光学フィルタ、蛍光分析用フィルタセット及びその光学フィルタを用いた蛍光測定装置
【課題】スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するフィルタの透過領域の幅を広げ、より少ない積層数で必要な反射率を実現する。
【解決手段】使用波長領域において透明な基板と、その基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、その基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備えたことによって、スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するようにする。
【解決手段】使用波長領域において透明な基板と、その基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、その基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備えたことによって、スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するようにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は透明な基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもつ光学フィルタ、複数の光学フィルタを組み合わせた蛍光分析用フィルタセット及びその光学フィルタを用いた蛍光測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学フィルタ（以下では単にフィルタと称する。）として透明な基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもつものが用いられている。
【０００３】
フィルタは１波長帯を透過させ、その他の波長帯をカットする製品は数多く存在する。フィルタの用途は多々あるが、例えば蛍光分析においてそのようなフィルタを用いて２種類以上の蛍光試薬を検出するためには、後で詳細に述べるように、フィルタの機械的な切替え機構が必要となって光学系が複雑化するとともに、蛍光分析に支障をきたすことがある）。
【０００４】
複数の反射領域をもつフィルタも提案されている（特許文献１参照。）。そこでは、透明基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層されて形成された繰り返し層が２つ設けられ、それぞれの繰り返し層において高屈折率層の光学膜厚の平均値と低屈折率層の光学膜厚の平均値との和が垂直入射光に対するそれぞれの反射波長に略等しくなるように設定されている。具体的な例として、(0.55H 0.45L)27 0.55H 0.476L (0.619H 0.501L)27 0.619H 0.251L （λ＝４８８ｎｍとして）又は(0.489H 0.404L)27 0.489H 0.427L (0.55H 0.45L)27 0.55H 0.225L（λ＝５４３ｎｍとして）という膜設計値が挙げられている。この２通りの表記は２つの反射領域の中心波長λのそれぞれについて光学膜厚の表記をしたものであり、同一のフィルタの設計値を表している。記号Ｈ、Ｌはそれぞれ高屈折率層、低屈折率層、その前の数字はその層が設計の中心波長の何倍の光学膜厚をもつかを示し、括弧の右肩の数値（この例では「２７」）は括弧内の構成をその数値の回数だけ繰り返した構成であることを示している。
【特許文献１】特開２００６−２３４７１号公報
【特許文献２】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献３】特開２００１−２９９３６６号公報
【特許文献４】特開２００２−３００８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上に紹介した複数の反射領域をもつフィルタでは、透過領域及び反射領域の幅は積層膜構成自体により決まるので、帯域幅を広げるのに制約が大きい。また、上の例では所望の反射率を得るために１００層以上の膜構成となっており、物理的な膜厚にすると約１５μｍとなり、フィルタの生産性と再現性に問題がある。
【０００６】
本発明の１つの目的はスペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するフィルタであって、上に紹介した複数の反射領域をもつフィルタに比べて、透過領域の幅を広げるのが容易で、かつより少ない積層数で必要な反射率を実現することのできるフィルタを得ることである。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、本発明のフィルタを利用することにより構成が簡略化されるにも拘わらず測定精度の向上した蛍光測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、透明ガラス基板の一方の表面に短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタを成膜し、透明ガラス基板の他方の表面にノッチフィルタを成膜することにより、透過フィルタとノッチフィルタの組合せとして２つの透過領域と２つの反射領域をもつフィルタを形成しようとするものである。
【０００９】
すなわち、本発明のフィルタは、使用波長領域において透明な基板と、前記基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、前記基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、前記透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備えたことによって、スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するようにしたものである。
【００１０】
本発明では透過フィルタとノッチフィルタは基板のそれぞれの表面に互いに独立した積層構造として形成する。ノッチフィルタは１波長帯を反射し、その他の波長帯を透過させるよう設計を行う。短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタはノッチフィルタの短波長側又は長波長側の透過域の任意の波長から反射領域となるように設計を行う。これらの設計の組合わせにより、各フィルタの膜厚を薄くしても所望の反射率を達成することができ、生産性を向上させることができる。基板の片面に形成される積層膜の膜厚は、実施例に示した励起光フィルタでは片面の膜厚が約３μｍ、蛍光フィルタでは片面の膜厚が約５μｍである。先に紹介した複数の反射領域をもつフィルタでは、所望の反射率を得るためには膜厚が約１５μｍとなったのに比べるとかなり薄くなる。本発明では積層膜は基板の両面に形成されるので、両面の膜厚は片面の膜厚の合計となる。単純に片面の膜厚の２倍としても約１５μｍよりはかなり小さい。成膜工程は片面ずつ行うので、片面に形成される膜厚によって生産性が大きく影響を受ける。すなわち、基板の片面に形成される膜厚が厚くなると、連続して行う成膜時間の増加、蒸着材料などの消耗品の不足といったことが生じる。消耗品不足に対応するには、材料の自動供給装置など、特別な装置が必要になるからである。
【００１１】
また、透過フィルタにおける透過域と反射域との間の境界の波長（「所定の波長」と称しているもの。）とノッチフィルタの反射領域の中心波長は互いに独立して設定することができる。そして、ノッチフィルタの反射領域の中心波長を透過フィルタの所定の波長からどれくらい離して設定するかによって、透過フィルタの所定の波長からノッチフィルタの反射領域の間に存在する透過領域の幅を任意に設定することができる。
【００１２】
第１の形態は、透過フィルタが所定の波長よりも短波長側が透過域となっている短波長透過フィルタであり、透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の透過領域、第１の反射領域、第２の透過領域及び第２の反射領域となっているものである。
【００１３】
第２の形態は、透過フィルタが所定の波長よりも長波長側が透過域となっている長波長透過フィルタであり、透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の反射領域、第１の透過領域、第２の反射領域及び第２の透過領域となっているものである。
【００１４】
ノッチフィルタと短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタの設計の組合わせを変えることにより、後述する２波長帯用励起光フィルタ、２波長帯用蛍光フィルタ及び２波長帯用ダイクロイックフィルタの設計が可能となる。そして、本発明のフィルタセットは、２種類の蛍光試薬で標識された試料の分析を行う蛍光分析装置に使用されるものであり、好ましい第１の形態としては、２種類の蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる励起光フィルタ及び蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる蛍光フィルタであって、励起光フィルタ及び蛍光フィルタの少なくとも一方が本発明の光学フィルタからなることを特徴としている。励起光フィルタとして本発明の光学フィルタを用いる場合、本発明のフィルタセットには、２つの透過領域が２つの励起波長を含むように設計される一つの２波長帯用励起光フィルタを含む。蛍光フィルタとして本発明のフィルタを用いる場合、本発明のフィルタセットには、２つの透過領域が蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を含むように設計される一つの２波長帯用蛍光フィルタを含む。ここで、フィルタの透過領域が励起波長又は蛍光波長を「透過させる」又は「含む」というのは、フィルタの透過領域が励起波長域又は蛍光波長域よりも広くなければならないことを意味するものではなく、励起波長域の少なくとも一部又は蛍光波長域の少なくとも一部を透過させるという意味である。
【００１５】
本発明のフィルタセットの好ましい第２の形態としては、２種類の蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる励起光フィルタ、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる蛍光フィルタ、及び、それらの２つの励起波長を反射しそれらの蛍光波長を透過させるダイクロイックフィルタであって、励起光フィルタ、蛍光フィルタ及びダイクロイックフィルタの少なくともいずれかひとつのフィルタが本発明の光学フィルタからなることを特徴とする。特に、ダイクロイックフィルタに本発明のフィルタを用いる場合は、本発明のフィルタセットには、２つの反射領域に２つの励起波長が、２つの透過領域に２つの蛍光波長が含まれる、一つの２波長帯用ダイクロイックフィルタを含む。励起光フィルタ又は蛍光フィルタとして本発明の光学フィルタを用いる場合は、上述の通りである。
【００１６】
２波長帯用励起光フィルタ又は２波長帯用蛍光フィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域はスペクトル上で反射率９０％以上で交差する特性を有するように設定されている。本発明では透過領域又は反射領域の設定の自由度が高いので、そのような設定も容易である。その結果、励起光成分が試料で反射して蛍光フィルタに入射しても殆どが反射されるため、光源からの漏れ光が検出器に入射するのが低減する。さらに、２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域がスペクトル上で反射率９９％以上で交差する特性を有するように設定することもでき、その場合には光源からの漏れ光が検出器に入射するのをさらに抑えることができる。
【００１７】
２波長帯用ダイクロイックフィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、励起光フィルタと２波長帯ダイクロイックフィルタの反射領域はスペクトル上で反射率９０％以上で交差する特性を有するように設定されている。その結果、励起フィルタを透過した励起光成分を確実に試料に照射させることができる。さらに、励起光フィルタと２波長帯ダイクロイックフィルタの反射領域が９５％以上で交差する特性を有するように設定することもできる。この場合には、励起光フィルタを透過した励起光成分をさらに確実に試料に照射させることができる。
【００１８】
２波長帯蛍光フィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、２波長帯用蛍光フィルタは蛍光試薬の発光スペクトルをカバーするように透過領域幅が広げられている。本発明によれば透過領域幅はノッチフィルタと短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタの設計の組合わせにより設定できるので、透過領域幅を広げることが容易であるので、蛍光測定のように所望の透過領域幅に設定することができる。その結果、蛍光信号の増大を実現することができる。
【００１９】
このような好ましい第１及び第２の形態のフィルタセットを使用して蛍光測定を行えば、検出器における蛍光検出のＳ／Ｎ（信号対ノイズ）比が向上する。
【００２０】
本発明の蛍光測定装置は、第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置である。蛍光測定装置の第１の形態は、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置できるようにした励起光学系と、励起光学系に配置され、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、本発明の光学フィルタからなり、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの反射領域と、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもち、励起光学系からの励起光を試料方向に反射させ、試料からの蛍光を受光して透過させるように配置された単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタと、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定され、ダイクロイックフィルタを透過した蛍光を受光して透過させる位置に配置された蛍光フィルタと、蛍光フィルタを透過した蛍光を受光する位置に配置された光検出器とを備えている。ここで、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を「含む」光を発生する第１励起光源というのは、第１励起光源の発光スペクトルが、第１励起波長域よりも広くなければならないことを意味するものではなく、第１励起光源の発光スペクトルが第１励起波長域の少なくとも一部を含むという意味である。第２励起光源についても同様に解釈される。
【００２１】
この場合、励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された本発明の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることが好ましい。
【００２２】
蛍光測定装置の第２の形態は、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置して試料に照射する励起光学系と、励起光学系に配置され、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、試料から発生する蛍光を検出する検出器と、試料に対して励起光学系の反対側で試料からの蛍光を受光する位置に配置され、受光した蛍光を検出器へ導く蛍光受光光学系と、蛍光受光光学系に配置され、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された蛍光フィルタとを備え、励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された本発明の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである。
【００２３】
この蛍光測定装置の測定対象となる試料の一例はＤＮＡであり、測定項目は例えば一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のフィルタでは、所望の反射率を達成するための積層構造の膜厚を薄くすることができるので、生産性を向上させることができる。さらに、透過フィルタの所定の波長からノッチフィルタの反射領域の間に存在する透過領域の幅を任意に設定することができる。
【００２５】
本発明のフィルタセットを使用すれば、蛍光測定装置において従来は複数必要であったフィルタが統合でき、部品点数の削減と光学系の簡素化を図ることができる。
さらに、本発明の蛍光測定装置ではフィルタもダイクロイックフィルタも機械的な切換えを必要としないので、蛍光測定を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
２種類の蛍光試薬を用いて分析を行う蛍光測定装置に使用されるフィルタセットとしては、蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用励起光フィルタ、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用蛍光フィルタ、及び２つの励起波長を反射させる２つの反射領域と２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用ダイクロイックフィルタが必要である。そのような各フィルタの要求仕様の一例を表１〜表３に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
以下に設計例を示す。
フィルタの積層構造を構成する膜材料は、高屈折率膜材料がＴａ2Ｏ5（屈折率は波長に依存するが、約２．２）、ＴｉＯ2（屈折率は波長に依存するが、約２．４）、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2もしくはＡｌ2Ｏ3、又はこれらを含む混合物、低屈折率膜材料がＳｉＯ2（屈折率は波長に依存するが、約１．４６）又はその混合物である。ここでは、高屈折率膜材料としてＴａ2Ｏ5を使用し、低屈折率膜材料としてＳｉＯ2を使用する。基板は光学ガラスＢＫ７とした。
【００３１】
成膜は蒸着法により波長シフトの生じない手法で行い、基板温度を２５０℃とした。通常の蒸着方法では，膜の密度がバルク以下となる。密度が低いと隙間に水分などが進入し、使用環境によっては分光特性が変化（シフト）する。そこで、分光特性のシフトを抑制するために、イオンアシスト蒸着などのイオンプロセスなどを併用した蒸着を行うことで膜の充填密度をバルクの状態に近づけて水分の侵入を防止した。「波長シフトの生じない手法」とはそのような成膜方法を意味する。
【００３２】
（１）励起光フィルタの設計は以下の通りに行った。
励起光フィルタは基板の一方の表面に短波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００３３】
短波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｌ Ｈ ０．５Ｌ）18（中心波長λ＝６６３．０ｎｍとして）として設計を行った。ここで、記号ＨはＴａ2Ｏ5膜、記号ＬはＳｉＯ2膜であり、それぞれの前の数字（数字が記載されていないのは、「１」を表す。）はその層が設計の中心波長の１／４波長厚の何倍の光学膜厚をもつかを意味する。括弧の右肩の数値（この例では「１８」）は括弧内の構成をその数値の回数だけ繰り返すことを意味している。光学膜厚は物理的な膜厚とその膜材質の屈折率との積である。以下に示すベース膜構成の意味も同様である。なお、ベース膜構成とは最適化するための基礎になる設計（ベース設計）に基づく積層構成であることを意味している。
【００３４】
したがって、この短波長透過フィルタのベース膜構成は、最下層から順に（０．５Ｌ Ｈ Ｌ Ｈ Ｌ …… Ｈ ０．５Ｌ）というようにＳｉＯ2膜とＴａ2Ｏ5膜が交互に積層されて全体で３７層の積層構造となる。
【００３５】
そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。なお、図１中において、「Illumination: WHITE」は測定に用いた照射光が白色光であること、「Medium: AIR」は空気中での測定であること、「Substrate: BK7」は基板がＢＫ７ガラスであること、「Exit: BK7」は出射媒質がＢＫ７ガラスであること、「Detector: IDEAL」は検出器が完全（感度の波長依存性などがないこと）であること、「Angle: 0.0 (deg)」は測定光を基板に対して垂直方向から入射させたこと、「Reference: 663.0 (nm)」は６６３.０ｎｍを中心波長として積層構造を設計したこと、「Polarization: Ave -」は無偏光であること、「First surface: Front」は基板表面から光が入射することを意味している。
【００３６】
次に、このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った。最適化設計は積層構造の両端部の幾らかの層の膜厚を調整することにより行う。このベース膜構成の最適化だけでリップルが十分に低減できない場合は、さらに両端に幾らかの層を調整層として付加する。リップルを低減するための最適化設計方法は既知であり、市販のソフトウエアTF Calc（登録商標）（Spectra.Inc.社の製品）を使用して実行した。以下に示すフィルタの最適化設計も同様に実行した。
【００３７】
その最適化設計されたフィルタの光学特性を示すスペクトルを図２に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００３８】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）20（中心波長λ＝５２７．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図３に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００３９】
反射帯の幅は高屈折率材料と低屈折材料の屈折率の差で決まる。屈折率の差が大きいほど反射帯の幅は広がる。ただし、最適化設計によって反射帯の幅を広げることもできるが、製造上の膜厚誤差によっては反射帯の一部にリップルが生じ反射率が低下することもある。
【００４０】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図４に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４１】
このように最適化設計を行った短波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成した状態の励起光フィルタの光学特性を示すスペクトルを図５に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性の励起光フィルタは表１に示された要求仕様を満たしている。
【００４２】
（２）蛍光フィルタの設計は以下の通りに行った。
蛍光フィルタは基板の一方の表面に長波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００４３】
長波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｈ Ｌ ０．５Ｈ）17（中心波長λ＝４５０．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図６に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。
【００４４】
この設計を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図７に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４５】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）１７（中心波長λ＝５８５．０ｎｍとして）で設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図８に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００４６】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図９に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４７】
このように最適化設計を行った長波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成した蛍光フィルタの光学特性を示すスペクトルを図１０に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性の蛍光フィルタは表２に示された要求仕様を満たしている。
【００４８】
（３）ダイクロイックフィルタの設計は以下の通りに行った。
ダイクロイックフィルタは基板の一方の表面に長波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００４９】
長波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｈ Ｌ ０．５Ｈ）19（中心波長λ＝４９７．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１１に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。
【００５０】
この設計を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１２に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００５１】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）１７（中心波長λ＝６２５．０ｎｍとして）で設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１３に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００５２】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１４に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００５３】
このように最適化設計を行った長波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成したダイクロイックフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１５に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性のダイクロイックフィルタは表３に示された要求仕様を満たしている。
【００５４】
前述の設計を基に製作した励起光フィルタａ、蛍光フィルタｂ及びダイクロイックフィルタｃからなるフィルタセットの光学特性をいっしょにして図１６に示す。励起光フィルタａと蛍光フィルタｂの反射領域は反射率９９％程度で交差していることがわかる。また、励起光フィルタａとダイクロイックフィルタｃの反射領域は反射率９５％程度で交差していることがわかる。
【００５５】
図１７に既存のバンドパスフィルタと上述の実施例で作製した２波長帯用励起光フィルタ及び２波長帯用蛍光フィルタの光学特性を示す。ａは実施例の蛍光フィルタ、ｂは実施例の励起光フィルタである。ｃ〜ｆは既存のバンドパスフィルタであり、ｃは励起光フィルタ（黄色励起光用）、ｄは蛍光フィルタ（黄色励起光用）、ｅは励起光フィルタ（青色励起光用）、ｆは蛍光フィルタ（青色励起光用）である。実施例の各フィルタは、既存品と比較して透過領域幅は広く、透過率が高いことがわかる。実施例のフィルタと既存品を同じ蛍光測定装置に装着して比較した蛍光測定においても、実施例のフィルタは既存品より高い蛍光信号を得ることができた。
【００５６】
図１８にＬＥＤ及び蛍光試薬の吸収・放出波長帯の一例を示す。ａは蛍光試薬ＦＡＭの吸収スペクトル、ｂは同蛍光試薬ＦＡＭが放出する蛍光スペクトルであり、ｃは青色ＬＥＤの発光スペクトルである。これらのスペクトルから青色ＬＥＤによって蛍光試薬ＦＡＭを励起して蛍光を放出させることができる。また、ｄは蛍光試薬Redmond Redの吸収スペクトル、ｅは同蛍光試薬Redmond Redが放出する蛍光スペクトルであり、ｆは黄色ＬＥＤの発光スペクトルである。これらのスペクトルから黄色ＬＥＤによって蛍光試薬Redmond Redを励起して蛍光を放出させることができる。これらのＬＥＤ及び蛍光試薬を使用する限り、上記の実施例の各フィルタを含むフィルタセットを使用すれば良好なＳ／Ｎ比で蛍光測定を行うことができることがわかる。
【００５７】
次に、本発明のフィルタセットを用いるのに適した蛍光測定装置への適用例を示す。その好適な一例はＤＮＡの一塩基多型を検出する遺伝子多型検出装置である。
【００５８】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
【００５９】
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸試料を採取し、該試料中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献２参照。）。
【００６０】
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の分析のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、これらの多型性を参照することによりｆｌｔ−１リガンド仲介疾患を診断する（特許文献３参照。）。
【００６１】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
【００６２】
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献４参照。）。
【００６３】
これらの方法では、ＤＮＡの一塩基多型を検出するために蛍光試薬を用いることが一般的である。蛍光試薬を検出するためには、蛍光試薬を励起するための光源（励起光源）と、蛍光試薬から放出される光（蛍光）を検出するための検出器と、励起光源からの光が直接検出器に入るのを防ぐためのフィルタが必要である。
【００６４】
従来の蛍光試薬検出のための典型的な部品構成を図１９に示す。光源２からの光はコリメートレンズ４を通った後、第１のフィルタ（励起光フィルタ）６を透過することで、蛍光試薬の励起に必要な波長帯のみが選択的に取り出される。次にダイクロイックフィルタ８によって、蛍光試薬の励起に必要な波長帯のみが選択的に反射され、レンズ１０を通してサンプル１２に照射される。サンプル１２の蛍光試薬からの蛍光はレンズ１０で集められ、第２のフィルタ（ダイクロイックフィルタ８）によって蛍光の波長帯のみが選択的に透過する。ダイクロイックフィルタ８を透過した光は第３のフィルタ（蛍光フィルタ）１３によって蛍光以外の不要な光を除去した後に、レンズ１４を通して検出器１６に集められ検出される。
【００６５】
励起光源２にはレーザーやランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）などが用いられるが、近年では高輝度のＬＥＤを用いられることが多い。それはＬＥＤがレーザーよりも小型・安価で、さらにランプに比べて長寿命・高効率であるためである。
【００６６】
また、検出器１６には光電子増倍管（ホトマルチプライヤー：ＰＭＴ）、フォトダイオード（ＰＤ）又は用途に応じて電荷結合素子（ＣＣＤ）やＣ−ＭＯＳイメージセンサなどが主に使用される。
【００６７】
フィルタ６，８，１３はガラスなどの透明の基材に、真空蒸着などの方法によって薄膜を形成して、選択的に光を透過するようにしたものが使用される。
【００６８】
これらの光学部品の中でも特にフィルタ６，８，１３は蛍光測定の際の信号とノイズの比（Ｓ／Ｎ比）を決定付ける重要な部品であり、目的の蛍光物質の波長特性に適したものを選択する必要がある。また、光源２にレーザーやＬＥＤなどのスペクトル幅の比較的狭いものを使用する場合には、目的の蛍光物質が効率よく励起できるような波長帯のものを選ばなければならない。
【００６９】
これに対して、ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出において、対象とするサンプルが野生型のホモ、変異型のホモ、又はヘテロのいずれであるかを判別するためには、通常２種類以上の蛍光試薬が使用される。つまり、例えば野生型を検出するプローブには蛍光試薬Ａで標識しておき、変異型を検出するプローブには蛍光試薬Ｂで標識しておく。サンプルと２種類のプローブとを反応させた後に、蛍光試薬Ａからの信号と蛍光試薬Ｂからの信号をそれぞれ検出する。その結果、蛍光試薬Ａからの信号のみが得られた場合はそのサンプルが野生型のホモであることが分かる。同様にして、蛍光試薬Ｂからの信号のみが得られた場合は変異型のホモ、両方の蛍光試薬からの信号が得られた場合にはヘテロであることが分かる。
【００７０】
このように、光学部品は蛍光試薬個々に応じて特性の異なるものを選ぶ必要があるのに対して、ＳＮＰの検出のためには２種類以上の蛍光試薬を使用する必要がある。そのため、各々の蛍光試薬からの信号を検出するために、光学系を蛍光試薬ごとに複数搭載する方法や、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法が採られている。
【００７１】
２種類以上の蛍光試薬を検出するために、それぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法では、光学系全体が大型になる欠点がある。例えば２種類の蛍光試薬に対応した光学系を構成するためには、光源、検出器、フィルタ、レンズなど図１９に示す全ての部品を個別に配置しなければならないため、その大きさは１種類の蛍光試薬の光学系に比べて２倍の大きさになる。
【００７２】
また、蛍光試薬ごとに異なる光学系を使用するため、それぞれで光学部品の調整をする必要があり、手間がかかるだけでなく光学系ごとに調整のばらつきが大きく生じることになる。そのため、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その結果が調整のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７３】
さらに、蛍光試薬ごとに異なる光軸をもつ光学系から構成されるために、１つのサンプルに対して２種類以上の蛍光を測定するにはサンプル又は光学系の少なくともどちらか一方をモーターなどで動かす必要がある。モーターなどによる駆動のための機構が必要なため、装置が複雑かつ大型になるのに加えて、駆動の際の誤差が蛍光測定の誤差となり得る。これにより、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その計算結果が駆動のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７４】
以上のように、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、それぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法では、光学系だけでなくその周辺の機構部品が複雑になり、蛍光試薬間での測定のばらつきの原因となる。その結果としてＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点がある。
【００７５】
機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法は、主に複数のフィルタが搭載された円盤を、モーターなどで動かして目的の蛍光試薬に適した波長特性のものに切り換えることで実現される。この方法では複数の蛍光試薬に対してレンズや検出器といった部品が共通で使え、さらに複数の蛍光試薬を測定するためにサンプル又は光学系をモーターなどで駆動する必要がないため、前述の方法に比べてより安定した測定が可能であることが特長である。
【００７６】
ただし、複数のフィルタを蛍光試薬に応じて切り換える必要があるために、モーターなどの駆動部品が必要になり、さらに複数のフィルタを搭載した円盤も大きなものになってしまう。また、光学部品をモーターで動かすために測定が不安定になりがちである。特にタイクロイックフィルタを使用する構成では、サンプルに照射される励起光の光軸をそのダイクロイックフィルタで９０度に折り曲げることになるが、そのダイクロイックフィルタをモーターで切り換えた場合、少しの誤差が光軸の大きなズレとなることになる。これにより、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その計算結果が駆動のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７７】
以上のように、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法では、フィルタを切り換える機構部品が複雑になり、装置が大型・複雑なものになるという問題点がある。また、構成によっては蛍光測定が不安定になる可能性を含んでおり、ＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点がある。
【００７８】
上述の問題点を解決するために、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、２つ以上の波長帯を透過することのできる本発明の実施例のフィルタを使用した。例として、２種類の蛍光試薬を検出するための、２つの波長帯を透過することのできる励起光フィルタ、ダイクロイックフィルタ及び蛍光フィルタを使用した場合の構成を図２０に示す。この例では、光源として２種類のＬＥＤを使用し、検出器としてフォトダイオードを使用しているが、これに限定されるものではない。
【００７９】
蛍光試薬の励起効率が高い波長の２種類のＬＥＤ２０，２２を光源として使用する。サンプルを標識している蛍光試薬として、波長４７０〜４９０ｎｍ（青色）で励起したときに波長５１０〜５３０ｎｍ（緑色）の蛍光を発する蛍光試薬Ａと、波長５８０〜６００ｎｍ（黄色〜オレンジ）で励起したときに波長６２０〜６４０ｎｍ（赤色）の蛍光を発する蛍光試薬Ｂを使用した場合の例で考えると、この場合には青色のＬＥＤと黄色（又はオレンジ色）のＬＥＤを使用するのが適している。それらのＬＥＤ２０，２２からの光をそれぞれレンズ４ａ，４ｂによって平行光にした後、第１のダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にする。ここでのダイクロイックフィルタ２８は、黄色の波長帯を透過して青色の波長帯を反射させるような、所定の波長を境にして透過領域と反射領域に分かれた従来のダイクロイックフィルタでよい。
【００８０】
次に、青色と黄色の光を透過させて緑色と赤色の光を反射することのできる実施例の励起光フィルタ３０を通過させる。さらに青色と黄色の２つの波長帯を反射させて緑色と赤色を透過させることのできる実施例のダイクロイックフィルタ３２を経て下部に配置されたサンプル１２部分へ折り返される。その後、レンズ１０で集光され蛍光試薬で標識されたサンプル１２に照射される。
【００８１】
サンプル１２に励起光が照射され、青色と黄色の２つの光によってそれぞれ励起された２種類の蛍光試薬からの蛍光は、緑色と赤色というように異なる２つの波長を持っている。それらの光は再びサンプル部上方に配置されたレンズ１０で集光され、ダイクロイックフィルタ３２を透過する。その後、緑色と赤色の２つの波長帯を透過させて、青色と黄色を反射することのできる実施例の蛍光フィルタ３４を透過する。最終的にそれらの光はレンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。
【００８２】
蛍光試薬Ａの信号を検出する場合は青色のＬＥＤ２０のみを点灯させ、黄色のＬＥＤ２２は消灯させる。すると蛍光試薬Ａのみが青色ＬＥＤ２０によって励起されて蛍光を発し、一方蛍光試薬Ｂは励起されず蛍光を発することがない。こうすることで蛍光試薬Ａのみの信号を検出することができる。次に蛍光試薬Ｂの信号を検出する場合は黄色のＬＥＤ２２のみを点灯させ、青色のＬＥＤ２０は消灯させる。すると今度は逆に蛍光試薬Ｂのみが黄色ＬＥＤ２２によって励起されて蛍光を発し、逆に蛍光試薬Ａは励起されず、蛍光を発しない。このように、２種類のＬＥＤ２０，２２を点灯・消灯するだけで共通のフォトダイオード１６で２つの蛍光試薬からの信号をそれぞれ独立に読み取ることができる。
【００８３】
図２０の装置では光源として２種類のＬＥＤ２０，２２を備え、ＬＥＤ２０，２２からの励起光をそれぞれのレンズ４ａ，４ｂを経てダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にしているが、ダイクロイックフィルタ２８を使用しない構成とすることもできる。ダイクロイックフィルタ２８を使用しない構成では、ＬＥＤ２０とレンズ４ａを１組とし、ＬＥＤ２２とレンズ４ｂを他の１組として、それらの組を切り換えて光軸上に配置できるようにすればよい。
【００８４】
図２０に示した実験装置を用いて、２つの透過領域を持つフィルタがＳＮＰのアレル判定に有効であることを検証した。光源として５Ｗの青色（blue）及び黄色〜オレンジ（amber）の高輝度発光ダイオード（ＬＥＤ）２０，２２を使用した。使用したＬＥＤの発光スペクトルを図４（ａ）に示す。点灯されたＬＥＤ２０，２２からの光は直径２０ｍｍ、焦点距離３０ｍｍの平凸レンズ４ａ又は４ｂによって平行光にされてダイクロイックフィルタ２８で反射又は透過して励起光フィルタ３０に入射される。励起光フィルタ３０の透過特性は図２１（ｂ）に示すように、波長が４６０〜４９０ｎｍと５７０〜５９０ｎｍでは光を透過し、５２０〜５６０ｎｍと６２０ｎｍ〜では光を透過しない。このように異なる２つの透過領域を持ったフィルタ３０を用いることで、２種類のＬＥＤ２０，２２のいずれに対しても有効な特性を１枚のフィルタ３０で実現することができる。励起光フィルタ３０を透過した光は、次にダイクロイックフィルタ３２で図の下方向に折り返される。このダイクロイックフィルタ３２の透過特性を図２１（ｃ）に示す。このダイクロイックフィルタ３２では４５度の角度で入射した光のうち、波長が４６０〜４９０ｎｍと５７０−５９０ｎｍの光は反射され、５２０〜５６０ｎｍと６２０ｎｍ〜の光は透過する。ダイクロイックフィルタ３２で反射された光は直径１２ｍｍ、焦点距離１２ｍｍの平凸レンズで集光され、サンプル１２に照射される。
【００８５】
サンプル１２からの蛍光は同じ平凸レンズ１０で集光され、ダイクロイックフィルタ３２を透過し、さらに蛍光フィルタ３４に入射する。この蛍光フィルタ３４の透過特性を図２１（ｄ）に示す。この蛍光フィルタ３４は５２０〜５４０ｎｍと６３０〜６６０ｎｍでは光を透過させ、〜４９０ｎｍと５６０〜６００ｎｍでは光を透過させない。蛍光フィルタ３４を透過した光は直径１２ｍｍ、焦点距離１２ｍｍの平凸レンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。フォトダイオード１６からの電流は電流−電圧変換回路（図示略）で電圧信号に変換された後、デジタル電圧計（図示略）で測定を行う。
【００８６】
サンプルとして別の実験装置でインベーダ反応が既に終了している精製ＤＮＡを使用した。測定する部分に配置するプローブを標識する蛍光試薬としてＦＡＭとRedmond Redを使用した。これらの蛍光試薬の吸収スペクトルを図２２（ａ）に、発光スペクトルを図２２（ｂ）に示す。プローブのうち野生型を検出するためのプローブはＦＡＭで標識し、変異型を検出するためのプローブはRedmond Redで標識した。
【００８７】
ＦＡＭの測定に青色ＬＥＤ２０を使用し、Redmond Redの測定に黄色〜オレンジのＬＥＤ２２を使用して、サンプル１２の信号を検出した結果を図２３に示す。蛍光試薬からの蛍光は図中の「蛍光」で示され、サンプル部分での反射・散乱のノイズを図中の「反射・散乱光」で示す。「反射・散乱光」はサンプルの部分にサンプルに代えて水を配置して測定した結果である。このようにノイズに対して十分に大きな蛍光の信号を得ることができた。この測定の結果はＦＡＭからの蛍光とRedmond Redからの蛍光の両方が検出されたことを示しているので、ここで使用したサンプルはヘテロの型をもつものであるといえる。
【００８８】
２種類以上の蛍光試薬を検出するために、従来技術ではそれぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法が用いられていたが、光学系だけでなくその周辺の機構部品が複雑になり、蛍光試薬間での測定のばらつきの原因となっていた。また、その結果としてＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点があった。また従来技術の別の方法として用いられてきた、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法では、フィルタを切り換える機構部品が複雑になり、装置が大型・複雑なものになるという問題点があった。また、構成によっては蛍光測定が不安定になる可能性を含んでおり、ＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点があった。
【００８９】
それに対し、本発明の実施例のフィルタを使用した上記の方法では、レンズやフィルタ、検出器といった光学部品の大部分がいずれの蛍光試薬でも共通して用いられるために、蛍光試薬間での測定のばらつきを最小限にすることができる。また、複数の蛍光試薬を検出する際には複数のＬＥＤの点灯・消灯を行うだけであり、モーターなどの機構部品を必要としないために安定して測定が行えるだけでなく、装置を小型にすることができる。それらの結果、ＳＮＰのアレル判定が簡便かつ正確に行なうことができる。
【００９０】
図２４に示す蛍光検出装置に示すように、落射光学系で用いる励起光フィルタ、蛍光フィルタ及びダイクロイックフィルタのうち、例えば、ダイクロイックフィルタ３２にのみ本発明のダイクロイックフィルタを用いてもよい。その場合、励起光フィルタとしてはそれぞれ励起光の光路に単一の透過波長帯域をもつ励起光フィルタ３０ａ，３０ｂを配置する。また、蛍光受光側では、蛍光フィルタとしてもそれぞれの蛍光用に単一の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂを使用する。例えば、蛍光受光側では、ダイクロイックフィルタ３２を透過した蛍光を１つの透過域と１つの反射域をもつ通常のダイクロイックフィルタ２８ａを用いて蛍光の波長により２つの蛍光光路に分離し、一方の蛍光光路にはその蛍光用の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａを配置し、その蛍光フィルタ３４ａを透過した蛍光をレンズ１４ａで集光してフォトダイオード１６ａに入射させる。ダイクロイックフィルタ２８ａで分離された他方の蛍光光路にはその蛍光用の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ｂを配置し、その蛍光フィルタ３４ｂを透過した蛍光をレンズ１４ｂで集光してフォトダイオード１６ｂに入射させる。フォトダイオード１６ａ，１６ｂではそれぞれの蛍光が電気信号に変換される。
【００９１】
この実施例の場合でも、各励起光に応じたダイクロイックフィルタを光軸上に配置しなおす必要がなくなるため、装置の小型化に寄与できる。
【００９２】
図２４の実施例において、励起光フィルタ３０ａ，３０ｂに代えて本発明の２波長帯用励起光フィルタ３０を用いて図２０に示されるような励起光学系を組み合わせてもよい。
【００９３】
また、図２４の実施例において、蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂに代えて本発明の２波長帯用蛍光フィルタ３４を用いて図２０に示されるような蛍光受光光学系を組み合わせてもよい。
【００９４】
これまでの実施例はダイクロイックフィルタを使用した落射光学系を使用しているが、ダイクロイックフィルタを使用しなくても蛍光測定装置を実現することができる。図２５はダイクロイックフィルタを使用しない蛍光測定装置の一実施例である。
【００９５】
図２５に示される蛍光測定装置では、励起光フィルタとしては図２４の蛍光測定装置と同様にそれぞれ励起光の光路に単一の透過波長帯域をもつ励起光フィルタ３０ａ，３０ｂを配置し、蛍光受光側では図２０の実施例と同様に２つの波長帯を透過することのできる蛍光フィルタ３４を使用する。励起光学系のダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にされた励起光は、レンズ１０ａで集光され蛍光試薬で標識されたサンプル１２に斜め方向から照射される。
【００９６】
サンプル１２に励起光が照射され、それぞれの波長の励起光によってそれぞれ励起された２種類の蛍光試薬からの蛍光は、励起光学系とは反対側に配置された蛍光受光光学系のレンズ１０ｂで集光され、２つの波長帯に透過域をもつ実施例の蛍光フィルタ３４を透過する。最終的にそれらの光はレンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。この実施例では、蛍光受光光学系において検出器を共通化できるため、装置の小型化に寄与できる。
【００９７】
図２５に示される蛍光測定装置において、励起光学系として図２０の実施例と同様に２つの波長帯を透過することのできる励起光フィルタ３０を使用し、蛍光受光側では図２４の実施例と同様にレンズ１０ｂを透過した蛍光を１つの透過域と１つの反射域をもつ通常のダイクロイックフィルタ２８ａを用いて蛍光の波長により２つの蛍光光路に分離し、それぞれの蛍光光路に単一の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂをそれぞれ配置するようにしてもよい。この実施例では、励起光学系において励起光フィルタの数を減らすことができるので、やはり装置の小型化に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】励起光フィルタ用の短波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図２】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図３】励起光フィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図４】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図５】最適化設計された短波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例の励起光フィルタのスペクトルを示す図である。
【図６】蛍光フィルタ用の長波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図７】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図８】蛍光フィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図９】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１０】最適化設計された長波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例の蛍光フィルタのスペクトルを示す図である。
【図１１】ダイクロイックフィルタ用の長波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図１２】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１３】ダイクロイックフィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図１４】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１５】最適化設計された長波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例のダイクロイックフィルタのスペクトルを示す図である。
【図１６】同実施例で製作されたフィルタセットのスペクトルを示す図である。
【図１７】同実施例で製作された励起光フィルタと蛍光フィルタの光学特性を従来の既存の製品と比較して示すスペクトルの図である。
【図１８】２種類のＬＥＤ及び蛍光試薬の吸収・放出波長帯の一例のスペクトルを示す図である。
【図１９】従来の蛍光検出装置を示す概略構成図である。
【図２０】実施例のフィルタセットを使用した蛍光検出装置を示す概略構成図である。
【図２１】２種類のＬＥＤ及びフィルタセットのスペクトルを示す図である。
【図２２】２種類の蛍光試薬の吸収スペクトルと発光スペクトルを示す図である。
【図２３】インベーダ反応が終了したＤＮＡサンプルの測定結果を示す図である。
【図２４】実施例のフィルタを使用した蛍光検出装置の他の実施例を示す概略構成図である。
【図２５】実施例のフィルタを使用した蛍光検出装置のさらに他の実施例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００９９】
４ａ，４ｂ，１０，１０ａ，１０ｂ，１４ レンズ
１２ サンプル
１６ フォトダイオード
２０，２２ ＬＥＤ
２８，３２ ダイクロイックフィルタ
３０ 励起光フィルタ
３４ 蛍光フィルタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は透明な基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもつ光学フィルタ、複数の光学フィルタを組み合わせた蛍光分析用フィルタセット及びその光学フィルタを用いた蛍光測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学フィルタ（以下では単にフィルタと称する。）として透明な基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもつものが用いられている。
【０００３】
フィルタは１波長帯を透過させ、その他の波長帯をカットする製品は数多く存在する。フィルタの用途は多々あるが、例えば蛍光分析においてそのようなフィルタを用いて２種類以上の蛍光試薬を検出するためには、後で詳細に述べるように、フィルタの機械的な切替え機構が必要となって光学系が複雑化するとともに、蛍光分析に支障をきたすことがある）。
【０００４】
複数の反射領域をもつフィルタも提案されている（特許文献１参照。）。そこでは、透明基板上に高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層されて形成された繰り返し層が２つ設けられ、それぞれの繰り返し層において高屈折率層の光学膜厚の平均値と低屈折率層の光学膜厚の平均値との和が垂直入射光に対するそれぞれの反射波長に略等しくなるように設定されている。具体的な例として、(0.55H 0.45L)27 0.55H 0.476L (0.619H 0.501L)27 0.619H 0.251L （λ＝４８８ｎｍとして）又は(0.489H 0.404L)27 0.489H 0.427L (0.55H 0.45L)27 0.55H 0.225L（λ＝５４３ｎｍとして）という膜設計値が挙げられている。この２通りの表記は２つの反射領域の中心波長λのそれぞれについて光学膜厚の表記をしたものであり、同一のフィルタの設計値を表している。記号Ｈ、Ｌはそれぞれ高屈折率層、低屈折率層、その前の数字はその層が設計の中心波長の何倍の光学膜厚をもつかを示し、括弧の右肩の数値（この例では「２７」）は括弧内の構成をその数値の回数だけ繰り返した構成であることを示している。
【特許文献１】特開２００６−２３４７１号公報
【特許文献２】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献３】特開２００１−２９９３６６号公報
【特許文献４】特開２００２−３００８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上に紹介した複数の反射領域をもつフィルタでは、透過領域及び反射領域の幅は積層膜構成自体により決まるので、帯域幅を広げるのに制約が大きい。また、上の例では所望の反射率を得るために１００層以上の膜構成となっており、物理的な膜厚にすると約１５μｍとなり、フィルタの生産性と再現性に問題がある。
【０００６】
本発明の１つの目的はスペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するフィルタであって、上に紹介した複数の反射領域をもつフィルタに比べて、透過領域の幅を広げるのが容易で、かつより少ない積層数で必要な反射率を実現することのできるフィルタを得ることである。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、本発明のフィルタを利用することにより構成が簡略化されるにも拘わらず測定精度の向上した蛍光測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、透明ガラス基板の一方の表面に短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタを成膜し、透明ガラス基板の他方の表面にノッチフィルタを成膜することにより、透過フィルタとノッチフィルタの組合せとして２つの透過領域と２つの反射領域をもつフィルタを形成しようとするものである。
【０００９】
すなわち、本発明のフィルタは、使用波長領域において透明な基板と、前記基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、前記基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、前記透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備えたことによって、スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有するようにしたものである。
【００１０】
本発明では透過フィルタとノッチフィルタは基板のそれぞれの表面に互いに独立した積層構造として形成する。ノッチフィルタは１波長帯を反射し、その他の波長帯を透過させるよう設計を行う。短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタはノッチフィルタの短波長側又は長波長側の透過域の任意の波長から反射領域となるように設計を行う。これらの設計の組合わせにより、各フィルタの膜厚を薄くしても所望の反射率を達成することができ、生産性を向上させることができる。基板の片面に形成される積層膜の膜厚は、実施例に示した励起光フィルタでは片面の膜厚が約３μｍ、蛍光フィルタでは片面の膜厚が約５μｍである。先に紹介した複数の反射領域をもつフィルタでは、所望の反射率を得るためには膜厚が約１５μｍとなったのに比べるとかなり薄くなる。本発明では積層膜は基板の両面に形成されるので、両面の膜厚は片面の膜厚の合計となる。単純に片面の膜厚の２倍としても約１５μｍよりはかなり小さい。成膜工程は片面ずつ行うので、片面に形成される膜厚によって生産性が大きく影響を受ける。すなわち、基板の片面に形成される膜厚が厚くなると、連続して行う成膜時間の増加、蒸着材料などの消耗品の不足といったことが生じる。消耗品不足に対応するには、材料の自動供給装置など、特別な装置が必要になるからである。
【００１１】
また、透過フィルタにおける透過域と反射域との間の境界の波長（「所定の波長」と称しているもの。）とノッチフィルタの反射領域の中心波長は互いに独立して設定することができる。そして、ノッチフィルタの反射領域の中心波長を透過フィルタの所定の波長からどれくらい離して設定するかによって、透過フィルタの所定の波長からノッチフィルタの反射領域の間に存在する透過領域の幅を任意に設定することができる。
【００１２】
第１の形態は、透過フィルタが所定の波長よりも短波長側が透過域となっている短波長透過フィルタであり、透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の透過領域、第１の反射領域、第２の透過領域及び第２の反射領域となっているものである。
【００１３】
第２の形態は、透過フィルタが所定の波長よりも長波長側が透過域となっている長波長透過フィルタであり、透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の反射領域、第１の透過領域、第２の反射領域及び第２の透過領域となっているものである。
【００１４】
ノッチフィルタと短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタの設計の組合わせを変えることにより、後述する２波長帯用励起光フィルタ、２波長帯用蛍光フィルタ及び２波長帯用ダイクロイックフィルタの設計が可能となる。そして、本発明のフィルタセットは、２種類の蛍光試薬で標識された試料の分析を行う蛍光分析装置に使用されるものであり、好ましい第１の形態としては、２種類の蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる励起光フィルタ及び蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる蛍光フィルタであって、励起光フィルタ及び蛍光フィルタの少なくとも一方が本発明の光学フィルタからなることを特徴としている。励起光フィルタとして本発明の光学フィルタを用いる場合、本発明のフィルタセットには、２つの透過領域が２つの励起波長を含むように設計される一つの２波長帯用励起光フィルタを含む。蛍光フィルタとして本発明のフィルタを用いる場合、本発明のフィルタセットには、２つの透過領域が蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を含むように設計される一つの２波長帯用蛍光フィルタを含む。ここで、フィルタの透過領域が励起波長又は蛍光波長を「透過させる」又は「含む」というのは、フィルタの透過領域が励起波長域又は蛍光波長域よりも広くなければならないことを意味するものではなく、励起波長域の少なくとも一部又は蛍光波長域の少なくとも一部を透過させるという意味である。
【００１５】
本発明のフィルタセットの好ましい第２の形態としては、２種類の蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる励起光フィルタ、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる蛍光フィルタ、及び、それらの２つの励起波長を反射しそれらの蛍光波長を透過させるダイクロイックフィルタであって、励起光フィルタ、蛍光フィルタ及びダイクロイックフィルタの少なくともいずれかひとつのフィルタが本発明の光学フィルタからなることを特徴とする。特に、ダイクロイックフィルタに本発明のフィルタを用いる場合は、本発明のフィルタセットには、２つの反射領域に２つの励起波長が、２つの透過領域に２つの蛍光波長が含まれる、一つの２波長帯用ダイクロイックフィルタを含む。励起光フィルタ又は蛍光フィルタとして本発明の光学フィルタを用いる場合は、上述の通りである。
【００１６】
２波長帯用励起光フィルタ又は２波長帯用蛍光フィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域はスペクトル上で反射率９０％以上で交差する特性を有するように設定されている。本発明では透過領域又は反射領域の設定の自由度が高いので、そのような設定も容易である。その結果、励起光成分が試料で反射して蛍光フィルタに入射しても殆どが反射されるため、光源からの漏れ光が検出器に入射するのが低減する。さらに、２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域がスペクトル上で反射率９９％以上で交差する特性を有するように設定することもでき、その場合には光源からの漏れ光が検出器に入射するのをさらに抑えることができる。
【００１７】
２波長帯用ダイクロイックフィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、励起光フィルタと２波長帯ダイクロイックフィルタの反射領域はスペクトル上で反射率９０％以上で交差する特性を有するように設定されている。その結果、励起フィルタを透過した励起光成分を確実に試料に照射させることができる。さらに、励起光フィルタと２波長帯ダイクロイックフィルタの反射領域が９５％以上で交差する特性を有するように設定することもできる。この場合には、励起光フィルタを透過した励起光成分をさらに確実に試料に照射させることができる。
【００１８】
２波長帯蛍光フィルタを含むフィルタセットでは、好ましくは、２波長帯用蛍光フィルタは蛍光試薬の発光スペクトルをカバーするように透過領域幅が広げられている。本発明によれば透過領域幅はノッチフィルタと短波長透過フィルタ又は長波長透過フィルタの設計の組合わせにより設定できるので、透過領域幅を広げることが容易であるので、蛍光測定のように所望の透過領域幅に設定することができる。その結果、蛍光信号の増大を実現することができる。
【００１９】
このような好ましい第１及び第２の形態のフィルタセットを使用して蛍光測定を行えば、検出器における蛍光検出のＳ／Ｎ（信号対ノイズ）比が向上する。
【００２０】
本発明の蛍光測定装置は、第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置である。蛍光測定装置の第１の形態は、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置できるようにした励起光学系と、励起光学系に配置され、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、本発明の光学フィルタからなり、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの反射領域と、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもち、励起光学系からの励起光を試料方向に反射させ、試料からの蛍光を受光して透過させるように配置された単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタと、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定され、ダイクロイックフィルタを透過した蛍光を受光して透過させる位置に配置された蛍光フィルタと、蛍光フィルタを透過した蛍光を受光する位置に配置された光検出器とを備えている。ここで、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を「含む」光を発生する第１励起光源というのは、第１励起光源の発光スペクトルが、第１励起波長域よりも広くなければならないことを意味するものではなく、第１励起光源の発光スペクトルが第１励起波長域の少なくとも一部を含むという意味である。第２励起光源についても同様に解釈される。
【００２１】
この場合、励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された本発明の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることが好ましい。
【００２２】
蛍光測定装置の第２の形態は、第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置して試料に照射する励起光学系と、励起光学系に配置され、第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、試料から発生する蛍光を検出する検出器と、試料に対して励起光学系の反対側で試料からの蛍光を受光する位置に配置され、受光した蛍光を検出器へ導く蛍光受光光学系と、蛍光受光光学系に配置され、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された蛍光フィルタとを備え、励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された本発明の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである。
【００２３】
この蛍光測定装置の測定対象となる試料の一例はＤＮＡであり、測定項目は例えば一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のフィルタでは、所望の反射率を達成するための積層構造の膜厚を薄くすることができるので、生産性を向上させることができる。さらに、透過フィルタの所定の波長からノッチフィルタの反射領域の間に存在する透過領域の幅を任意に設定することができる。
【００２５】
本発明のフィルタセットを使用すれば、蛍光測定装置において従来は複数必要であったフィルタが統合でき、部品点数の削減と光学系の簡素化を図ることができる。
さらに、本発明の蛍光測定装置ではフィルタもダイクロイックフィルタも機械的な切換えを必要としないので、蛍光測定を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
２種類の蛍光試薬を用いて分析を行う蛍光測定装置に使用されるフィルタセットとしては、蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用励起光フィルタ、蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用蛍光フィルタ、及び２つの励起波長を反射させる２つの反射領域と２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつ２波長帯用ダイクロイックフィルタが必要である。そのような各フィルタの要求仕様の一例を表１〜表３に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
以下に設計例を示す。
フィルタの積層構造を構成する膜材料は、高屈折率膜材料がＴａ2Ｏ5（屈折率は波長に依存するが、約２．２）、ＴｉＯ2（屈折率は波長に依存するが、約２．４）、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2もしくはＡｌ2Ｏ3、又はこれらを含む混合物、低屈折率膜材料がＳｉＯ2（屈折率は波長に依存するが、約１．４６）又はその混合物である。ここでは、高屈折率膜材料としてＴａ2Ｏ5を使用し、低屈折率膜材料としてＳｉＯ2を使用する。基板は光学ガラスＢＫ７とした。
【００３１】
成膜は蒸着法により波長シフトの生じない手法で行い、基板温度を２５０℃とした。通常の蒸着方法では，膜の密度がバルク以下となる。密度が低いと隙間に水分などが進入し、使用環境によっては分光特性が変化（シフト）する。そこで、分光特性のシフトを抑制するために、イオンアシスト蒸着などのイオンプロセスなどを併用した蒸着を行うことで膜の充填密度をバルクの状態に近づけて水分の侵入を防止した。「波長シフトの生じない手法」とはそのような成膜方法を意味する。
【００３２】
（１）励起光フィルタの設計は以下の通りに行った。
励起光フィルタは基板の一方の表面に短波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００３３】
短波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｌ Ｈ ０．５Ｌ）18（中心波長λ＝６６３．０ｎｍとして）として設計を行った。ここで、記号ＨはＴａ2Ｏ5膜、記号ＬはＳｉＯ2膜であり、それぞれの前の数字（数字が記載されていないのは、「１」を表す。）はその層が設計の中心波長の１／４波長厚の何倍の光学膜厚をもつかを意味する。括弧の右肩の数値（この例では「１８」）は括弧内の構成をその数値の回数だけ繰り返すことを意味している。光学膜厚は物理的な膜厚とその膜材質の屈折率との積である。以下に示すベース膜構成の意味も同様である。なお、ベース膜構成とは最適化するための基礎になる設計（ベース設計）に基づく積層構成であることを意味している。
【００３４】
したがって、この短波長透過フィルタのベース膜構成は、最下層から順に（０．５Ｌ Ｈ Ｌ Ｈ Ｌ …… Ｈ ０．５Ｌ）というようにＳｉＯ2膜とＴａ2Ｏ5膜が交互に積層されて全体で３７層の積層構造となる。
【００３５】
そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。なお、図１中において、「Illumination: WHITE」は測定に用いた照射光が白色光であること、「Medium: AIR」は空気中での測定であること、「Substrate: BK7」は基板がＢＫ７ガラスであること、「Exit: BK7」は出射媒質がＢＫ７ガラスであること、「Detector: IDEAL」は検出器が完全（感度の波長依存性などがないこと）であること、「Angle: 0.0 (deg)」は測定光を基板に対して垂直方向から入射させたこと、「Reference: 663.0 (nm)」は６６３.０ｎｍを中心波長として積層構造を設計したこと、「Polarization: Ave -」は無偏光であること、「First surface: Front」は基板表面から光が入射することを意味している。
【００３６】
次に、このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った。最適化設計は積層構造の両端部の幾らかの層の膜厚を調整することにより行う。このベース膜構成の最適化だけでリップルが十分に低減できない場合は、さらに両端に幾らかの層を調整層として付加する。リップルを低減するための最適化設計方法は既知であり、市販のソフトウエアTF Calc（登録商標）（Spectra.Inc.社の製品）を使用して実行した。以下に示すフィルタの最適化設計も同様に実行した。
【００３７】
その最適化設計されたフィルタの光学特性を示すスペクトルを図２に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００３８】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）20（中心波長λ＝５２７．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図３に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００３９】
反射帯の幅は高屈折率材料と低屈折材料の屈折率の差で決まる。屈折率の差が大きいほど反射帯の幅は広がる。ただし、最適化設計によって反射帯の幅を広げることもできるが、製造上の膜厚誤差によっては反射帯の一部にリップルが生じ反射率が低下することもある。
【００４０】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図４に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４１】
このように最適化設計を行った短波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成した状態の励起光フィルタの光学特性を示すスペクトルを図５に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性の励起光フィルタは表１に示された要求仕様を満たしている。
【００４２】
（２）蛍光フィルタの設計は以下の通りに行った。
蛍光フィルタは基板の一方の表面に長波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００４３】
長波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｈ Ｌ ０．５Ｈ）17（中心波長λ＝４５０．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図６に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。
【００４４】
この設計を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図７に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４５】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）１７（中心波長λ＝５８５．０ｎｍとして）で設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図８に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００４６】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図９に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００４７】
このように最適化設計を行った長波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成した蛍光フィルタの光学特性を示すスペクトルを図１０に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性の蛍光フィルタは表２に示された要求仕様を満たしている。
【００４８】
（３）ダイクロイックフィルタの設計は以下の通りに行った。
ダイクロイックフィルタは基板の一方の表面に長波長透過フィルタを形成し、基板の他方の表面にノッチフィルタを形成することにより製作した。
【００４９】
長波長透過フィルタのベース膜構成を（０．５Ｈ Ｌ ０．５Ｈ）19（中心波長λ＝４９７．０ｎｍとして）として設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１１に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射域に近い側の透過域にリップルが発生している。
【００５０】
この設計を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１２に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００５１】
ノッチフィルタのベース膜構成を（Ｌ ３Ｈ）１７（中心波長λ＝６２５．０ｎｍとして）で設計を行った。そのフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１３に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この設計のベース膜構成では、その光学特性は反射領域の両側の透過域で反射領域に近い側にリップルが発生している。
【００５２】
このベース膜構成を基にリップルの低減を図るため最適化設計を行った後のフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１４に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。反射領域に近い側の透過域にあったリップルが低減しているのがわかる。
【００５３】
このように最適化設計を行った長波長透過フィルタをガラス基板の一方の表面に形成し、最適化設計を行ったノッチフィルタをそのガラス基板の他方の表面に形成したダイクロイックフィルタの光学特性を示すスペクトルを図１５に示す。縦軸は透過率（％）、横軸は波長（ｎｍ）である。この光学特性のダイクロイックフィルタは表３に示された要求仕様を満たしている。
【００５４】
前述の設計を基に製作した励起光フィルタａ、蛍光フィルタｂ及びダイクロイックフィルタｃからなるフィルタセットの光学特性をいっしょにして図１６に示す。励起光フィルタａと蛍光フィルタｂの反射領域は反射率９９％程度で交差していることがわかる。また、励起光フィルタａとダイクロイックフィルタｃの反射領域は反射率９５％程度で交差していることがわかる。
【００５５】
図１７に既存のバンドパスフィルタと上述の実施例で作製した２波長帯用励起光フィルタ及び２波長帯用蛍光フィルタの光学特性を示す。ａは実施例の蛍光フィルタ、ｂは実施例の励起光フィルタである。ｃ〜ｆは既存のバンドパスフィルタであり、ｃは励起光フィルタ（黄色励起光用）、ｄは蛍光フィルタ（黄色励起光用）、ｅは励起光フィルタ（青色励起光用）、ｆは蛍光フィルタ（青色励起光用）である。実施例の各フィルタは、既存品と比較して透過領域幅は広く、透過率が高いことがわかる。実施例のフィルタと既存品を同じ蛍光測定装置に装着して比較した蛍光測定においても、実施例のフィルタは既存品より高い蛍光信号を得ることができた。
【００５６】
図１８にＬＥＤ及び蛍光試薬の吸収・放出波長帯の一例を示す。ａは蛍光試薬ＦＡＭの吸収スペクトル、ｂは同蛍光試薬ＦＡＭが放出する蛍光スペクトルであり、ｃは青色ＬＥＤの発光スペクトルである。これらのスペクトルから青色ＬＥＤによって蛍光試薬ＦＡＭを励起して蛍光を放出させることができる。また、ｄは蛍光試薬Redmond Redの吸収スペクトル、ｅは同蛍光試薬Redmond Redが放出する蛍光スペクトルであり、ｆは黄色ＬＥＤの発光スペクトルである。これらのスペクトルから黄色ＬＥＤによって蛍光試薬Redmond Redを励起して蛍光を放出させることができる。これらのＬＥＤ及び蛍光試薬を使用する限り、上記の実施例の各フィルタを含むフィルタセットを使用すれば良好なＳ／Ｎ比で蛍光測定を行うことができることがわかる。
【００５７】
次に、本発明のフィルタセットを用いるのに適した蛍光測定装置への適用例を示す。その好適な一例はＤＮＡの一塩基多型を検出する遺伝子多型検出装置である。
【００５８】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
【００５９】
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸試料を採取し、該試料中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献２参照。）。
【００６０】
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の分析のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、これらの多型性を参照することによりｆｌｔ−１リガンド仲介疾患を診断する（特許文献３参照。）。
【００６１】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
【００６２】
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献４参照。）。
【００６３】
これらの方法では、ＤＮＡの一塩基多型を検出するために蛍光試薬を用いることが一般的である。蛍光試薬を検出するためには、蛍光試薬を励起するための光源（励起光源）と、蛍光試薬から放出される光（蛍光）を検出するための検出器と、励起光源からの光が直接検出器に入るのを防ぐためのフィルタが必要である。
【００６４】
従来の蛍光試薬検出のための典型的な部品構成を図１９に示す。光源２からの光はコリメートレンズ４を通った後、第１のフィルタ（励起光フィルタ）６を透過することで、蛍光試薬の励起に必要な波長帯のみが選択的に取り出される。次にダイクロイックフィルタ８によって、蛍光試薬の励起に必要な波長帯のみが選択的に反射され、レンズ１０を通してサンプル１２に照射される。サンプル１２の蛍光試薬からの蛍光はレンズ１０で集められ、第２のフィルタ（ダイクロイックフィルタ８）によって蛍光の波長帯のみが選択的に透過する。ダイクロイックフィルタ８を透過した光は第３のフィルタ（蛍光フィルタ）１３によって蛍光以外の不要な光を除去した後に、レンズ１４を通して検出器１６に集められ検出される。
【００６５】
励起光源２にはレーザーやランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）などが用いられるが、近年では高輝度のＬＥＤを用いられることが多い。それはＬＥＤがレーザーよりも小型・安価で、さらにランプに比べて長寿命・高効率であるためである。
【００６６】
また、検出器１６には光電子増倍管（ホトマルチプライヤー：ＰＭＴ）、フォトダイオード（ＰＤ）又は用途に応じて電荷結合素子（ＣＣＤ）やＣ−ＭＯＳイメージセンサなどが主に使用される。
【００６７】
フィルタ６，８，１３はガラスなどの透明の基材に、真空蒸着などの方法によって薄膜を形成して、選択的に光を透過するようにしたものが使用される。
【００６８】
これらの光学部品の中でも特にフィルタ６，８，１３は蛍光測定の際の信号とノイズの比（Ｓ／Ｎ比）を決定付ける重要な部品であり、目的の蛍光物質の波長特性に適したものを選択する必要がある。また、光源２にレーザーやＬＥＤなどのスペクトル幅の比較的狭いものを使用する場合には、目的の蛍光物質が効率よく励起できるような波長帯のものを選ばなければならない。
【００６９】
これに対して、ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出において、対象とするサンプルが野生型のホモ、変異型のホモ、又はヘテロのいずれであるかを判別するためには、通常２種類以上の蛍光試薬が使用される。つまり、例えば野生型を検出するプローブには蛍光試薬Ａで標識しておき、変異型を検出するプローブには蛍光試薬Ｂで標識しておく。サンプルと２種類のプローブとを反応させた後に、蛍光試薬Ａからの信号と蛍光試薬Ｂからの信号をそれぞれ検出する。その結果、蛍光試薬Ａからの信号のみが得られた場合はそのサンプルが野生型のホモであることが分かる。同様にして、蛍光試薬Ｂからの信号のみが得られた場合は変異型のホモ、両方の蛍光試薬からの信号が得られた場合にはヘテロであることが分かる。
【００７０】
このように、光学部品は蛍光試薬個々に応じて特性の異なるものを選ぶ必要があるのに対して、ＳＮＰの検出のためには２種類以上の蛍光試薬を使用する必要がある。そのため、各々の蛍光試薬からの信号を検出するために、光学系を蛍光試薬ごとに複数搭載する方法や、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法が採られている。
【００７１】
２種類以上の蛍光試薬を検出するために、それぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法では、光学系全体が大型になる欠点がある。例えば２種類の蛍光試薬に対応した光学系を構成するためには、光源、検出器、フィルタ、レンズなど図１９に示す全ての部品を個別に配置しなければならないため、その大きさは１種類の蛍光試薬の光学系に比べて２倍の大きさになる。
【００７２】
また、蛍光試薬ごとに異なる光学系を使用するため、それぞれで光学部品の調整をする必要があり、手間がかかるだけでなく光学系ごとに調整のばらつきが大きく生じることになる。そのため、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その結果が調整のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７３】
さらに、蛍光試薬ごとに異なる光軸をもつ光学系から構成されるために、１つのサンプルに対して２種類以上の蛍光を測定するにはサンプル又は光学系の少なくともどちらか一方をモーターなどで動かす必要がある。モーターなどによる駆動のための機構が必要なため、装置が複雑かつ大型になるのに加えて、駆動の際の誤差が蛍光測定の誤差となり得る。これにより、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その計算結果が駆動のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７４】
以上のように、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、それぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法では、光学系だけでなくその周辺の機構部品が複雑になり、蛍光試薬間での測定のばらつきの原因となる。その結果としてＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点がある。
【００７５】
機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法は、主に複数のフィルタが搭載された円盤を、モーターなどで動かして目的の蛍光試薬に適した波長特性のものに切り換えることで実現される。この方法では複数の蛍光試薬に対してレンズや検出器といった部品が共通で使え、さらに複数の蛍光試薬を測定するためにサンプル又は光学系をモーターなどで駆動する必要がないため、前述の方法に比べてより安定した測定が可能であることが特長である。
【００７６】
ただし、複数のフィルタを蛍光試薬に応じて切り換える必要があるために、モーターなどの駆動部品が必要になり、さらに複数のフィルタを搭載した円盤も大きなものになってしまう。また、光学部品をモーターで動かすために測定が不安定になりがちである。特にタイクロイックフィルタを使用する構成では、サンプルに照射される励起光の光軸をそのダイクロイックフィルタで９０度に折り曲げることになるが、そのダイクロイックフィルタをモーターで切り換えた場合、少しの誤差が光軸の大きなズレとなることになる。これにより、ＳＮＰのアレル判定のために複数の蛍光試薬の間での蛍光信号の比を計算する際に、その計算結果が駆動のバラつきを大きく反映したものとなり、正しいＳＮＰのアレル判定を困難なものにしている。
【００７７】
以上のように、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法では、フィルタを切り換える機構部品が複雑になり、装置が大型・複雑なものになるという問題点がある。また、構成によっては蛍光測定が不安定になる可能性を含んでおり、ＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点がある。
【００７８】
上述の問題点を解決するために、２種類以上の蛍光試薬を検出するために、２つ以上の波長帯を透過することのできる本発明の実施例のフィルタを使用した。例として、２種類の蛍光試薬を検出するための、２つの波長帯を透過することのできる励起光フィルタ、ダイクロイックフィルタ及び蛍光フィルタを使用した場合の構成を図２０に示す。この例では、光源として２種類のＬＥＤを使用し、検出器としてフォトダイオードを使用しているが、これに限定されるものではない。
【００７９】
蛍光試薬の励起効率が高い波長の２種類のＬＥＤ２０，２２を光源として使用する。サンプルを標識している蛍光試薬として、波長４７０〜４９０ｎｍ（青色）で励起したときに波長５１０〜５３０ｎｍ（緑色）の蛍光を発する蛍光試薬Ａと、波長５８０〜６００ｎｍ（黄色〜オレンジ）で励起したときに波長６２０〜６４０ｎｍ（赤色）の蛍光を発する蛍光試薬Ｂを使用した場合の例で考えると、この場合には青色のＬＥＤと黄色（又はオレンジ色）のＬＥＤを使用するのが適している。それらのＬＥＤ２０，２２からの光をそれぞれレンズ４ａ，４ｂによって平行光にした後、第１のダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にする。ここでのダイクロイックフィルタ２８は、黄色の波長帯を透過して青色の波長帯を反射させるような、所定の波長を境にして透過領域と反射領域に分かれた従来のダイクロイックフィルタでよい。
【００８０】
次に、青色と黄色の光を透過させて緑色と赤色の光を反射することのできる実施例の励起光フィルタ３０を通過させる。さらに青色と黄色の２つの波長帯を反射させて緑色と赤色を透過させることのできる実施例のダイクロイックフィルタ３２を経て下部に配置されたサンプル１２部分へ折り返される。その後、レンズ１０で集光され蛍光試薬で標識されたサンプル１２に照射される。
【００８１】
サンプル１２に励起光が照射され、青色と黄色の２つの光によってそれぞれ励起された２種類の蛍光試薬からの蛍光は、緑色と赤色というように異なる２つの波長を持っている。それらの光は再びサンプル部上方に配置されたレンズ１０で集光され、ダイクロイックフィルタ３２を透過する。その後、緑色と赤色の２つの波長帯を透過させて、青色と黄色を反射することのできる実施例の蛍光フィルタ３４を透過する。最終的にそれらの光はレンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。
【００８２】
蛍光試薬Ａの信号を検出する場合は青色のＬＥＤ２０のみを点灯させ、黄色のＬＥＤ２２は消灯させる。すると蛍光試薬Ａのみが青色ＬＥＤ２０によって励起されて蛍光を発し、一方蛍光試薬Ｂは励起されず蛍光を発することがない。こうすることで蛍光試薬Ａのみの信号を検出することができる。次に蛍光試薬Ｂの信号を検出する場合は黄色のＬＥＤ２２のみを点灯させ、青色のＬＥＤ２０は消灯させる。すると今度は逆に蛍光試薬Ｂのみが黄色ＬＥＤ２２によって励起されて蛍光を発し、逆に蛍光試薬Ａは励起されず、蛍光を発しない。このように、２種類のＬＥＤ２０，２２を点灯・消灯するだけで共通のフォトダイオード１６で２つの蛍光試薬からの信号をそれぞれ独立に読み取ることができる。
【００８３】
図２０の装置では光源として２種類のＬＥＤ２０，２２を備え、ＬＥＤ２０，２２からの励起光をそれぞれのレンズ４ａ，４ｂを経てダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にしているが、ダイクロイックフィルタ２８を使用しない構成とすることもできる。ダイクロイックフィルタ２８を使用しない構成では、ＬＥＤ２０とレンズ４ａを１組とし、ＬＥＤ２２とレンズ４ｂを他の１組として、それらの組を切り換えて光軸上に配置できるようにすればよい。
【００８４】
図２０に示した実験装置を用いて、２つの透過領域を持つフィルタがＳＮＰのアレル判定に有効であることを検証した。光源として５Ｗの青色（blue）及び黄色〜オレンジ（amber）の高輝度発光ダイオード（ＬＥＤ）２０，２２を使用した。使用したＬＥＤの発光スペクトルを図４（ａ）に示す。点灯されたＬＥＤ２０，２２からの光は直径２０ｍｍ、焦点距離３０ｍｍの平凸レンズ４ａ又は４ｂによって平行光にされてダイクロイックフィルタ２８で反射又は透過して励起光フィルタ３０に入射される。励起光フィルタ３０の透過特性は図２１（ｂ）に示すように、波長が４６０〜４９０ｎｍと５７０〜５９０ｎｍでは光を透過し、５２０〜５６０ｎｍと６２０ｎｍ〜では光を透過しない。このように異なる２つの透過領域を持ったフィルタ３０を用いることで、２種類のＬＥＤ２０，２２のいずれに対しても有効な特性を１枚のフィルタ３０で実現することができる。励起光フィルタ３０を透過した光は、次にダイクロイックフィルタ３２で図の下方向に折り返される。このダイクロイックフィルタ３２の透過特性を図２１（ｃ）に示す。このダイクロイックフィルタ３２では４５度の角度で入射した光のうち、波長が４６０〜４９０ｎｍと５７０−５９０ｎｍの光は反射され、５２０〜５６０ｎｍと６２０ｎｍ〜の光は透過する。ダイクロイックフィルタ３２で反射された光は直径１２ｍｍ、焦点距離１２ｍｍの平凸レンズで集光され、サンプル１２に照射される。
【００８５】
サンプル１２からの蛍光は同じ平凸レンズ１０で集光され、ダイクロイックフィルタ３２を透過し、さらに蛍光フィルタ３４に入射する。この蛍光フィルタ３４の透過特性を図２１（ｄ）に示す。この蛍光フィルタ３４は５２０〜５４０ｎｍと６３０〜６６０ｎｍでは光を透過させ、〜４９０ｎｍと５６０〜６００ｎｍでは光を透過させない。蛍光フィルタ３４を透過した光は直径１２ｍｍ、焦点距離１２ｍｍの平凸レンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。フォトダイオード１６からの電流は電流−電圧変換回路（図示略）で電圧信号に変換された後、デジタル電圧計（図示略）で測定を行う。
【００８６】
サンプルとして別の実験装置でインベーダ反応が既に終了している精製ＤＮＡを使用した。測定する部分に配置するプローブを標識する蛍光試薬としてＦＡＭとRedmond Redを使用した。これらの蛍光試薬の吸収スペクトルを図２２（ａ）に、発光スペクトルを図２２（ｂ）に示す。プローブのうち野生型を検出するためのプローブはＦＡＭで標識し、変異型を検出するためのプローブはRedmond Redで標識した。
【００８７】
ＦＡＭの測定に青色ＬＥＤ２０を使用し、Redmond Redの測定に黄色〜オレンジのＬＥＤ２２を使用して、サンプル１２の信号を検出した結果を図２３に示す。蛍光試薬からの蛍光は図中の「蛍光」で示され、サンプル部分での反射・散乱のノイズを図中の「反射・散乱光」で示す。「反射・散乱光」はサンプルの部分にサンプルに代えて水を配置して測定した結果である。このようにノイズに対して十分に大きな蛍光の信号を得ることができた。この測定の結果はＦＡＭからの蛍光とRedmond Redからの蛍光の両方が検出されたことを示しているので、ここで使用したサンプルはヘテロの型をもつものであるといえる。
【００８８】
２種類以上の蛍光試薬を検出するために、従来技術ではそれぞれの蛍光試薬に対応した光学系を複数搭載する方法が用いられていたが、光学系だけでなくその周辺の機構部品が複雑になり、蛍光試薬間での測定のばらつきの原因となっていた。また、その結果としてＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点があった。また従来技術の別の方法として用いられてきた、機械的に光学部品を切り換えて複数の蛍光試薬に対応する方法では、フィルタを切り換える機構部品が複雑になり、装置が大型・複雑なものになるという問題点があった。また、構成によっては蛍光測定が不安定になる可能性を含んでおり、ＳＮＰのアレル判定が不正確なものになりがちであるという問題点があった。
【００８９】
それに対し、本発明の実施例のフィルタを使用した上記の方法では、レンズやフィルタ、検出器といった光学部品の大部分がいずれの蛍光試薬でも共通して用いられるために、蛍光試薬間での測定のばらつきを最小限にすることができる。また、複数の蛍光試薬を検出する際には複数のＬＥＤの点灯・消灯を行うだけであり、モーターなどの機構部品を必要としないために安定して測定が行えるだけでなく、装置を小型にすることができる。それらの結果、ＳＮＰのアレル判定が簡便かつ正確に行なうことができる。
【００９０】
図２４に示す蛍光検出装置に示すように、落射光学系で用いる励起光フィルタ、蛍光フィルタ及びダイクロイックフィルタのうち、例えば、ダイクロイックフィルタ３２にのみ本発明のダイクロイックフィルタを用いてもよい。その場合、励起光フィルタとしてはそれぞれ励起光の光路に単一の透過波長帯域をもつ励起光フィルタ３０ａ，３０ｂを配置する。また、蛍光受光側では、蛍光フィルタとしてもそれぞれの蛍光用に単一の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂを使用する。例えば、蛍光受光側では、ダイクロイックフィルタ３２を透過した蛍光を１つの透過域と１つの反射域をもつ通常のダイクロイックフィルタ２８ａを用いて蛍光の波長により２つの蛍光光路に分離し、一方の蛍光光路にはその蛍光用の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａを配置し、その蛍光フィルタ３４ａを透過した蛍光をレンズ１４ａで集光してフォトダイオード１６ａに入射させる。ダイクロイックフィルタ２８ａで分離された他方の蛍光光路にはその蛍光用の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ｂを配置し、その蛍光フィルタ３４ｂを透過した蛍光をレンズ１４ｂで集光してフォトダイオード１６ｂに入射させる。フォトダイオード１６ａ，１６ｂではそれぞれの蛍光が電気信号に変換される。
【００９１】
この実施例の場合でも、各励起光に応じたダイクロイックフィルタを光軸上に配置しなおす必要がなくなるため、装置の小型化に寄与できる。
【００９２】
図２４の実施例において、励起光フィルタ３０ａ，３０ｂに代えて本発明の２波長帯用励起光フィルタ３０を用いて図２０に示されるような励起光学系を組み合わせてもよい。
【００９３】
また、図２４の実施例において、蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂに代えて本発明の２波長帯用蛍光フィルタ３４を用いて図２０に示されるような蛍光受光光学系を組み合わせてもよい。
【００９４】
これまでの実施例はダイクロイックフィルタを使用した落射光学系を使用しているが、ダイクロイックフィルタを使用しなくても蛍光測定装置を実現することができる。図２５はダイクロイックフィルタを使用しない蛍光測定装置の一実施例である。
【００９５】
図２５に示される蛍光測定装置では、励起光フィルタとしては図２４の蛍光測定装置と同様にそれぞれ励起光の光路に単一の透過波長帯域をもつ励起光フィルタ３０ａ，３０ｂを配置し、蛍光受光側では図２０の実施例と同様に２つの波長帯を透過することのできる蛍光フィルタ３４を使用する。励起光学系のダイクロイックフィルタ２８で１つの光軸にされた励起光は、レンズ１０ａで集光され蛍光試薬で標識されたサンプル１２に斜め方向から照射される。
【００９６】
サンプル１２に励起光が照射され、それぞれの波長の励起光によってそれぞれ励起された２種類の蛍光試薬からの蛍光は、励起光学系とは反対側に配置された蛍光受光光学系のレンズ１０ｂで集光され、２つの波長帯に透過域をもつ実施例の蛍光フィルタ３４を透過する。最終的にそれらの光はレンズ１４で集光され、フォトダイオード１６で電気信号に変換される。この実施例では、蛍光受光光学系において検出器を共通化できるため、装置の小型化に寄与できる。
【００９７】
図２５に示される蛍光測定装置において、励起光学系として図２０の実施例と同様に２つの波長帯を透過することのできる励起光フィルタ３０を使用し、蛍光受光側では図２４の実施例と同様にレンズ１０ｂを透過した蛍光を１つの透過域と１つの反射域をもつ通常のダイクロイックフィルタ２８ａを用いて蛍光の波長により２つの蛍光光路に分離し、それぞれの蛍光光路に単一の透過波長帯域をもつ蛍光フィルタ３４ａ，３４ｂをそれぞれ配置するようにしてもよい。この実施例では、励起光学系において励起光フィルタの数を減らすことができるので、やはり装置の小型化に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】励起光フィルタ用の短波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図２】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図３】励起光フィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図４】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図５】最適化設計された短波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例の励起光フィルタのスペクトルを示す図である。
【図６】蛍光フィルタ用の長波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図７】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図８】蛍光フィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図９】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１０】最適化設計された長波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例の蛍光フィルタのスペクトルを示す図である。
【図１１】ダイクロイックフィルタ用の長波長透過フィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図１２】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１３】ダイクロイックフィルタ用のノッチフィルタのベース膜構成によるスペクトルを示す図である。
【図１４】同フィルタの最適化設計後のスペクトルを示す図である。
【図１５】最適化設計された長波長透過フィルタと最適化設計されたノッチフィルタからなる一実施例のダイクロイックフィルタのスペクトルを示す図である。
【図１６】同実施例で製作されたフィルタセットのスペクトルを示す図である。
【図１７】同実施例で製作された励起光フィルタと蛍光フィルタの光学特性を従来の既存の製品と比較して示すスペクトルの図である。
【図１８】２種類のＬＥＤ及び蛍光試薬の吸収・放出波長帯の一例のスペクトルを示す図である。
【図１９】従来の蛍光検出装置を示す概略構成図である。
【図２０】実施例のフィルタセットを使用した蛍光検出装置を示す概略構成図である。
【図２１】２種類のＬＥＤ及びフィルタセットのスペクトルを示す図である。
【図２２】２種類の蛍光試薬の吸収スペクトルと発光スペクトルを示す図である。
【図２３】インベーダ反応が終了したＤＮＡサンプルの測定結果を示す図である。
【図２４】実施例のフィルタを使用した蛍光検出装置の他の実施例を示す概略構成図である。
【図２５】実施例のフィルタを使用した蛍光検出装置のさらに他の実施例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００９９】
４ａ，４ｂ，１０，１０ａ，１０ｂ，１４ レンズ
１２ サンプル
１６ フォトダイオード
２０，２２ ＬＥＤ
２８，３２ ダイクロイックフィルタ
３０ 励起光フィルタ
３４ 蛍光フィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
使用波長領域において透明な基板と、
前記基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、
前記基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、前記透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備え、
スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有する光学フィルタ。
【請求項２】
前記透過フィルタは前記所定の波長よりも短波長側が透過域となっている短波長透過フィルタであり、
前記透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の透過領域、第１の反射領域、第２の透過領域及び第２の反射領域となっている請求項１に記載の光学フィルタ。
【請求項３】
前記透過フィルタは前記所定の波長よりも長波長側が透過域となっている長波長透過フィルタであり、
前記透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の反射領域、第１の透過領域、第２の反射領域及び第２の透過領域となっている請求項１に記載の光学フィルタ。
【請求項４】
蛍光試薬を用いて分析を行う装置に使用される１組のフィルタからなるフィルタセットにおいて、
前記蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させるように２つの透過領域が設定された励起光フィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させるように２つの透過領域が設定された蛍光フィルタと、
前記２つの励起波長を反射させる２つの反射領域と前記２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタとを備えたことを特徴とするフィルタセット。
【請求項５】
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである請求項４に記載のフィルタセット。
【請求項６】
蛍光試薬を用いて分析を行う装置に使用される１組のフィルタからなるフィルタセットにおいて、
前記蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させるように２つの透過領域が設定された励起光フィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させるように２つの透過領域が設定された蛍光フィルタと、を備え、
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることを特徴とするフィルタセット。
【請求項７】
２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域は反射率９０％以上で交差する特性を有する請求項４から６のいずれか一項に記載のフィルタセット。
【請求項８】
２波長帯用蛍光フィルタは蛍光試薬の発光スペクトルをカバーするように透過領域幅が広げられている請求項５から７のいずれか一項に記載のフィルタセット。
【請求項９】
第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置であって、
前記第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び前記第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置できるようにした励起光学系と、
前記励起光学系に配置され、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、
請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなり、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの反射領域と、前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもち、前記励起光学系からの励起光を試料方向に反射させ、試料からの蛍光を受光して透過させるように配置された単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定され、前記ダイクロイックフィルタを透過した蛍光を受光して透過させる位置に配置された蛍光フィルタと、
前記蛍光フィルタを透過した蛍光を受光する位置に配置された光検出器と、
を備えた蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである請求項９に記載の蛍光測定装置。
【請求項１１】
第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置であって、
前記第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び前記第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置して試料に照射する励起光学系と、
前記励起光学系に配置され、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、
試料から発生する蛍光を検出する検出器と、
試料に対して前記励起光学系の反対側で試料からの蛍光を受光する位置に配置され、受光した蛍光を前記検出器へ導く蛍光受光光学系と、
前記蛍光受光光学系に配置され、前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された蛍光フィルタと、を備え、
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項１】
使用波長領域において透明な基板と、
前記基板の一方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、所定の波長より短波長側と長波長側の一方が透過域となり他方が反射域となっている透過フィルタと、
前記基板の他方の表面に形成され、高屈折率層と低屈折率層とが交互に順次積層された積層構造をもち、前記透過フィルタの透過域内で、かつ前記所定の波長から離れた波長域に反射領域をもつノッチフィルタとを備え、
スペクトル上で不連続な２つの透過領域と２つの反射領域を有する光学フィルタ。
【請求項２】
前記透過フィルタは前記所定の波長よりも短波長側が透過域となっている短波長透過フィルタであり、
前記透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の透過領域、第１の反射領域、第２の透過領域及び第２の反射領域となっている請求項１に記載の光学フィルタ。
【請求項３】
前記透過フィルタは前記所定の波長よりも長波長側が透過域となっている長波長透過フィルタであり、
前記透過領域と反射領域は短波長側から順に第１の反射領域、第１の透過領域、第２の反射領域及び第２の透過領域となっている請求項１に記載の光学フィルタ。
【請求項４】
蛍光試薬を用いて分析を行う装置に使用される１組のフィルタからなるフィルタセットにおいて、
前記蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させるように２つの透過領域が設定された励起光フィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させるように２つの透過領域が設定された蛍光フィルタと、
前記２つの励起波長を反射させる２つの反射領域と前記２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタとを備えたことを特徴とするフィルタセット。
【請求項５】
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである請求項４に記載のフィルタセット。
【請求項６】
蛍光試薬を用いて分析を行う装置に使用される１組のフィルタからなるフィルタセットにおいて、
前記蛍光試薬を励起する２つの励起波長を透過させるように２つの透過領域が設定された励起光フィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させるように２つの透過領域が設定された蛍光フィルタと、を備え、
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることを特徴とするフィルタセット。
【請求項７】
２波長帯用励起光フィルタと２波長帯用蛍光フィルタの反射領域は反射率９０％以上で交差する特性を有する請求項４から６のいずれか一項に記載のフィルタセット。
【請求項８】
２波長帯用蛍光フィルタは蛍光試薬の発光スペクトルをカバーするように透過領域幅が広げられている請求項５から７のいずれか一項に記載のフィルタセット。
【請求項９】
第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置であって、
前記第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び前記第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置できるようにした励起光学系と、
前記励起光学系に配置され、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、
請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなり、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの反射領域と、前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長を透過させる２つの透過領域をもち、前記励起光学系からの励起光を試料方向に反射させ、試料からの蛍光を受光して透過させるように配置された単一の２波長帯用ダイクロイックフィルタと、
前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定され、前記ダイクロイックフィルタを透過した蛍光を受光して透過させる位置に配置された蛍光フィルタと、
前記蛍光フィルタを透過した蛍光を受光する位置に配置された光検出器と、
を備えた蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタである請求項９に記載の蛍光測定装置。
【請求項１１】
第１、第２の２種類の蛍光試薬で標識された試料を測定する蛍光測定装置であって、
前記第１蛍光試薬を励起することのできる第１励起波長を含む光を発生する第１励起光源及び前記第２蛍光試薬を励起することのできる第２励起波長を含む光を発生する第２励起光源を有し、それぞれの光源からの光を切り換えて共通の励起光光軸上に配置して試料に照射する励起光学系と、
前記励起光学系に配置され、前記第１励起波長と第２励起波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された励起光フィルタと、
試料から発生する蛍光を検出する検出器と、
試料に対して前記励起光学系の反対側で試料からの蛍光を受光する位置に配置され、受光した蛍光を前記検出器へ導く蛍光受光光学系と、
前記蛍光受光光学系に配置され、前記蛍光試薬から発生する２つの蛍光波長をそれぞれ含む２つの透過領域をもつように設定された蛍光フィルタと、を備え、
前記励起光フィルタと蛍光フィルタの一方又は両方は２つの透過領域をもつように設定された請求項１から３のいずれか一項に記載の光学フィルタからなる単一の２波長帯用フィルタであることを特徴とする蛍光測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２００９−１２２２０３（Ｐ２００９−１２２２０３Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９３７２２（Ｐ２００７−２９３７２２）
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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