偏光解消法による生体高分子のスクリーニング方法及びそれに用いる反応容器
【課題】
測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を実際の生理学的な系で測定して評価できるようにする。
【解決手段】
測定対象物としての例えばＲＮＡ又はＤＮＡに蛍光プローブとして例えばアンチセンス分子である蛍光標識核酸を接触させるように試料反応液を調製し、その試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定する。その測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量又は変化速度を求めて、その蛍光標識核酸の結合のしやすさを評価する。
測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を実際の生理学的な系で測定して評価できるようにする。
【解決手段】
測定対象物としての例えばＲＮＡ又はＤＮＡに蛍光プローブとして例えばアンチセンス分子である蛍光標識核酸を接触させるように試料反応液を調製し、その試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定する。その測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量又は変化速度を求めて、その蛍光標識核酸の結合のしやすさを評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、生体試料の挙動を研究するのに使用される分析方法と装置に関し、特に測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるための生体高分子のスクリーニング方法と、それに用いる反応容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、高度な新製品を効率良く開発するために、物質が細胞に与える効果（例えば、遺伝子を導入した細胞が産生するタンパク質）を経時的に解析し、その効果が発現するメカニズムを捉えたいという要請がある。
【０００３】
例えば細胞の機能を解析する際には、従来、効果を確認したい物質を導入した細胞を容器の中で数時間から数日の間培養し、その上清液を分離して分析することにより細胞の機能解析が行われていた。この場合、得られる情報は、培養時間中に細胞が産生した物質の総和であり、経時的な細胞の応答を解析することは困難であった。
【０００４】
また、疾患の原因を解明したり、効果の高い新薬を開発したりするために、遺伝子の機能解析が盛んに行われている。中でも、遺伝子情報をタンパク質合成に翻訳するｍＲＮＡの解析は非常に重要である。その中で、アンチセンス法の技術は遺伝子発現を制御する様々な疾患の治療や遺伝子機能の解析に役立つと期待されている。
【０００５】
最近、高いアンチセンス効果を保持し、ターゲットｍＲＮＡに非常に強く結合する（結合係数Ｋａの大きい）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）（アンチセンス分子）が報告されている。そこでは、効果的なＡＳＯＮを設計する際に重要なファクターの１つであるカイネティクス（ターゲットｍＲＮＡとの結合速度）を評価する手法として、ゲル電気泳動を用いた手法（非特許文献１、２参照。）や、表面プラズモン共鳴を用いた手法（非特許文献３）が用いられている。
【０００６】
しかし、測定対象物であるｍＲＮＡに対するアンチセンス分子のターゲットサイトを決定することはいまだ困難であることが多い。これはｍＲＮＡの高次構造の複雑さに起因している場合もあるが、アンチセンス分子を短時間で有効に評価できるスクリーニング方法が確立されていないことにも原因がある。
【０００７】
ところで、経時的な細胞の応答を解析する方法の１つに蛍光偏光解消法がある。溶液中や膜内に固定化された状態の蛍光剤の運動性を評価できることから、蛍光標識を施した生体分子を蛍光プローブとして、その運動性の変化を観測することにより生体分子の微量検出に応用されている。蛍光偏光解消法は、蛍光プローブを検出系から分離することなく溶液中における対象分子との相互作用を解析できる特徴がある（特許文献１、非特許文献４参照。）。
【特許文献１】特開２００４−２７９１４３号公報
【非特許文献１】S. P. Walton, G. N. Stephanopoulos, M. L. Yarmush, C. M. Roth, Thermodynamic and kinetic characterization of antisense oligodeoxynucleotide binding to a structured mRNA, Biophys. J. 82 (2002) 366-377.
【非特許文献２】F. Venturini, J. Braspenning, M. Homann, L. Gissmann, G. Sczakiel, Kinetic selection of HPV 16 E6/E7-directed antisense nucleic acids: anti-proliferative effects on HPV 16-transformed cells, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 1585-1592.
【非特許文献３】A. J. Thiel, A. G. Frutos, C. E. Jordan, R. M. Corn, L. M. Smith, In situ surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization to oligonucleotide array on gold surfaces, Anal. Chem 69 (1997) 4948-4956.
【非特許文献４】T.Sakamoto et al.,Study on structure of ribosomal RNA by time-resolved luminescence anisotropy analysis, Nucleic Acids Research Supplement No.1, pp.143-144
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞に関わる様々な反応をリアルタイムに解析することが求められており、さらに、細胞の糖タンパク質産生及び糖鎖構造の解析も細胞の機能を解析する上で重要である。
しかし、ゲル電気泳動を用いた手法は時間がかかって稼動率が高くないという問題点だけでなく、ゲル電気泳動を用いた手法や表面プラズモン共鳴を用いた手法は、実際の生理学的な系で測定することができないため実情を反映していないという問題があった。
本発明は測定対象物である生体高分子を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を実際の生理学的な系で測定して評価できるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるために、測定対象物に蛍光プローブとして蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を接触させるように試料反応液を調製するステップと、前記蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を評価するために、前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求めるステップと、を備えている。
測定対象物の一例は糖鎖であり、その場合の蛍光プローブは測定対象物と特異的に結合する糖鎖を蛍光剤で標識した蛍光標識糖鎖である。
【００１０】
また、測定対象物の他の例はＲＮＡ又はＤＮＡであり、その場合の蛍光プローブは蛍光標識核酸であり、好ましい一例はアンチセンス分子である。
試料反応液の体積は１μＬ以下であることが好ましい。
【００１１】
蛍光偏光解消法には、パルス光源を用いて偏光励起し、遅れて出てくる蛍光の偏光度の時間変化を１０ナノ秒から数マイクロ秒の間に検出する「時間分解蛍光偏光解消法」と、光源に定常光を用いて偏光励起する「定常光励起による蛍光偏光解消法」とがある。時間分解蛍光偏光解消法では蛍光剤の蛍光寿命を測定することができ、定常光励起による蛍光偏光解消法では時間分解蛍光偏光解消法で得られる偏光度の時間平均値が得られる。本発明で使用する蛍光偏光解消法は、そのいずれの方法も含んでいる。
【００１２】
蛍光異方性ｒは、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向及びそれに直交する偏光方向のそれぞれの直線偏光成分に基づいて求める。蛍光異方性ｒは励起偏光と平行な成分と直交する成分との蛍光強度の差を全蛍光強度で除した値である。蛍光異方性ｒの時間変化関数ｒ（ｔ）と分子の回転運動を表す回転相関時間（閘）には以下に次に示すような関連があるため、蛍光標識プローブと結合した測定対象物の回転運動を読み取ることができる。ここで示したように、複数の回転運動成分が存在する場合でも、ｒ（ｔ）を多成分の指数関数で近似することで個々に評価することが可能となる。
ｒ(ｔ)＝（ＩVV(ｔ)−ＩVH(ｔ)）／（ＩVV(ｔ)＋２ＩVH(ｔ)）
＝Σａiｅｘｐ(−ｔ／θi)
θ＝１／６Ｄ
＝ηＶ／ｋＴ
ここで、
ＩVV：蛍光の縦偏光成分強度
ＩVH：蛍光の横偏光成分強度
Ｄ：回転拡散係数
轗：粘度
Ｖ：分子の体積
ｋ：ボルツマン定数
Ｔ：絶対温度（Ｋ）
Ｉ：個々の分子（あるいは結合部位）を表わし、上記の説明では回転運動成分
ａi：比例係数（存在割合の比）で、ａiをすべて足すと１になる
【００１３】
蛍光異方性ｒは分子の回転運動により減衰していくが、励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後のそれらの値の変化は測定対象物量の増減を表わす。そこで、本発明の好ましい態様では、時間分解蛍光偏光解消法により励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後の測定値の経時変化として行なう。
【００１４】
蛍光プローブの蛍光剤としては、フルオレセインのほか、種々のものを使用することができる。
測定対象物と蛍光プローブが相互作用した物質を経時的に検出することを目的とした場合、蛍光偏光解消法は相互作用を定量的に測定することが原理的に可能であるが、測定したい蛍光以外に試料中の培地やレンズから発生する自家蛍光（背景光）がノイズとして含まれることがあるため、これを除去することができれば好都合である。自家蛍光は寿命が短いものが多いことを利用して、自家蛍光が消滅した後に目的の蛍光を検出することにより自家蛍光によるノイズを除去することができる。
【００１５】
その方法として、時間分解蛍光偏光解消法を使用するのが好ましい。その際、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なうようにするのが好ましい。蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にある蛍光剤としては、Ｒｕ（ルテニウム）錯体をあげることができる。Ｒｕ錯体の一例として、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）3］Ｃｌ2（tris-1,10-Phenanthroline ruthenium(II)dichloride）などを挙げることができる。
【００１６】
本発明の反応容器は、本発明のスクリーニング方法で使用する反応容器であり、基体内部に容積が１μＬ以下の反応室が形成され、外部からその反応室につながる流路が形成され、前記反応室の上側又は下側が励起光照射による蛍光測定が可能な透明部材となっており、前記流路を経て前記反応室に測定対象物又は蛍光プローブを入れ、その後前記流路を経て前記反応室に蛍光プローブ又は測定対象物を導入することにより反応を開始させて蛍光測定を行なえるようにしたものである。
【００１７】
複数の蛍光プローブを並行して評価することにより稼動率を上げるための好ましい反応容器は、１つの基体に反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにしたものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法では測定対象物に蛍光プローブを接触させる試料反応液を調製し、測定対象物と蛍光プローブとの相互作用を蛍光偏光解消法による蛍光異方性の変化量、変化速度又はその両方により評価するようにしたので、蛍光プローブを検出系から分離することなく生理学的な環境下で溶液中における測定対象物と蛍光プローブとの相互作用を解析してカイネティックスを評価することができるようになる。
【００１９】
試料反応液の体積を１μＬ以下とすれば、測定対象物を不用意に薄めることがなくなり、微量測定が可能となる。
蛍光偏光解消法として時間分解蛍光偏光解消法を採用し、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なうようにすれば、自家蛍光によるノイズを除去することができる。
【００２０】
本発明の反応容器は、容積が１μＬ以下の反応室とそれにつながる流路が形成されたものであるので、測定対象物と蛍光プローブを接触させる反応開始時点を明確にすることができるので、蛍光異方性の変化量や変化速度をより正確に測定することができるようになる。
【００２１】
その反応容器として、１つの基体に反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにしたものを使用すれば、スクリーニングの稼動率を上げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
蛍光異方性の測定を行なう装置について説明する。
蛍光偏光解消法には定常光励起による蛍光偏光解消法と時間分解蛍光偏光解消法があるが、前者の定常光励起による蛍光偏光解消法は通常の蛍光顕微鏡により実施することができる。そこで、本発明の好ましい蛍光偏光解消法としての時間分解蛍光偏光解消法を実施する装置の一例を図１に示す。
【００２３】
試料が収容された反応容器としてマイクロチップ２を使用する。マイクロチップ２は顕微鏡４の試料保持台に保持する。パルス励起光を出力するパルス励起光源部としてパルスレーザー装置６が設けられており、パルスレーザー装置６からのパルス励起光をマイクロチップ２の試料に照射するために、励起光波長の光を反射し、試料からの蛍光を透過させるダイクロイックミラー８が設けられている。パルスレーザー装置６から出力されたパルス励起光を特定の偏光方向、例えば縦方向の偏光方向をもつ直線偏光にする偏光手段として偏光板１０が、パルスレーザー装置６とダイクロイックミラー８の間の光路上に配置されている。これにより、偏光板１０により偏光方向が規定されたパルス励起光が顕微鏡４を通してマイクロチップ２中の微小空間内にある試料に照射される。ダイクロイックミラー８と顕微鏡４は照射光学系を構成している。
【００２４】
パルス励起光の照射により試料から発生した蛍光は、顕微鏡４を通ってダイクロイックミラー８を透過し、偏光板１０と同一の偏光方向に設定された検光子（偏光素子）１２を通過した後、励起光成分を除去するカットオフフィルタ１４を経て検出手段のストリークスコープ１６に導かれて検出される。顕微鏡４、検光子１２及びカットオフフィルタ１４は受光光学系を構成している。
【００２５】
演算手段（図示略）は、ストリークスコープ１６で検出された検出信号のうち、蛍光発生から所定の時間後、例えば２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号を使用して蛍光偏光解消を評価するようになっている。演算手段はデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００２６】
検出に用いるストリークスコープ１６は、検出すべき光量が少ない場合には、フォトンカウンティングモードで高感度な検出が可能であり、光量が多い場合にはアナログ計測により高速の検出ができるという特徴をもっている。しかし、ストリークスコープ１６に替えて、ＴＡＣ（時間―電圧変換器）法を用いたＴＣＳＰＣ（時間相関単一格子計数法）方式の検出器を用いてよい。
【００２７】
検光子１２を偏光板１０と同方向に設置した場合に、ＩVVすなわち蛍光の縦偏光成分強度が得られ、検光子１２を偏光板１０と直交する方向に設置した場合にはＩVHすなわち蛍光の横偏光成分強度が得られる。そこで、他の方法として、受光光学系に検光子１２を回転させる回転機構を設けることができる。検光子１２を回転させることによりＩVVとＩVHを得ることができる。検光子１２の回転は手動と自動のどちらでもよい。
【００２８】
さらに他の方法として、検光子を用いずに、入射光の縦偏光と横偏光を分離することのできる偏光ビームスプリッターを受光光学系に設け、その偏光ビームスプリッターを使用して蛍光の縦偏光成分と横偏光成分を検出器に導いてＩVVとＩVHを同時に検出するようにしてもよい。この場合にはストリークスコープ等の検出器が２個必要となる。
得られたＩVV、ＩVHを演算手段で演算することで蛍光異方性を求めることができる。この演算手段もデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００２９】
好ましい形態では、測定対象物と蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖との結合反応及び時間分解蛍光偏光解消法による測定を試料の体積が１μＬ以下の状態で行なう。そのために、試料の体積が１μＬ以下となるように形成されたマイクロチップを反応容器として使用することができる。そのような反応容器は、例えばシリコン基板に微細加工により反応室と流路を形成し、上下の底面に透明ガラス基板又は透明石英ガラスを用いて形成することができる。
【００３０】
そのようなマイクロチップに関しては、近年、μＴＡＳ（Micro Total Analysis Systems）、ＬＯＣ（Laboratory on a Chip）と称される、マイクロマシニング技術を利用してガラスやシリコンの基板上に化学分析や化学合成の機能を集積しチップ化する研究が盛んに行われており、容易に作製したり入手したりすることができる。
【００３１】
μＴＡＳやＬＯＣは、主として分析装置の超小型化や微小空間での化学反応が研究の対象であるが、最近は細胞操作に関する研究が注目されつつある。いずれも共通の特徴として、１）使用する試薬や試料の大幅な低減、２）分析や反応の高速化（短時間化）、３）並列処理による分析や合成操作件数のハイスループット化、４）機能の集積による高機能化・自動化・省力化、５）システム全体の小型化などがあり、様々な分野で将来の新市場を形成するものと期待されている。
【００３２】
マイクロチップ２の一例を図２に示す。（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
マイクロチップ２は３枚のガラス基板２０，２２，２４が接合されて構成されている。ガラス基板２０は厚みが１.０ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２２は厚みが０．５ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２４は厚みが０．１７ｍｍのカバーガラスである。カバーガラスの材質は限定されないが、石英、ＢＫ−７、パイレックス（登録商標）など、自家蛍光の少ないものが望ましい。
【００３３】
ガラス基板２０の片面には、数百μｍ以下の幅と深さを持つ微小な流路溝２６と、流路溝２６の両端部に位置する試料導入（Inlet）及び排出（Outlet）のための貫通穴２８，３０が形成されている。ガラス基板２２には流路溝２６の中央部に該当する位置に直径が１ｍｍの反応室用の貫通穴３２があけられている。ガラス基板２４は加工を施していない平坦な板である。
【００３４】
ガラス基板２０の流路溝２６が形成されている面とガラス基板２２の片面とを向かい合わせて密着させ、さらにガラス基板２２の裏面にガラス基板２４を密着させた状態で、それぞれのガラス基板間を例えばフッ酸溶液による接合などの手段で液密に接合することにより、このマイクロチップ２が構成されている。
マイクロチップ２中の反応室３２の形状は直径１ｍｍ、深さが０．５ｍｍで、容量は約０．４μＬである。
【００３５】
一実施の形態として、測定対象物をｍＲＮＡとして、蛍光プローブとして蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いて、どのオリゴヌクレオチドが測定対象物のｍＲＮＡを特異的に認識して結合するかを調べるスクリーニング方法を示す。
【００３６】
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のような生理食塩水をバッファ液として、その中に測定対象物のｍＲＮＡと蛍光標識オリゴヌクレオチドを入れて試料反応液を調製した。具体的には、蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、５'−フルオレセイン標識オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｆプローブと略記する。）を用いた。また、ｍＲＮＡとしては、二次構造の解明されているEscherichia coli １６Ｓ リボソーマルＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡと略記する。）を使用した。試料反応液のバッファ液は１０ｍＭのTris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ2を含むものであり、Ｆプローブと１６ＳｒＲＮＡの濃度はともに０．７５μＭとした。
【００３７】
図３は測定対象物である１６ＳｒＲＮＡのターゲットサイトと塩基配列を示す。Ｌ１−Ｌ７は一本鎖になったターゲットサイトで、Ｓ１はすでに２重鎖を組んでおりＦプローブと結合しない部位である。それらの塩基配列（Sequence）は既知であり、図３の右の表に示した。ターゲットサイトは各ターゲットの位置を５‘末端からの塩基番号で示している。
Ｌ１〜Ｌ７，Ｓ１の塩基配列と相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識したものをＦ−Ｌ１等と表すことにする。
【００３８】
１６ＳｒＲＮＡにＦプローブとしてＦ−Ｌ１〜Ｆ−Ｌ７，Ｆ−Ｓ１のそれぞれを混合させて調製した試料反応液について、定常光励起による蛍光偏光解消法で蛍光異方性を測定した。励起波長は４９５ｎｍ、検出波長は５１５ｎｍでそのバンド幅を５ｎｍとした。測定時の試料反応液の温度は１１℃であった。
その結果を表１にまとめて示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１中で、ｒは蛍光異方性を表わし、ｒｐはＦプローブのみによる蛍光異方性値、ｒcORNはＦプローブと相補的なオリゴヌクレオチドとの混合物の２４時間後の蛍光異方性値、ｒrRNAはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの混合物の２４時間後の蛍光異方性値である。
ｒｐとｒrRNAとの比較から蛍光異方性の変化量を知ることができる。Ｆ−Ｌ１，Ｆ−Ｌ２及びＦ−Ｌ７のＦプローブはｒＲＮＡとの混合によりＦプローブの蛍光異方性が増加しており、これらのＦプローブが１６ＳｒＲＮＡの対応する位置に結合していることがわかる。Ｆ−Ｌ３〜Ｆ−Ｌ６及びＦ−Ｓ１ではＦプローブの蛍光異方性の増加がみられず、これらの対応する位置ではＦプローブが結合しにくいことを示している。
【００４１】
Ｆ−Ｌ３〜Ｆ−Ｌ６及びＦ−Ｓ１の結合能力自体は、それと相補的なオリゴヌクレオチドを加えた際の蛍光異方性ｒcORNの増加によって確認することができる。
なお、表１中のτpはＦプローブ自体の蛍光の平均寿命、τrRNAはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの混合物の２４時間後の蛍光の平均寿命である。ＫｄはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの結合物の平衡解離定数である。
【００４２】
また、この反応における蛍光異方性値の時間変化を示した結果が図４であり、これから蛍光異方性の変化速度、すなわち結合速度を求めることができる。表１中のｋassoc，ｋsissocはそれぞれこのグラフからカーブフィッティングにより求めた結合速度定数、解離速度定数であり、このｒＲＮＡとの結合速度及び解離速度定数はＦ−Ｌ２が最も大きく、Ｆ−Ｌ１とＦ−Ｌ７がそれに続き、他のＦプローブは検出できない程度（ｎ．ｄ．）に小さい。この結果からも、Ｆ−Ｌ１，Ｆ−Ｌ２及びＦ−Ｌ７がｒＲＮＡの対応する位置に結合することを示している。
【００４３】
表１中の結合性（Acceptability）は、Ｆプローブと１６ＳｒＲＮＡとの等モル混合液の平衡状態での蛍光強度の増加量から評価した。この結果からも、１６ＳｒＲＮＡに対する結合性はＦ−Ｌ２が強く、Ｆ−Ｌ１とＦ−Ｌ７は中程度、その他のＦプローブは反応しないと評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、測定対象物を特異的に認識して結合する核酸や糖鎖、例えば核酸や糖鎖の所定の部位に結合するアンチセンス分子を見つけるためのスクリーニング方法などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施に使用する分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】同分析装置において使用することのできる一実施例のマイクロチップを示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
【図３】一実施例で示した測定対象物の一例の構造を示す図である。
【図４】同実施例において測定対象物とＡＳＯＮの相互作用を経時的に測定した分析結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４６】
２ マイクロチップ
２０，２２，２４ ガラス基板
２６ 流路溝
２８，３０ 試料導入又は排出のための貫通穴
３２ 反応室用の貫通穴
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>Kyoto Institute of Technology
Shimadzu Corporation
<120>Screening method of biopolymer by fluorescence depolarization spectroscopy and reaction vessel used therefor
<130>K1050058
<160>8
<210>1
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>1
gcc gta ctc c
<210>2
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>2
ccg tgt ctc a
<210>3
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>3
cag taa ttc c
<210>4
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>4
atc gtt tac g
<210>5
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>5
gaa cgt att c
<210>6
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>6
gta tct aat c
<210>7
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>7
gcg ttg cat c
<210>8
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>8
gta tca gat g
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、生体試料の挙動を研究するのに使用される分析方法と装置に関し、特に測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるための生体高分子のスクリーニング方法と、それに用いる反応容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、高度な新製品を効率良く開発するために、物質が細胞に与える効果（例えば、遺伝子を導入した細胞が産生するタンパク質）を経時的に解析し、その効果が発現するメカニズムを捉えたいという要請がある。
【０００３】
例えば細胞の機能を解析する際には、従来、効果を確認したい物質を導入した細胞を容器の中で数時間から数日の間培養し、その上清液を分離して分析することにより細胞の機能解析が行われていた。この場合、得られる情報は、培養時間中に細胞が産生した物質の総和であり、経時的な細胞の応答を解析することは困難であった。
【０００４】
また、疾患の原因を解明したり、効果の高い新薬を開発したりするために、遺伝子の機能解析が盛んに行われている。中でも、遺伝子情報をタンパク質合成に翻訳するｍＲＮＡの解析は非常に重要である。その中で、アンチセンス法の技術は遺伝子発現を制御する様々な疾患の治療や遺伝子機能の解析に役立つと期待されている。
【０００５】
最近、高いアンチセンス効果を保持し、ターゲットｍＲＮＡに非常に強く結合する（結合係数Ｋａの大きい）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）（アンチセンス分子）が報告されている。そこでは、効果的なＡＳＯＮを設計する際に重要なファクターの１つであるカイネティクス（ターゲットｍＲＮＡとの結合速度）を評価する手法として、ゲル電気泳動を用いた手法（非特許文献１、２参照。）や、表面プラズモン共鳴を用いた手法（非特許文献３）が用いられている。
【０００６】
しかし、測定対象物であるｍＲＮＡに対するアンチセンス分子のターゲットサイトを決定することはいまだ困難であることが多い。これはｍＲＮＡの高次構造の複雑さに起因している場合もあるが、アンチセンス分子を短時間で有効に評価できるスクリーニング方法が確立されていないことにも原因がある。
【０００７】
ところで、経時的な細胞の応答を解析する方法の１つに蛍光偏光解消法がある。溶液中や膜内に固定化された状態の蛍光剤の運動性を評価できることから、蛍光標識を施した生体分子を蛍光プローブとして、その運動性の変化を観測することにより生体分子の微量検出に応用されている。蛍光偏光解消法は、蛍光プローブを検出系から分離することなく溶液中における対象分子との相互作用を解析できる特徴がある（特許文献１、非特許文献４参照。）。
【特許文献１】特開２００４−２７９１４３号公報
【非特許文献１】S. P. Walton, G. N. Stephanopoulos, M. L. Yarmush, C. M. Roth, Thermodynamic and kinetic characterization of antisense oligodeoxynucleotide binding to a structured mRNA, Biophys. J. 82 (2002) 366-377.
【非特許文献２】F. Venturini, J. Braspenning, M. Homann, L. Gissmann, G. Sczakiel, Kinetic selection of HPV 16 E6/E7-directed antisense nucleic acids: anti-proliferative effects on HPV 16-transformed cells, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 1585-1592.
【非特許文献３】A. J. Thiel, A. G. Frutos, C. E. Jordan, R. M. Corn, L. M. Smith, In situ surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization to oligonucleotide array on gold surfaces, Anal. Chem 69 (1997) 4948-4956.
【非特許文献４】T.Sakamoto et al.,Study on structure of ribosomal RNA by time-resolved luminescence anisotropy analysis, Nucleic Acids Research Supplement No.1, pp.143-144
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞に関わる様々な反応をリアルタイムに解析することが求められており、さらに、細胞の糖タンパク質産生及び糖鎖構造の解析も細胞の機能を解析する上で重要である。
しかし、ゲル電気泳動を用いた手法は時間がかかって稼動率が高くないという問題点だけでなく、ゲル電気泳動を用いた手法や表面プラズモン共鳴を用いた手法は、実際の生理学的な系で測定することができないため実情を反映していないという問題があった。
本発明は測定対象物である生体高分子を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を実際の生理学的な系で測定して評価できるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるために、測定対象物に蛍光プローブとして蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を接触させるように試料反応液を調製するステップと、前記蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を評価するために、前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求めるステップと、を備えている。
測定対象物の一例は糖鎖であり、その場合の蛍光プローブは測定対象物と特異的に結合する糖鎖を蛍光剤で標識した蛍光標識糖鎖である。
【００１０】
また、測定対象物の他の例はＲＮＡ又はＤＮＡであり、その場合の蛍光プローブは蛍光標識核酸であり、好ましい一例はアンチセンス分子である。
試料反応液の体積は１μＬ以下であることが好ましい。
【００１１】
蛍光偏光解消法には、パルス光源を用いて偏光励起し、遅れて出てくる蛍光の偏光度の時間変化を１０ナノ秒から数マイクロ秒の間に検出する「時間分解蛍光偏光解消法」と、光源に定常光を用いて偏光励起する「定常光励起による蛍光偏光解消法」とがある。時間分解蛍光偏光解消法では蛍光剤の蛍光寿命を測定することができ、定常光励起による蛍光偏光解消法では時間分解蛍光偏光解消法で得られる偏光度の時間平均値が得られる。本発明で使用する蛍光偏光解消法は、そのいずれの方法も含んでいる。
【００１２】
蛍光異方性ｒは、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向及びそれに直交する偏光方向のそれぞれの直線偏光成分に基づいて求める。蛍光異方性ｒは励起偏光と平行な成分と直交する成分との蛍光強度の差を全蛍光強度で除した値である。蛍光異方性ｒの時間変化関数ｒ（ｔ）と分子の回転運動を表す回転相関時間（閘）には以下に次に示すような関連があるため、蛍光標識プローブと結合した測定対象物の回転運動を読み取ることができる。ここで示したように、複数の回転運動成分が存在する場合でも、ｒ（ｔ）を多成分の指数関数で近似することで個々に評価することが可能となる。
ｒ(ｔ)＝（ＩVV(ｔ)−ＩVH(ｔ)）／（ＩVV(ｔ)＋２ＩVH(ｔ)）
＝Σａiｅｘｐ(−ｔ／θi)
θ＝１／６Ｄ
＝ηＶ／ｋＴ
ここで、
ＩVV：蛍光の縦偏光成分強度
ＩVH：蛍光の横偏光成分強度
Ｄ：回転拡散係数
轗：粘度
Ｖ：分子の体積
ｋ：ボルツマン定数
Ｔ：絶対温度（Ｋ）
Ｉ：個々の分子（あるいは結合部位）を表わし、上記の説明では回転運動成分
ａi：比例係数（存在割合の比）で、ａiをすべて足すと１になる
【００１３】
蛍光異方性ｒは分子の回転運動により減衰していくが、励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後のそれらの値の変化は測定対象物量の増減を表わす。そこで、本発明の好ましい態様では、時間分解蛍光偏光解消法により励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後の測定値の経時変化として行なう。
【００１４】
蛍光プローブの蛍光剤としては、フルオレセインのほか、種々のものを使用することができる。
測定対象物と蛍光プローブが相互作用した物質を経時的に検出することを目的とした場合、蛍光偏光解消法は相互作用を定量的に測定することが原理的に可能であるが、測定したい蛍光以外に試料中の培地やレンズから発生する自家蛍光（背景光）がノイズとして含まれることがあるため、これを除去することができれば好都合である。自家蛍光は寿命が短いものが多いことを利用して、自家蛍光が消滅した後に目的の蛍光を検出することにより自家蛍光によるノイズを除去することができる。
【００１５】
その方法として、時間分解蛍光偏光解消法を使用するのが好ましい。その際、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なうようにするのが好ましい。蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にある蛍光剤としては、Ｒｕ（ルテニウム）錯体をあげることができる。Ｒｕ錯体の一例として、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）3］Ｃｌ2（tris-1,10-Phenanthroline ruthenium(II)dichloride）などを挙げることができる。
【００１６】
本発明の反応容器は、本発明のスクリーニング方法で使用する反応容器であり、基体内部に容積が１μＬ以下の反応室が形成され、外部からその反応室につながる流路が形成され、前記反応室の上側又は下側が励起光照射による蛍光測定が可能な透明部材となっており、前記流路を経て前記反応室に測定対象物又は蛍光プローブを入れ、その後前記流路を経て前記反応室に蛍光プローブ又は測定対象物を導入することにより反応を開始させて蛍光測定を行なえるようにしたものである。
【００１７】
複数の蛍光プローブを並行して評価することにより稼動率を上げるための好ましい反応容器は、１つの基体に反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにしたものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法では測定対象物に蛍光プローブを接触させる試料反応液を調製し、測定対象物と蛍光プローブとの相互作用を蛍光偏光解消法による蛍光異方性の変化量、変化速度又はその両方により評価するようにしたので、蛍光プローブを検出系から分離することなく生理学的な環境下で溶液中における測定対象物と蛍光プローブとの相互作用を解析してカイネティックスを評価することができるようになる。
【００１９】
試料反応液の体積を１μＬ以下とすれば、測定対象物を不用意に薄めることがなくなり、微量測定が可能となる。
蛍光偏光解消法として時間分解蛍光偏光解消法を採用し、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なうようにすれば、自家蛍光によるノイズを除去することができる。
【００２０】
本発明の反応容器は、容積が１μＬ以下の反応室とそれにつながる流路が形成されたものであるので、測定対象物と蛍光プローブを接触させる反応開始時点を明確にすることができるので、蛍光異方性の変化量や変化速度をより正確に測定することができるようになる。
【００２１】
その反応容器として、１つの基体に反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにしたものを使用すれば、スクリーニングの稼動率を上げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
蛍光異方性の測定を行なう装置について説明する。
蛍光偏光解消法には定常光励起による蛍光偏光解消法と時間分解蛍光偏光解消法があるが、前者の定常光励起による蛍光偏光解消法は通常の蛍光顕微鏡により実施することができる。そこで、本発明の好ましい蛍光偏光解消法としての時間分解蛍光偏光解消法を実施する装置の一例を図１に示す。
【００２３】
試料が収容された反応容器としてマイクロチップ２を使用する。マイクロチップ２は顕微鏡４の試料保持台に保持する。パルス励起光を出力するパルス励起光源部としてパルスレーザー装置６が設けられており、パルスレーザー装置６からのパルス励起光をマイクロチップ２の試料に照射するために、励起光波長の光を反射し、試料からの蛍光を透過させるダイクロイックミラー８が設けられている。パルスレーザー装置６から出力されたパルス励起光を特定の偏光方向、例えば縦方向の偏光方向をもつ直線偏光にする偏光手段として偏光板１０が、パルスレーザー装置６とダイクロイックミラー８の間の光路上に配置されている。これにより、偏光板１０により偏光方向が規定されたパルス励起光が顕微鏡４を通してマイクロチップ２中の微小空間内にある試料に照射される。ダイクロイックミラー８と顕微鏡４は照射光学系を構成している。
【００２４】
パルス励起光の照射により試料から発生した蛍光は、顕微鏡４を通ってダイクロイックミラー８を透過し、偏光板１０と同一の偏光方向に設定された検光子（偏光素子）１２を通過した後、励起光成分を除去するカットオフフィルタ１４を経て検出手段のストリークスコープ１６に導かれて検出される。顕微鏡４、検光子１２及びカットオフフィルタ１４は受光光学系を構成している。
【００２５】
演算手段（図示略）は、ストリークスコープ１６で検出された検出信号のうち、蛍光発生から所定の時間後、例えば２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号を使用して蛍光偏光解消を評価するようになっている。演算手段はデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００２６】
検出に用いるストリークスコープ１６は、検出すべき光量が少ない場合には、フォトンカウンティングモードで高感度な検出が可能であり、光量が多い場合にはアナログ計測により高速の検出ができるという特徴をもっている。しかし、ストリークスコープ１６に替えて、ＴＡＣ（時間―電圧変換器）法を用いたＴＣＳＰＣ（時間相関単一格子計数法）方式の検出器を用いてよい。
【００２７】
検光子１２を偏光板１０と同方向に設置した場合に、ＩVVすなわち蛍光の縦偏光成分強度が得られ、検光子１２を偏光板１０と直交する方向に設置した場合にはＩVHすなわち蛍光の横偏光成分強度が得られる。そこで、他の方法として、受光光学系に検光子１２を回転させる回転機構を設けることができる。検光子１２を回転させることによりＩVVとＩVHを得ることができる。検光子１２の回転は手動と自動のどちらでもよい。
【００２８】
さらに他の方法として、検光子を用いずに、入射光の縦偏光と横偏光を分離することのできる偏光ビームスプリッターを受光光学系に設け、その偏光ビームスプリッターを使用して蛍光の縦偏光成分と横偏光成分を検出器に導いてＩVVとＩVHを同時に検出するようにしてもよい。この場合にはストリークスコープ等の検出器が２個必要となる。
得られたＩVV、ＩVHを演算手段で演算することで蛍光異方性を求めることができる。この演算手段もデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００２９】
好ましい形態では、測定対象物と蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖との結合反応及び時間分解蛍光偏光解消法による測定を試料の体積が１μＬ以下の状態で行なう。そのために、試料の体積が１μＬ以下となるように形成されたマイクロチップを反応容器として使用することができる。そのような反応容器は、例えばシリコン基板に微細加工により反応室と流路を形成し、上下の底面に透明ガラス基板又は透明石英ガラスを用いて形成することができる。
【００３０】
そのようなマイクロチップに関しては、近年、μＴＡＳ（Micro Total Analysis Systems）、ＬＯＣ（Laboratory on a Chip）と称される、マイクロマシニング技術を利用してガラスやシリコンの基板上に化学分析や化学合成の機能を集積しチップ化する研究が盛んに行われており、容易に作製したり入手したりすることができる。
【００３１】
μＴＡＳやＬＯＣは、主として分析装置の超小型化や微小空間での化学反応が研究の対象であるが、最近は細胞操作に関する研究が注目されつつある。いずれも共通の特徴として、１）使用する試薬や試料の大幅な低減、２）分析や反応の高速化（短時間化）、３）並列処理による分析や合成操作件数のハイスループット化、４）機能の集積による高機能化・自動化・省力化、５）システム全体の小型化などがあり、様々な分野で将来の新市場を形成するものと期待されている。
【００３２】
マイクロチップ２の一例を図２に示す。（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
マイクロチップ２は３枚のガラス基板２０，２２，２４が接合されて構成されている。ガラス基板２０は厚みが１.０ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２２は厚みが０．５ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２４は厚みが０．１７ｍｍのカバーガラスである。カバーガラスの材質は限定されないが、石英、ＢＫ−７、パイレックス（登録商標）など、自家蛍光の少ないものが望ましい。
【００３３】
ガラス基板２０の片面には、数百μｍ以下の幅と深さを持つ微小な流路溝２６と、流路溝２６の両端部に位置する試料導入（Inlet）及び排出（Outlet）のための貫通穴２８，３０が形成されている。ガラス基板２２には流路溝２６の中央部に該当する位置に直径が１ｍｍの反応室用の貫通穴３２があけられている。ガラス基板２４は加工を施していない平坦な板である。
【００３４】
ガラス基板２０の流路溝２６が形成されている面とガラス基板２２の片面とを向かい合わせて密着させ、さらにガラス基板２２の裏面にガラス基板２４を密着させた状態で、それぞれのガラス基板間を例えばフッ酸溶液による接合などの手段で液密に接合することにより、このマイクロチップ２が構成されている。
マイクロチップ２中の反応室３２の形状は直径１ｍｍ、深さが０．５ｍｍで、容量は約０．４μＬである。
【００３５】
一実施の形態として、測定対象物をｍＲＮＡとして、蛍光プローブとして蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いて、どのオリゴヌクレオチドが測定対象物のｍＲＮＡを特異的に認識して結合するかを調べるスクリーニング方法を示す。
【００３６】
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のような生理食塩水をバッファ液として、その中に測定対象物のｍＲＮＡと蛍光標識オリゴヌクレオチドを入れて試料反応液を調製した。具体的には、蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、５'−フルオレセイン標識オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｆプローブと略記する。）を用いた。また、ｍＲＮＡとしては、二次構造の解明されているEscherichia coli １６Ｓ リボソーマルＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡと略記する。）を使用した。試料反応液のバッファ液は１０ｍＭのTris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ2を含むものであり、Ｆプローブと１６ＳｒＲＮＡの濃度はともに０．７５μＭとした。
【００３７】
図３は測定対象物である１６ＳｒＲＮＡのターゲットサイトと塩基配列を示す。Ｌ１−Ｌ７は一本鎖になったターゲットサイトで、Ｓ１はすでに２重鎖を組んでおりＦプローブと結合しない部位である。それらの塩基配列（Sequence）は既知であり、図３の右の表に示した。ターゲットサイトは各ターゲットの位置を５‘末端からの塩基番号で示している。
Ｌ１〜Ｌ７，Ｓ１の塩基配列と相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識したものをＦ−Ｌ１等と表すことにする。
【００３８】
１６ＳｒＲＮＡにＦプローブとしてＦ−Ｌ１〜Ｆ−Ｌ７，Ｆ−Ｓ１のそれぞれを混合させて調製した試料反応液について、定常光励起による蛍光偏光解消法で蛍光異方性を測定した。励起波長は４９５ｎｍ、検出波長は５１５ｎｍでそのバンド幅を５ｎｍとした。測定時の試料反応液の温度は１１℃であった。
その結果を表１にまとめて示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１中で、ｒは蛍光異方性を表わし、ｒｐはＦプローブのみによる蛍光異方性値、ｒcORNはＦプローブと相補的なオリゴヌクレオチドとの混合物の２４時間後の蛍光異方性値、ｒrRNAはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの混合物の２４時間後の蛍光異方性値である。
ｒｐとｒrRNAとの比較から蛍光異方性の変化量を知ることができる。Ｆ−Ｌ１，Ｆ−Ｌ２及びＦ−Ｌ７のＦプローブはｒＲＮＡとの混合によりＦプローブの蛍光異方性が増加しており、これらのＦプローブが１６ＳｒＲＮＡの対応する位置に結合していることがわかる。Ｆ−Ｌ３〜Ｆ−Ｌ６及びＦ−Ｓ１ではＦプローブの蛍光異方性の増加がみられず、これらの対応する位置ではＦプローブが結合しにくいことを示している。
【００４１】
Ｆ−Ｌ３〜Ｆ−Ｌ６及びＦ−Ｓ１の結合能力自体は、それと相補的なオリゴヌクレオチドを加えた際の蛍光異方性ｒcORNの増加によって確認することができる。
なお、表１中のτpはＦプローブ自体の蛍光の平均寿命、τrRNAはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの混合物の２４時間後の蛍光の平均寿命である。ＫｄはＦプローブと１６ＳｒＲＮＡの結合物の平衡解離定数である。
【００４２】
また、この反応における蛍光異方性値の時間変化を示した結果が図４であり、これから蛍光異方性の変化速度、すなわち結合速度を求めることができる。表１中のｋassoc，ｋsissocはそれぞれこのグラフからカーブフィッティングにより求めた結合速度定数、解離速度定数であり、このｒＲＮＡとの結合速度及び解離速度定数はＦ−Ｌ２が最も大きく、Ｆ−Ｌ１とＦ−Ｌ７がそれに続き、他のＦプローブは検出できない程度（ｎ．ｄ．）に小さい。この結果からも、Ｆ−Ｌ１，Ｆ−Ｌ２及びＦ−Ｌ７がｒＲＮＡの対応する位置に結合することを示している。
【００４３】
表１中の結合性（Acceptability）は、Ｆプローブと１６ＳｒＲＮＡとの等モル混合液の平衡状態での蛍光強度の増加量から評価した。この結果からも、１６ＳｒＲＮＡに対する結合性はＦ−Ｌ２が強く、Ｆ−Ｌ１とＦ−Ｌ７は中程度、その他のＦプローブは反応しないと評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、測定対象物を特異的に認識して結合する核酸や糖鎖、例えば核酸や糖鎖の所定の部位に結合するアンチセンス分子を見つけるためのスクリーニング方法などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施に使用する分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】同分析装置において使用することのできる一実施例のマイクロチップを示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
【図３】一実施例で示した測定対象物の一例の構造を示す図である。
【図４】同実施例において測定対象物とＡＳＯＮの相互作用を経時的に測定した分析結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４６】
２ マイクロチップ
２０，２２，２４ ガラス基板
２６ 流路溝
２８，３０ 試料導入又は排出のための貫通穴
３２ 反応室用の貫通穴
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>Kyoto Institute of Technology
Shimadzu Corporation
<120>Screening method of biopolymer by fluorescence depolarization spectroscopy and reaction vessel used therefor
<130>K1050058
<160>8
<210>1
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>1
gcc gta ctc c
<210>2
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>2
ccg tgt ctc a
<210>3
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>3
cag taa ttc c
<210>4
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>4
atc gtt tac g
<210>5
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>5
gaa cgt att c
<210>6
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>6
gta tct aat c
<210>7
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>7
gcg ttg cat c
<210>8
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>8
gta tca gat g
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるための生体高分子のスクリーニング方法において、
測定対象物に蛍光プローブとして蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を接触させるように試料反応液を調製するステップと、
前記蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を評価するために、前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求めるステップと、
を備えていることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記測定対象物は糖鎖であり、前記蛍光プローブは蛍光標識糖鎖である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記測定対象物はＲＮＡ又はＤＮＡであり、前記蛍光プローブは蛍光標識核酸である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記蛍光標識核酸はアンチセンス分子である請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記試料反応液の体積を１μＬ以下とする請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記蛍光偏光解消法は時間分解蛍光偏光解消法である請求項１から５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なう請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１に記載のスクリーニング方法で使用する反応容器であって、
基体内部に容積が１μＬ以下の反応室が形成され、外部からその反応室につながる流路が形成され、前記反応室の上側又は下側が励起光照射による蛍光測定が可能な透明部材となっており、
前記流路を経て前記反応室に測定対象物又は蛍光プローブを入れ、その後前記流路を経て前記反応室に蛍光プローブ又は測定対象物を導入することにより反応を開始させて蛍光測定を行なえるようにしたことを特徴とする反応容器。
【請求項９】
１つの基体に前記反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにした請求項８に記載の反応容器。
【請求項１】
測定対象物を特異的に認識して結合する核酸又は糖鎖を見つけるための生体高分子のスクリーニング方法において、
測定対象物に蛍光プローブとして蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を接触させるように試料反応液を調製するステップと、
前記蛍光標識核酸又は蛍光標識糖鎖を評価するために、前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求めるステップと、
を備えていることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記測定対象物は糖鎖であり、前記蛍光プローブは蛍光標識糖鎖である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記測定対象物はＲＮＡ又はＤＮＡであり、前記蛍光プローブは蛍光標識核酸である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記蛍光標識核酸はアンチセンス分子である請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記試料反応液の体積を１μＬ以下とする請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記蛍光偏光解消法は時間分解蛍光偏光解消法である請求項１から５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なう請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１に記載のスクリーニング方法で使用する反応容器であって、
基体内部に容積が１μＬ以下の反応室が形成され、外部からその反応室につながる流路が形成され、前記反応室の上側又は下側が励起光照射による蛍光測定が可能な透明部材となっており、
前記流路を経て前記反応室に測定対象物又は蛍光プローブを入れ、その後前記流路を経て前記反応室に蛍光プローブ又は測定対象物を導入することにより反応を開始させて蛍光測定を行なえるようにしたことを特徴とする反応容器。
【請求項９】
１つの基体に前記反応室及び流路が複数個形成されており、複数の測定対象物について並行して測定を行ないうるようにした請求項８に記載の反応容器。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−２２０５６６（Ｐ２００６−２２０５６６Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４９７２（Ｐ２００５−３４９７２）
【出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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