優れたストレス耐性を有する酵母の分子育種法及び遺伝子改変酵母
【課題】優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母を提供すること。
【解決手段】高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；を含む、核酸カセット。
【解決手段】高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；を含む、核酸カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、その方法、およびその核酸カセットを使用して得られる遺伝子改変酵母に関する。より具体的には、本発明は、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセット、その方法、および得られる酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母の発酵産業への利用において、酵母の発酵および生育阻害要因となるストレスの存在が問題となっている。例えば、パンの製造においては、我が国において需要の多い菓子パン等に用いられる高糖生地では、約３０％（対小麦粉比）にも及ぶショ糖が添加されることから、極めて高い浸透圧ストレス（高ショ糖ストレス）が負荷される。また、近年、急速に普及した冷凍生地製パン法においては冷凍ストレスが負荷される。以上のことから、酵母の産業利用においては様々なストレス（例えば、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレス）に対する耐性の向上が求められている。従来より、ストレス耐性の向上を目的とした交配や突然変異導入等による育種が行われてきたが、得られた耐性は十分とは言い難い。近年のバイオマスエタノールへの注目を受け、より優れたストレス耐性を持つ酵母の開発が急務となっている。
【０００３】
１９９０年代以降、ストレス耐性機構に関する知見の蓄積に伴い、耐性関連遺伝子を改変することによって耐性を増強しようという試みがなされている。特許文献１は、ストレスに起因する細胞の障害を緩和する役割を担うことが知られている、いわゆる適合溶質の代謝を操作することによる冷凍耐性酵母の作出を開示する。具体的には、特許文献１は、ＮＴＨ１遺伝子（中性トレハラーゼ遺伝子）を遺伝子破壊した１倍体酵母または２倍体以上の倍数体酵母を開示する。非特許文献１は、芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子（ＡＲＯ１など）を破壊することによって高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれることを開示する。非特許文献１はまた、ＢＵＤ２３、ＧＯＮ７、ＳＰＴ２０の遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すことを開示する。非特許文献２は、ＰＭＲ１遺伝子またはＳＮＦ５遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれることを開示する。非特許文献３は、ＣＢＳ２欠損により、乾燥ストレス感受性になることを開示する。非特許文献４は、ＤＢＦ２の破壊により、ソルビン酸ストレスに対して高感受性になることを開示する。
【特許文献１】特開平１０−１１７７７１号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｏら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．」，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ（２００６）６：２４９−２６７
【非特許文献２】Ａｎｄｏら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ．」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．（２００７）７：２４４−２５３
【非特許文献３】Ｓｈｉｍａら「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｉｒ−ｄｒｙｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ」Ｙｅａｓｔ（２００８）２５：１７９−１９０
【非特許文献４】Ｍａｋｒａｎｔｏｎｉら「Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄｂｆ２ｐ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）１５３：４０１６−４０２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
・（項目１）
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および
当該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；
を含む、核酸カセット。
・（項目２）
上記プロモーターが、ＨＳＰ１０４プロモーターである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目３）
上記ＡＲＯ１遺伝子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＢＵＤ２３遺伝子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＰＭＲ１遺伝子が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＳＮＦ５遺伝子が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＧＯＮ７遺伝子が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＳＰＴ２０遺伝子が、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＣＢＳ２遺伝子が、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＤＢＦ２遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる、
項目１に記載の核酸カセット。
・（項目４）
上記プロモーターの上流に、上記ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子の上流領域のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目５）
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目６）
上記選択マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、および薬剤耐性マーカーからなる群より選択される、項目５に記載の核酸カセット。
・（項目７）
上記栄養要求性マーカーが、ＵＲＡ３マーカーである、項目６に記載の核酸カセット。
・（項目８）
上記５’末端フラグメントが、導入された酵母中のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子と相同組換えを生じるために十分な長さである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目９）
上記長さが、少なくとも４０ヌクレオチドである、項目８に記載の核酸カセット。
・（項目１０）
上記長さが、少なくとも６００ヌクレオチドである、項目９に記載の核酸カセット。
・（項目１１）
上記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目１２）
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造する方法であって、
酵母中に項目１に記載の核酸カセットを導入する工程；
を包含する、方法。
・（項目１３）
上記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、項目１２に記載の方法。
・（項目１４）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）である、項目１３に記載の方法。
・（項目１５）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４５株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）である、項目１３に記載の方法。
・（項目１６）
項目１に記載の核酸カセットを含む、酵母。
・（項目１７）
サッカロミセス・セレビシェである、項目１６に記載の酵母。
・（項目１８）
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６からなる群より選択される株である、項目１７に記載の酵母。
・（項目１９）
項目１６に記載の酵母を含む、食品またはその材料。
・（項目２０）
パン、パン生地、アルコール、菓子類、漬物、および発酵調味料からなる群より選択される、項目１９に記載の食品またはその材料。
・（項目２１）
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造するための、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの組合せの使用。
・（項目２２）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）である、項目１３に記載の方法。
・（項目２３）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２５１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）である、項目１３に記載の方法。
【０００６】
本発明は、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性を増強することに関する。酵母ＡＲＯ１遺伝子は、芳香族アミノ酸合成の一部を触媒する酵素をコードしている。酵母のＡＲＯ１遺伝子を含む芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子を破壊することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれることは、以前に公知であった（Ａｎｄｏら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．」，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ（２００６）６：２４９−２６７）。酵母ＢＵＤ２３遺伝子は、娘細胞の出芽部位の決定に関与しているが、その分子機構は不明である。酵母ＢＵＤ２３遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＧＯＮ７遺伝子は、Ｎ結合型オリゴ糖へのマンノシルリン酸基の転移に関与すると提唱されているタンパク質をコードしており、酵母ＧＯＮ７遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＳＰＴ２０遺伝子は、転写部位選択を変化させるＴＢＰクラスのＳＰＴタンパク質のメンバーをコードしており、酵母ＳＰＴ２０遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＣＢＳ２遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳の活性化に関与しており（Ｋｒａｕｓｅ−Ｂｕｃｈｈｏｌｚら「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｃｂｓ２ｐ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）４６：２０−２８）、その遺伝子欠損により、乾燥ストレス感受性になることが、以前に公知であった（Ｓｈｉｍａら「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｉｒ−ｄｒｙｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ」Ｙｅａｓｔ（２００８）２５：１７９−１９０）。酵母ＤＢＦ２遺伝子は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼをコードしている。ＤＢＦ２の破壊により、ソルビン酸ストレスに対して高感受性になることが、以前に公知であった（Ｍａｋｒａｎｔｏｎｉら「Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄｂｆ２ｐ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）１５３：４０１６−４０２６）。しかし、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性を実際に増強し得たという本発明の効果は、このような本願出願時の文献および技術常識から全く予想外であった。なぜなら、遺伝子破壊による表現型と、当該遺伝子の過剰発現による表現型の変化については、一般化できるような法則性はないからである。また、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子の遺伝子発現と高ショ糖ストレス耐性との関連に言及した報告は現在までにない。従って、これら遺伝子の発現増強によって高ショ糖ストレス耐性の向上が得られたことは予想外であった。
【０００７】
本発明はまた、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性を増強することに関する。酵母ＰＭＲ１遺伝子は、ゴルジ体膜上に局在するイオンポンプをコードしており、ゴルジ体のみならず細胞内のイオン恒常性維持に関与している。ＰＭＲ１遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれる（Ａｎｄｏら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ．」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ． ２００７ ７：２４４−２５３）。酵母ＳＮＦ５遺伝子は、ＤＮＡ複製および転写に関与するＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成タンパク質の一つをコードしている。ＳＮＦ５遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれる（Ａｎｄｏら，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ７，２４４−２５３）。しかし、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性を増強し得たという本発明の効果は、このような本願出願時の文献および技術常識から全く予想外であった。なぜなら、遺伝子破壊による表現型と、当該遺伝子の過剰発現による表現型の変化については、一般化できるような法則性はないからである。また、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子の遺伝子発現と冷凍ストレス耐性との関連に言及した報告は現在までにない。従って、これら遺伝子の発現増強によって冷凍ストレス耐性の向上が得られたことは予想外であった。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１０】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１１】
用語「ストレスに対して耐性」とは、酵母に関して使用される場合、種々のストレス（例えば、高ショ糖ストレス、冷凍ストレスなど）を負荷された条件下で生育し、かつその条件下でコントロール酵母株と比較して発酵力が強いことを意味する。そのような「発酵力」は、一定の酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）における発酵時のガス発生量により表わされる。
【００１２】
用語「高ショ糖ストレス」とは、本明細書において使用される場合、ショ糖濃度が３０重量％の酵母発酵条件を意味し、極めて高い浸透圧が酵母に対して負荷される。従って、本発明における高ショ糖ストレスに対して耐性である酵母は、同等の浸透圧を負荷する他の溶液中でも耐性であり得る。
【００１３】
用語「冷凍ストレス」とは、本明細書において使用される場合、０℃以下にて酵母を冷凍することを意味する。酵母が冷凍される限り、０℃以下の任意の温度が使用され得る。
【００１４】
用語「核酸カセット」とは、核酸またはそのアナログを含む構築物を意味する。この文脈において、核酸とは、一般的な意味において、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、このヌクレオチドとは、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはこれらのアナログを含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。核酸のアナログとはまた、改変した骨格を含むもの（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または改変した塩基を含有するものなどの、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを包含する。
【００１５】
用語「ＡＲＯ１遺伝子」とは、酵母ＡＲＯ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＡＲＯ１タンパク質は、芳香族アミノ酸合成に関与する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子のコード領域は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１６】
用語「ＢＵＤ２３遺伝子」とは、酵母ＢＵＤ２３タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＢＵＤ２３タンパク質は、出芽部位の決定に関与する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子のコード領域は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１７】
用語「ＰＭＲ１遺伝子」とは、酵母ＰＭＲ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＰＭＲ１タンパク質は、ゴルジ体のイオンポンプを構成する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子のコード領域は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１８】
用語「ＳＮＦ５遺伝子」とは、酵母ＳＮＦ５タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＳＮＦ５タンパク質は、転写複合体の一部を構成する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子のコード領域は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１９】
用語「ＧＯＮ７遺伝子」とは、酵母ＧＯＮ７タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＧＯＮ７タンパク質は、Ｎ結合型オリゴ糖へのマンノシルリン酸基の転移に関与すると提唱されている。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子のコード領域は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２０】
用語「ＳＰＴ２０７遺伝子」とは、酵母ＳＰＴ２０タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＳＰＴ２０タンパク質は、転写部位選択を変化させるＴＢＰクラスのＳＰＴタンパク質のメンバーである。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子のコード領域は、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２１】
用語「ＣＢＳ２遺伝子」とは、酵母ＣＢＳ２タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＣＢＳ２タンパク質は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳の活性化に関与している。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子のコード領域は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
用語「ＤＢＦ２遺伝子」とは、酵母ＤＢＦ２タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＤＢＦ２タンパク質は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を有する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子のコード領域は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２３】
本発明の高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットは、当該核酸カセットに含まれる酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメントと、相同組換えを生じ得るＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子を有する任意の株を形質転換するために使用し得ることが、当業者には容易に理解され得る。
【００２４】
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株と、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株とは、極めて近縁な株であり、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ののＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子とほぼ同一または全く同一のヌクレオチド配列を有していると推定される。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子と、少なくとも相同組換えを生じる程度の配列相同性を有することが、本出願において確認された。
【００２５】
当業者は、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株以外、Ｙ２４５株以外、およびＹ２４９株以外、Ｙ２５１株以外の酵母の株についても、相同組換えを生じる程度の配列相同性を有する限り任意の酵母サッカロミセス・セレビシェ株（例えば、Ｓ２８８Ｃ株であるが、これに限定はされない）のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子に対応するその株の各遺伝子を用いて同様の遺伝子操作をすることができることを理解する。
【００２６】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる株における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものであってもよい。従って、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株以外の酵母の株において、対応するＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子を見出すことができる。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株のＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株以外の酵母の株において、対応するＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子、ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子）の配列をクエリ配列として用いて対象となる酵母株の配列データベースを検索することによって見出すことができる。以下に限定されることはないが、例えば、ＡＲＯ１遺伝子について言えば、対応する他の酵母株のＡＲＯ１遺伝子は、配列番号１に示す配列からなる核酸と同一であるかまたは１つ以上、または１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する（すなわち芳香族アミノ酸合成に関与する）ポリペプチドをコードするものであり得る。あるいは、そのような対応する他の酵母株のＡＲＯ１遺伝子は、配列番号１がコードするアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、かつ、生物学的活性を有する（すなわち芳香族アミノ酸合成に関与する）ポリペプチドをコードするものであり得る。ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子、ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子についても、同様に対応する遺伝子を見出すことができる。
【００２７】
用語「高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター」とは、高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスのうちのいずれか一方によって誘導されるプロモーター、またはその双方により誘導されるプロモーターを意味する。このようなプロモーターとしては、ＨＳＰ１０４プロモーター、ＨＳＰ１２プロモーター、ＴＰＳ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、ならびに他の公知のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
用語「ＨＳＰ１０４プロモーター」とは、任意の酵母のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターを意味する。ＨＳＰ１０４プロモーターは、高ショ糖ストレス条件下および／または冷凍ストレス条件下で、そのプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが公知である。このようなＨＳＰ１０４プロモーターとしては、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２５）が挙げられるが、これに限定はされない。
【００２９】
用語「作動可能に連結された」とは、遺伝子に関して使用される場合、その遺伝子が機能するように適切な調節配列の制御下に連結されていることを指す。例えば、あるプロモーターが、適切な宿主細胞もしくは他の発現系における遺伝子コード配列の転写および／または翻訳の制御を補助する場合に、その遺伝子コード配列は、そのプロモーターに作動可能に連結されている。作動可能に連結されている遺伝子コード配列は、連続的であり得、かつこの遺伝子コード配列は、同じリーディングフレーム中に存在し得るが、特定の遺伝子調節配列は、発現されるべきポリペプチドをコードする遺伝子コード配列に連続的に連結されている必要はない。例えば、エンハンサーは、そのエンハンサーが転写を増強するコード配列に近接している必要はない。
【００３０】
用語「酵母」とは、実用株および実験室株を含む、任意の酵母を指す。代表的には、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシェ）（パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（ビール酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ（ワイン酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｒｏｕｘｉｉ（醤油酵母）、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属酵母、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ属酵母、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母などが挙げられるが、これらに限定はされない。実用株とは、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母等、産業上優れた形質を持つ株であり、それぞれの用途に応じて当該分野において多数の株が現在までに選別されている。実用株としては、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）およびそのウラシル要求性変異株Ｙ２４５（２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１を付与された）、ならびに酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株（２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１を付与された）およびそのウラシル要求性変異株Ｙ２５１（２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２を付与された）が挙げられる。実験室株とは、遺伝学的な解析が行いやすい形質を持つ株である。一般的に、ヘテロタリズムの形質を有し、接合子形成率または胞子形成率が高く、ＤＮＡ抽出や形質転換、相同組換え等を効率よく行うことの出来る株が実験室株として用いられている。最近では、１９９６年に全ゲノム配列が解読された酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株およびその誘導株が多く用いられている。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株は、例えば、ＡＴＣＣ ２６１０８としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国，ヴァージニア ２０１０８，マナサス，ピーオーボックス１５４９）から入手可能であり、ＮＢＲＣ １１３６として独立行政法人 製品技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）からも入手可能である。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株の全ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅのホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／にて閲覧可能である。近年、実験室株と実用株の差異がゲノムレベルで議論されている（Ｙｅａｓｔ １９：４４１−４４８ （２００２）、Ｙｅａｓｔ １８：１１４５−１１５４ （２００１））。
【００３１】
用語「相同組換えを生じるために十分な長さ」とは、酵母において、２つの核酸の間で相同組換えが生じ得る長さを意味する。そのような２つの核酸は、例えば、酵母ゲノムと外来核酸とであり得る。実験室株については少なくとも約４０ヌクレオチドの相同配列があれば、十分な頻度で相同組換えが起こることが公知である（Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２１（１４）：３３２９−３３３０（１９９３）、Ｙｅａｓｔ １０：１７９３−１８０８（１９９４）を参照のこと）。パン酵母または清酒酵母等の実用株における相同組換えのためには、約６００ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド程度またはそれ以上の相同配列が必要であると考えられている（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６５（７）：２８４１−２８４６（１９９９）、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ９７（６）：４１２−４１８（２００４）を参照のこと）。
【００３２】
用語「フラグメント」とは、ヌクレオチドに関して使用される場合、好ましくは約４０ヌクレオチド長以上の任意のオリゴヌクレオチドフラグメントを意味する。オリゴヌクレオチドフラグメントは、例えば、約４０ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約５５ヌクレオチド長、約６０ヌクレオチド長、またはそれ以上など、酵母の実験室株において相同組換えを生じるために十分な長さであり得る。オリゴヌクレオチドフラグメントはまた、好ましくは約６００ヌクレオチド長〜数千ヌクレオチド長以上の任意のヌクレオチドフラグメントを意味する。ヌクレオチドフラグメントは、例えば、約６００ヌクレオチド長、約６５０ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約７５０ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約８５０ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約９５０ヌクレオチド長、約１，０００ヌクレオチド長、約１，１００ヌクレオチド長、約１，２００ヌクレオチド長、約１，３００ヌクレオチド長、約１，４００ヌクレオチド長、約１，５００ヌクレオチド長、約１，６００ヌクレオチド長、約１，７００ヌクレオチド長、約１，８００ヌクレオチド長、約１，９００ヌクレオチド長、約２，０００ヌクレオチド長、約２，２００ヌクレオチド長、約２，４００ヌクレオチド長、約２，６００ヌクレオチド長、約２，８００ヌクレオチド長、約３，０００ヌクレオチド長、約３，３００ヌクレオチド長、約３，６００ヌクレオチド長、約３，９００ヌクレオチド長、約４，０００ヌクレオチド長、約４，４００ヌクレオチド長、約４，８００ヌクレオチド長、約５，０００ヌクレオチド長、約５，５００ヌクレオチド長、約６，０００ヌクレオチド長、約６，６００ヌクレオチド長、約７，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上など、酵母の実用株において相同組換えを生じるために十分な長さであり得る。
【００３３】
用語「約」とは、数値に関して使用される場合、示される値±１０％を意味する。
【００３４】
用語「選択マーカー」とは、その選択マーカーを含む酵母が検出され得る特性を提供するエレメントを意味する。選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、薬剤耐性マーカーが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３５】
用語「栄養要求性マーカー」とは、酵母の栄養要求性を相補するタンパク質を意味する。栄養要求性マーカーとしては、ＵＲＡ３マーカー、ＬＥＵ１マーカー、ＬＥＵ２マーカー、ＨＩＳ３マーカー、ＵＲＡ４マーカー、ＴＲＰ１マーカー、ＨＩＳ５マーカー、ＬＹＳ２マーカー、ＭＥＴ１５マーカー、ＥＣＭ３１マーカーなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３６】
用語「抗生物質耐性マーカー」とは、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質を意味する。このような抗生物質耐性マーカーとしては、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシンに対する耐性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；Ｇ４１８耐性を付与する、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシンＢ耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；セルレニン耐性を付与する変異型脂肪酸合成酵素；シクロヘキシミド耐性を付与する変異型リボソームタンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３７】
用語「蛍光タンパク質マーカー」とは、蛍光を発するタンパク質を意味する。このような蛍光タンパク質マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３８】
用語「発光タンパク質マーカー」とは、発光するタンパク質を意味する。このような発光タンパク質マーカーとしては、エクオリン、ルシフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３９】
用語「酵素タンパク質マーカー」とは、酵素タンパク質を意味する。このような酵素タンパク質マーカーとしては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４０】
用語「薬剤耐性マーカー」とは、薬剤に対する耐性を付与するタンパク質を意味する。薬剤耐性マーカーとしては、代謝物のアナログ（例えば、チアミンアナログであるピリチアミン）への耐性を付与する変異型チアミン輸送タンパク質や、銅耐性を付与する変異型メタロチオニンなど）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４１】
標的遺伝子の「５’末端含有領域」という用語は、標的遺伝子の５’末端を含む核酸領域（すなわち、「５’末端領域」）、または標的遺伝子の５’末端とその下流の領域とを含む核酸領域を指す。この用語において、その下流の領域の範囲は、標的遺伝子内部に限定されず、標的遺伝子の３’末端まで（すなわち、「標的遺伝子全体」）に及び得、さらには標的遺伝子の下流領域（「標的遺伝子およびその下流域」）にさえ及び得る。従って、本明細書において、標的遺伝子の「５’末端含有領域」という用語は、「５’末端領域」、「標的遺伝子全体」、および「標的遺伝子およびその下流域」を包含し得る。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性が増強されることを初めて見出し、高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母サッカロミセス・セレビシェＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株ならびにＡＹ１７４株、ＡＹ２４９株、ＡＹ２５３株、およびＡＹ３６８株を得た。上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１２８株は、そのゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＡＲＯ１遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＡＲＯ１遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＡＲＯ１遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＡＲＯ１遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４３】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１３７株は、ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＢＵＤ２３遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＢＵＤ２３遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＢＵＤ２３遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＢＵＤ２３遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４４】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１７４株は、ゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＧＯＮ７遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＧＯＮ７遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＧＯＮ７遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＧＯＮ７遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４５】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ２４９株は、ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＳＰＴ２０遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＳＰＴ２０遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＳＰＴ２０遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＳＰＴ２０遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４６】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ２５３株は、ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＣＢＳ２遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＣＢＳ２遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＣＢＳ２遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＣＢＳ２遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４７】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ３６８株は、ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＤＢＦ２遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＤＢＦ２遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＤＢＦ２遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４８】
本発明者らはまた、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性が増強されることを初めて見出し、冷凍ストレス耐性が増強された酵母サッカロミセス・セレビシェＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株を得た。上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１１２株は、そのゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、冷凍ストレス条件下でＰＭＲ１遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、冷凍ストレス条件下でＰＭＲ１遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＰＭＲ１遺伝子を有するいかなる酵母においても、冷凍ストレス条件下におけるＰＭＲ１遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に冷凍ストレス耐性を付与し得る。
【００４９】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１０８株は、そのゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、冷凍ストレス条件下でＳＮＦ５遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、冷凍ストレス条件下でＳＮＦ５遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＳＮＦ５遺伝子を有するいかなる酵母においても、冷凍ストレス条件下におけるＳＮＦ５遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に冷凍ストレス耐性を付与し得る。
【００５０】
本発明の高ショ糖耐性酵母は、ショ糖を大量に含む菓子パン生地の発酵が短時間で済む、使用酵母量を減らすことが可能になるなどの利点を提供する。さらに、本発明の高ショ糖耐性酵母は、初発糖濃度が極めて高いアルコール発酵、または漬物・醤油・味噌等の発酵調味料における極めて厳しい浸透圧条件下での発酵を効率よく行うことを可能にする。
【００５１】
本発明の冷凍耐性酵母は、冷凍生地製パン法において、冷凍期間の延長、解凍後の発酵特性の改善、発酵時間の短縮、使用酵母量の削減等、種々の利点を提供する。
【００５２】
本発明により、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって、酵母の高ショ糖ストレス耐性が増強されることが明らかとなった。また、本発明により、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって、酵母の冷凍ストレス耐性が増強されることが明らかとなった。従って、酵母の高ショ糖ストレス耐性および／または冷凍ストレス耐性の増強は、これらの酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現が増強される限り、当業者にとって周知である任意の遺伝子発現増強方法によって行われ得ることを、当業者は理解する。そのような遺伝子発現増強方法としては、酵母ゲノム上にある上記酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサーなど）の挿入、自律複製可能な線状または環状のベクターに連結された上記酵母遺伝子の酵母中への導入、上記酵母遺伝子の発現を誘導する転写因子等の過剰発現、あるいはプロモーターエレメントとの親和性を増大させる変異の導入などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５３】
（酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域の挿入）
本発明の酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域の挿入は、例えば、融合ＰＣＲ法と相同組換えとの組み合わせにより行われ得る。融合ＰＣＲ法は、当該分野において公知である。例えば、Ｋｕｗａｙａｍａら，「ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００２）３０（２）：Ｅ２を参照のこと。Ｋｕｗａｙａｍａらの手法は、遺伝子破壊を目的としたＤＮＡ断片を一段階の融合ＰＣＲにより増幅するものである。融合ＰＣＲにおいては、２つのプライマーを使用するＰＣＲによって、２つ以上のＤＮＡ断片が融合して１つの融合断片を生じる。このような融合断片を生じるために、融合ＰＣＲにおいて使用される連結されるべき２つＤＮＡ断片において、少なくとも一方のＤＮＡ断片は、その連結されるべき末端に、もう一方のＤＮＡ断片の連結されるべき末端の部分領域と同じ配列を有するタグを有するように設計される。
【００５４】
本発明において使用される融合ＰＣＲ法は、以下のような二段階の融合ＰＣＲによる。第一段階の融合ＰＣＲにおいて、遺伝子発現調節領域カセットが作製される。より具体的には、選択マーカー遺伝子が、５’プライマー（プライマーＡ）および３’プライマー（プライマーＢ）を用いてＰＣＲ増幅される。遺伝子発現調節領域もまた、５’プライマー（プライマーＣ）および３’プライマー（プライマーＤ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＣは、増幅される遺伝子発現調節領域の５’末端に、選択マーカーの３’末端領域と同じ配列の５’タグが付加されるように設計される。得られる二つの増幅断片が、５’プライマー（プライマーＡ）および３’プライマー（プライマーＤ）を用いる融合ＰＣＲにより連結される。得られる融合ＰＣＲ増幅断片は、遺伝子発現調節領域カセットと呼ばれる。この遺伝子発現調節領域カセットは、プロモーターを使用する場合、プロモーターカセットとも呼ばれ得る。第二段階の融合ＰＣＲにおいて、上記遺伝子発現調節領域カセットの両側に、標的酵母遺伝子と相同な（または好ましくは同一の）配列が付加される。より具体的には、標的酵母遺伝子の上流域＋３’タグ断片が、５’プライマー（プライマーＥ）および３’プライマー（プライマーＦ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＦは、増幅される標的酵母遺伝子上流域の３’末端に、上記選択マーカー遺伝子の５’末端領域と同じ配列の３’タグが付加されるように設計される。５’タグ＋標的酵母遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）断片もまた、５’プライマー（プライマーＧ）および３’プライマー（プライマーＨ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＧは、増幅される標的酵母遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）の５’末端に、上記遺伝子発現調節領域の３’末端領域と同じ配列の５’タグが付加されるように設計される。得られる二つの断片の間に、上記遺伝子発現調節領域カセットが、５’プライマー（プライマーＥ）および３’プライマー（プライマーＨ）を用いる融合ＰＣＲによって挿入・連結される。得られた融合ＰＣＲ断片（５’側から３’側に向って、標的遺伝子の上流域、選択マーカー、遺伝子発現調節領域、標的遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）を含む）は、酵母の形質転換用ＰＣＲ断片である。この形質転換用ＰＣＲ断片は、酵母ゲノム上の標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）と、形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）との間での相同組換えにより、ダブルクロスオーバー様式で酵母ゲノム中に導入される。得られた酵母は、標的遺伝子の上流に、選択マーカーおよび遺伝子発現調節領域が挿入されている。上記選択マーカーを指標として、遺伝子発現調節領域が導入された酵母株を単離し得る。上記のような相同組換え機構の利用に鑑みれば、標的遺伝子の５’末端領域を含む断片を融合ＰＣＲにより増幅してもよいし、標的遺伝子の５’末端含有領域を含む断片を融合ＰＣＲにより増幅してもよいことが、当業者には容易に理解され得る。
【００５５】
上記の例示的融合ＰＣＲにおいては、増幅される遺伝子発現調節領域の５’末端、増幅される標的酵母遺伝子上流域の３’末端、および増幅される標的酵母遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）の５’末端それぞれに、それらが連結されるべき末端の部分領域と同じ配列のタグが付加されるように設計されている。このようなタグが付加される末端およびその配列は、上記に限定されない。例えば、増幅される選択マーカーの５’末端に標的酵母遺伝子上流域の３’末端領域と同じ配列のタグを付加し得、増幅される選択マーカーの３’末端に遺伝子発現調節領域の５’末端領域と同じ配列のタグを付加し得る。このように、タグが付加される末端およびその配列は、融合ＰＣＲが生じる限り適切に変更・改変され得ることが、当業者には明らかである。
【００５６】
酵母ゲノムと形質転換用ＰＣＲ断片との間で生じる相同組換えの長さは、形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域の長さおよび標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）の長さから当業者が容易に決定し得る。このような形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域および５’末端領域（または５’末端含有領域）の長さは、これらの標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）を増幅するために使用されるプライマーＥおよびプライマーＦの鋳型上での位置、ならびにプライマーＧおよびプライマーＨの鋳型上での位置から決定され得る。逆に、鋳型上での適切な位置に対応するプライマーＥ〜Ｈを設計することによって、相同組換えを生じるために必要な長さを有する標的遺伝子の上流域および５’末端領域（または５’末端含有領域）を含む形質転換用ＰＣＲ断片を取得し得る。このようなプライマーの設計および相同組換えの長さの算出は、当業者の技術範囲内にある。
【００５７】
（遺伝子発現調節領域）
上記のように、本発明において、酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現が、遺伝子発現調節領域によって増強され得る。高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方の条件下で標的遺伝子の発現を増強し得る限り、任意のプロモーター、エンハンサー、または他の遺伝子発現調節領域を使用して酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強し、それによって酵母に高ショ糖耐性または冷凍耐性を付与し得ることが、当業者には明らかである。好ましい遺伝子発現調節領域は、酵母ＨＳＰ１０４プロモーターであり、より好ましくは、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーターである。
【００５８】
（選択マーカー）
本発明において、酵母ゲノム上にある上記酵母遺伝子領域へと遺伝子発現調節領域（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサーなど）が挿入された改変酵母、または自律複製可能な線状もしくは環状のベクターに連結された上記酵母遺伝子が導入された改変酵母などを検出する指標として、種々の選択マーカーが使用され得る。このような選択マーカーとしては、改変酵母を検出する効果を奏す限り、適切な任意の選択マーカーが使用され得ることが、当業者にとって明らかである。
【００５９】
（ＰＣＲ増幅）
本発明において使用されるＰＣＲ増幅は、種々のポリメラーゼおよびサーマルサイクラー、当業者が容易に決定可能な適切なＰＣＲ条件を使用して行われる。例示的なポリメラーゼとしては、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社，大津市瀬田三丁目４番１号）が挙げられるが、これに限定はされない。例示的なサーマルサイクラーとしては、ＡＢＩ ９６００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京、日本）が挙げられるが、これに限定はされない。
【００６０】
（ストレス負荷条件に対する酵母の耐性）
ストレス負荷条件に対する酵母の耐性は、その炭酸ガス発生量を測定することによって評価され得る。酵母の炭酸ガス発生量は、例えば、ファーモグラフ法によって測定され得る。ファーモグラフ法とは、ファーモグラフ（アトー株式会社，東京都文京区本郷１−２５−２３）を使用して、微生物発酵などによって発生するガス量を計測する方法である。
【００６１】
（酵母の形質転換）
酵母を形質転換する方法は、当該分野において周知である。例えば、「Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）ｐ１０３を参照のこと。
【００６２】
（酵母の培地）
酵母を培養・保存するための培地は、当該分野において周知である。そのような培地としては、ＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）、ＹＭＰＤ培地（０．３％ イーストエキス、０．３％ マルトエキス、０．５％ ペプトン、３％ グルコース）、糖蜜培地（２６０ｇ／Ｌの糖に相当する廃糖蜜に１９．４９ｇ／Ｌの尿素、および５２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を添加した溶液）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６３】
（パン生地・パンの製造）
パン生地・パンの製造は、当該分野で周知である。例えば、パン生地・パンは、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる方法によって製造され得る。例として、菓子パンなどに使用される高糖生地の一例は、
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ３０重量部
食塩 ０．５重量部
酵母 ４重量部
ショートニング ６重量部
脱脂粉乳 ２重量部
水 ５２重量部
を含む。この高糖生地を、以下のような例示的製パン条件：
ミキシング Ｌ３，Ｍ２，↓
Ｌ２，Ｍ２，Ｈ１〜
捏ね上げ温度 ２８℃
第一発酵 ３０℃、７０分
第二発酵 ３０℃、３０分
分割・丸め ４５０ｇ
ベンチ ３０℃、２０分
成形 ワンローフ
ホイロ発酵 ３８℃、ＲＨ８５％
型上１．５ｃｍ
焼成 ２００℃、２５分
にて製パンし得る。
【００６４】
また、例えば、冷凍製パン用生地の一例は、
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ５重量部
食塩 ２重量部
酵母 ２重量部
ショートニング ５重量部
を含む。この生地を、以下のような例示的製パン条件：
凍結前発酵 ６０分
冷凍期間 １〜２週間（−２０℃）
解凍 ９０分（３０℃）
丸め、ベンチ ３０分
成形
ホイロ ５５分
焼成 ２５分
にて製パンし得る。上記のような生地の組成および製パン条件は、意図されるパンの性質に依存して、必要に応じて当業者が容易に改変し得ることが明らかである。
【００６５】
（菓子類の製造）
酵母を使用した菓子は、酵母を原料混合時に添加し、混捏し、発酵させ、成型し、焙焼することによって製造され得る。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、特開２００１−２１１８１５を参照のこと。
【００６６】
（日本酒の製造）
日本酒の製造方法は、当該分野において周知である。例えば、以下のような方法で、日本酒は製造され得る：
１）精米
米を精米する。玄米の表層部や胚芽には、麹菌および酵母の増殖、発酵促進には過剰な灰分およびビタミン類、また必要以上に多いと製成酒の香りや味を劣化させるタンパク質および脂質が多く含まれている。これらは醸造管理を困難にさせることから、醸造上で不必要な成分を取り除く作業を行う。これが精米である。
【００６７】
２）洗米
次に精米した米を洗米する。白米表層に残留している糠分を除去する目的で、白米を水洗いすることを「洗米」という。洗米中に白米の表面が１〜２％摩耗し、二次精米の効果がある。
【００６８】
３）浸漬および水切り
３−１）浸漬
次に、洗米した米を浸漬タンクに入れ水に浸漬させる。浸漬の目的は、米粒の中心まで水を充分に吸収させることによって、蒸煮したときに完全な蒸米になるように、すなわちα化（生の米デンプンのかたい結晶構造に水が入り、加熱によってデンプンが膨潤、糊化すること）が完全に行われるようにするためである。
【００６９】
３−２）水切り
予定の浸漬時間を経過した後、浸漬タンクから水を排出する。これを水切りという。
【００７０】
４）蒸し
次に、浸漬タンクから米を取り出し蒸しの工程を行う。
【００７１】
蒸しの目的は、適度に水を吸わせた生米を、蒸気で加熱することによって、米の生デンプンをα化し、麹菌の生産する糖化酵素の作用を受けやすくするためである。また、加熱によって米を殺菌し、以後の醸造工程を安全に遂行するためでもある。
【００７２】
よい蒸米とは、さばけがよくて外硬内軟なもの。つまり、完全にα化され、適度のかたさを保ち、表面がべたつかないものを指す。蒸米の硬軟は、以後の製麹管理と醪中の米の溶解に大きな影響を与えるので、大変重要な工程である。
【００７３】
５）麹
次に、蒸米に麹菌を増殖させる（これを「麹」という）。麹菌は蒸米上で増殖すると同時に各種の酵素を菌体外に分泌する。麹菌自体は空気中の酸素を必要とする好気的な微生物であるため、空気の存在しない醪の中では生きることができず、死滅してしまう。
【００７４】
麹菌の生産した酵素はタンパク質の一種で、生物でなく物質であるため、醪中に残存し、酵素作用を発揮する。
【００７５】
日本酒醸造は、酵母によるアルコール発酵（酵母のような微生物が、自己のもっている酵素の力で糖分をアルコールにする作用）によるが、主原料となる白米中のデンプンまたはタンパク質などは、酵母が利用できない高分子物質の状態にあるため、麹菌の生産する酵素をもって、酵母が利用できるブドウ糖またはアミノ酸段階までの形に変えることが麹の最も大きな役割である。
【００７６】
６）酒母（モト）および酵母
次に、酵母（サッカロミセス・セレビシェ）を発酵させて酒母（モト）を作る。ついで、日本酒醪を解放状態で発酵を行う。
【００７７】
この後、初添え（添え仕込み）、踊り、仲添え（仲仕込み）、留添え（留仕込み）などを行う。通常醪は４日間にわたり、３段階の仕込みをする（段掛法または段仕込み）。
【００７８】
その後、上槽、滓引き、濾過を行う。このように生産した日本酒は、調合、火入れなどを行い、出荷するまで貯蔵する。
【００７９】
（ビール・発泡酒の製造）
ビール・発泡酒は、原料（大麦麦芽、米、トウモロコシ、でんぷんなど）から糖化・調製した麦汁にホップを加え、酵母で発酵・熟成させて製造する。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、国税庁のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｔａ．ｇｏ．ｊｐ、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐなどを参照のこと。
【００８０】
（ワインの製造）
ワインは、果実全般（特に、ブドウ）を原料として、果実中に含まれる糖類を酵母により直接発酵させること（単式発酵方式）により製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐを参照のこと。
【００８１】
（焼酎・泡盛の製造）
焼酎・泡盛は、でんぷん原料を麹菌のアミラーゼで糖化しながら酵母でアルコール発酵する平行複発酵方式させて得られるもろみを蒸留することによって製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐを参照のこと。
【００８２】
（醤油の製造）
醤油は、本醸造方式、新醸造（化学）方式、およびアミノ酸液混合（半化学）方式などの方法によって製造される。大豆および小麦に種麹を加えた麹からもろみを製造し、麹菌・酵母・乳酸菌などによって醤油が得られる。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、しょうゆ情報センターのホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｙｓａｕｃｅ．ｏｒ．ｊｐなどを参照のこと。
【００８３】
（みその製造）
発酵型みそは、米、麦などの原料から製麹し、純粋培養した酵母を加えて発酵させることによって製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、全国味噌工業協同組合連合会のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｚｅｎｍｉ．ｊｐを参照のこと。
【００８４】
（酢の製造）
果実酢は、果実を原料として、酵母によりアルコール発酵させ、その後酢酸発酵させることにより製造される。穀類酢は、穀類のデンプンを糖化した後、酵母によりアルコール発酵させ、その後酢酸発酵させることにより製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、全国食酢協会中央会のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｏｋｕｓｕ．ｏｒｇ／を参照のこと。
【００８５】
（発酵乳の製造）
発酵乳の一種である乳種類（ケフィア、クミスなど）は、原料乳を乳酸菌と酵母とで複合発酵することにより製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、特開２００６−３４２６７、特開平１０−５６９６１を参照のこと。
【００８６】
（漬物の製造）
漬物は、例えば、培養した酵母菌体をスターターとして漬物あるいは糠床等に加える方法などの周知の方法によって製造される。特開２００５−７３５３２などを参照のこと。
【００８７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例において、特に記載がない限り、すべてのＰＣＲ反応において、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＴａｑポリメラーゼおよびサーマルサイクラーＡＢＩ ９６００を使用した。
【００９０】
（実施例１．ＵＲＡ３遺伝子のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）を用いてＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
１μｌ １０μＭ ５’プライマーＡ（配列番号５）
１μｌ １０μＭ ５’プライマーＢ（配列番号６）
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 鋳型サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８ＣゲノムＤＮＡ
以上に滅菌水を加えて、合計２５μｌにした（反応液組成１）。
【００９１】
反応温度サイクルは、
９４℃：５分
（９４℃：３０秒→４６℃：３０秒→７２℃：１分）×３５回
７２℃：２分
であった（反応温度サイクル１）。
【００９２】
（実施例２．５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーターのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の５’末端に酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の３’末端領域ＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡ（配列番号３２）と同じ配列の５’タグが付加した断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりに５’プライマーＣ（配列番号７）および３’プライマーＤ（配列番号８）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、
９４℃：５分
（９４℃：３０秒→４８℃：３０秒→７２℃：１分）×３５回
７２℃：２分
であった（反応温度サイクル２）。
【００９３】
（実施例３．ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの融合ＰＣＲ増幅）
得られたＵＲＡ３遺伝子断片と５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーター断片とを鋳型として、５’プライマーＡおよび３’プライマーＤを用いて、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーター融合断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例１で得られたＵＲＡ３ ＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例２で得られた５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーターＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした（反応液組成２）。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：２分）×１０回
ここで、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＤ（配列番号８）各１０μＭを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：２分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％）
であった（反応温度サイクル３）。
【００９４】
得られた融合断片を、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと呼び、以後の実験に使用した。
【００９５】
（実施例４．ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＲＯ１遺伝子の上流域（ＡＲＯ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−６９０〜−１領域）（配列番号２７）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【００９６】
（実施例５．５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＲＯ１遺伝子（配列番号１）の５’末端領域（ＡＲＯ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６０９領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）を用いた以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【００９７】
（実施例６．ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の融合ＰＣＲ増幅）
実施例３において得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと、実施例４および５において得られたＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片を鋳型として、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨとを用いて、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例３で得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例４で得られたＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例５で得られた５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域ＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×１０回
ここで、１０μＭ ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよび１０μＭ ＡＲＯ１用５’プライマーＨを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％（約０．１℃／秒））
であった。得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＡＲＯ１遺伝子の上流域（配列番号２７）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＡＲＯ１遺伝子５’末端領域（配列番号１の１〜６０９領域）を含んだ。
【００９８】
（実施例７．酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例６において得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）のウラシル要求性突然変異株Ｙ２４５（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）を形質転換した。この形質転換は、以下の手順にて行った：
１． Ｙ２４５株を含むＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）１ｍｌを一晩（Ｏ／Ｎ） 前培養した
２． １．の前培養したＹ２４５株を、５ｍｌのＹＰＤ培地に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ＯＤ６００＝０．２くらい）になるように接種した
３． ２．の培地を３〜５ｈ培養した（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ：ＯＤ６００＝０．７〜１になるまで）
４． ３．の培養物を２，５００ｒｐｍ（３，０００ｘｇ）にて５分間，室温で遠心分離した後，上清を捨てた
５． ４．で得られた菌体を約１ｍｌ滅菌水に懸濁し，エッペンドルフチューブに移した
６． ５．の懸濁物を１５，０００ｒｐｍにて５秒間遠心分離し，上清を捨てた
７． ６．で得られた菌体を約５００μｌの１００ｍＭ ＬｉＡｃに懸濁し，１５，０００ｒｐｍにて，５秒間遠心分離した
８． ７．で生じた上清を捨てて以下の順に溶液を加えた：
２４０μｌ ＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ，ＭＷ ３３５０）
３６μｌ １Ｍ ＬｉＡｃ
１０μｌ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）
１０μｌ 実施例６で得られた融合ＰＣＲ増幅液
５５μｌ 滅菌水
９． ８．の溶液を１分間ｖｏｒｔｅｘし，３０℃にて３０分間保温した
１０． ９．の溶液を４２℃にて２５分間保温した
１１． １０．の溶液を７，０００ｒｐｍ，１５秒間，室温で遠心分離し，上清を捨てた
１２． １１．の菌体を滅菌水に懸濁し，ウラシルを含まない寒天培地に播いた。
形質転換体のうちから、ウラシル非要求性株を取得した。このウラシル非要求性株をＡＹ１２８株と名付けた。このＡＹ１２８株は、そのゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入されていた。実施例１〜７に示した酵母ゲノム上の標的遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入についての模式図を、図１に示す。この酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１２８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）を付与された。
【００９９】
（実施例８．酵母ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＥ（配列番号１３）およびＢＵＤ２３用３’プライマーＦ（配列番号１４）を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子の上流域（ＢＵＤ２３遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−６７５〜−１領域）（配列番号２８）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＧ（配列番号１５）およびＢＵＤ２３用３’プライマーＨ（配列番号１６）を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子（配列番号２）の５’末端領域（ＢＵＤ２３遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６７４領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＥおよびＢＵＤ２３用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＢＵＤ２３遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＢＵＤ２３遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＢＵＤ２３遺伝子の上流域（配列番号２８）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＢＵＤ２３遺伝子５’末端領域（配列番号２の１〜６７４領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１３７株を得た。このＡＹ１３７株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１３７株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）を付与された。
【０１００】
（実施例９．酵母ゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＥ（配列番号１７）およびＰＭＲ１用３’プライマーＦ（配列番号１８）を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子の上流域（ＰＭＲ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７０５〜−１領域）（配列番号２９）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＧ（配列番号１９）およびＰＭＲ１用３’プライマーＨ（配列番号２０）を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子（配列番号３）の５’末端領域（ＰＭＲ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７４６領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＥおよびＰＭＲ１用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＰＭＲ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＰＭＲ１遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＰＭＲ１遺伝子の上流域（配列番号２９）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＰＭＲ１遺伝子５’末端領域（配列番号３の１〜７４６領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株を得た。このＡＹ１１２株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１１２株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）を付与された。
【０１０１】
（実施例１０．酵母ゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＥ（配列番号２１）およびＳＮＦ５用３’プライマーＦ（配列番号２２）を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子の上流域（ＳＮＦ５遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７３０〜−１領域）（配列番号３０）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＧ（配列番号２３）およびＳＮＦ５用３’プライマーＨ（配列番号２４）を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子（配列番号４）の５’末端領域（ＳＮＦ５遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６３１領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＥおよびＳＮＦ５用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＳＮＦ５遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＳＮＦ５遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＳＮＦ５遺伝子の上流域（配列番号３０）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＳＮＦ５遺伝子５’末端領域（配列番号４の１〜６３１領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１０８株を得た。このＡＹ１０８株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１０８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）を付与された。
【０１０２】
（実施例１１．ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＯＮ７遺伝子の上流域（ＧＯＮ７遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７１９〜−１領域）（配列番号５４）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【０１０３】
（実施例１２．５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＯＮ７遺伝子（配列番号３４）およびその下流域（ＧＯＮ７遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６７０領域）（以後、本明細書において「ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域」と呼ぶ）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）を用いた以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【０１０４】
（実施例１３．ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の融合ＰＣＲ増幅）
実施例３において得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと、実施例１１および１２において得られたＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片を鋳型として、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨとを用いて、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例３で得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例１１で得られたＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例１２で得られたＧＯＮ７遺伝子の５’タグ＋５’末端領域ＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×１０回
ここで、１０μＭ ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよび１０μＭ ＧＯＮ７用５’プライマーＨを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％（約０．１℃／秒））
であった。得られたＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＧＯＮ７遺伝子の上流域（配列番号５４）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＧＯＮ７遺伝子５’末端含有領域（配列番号３４の１〜６７０領域）を含んだ。
【０１０５】
（実施例１４．酵母ゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１３において得られたＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）のウラシル要求性突然変異株Ｙ２５１（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）を形質転換した。この形質転換は、以下の手順にて行った：
１． Ｙ２５１株を含むＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）１ｍｌを一晩（Ｏ／Ｎ） 前培養した
２． １．の前培養したＹ２５１株を、５ｍｌのＹＰＤ培地に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ＯＤ６００＝０．２くらい）になるように接種した
３． ２．の培地を３〜５ｈ培養した（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ：ＯＤ６００＝０．７〜１になるまで）
４． ３．の培養物を２，５００ｒｐｍ（３，０００ｘｇ）にて５分間，室温で遠心分離した後，上清を捨てた
５． ４．で得られた菌体を約１ｍｌ滅菌水に懸濁し，エッペンドルフチューブに移した
６． ５．の懸濁物を１５，０００ｒｐｍにて５秒間遠心分離し，上清を捨てた
７． ６．で得られた菌体を約５００μｌの１００ｍＭ ＬｉＡｃに懸濁し，１５，０００ｒｐｍにて，５秒間遠心分離した
８． ７．で生じた上清を捨てて以下の順に溶液を加えた：
２４０μｌ ＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ，ＭＷ ３３５０）
３６μｌ １Ｍ ＬｉＡｃ
１０μｌ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）
１０μｌ 実施例１３で得られた融合ＰＣＲ増幅液
５５μｌ 滅菌水
９． ８．の溶液を１分間ｖｏｒｔｅｘし，３０℃にて３０分間保温した
１０． ９．の溶液を４２℃にて２５分間保温した
１１． １０．の溶液を７，０００ｒｐｍ，１５秒間，室温で遠心分離し，上清を捨てた
１２． １１．の菌体を滅菌水に懸濁し，ウラシルを含まない寒天培地に播いた。
形質転換体のうちから、ウラシル非要求性株を取得した。このウラシル非要求性株をＡＹ１７４株と名付けた。このＡＹ１７４株は、そのゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入されていた。この酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１７４株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３を付与された。
【０１０６】
（実施例１５．酵母ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＥ（配列番号４２）およびＳＰＴ２０用３’プライマーＦ（配列番号４３）を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子の上流域（ＳＰＴ２０遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７２４〜−１領域）（配列番号５５）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＧ（配列番号４４）およびＳＰＴ２０用３’プライマーＨ（配列番号４５）を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子（配列番号３５）の５’末端領域（ＳＰＴ２０遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７４８領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＥおよびＳＰＴ２０用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片の代わりにＳＰＴ２０遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＳＰＴ２０遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＳＰＴ２０遺伝子の上流域（配列番号５５）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＳＰＴ２０遺伝子５’末端領域（配列番号３５の１〜７４８領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２４９株を得た。このＡＹ２４９株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ２４９株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４を付与された。
【０１０７】
（実施例１６．酵母ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＥ（配列番号４６）およびＣＢＳ２用３’プライマーＦ（配列番号４７）を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子の上流域（ＣＢＳ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７３９〜−１領域）（配列番号５６）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＧ（配列番号４８）およびＣＢＳ２用３’プライマーＨ（配列番号４９）を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子（配列番号３６）の５’末端領域（ＣＢＳ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７１７領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＥおよびＣＢＳ２用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片の代わりにＣＢＳ２遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＣＢＳ２遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＣＢＳ２遺伝子の上流域（配列番号５６）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＣＢＳ２遺伝子５’末端領域（配列番号３６の１〜７１７領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２５３株を得た。このＡＹ２５３株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ２５３株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５を付与された。
【０１０８】
（実施例１７．酵母ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＥ（配列番号５０）およびＤＢＦ２用３’プライマーＦ（配列番号５１）を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子の上流域（ＤＢＦ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７２５〜−１領域）（配列番号５７）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＧ（配列番号５２）およびＤＢＦ２用３’プライマーＨ（配列番号５３）を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子（配列番号３７）の５’末端領域（ＤＢＦ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７１４領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＥおよびＤＢＦ２用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端領域含有断片の代わりにＤＢＦ２遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＤＢＦ２遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＤＢＦ２遺伝子の上流域（配列番号５７）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＤＢＦ２遺伝子５’末端領域（配列番号３７の１〜７１４領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ３６８株を得た。このＡＹ３６８株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ３６８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６を付与された。
【０１０９】
（実施例１８．Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流またはＨＭＯ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨと同様の様式で種々の標的遺伝子の上流域および５’末端領域を増幅するために、ＡＲＯ１を標的とするプライマーＥ〜Ｈに対応するプライマーＥ〜Ｈを設計した。ＭＳＫ１遺伝子を標的として、実施例４〜７において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＭＳＫ１用５’プライマーＥ、ＭＳＫ１用３’プライマーＦ、ＭＳＫ１用５’プライマーＧおよびＭＳＫ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＭＳＫ１を得た。同様に、ＨＭＯ１遺伝子を標的として、実施例４〜７において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＨＭＯ１用５’プライマーＥ、ＨＭＯ１用３’プライマーＦ、ＨＭＯ１用５’プライマーＧおよびＨＭＯ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＨＭＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＨＭＯ１を得た。
【０１１０】
（実施例１９．Ｙ２５１株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
ＧＯＮ７用５’プライマーＥ、ＧＯＮ７用３’プライマーＦ、ＧＯＮ７用５’プライマーＧおよびＧＯＮ７用３’プライマーＨと同様の様式で種々の標的遺伝子の上流域および５’末端領域を増幅するために、ＧＯＮ７を標的とするプライマーＥ〜Ｈに対応するプライマーＥ〜Ｈを設計した。ＭＳＫ１遺伝子を標的として、実施例１１〜１４において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ、ＧＯＮ７用３’プライマーＦ、ＧＯＮ７用５’プライマーＧおよびＧＯＮ７用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＭＳＫ１用５’プライマーＥ、ＭＳＫ１用３’プライマーＦ、ＭＳＫ１用５’プライマーＧおよびＭＳＫ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２５１株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）を得た。
【０１１１】
（実施例２０．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高ショ糖ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４４株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２４５のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１２８株、ＡＹ１３７株、およびＨＳＰ−ＭＳＫ１株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）または５０％ショ糖を含む培地（５０％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４を１とする炭酸ガス発生量比として表１および図２Ａに表す。
【０１１２】
【表１】
表１および図２Ａから明らかであるように、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株は、コントロールであるＹ２４４株と比較して、５０％ショ糖を含む高ショ糖ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性であった。一方、表１から明らかであるように、ＨＳＰ−ＭＳＫ１株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高い高ショ糖ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、高ショ糖ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＡＲＯ１遺伝子およびＢＵＤ２３遺伝子の効果であることを示した。
【０１１３】
（実施例２１．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の冷凍ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４４株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２４５のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１１２株、ＡＹ１０８株、およびＨＳＰ−ＨＭＯ１株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において３０℃で１２０分間培養した後、培養液を−２５℃で３日間冷凍した。これを解凍した後、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４を１とする炭酸ガス発生量比として表２および図２Ｂに表す。
【０１１４】
【表２】
表２および図２Ｂから明らかであるように、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株は、コントロールであるＹ２４４株と比較して、冷凍ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株は、Ｙ２４４株と比較して冷凍ストレスに対して耐性であった。一方、表２から明らかであるように、ＨＳＰ−ＨＭＯ１株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の高い冷凍ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、冷凍ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子の効果であることを示した。
【０１１５】
（実施例２２．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株の高ショ糖ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４９株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２５１のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株、およびＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）または５０％ショ糖を含む培地（５０％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株を１とする炭酸ガス発生量比として表３、図３Ａおよび図３Ｂに表す。
【０１１６】
【表３】
表３、図３Ａおよび図３Ｂから明らかであるように、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株は、コントロールであるＹ２４９株と比較して、５０％ショ糖を含む高ショ糖ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株は、Ｙ２４９株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性であった。一方、表３から明らかであるように、ＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）は、Ｙ２４９株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株の高い高ショ糖ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、高ショ糖ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、およびＣＢＳ２遺伝子の効果であることを示した。
【０１１７】
（実施例２３．酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流、ＢＵＤ２３遺伝子上流、ＰＭＲ１遺伝子上流、ＳＮＦ５遺伝子上流、ＧＯＮ７遺伝子上流、ＳＰＴ２０遺伝子上流、ＣＢＳ２遺伝子上流、およびＤＢＦ２遺伝子上流のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例６、８、９、１０、１３、１５、１６、１７において得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、またはＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個を用いて、実施例７または１４の形質転換手順に従って酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４５株またはＹ２５１株を形質転換する。形質転換体のうちから、酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流、ＢＵＤ２３遺伝子上流、ＰＭＲ１遺伝子上流、ＳＮＦ５遺伝子上流、ＧＯＮ７遺伝子上流、ＳＰＴ２０遺伝子上流、ＣＢＳ２遺伝子上流、およびＤＢＦ２遺伝子上流のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株を取得する。そのような株は、形質転換体の染色体ＤＮＡを鋳型として、各遺伝子用の５’プライマーＥおよび３’プライマーＨを用いてＰＣＲ増幅を行うことによって確認される。得られた目的とする形質転換体を、高ショ糖ストレス耐性および冷凍ストレス耐性について、実施例２０〜２２に記載される方法に従って測定する。
【０１１８】
（実施例２４．自律複製可能なベクターに連結された酵母遺伝子ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、および／またはＣＢＳ２の酵母染色体外への導入）
標的遺伝子ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、および／またはＣＢＳ２の開始コドンから当該遺伝子のターミネーターを含む領域をＰＣＲ増幅し、酵母自律複製型の酵母・大腸菌シャトルベクター（ＹＥｐ）にクローン化する。クローン化した遺伝子の上流にＨＳＰ１０４プロモーターを作動可能に挿入・連結し、実施例７または１４に記載の形質転換手順により酵母サッカロマイセス・セレビシエ細胞を形質転換する。この場合、形質転換体のほぼ全てが目的ベクターを持つと考えて良い。形質転換体から抽出したＤＮＡを用いて大腸菌の形質転換を行うことにより、目的ベクターを持つ株を検出する。得られた目的とする形質転換株を、高ショ糖ストレス耐性および冷凍ストレス耐性について、実施例２０〜２２に記載される方法に従って測定する。
【０１１９】
（実施例２５．本発明の酵母を使用するパンの製造）
実施例７〜１０、１４〜１７、または２３〜２４に従って得られた改変酵母を使用してパンを製造する。まず、以下の組成の高糖生地を製造する：
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ３０重量部
食塩 ０．５重量部
酵母 ４重量部
ショートニング ６重量部
脱脂粉乳 ２重量部
水 ５２重量部。この高糖生地を、以下のような製パン条件：
ミキシング Ｌ３，Ｍ２，↓
Ｌ２，Ｍ２，Ｈ１〜
捏ね上げ温度 ２８℃
第一発酵 ３０℃、７０分
第二発酵 ３０℃、３０分
分割・丸め ４５０ｇ
ベンチ ３０℃、２０分
成形 ワンローフ
ホイロ発酵 ３８℃、ＲＨ８５％
型上１．５ｃｍ
焼成 ２００℃、２５分
に従って製パンする。得られたパンについて、その外観、内相、および／または比容積を指標とすることにより、使用した酵母の高ショ糖ストレス耐性効果を確認する。
【０１２０】
または、以下の組成の冷凍製パン用生地を製造する：
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ５重量部
食塩 ２重量部
酵母 ２重量部
ショートニング ５重量部。この生地を、以下のような製パン条件：
凍結前発酵 ６０分
冷凍期間 １〜２週間（−２０℃）
解凍 ９０分（３０℃）
丸め、ベンチ ３０分
成形
ホイロ ５５分
焼成 ２５分
に従って製パンする。得られたパンについて、その外観、内相、および／または比容積を指標とすることにより、使用した酵母の冷凍ストレス耐性効果を確認する。
【０１２１】
本明細書は、特定の実施例に関して詳細に記載されているが、これらの実施例は、単に本発明を例示するために提供されているものに過ぎず、これらの実施例は、本発明を限定することは決して意図しない。当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、上記実施例に対する変更・改変を施し得ることが、明らかである。本発明の範囲は、添付されている特許請求の範囲およびその均等物によってのみ規定される。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を使用し得るあらゆる酵母利用産業（例えば、エタノール製造や製パン産業）において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、酵母ゲノム中へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入の模式図である。
【図２】図２Ａは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＡＲＯ１遺伝子発現増強株およびＢＵＤ２３遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株）と比較したグラフである。図２Ｂは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＰＭＲ１遺伝子発現増強株およびＳＮＦ５遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の冷凍ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株）と比較したグラフである。
【図３】図３Ａは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＧＯＮ７遺伝子発現増強株およびＤＢＦ２遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株およびＡＹ３６８株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株）と比較したグラフである。図３Ｂは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＳＰＴ２０遺伝子発現増強株およびＣＢＳ２遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２４９株およびＡＹ２５３株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株）と比較したグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号２：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号５：５’プライマーＡのヌクレオチド配列
配列番号６：３’プライマーＢのヌクレオチド配列
配列番号７：５’プライマーＣのヌクレオチド配列
配列番号８：３’プライマーＤのヌクレオチド配列
配列番号９：ＡＲＯ１用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１０：ＡＲＯ１用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１１：ＡＲＯ１用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号１２：ＡＲＯ１用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号１３：ＢＵＤ２３用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１４：ＢＵＤ２３用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１５：ＢＵＤ２３用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号１６：ＢＵＤ２３用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号１７：ＰＭＲ１用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１８：ＰＭＲ１用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１９：ＰＭＲ１用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号２０：ＰＭＲ１用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号２１：ＳＮＦ５用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号２２：ＳＮＦ５用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号２３：ＳＮＦ５用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号２４：ＳＮＦ５用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号２５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号２６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＵＲＡ３遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子の上流域（−６９０〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号２８：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子の上流域（−６７５〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号２９：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子の上流域（−７０５〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号３０：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子の上流域（−７３０〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号３１：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子の５’末端領域（配列番号２６の１〜３０位）のヌクレオチド配列
配列番号３２：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子の３’末端領域（配列番号２６の１，１６５〜１，１９４位）のヌクレオチド配列
配列番号３３：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子プロモーターの３’末端領域(配列番号２５の４１１〜４４０位）のヌクレオチド配列
配列番号３４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３８：ＧＯＮ７用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号３９：ＧＯＮ７用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４０：ＧＯＮ７用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４１：ＧＯＮ７用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号４２：ＳＰＴ２０用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号４３：ＳＰＴ２０用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４４：ＳＰＴ２０用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４５：ＳＰＴ２０用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号４６：ＣＢＳ２用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号４７：ＣＢＳ２用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４８：ＣＢＳ２用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４９：ＣＢＳ２用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号５０：ＤＢＦ２用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号５１：ＤＢＦ２用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号５２：ＤＢＦ２用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号５３：ＤＢＦ２用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号５４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子の上流域（−７１９〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子の上流域（−７２４〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子の上流域（−７３９〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子の上流域（−７２５〜−１領域）のヌクレオチド配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、その方法、およびその核酸カセットを使用して得られる遺伝子改変酵母に関する。より具体的には、本発明は、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセット、その方法、および得られる酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母の発酵産業への利用において、酵母の発酵および生育阻害要因となるストレスの存在が問題となっている。例えば、パンの製造においては、我が国において需要の多い菓子パン等に用いられる高糖生地では、約３０％（対小麦粉比）にも及ぶショ糖が添加されることから、極めて高い浸透圧ストレス（高ショ糖ストレス）が負荷される。また、近年、急速に普及した冷凍生地製パン法においては冷凍ストレスが負荷される。以上のことから、酵母の産業利用においては様々なストレス（例えば、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレス）に対する耐性の向上が求められている。従来より、ストレス耐性の向上を目的とした交配や突然変異導入等による育種が行われてきたが、得られた耐性は十分とは言い難い。近年のバイオマスエタノールへの注目を受け、より優れたストレス耐性を持つ酵母の開発が急務となっている。
【０００３】
１９９０年代以降、ストレス耐性機構に関する知見の蓄積に伴い、耐性関連遺伝子を改変することによって耐性を増強しようという試みがなされている。特許文献１は、ストレスに起因する細胞の障害を緩和する役割を担うことが知られている、いわゆる適合溶質の代謝を操作することによる冷凍耐性酵母の作出を開示する。具体的には、特許文献１は、ＮＴＨ１遺伝子（中性トレハラーゼ遺伝子）を遺伝子破壊した１倍体酵母または２倍体以上の倍数体酵母を開示する。非特許文献１は、芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子（ＡＲＯ１など）を破壊することによって高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれることを開示する。非特許文献１はまた、ＢＵＤ２３、ＧＯＮ７、ＳＰＴ２０の遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すことを開示する。非特許文献２は、ＰＭＲ１遺伝子またはＳＮＦ５遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれることを開示する。非特許文献３は、ＣＢＳ２欠損により、乾燥ストレス感受性になることを開示する。非特許文献４は、ＤＢＦ２の破壊により、ソルビン酸ストレスに対して高感受性になることを開示する。
【特許文献１】特開平１０−１１７７７１号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｏら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．」，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ（２００６）６：２４９−２６７
【非特許文献２】Ａｎｄｏら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ．」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．（２００７）７：２４４−２５３
【非特許文献３】Ｓｈｉｍａら「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｉｒ−ｄｒｙｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ」Ｙｅａｓｔ（２００８）２５：１７９−１９０
【非特許文献４】Ｍａｋｒａｎｔｏｎｉら「Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄｂｆ２ｐ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）１５３：４０１６−４０２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
・（項目１）
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および
当該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；
を含む、核酸カセット。
・（項目２）
上記プロモーターが、ＨＳＰ１０４プロモーターである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目３）
上記ＡＲＯ１遺伝子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＢＵＤ２３遺伝子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＰＭＲ１遺伝子が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＳＮＦ５遺伝子が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＧＯＮ７遺伝子が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＳＰＴ２０遺伝子が、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＣＢＳ２遺伝子が、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなり、
上記ＤＢＦ２遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる、
項目１に記載の核酸カセット。
・（項目４）
上記プロモーターの上流に、上記ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子の上流領域のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目５）
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目６）
上記選択マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、および薬剤耐性マーカーからなる群より選択される、項目５に記載の核酸カセット。
・（項目７）
上記栄養要求性マーカーが、ＵＲＡ３マーカーである、項目６に記載の核酸カセット。
・（項目８）
上記５’末端フラグメントが、導入された酵母中のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子と相同組換えを生じるために十分な長さである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目９）
上記長さが、少なくとも４０ヌクレオチドである、項目８に記載の核酸カセット。
・（項目１０）
上記長さが、少なくとも６００ヌクレオチドである、項目９に記載の核酸カセット。
・（項目１１）
上記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、項目１に記載の核酸カセット。
・（項目１２）
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造する方法であって、
酵母中に項目１に記載の核酸カセットを導入する工程；
を包含する、方法。
・（項目１３）
上記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、項目１２に記載の方法。
・（項目１４）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）である、項目１３に記載の方法。
・（項目１５）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４５株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）である、項目１３に記載の方法。
・（項目１６）
項目１に記載の核酸カセットを含む、酵母。
・（項目１７）
サッカロミセス・セレビシェである、項目１６に記載の酵母。
・（項目１８）
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６からなる群より選択される株である、項目１７に記載の酵母。
・（項目１９）
項目１６に記載の酵母を含む、食品またはその材料。
・（項目２０）
パン、パン生地、アルコール、菓子類、漬物、および発酵調味料からなる群より選択される、項目１９に記載の食品またはその材料。
・（項目２１）
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造するための、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの組合せの使用。
・（項目２２）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）である、項目１３に記載の方法。
・（項目２３）
上記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２５１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）である、項目１３に記載の方法。
【０００６】
本発明は、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性を増強することに関する。酵母ＡＲＯ１遺伝子は、芳香族アミノ酸合成の一部を触媒する酵素をコードしている。酵母のＡＲＯ１遺伝子を含む芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子を破壊することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれることは、以前に公知であった（Ａｎｄｏら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．」，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ（２００６）６：２４９−２６７）。酵母ＢＵＤ２３遺伝子は、娘細胞の出芽部位の決定に関与しているが、その分子機構は不明である。酵母ＢＵＤ２３遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＧＯＮ７遺伝子は、Ｎ結合型オリゴ糖へのマンノシルリン酸基の転移に関与すると提唱されているタンパク質をコードしており、酵母ＧＯＮ７遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＳＰＴ２０遺伝子は、転写部位選択を変化させるＴＢＰクラスのＳＰＴタンパク質のメンバーをコードしており、酵母ＳＰＴ２０遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこともまた以前に公知であった（Ａｎｄｏら、上記文献）。酵母ＣＢＳ２遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳の活性化に関与しており（Ｋｒａｕｓｅ−Ｂｕｃｈｈｏｌｚら「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｃｂｓ２ｐ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）４６：２０−２８）、その遺伝子欠損により、乾燥ストレス感受性になることが、以前に公知であった（Ｓｈｉｍａら「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｉｒ−ｄｒｙｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ」Ｙｅａｓｔ（２００８）２５：１７９−１９０）。酵母ＤＢＦ２遺伝子は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼをコードしている。ＤＢＦ２の破壊により、ソルビン酸ストレスに対して高感受性になることが、以前に公知であった（Ｍａｋｒａｎｔｏｎｉら「Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄｂｆ２ｐ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）１５３：４０１６−４０２６）。しかし、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性を実際に増強し得たという本発明の効果は、このような本願出願時の文献および技術常識から全く予想外であった。なぜなら、遺伝子破壊による表現型と、当該遺伝子の過剰発現による表現型の変化については、一般化できるような法則性はないからである。また、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子の遺伝子発現と高ショ糖ストレス耐性との関連に言及した報告は現在までにない。従って、これら遺伝子の発現増強によって高ショ糖ストレス耐性の向上が得られたことは予想外であった。
【０００７】
本発明はまた、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性を増強することに関する。酵母ＰＭＲ１遺伝子は、ゴルジ体膜上に局在するイオンポンプをコードしており、ゴルジ体のみならず細胞内のイオン恒常性維持に関与している。ＰＭＲ１遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれる（Ａｎｄｏら「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ．」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ． ２００７ ７：２４４−２５３）。酵母ＳＮＦ５遺伝子は、ＤＮＡ複製および転写に関与するＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成タンパク質の一つをコードしている。ＳＮＦ５遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれる（Ａｎｄｏら，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ７，２４４−２５３）。しかし、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性を増強し得たという本発明の効果は、このような本願出願時の文献および技術常識から全く予想外であった。なぜなら、遺伝子破壊による表現型と、当該遺伝子の過剰発現による表現型の変化については、一般化できるような法則性はないからである。また、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子の遺伝子発現と冷凍ストレス耐性との関連に言及した報告は現在までにない。従って、これら遺伝子の発現増強によって冷凍ストレス耐性の向上が得られたことは予想外であった。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１０】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１１】
用語「ストレスに対して耐性」とは、酵母に関して使用される場合、種々のストレス（例えば、高ショ糖ストレス、冷凍ストレスなど）を負荷された条件下で生育し、かつその条件下でコントロール酵母株と比較して発酵力が強いことを意味する。そのような「発酵力」は、一定の酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）における発酵時のガス発生量により表わされる。
【００１２】
用語「高ショ糖ストレス」とは、本明細書において使用される場合、ショ糖濃度が３０重量％の酵母発酵条件を意味し、極めて高い浸透圧が酵母に対して負荷される。従って、本発明における高ショ糖ストレスに対して耐性である酵母は、同等の浸透圧を負荷する他の溶液中でも耐性であり得る。
【００１３】
用語「冷凍ストレス」とは、本明細書において使用される場合、０℃以下にて酵母を冷凍することを意味する。酵母が冷凍される限り、０℃以下の任意の温度が使用され得る。
【００１４】
用語「核酸カセット」とは、核酸またはそのアナログを含む構築物を意味する。この文脈において、核酸とは、一般的な意味において、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、このヌクレオチドとは、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはこれらのアナログを含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。核酸のアナログとはまた、改変した骨格を含むもの（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または改変した塩基を含有するものなどの、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを包含する。
【００１５】
用語「ＡＲＯ１遺伝子」とは、酵母ＡＲＯ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＡＲＯ１タンパク質は、芳香族アミノ酸合成に関与する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子のコード領域は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１６】
用語「ＢＵＤ２３遺伝子」とは、酵母ＢＵＤ２３タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＢＵＤ２３タンパク質は、出芽部位の決定に関与する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子のコード領域は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１７】
用語「ＰＭＲ１遺伝子」とは、酵母ＰＭＲ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＰＭＲ１タンパク質は、ゴルジ体のイオンポンプを構成する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子のコード領域は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１８】
用語「ＳＮＦ５遺伝子」とは、酵母ＳＮＦ５タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＳＮＦ５タンパク質は、転写複合体の一部を構成する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子のコード領域は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００１９】
用語「ＧＯＮ７遺伝子」とは、酵母ＧＯＮ７タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＧＯＮ７タンパク質は、Ｎ結合型オリゴ糖へのマンノシルリン酸基の転移に関与すると提唱されている。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子のコード領域は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２０】
用語「ＳＰＴ２０７遺伝子」とは、酵母ＳＰＴ２０タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＳＰＴ２０タンパク質は、転写部位選択を変化させるＴＢＰクラスのＳＰＴタンパク質のメンバーである。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子のコード領域は、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２１】
用語「ＣＢＳ２遺伝子」とは、酵母ＣＢＳ２タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＣＢＳ２タンパク質は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳の活性化に関与している。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子のコード領域は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
用語「ＤＢＦ２遺伝子」とは、酵母ＤＢＦ２タンパク質をコードする遺伝子を意味する。酵母ＤＢＦ２タンパク質は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を有する。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子のコード領域は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２３】
本発明の高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットは、当該核酸カセットに含まれる酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメントと、相同組換えを生じ得るＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子を有する任意の株を形質転換するために使用し得ることが、当業者には容易に理解され得る。
【００２４】
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株と、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株とは、極めて近縁な株であり、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ののＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子とほぼ同一または全く同一のヌクレオチド配列を有していると推定される。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株、Ｙ２４５株、Ｙ２４９株、およびＹ２５１株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子と、少なくとも相同組換えを生じる程度の配列相同性を有することが、本出願において確認された。
【００２５】
当業者は、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株以外、Ｙ２４５株以外、およびＹ２４９株以外、Ｙ２５１株以外の酵母の株についても、相同組換えを生じる程度の配列相同性を有する限り任意の酵母サッカロミセス・セレビシェ株（例えば、Ｓ２８８Ｃ株であるが、これに限定はされない）のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子に対応するその株の各遺伝子を用いて同様の遺伝子操作をすることができることを理解する。
【００２６】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる株における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものであってもよい。従って、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株以外の酵母の株において、対応するＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子を見出すことができる。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株のＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子は、それぞれ、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株以外の酵母の株において、対応するＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子、ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子）の配列をクエリ配列として用いて対象となる酵母株の配列データベースを検索することによって見出すことができる。以下に限定されることはないが、例えば、ＡＲＯ１遺伝子について言えば、対応する他の酵母株のＡＲＯ１遺伝子は、配列番号１に示す配列からなる核酸と同一であるかまたは１つ以上、または１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する（すなわち芳香族アミノ酸合成に関与する）ポリペプチドをコードするものであり得る。あるいは、そのような対応する他の酵母株のＡＲＯ１遺伝子は、配列番号１がコードするアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、かつ、生物学的活性を有する（すなわち芳香族アミノ酸合成に関与する）ポリペプチドをコードするものであり得る。ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子、ならびにＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、およびＤＢＦ２遺伝子についても、同様に対応する遺伝子を見出すことができる。
【００２７】
用語「高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター」とは、高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスのうちのいずれか一方によって誘導されるプロモーター、またはその双方により誘導されるプロモーターを意味する。このようなプロモーターとしては、ＨＳＰ１０４プロモーター、ＨＳＰ１２プロモーター、ＴＰＳ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、ならびに他の公知のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
用語「ＨＳＰ１０４プロモーター」とは、任意の酵母のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターを意味する。ＨＳＰ１０４プロモーターは、高ショ糖ストレス条件下および／または冷凍ストレス条件下で、そのプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが公知である。このようなＨＳＰ１０４プロモーターとしては、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２５）が挙げられるが、これに限定はされない。
【００２９】
用語「作動可能に連結された」とは、遺伝子に関して使用される場合、その遺伝子が機能するように適切な調節配列の制御下に連結されていることを指す。例えば、あるプロモーターが、適切な宿主細胞もしくは他の発現系における遺伝子コード配列の転写および／または翻訳の制御を補助する場合に、その遺伝子コード配列は、そのプロモーターに作動可能に連結されている。作動可能に連結されている遺伝子コード配列は、連続的であり得、かつこの遺伝子コード配列は、同じリーディングフレーム中に存在し得るが、特定の遺伝子調節配列は、発現されるべきポリペプチドをコードする遺伝子コード配列に連続的に連結されている必要はない。例えば、エンハンサーは、そのエンハンサーが転写を増強するコード配列に近接している必要はない。
【００３０】
用語「酵母」とは、実用株および実験室株を含む、任意の酵母を指す。代表的には、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシェ）（パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（ビール酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ（ワイン酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｒｏｕｘｉｉ（醤油酵母）、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属酵母、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ属酵母、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母などが挙げられるが、これらに限定はされない。実用株とは、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母等、産業上優れた形質を持つ株であり、それぞれの用途に応じて当該分野において多数の株が現在までに選別されている。実用株としては、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）およびそのウラシル要求性変異株Ｙ２４５（２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１を付与された）、ならびに酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株（２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１を付与された）およびそのウラシル要求性変異株Ｙ２５１（２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２を付与された）が挙げられる。実験室株とは、遺伝学的な解析が行いやすい形質を持つ株である。一般的に、ヘテロタリズムの形質を有し、接合子形成率または胞子形成率が高く、ＤＮＡ抽出や形質転換、相同組換え等を効率よく行うことの出来る株が実験室株として用いられている。最近では、１９９６年に全ゲノム配列が解読された酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株およびその誘導株が多く用いられている。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株は、例えば、ＡＴＣＣ ２６１０８としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国，ヴァージニア ２０１０８，マナサス，ピーオーボックス１５４９）から入手可能であり、ＮＢＲＣ １１３６として独立行政法人 製品技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）からも入手可能である。酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株の全ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅのホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／にて閲覧可能である。近年、実験室株と実用株の差異がゲノムレベルで議論されている（Ｙｅａｓｔ １９：４４１−４４８ （２００２）、Ｙｅａｓｔ １８：１１４５−１１５４ （２００１））。
【００３１】
用語「相同組換えを生じるために十分な長さ」とは、酵母において、２つの核酸の間で相同組換えが生じ得る長さを意味する。そのような２つの核酸は、例えば、酵母ゲノムと外来核酸とであり得る。実験室株については少なくとも約４０ヌクレオチドの相同配列があれば、十分な頻度で相同組換えが起こることが公知である（Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２１（１４）：３３２９−３３３０（１９９３）、Ｙｅａｓｔ １０：１７９３−１８０８（１９９４）を参照のこと）。パン酵母または清酒酵母等の実用株における相同組換えのためには、約６００ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド程度またはそれ以上の相同配列が必要であると考えられている（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６５（７）：２８４１−２８４６（１９９９）、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ９７（６）：４１２−４１８（２００４）を参照のこと）。
【００３２】
用語「フラグメント」とは、ヌクレオチドに関して使用される場合、好ましくは約４０ヌクレオチド長以上の任意のオリゴヌクレオチドフラグメントを意味する。オリゴヌクレオチドフラグメントは、例えば、約４０ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約５５ヌクレオチド長、約６０ヌクレオチド長、またはそれ以上など、酵母の実験室株において相同組換えを生じるために十分な長さであり得る。オリゴヌクレオチドフラグメントはまた、好ましくは約６００ヌクレオチド長〜数千ヌクレオチド長以上の任意のヌクレオチドフラグメントを意味する。ヌクレオチドフラグメントは、例えば、約６００ヌクレオチド長、約６５０ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約７５０ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約８５０ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約９５０ヌクレオチド長、約１，０００ヌクレオチド長、約１，１００ヌクレオチド長、約１，２００ヌクレオチド長、約１，３００ヌクレオチド長、約１，４００ヌクレオチド長、約１，５００ヌクレオチド長、約１，６００ヌクレオチド長、約１，７００ヌクレオチド長、約１，８００ヌクレオチド長、約１，９００ヌクレオチド長、約２，０００ヌクレオチド長、約２，２００ヌクレオチド長、約２，４００ヌクレオチド長、約２，６００ヌクレオチド長、約２，８００ヌクレオチド長、約３，０００ヌクレオチド長、約３，３００ヌクレオチド長、約３，６００ヌクレオチド長、約３，９００ヌクレオチド長、約４，０００ヌクレオチド長、約４，４００ヌクレオチド長、約４，８００ヌクレオチド長、約５，０００ヌクレオチド長、約５，５００ヌクレオチド長、約６，０００ヌクレオチド長、約６，６００ヌクレオチド長、約７，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上など、酵母の実用株において相同組換えを生じるために十分な長さであり得る。
【００３３】
用語「約」とは、数値に関して使用される場合、示される値±１０％を意味する。
【００３４】
用語「選択マーカー」とは、その選択マーカーを含む酵母が検出され得る特性を提供するエレメントを意味する。選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、薬剤耐性マーカーが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３５】
用語「栄養要求性マーカー」とは、酵母の栄養要求性を相補するタンパク質を意味する。栄養要求性マーカーとしては、ＵＲＡ３マーカー、ＬＥＵ１マーカー、ＬＥＵ２マーカー、ＨＩＳ３マーカー、ＵＲＡ４マーカー、ＴＲＰ１マーカー、ＨＩＳ５マーカー、ＬＹＳ２マーカー、ＭＥＴ１５マーカー、ＥＣＭ３１マーカーなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３６】
用語「抗生物質耐性マーカー」とは、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質を意味する。このような抗生物質耐性マーカーとしては、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシンに対する耐性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；Ｇ４１８耐性を付与する、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシンＢ耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；セルレニン耐性を付与する変異型脂肪酸合成酵素；シクロヘキシミド耐性を付与する変異型リボソームタンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３７】
用語「蛍光タンパク質マーカー」とは、蛍光を発するタンパク質を意味する。このような蛍光タンパク質マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３８】
用語「発光タンパク質マーカー」とは、発光するタンパク質を意味する。このような発光タンパク質マーカーとしては、エクオリン、ルシフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３９】
用語「酵素タンパク質マーカー」とは、酵素タンパク質を意味する。このような酵素タンパク質マーカーとしては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４０】
用語「薬剤耐性マーカー」とは、薬剤に対する耐性を付与するタンパク質を意味する。薬剤耐性マーカーとしては、代謝物のアナログ（例えば、チアミンアナログであるピリチアミン）への耐性を付与する変異型チアミン輸送タンパク質や、銅耐性を付与する変異型メタロチオニンなど）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４１】
標的遺伝子の「５’末端含有領域」という用語は、標的遺伝子の５’末端を含む核酸領域（すなわち、「５’末端領域」）、または標的遺伝子の５’末端とその下流の領域とを含む核酸領域を指す。この用語において、その下流の領域の範囲は、標的遺伝子内部に限定されず、標的遺伝子の３’末端まで（すなわち、「標的遺伝子全体」）に及び得、さらには標的遺伝子の下流領域（「標的遺伝子およびその下流域」）にさえ及び得る。従って、本明細書において、標的遺伝子の「５’末端含有領域」という用語は、「５’末端領域」、「標的遺伝子全体」、および「標的遺伝子およびその下流域」を包含し得る。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性が増強されることを初めて見出し、高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母サッカロミセス・セレビシェＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株ならびにＡＹ１７４株、ＡＹ２４９株、ＡＹ２５３株、およびＡＹ３６８株を得た。上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１２８株は、そのゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＡＲＯ１遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＡＲＯ１遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＡＲＯ１遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＡＲＯ１遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４３】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１３７株は、ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＢＵＤ２３遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＢＵＤ２３遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＢＵＤ２３遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＢＵＤ２３遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４４】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１７４株は、ゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＧＯＮ７遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＧＯＮ７遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＧＯＮ７遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＧＯＮ７遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４５】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ２４９株は、ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＳＰＴ２０遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＳＰＴ２０遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＳＰＴ２０遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＳＰＴ２０遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４６】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ２５３株は、ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＣＢＳ２遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＣＢＳ２遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＣＢＳ２遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＣＢＳ２遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４７】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ３６８株は、ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、高ショ糖ストレス条件下でＤＢＦ２遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、高ショ糖ストレス条件下でＤＢＦ２遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＤＢＦ２遺伝子を有するいかなる酵母においても、高ショ糖ストレス条件下におけるＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することにより、その酵母に高ショ糖ストレス耐性を付与し得る。
【００４８】
本発明者らはまた、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって酵母の冷凍ストレス耐性が増強されることを初めて見出し、冷凍ストレス耐性が増強された酵母サッカロミセス・セレビシェＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株を得た。上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１１２株は、そのゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、冷凍ストレス条件下でＰＭＲ１遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、冷凍ストレス条件下でＰＭＲ１遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＰＭＲ１遺伝子を有するいかなる酵母においても、冷凍ストレス条件下におけるＰＭＲ１遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に冷凍ストレス耐性を付与し得る。
【００４９】
上記サッカロミセス・セレビシェＡＹ１０８株は、そのゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入され、冷凍ストレス条件下でＳＮＦ５遺伝子が過剰発現された。理論に束縛されることを望まないが、この遺伝子は、特定の酵母株のみに存在する遺伝子ではなくどの酵母株にも存在すると考えられていることから、この遺伝子の働きは、酵母に普遍的であると考えられる。従って、本発明の対象となる酵母株は特定のものに限定されず、任意の株を使用することができると理解され、冷凍ストレス条件下でＳＮＦ５遺伝子が過剰発現された酵母はどの株由来のものであっても、本発明の効果を有することが理解される。従って、ＳＮＦ５遺伝子を有するいかなる酵母においても、冷凍ストレス条件下におけるＳＮＦ５遺伝子の発現を増強させることによって、その酵母に冷凍ストレス耐性を付与し得る。
【００５０】
本発明の高ショ糖耐性酵母は、ショ糖を大量に含む菓子パン生地の発酵が短時間で済む、使用酵母量を減らすことが可能になるなどの利点を提供する。さらに、本発明の高ショ糖耐性酵母は、初発糖濃度が極めて高いアルコール発酵、または漬物・醤油・味噌等の発酵調味料における極めて厳しい浸透圧条件下での発酵を効率よく行うことを可能にする。
【００５１】
本発明の冷凍耐性酵母は、冷凍生地製パン法において、冷凍期間の延長、解凍後の発酵特性の改善、発酵時間の短縮、使用酵母量の削減等、種々の利点を提供する。
【００５２】
本発明により、酵母のＡＲＯ１遺伝子および／またはＢＵＤ２３遺伝子および／またはＧＯＮ７遺伝子および／またはＳＰＴ２０遺伝子および／またはＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強することによって、酵母の高ショ糖ストレス耐性が増強されることが明らかとなった。また、本発明により、酵母のＰＭＲ１遺伝子および／またはＳＮＦ５遺伝子の発現を増強することによって、酵母の冷凍ストレス耐性が増強されることが明らかとなった。従って、酵母の高ショ糖ストレス耐性および／または冷凍ストレス耐性の増強は、これらの酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現が増強される限り、当業者にとって周知である任意の遺伝子発現増強方法によって行われ得ることを、当業者は理解する。そのような遺伝子発現増強方法としては、酵母ゲノム上にある上記酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサーなど）の挿入、自律複製可能な線状または環状のベクターに連結された上記酵母遺伝子の酵母中への導入、上記酵母遺伝子の発現を誘導する転写因子等の過剰発現、あるいはプロモーターエレメントとの親和性を増大させる変異の導入などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５３】
（酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域の挿入）
本発明の酵母遺伝子領域への遺伝子発現調節領域の挿入は、例えば、融合ＰＣＲ法と相同組換えとの組み合わせにより行われ得る。融合ＰＣＲ法は、当該分野において公知である。例えば、Ｋｕｗａｙａｍａら，「ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００２）３０（２）：Ｅ２を参照のこと。Ｋｕｗａｙａｍａらの手法は、遺伝子破壊を目的としたＤＮＡ断片を一段階の融合ＰＣＲにより増幅するものである。融合ＰＣＲにおいては、２つのプライマーを使用するＰＣＲによって、２つ以上のＤＮＡ断片が融合して１つの融合断片を生じる。このような融合断片を生じるために、融合ＰＣＲにおいて使用される連結されるべき２つＤＮＡ断片において、少なくとも一方のＤＮＡ断片は、その連結されるべき末端に、もう一方のＤＮＡ断片の連結されるべき末端の部分領域と同じ配列を有するタグを有するように設計される。
【００５４】
本発明において使用される融合ＰＣＲ法は、以下のような二段階の融合ＰＣＲによる。第一段階の融合ＰＣＲにおいて、遺伝子発現調節領域カセットが作製される。より具体的には、選択マーカー遺伝子が、５’プライマー（プライマーＡ）および３’プライマー（プライマーＢ）を用いてＰＣＲ増幅される。遺伝子発現調節領域もまた、５’プライマー（プライマーＣ）および３’プライマー（プライマーＤ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＣは、増幅される遺伝子発現調節領域の５’末端に、選択マーカーの３’末端領域と同じ配列の５’タグが付加されるように設計される。得られる二つの増幅断片が、５’プライマー（プライマーＡ）および３’プライマー（プライマーＤ）を用いる融合ＰＣＲにより連結される。得られる融合ＰＣＲ増幅断片は、遺伝子発現調節領域カセットと呼ばれる。この遺伝子発現調節領域カセットは、プロモーターを使用する場合、プロモーターカセットとも呼ばれ得る。第二段階の融合ＰＣＲにおいて、上記遺伝子発現調節領域カセットの両側に、標的酵母遺伝子と相同な（または好ましくは同一の）配列が付加される。より具体的には、標的酵母遺伝子の上流域＋３’タグ断片が、５’プライマー（プライマーＥ）および３’プライマー（プライマーＦ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＦは、増幅される標的酵母遺伝子上流域の３’末端に、上記選択マーカー遺伝子の５’末端領域と同じ配列の３’タグが付加されるように設計される。５’タグ＋標的酵母遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）断片もまた、５’プライマー（プライマーＧ）および３’プライマー（プライマーＨ）を用いてＰＣＲ増幅される。このプライマーＧは、増幅される標的酵母遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）の５’末端に、上記遺伝子発現調節領域の３’末端領域と同じ配列の５’タグが付加されるように設計される。得られる二つの断片の間に、上記遺伝子発現調節領域カセットが、５’プライマー（プライマーＥ）および３’プライマー（プライマーＨ）を用いる融合ＰＣＲによって挿入・連結される。得られた融合ＰＣＲ断片（５’側から３’側に向って、標的遺伝子の上流域、選択マーカー、遺伝子発現調節領域、標的遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）を含む）は、酵母の形質転換用ＰＣＲ断片である。この形質転換用ＰＣＲ断片は、酵母ゲノム上の標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）と、形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）との間での相同組換えにより、ダブルクロスオーバー様式で酵母ゲノム中に導入される。得られた酵母は、標的遺伝子の上流に、選択マーカーおよび遺伝子発現調節領域が挿入されている。上記選択マーカーを指標として、遺伝子発現調節領域が導入された酵母株を単離し得る。上記のような相同組換え機構の利用に鑑みれば、標的遺伝子の５’末端領域を含む断片を融合ＰＣＲにより増幅してもよいし、標的遺伝子の５’末端含有領域を含む断片を融合ＰＣＲにより増幅してもよいことが、当業者には容易に理解され得る。
【００５５】
上記の例示的融合ＰＣＲにおいては、増幅される遺伝子発現調節領域の５’末端、増幅される標的酵母遺伝子上流域の３’末端、および増幅される標的酵母遺伝子５’末端領域（または５’末端含有領域）の５’末端それぞれに、それらが連結されるべき末端の部分領域と同じ配列のタグが付加されるように設計されている。このようなタグが付加される末端およびその配列は、上記に限定されない。例えば、増幅される選択マーカーの５’末端に標的酵母遺伝子上流域の３’末端領域と同じ配列のタグを付加し得、増幅される選択マーカーの３’末端に遺伝子発現調節領域の５’末端領域と同じ配列のタグを付加し得る。このように、タグが付加される末端およびその配列は、融合ＰＣＲが生じる限り適切に変更・改変され得ることが、当業者には明らかである。
【００５６】
酵母ゲノムと形質転換用ＰＣＲ断片との間で生じる相同組換えの長さは、形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域の長さおよび標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）の長さから当業者が容易に決定し得る。このような形質転換用ＰＣＲ断片上の標的遺伝子の上流域および５’末端領域（または５’末端含有領域）の長さは、これらの標的遺伝子の上流域および標的遺伝子の５’末端領域（または５’末端含有領域）を増幅するために使用されるプライマーＥおよびプライマーＦの鋳型上での位置、ならびにプライマーＧおよびプライマーＨの鋳型上での位置から決定され得る。逆に、鋳型上での適切な位置に対応するプライマーＥ〜Ｈを設計することによって、相同組換えを生じるために必要な長さを有する標的遺伝子の上流域および５’末端領域（または５’末端含有領域）を含む形質転換用ＰＣＲ断片を取得し得る。このようなプライマーの設計および相同組換えの長さの算出は、当業者の技術範囲内にある。
【００５７】
（遺伝子発現調節領域）
上記のように、本発明において、酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現が、遺伝子発現調節領域によって増強され得る。高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方の条件下で標的遺伝子の発現を増強し得る限り、任意のプロモーター、エンハンサー、または他の遺伝子発現調節領域を使用して酵母ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子および／またはＤＢＦ２遺伝子の発現を増強し、それによって酵母に高ショ糖耐性または冷凍耐性を付与し得ることが、当業者には明らかである。好ましい遺伝子発現調節領域は、酵母ＨＳＰ１０４プロモーターであり、より好ましくは、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーターである。
【００５８】
（選択マーカー）
本発明において、酵母ゲノム上にある上記酵母遺伝子領域へと遺伝子発現調節領域（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサーなど）が挿入された改変酵母、または自律複製可能な線状もしくは環状のベクターに連結された上記酵母遺伝子が導入された改変酵母などを検出する指標として、種々の選択マーカーが使用され得る。このような選択マーカーとしては、改変酵母を検出する効果を奏す限り、適切な任意の選択マーカーが使用され得ることが、当業者にとって明らかである。
【００５９】
（ＰＣＲ増幅）
本発明において使用されるＰＣＲ増幅は、種々のポリメラーゼおよびサーマルサイクラー、当業者が容易に決定可能な適切なＰＣＲ条件を使用して行われる。例示的なポリメラーゼとしては、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社，大津市瀬田三丁目４番１号）が挙げられるが、これに限定はされない。例示的なサーマルサイクラーとしては、ＡＢＩ ９６００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京、日本）が挙げられるが、これに限定はされない。
【００６０】
（ストレス負荷条件に対する酵母の耐性）
ストレス負荷条件に対する酵母の耐性は、その炭酸ガス発生量を測定することによって評価され得る。酵母の炭酸ガス発生量は、例えば、ファーモグラフ法によって測定され得る。ファーモグラフ法とは、ファーモグラフ（アトー株式会社，東京都文京区本郷１−２５−２３）を使用して、微生物発酵などによって発生するガス量を計測する方法である。
【００６１】
（酵母の形質転換）
酵母を形質転換する方法は、当該分野において周知である。例えば、「Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）ｐ１０３を参照のこと。
【００６２】
（酵母の培地）
酵母を培養・保存するための培地は、当該分野において周知である。そのような培地としては、ＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）、ＹＭＰＤ培地（０．３％ イーストエキス、０．３％ マルトエキス、０．５％ ペプトン、３％ グルコース）、糖蜜培地（２６０ｇ／Ｌの糖に相当する廃糖蜜に１９．４９ｇ／Ｌの尿素、および５２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を添加した溶液）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６３】
（パン生地・パンの製造）
パン生地・パンの製造は、当該分野で周知である。例えば、パン生地・パンは、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる方法によって製造され得る。例として、菓子パンなどに使用される高糖生地の一例は、
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ３０重量部
食塩 ０．５重量部
酵母 ４重量部
ショートニング ６重量部
脱脂粉乳 ２重量部
水 ５２重量部
を含む。この高糖生地を、以下のような例示的製パン条件：
ミキシング Ｌ３，Ｍ２，↓
Ｌ２，Ｍ２，Ｈ１〜
捏ね上げ温度 ２８℃
第一発酵 ３０℃、７０分
第二発酵 ３０℃、３０分
分割・丸め ４５０ｇ
ベンチ ３０℃、２０分
成形 ワンローフ
ホイロ発酵 ３８℃、ＲＨ８５％
型上１．５ｃｍ
焼成 ２００℃、２５分
にて製パンし得る。
【００６４】
また、例えば、冷凍製パン用生地の一例は、
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ５重量部
食塩 ２重量部
酵母 ２重量部
ショートニング ５重量部
を含む。この生地を、以下のような例示的製パン条件：
凍結前発酵 ６０分
冷凍期間 １〜２週間（−２０℃）
解凍 ９０分（３０℃）
丸め、ベンチ ３０分
成形
ホイロ ５５分
焼成 ２５分
にて製パンし得る。上記のような生地の組成および製パン条件は、意図されるパンの性質に依存して、必要に応じて当業者が容易に改変し得ることが明らかである。
【００６５】
（菓子類の製造）
酵母を使用した菓子は、酵母を原料混合時に添加し、混捏し、発酵させ、成型し、焙焼することによって製造され得る。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、特開２００１−２１１８１５を参照のこと。
【００６６】
（日本酒の製造）
日本酒の製造方法は、当該分野において周知である。例えば、以下のような方法で、日本酒は製造され得る：
１）精米
米を精米する。玄米の表層部や胚芽には、麹菌および酵母の増殖、発酵促進には過剰な灰分およびビタミン類、また必要以上に多いと製成酒の香りや味を劣化させるタンパク質および脂質が多く含まれている。これらは醸造管理を困難にさせることから、醸造上で不必要な成分を取り除く作業を行う。これが精米である。
【００６７】
２）洗米
次に精米した米を洗米する。白米表層に残留している糠分を除去する目的で、白米を水洗いすることを「洗米」という。洗米中に白米の表面が１〜２％摩耗し、二次精米の効果がある。
【００６８】
３）浸漬および水切り
３−１）浸漬
次に、洗米した米を浸漬タンクに入れ水に浸漬させる。浸漬の目的は、米粒の中心まで水を充分に吸収させることによって、蒸煮したときに完全な蒸米になるように、すなわちα化（生の米デンプンのかたい結晶構造に水が入り、加熱によってデンプンが膨潤、糊化すること）が完全に行われるようにするためである。
【００６９】
３−２）水切り
予定の浸漬時間を経過した後、浸漬タンクから水を排出する。これを水切りという。
【００７０】
４）蒸し
次に、浸漬タンクから米を取り出し蒸しの工程を行う。
【００７１】
蒸しの目的は、適度に水を吸わせた生米を、蒸気で加熱することによって、米の生デンプンをα化し、麹菌の生産する糖化酵素の作用を受けやすくするためである。また、加熱によって米を殺菌し、以後の醸造工程を安全に遂行するためでもある。
【００７２】
よい蒸米とは、さばけがよくて外硬内軟なもの。つまり、完全にα化され、適度のかたさを保ち、表面がべたつかないものを指す。蒸米の硬軟は、以後の製麹管理と醪中の米の溶解に大きな影響を与えるので、大変重要な工程である。
【００７３】
５）麹
次に、蒸米に麹菌を増殖させる（これを「麹」という）。麹菌は蒸米上で増殖すると同時に各種の酵素を菌体外に分泌する。麹菌自体は空気中の酸素を必要とする好気的な微生物であるため、空気の存在しない醪の中では生きることができず、死滅してしまう。
【００７４】
麹菌の生産した酵素はタンパク質の一種で、生物でなく物質であるため、醪中に残存し、酵素作用を発揮する。
【００７５】
日本酒醸造は、酵母によるアルコール発酵（酵母のような微生物が、自己のもっている酵素の力で糖分をアルコールにする作用）によるが、主原料となる白米中のデンプンまたはタンパク質などは、酵母が利用できない高分子物質の状態にあるため、麹菌の生産する酵素をもって、酵母が利用できるブドウ糖またはアミノ酸段階までの形に変えることが麹の最も大きな役割である。
【００７６】
６）酒母（モト）および酵母
次に、酵母（サッカロミセス・セレビシェ）を発酵させて酒母（モト）を作る。ついで、日本酒醪を解放状態で発酵を行う。
【００７７】
この後、初添え（添え仕込み）、踊り、仲添え（仲仕込み）、留添え（留仕込み）などを行う。通常醪は４日間にわたり、３段階の仕込みをする（段掛法または段仕込み）。
【００７８】
その後、上槽、滓引き、濾過を行う。このように生産した日本酒は、調合、火入れなどを行い、出荷するまで貯蔵する。
【００７９】
（ビール・発泡酒の製造）
ビール・発泡酒は、原料（大麦麦芽、米、トウモロコシ、でんぷんなど）から糖化・調製した麦汁にホップを加え、酵母で発酵・熟成させて製造する。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、国税庁のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｔａ．ｇｏ．ｊｐ、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐなどを参照のこと。
【００８０】
（ワインの製造）
ワインは、果実全般（特に、ブドウ）を原料として、果実中に含まれる糖類を酵母により直接発酵させること（単式発酵方式）により製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐを参照のこと。
【００８１】
（焼酎・泡盛の製造）
焼酎・泡盛は、でんぷん原料を麹菌のアミラーゼで糖化しながら酵母でアルコール発酵する平行複発酵方式させて得られるもろみを蒸留することによって製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、独立行政法人酒類総合研究所のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐを参照のこと。
【００８２】
（醤油の製造）
醤油は、本醸造方式、新醸造（化学）方式、およびアミノ酸液混合（半化学）方式などの方法によって製造される。大豆および小麦に種麹を加えた麹からもろみを製造し、麹菌・酵母・乳酸菌などによって醤油が得られる。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、しょうゆ情報センターのホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｙｓａｕｃｅ．ｏｒ．ｊｐなどを参照のこと。
【００８３】
（みその製造）
発酵型みそは、米、麦などの原料から製麹し、純粋培養した酵母を加えて発酵させることによって製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、全国味噌工業協同組合連合会のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｚｅｎｍｉ．ｊｐを参照のこと。
【００８４】
（酢の製造）
果実酢は、果実を原料として、酵母によりアルコール発酵させ、その後酢酸発酵させることにより製造される。穀類酢は、穀類のデンプンを糖化した後、酵母によりアルコール発酵させ、その後酢酸発酵させることにより製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、全国食酢協会中央会のホームページ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｏｋｕｓｕ．ｏｒｇ／を参照のこと。
【００８５】
（発酵乳の製造）
発酵乳の一種である乳種類（ケフィア、クミスなど）は、原料乳を乳酸菌と酵母とで複合発酵することにより製造される。詳細な製造方法は、当該分野において周知である。例えば、特開２００６−３４２６７、特開平１０−５６９６１を参照のこと。
【００８６】
（漬物の製造）
漬物は、例えば、培養した酵母菌体をスターターとして漬物あるいは糠床等に加える方法などの周知の方法によって製造される。特開２００５−７３５３２などを参照のこと。
【００８７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例において、特に記載がない限り、すべてのＰＣＲ反応において、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＴａｑポリメラーゼおよびサーマルサイクラーＡＢＩ ９６００を使用した。
【００９０】
（実施例１．ＵＲＡ３遺伝子のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）を用いてＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
１μｌ １０μＭ ５’プライマーＡ（配列番号５）
１μｌ １０μＭ ５’プライマーＢ（配列番号６）
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 鋳型サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８ＣゲノムＤＮＡ
以上に滅菌水を加えて、合計２５μｌにした（反応液組成１）。
【００９１】
反応温度サイクルは、
９４℃：５分
（９４℃：３０秒→４６℃：３０秒→７２℃：１分）×３５回
７２℃：２分
であった（反応温度サイクル１）。
【００９２】
（実施例２．５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーターのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の５’末端に酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の３’末端領域ＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡ（配列番号３２）と同じ配列の５’タグが付加した断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりに５’プライマーＣ（配列番号７）および３’プライマーＤ（配列番号８）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、
９４℃：５分
（９４℃：３０秒→４８℃：３０秒→７２℃：１分）×３５回
７２℃：２分
であった（反応温度サイクル２）。
【００９３】
（実施例３．ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの融合ＰＣＲ増幅）
得られたＵＲＡ３遺伝子断片と５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーター断片とを鋳型として、５’プライマーＡおよび３’プライマーＤを用いて、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーター融合断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例１で得られたＵＲＡ３ ＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例２で得られた５’タグ＋ＨＳＰ１０４プロモーターＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした（反応液組成２）。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：２分）×１０回
ここで、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＤ（配列番号８）各１０μＭを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：２分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％）
であった（反応温度サイクル３）。
【００９４】
得られた融合断片を、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと呼び、以後の実験に使用した。
【００９５】
（実施例４．ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＲＯ１遺伝子の上流域（ＡＲＯ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−６９０〜−１領域）（配列番号２７）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【００９６】
（実施例５．５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡＲＯ１遺伝子（配列番号１）の５’末端領域（ＡＲＯ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６０９領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）を用いた以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【００９７】
（実施例６．ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の融合ＰＣＲ増幅）
実施例３において得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと、実施例４および５において得られたＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片を鋳型として、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨとを用いて、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例３で得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例４で得られたＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例５で得られた５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域ＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×１０回
ここで、１０μＭ ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよび１０μＭ ＡＲＯ１用５’プライマーＨを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％（約０．１℃／秒））
であった。得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＡＲＯ１遺伝子の上流域（配列番号２７）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＡＲＯ１遺伝子５’末端領域（配列番号１の１〜６０９領域）を含んだ。
【００９８】
（実施例７．酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例６において得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）のウラシル要求性突然変異株Ｙ２４５（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）を形質転換した。この形質転換は、以下の手順にて行った：
１． Ｙ２４５株を含むＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）１ｍｌを一晩（Ｏ／Ｎ） 前培養した
２． １．の前培養したＹ２４５株を、５ｍｌのＹＰＤ培地に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ＯＤ６００＝０．２くらい）になるように接種した
３． ２．の培地を３〜５ｈ培養した（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ：ＯＤ６００＝０．７〜１になるまで）
４． ３．の培養物を２，５００ｒｐｍ（３，０００ｘｇ）にて５分間，室温で遠心分離した後，上清を捨てた
５． ４．で得られた菌体を約１ｍｌ滅菌水に懸濁し，エッペンドルフチューブに移した
６． ５．の懸濁物を１５，０００ｒｐｍにて５秒間遠心分離し，上清を捨てた
７． ６．で得られた菌体を約５００μｌの１００ｍＭ ＬｉＡｃに懸濁し，１５，０００ｒｐｍにて，５秒間遠心分離した
８． ７．で生じた上清を捨てて以下の順に溶液を加えた：
２４０μｌ ＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ，ＭＷ ３３５０）
３６μｌ １Ｍ ＬｉＡｃ
１０μｌ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）
１０μｌ 実施例６で得られた融合ＰＣＲ増幅液
５５μｌ 滅菌水
９． ８．の溶液を１分間ｖｏｒｔｅｘし，３０℃にて３０分間保温した
１０． ９．の溶液を４２℃にて２５分間保温した
１１． １０．の溶液を７，０００ｒｐｍ，１５秒間，室温で遠心分離し，上清を捨てた
１２． １１．の菌体を滅菌水に懸濁し，ウラシルを含まない寒天培地に播いた。
形質転換体のうちから、ウラシル非要求性株を取得した。このウラシル非要求性株をＡＹ１２８株と名付けた。このＡＹ１２８株は、そのゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入されていた。実施例１〜７に示した酵母ゲノム上の標的遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入についての模式図を、図１に示す。この酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１２８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）を付与された。
【００９９】
（実施例８．酵母ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＥ（配列番号１３）およびＢＵＤ２３用３’プライマーＦ（配列番号１４）を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子の上流域（ＢＵＤ２３遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−６７５〜−１領域）（配列番号２８）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＧ（配列番号１５）およびＢＵＤ２３用３’プライマーＨ（配列番号１６）を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子（配列番号２）の５’末端領域（ＢＵＤ２３遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６７４領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＢＵＤ２３用５’プライマーＥおよびＢＵＤ２３用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＢＵＤ２３遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＢＵＤ２３遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＢＵＤ２３遺伝子の上流域（配列番号２８）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＢＵＤ２３遺伝子５’末端領域（配列番号２の１〜６７４領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＢＵＤ２３遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１３７株を得た。このＡＹ１３７株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１３７株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）を付与された。
【０１００】
（実施例９．酵母ゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＥ（配列番号１７）およびＰＭＲ１用３’プライマーＦ（配列番号１８）を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子の上流域（ＰＭＲ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７０５〜−１領域）（配列番号２９）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＧ（配列番号１９）およびＰＭＲ１用３’プライマーＨ（配列番号２０）を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子（配列番号３）の５’末端領域（ＰＭＲ１遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７４６領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＰＭＲ１用５’プライマーＥおよびＰＭＲ１用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＰＭＲ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＰＭＲ１遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＰＭＲ１遺伝子の上流域（配列番号２９）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＰＭＲ１遺伝子５’末端領域（配列番号３の１〜７４６領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＰＭＲ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株を得た。このＡＹ１１２株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１１２株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）を付与された。
【０１０１】
（実施例１０．酵母ゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例４の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ（配列番号９）およびＡＲＯ１用３’プライマーＦ（配列番号１０）の代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＥ（配列番号２１）およびＳＮＦ５用３’プライマーＦ（配列番号２２）を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子の上流域（ＳＮＦ５遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７３０〜−１領域）（配列番号３０）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例５の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＧ（配列番号１１）およびＡＲＯ１用３’プライマーＨ（配列番号１２）の代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＧ（配列番号２３）およびＳＮＦ５用３’プライマーＨ（配列番号２４）を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子（配列番号４）の５’末端領域（ＳＮＦ５遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６３１領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例６の手順において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥおよびＡＲＯ１用５’プライマーＨの代わりにＳＮＦ５用５’プライマーＥおよびＳＮＦ５用５’プライマーＨを使用し、ＡＲＯ１遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＡＲＯ１遺伝子の５’末端領域断片の代わりにＳＮＦ５遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＳＮＦ５遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＳＮＦ５遺伝子の上流域（配列番号３０）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＳＮＦ５遺伝子５’末端領域（配列番号４の１〜６３１領域）を含んだ。実施例７において、ＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＳＮＦ５遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１０８株を得た。このＡＹ１０８株を、２００７年８月２３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１０８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）を付与された。
【０１０２】
（実施例１１．ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグのＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＯＮ７遺伝子の上流域（ＧＯＮ７遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７１９〜−１領域）（配列番号５４）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）を使用した以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【０１０３】
（実施例１２．５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片のＰＣＲ増幅）
酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＯＮ７遺伝子（配列番号３４）およびその下流域（ＧＯＮ７遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜６７０領域）（以後、本明細書において「ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域」と呼ぶ）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。反応液組成は、５’プライマーＡ（配列番号５）および３’プライマーＢ（配列番号６）の代わりにＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）を用いた以外は、反応液組成１と同じであった。反応温度サイクルは、反応温度サイクル１と同じであった。
【０１０４】
（実施例１３．ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の融合ＰＣＲ増幅）
実施例３において得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットと、実施例１１および１２において得られたＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片を鋳型として、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨとを用いて、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を融合ＰＣＲ増幅した。反応液組成は、以下の通りであった：
２．５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ用１０倍濃度反応バッファー
２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２
４μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
０．２５μｌ ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ
１０ｎｇ 実施例３で得られたＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例１１で得られたＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグＤＮＡ断片
１０ｎｇ 実施例１２で得られたＧＯＮ７遺伝子の５’タグ＋５’末端領域ＤＮＡ断片
以上に滅菌水を加えて、合計２３μｌにした。反応温度サイクルは、
９４℃：２分
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×１０回
ここで、１０μＭ ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよび１０μＭ ＧＯＮ７用５’プライマーＨを１μｌずつ添加
（９４℃：２０秒→５０℃：３０秒→６８℃：３分）×２５回
（５０℃から６８℃までの温度上昇はＡＢＩ ９６００の場合Ｒａｍｐ １０％（約０．１℃／秒））
であった。得られたＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＧＯＮ７遺伝子の上流域（配列番号５４）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＧＯＮ７遺伝子５’末端含有領域（配列番号３４の１〜６７０領域）を含んだ。
【０１０５】
（実施例１４．酵母ゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１３において得られたＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）のウラシル要求性突然変異株Ｙ２５１（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）を形質転換した。この形質転換は、以下の手順にて行った：
１． Ｙ２５１株を含むＹＰＤ培地（１％ イーストエキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）１ｍｌを一晩（Ｏ／Ｎ） 前培養した
２． １．の前培養したＹ２５１株を、５ｍｌのＹＰＤ培地に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ＯＤ６００＝０．２くらい）になるように接種した
３． ２．の培地を３〜５ｈ培養した（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ：ＯＤ６００＝０．７〜１になるまで）
４． ３．の培養物を２，５００ｒｐｍ（３，０００ｘｇ）にて５分間，室温で遠心分離した後，上清を捨てた
５． ４．で得られた菌体を約１ｍｌ滅菌水に懸濁し，エッペンドルフチューブに移した
６． ５．の懸濁物を１５，０００ｒｐｍにて５秒間遠心分離し，上清を捨てた
７． ６．で得られた菌体を約５００μｌの１００ｍＭ ＬｉＡｃに懸濁し，１５，０００ｒｐｍにて，５秒間遠心分離した
８． ７．で生じた上清を捨てて以下の順に溶液を加えた：
２４０μｌ ＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ，ＭＷ ３３５０）
３６μｌ １Ｍ ＬｉＡｃ
１０μｌ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）
１０μｌ 実施例１３で得られた融合ＰＣＲ増幅液
５５μｌ 滅菌水
９． ８．の溶液を１分間ｖｏｒｔｅｘし，３０℃にて３０分間保温した
１０． ９．の溶液を４２℃にて２５分間保温した
１１． １０．の溶液を７，０００ｒｐｍ，１５秒間，室温で遠心分離し，上清を捨てた
１２． １１．の菌体を滅菌水に懸濁し，ウラシルを含まない寒天培地に播いた。
形質転換体のうちから、ウラシル非要求性株を取得した。このウラシル非要求性株をＡＹ１７４株と名付けた。このＡＹ１７４株は、そのゲノム上のＧＯＮ７遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入されていた。この酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ１７４株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３を付与された。
【０１０６】
（実施例１５．酵母ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＥ（配列番号４２）およびＳＰＴ２０用３’プライマーＦ（配列番号４３）を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子の上流域（ＳＰＴ２０遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７２４〜−１領域）（配列番号５５）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＧ（配列番号４４）およびＳＰＴ２０用３’プライマーＨ（配列番号４５）を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子（配列番号３５）の５’末端領域（ＳＰＴ２０遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７４８領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＳＰＴ２０用５’プライマーＥおよびＳＰＴ２０用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片の代わりにＳＰＴ２０遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＳＰＴ２０遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＳＰＴ２０遺伝子の上流域（配列番号５５）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＳＰＴ２０遺伝子５’末端領域（配列番号３５の１〜７４８領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＳＰＴ２０遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２４９株を得た。このＡＹ２４９株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ２４９株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４を付与された。
【０１０７】
（実施例１６．酵母ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＥ（配列番号４６）およびＣＢＳ２用３’プライマーＦ（配列番号４７）を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子の上流域（ＣＢＳ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７３９〜−１領域）（配列番号５６）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＧ（配列番号４８）およびＣＢＳ２用３’プライマーＨ（配列番号４９）を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子（配列番号３６）の５’末端領域（ＣＢＳ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７１７領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＣＢＳ２用５’プライマーＥおよびＣＢＳ２用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端含有領域断片の代わりにＣＢＳ２遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＣＢＳ２遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＣＢＳ２遺伝子の上流域（配列番号５６）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＣＢＳ２遺伝子５’末端領域（配列番号３６の１〜７１７領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＣＢＳ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２５３株を得た。このＡＹ２５３株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ２５３株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５を付与された。
【０１０８】
（実施例１７．酵母ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例１１の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ（配列番号３８）およびＧＯＮ７用３’プライマーＦ（配列番号３９）の代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＥ（配列番号５０）およびＤＢＦ２用３’プライマーＦ（配列番号５１）を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子の上流域（ＤＢＦ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として−７２５〜−１領域）（配列番号５７）の３’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）の５’末端領域ＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号３１）と同じ配列の３’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１２の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＧ（配列番号４０）およびＧＯＮ７用３’プライマーＨ（配列番号４１）の代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＧ（配列番号５２）およびＤＢＦ２用３’プライマーＨ（配列番号５３）を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子（配列番号３７）の５’末端領域（ＤＢＦ２遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１として１〜７１４領域）の５’末端に、酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）の３’末端領域ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴ（配列番号３３）と同じ配列の５’タグが付加された断片をＰＣＲ増幅した。実施例１３の手順において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥおよびＧＯＮ７用５’プライマーＨの代わりにＤＢＦ２用５’プライマーＥおよびＤＢＦ２用５’プライマーＨを使用し、ＧＯＮ７遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＧＯＮ７遺伝子の５’末端領域含有断片の代わりにＤＢＦ２遺伝子の上流域＋３’タグ断片および５’タグ＋ＤＢＦ２遺伝子の５’末端領域断片を使用することによって、ＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を得た。このＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片は、５’側から３’側に向って、ＤＢＦ２遺伝子の上流域（配列番号５７）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号２６）、ＨＳＰ１０４プロモーター（配列番号２５）、ＤＢＦ２遺伝子５’末端領域（配列番号３７の１〜７１４領域）を含んだ。実施例１４において、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片の代わりにＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片を使用することによって、ゲノム上のＤＢＦ２遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された酵母サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ３６８株を得た。このＡＹ３６８株を、２００８年８月１３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。このＡＹ３６８株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６を付与された。
【０１０９】
（実施例１８．Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流またはＨＭＯ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨと同様の様式で種々の標的遺伝子の上流域および５’末端領域を増幅するために、ＡＲＯ１を標的とするプライマーＥ〜Ｈに対応するプライマーＥ〜Ｈを設計した。ＭＳＫ１遺伝子を標的として、実施例４〜７において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＭＳＫ１用５’プライマーＥ、ＭＳＫ１用３’プライマーＦ、ＭＳＫ１用５’プライマーＧおよびＭＳＫ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＭＳＫ１を得た。同様に、ＨＭＯ１遺伝子を標的として、実施例４〜７において、ＡＲＯ１用５’プライマーＥ、ＡＲＯ１用３’プライマーＦ、ＡＲＯ１用５’プライマーＧおよびＡＲＯ１用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＨＭＯ１用５’プライマーＥ、ＨＭＯ１用３’プライマーＦ、ＨＭＯ１用５’プライマーＧおよびＨＭＯ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２４５株の酵母ゲノム上のＨＭＯ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＨＭＯ１を得た。
【０１１０】
（実施例１９．Ｙ２５１株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
ＧＯＮ７用５’プライマーＥ、ＧＯＮ７用３’プライマーＦ、ＧＯＮ７用５’プライマーＧおよびＧＯＮ７用３’プライマーＨと同様の様式で種々の標的遺伝子の上流域および５’末端領域を増幅するために、ＧＯＮ７を標的とするプライマーＥ〜Ｈに対応するプライマーＥ〜Ｈを設計した。ＭＳＫ１遺伝子を標的として、実施例１１〜１４において、ＧＯＮ７用５’プライマーＥ、ＧＯＮ７用３’プライマーＦ、ＧＯＮ７用５’プライマーＧおよびＧＯＮ７用３’プライマーＨの代わりに、それぞれＭＳＫ１用５’プライマーＥ、ＭＳＫ１用３’プライマーＦ、ＭＳＫ１用５’プライマーＧおよびＭＳＫ１用３’プライマーＨを使用することによって、Ｙ２５１株の酵母ゲノム上のＭＳＫ１遺伝子上流にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株ＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）を得た。
【０１１１】
（実施例２０．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高ショ糖ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４４株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２４５のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１２８株、ＡＹ１３７株、およびＨＳＰ−ＭＳＫ１株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）または５０％ショ糖を含む培地（５０％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４を１とする炭酸ガス発生量比として表１および図２Ａに表す。
【０１１２】
【表１】
表１および図２Ａから明らかであるように、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株は、コントロールであるＹ２４４株と比較して、５０％ショ糖を含む高ショ糖ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性であった。一方、表１から明らかであるように、ＨＳＰ−ＭＳＫ１株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高い高ショ糖ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、高ショ糖ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＡＲＯ１遺伝子およびＢＵＤ２３遺伝子の効果であることを示した。
【０１１３】
（実施例２１．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の冷凍ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４４株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２４５のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１１２株、ＡＹ１０８株、およびＨＳＰ−ＨＭＯ１株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において３０℃で１２０分間培養した後、培養液を−２５℃で３日間冷凍した。これを解凍した後、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４を１とする炭酸ガス発生量比として表２および図２Ｂに表す。
【０１１４】
【表２】
表２および図２Ｂから明らかであるように、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株は、コントロールであるＹ２４４株と比較して、冷凍ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株は、Ｙ２４４株と比較して冷凍ストレスに対して耐性であった。一方、表２から明らかであるように、ＨＳＰ−ＨＭＯ１株は、Ｙ２４４株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の高い冷凍ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、冷凍ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＰＭＲ１遺伝子およびＳＮＦ５遺伝子の効果であることを示した。
【０１１５】
（実施例２２．サッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株の高ショ糖ストレス耐性）
酵母サッカロミセス・セレビシェ 野生型Ｙ２４９株と、そのウラシル要求性変異株Ｙ２５１のＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット導入株であるＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株、およびＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）株を、５％ショ糖を含む培地（５％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）または５０％ショ糖を含む培地（５０％ショ糖、５％マルトース、０．２５％硫酸アンモニウム、０．５％尿素、１．６％リン酸二水素カリウム、０．５％リン酸一水素ナトリウム１２水和物、０．０６％硫酸マグネシウム、０．００２２５％ニコチン酸、０．０００５％パントテン酸、０．０００２５％チアミン、０．０００１２５％ピリドキシン、０．０００１％リボフラビン、０．００００５％葉酸）において、３０℃にて３００分間、９０ｒｐｍで振盪培養し、炭酸ガス発生量をファーモグラフ法にて測定した。得られた炭酸ガス発生量を、同じ酵母菌体量（ＯＤ６００ Ｕｎｉｔｓ）について比較した。その結果を、コントロールである酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株を１とする炭酸ガス発生量比として表３、図３Ａおよび図３Ｂに表す。
【０１１６】
【表３】
表３、図３Ａおよび図３Ｂから明らかであるように、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株は、コントロールであるＹ２４９株と比較して、５０％ショ糖を含む高ショ糖ストレス条件下で高い炭酸ガス発生量（発酵力）を示した。従って、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株は、Ｙ２４９株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性であった。一方、表３から明らかであるように、ＨＳＰ−ＭＳＫ１（Ｙ２５１）は、Ｙ２４９株と比較して高ショ糖ストレスに対して耐性が低かった。これらの知見は、ＡＹ１７４株、ＡＹ３６８株、ＡＹ２４９株、およびＡＹ２５３株の高い高ショ糖ストレス耐性は、ＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセット自体に起因するのではなく、それぞれ、高ショ糖ストレス条件下で誘導されたＨＳＰ１０４プロモーターにより発現が増強されたＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、およびＣＢＳ２遺伝子の効果であることを示した。
【０１１７】
（実施例２３．酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流、ＢＵＤ２３遺伝子上流、ＰＭＲ１遺伝子上流、ＳＮＦ５遺伝子上流、ＧＯＮ７遺伝子上流、ＳＰＴ２０遺伝子上流、ＣＢＳ２遺伝子上流、およびＤＢＦ２遺伝子上流のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入）
実施例６、８、９、１０、１３、１５、１６、１７において得られたＡＲＯ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＢＵＤ２３遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＰＭＲ１遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＳＮＦ５遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＧＯＮ７遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＳＰＴ２０遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、ＣＢＳ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片、またはＤＢＦ２遺伝子を標的とする形質転換用ＰＣＲ断片のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個を用いて、実施例７または１４の形質転換手順に従って酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４５株またはＹ２５１株を形質転換する。形質転換体のうちから、酵母ゲノム上のＡＲＯ１遺伝子上流、ＢＵＤ２３遺伝子上流、ＰＭＲ１遺伝子上流、ＳＮＦ５遺伝子上流、ＧＯＮ７遺伝子上流、ＳＰＴ２０遺伝子上流、ＣＢＳ２遺伝子上流、およびＤＢＦ２遺伝子上流のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個にＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットが導入された株を取得する。そのような株は、形質転換体の染色体ＤＮＡを鋳型として、各遺伝子用の５’プライマーＥおよび３’プライマーＨを用いてＰＣＲ増幅を行うことによって確認される。得られた目的とする形質転換体を、高ショ糖ストレス耐性および冷凍ストレス耐性について、実施例２０〜２２に記載される方法に従って測定する。
【０１１８】
（実施例２４．自律複製可能なベクターに連結された酵母遺伝子ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、および／またはＣＢＳ２の酵母染色体外への導入）
標的遺伝子ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＤＢＦ２遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、および／またはＣＢＳ２の開始コドンから当該遺伝子のターミネーターを含む領域をＰＣＲ増幅し、酵母自律複製型の酵母・大腸菌シャトルベクター（ＹＥｐ）にクローン化する。クローン化した遺伝子の上流にＨＳＰ１０４プロモーターを作動可能に挿入・連結し、実施例７または１４に記載の形質転換手順により酵母サッカロマイセス・セレビシエ細胞を形質転換する。この場合、形質転換体のほぼ全てが目的ベクターを持つと考えて良い。形質転換体から抽出したＤＮＡを用いて大腸菌の形質転換を行うことにより、目的ベクターを持つ株を検出する。得られた目的とする形質転換株を、高ショ糖ストレス耐性および冷凍ストレス耐性について、実施例２０〜２２に記載される方法に従って測定する。
【０１１９】
（実施例２５．本発明の酵母を使用するパンの製造）
実施例７〜１０、１４〜１７、または２３〜２４に従って得られた改変酵母を使用してパンを製造する。まず、以下の組成の高糖生地を製造する：
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ３０重量部
食塩 ０．５重量部
酵母 ４重量部
ショートニング ６重量部
脱脂粉乳 ２重量部
水 ５２重量部。この高糖生地を、以下のような製パン条件：
ミキシング Ｌ３，Ｍ２，↓
Ｌ２，Ｍ２，Ｈ１〜
捏ね上げ温度 ２８℃
第一発酵 ３０℃、７０分
第二発酵 ３０℃、３０分
分割・丸め ４５０ｇ
ベンチ ３０℃、２０分
成形 ワンローフ
ホイロ発酵 ３８℃、ＲＨ８５％
型上１．５ｃｍ
焼成 ２００℃、２５分
に従って製パンする。得られたパンについて、その外観、内相、および／または比容積を指標とすることにより、使用した酵母の高ショ糖ストレス耐性効果を確認する。
【０１２０】
または、以下の組成の冷凍製パン用生地を製造する：
小麦粉 １００重量部
ショ糖 ５重量部
食塩 ２重量部
酵母 ２重量部
ショートニング ５重量部。この生地を、以下のような製パン条件：
凍結前発酵 ６０分
冷凍期間 １〜２週間（−２０℃）
解凍 ９０分（３０℃）
丸め、ベンチ ３０分
成形
ホイロ ５５分
焼成 ２５分
に従って製パンする。得られたパンについて、その外観、内相、および／または比容積を指標とすることにより、使用した酵母の冷凍ストレス耐性効果を確認する。
【０１２１】
本明細書は、特定の実施例に関して詳細に記載されているが、これらの実施例は、単に本発明を例示するために提供されているものに過ぎず、これらの実施例は、本発明を限定することは決して意図しない。当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、上記実施例に対する変更・改変を施し得ることが、明らかである。本発明の範囲は、添付されている特許請求の範囲およびその均等物によってのみ規定される。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を使用し得るあらゆる酵母利用産業（例えば、エタノール製造や製パン産業）において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、酵母ゲノム中へのＵＲＡ３−ＨＳＰ１０４プロモーターカセットの導入の模式図である。
【図２】図２Ａは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＡＲＯ１遺伝子発現増強株およびＢＵＤ２３遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１２８株およびＡＹ１３７株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株）と比較したグラフである。図２Ｂは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＰＭＲ１遺伝子発現増強株およびＳＮＦ５遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１１２株およびＡＹ１０８株の冷凍ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４４株）と比較したグラフである。
【図３】図３Ａは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＧＯＮ７遺伝子発現増強株およびＤＢＦ２遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ１７４株およびＡＹ３６８株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株）と比較したグラフである。図３Ｂは、本発明の遺伝子改変酵母株（ＳＰＴ２０遺伝子発現増強株およびＣＢＳ２遺伝子発現増強株）であるサッカロミセス・セレビシェ ＡＹ２４９株およびＡＹ２５３株の高ショ糖ストレス耐性を、コントロール野生型酵母株（酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｙ２４９株）と比較したグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号２：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号５：５’プライマーＡのヌクレオチド配列
配列番号６：３’プライマーＢのヌクレオチド配列
配列番号７：５’プライマーＣのヌクレオチド配列
配列番号８：３’プライマーＤのヌクレオチド配列
配列番号９：ＡＲＯ１用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１０：ＡＲＯ１用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１１：ＡＲＯ１用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号１２：ＡＲＯ１用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号１３：ＢＵＤ２３用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１４：ＢＵＤ２３用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１５：ＢＵＤ２３用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号１６：ＢＵＤ２３用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号１７：ＰＭＲ１用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号１８：ＰＭＲ１用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号１９：ＰＭＲ１用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号２０：ＰＭＲ１用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号２１：ＳＮＦ５用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号２２：ＳＮＦ５用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号２３：ＳＮＦ５用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号２４：ＳＮＦ５用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号２５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号２６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＵＲＡ３遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＡＲＯ１遺伝子の上流域（−６９０〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号２８：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＢＵＤ２３遺伝子の上流域（−６７５〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号２９：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＰＭＲ１遺伝子の上流域（−７０５〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号３０：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＮＦ５遺伝子の上流域（−７３０〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号３１：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子の５’末端領域（配列番号２６の１〜３０位）のヌクレオチド配列
配列番号３２：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株ＵＲＡ３遺伝子の３’末端領域（配列番号２６の１，１６５〜１，１９４位）のヌクレオチド配列
配列番号３３：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＨＳＰ１０４遺伝子プロモーターの３’末端領域(配列番号２５の４１１〜４４０位）のヌクレオチド配列
配列番号３４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３８：ＧＯＮ７用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号３９：ＧＯＮ７用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４０：ＧＯＮ７用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４１：ＧＯＮ７用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号４２：ＳＰＴ２０用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号４３：ＳＰＴ２０用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４４：ＳＰＴ２０用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４５：ＳＰＴ２０用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号４６：ＣＢＳ２用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号４７：ＣＢＳ２用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号４８：ＣＢＳ２用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号４９：ＣＢＳ２用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号５０：ＤＢＦ２用５’プライマーＥのヌクレオチド配列
配列番号５１：ＤＢＦ２用３’プライマーＦのヌクレオチド配列
配列番号５２：ＤＢＦ２用５’プライマーＧのヌクレオチド配列
配列番号５３：ＤＢＦ２用３’プライマーＨのヌクレオチド配列
配列番号５４：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＧＯＮ７遺伝子の上流域（−７１９〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５５：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＳＰＴ２０遺伝子の上流域（−７２４〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５６：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＣＢＳ２遺伝子の上流域（−７３９〜−１領域）のヌクレオチド配列
配列番号５７：酵母サッカロミセス・セレビシェ Ｓ２８８Ｃ株のＤＢＦ２遺伝子の上流域（−７２５〜−１領域）のヌクレオチド配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および
該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；
を含む、核酸カセット。
【請求項２】
前記プロモーターが、ＨＳＰ１０４プロモーターである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項３】
前記ＡＲＯ１遺伝子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＢＵＤ２３遺伝子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＰＭＲ１遺伝子が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＳＮＦ５遺伝子が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＧＯＮ７遺伝子が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＳＰＴ２０遺伝子が、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＣＢＳ２遺伝子が、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＤＢＦ２遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる、
請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項４】
前記プロモーターの上流に、前記ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子の上流領域のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項５】
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項６】
前記選択マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、および薬剤耐性マーカーからなる群より選択される、請求項５に記載の核酸カセット。
【請求項７】
前記栄養要求性マーカーが、ＵＲＡ３マーカーである、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項８】
前記５’末端フラグメントが、導入された酵母中のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子と相同組換えを生じるために十分な長さである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項９】
前記長さが、少なくとも４０ヌクレオチドである、請求項８に記載の核酸カセット。
【請求項１０】
前記長さが、少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項９に記載の核酸カセット。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項１２】
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造する方法であって、
酵母中に請求項１に記載の核酸カセットを導入する工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４５株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸カセットを含む、酵母。
【請求項１７】
サッカロミセス・セレビシェである、請求項１６に記載の酵母。
【請求項１８】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６からなる群より選択される株である、請求項１７に記載の酵母。
【請求項１９】
請求項１６に記載の酵母を含む、食品またはその材料。
【請求項２０】
パン、パン生地、アルコール、菓子類、漬物、および発酵調味料からなる群より選択される、請求項１９に記載の食品またはその材料。
【請求項２１】
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造するための、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの組合せの使用。
【請求項２２】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２５１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター；および
該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその５’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ；
を含む、核酸カセット。
【請求項２】
前記プロモーターが、ＨＳＰ１０４プロモーターである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項３】
前記ＡＲＯ１遺伝子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＢＵＤ２３遺伝子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＰＭＲ１遺伝子が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＳＮＦ５遺伝子が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＧＯＮ７遺伝子が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＳＰＴ２０遺伝子が、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＣＢＳ２遺伝子が、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記ＤＢＦ２遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる、
請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項４】
前記プロモーターの上流に、前記ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子の上流領域のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項５】
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項６】
前記選択マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、および薬剤耐性マーカーからなる群より選択される、請求項５に記載の核酸カセット。
【請求項７】
前記栄養要求性マーカーが、ＵＲＡ３マーカーである、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項８】
前記５’末端フラグメントが、導入された酵母中のＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子と相同組換えを生じるために十分な長さである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項９】
前記長さが、少なくとも４０ヌクレオチドである、請求項８に記載の核酸カセット。
【請求項１０】
前記長さが、少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項９に記載の核酸カセット。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項１２】
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造する方法であって、
酵母中に請求項１に記載の核酸カセットを導入する工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシェである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７４）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４５株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０１；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０１）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸カセットを含む、酵母。
【請求項１７】
サッカロミセス・セレビシェである、請求項１６に記載の酵母。
【請求項１８】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０４）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０５）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０３）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４０２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−４０２）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３３、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３４、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３５、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３６からなる群より選択される株である、請求項１７に記載の酵母。
【請求項１９】
請求項１６に記載の酵母を含む、食品またはその材料。
【請求項２０】
パン、パン生地、アルコール、菓子類、漬物、および発酵調味料からなる群より選択される、請求項１９に記載の食品またはその材料。
【請求項２１】
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造するための、ＡＲＯ１遺伝子、ＢＵＤ２３遺伝子、ＰＭＲ１遺伝子、ＳＮＦ５遺伝子、ＧＯＮ７遺伝子、ＳＰＴ２０遺伝子、ＣＢＳ２遺伝子、もしくはＤＢＦ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの組合せの使用。
【請求項２２】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２４９株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３１）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Ｙ２５１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６３２）である、請求項１３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−７２１８７（Ｐ２００９−７２１８７Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２０５２５（Ｐ２００８−２２０５２５）
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター委託研究による成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）」
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター委託研究による成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）」
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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