にあり、半分が「ランダムコイル」（一本鎖）状態にある際の温度は、融解温度として定義される(Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465 (1998))。すなわち、核酸鎖の所与の対のＴｍは、鎖結合に対する鎖の安定性の指標であり、鎖の相補性、配列長、ＧＣ含有量および環境状態によって決定される(Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998)。本明細書中で使用されるごとく、一本鎖核酸の二本鎖二次構造に関して、二本鎖二次構造を形成した一本鎖核酸の２つのセグメントの解離のため、「融解温度」、「Ｔｍ」およびその文法的同等物は、試料の一本鎖核酸の約半分が二本鎖二次構造よりなり、約半分はそうではない時の温度を意味する。
【００４６】
発明の背景のセクションで論議したように、核酸の融解温度を決定する多くの方法は、当該分野で知られている。好ましい具体例において、一本鎖核酸の二本鎖二次構造のＴｍは、核酸の温度を変動させる間に、一本鎖核酸と合わせたｄｓＮＡ−Ｓ色素の蛍光発光をモニタリングすることによって決定される。所与の温度または制限された温度範囲での蛍光発光の変化は、二本鎖二次構造の融解温度を示す。
【００４７】
当業者は理解するように、一般に、いずれかの二本鎖核酸構造の融解は、制限された温度範囲にわたり、同様の核酸の集団の実質的な集団で起こり、典型的には、該核酸のＴｍの近似値にて、融解（最速の移動）のピークを迎えるだろう。すなわち、蛍光発光の変化のそのようなピークを使用して、二本鎖二次構造に対するＴｍを計算することができる。
【００４８】
さらに、１つ以上の二本鎖二次構造を有するいずれかの一本鎖核酸は、特徴的なＴｍプロファイルを提供するだろう。「Ｔｍプロファイル」によって、「融解温度プロファイル」、およびその文法的同等物は、二本鎖二次構造を有する一本鎖核酸の相対的量の記載を意味する。好ましい具体例において、Ｔｍプロファイルは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素の蛍光発光を測定することによって発生されて、二本鎖二次構造を持つ検出可能な複合体に組み込まれた色素の量を示し、すなわち、二本鎖高次構造にある一本鎖核酸の量を示す。
【００４９】
融解温度プロファイルは、Ｔに対して−ｄＦ／ｄＴをプロットすることによって図示的に表され、ここにｄＦは測定された蛍光発光の変化であり、ｄＴは、核酸の温度の変化であり、Ｔは核酸の温度である。そのような図示的表示は、融解温度を示しつつ、蛍光の最速の変化が起こる温度でのピークを見せるだろう。
【００５０】
二本鎖二次構造のＴｍにつき分析される一本鎖核酸は、細胞または組織資料からの核酸のようないずれかの源からの主要な試料の部分であるか、あるいはそれから単離されたものである。核酸は、合成核酸であってもよい。また、分析される核酸は、核酸増幅産物であってもよい。もちろん、増幅される核酸は、天然に生じる源あるいは合成された源のいずれからでも入手できる。
【００５１】
「核酸増幅産物」、「増幅産物」、「増幅核酸」およびその文法的同等物は、核酸増幅方法の産物を意味し、これによって、初期の核酸のコピーが作成される。当業者は、核酸を増幅する多くの入手可能な方法が存在することを理解するだろう。恐らく、最も人気のある方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である(ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにSaikiら, Science 230: 1350-1354 (1985)およびGyllenstenら, PNAS (USA) 85: 7652-7656 (1985)参照)。ＰＣＲ方法の好ましいバリエーションは、非対称性ＰＣＲである(例えば、Maoら, Biotechniques 27 (4): 674-678 (1999); Lehbeinら, Electrophoresis 19 (8-9): 1381-1384 (1998); Lazaroら, Molec. Cell. Probes 6 (5): 357-359 (1992);および米国特許第６，１９７，４９９号参照)。他の増幅方法は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）(Walkerら, Nuc. Acids Res. 20 (7): 1691-1696 (1992)、ならびに米国特許第５，７４４，３１１号、同第５，６４８，２１１号および同第５，６３１，１４７号参照)、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）(ＰＣＴ公報ＷＯ９７／１９１９３参照)、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）(Compton, Nature 350: 91-92 (1991) ;ならびに米国特許第５，４０９，８１８号および同第５，５５４，５２７号参照)、転写媒介増幅（ＴＭＡ）(Kwohら, PNAS (USA) 86: 1173-1177(1989)ならびに米国特許第５，３９９，４９１号参照)、自己持続性配列複製（３ＳＲ）(Guatelliら,PNAS(USA) 87: 1874-1879 (1990)参照）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＡ）(米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，７９２，６０７号参照)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
１つの好ましい具体例において、分析される核酸は、細胞または組織試料から入手されたかあるいは単離された天然に生じる核酸である。もう１つの好ましい具体例において、核酸は増幅された核酸である。後者の具体例において、好ましくは、増幅された核酸はＰＣＲの産物であり、より好ましくは、非対称性ＰＣＲの産物である。
【００５３】
本発明は、多くの利用法がある。例えば、Ｔｍプロファイルを使用して、一本鎖核酸を特徴付けることができる。次いで、そのような特徴付けを使用して、異なる一本鎖核酸を比較することが可能である。２つの核酸のＴｍプロファイルの差異は、２つの核酸が異なる配列を有することを示す。２つの核酸間の配列の差異の同定は、多くの利用法がある。
【００５４】
１つの具体例において、試料核酸の配列の改変は、試料核酸のＴｍプロファイルを、既知の配列を有する核酸のそれと比較することによって、検出可能である。例えば、通常または鎖細胞のゲノムからの既知の配列の核酸のＴｍプロファイルは決定され得る。同一の細胞型の試料からの同様の核酸のＴｍプロファイルは決定され得る。通常／標準細胞からの核酸および試料からの核酸のＴｍプロファイル間の差異は、試料からの核酸の対立形質の変動または突然変異を示す。さらに、もし既知の配列変動のプロファイルが決定されたならば、試料からの核酸のＴｍプロファイルは、通常／標準核酸からの差異の性質を示す。この技術を用いて、個人は、特定の対立遺伝子につきタイプされ得、あるいは特定の突然変異体によって引き起こされる疾患につきスクリーンされ得る。
【００５５】
細胞からの核酸試料のＴｍプロファイル決定に対するもう１つの使用法は、どの細胞の種型から試料が得られたかの決定である。そのような決定につき特に有用なのは、リボソームＲＮＡであり、あるいは、好ましくは、ＤＡコーディングリボソームＲＮＡの増幅された領域である。発明の背景セクションで論議したごとく、高頻度可変領域は種−特異的であるため、リボソームの配列の高度に保存された領域によって囲まれた多くの高頻度可変領域が同定されてきた。保存された領域に基づくプライマーは、リボタイピング技術用に、そのような高頻度可変領域を特異的に増幅するように開発された。本発明を同様の方法で使用して、試料中のリボソーム核酸のセグメント（例えば、エンドヌクレアーゼ消化断片）を増幅させ、そのような増幅産物に対するＴｍプロファイルを決定することによって、核酸試料が入手された細胞をタイプすることができる。Ｔｍプロファイルを、既知の種からの同様の核酸セグメントからのＴｍプロファイルと比較すると、試料が入手された種がわかる。これらの方法を使用して、例えば、感染の原因を同定、あるいは感染性細胞種の存在を同定することが可能である。
【００５６】
本発明は、多くの分野で利用法があり、これは、遺伝学、免疫学、感染性疾患、腫瘍学、疫学および法医学を含むが、これらに限定されるものではない。そのような使用は、腫瘍原性物質の突然変異を同定すること、遺伝性の遺伝病を同定すること、およびそのような疾患の治療を導くことを含むが、これらに限定されるものではない。加えて、本発明を使用して、対立遺伝子変異体を同定し、生物学的試料の源を同定し、および父性を決定することが可能である。
【００５７】
当業者には、本発明の多くの他の適用が可能であることが明白であろう。本明細書中に引用する全ての文献は、それらの全文において組み込まれる。
【００５８】
次の実施例は、例示的な目的のために提供される。これらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するようなものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：２０℃ないし１００℃の範囲で、試料温度の生成に対して蛍光検出能力を有する高速熱サイクリングデバイスの修飾
その蛍光モニタリング能力および小試料容量のため、本明細書中に記載する実験用の選択器具として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ(Idaho Technologies, Idaho Falls, ID)を選択した。しかしながら、核酸の融解温度に関する文献の概説は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの標準の範囲である４０℃ないし１００℃よりも広い範囲の温度が必要であろうことを示唆している。例えば、リボソーム遺伝子内の二重−らせん領域の標準の長さは、約３ｂｐないし２０ｂｐの範囲であると知られていた（(De Rijkら, 前掲; Gutellら, Nucleic Acids Res. 21 (13) :3055-3074 (1993); Spechtら, Nucleic Acids Res. 25(1) :96-97(1997) ; Szymanskiら, Nucleic Acids Res. 28(1) :166-167 (2000))。Kulinksiら(1991)は、麦芽およびルピナス種子の両方からの５Ｓ ｒＲＮＡ試料は３００および３４０Ｋ（２７°および６７℃）間の観察可能な転移を有し、非常に特徴的な融解転移プロファイルが、２つの検体につき観察されることを発見した。Panerらは、４ｂｐループを持つ６ｂｐステムを含有するヘアピンにつき、５５℃中心の転移を報告している（1990）。VamosiおよびCleggは、８ｂｐないし２０ｂｐのステムサイズの範囲にあるヘアピンにつき、２０°ないし７１℃の融解範囲を記録している（1998）。Volkerおよび同僚らによって行われた研究は、２００ｂｐプラスミドの活性をモニターし、短い内部セグメントは、７５℃および９５℃の間で融解することが判明している（1999）。これらの研究群によって使用された温度転移速度は、通常、６０℃／時間（＜０．０１７℃／秒）未満であった。この情報に基づき、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの温度調節を修飾して、３℃ほどの低温度を達成し、０．０１℃／秒に近い転移速度を達成した。
【００６０】
先に修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭシステムは、「高速温度調節を持つマイクロボリュームマルチサンプル蛍光光度計」である(Wittwerら, 1997)。基本的な熱サイクリングデバイスは、米国特許第５，４５５，１７５号および同第５，９３５，５２２号に詳細に記載され、これらは全文において、本明細書中に組み込まれる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭに似たデバイスは、同時係属米国特許第０９／６５１，３７４号に記載され、これもまた本明細書中に組み込まれる。
【００６１】
図１は、熱サイクリングおよび増幅産物分析用に使用される作用器具の基本的な構成要素の全てを示す。温度サイクリングは、調節可能な高−ワット数加熱コイルおよび連続的気流によって可能になる。器具を囲む空気は、チャンバー内部で見受けられる放射状のファンの作用によってチャンバー内に吸い込まれ続ける。それがチャンバーの頂部を出るまで、ファンの回転は、中心から外側および上側に空気を押す。空気の外側への動きは、チャンバーの中心に低圧力領域を起こし、これは空気を、加熱コイルを横切ってチャンバーへと吸い込ませる。また、円状気流パターンが、チャンバー内部で確立される。反応試料は、小さな試料ホルダー内で含有され、チャンバー内部の熱環境に曝される。チャンバー内部の高速循環空気は、個々の試料ホルダー内へあるいはその外へと、熱移動を増加させ、ＰＣＲ反応としてのそのような適用のために使用する高速熱サイクリングを可能にする。試料の増幅反応および産物分析の間の産物蓄積のモニタリングは、ステッパーモーターで励起および収光オプティックス上方で試料を回転させ、蛍光核酸色素を取り込むことによって可能になる。核酸色素用の励起源としての青色ＬＥＤ機能および励起およびシグナル収集は、同一の経路（近軸向き）に沿って起こる。
【００６２】
図１は、２つのフォトダイオードを使用して、出力シグナルを収集する二色取得の可能性を持つＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭを示す。２つの二色性を使用して、それぞれ５０５ｎｍおよび５６０ｎｍにてカットオフで、色分離を達成する。試料回転経路の内側のチャンバーに置かれた熱電対は、温度フィードバックをコントローラーに供給する。温度、ステッパーモーター、ファン速度、および蛍光データ取得は、ＬａｂＶｉｅｗ−ｂａｓｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ(National Instruments, Austin, TX)を用いて調節される。
【００６３】
修飾されていないチャンバーは、主に、試料−含有ガラスキャピラリーを保持するための２４−真鍮差込を持つ陽極酸化されたアルミニウムで構成される（図１参照）。絶縁体は、チャンバーの内部の全側面に並ぶ（図１−チャンバーの内部に並ぶ絶縁体を灰色で陰影を付ける）。計測手段修飾は、チャンバー修飾、および温度調節修飾に分けられる。蛍光モニタリングに使用する通常の光学経路を再構築する必要を避けるため、チャンバー修飾は最小化された。通常のシステムへの修飾は、チャンバーの内部および外部へのさらなる絶縁強化、ペルチエ冷却／加熱デバイスの利用、試料カルーセルの頂部開口への寸法的調整、さらなる軸受けの組み込み、冷却剤浴組み込みおよびファン修飾を含んだ。特定の修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭは、標準の２４−試料熱サイクラー（ＬＣ２４）であった。
【００６４】
チャンバー修飾
高速熱移動率を持つ現在のチャンバーデザインを、ガラスキャピラリーに利用するために、小さな修飾のみが、反応チャンバーに行われた。上記のごとく、さらなる絶縁体をチャンバーの内部および外部に加えた。最も重要なことには、新たな絶縁体を、試料カルーセルの上部に配置して、真鍮差込を介するチャンバーへの熱の高速移動を減少させた。また、さらなる絶縁体を、試料チャンバーの側面に付けた。標準の放射状のチャンバーファンを、軸ファンで置き換えて、ファンモーターへの力を半分に減少させた。図２は、標準加熱コイルの取出および他のチャンバー調整を示す。
【００６５】
温度制御修飾
変化を最小化するために、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの加熱体として、冷却／加熱源を同一の位置に置いた。システムモデリングから得られる推定されるチャンバー性質を使用して、ワット数出力および寸法に基づいて、ペルチエ冷却／加熱モジュールを選択した(Melcor Materials Electronic Products Corporation, Trenton, New Jersey, Part #CP 1.0-127-05L-1）。２つのヒートシンク(Wakefield Engineering, Wakefield, MA, Part#698-100AB)を入手し、ペルチエモジュールと組合せて使用するために修飾した；モジュールの温かい側および冷たい側の両方につき、１つのヒートシンク。「熱い」ヒートシンクの連続的冷却との最適なペルチエ作動のため、連続した冷却流能力を持つアルミニウムの水浴または冷却浴も構築し、機械化した（図３参照）。上部ヒートシンクを、冷却チャンバー内に置き、下部ヒートシンクを、ペルチエモジュールから反応チャンバーへ延長した。冷却チャンバーに配置された上部ヒートシンクの最終的な形は、１．７５インチ（４．４ｃｍ）の底部直径および１．２インチ（３．０ｃｍ）の高さを持つ円柱状であった。底部ヒートシンクを同じ寸法に切ったが、フィンを修飾して、チャンバーへのヒートシンク浸透を最大化し、ファン回転させた。
【００６６】
試料カルーセルへの小さな修飾は、閉鎖したシステムを維持する間、ヒートシンクを伴う冷却浴の組み込みおよびカルーセル回転の両方を可能にするために必要であった。頂部開口を僅かに拡大させ、２．５”ＯＤ（２．０”ＩＤ）機械的軸受けを締め付けることによって、ペルチエモジュールについての回転を達成した(Kaydon Corp., Muskegon, MI)。機械的軸受けによって、試料カルーセルがその下を回転している間、アルミニウム冷却チャンバーを静置させておくことができた。
【００６７】
冷却浴を含むペルチエモジュール冷却／加熱システム
試料カルーセルへの熱入力を、６０Ｗ（３．９Ａ１５ボルト）ペルチエモジュール(Melcor Corp. Part # CP 1.0-127-051-1)、２つの修飾されたヒートシンク（上記で言及）およびカスタムデザインされた／カスタム形成されたアルミニウムの冷却浴で達成した。３ｃｍ平方ペルチエモジュールを、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面双方を通って、上部ヒートシンク中の４つの６−４０テーパー付きの穴へ延びる４つのネジで冷却浴の下面に締め付けた。ネジの締めが、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面の間にモジュールを拘束するような配置とした。熱ペースト(Melcor Corp. Part #TCE-001)を、各界面にて使用して、モジュールから下部ヒートシンクおよび冷却浴への熱移動を促進させた。上部ヒートシンクを、冷却浴に含めて、液体冷却剤に暴露される表面領域を拡大した。デジタル温度計(Physitemp Instruments, Inc.Clifton, NJ)によって読み取られる２つのさらなる熱電対を使用して、ペルチエモジュール性能をモニターした。１つを下部ヒートシンクに置き、他方を上部ヒートシンクの冷却浴内に置いた。両方の熱電対を、熱エポキシ(Melcor Corp. part#TCE-001)で、それぞれのヒートシンクに固定した。
【００６８】
３インチのアルミニウムバーストックから機械で作られた冷却浴は、カップ様冷却浴および蓋よりなる。蓋を３半インチ（１．７５ｃｍ）６−４０ネジで浴の上部に固定した。ゴム製ガスケットを、蓋および浴の間に置いて、接合部を水密にした。冷却浴の内部容量は（上部ヒートシンクなしで）８０ｍＬであった。１０％ＥｔＯＨ溶液を液体冷却剤として使用し、蓋にネジ止めされた２つの銅取付具に付着したゴム管を用いて、溜め内および外に送った。冷却循環を、冷凍および加熱能力を有する循環サーモスタット(Haake, Karlsruhe, Germany, #FK16)によって動かした。室温冷却剤流速は、約１４００ｍＬ／分であった。１０％エタノール溶液は、水の凝固点を約１０℃降下させた(Weast, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第６３版, CRC Press, Boca Raton, FL (1982) p.236)が、冷却剤が冷却されると、溶液は僅かにより粘稠性になり、流速は減少した。−１０℃の冷却温度では、流速は室温の大体半分であった。１つの銅取付具のルーメンから下には、ゴム管のセグメントがあり、これは外部空気圧縮機による自動冷却剤排出を可能にした。空気が密閉冷却チャンバーに押し出されると、液体は延長管を介して押し出された。管は、チャンバーの底部のすぐ上に達するため、冷却チャンバーのほぼ完全な放出は可能であった。銅取付具のすぐ下のゴム延長管の小さな穴によって、チャンバーを再充填する際に得られた空気を逃がすことができた。図４は、完全な冷却浴デザインおよび試料反応チャンバーへの組み込みを示す。また、ヒートシンクデザインも図４で示される。
【００６９】
温度調節修飾
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭによって使用される高ワット数パルス幅変調制御スキームは、ペルチエモジュールと不適合であるため、新たなペルチエモジュール加熱／冷却システムもまた、新たな調節システムを必要とした。結果的に、別々の電力供給およびリニアーコントローラーを構築し、システムに組み込んだ。図５は、修飾されたシステム内の各構成要素の関係を示す。Ｌａｂ Ｖｉｅｗを動かしているコンピューターを使用して、ポンプ活動、圧縮機活動、１００Ｗ電力供給からの電力出力およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ用の標準実行ソフトウェアを含む修飾されたシステムの全側面を制御した。図５に示されるごとく、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘは、各構成要素からコンピューターへの入力および出力を流すジャンパーステーションとして作動する。また、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘは、システムの各構成要素の活動を媒介する電力供給および制御エレクトロニクスを収容する。具体的な制御構成要素は、ペルチエモジュールへの電力を調節するカスタム形成リニアーコントローラーおよび圧縮機および冷却剤ポンプの活動を制御する２つのソリッドステートリレー(Crydom Corp., San Diego,Cal., Part #DID07)を含む。リニアーコントローラーは、電流極性制御および電力制御セグメントよりなる。温度フィードバックは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ標準熱電対を介して起こる。
【００７０】
制御システムの各側面の詳細は、図６に図示する。図６内の陰影を付した領域は、電力極性を制御する際に使用される回路およびペルチエモジュールを介する電力−調節を示す。図６の上方の最も陰影を付した領域は、モジュールを介して電力極性を制御するのに使用される構成要素を示し、下方の陰影を付した領域は、使用された電力調節スキームを表す。陰影を付した領域の外の回路図は、空気圧縮機および冷却剤ポンプ用の制御経路を示す。１００Ｗ電力供給は、Ｌａｂ Ｖｉｅｗによって発生した制御電圧を除く全ての調節構成要素用の電源電圧である。脚注は、どの接地経路が使用されたかを特定する。調節回路の各セグメントは、下記で論議する。
【００７１】
極性制御は、１２Ｖ（２０ｍＡ）切換コイル（Matsushita Electric Works, Ltd. (Nais group), New Providence, New Jersey. Part #JW2SN-DC12VAJW7211)、１Ａシリコン整流器（ダイオード）（DigiKey Inc., Part #IN4007GICT-NDから入手可能)、低電力ＮＰＮトランジスタ（Digi-Key. Part #2Sd 1474-NDから入手可能）、１つの１−Ｋオームレジスタ、２００オームレジスタおよび１つの２２０ｍＦ５０ボルトコンデンサを持つ５Ａ６ピンリレーを含む。２００−オームレジスタは、リレーコイルを通って、１４Ｖないし１０．５Ｖまで電圧を段階的に下げ、１Ｋオームレジスタは、Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの電流出力を制限する。リレー制御コイルは、誘起電荷であるため、ダイオードを使用して、コイル活性解除に起因するいずれの電流からもコンピューター回路を保護する。リレーの右側への配線は、電流方向を、コイル活性と相関するように変化させることができ、左側の配線は、コイル活性化制御を示す。
【００７２】
６ピン、２状態リレーによって、電流方向は、リレーを通じて一定の極性を維持しつつ、モジュールを介して変化させることができる。例示するために、もし図６で示すごとくリレーのデフォルトのリード配置に従うならば、正電圧はモジュールの赤リードによって見られ、リレーを横切る電圧降下は、赤リードおよび黒リードの間に起こる。次いで、ペルチエモジュールからの負の黒ワイヤは、電力トランジスタに接続されたリードに接続される。もしリード配置が、コイル活性化によって変化すれば、正電圧はモジュールの黒リードにそれが接続されているリレー（灰色ワイヤ）の底面に切り換えられる。次いで、デフォルトケースの逆極性（方向）のモジュールを通って電圧降下が起こる。ペルチエモジュールから（今は赤ワイヤを通って）戻る電圧は、電力トランジスタに接続されたリードに直接切り換えられる。このように、ペルチエモジュール用の電力調節トランジスタは、モジュールを通る電流の方向に拘わらず、常に、同じ電流極性を見るであろう。
【００７３】
リレーのコイル活性化は、次の通り制御した。（Ｖｓ（１４ｖ）と標識された）電源電圧ピンからＬａｂ Ｖｉｅｗ接地へ通過することができる電力量、またはリレー内の制御コイルを通る電力は、ＮＰＮトランジスタの状態によって調節した。デジタル制御ピン＃４７によって、トランジスタゲートにて導入された５Ｖバイアスは、トランジスタのコンダクタンスを上昇させ、全電力がリレーコイルを通り抜けることを可能にする。コイルを通過する電流は、磁場を作り出し、これを使用して、リレーの内部リード立体配置を変化させ、これは代わりにペルチエモジュールを通る電流の方向を変化させる。ピン＃４７にて、制御電位をゼロまで降下させると、トランジスタのコンダクタンスは通常まで戻り、制御コイルを通る電力は停止し、リレーリード立体配置は通常の状態に戻る。不活性化の際に調節コイルによって発生するいずれの電圧も、ダイオードの作用によって制御回路に入ることはできない。
【００７４】
ペルチエモジュール電力調節は、高電圧適用、ＯＰアンプ（作動増幅器)(Analog Devices Inc., Norwood, MA. Part#AD5941)、１つの２０ｋオームＰＯＴ（可変レジスタ）、１つの２００オームレジスタ、１つの０．１オームレジスタおよび１つの０．１ｍＦコンデンサ用に構築された１つのＮＰＮパナソニック電力トランジスタ(Panasonic, Secaucus, NJ. Part#2SD 1474)を含む。システムを設計して、ペルチエモジュールに伝達される電力に対する電圧調節直線状制御を得る。第１に、ＯＰアンプを用いてトランジスタの非線形性質を説明し、第２に、０．１オームレジスタを横切る電圧への正ＯＰアンプターミナルで見られる最大電圧をマッチングさせることによって、線形電力調節は可能になる。もしペルチエモジュールから流れる最大電流は、４Ａ（実際の最大電流は、製造者によって示される通り、３．９である）であると仮定するならば、０．１オームレジスタを横切る最大電圧降下は、オームの法則に従い、０．４Ｖ（オームの法則：Ｖ＝ＩＲ）になるだろう。Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの最大電圧出力は、１０Ｖであるため、ＰＯＴは８００に設定され、１９２００オームは、ＰＯＴの中心ピンに接続されたＯＰアンプの正ターミナルと並んで配置される。再びオームの法則に従い、２０，０００オームの全抵抗を持つＰＯＴを通して１０Ｖにて、０．０００５アンペアが回路を流れる。次いで、個々の電圧降下は、０．４Ｖ（８００ｘ０．０００５）および９．６Ｖ（１９２０００ｘ０．０００５）になるだろう。この配置で、Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの制御電圧が０および１０Ｖ間で変動する時、ＯＰアンプは電力−トランジスタのゲートバイアスを変化させ、（Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの）入力制御電圧をマッチさせる試みにおけるそのコンダクタンスを０．１−オームレジスタを横切っての電圧降下に変化させる。結果的に、ペルチエモジュールを介する電力は、トランジスタのコンダクタンス状態によって調節され、これは、ＯＰアンプの正ターミナルにて、電圧によって調節される。ペルチエ活性から得られるチャンバー温度変動がＬａｂ Ｖｉｅｗ系コントローラーへフィードバックされる時に、完全に閉じたループ状のシステムが形成される。
【００７５】
２つのさらなる制御経路を使用して、モジュール性能にも影響を及ぼす空気圧縮機および冷却剤ポンプの活性を制御する。空気圧縮機の活性化は、アルミニウム冷却剤ポンプを排出し、ポンプは連続的な冷却剤循環を供給する。冷却剤循環は上部ヒートシンクを冷却剤の温度に非常に近い状態で維持しつつ、チャンバーを排出することによって、上部ヒートシンクの温度を上昇させることができる。２つのチェック弁（一方向弁、United States Plastic Corp., Lima, Ohio. Part#22294)を、圧縮機およびポンプの両方のすぐ後に置いて、空気および液体流の適切な方向の維持を確保する。「シンク」配置の２つのさらなるＬａｂ Ｖｉｅｗデジタル出力ピンを使用して、２つの固体状態リレーをスイッチして、圧縮機または水ポンプをつけたり消したりした。１つのＤＣ／ＡＣ固体状態リレー(Continental Industries Inc., Mesa, AR#AC-DC-108-000)を使用して、水ポンプを壁電流と接続させて、ＤＣ／ＡＣ(Crydom. Part #D1D07)リレーを使用して、空気圧縮機の制御回路内のさらなるリレーを活性化させた（空気圧縮機は、このように、コンピューター制御用に構築された）。シンク配置において、１つのターミナルに５Ｖ電源電圧を接続し、他方にデジタル制御電圧を接続することによって、リレーを制御した。デジタル制御電圧が５Ｖから０Ｖに降下する時、５Ｖ降下が制御ターミナルを横切って存在し、リレーは活性化される。この配置によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉ／Ｏボード(National Instruments Corp., 1995)からのより高いワット数出力が可能になる。
【００７６】
器具の性能の決定
性能評価を、標準の２４試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＬＣ２４）、３２試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＬＣ３２）、および修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ｍｏｄＬＣ２４）について、設定温度ランプを実施し、結果を比較することによって達成した。器具は、０．１℃／秒（０．０５℃／秒の速度を、ｍｏｄＬＣ２４につき使用した）の温度転移速度にて、４０℃ないし９０℃まで、チャンバー温度を上昇させるものであった。記録された温度追跡を、誤差シグナルに変換し、グラフ化して、標的温度ランプについての温度変動を示した。いずれの時間間隔での標的温度も、０．１℃／秒または０．０５℃／秒の勾配を持つ開始および終了温度（それぞれ４０°および９０℃）を通る線によって表される。いずれかの所与の時間の標的温度を、実際のチャンバー温度から差し引くことにより、誤差シグナルを読み取ることができる。この誤差シグナルを記して、各機械の性能を実施した。最大および最小の誤差読み取りの間の差異を計算することによって決定された全体的な変動（ランの全時間スケールにわたる）、および局所的な最大および最小によって決定される局所的変動（小さな時間スケール、〜１０秒）を比較して、温度制御性能を決定した。
【００７７】
修飾されたＬＣ２４の構築の間、新たな軸ファンのファン速度を最適化した。ペルチエモジュールを横切る全電力および一定の冷却剤循環率を維持しつつ、ファンモーターでＰＯＴを連続して挿入することによって、最適化を実施した。１分後、チャンバーの温度を、ＰＯＴを横切る電流電圧降下と共に記録した。１分後に最も低いチャンバー温度を与えた可変レジスタを横切る電圧降下を記録した。
【００７８】
器具の性能結果
ファンの稼働あるなしで、同等の回路モデルのＭａｔＬａｂ計算を行った。チャンバーの熱負荷は、（それぞれ、ファンあるなしで）６．１ワットおよび４．８ワットであることがわかった。システムの全熱負荷計算を、さらなる内部および外部絶縁体で反復した（上部および側面のみ）。さらなる絶縁体を計算して、システムの損失を、ファン作動あるなしで、それぞれ３．６および３．１ワットまで減少させた。
【００７９】
修飾されたＬＣ２４の精度および精密度は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ２４（ＬＣ２４）機械の標準の温度制御より４倍ほど良いことがわかった。２つの機械からの誤差信号の図示表現は、図７に示す通りである。ピークからピークの全体的および局所的変動は、ＬＣ２４においてより不正確であった。ＬＣ２４の最大記録誤差は、標的温度から３℃以上ずれていることが観察されたが、修飾されたＬＣ２４機械は、標的の０．２℃以内に温度を維持した。より重要なことに、ｍｏｄＬＣ２４およびＬＣ２４の局所的変動（１０秒未満の小さな時間スケール）は、それぞれ０．３２℃および１．３℃であった。２つの機械の観察された性能の作表は、表１の通りである。全誤差シグナルの標準偏差ならびに最大および最小誤差の標準偏差が示されている。また、表１には、器具の全体の温度範囲および各機械に対する可能なランプ速度が含まれる。
【００８０】
【表１】
表１．器具性能データの作表。時間特異的誤差データを、図７記載の方法で計算し、それを使用して、最後の５欄に示したデータを発生させた。第２欄および第３欄は、各機械につき、各々、最も遅い可能なランプ速度および正常作動温度をリストする。具体的な機械を最も左の欄に示す。全ての３つの機械は、４０℃ないし９０℃の温度ランプに従い、標準ＬＣ２４、修飾ＬＣ２４およびＬＣ３２で用いたそれぞれの各ランプ速度は、０．１℃／秒、０．０５℃／秒、および０．１℃／秒であった。
【００８１】
ＬＣ２４への修飾は、システムの熱安定性ならびに器具の温度範囲を上昇させた。標準の２４ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの稼働中の温度範囲は、４０°および１００℃の間であった。修飾されたＬＣ２４内のペルチエモジュールによる能動的冷却は、より低い温度範囲を、約４０℃ないし０℃減少させた。温度上限は他の機械より１０℃低かった。１０℃未満のチャンバー温度は、０℃未満の冷却剤温度を必要とし、８０℃を超えるチャンバー温度は６０℃を超える冷却剤温度を必要とした。すなわち、温度極端は、ペルチエモジュールのワット数およびモジュールの可能なΔＴによって決定された。温度範囲の極端および軸ファンへの最適電力伝達（標準のＬＣ２４ファン電力の５０％）にて、絶対的下部ヒートシンク温度は、常に、絶対的チャンバー温度を少なくとも１５度超えた。いずれの冷却剤温度においても、上部および下部ヒートシンクを通して観察された最大持続ΔＴは、約４５℃であった。
【００８２】
器具使用論議
試料チャンバーを閉鎖システムに変換することにより、修飾されたＬＣ２４の温度制御性能が４倍増加する。標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ配置において、チャンバー内からの空気は、チャンバーファンの作用によって、連続して、上部空気弁から押し出され、新たな空気は連続して、注入管からチャンバーへ入る。すなわち、適切なチャンバー温度制御は、それが丁度チャンバーよりも優れた加熱体を素速く通るにつれて入ってくる空気の加熱、およびチャンバーファンによるチャンバー空気の適切な混合に依存する。入ってくる空気は迅速に加熱コイルを通過し、入ってくる空気の非−均質の温度に至るため、混合は必要である。すなわち、高速ファン速度は、入ってくる空気を適切に混合するのに必要である。また、熱移動速度は、空気の速度によって決まるため(Hagen, Heat Transfer with Applications, 第一版, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ (1999))、高速ファン速度は、熱移動速度を試料キャピラリへと上昇させる。すなわち、高速温度循環は可能であり、結果的に、ＰＣＲ反応の多くの循環は、比較的短い時間間隔で起こり得る。しかしながら、ファン速度および空気流が増加するにつれ、対照表面（加熱体）上の空気暴露時間は減少し、入ってくる空気量のより大きい温度差が存在するだろう。加熱された、入ってくる空気は、より少なく、より均質性に乏しいため、より多くの混合およびより高速のファン速度が必要になる。また、より短い加熱体暴露時間は、小さい時間間隔で適切な電力調整を行うためにより精密なコントローラー精度を必要とする。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの製造者らは、高速ファン速度に対する最適な調節スキームを発見することに大きな関心を寄せてきた。また、器具のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭラインは、特に、迅速な温度循環のために構築されたものであり、温度移動を遅くするためのものではないことは記されるべきである。
【００８３】
システムを閉鎖し、試料チャンバーに新たな空気を連続導入しないことによって、低電力加熱／冷却エレメントおよびより遅いファン速度を用いることにより、均質な環境を試料チャンバー内に維持することが可能である。混合する時間を増加させ、対照表面（下部ヒートシンク）への空気の露出時間を増加させることにより、システムの閉鎖によって、より厳密な温度調節が得られる。混合する時間を増加させることによって、非常に小容量の空気の収集というよりも１つのヒートマスといったような対照表面温度の変化に、チャンバーを応答させる。チャンバー空気は、１つのマスのように動き、対照表面上の温度変化にゆっくりと応答する。次いで、システムは、緩慢にのみ応答することができ、より緩慢な速度およびより良い熱安定度が、システムの特徴になる。
【００８４】
０°および９０℃の範囲のチャンバー反応温度は、ペルチエモジュールおよびより緩慢なファン速度によって実現する。記載する制御スキームを用いて、ペルチエモジュールを横切る極性を変化させることによって、能動的な冷却および加熱が可能である。ファン速度を減少させることにより、チャンバーの壁を通るシステムの熱損失は減少され、それにより、低ワット数温度調節スキームは、依然として、所望のチャンバー状態を達成することができる。ＬＣ２４のより高いファン速度は、加熱エレメントから空気への熱移動速度だけではなく、チャンバーの壁を通る熱移動速度も増加させる。
【００８５】
２つのヒートシンクにわたって維持される最大ΔＴ、および下部ヒートシンクおよびチャンバー温度間の温度差といった個々のシステム構成要素の測定された温度から、システムの実際の熱的性質が洞察される。下部ヒートシン温度クおよび最大電力出力でのチャンバー温度の間の観察された１５℃の差は、対照表面（下部ヒートシンク）からの熱移動およびチャンバーの壁を通るそれの間のバランスを表す。２つのヒートシンクにわたり観察された４５℃のΔＴは、ペルチエモジュールワット数、上部ヒートシンクから液体冷却剤への熱移動速度およびアルミニウム冷却浴の壁を通る熱負荷によって決定される。
【００８６】
所望により、温度範囲の増加は、現在のシステムのカップル態様を変化させることによって達成できる。温度範囲強化は、チャンバー壁を通る熱移動を減少させ、かつ対照表面（下部および上部ヒートシンク）からの熱移動を増加させることにより、ペルチエモジュール特徴（サイズ、ワット数、ΔＴ）を増加させることによって達成できる。チャンバーに加えられたさらなる絶縁体は、チャンバーの壁を通る熱移動を減少させようという試みであった。チャンバー内の気流を増加させる（より速いファン速度）ことが、チャンバー壁を通る熱移動速度よりも対照表面からの熱移動速度により大きな影響を及ぼす地点まで、絶縁体を増加させることが可能かもしれない。また、下部ヒートシンクを通るより定方向の気流は、ヒートシンクからチャンバーへの熱移動を増加させるが、チャンバーの壁に沿った気流は大して増加させない。放射状のファンから軸ファンへ変化させて、下部ヒートシンクを通る気流を増加させようと試みた。
【００８７】
また、冷却流速を増加させることで、上部ヒートシンクからの熱移動を増加させることによって、ペルチエモジュール性能を改善することができる。冷却剤浴内のより速い流速は、試料チャンバー内の流速を増加させるのと同じシステム効果を持ち；上部ヒートシンクから冷却剤への熱移動速度は増加するだろう。上部ヒートシンク温度が冷却剤温度により近づくと、２つのヒートシンクを横切る潜在的なΔＴを上昇させることによって、冷却移動速度に対してより良い上部ヒートシンクは、ペルチエモジュールの性能を増加させるだろう。しかしながら、冷却浴の壁を通る熱移動速度もまた上昇し、これは、モジュールの性能を減少させる傾向にある。従って、絶縁体もまた、冷却浴の外側に置かれた。
【００８８】
実施例２：二次構造融解曲線および複数のドメイン融解の実証
モデルオリゴヌクレオチドシステムは、（１）二本鎖ＤＮＡ特異的核酸色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を実証し、（２）経験的に、二次構造融解温度範囲を決定し、（３）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を用いて、複数ドメイン融解を実証し、（４）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて、二次構造の配列特異的融解を実証するように設計された。核酸の複数ドメイン融解は、示差走査熱分析(Kulinski, 1991; Panerら, 1990)を使用し、光学吸収度(Volkerら, 1999)を使用し、ならびに共有結合したフルオロフォア(Vamosi and Clegg, 1998; Volkerら, 1999)をモニタリングすることによって先に報告されているが、複数ドメイン融解決定は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉといった二本鎖核酸−特異的色素を用いては示されていない。
【００８９】
モデルオリゴヌクレオチドデザイン
１３の特異的に設計されたモデル核酸オリゴヌクレオチドを、ＩＴ Ｂｉｏｃｈｅｍ(Salt Lake City, UT)による標準高速促進ホスホルアミダイト化学を用いて、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ８９０９ ＭＯＳＳ合成器(Framingham, MA)で合成した。合成後、各オリゴヌクレオチドを、標準脱保護および脱塩条件で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。１３のオリゴヌクレオチドの各々は、３塩基対（ｂｐ）ないし１８ｂｐの可変長のループおよびステム中に４つのヌクレオチドを有する少なくとも１つのヘアピンを含有した（図８参照）。ステム長が９の塩基対およびそれより短いものに対するループ配列は、全て同一であった（−ＡＡＡＡ−）。９を超えるステム長に対するループ配列は、全て−ＴＣＣＴ−であった。全てのステムにおいて、一定のＧＣ含有量を維持しようと努力したが、ステム配列は完全には同一ではなかった。全てのオリゴヌクレオチドの平均的なＧＣ含有量は、約４８％であった。図８は、各オリゴヌクレオチドおよびそれらの提唱された二次構造に対する特異的な配列を示す。１３の配列から、２つのオリゴヌクレオチドは、ステム配列内にミスマッチを含有し、２つは二次構造（テール）内に組み込まれていないさらなる塩基を有し、１つは異なるステム長（９ｂｐおよび１２ｂｐ）を持つ複数のヘアピンを含有する。合成に引き続いて、全てのオリゴヌクレオチドを、１ｘＴＥ’（０．０１Ｍ ＥＤＴＡによる１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣＬの１：１００希釈）中に再懸濁し、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ２０００分光光度計(Pharmacia Biotech, Cambridge, England)を用いて、２６０／２８０の割合を取った。配列は既知であったため、核酸濃度を、まず、核酸の公開された光学性質(Borer,"Nucleic Acids", In Handbook of biochemistry and Molecular Biology, 第三版, (Fasman, ed.) CRC Press, Boca Raton, FL (1975) p.589)およびカスタム設計されたソフトウェア(CTWTool-2-18-00, Carl T. Wittwer, University of Utah, SLC, UT)を用いて、各オリゴヌクレオチドにつき、吸光係数を計算することによって、決定した。二次構造立体配座を、２０℃および１Ｍ ＮａＣｌの２つのヌクレオチド構造−予測ソフトウェアパッケージ、Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ(Sci-ed Software, Durham, NC)およびＭｆｏｌｄ(Dr. M. Zuker, Washington University Medical School, St. Louis, MO)を用いて確認した。Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒは、Ｍｆｏｌｄが同定した２つのヘアピン構造を同定することができなかった。図９は、Ｍｆｏｌｄによって計算されたように、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドの得られた構造を示す。
【００９０】
アッセイ最適化
将来のＰＣＲ後反応状態を見越して、各反応は、ＰＣＲ緩衝液(IT Biochem: ５０ｍＭ「透明」緩衝液)内に、ＤＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを含有した。３つの構成成分に対して最適化ランを実施した。まず、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩおよびＤＮＡ濃度の範囲を調べ、引き続いて、緩衝液濃度の範囲を調べた。融解ピークおよびピークの相対的なシグナル対ノイズ比（またはピークの標準偏差）両方の存在を、最適濃度を決定する基準として使用した。標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭデータ分析ソフトウェア(LCDA 3.0, Idaho Technology Inc, SLC, UT)を用いて、観察された融解ピークの標準偏差を計算した。
【００９１】
最初の最適化ランを、３２の試料ホルダーを持つＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭを用いて、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドで実施して、最適化プロセスを促進させた。複数ドメイン融解を調べるために最適化されたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＤＮＡおよび緩衝液の最終濃度は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ(Molecular Probes, Eugene, OR, Part #S-7567)の１：２０，０００原液希釈液、０．１ｍＭのＤＮＡ、および５０ｍＭ透明ＰＣＲ緩衝液の１：５０原液希釈液（最終構成成分濃度：５ｍＭ トリス、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および１．０ｍＭ Ｍｇ２＋）であった。９ｂｐより短いステムを含有する試料につき、最終ＤＮＡ濃度は、１．０ｍＭから３．５ｍＭへと変更されて、ステムループ蛍光を増加させた。アッセイ最適化に従い、１３のモデルオリゴヌクレオチドのうち１２（６の反復で実行）を、各オリゴヌクレオチドの融解転移温度辺りに標的した温度範囲で修飾されたＬＣ２４を用いて、０．０５℃／秒温度ランプに付した。ＬＣ３２を使用して、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドからデータを収集した。得られたデータを、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ分析ソフトウェア(LCDA 3.0)を用いて分析し、Ｔｍ値を作表した。また、平均および標準偏差計算を含むＴｍ値を基本的な統計学的に分析した。
【００９２】
モデルオリゴシステム結果
平均Ｔｍ、標準偏差、およびデルタＴｍ値（ステム配列変動またはオリゴヌクレオチドデザイン差異により、Ｔｍはシフトする）を含む１３のオリゴヌクレオチドの各々からの結果は、表２の通りである。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、２つの左の欄で確認される。Ｔｍ１欄の値は、平均Ｔｍ値であり、各オリゴに対するｎは、右に示されている。融解温度に対する標準偏差は、標準偏差下で示される。２つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。ＬＣ３２で得られた９ないし１２のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたＬＣ２４を用いて入手した。
【００９３】
【表２】
*は、３７ｂｐテールの存在を示す。
**は、ヘアピンステム内の１つのミスマッチの存在を示す。
表２．モデルオリゴシステムからの結果の表化。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、２つの左欄で確認される。Ｔｍ１欄の値は、平均Ｔｍ値であり、各オリゴに対するｎは、右に示されている。融解温度の標準偏差は、標準偏差下で示される．２つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。ＬＣ３２で得られた９ないし１２のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたＬＣ２４を用いて入手した。
【００９４】
融解ピーク値は、１７．７°から７８℃の範囲であり、Ｔｍ値はステムサイズと共に増加する（図１０参照）。ステム配列および配列長一貫性の変動は、異なるＴｍ値を与える。１３のオリゴヌクレオチドの各々に対する融解曲線の編集は、図１０ａおよび１０ｂにある。図１０ａは、ミスマッチ、テールおよび複数のドメインを含まないオリゴヌクレオチドの典型的な融解曲線を与える。ミスマッチ、テールおよび複数のドメインを含有するオリゴヌクレオチドの融解曲線は、図１０ｂに示される。特異的なオリゴヌクレオチドに対応する曲線は、脚注で示される。一般に、バックグラウンドを超える融解ピーク高は、ヘアピンステム長と共に増加する（図１０ａ参照）。しかしながら、１２ｂｐヘアピンステムを含有する合成オリゴヌクレオチドのピーク高は、あまり顕著ではなく、３ｂｐまたは４ｂｐのステムを持つヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドに似ていた。
【００９５】
ステムサイズ対Ｔｍの関係をよりはっきりと視覚化するため、各オリゴヌクレオチドの平均Ｔｍ値を、ステムサイズに対してプロットした（図１１）。ミスマッチ、テールまたは二重ステムを持つオリゴヌクレオチドを除いて、ステムサイズおよび生成物Ｔｍ間の関係は、対数関係
ｙ＝３２．２８７ｌｎ（ｘ）−９．０３１８
［式中、ｙは℃で生成物Ｔｍを表し、ｘは塩基対（ｂｐ）のステムサイズである］によって（Ｒ２＝０．９１４）で最も適切に示される。最も適合した対数式は、マイクロソフトのＥｘｃｅｌによって実行された最小二乗計算によって決定された。図１１は、計算された傾向ラインおよびＲ２値を含む生成物Ｔｍおよびステムサイズ間の関係を示す。
【００９６】
１２ｂｐステムおよび１５ｂｐステムは、上記の対数関係によって予測されたようには融解しなかった。１２ｂｐヘアピンは、１５ｂｐステムよりも、０．４℃高く（平均Ｔｍ値）融解した。１２ｂｐおよび１５ｂｐヘアピンの標準偏差は、それぞれ、０．７８℃および０．３℃であった。９ｂｐおよび１２ｂｐサイズにて、Ｔｍ値の４つの集団が観察された。２つの融解ピークが、９ｂｐおよび１２ｂｐのステムサイズを持つ複数のヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドから観察された。９ｂｐに対応する融解ピークは９ｂｐヘアピン融解のみと比較すると、＋８．４℃（プラスまたはマイナス１．５℃）シフトした。複数のヘアピンオリゴヌクレオチドの中で、１２ｂｐに対応する融解ピークは、＋２℃Ｔｍシフト（プラスまたはマイナス０．６℃）を示した。９ｂｐステムおよび１２ｂｐステムのミスマッチは、それぞれ−１４℃および−１５℃のＴｍシフトを与えた。「テール」の存在、９ｂｐステムおよび１２ｂｐステムから延びているステム構造に関与していない３７の塩基は、それぞれ−８．１℃および−２．２℃のＴｍシフトを与えた。
【００９７】
モデルオリゴシステム論議
モデルシステムを設計して、下記の目的を各々達成した。
１．二本鎖特異的核酸色素の蛍光活性をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を示す。
２．経験的に、二次構造融解温度範囲を決定する。
３．二本鎖特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示す。
４．二次構造の配列特異的融解を示す。
これらの目的の各々は、モデルシステムから得られた結果を用いて取り組むことができる。１つのＤＮＡ分子内に存在している二次構造は、二本鎖−特異的核酸色素蛍光をモニタリングすることによって検出可能であることを、モデルオリゴヌクレオチドシステムからの結果は示した。また、３ｂｐないし１８ｂｐのステム長範囲のヘアピンが融解した温度に関して、６０℃の温度範囲を決定した（１８°および７８℃の間）。ミスマッチまたはテールを含有するオリゴヌクレオチドに対して観察されたＴｍシフトによって明白になったように、Ｔｍ値は配列特有の形で変動した。最終的に、２つのヘアピンドメインを含有する合成オリゴヌクレオチドの融解は、２つの融解ピークを得、すなわち、二本鎖−特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示した。生成物Ｔｍの配列依存性ならびにＴｍのステムサイズへの依存性を示すこれらの結果は、Ｔｍの配列依存性に対する先に公開された結果と一致する(Kulinskiら 1991; Panerら, 1990; Ririeら, 1997; Vamosi and Clegg, 1998)。
【００９８】
Ｔｍによって生成物の長さを識別する能力は、ステムサイズが増加するにつれ減少する。図１１で記すように、生成物Ｔｍおよびステムサイズ間の関係を示す曲線の傾斜は、ステムサイズが増加するにつれ平らになる。明らかに、ステム長が増加すれば、ヘアピンステムに添加されたさらなる塩基対は、ヘアピンの安定性をあまり増加させない。しかしながら、関係が最大値に達するか、あるいは上昇し続けるかは、これらの結果からは決定できない。
【００９９】
他の核酸システムの概説およびリサーチは、たとえ長い二本鎖長においても、Ｔｍはステム長と共に変動することを示す。例えば、異なる長さのＰＣＲ生成物は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ(Ririeら, 1997)を用いるＴｍ分析によって識別可能であり、これはステムサイズを増加させることは、Ｔｍを増加させ続けるであろうことを示唆する。しかしながら、この研究は、二本鎖アンプリコンおよび生成物Ｔｍ値に対して行われ、すなわち、２つの別々の、しかし相補的なＤＮＡ鎖の融解を表す。モデルヘアピンシステム内で、二本鎖相互作用は、分子間とは対照的に、分子内である。ヘアピン内の２つの相補的なセグメントは、相補的な鎖をあまり時間をかけずに発見し、２つの相補的な鎖の濃度は効果的に増加する。例えば、Vamosi and Cleggは、３４ｂｐ分子間（つまり、２つの別々のＤＮＡ鎖の間の）相互作用は、２０ｂｐ分子内（ヘアピン）相互作用よりも、低い温度で融解することを観察した（1998）。言い換えれば、分子間システムからの結果（例えば、Ririeら,1997による研究）は、分子内システムに直接適用することができない。それならば、分子内システムにつき、ステムサイズおよびＴｍ間の関係を決定する最良の方法は、増加するサイズのステムを持つヘアピンを分析するか、他の分子内核酸研究から得られたデータを使用することである。
【０１００】
ステムサイズおよびＴｍ間の良い相関関係は、本研究で示される。相関関係の有効性は、部分的に、Ｒ２値によって示され、また記録されたＴｍ値の標準偏差によっても示される。ステムサイズおよびＴｍ間の計算された関係は、他のヘアピンのＴｍ値を推定する方法を提供する。
【０１０１】
高解像度ＬＣ３２を用いて、９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンの両方を含有するモデルオリゴヌクレオチドは、２つの融解ピークを得、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ分析によって、複数ドメイン融解を示した（図１２ｂ参照）。９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンのＴｍのシフトによって示されるように、同一分子内の複数のヘアピンの存在は、分子の全体的な安定性に影響を及ぼした。一旦融解すると、９ｂｐヘアピンは、テールセグメントと同様に作用し、１２ｂｐヘアピンの安定性を減少させると考えるだろうが、その代わりに、＋２．０℃Ｔｍシフトが観察された。９ｂｐヘアピンの観察された安定性は、＋８．４℃のＴｍシフトと共に増加した。この安定性の理由は不明である。１つの説明としては、一本鎖セグメントと比較して、より少ない熱運動がＤＮＡの二本鎖領域に存在していることかもしれない。図９に示すごとく、９ｂｐおよび１２ｂｐセグメントの両方が二本鎖立体配座にある時、二本鎖でないのは、短３ｂｐリンカーおよび２つの短３ｂｐテールしかない。
【０１０２】
結果的に、完全構造の熱運動を最小化して、９ｂｐセグメントを高温度にて融解させることによって、１２ｂｐヘアピンは、９ｂｐヘアピンを安定化させるかもしれない。これと同じ論理に従い、９ｂｐ断片が融解し、一本鎖になり、それにより分子の熱運動が増加する時、１２ｂｐヘアピンの安定性は減少し、よい低いＴｍが観察されるはずである。
【０１０３】
テールがシステムに対して持ち得る効果に関して、1990年にDoktyczらによって行われた研究(Biopolymers 30: 829-845)が関連している。示差走査熱分析を用いて、様々な配列の４ｂｐのダングリング末端（またはテール）は、一貫して、同一の配列の平滑末端（ダングリング末端なし）ヘアピンよりも高温度にて融解した。彼らはダングリング末端のヘアピンにつき、より高いＴｍ値を観察したが、このＴｍシフトは、ダングリング末端を持つヘアピンの融解転移の型の変化に起因する。彼らは、ダングリング末端の存在は、ヘアピンを完全な「全てそう、あるいは全くそうでない」といった形で融解させ（つまり、完全に二本鎖または完全に一本鎖）、該平滑末端ヘアピンは「全てそう、あるいは全くそうでない」モデルから逸脱すると議論する(Doktyczら, 1990)。すなわち、それが融解する時、より不安定な立体配座を介して通過するため、より低温度の転移は、平滑末端オリゴヌクレオチドで観察される。ダングリング末端を持つヘアピンにおいて、二本鎖から一本鎖への転移を引き起こすのに、より強い熱エネルギーまたはエンタルピーが実際に必要であった(Doktyczら, 1990)。従って、二本ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド内の３ｂｐテールの存在も、２つのヘアピンで観察されたより高い熱安定性に寄与するかもしれない。
【０１０４】
モデルシステムのテールを持つ全てのヘアピンは、Ｔｍ増加よりもむしろ実質的なＴｍ減少を経験したため、Doktyczの研究および本実施例に記載するモデルシステムからの観察の間に明白な矛盾が存在する。この矛盾は、注意深く取りかかる必要がある。Doktyczは、４つの塩基のダングリング末端（またはテール）を使用したが、モデルシステムのダングリング末端（１２−テールおよび９−テールオリゴヌクレオチド）は、３７塩基長であった。Doktyczシステムにおけるヘアピン安定性の度合いは、ダングリング末端の最初の塩基に密接に相関していた(Doktyczら, 1990)。モデルオリゴヌクレオチドシステムの３７塩基ダングリング末端をもって、最初の塩基のいずれの安定化効果も、長い非二本鎖配列の総エネルギーによって覆われるだろうと推論することができるだろう。しかしながら、３ｂｐテールは９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンの両方に存在するため、二本ヘアピンモデルオリゴヌクレオチドで観察された安定性は、Doktyczによる結論によって支持される。モデルシステムの長いテールのヘアピン不安定化効果は、エントロピー主導であると考えられ、これはDoktyczおよび他者の研究によって支持される(Doktyczら, 1990 ; Panerら, 1990 ; Rentzeperisら,Nucleic Acids Res. 21 (11) : 2683-2689 (1993))。
【０１０５】
本明細書中で研究されたステム長の比較的小さな範囲に拘わらず、ステム長は、天然に生じるステム長にほぼ近いものを使用した。小さなおよび大きなリボソームサブユニット内で見受けられた核酸二次構造相互作用の大部分は、３ｂｐおよび２５ｂｐ間のステムサイズを持つヘアピンで構成されている。(Szymanskiら, 1997; Spechtら, 1997; De Rijkら, 1992; Kulinski, 1991)。結果的に、天然システムから由来した配列は、二本鎖核酸−特異的色素を用いるＴｍ分析によって観察可能であるはずである。
【０１０６】
複数ドメイン融解プロセスの正確な仕組みが不明瞭であるにも拘わらず、二本鎖核酸−特異的色素を用いる複数ドメイン融解は、モデル核酸システムで確認されている。さらに、使用される化学濃度は、ＰＣＲ後適用に対して実行可能である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる一本鎖立体配座Ｔｍ分析の将来の研究は、Ｔｍ分析によって観察できる十分な、生物依存性二次構造差異を含有する増幅可能領域を発見することにかかっている。
【０１０７】
実施例３：５Ｓ ｒＲＮＡの複数成分融解の実証
５Ｓ ｒＲＮＡの複数の融解構成成分を識別する能力は、商業的に入手可能なｒＲＮＡを用いて示された。Ｅ． Ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００ ５Ｓ ｒＲＮＡを、Roche Molecular Diagnostics(Boehringer Mannheim, GmbH, Germany, Part#206911)から入手した。５Ｓ ｒＲＮＡ試料を選択して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いる天然システムの複数ドメイン融解を同定する可能性を実証した。濃度最適化を、モデルオリゴヌクレオチドシステムと同様に行った。最終的な最適化された濃度は、１．０ｍＭ ＲＮＡおよび１．０ｍＭ Ｍｇ＋２ＰＣＲ緩衝液（５ｍＭトリス，５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ， および１．ＯｍＭ Ｍｇ２＋）中のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの１：１５，０００原液希釈液であった。(IT Biochem, SLC, UT)。
【０１０８】
最適化の後、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を、八回、融解させた。開始および終了温度はそれぞれ６０℃および９７℃で、融解転移速度は０．０５℃／秒であった。次いで、融解曲線を、ＬＣＤＡ３．０を用いて分析した（融解ピークを、２．５℃に平均設定された度数を持つ多項フィティングスキームを用いて観察した）。構成成分Ｔｍ値を、−ｄＦ／ｄＴ対温度のソフトウェア発生プロットから手動で同定し、統計学的概説用にＥｘｃｅｌで作表した。
【０１０９】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉによる５Ｓ ｒＲＮＡ融解モニタリング
図１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下で、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を、０．０５℃／秒温度ランプに付すことによって得られた結果を示す。二つ組のラン（ｎ＝８）は、融解プロファイルの８つの特徴が反復可能であることを示唆する。融解プロファイルは、８１℃および８２℃間の低蛍光（−ｄＦ／ｄＴ）「谷」、および８２℃ないし９５℃の温度範囲のいくつかの異なる融解構成成分を含有する広い融解転移よりなる。低蛍光「谷」内に、小さなピークが、一般に、８１．７℃の平均Ｔｍと共に存在していた。蛍光谷下では、一貫した融解転移は観察されなかった。各ランに対応するＴｍ値は、表３に作表した。１つのケースで、８つのピークのうち２つは同定されなかった。ピーク２、５および６は、最も変動を示した。各ピークに対する平均Ｔｍ値および標準偏差は含まれる。ピーク５は、標準偏差０．６７℃と共に、Ｔｍ値で最高の変動を示した。平均ΔＴｍ値、または１つのピークおよび次のピーク間の温度差は、３．１°、１．１°、１．３°、１．２°、１．２°、１．５°、および１．４°であった。
【０１１０】
【表３】
表３．５Ｓ ｒＲＮＡ融解曲線内で見受けられる最も顕著な融解構成成分の温度の作表。ピーク数は、頂部の列に沿って示される。平均および標準偏差は、各ピークにつき与えられる。ピーク数５は、最大の変動を見せ、最初のピークは最小のピークを見せ、それぞれ標準偏差は、０．６７℃および０．３１℃であった。構成成分融解ピーク７および８は、ラン数８からは解読できなかった。試料を、６０ないし９７℃の範囲の０．０５℃／秒温度ランプに付した。ｒＲＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉおよびマグネシウム緩衝液の最終濃度は、それぞれ１．０ｍＭ、１：１５，０００原液希釈液、および１．０ｍＭ Ｍｇ＋２であった。
【０１１１】
天然５Ｓ ｒＲＮＡシステム論議
５Ｓ ｒＲＮＡ試料の分析からの予備結果は、８つの同定可能な構成成分または転移を持つ融解曲線プロファイルを得た。どのような可能な説明が存在するにしても、５Ｓ ｒＲＮＡ立体配座の特定の構成成分は、未だ、経験的または理論的に、個々の融解転移にリンクされていない。
【０１１２】
広範囲の生物体からの５Ｓ ｒＲＮＡセグメントの配列に関する詳細な情報および二次構造情報は、核酸関連のジャーナルおよびリボソームのオンラインデータベースで見つけることができる。基本的な、３ドメイン、二次元５Ｓ構造は、５つの二本鎖領域、２つのヘアピンループおよび３つの内部ループ（膨隆）よりなる(Brownleeら,Nature 215 (102): 735-736 (1967); De Rijk, 1992; Spechtら, 1997 ; Szymanskiら, 1997)。核酸セグメントの長さは、種から種で変動するが、一般的に、１２０塩基長である(Spechtら,1997; Szymanskiら, 1997)。いくつかの高頻度可変領域は、セグメントならびに１つのかなり保存された領域内に存在する。加えて、非−ワトソン−クリック相互作用は、しばしば、５Ｓ ｒＲＮＡ構造のＥ−ループ内に存在する(Browleeら,1967 ; Voetら,"Nucleic Acid Structure", In Fundamentals of Biochemistry, 初版, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999) pp.742-743)。標準塩基番号付けおよびヘアピンまたはループ同定は、Ｅ．ｃｏｌｉ標準に基づいている(Spechtら, 1997; Szymanskiら, 1997)。図１５は、ドメイン同定およびループ図案化を含むＥ．ｃｏｌｉ由来５Ｓ ｒＲＮＡの基本的な組織を示す。
【０１１３】
５Ｓ ｒＲＮＡ分子の二次構造および観察された融解プロファイルの間の直接的な相関関係は、すぐには明らかではない。図１３に示されるように、通常、５つの二本鎖セグメントのみが、５Ｓ配列で同定されるが、そこには融解プロファイルの８つの反復可能な構成成分がある。多くの方法で、さらなる３つの構成成分を説明することができるだろう。まず、試料汚染は常に可能性としてある。正確な単離手順は開示されておらず、第２当事者によって行われたため、試料は純粋であると仮定されているだけである。第２に、全ての融解構成成分は、二本鎖から一本鎖への転移を直接的に反映しないかもしれない。完全な５Ｓ立体配座は三次元であり、全ての構造転移は、厳密には二次構造に関係していないかもしれない。さらに、二本鎖から一本鎖への転移を直接的に反映しないさらなる融解構成成分の存在を認めれば、三次元転移への洞察の余地が出てくる。第三に、５Ｓ ｒＲＮＡ分子の２つの二本鎖領域（図１３で、２および３と標識されたセグメント）は、２つの部分に細分化することができ、それにより、５Ｓ分子内の７つの総二本鎖領域を増加させる。最後に、非−ワトソン−クリック相互作用は、しばしば、リボソームの第二次立体配座内で発見される(Brownleeら, 1967; Voetら, 1999)。いくつかのそのような非標準結合相互作用は、５Ｓ分子のＥ ループで同定されている(Voetら, 1999)。もし非標準相互作用がループであると考えられる領域内で起これば、ループ形成を表すさらなる融解ピークが観察されるだろう。
【０１１４】
三次影響の可能性に関して、三次元構造が温度の上昇と共に緩和し始めると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ結合部位の有効性が増加すると仮定するのが妥当である。より多くのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが、新たに暴露された５Ｓ分子の二本鎖ＤＮＡセグメントに結合すると、色素の蛍光は、代わりに、わずかに増加する。そうすると、実際に融解曲線の平面化を表す図１２で明白な低−ｄＦ／ｄＴ「谷」は、５Ｓ三次構造の初期緩和を表す。強度、異方性、寿命およびスペクトルといったフルオロフォアの特異的な性質を、核酸構造の異なる態様にリンクするVamosi and Clegg(1998)によって使用される技術を使用して、潜在的な三次影響を実証することができるだろう。加えて、Doktycz ら, 1990, SantaLucia, 1998, and Bonnetら, PNAS (USA) 96: 6171-6176 (1999)によって行われた複雑な数学的モデリングを適用することで、５Ｓ ｒＲＮＡ配列の熱融解の詳細を洞察することもできるだろう。
【０１１５】
潜在的な三次影響にも拘わらず、該三次影響が二次構造転移と重ならない限り、５つの二本鎖セグメントは観察可能なはずである。Molecular Probesは、核酸融解に際し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度の大きな減少を報告し(Haugland,1996)、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭが蛍光強度をモニターするため、融解プロファイルの主要な特徴は、５Ｓ ｒＲＮＡ分子内で二次構造融解転移を反映すると考えられる。
【０１１６】
先に論議したモデルオリゴヌクレオチドから、１つ以上のヘアピンの存在が、他のヘアピンのＴｍ値に影響を及ぼすことが発見された。モデルオリゴヌクレオチド論議で使用される同一の論議を用いて、５つの二本鎖セグメントのＴｍ値は、より高い温度にシフトする可能性が非常に高い。最長のモデルオリゴヌクレオチド（１８ｂｐ）は、７７．８℃で融解した。５Ｓシステムの最長の二本鎖領域は、１０ｂｐだけであるが、主要な蛍光変化が８６°および９４℃間で観察される。もし最も安定した二次転移の前にいずれかおよび全ての三次影響が起こると考えられるならば、図１２の８と標識されたピークは、最大の５Ｓヘアピンステムの融解を表すだろう。それならば、ピーク７ないし４は、二番目に大きなステムから最小のステムへ融解するステムを表すだろう。
【０１１７】
図１３に示されるごとく、β−ドメインのステムの両方は、ミスマッチを含有する。もしこれらのミスマッチがステム内のサブ−ドメインを識別するように作成されれば、５Ｓ ｒＲＮＡ融解プロファイルのさらなる解釈が示される。そうなると、ステム数２は１つのミスマッチによって分離された２ｂｐステムおよび６ｂｐステムよりなる。ステム数３は、２−塩基挿入によって分離された３ｂｐおよび４ｂｐステムに分けられる。潜在的な別々の融解ドメインの数は、全部で７つである。モデルオリゴヌクレオチドシステムは、３ｂｐステムの融解はモニターでき、５Ｓ ｒＲＮＡシステムのステムを、２ｂｐないし８ｂｐのサイズ範囲のより小さなサブユニットに分離することは適切ではないことを示した。もし非−ワトソン−クリック相互作用がＥループ内にあると考えられるなら、全ての８つの融解転移は説明できる。もしＥループ内の非−ワトソン−クリック相互作用がいずれの他の相互作用よりもより安定していないと考えるなら、８つの潜在的な異なる融解ドメインは存在する。そうなれば、Ｅループ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、８ｂｐおよび１９ｂｐステム内の非−ワトソン−クリック相互作用を含む解釈が可能であり、これは、それぞれ、８１．６℃、８４．８℃、８６．８℃、８７．５℃、８８．９℃、９０．２℃、９１．６℃および９３．１℃の融解転移に対応する。全ての８つの潜在的転移は、このように説明できるが、三次影響の影響は、不明瞭ではあるが、考慮されていない。
【０１１８】
決定された５Ｓ ｒＲＮＡ Ｔｍプロファイルの他の説明が可能である。５Ｓ構造の融解が進むにつれ、可変サイズのループが発生し、これは、付随するステムの安定性を変化させる。すなわち、融解システムは非常に複雑であり、上記略述通りには進行しないだろう。他方で、ステムをサブステムに分けることは、モデルオリゴヌクレオチドシステムによって得られた観察によって支持される。また、潜在的な解釈は、全ての立体配座転移は８０°および９５℃の間で起こると仮定するが、これは当てはまらないかもしれない。しかしながら、モデルオリゴヌクレオチドシステムからの結果は、５Ｓセグメントで見受けられるような複雑な二次組織内の二本鎖領域は高温度で融解する可能性を支持する。
【０１１９】
不明瞭ではあっても、どのように８つの融解転移が５Ｓ ｒＲＮＡ試料に関連するかに関して、予備結果が有用である。考慮すべき８つの異なる構成成分に対して、いくつかの生物体間の融解プロファイルの差異を観察する可能性が予測される。天然の二次構造のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ由来の結果を、濃色性または示差熱量測定（ＤＳＣ）といった他の方法に比較することによって、融解転移の仕組みへの洞察を得ることができるかもしれない。Doktyczら, 1990, Panerら, 1990, and Vamosi and Clegg, 1998によって使用された技術および数学的モデルを用いる５Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列の完全な熱力学的研究は、５Ｓセグメントの融解転移を完全に解明することができる。しかしながら、融解転移の裏にある正確な仕組みの詳細は、プロセスを使用して生物体を識別する前に決定する必要はない。１つの試料から次へと一定の差異が観察される限り、ＴｍおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる二次構造立体配座の分析を使用して、生物体を同定することができる。
【０１２０】
モデルシステムは、核酸の分子内の二次構造特徴を検出する可能性を示す際に、非常に強力なツールであることが証明された。５Ｓ ｒＲＮＡ融解プロファイルで示したごとく、天然に生じる配列は、この研究で使用されたモデルシステムよりも遙かに複雑である。リボソームＲＮＡ内二次構造の配列決定および同定に関して、多くの研究がなされてきた。例えば、１０１の膨隆またはヘアピンループが、Pseudomonas cepacia (Van Campら, 1993)から入手された２３ｓ ｒＲＮＡ分子で同定された。対照的に、５Ｓ ｒＲＮＡ構造は、５つの二本鎖領域、２つのヘアピンループおよび３つの内部ループ（膨隆）のみで構成されている(De Rijk, 1992; Szymanskiら, 1997)。いずれの場合も、天然に生じる二次構造の複雑さは計り知れない。しかしながら、これらの配列の殆どに、高度に保存された領域が存在し、これにより、ＳＳＣＰおよびリボタイピングといったアッセイによって、セグメント増幅のためにＰＣＲを用いて、生物体レベルにて、試料を識別することが可能になる。Van Campおよび同僚らは、いくつかの普遍的なプライマー部位を同定し、これを使用して、２３ｓ遺伝子内の高頻度可変領域を増幅することができる（1993）。Erik Avaniss-Aghajaniらは、リボタイピング技術を用いて、細菌タイピングのための「実質的に全ての細菌からのＳＳＵ（小さなサブユニット）ｒＲＮＡを増幅することが可能な」プライマー対を同定し、テストした（1994）。そのような領域は、ＳＳＣＰおよびリボタイピングといったアッセイに現在使用されており、ＴｍおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用する二次構造分析にも良いはずである。
【０１２１】
多くの細菌検体をタイプするのに使用可能な普遍的なプライマー部位を同定するために、多くの研究がなされてきた。恐らく、二次構造構成成分を含有する有益な高頻度可変領域の増幅に、５Ｓ ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡよりも、１６ｓおよび２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を現在研究している何人かの研究者によって設計された普遍的なプライマーの方が適しているだろう(Anthonyら, 2000; Rantakokoo-Jalavaら, 2000; Widjojoatmodjoら, 1994)。これらの研究グループによって行われた研究は、高頻度可変セグメント内に二次構造を含有する１６ｓおよび２３ｓ遺伝子内に、医学的に有意な領域を発見した。具体的には、Widjojoatmodjoによって行われた研究は、１０８ｂｐないし３００ｂｐの範囲の小さなアンプリコンサイズを持つＳＳＣＰによる良種タイピングを示す（1994）。本発明による分析用に、これらの同一領域から、一貫しているが区別可能な融解プロファイルが入手できる。
【符号の説明】
【０１２２】
１ 器具
２ 空気注入口
３ 円試料カルーセル
４ ステッパーモーター
５ チャンバーファン
６ オプティクス／フィルターアセンブリ
７ 試料
８ 反応チャンバー
９ ２４ブラスオフセットガイド
１０ 励起および収集オプティクス
１１ 高ワット数加熱コイル
１２ 青ＬＥＤ
１３ フォトダイオード
３０ 軸ファン
３１ 絶縁体
４０ アルミニウム冷却浴
４１ ブラスコネクター
４２ ブラスコネクター
４３ ゴム管
４４ ペルチエモジュール
４５ ヒートシンク
４６ 支柱
４７ ゴム吐出口管
４８ 標準蛍光モニタリング経路
６０ コンピューター
６２ ポンプ
６３ 圧縮機
６４ ペルチエモジュール
６５ 冷却管
６６ 冷却管
６７ 冷却管
６８ アルミニウム冷却浴
６９ 一方向チェック弁
７０ 一方向チェック弁
７１ １００Ｗ電力供給
９０ モジュール
９１ モジュール
９３ １２ボルト６−リード機械的リレー
９４ 低電力ＮＰＮトランジスタ
９５ トランジスタ
９３ リレーコイル
９７ 底部末端
９８ 電力供給
９９ 地面
１００ ダイオード
１０１ コンピューター
１０４ 高ワット数ＮＰＮトランジスタ
１０５ 作業増幅器
１０６ ０．１オームレジスタ
１０８ リレー制御
１０９ リレー制御
１１０ 冷却剤ポンプ
１１１ 空気圧縮機
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の同定および特徴付けならびにその修飾に関し、これを使用して、そのような核酸および／または表現型を含有する細胞および／または生物またはこれらの核酸またはそのような修飾と関連する疾患状態を同定することができる。
【背景技術】
【０００２】
核酸の二次構造への洞察は、突然変異検出および生物同定の強力なツールを得た。いくつかの分析用技術が開発され、これは１つの試料および次の試料の間に存在する異なる二次構造を活用する。これらの技術のいくつかは、一本鎖高次構造的多形性（ＳＳＣＰ）（Oritaら, PNAS(USA) 86: 2766-2770(1989))、ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）(Espejoら, Microbiology 144: 1611-1617(1998))、リボタイピング(Grimont and Grimont, Ann.lest.Pasteur Microbiol. 137B (2): 165-175 (1989))および産物融解温度（Ｔｍ）によるＰＣＲ後産物同定(Ririeら, Anal. Biochem. 245154-160(1997))を含む。
【０００３】
二次構造分析法は、核酸特徴の検出に焦点を合わせ、これは特定の配列がどのようにお互いと相互作用するかによるものである。１９８９年に、Oritaらは、単一の塩基対欠失または改変は、核酸ゲル電気泳動において明白な一本鎖高次構造的多形性によって検出可能であることを示した(Oritaら 1989)。実質的に、彼女は、主要な核酸配列における小さな差が、結果的に、二次構造立体配座にわずかな差をもたらし、これが電気泳動ゲルマトリックス内で異なって移動することを発見した。ＳＳＣＰ分析は、非常に感度が高く、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）方法よりもさらに特異的である(Oritaら 1989)。
【０００４】
ヘテロ二本鎖移動度アッセイまたはＨＭＡは、ＳＳＣＰに似ている。ＨＭＡでは、非−完全にマッチングしたＤＮＡ標的−プローブ二本鎖の電気泳動移動度がモニターされる(Espejoら, 1998)。標的−プローブ二本鎖内のミスマッチングは、二次構造に歪みを起こし、これは結果的に二本鎖の移動度変化を起こす。標的配列の差は、すなわち、電気泳動ゲルマトリックスにおける差動的産物移動によって明白になる(Espejoら, 1998)。
【０００５】
リボタイピングは、ゲル電気泳動によって観察されるリボソーム性核酸遺伝子制限パターンの同定である(Grimont and Grimont, 1989)。リボタイピングは、リボソームの偏在性質、核酸成分内で見受けられる高頻度可変領域および制限酵素の特異性を利用する。この方法では、保存領域によって隣接した高頻度可変領域を含有するｒＲＮＡの遺伝子コードが、ＰＣＲを用いて増幅され、生成されたＤＮＡは、続いて、酵素的に消化される。特異的な制限酵素は、高頻度可変領域内の制限部位に選択される。これらの酵素によるＤＮＡ開裂によって、結果的に、可変長のＤＮＡのセグメントが得られる。酵素的開裂に引き続いて、ＤＮＡ断片はゲル上に流され、分析される。すなわち、ＤＮＡセグメントの特定の組合せ（パターン）は、主要な配列の指標である。もし酵素が適切に選択されれば、各生物タイプは、制限断片のユニークな組合せを有するだろう(Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, Curr. Microbiol. 27 (3): 147-151 (1993))。
【０００６】
リボソーム核酸（ｒＲＮＡ）の配列は、高度に保存された領域によって囲まれた多くの高頻度可変領域を同定した(De Rijkら, Nuc. Acids Res. 20 (Supplement): 2075-2089 (1992); Edwardsら, Nuc. Acids Res., 17 (19): 7843-7853 (1989); Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, 1993)。実に、広範囲の生物からのＤＮＡを増幅することが可能な多くの普遍的な主要部位が同定され、ＳＳＣＰまたはリボタイピング分析用に適合された(Van Camp, 1993; Weisburgら, J. Bacteriol. 173 (2): 697-703(1991) ; Stubbsら, J. Clin. Microbiot 37 (2): 461-463 (1999); Anthonyら,J. Clin.Microbiol. 38 (2): 781-788 (2000);Rantakokko-Jalavaら, J. Clin. Microbiol. 38(1) : 32-39 (2000); Widjojoatmodjoら, J. Clin. Microbiol. 32 (12): 3002-3007 (1994))。これらのリサーチ群によって実施された研究は、高頻度可変領域セグメント内に二次構造を含有する１６ｓおよび２３ｓ遺伝子内に、医学的に有意な領域を発見した。Van Campおよび同僚らは、２３ｓ遺伝子内の高頻度可変領域を増幅するのに使用できるいくつかの普遍的な主要箇所を同定した（1993）。Widjojoatmodjoによって行われた研究は、１０８ｂｐないし３００ｂｐの範囲の小さなアンプリコンサイズを持つＳＳＣＰによる良好な種タイピングを示す（1994）。Erik Avaniss-Aghajaniらは、リボタイピング技術を用いて、細菌タイピング用の「実質的に全ての細菌からのＳＳＵ［小さなサブユニット］ｒＲＮＡを増幅することが可能な」主要な組を同定し、テストした(Biotechiques. 17(1):144-146,148-149(1994))。
【０００７】
上記した分析方法の各々において（ＳＳＣＰ、ＨＭＡおよびリボタイピング）、核酸配列は二次構造分析によって同定される。これらのプロセスのうち３つ全ては、配列変動に対して非常に敏感であり、これらを使用して、生物間に存在する核酸配列の差を同定することができる。しかしながら、アッセイは、全て、ゲル電気泳動によって決定され、リボタイピングは、酵素開裂のさらなる工程を必要とする。ゲル電気泳動および酵素開裂は、共に、時間を要する増幅後工程である。
【０００８】
核酸の二次構造的分析のもう１つの形態内の主要な配列変動は、二本鎖核酸融解特徴を観察することによって、明白になる。核酸の融解は、二本−らせん状態から一本鎖状態への高次構造的転移を指す。核酸鎖の半分が二本−らせん状態にあり、半分が「ランダムコイル」（一本鎖）状態にある温度は、融解温度（Ｔｍ）として定義される(Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465(1998))。すなわち、核酸鎖の所与の対のＴｍは、鎖結合に対する鎖の安定性の指標であり、鎖の相補性、配列長、ＧＣ含有量および環境状態によって決定される(Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998)。
【０００９】
核酸融解の分析は、多くの方法で達成された。核酸変性転移を観察および分析する方法は：示差熱量測定（ＤＳＣ）によって変性する時に、試料中のエンタルピー変化を測定し(Kulinskiら, Nucleic Acids Res. 19 (9): 2449- 2455 (1991); Panerら, Biopolymers 29: 1715-1734 (1990); Volkerら, Biopolymers 50: 303-318 (1999))、フルオロフォアの共有結合対の蛍光を測定し(Vamosi and Clegg, Biochemistry 37: 14300-14316 (1998))、次いで核酸の濃色性の変化をモニターすること(Haugland,"In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes", in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,dh ed. , Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) pp. 161-174)を含む。ＤＳＣは、化学薬品の純度を測定するのに最初に使用された技術である。プロセスは、化学反応または転移の間に進化または吸収された熱を測定する(Plato, Anal. Chem. 41 (2): 330-336 (1969))。核酸転移の理論的モデルの詳細な分析および発展は、ＤＳＣ技術を用いて、可能であった(Panerら, 1990)。Kulinskiは、ルピナス種子および麦芽から入手した２つの植物５Ｓ ｒＲＮＡの異なる融解プロファイルを、ＤＳＣを用いて観察した(Kulinski,1991）。残念ながら、光学的（濃色性）およびＤＳＣ分析は、両方とも、実質的な量の核酸を必要とし、分析は遅く、通常、一度につき、単一試料のみが研究できる。対のフルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー転移の測定は、Vamosi and Clegg (1998)に記載のごとく、二本鎖核酸の末端にて、フルオロフォアの共有結合を必要とし、その末端は、核酸が有効な測定用に二本鎖化される時、隣接していなければならない。
【００１０】
また、二本鎖核酸のＴｍ値は、核酸と合わせた二本鎖ＤＮＡ−特異的色素の蛍光をモニタリングすることによって観察できる(Wittwerら, 1996)。二本鎖−特異的色素は、核酸−結合フルオロフォアである。典型的には、これらの色素の蛍光は、二本鎖核酸に結合する時、増加する(Wittwerら, BioTechniques 22 : 176-181(1997))。Ririeらは、二本鎖核酸結合色素ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて、ＰＣＲ後産物を、融解曲線分析によって識別することが可能であることを示した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉは、優先的に、二本鎖核酸に結合する(Haugland, 1996)。
【００１１】
Ｔｍ分析のプロセスは、さらなるＰＣＲ後の取り扱いを必要としない。しかしながら、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉといった二本鎖ＤＮＡ−特異的色素を使用する本出願は、配列特異的ではなく、生物を１つのプライマー組で識別するのに使用されていなかった。さらに、これらの色素は、核酸の別々の相補的鎖の分析に使用されてきただけであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Oritaら, PNAS(USA) 86: 2766-2770(1989)
【非特許文献２】Espejoら, Microbiology 144: 1611-1617(1998)
【非特許文献３】Grimont and Grimont、Ann.lest.Pasteur Microbiol. 137B (2): 165-175 (1989)
【非特許文献４】Ririeら, Anal. Biochem. 245154-160(1997)
【非特許文献５】Grimont and Grimont, 1989; Van Camp, Curr. Microbiol. 27 (3): 147-151 (1993)
【非特許文献６】De Rijkら, Nuc. Acids Res. 20 (Supplement): 2075-2089 (1992)
【非特許文献７】Edwardsら, Nuc. Acids Res., 17 (19): 7843-7853 (1989)
【非特許文献８】Weisburgら, J. Bacteriol. 173 (2): 697-703(1991)
【非特許文献９】Stubbsら, J. Clin. Microbiot 37 (2): 461-463 (1999)
【非特許文献１０】Anthonyら,J. Clin.Microbiol. 38 (2): 781-788 (2000)
【非特許文献１１】Rantakokko-Jalavaら, J. Clin. Microbiol. 38(1) : 32-39 (2000)
【非特許文献１２】Widjojoatmodjoら, J. Clin. Microbiol. 32 (12): 3002-3007 (1994)
【非特許文献１３】Erik Avaniss-Aghajaniら、Biotechiques. 17(1):144-146,148-149(1994)
【非特許文献１４】Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465(1998)
【非特許文献１５】Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998
【非特許文献１６】Kulinskiら, Nucleic Acids Res. 19 (9): 2449- 2455 (1991)
【非特許文献１７】Panerら, Biopolymers 29: 1715-1734 (1990)
【非特許文献１８】Volkerら, Biopolymers 50: 303-318 (1999)
【非特許文献１９】Vamosi and Clegg, Biochemistry 37: 14300-14316 (1998))、
【非特許文献２０】Haugland,"In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes", in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,dh ed. , Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) pp. 161-174
【非特許文献２１】Plato, Anal. Chem. 41 (2): 330-336 (1969)
【非特許文献２２】Wittwerら, BioTechniques 22 : 176-181(1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これまでの議論に徴し、一本鎖核酸のより迅速かつ単純な分析方法への必要性が存在することは明らかである。そのような方法は、ＳＳＣＰおよびＨＭＡといった配列の変動を同定すること、リボタイピングのような生物をタイピングすることの両方に適用可能であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
先に従って、本発明は、核酸を特徴付ける方法を提供し、ここに核酸の一本鎖形態は、二本鎖核酸−特異的色素と合わせられ、該組合せは、可変温度に暴露されて、一本鎖核酸内で可逆的に形成される二本鎖二次構造に対する融解温度プロファイルを発生させる。
【００１５】
好ましい具体例において、二本鎖核酸−特異的色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、臭化プロピジウム、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＹＯ−ＰＲＯ−ＩおよびＹＯ−ＹＯ−Ｉよりなる群から選択される。
【００１６】
さらなる好ましい具体例において、１つの核酸の融解温度プロファイルは、第２の核酸の融解温度プロファイルと比較され、ここにプロファイルの差は、該第１および第２の核酸の間の配列の差を示す。
【００１７】
もう１つの好ましい具体例において、本発明は、核酸の突然変異の検出方法を提供する。この具体例において、一本鎖核酸試料の融解温度プロファイルは、二本鎖核酸−特異的色素を用いて決定され、核酸試料の融解温度プロファイルおよび野生型核酸融解温度プロファイルの差は、可逆的に二本鎖二次構造を形成することが可能な一本鎖核酸の１つ以上の領域内の核酸試料における１つ以上の突然変異の存在を示す。
【００１８】
さらに好ましい具体例において、本発明は、細胞の特異的型を同定する方法を提供する。この具体例において、細胞からの試料ｒＲＮＡ、またはその断片の融解温度プロファイルが、二本鎖核酸−特異的色素を用いて、決定される。次いで、プロファイルは、１つ以上の細胞につき、既知のｒＲＮＡプロファイルと比較され、マッチは、試料ｒＲＮＡは既知のｒＲＮＡ細胞型からのものであることを示す。そのような細胞は、動物細胞、細菌細胞、または植物細胞であってもよい。
【００１９】
もう１つの好ましい具体例において、一本鎖核酸は、増幅された遺伝子またはその断片から由来する。
【００２０】
さらに好ましい具体例において、増幅された試料ｒＲＮＡは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、増幅に基づく核酸配列（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、非対称的ＰＣＲ増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅よりなる群から選択される方法によって生成される。
【００２１】
さらなる好ましい具体例において、融解温度プロファイルの決定は、一本鎖核酸試料を二本鎖核酸−特異的色素と合わせて、色素および該核酸内に形成する１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し、温度を変動させる間に色素の蛍光発光を測定することによって、達成される。
【００２２】
本発明のもう１つの態様において、様々な蛍光色素が、二次構造検出につき同定される。これらの色素は、ＰＣＲ適用での使用につき最初に同定された。増幅の間または後のＤＮＡに関して、これらの「飽和色素」は、ＰＣＲの阻害を最小化しつつ、十分に飽和な状態にて存在可能である。例えば、最大のＰＣＲ−適合濃度にて、ｄｓＤＮＡ結合色素は、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する。他の具体例において、パーセント飽和は、少なくとも８０％であり、より具体的には、少なくとも９０％である。さらに他の具体例において、パーセント飽和は少なくとも９９％である。パーセント飽和は、飽和濃度の同じ色素の蛍光と比較したパーセント蛍光であり、つまり、ｄｓＤＮＡの先に決定された量の存在下で可能な最も高い傾向強度を提供する濃度であると理解されている。これらの色素は、特定の核酸反応と有意に干渉することなしに、有意により高い濃度にて存在することが可能であるため、これらの色素は、一本鎖核酸の立体配座をモニタリングするのに、特に有用であり得ると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、高速ＤＮＡ増幅およびＰＣＲおよび蛍光モニタリングによる分析に使用される標準の２色ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの構成要素を表す。器具（１）は、空気注入口（２）、円試料カルーセル（３）、ステッパーモーター（４）、チャンバーファン（５）、およびオプティクス／フィルターアセンブリ（６）よりなる。試料（７）を、ガラスキャピラリー内に置き、２４ブラスオフセットガイド（９）を持つ反応チャンバー（８）内に、垂直試料整列で維持する。ステッパーモーター（４）を使用して、試料カルーセル（３）を回転させ、試料（７）を励起および収集オプティクス（１０）上に置く。高ワット数加熱コイル（１１）および連続的気流を使用することによって、高速温度回転を達成する。チャンバーを通る空気の一般的な動きは、矢印によって示され、それはファン（５）の回転主導である。ガラスキャピラリーを使用することにより、試料（７）への熱転移速度が増加し、また、高められた蛍光モニタリングに対する総内部反射が得られる。次いで、反応混合物中に存在するフルオロフォアを励起させ、キャピラリーチップの落射によってモニターする。青ＬＥＤ（１２）は、励起に使用され、２つのフォトダイオード（１３）は、蛍光モニタリングに使用される。フィルターアセンブリ（６）は、示されたナノメーター切断を持つ２つの二色性（１４−１５）を含有して、蛍光発光を、データ収集用に、２つのチャンネルに分離する。
【図２】図２は、２４試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに施された小さなチャンバー修飾を示す図である。現在の試料配置および蛍光モニタリングシステムの整合性を維持するために、少しの修飾のみが望ましかった。標準加熱コイルおよび空気注入口パイプを除去し、元の放射状のチャンバーファンを、軸ファン（３０）で置き換えた。チャンバーファンへの電力を、半分減少させた。さらなる絶縁体（３１）を、反応チャンバーおよび試料カルーセル（わずかに陰影を付した領域）の全てのセクションに加えて、チャンバーの熱負荷を減少させた。
【図３】図３は、冷却上部ヒートシンク温度を維持するのに使用されるアルミニウム冷却浴（４０）の描写である。２つのブラスコネクター（４１−４２）（冷却浴の縁から延びている）を使用して、１０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ冷却剤を持つゴム管を接続する。冷却浴の縁から下方に延び、浴の底部に達しているのは、ゴム管（４３）の短いセクションであり、これにより、外部空気圧縮機を使用して、冷却浴のほぼ完全な排出が可能になった。接合の位置の直下（この図では見えない）のゴム管セクションの小さな穴によって、チャンバーを再度充填する際に、空気を逃がすことができる。冷却浴の底部から延びているのは、ペルチエモジュール（４４）および付随するヒートシンク（４５）である。４つのネジを使用して、下部ヒートシンクおよびペルチエモジュールを、浴の底部にしっかりと固定した。３つのネジを使用して、チャンバーを蓋で密閉した。
【図４】図４は修飾されたＬＣ２４器具の最終的な組織図である。付属するヒートシンク（４４）およびペルチエモジュール（４５）を持つ冷却浴（４０）を組み込むため、試料カルーセル（３）の頂部開口を広くし、支柱（４６）を付加して、冷却浴（４０）に対してカルーセルが回転できるようにした。ブラス冷却剤採取（４１）および吐出口取付具（４２）、ならびにチャンバー−冷却剤排出を可能にするためのチャンバー（４０）の底部に延びるゴム吐出口管（４３）が記される。下部ヒートシンク（４４）は、上部ヒートシンク（４７）と同一に機械化されたが、ファン（３０）を回転させるのに、いくつかのさらなる改変が必要であった。最終的な器具修飾は、完全に閉鎖され、冷凍状態を許容するよく絶縁されたシステムを作る。１つの外部調節されたペルチエモジュール（４５）は、活性冷却および加熱インプットの両方を供給する。チャンバー修飾は、標準蛍光モニタリング経路（４８）に全く影響を及ぼさなかった。
【図５】図５は、反応チャンバー温度を調節するのに使用される外部制御システムの基本的な構成成分の図である。１つのコンピューター（６０）、稼働中のＬａｂ Ｖｉｅｗ５．１(National Instruments)を使用して、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ制御ソフトウェアならびに新たなカスタム設計された制御エレクトロニクスを制御する。チャンバー温度フィードバックおよび制御回路は、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内で統合される。Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）からポンプ（６２）および圧縮機（６３）へと延びる黒い線は、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内の回路から生じる制御インプットを示す。制御ボックス（６１）の右底部から延びる二本の線は、ペルチエモジュール（６４）への電力インプットを表す。冷却管（６５−６７）は、ポンプ（６２）および圧縮機（６３）の両方から、アルミニウム冷却浴（６８）の頂部へ延びる線によって示される。２つの一方向チェック弁（圧縮機およびポンプから延びる管と線で繋がる小さな灰色の箱）（６９−７０）を使用して、適切な空気および液体冷却剤の流れる方向を維持した。Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘ（６１）内に配置された１つの１００Ｗ電力供給（７１）は、制御回路に電力を供給し、ならびにペルチエモジュール（６４）に主導電力を供給する。
【図６】図６は、チャンバー温度を制御するのに使用される制御回路の具体的な電子工学構成成分を示す。制御回路は３つのセクションに分けられる：モジュール（９０）を通る電流極性制御、モジュール（９１）への直線状電力調節および圧縮機−ポンプ調節（９２）。極性制御（９０）。ペルチエモジュール（示されていない）を通る電流極性（上部陰影を付した領域）は、１２ボルト６−リード機械的リレー（９３）の状態によって調節され、これは、低電力ＮＰＮトランジスタ（９４）の状態によって制御される。リード配置は、コイル活性化が、モジュール（示されていない）を通る電流方向を逆にするものである。リレーコイル（９３）活性化は、リレーリード配置を切り換え、ＮＰＮトランジスタ（９４）の底部末端（９７）にバイアスを導入することによって開始される。バイアスは、トランジスタ（９５）のコンダクタンスを増加させ、リレーコイル（９６）から地面（９９）への電力供給（９８）から回路を実質的に閉鎖する。１つのダイオード（１００）を使用して、リレーコイル（９６）（誘導的負荷）を活性化および不活性化させることによって発生する小さな電位からコンピューター（１０１）を保護する。それぞれ１ｋΩ（１０２）および２００Ω（１０３）のレジスタは、コンピューター（１０１）からの電力出力を減少させ、適切なトランジスタ（９５）およびリレーコイル（９６）活性化用の源電位を下げる。電力調節（９１）。ペルチエモジュール（９３）を通る電力調節は、電位−フィードバック配置の作業増幅器（１０５）と合わせて、高ワット数ＮＰＮトランジスタ（１０４）を使用する。（ＯＰアンプ（１０５）の陽性末端に接続された）コンピューター（１１２）からの最大アナログ−制御電位は２０ｋΩＰＯＴ（１０７）を用いる（可変レジスタ）（ＯＰアンプ（１０５）の陰性末端に接続された）０．１オームレジスタ（１０６）を横切る最大電位低下に整合される。このように接続されると、０．１オームレジスタ（１０６）を横切る電位低下がコンピューター発生制御電位に整合するまで、ＯＰアンプ（１０５）は、トランジスタ（１０４）の底部電位を調節する。すなわち、コンピューター出力は、ペルチエモジュール（９３）を通る電力を変調し、最終的にはチャンバー温度を変調する。さらなる制御（９２）。陰影を付した領域外の回路は、冷却剤ポンプ（１１０）および空気圧縮機（１１１）の活性を調節するリレー制御（１０８−１０９）を含む。両方のリレー（１０８−１０９）は、「シンク」配置に繋がれるか、あるいは偽論理を使用する。コンピューターボードからのより高いワット数出力は、シンク配置で可能である。
【図７】図７は、標準ＬＣ２４（ａ）、修飾されたＬＣ２４（ｃ）、およびＬＣ３２（ｄ）が４０℃ないし９０℃の標的温度ランプに従う能力を示す誤差対温度プロットを示す。個々のランプ速度は、修飾されたＬＣ２４につき、０．０５℃／秒であり、ＬＣ２４およびＬＣ３２につき、０．１℃／秒であった。誤差プロットは、いずれかの所与の時間の標的温度から実際のチャンバー温度を差し引き、次いで、標的温度に対して誤差シグナルをプロットすることによって作成された。３つの機械の間、修飾されたＬＣ２４は、より標的温度中心の誤差で最も良く実行した。ＬＣ２４およびＬＣ３２の両方は、標的温度から実質的に外れた。
【図８】図８は、正確な配列および使用された全１３のモデルオリゴヌクレオチドの提案された二次構造の両方の図である。対応する配列および右に与えられた構造のすぐ上に、特有の名前と共に、配列を左にリストする。左の配列の下の陰影を付された領域は、右のヘアピン形成に関与した配列を同定する。配列長は１０ヌクレオチドないし５６ヌクレオチドの範囲である。オリゴは、ヘアピン長によって名付けられ、また、テールまたはミスマッチといった修飾の存在を示す。９−１２ヘアピンと名付けられたオリゴは、９ｂｐおよび１２ｂｐの二本鎖領域を形成する２つのヘアピンを含有する。
【図９】図９は、Ｍｆｏｌｄソフトウェアによって計算されたごとく、モデルオリゴ（９−１２ヘアピン）を含有する２つのヘアピンの二次構造を示す。５’および３’端ならびにステム長が示される。www.mfold.burnet.edu.au/rna_formにてオンラインで入手可能なＭｆｏｌｄソフトウェアは、最も近い隣接計算によって、二次構造を予測する(SantaLucia,1998)。２０℃の所与の構造の遊離エネルギー計算は、図の直下で与えられる。
【図１０】図１０は、１３のモデルオリゴヌクレオチドの各々の代表的な融解曲線の編集を示す。この図では、蛍光の陰性誘導体は、温度に対してプロットされる。器具融解温度範囲は最小化されて、各配列の融解転移を強調するため、曲線は断片化される。オリゴヌクレオチドの各々につき収集された全てのデータポイントが含まれる。融解ピークは、１７．７℃ないし７８．６℃の範囲である。ミスマッチ、テールまたは複数のドメインを含まないオリゴヌクレオチドの典型的な融解曲線は、上方のプロット（ａ）で与えられる。ミスマッチ、テールおよび２つのヘアピンを持つオリゴを有するオリゴヌクレオチドから発生された曲線は、下方のプロット（ｂ）で与えられる。低温度へのＴｍシフトは、テールまたはミスマッチを有するヘアピンにつき、明白である。二本ヘアピンオリゴ内の９ｂｐおよび１２ｂｐのヘアピン（９−１２ヘアピン）の安定性は、下方のプロットで示される。
【図１１】図１１は、モデル核酸システムの各配列の平均Ｔｍ値の圧密を、ステムサイズによって示す。複数の集団が、テール、ミスマッチおよび複数の融解ドメインといった配列変動を有するステムサイズと共に見受けられる。すなわち、９−１２ヘアピンからのデータは、構成成分ステムサイズデータ（ステムサイズ９および１２）と共に含まれる。テール、ミスマッチまたは複数のステムを含まない平均Ｔｍ値は、丸で確認され、ここに、Ｔｍ値およびステムサイズの間の対数関係を計算するのに使用される。
【図１２】図１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光によって観察された単離された５Ｓ ｒＲＮＡの代表的な融解プロファイルを示す。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下で、７０ないし９６℃の０．０５℃／秒温度ランプに、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を付し、蛍光をモニタリングすることによって、融解データは収集された。図では、蛍光の陰性誘導体は、温度に対してプロットされる。８つの融解プロファイル構成成分が同定される。テスト（ｎ＝８）を繰り返すと、最大の変動を示す２、５および６と数を付けられたピークを持つ同様の結果を得た。使用された濃度は、１．０ｍＭ ＲＮＡ、ＳＹＢＲの１：１５，０００原液希釈液、および１．０ｍＭ Ｍｇ＋２緩衝液であった。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｉｌ ５Ｓ ｒＲＮＡセグメントの二次構造の図である。セグメントの二次構造は、特異的なループまたは大文字で標識されたヘアピンを持つアルファ、ベータおよびガンマに分けられる。太い数字を使用して、特異的な二本鎖セグメントを確認する。より小さい数字は、潜在的な、命名者−同定、サブ−ドメインを同定する。図１２に示される融解プロファイルの８つの観察された構成成分のうち７つは、このように、５Ｓセグメントをサブ−分割することによって説明できる。残りの融解転移は、内部Ｅループ内でしばしば起こる非−ワトソン−クリック相互作用の融解を反映するかもしれない。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、二本鎖の領域で現れる二次構造を有する一本鎖核酸の分析方法を提供する。一本鎖セグメントおよび二本鎖セグメントを含有する核酸分子は、二本鎖核酸セクションの各々につき、特異的な測定可能な融解温度またはＴｍを有するだろう。二本鎖セグメントの融解転移は、二本鎖核酸−特定的（ｄｓＮＡ−Ｓ）色素の蛍光強度をモニタリングすることによって決定可能であることを示すのは、本発明が最初である。さらに、もし二本鎖領域内に種−特異的配列変動が存在するならば、種−依存性融解プロファイルは入手可能であることを、本発明は示す。核酸融解転移をモニタリングすることによって二次構造分析を行うこの分析技術は、改変または突然変異核酸およびあまり改変されていない核酸またはあまり突然変異していない核酸といった非−同一核酸を識別することが可能である。リボソームＲＮＡといった種−特異的配列またはそれらをコードする遺伝子を有する相同的核酸を使用して、そのような核酸が採取される細胞の種を同定することができる。さらに、既知の技術に必須な通常の増幅後プロセスなしに、本発明を用いて、増幅された核酸を特徴付けることができる。
【００２５】
従って、本明細書中で提供されるのは、一本鎖核酸を特徴付ける方法である。この特徴付けは、核酸の環境温度の変化に応答して、一本鎖核酸の二次構造の変化をモニタリングすることを含む。さらに具体的には、該方法は、二本鎖または一本鎖核酸の二次高次構造から得られる明白な二本鎖領域の融解温度（Ｔｍ）を決定することを含む。二本鎖核酸−特異的色素を使用して、変動する温度に応答する二次構造のこれらの転移をモニターすることができる。理論に制限されることなしに、一本鎖核酸の異なるセグメント間の水素結合および他の非共有相互作用のため、二本鎖領域は、相補的およびほぼ相補的な領域間で、主にハイブリダイゼーションを介して形成する。上記記載のごとく、一本鎖核酸の二本鎖領域は、本明細書中で、「二本鎖二次構造」として呼ばれる。
【００２６】
広い意味で、本明細書中の「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に同等のものは、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の分析に影響されやすい核酸は、直線状配列の少なくとも２つの領域間で十分な相補性を有し、少なくとも１つの二本鎖二次構造を形成するのに十分な長さを有する。一般に、核酸は、天然に生じるヌクレオチドよりなる。しかしながら、当業者は、本発明はゲノムおよびｃＤＮＡ双方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドである核酸に適用可能であり、ここに核酸配列はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれかの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基のいずれかの組合せを含有する。本明細書中で使用されるごとく、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、およびアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾されたヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、非−天然に生じるアナログ構造を含む。すなわち、例えば、各々が塩基を含有するペプチド核酸配列の個々のユニットは、本明細書中で、ヌクレオシドと呼ばれる。
【００２７】
当業者は、例えば、ホスホルアミデート(Beaucageら, Tetrahedron 49(10) :1925(1993)およびその中の引用; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzlら, Eur.J. Biochem. 81 : 579 (1977); Letsingerら,Nucl. Acids Res. 14 : 3487(1986); Sawaiら, Chem. Lett. 805(1984), Letsingerら, J. Am. Chem.Soc. 110: 4470(1988);およびPauwelsら, Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Magら, Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991);および米国特許第５，６４４，０４８号)、ホスホロジチオエート(Briuら,J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989))、Ｏ−メチルホスホルアミデート結合(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)、およびペプチド核酸骨格および結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meierら, Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992);Nielsen, Nature, 365: 566 (1993);Carlssonら, Nature 380: 207 (1996)参照）,これら全ては引用によって組み込まれる)を含む代替の骨格を有する核酸アナログに、本発明は適用可能であることを理解するだろうが、本発明の核酸配列は、一般に、リン酸ジエステル結合を含有するだろう。本発明を使用して分析することができる他のアナログ核酸は、陽性の骨格（Denpcyら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995);非イオン性骨格(米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号; Kiedrowshiら, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsingerら, J. Am. Chem. Soc.110 : 4470(1988); Letsingerら, Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaekerら, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffsら, J.BiomolecularNMR 34 : 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))および米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook記載のものを含む非−リボース骨格を含む。また、１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸は、核酸の一つの定義内に含まれる(Jenkinsら, Chem. Soc. Rev. (1995)pp 169-176参照)。いくつかの核酸アナログは、Rawls, C & E News June 2,1997ページ35に記載されている。これらの引用の全ては、引用によって、ここに明白に組み込まれる。
【００２８】
当業者によって理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明における利用法を見つけるだろう。加えて、天然に生じる核酸およびアナログの混合物ならびに異なる核酸アナログの混合物、および天然に生じる核酸およびアナログの混合物は、本発明を用いて分析可能である。
【００２９】
本発明の好ましい具体例において、一本鎖核酸は、二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせられる。「組み合わせる」およびその文法的に同等のものによって意味されるのは、核酸および色素は、相互作用するように十分に近接されるということである。例えば、核酸および色素は、同じ溶液に、同時に、またはいずれかの順序で引き続いて添加されてもよい。特に下記の論議から当業者は認識するであろうごとく、例えば核酸が増幅産物である時、一本鎖核酸は、色素の存在下で生成される。また、本明細書中で使用するように、もう１つの成分の存在下での一方の成分の生成は、用語「組み合わせる」によって網羅される。
【００３０】
二本鎖核酸−特異的色素は、当該分野でよく知られている。一般に、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、好ましくは、二本鎖核酸と複合体化した存在下にある時に検出可能であるいずれかの物質である。典型的には、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、好ましくは、二本鎖核酸と結合されるか、あるいは複合体化されているだろう。
【００３１】
好ましくは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は蛍光色素であり、二本鎖核酸と複合体化された時のその蛍光特徴は、それがあまり複合体化されていない時から区別可能である。典型的には、二本鎖核酸と複合体化されている時の方がされていない時よりも、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、より強い（より大きい）蛍光シグナル（蛍光発光）を生成するだろう。しかしながら、二本鎖核酸に結合すると、そのような色素はより弱い（より小さい）蛍光シグナルを生成することがあり、あるいはそれらは、例えば異なる波長のシグナルといった異なる蛍光シグナルを生成するかもしれない。そのような区別可能なシグナルは本発明において有用である。
【００３２】
本明細書中に開示する方法で有用な色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、臭化プロピジウム、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０、Ｙ−ＰＲＯ（登録商標）−ＩおよびＹＯＹＯ（登録商標）−Ｉを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、the Molecular Probes (Eugene, OR) catalog Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 第８版(on CD-ROM, May,2001；引用によって、本明細書中に組み込まれる）のChapter 8は、本発明で使用可能な色素のホストをリストする。
【００３３】
また、飽和色素は、本発明の方法において使用可能である。多くの飽和色素は、シアニン族に属する。しかしながら、ｄｓＤＮＡ結合色素の他の族は有用であると考えられ、これはフェナントリジニウムインターカレーターおよびフェナントロリン系メタロインターカレーターを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法で有用なシアニン色素は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＧｒｅｅｎおよびＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯ ４３、ＳＹＴＯ ４４、ＳＹＴＯ ４５、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−１、およびＢＯＢＯ−３(分子プローブ)を含むが、これらに限定されるものではなく、これらは：
【化１】
［式中、
部位Ｙは、所望により置換された縮合単環式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し；
Ｘは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはＣ（ＣＨ３）２、およびＮＲ１よりなる群から選択され、ここにＲ１は水素またはＣ１−６アルキルである；
Ｒ２は所望により置換されたＣ１−６アルキル、または環式または非環式ヘテロ原子含有部位である］
として一般に記載されるピリジニウム核構造との非対称性シアニンのモノマーまたはダイマーである。例示的なヘテロ原子含有部位は、所望により置換されたヘテロアルキル、ヘテロシクリル、スルホネート、アミノ、カルボキシ、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、エステル、アミン、アミド、リン−酸素、およびリン−硫黄結合を含む。例示的なヘテロ原子含有部位は、米国特許第５，６５８，７５１号およびＷＯ００／６６６６４で論議され、これらは引用によって本明細書中に組み込まれる。
ｔ＝０または１であり；
ｚは０または１から選択される電荷であり、但し、ｚ＝ｔであり；
Ｒ３、Ｒ９、およびＲ１０は、独立して、水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎ＝０、１、または２であり；
Ｑは：
【化２】
［式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル（これらは全て所望により置換される）；他のヘテロ原子含有部位；ＢＲＩＤＧＥ−ＤＹＥ（ダイマーを含む）；および反応性基（これらは各々、所望により、第四級アンモニウムといった荷電基を含む）よりなる群から選択される］
よりなる構造の群から選択される芳香環である。ＢＲＩＤＧＥは、ＷＯ００／６６６６４で定義され、既に引用によって組み込まれている。ＤＹＥは、式Ｉの化合物である。立体異性体は、特記しない限り、シアニン色素構造の記載に含まれる。
【００３４】
本発明での使用に対して例示的な色素は、式Ｉのシアニン色素であり、これは、ピリジニウムまたはピリミジニウム核構造を有し、ここに部位Ｙは、所望により置換されたベンゼンを形成し、それにより、ベンザゾリウム環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝０または１であり；Ｒ２はメチルであり；Ｑは：
【化３】
よりなる構造の群から選択される芳香環であり、
好ましくは、Ｑは：
【化４】
［式中、
Ｒ４は水素、アルコキシ（例えばＯＭｅ）、アルキルチオ（例えばＳＭｅ）、またはヘテロシクロアルキル（例えばピペラジニル）、または荷電基（例えば４，４−ジメチルピペラジニウム−１−イル）を含むヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ５はＣ１−６アルキル、（例えばＭｅ）、またはフェニル、（ＣＨ２）３Ｎ＋（Ｍｅ）３、または（ＣＨ２）３Ｎ＋Ｍｅ２（ＣＨ２）３Ｎ＋Ｍｅ２（ＣＨ２）３であり、加えて、これは第２の４−ピリジニウムの窒素に結合しており、それにより、ダイマーを形成し、ここに第２のピリミジニウムは式Ｉの第２の化合物の部分であり；Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は水素である］
である。
【００３５】
ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯ １１、ＳＹＴＯ １３、ＳＹＴＯ １５、ＳＹＴＯ １６、ＳＹＴＯ ２０、ＳＹＴＯ ２３、ＴＯＴＯ−３、ＹＯＹＯ−３(Molecular Probes,Inc.)、ＧｅｌＳタール(Cambrex Bio ScienceRockland Inc., Rockland, ME)、およびチアゾールオレンジ(Aldrich)に限定されるものではないが、こういったキノリニウム核構造との非対称性シアニンもまた有用である。４−キノリニウム（式ＩＩとして下記に示す）または２−キノリニウムのいずれかが、ピリジニウムの代わりに分子の右部分を占有することを除いては、キノリニウム核構造は、ピリミジニウム系シアニンのそれと似ている。
【化５】
［式中、
部位Ｙは、所望により置換された縮合単式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し；
Ｘは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはＣ（ＣＨ３）２、およびＮＲ１から選択される基であり、ここにＲ１は水素またはＣ１−６アルキルである；
Ｒ２は所望により置換されたＣ１−６アルキルであり、あるいは環式または非環式ヘテロ原子含有部位である］
ｔ＝０または１であり；
ｚは０または１から選択される電荷であり、但し、ｚ＝ｔであり；
Ｒ３、Ｒ９、およびＲ１０は、独立して、水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
ｎ＝０、１、または２であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル（これら全ては所望により置換される）；他のヘテロ原子含有部位；および反応性基、（もしＲ４は１１５未満、より好ましくは１０５未満の分子量であるならば、これらは各々所望により第四級アンモニウムといった荷電基を含む）である。代わりに、Ｒ４、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は上記定義通りであり、式ＩＩの２つの化合物は一緒になって、ダイマーを形成し、ここに、もし色素がキノリニウムシアニンｎ＝１または２のダイマーであるならば、式ＩＩの各々の基Ｒ５は一緒になって、二価部位を形成する。
【００３６】
本発明における使用のための例示的な色素は、式ＩＩのシアニン色素を含み、ここに部位Ｙは所望により置換されたベンゼンを形成し、それにより、ベンザゾリウム環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝０または１であり；Ｒ２はメチルであり；
Ｒ４は水素、（Ｍｅといった）Ｃ１−６アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり；
Ｒ５は、（メチルのような）Ｃ１−６アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり；次いで
Ｒ８は水素であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は水素または（メトキシといった）アルコキシである。
また、本発明における使用のための例示的な色素は、例示的に、式ＩＩのシアニン色素を含み、ここに部位Ｙは、所望により置換された（１−メチルピリジニウムまたは３−ブロモ−１−メチルピリジニウムといった）複素環を形成し；Ｘは酸素または硫黄であり；ｎ＝０または１であり；ｔ＝ｚ＝０であり；
Ｒ４は水素、または（Ｍｅといった）Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ５は、（Ｍｅのような）Ｃ１−６アルキル、所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルまたは（基−（ＣＨ２）３Ｎ（Ｍｅ）３）といった）荷電基を含むヘテロアルキルであり；次いで
Ｒ８は水素であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は水素、（メチルのような）アルキル、または（メトキシのごとき）アルコキシである。
【００３７】
上記のシアニン色素は例示的なものであって、他のシアニン色素もまたここに記載される方法において有用であり得る。
【００３８】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを含むキノリニウム系非対称性シアニンのいくつかは、「飽和色素」の定義内に含まれていない。色素が、キノリニウム系シアニンのモノマーである時、キノロニウム環（Ｒ４と同等の位置）の窒素に隣接した炭素でのかさ高い置換は、色素が高飽和レベルで結合する能力を妨害する。かさ高い置換は、例えば、ＭＷ＝１５０より大きい脂肪族分岐で置換された長分岐ヘテロ−原子−含有脂肪族鎖または芳香族部位である。しかしながら、この制限は、先に言及したピリジニウムシアニンには適用しない。キノリニウム系シアニンダイマーの場合、（基−ＣＲ３（＝ＣＲ９−ＣＲ１０）ｎ＝によって決定される）左および右環系間の長さは、また、官能性を決定するようである。これらの色素は「飽和色素」の定義内に含まれず、特定の適用に適していないが、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉといった色素は、本開示の方法と適合する。
【００３９】
好ましい具体例において、一本鎖およびｄｓＮＡ−Ｓ色素の組合せは、結果的に、核酸内の色素および１つ以上の二本鎖二次構造間に検出可能な複合体を形成する。理論によって制限されることなしに言えば、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、二本鎖核酸に対して優先的な親和性を有し、しばしば核酸の二つの鎖の間に介入することによって、二本鎖核酸に結合、あるいはさもなければそれと連結する。色素および核酸の連結は、結果的に、二本鎖核酸とあまり連結していない色素から色素を識別する。すなわち、本明細書中で使用するごとく、「検出可能な複合体」は、二本鎖二次構造を意味し、ここに一本鎖核酸およびｄｓＮＡ−Ｓ色素は一緒になって、二本鎖二次構造と連結していないｄｓＮＡ−Ｓ色素から識別可能な複合体を形成する。
【００４０】
好ましくは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素は、蛍光色素である。好ましくは、検出は、ｄｓＮＡ−Ｓ色素からの蛍光発光の測定によるものである。一般的に、「励起」波長と呼ばれる特定の周波数または周波数のバンドへの露出に応答して、フルオロフォアは、特定の周波数または周波数のバンドにて、蛍光発光（フォトン発光）を生成する。本発明において、色素が検出可能な複合体にない時と区別することができる検出可能な複合体の二本鎖二次構造と連結する時に、各ｄｓＮＡ−Ｓ色素は蛍光発光を生成する。好ましくは、検出可能な複合体の色素の発光は、発光の強さおよび／または発光のスペクトル含有量によって区別できる。いくつかの場合、色素は検出可能な複合体内にない場合、実質的に全く蛍光発光を有しない。典型的には、色素の発光は、検出可能な複合体内にある時により大きい（より強い）が；しかしながら、検出可能な複合体の形成は、いくつかの色素の発光を減少させ、および／または、発光のスペクトル含有量を改変する。
【００４１】
蛍光ｄｓＮＡ−Ｓ色素のごとき、フルオロフォアからの蛍光発光（ルミネセンス）の測定は、当該分野でよく知られている。典型的には、励起照明はフルオロフォアを含有する試料に提供され、関心のある周波数または周波数バンドは、１つ以上のフィルターおよび光学検出器、たとえばフォトダイオードを用いて測定される。
【００４２】
本発明の好ましい具体例において、分析下にある一本鎖核酸の温度は変動する。「温度を変動させる」によって意味されるのは、温度を上昇させるおよび／または減少させることである。好ましい具体例において、一本鎖核酸は、１つ以上のその二本鎖二次構造の融解温度（下記定義される）以下の温度にて提供され、二本鎖二次構造のＴｍを超える温度まで上昇される。核酸試料の温度を変動させる多くの手段は、当該分野で知られ、入手可能である。
【００４３】
本発明の好ましい具体例において、変動が起こる間の温度は、約１０°および１００℃であり、より好ましくは約２０°および９５℃であり、さらにより好ましくは約３０°および９５℃である。
【００４４】
好ましい具体例において、一本鎖核酸の温度は、約０．００５°および０．０５℃／秒間、より好ましくは０．００１°および０．１℃／秒間、よりさらに好ましくは約０．０００１°および１℃／秒間の率にて変動する。特に好ましい具体例において、一本鎖核酸の温度は約０．０１℃／秒またはそれ未満の率にて変動する。
【００４５】
好ましい具体例において、一本鎖核酸の１つ以上の二本鎖二次構造の融解温度（Ｔｍ）は、決定される。一般に、核酸の融解は、二重らせん状態から一本鎖状態への高次的転移を指す。核酸鎖の半分が二重らせん状態にあり、半分が「ランダムコイル」（一本鎖）状態にある際の温度は、融解温度として定義される(Santa Lucia, PNAS(USA) 95: 1460-1465 (1998))。すなわち、核酸鎖の所与の対のＴｍは、鎖結合に対する鎖の安定性の指標であり、鎖の相補性、配列長、ＧＣ含有量および環境状態によって決定される(Lewin, GenesV, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126 ; SantaLucia,1998)。本明細書中で使用されるごとく、一本鎖核酸の二本鎖二次構造に関して、二本鎖二次構造を形成した一本鎖核酸の２つのセグメントの解離のため、「融解温度」、「Ｔｍ」およびその文法的同等物は、試料の一本鎖核酸の約半分が二本鎖二次構造よりなり、約半分はそうではない時の温度を意味する。
【００４６】
発明の背景のセクションで論議したように、核酸の融解温度を決定する多くの方法は、当該分野で知られている。好ましい具体例において、一本鎖核酸の二本鎖二次構造のＴｍは、核酸の温度を変動させる間に、一本鎖核酸と合わせたｄｓＮＡ−Ｓ色素の蛍光発光をモニタリングすることによって決定される。所与の温度または制限された温度範囲での蛍光発光の変化は、二本鎖二次構造の融解温度を示す。
【００４７】
当業者は理解するように、一般に、いずれかの二本鎖核酸構造の融解は、制限された温度範囲にわたり、同様の核酸の集団の実質的な集団で起こり、典型的には、該核酸のＴｍの近似値にて、融解（最速の移動）のピークを迎えるだろう。すなわち、蛍光発光の変化のそのようなピークを使用して、二本鎖二次構造に対するＴｍを計算することができる。
【００４８】
さらに、１つ以上の二本鎖二次構造を有するいずれかの一本鎖核酸は、特徴的なＴｍプロファイルを提供するだろう。「Ｔｍプロファイル」によって、「融解温度プロファイル」、およびその文法的同等物は、二本鎖二次構造を有する一本鎖核酸の相対的量の記載を意味する。好ましい具体例において、Ｔｍプロファイルは、ｄｓＮＡ−Ｓ色素の蛍光発光を測定することによって発生されて、二本鎖二次構造を持つ検出可能な複合体に組み込まれた色素の量を示し、すなわち、二本鎖高次構造にある一本鎖核酸の量を示す。
【００４９】
融解温度プロファイルは、Ｔに対して−ｄＦ／ｄＴをプロットすることによって図示的に表され、ここにｄＦは測定された蛍光発光の変化であり、ｄＴは、核酸の温度の変化であり、Ｔは核酸の温度である。そのような図示的表示は、融解温度を示しつつ、蛍光の最速の変化が起こる温度でのピークを見せるだろう。
【００５０】
二本鎖二次構造のＴｍにつき分析される一本鎖核酸は、細胞または組織資料からの核酸のようないずれかの源からの主要な試料の部分であるか、あるいはそれから単離されたものである。核酸は、合成核酸であってもよい。また、分析される核酸は、核酸増幅産物であってもよい。もちろん、増幅される核酸は、天然に生じる源あるいは合成された源のいずれからでも入手できる。
【００５１】
「核酸増幅産物」、「増幅産物」、「増幅核酸」およびその文法的同等物は、核酸増幅方法の産物を意味し、これによって、初期の核酸のコピーが作成される。当業者は、核酸を増幅する多くの入手可能な方法が存在することを理解するだろう。恐らく、最も人気のある方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である(ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにSaikiら, Science 230: 1350-1354 (1985)およびGyllenstenら, PNAS (USA) 85: 7652-7656 (1985)参照)。ＰＣＲ方法の好ましいバリエーションは、非対称性ＰＣＲである(例えば、Maoら, Biotechniques 27 (4): 674-678 (1999); Lehbeinら, Electrophoresis 19 (8-9): 1381-1384 (1998); Lazaroら, Molec. Cell. Probes 6 (5): 357-359 (1992);および米国特許第６，１９７，４９９号参照)。他の増幅方法は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）(Walkerら, Nuc. Acids Res. 20 (7): 1691-1696 (1992)、ならびに米国特許第５，７４４，３１１号、同第５，６４８，２１１号および同第５，６３１，１４７号参照)、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）(ＰＣＴ公報ＷＯ９７／１９１９３参照)、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）(Compton, Nature 350: 91-92 (1991) ;ならびに米国特許第５，４０９，８１８号および同第５，５５４，５２７号参照)、転写媒介増幅（ＴＭＡ）(Kwohら, PNAS (USA) 86: 1173-1177(1989)ならびに米国特許第５，３９９，４９１号参照)、自己持続性配列複製（３ＳＲ）(Guatelliら,PNAS(USA) 87: 1874-1879 (1990)参照）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＡ）(米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，７９２，６０７号参照)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
１つの好ましい具体例において、分析される核酸は、細胞または組織試料から入手されたかあるいは単離された天然に生じる核酸である。もう１つの好ましい具体例において、核酸は増幅された核酸である。後者の具体例において、好ましくは、増幅された核酸はＰＣＲの産物であり、より好ましくは、非対称性ＰＣＲの産物である。
【００５３】
本発明は、多くの利用法がある。例えば、Ｔｍプロファイルを使用して、一本鎖核酸を特徴付けることができる。次いで、そのような特徴付けを使用して、異なる一本鎖核酸を比較することが可能である。２つの核酸のＴｍプロファイルの差異は、２つの核酸が異なる配列を有することを示す。２つの核酸間の配列の差異の同定は、多くの利用法がある。
【００５４】
１つの具体例において、試料核酸の配列の改変は、試料核酸のＴｍプロファイルを、既知の配列を有する核酸のそれと比較することによって、検出可能である。例えば、通常または鎖細胞のゲノムからの既知の配列の核酸のＴｍプロファイルは決定され得る。同一の細胞型の試料からの同様の核酸のＴｍプロファイルは決定され得る。通常／標準細胞からの核酸および試料からの核酸のＴｍプロファイル間の差異は、試料からの核酸の対立形質の変動または突然変異を示す。さらに、もし既知の配列変動のプロファイルが決定されたならば、試料からの核酸のＴｍプロファイルは、通常／標準核酸からの差異の性質を示す。この技術を用いて、個人は、特定の対立遺伝子につきタイプされ得、あるいは特定の突然変異体によって引き起こされる疾患につきスクリーンされ得る。
【００５５】
細胞からの核酸試料のＴｍプロファイル決定に対するもう１つの使用法は、どの細胞の種型から試料が得られたかの決定である。そのような決定につき特に有用なのは、リボソームＲＮＡであり、あるいは、好ましくは、ＤＡコーディングリボソームＲＮＡの増幅された領域である。発明の背景セクションで論議したごとく、高頻度可変領域は種−特異的であるため、リボソームの配列の高度に保存された領域によって囲まれた多くの高頻度可変領域が同定されてきた。保存された領域に基づくプライマーは、リボタイピング技術用に、そのような高頻度可変領域を特異的に増幅するように開発された。本発明を同様の方法で使用して、試料中のリボソーム核酸のセグメント（例えば、エンドヌクレアーゼ消化断片）を増幅させ、そのような増幅産物に対するＴｍプロファイルを決定することによって、核酸試料が入手された細胞をタイプすることができる。Ｔｍプロファイルを、既知の種からの同様の核酸セグメントからのＴｍプロファイルと比較すると、試料が入手された種がわかる。これらの方法を使用して、例えば、感染の原因を同定、あるいは感染性細胞種の存在を同定することが可能である。
【００５６】
本発明は、多くの分野で利用法があり、これは、遺伝学、免疫学、感染性疾患、腫瘍学、疫学および法医学を含むが、これらに限定されるものではない。そのような使用は、腫瘍原性物質の突然変異を同定すること、遺伝性の遺伝病を同定すること、およびそのような疾患の治療を導くことを含むが、これらに限定されるものではない。加えて、本発明を使用して、対立遺伝子変異体を同定し、生物学的試料の源を同定し、および父性を決定することが可能である。
【００５７】
当業者には、本発明の多くの他の適用が可能であることが明白であろう。本明細書中に引用する全ての文献は、それらの全文において組み込まれる。
【００５８】
次の実施例は、例示的な目的のために提供される。これらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するようなものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：２０℃ないし１００℃の範囲で、試料温度の生成に対して蛍光検出能力を有する高速熱サイクリングデバイスの修飾
その蛍光モニタリング能力および小試料容量のため、本明細書中に記載する実験用の選択器具として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ(Idaho Technologies, Idaho Falls, ID)を選択した。しかしながら、核酸の融解温度に関する文献の概説は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの標準の範囲である４０℃ないし１００℃よりも広い範囲の温度が必要であろうことを示唆している。例えば、リボソーム遺伝子内の二重−らせん領域の標準の長さは、約３ｂｐないし２０ｂｐの範囲であると知られていた（(De Rijkら, 前掲; Gutellら, Nucleic Acids Res. 21 (13) :3055-3074 (1993); Spechtら, Nucleic Acids Res. 25(1) :96-97(1997) ; Szymanskiら, Nucleic Acids Res. 28(1) :166-167 (2000))。Kulinksiら(1991)は、麦芽およびルピナス種子の両方からの５Ｓ ｒＲＮＡ試料は３００および３４０Ｋ（２７°および６７℃）間の観察可能な転移を有し、非常に特徴的な融解転移プロファイルが、２つの検体につき観察されることを発見した。Panerらは、４ｂｐループを持つ６ｂｐステムを含有するヘアピンにつき、５５℃中心の転移を報告している（1990）。VamosiおよびCleggは、８ｂｐないし２０ｂｐのステムサイズの範囲にあるヘアピンにつき、２０°ないし７１℃の融解範囲を記録している（1998）。Volkerおよび同僚らによって行われた研究は、２００ｂｐプラスミドの活性をモニターし、短い内部セグメントは、７５℃および９５℃の間で融解することが判明している（1999）。これらの研究群によって使用された温度転移速度は、通常、６０℃／時間（＜０．０１７℃／秒）未満であった。この情報に基づき、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの温度調節を修飾して、３℃ほどの低温度を達成し、０．０１℃／秒に近い転移速度を達成した。
【００６０】
先に修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭシステムは、「高速温度調節を持つマイクロボリュームマルチサンプル蛍光光度計」である(Wittwerら, 1997)。基本的な熱サイクリングデバイスは、米国特許第５，４５５，１７５号および同第５，９３５，５２２号に詳細に記載され、これらは全文において、本明細書中に組み込まれる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭに似たデバイスは、同時係属米国特許第０９／６５１，３７４号に記載され、これもまた本明細書中に組み込まれる。
【００６１】
図１は、熱サイクリングおよび増幅産物分析用に使用される作用器具の基本的な構成要素の全てを示す。温度サイクリングは、調節可能な高−ワット数加熱コイルおよび連続的気流によって可能になる。器具を囲む空気は、チャンバー内部で見受けられる放射状のファンの作用によってチャンバー内に吸い込まれ続ける。それがチャンバーの頂部を出るまで、ファンの回転は、中心から外側および上側に空気を押す。空気の外側への動きは、チャンバーの中心に低圧力領域を起こし、これは空気を、加熱コイルを横切ってチャンバーへと吸い込ませる。また、円状気流パターンが、チャンバー内部で確立される。反応試料は、小さな試料ホルダー内で含有され、チャンバー内部の熱環境に曝される。チャンバー内部の高速循環空気は、個々の試料ホルダー内へあるいはその外へと、熱移動を増加させ、ＰＣＲ反応としてのそのような適用のために使用する高速熱サイクリングを可能にする。試料の増幅反応および産物分析の間の産物蓄積のモニタリングは、ステッパーモーターで励起および収光オプティックス上方で試料を回転させ、蛍光核酸色素を取り込むことによって可能になる。核酸色素用の励起源としての青色ＬＥＤ機能および励起およびシグナル収集は、同一の経路（近軸向き）に沿って起こる。
【００６２】
図１は、２つのフォトダイオードを使用して、出力シグナルを収集する二色取得の可能性を持つＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭを示す。２つの二色性を使用して、それぞれ５０５ｎｍおよび５６０ｎｍにてカットオフで、色分離を達成する。試料回転経路の内側のチャンバーに置かれた熱電対は、温度フィードバックをコントローラーに供給する。温度、ステッパーモーター、ファン速度、および蛍光データ取得は、ＬａｂＶｉｅｗ−ｂａｓｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ(National Instruments, Austin, TX)を用いて調節される。
【００６３】
修飾されていないチャンバーは、主に、試料−含有ガラスキャピラリーを保持するための２４−真鍮差込を持つ陽極酸化されたアルミニウムで構成される（図１参照）。絶縁体は、チャンバーの内部の全側面に並ぶ（図１−チャンバーの内部に並ぶ絶縁体を灰色で陰影を付ける）。計測手段修飾は、チャンバー修飾、および温度調節修飾に分けられる。蛍光モニタリングに使用する通常の光学経路を再構築する必要を避けるため、チャンバー修飾は最小化された。通常のシステムへの修飾は、チャンバーの内部および外部へのさらなる絶縁強化、ペルチエ冷却／加熱デバイスの利用、試料カルーセルの頂部開口への寸法的調整、さらなる軸受けの組み込み、冷却剤浴組み込みおよびファン修飾を含んだ。特定の修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭは、標準の２４−試料熱サイクラー（ＬＣ２４）であった。
【００６４】
チャンバー修飾
高速熱移動率を持つ現在のチャンバーデザインを、ガラスキャピラリーに利用するために、小さな修飾のみが、反応チャンバーに行われた。上記のごとく、さらなる絶縁体をチャンバーの内部および外部に加えた。最も重要なことには、新たな絶縁体を、試料カルーセルの上部に配置して、真鍮差込を介するチャンバーへの熱の高速移動を減少させた。また、さらなる絶縁体を、試料チャンバーの側面に付けた。標準の放射状のチャンバーファンを、軸ファンで置き換えて、ファンモーターへの力を半分に減少させた。図２は、標準加熱コイルの取出および他のチャンバー調整を示す。
【００６５】
温度制御修飾
変化を最小化するために、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの加熱体として、冷却／加熱源を同一の位置に置いた。システムモデリングから得られる推定されるチャンバー性質を使用して、ワット数出力および寸法に基づいて、ペルチエ冷却／加熱モジュールを選択した(Melcor Materials Electronic Products Corporation, Trenton, New Jersey, Part #CP 1.0-127-05L-1）。２つのヒートシンク(Wakefield Engineering, Wakefield, MA, Part#698-100AB)を入手し、ペルチエモジュールと組合せて使用するために修飾した；モジュールの温かい側および冷たい側の両方につき、１つのヒートシンク。「熱い」ヒートシンクの連続的冷却との最適なペルチエ作動のため、連続した冷却流能力を持つアルミニウムの水浴または冷却浴も構築し、機械化した（図３参照）。上部ヒートシンクを、冷却チャンバー内に置き、下部ヒートシンクを、ペルチエモジュールから反応チャンバーへ延長した。冷却チャンバーに配置された上部ヒートシンクの最終的な形は、１．７５インチ（４．４ｃｍ）の底部直径および１．２インチ（３．０ｃｍ）の高さを持つ円柱状であった。底部ヒートシンクを同じ寸法に切ったが、フィンを修飾して、チャンバーへのヒートシンク浸透を最大化し、ファン回転させた。
【００６６】
試料カルーセルへの小さな修飾は、閉鎖したシステムを維持する間、ヒートシンクを伴う冷却浴の組み込みおよびカルーセル回転の両方を可能にするために必要であった。頂部開口を僅かに拡大させ、２．５”ＯＤ（２．０”ＩＤ）機械的軸受けを締め付けることによって、ペルチエモジュールについての回転を達成した(Kaydon Corp., Muskegon, MI)。機械的軸受けによって、試料カルーセルがその下を回転している間、アルミニウム冷却チャンバーを静置させておくことができた。
【００６７】
冷却浴を含むペルチエモジュール冷却／加熱システム
試料カルーセルへの熱入力を、６０Ｗ（３．９Ａ１５ボルト）ペルチエモジュール(Melcor Corp. Part # CP 1.0-127-051-1)、２つの修飾されたヒートシンク（上記で言及）およびカスタムデザインされた／カスタム形成されたアルミニウムの冷却浴で達成した。３ｃｍ平方ペルチエモジュールを、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面双方を通って、上部ヒートシンク中の４つの６−４０テーパー付きの穴へ延びる４つのネジで冷却浴の下面に締め付けた。ネジの締めが、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面の間にモジュールを拘束するような配置とした。熱ペースト(Melcor Corp. Part #TCE-001)を、各界面にて使用して、モジュールから下部ヒートシンクおよび冷却浴への熱移動を促進させた。上部ヒートシンクを、冷却浴に含めて、液体冷却剤に暴露される表面領域を拡大した。デジタル温度計(Physitemp Instruments, Inc.Clifton, NJ)によって読み取られる２つのさらなる熱電対を使用して、ペルチエモジュール性能をモニターした。１つを下部ヒートシンクに置き、他方を上部ヒートシンクの冷却浴内に置いた。両方の熱電対を、熱エポキシ(Melcor Corp. part#TCE-001)で、それぞれのヒートシンクに固定した。
【００６８】
３インチのアルミニウムバーストックから機械で作られた冷却浴は、カップ様冷却浴および蓋よりなる。蓋を３半インチ（１．７５ｃｍ）６−４０ネジで浴の上部に固定した。ゴム製ガスケットを、蓋および浴の間に置いて、接合部を水密にした。冷却浴の内部容量は（上部ヒートシンクなしで）８０ｍＬであった。１０％ＥｔＯＨ溶液を液体冷却剤として使用し、蓋にネジ止めされた２つの銅取付具に付着したゴム管を用いて、溜め内および外に送った。冷却循環を、冷凍および加熱能力を有する循環サーモスタット(Haake, Karlsruhe, Germany, #FK16)によって動かした。室温冷却剤流速は、約１４００ｍＬ／分であった。１０％エタノール溶液は、水の凝固点を約１０℃降下させた(Weast, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第６３版, CRC Press, Boca Raton, FL (1982) p.236)が、冷却剤が冷却されると、溶液は僅かにより粘稠性になり、流速は減少した。−１０℃の冷却温度では、流速は室温の大体半分であった。１つの銅取付具のルーメンから下には、ゴム管のセグメントがあり、これは外部空気圧縮機による自動冷却剤排出を可能にした。空気が密閉冷却チャンバーに押し出されると、液体は延長管を介して押し出された。管は、チャンバーの底部のすぐ上に達するため、冷却チャンバーのほぼ完全な放出は可能であった。銅取付具のすぐ下のゴム延長管の小さな穴によって、チャンバーを再充填する際に得られた空気を逃がすことができた。図４は、完全な冷却浴デザインおよび試料反応チャンバーへの組み込みを示す。また、ヒートシンクデザインも図４で示される。
【００６９】
温度調節修飾
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭによって使用される高ワット数パルス幅変調制御スキームは、ペルチエモジュールと不適合であるため、新たなペルチエモジュール加熱／冷却システムもまた、新たな調節システムを必要とした。結果的に、別々の電力供給およびリニアーコントローラーを構築し、システムに組み込んだ。図５は、修飾されたシステム内の各構成要素の関係を示す。Ｌａｂ Ｖｉｅｗを動かしているコンピューターを使用して、ポンプ活動、圧縮機活動、１００Ｗ電力供給からの電力出力およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ用の標準実行ソフトウェアを含む修飾されたシステムの全側面を制御した。図５に示されるごとく、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘは、各構成要素からコンピューターへの入力および出力を流すジャンパーステーションとして作動する。また、Ｐｏｗｅｒ Ｂｏｘは、システムの各構成要素の活動を媒介する電力供給および制御エレクトロニクスを収容する。具体的な制御構成要素は、ペルチエモジュールへの電力を調節するカスタム形成リニアーコントローラーおよび圧縮機および冷却剤ポンプの活動を制御する２つのソリッドステートリレー(Crydom Corp., San Diego,Cal., Part #DID07)を含む。リニアーコントローラーは、電流極性制御および電力制御セグメントよりなる。温度フィードバックは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ標準熱電対を介して起こる。
【００７０】
制御システムの各側面の詳細は、図６に図示する。図６内の陰影を付した領域は、電力極性を制御する際に使用される回路およびペルチエモジュールを介する電力−調節を示す。図６の上方の最も陰影を付した領域は、モジュールを介して電力極性を制御するのに使用される構成要素を示し、下方の陰影を付した領域は、使用された電力調節スキームを表す。陰影を付した領域の外の回路図は、空気圧縮機および冷却剤ポンプ用の制御経路を示す。１００Ｗ電力供給は、Ｌａｂ Ｖｉｅｗによって発生した制御電圧を除く全ての調節構成要素用の電源電圧である。脚注は、どの接地経路が使用されたかを特定する。調節回路の各セグメントは、下記で論議する。
【００７１】
極性制御は、１２Ｖ（２０ｍＡ）切換コイル（Matsushita Electric Works, Ltd. (Nais group), New Providence, New Jersey. Part #JW2SN-DC12VAJW7211)、１Ａシリコン整流器（ダイオード）（DigiKey Inc., Part #IN4007GICT-NDから入手可能)、低電力ＮＰＮトランジスタ（Digi-Key. Part #2Sd 1474-NDから入手可能）、１つの１−Ｋオームレジスタ、２００オームレジスタおよび１つの２２０ｍＦ５０ボルトコンデンサを持つ５Ａ６ピンリレーを含む。２００−オームレジスタは、リレーコイルを通って、１４Ｖないし１０．５Ｖまで電圧を段階的に下げ、１Ｋオームレジスタは、Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの電流出力を制限する。リレー制御コイルは、誘起電荷であるため、ダイオードを使用して、コイル活性解除に起因するいずれの電流からもコンピューター回路を保護する。リレーの右側への配線は、電流方向を、コイル活性と相関するように変化させることができ、左側の配線は、コイル活性化制御を示す。
【００７２】
６ピン、２状態リレーによって、電流方向は、リレーを通じて一定の極性を維持しつつ、モジュールを介して変化させることができる。例示するために、もし図６で示すごとくリレーのデフォルトのリード配置に従うならば、正電圧はモジュールの赤リードによって見られ、リレーを横切る電圧降下は、赤リードおよび黒リードの間に起こる。次いで、ペルチエモジュールからの負の黒ワイヤは、電力トランジスタに接続されたリードに接続される。もしリード配置が、コイル活性化によって変化すれば、正電圧はモジュールの黒リードにそれが接続されているリレー（灰色ワイヤ）の底面に切り換えられる。次いで、デフォルトケースの逆極性（方向）のモジュールを通って電圧降下が起こる。ペルチエモジュールから（今は赤ワイヤを通って）戻る電圧は、電力トランジスタに接続されたリードに直接切り換えられる。このように、ペルチエモジュール用の電力調節トランジスタは、モジュールを通る電流の方向に拘わらず、常に、同じ電流極性を見るであろう。
【００７３】
リレーのコイル活性化は、次の通り制御した。（Ｖｓ（１４ｖ）と標識された）電源電圧ピンからＬａｂ Ｖｉｅｗ接地へ通過することができる電力量、またはリレー内の制御コイルを通る電力は、ＮＰＮトランジスタの状態によって調節した。デジタル制御ピン＃４７によって、トランジスタゲートにて導入された５Ｖバイアスは、トランジスタのコンダクタンスを上昇させ、全電力がリレーコイルを通り抜けることを可能にする。コイルを通過する電流は、磁場を作り出し、これを使用して、リレーの内部リード立体配置を変化させ、これは代わりにペルチエモジュールを通る電流の方向を変化させる。ピン＃４７にて、制御電位をゼロまで降下させると、トランジスタのコンダクタンスは通常まで戻り、制御コイルを通る電力は停止し、リレーリード立体配置は通常の状態に戻る。不活性化の際に調節コイルによって発生するいずれの電圧も、ダイオードの作用によって制御回路に入ることはできない。
【００７４】
ペルチエモジュール電力調節は、高電圧適用、ＯＰアンプ（作動増幅器)(Analog Devices Inc., Norwood, MA. Part#AD5941)、１つの２０ｋオームＰＯＴ（可変レジスタ）、１つの２００オームレジスタ、１つの０．１オームレジスタおよび１つの０．１ｍＦコンデンサ用に構築された１つのＮＰＮパナソニック電力トランジスタ(Panasonic, Secaucus, NJ. Part#2SD 1474)を含む。システムを設計して、ペルチエモジュールに伝達される電力に対する電圧調節直線状制御を得る。第１に、ＯＰアンプを用いてトランジスタの非線形性質を説明し、第２に、０．１オームレジスタを横切る電圧への正ＯＰアンプターミナルで見られる最大電圧をマッチングさせることによって、線形電力調節は可能になる。もしペルチエモジュールから流れる最大電流は、４Ａ（実際の最大電流は、製造者によって示される通り、３．９である）であると仮定するならば、０．１オームレジスタを横切る最大電圧降下は、オームの法則に従い、０．４Ｖ（オームの法則：Ｖ＝ＩＲ）になるだろう。Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの最大電圧出力は、１０Ｖであるため、ＰＯＴは８００に設定され、１９２００オームは、ＰＯＴの中心ピンに接続されたＯＰアンプの正ターミナルと並んで配置される。再びオームの法則に従い、２０，０００オームの全抵抗を持つＰＯＴを通して１０Ｖにて、０．０００５アンペアが回路を流れる。次いで、個々の電圧降下は、０．４Ｖ（８００ｘ０．０００５）および９．６Ｖ（１９２０００ｘ０．０００５）になるだろう。この配置で、Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの制御電圧が０および１０Ｖ間で変動する時、ＯＰアンプは電力−トランジスタのゲートバイアスを変化させ、（Ｌａｂ Ｖｉｅｗからの）入力制御電圧をマッチさせる試みにおけるそのコンダクタンスを０．１−オームレジスタを横切っての電圧降下に変化させる。結果的に、ペルチエモジュールを介する電力は、トランジスタのコンダクタンス状態によって調節され、これは、ＯＰアンプの正ターミナルにて、電圧によって調節される。ペルチエ活性から得られるチャンバー温度変動がＬａｂ Ｖｉｅｗ系コントローラーへフィードバックされる時に、完全に閉じたループ状のシステムが形成される。
【００７５】
２つのさらなる制御経路を使用して、モジュール性能にも影響を及ぼす空気圧縮機および冷却剤ポンプの活性を制御する。空気圧縮機の活性化は、アルミニウム冷却剤ポンプを排出し、ポンプは連続的な冷却剤循環を供給する。冷却剤循環は上部ヒートシンクを冷却剤の温度に非常に近い状態で維持しつつ、チャンバーを排出することによって、上部ヒートシンクの温度を上昇させることができる。２つのチェック弁（一方向弁、United States Plastic Corp., Lima, Ohio. Part#22294)を、圧縮機およびポンプの両方のすぐ後に置いて、空気および液体流の適切な方向の維持を確保する。「シンク」配置の２つのさらなるＬａｂ Ｖｉｅｗデジタル出力ピンを使用して、２つの固体状態リレーをスイッチして、圧縮機または水ポンプをつけたり消したりした。１つのＤＣ／ＡＣ固体状態リレー(Continental Industries Inc., Mesa, AR#AC-DC-108-000)を使用して、水ポンプを壁電流と接続させて、ＤＣ／ＡＣ(Crydom. Part #D1D07)リレーを使用して、空気圧縮機の制御回路内のさらなるリレーを活性化させた（空気圧縮機は、このように、コンピューター制御用に構築された）。シンク配置において、１つのターミナルに５Ｖ電源電圧を接続し、他方にデジタル制御電圧を接続することによって、リレーを制御した。デジタル制御電圧が５Ｖから０Ｖに降下する時、５Ｖ降下が制御ターミナルを横切って存在し、リレーは活性化される。この配置によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉ／Ｏボード(National Instruments Corp., 1995)からのより高いワット数出力が可能になる。
【００７６】
器具の性能の決定
性能評価を、標準の２４試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＬＣ２４）、３２試料ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＬＣ３２）、および修飾されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ｍｏｄＬＣ２４）について、設定温度ランプを実施し、結果を比較することによって達成した。器具は、０．１℃／秒（０．０５℃／秒の速度を、ｍｏｄＬＣ２４につき使用した）の温度転移速度にて、４０℃ないし９０℃まで、チャンバー温度を上昇させるものであった。記録された温度追跡を、誤差シグナルに変換し、グラフ化して、標的温度ランプについての温度変動を示した。いずれの時間間隔での標的温度も、０．１℃／秒または０．０５℃／秒の勾配を持つ開始および終了温度（それぞれ４０°および９０℃）を通る線によって表される。いずれかの所与の時間の標的温度を、実際のチャンバー温度から差し引くことにより、誤差シグナルを読み取ることができる。この誤差シグナルを記して、各機械の性能を実施した。最大および最小の誤差読み取りの間の差異を計算することによって決定された全体的な変動（ランの全時間スケールにわたる）、および局所的な最大および最小によって決定される局所的変動（小さな時間スケール、〜１０秒）を比較して、温度制御性能を決定した。
【００７７】
修飾されたＬＣ２４の構築の間、新たな軸ファンのファン速度を最適化した。ペルチエモジュールを横切る全電力および一定の冷却剤循環率を維持しつつ、ファンモーターでＰＯＴを連続して挿入することによって、最適化を実施した。１分後、チャンバーの温度を、ＰＯＴを横切る電流電圧降下と共に記録した。１分後に最も低いチャンバー温度を与えた可変レジスタを横切る電圧降下を記録した。
【００７８】
器具の性能結果
ファンの稼働あるなしで、同等の回路モデルのＭａｔＬａｂ計算を行った。チャンバーの熱負荷は、（それぞれ、ファンあるなしで）６．１ワットおよび４．８ワットであることがわかった。システムの全熱負荷計算を、さらなる内部および外部絶縁体で反復した（上部および側面のみ）。さらなる絶縁体を計算して、システムの損失を、ファン作動あるなしで、それぞれ３．６および３．１ワットまで減少させた。
【００７９】
修飾されたＬＣ２４の精度および精密度は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ２４（ＬＣ２４）機械の標準の温度制御より４倍ほど良いことがわかった。２つの機械からの誤差信号の図示表現は、図７に示す通りである。ピークからピークの全体的および局所的変動は、ＬＣ２４においてより不正確であった。ＬＣ２４の最大記録誤差は、標的温度から３℃以上ずれていることが観察されたが、修飾されたＬＣ２４機械は、標的の０．２℃以内に温度を維持した。より重要なことに、ｍｏｄＬＣ２４およびＬＣ２４の局所的変動（１０秒未満の小さな時間スケール）は、それぞれ０．３２℃および１．３℃であった。２つの機械の観察された性能の作表は、表１の通りである。全誤差シグナルの標準偏差ならびに最大および最小誤差の標準偏差が示されている。また、表１には、器具の全体の温度範囲および各機械に対する可能なランプ速度が含まれる。
【００８０】
【表１】
表１．器具性能データの作表。時間特異的誤差データを、図７記載の方法で計算し、それを使用して、最後の５欄に示したデータを発生させた。第２欄および第３欄は、各機械につき、各々、最も遅い可能なランプ速度および正常作動温度をリストする。具体的な機械を最も左の欄に示す。全ての３つの機械は、４０℃ないし９０℃の温度ランプに従い、標準ＬＣ２４、修飾ＬＣ２４およびＬＣ３２で用いたそれぞれの各ランプ速度は、０．１℃／秒、０．０５℃／秒、および０．１℃／秒であった。
【００８１】
ＬＣ２４への修飾は、システムの熱安定性ならびに器具の温度範囲を上昇させた。標準の２４ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの稼働中の温度範囲は、４０°および１００℃の間であった。修飾されたＬＣ２４内のペルチエモジュールによる能動的冷却は、より低い温度範囲を、約４０℃ないし０℃減少させた。温度上限は他の機械より１０℃低かった。１０℃未満のチャンバー温度は、０℃未満の冷却剤温度を必要とし、８０℃を超えるチャンバー温度は６０℃を超える冷却剤温度を必要とした。すなわち、温度極端は、ペルチエモジュールのワット数およびモジュールの可能なΔＴによって決定された。温度範囲の極端および軸ファンへの最適電力伝達（標準のＬＣ２４ファン電力の５０％）にて、絶対的下部ヒートシンク温度は、常に、絶対的チャンバー温度を少なくとも１５度超えた。いずれの冷却剤温度においても、上部および下部ヒートシンクを通して観察された最大持続ΔＴは、約４５℃であった。
【００８２】
器具使用論議
試料チャンバーを閉鎖システムに変換することにより、修飾されたＬＣ２４の温度制御性能が４倍増加する。標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ配置において、チャンバー内からの空気は、チャンバーファンの作用によって、連続して、上部空気弁から押し出され、新たな空気は連続して、注入管からチャンバーへ入る。すなわち、適切なチャンバー温度制御は、それが丁度チャンバーよりも優れた加熱体を素速く通るにつれて入ってくる空気の加熱、およびチャンバーファンによるチャンバー空気の適切な混合に依存する。入ってくる空気は迅速に加熱コイルを通過し、入ってくる空気の非−均質の温度に至るため、混合は必要である。すなわち、高速ファン速度は、入ってくる空気を適切に混合するのに必要である。また、熱移動速度は、空気の速度によって決まるため(Hagen, Heat Transfer with Applications, 第一版, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ (1999))、高速ファン速度は、熱移動速度を試料キャピラリへと上昇させる。すなわち、高速温度循環は可能であり、結果的に、ＰＣＲ反応の多くの循環は、比較的短い時間間隔で起こり得る。しかしながら、ファン速度および空気流が増加するにつれ、対照表面（加熱体）上の空気暴露時間は減少し、入ってくる空気量のより大きい温度差が存在するだろう。加熱された、入ってくる空気は、より少なく、より均質性に乏しいため、より多くの混合およびより高速のファン速度が必要になる。また、より短い加熱体暴露時間は、小さい時間間隔で適切な電力調整を行うためにより精密なコントローラー精度を必要とする。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭの製造者らは、高速ファン速度に対する最適な調節スキームを発見することに大きな関心を寄せてきた。また、器具のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭラインは、特に、迅速な温度循環のために構築されたものであり、温度移動を遅くするためのものではないことは記されるべきである。
【００８３】
システムを閉鎖し、試料チャンバーに新たな空気を連続導入しないことによって、低電力加熱／冷却エレメントおよびより遅いファン速度を用いることにより、均質な環境を試料チャンバー内に維持することが可能である。混合する時間を増加させ、対照表面（下部ヒートシンク）への空気の露出時間を増加させることにより、システムの閉鎖によって、より厳密な温度調節が得られる。混合する時間を増加させることによって、非常に小容量の空気の収集というよりも１つのヒートマスといったような対照表面温度の変化に、チャンバーを応答させる。チャンバー空気は、１つのマスのように動き、対照表面上の温度変化にゆっくりと応答する。次いで、システムは、緩慢にのみ応答することができ、より緩慢な速度およびより良い熱安定度が、システムの特徴になる。
【００８４】
０°および９０℃の範囲のチャンバー反応温度は、ペルチエモジュールおよびより緩慢なファン速度によって実現する。記載する制御スキームを用いて、ペルチエモジュールを横切る極性を変化させることによって、能動的な冷却および加熱が可能である。ファン速度を減少させることにより、チャンバーの壁を通るシステムの熱損失は減少され、それにより、低ワット数温度調節スキームは、依然として、所望のチャンバー状態を達成することができる。ＬＣ２４のより高いファン速度は、加熱エレメントから空気への熱移動速度だけではなく、チャンバーの壁を通る熱移動速度も増加させる。
【００８５】
２つのヒートシンクにわたって維持される最大ΔＴ、および下部ヒートシンクおよびチャンバー温度間の温度差といった個々のシステム構成要素の測定された温度から、システムの実際の熱的性質が洞察される。下部ヒートシン温度クおよび最大電力出力でのチャンバー温度の間の観察された１５℃の差は、対照表面（下部ヒートシンク）からの熱移動およびチャンバーの壁を通るそれの間のバランスを表す。２つのヒートシンクにわたり観察された４５℃のΔＴは、ペルチエモジュールワット数、上部ヒートシンクから液体冷却剤への熱移動速度およびアルミニウム冷却浴の壁を通る熱負荷によって決定される。
【００８６】
所望により、温度範囲の増加は、現在のシステムのカップル態様を変化させることによって達成できる。温度範囲強化は、チャンバー壁を通る熱移動を減少させ、かつ対照表面（下部および上部ヒートシンク）からの熱移動を増加させることにより、ペルチエモジュール特徴（サイズ、ワット数、ΔＴ）を増加させることによって達成できる。チャンバーに加えられたさらなる絶縁体は、チャンバーの壁を通る熱移動を減少させようという試みであった。チャンバー内の気流を増加させる（より速いファン速度）ことが、チャンバー壁を通る熱移動速度よりも対照表面からの熱移動速度により大きな影響を及ぼす地点まで、絶縁体を増加させることが可能かもしれない。また、下部ヒートシンクを通るより定方向の気流は、ヒートシンクからチャンバーへの熱移動を増加させるが、チャンバーの壁に沿った気流は大して増加させない。放射状のファンから軸ファンへ変化させて、下部ヒートシンクを通る気流を増加させようと試みた。
【００８７】
また、冷却流速を増加させることで、上部ヒートシンクからの熱移動を増加させることによって、ペルチエモジュール性能を改善することができる。冷却剤浴内のより速い流速は、試料チャンバー内の流速を増加させるのと同じシステム効果を持ち；上部ヒートシンクから冷却剤への熱移動速度は増加するだろう。上部ヒートシンク温度が冷却剤温度により近づくと、２つのヒートシンクを横切る潜在的なΔＴを上昇させることによって、冷却移動速度に対してより良い上部ヒートシンクは、ペルチエモジュールの性能を増加させるだろう。しかしながら、冷却浴の壁を通る熱移動速度もまた上昇し、これは、モジュールの性能を減少させる傾向にある。従って、絶縁体もまた、冷却浴の外側に置かれた。
【００８８】
実施例２：二次構造融解曲線および複数のドメイン融解の実証
モデルオリゴヌクレオチドシステムは、（１）二本鎖ＤＮＡ特異的核酸色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を実証し、（２）経験的に、二次構造融解温度範囲を決定し、（３）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を用いて、複数ドメイン融解を実証し、（４）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて、二次構造の配列特異的融解を実証するように設計された。核酸の複数ドメイン融解は、示差走査熱分析(Kulinski, 1991; Panerら, 1990)を使用し、光学吸収度(Volkerら, 1999)を使用し、ならびに共有結合したフルオロフォア(Vamosi and Clegg, 1998; Volkerら, 1999)をモニタリングすることによって先に報告されているが、複数ドメイン融解決定は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉといった二本鎖核酸−特異的色素を用いては示されていない。
【００８９】
モデルオリゴヌクレオチドデザイン
１３の特異的に設計されたモデル核酸オリゴヌクレオチドを、ＩＴ Ｂｉｏｃｈｅｍ(Salt Lake City, UT)による標準高速促進ホスホルアミダイト化学を用いて、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ８９０９ ＭＯＳＳ合成器(Framingham, MA)で合成した。合成後、各オリゴヌクレオチドを、標準脱保護および脱塩条件で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。１３のオリゴヌクレオチドの各々は、３塩基対（ｂｐ）ないし１８ｂｐの可変長のループおよびステム中に４つのヌクレオチドを有する少なくとも１つのヘアピンを含有した（図８参照）。ステム長が９の塩基対およびそれより短いものに対するループ配列は、全て同一であった（−ＡＡＡＡ−）。９を超えるステム長に対するループ配列は、全て−ＴＣＣＴ−であった。全てのステムにおいて、一定のＧＣ含有量を維持しようと努力したが、ステム配列は完全には同一ではなかった。全てのオリゴヌクレオチドの平均的なＧＣ含有量は、約４８％であった。図８は、各オリゴヌクレオチドおよびそれらの提唱された二次構造に対する特異的な配列を示す。１３の配列から、２つのオリゴヌクレオチドは、ステム配列内にミスマッチを含有し、２つは二次構造（テール）内に組み込まれていないさらなる塩基を有し、１つは異なるステム長（９ｂｐおよび１２ｂｐ）を持つ複数のヘアピンを含有する。合成に引き続いて、全てのオリゴヌクレオチドを、１ｘＴＥ’（０．０１Ｍ ＥＤＴＡによる１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣＬの１：１００希釈）中に再懸濁し、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ２０００分光光度計(Pharmacia Biotech, Cambridge, England)を用いて、２６０／２８０の割合を取った。配列は既知であったため、核酸濃度を、まず、核酸の公開された光学性質(Borer,"Nucleic Acids", In Handbook of biochemistry and Molecular Biology, 第三版, (Fasman, ed.) CRC Press, Boca Raton, FL (1975) p.589)およびカスタム設計されたソフトウェア(CTWTool-2-18-00, Carl T. Wittwer, University of Utah, SLC, UT)を用いて、各オリゴヌクレオチドにつき、吸光係数を計算することによって、決定した。二次構造立体配座を、２０℃および１Ｍ ＮａＣｌの２つのヌクレオチド構造−予測ソフトウェアパッケージ、Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ(Sci-ed Software, Durham, NC)およびＭｆｏｌｄ(Dr. M. Zuker, Washington University Medical School, St. Louis, MO)を用いて確認した。Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒは、Ｍｆｏｌｄが同定した２つのヘアピン構造を同定することができなかった。図９は、Ｍｆｏｌｄによって計算されたように、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドの得られた構造を示す。
【００９０】
アッセイ最適化
将来のＰＣＲ後反応状態を見越して、各反応は、ＰＣＲ緩衝液(IT Biochem: ５０ｍＭ「透明」緩衝液)内に、ＤＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを含有した。３つの構成成分に対して最適化ランを実施した。まず、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩおよびＤＮＡ濃度の範囲を調べ、引き続いて、緩衝液濃度の範囲を調べた。融解ピークおよびピークの相対的なシグナル対ノイズ比（またはピークの標準偏差）両方の存在を、最適濃度を決定する基準として使用した。標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭデータ分析ソフトウェア(LCDA 3.0, Idaho Technology Inc, SLC, UT)を用いて、観察された融解ピークの標準偏差を計算した。
【００９１】
最初の最適化ランを、３２の試料ホルダーを持つＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭを用いて、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドで実施して、最適化プロセスを促進させた。複数ドメイン融解を調べるために最適化されたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＤＮＡおよび緩衝液の最終濃度は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ(Molecular Probes, Eugene, OR, Part #S-7567)の１：２０，０００原液希釈液、０．１ｍＭのＤＮＡ、および５０ｍＭ透明ＰＣＲ緩衝液の１：５０原液希釈液（最終構成成分濃度：５ｍＭ トリス、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および１．０ｍＭ Ｍｇ２＋）であった。９ｂｐより短いステムを含有する試料につき、最終ＤＮＡ濃度は、１．０ｍＭから３．５ｍＭへと変更されて、ステムループ蛍光を増加させた。アッセイ最適化に従い、１３のモデルオリゴヌクレオチドのうち１２（６の反復で実行）を、各オリゴヌクレオチドの融解転移温度辺りに標的した温度範囲で修飾されたＬＣ２４を用いて、０．０５℃／秒温度ランプに付した。ＬＣ３２を使用して、２つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドからデータを収集した。得られたデータを、標準ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ分析ソフトウェア(LCDA 3.0)を用いて分析し、Ｔｍ値を作表した。また、平均および標準偏差計算を含むＴｍ値を基本的な統計学的に分析した。
【００９２】
モデルオリゴシステム結果
平均Ｔｍ、標準偏差、およびデルタＴｍ値（ステム配列変動またはオリゴヌクレオチドデザイン差異により、Ｔｍはシフトする）を含む１３のオリゴヌクレオチドの各々からの結果は、表２の通りである。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、２つの左の欄で確認される。Ｔｍ１欄の値は、平均Ｔｍ値であり、各オリゴに対するｎは、右に示されている。融解温度に対する標準偏差は、標準偏差下で示される。２つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。ＬＣ３２で得られた９ないし１２のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたＬＣ２４を用いて入手した。
【００９３】
【表２】
*は、３７ｂｐテールの存在を示す。
**は、ヘアピンステム内の１つのミスマッチの存在を示す。
表２．モデルオリゴシステムからの結果の表化。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、２つの左欄で確認される。Ｔｍ１欄の値は、平均Ｔｍ値であり、各オリゴに対するｎは、右に示されている。融解温度の標準偏差は、標準偏差下で示される．２つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。ＬＣ３２で得られた９ないし１２のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたＬＣ２４を用いて入手した。
【００９４】
融解ピーク値は、１７．７°から７８℃の範囲であり、Ｔｍ値はステムサイズと共に増加する（図１０参照）。ステム配列および配列長一貫性の変動は、異なるＴｍ値を与える。１３のオリゴヌクレオチドの各々に対する融解曲線の編集は、図１０ａおよび１０ｂにある。図１０ａは、ミスマッチ、テールおよび複数のドメインを含まないオリゴヌクレオチドの典型的な融解曲線を与える。ミスマッチ、テールおよび複数のドメインを含有するオリゴヌクレオチドの融解曲線は、図１０ｂに示される。特異的なオリゴヌクレオチドに対応する曲線は、脚注で示される。一般に、バックグラウンドを超える融解ピーク高は、ヘアピンステム長と共に増加する（図１０ａ参照）。しかしながら、１２ｂｐヘアピンステムを含有する合成オリゴヌクレオチドのピーク高は、あまり顕著ではなく、３ｂｐまたは４ｂｐのステムを持つヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドに似ていた。
【００９５】
ステムサイズ対Ｔｍの関係をよりはっきりと視覚化するため、各オリゴヌクレオチドの平均Ｔｍ値を、ステムサイズに対してプロットした（図１１）。ミスマッチ、テールまたは二重ステムを持つオリゴヌクレオチドを除いて、ステムサイズおよび生成物Ｔｍ間の関係は、対数関係
ｙ＝３２．２８７ｌｎ（ｘ）−９．０３１８
［式中、ｙは℃で生成物Ｔｍを表し、ｘは塩基対（ｂｐ）のステムサイズである］によって（Ｒ２＝０．９１４）で最も適切に示される。最も適合した対数式は、マイクロソフトのＥｘｃｅｌによって実行された最小二乗計算によって決定された。図１１は、計算された傾向ラインおよびＲ２値を含む生成物Ｔｍおよびステムサイズ間の関係を示す。
【００９６】
１２ｂｐステムおよび１５ｂｐステムは、上記の対数関係によって予測されたようには融解しなかった。１２ｂｐヘアピンは、１５ｂｐステムよりも、０．４℃高く（平均Ｔｍ値）融解した。１２ｂｐおよび１５ｂｐヘアピンの標準偏差は、それぞれ、０．７８℃および０．３℃であった。９ｂｐおよび１２ｂｐサイズにて、Ｔｍ値の４つの集団が観察された。２つの融解ピークが、９ｂｐおよび１２ｂｐのステムサイズを持つ複数のヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドから観察された。９ｂｐに対応する融解ピークは９ｂｐヘアピン融解のみと比較すると、＋８．４℃（プラスまたはマイナス１．５℃）シフトした。複数のヘアピンオリゴヌクレオチドの中で、１２ｂｐに対応する融解ピークは、＋２℃Ｔｍシフト（プラスまたはマイナス０．６℃）を示した。９ｂｐステムおよび１２ｂｐステムのミスマッチは、それぞれ−１４℃および−１５℃のＴｍシフトを与えた。「テール」の存在、９ｂｐステムおよび１２ｂｐステムから延びているステム構造に関与していない３７の塩基は、それぞれ−８．１℃および−２．２℃のＴｍシフトを与えた。
【００９７】
モデルオリゴシステム論議
モデルシステムを設計して、下記の目的を各々達成した。
１．二本鎖特異的核酸色素の蛍光活性をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を示す。
２．経験的に、二次構造融解温度範囲を決定する。
３．二本鎖特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示す。
４．二次構造の配列特異的融解を示す。
これらの目的の各々は、モデルシステムから得られた結果を用いて取り組むことができる。１つのＤＮＡ分子内に存在している二次構造は、二本鎖−特異的核酸色素蛍光をモニタリングすることによって検出可能であることを、モデルオリゴヌクレオチドシステムからの結果は示した。また、３ｂｐないし１８ｂｐのステム長範囲のヘアピンが融解した温度に関して、６０℃の温度範囲を決定した（１８°および７８℃の間）。ミスマッチまたはテールを含有するオリゴヌクレオチドに対して観察されたＴｍシフトによって明白になったように、Ｔｍ値は配列特有の形で変動した。最終的に、２つのヘアピンドメインを含有する合成オリゴヌクレオチドの融解は、２つの融解ピークを得、すなわち、二本鎖−特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示した。生成物Ｔｍの配列依存性ならびにＴｍのステムサイズへの依存性を示すこれらの結果は、Ｔｍの配列依存性に対する先に公開された結果と一致する(Kulinskiら 1991; Panerら, 1990; Ririeら, 1997; Vamosi and Clegg, 1998)。
【００９８】
Ｔｍによって生成物の長さを識別する能力は、ステムサイズが増加するにつれ減少する。図１１で記すように、生成物Ｔｍおよびステムサイズ間の関係を示す曲線の傾斜は、ステムサイズが増加するにつれ平らになる。明らかに、ステム長が増加すれば、ヘアピンステムに添加されたさらなる塩基対は、ヘアピンの安定性をあまり増加させない。しかしながら、関係が最大値に達するか、あるいは上昇し続けるかは、これらの結果からは決定できない。
【００９９】
他の核酸システムの概説およびリサーチは、たとえ長い二本鎖長においても、Ｔｍはステム長と共に変動することを示す。例えば、異なる長さのＰＣＲ生成物は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ(Ririeら, 1997)を用いるＴｍ分析によって識別可能であり、これはステムサイズを増加させることは、Ｔｍを増加させ続けるであろうことを示唆する。しかしながら、この研究は、二本鎖アンプリコンおよび生成物Ｔｍ値に対して行われ、すなわち、２つの別々の、しかし相補的なＤＮＡ鎖の融解を表す。モデルヘアピンシステム内で、二本鎖相互作用は、分子間とは対照的に、分子内である。ヘアピン内の２つの相補的なセグメントは、相補的な鎖をあまり時間をかけずに発見し、２つの相補的な鎖の濃度は効果的に増加する。例えば、Vamosi and Cleggは、３４ｂｐ分子間（つまり、２つの別々のＤＮＡ鎖の間の）相互作用は、２０ｂｐ分子内（ヘアピン）相互作用よりも、低い温度で融解することを観察した（1998）。言い換えれば、分子間システムからの結果（例えば、Ririeら,1997による研究）は、分子内システムに直接適用することができない。それならば、分子内システムにつき、ステムサイズおよびＴｍ間の関係を決定する最良の方法は、増加するサイズのステムを持つヘアピンを分析するか、他の分子内核酸研究から得られたデータを使用することである。
【０１００】
ステムサイズおよびＴｍ間の良い相関関係は、本研究で示される。相関関係の有効性は、部分的に、Ｒ２値によって示され、また記録されたＴｍ値の標準偏差によっても示される。ステムサイズおよびＴｍ間の計算された関係は、他のヘアピンのＴｍ値を推定する方法を提供する。
【０１０１】
高解像度ＬＣ３２を用いて、９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンの両方を含有するモデルオリゴヌクレオチドは、２つの融解ピークを得、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ分析によって、複数ドメイン融解を示した（図１２ｂ参照）。９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンのＴｍのシフトによって示されるように、同一分子内の複数のヘアピンの存在は、分子の全体的な安定性に影響を及ぼした。一旦融解すると、９ｂｐヘアピンは、テールセグメントと同様に作用し、１２ｂｐヘアピンの安定性を減少させると考えるだろうが、その代わりに、＋２．０℃Ｔｍシフトが観察された。９ｂｐヘアピンの観察された安定性は、＋８．４℃のＴｍシフトと共に増加した。この安定性の理由は不明である。１つの説明としては、一本鎖セグメントと比較して、より少ない熱運動がＤＮＡの二本鎖領域に存在していることかもしれない。図９に示すごとく、９ｂｐおよび１２ｂｐセグメントの両方が二本鎖立体配座にある時、二本鎖でないのは、短３ｂｐリンカーおよび２つの短３ｂｐテールしかない。
【０１０２】
結果的に、完全構造の熱運動を最小化して、９ｂｐセグメントを高温度にて融解させることによって、１２ｂｐヘアピンは、９ｂｐヘアピンを安定化させるかもしれない。これと同じ論理に従い、９ｂｐ断片が融解し、一本鎖になり、それにより分子の熱運動が増加する時、１２ｂｐヘアピンの安定性は減少し、よい低いＴｍが観察されるはずである。
【０１０３】
テールがシステムに対して持ち得る効果に関して、1990年にDoktyczらによって行われた研究(Biopolymers 30: 829-845)が関連している。示差走査熱分析を用いて、様々な配列の４ｂｐのダングリング末端（またはテール）は、一貫して、同一の配列の平滑末端（ダングリング末端なし）ヘアピンよりも高温度にて融解した。彼らはダングリング末端のヘアピンにつき、より高いＴｍ値を観察したが、このＴｍシフトは、ダングリング末端を持つヘアピンの融解転移の型の変化に起因する。彼らは、ダングリング末端の存在は、ヘアピンを完全な「全てそう、あるいは全くそうでない」といった形で融解させ（つまり、完全に二本鎖または完全に一本鎖）、該平滑末端ヘアピンは「全てそう、あるいは全くそうでない」モデルから逸脱すると議論する(Doktyczら, 1990)。すなわち、それが融解する時、より不安定な立体配座を介して通過するため、より低温度の転移は、平滑末端オリゴヌクレオチドで観察される。ダングリング末端を持つヘアピンにおいて、二本鎖から一本鎖への転移を引き起こすのに、より強い熱エネルギーまたはエンタルピーが実際に必要であった(Doktyczら, 1990)。従って、二本ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド内の３ｂｐテールの存在も、２つのヘアピンで観察されたより高い熱安定性に寄与するかもしれない。
【０１０４】
モデルシステムのテールを持つ全てのヘアピンは、Ｔｍ増加よりもむしろ実質的なＴｍ減少を経験したため、Doktyczの研究および本実施例に記載するモデルシステムからの観察の間に明白な矛盾が存在する。この矛盾は、注意深く取りかかる必要がある。Doktyczは、４つの塩基のダングリング末端（またはテール）を使用したが、モデルシステムのダングリング末端（１２−テールおよび９−テールオリゴヌクレオチド）は、３７塩基長であった。Doktyczシステムにおけるヘアピン安定性の度合いは、ダングリング末端の最初の塩基に密接に相関していた(Doktyczら, 1990)。モデルオリゴヌクレオチドシステムの３７塩基ダングリング末端をもって、最初の塩基のいずれの安定化効果も、長い非二本鎖配列の総エネルギーによって覆われるだろうと推論することができるだろう。しかしながら、３ｂｐテールは９ｂｐおよび１２ｂｐヘアピンの両方に存在するため、二本ヘアピンモデルオリゴヌクレオチドで観察された安定性は、Doktyczによる結論によって支持される。モデルシステムの長いテールのヘアピン不安定化効果は、エントロピー主導であると考えられ、これはDoktyczおよび他者の研究によって支持される(Doktyczら, 1990 ; Panerら, 1990 ; Rentzeperisら,Nucleic Acids Res. 21 (11) : 2683-2689 (1993))。
【０１０５】
本明細書中で研究されたステム長の比較的小さな範囲に拘わらず、ステム長は、天然に生じるステム長にほぼ近いものを使用した。小さなおよび大きなリボソームサブユニット内で見受けられた核酸二次構造相互作用の大部分は、３ｂｐおよび２５ｂｐ間のステムサイズを持つヘアピンで構成されている。(Szymanskiら, 1997; Spechtら, 1997; De Rijkら, 1992; Kulinski, 1991)。結果的に、天然システムから由来した配列は、二本鎖核酸−特異的色素を用いるＴｍ分析によって観察可能であるはずである。
【０１０６】
複数ドメイン融解プロセスの正確な仕組みが不明瞭であるにも拘わらず、二本鎖核酸−特異的色素を用いる複数ドメイン融解は、モデル核酸システムで確認されている。さらに、使用される化学濃度は、ＰＣＲ後適用に対して実行可能である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる一本鎖立体配座Ｔｍ分析の将来の研究は、Ｔｍ分析によって観察できる十分な、生物依存性二次構造差異を含有する増幅可能領域を発見することにかかっている。
【０１０７】
実施例３：５Ｓ ｒＲＮＡの複数成分融解の実証
５Ｓ ｒＲＮＡの複数の融解構成成分を識別する能力は、商業的に入手可能なｒＲＮＡを用いて示された。Ｅ． Ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００ ５Ｓ ｒＲＮＡを、Roche Molecular Diagnostics(Boehringer Mannheim, GmbH, Germany, Part#206911)から入手した。５Ｓ ｒＲＮＡ試料を選択して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いる天然システムの複数ドメイン融解を同定する可能性を実証した。濃度最適化を、モデルオリゴヌクレオチドシステムと同様に行った。最終的な最適化された濃度は、１．０ｍＭ ＲＮＡおよび１．０ｍＭ Ｍｇ＋２ＰＣＲ緩衝液（５ｍＭトリス，５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ， および１．ＯｍＭ Ｍｇ２＋）中のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの１：１５，０００原液希釈液であった。(IT Biochem, SLC, UT)。
【０１０８】
最適化の後、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を、八回、融解させた。開始および終了温度はそれぞれ６０℃および９７℃で、融解転移速度は０．０５℃／秒であった。次いで、融解曲線を、ＬＣＤＡ３．０を用いて分析した（融解ピークを、２．５℃に平均設定された度数を持つ多項フィティングスキームを用いて観察した）。構成成分Ｔｍ値を、−ｄＦ／ｄＴ対温度のソフトウェア発生プロットから手動で同定し、統計学的概説用にＥｘｃｅｌで作表した。
【０１０９】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉによる５Ｓ ｒＲＮＡ融解モニタリング
図１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下で、５Ｓ ｒＲＮＡ試料を、０．０５℃／秒温度ランプに付すことによって得られた結果を示す。二つ組のラン（ｎ＝８）は、融解プロファイルの８つの特徴が反復可能であることを示唆する。融解プロファイルは、８１℃および８２℃間の低蛍光（−ｄＦ／ｄＴ）「谷」、および８２℃ないし９５℃の温度範囲のいくつかの異なる融解構成成分を含有する広い融解転移よりなる。低蛍光「谷」内に、小さなピークが、一般に、８１．７℃の平均Ｔｍと共に存在していた。蛍光谷下では、一貫した融解転移は観察されなかった。各ランに対応するＴｍ値は、表３に作表した。１つのケースで、８つのピークのうち２つは同定されなかった。ピーク２、５および６は、最も変動を示した。各ピークに対する平均Ｔｍ値および標準偏差は含まれる。ピーク５は、標準偏差０．６７℃と共に、Ｔｍ値で最高の変動を示した。平均ΔＴｍ値、または１つのピークおよび次のピーク間の温度差は、３．１°、１．１°、１．３°、１．２°、１．２°、１．５°、および１．４°であった。
【０１１０】
【表３】
表３．５Ｓ ｒＲＮＡ融解曲線内で見受けられる最も顕著な融解構成成分の温度の作表。ピーク数は、頂部の列に沿って示される。平均および標準偏差は、各ピークにつき与えられる。ピーク数５は、最大の変動を見せ、最初のピークは最小のピークを見せ、それぞれ標準偏差は、０．６７℃および０．３１℃であった。構成成分融解ピーク７および８は、ラン数８からは解読できなかった。試料を、６０ないし９７℃の範囲の０．０５℃／秒温度ランプに付した。ｒＲＮＡ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉおよびマグネシウム緩衝液の最終濃度は、それぞれ１．０ｍＭ、１：１５，０００原液希釈液、および１．０ｍＭ Ｍｇ＋２であった。
【０１１１】
天然５Ｓ ｒＲＮＡシステム論議
５Ｓ ｒＲＮＡ試料の分析からの予備結果は、８つの同定可能な構成成分または転移を持つ融解曲線プロファイルを得た。どのような可能な説明が存在するにしても、５Ｓ ｒＲＮＡ立体配座の特定の構成成分は、未だ、経験的または理論的に、個々の融解転移にリンクされていない。
【０１１２】
広範囲の生物体からの５Ｓ ｒＲＮＡセグメントの配列に関する詳細な情報および二次構造情報は、核酸関連のジャーナルおよびリボソームのオンラインデータベースで見つけることができる。基本的な、３ドメイン、二次元５Ｓ構造は、５つの二本鎖領域、２つのヘアピンループおよび３つの内部ループ（膨隆）よりなる(Brownleeら,Nature 215 (102): 735-736 (1967); De Rijk, 1992; Spechtら, 1997 ; Szymanskiら, 1997)。核酸セグメントの長さは、種から種で変動するが、一般的に、１２０塩基長である(Spechtら,1997; Szymanskiら, 1997)。いくつかの高頻度可変領域は、セグメントならびに１つのかなり保存された領域内に存在する。加えて、非−ワトソン−クリック相互作用は、しばしば、５Ｓ ｒＲＮＡ構造のＥ−ループ内に存在する(Browleeら,1967 ; Voetら,"Nucleic Acid Structure", In Fundamentals of Biochemistry, 初版, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999) pp.742-743)。標準塩基番号付けおよびヘアピンまたはループ同定は、Ｅ．ｃｏｌｉ標準に基づいている(Spechtら, 1997; Szymanskiら, 1997)。図１５は、ドメイン同定およびループ図案化を含むＥ．ｃｏｌｉ由来５Ｓ ｒＲＮＡの基本的な組織を示す。
【０１１３】
５Ｓ ｒＲＮＡ分子の二次構造および観察された融解プロファイルの間の直接的な相関関係は、すぐには明らかではない。図１３に示されるように、通常、５つの二本鎖セグメントのみが、５Ｓ配列で同定されるが、そこには融解プロファイルの８つの反復可能な構成成分がある。多くの方法で、さらなる３つの構成成分を説明することができるだろう。まず、試料汚染は常に可能性としてある。正確な単離手順は開示されておらず、第２当事者によって行われたため、試料は純粋であると仮定されているだけである。第２に、全ての融解構成成分は、二本鎖から一本鎖への転移を直接的に反映しないかもしれない。完全な５Ｓ立体配座は三次元であり、全ての構造転移は、厳密には二次構造に関係していないかもしれない。さらに、二本鎖から一本鎖への転移を直接的に反映しないさらなる融解構成成分の存在を認めれば、三次元転移への洞察の余地が出てくる。第三に、５Ｓ ｒＲＮＡ分子の２つの二本鎖領域（図１３で、２および３と標識されたセグメント）は、２つの部分に細分化することができ、それにより、５Ｓ分子内の７つの総二本鎖領域を増加させる。最後に、非−ワトソン−クリック相互作用は、しばしば、リボソームの第二次立体配座内で発見される(Brownleeら, 1967; Voetら, 1999)。いくつかのそのような非標準結合相互作用は、５Ｓ分子のＥ ループで同定されている(Voetら, 1999)。もし非標準相互作用がループであると考えられる領域内で起これば、ループ形成を表すさらなる融解ピークが観察されるだろう。
【０１１４】
三次影響の可能性に関して、三次元構造が温度の上昇と共に緩和し始めると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ結合部位の有効性が増加すると仮定するのが妥当である。より多くのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが、新たに暴露された５Ｓ分子の二本鎖ＤＮＡセグメントに結合すると、色素の蛍光は、代わりに、わずかに増加する。そうすると、実際に融解曲線の平面化を表す図１２で明白な低−ｄＦ／ｄＴ「谷」は、５Ｓ三次構造の初期緩和を表す。強度、異方性、寿命およびスペクトルといったフルオロフォアの特異的な性質を、核酸構造の異なる態様にリンクするVamosi and Clegg(1998)によって使用される技術を使用して、潜在的な三次影響を実証することができるだろう。加えて、Doktycz ら, 1990, SantaLucia, 1998, and Bonnetら, PNAS (USA) 96: 6171-6176 (1999)によって行われた複雑な数学的モデリングを適用することで、５Ｓ ｒＲＮＡ配列の熱融解の詳細を洞察することもできるだろう。
【０１１５】
潜在的な三次影響にも拘わらず、該三次影響が二次構造転移と重ならない限り、５つの二本鎖セグメントは観察可能なはずである。Molecular Probesは、核酸融解に際し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度の大きな減少を報告し(Haugland,1996)、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭが蛍光強度をモニターするため、融解プロファイルの主要な特徴は、５Ｓ ｒＲＮＡ分子内で二次構造融解転移を反映すると考えられる。
【０１１６】
先に論議したモデルオリゴヌクレオチドから、１つ以上のヘアピンの存在が、他のヘアピンのＴｍ値に影響を及ぼすことが発見された。モデルオリゴヌクレオチド論議で使用される同一の論議を用いて、５つの二本鎖セグメントのＴｍ値は、より高い温度にシフトする可能性が非常に高い。最長のモデルオリゴヌクレオチド（１８ｂｐ）は、７７．８℃で融解した。５Ｓシステムの最長の二本鎖領域は、１０ｂｐだけであるが、主要な蛍光変化が８６°および９４℃間で観察される。もし最も安定した二次転移の前にいずれかおよび全ての三次影響が起こると考えられるならば、図１２の８と標識されたピークは、最大の５Ｓヘアピンステムの融解を表すだろう。それならば、ピーク７ないし４は、二番目に大きなステムから最小のステムへ融解するステムを表すだろう。
【０１１７】
図１３に示されるごとく、β−ドメインのステムの両方は、ミスマッチを含有する。もしこれらのミスマッチがステム内のサブ−ドメインを識別するように作成されれば、５Ｓ ｒＲＮＡ融解プロファイルのさらなる解釈が示される。そうなると、ステム数２は１つのミスマッチによって分離された２ｂｐステムおよび６ｂｐステムよりなる。ステム数３は、２−塩基挿入によって分離された３ｂｐおよび４ｂｐステムに分けられる。潜在的な別々の融解ドメインの数は、全部で７つである。モデルオリゴヌクレオチドシステムは、３ｂｐステムの融解はモニターでき、５Ｓ ｒＲＮＡシステムのステムを、２ｂｐないし８ｂｐのサイズ範囲のより小さなサブユニットに分離することは適切ではないことを示した。もし非−ワトソン−クリック相互作用がＥループ内にあると考えられるなら、全ての８つの融解転移は説明できる。もしＥループ内の非−ワトソン−クリック相互作用がいずれの他の相互作用よりもより安定していないと考えるなら、８つの潜在的な異なる融解ドメインは存在する。そうなれば、Ｅループ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、８ｂｐおよび１９ｂｐステム内の非−ワトソン−クリック相互作用を含む解釈が可能であり、これは、それぞれ、８１．６℃、８４．８℃、８６．８℃、８７．５℃、８８．９℃、９０．２℃、９１．６℃および９３．１℃の融解転移に対応する。全ての８つの潜在的転移は、このように説明できるが、三次影響の影響は、不明瞭ではあるが、考慮されていない。
【０１１８】
決定された５Ｓ ｒＲＮＡ Ｔｍプロファイルの他の説明が可能である。５Ｓ構造の融解が進むにつれ、可変サイズのループが発生し、これは、付随するステムの安定性を変化させる。すなわち、融解システムは非常に複雑であり、上記略述通りには進行しないだろう。他方で、ステムをサブステムに分けることは、モデルオリゴヌクレオチドシステムによって得られた観察によって支持される。また、潜在的な解釈は、全ての立体配座転移は８０°および９５℃の間で起こると仮定するが、これは当てはまらないかもしれない。しかしながら、モデルオリゴヌクレオチドシステムからの結果は、５Ｓセグメントで見受けられるような複雑な二次組織内の二本鎖領域は高温度で融解する可能性を支持する。
【０１１９】
不明瞭ではあっても、どのように８つの融解転移が５Ｓ ｒＲＮＡ試料に関連するかに関して、予備結果が有用である。考慮すべき８つの異なる構成成分に対して、いくつかの生物体間の融解プロファイルの差異を観察する可能性が予測される。天然の二次構造のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ由来の結果を、濃色性または示差熱量測定（ＤＳＣ）といった他の方法に比較することによって、融解転移の仕組みへの洞察を得ることができるかもしれない。Doktyczら, 1990, Panerら, 1990, and Vamosi and Clegg, 1998によって使用された技術および数学的モデルを用いる５Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列の完全な熱力学的研究は、５Ｓセグメントの融解転移を完全に解明することができる。しかしながら、融解転移の裏にある正確な仕組みの詳細は、プロセスを使用して生物体を識別する前に決定する必要はない。１つの試料から次へと一定の差異が観察される限り、ＴｍおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる二次構造立体配座の分析を使用して、生物体を同定することができる。
【０１２０】
モデルシステムは、核酸の分子内の二次構造特徴を検出する可能性を示す際に、非常に強力なツールであることが証明された。５Ｓ ｒＲＮＡ融解プロファイルで示したごとく、天然に生じる配列は、この研究で使用されたモデルシステムよりも遙かに複雑である。リボソームＲＮＡ内二次構造の配列決定および同定に関して、多くの研究がなされてきた。例えば、１０１の膨隆またはヘアピンループが、Pseudomonas cepacia (Van Campら, 1993)から入手された２３ｓ ｒＲＮＡ分子で同定された。対照的に、５Ｓ ｒＲＮＡ構造は、５つの二本鎖領域、２つのヘアピンループおよび３つの内部ループ（膨隆）のみで構成されている(De Rijk, 1992; Szymanskiら, 1997)。いずれの場合も、天然に生じる二次構造の複雑さは計り知れない。しかしながら、これらの配列の殆どに、高度に保存された領域が存在し、これにより、ＳＳＣＰおよびリボタイピングといったアッセイによって、セグメント増幅のためにＰＣＲを用いて、生物体レベルにて、試料を識別することが可能になる。Van Campおよび同僚らは、いくつかの普遍的なプライマー部位を同定し、これを使用して、２３ｓ遺伝子内の高頻度可変領域を増幅することができる（1993）。Erik Avaniss-Aghajaniらは、リボタイピング技術を用いて、細菌タイピングのための「実質的に全ての細菌からのＳＳＵ（小さなサブユニット）ｒＲＮＡを増幅することが可能な」プライマー対を同定し、テストした（1994）。そのような領域は、ＳＳＣＰおよびリボタイピングといったアッセイに現在使用されており、ＴｍおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用する二次構造分析にも良いはずである。
【０１２１】
多くの細菌検体をタイプするのに使用可能な普遍的なプライマー部位を同定するために、多くの研究がなされてきた。恐らく、二次構造構成成分を含有する有益な高頻度可変領域の増幅に、５Ｓ ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡよりも、１６ｓおよび２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を現在研究している何人かの研究者によって設計された普遍的なプライマーの方が適しているだろう(Anthonyら, 2000; Rantakokoo-Jalavaら, 2000; Widjojoatmodjoら, 1994)。これらの研究グループによって行われた研究は、高頻度可変セグメント内に二次構造を含有する１６ｓおよび２３ｓ遺伝子内に、医学的に有意な領域を発見した。具体的には、Widjojoatmodjoによって行われた研究は、１０８ｂｐないし３００ｂｐの範囲の小さなアンプリコンサイズを持つＳＳＣＰによる良種タイピングを示す（1994）。本発明による分析用に、これらの同一領域から、一貫しているが区別可能な融解プロファイルが入手できる。
【符号の説明】
【０１２２】
１ 器具
２ 空気注入口
３ 円試料カルーセル
４ ステッパーモーター
５ チャンバーファン
６ オプティクス／フィルターアセンブリ
７ 試料
８ 反応チャンバー
９ ２４ブラスオフセットガイド
１０ 励起および収集オプティクス
１１ 高ワット数加熱コイル
１２ 青ＬＥＤ
１３ フォトダイオード
３０ 軸ファン
３１ 絶縁体
４０ アルミニウム冷却浴
４１ ブラスコネクター
４２ ブラスコネクター
４３ ゴム管
４４ ペルチエモジュール
４５ ヒートシンク
４６ 支柱
４７ ゴム吐出口管
４８ 標準蛍光モニタリング経路
６０ コンピューター
６２ ポンプ
６３ 圧縮機
６４ ペルチエモジュール
６５ 冷却管
６６ 冷却管
６７ 冷却管
６８ アルミニウム冷却浴
６９ 一方向チェック弁
７０ 一方向チェック弁
７１ １００Ｗ電力供給
９０ モジュール
９１ モジュール
９３ １２ボルト６−リード機械的リレー
９４ 低電力ＮＰＮトランジスタ
９５ トランジスタ
９３ リレーコイル
９７ 底部末端
９８ 電力供給
９９ 地面
１００ ダイオード
１０１ コンピューター
１０４ 高ワット数ＮＰＮトランジスタ
１０５ 作業増幅器
１０６ ０．１オームレジスタ
１０８ リレー制御
１０９ リレー制御
１１０ 冷却剤ポンプ
１１１ 空気圧縮機
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）一本鎖核酸を、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該一本鎖核酸内に、該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し；次いで
ｂ）該一本鎖核酸の温度を変動させて、該検出可能な複合体中の各該二次構造に対する融解温度（Ｔｍ）を決定し、ここに該融解温度は、該一本鎖核酸を特徴付けるＴｍプロファイルを定義することを特徴とする一本鎖核酸を特徴付ける方法。
【請求項２】
ａ）少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、第１の一本鎖核酸のＴｍプロファイルを決定し；次いで
ｂ）第１の一本鎖核酸のＴｍプロファイルを、第２の一本鎖核酸のＴｍプロファイルと比較し；ここに該第１および第２の一本鎖核酸間のＴｍプロファイルの差異は、該第１および第２核酸間の配列の差異を示すことを特徴とする第１および第２の一本鎖核酸の配列間の差を検出する方法。
【請求項３】
既知の配列を有する核酸と比較した、試料核酸の配列の変化を検出する方法であって、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、一本鎖核酸のＴｍプロファイルを決定し、ここに該核酸試料のＴｍプロファイルおよび既知の配列を有する該核酸のＴｍプロファイル間の差は、該既知の配列と比較した、該試料核酸の配列の改変を示すことを特徴とする該方法。
【請求項４】
細胞の種型を同定する方法であって、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、細胞からの試料ｒＲＮＡまたはその断片のＴｍプロファイルを決定し、ここに、該決定されたＴｍプロファイルおよび既知の種型からの細胞の対応するｒＲＮＡまたはその断片のＴｍプロファイルの間のマッチングが、試料ｒＲＮＡは既知のｒＲＮＡ細胞型からのものであることを示すことを特徴とする該方法。
【請求項５】
該変化が突然変異である請求項３記載の方法。
【請求項６】
該試料ｒＲＮＡまたはその断片が、増幅されたｒＲＮＡ遺伝子またはその断片である請求項４記載の方法。
【請求項７】
該一本鎖核酸が、増幅された核酸産物である請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
【請求項８】
該一本鎖核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ＰＣＲが非対称的ＰＣＲである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該一本鎖核酸が、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）よりなる群から選択される増幅反応の産物である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該二本鎖核酸−特異的色素が、ＹＯ−ＰＲＯ−１およびＹＯ−ＹＯ−１よりなる群から選択される請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１２】
さらに、該方法が：該Ｔｍプロファイルの該決定前あるいはそれと同時に、該一本鎖核酸を増幅することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
【請求項１３】
該決定が、核酸の温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１４】
該温度が、０．０１℃ないし０．１℃／秒の速度にて変化する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該決定が、該第１の一本鎖核酸を少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該第１の一本鎖核酸内で該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間の検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項２ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１７】
該温度が、０．０１℃ないし０．１℃／秒の速度にて変化する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該増幅で使用されるプライマーが、既知の配列を有する該核酸の配列から由来する請求項７記載の方法。
【請求項２０】
該細胞が細菌細胞である請求項４記載の方法。
【請求項２１】
該細胞が植物細胞である請求項４記載の方法。
【請求項２２】
該増幅ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって生成される請求項６記載の方法。
【請求項２３】
該ＰＣＲが非対称的ＰＣＲである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片が、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）よりなる群から選択される増幅反応によって生成される請求項６記載の方法。
【請求項２５】
該決定が、該ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片を少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該増幅ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片内で、該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項４記載の方法。
【請求項２６】
該Ｔｍプロファイルの温度範囲が、２０℃および１００℃の間である請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項２７】
該温度範囲の該下限が、４０℃未満である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該温度範囲の該下限が、３５℃未満である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該色素が、少なくとも８０％のパーセント飽和を有する請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項３０】
該色素が、少なくとも９０％のパーセント飽和を有する請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１】
ａ）一本鎖核酸を、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該一本鎖核酸内に、該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し；次いで
ｂ）該一本鎖核酸の温度を変動させて、該検出可能な複合体中の各該二次構造に対する融解温度（Ｔｍ）を決定し、ここに該融解温度は、該一本鎖核酸を特徴付けるＴｍプロファイルを定義することを特徴とする一本鎖核酸を特徴付ける方法。
【請求項２】
ａ）少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、第１の一本鎖核酸のＴｍプロファイルを決定し；次いで
ｂ）第１の一本鎖核酸のＴｍプロファイルを、第２の一本鎖核酸のＴｍプロファイルと比較し；ここに該第１および第２の一本鎖核酸間のＴｍプロファイルの差異は、該第１および第２核酸間の配列の差異を示すことを特徴とする第１および第２の一本鎖核酸の配列間の差を検出する方法。
【請求項３】
既知の配列を有する核酸と比較した、試料核酸の配列の変化を検出する方法であって、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、一本鎖核酸のＴｍプロファイルを決定し、ここに該核酸試料のＴｍプロファイルおよび既知の配列を有する該核酸のＴｍプロファイル間の差は、該既知の配列と比較した、該試料核酸の配列の改変を示すことを特徴とする該方法。
【請求項４】
細胞の種型を同定する方法であって、少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、細胞からの試料ｒＲＮＡまたはその断片のＴｍプロファイルを決定し、ここに、該決定されたＴｍプロファイルおよび既知の種型からの細胞の対応するｒＲＮＡまたはその断片のＴｍプロファイルの間のマッチングが、試料ｒＲＮＡは既知のｒＲＮＡ細胞型からのものであることを示すことを特徴とする該方法。
【請求項５】
該変化が突然変異である請求項３記載の方法。
【請求項６】
該試料ｒＲＮＡまたはその断片が、増幅されたｒＲＮＡ遺伝子またはその断片である請求項４記載の方法。
【請求項７】
該一本鎖核酸が、増幅された核酸産物である請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
【請求項８】
該一本鎖核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ＰＣＲが非対称的ＰＣＲである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該一本鎖核酸が、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）よりなる群から選択される増幅反応の産物である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該二本鎖核酸−特異的色素が、ＹＯ−ＰＲＯ−１およびＹＯ−ＹＯ−１よりなる群から選択される請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１２】
さらに、該方法が：該Ｔｍプロファイルの該決定前あるいはそれと同時に、該一本鎖核酸を増幅することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
【請求項１３】
該決定が、核酸の温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１４】
該温度が、０．０１℃ないし０．１℃／秒の速度にて変化する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該決定が、該第１の一本鎖核酸を少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該第１の一本鎖核酸内で該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間の検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項２ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項１７】
該温度が、０．０１℃ないし０．１℃／秒の速度にて変化する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該増幅で使用されるプライマーが、既知の配列を有する該核酸の配列から由来する請求項７記載の方法。
【請求項２０】
該細胞が細菌細胞である請求項４記載の方法。
【請求項２１】
該細胞が植物細胞である請求項４記載の方法。
【請求項２２】
該増幅ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって生成される請求項６記載の方法。
【請求項２３】
該ＰＣＲが非対称的ＰＣＲである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片が、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）よりなる群から選択される増幅反応によって生成される請求項６記載の方法。
【請求項２５】
該決定が、該ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片を少なくとも５０％のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該増幅ｒＲＮＡ遺伝子またはその断片内で、該色素および１つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項４記載の方法。
【請求項２６】
該Ｔｍプロファイルの温度範囲が、２０℃および１００℃の間である請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項２７】
該温度範囲の該下限が、４０℃未満である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該温度範囲の該下限が、３５℃未満である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該色素が、少なくとも８０％のパーセント飽和を有する請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項３０】
該色素が、少なくとも９０％のパーセント飽和を有する請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−１６２０３４（Ｐ２０１０−１６２０３４Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４４５９６（Ｐ２０１０−４４５９６）
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【分割の表示】特願２００３−５８７９４４（Ｐ２００３−５８７９４４）の分割
【原出願日】平成１５年４月２５日（２００３．４．２５）
【出願人】（５００１８９２３０）ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【分割の表示】特願２００３−５８７９４４（Ｐ２００３−５８７９４４）の分割
【原出願日】平成１５年４月２５日（２００３．４．２５）
【出願人】（５００１８９２３０）ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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