低い免疫原性を有する結合分子
本発明は、少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子を提供し、前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、および、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、特異的なアミノ酸置換を含む特に同定されたアミノ酸配列であり、第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む。本発明はさらに、本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および、前記ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。その上、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子の製造方法、および、本発明の二重特異性を有する結合分子を含む組成物、本発明の核酸分子、または、本発明の宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子を提供し、本結合分子において、前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、さらに、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、特異的なアミノ酸置換を含む特に同定されたアミノ酸配列であり、さらに、第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む。本発明はさらに、本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および、前記ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。その上、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子の製造方法、および、本発明の二重特異性を有する結合分子を含む組成物、本発明の核酸分子、または、本発明の宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書本文中に、数々の文書が引用されている。本明細書で引用されたそれぞれの文書（あらゆる製造元の仕様書、説明書などを含む）は、参照により本発明に含まれる。
遺伝子工学が開発されてから、免疫療法は、多数の重篤な病気（例えば腫瘍性の疾患）の治療に用いられてきた。しかしながら、非ヒト源由来の抗体の使用は、ヒトの治療計画の一環としてを用いられる場合、数々の問題を引き起こす。
【０００３】
まず第一に、非ヒト源の抗体は、「サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）」を引き起こす可能性がある。ＣＲＳは、最初の少量の抗ＣＤ３抗体の投与の後に観察される臨床症候群であり、さらに、多くのＣＤ３に対して向けられた抗体は分裂促進性であるということに関連している。ＣＤ３に対して向けられたインビトロの分裂促進性の抗体は、Ｔ細胞増殖とサイトカイン生産を誘導する。インビボでのこの分裂促進性の活性により、最初の抗体注射後の数時間以内に大規模なサイトカイン（多くのＴ細胞由来のサイトカインなど）放出が引き起こされる。ＣＤ３特異的抗体の分裂促進能は、単球／マクロファージ依存性であり、さらに、これらの細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１β生産に関与する。ＣＲＳの症状は、頻繁に報告されている軽度の「インフルエンザ様の」症状から、それほど頻繁に報告されていない重度の「ショック様の」反応（これは、心血管症状および中枢神経症状を含み得る）にまで及ぶ。症状としては、特に、頭痛、震え、吐き気／嘔吐、下痢、腹痛、倦怠感、および、筋肉／関節の痛み、ならびに、疼痛、全身衰弱、呼吸循環系の現象、同様に、神経精神病学的な現象が挙げられる。重度の肺水腫は、体液過剰の患者に起こり、さらに体液過剰ではないようにみえる患者にも起こる。（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ，２００３年 Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１２３〜１３２）。
【０００４】
第二に、マウス抗体は、ヒト抗マウス抗体の体液性免疫応答（ＨＡＭＡｓ）によって認識されており、小さい治療域を得ることになる（Ｓｃｈｒｏｆｆ（１９８５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：８７９〜８８５，Ｓｈａｗｌｅｒ（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０〜１５３５）。ＨＡＭＡｓは、典型的には、マウス治療抗体での処理の第二週中に発生し、それらの目的とする標的への結合をブロックすることによってマウス抗体を中和する。ＨＡＭＡ応答は、マウスの定常（「Ｆｃ」）抗体領域、または／および、マウスの可変（「Ｖ」）領域の性質によって様々であり得る。この宿主反応は、抗体の薬物動態学的な特徴を劇的に変化させ、それにより迅速に抗体が除去され、繰り返しの投与を妨げる（Ｒｅｆｆ，２００２年 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９：１５２〜１６６）。
【０００５】
治療抗体の免疫原性に対処するために、４種の基礎的な抗体方法；キメラ化、完全ヒトＶ領域の提供、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、および、ヒト化が適用されてきた。キメラ抗体では、定常領域は免疫原性に重要な成分に寄与するということに基づいて、マウス定常領域がヒト定常領域で置換される。完全ヒトＶ領域を作製するアプローチが２つあり、それは、ファージライブラリーからヒト抗体のＶ領域を選択すること、および、それら自身の免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン遺伝子で置換されたトランスジェニックマウスを提供すること、である。脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）では、特異的な免疫原性ペプチドが、特定のアルゴリズムに従って、免疫原性が減少した、または、免疫原性ではないペプチドによって変化する。
【０００６】
一般的に、ヒト化は、例えばＣＤＲグラフティングを用いた場合のように、可変領域中の非ヒト抗体フレームワーク配列を対応するヒト配列で置換することを必然的に伴う。従来技術では、抗体をヒト化する数種のアプローチが説明されている。これらの方法の１つは、外来のフレームワークへのＣＤＲグラフティングであり、この方法では、ある種由来のＣＤＲがヒトのフレームワークにグラフティングされる（ＥＰ２３９４００）。しかしながら、このようなヒト化抗体は、結合親和性が不十分であるという問題を有することが多い（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７）。これは、ヒトのフレームワークに追加の突然変異を導入して上述のアプローチを改変することによって克服することができる。このような方法が用いられている例は、ＥＰ４６９１６７、ＥＰ９７１９５９、ＥＰ９４０４６８で説明されている。抗体をヒト化するその他のアプローチは、ファージディスプレイによるヒト化（ＵＳ５，５６５，３２２）、および、表面の改変（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）／表面の修飾（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）によるヒト化であり、この場合、抗体の表面に露出したアミノ酸を同定し、ヒトのフレームワークに類似した、または同一なアミノ酸で置換する（例えばＥＰ５１９５９６、ＥＰ５９２１０６を参照）。
【０００７】
ヒトＣＤ３は、多分子のＴ細胞複合体の一部としてＴ細胞で発現される抗原を意味し、３種の異なる鎖：ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δおよびＣＤ３−γからなる。例えば固定化抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞でのＣＤ３のクラスター化は、Ｔ細胞受容体の関与と同様のＴ細胞の活性化を引き起こすが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係である；（ＷＯ９９／５４４４０、または、Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：５〜８を参照）。
【０００８】
従来技術において、ＣＤ３抗原を特異的に認識する抗体が説明されており、例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ１０（１９９１年），３６５５〜９、および、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８年），７６３〜７７２で説明されている。最近、多種多様な病気の治療において、ＣＤ３に対して向けられた抗体が提唱されている。これらの抗体または抗体コンストラクトは、ＥＰ１０２５８５４で開示されたような、Ｔ細胞除去物質または分裂促進性の物質のいずれかとして作用する。ＷＯ００／０５２６８には、ヒトＣＤ３抗原複合体に特異的に結合するヒト／げっ歯類ハイブリッド抗体が開示されており、例えば腎臓移植後の拒絶反応の出現の治療、敗血症および心臓同種移植片のための免疫抑制剤として提唱されている。ＷＯ０３／０４６４８は、ＣＤ３と卵巣ガン抗原に対して向けられた二重特異性抗体を開示している。その上、Ｋｕｆｅｒ（１９９７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４５：１９３〜７は、わずかに残留したガンを処理するためのＣＤ３とＥｐＣＡＭに特異的な二重特異性抗体に関する。
【０００９】
ＣＤ３に結合する抗体をヒト化する数々の試みが行われてきた。ＵＳ５，９２９，２１２、ＵＳ５，８５９，２０５、ＷＯ９１／０９９６８、ＷＯ９１／０９９６７、および、Ａｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８は、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３のためのヒト化方法を説明しており、ここで、マウス（ドナー）ＣＤＲは、ヒト（アクセプター）フレームワークにグラフティングされ、そのフレームワークにドナーアミノ酸残基が導入される。ＵＳ６，４０７，２１３、および、ＷＯ９２／２２６５３は、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体を説明しており、ここで、最小数のマウスＣＤＲとＦＲ残基が、マウスの親抗体と同等の抗原結合親和性と生物学的な特性を達成するために、必要に応じてコンセンサスヒト可変ドメイン配列のなかに導入される。ヒト化ＣＤ３抗体のさらなる例は、ＥＰ０６２６３９０（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，８８５，５７３（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，８３４，５９７（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，５８５，０９７（ＹＴＨ１２．５）、および、ＵＳ２００２１３１９６８（ＹＴＨ１２．５）である。
【００１０】
しかしながら、二重特異性を有する結合分子型のＯＫＴ３から誘導されたヒト化抗体コンストラクトは、ＣＤ３への結合／ＣＤ３との相互作用を介してシグナルを誘導する能力などの特異的な活性を減少させることが観察されている。
【発明の開示】
【００１１】
従って、本発明の根底にある技術的課題は、極めて効率的な抗体由来の化合物を提供するための手段および方法を提供することであり、これは、ヒトの病気の治療に有用である可能性があり、副作用が低いものである。副作用は化合物の免疫原性により誘導され、その結果化合物の活性が減少するが、本発明では特に、副作用の減少を目的とする。
【００１２】
前記技術的な問題に対する解決は、特許請求の範囲で特徴を示された実施形態を提供することによって達成される。
従って、本発明は、少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子に関し、ここで、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、ここで、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉｉ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列、
であり、ただし、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）システムに従って、軽鎖のＣＤＲ領域のＬ２４位、Ｌ５４位およびＬ９６位にアミノ酸置換を含み；および、
（ｂ）第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「〜との結合／相互作用」は、少なくとも２つの「抗原相互作用部位」が互いに結合／相互作用することを定義する。本発明に係る用語「抗原相互作用部位」は、特異的な抗原または抗原の特異的な基と特異的な相互作用をする能力を示すポリペプチドのモチーフを意味する。前記結合／相互作用はまた、「特異的な認識」を意味するものとしても理解される。本発明に係る用語「〜を特異的に認識する」は、抗体分子が、ここで定義されるヒト標的分子それぞれのアミノ酸のうち少なくとも２つと特異的に相互作用する、および／または、それらに特異的に結合することができることを意味する。抗体は、同じ標的分子上の異なるエピトープを認識し、それらと相互作用すること、および／または、それらに結合することができる。前記用語は、抗体分子の特異性に関し、すなわち、それらのここで定義されるヒト標的分子の特異的な領域を区別する能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用により、例えば抗原のコンフォメーション変化の誘導、抗原のオリゴマー化等によってシグナルの開始が起こる可能性がある。従って、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的なモチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果、同様に、前記構造の二次的な改変の結果である。
【００１４】
本発明で用いられる用語「特異的な相互作用」は、本発明の二重特異性を有する結合分子のＣＤ３特異的ドメインが、類似構造を有する（ポリ）ペプチドと交叉反応しない、または、実質的に交叉反応しないことを意味するものと理解される。調査中の結合分子のパネルの交叉反応性は、例えば、従来の条件下での、対象の（ポリ）ペプチド、同様に、多数の、程度の差はあるが（構造的および／または機能的に）密接に関連した（ポリ）ペプチドへの、単鎖結合分子の前記パネルの結合を評価することによって試験してもよい（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），１９８８年、および、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９９９年を参照）。これらの方法は、特に、構造的および／または機能的に密接に関連した分子との結合研究、ブロックおよび競合研究を含んでいてもよい。また、これらの結合研究は、ＦＡＣＳ 解析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，例えばビアコア（Ｒ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ））を使用）、分析用の超遠心分離法、等温滴定熱量計、蛍光異方性、蛍光分光分析も含み、または、放射標識したリガンド結合分析による。従って、抗原相互作用部位と特異的な抗原と特異的な相互作用に関する例には、その受容体のためのリガンドの特異性が含まれていてもよい。前記定義は特に、その特異的な受容体に結合する際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例には、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用／結合するサイトカインが含まれる。前記相互作用のその他の例（特に前記定義にも含まれる）は、抗原決定基（エピトープ）と、抗原性の抗体結合部位との相互作用である。また、前記相互作用は、抗原性の抗体結合部位の類似の構造を有するその他のエピトープとの交叉反応性がない、または、実質的にないことも特徴とする。
【００１５】
当然ながら、用語「〜との結合／相互作用」の定義には、結合ドメインと、直鎖状エピトープとの結合／相互作用、同様に、立体配座的なエピトープ（構造的なエピトープ、または、不連続エピトープともいう）との結合／相互作用が含まれるものとする。対応するエピトープの定義は、当業界既知である。例えば、前記エピトープは、ヒト標的分子の２つの領域、またはそれらの部分からなる可能性がある。本明細書によれば、立体配座的なエピトープは、ポリペプチドが天然型タンパク質に折り畳まれる際に分子表面上に集まった一次配列中の、分離された２またはそれ以上の別々のアミノ酸配列によって定義される（Ｓｅｌａ，（１９６９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６，１３６５、および、Ｌａｖｅｒ，（１９９０年）Ｃｅｌｌ ６１，５５３〜６）。
【００１６】
用語「不連続エピトープ」は特に、本明細書によれば、ポリペプチド鎖の遠い部分からの残基で構築される非直鎖状エピトープを定義するものとする。これらの残基は、ポリペプチド鎖が、立体配座的／構造的なエピトープが構成されるように三次元構造に折り畳まれる際に表面上に集まる。
【００１７】
また、本発明の結合分子は、立体配座的なエピトープを含む少なくとも１つの結合ドメインと、特異的に結合／特異的に相互作用することも想定しており、これは、ヒトＣＤ３複合体の少なくとも２つの領域で構成される、および／または、それらを含む、または、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δ、および、ＣＤ３−γのような個々の成分および／または前記成分の組み合わせ、例えばＣＤ３−ε／ＣＤ３−δ、または、ＣＤ３−ε／ＣＤ３γで構成される、または、それらを含む。その上、本明細書で説明される前記立体配座的／構造的なエピトープは、ヒトＣＤ３複合体の単一の成分の少なくとも２つの領域の個々の部位／領域／伸長、好ましくは、ＣＤ３−ε（さらにより好ましくはＣＤ３−ε）の細胞外ドメイン少なくとも２つの部位／領域／伸長を含むことを想定している。
【００１８】
ここで定義されるように、本発明の二重特異性を有する結合分子のの第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインに結合する。用語「エフェクタードメイン」は、本発明によれば、一次または二次刺激シグナルの誘導、細胞傷害効果の誘導（例えば、アポトーシスを誘導するシグナルなど）、または、単に特異的な抗原相互作用部位と特異的に結合／特異的に相互作用する能力を有することのような生物学的作用を開始させる本発明の分子のドメインを特徴とする。また、「細胞傷害効果」は、Ｔ細胞によって発生する細胞性の細胞毒性も含む。従って、本発明の二重特異性を有する結合分子は、少なくとも２種の異なる特異性を特徴とする。
【００１９】
特異性は、当業界既知の方法、および、本明細書で開示および説明されている方法によって実験的に決定することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、および、ペプチドスキャンが挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ＣＤＲ」は、「相補性決定領域」に関し、これは当業界周知である。ＣＤＲは、前記分子の特異性を決定する免疫グロブリンの一部であり、および、特異的なリガンドと接触する。ＣＤＲは、上記分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がある。ＣＤＲ−Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を特徴とし、ＣＤＲ−Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。Ｈは可変重鎖を意味し、Ｌは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）），Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９年；Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７〜８８３）で説明されているようにして決定してもよい。
【００２１】
「カバットシステム」は、本発明によれば、カバット（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）に従い一貫した方法で残基を番号付ける基準を意味する。この番号付けは、当業者に広く用いられており、抗原結合活性に重要な可変ドメイン領域の配列の変異性および３次元ループに基づく。軽鎖または重鎖の残基は全て、別個のカバットの位置を有する；すなわち、カバットの番号付けは、ＣＤＲ、同様に、フレームワークに適用される。あらゆる抗体の特異的な残基の位置は、カバットに従って番号付けすることができる。抗体の特異的な残基の番号付け、およびカバットの位置は、http://www.bioinf.org.uk/absで示されている。例えば、本発明で言及されるＬ２４位は、カバットシステムによる軽鎖中の２４番目の残基を意味する。従って、Ｌ５４、および、Ｌ９６は、カバットシステムに従って、抗体の軽鎖中の５４位および９６位を意味する。
【００２２】
カバットによるＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ領域を同定するための規則は、www.bioinf.org.uk/abs、および、表１に示されている。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明によれば、フレームワーク領域は、免疫グロブリンのＶドメイン（ＶＨまたはＶＬドメイン）、および、抗原と接触する超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）のためのタンパク質の足場を提供するＴ細胞受容体中の領域に関する。各Ｖドメインには、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および、ＦＲ４と名付けられた４つのフレームワーク領域がある。フレームワーク１は、ＶドメインのＮ末端からＣＤＲ１の始点までの領域を包含し、フレームワーク２は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２都の間の領域に関し、フレームワーク３は、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間の領域を包含し、および、フレームワーク４は、ＣＤＲ３の終点からＶドメインのＣ末端までの領域を意味する；特に、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００１年，第５版を参照。従って、上記フレームワーク領域は、ＶＨまたはＶＬドメイン中のＣＤＲ領域の外側の全ての領域を包含する。
【００２５】
当業者であれば、所定の配列からフレームワーク領域とＣＤＲを容易に推測することができる；Ｋａｂａｔ（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省，Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７〜８８３を参照。
【００２６】
本発明に係る「二重特異性を有する結合分子」は、必然的に、１つのドメインによってヒトＣＤ３複合体および／またはその個々の成分に特異的に結合する（ポリ）ペプチドである。本明細書で用いられる用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドのグループ、同様に、ポリペプチドのグループを含む、分子のグループを説明している。ペプチドのグループは、３０個までのアミノ酸を有する分子で構成され、ポリペプチドのグループは、３０個より多いアミノ酸からなる分子で構成される。最も好ましくは、前記「二重特異性を有する結合分子」は、抗体、抗体フラグメント、抗体の誘導体、特異的に結合するペプチド、および、特異的に結合するタンパク質からなる群より選択される。前記抗体フラグメントは当業界既知であり、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ−フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなどが挙げられる。抗体の誘導体としては、これらに限定されないが、標識された抗体／抗体フラグメント、同様に、化学修飾された抗体分子／抗体フラグメントが挙げられる。以下で詳細に述べるように、特に好ましい本発明に係る抗体の誘導体は、ｓｃＦｖである。
【００２７】
本発明の二重特異性を有する結合分子の１つのドメインは、ヒト化されたＣＤＲグラフティングされたＣＤ３−抗体から誘導される。本明細書において抗体と抗体コンストラクトの文脈で用いられる用語「ヒト化」は、非ヒト配列の対応するヒト配列での置換と定義することができる。これは、マウスＣＤＲをヒトのフレームワークにグラフティングすること、または、マウスのフレームワーク中の一つのアミノ酸を対応する位置の一つのヒトアミノ酸でを置換することによって達成できる。加えて、本発明で用いられる用語ヒト化は、タンパク質の結合または細胞毒性活性を改善するために、さらなる突然変異を導入することも包含する。これらのさらなる突然変異は、必ずしもマウス残基のヒト残基への置換でなくてもよい。
【００２８】
所定のアミノ酸配列中の、アミノ酸、特に特定の位置のアミノ酸を、特別に選択されたアミノ酸で置換する方法は当業者既知であり、標準的な実験方法の代表である。このような方法の例は、プライマー変異誘発である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等．１９８９年）。
【００２９】
驚くべきことに、上記で二重特異性を有する結合分子に関して説明されているように、軽鎖のＣＤＲに追加のアミノ酸置換を含むヒト化ＣＤ３の特異的な抗体コンストラクトは、細胞毒性活性を有することが見出された。これらの分子は、標的細胞において細胞死を誘導するする能力を有する。それに対して、ヒト化ＣＤ３の特異的な抗体コンストラクト（当業界で、例えばＡｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８で説明されている）は、前記コンストラクトが上記で定義された二重特異性を有する結合分子と一緒に発現されると、標的細胞において細胞死を誘導するする能力が著しく機能が損なわれていることが示される。
【００３０】
特に、本発明の二重特異性を有する分子は、その特異的なエピトープへの顕著な結合（実施例４，図２を参照）、および、高い細胞毒性活性（実施例６，図６）を示す。本発明の、ＣＤ３結合部分の軽鎖のＣＤＲに置換を有する二重特異性を有するヒト化ＣＤ３は、５０ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値示すが、それに対して、ヒト化ＯＫＴ３を含む二重特異性抗体コンストラクト（Ａｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８で説明されている）のＥＣ５０値は、１９５ｐｇ／ｍｌである。細胞毒性活性が４倍も高いため、本発明の二重特異性を有する分子は、治療活動に効果的に用いることができる。その上、患者に必要な治療効果を得るのに、本発明の二重特異性を有する分子は少量のでよいため、高い細胞毒性活性を有するヒト化二重特異性を有する分子を提供することは、医療分野では主要な利点を示す。従って、本発明の二重特異性を有する分子は、高い細胞毒性活性と、ヒト化されているためより低い免疫原性とを同時に示すため、患者を治療する場合、従来技術の抗体を超える重要な利点を提供する。それゆえに、これらは医療分野において明確な改善を提供する。
【００３１】
本発明の二重特異性を有する結合分子は、上述の軽鎖のＣＤＲにおける３個のアミノ酸置換により、当業界で説明されているヒト化分子とは異なる。
抗体は、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列の影響を受ける分子内力を介して、その特異的な抗原と結合／相互作用するため、当業者は、抗体の生物活性を高めるためにＣＤＲ領域のアミノ酸配列中のアミノ酸は置換しないと予想される。その代わりに、当業者は、元のマウスＣＤＲ配列を保持すると予想される。従って、驚くべきことに、本発明の二重特異性を有する結合分子は、このように高い細胞毒性活性を有する。
【００３２】
特に好ましくは、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、Ｌ２４位のセリン、Ｌ５４位のバリン、および、Ｌ９６位のロイシンを有することを特徴とする。Ｌ２４位は、カバット（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）、および、http://www.bioinf.org.uk/absで説明されている通りに、軽鎖の２４位を意味する。同様に、Ｌ５４位およびＬ９６位はそれぞれ、カバットおよびＣｈｏｔｈｉａによって説明されている通りに、軽鎖の残基５４および９６を示す。
【００３３】
一実施形態において、本発明の二重特異性を有する結合分子はさらに、軽鎖の前記ＣＤＲ領域は、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、または、配列番号３、５または７の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明は、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、ｓｃＦｖであることを想定している。
用語「ｓｃＦｖ」（単鎖Ｆｖ）は、当業界では十分に理解されている。本明細書によれば、ｓｃＦｖが、サイズが小さく、これらの抗体の誘導体を組換えによって生産できる可能性があるために、好ましい。
【００３５】
さらに、ヒトＣＤ３複合体に結合する／ヒトＣＤ３複合体と相互作用する本発明の二重特異性を有する結合分子のドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列（本発明のヒト化ＣＤ３結合分子の軽鎖）を含む、もしくは、それらからなる、または、配列番号９の核酸配列によってコードされていることを想定している。
【００３６】
好ましくは、本発明の結合分子は、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインが、配列番号１４で示されたアミノ酸配列を含む、もしくは、それらからなる結合分子であるか、または、配列番号１３の核酸配列によってコードされている結合分子である。
【００３７】
本発明はさらに、二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインが、１またはそれ以上の細胞表面分子に特異的な少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である結合分子であることを想定している。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「細胞表面分子」は、細胞表面に存在する、または／および、それらに結合している分子を意味する。前記細胞表面分子の例は、膜タンパク質および膜貫通タンパク質（改変された変異体が挙げられ、例えばグリコシル化された変異体である）、前記タンパク質または細胞表面に結合した分子、同様に、例えば糖脂質のようなグリコシル化された成分である。付着は、好ましくは、内在性膜タンパク質、ＧＰＩ結合型（グリコシルホスファチジルイノシトール結合型）のタンパク質、その他のキャリアー分子（例えば糖成分、または、ガングリオシド成分）に共有結合または非共有結合で結合したタンパク質様または非タンパク質様の成分によってなされるものと理解される。好ましくは、前記細胞表面分子は、腫瘍特異的な分子である。腫瘍特異的な分子は、腫瘍関連の細胞表面抗原であり、これは、腫瘍細胞で独占的に見出されるか、または、良性細胞と比較して腫瘍細胞で過剰発現しているかののいずれかである。腫瘍関連の細胞表面抗原は、腫瘍細胞だけでなく、生存に必須ではない細胞／組織、または、腫瘍関連の細胞表面抗原を発現しない幹細胞で補充することができる細胞／組織でも発現させることができる。その上、腫瘍関連の細胞表面抗原は、悪性細胞でも良性細胞でも発現させることができるが、悪性細胞において対象の治療剤がよりよく利用することができる。過剰発現される腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ−３、および、ＨＥＲ−４である。腫瘍特異的な腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＥＧＦＲＶ−ＩＩＩである。生存に必須ではない細胞に存在する腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＰＳＭＡである。補充される細胞に存在する腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、および、ＣＤ３３である。良性の状態よりも悪性の状態でよく利用できる腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＥｐＣＡＭである。
【００３９】
好ましくは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である前記第二のドメインは、抗体由来の領域であり、これは、抗体の少なくとも１つの可変領域に対応するポリペプチド配列を含む。より好ましくは、前記第二のドメインは、追加のｓｃＦｖである。特に好ましい本発明の分子の形態は、二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの形態のポリペプチドコンストラクトを提供し、ここで、抗体由来の領域は、１つのＶＨと、１つのＶＬ領域とを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、どのような配列で並んでいてもよい。
【００４０】
用語「二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクト」は、上記で定義された、ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ３複合体と特異的に相互作用／結合することができる（少なくとも１つの）可変軽鎖からなる１つのドメインを含み、さらに、上記で定義された、さらなる抗原と特異的に相互作用／結合することができる（少なくとも１つの）可変領域（またはそれらの部分）からなる第二のドメインを含むコンストラクトに関する。可変領域の一部は、少なくとも１種のＣＤＲ（「相補性決定領域」）であってもよく、最も好ましくは、少なくともＣＤＲ３領域である。前記単鎖抗体コンストラクト中の２つのドメイン／領域は、好ましくは、単鎖として互いに共有結合している。この結合は、直接（ＣＤ３と相互作用するドメイン１−さらなる抗原と相互作用するドメイン２、または、さらなる抗原と相互作用するドメイン１−ＣＤ３と相互作用するドメイン２）、または、追加のポリペプチドリンカー配列を介して（ドメイン１−リンカー配列−ドメイン２、または、ドメイン２−リンカー配列−ドメイン１）のいずれかによって形成することができる。リンカーが用いられる場合、このリンカーは、好ましくは、第一および第二のドメインがそれぞれ独立して、それらの異なる結合特異性を互いに保持するのに十分な長さと配列を有する。最も好ましくは、さらに、添付の実施例で示されたように、「二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクト」は、二重特異性を有する単鎖Ｆｖ（ｂｓｃＦｖ）である。二重特異性を有する単鎖分子の分子形態は、当業界既知であり、例えばＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７年），１５８，３９６５〜３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５年），９２，７０２１〜７０２５；Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７年），４５，１９３〜１９７；Ｌoｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００年），９５，６，２０９８〜２１０３；Ｂｒuｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１年），１６６，２４２０〜２４２６で説明されている。このような本発明の二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの具体例は、以下で示し、添付の実施例で説明する。
【００４１】
本発明によれば、二重特異性を有する結合分子であり、ここで、前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ｂｈＣＧ、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ＧｌｏｂｏＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、血漿細胞抗原（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、および、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、および、ＣＯ−２９からなる群より選択される抗原と特異的に結合／相互作用する。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記第二のドメインは、ＣＤ１９分子と特異的に結合／相互作用する。
特に、本発明の、ＣＤ３およびＣＤ１９分子と特異的に結合／相互作用する二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることを想定している：
（ａ）配列番号１６または１８に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５または１７に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４３】
より好ましくは、二重特異性を有する結合分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２０に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１９に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４４】
前記二重特異性を有する結合分子は、好ましくは、二重特異性を有するｓｃＦｖコンストラクト（それによって、第一のｓｃＦｖは、ＣＤ３と特異的に結合／相互作用し、第二のｓｃＦｖは、ＣＤ１９と特異的に結合／相互作用する）である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ分子と特異的に結合／相互作用する。
特に、本発明の、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ分子と特異的に結合／相互作用する二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることを想定している：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、または、３２に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または、３１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４６】
より好ましくは、二重特異性を有する結合分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号３４または３６に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３３または３５に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４７】
前記二重特異性を有する結合分子は、好ましくは、二重特異性を有するｓｃＦｖコンストラクト（それによって第一のｓｃＦｖは、ＣＤ３と特異的に結合／相互作用し、第二のｓｃＦｖは、ＥｐＣＡＭと特異的に結合／相互作用する）である。
【００４８】
さらに好ましくは、本発明の二重特異性を有する結合分子の、前記少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位は、ヒト化されている。
さらなる実施形態において、本発明は、上記で定義された本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸配列を包含する。
【００４９】
好ましくは、前記核酸配列は、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号２０、３４、または、３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１９、３３、または、３５からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、または、からなるヌクレオチド配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義されたヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたタンパク質から誘導されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列に、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、および、最も好ましくは９９％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）遺伝子コードの縮重により得られた（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つのヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列。
【００５０】
用語「ハイブリダイゼーション（すること）」は、本明細書で用いられる場合、列挙された核酸配列もしくはそれらの部分の相補鎖、または、列挙された核酸配列もしくはそれらの部分にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドを意味する。それゆえに、前記核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ標本それぞれのノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用な可能性があり、または、それらそれぞれのサイズに応じたＰＣＲ解析でオリゴヌクレオチドプライマーとして用いることができる。好ましくは、前記ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、一方で、プローブとしてとして用いることができる本発明のハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも２００個、または、最も好ましくは少なくとも５００個のヌクレオチドを含む。
【００５１】
核酸分子を用いたハイブリダイゼーション実験をどのように実施するかは当業界周知であり、すなわち当業者は、本発明に従って使用すべきハイブリダイゼーション条件についてわかっている。このようなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記引用文中）のような標準的な教本や、当業者既知の、または、上記で列挙したその他の標準的な実験マニュアルに記載されている。本発明において好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチド、またはそれらの部分にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドである。
【００５２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」はすなわち、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および、２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、続いて、フィルターを０．１×ＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することを意味する。また、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする核酸分子も考慮される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにおける変更、および、シグナル検出は、主として、ホルムアミド濃度の操作（ホルムアミドをより低いパーセンテージにすると、低いストリンジェンシーが得られる）；塩の状態、または、温度によって達成される。例えば、より低いストリンジェンシーの条件には、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ｐｏ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベート；それに続いて、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで５０℃で洗浄が含まれる。加えて、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに続いて行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）で行ってもよい。注目すべきことに、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために用いられる代わりのブロッキング試薬を含ませたり、および／または、交換したりすることによって、上記の条件の変化形を得ることができる。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および、市販の商標登録された調合物が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含ませることは、相溶性の問題により上述のハイブリダイゼーション条件の改変が必要な場合がある。
【００５３】
列挙された核酸分子としては、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または、合成で生産されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、組換えによって生産されたキメラ核酸分子、または、それらのキメラの混合物（上記ポリヌクレオチドのいずれかを単独または組み合わせのいずれかで含む）が可能である。
【００５４】
当業者には当然であるが、本発明の核酸分子に調節配列を付加してもよい。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、および／または、本発明のポリヌクレオチドの誘導性の発現を可能にする配列を用いてもよい。適切な誘導性システムは、例えば、テトラサイクリンで調節された遺伝子発現［例えばＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２年），５５４７〜５５５１）、および、Ｇｏｓｓｅｎ等（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４年），５８〜６２）で説明されている］、または、デキサメタゾン誘導性の遺伝子発現系［例えばＣｒｏｏｋ（１９８９年）ＥＭＢＯ Ｊ．８，５１３〜５１９で説明されている］である。
【００５５】
その上、さらなる目的のために、核酸分子に、例えば、チオエステル結合、および／または、ヌクレオチド類似体を含ませる可能性も考慮される。前記改変は、細胞中のエンドおよび／またはエキソヌクレアーゼにする核酸分子の安定化に有用な場合がある。前記核酸分子は、細胞中の前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写することもできる。また当然ながら、この点において、このようなポリヌクレオチドは、「遺伝子ターゲティング」、または、「遺伝子治療」アプローチのために用いることができる。その他の実施形態において、前記核酸分子は、標識されている。核酸の検出方法は当業界周知であり、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲ、または、プライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチの際の上述の核酸分子の導入を確実に成功させるためのスクリーニング方法に有用である可能性がある。
【００５６】
前記核酸分子は、上述の核酸分子のいずれかを単独または組み合わせのいずれかで含む、組換えによって生産されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、上記核酸分子は、ベクターの一部である。
【００５７】
それゆえに、本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。
多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に既知であり、それらの選択は、所望の機能に依存すると予想され、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および、遺伝子工学で慣習的に用いられるその他のベクターが挙げられる。様々なプラスミドおよびベクターを構築するために、当業者既知の方法を用いることができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記引用文中）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），Ｎ．Ｙ．（１９８９年），（１９９４年）で説明されている技術を参照。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞へ運搬するためのリポソームに、再構成してもよい。以下でさらに詳細に考察するように、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが用いられた。関連配列を、特定のポリペプチドの発現が必要な発現ベクターに移行させることができる。典型的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、および、ｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
【００５８】
好ましくは、前記ベクターは、本明細書で定義された単鎖抗体コンストラクトをコードする前記核酸配列に作動可能に連結した調節配列である核酸配列を含む。
このような調節配列（調節要素）は、技術者に既知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳部位、および、ベクターにインサートを導入するための挿入部位を含んでいてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、真核または原核細胞で発現させることができる前記発現制御配列に作動可能に結合している。
【００５９】
前記ベクターは、本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることを想定している。
用語「調節配列」は、それらがライゲーションしたコード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を意味する。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて様々である。原核生物において、制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位、および、ターミネーターを含む。真核生物において、制御配列は、一般的に、プロモーター、ターミネーターを含み、さらに、いくつかの例では、エンハンサー、トランス転写活性化因子、または、転写因子も含む。用語「制御配列」は、最小限の全ての成分を含むものとし、その存在は発現に必要であり、さらに追加の有利な成分を含んでいてもよい。
【００６０】
用語「作動可能に連結した（operably linked）」は、これまでに説明したような成分が、それらの目的とする様式でそれらを作動させるような関係で並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。制御配列がプロモーターの場合、当業者には当然であるが、好ましくは二本鎖核酸が用いられる。
【００６１】
従って、列挙されたベクターは、好ましくは、発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換させるのに用いることができ、さらに、選択された宿主中でコード配列の発現を提供するコンストラクトである。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または、組み込み型ベクターが可能である。発現は、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物および／または真核細胞において発現を確実にする調節因子は当業者周知である。真核細胞の場合、このような調節因子は通常、転写の開始を確実にするプロモーター、および、場合により、転写の終結と転写の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞において発現を可能にする考えられる調節因子としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、または、ｔａｃプロモーターが挙げられ、さらに、真核宿主細胞において発現を可能にする調節因子の例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または、哺乳動物およびその他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【００６２】
転写開始に関与する要素の近傍に、このような調節因子は転写停止シグナルを含んでいてもよく、例えば、ポリヌクレオチド下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位、または、ｔｋ−ポリＡ部位である。さらに、用いられる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞の区画に方向付ける、または、それらを培地に分泌させることができるリーダー配列が、列挙された核酸配列のコード配列に付加されていてもよく、これらは当業界周知である；また、例えば添付の実施例３も参照。リーダー配列は、適切な段階で、翻訳、開始および終結配列、および、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはそれらの部分がペリプラスム間隙または細胞外の培地に分泌されるように仕向けることができるリーダー配列と統合される。場合により、異種配列は、望ましい特徴（例えば安定化、または、発現された組換え産物の簡単な精製）を付与するＮ末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる；上記参照。この文脈において、適切な発現ベクターは当業界既知であり、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ））、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ、または、ｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｍａｃｋ等．ＰＮＡＳ（１９９５年）９２，７０２１〜７０２５、および、Ｒａｕｍ等．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１年）５０（３），１４１〜１５０）、または、ｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ））である。
【００６３】
好ましくは、発現制御配列は、トランスフェクトする真核宿主細胞を形質転換することができるベクター中の真核生物プロモーター系と予想されるが、原核生物宿主のための制御配列も使用可能である。ベクターが適切な宿主に包含されると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適した条件下で維持され、要望に応じて、本発明の二重特異性を有する結合分子の回収および精製が続いて行われる；例えば、添付の実施例を参照。
【００６４】
細胞周期と相互作用するタンパク質を発現させるのに用いることができるその代わりの発現系は、昆虫系である。このようなシステムの一つに、アウトグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。列挙された核酸分子のコードの配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングしてもよく、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。前記コード配列をうまく挿入することは、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質のコートが欠失した組換えウイルスを生産することと予想される。次に、この組換えウイルスは、本発明のタンパク質が発現されるＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、または、トリコプルシア幼虫に感染させるのに用いられる（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６（１９８３年），５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１９９４年），３２２４〜３２２７）。
【００６５】
追加の調節因子は、転写エンハンサー、同様に、翻訳エンハンサーを含んでいてもよい。有利には、上述の本発明のベクターは、選択可能な、および／または、得点を付けることができる（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーを含む。
【００６６】
形質転換された細胞、例えば植物組織および植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者周知であり、例えば、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４年），１４３〜１４９）；アミノグルコシド系ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン耐性を付与するｎｐ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３年），９８７〜９９５）、および、ハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ ３２（１９８４年），４８１〜４８５）のための選択の基礎としての代謝拮抗物質耐性が挙げられる。追加の選択可能な遺伝子が説明されており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８年），８０４７）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）、および、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７年，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー編）、または、ブラストサイジンＳ耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５年），２３３６〜２３３８）が挙げられる。
【００６７】
また、有用な得点を付けることができるマーカーも当業者既知のであり、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６年），５９〜７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６年），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６年），４４〜４７）、または、β−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．６（１９８７年），３９０１〜３９０７）をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙されたベクターを含む細胞、組織、および、生物の簡単かつ迅速なスクリーニングに特に有用である。
【００６８】
上述したように、列挙された核酸分子は、細胞中で本発明の二重特異性を有する結合分子を発現させるために、単独で用いてもよいし、または、例えば精製のために、さらに遺伝子治療目的でもベクターの一部として用いてもよい。上述の本発明の二重特異性を有する結合分子のいずれか一方をコードするＤＮＡ配列を含む核酸分子またはベクターは、細胞に導入され、続いて、対象のポリペプチドがを生産される。遺伝子治療は、治療遺伝子をエクスビボまたはインビボ技術で細胞に導入することに基づいており、これは、遺伝子移入最も重要な応用の１つである。インビトロまたはインビボの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子運搬システムは、文献で説明されており、当業者既知である；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年），５３４〜５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６年），９１１〜９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２年），８０８〜８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９４年），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６年），３７０〜３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５年），１０７７〜１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ ９１（１９９８年），３０〜３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８年），６９２〜６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７年），２８９〜２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８年），２２４３〜５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年），７１４〜７１６；ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７，ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；ｏｒ Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６年），６３５〜６４０を参照。列挙された核酸分子およびベクターは、細胞への直接的な導入、または、リポソームまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルスベクター）を介した導入のために設計してもよい。好ましくは、前記細胞は、生殖細胞系細胞、胚細胞もしくは卵細胞、または、それらから誘導されたものであり、最も好ましくは、前記細胞は幹細胞である。胚幹細胞の例は、特に、Ｎａｇｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３年），８４２４〜８４２８で説明されているような幹細胞が挙げられる。
【００６９】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を提供する。前記宿主は、上述した少なくとも１種の本発明の前記ベクター、または、上述の本発明の核酸分子の少なくとも１種を宿主に導入することによって生産してもよい。宿主における前記少なくとも１種のベクターまたは少なくとも１種の核酸分子の存在が、上述の単鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子発現を媒介する可能性がある。
【００７０】
上述した宿主に導入される本発明の核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに統合されてもよいし、または、染色体外で維持されてもよい。
宿主は、あらゆる原核生物または真核細胞が可能である。
【００７１】
用語「原核生物」は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションが可能な全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、グラム陰性細菌、同様に、グラム陽性細菌が挙げられ、例えば大腸菌、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、および、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。用語「真核性の」は、酵母、高等植物、昆虫を含むものを意味し、好ましくは、哺乳動物細胞である。組換え生産法で用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質は、グリコシル化されていてもよいし、または、グリコシル化されていなくてもよい。特に好ましくは、本発明のポリペプチドのコード配列を含み、それらにＮ末端ＦＬＡＧ−タグおよび／またはＣ末端のＨｉｓ−タグが遺伝学的に融合したプラスミドまたはウイルスの使用である。好ましくは、前記ＦＬＡＧ−タグの長さは、約４〜８個のアミノ酸、最も好ましくは８個のアミノ酸である。上述したように、ポリヌクレオチドは、一般的に当業者既知の技術のいずれかを用いて、宿主を形質転換またはトランスフェクションさせるのに用いることができる。その上、融合した、作動可能に連結した遺伝子を製造し、それらを例えば哺乳動物細胞および細菌中で発現させる方法は当業界周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記引用文中）。
【００７２】
好ましくは、前記宿主は、細菌もしくは昆虫の細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である。
特に、列挙された宿主が哺乳動物細胞であることを想定している。特に好ましい宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０様の骨髄腫細胞系、または、ＮＳ／０が挙げられる。添付の実施例で説明されているように、宿主として特に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００７３】
より好ましくは、前記宿主細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系であり、例えばｐｅｒ．ｃ６である（Ｋｒｏｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２００３年，１９：１６３〜１６８）。
【００７４】
従って、さらなる実施形態において、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子の製造プロセスに関し、本プロセスは、本発明の細胞および／または宿主を、二重特異性を有する結合分子の発現に適した条件下／それらを発現させるような条件下で培養すること、および、細胞または培養物／培地から二重特異性を有する結合分子を単離／回収することを含む。
【００７５】
形質転換された宿主は、最適な細胞成長を達成するための当業界既知の技術に従って、発酵槽で成長させ、培養することができる。次に、本発明のポリペプチドは、増殖培地、細胞の溶解産物、または、細胞膜分画から単離することができる。例えば微生物により発現された本発明のポリペプチドの単離および精製は、例えば分取クロマトグラフィーによる分離、および、免疫学的な分離、例えば本発明のポリペプチドのタグに対して向けられたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含む分離のようなあらゆる従来の手段によって行われてもよいし、または、添付の実施例で説明されているようにして行われてもよい。
【００７６】
発現を可能にする宿主の培養条件は、このようなプロセスで用いられる宿主系および発現系／ベクターに依存することは当業界既知である。組換えポリペプチドの発現を可能にする条件を達成するために改変され得るパラメーターは、当業界既知である。従って、適切な条件は、さらに発明の進歩性を要する情報を要さず、当業者によって決定することができる。
【００７７】
発現されれば、本発明の二重特異性を有する結合分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当業界で標準的な手法に従って精製することができる；Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２年）を参照。少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、製薬で使用するためには、９８〜９９％またはそれを超える均一性が最も好ましい。部分的に、または、要望に応じて均一性になるまで精製したら、本発明の二重特異性を有する結合分子は、治療的に（例えば体外で）用いてもよいし、または、分析手法の開発や実施で用いてもよい。さらに、本発明の二重特異性を有する結合分子を培養物から回収する方法の例は、添付の実施例で詳細に説明される。
【００７８】
その上、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、上記で開示されたプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、本発明のベクターもしくは宿主を含む組成物を提供する。また、前記組成物は、場合により、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物を含んでいてもよい。最も好ましくは、前記組成物は、必要に応じて、キャリアー、安定剤および／または賦形剤の適切な調合物をさらに含む医薬組成物である。
【００７９】
本発明の観点において、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供する前記「タンパク質様化合物」は、例えばＴ細胞のための活性化シグナルであり得る。タンパク質様化合物の好ましい形態としては、二重特異性抗体、および、それらのフラグメントまたは誘導体、例えば二重特異性を有するｓｃＦｖが挙げられる。好ましくは、Ｔ細胞のための前記活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、より好ましくは、ＴＣＲのＣＤ３分子を介して提供され得る。タンパク質様化合物としては、これらに限定されないが、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体に特異的なｓｃＦｖ、または、超抗原が挙げられる。超抗原は、Ｔ細胞受容体の可変領域の所定のサブファミリーにＭＨＣ非依存性の形態で直接結合し、従って、一次的なＴ細胞活性化シグナルが仲介する。また、このようなタンパク質様化合物は、Ｔ細胞ではない免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供することもできる。Ｔ細胞ではない免疫エフェクター細胞の例としては、特に、Ｂ細胞、および、ＮＫ細胞が挙げられる。
【００８０】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくは人間の患者へ投与するための組成物に関する。好ましい実施形態において、本医薬組成物としては、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内投与のための、または、組織または腫瘍への直接の注射による投与のための組成物が挙げられる。特に、前記医薬組成物は、輸液または注射を介して患者に投与されることを想定している。適切な本組成物の投与は、様々な方法で、例えば、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、局所的または皮内投与で実行されてもよい。本発明の医薬組成物は、製薬上許容できるキャリアーをさらに含んでいてもよい。適切な製薬キャリアーの例は当業界周知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液、例えば油／水乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このようなキャリアーを含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適切な用量で被検体に投与することができる。用量の処方計画は、担当医と臨床的な因子によって決定されると予想される。医療業界では周知の通り、どの患者に対する投与量でも、患者の大きさ、体表面領域、年齢、投与しようとする具体的な化合物、性別、時間および投与経路、一般的な健康状態、および、同時に投与されるその他の薬物などの多くの因子に依存する。一般的に、本医薬組成物の規則的な投与としての処方計画は、１日あたり１μｇ〜５ｇ単位の範囲と予想される。しかしながら、連続的な輸液により好ましい用量は、１時間あたり、０．０１μｇ〜２ｍｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１ｍｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜１００μｇ、さらにより好ましくは０．０１μｇ〜５０μｇ、最も好ましくは０．０１μｇ〜１０μｇ単位／体重キログラムの範囲であり得る。特に好ましい投与量を以下で列挙する。定期的な評価によって進行をモニターすることができる。投与量は様々であると予想されるが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい用量は、ＤＮＡ分子の約１０６〜１０１２コピーである。本発明の組成物は、局所投与してもよいし、または、全身投与してもよい。投与は通常、非経口と予想され、例えば静脈内である；ＤＮＡはまた、標的部位を目標として投与してもよく、例えば、内部または外部標的部位への遺伝子銃の運搬によって、または、動脈内の部位へのカテーテルによって投与される。非経口投与のための調合物としては、滅菌水溶液、または、非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および、注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性キャリアーとしては、水、アルコール性溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液、例えば食塩水および緩衝化培地などが挙げられる。非経口の媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および、塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または、不揮発性油が挙げられる。静脈内の媒体としては、流体および栄養素の補給液、電解質補給液（例えば、リンガーデキストロースベースのもの）などが挙げられる。また、保存剤およびその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどが存在してもよい。加えて、本発明の医薬組成物は、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン（好ましくはヒト由来）のようなタンパク質様のキャリアーを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、タンパク質様のＣＤ３結合分子、または、同じものをコードする核酸分子もしくはベクター（本発明で説明されているような）に加えて、本医薬組成物の目的とする使用に応じてさらなる生物学的に活性な物質を含んでいてもよいということを想定している。このような物質としては、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、および／または、Ｔ細胞副刺激分子のような物質、または、当業界既知のサイトカインが挙げられる。
【００８１】
本発明の組成物の投与の可能な適用は、腫瘍性の疾患、ガン、特に上皮癌／癌腫、例えば乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、頭頚部ガン、非黒色皮膚ガン、尿生殖路のガン、例えば卵巣ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、および、腎臓ガン、肺ガン、胃ガン、小腸ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、食道ガン、唾液腺ガン、および、甲状腺ガン、または、その他の腫瘍性の疾患、例えば血液ガン、黒色腫、神経膠腫、肉腫、例えば骨肉種である。本発明の組成物の投与のさらなる適用は、増殖疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患である。
【００８２】
また、上述したような本発明の組成物は、診断用組成物であってもよく、本組成物は、場合により、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を検出するための手段および方法をさらに含む。
【００８３】
また、本発明の二重特異性を有する特異的な結合分子は、イムノアッセイでの使用にも適しており、この場合、本結合分子は、液相で、または、固相キャリアーに結合させて利用することができる。例えば診断目的で、本発明のポリペプチドを利用することができるイムノアッセイの例は、直接的または間接的な様式のいずれかでの、競合的および非競合的イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、酵素様免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリック分析）、ドットブロット、および、ウェスタンブロット分析である。例えば診断分析で二重特異性を有する結合分子を検出するのに用いることができる追加の分析は、ＦＡＣＳに基づく分析、細胞毒性分析（Ｃｒ５１，蛍光放出）、または、色素放出分析である。
【００８４】
本発明の二重特異性を有する特異的な結合分子を多くの様々なキャリアーに結合させて、さらに、前記ポリペプチドに特異的に結合した細胞を単離するのに用いることができる。周知のキャリアーの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアーの性質は、本発明の目的に応じて可溶性または不溶性のいずれでもよく、例えばビーズである。
【００８５】
前記診断用組成物は、１またはそれ以上の容器に入れてもよく、この容器には、必要に応じて緩衝液、貯蔵溶液、および／または、医療目的または科学的な目的の実施に必要なその他の試薬または材料が含まれる。その上、本発明の診断用組成物の一部は、バイアルまたはボトルに個別に包装してもよいし、または、容器またはマルチコンテナーユニット中で組み合わせてもよい。
【００８６】
当業者既知の多くの様々な標識および標識方法がある。本発明で用いることができる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および、生物発光化合物が挙げられる。
【００８７】
本発明の最も好ましい実施形態において、医薬組成物を製造するための、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された結合分子、本発明のベクターもしくは宿主の使用が考慮される。前記医薬組成物は、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患の予防、治療または改善に用いてもよい。
【００８８】
本発明はまた、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を予防、治療または改善する方法に関し、本方法は、このような予防、治療または改善が必要な被検体に、有効量の本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された結合分子、本発明のベクターもしくは宿主を投与することを含む。好ましくは、前記被検体はヒトである。
【００８９】
さらに、上記治療方法は、有効量の免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物の投与をさらに含むことも考慮される。好ましくは、前記タンパク質様化合物は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、ベクターもしくは宿主と同時に、または異なる時期に投与される。
【００９０】
最終的に、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、ベクターもしくは宿主を含むキットを提供する。
【００９１】
前記キットは、本発明の医薬組成物の製造において特に有用であり、特に、注射または輸液に有用な容器で構成されてもよい。有利には、本発明のキットは、必要に応じて緩衝液、貯蔵溶液、および／または、医療目的または科学的な目的の実施に必要なその他の試薬または材料をさらに含む。その上、本発明のキットの一部は、バイアルまたはボトルに個別に包装してもよいし、または、容器またはマルチコンテナーユニット中で組み合わせてもよい。本発明のキットは、特に本発明の方法を行うのに有利に用いることができ、さらに、例えば調査手段または医療的な手段として、本明細書で述べられた多種多様な適用で用いることができる。本キットの製造は、好ましくは、当業者既知の標準的な手法に従う。
【００９２】
これらのおよびその他の実施形態が開示されており、本発明の説明および実施例に包含される。本発明に従って用いることができる抗体、方法、使用および化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子装置を用いて、公共のライブラリーおよびデータベースから収集することもできる。例えば、インターネットで利用可能な公共データベース「メドライン（Ｍｅｄｌｉｎｅ）」が、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用可能である。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org/などのさらなるデータベースおよびアドレスが当業者既知であり、これもまた、例えば、http://www.lycos.com、または、http://www.google.comを利用して入手可能である。
【実施例】
【００９３】
以下、以下の生物学的な実施例を参照しながら本発明を説明するが、これらは単に説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
実施例１．
ＣＤ３抗原に特異的なヒト化抗体の生成
ＣＤ３の特異的な抗体ＯＫＴ３のＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ，ＥＡ，等．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版．第３巻．ベセスダ，メリーランド州：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１９９１年；２５９７．ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２を参照して決定された。
【００９４】
移植されたＣＤＲを受け入れるように選択されたヒトのフレームワーク領域は、重鎖および軽鎖それぞれに対してＫＯＬおよびＲＥＩであった。これらのタンパク質の構造は、結晶学的に解析された（ＲＥＩ：Ｐａｌｍ（１９７５年）Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３５６，１６７〜１９１，ＫＯＬ：Ｓｃｈｍｉｄｔ（１９８３年）Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３６４，７１３〜７４７）。
【００９５】
多数の追加のマウスの残基を、Ａｄａｉｒ １９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８に従って、ヒト可変領域フレームワークに導入した。改変されたこれらの残基は、元の抗原特異性の保持に重要である。軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に追加の突然変異を導入した。表２に、本発明のヒト化ＯＫＴおよび改善されたヒト化ＣＤ３のＣＤＲ配列を示す。図１Ａに、改善されたヒト化ＣＤ３結合分子の配列を示す；配列番号９〜１２。
【００９６】
【表２】
【００９７】
実施例２．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗体の構築
実施例２．１
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ３抗体の構築
得られたヒト化抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡを、遺伝子合成により得て、さらにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖとの遺伝学的な融合で処理し、二重特異性を有する単鎖抗体を得た（図１Ｂ，配列番号１９，２０）。二重特異性を有する単鎖抗体を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて、哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした。
【００９８】
実施例２．２
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗ＥｐＣＡＭｘ抗ＣＤ３抗体の構築
実施例１．１に記載の二重特異性を有するコンストラクトに加えて、異なる腫瘍特異性を有する、２種のさらなる二重特異性を有する単鎖抗体を構築した。二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３のＣＤ１９特異性を、２種の選択されたＥｐＣＡＭ抗体５−１０、および、３−１で置き換えた。このようにして、２つのＥｐＣＡＭ−特異的な二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（配列番号３５，３６）、および、抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（配列番号３３，３４）を得た。
【００９９】
実施例３．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗体の発現
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３、および、抗ＥｐＣＡＭｘｈｕｍ．抗ＣＤ３コンストラクト（配列番号１９，２０，３３，３４，３５，３６）を、Ｍａｃｋ，Ｍ．等（１９９５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，７０２１〜７０２５で説明されているように、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への安定なトランスフェクションによって発現させた。細胞をリン酸カルシウム処理した後に、発現ベクターのトランスフェクションを行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等．１９８９年）。
【０１００】
実施例４．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む単鎖二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳ解析
結合能力に関する機能性を試験するために、ＦＡＣＳ 解析を行った。
【０１０１】
実施例４．１
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる結合解析
ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞（ヒト前駆Ｂ細胞白血病）、および、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞性白血病）を用いた。２００，０００個のＮａｌｍ６細胞、および、２００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３の特異的なポリペプチドでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の純粋な細胞培養上清（５０μｌ）と、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、このコンストラクトの結合を、マウスのペンタＨｉｓ（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ）抗体（２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌで１：２０に希釈；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、そのＣ末端のヒスチジンタグを介して検出し、続いて洗浄工程を行い、フィコエリトリン結合Ｆｃガンマ特異的抗体（ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈した（図２Ａ，太線）。ネガティブコントロールとして、細胞培養上清の代わりに新しい細胞培地を用いた（図２，細線）。
【０１０２】
細胞を、ＦＡＣＳ−キャリバー（ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ，ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ハイデルベルグ）でフローサイトメトリーによって解析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＳｈｅｖａｃｈおよびＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年）で説明されているようにして行われた。二重特異性を有する結合分子の結合活性を、従来技術で説明されている通りに、ヒト化ＯＫＴ３部分を含む対応するコントロール二重特異性抗体の結合活性と比較した。
【０１０３】
図２で示されるように、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．ＯＫＴ３、および、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（改善されたｈｕｍ．ＯＫＴ３）はいずれも、ＣＤ１９およびＣＤ３によく結合した。
【０１０４】
実施例４．２
抗ＥｐＣＡＭｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる結合解析
ＥｐＣＡＭ特異的な二重特異性抗体の結合能力を試験するために、実施例４．１で説明されているような分析を、以下の改変を施して繰り返した：Ｎａｌｍ６細胞の代わりに、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用い（胃ガン細胞系；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０３）、ＥｐＣＡＭ二重特異性抗体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清を用いた。図２Ｂおよび２Ｃに、ＥｐＣＡＭ結合分析の結果を示す。コントロールとして、従来技術で説明されているようなヒト化ＯＫＴ３を含む対応する二重特異性抗体を用いた。
【０１０５】
図２Ｂおよび２Ｃで示されるように、本発明のヒト化抗ＣＤ３を含む二重特異性を有するコンストラクト（配列番号３４，３６）は、ヒト化ＯＫＴ３を含むコンストラクトよりも極めて優れた結合を示す。
【０１０６】
実施例５．
改善されたヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有するコンストラクトの精製
二重特異性を有する単鎖コンストラクトを精製するために、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションした抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３を、回収の前の７日間、ローラーボトル中でハイクローン（Ｒ）（ＨｉＣｌｏｎｅ（Ｒ））ＣＨＯ改変ＤＭＥＭ培地（ＨｉＱ）を用いて成長させた。この細胞を遠心分離によって分離し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。
【０１０７】
クロマトグラフィーには、Aｋｔａ ＦＰＬＣシステム（Ｒ）（ファルマシア）、および、ユニコーン（Ｕｎｉｃｏｒｎ）ソフトウェアを用いた。全ての化学物質は、研究グレードのものであり、シグマ（Ｓｉｇｍａ，ダイゼンホーフェン，ドイツ）、または、メルク（Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）から購入した。
【０１０８】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および、ゲルろ過を含む二工程精製プロセスで、ヒト化二重特異性を有する単鎖コンストラクトタンパク質を単離した。
【０１０９】
ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）は、製造元のプロトコールに従ってＺｎＣｌ２でローデングされたフラクトゲルカラム（Ｒ）（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ（Ｒ））（ファルマシア）を用いて行なわれた。このカラムを、緩衝液Ａ２（２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５，０．４ＭのＮａＣｌ）で平衡化させ、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に入れた。このカラムを緩衝液Ａ２で洗浄し、未結合のサンプルを除去した。結合したタンパク質は、緩衝液Ｂ２（２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５，０．４ＭのＮａＣｌ，０．５Ｍのイミダゾール）の二工程の勾配を用いて、すなわち工程１：カラム体積の１０倍量の２０％緩衝液Ｂ２；工程２：カラム体積の１０倍量の１００％緩衝液Ｂ２を用いて溶出させた。１００％工程から溶出したタンパク質分画をさらなる精製のためにプールした（図３）。
【０１１０】
ＰＢＳ（ギブコ）で平衡化させたセファデックスＳ２００ハイプレップカラム（Ｒ）（ＨｉＰｒｅｐ ｃｏｌｕｍｎ（Ｒ），ファルマシア）で、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、ウェスタンブロットで処理した。このカラムは、分子量決定（分子量マーカーキット，シグマＭＷ ＧＦ−２００）のために予め較正されていた（図４）。
【０１１１】
タンパク質分析用色素（マイクロＢＣＡ（Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ，ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））、および、標準タンパク質としてＩｇＧ（バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、精製されたコンストラクトのタンパク質の濃度を決定した。表２に、タンパク質の収率を示す。全てのコンストラクトが、細胞培養上清から精製することができた。抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（１６μｇ／ｍｌ）、および、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．ＯＫＴ３（１３，６μｇ／ｍｌ）について、匹敵する量の精製タンパク質が得られた。
【０１１２】
精製産物の分子量は、ＰＢＳ中のゲルろ過によって測定したところ、天然型の状態で５２ｋＤａであった。
既製の４〜１２％ビストリスゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で、精製された二重特異性を有するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプル調整および適用は、製造元のプロトコールに従った。マルチマークタンパク質標準（Ｒ）（ＭｕｌｔｉＭａｒｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｒ），インビトロジェン）を用いて分子量を決定した。ゲルをコロイド状のクーマシー（インビトロジェンのプロトコール）で染色したところ、５２ｋＤａでバンドが示された。単離したタンパク質の純度は、９５％を超えることが示された。
【０１１３】
オプティトランＢＡ−Ｓ８３メンブレン（Ｏｐｔｉｔｒａｎ ＢＡ−Ｓ８３ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｒ））、および、インビトロジェンのブロット・モジュール（Ｒ）（Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ））を製造元のプロトコールに従って用いて、ウェスタンブロットを行った。用いられた抗体は、ペンタＨｉｓ（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））、および、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（シグマ）であり、染色溶液は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ）であった。ヒト化二重特異性を有するタンパク質をウェスタンブロットで検出したところ、５２ｋＤのバンドが示され（図５Ｂ）、これは、クーマシー染色されたＳＤＳ−ゲルでは、精製された二重特異性を有するタンパク質に相当する（図５Ａ）。
【０１１４】
実施例６．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体の生物活性
構築された二重特異性抗体の高い細胞毒性活性を照明するために、以下の分析を行った。
【０１１５】
実施例６．１
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体（配列番号２０）
標的のＮＡＬＭ−６細胞（１．５×１０７）を、細胞培地中で３７℃で３０分間、１０μＭカルセインＡＭ（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で標識した。細胞培地中で２回洗浄した後、細胞を計数し、ＣＤ４陽性ＣＢ１５Ｔ細胞と混合した。得られたエフェクター標的細胞の混合物には、１ｍｌあたり、２×１０５のＮａｌｍ６細胞、および、２×１０６のＣＢ１５細胞（Ｅ：Ｔの比率は１：１０）が含まれていた。抗体をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで必要な濃度に希釈した。この溶液５０μｌを、細胞懸濁液に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞毒性反応の後に、インキュベート培地中に放出された色素を蛍光リーダーで定量し、細胞毒性化合物が含まれていないコントロール反応（ネガティブコントロール）と、完全に溶解させた細胞（１％サポニン中で１０分間）で蛍光シグナルが測定された反応（ポジティブコントロール）とからの蛍光シグナルと比較した。これらの測定値に基づき、以下の式に従って具体的な細胞毒性を計算した：［蛍光（サンプル）−蛍光（コントロール）］：［蛍光（完全な溶解物）−蛍光（コントロール）］×１００。
【０１１６】
典型的には、Ｓ字状の用量反応曲線は、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．），サンディエゴ，米国）によって決定されたように、０．９７を超えるＲ２値を有していた。生物活性を比較するために、解析プログラムによって計算されたあＥＣ５０値を用いた。図６に、ヒト化ＣＤ３部分を含むＣＤ１９およびＣＤ３に対する二重特異性抗体の細胞毒性を示す。従来技術で説明されているような、対応するヒト化ＯＫＴ３を含む二重特異性抗体を、コントロールとして用いた。
【０１１７】
二重特異性を有する形態では、二重特異性を有するヒト化改変ＣＤ３（ｈｕｍ．抗ＣＤ３）（配列番号２０）は、Ａｄａｉｒで説明されているようなヒト化ＯＫＴ３（ＥＣ５０値は、１９５ｐｇ／ｍｌ）と比較して、細胞毒性活性が明らかに増加していた（ＥＣ５０値＝５０ｐｇ／ｍｌ）。従って、これらの結果より、本発明の、改善されたヒト化抗体ＣＤ３への結合の主な利点が実証される。二重特異性を有する形態の改変ヒト化ＣＤ３の細胞毒性活性が約４倍増加していることにより、この分子は、治療用途において極めて有利である。より強い細胞毒性活性に基づき、治療に必要なタンパク質は、従来技術の分子よりも少量でよい。従って、本発明の二重特異性を有する分子は、高い細胞毒性活性と、ヒト化されているためより低い免疫原性とを同時に示すため、患者を治療する場合に、従来技術の抗体を超える重要な利点を提供する。それゆえに、これらは、医療分野において明らかな改善を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】ヒト化抗ＣＤ３抗体軽鎖および重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号９〜１２）
【図１Ｂ】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１９，２０）
【図１Ｃ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号３５，３６）
【図１Ｄ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号３３，３４）である。
【図２Ａ】様々なコンストラクトの、ＣＤ３およびＣＤ１９、または、ＥｐＣＡＭに対する結合親和性のＦＡＣＳ解析である。ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＣＤ３結合のＦＡＣＳ解析を行った。二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号２０）。ＣＤ１９への結合を、ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞を用いて示す。
【図２Ｂ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号３４）。ＥｐＣＡＭへの結合を、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用いて示す。
【図２Ｃ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号３６）。ＥｐＣＡＭへの結合を、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用いて示す。右側へのシフトは、結合を示す。
【図３】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の溶出パターンであり、Ｚｎ−キレーティング・フラクトゲル（Ｒ）（Ｚｎ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Ｒ））カラムからのタンパク質分画を含む。５０〜５３０ｍｌの保持時間の２８０ｎｍでの高い吸着は、カラム流出液中の非結合タンパク質によるものであった。６１７．４４ｍｌでのピークにおける矢印は、用いられた、またはさらに精製された二重特異性を有するヒト化コンストラクトを含むタンパク質分画を示す。
【図４】セファデックスＳ２００（Ｒ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ２００（Ｒ））ゲルろ過カラムからのタンパク質溶出パターンである。８２．４２ｍｌにおける抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３に対する二重特異性抗体を含むタンパク質ピークは、約５２ｋＤの分子量に相当する。４０〜１２０ｍｌの保持時間で分画を回収した。
【図５】Ａ）二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析タンパク質分画である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：細胞培養上清；レーン２：ＩＭＡＣ溶出液；レーン３：ゲルろ過凝集ピーク；レーン４：精製された二重特異性抗体の抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３； Ｂ）精製された二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の、ウェスタンブロット解析である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：細胞培養上清；レーン２：ＩＭＡＣ溶出液；レーン３：ゲルろ過凝集ピーク；レーン４：ゲルろ過から得られた、精製された二重特異性抗体抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３である。
【図６】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体（配列番号２０）の細胞毒性分析である。ＮＡＬＭ−６細胞を標的細胞として用い、ＣＤ４陽性ＣＢ１５Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた（Ｅ：Ｔの比率は１：１０）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子を提供し、本結合分子において、前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、さらに、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、特異的なアミノ酸置換を含む特に同定されたアミノ酸配列であり、さらに、第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む。本発明はさらに、本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および、前記ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。その上、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子の製造方法、および、本発明の二重特異性を有する結合分子を含む組成物、本発明の核酸分子、または、本発明の宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書本文中に、数々の文書が引用されている。本明細書で引用されたそれぞれの文書（あらゆる製造元の仕様書、説明書などを含む）は、参照により本発明に含まれる。
遺伝子工学が開発されてから、免疫療法は、多数の重篤な病気（例えば腫瘍性の疾患）の治療に用いられてきた。しかしながら、非ヒト源由来の抗体の使用は、ヒトの治療計画の一環としてを用いられる場合、数々の問題を引き起こす。
【０００３】
まず第一に、非ヒト源の抗体は、「サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）」を引き起こす可能性がある。ＣＲＳは、最初の少量の抗ＣＤ３抗体の投与の後に観察される臨床症候群であり、さらに、多くのＣＤ３に対して向けられた抗体は分裂促進性であるということに関連している。ＣＤ３に対して向けられたインビトロの分裂促進性の抗体は、Ｔ細胞増殖とサイトカイン生産を誘導する。インビボでのこの分裂促進性の活性により、最初の抗体注射後の数時間以内に大規模なサイトカイン（多くのＴ細胞由来のサイトカインなど）放出が引き起こされる。ＣＤ３特異的抗体の分裂促進能は、単球／マクロファージ依存性であり、さらに、これらの細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１β生産に関与する。ＣＲＳの症状は、頻繁に報告されている軽度の「インフルエンザ様の」症状から、それほど頻繁に報告されていない重度の「ショック様の」反応（これは、心血管症状および中枢神経症状を含み得る）にまで及ぶ。症状としては、特に、頭痛、震え、吐き気／嘔吐、下痢、腹痛、倦怠感、および、筋肉／関節の痛み、ならびに、疼痛、全身衰弱、呼吸循環系の現象、同様に、神経精神病学的な現象が挙げられる。重度の肺水腫は、体液過剰の患者に起こり、さらに体液過剰ではないようにみえる患者にも起こる。（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ，２００３年 Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１２３〜１３２）。
【０００４】
第二に、マウス抗体は、ヒト抗マウス抗体の体液性免疫応答（ＨＡＭＡｓ）によって認識されており、小さい治療域を得ることになる（Ｓｃｈｒｏｆｆ（１９８５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：８７９〜８８５，Ｓｈａｗｌｅｒ（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０〜１５３５）。ＨＡＭＡｓは、典型的には、マウス治療抗体での処理の第二週中に発生し、それらの目的とする標的への結合をブロックすることによってマウス抗体を中和する。ＨＡＭＡ応答は、マウスの定常（「Ｆｃ」）抗体領域、または／および、マウスの可変（「Ｖ」）領域の性質によって様々であり得る。この宿主反応は、抗体の薬物動態学的な特徴を劇的に変化させ、それにより迅速に抗体が除去され、繰り返しの投与を妨げる（Ｒｅｆｆ，２００２年 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９：１５２〜１６６）。
【０００５】
治療抗体の免疫原性に対処するために、４種の基礎的な抗体方法；キメラ化、完全ヒトＶ領域の提供、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、および、ヒト化が適用されてきた。キメラ抗体では、定常領域は免疫原性に重要な成分に寄与するということに基づいて、マウス定常領域がヒト定常領域で置換される。完全ヒトＶ領域を作製するアプローチが２つあり、それは、ファージライブラリーからヒト抗体のＶ領域を選択すること、および、それら自身の免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン遺伝子で置換されたトランスジェニックマウスを提供すること、である。脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）では、特異的な免疫原性ペプチドが、特定のアルゴリズムに従って、免疫原性が減少した、または、免疫原性ではないペプチドによって変化する。
【０００６】
一般的に、ヒト化は、例えばＣＤＲグラフティングを用いた場合のように、可変領域中の非ヒト抗体フレームワーク配列を対応するヒト配列で置換することを必然的に伴う。従来技術では、抗体をヒト化する数種のアプローチが説明されている。これらの方法の１つは、外来のフレームワークへのＣＤＲグラフティングであり、この方法では、ある種由来のＣＤＲがヒトのフレームワークにグラフティングされる（ＥＰ２３９４００）。しかしながら、このようなヒト化抗体は、結合親和性が不十分であるという問題を有することが多い（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７）。これは、ヒトのフレームワークに追加の突然変異を導入して上述のアプローチを改変することによって克服することができる。このような方法が用いられている例は、ＥＰ４６９１６７、ＥＰ９７１９５９、ＥＰ９４０４６８で説明されている。抗体をヒト化するその他のアプローチは、ファージディスプレイによるヒト化（ＵＳ５，５６５，３２２）、および、表面の改変（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）／表面の修飾（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）によるヒト化であり、この場合、抗体の表面に露出したアミノ酸を同定し、ヒトのフレームワークに類似した、または同一なアミノ酸で置換する（例えばＥＰ５１９５９６、ＥＰ５９２１０６を参照）。
【０００７】
ヒトＣＤ３は、多分子のＴ細胞複合体の一部としてＴ細胞で発現される抗原を意味し、３種の異なる鎖：ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δおよびＣＤ３−γからなる。例えば固定化抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞でのＣＤ３のクラスター化は、Ｔ細胞受容体の関与と同様のＴ細胞の活性化を引き起こすが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係である；（ＷＯ９９／５４４４０、または、Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：５〜８を参照）。
【０００８】
従来技術において、ＣＤ３抗原を特異的に認識する抗体が説明されており、例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ１０（１９９１年），３６５５〜９、および、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８年），７６３〜７７２で説明されている。最近、多種多様な病気の治療において、ＣＤ３に対して向けられた抗体が提唱されている。これらの抗体または抗体コンストラクトは、ＥＰ１０２５８５４で開示されたような、Ｔ細胞除去物質または分裂促進性の物質のいずれかとして作用する。ＷＯ００／０５２６８には、ヒトＣＤ３抗原複合体に特異的に結合するヒト／げっ歯類ハイブリッド抗体が開示されており、例えば腎臓移植後の拒絶反応の出現の治療、敗血症および心臓同種移植片のための免疫抑制剤として提唱されている。ＷＯ０３／０４６４８は、ＣＤ３と卵巣ガン抗原に対して向けられた二重特異性抗体を開示している。その上、Ｋｕｆｅｒ（１９９７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４５：１９３〜７は、わずかに残留したガンを処理するためのＣＤ３とＥｐＣＡＭに特異的な二重特異性抗体に関する。
【０００９】
ＣＤ３に結合する抗体をヒト化する数々の試みが行われてきた。ＵＳ５，９２９，２１２、ＵＳ５，８５９，２０５、ＷＯ９１／０９９６８、ＷＯ９１／０９９６７、および、Ａｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８は、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３のためのヒト化方法を説明しており、ここで、マウス（ドナー）ＣＤＲは、ヒト（アクセプター）フレームワークにグラフティングされ、そのフレームワークにドナーアミノ酸残基が導入される。ＵＳ６，４０７，２１３、および、ＷＯ９２／２２６５３は、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体を説明しており、ここで、最小数のマウスＣＤＲとＦＲ残基が、マウスの親抗体と同等の抗原結合親和性と生物学的な特性を達成するために、必要に応じてコンセンサスヒト可変ドメイン配列のなかに導入される。ヒト化ＣＤ３抗体のさらなる例は、ＥＰ０６２６３９０（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，８８５，５７３（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，８３４，５９７（ＯＫＴ３）、ＵＳ５，５８５，０９７（ＹＴＨ１２．５）、および、ＵＳ２００２１３１９６８（ＹＴＨ１２．５）である。
【００１０】
しかしながら、二重特異性を有する結合分子型のＯＫＴ３から誘導されたヒト化抗体コンストラクトは、ＣＤ３への結合／ＣＤ３との相互作用を介してシグナルを誘導する能力などの特異的な活性を減少させることが観察されている。
【発明の開示】
【００１１】
従って、本発明の根底にある技術的課題は、極めて効率的な抗体由来の化合物を提供するための手段および方法を提供することであり、これは、ヒトの病気の治療に有用である可能性があり、副作用が低いものである。副作用は化合物の免疫原性により誘導され、その結果化合物の活性が減少するが、本発明では特に、副作用の減少を目的とする。
【００１２】
前記技術的な問題に対する解決は、特許請求の範囲で特徴を示された実施形態を提供することによって達成される。
従って、本発明は、少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子に関し、ここで、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、ここで、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉｉ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列、
であり、ただし、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）システムに従って、軽鎖のＣＤＲ領域のＬ２４位、Ｌ５４位およびＬ９６位にアミノ酸置換を含み；および、
（ｂ）第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「〜との結合／相互作用」は、少なくとも２つの「抗原相互作用部位」が互いに結合／相互作用することを定義する。本発明に係る用語「抗原相互作用部位」は、特異的な抗原または抗原の特異的な基と特異的な相互作用をする能力を示すポリペプチドのモチーフを意味する。前記結合／相互作用はまた、「特異的な認識」を意味するものとしても理解される。本発明に係る用語「〜を特異的に認識する」は、抗体分子が、ここで定義されるヒト標的分子それぞれのアミノ酸のうち少なくとも２つと特異的に相互作用する、および／または、それらに特異的に結合することができることを意味する。抗体は、同じ標的分子上の異なるエピトープを認識し、それらと相互作用すること、および／または、それらに結合することができる。前記用語は、抗体分子の特異性に関し、すなわち、それらのここで定義されるヒト標的分子の特異的な領域を区別する能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用により、例えば抗原のコンフォメーション変化の誘導、抗原のオリゴマー化等によってシグナルの開始が起こる可能性がある。従って、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的なモチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果、同様に、前記構造の二次的な改変の結果である。
【００１４】
本発明で用いられる用語「特異的な相互作用」は、本発明の二重特異性を有する結合分子のＣＤ３特異的ドメインが、類似構造を有する（ポリ）ペプチドと交叉反応しない、または、実質的に交叉反応しないことを意味するものと理解される。調査中の結合分子のパネルの交叉反応性は、例えば、従来の条件下での、対象の（ポリ）ペプチド、同様に、多数の、程度の差はあるが（構造的および／または機能的に）密接に関連した（ポリ）ペプチドへの、単鎖結合分子の前記パネルの結合を評価することによって試験してもよい（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），１９８８年、および、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９９９年を参照）。これらの方法は、特に、構造的および／または機能的に密接に関連した分子との結合研究、ブロックおよび競合研究を含んでいてもよい。また、これらの結合研究は、ＦＡＣＳ 解析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，例えばビアコア（Ｒ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ））を使用）、分析用の超遠心分離法、等温滴定熱量計、蛍光異方性、蛍光分光分析も含み、または、放射標識したリガンド結合分析による。従って、抗原相互作用部位と特異的な抗原と特異的な相互作用に関する例には、その受容体のためのリガンドの特異性が含まれていてもよい。前記定義は特に、その特異的な受容体に結合する際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例には、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用／結合するサイトカインが含まれる。前記相互作用のその他の例（特に前記定義にも含まれる）は、抗原決定基（エピトープ）と、抗原性の抗体結合部位との相互作用である。また、前記相互作用は、抗原性の抗体結合部位の類似の構造を有するその他のエピトープとの交叉反応性がない、または、実質的にないことも特徴とする。
【００１５】
当然ながら、用語「〜との結合／相互作用」の定義には、結合ドメインと、直鎖状エピトープとの結合／相互作用、同様に、立体配座的なエピトープ（構造的なエピトープ、または、不連続エピトープともいう）との結合／相互作用が含まれるものとする。対応するエピトープの定義は、当業界既知である。例えば、前記エピトープは、ヒト標的分子の２つの領域、またはそれらの部分からなる可能性がある。本明細書によれば、立体配座的なエピトープは、ポリペプチドが天然型タンパク質に折り畳まれる際に分子表面上に集まった一次配列中の、分離された２またはそれ以上の別々のアミノ酸配列によって定義される（Ｓｅｌａ，（１９６９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６，１３６５、および、Ｌａｖｅｒ，（１９９０年）Ｃｅｌｌ ６１，５５３〜６）。
【００１６】
用語「不連続エピトープ」は特に、本明細書によれば、ポリペプチド鎖の遠い部分からの残基で構築される非直鎖状エピトープを定義するものとする。これらの残基は、ポリペプチド鎖が、立体配座的／構造的なエピトープが構成されるように三次元構造に折り畳まれる際に表面上に集まる。
【００１７】
また、本発明の結合分子は、立体配座的なエピトープを含む少なくとも１つの結合ドメインと、特異的に結合／特異的に相互作用することも想定しており、これは、ヒトＣＤ３複合体の少なくとも２つの領域で構成される、および／または、それらを含む、または、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δ、および、ＣＤ３−γのような個々の成分および／または前記成分の組み合わせ、例えばＣＤ３−ε／ＣＤ３−δ、または、ＣＤ３−ε／ＣＤ３γで構成される、または、それらを含む。その上、本明細書で説明される前記立体配座的／構造的なエピトープは、ヒトＣＤ３複合体の単一の成分の少なくとも２つの領域の個々の部位／領域／伸長、好ましくは、ＣＤ３−ε（さらにより好ましくはＣＤ３−ε）の細胞外ドメイン少なくとも２つの部位／領域／伸長を含むことを想定している。
【００１８】
ここで定義されるように、本発明の二重特異性を有する結合分子のの第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインに結合する。用語「エフェクタードメイン」は、本発明によれば、一次または二次刺激シグナルの誘導、細胞傷害効果の誘導（例えば、アポトーシスを誘導するシグナルなど）、または、単に特異的な抗原相互作用部位と特異的に結合／特異的に相互作用する能力を有することのような生物学的作用を開始させる本発明の分子のドメインを特徴とする。また、「細胞傷害効果」は、Ｔ細胞によって発生する細胞性の細胞毒性も含む。従って、本発明の二重特異性を有する結合分子は、少なくとも２種の異なる特異性を特徴とする。
【００１９】
特異性は、当業界既知の方法、および、本明細書で開示および説明されている方法によって実験的に決定することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、および、ペプチドスキャンが挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ＣＤＲ」は、「相補性決定領域」に関し、これは当業界周知である。ＣＤＲは、前記分子の特異性を決定する免疫グロブリンの一部であり、および、特異的なリガンドと接触する。ＣＤＲは、上記分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がある。ＣＤＲ−Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を特徴とし、ＣＤＲ−Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。Ｈは可変重鎖を意味し、Ｌは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）），Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９年；Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７〜８８３）で説明されているようにして決定してもよい。
【００２１】
「カバットシステム」は、本発明によれば、カバット（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）に従い一貫した方法で残基を番号付ける基準を意味する。この番号付けは、当業者に広く用いられており、抗原結合活性に重要な可変ドメイン領域の配列の変異性および３次元ループに基づく。軽鎖または重鎖の残基は全て、別個のカバットの位置を有する；すなわち、カバットの番号付けは、ＣＤＲ、同様に、フレームワークに適用される。あらゆる抗体の特異的な残基の位置は、カバットに従って番号付けすることができる。抗体の特異的な残基の番号付け、およびカバットの位置は、http://www.bioinf.org.uk/absで示されている。例えば、本発明で言及されるＬ２４位は、カバットシステムによる軽鎖中の２４番目の残基を意味する。従って、Ｌ５４、および、Ｌ９６は、カバットシステムに従って、抗体の軽鎖中の５４位および９６位を意味する。
【００２２】
カバットによるＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ領域を同定するための規則は、www.bioinf.org.uk/abs、および、表１に示されている。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明によれば、フレームワーク領域は、免疫グロブリンのＶドメイン（ＶＨまたはＶＬドメイン）、および、抗原と接触する超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）のためのタンパク質の足場を提供するＴ細胞受容体中の領域に関する。各Ｖドメインには、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および、ＦＲ４と名付けられた４つのフレームワーク領域がある。フレームワーク１は、ＶドメインのＮ末端からＣＤＲ１の始点までの領域を包含し、フレームワーク２は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２都の間の領域に関し、フレームワーク３は、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間の領域を包含し、および、フレームワーク４は、ＣＤＲ３の終点からＶドメインのＣ末端までの領域を意味する；特に、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００１年，第５版を参照。従って、上記フレームワーク領域は、ＶＨまたはＶＬドメイン中のＣＤＲ領域の外側の全ての領域を包含する。
【００２５】
当業者であれば、所定の配列からフレームワーク領域とＣＤＲを容易に推測することができる；Ｋａｂａｔ（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省，Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７〜８８３を参照。
【００２６】
本発明に係る「二重特異性を有する結合分子」は、必然的に、１つのドメインによってヒトＣＤ３複合体および／またはその個々の成分に特異的に結合する（ポリ）ペプチドである。本明細書で用いられる用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドのグループ、同様に、ポリペプチドのグループを含む、分子のグループを説明している。ペプチドのグループは、３０個までのアミノ酸を有する分子で構成され、ポリペプチドのグループは、３０個より多いアミノ酸からなる分子で構成される。最も好ましくは、前記「二重特異性を有する結合分子」は、抗体、抗体フラグメント、抗体の誘導体、特異的に結合するペプチド、および、特異的に結合するタンパク質からなる群より選択される。前記抗体フラグメントは当業界既知であり、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ−フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなどが挙げられる。抗体の誘導体としては、これらに限定されないが、標識された抗体／抗体フラグメント、同様に、化学修飾された抗体分子／抗体フラグメントが挙げられる。以下で詳細に述べるように、特に好ましい本発明に係る抗体の誘導体は、ｓｃＦｖである。
【００２７】
本発明の二重特異性を有する結合分子の１つのドメインは、ヒト化されたＣＤＲグラフティングされたＣＤ３−抗体から誘導される。本明細書において抗体と抗体コンストラクトの文脈で用いられる用語「ヒト化」は、非ヒト配列の対応するヒト配列での置換と定義することができる。これは、マウスＣＤＲをヒトのフレームワークにグラフティングすること、または、マウスのフレームワーク中の一つのアミノ酸を対応する位置の一つのヒトアミノ酸でを置換することによって達成できる。加えて、本発明で用いられる用語ヒト化は、タンパク質の結合または細胞毒性活性を改善するために、さらなる突然変異を導入することも包含する。これらのさらなる突然変異は、必ずしもマウス残基のヒト残基への置換でなくてもよい。
【００２８】
所定のアミノ酸配列中の、アミノ酸、特に特定の位置のアミノ酸を、特別に選択されたアミノ酸で置換する方法は当業者既知であり、標準的な実験方法の代表である。このような方法の例は、プライマー変異誘発である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等．１９８９年）。
【００２９】
驚くべきことに、上記で二重特異性を有する結合分子に関して説明されているように、軽鎖のＣＤＲに追加のアミノ酸置換を含むヒト化ＣＤ３の特異的な抗体コンストラクトは、細胞毒性活性を有することが見出された。これらの分子は、標的細胞において細胞死を誘導するする能力を有する。それに対して、ヒト化ＣＤ３の特異的な抗体コンストラクト（当業界で、例えばＡｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８で説明されている）は、前記コンストラクトが上記で定義された二重特異性を有する結合分子と一緒に発現されると、標的細胞において細胞死を誘導するする能力が著しく機能が損なわれていることが示される。
【００３０】
特に、本発明の二重特異性を有する分子は、その特異的なエピトープへの顕著な結合（実施例４，図２を参照）、および、高い細胞毒性活性（実施例６，図６）を示す。本発明の、ＣＤ３結合部分の軽鎖のＣＤＲに置換を有する二重特異性を有するヒト化ＣＤ３は、５０ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値示すが、それに対して、ヒト化ＯＫＴ３を含む二重特異性抗体コンストラクト（Ａｄａｉｒ，１９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８で説明されている）のＥＣ５０値は、１９５ｐｇ／ｍｌである。細胞毒性活性が４倍も高いため、本発明の二重特異性を有する分子は、治療活動に効果的に用いることができる。その上、患者に必要な治療効果を得るのに、本発明の二重特異性を有する分子は少量のでよいため、高い細胞毒性活性を有するヒト化二重特異性を有する分子を提供することは、医療分野では主要な利点を示す。従って、本発明の二重特異性を有する分子は、高い細胞毒性活性と、ヒト化されているためより低い免疫原性とを同時に示すため、患者を治療する場合、従来技術の抗体を超える重要な利点を提供する。それゆえに、これらは医療分野において明確な改善を提供する。
【００３１】
本発明の二重特異性を有する結合分子は、上述の軽鎖のＣＤＲにおける３個のアミノ酸置換により、当業界で説明されているヒト化分子とは異なる。
抗体は、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列の影響を受ける分子内力を介して、その特異的な抗原と結合／相互作用するため、当業者は、抗体の生物活性を高めるためにＣＤＲ領域のアミノ酸配列中のアミノ酸は置換しないと予想される。その代わりに、当業者は、元のマウスＣＤＲ配列を保持すると予想される。従って、驚くべきことに、本発明の二重特異性を有する結合分子は、このように高い細胞毒性活性を有する。
【００３２】
特に好ましくは、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、Ｌ２４位のセリン、Ｌ５４位のバリン、および、Ｌ９６位のロイシンを有することを特徴とする。Ｌ２４位は、カバット（１９９１年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２ 米国保健社会福祉省）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１〜９１７）、および、http://www.bioinf.org.uk/absで説明されている通りに、軽鎖の２４位を意味する。同様に、Ｌ５４位およびＬ９６位はそれぞれ、カバットおよびＣｈｏｔｈｉａによって説明されている通りに、軽鎖の残基５４および９６を示す。
【００３３】
一実施形態において、本発明の二重特異性を有する結合分子はさらに、軽鎖の前記ＣＤＲ領域は、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、または、配列番号３、５または７の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明は、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、ｓｃＦｖであることを想定している。
用語「ｓｃＦｖ」（単鎖Ｆｖ）は、当業界では十分に理解されている。本明細書によれば、ｓｃＦｖが、サイズが小さく、これらの抗体の誘導体を組換えによって生産できる可能性があるために、好ましい。
【００３５】
さらに、ヒトＣＤ３複合体に結合する／ヒトＣＤ３複合体と相互作用する本発明の二重特異性を有する結合分子のドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列（本発明のヒト化ＣＤ３結合分子の軽鎖）を含む、もしくは、それらからなる、または、配列番号９の核酸配列によってコードされていることを想定している。
【００３６】
好ましくは、本発明の結合分子は、ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインが、配列番号１４で示されたアミノ酸配列を含む、もしくは、それらからなる結合分子であるか、または、配列番号１３の核酸配列によってコードされている結合分子である。
【００３７】
本発明はさらに、二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインが、１またはそれ以上の細胞表面分子に特異的な少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である結合分子であることを想定している。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「細胞表面分子」は、細胞表面に存在する、または／および、それらに結合している分子を意味する。前記細胞表面分子の例は、膜タンパク質および膜貫通タンパク質（改変された変異体が挙げられ、例えばグリコシル化された変異体である）、前記タンパク質または細胞表面に結合した分子、同様に、例えば糖脂質のようなグリコシル化された成分である。付着は、好ましくは、内在性膜タンパク質、ＧＰＩ結合型（グリコシルホスファチジルイノシトール結合型）のタンパク質、その他のキャリアー分子（例えば糖成分、または、ガングリオシド成分）に共有結合または非共有結合で結合したタンパク質様または非タンパク質様の成分によってなされるものと理解される。好ましくは、前記細胞表面分子は、腫瘍特異的な分子である。腫瘍特異的な分子は、腫瘍関連の細胞表面抗原であり、これは、腫瘍細胞で独占的に見出されるか、または、良性細胞と比較して腫瘍細胞で過剰発現しているかののいずれかである。腫瘍関連の細胞表面抗原は、腫瘍細胞だけでなく、生存に必須ではない細胞／組織、または、腫瘍関連の細胞表面抗原を発現しない幹細胞で補充することができる細胞／組織でも発現させることができる。その上、腫瘍関連の細胞表面抗原は、悪性細胞でも良性細胞でも発現させることができるが、悪性細胞において対象の治療剤がよりよく利用することができる。過剰発現される腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ−３、および、ＨＥＲ−４である。腫瘍特異的な腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＥＧＦＲＶ−ＩＩＩである。生存に必須ではない細胞に存在する腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＰＳＭＡである。補充される細胞に存在する腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、および、ＣＤ３３である。良性の状態よりも悪性の状態でよく利用できる腫瘍関連の細胞表面抗原の例は、ＥｐＣＡＭである。
【００３９】
好ましくは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である前記第二のドメインは、抗体由来の領域であり、これは、抗体の少なくとも１つの可変領域に対応するポリペプチド配列を含む。より好ましくは、前記第二のドメインは、追加のｓｃＦｖである。特に好ましい本発明の分子の形態は、二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの形態のポリペプチドコンストラクトを提供し、ここで、抗体由来の領域は、１つのＶＨと、１つのＶＬ領域とを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、どのような配列で並んでいてもよい。
【００４０】
用語「二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクト」は、上記で定義された、ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ３複合体と特異的に相互作用／結合することができる（少なくとも１つの）可変軽鎖からなる１つのドメインを含み、さらに、上記で定義された、さらなる抗原と特異的に相互作用／結合することができる（少なくとも１つの）可変領域（またはそれらの部分）からなる第二のドメインを含むコンストラクトに関する。可変領域の一部は、少なくとも１種のＣＤＲ（「相補性決定領域」）であってもよく、最も好ましくは、少なくともＣＤＲ３領域である。前記単鎖抗体コンストラクト中の２つのドメイン／領域は、好ましくは、単鎖として互いに共有結合している。この結合は、直接（ＣＤ３と相互作用するドメイン１−さらなる抗原と相互作用するドメイン２、または、さらなる抗原と相互作用するドメイン１−ＣＤ３と相互作用するドメイン２）、または、追加のポリペプチドリンカー配列を介して（ドメイン１−リンカー配列−ドメイン２、または、ドメイン２−リンカー配列−ドメイン１）のいずれかによって形成することができる。リンカーが用いられる場合、このリンカーは、好ましくは、第一および第二のドメインがそれぞれ独立して、それらの異なる結合特異性を互いに保持するのに十分な長さと配列を有する。最も好ましくは、さらに、添付の実施例で示されたように、「二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクト」は、二重特異性を有する単鎖Ｆｖ（ｂｓｃＦｖ）である。二重特異性を有する単鎖分子の分子形態は、当業界既知であり、例えばＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７年），１５８，３９６５〜３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５年），９２，７０２１〜７０２５；Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７年），４５，１９３〜１９７；Ｌoｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００年），９５，６，２０９８〜２１０３；Ｂｒuｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１年），１６６，２４２０〜２４２６で説明されている。このような本発明の二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの具体例は、以下で示し、添付の実施例で説明する。
【００４１】
本発明によれば、二重特異性を有する結合分子であり、ここで、前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ｂｈＣＧ、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ＧｌｏｂｏＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、血漿細胞抗原（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、および、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、および、ＣＯ−２９からなる群より選択される抗原と特異的に結合／相互作用する。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記第二のドメインは、ＣＤ１９分子と特異的に結合／相互作用する。
特に、本発明の、ＣＤ３およびＣＤ１９分子と特異的に結合／相互作用する二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることを想定している：
（ａ）配列番号１６または１８に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５または１７に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４３】
より好ましくは、二重特異性を有する結合分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２０に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１９に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４４】
前記二重特異性を有する結合分子は、好ましくは、二重特異性を有するｓｃＦｖコンストラクト（それによって、第一のｓｃＦｖは、ＣＤ３と特異的に結合／相互作用し、第二のｓｃＦｖは、ＣＤ１９と特異的に結合／相互作用する）である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ分子と特異的に結合／相互作用する。
特に、本発明の、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ分子と特異的に結合／相互作用する二重特異性を有する結合分子は、前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることを想定している：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、または、３２に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または、３１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４６】
より好ましくは、二重特異性を有する結合分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号３４または３６に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３３または３５に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【００４７】
前記二重特異性を有する結合分子は、好ましくは、二重特異性を有するｓｃＦｖコンストラクト（それによって第一のｓｃＦｖは、ＣＤ３と特異的に結合／相互作用し、第二のｓｃＦｖは、ＥｐＣＡＭと特異的に結合／相互作用する）である。
【００４８】
さらに好ましくは、本発明の二重特異性を有する結合分子の、前記少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位は、ヒト化されている。
さらなる実施形態において、本発明は、上記で定義された本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸配列を包含する。
【００４９】
好ましくは、前記核酸配列は、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号２０、３４、または、３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１９、３３、または、３５からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、または、からなるヌクレオチド配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義されたヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたタンパク質から誘導されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列に、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、および、最も好ましくは９９％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）遺伝子コードの縮重により得られた（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つのヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列。
【００５０】
用語「ハイブリダイゼーション（すること）」は、本明細書で用いられる場合、列挙された核酸配列もしくはそれらの部分の相補鎖、または、列挙された核酸配列もしくはそれらの部分にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドを意味する。それゆえに、前記核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ標本それぞれのノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用な可能性があり、または、それらそれぞれのサイズに応じたＰＣＲ解析でオリゴヌクレオチドプライマーとして用いることができる。好ましくは、前記ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、一方で、プローブとしてとして用いることができる本発明のハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも２００個、または、最も好ましくは少なくとも５００個のヌクレオチドを含む。
【００５１】
核酸分子を用いたハイブリダイゼーション実験をどのように実施するかは当業界周知であり、すなわち当業者は、本発明に従って使用すべきハイブリダイゼーション条件についてわかっている。このようなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記引用文中）のような標準的な教本や、当業者既知の、または、上記で列挙したその他の標準的な実験マニュアルに記載されている。本発明において好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチド、またはそれらの部分にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドである。
【００５２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」はすなわち、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および、２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、続いて、フィルターを０．１×ＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することを意味する。また、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする核酸分子も考慮される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにおける変更、および、シグナル検出は、主として、ホルムアミド濃度の操作（ホルムアミドをより低いパーセンテージにすると、低いストリンジェンシーが得られる）；塩の状態、または、温度によって達成される。例えば、より低いストリンジェンシーの条件には、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ｐｏ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベート；それに続いて、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで５０℃で洗浄が含まれる。加えて、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに続いて行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）で行ってもよい。注目すべきことに、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために用いられる代わりのブロッキング試薬を含ませたり、および／または、交換したりすることによって、上記の条件の変化形を得ることができる。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および、市販の商標登録された調合物が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含ませることは、相溶性の問題により上述のハイブリダイゼーション条件の改変が必要な場合がある。
【００５３】
列挙された核酸分子としては、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または、合成で生産されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、組換えによって生産されたキメラ核酸分子、または、それらのキメラの混合物（上記ポリヌクレオチドのいずれかを単独または組み合わせのいずれかで含む）が可能である。
【００５４】
当業者には当然であるが、本発明の核酸分子に調節配列を付加してもよい。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、および／または、本発明のポリヌクレオチドの誘導性の発現を可能にする配列を用いてもよい。適切な誘導性システムは、例えば、テトラサイクリンで調節された遺伝子発現［例えばＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２年），５５４７〜５５５１）、および、Ｇｏｓｓｅｎ等（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４年），５８〜６２）で説明されている］、または、デキサメタゾン誘導性の遺伝子発現系［例えばＣｒｏｏｋ（１９８９年）ＥＭＢＯ Ｊ．８，５１３〜５１９で説明されている］である。
【００５５】
その上、さらなる目的のために、核酸分子に、例えば、チオエステル結合、および／または、ヌクレオチド類似体を含ませる可能性も考慮される。前記改変は、細胞中のエンドおよび／またはエキソヌクレアーゼにする核酸分子の安定化に有用な場合がある。前記核酸分子は、細胞中の前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写することもできる。また当然ながら、この点において、このようなポリヌクレオチドは、「遺伝子ターゲティング」、または、「遺伝子治療」アプローチのために用いることができる。その他の実施形態において、前記核酸分子は、標識されている。核酸の検出方法は当業界周知であり、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲ、または、プライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチの際の上述の核酸分子の導入を確実に成功させるためのスクリーニング方法に有用である可能性がある。
【００５６】
前記核酸分子は、上述の核酸分子のいずれかを単独または組み合わせのいずれかで含む、組換えによって生産されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、上記核酸分子は、ベクターの一部である。
【００５７】
それゆえに、本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。
多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に既知であり、それらの選択は、所望の機能に依存すると予想され、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および、遺伝子工学で慣習的に用いられるその他のベクターが挙げられる。様々なプラスミドおよびベクターを構築するために、当業者既知の方法を用いることができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記引用文中）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），Ｎ．Ｙ．（１９８９年），（１９９４年）で説明されている技術を参照。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞へ運搬するためのリポソームに、再構成してもよい。以下でさらに詳細に考察するように、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが用いられた。関連配列を、特定のポリペプチドの発現が必要な発現ベクターに移行させることができる。典型的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、および、ｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
【００５８】
好ましくは、前記ベクターは、本明細書で定義された単鎖抗体コンストラクトをコードする前記核酸配列に作動可能に連結した調節配列である核酸配列を含む。
このような調節配列（調節要素）は、技術者に既知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳部位、および、ベクターにインサートを導入するための挿入部位を含んでいてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、真核または原核細胞で発現させることができる前記発現制御配列に作動可能に結合している。
【００５９】
前記ベクターは、本発明の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることを想定している。
用語「調節配列」は、それらがライゲーションしたコード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を意味する。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて様々である。原核生物において、制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位、および、ターミネーターを含む。真核生物において、制御配列は、一般的に、プロモーター、ターミネーターを含み、さらに、いくつかの例では、エンハンサー、トランス転写活性化因子、または、転写因子も含む。用語「制御配列」は、最小限の全ての成分を含むものとし、その存在は発現に必要であり、さらに追加の有利な成分を含んでいてもよい。
【００６０】
用語「作動可能に連結した（operably linked）」は、これまでに説明したような成分が、それらの目的とする様式でそれらを作動させるような関係で並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。制御配列がプロモーターの場合、当業者には当然であるが、好ましくは二本鎖核酸が用いられる。
【００６１】
従って、列挙されたベクターは、好ましくは、発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換させるのに用いることができ、さらに、選択された宿主中でコード配列の発現を提供するコンストラクトである。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または、組み込み型ベクターが可能である。発現は、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物および／または真核細胞において発現を確実にする調節因子は当業者周知である。真核細胞の場合、このような調節因子は通常、転写の開始を確実にするプロモーター、および、場合により、転写の終結と転写の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞において発現を可能にする考えられる調節因子としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、または、ｔａｃプロモーターが挙げられ、さらに、真核宿主細胞において発現を可能にする調節因子の例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または、哺乳動物およびその他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【００６２】
転写開始に関与する要素の近傍に、このような調節因子は転写停止シグナルを含んでいてもよく、例えば、ポリヌクレオチド下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位、または、ｔｋ−ポリＡ部位である。さらに、用いられる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞の区画に方向付ける、または、それらを培地に分泌させることができるリーダー配列が、列挙された核酸配列のコード配列に付加されていてもよく、これらは当業界周知である；また、例えば添付の実施例３も参照。リーダー配列は、適切な段階で、翻訳、開始および終結配列、および、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはそれらの部分がペリプラスム間隙または細胞外の培地に分泌されるように仕向けることができるリーダー配列と統合される。場合により、異種配列は、望ましい特徴（例えば安定化、または、発現された組換え産物の簡単な精製）を付与するＮ末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる；上記参照。この文脈において、適切な発現ベクターは当業界既知であり、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ））、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ、または、ｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｍａｃｋ等．ＰＮＡＳ（１９９５年）９２，７０２１〜７０２５、および、Ｒａｕｍ等．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１年）５０（３），１４１〜１５０）、または、ｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ））である。
【００６３】
好ましくは、発現制御配列は、トランスフェクトする真核宿主細胞を形質転換することができるベクター中の真核生物プロモーター系と予想されるが、原核生物宿主のための制御配列も使用可能である。ベクターが適切な宿主に包含されると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適した条件下で維持され、要望に応じて、本発明の二重特異性を有する結合分子の回収および精製が続いて行われる；例えば、添付の実施例を参照。
【００６４】
細胞周期と相互作用するタンパク質を発現させるのに用いることができるその代わりの発現系は、昆虫系である。このようなシステムの一つに、アウトグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。列挙された核酸分子のコードの配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングしてもよく、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。前記コード配列をうまく挿入することは、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質のコートが欠失した組換えウイルスを生産することと予想される。次に、この組換えウイルスは、本発明のタンパク質が発現されるＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、または、トリコプルシア幼虫に感染させるのに用いられる（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６（１９８３年），５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１９９４年），３２２４〜３２２７）。
【００６５】
追加の調節因子は、転写エンハンサー、同様に、翻訳エンハンサーを含んでいてもよい。有利には、上述の本発明のベクターは、選択可能な、および／または、得点を付けることができる（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーを含む。
【００６６】
形質転換された細胞、例えば植物組織および植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者周知であり、例えば、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４年），１４３〜１４９）；アミノグルコシド系ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン耐性を付与するｎｐ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３年），９８７〜９９５）、および、ハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ ３２（１９８４年），４８１〜４８５）のための選択の基礎としての代謝拮抗物質耐性が挙げられる。追加の選択可能な遺伝子が説明されており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８年），８０４７）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）、および、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７年，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー編）、または、ブラストサイジンＳ耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５年），２３３６〜２３３８）が挙げられる。
【００６７】
また、有用な得点を付けることができるマーカーも当業者既知のであり、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６年），５９〜７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６年），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６年），４４〜４７）、または、β−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．６（１９８７年），３９０１〜３９０７）をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙されたベクターを含む細胞、組織、および、生物の簡単かつ迅速なスクリーニングに特に有用である。
【００６８】
上述したように、列挙された核酸分子は、細胞中で本発明の二重特異性を有する結合分子を発現させるために、単独で用いてもよいし、または、例えば精製のために、さらに遺伝子治療目的でもベクターの一部として用いてもよい。上述の本発明の二重特異性を有する結合分子のいずれか一方をコードするＤＮＡ配列を含む核酸分子またはベクターは、細胞に導入され、続いて、対象のポリペプチドがを生産される。遺伝子治療は、治療遺伝子をエクスビボまたはインビボ技術で細胞に導入することに基づいており、これは、遺伝子移入最も重要な応用の１つである。インビトロまたはインビボの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子運搬システムは、文献で説明されており、当業者既知である；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年），５３４〜５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６年），９１１〜９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２年），８０８〜８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９４年），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６年），３７０〜３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５年），１０７７〜１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ ９１（１９９８年），３０〜３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８年），６９２〜６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７年），２８９〜２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８年），２２４３〜５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年），７１４〜７１６；ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７，ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；ｏｒ Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６年），６３５〜６４０を参照。列挙された核酸分子およびベクターは、細胞への直接的な導入、または、リポソームまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルスベクター）を介した導入のために設計してもよい。好ましくは、前記細胞は、生殖細胞系細胞、胚細胞もしくは卵細胞、または、それらから誘導されたものであり、最も好ましくは、前記細胞は幹細胞である。胚幹細胞の例は、特に、Ｎａｇｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３年），８４２４〜８４２８で説明されているような幹細胞が挙げられる。
【００６９】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を提供する。前記宿主は、上述した少なくとも１種の本発明の前記ベクター、または、上述の本発明の核酸分子の少なくとも１種を宿主に導入することによって生産してもよい。宿主における前記少なくとも１種のベクターまたは少なくとも１種の核酸分子の存在が、上述の単鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子発現を媒介する可能性がある。
【００７０】
上述した宿主に導入される本発明の核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに統合されてもよいし、または、染色体外で維持されてもよい。
宿主は、あらゆる原核生物または真核細胞が可能である。
【００７１】
用語「原核生物」は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションが可能な全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、グラム陰性細菌、同様に、グラム陽性細菌が挙げられ、例えば大腸菌、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、および、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。用語「真核性の」は、酵母、高等植物、昆虫を含むものを意味し、好ましくは、哺乳動物細胞である。組換え生産法で用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質は、グリコシル化されていてもよいし、または、グリコシル化されていなくてもよい。特に好ましくは、本発明のポリペプチドのコード配列を含み、それらにＮ末端ＦＬＡＧ−タグおよび／またはＣ末端のＨｉｓ−タグが遺伝学的に融合したプラスミドまたはウイルスの使用である。好ましくは、前記ＦＬＡＧ−タグの長さは、約４〜８個のアミノ酸、最も好ましくは８個のアミノ酸である。上述したように、ポリヌクレオチドは、一般的に当業者既知の技術のいずれかを用いて、宿主を形質転換またはトランスフェクションさせるのに用いることができる。その上、融合した、作動可能に連結した遺伝子を製造し、それらを例えば哺乳動物細胞および細菌中で発現させる方法は当業界周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記引用文中）。
【００７２】
好ましくは、前記宿主は、細菌もしくは昆虫の細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である。
特に、列挙された宿主が哺乳動物細胞であることを想定している。特に好ましい宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０様の骨髄腫細胞系、または、ＮＳ／０が挙げられる。添付の実施例で説明されているように、宿主として特に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００７３】
より好ましくは、前記宿主細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系であり、例えばｐｅｒ．ｃ６である（Ｋｒｏｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２００３年，１９：１６３〜１６８）。
【００７４】
従って、さらなる実施形態において、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子の製造プロセスに関し、本プロセスは、本発明の細胞および／または宿主を、二重特異性を有する結合分子の発現に適した条件下／それらを発現させるような条件下で培養すること、および、細胞または培養物／培地から二重特異性を有する結合分子を単離／回収することを含む。
【００７５】
形質転換された宿主は、最適な細胞成長を達成するための当業界既知の技術に従って、発酵槽で成長させ、培養することができる。次に、本発明のポリペプチドは、増殖培地、細胞の溶解産物、または、細胞膜分画から単離することができる。例えば微生物により発現された本発明のポリペプチドの単離および精製は、例えば分取クロマトグラフィーによる分離、および、免疫学的な分離、例えば本発明のポリペプチドのタグに対して向けられたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含む分離のようなあらゆる従来の手段によって行われてもよいし、または、添付の実施例で説明されているようにして行われてもよい。
【００７６】
発現を可能にする宿主の培養条件は、このようなプロセスで用いられる宿主系および発現系／ベクターに依存することは当業界既知である。組換えポリペプチドの発現を可能にする条件を達成するために改変され得るパラメーターは、当業界既知である。従って、適切な条件は、さらに発明の進歩性を要する情報を要さず、当業者によって決定することができる。
【００７７】
発現されれば、本発明の二重特異性を有する結合分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当業界で標準的な手法に従って精製することができる；Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２年）を参照。少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、製薬で使用するためには、９８〜９９％またはそれを超える均一性が最も好ましい。部分的に、または、要望に応じて均一性になるまで精製したら、本発明の二重特異性を有する結合分子は、治療的に（例えば体外で）用いてもよいし、または、分析手法の開発や実施で用いてもよい。さらに、本発明の二重特異性を有する結合分子を培養物から回収する方法の例は、添付の実施例で詳細に説明される。
【００７８】
その上、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、上記で開示されたプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、本発明のベクターもしくは宿主を含む組成物を提供する。また、前記組成物は、場合により、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物を含んでいてもよい。最も好ましくは、前記組成物は、必要に応じて、キャリアー、安定剤および／または賦形剤の適切な調合物をさらに含む医薬組成物である。
【００７９】
本発明の観点において、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供する前記「タンパク質様化合物」は、例えばＴ細胞のための活性化シグナルであり得る。タンパク質様化合物の好ましい形態としては、二重特異性抗体、および、それらのフラグメントまたは誘導体、例えば二重特異性を有するｓｃＦｖが挙げられる。好ましくは、Ｔ細胞のための前記活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、より好ましくは、ＴＣＲのＣＤ３分子を介して提供され得る。タンパク質様化合物としては、これらに限定されないが、ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ、Ｔ細胞受容体に特異的なｓｃＦｖ、または、超抗原が挙げられる。超抗原は、Ｔ細胞受容体の可変領域の所定のサブファミリーにＭＨＣ非依存性の形態で直接結合し、従って、一次的なＴ細胞活性化シグナルが仲介する。また、このようなタンパク質様化合物は、Ｔ細胞ではない免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供することもできる。Ｔ細胞ではない免疫エフェクター細胞の例としては、特に、Ｂ細胞、および、ＮＫ細胞が挙げられる。
【００８０】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくは人間の患者へ投与するための組成物に関する。好ましい実施形態において、本医薬組成物としては、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内投与のための、または、組織または腫瘍への直接の注射による投与のための組成物が挙げられる。特に、前記医薬組成物は、輸液または注射を介して患者に投与されることを想定している。適切な本組成物の投与は、様々な方法で、例えば、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、局所的または皮内投与で実行されてもよい。本発明の医薬組成物は、製薬上許容できるキャリアーをさらに含んでいてもよい。適切な製薬キャリアーの例は当業界周知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液、例えば油／水乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このようなキャリアーを含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適切な用量で被検体に投与することができる。用量の処方計画は、担当医と臨床的な因子によって決定されると予想される。医療業界では周知の通り、どの患者に対する投与量でも、患者の大きさ、体表面領域、年齢、投与しようとする具体的な化合物、性別、時間および投与経路、一般的な健康状態、および、同時に投与されるその他の薬物などの多くの因子に依存する。一般的に、本医薬組成物の規則的な投与としての処方計画は、１日あたり１μｇ〜５ｇ単位の範囲と予想される。しかしながら、連続的な輸液により好ましい用量は、１時間あたり、０．０１μｇ〜２ｍｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１ｍｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜１００μｇ、さらにより好ましくは０．０１μｇ〜５０μｇ、最も好ましくは０．０１μｇ〜１０μｇ単位／体重キログラムの範囲であり得る。特に好ましい投与量を以下で列挙する。定期的な評価によって進行をモニターすることができる。投与量は様々であると予想されるが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい用量は、ＤＮＡ分子の約１０６〜１０１２コピーである。本発明の組成物は、局所投与してもよいし、または、全身投与してもよい。投与は通常、非経口と予想され、例えば静脈内である；ＤＮＡはまた、標的部位を目標として投与してもよく、例えば、内部または外部標的部位への遺伝子銃の運搬によって、または、動脈内の部位へのカテーテルによって投与される。非経口投与のための調合物としては、滅菌水溶液、または、非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および、注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性キャリアーとしては、水、アルコール性溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液、例えば食塩水および緩衝化培地などが挙げられる。非経口の媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および、塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または、不揮発性油が挙げられる。静脈内の媒体としては、流体および栄養素の補給液、電解質補給液（例えば、リンガーデキストロースベースのもの）などが挙げられる。また、保存剤およびその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどが存在してもよい。加えて、本発明の医薬組成物は、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン（好ましくはヒト由来）のようなタンパク質様のキャリアーを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、タンパク質様のＣＤ３結合分子、または、同じものをコードする核酸分子もしくはベクター（本発明で説明されているような）に加えて、本医薬組成物の目的とする使用に応じてさらなる生物学的に活性な物質を含んでいてもよいということを想定している。このような物質としては、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、および／または、Ｔ細胞副刺激分子のような物質、または、当業界既知のサイトカインが挙げられる。
【００８１】
本発明の組成物の投与の可能な適用は、腫瘍性の疾患、ガン、特に上皮癌／癌腫、例えば乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、頭頚部ガン、非黒色皮膚ガン、尿生殖路のガン、例えば卵巣ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、および、腎臓ガン、肺ガン、胃ガン、小腸ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、食道ガン、唾液腺ガン、および、甲状腺ガン、または、その他の腫瘍性の疾患、例えば血液ガン、黒色腫、神経膠腫、肉腫、例えば骨肉種である。本発明の組成物の投与のさらなる適用は、増殖疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患である。
【００８２】
また、上述したような本発明の組成物は、診断用組成物であってもよく、本組成物は、場合により、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を検出するための手段および方法をさらに含む。
【００８３】
また、本発明の二重特異性を有する特異的な結合分子は、イムノアッセイでの使用にも適しており、この場合、本結合分子は、液相で、または、固相キャリアーに結合させて利用することができる。例えば診断目的で、本発明のポリペプチドを利用することができるイムノアッセイの例は、直接的または間接的な様式のいずれかでの、競合的および非競合的イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、酵素様免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリック分析）、ドットブロット、および、ウェスタンブロット分析である。例えば診断分析で二重特異性を有する結合分子を検出するのに用いることができる追加の分析は、ＦＡＣＳに基づく分析、細胞毒性分析（Ｃｒ５１，蛍光放出）、または、色素放出分析である。
【００８４】
本発明の二重特異性を有する特異的な結合分子を多くの様々なキャリアーに結合させて、さらに、前記ポリペプチドに特異的に結合した細胞を単離するのに用いることができる。周知のキャリアーの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアーの性質は、本発明の目的に応じて可溶性または不溶性のいずれでもよく、例えばビーズである。
【００８５】
前記診断用組成物は、１またはそれ以上の容器に入れてもよく、この容器には、必要に応じて緩衝液、貯蔵溶液、および／または、医療目的または科学的な目的の実施に必要なその他の試薬または材料が含まれる。その上、本発明の診断用組成物の一部は、バイアルまたはボトルに個別に包装してもよいし、または、容器またはマルチコンテナーユニット中で組み合わせてもよい。
【００８６】
当業者既知の多くの様々な標識および標識方法がある。本発明で用いることができる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および、生物発光化合物が挙げられる。
【００８７】
本発明の最も好ましい実施形態において、医薬組成物を製造するための、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された結合分子、本発明のベクターもしくは宿主の使用が考慮される。前記医薬組成物は、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患の予防、治療または改善に用いてもよい。
【００８８】
本発明はまた、増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を予防、治療または改善する方法に関し、本方法は、このような予防、治療または改善が必要な被検体に、有効量の本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された結合分子、本発明のベクターもしくは宿主を投与することを含む。好ましくは、前記被検体はヒトである。
【００８９】
さらに、上記治療方法は、有効量の免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物の投与をさらに含むことも考慮される。好ましくは、前記タンパク質様化合物は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、ベクターもしくは宿主と同時に、または異なる時期に投与される。
【００９０】
最終的に、本発明は、本発明の二重特異性を有する結合分子、または、本発明のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、本発明の核酸分子、ベクターもしくは宿主を含むキットを提供する。
【００９１】
前記キットは、本発明の医薬組成物の製造において特に有用であり、特に、注射または輸液に有用な容器で構成されてもよい。有利には、本発明のキットは、必要に応じて緩衝液、貯蔵溶液、および／または、医療目的または科学的な目的の実施に必要なその他の試薬または材料をさらに含む。その上、本発明のキットの一部は、バイアルまたはボトルに個別に包装してもよいし、または、容器またはマルチコンテナーユニット中で組み合わせてもよい。本発明のキットは、特に本発明の方法を行うのに有利に用いることができ、さらに、例えば調査手段または医療的な手段として、本明細書で述べられた多種多様な適用で用いることができる。本キットの製造は、好ましくは、当業者既知の標準的な手法に従う。
【００９２】
これらのおよびその他の実施形態が開示されており、本発明の説明および実施例に包含される。本発明に従って用いることができる抗体、方法、使用および化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子装置を用いて、公共のライブラリーおよびデータベースから収集することもできる。例えば、インターネットで利用可能な公共データベース「メドライン（Ｍｅｄｌｉｎｅ）」が、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用可能である。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org/などのさらなるデータベースおよびアドレスが当業者既知であり、これもまた、例えば、http://www.lycos.com、または、http://www.google.comを利用して入手可能である。
【実施例】
【００９３】
以下、以下の生物学的な実施例を参照しながら本発明を説明するが、これらは単に説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
実施例１．
ＣＤ３抗原に特異的なヒト化抗体の生成
ＣＤ３の特異的な抗体ＯＫＴ３のＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ，ＥＡ，等．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版．第３巻．ベセスダ，メリーランド州：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１９９１年；２５９７．ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２を参照して決定された。
【００９４】
移植されたＣＤＲを受け入れるように選択されたヒトのフレームワーク領域は、重鎖および軽鎖それぞれに対してＫＯＬおよびＲＥＩであった。これらのタンパク質の構造は、結晶学的に解析された（ＲＥＩ：Ｐａｌｍ（１９７５年）Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３５６，１６７〜１９１，ＫＯＬ：Ｓｃｈｍｉｄｔ（１９８３年）Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３６４，７１３〜７４７）。
【００９５】
多数の追加のマウスの残基を、Ａｄａｉｒ １９９４年 Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４１〜４８に従って、ヒト可変領域フレームワークに導入した。改変されたこれらの残基は、元の抗原特異性の保持に重要である。軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に追加の突然変異を導入した。表２に、本発明のヒト化ＯＫＴおよび改善されたヒト化ＣＤ３のＣＤＲ配列を示す。図１Ａに、改善されたヒト化ＣＤ３結合分子の配列を示す；配列番号９〜１２。
【００９６】
【表２】
【００９７】
実施例２．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗体の構築
実施例２．１
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ３抗体の構築
得られたヒト化抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡを、遺伝子合成により得て、さらにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖとの遺伝学的な融合で処理し、二重特異性を有する単鎖抗体を得た（図１Ｂ，配列番号１９，２０）。二重特異性を有する単鎖抗体を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて、哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした。
【００９８】
実施例２．２
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗ＥｐＣＡＭｘ抗ＣＤ３抗体の構築
実施例１．１に記載の二重特異性を有するコンストラクトに加えて、異なる腫瘍特異性を有する、２種のさらなる二重特異性を有する単鎖抗体を構築した。二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３のＣＤ１９特異性を、２種の選択されたＥｐＣＡＭ抗体５−１０、および、３−１で置き換えた。このようにして、２つのＥｐＣＡＭ−特異的な二重特異性を有する単鎖抗体コンストラクトの抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（配列番号３５，３６）、および、抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（配列番号３３，３４）を得た。
【００９９】
実施例３．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有する単鎖抗体の発現
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３、および、抗ＥｐＣＡＭｘｈｕｍ．抗ＣＤ３コンストラクト（配列番号１９，２０，３３，３４，３５，３６）を、Ｍａｃｋ，Ｍ．等（１９９５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，７０２１〜７０２５で説明されているように、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への安定なトランスフェクションによって発現させた。細胞をリン酸カルシウム処理した後に、発現ベクターのトランスフェクションを行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等．１９８９年）。
【０１００】
実施例４．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む単鎖二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳ解析
結合能力に関する機能性を試験するために、ＦＡＣＳ 解析を行った。
【０１０１】
実施例４．１
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる結合解析
ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞（ヒト前駆Ｂ細胞白血病）、および、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞性白血病）を用いた。２００，０００個のＮａｌｍ６細胞、および、２００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３の特異的なポリペプチドでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の純粋な細胞培養上清（５０μｌ）と、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、このコンストラクトの結合を、マウスのペンタＨｉｓ（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ）抗体（２％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌで１：２０に希釈；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、そのＣ末端のヒスチジンタグを介して検出し、続いて洗浄工程を行い、フィコエリトリン結合Ｆｃガンマ特異的抗体（ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈した（図２Ａ，太線）。ネガティブコントロールとして、細胞培養上清の代わりに新しい細胞培地を用いた（図２，細線）。
【０１０２】
細胞を、ＦＡＣＳ−キャリバー（ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ，ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ハイデルベルグ）でフローサイトメトリーによって解析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＳｈｅｖａｃｈおよびＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年）で説明されているようにして行われた。二重特異性を有する結合分子の結合活性を、従来技術で説明されている通りに、ヒト化ＯＫＴ３部分を含む対応するコントロール二重特異性抗体の結合活性と比較した。
【０１０３】
図２で示されるように、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．ＯＫＴ３、および、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（改善されたｈｕｍ．ＯＫＴ３）はいずれも、ＣＤ１９およびＣＤ３によく結合した。
【０１０４】
実施例４．２
抗ＥｐＣＡＭｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる結合解析
ＥｐＣＡＭ特異的な二重特異性抗体の結合能力を試験するために、実施例４．１で説明されているような分析を、以下の改変を施して繰り返した：Ｎａｌｍ６細胞の代わりに、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用い（胃ガン細胞系；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０３）、ＥｐＣＡＭ二重特異性抗体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清を用いた。図２Ｂおよび２Ｃに、ＥｐＣＡＭ結合分析の結果を示す。コントロールとして、従来技術で説明されているようなヒト化ＯＫＴ３を含む対応する二重特異性抗体を用いた。
【０１０５】
図２Ｂおよび２Ｃで示されるように、本発明のヒト化抗ＣＤ３を含む二重特異性を有するコンストラクト（配列番号３４，３６）は、ヒト化ＯＫＴ３を含むコンストラクトよりも極めて優れた結合を示す。
【０１０６】
実施例５．
改善されたヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性を有するコンストラクトの精製
二重特異性を有する単鎖コンストラクトを精製するために、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションした抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３を、回収の前の７日間、ローラーボトル中でハイクローン（Ｒ）（ＨｉＣｌｏｎｅ（Ｒ））ＣＨＯ改変ＤＭＥＭ培地（ＨｉＱ）を用いて成長させた。この細胞を遠心分離によって分離し、発現されたタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。
【０１０７】
クロマトグラフィーには、Aｋｔａ ＦＰＬＣシステム（Ｒ）（ファルマシア）、および、ユニコーン（Ｕｎｉｃｏｒｎ）ソフトウェアを用いた。全ての化学物質は、研究グレードのものであり、シグマ（Ｓｉｇｍａ，ダイゼンホーフェン，ドイツ）、または、メルク（Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）から購入した。
【０１０８】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および、ゲルろ過を含む二工程精製プロセスで、ヒト化二重特異性を有する単鎖コンストラクトタンパク質を単離した。
【０１０９】
ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）は、製造元のプロトコールに従ってＺｎＣｌ２でローデングされたフラクトゲルカラム（Ｒ）（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ（Ｒ））（ファルマシア）を用いて行なわれた。このカラムを、緩衝液Ａ２（２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５，０．４ＭのＮａＣｌ）で平衡化させ、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に入れた。このカラムを緩衝液Ａ２で洗浄し、未結合のサンプルを除去した。結合したタンパク質は、緩衝液Ｂ２（２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５，０．４ＭのＮａＣｌ，０．５Ｍのイミダゾール）の二工程の勾配を用いて、すなわち工程１：カラム体積の１０倍量の２０％緩衝液Ｂ２；工程２：カラム体積の１０倍量の１００％緩衝液Ｂ２を用いて溶出させた。１００％工程から溶出したタンパク質分画をさらなる精製のためにプールした（図３）。
【０１１０】
ＰＢＳ（ギブコ）で平衡化させたセファデックスＳ２００ハイプレップカラム（Ｒ）（ＨｉＰｒｅｐ ｃｏｌｕｍｎ（Ｒ），ファルマシア）で、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、ウェスタンブロットで処理した。このカラムは、分子量決定（分子量マーカーキット，シグマＭＷ ＧＦ−２００）のために予め較正されていた（図４）。
【０１１１】
タンパク質分析用色素（マイクロＢＣＡ（Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ，ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））、および、標準タンパク質としてＩｇＧ（バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、精製されたコンストラクトのタンパク質の濃度を決定した。表２に、タンパク質の収率を示す。全てのコンストラクトが、細胞培養上清から精製することができた。抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３（１６μｇ／ｍｌ）、および、抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．ＯＫＴ３（１３，６μｇ／ｍｌ）について、匹敵する量の精製タンパク質が得られた。
【０１１２】
精製産物の分子量は、ＰＢＳ中のゲルろ過によって測定したところ、天然型の状態で５２ｋＤａであった。
既製の４〜１２％ビストリスゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で、精製された二重特異性を有するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプル調整および適用は、製造元のプロトコールに従った。マルチマークタンパク質標準（Ｒ）（ＭｕｌｔｉＭａｒｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｒ），インビトロジェン）を用いて分子量を決定した。ゲルをコロイド状のクーマシー（インビトロジェンのプロトコール）で染色したところ、５２ｋＤａでバンドが示された。単離したタンパク質の純度は、９５％を超えることが示された。
【０１１３】
オプティトランＢＡ−Ｓ８３メンブレン（Ｏｐｔｉｔｒａｎ ＢＡ−Ｓ８３ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｒ））、および、インビトロジェンのブロット・モジュール（Ｒ）（Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ））を製造元のプロトコールに従って用いて、ウェスタンブロットを行った。用いられた抗体は、ペンタＨｉｓ（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））、および、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（シグマ）であり、染色溶液は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ）であった。ヒト化二重特異性を有するタンパク質をウェスタンブロットで検出したところ、５２ｋＤのバンドが示され（図５Ｂ）、これは、クーマシー染色されたＳＤＳ−ゲルでは、精製された二重特異性を有するタンパク質に相当する（図５Ａ）。
【０１１４】
実施例６．
ヒト化抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体の生物活性
構築された二重特異性抗体の高い細胞毒性活性を照明するために、以下の分析を行った。
【０１１５】
実施例６．１
抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３二重特異性抗体（配列番号２０）
標的のＮＡＬＭ−６細胞（１．５×１０７）を、細胞培地中で３７℃で３０分間、１０μＭカルセインＡＭ（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で標識した。細胞培地中で２回洗浄した後、細胞を計数し、ＣＤ４陽性ＣＢ１５Ｔ細胞と混合した。得られたエフェクター標的細胞の混合物には、１ｍｌあたり、２×１０５のＮａｌｍ６細胞、および、２×１０６のＣＢ１５細胞（Ｅ：Ｔの比率は１：１０）が含まれていた。抗体をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで必要な濃度に希釈した。この溶液５０μｌを、細胞懸濁液に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞毒性反応の後に、インキュベート培地中に放出された色素を蛍光リーダーで定量し、細胞毒性化合物が含まれていないコントロール反応（ネガティブコントロール）と、完全に溶解させた細胞（１％サポニン中で１０分間）で蛍光シグナルが測定された反応（ポジティブコントロール）とからの蛍光シグナルと比較した。これらの測定値に基づき、以下の式に従って具体的な細胞毒性を計算した：［蛍光（サンプル）−蛍光（コントロール）］：［蛍光（完全な溶解物）−蛍光（コントロール）］×１００。
【０１１６】
典型的には、Ｓ字状の用量反応曲線は、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．），サンディエゴ，米国）によって決定されたように、０．９７を超えるＲ２値を有していた。生物活性を比較するために、解析プログラムによって計算されたあＥＣ５０値を用いた。図６に、ヒト化ＣＤ３部分を含むＣＤ１９およびＣＤ３に対する二重特異性抗体の細胞毒性を示す。従来技術で説明されているような、対応するヒト化ＯＫＴ３を含む二重特異性抗体を、コントロールとして用いた。
【０１１７】
二重特異性を有する形態では、二重特異性を有するヒト化改変ＣＤ３（ｈｕｍ．抗ＣＤ３）（配列番号２０）は、Ａｄａｉｒで説明されているようなヒト化ＯＫＴ３（ＥＣ５０値は、１９５ｐｇ／ｍｌ）と比較して、細胞毒性活性が明らかに増加していた（ＥＣ５０値＝５０ｐｇ／ｍｌ）。従って、これらの結果より、本発明の、改善されたヒト化抗体ＣＤ３への結合の主な利点が実証される。二重特異性を有する形態の改変ヒト化ＣＤ３の細胞毒性活性が約４倍増加していることにより、この分子は、治療用途において極めて有利である。より強い細胞毒性活性に基づき、治療に必要なタンパク質は、従来技術の分子よりも少量でよい。従って、本発明の二重特異性を有する分子は、高い細胞毒性活性と、ヒト化されているためより低い免疫原性とを同時に示すため、患者を治療する場合に、従来技術の抗体を超える重要な利点を提供する。それゆえに、これらは、医療分野において明らかな改善を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】ヒト化抗ＣＤ３抗体軽鎖および重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号９〜１２）
【図１Ｂ】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１９，２０）
【図１Ｃ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号３５，３６）
【図１Ｄ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号３３，３４）である。
【図２Ａ】様々なコンストラクトの、ＣＤ３およびＣＤ１９、または、ＥｐＣＡＭに対する結合親和性のＦＡＣＳ解析である。ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＣＤ３結合のＦＡＣＳ解析を行った。二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号２０）。ＣＤ１９への結合を、ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞を用いて示す。
【図２Ｂ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（３−１）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号３４）。ＥｐＣＡＭへの結合を、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用いて示す。
【図２Ｃ】二重特異性を有する抗ＥｐＣＡＭ（５−１０）ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体コンストラクト（配列番号３６）。ＥｐＣＡＭへの結合を、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を用いて示す。右側へのシフトは、結合を示す。
【図３】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の溶出パターンであり、Ｚｎ−キレーティング・フラクトゲル（Ｒ）（Ｚｎ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Ｒ））カラムからのタンパク質分画を含む。５０〜５３０ｍｌの保持時間の２８０ｎｍでの高い吸着は、カラム流出液中の非結合タンパク質によるものであった。６１７．４４ｍｌでのピークにおける矢印は、用いられた、またはさらに精製された二重特異性を有するヒト化コンストラクトを含むタンパク質分画を示す。
【図４】セファデックスＳ２００（Ｒ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ２００（Ｒ））ゲルろ過カラムからのタンパク質溶出パターンである。８２．４２ｍｌにおける抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３に対する二重特異性抗体を含むタンパク質ピークは、約５２ｋＤの分子量に相当する。４０〜１２０ｍｌの保持時間で分画を回収した。
【図５】Ａ）二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析タンパク質分画である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：細胞培養上清；レーン２：ＩＭＡＣ溶出液；レーン３：ゲルろ過凝集ピーク；レーン４：精製された二重特異性抗体の抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３； Ｂ）精製された二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体の、ウェスタンブロット解析である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：細胞培養上清；レーン２：ＩＭＡＣ溶出液；レーン３：ゲルろ過凝集ピーク；レーン４：ゲルろ過から得られた、精製された二重特異性抗体抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３である。
【図６】二重特異性を有する抗ＣＤ１９ｘｈｕｍ．抗ＣＤ３抗体（配列番号２０）の細胞毒性分析である。ＮＡＬＭ−６細胞を標的細胞として用い、ＣＤ４陽性ＣＢ１５Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた（Ｅ：Ｔの比率は１：１０）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子であって、ここで、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、ここで、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉｉ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列、
であり、ただし、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）システムに従って、軽鎖のＣＤＲ領域のＬ２４位、Ｌ５４位およびＬ９６位にアミノ酸置換を含み；および、
（ｂ）第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む、上記分子。
【請求項２】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、Ｌ２４位のセリン、Ｌ５４位のバリン、および、Ｌ９６位のロイシンを有することを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項３】
前記軽鎖のＣＤＲ領域は、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、または、配列番号３、５または７の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む、または、からなる、請求項１または２に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項４】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、ｓｃＦｖである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項５】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、または、配列番号９の核酸配列によってコードされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項６】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、配列番号１４で示されたアミノ酸配列を含む、もしくは、配列番号１４で示されたアミノ酸配列からなる、または、配列番号１３の核酸配列によってコードされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項７】
前記第二のドメインは、１またはそれ以上の細胞表面分子に特異的な少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項８】
前記１またはそれ以上の細胞表面分子は腫瘍特異的な分子である、請求項７に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項９】
前記第二のドメインは、追加のｓｃＦｖである、請求項７または８に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１０】
前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ｂｈＣＧ、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ＧｌｏｂｏＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、血漿細胞抗原（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、および、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、および、ＣＯ−２９からなる群より選択される抗原と特異的に結合/相互作用する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１１】
前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号１６または１８に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５または１７に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１２】
前記分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号２０に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１３】
前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１４】
前記分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号３４、３６に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３３、３５に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位は、ヒト化されている、請求項７〜１１または１３のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸配列。
【請求項１７】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子：
（ａ）配列番号２０、３４、３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１９、３３、３５からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、または、からなるヌクレオチド配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義されたヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたタンパク質から誘導されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列に少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）遺伝子コードの縮重により得られた（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つのヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の核酸配列に作動可能に連結した調節配列である核酸配列をさらに含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
発現ベクターである、請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子の製造プロセスであって、前記二重特異性を有する結合分子が発現されるような条件下で請求項２１に記載の宿主を培養すること、および、該培養から生産された二重特異性を有する結合分子を回収することを含む、上記プロセス。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主、および、場合により、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物を含む組成物。
【請求項２４】
キャリアー、安定剤、および／または、賦形剤の適切な調合物をさらに含む医薬組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を検出するための手段および方法をさらに含む診断用組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患の予防、治療または改善のための医薬組成物を製造するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主の使用。
【請求項２７】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を、それらの予防、治療または改善が必要な被検体において、予防、治療または改善する方法であって、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２８】
前記被検体はヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物の投与をさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質様化合物は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主と同時に、または異なる時期に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主を含むキット。
【請求項１】
少なくとも２つのドメインを含む、または、少なくとも２つのドメインからなる二重特異性を有する結合分子であって、ここで、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの一方は、ヒトＣＤ３複合体と特異的に結合／相互作用し、ここで、前記ドメインは、抗体由来の軽鎖のアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉｉ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列、
であり、ただし、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）システムに従って、軽鎖のＣＤＲ領域のＬ２４位、Ｌ５４位およびＬ９６位にアミノ酸置換を含み；および、
（ｂ）第二のドメインは、少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位、および／または、少なくとも１つのさらなるエフェクタードメインであるか、または、それらを含む、上記分子。
【請求項２】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、Ｌ２４位のセリン、Ｌ５４位のバリン、および、Ｌ９６位のロイシンを有することを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項３】
前記軽鎖のＣＤＲ領域は、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、または、配列番号３、５または７の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む、または、からなる、請求項１または２に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項４】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、ｓｃＦｖである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項５】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、または、配列番号９の核酸配列によってコードされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項６】
前記ヒトＣＤ３複合体と結合／相互作用するドメインは、配列番号１４で示されたアミノ酸配列を含む、もしくは、配列番号１４で示されたアミノ酸配列からなる、または、配列番号１３の核酸配列によってコードされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項７】
前記第二のドメインは、１またはそれ以上の細胞表面分子に特異的な少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項８】
前記１またはそれ以上の細胞表面分子は腫瘍特異的な分子である、請求項７に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項９】
前記第二のドメインは、追加のｓｃＦｖである、請求項７または８に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１０】
前記第二のドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ｂｈＣＧ、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ＧｌｏｂｏＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、血漿細胞抗原（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、および、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、および、ＣＯ−２９からなる群より選択される抗原と特異的に結合/相互作用する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１１】
前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号１６または１８に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５または１７に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１２】
前記分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号２０に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１３】
前記第二のドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１４】
前記分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、または、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の二重特異性を有する結合分子：
（ａ）配列番号３４、３６に対応するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３３、３５に対応する核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義された核酸配列の相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされたアミノ酸配列；および、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）のいずれか一種のヌクレオチドの配列に相当する遺伝子コードの縮重により得られた核酸配列によってコードされたアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのさらなる抗原相互作用部位は、ヒト化されている、請求項７〜１１または１３のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子をコードする核酸配列。
【請求項１７】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子：
（ａ）配列番号２０、３４、３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１９、３３、３５からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、または、からなるヌクレオチド配列；
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｂ）で定義されたヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたタンパク質から誘導されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドの配列によってコードされたアミノ酸配列に少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）遺伝子コードの縮重により得られた（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つのヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の核酸配列に作動可能に連結した調節配列である核酸配列をさらに含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
発現ベクターである、請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子の製造プロセスであって、前記二重特異性を有する結合分子が発現されるような条件下で請求項２１に記載の宿主を培養すること、および、該培養から生産された二重特異性を有する結合分子を回収することを含む、上記プロセス。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主、および、場合により、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物を含む組成物。
【請求項２４】
キャリアー、安定剤、および／または、賦形剤の適切な調合物をさらに含む医薬組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を検出するための手段および方法をさらに含む診断用組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患の予防、治療または改善のための医薬組成物を製造するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主の使用。
【請求項２７】
増殖疾患、腫瘍性の疾患、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性の反応、移植片対宿主疾患、または、宿主対移植片疾患を、それらの予防、治療または改善が必要な被検体において、予防、治療または改善する方法であって、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２８】
前記被検体はヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質様化合物の投与をさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質様化合物は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主と同時に、または異なる時期に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性を有する結合分子、または、請求項２２に記載のプロセスによって生産された二重特異性を有する結合分子、請求項１６または１７に記載の核酸分子、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター、または、請求項２１に記載の宿主を含むキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０６３５３（Ｐ２００８−５０６３５３Ａ）
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２５７６（Ｐ２００６−５５２５７６）
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９８２
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５００５２２７１４）ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト (5)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＣＲＯＭＥＴ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９８２
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５００５２２７１４）ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト (5)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＣＲＯＭＥＴ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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