修飾されたＲＮＡ単量体を用いるＲＮアーゼＨを基礎とするアッセイ
本発明は、核酸増幅、連結及び配列決定反応などの様々な生物学的アッセイにおいて使用するための新規オリゴヌクレオチド化合物に関する。新規オリゴヌクレオチドは、リボ核酸ドメイン及びオリゴヌクレオチドの３’末端の又は３’末端付近のブロッキング基を含む。これらの化合物は、以前に見られなかった特異性の増加したレベルを付与する。核酸増幅、連結及び配列決定を実施するための方法も提供される。さらに、オリゴヌクレオチドを含有するキットも、本明細書に開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）、（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、（ｉｉｉ）切断酵素並びに（ｉｖ）ポリメラーゼを含む（前記切断酵素は熱安定的であり及びより低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である。）反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項２】
ホットスタート切断酵素がＲＮアーゼＨ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮアーゼＨ酵素がＲＮアーゼＨ２酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮアーゼＨ２酵素が低下した温度でより低い活性を本来的に有しており、化学的修飾によって又は遮断抗体によって可逆的に不活化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断酵素が配列特異的二本鎖エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記配列特異的二本鎖エンドヌクレアーゼが制限酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ブロッキング基がプライマーの３’−末端ヌクレオチドに付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ブロッキング基が３’−末端残基の５’に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ブロッキング基が１つ又はそれ以上の塩基脱落残基又は修飾されたヌクレオシドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
塩基脱落残基がＣ３スペーサーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
修飾されたヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルリボース残基である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ブロッキング基が増幅反応の検出を可能にする標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標識が蛍光色素、消光物質、ビオチン又はハプテンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標識が質量分析法による増幅反応の検出のための質量タグである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
切断ドメインが３又はそれ以上のＲＮＡ残基の連続する配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、塩基脱落残基、修飾されたヌクレオシド又は修飾されたホスファートヌクレオチド間連結の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
切断ドメインが単一のＲＮＡ残基又は２つの隣接するＲＮＡ残基である、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記２’修飾されたヌクレオシドが単一の２’−フルオロヌクレオシドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
切断反応が、以下の二価の陽イオン：マンガン、コバルト、ニッケル又は亜鉛の１つ又はそれ以上の存在下で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
反応混合物中にマグネシウムも存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
切断ドメイン内の又は切断ドメインに隣接する配列がヌクレアーゼ切断に対して耐性を有する１つ又はそれ以上のヌクレオシド間連結を含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクラーゼ耐性連結が、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート又は塩基脱落残基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクラーゼ耐性連結が切断ドメインの３’側に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＣＲを支持するために、第一のプライマーとは逆の方向性の第二のプライマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
第二のプライマーが修飾されていないＤＮＡプライマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第二のプライマーがブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを含み、前記ブロッキング基がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結されており、前記ブロッキング基がプライマーの伸長を妨げる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
バリアント対立遺伝子間を識別するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
バリアント対立遺伝子の検出を増強するために、第二の変異部位が切断ドメイン内に又は切断ドメインに隣接して取り込まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
バリアント対立遺伝子の検出を増強するために、修飾されたヌクレオシドが切断ドメイン内に又は切断ドメインに隣接して取り込まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾されたヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルリボース残基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヌクレアーゼ耐性連結が切断ドメインの３’側に取り込まれている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の標的核酸配列の量を定量するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＣＲアッセイがプライマー−プローブＰＣＲアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
５’標識ドメインを有するプライマーが切断ドメインを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
切断ドメインがＲＮアーゼＨ切断ドメインである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＮアーゼＨ切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端残基の上流５’に連結され、前記ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）、（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、（ｉｉｉ）切断酵素及び（ｉｖ）ポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項４１】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は、１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４２】
前記２’修飾されたヌクレオシド残基が２’−フルオロヌクレオシドである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び標識を取り込んだプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４４】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基の５‘に位置するブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４５】
プローブの切断が好熱性ＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介され、及び切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項４６】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’ヌクレオシド残基から構成される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
プローブの切断がより低い温度で低下した活性を有する好熱性ホットスタートＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介される、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項４９】
ａ）切断ドメイン及び３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含むアクセプターオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記アクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成されたアクセプターを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記アクセプターオリゴヌクレオチドをドナーオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項５０】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
対立遺伝子バリアントを識別するためにオリゴヌクレオチド連結アッセイが使用される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記対立遺伝子バリアントが単一のヌクレオチド多型である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ａ）切断ドメイン及び５’末端に又は５’末端付近にブロッキング基を含むドナーオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記ドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、前記ハイブリッド形成されたドナーオリゴヌクレオチドを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記ドナーオリゴヌクレオチドをアクセプターオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項５４】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）標的核酸、アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組みを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みはグアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一のドメインは１つ又は２つの塩基を含み、及び所定の組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、第一のドメインの３’側の第二のドメインはＲＮアーゼＨ２酵素によって切断可能であり、第二のドメインの３’側の第三のドメインは縮重又はユニバーサル塩基を含み、並びに第四のドメインは前記ドナーオリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に標識及びブロッキング基（前記標識であり得る。）を含み、ドナーオリゴヌクレオチドが連結反応においてアクセプターとしての役割を果たすのを妨げる。）；
ｂ）標的核酸配列にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）標的核酸配列にドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｄ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｅ）アクセプターに連結されたドナーオリゴヌクレオチド上の標識を検出する工程；
ｆ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の第一のドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｇ）工程ｃからｆを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項５６】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドは、５’ホスファートを有し、及び５’末端に特異的塩基、隣接するＲＮＡ残基、１から８残基の３’突出部を有するヘアピン構造を含み、前記突出部は縮重又はユニバーサル塩基を含み、’末端の又は３’末端付近のブロッキング基及び標識を場合によって含む。）；
ｂ）ドナーオリゴヌクレオチドの３’突出部にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項５７】
ａ）ブロッキング基の５’位置に切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の末端に又は末端付近に連結されており、前記ブロッキング基は、プライマー伸長を妨げる。）、試料核酸、切断酵素、ポリメラーゼ、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸及び標識されていないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項５８】
ａ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマー、試料核酸、ポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、試料ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
ｄ）伸長反応の二本鎖産物をＲＮアーゼＨ２酵素を用いて切断する工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状の標識された断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項５９】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は熱安定的なＲＮＡｓｅＨ切断ドメイン及びプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項６０】
３’末端及び５’末端を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡ残基及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含むリボ核酸ドメインを含む。）。
【請求項６１】
リボ核酸部分が１から３個のリボ核酸塩基又は修飾されたその誘導体からなる、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
リボ核酸ドメインが１又は２個のＲＮＡ塩基を含む、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
リボ核酸ドメインが１個のＲＮＡ塩基を含む、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
少なくとも１つのＲＮＡ残基が１つ又はそれ以上の修飾を含有する、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
修飾が一本鎖リボヌクレアーゼによる切断及び水によって触媒される加水分解に対する耐性を付与する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
修飾がＲＮＡ残基の２’位に存在する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
修飾が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項６９に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７１】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側のホスファート基に位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７２】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側の隣接する残基の５’位に位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
修飾がホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及びボロナートからなる群から選択される、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
修飾が５’チオ、５’アミン及び５’アルキル、５’メチレン及び５’エチレンからなる群から選択される、請求項７３に記載の一本鎖オリゴヌクレチド。
【請求項７５】
ブロッキング基がジデオキシヌクレオチド、３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基、２’ヒドロキシル置換又は伸長若しくは連結を妨げることができる３’末端の又は３’末端付近の単量体の塩基基のあらゆる置換除去からなる群から選択される、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基がジデオキシ、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項７５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
３’ホスファートジエステルが３’−ヒドロキシプロピルジエステルである、請求項７６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
２’ヒドロキシル置換がトリイソプロピルシリル及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルからなる群から選択される、請求項７５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
１つ又はそれ以上のＲＮＡ塩基又は修飾された残基がＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たし、プライマーの３’末端及び／又は５’末端から少なくとも８塩基離れて位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
ａ）標的核酸に対して相補的でない５’配列タグ；
ｂ）５’配列タグ内に又は５’配列タグの３’に位置し、及び相補的な塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに切断可能である第一の切断ドメイン；
ｃ）５’配列タグ及び第一の切断ドメインの３’に位置する標的ハイブリッド形成配列（該標的ハイブリッド形成配列は、標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である。）；
ｄ）ハイブリッド形成配列の３’に位置するブロッキング基（該ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）；
ｅ）標的ハイブリッド形成配列とブロッキング基の間に位置する第二の切断ドメイン；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８１】
第二の切断ドメインが標的核酸に対して相補的である場合に、第二の切断ドメインがより高い速度で切断される、請求項８０に記載のプライマー。
【請求項８２】
ａ）３’末端及び５’末端、少なくとも１つのＲＮＡ残基を含むリボ核酸ドメイン及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
ｂ）３’末端及び５’末端、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに実質的に相補的な領域及び標的ＤＮＡ配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、二本鎖核酸化合物。
【請求項８３】
３’末端及び５’末端、１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン、蛍光色素及び消光物質を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）。
【請求項８４】
修飾されたヌクレオチド残基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項８３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８５】
ａ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記ブロッキング基に対して５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメイン、標的核酸、ＲＮアーゼＨ２酵素及びポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的核酸に少なくとも１つのプライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）ＲＮアーゼＨ２酵素を用いてブロッキング基を除去する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；
を含む、標的核酸配列を複製する方法。
【請求項８６】
反応混合物が３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
ａ）（ｉ）複フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み（フォワード又はリバースプライマーの複数の少なくとも１つは、３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及びブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ２切断ドメインを有する各プライマーを含む。）、（ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素、（ｉｉｉ）ｄＮＰＴ及び（ｉｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含有するプライマーの複数及び相補的配列にハイブリッド形成され及び切断ドメインがＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されるまで、前記ブロッキング基の５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメインは伸長せず；
ｅ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成し、並びに（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成するような条件に反応混合物を供する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、並びにさらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅されている反応混合物を提供するために、工程（ｆ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列を増幅する方法。
【請求項９５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、及び少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０３】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０７】
両プライマーの複数中の各プライマーが３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを含有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０８】
標的核酸の増幅が蛍光によってモニターされ、生成された蛍光の量が標的核酸増幅の量に直接比例する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０９】
標的核酸が多項目式に増幅される、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１０】
第一のプライマー伸長産物がリバースプライマーの切断ドメインを含有し、及び第二のプライマー伸長産物がリバースプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第一のプライマー伸長産物を形成するように、第二のプライマー伸長産物の伸長が第一のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１１】
第二のプライマー伸長産物がフォワードプライマーの切断ドメインを含有し、及び第一のプライマー伸長産物がフォワードプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第二のプライマー伸長産物を形成するように、第一のプライマー伸長産物の伸長が第二のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１２】
ａ）（ｉ）フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基、蛍光色素及び消光物質を含むＲＮアーゼＨ切断ドメインを含む３’末端及び５’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ（前記ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）、（ｉｉｉ）ＲＮアーゼＨ酵素、（ｉｖ）ｄＮＰＴ並びに（ｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成する、（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成する、及び（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブが第一又は第二のプライマー伸長産物の何れかを結合し、第一又は第二のプライマー伸長産物へのハイブリッド形成後に、ＲＮアーゼＨ酵素によって、プローブがその切断ドメインにおいて切断されるような条件に、反応混合物を供する工程；
ｅ）プローブの切断によって生成された蛍光を測定する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、さらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅され、及びプローブの切断によって生成された蛍光を測定することによって増幅が定量される反応混合物を提供するために、工程（ｆ）及び（ｇ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列の増幅を定量する方法。
【請求項１１３】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１８】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１９】
オリゴヌクレオチドプローブがＲＮアーゼＨ２によって切断される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２０】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーとともに温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）標的核酸に少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができ切断ドメイン、並びに該切断ドメインは、標的核酸が野生型対立遺伝子であるときに、潜在的な塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）；及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１２１】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
切断ドメインが少なくとも１つのリボヌクレオチド塩基を含有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
２つのブロッキング基がプライマーの３’末端に存在する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーと温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）前記領域の５’末端上に存在する５’配列ドメイン（該５’配列ドメインは、標的核酸試料に対して非相補的であり、及び相補的塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに、ＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる第二の切断ドメインを含有する。）、（ｉｉ）前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる切断ドメイン並びに該切断ドメインは潜在的塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）、及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１２５】
ブロッキング基が３’−末端ヌクレオチドから内部に位置している、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
３’末端に又は３’末端付近に、少なくとも第二のブロッキング基をさらに含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
切断ドメイン中の少なくとも１つのＲＮＡ塩基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
反応混合物がＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２又はＭｇＣｌ２の１つ又はそれ以上の二価の陽イオンを含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
反応混合物がＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
反応混合物が３ｍＭＭｇＣｌ２及び６００μＭＭｎＣｌ２を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３２】
ＲＮアーゼＨ２酵素がピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）及びピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）を含む群から得られる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含む単離された熱安定的リボヌクレアーゼＨ酵素。
【請求項１３４】
ａ）標的核酸及びアクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピンを含有する約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基ドメインは１から２個の塩基であり及び与えられた組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基ドメインはＲＮアーゼＨ２に対する基質である少なくとも１つのＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、及び残りの塩基は縮重又はユニバーサルである。）及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及び標的核酸に対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドに標的核酸をハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基ドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項１３５】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピン及び約１から５塩基長の５’末端上の突出部を含有するドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基は与えられた組みのヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基はＲＮアーゼＨ２に対する基質であるＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、残りの塩基はランダム又はユニバーサルである。）を含み、及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を場合によって含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及びアクセプターオリゴヌクレオチドに対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を合成する方法。
【請求項１３６】
ジデオキシ三リン酸及びポリメラーゼが、リガーゼ酵素の後に及びＲＮアーゼＨ２酵素の前に添加される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
ポリメラーゼが末端の転移酵素である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
ａ）標的核酸と配列決定反応混合物を混合すること；
ｂ）及び適切な条件下で、請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーとともに反応混合物を温置すること；
を含む、標的核酸を配列決定するための方法。
【請求項１３９】
ａ）核酸を含有する試料とＰＣＲ反応混合物を混合する工程；
ｂ）適切な条件下で、請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーとともに反応混合物を温置する工程；
を含む、単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１４０】
ａ）標的核酸セグメント、適切な緩衝液及び適切なリガーゼを含む連結混合物に、請求項１に記載のプライマーの少なくとも１つの有効量を添加する工程、及び
ｂ）適切な連結条件下で、前記混合物を温置する工程；
を含む、標的核酸セグメントを連結する方法。
【請求項１】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）、（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、（ｉｉｉ）切断酵素並びに（ｉｖ）ポリメラーゼを含む（前記切断酵素は熱安定的であり及びより低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である。）反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項２】
ホットスタート切断酵素がＲＮアーゼＨ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮアーゼＨ酵素がＲＮアーゼＨ２酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮアーゼＨ２酵素が低下した温度でより低い活性を本来的に有しており、化学的修飾によって又は遮断抗体によって可逆的に不活化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断酵素が配列特異的二本鎖エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記配列特異的二本鎖エンドヌクレアーゼが制限酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ブロッキング基がプライマーの３’−末端ヌクレオチドに付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ブロッキング基が３’−末端残基の５’に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ブロッキング基が１つ又はそれ以上の塩基脱落残基又は修飾されたヌクレオシドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
塩基脱落残基がＣ３スペーサーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
修飾されたヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルリボース残基である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ブロッキング基が増幅反応の検出を可能にする標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標識が蛍光色素、消光物質、ビオチン又はハプテンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標識が質量分析法による増幅反応の検出のための質量タグである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
切断ドメインが３又はそれ以上のＲＮＡ残基の連続する配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、塩基脱落残基、修飾されたヌクレオシド又は修飾されたホスファートヌクレオチド間連結の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
切断ドメインが単一のＲＮＡ残基又は２つの隣接するＲＮＡ残基である、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記２’修飾されたヌクレオシドが単一の２’−フルオロヌクレオシドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
切断反応が、以下の二価の陽イオン：マンガン、コバルト、ニッケル又は亜鉛の１つ又はそれ以上の存在下で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
反応混合物中にマグネシウムも存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
切断ドメイン内の又は切断ドメインに隣接する配列がヌクレアーゼ切断に対して耐性を有する１つ又はそれ以上のヌクレオシド間連結を含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクラーゼ耐性連結が、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート又は塩基脱落残基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクラーゼ耐性連結が切断ドメインの３’側に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＣＲを支持するために、第一のプライマーとは逆の方向性の第二のプライマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
第二のプライマーが修飾されていないＤＮＡプライマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第二のプライマーがブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを含み、前記ブロッキング基がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結されており、前記ブロッキング基がプライマーの伸長を妨げる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
バリアント対立遺伝子間を識別するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
バリアント対立遺伝子の検出を増強するために、第二の変異部位が切断ドメイン内に又は切断ドメインに隣接して取り込まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
バリアント対立遺伝子の検出を増強するために、修飾されたヌクレオシドが切断ドメイン内に又は切断ドメインに隣接して取り込まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾されたヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルリボース残基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヌクレアーゼ耐性連結が切断ドメインの３’側に取り込まれている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の標的核酸配列の量を定量するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＣＲアッセイがプライマー−プローブＰＣＲアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
５’標識ドメインを有するプライマーが切断ドメインを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
切断ドメインがＲＮアーゼＨ切断ドメインである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＮアーゼＨ切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端残基の上流５’に連結され、前記ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）、（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、（ｉｉｉ）切断酵素及び（ｉｖ）ポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項４１】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は、１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４２】
前記２’修飾されたヌクレオシド残基が２’−フルオロヌクレオシドである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び標識を取り込んだプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４４】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基の５‘に位置するブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項４５】
プローブの切断が好熱性ＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介され、及び切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項４６】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’ヌクレオシド残基から構成される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
プローブの切断がより低い温度で低下した活性を有する好熱性ホットスタートＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介される、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項４９】
ａ）切断ドメイン及び３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含むアクセプターオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記アクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成されたアクセプターを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記アクセプターオリゴヌクレオチドをドナーオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項５０】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
対立遺伝子バリアントを識別するためにオリゴヌクレオチド連結アッセイが使用される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記対立遺伝子バリアントが単一のヌクレオチド多型である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ａ）切断ドメイン及び５’末端に又は５’末端付近にブロッキング基を含むドナーオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記ドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、前記ハイブリッド形成されたドナーオリゴヌクレオチドを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記ドナーオリゴヌクレオチドをアクセプターオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項５４】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）標的核酸、アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組みを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みはグアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一のドメインは１つ又は２つの塩基を含み、及び所定の組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、第一のドメインの３’側の第二のドメインはＲＮアーゼＨ２酵素によって切断可能であり、第二のドメインの３’側の第三のドメインは縮重又はユニバーサル塩基を含み、並びに第四のドメインは前記ドナーオリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に標識及びブロッキング基（前記標識であり得る。）を含み、ドナーオリゴヌクレオチドが連結反応においてアクセプターとしての役割を果たすのを妨げる。）；
ｂ）標的核酸配列にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）標的核酸配列にドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｄ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｅ）アクセプターに連結されたドナーオリゴヌクレオチド上の標識を検出する工程；
ｆ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の第一のドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｇ）工程ｃからｆを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項５６】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドは、５’ホスファートを有し、及び５’末端に特異的塩基、隣接するＲＮＡ残基、１から８残基の３’突出部を有するヘアピン構造を含み、前記突出部は縮重又はユニバーサル塩基を含み、’末端の又は３’末端付近のブロッキング基及び標識を場合によって含む。）；
ｂ）ドナーオリゴヌクレオチドの３’突出部にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項５７】
ａ）ブロッキング基の５’位置に切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の末端に又は末端付近に連結されており、前記ブロッキング基は、プライマー伸長を妨げる。）、試料核酸、切断酵素、ポリメラーゼ、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸及び標識されていないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項５８】
ａ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマー、試料核酸、ポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、試料ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
ｄ）伸長反応の二本鎖産物をＲＮアーゼＨ２酵素を用いて切断する工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状の標識された断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項５９】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は熱安定的なＲＮＡｓｅＨ切断ドメイン及びプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項６０】
３’末端及び５’末端を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡ残基及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含むリボ核酸ドメインを含む。）。
【請求項６１】
リボ核酸部分が１から３個のリボ核酸塩基又は修飾されたその誘導体からなる、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
リボ核酸ドメインが１又は２個のＲＮＡ塩基を含む、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
リボ核酸ドメインが１個のＲＮＡ塩基を含む、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
少なくとも１つのＲＮＡ残基が１つ又はそれ以上の修飾を含有する、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
修飾が一本鎖リボヌクレアーゼによる切断及び水によって触媒される加水分解に対する耐性を付与する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
修飾がＲＮＡ残基の２’位に存在する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
修飾が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項６９に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７１】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側のホスファート基に位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７２】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側の隣接する残基の５’位に位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
修飾がホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及びボロナートからなる群から選択される、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
修飾が５’チオ、５’アミン及び５’アルキル、５’メチレン及び５’エチレンからなる群から選択される、請求項７３に記載の一本鎖オリゴヌクレチド。
【請求項７５】
ブロッキング基がジデオキシヌクレオチド、３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基、２’ヒドロキシル置換又は伸長若しくは連結を妨げることができる３’末端の又は３’末端付近の単量体の塩基基のあらゆる置換除去からなる群から選択される、請求項６０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基がジデオキシ、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項７５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
３’ホスファートジエステルが３’−ヒドロキシプロピルジエステルである、請求項７６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
２’ヒドロキシル置換がトリイソプロピルシリル及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルからなる群から選択される、請求項７５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
１つ又はそれ以上のＲＮＡ塩基又は修飾された残基がＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たし、プライマーの３’末端及び／又は５’末端から少なくとも８塩基離れて位置する、請求項６７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
ａ）標的核酸に対して相補的でない５’配列タグ；
ｂ）５’配列タグ内に又は５’配列タグの３’に位置し、及び相補的な塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに切断可能である第一の切断ドメイン；
ｃ）５’配列タグ及び第一の切断ドメインの３’に位置する標的ハイブリッド形成配列（該標的ハイブリッド形成配列は、標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である。）；
ｄ）ハイブリッド形成配列の３’に位置するブロッキング基（該ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）；
ｅ）標的ハイブリッド形成配列とブロッキング基の間に位置する第二の切断ドメイン；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８１】
第二の切断ドメインが標的核酸に対して相補的である場合に、第二の切断ドメインがより高い速度で切断される、請求項８０に記載のプライマー。
【請求項８２】
ａ）３’末端及び５’末端、少なくとも１つのＲＮＡ残基を含むリボ核酸ドメイン及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
ｂ）３’末端及び５’末端、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに実質的に相補的な領域及び標的ＤＮＡ配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、二本鎖核酸化合物。
【請求項８３】
３’末端及び５’末端、１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン、蛍光色素及び消光物質を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）。
【請求項８４】
修飾されたヌクレオチド残基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項８３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８５】
ａ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記ブロッキング基に対して５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメイン、標的核酸、ＲＮアーゼＨ２酵素及びポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的核酸に少なくとも１つのプライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）ＲＮアーゼＨ２酵素を用いてブロッキング基を除去する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；
を含む、標的核酸配列を複製する方法。
【請求項８６】
反応混合物が３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
ａ）（ｉ）複フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み（フォワード又はリバースプライマーの複数の少なくとも１つは、３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及びブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ２切断ドメインを有する各プライマーを含む。）、（ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素、（ｉｉｉ）ｄＮＰＴ及び（ｉｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含有するプライマーの複数及び相補的配列にハイブリッド形成され及び切断ドメインがＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されるまで、前記ブロッキング基の５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメインは伸長せず；
ｅ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成し、並びに（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成するような条件に反応混合物を供する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、並びにさらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅されている反応混合物を提供するために、工程（ｆ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列を増幅する方法。
【請求項９５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、及び少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０３】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０７】
両プライマーの複数中の各プライマーが３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを含有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０８】
標的核酸の増幅が蛍光によってモニターされ、生成された蛍光の量が標的核酸増幅の量に直接比例する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０９】
標的核酸が多項目式に増幅される、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１０】
第一のプライマー伸長産物がリバースプライマーの切断ドメインを含有し、及び第二のプライマー伸長産物がリバースプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第一のプライマー伸長産物を形成するように、第二のプライマー伸長産物の伸長が第一のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１１】
第二のプライマー伸長産物がフォワードプライマーの切断ドメインを含有し、及び第一のプライマー伸長産物がフォワードプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第二のプライマー伸長産物を形成するように、第一のプライマー伸長産物の伸長が第二のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１２】
ａ）（ｉ）フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基、蛍光色素及び消光物質を含むＲＮアーゼＨ切断ドメインを含む３’末端及び５’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ（前記ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）、（ｉｉｉ）ＲＮアーゼＨ酵素、（ｉｖ）ｄＮＰＴ並びに（ｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成する、（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成する、及び（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブが第一又は第二のプライマー伸長産物の何れかを結合し、第一又は第二のプライマー伸長産物へのハイブリッド形成後に、ＲＮアーゼＨ酵素によって、プローブがその切断ドメインにおいて切断されるような条件に、反応混合物を供する工程；
ｅ）プローブの切断によって生成された蛍光を測定する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、さらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅され、及びプローブの切断によって生成された蛍光を測定することによって増幅が定量される反応混合物を提供するために、工程（ｆ）及び（ｇ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列の増幅を定量する方法。
【請求項１１３】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１８】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１９】
オリゴヌクレオチドプローブがＲＮアーゼＨ２によって切断される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２０】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーとともに温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）標的核酸に少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができ切断ドメイン、並びに該切断ドメインは、標的核酸が野生型対立遺伝子であるときに、潜在的な塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）；及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１２１】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
切断ドメインが少なくとも１つのリボヌクレオチド塩基を含有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
２つのブロッキング基がプライマーの３’末端に存在する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーと温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）前記領域の５’末端上に存在する５’配列ドメイン（該５’配列ドメインは、標的核酸試料に対して非相補的であり、及び相補的塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに、ＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる第二の切断ドメインを含有する。）、（ｉｉ）前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる切断ドメイン並びに該切断ドメインは潜在的塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）、及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１２５】
ブロッキング基が３’−末端ヌクレオチドから内部に位置している、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
３’末端に又は３’末端付近に、少なくとも第二のブロッキング基をさらに含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
切断ドメイン中の少なくとも１つのＲＮＡ塩基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
反応混合物がＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２又はＭｇＣｌ２の１つ又はそれ以上の二価の陽イオンを含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
反応混合物がＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
反応混合物が３ｍＭＭｇＣｌ２及び６００μＭＭｎＣｌ２を含有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３２】
ＲＮアーゼＨ２酵素がピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）及びピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）を含む群から得られる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含む単離された熱安定的リボヌクレアーゼＨ酵素。
【請求項１３４】
ａ）標的核酸及びアクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピンを含有する約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基ドメインは１から２個の塩基であり及び与えられた組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基ドメインはＲＮアーゼＨ２に対する基質である少なくとも１つのＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、及び残りの塩基は縮重又はユニバーサルである。）及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及び標的核酸に対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドに標的核酸をハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基ドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項１３５】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピン及び約１から５塩基長の５’末端上の突出部を含有するドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基は与えられた組みのヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基はＲＮアーゼＨ２に対する基質であるＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、残りの塩基はランダム又はユニバーサルである。）を含み、及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を場合によって含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及びアクセプターオリゴヌクレオチドに対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を合成する方法。
【請求項１３６】
ジデオキシ三リン酸及びポリメラーゼが、リガーゼ酵素の後に及びＲＮアーゼＨ２酵素の前に添加される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
ポリメラーゼが末端の転移酵素である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
ａ）標的核酸と配列決定反応混合物を混合すること；
ｂ）及び適切な条件下で、請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーとともに反応混合物を温置すること；
を含む、標的核酸を配列決定するための方法。
【請求項１３９】
ａ）核酸を含有する試料とＰＣＲ反応混合物を混合する工程；
ｂ）適切な条件下で、請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーとともに反応混合物を温置する工程；
を含む、単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項１４０】
ａ）標的核酸セグメント、適切な緩衝液及び適切なリガーゼを含む連結混合物に、請求項１に記載のプライマーの少なくとも１つの有効量を添加する工程、及び
ｂ）適切な連結条件下で、前記混合物を温置する工程；
を含む、標的核酸セグメントを連結する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１Ａ】
【図４１Ｂ】
【図４２Ａ】
【図４２Ｂ】
【図４２Ｃ】
【図４３】
【図４４】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１Ａ】
【図４１Ｂ】
【図４２Ａ】
【図４２Ｂ】
【図４２Ｃ】
【図４３】
【図４４】
【公表番号】特表２０１１−５２１６２４（Ｐ２０１１−５２１６２４Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０７６６９（Ｐ２０１１−５０７６６９）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５０９３
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０２８８５２９）インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５０９３
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０２８８５２９）インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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