光学顕微鏡システムおよびこれを用いた試料動画像生成方法
【課題】 １段階の操作で、複数の異なる観察視野にある多くの試料を位置決めして撮影できる光学顕微鏡システムを提供すること。
【解決手段】 光学顕微鏡システム１００は、試料室１０と、二次元移動ステージ１２と、顕微鏡装置３０とを備えている。試料室１０は、試料Ｓを収容する複数のウエル１ａを有するウエルプレート１を保持して二次元移動ステージ１２上に載置され、二次元移動ステージ１２によってＸ−Ｙ方向に移動する。ステージ制御部５１は、二次元移動ステージ１２を制御して複数の観察範囲に及ぶ移動経路に沿って試料Ｓを所定の撮影位置へ移動させる。この移動経路上の移動には二次元移動ステージ１２のＸ−Ｙ位置データを用いる。
【解決手段】 光学顕微鏡システム１００は、試料室１０と、二次元移動ステージ１２と、顕微鏡装置３０とを備えている。試料室１０は、試料Ｓを収容する複数のウエル１ａを有するウエルプレート１を保持して二次元移動ステージ１２上に載置され、二次元移動ステージ１２によってＸ−Ｙ方向に移動する。ステージ制御部５１は、二次元移動ステージ１２を制御して複数の観察範囲に及ぶ移動経路に沿って試料Ｓを所定の撮影位置へ移動させる。この移動経路上の移動には二次元移動ステージ１２のＸ−Ｙ位置データを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡システムおよびこれを用いた試料動画像生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた細胞などの生体試料を顕微鏡観察する場合、その細胞の試薬に対する反応または変化を経時的に観察することは有効な方法である。このために、特定の細胞の顕微鏡像を一定の時間間隔で複数枚撮影し、撮影終了後に、これら複数枚の顕微鏡画像を時系列に並べて動画像として観察することが行われている。この方法を発展させ、複数の顕微鏡視野範囲を選択した後に、その顕微鏡視野範囲内で顕微鏡観察をしながら複数の撮影範囲を選択し、複数の撮影範囲を位置決めして順次繰り返し撮影することにより、撮影範囲の数と同数の動画像を得る顕微鏡写真撮影装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−２７７７５４号公報（第２頁、図３，４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の特許文献１の技術では、顕微鏡視野範囲を選択した後に、同一の顕微鏡視野範囲内で複数の撮影範囲を選択、位置決めするので、撮影までの操作が２段階となり起動性に欠けるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）上記問題を解決するために、請求項１に係る発明の光学顕微鏡システムは、複数の小室にそれぞれ観察試料が収容された容器を保持する保持手段と、観察試料の顕微鏡像を形成する観察手段と、観察手段により観察試料のそれぞれの顕微鏡像を形成するように、保持手段と観察手段とを相対移動する相対移動手段と、観察手段による顕微鏡像を撮像する撮像手段と、撮像手段で撮像した顕微鏡像の画像データを記憶する記憶手段と、小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で観察試料のそれぞれを撮像手段により撮像するように、相対移動手段を駆動制御する制御手段と、記憶手段に記憶された観察試料のそれぞれの画像データを観察試料毎に時系列に並べることにより、観察試料のそれぞれの動画像を生成する動画像生成手段とを備えることを特徴とする。
【０００６】
（２）請求項２に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１の光学顕微鏡システムにおいて、各小室に観察試料が収容された容器周辺を所定の温度、湿度および炭酸ガス濃度に保持する環境制御装置をさらに備えることが好ましい。
請求項３に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１または２の光学顕微鏡システムにおいて、各小室内への試薬の追加、除去、交換を行う環境変更手段をさらに備えることが好ましい。
（３）請求項４に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１〜３のいずれかの光学顕微鏡システムにおいて、制御手段は、各小室の底面に形成されたマークまたは各小室の底面に存在する形態的特徴を位置情報として予め入力され、そのマークまたは形態的特徴を位置基準として所定の撮影位置を補正することが好ましい。
請求項５に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１〜４のいずれかの光学顕微鏡システムにおいて、オートフォーカス機構をさらに備えていてもよい。
【０００７】
（４）請求項６に係る発明の試料動画像生成方法は、複数のウエルの位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で生体試料の顕微鏡像をそれぞれ撮像し、撮像により得られた顕微鏡像の画像データを複数のウエルの位置情報とともに記憶し、所定時間経過後に、撮像工程と記憶工程とを行い、記憶されたそれぞれの画像データを複数のウエルの位置情報に基づいて生体試料毎に時系列に並べることにより、生体試料のそれぞれの動画像データを生成することを特徴とする。
請求項７に係る発明の試料動画像生成方法は、請求項６の試料動画像生成方法において、
撮像工程と記憶工程の後に、複数のウエルの１以上のウエルに対して試薬の追加或いは除去による環境変化工程をさらに行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、各々の観察視野で顕微鏡観察をしながら複数の撮影範囲を選択するという煩雑な作業をせずに、制御手段による１段階の操作で、複数の異なる観察視野にある多くの撮影対象を位置決めして撮影できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態による光学顕微鏡システムについて、図１〜６を参照しながら説明する。
図１は、本発明の実施の形態による光学顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。本実施の形態の光学顕微鏡システム１００は、試料室１０と、二次元移動ステージ１２と、密閉容器２０と、顕微鏡装置３０とを備えている。密閉容器２０は、試料室１０、二次元移動ステージ１２および顕微鏡装置３０の一部分を収納する容器である。
【００１０】
試料室１０は、天井部分が開放面１０Ａで示されるように開放され、底板１１には開口１１Ａが形成されている。培養容器１は、開口１１Ａを閉鎖するように底板１１上に載置される。培養容器１は、例えば、図示されるようなウエルプレートであり、複数の小室（ウエル）１ａを有し、各小室には、生物試料と試薬（培養液、染色液などの水溶液）が収容される。試料室１０は、二次元移動ステージ１２上に載置され、二次元移動ステージ１２によって光軸ＡＸと垂直な方向であるＸ方向とＹ方向に移動する。すなわち、培養容器１は、水平面に沿ってＸ方向とＹ方向に移動可能である。密閉容器２０の上板２１には、開口２１Ａが形成されており、開口２１Ａを開閉するためのシャッタ機構２２が設けられている。
【００１１】
顕微鏡装置３０は、対物レンズ３１、焦点調節機構３２、励起光照明装置３３、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５、ハーフプリズム３６、撮像装置３７および透過照明装置４０を有する。対物レンズ３１は、焦点調節機構（垂直移動ステージ）３２に保持され、焦点調節機構３２によって光軸ＡＸの方向、すなわちＺ方向に移動する。透過照明装置４０は、密閉容器２０の上方に配置され、光源４１とコリメータレンズ４２を有する。
【００１２】
ステージ制御部５１は、配線を介して二次元移動ステージ１２に電気的に接続されるとともに、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）５３に接続されている。また、ステージ制御部５１は、位置補正部５１ａを有している。オートフォーカス部５２は、配線を介して焦点調節機構３２に電気的に接続されるとともに、ＰＣ５３に接続されている。ＰＣ５３は、二次元移動ステージ１２の移動経路、移動距離、移動方向などに関するデータをステージ制御部５１へ送出するとともに、二次元移動ステージ１２のＸ−Ｙ位置データをステージ制御部５１から入力して記憶する。二次元移動ステージ１２の移動範囲は、顕微鏡装置３０の観察視野に限らず、複数の観察視野を含む広範囲に及ぶ。また、ＰＣ５３は、対物レンズ３１の焦点位置データをオートフォーカス部５２から入力して記憶する。
【００１３】
さらに、ＰＣ５３は、画像データ記憶部５４と画像データ編集部５５とを有する。画像データ記憶部５４は、撮像装置３７の撮像素子３７ａからの顕微鏡像の画像信号を画像データとして記憶する。画像データ編集部５５は、画像データ記憶部５４から画像データを入力して編集を行い、連続画像（動画像）を生成する。表示部５６は、画像データ編集部５５により生成された動画を表示する。なお、ＰＣ５３内部で、Ｘ−Ｙ位置データ、焦点位置データと画像データとの対応ができるようになっている。
【００１４】
以下、本実施の形態の光学顕微鏡システム１００を用いた顕微鏡観察、撮影および動画編集について説明する。
図２は、培養容器（ウエルプレート）１の構造を模式的に示す平面図である。ウエルプレート１は、縦８列、横１２列の合計９６個のウエル１ａが形成された透明なプレートである。各々のウエル１ａには、生物試料と試薬の少なくともいずれかが異なる観察試料（以下、試料Ｓ）が収容され、全部のウエル１ａについて所定時間間隔で顕微鏡画像が撮影される。前述した二次元移動ステージ１２の移動経路、移動距離、移動方向などの位置情報は、各々のウエル１ａの位置に基づいてデータ化されたものである。各ウエル１ａ中の試料Ｓの撮影順については、図４で示される動画編集プロセスとの関連で後述する。なお、各々のウエル１ａには、撮影位置を微調整するためのマークを予め形成しておいてもよい。
【００１５】
先ず、図１を参照して、試料Ｓの顕微鏡観察および撮影について説明する。最初のウエル１ａに収容された試料Ｓが所望の観察視野に入るように、すなわち所定の撮影位置に来るように、ステージ制御部５１からの制御信号によって二次元移動ステージ１２に載置されたウェルプレート１を所定の移動距離と移動方向でＸ−Ｙ面上を移動させる。このＸ−Ｙ位置データは、例えば特定のウエル１ａ位置を原点とする二次元座標で表わすことができる。観察視野、すなわちＸ−Ｙ方向の位置において、オートフォーカス部５２により焦点調節機構３２を駆動して対物レンズ３１をＺ方向に移動させ、試料Ｓの顕微鏡像の焦点位置を定める。この焦点位置データは、例えば特定のウエル１ａ中の試料Ｓの位置を原点とする一次元座標で表わすことができる。
【００１６】
透過像観察の場合は、透過照明装置４０からの照明光は、密閉容器２０の上板２１の開口２１Ａを通ってウエル１ａ中の試料Ｓを照射する。試料Ｓを透過した光は、ウエルプレート１の底板を介して対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射した光は、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５を通り、ハーフプリズム３６で分岐する。一方の光は、ハーフプリズム３６を透過して撮像装置３７へ入射し、撮像素子３７ａの撮像面に結像する。他方の光は、ハーフプリズム３６で反射し、不図示の接眼レンズへ導かれる。試料Ｓの顕微鏡画像データは、撮像素子３７ａからＰＣ５３へ送られ、画像データ記憶部５４により記憶される。
【００１７】
透過観察の際に、ウエル１ａの観察視野内に、ウエル１ａの底面に形成されたマークを認識して、このマークの位置を基準として撮影位置を微調整することができる。すなわち、観察視野内でのマークの位置データをＰＣ５３に入力しておき、この位置データを位置補正部５１ａに送ってＸ−Ｙ位置データを補正する。二次元移動ステージ１２の駆動時の機械誤差などのために、ウエル１ａを最初にセットした位置と、二次元移動ステージ１２を駆動した後にそのウエル１ａをリセット（２回目以降のセット）した位置とでは僅かなズレが生じることがある。撮影位置を微調整することにより、所定の撮影位置に正確にウエル１ａを移動させることができる。また、マークの代わりに、各ウエル１ａの底面に存在するキズや凹みなどの形態的特徴を撮影位置の微調整に利用してもよい。
【００１８】
別のウエル１ａに収容された試料Ｓ´を観察、撮影する場合も同様に、二次元移動ステージ１２によるウェルプレート１の移動と焦点調節機構３２による対物レンズ３１の焦点調節を行い、試料Ｓ´のＸ−Ｙ位置データと焦点位置データは、ＰＣ５３によって記憶される。試料Ｓ´についても焦点調節するのは、ウェルプレート１の移動や各々のウエル１ａ中の試料Ｓの状態によって焦点位置がずれることがあるからである。この焦点調節は、各々のウエル１ａについて最初に１回だけ行ってもよいし、毎回行ってもよい。
【００１９】
試料Ｓ´の顕微鏡画像データも、撮像素子３７ａからＰＣ５３へ送られ、画像データ記憶部５４により記憶される。このようにして、ウェルプレート１の全部のウエル１ａ中の試料Ｓについての画像データが画像データ記憶部５４により記憶される。以上の撮影と記録は、試料Ｓの数だけ行われ、この一連の撮影と記録は、所定の待機時間を置いて繰り返し行われる。すべての撮影と記録を終了すると、すべての顕微鏡画像データは、画像データ編集部５５により編集され、動画像が生成される。画像データ編集部５５による動画像生成については後に詳述する。
【００２０】
蛍光像観察の場合は、励起光照明装置３３から射出した照明光は、調光フィルタ３３ａ、蛍光フィルタ装置３４を通り、対物レンズ３１の下方から入射する。対物レンズ３１に入射した光は、ウェルプレート１の底板を透過して試料Ｓを照射する。この励起光によって試料Ｓから蛍光が発する。蛍光は、ウェルプレート１、対物レンズ３１、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５を通り、ハーフプリズム３６で分岐する。一方の光は、ハーフプリズム３６を透過して撮像装置３７へ入射し、撮像素子３７ａの撮像面に結像する。他方の光は、ハーフプリズム３６で反射し、不図示の接眼レンズへ導かれる。試料Ｓの顕微鏡画像データの送出と記憶、二次元移動ステージ１２の移動、焦点調節等に関しては、透過像観察でも蛍光像観察でも同様である。
【００２１】
図３は、本実施の形態による光学顕微鏡システムにおける試料Ｓの撮影から動画編集までの過程を示すフローチャートである。今、ウエル１ａの数、すなわち試料Ｓの数がｍ個、各々の試料Ｓについて所定時間間隔で繰り返し行われる撮影回数をｎ回とする。ステップＳ１では、最初に撮影する試料Ｓのウエル１ａの位置を定め、ステップＳ２では、その試料Ｓを撮影し、ステップＳ３では、その試料Ｓの顕微鏡画像を記憶する。ステップＳ４では、すべての試料Ｓについて顕微鏡画像を記憶したか否かをチェックする。「否」であれば、ステップＳ５へ移行し、次の試料Ｓについて位置設定、撮影（ステップＳ２）、画像記憶（ステップＳ３）を行う。
【００２２】
ステップＳ４で、ｍ個の試料Ｓすべての撮影が終了すると、ステップＳ６へ移行し、所定の待機時間Ｔをおく。撮影回数ｎ＝２では、撮影回数ｎ＝１のときの各々の試料ＳのＸ−Ｙ位置データを利用して二次元移動ステージ１２を駆動して撮影位置を設定する。撮影回数ｎを増やしたときも同様である。従って、各々の試料Ｓは、常に同じ撮影位置で撮影される。なお、撮影の際に毎回焦点調節を行う場合は、ｍ個の試料Ｓ各々について撮影回数ｎ＝１のときに得られた焦点位置データを利用して撮影回数２回目以降の焦点調節を行うことができる。
【００２３】
ステップＳ７では、各々の試料Ｓについて予め定めた撮影回数に達したか否かをチェックする。「否」であれば、ステップＳ８へ移行し、撮影回数ｎを増やしてステップＳ１からステップＳ６を繰り返す。ステップＳ７で、所定の撮影回数ｎ回に達すると、ステップＳ９へ移行し、動画編集を行う。ステップＳ１０で、編集された動画像データを記憶すると、一連の作業を終了する。
【００２４】
図４は、本実施の形態による光学顕微鏡システムにおける動画編集のプロセスを示す図である。図４（ａ）は、撮影された顕微鏡画像を撮影順に並べたものであり、図４（ｂ）は、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像のみを時系列的に並べた動画像である。ｔ１１からｔｎｍまでは、各顕微鏡画像を撮影した時刻を表わす。
【００２５】
ここで図２を参照して、各々のウエル１ａ中の試料Ｓについて、撮影の順番をウエルプレート１の第３列から第７列のウエル１ａで説明する。最初の位置（ａ，３）のウエル１ａからスタートし、図中、矢印に従って下方に向かって位置（ｈ，３）のウエル１ａまで順次進み、位置（ｈ，４）のウエル１ａから上方に向かって位置（ａ，４）まで順次進み、最終の位置（ｈ，７）のウエル１ａに到達すると１回目の撮影が終了する。この一連の撮影は、図４の撮影回数ｎ＝１に対応するものであり、ｍ枚の顕微鏡画像を撮影する。
【００２６】
図４（ａ）に示されるように、待機時間Ｔだけ経過した後に、撮影回数ｎ＝２の過程に入る。図２では、最終の位置（ｈ，７）から最初の位置（ａ，３）へウエルプレート１を移動させる。撮影回数ｎ＝２においても、ｎ＝１と同様の位置設定と撮影を行い、ｍ枚の顕微鏡画像を撮影する。この一連の操作をｎ回繰り返す。すなわち、時刻ｔ１１からｔｎｍまで、ｍ×ｎ枚の顕微鏡画像を撮影する。
【００２７】
図４（ｂ）に示されるように、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像ｎ枚を時系列的に並べると動画像が得られる。各画像の時間間隔は、ｍ枚の画像を撮影するのに要する時間に、待機時間Ｔと最終の位置（ｈ，７）から最初の位置（ａ，３）へウエルプレート１を移動させるためのステージ移動時間とを加えた時間である。このようにして、ｍ個の位置で、すなわちｍ個の試料Ｓについてｎ枚の画像から成る動画像が得られる。
【００２８】
本実施の形態の光学顕微鏡システム１００は、ステージ制御部５１により、顕微鏡装置３０の観察視野に限らず、複数の観察視野を含む広範囲で二次元移動ステージ１２を駆動できるので、観察視野毎に撮影範囲を決める必要はなく、１段階の操作で、複数の異なる観察視野にある多くの試料Ｓを位置決めして撮影できる。この位置決めは、ステージ制御部５１により正確に行われるので、ブレの少ない滑らかな動きの動画が得られる。さらに、ステージ制御部５１に位置補正部５１ａを設けることにより、より一層ブレの少ない滑らかな動きの動画が得られる。なお、位置補正部５１ａを設けず、すべての撮像が終了した後の動画編集段階で、画像データ中のマークやウエル１ａのキズなどが各画面上で同じ位置になるように画像をシフトして編集してもよい。
【００２９】
本実施の形態では、二次元移動ステージ１２を駆動して各々の試料Ｓをその撮影位置へ移動させたが、ウエルプレート１を載置するステージを固定とし、光学顕微鏡３０をＸ−Ｙ方向に移動させてもよいし、二次元移動ステージ１２と光学顕微鏡３０の両者をＸ−Ｙ方向に移動させてもよい。また、観察される試料Ｓの像は、暗視野像でもよいし、位相差像でもよい。
【００３０】
以下、試料室１０内の環境調整方法について図５を参照して説明する。
図５は、図１に示した光学顕微鏡システム１００に環境制御装置６０を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図であり、図１と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。また、ステージ制御部５１、オートフォーカス部５２、ＰＣ５３、画像データ記憶部５４、画像データ編集部５５、表示部５６および透過照明装置４０は図示を省略する。
【００３１】
環境制御装置６０は、所望の温度、湿度および組成のガスを生成し、このガスを試料室１０内へ循環させる装置である。環境制御装置６０は、加湿器６１、加熱器６２、送風機６３、温度／湿度センサー６４、ＣＯ２ガスセンサー６５およびリザーブタンク６６を備えている。送風機６３は、ガス送出チューブ６７によって密閉容器２０の上板２１に配管接続されている。加湿器６１は、ガス吸入チューブ６８によって密閉容器２０の上板２１に配管接続されている。上板２１の配管接続箇所は、試料室１０へ連通している。また、加湿器６１は、リザーブタンク６６に配管接続されている。加熱器５２と送風機５３との間から分岐する経路には電磁弁６９が設けられ、ＣＯ２ガスボンベからガスを導入できるようになっている。
【００３２】
温度／湿度センサー６４は、試料室１０内の温度と湿度をモニタするために、密閉容器２０の上板２１の下面に取り付けられている。ＣＯ２ガスセンサー６５は、試料室１０内のＣＯ２ガス濃度をモニタするために、ガス吸入チューブ６７の経路の途中に取り付けられている。各チューブには断熱処理が施されている。
【００３３】
ガス送出チューブ６７によって試料室１０へ供給されるガスは、次のようにしてガス組成、湿度および温度が調整される。ガス組成の調整は、ＣＯ２ガスセンサー６５の測定値をフィードバックして電磁弁６９の開放量を増減することにより行われる。湿度の調整は、温度／湿度センサー６４の測定値をフィードバックして、加湿器６１の超音波霧化素子への駆動電圧を増減することにより行われる。超音波霧化素子は、加湿器６１内の水から超音波振動によって水蒸気を発生させる。なお、加湿器６１内の水は、リザーブタンク６６からの供給によって常に一定量が確保されている。温度の調整は、温度／湿度センサー５４の測定値をフィードバックして、加熱器５１の電熱ヒーターに流す電流を増減することにより行われる。
【００３４】
このようにして調整されたガスは、例えば、３７℃−１００％ＲＨ、５％ＣＯ２であり、環境制御装置６０からガス送出チューブ６７によって試料室１０へ供給され、試料室１０からガス吸入チューブ６８によって環境制御装置６０へ戻る。循環経路上の調整ガスは、環境制御装置６０によって再び所定の温度、湿度およびガス組成の空気として試料室１０内に送り込まれる。試料室１０は、密閉容器２０に収納されているので、調整ガスが外部に漏れる恐れはない。光学顕微鏡システム１００に環境制御装置６０を付設することにより、試料室１０内は常に所定の環境に維持されるので、試料Ｓも所定の条件に保つことができる。
【００３５】
続いて、試料室１０に配置されたウエルプレート１のウエル１ａ内の試料Ｓの変更方法について図６を参照して説明する。試料Ｓとは、前述したとおり、細胞などの生物試料に培養液などの試薬が添加されたものであり、生物試料と試薬の少なくともいずれかが異なる対象物である。
図６は、図１に示した光学顕微鏡システム１００に注入／吸入機構７０を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図であり、図１と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。また、ステージ制御部５１、オートフォーカス部５２、ＰＣ５３、画像データ記憶部５４、画像データ編集部５５および表示部５６は図示を省略する。
【００３６】
注入／吸入機構７０は、光学顕微鏡システム１００の上方に位置し、不図示の駆動機構によりＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動でき、試薬をピペット７１を介してウェルプレート１のウエル１ａ内に注入したり、ウエル１ａ内の試薬を吸入できるように構成されている。注入、吸入の際には、図示のように透過照明装置４０は光軸ＡＸ上から外される。シャッタ機構２２により密閉容器２０の上板２１の開口２１Ａを開放し、試料室１０の内部を外界に対して開放された状態とする。これにより、試薬の注入、吸入を自由に行うことができる。
【００３７】
試薬の注入、吸入または交換が終了すると、注入／吸入機構７０のピペット７１は上方に後退し、シャッタ機構２２が作動して、開口２１Ａを例えば透明基板で閉鎖し、透過像観察の場合は透過照明装置４０を光軸ＡＸ上へ復帰させる。これにより、試料室１０の内部は、外界に対しても密閉された状態になる。光学顕微鏡システム１００に注入／吸入機構７０を付設することにより、試薬の注入、吸入を自由に行うことができ、試料Ｓの顕微鏡観察および撮影の前でも最中でもウエル１ａ内の環境（試料Ｓの条件）を変えることができるので、多様化するユーザーの要望に迅速に対応することができる。
【００３８】
具体例としては、同じ試料Ｓを入れた各ウエル１ａにそれぞれ異なる試薬を注入し、注入後に各ウエル１ａの試料Ｓの撮像を行い、ウエル１ａ毎に生成された動画を比較することにより、試薬の効果の違いを調べることができる。また、同じ試料Ｓを入れた各ウエル１ａに、撮影順に同一試薬の注入量を段階的に変化させて添加し、各ウエル１ａの試料Ｓの撮像を行い、ウエル１ａ毎に生成された動画を比較することにより、試薬の添加量による試料の変化の状況や添加から変化が現れるまでの時間を知ることができ、試薬の効果が生じる最適な添加量を見究めることができる。このように、異なる条件の試料毎に経時変化を観察することができる。また、注入／吸入機構７０が個々のウエル１ａに試薬を添加するタイミングと撮像装置３７が試料Ｓを撮像するタイミングとを連動して制御する構成とすれば、各ウエル１ａ中の試料Ｓの経時変化をより正確に比較観察することができる。
【００３９】
本発明は、光学顕微鏡システムに、小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置へ各観察試料を移動させるように、試料保持手段と観察手段とを相対的に移動制御する制御手段を設けることに特徴がある。本発明は、その特徴を損なわない限り、以上説明した実施の形態に何ら限定されない。なお、画像データ編集部５５は、動画像生成手段に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムで用いられる培養容器（ウエルプレート）の構造を模式的に示す平面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムにおける試料Ｓの撮影から動画編集までの過程を示すフローチャートである。
【図４】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムにおける動画編集のプロセスを示す図である。図４（ａ）は、撮影された顕微鏡画像を撮影順に並べたものであり、図４（ｂ）は、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像のみを時系列的に並べた動画像である。
【図５】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムに環境制御装置を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムに注入／吸入機構を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図である。
【符号の説明】
【００４１】
１：培養容器（ウエルプレート）
１ａ：ウエル
１０：試料室
１２：二次元移動ステージ
２０：密閉容器
２２：シャッタ機構
３０：顕微鏡装置
３１：対物レンズ
３２：焦点調節機構
３７：撮像装置
４０：透過照明装置
５１：ステージ制御部
５２：オートフォーカス部
５３：ＰＣ
５４：画像データ記憶部
５５：画像データ編集部
５６：表示部
６０：環境制御装置
７０：注入／吸入機構
１００：光学顕微鏡システム
Ｓ：試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡システムおよびこれを用いた試料動画像生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた細胞などの生体試料を顕微鏡観察する場合、その細胞の試薬に対する反応または変化を経時的に観察することは有効な方法である。このために、特定の細胞の顕微鏡像を一定の時間間隔で複数枚撮影し、撮影終了後に、これら複数枚の顕微鏡画像を時系列に並べて動画像として観察することが行われている。この方法を発展させ、複数の顕微鏡視野範囲を選択した後に、その顕微鏡視野範囲内で顕微鏡観察をしながら複数の撮影範囲を選択し、複数の撮影範囲を位置決めして順次繰り返し撮影することにより、撮影範囲の数と同数の動画像を得る顕微鏡写真撮影装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−２７７７５４号公報（第２頁、図３，４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の特許文献１の技術では、顕微鏡視野範囲を選択した後に、同一の顕微鏡視野範囲内で複数の撮影範囲を選択、位置決めするので、撮影までの操作が２段階となり起動性に欠けるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）上記問題を解決するために、請求項１に係る発明の光学顕微鏡システムは、複数の小室にそれぞれ観察試料が収容された容器を保持する保持手段と、観察試料の顕微鏡像を形成する観察手段と、観察手段により観察試料のそれぞれの顕微鏡像を形成するように、保持手段と観察手段とを相対移動する相対移動手段と、観察手段による顕微鏡像を撮像する撮像手段と、撮像手段で撮像した顕微鏡像の画像データを記憶する記憶手段と、小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で観察試料のそれぞれを撮像手段により撮像するように、相対移動手段を駆動制御する制御手段と、記憶手段に記憶された観察試料のそれぞれの画像データを観察試料毎に時系列に並べることにより、観察試料のそれぞれの動画像を生成する動画像生成手段とを備えることを特徴とする。
【０００６】
（２）請求項２に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１の光学顕微鏡システムにおいて、各小室に観察試料が収容された容器周辺を所定の温度、湿度および炭酸ガス濃度に保持する環境制御装置をさらに備えることが好ましい。
請求項３に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１または２の光学顕微鏡システムにおいて、各小室内への試薬の追加、除去、交換を行う環境変更手段をさらに備えることが好ましい。
（３）請求項４に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１〜３のいずれかの光学顕微鏡システムにおいて、制御手段は、各小室の底面に形成されたマークまたは各小室の底面に存在する形態的特徴を位置情報として予め入力され、そのマークまたは形態的特徴を位置基準として所定の撮影位置を補正することが好ましい。
請求項５に係る発明の光学顕微鏡システムは、請求項１〜４のいずれかの光学顕微鏡システムにおいて、オートフォーカス機構をさらに備えていてもよい。
【０００７】
（４）請求項６に係る発明の試料動画像生成方法は、複数のウエルの位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で生体試料の顕微鏡像をそれぞれ撮像し、撮像により得られた顕微鏡像の画像データを複数のウエルの位置情報とともに記憶し、所定時間経過後に、撮像工程と記憶工程とを行い、記憶されたそれぞれの画像データを複数のウエルの位置情報に基づいて生体試料毎に時系列に並べることにより、生体試料のそれぞれの動画像データを生成することを特徴とする。
請求項７に係る発明の試料動画像生成方法は、請求項６の試料動画像生成方法において、
撮像工程と記憶工程の後に、複数のウエルの１以上のウエルに対して試薬の追加或いは除去による環境変化工程をさらに行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、各々の観察視野で顕微鏡観察をしながら複数の撮影範囲を選択するという煩雑な作業をせずに、制御手段による１段階の操作で、複数の異なる観察視野にある多くの撮影対象を位置決めして撮影できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態による光学顕微鏡システムについて、図１〜６を参照しながら説明する。
図１は、本発明の実施の形態による光学顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。本実施の形態の光学顕微鏡システム１００は、試料室１０と、二次元移動ステージ１２と、密閉容器２０と、顕微鏡装置３０とを備えている。密閉容器２０は、試料室１０、二次元移動ステージ１２および顕微鏡装置３０の一部分を収納する容器である。
【００１０】
試料室１０は、天井部分が開放面１０Ａで示されるように開放され、底板１１には開口１１Ａが形成されている。培養容器１は、開口１１Ａを閉鎖するように底板１１上に載置される。培養容器１は、例えば、図示されるようなウエルプレートであり、複数の小室（ウエル）１ａを有し、各小室には、生物試料と試薬（培養液、染色液などの水溶液）が収容される。試料室１０は、二次元移動ステージ１２上に載置され、二次元移動ステージ１２によって光軸ＡＸと垂直な方向であるＸ方向とＹ方向に移動する。すなわち、培養容器１は、水平面に沿ってＸ方向とＹ方向に移動可能である。密閉容器２０の上板２１には、開口２１Ａが形成されており、開口２１Ａを開閉するためのシャッタ機構２２が設けられている。
【００１１】
顕微鏡装置３０は、対物レンズ３１、焦点調節機構３２、励起光照明装置３３、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５、ハーフプリズム３６、撮像装置３７および透過照明装置４０を有する。対物レンズ３１は、焦点調節機構（垂直移動ステージ）３２に保持され、焦点調節機構３２によって光軸ＡＸの方向、すなわちＺ方向に移動する。透過照明装置４０は、密閉容器２０の上方に配置され、光源４１とコリメータレンズ４２を有する。
【００１２】
ステージ制御部５１は、配線を介して二次元移動ステージ１２に電気的に接続されるとともに、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）５３に接続されている。また、ステージ制御部５１は、位置補正部５１ａを有している。オートフォーカス部５２は、配線を介して焦点調節機構３２に電気的に接続されるとともに、ＰＣ５３に接続されている。ＰＣ５３は、二次元移動ステージ１２の移動経路、移動距離、移動方向などに関するデータをステージ制御部５１へ送出するとともに、二次元移動ステージ１２のＸ−Ｙ位置データをステージ制御部５１から入力して記憶する。二次元移動ステージ１２の移動範囲は、顕微鏡装置３０の観察視野に限らず、複数の観察視野を含む広範囲に及ぶ。また、ＰＣ５３は、対物レンズ３１の焦点位置データをオートフォーカス部５２から入力して記憶する。
【００１３】
さらに、ＰＣ５３は、画像データ記憶部５４と画像データ編集部５５とを有する。画像データ記憶部５４は、撮像装置３７の撮像素子３７ａからの顕微鏡像の画像信号を画像データとして記憶する。画像データ編集部５５は、画像データ記憶部５４から画像データを入力して編集を行い、連続画像（動画像）を生成する。表示部５６は、画像データ編集部５５により生成された動画を表示する。なお、ＰＣ５３内部で、Ｘ−Ｙ位置データ、焦点位置データと画像データとの対応ができるようになっている。
【００１４】
以下、本実施の形態の光学顕微鏡システム１００を用いた顕微鏡観察、撮影および動画編集について説明する。
図２は、培養容器（ウエルプレート）１の構造を模式的に示す平面図である。ウエルプレート１は、縦８列、横１２列の合計９６個のウエル１ａが形成された透明なプレートである。各々のウエル１ａには、生物試料と試薬の少なくともいずれかが異なる観察試料（以下、試料Ｓ）が収容され、全部のウエル１ａについて所定時間間隔で顕微鏡画像が撮影される。前述した二次元移動ステージ１２の移動経路、移動距離、移動方向などの位置情報は、各々のウエル１ａの位置に基づいてデータ化されたものである。各ウエル１ａ中の試料Ｓの撮影順については、図４で示される動画編集プロセスとの関連で後述する。なお、各々のウエル１ａには、撮影位置を微調整するためのマークを予め形成しておいてもよい。
【００１５】
先ず、図１を参照して、試料Ｓの顕微鏡観察および撮影について説明する。最初のウエル１ａに収容された試料Ｓが所望の観察視野に入るように、すなわち所定の撮影位置に来るように、ステージ制御部５１からの制御信号によって二次元移動ステージ１２に載置されたウェルプレート１を所定の移動距離と移動方向でＸ−Ｙ面上を移動させる。このＸ−Ｙ位置データは、例えば特定のウエル１ａ位置を原点とする二次元座標で表わすことができる。観察視野、すなわちＸ−Ｙ方向の位置において、オートフォーカス部５２により焦点調節機構３２を駆動して対物レンズ３１をＺ方向に移動させ、試料Ｓの顕微鏡像の焦点位置を定める。この焦点位置データは、例えば特定のウエル１ａ中の試料Ｓの位置を原点とする一次元座標で表わすことができる。
【００１６】
透過像観察の場合は、透過照明装置４０からの照明光は、密閉容器２０の上板２１の開口２１Ａを通ってウエル１ａ中の試料Ｓを照射する。試料Ｓを透過した光は、ウエルプレート１の底板を介して対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射した光は、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５を通り、ハーフプリズム３６で分岐する。一方の光は、ハーフプリズム３６を透過して撮像装置３７へ入射し、撮像素子３７ａの撮像面に結像する。他方の光は、ハーフプリズム３６で反射し、不図示の接眼レンズへ導かれる。試料Ｓの顕微鏡画像データは、撮像素子３７ａからＰＣ５３へ送られ、画像データ記憶部５４により記憶される。
【００１７】
透過観察の際に、ウエル１ａの観察視野内に、ウエル１ａの底面に形成されたマークを認識して、このマークの位置を基準として撮影位置を微調整することができる。すなわち、観察視野内でのマークの位置データをＰＣ５３に入力しておき、この位置データを位置補正部５１ａに送ってＸ−Ｙ位置データを補正する。二次元移動ステージ１２の駆動時の機械誤差などのために、ウエル１ａを最初にセットした位置と、二次元移動ステージ１２を駆動した後にそのウエル１ａをリセット（２回目以降のセット）した位置とでは僅かなズレが生じることがある。撮影位置を微調整することにより、所定の撮影位置に正確にウエル１ａを移動させることができる。また、マークの代わりに、各ウエル１ａの底面に存在するキズや凹みなどの形態的特徴を撮影位置の微調整に利用してもよい。
【００１８】
別のウエル１ａに収容された試料Ｓ´を観察、撮影する場合も同様に、二次元移動ステージ１２によるウェルプレート１の移動と焦点調節機構３２による対物レンズ３１の焦点調節を行い、試料Ｓ´のＸ−Ｙ位置データと焦点位置データは、ＰＣ５３によって記憶される。試料Ｓ´についても焦点調節するのは、ウェルプレート１の移動や各々のウエル１ａ中の試料Ｓの状態によって焦点位置がずれることがあるからである。この焦点調節は、各々のウエル１ａについて最初に１回だけ行ってもよいし、毎回行ってもよい。
【００１９】
試料Ｓ´の顕微鏡画像データも、撮像素子３７ａからＰＣ５３へ送られ、画像データ記憶部５４により記憶される。このようにして、ウェルプレート１の全部のウエル１ａ中の試料Ｓについての画像データが画像データ記憶部５４により記憶される。以上の撮影と記録は、試料Ｓの数だけ行われ、この一連の撮影と記録は、所定の待機時間を置いて繰り返し行われる。すべての撮影と記録を終了すると、すべての顕微鏡画像データは、画像データ編集部５５により編集され、動画像が生成される。画像データ編集部５５による動画像生成については後に詳述する。
【００２０】
蛍光像観察の場合は、励起光照明装置３３から射出した照明光は、調光フィルタ３３ａ、蛍光フィルタ装置３４を通り、対物レンズ３１の下方から入射する。対物レンズ３１に入射した光は、ウェルプレート１の底板を透過して試料Ｓを照射する。この励起光によって試料Ｓから蛍光が発する。蛍光は、ウェルプレート１、対物レンズ３１、蛍光フィルタ装置３４、第二対物レンズ３５を通り、ハーフプリズム３６で分岐する。一方の光は、ハーフプリズム３６を透過して撮像装置３７へ入射し、撮像素子３７ａの撮像面に結像する。他方の光は、ハーフプリズム３６で反射し、不図示の接眼レンズへ導かれる。試料Ｓの顕微鏡画像データの送出と記憶、二次元移動ステージ１２の移動、焦点調節等に関しては、透過像観察でも蛍光像観察でも同様である。
【００２１】
図３は、本実施の形態による光学顕微鏡システムにおける試料Ｓの撮影から動画編集までの過程を示すフローチャートである。今、ウエル１ａの数、すなわち試料Ｓの数がｍ個、各々の試料Ｓについて所定時間間隔で繰り返し行われる撮影回数をｎ回とする。ステップＳ１では、最初に撮影する試料Ｓのウエル１ａの位置を定め、ステップＳ２では、その試料Ｓを撮影し、ステップＳ３では、その試料Ｓの顕微鏡画像を記憶する。ステップＳ４では、すべての試料Ｓについて顕微鏡画像を記憶したか否かをチェックする。「否」であれば、ステップＳ５へ移行し、次の試料Ｓについて位置設定、撮影（ステップＳ２）、画像記憶（ステップＳ３）を行う。
【００２２】
ステップＳ４で、ｍ個の試料Ｓすべての撮影が終了すると、ステップＳ６へ移行し、所定の待機時間Ｔをおく。撮影回数ｎ＝２では、撮影回数ｎ＝１のときの各々の試料ＳのＸ−Ｙ位置データを利用して二次元移動ステージ１２を駆動して撮影位置を設定する。撮影回数ｎを増やしたときも同様である。従って、各々の試料Ｓは、常に同じ撮影位置で撮影される。なお、撮影の際に毎回焦点調節を行う場合は、ｍ個の試料Ｓ各々について撮影回数ｎ＝１のときに得られた焦点位置データを利用して撮影回数２回目以降の焦点調節を行うことができる。
【００２３】
ステップＳ７では、各々の試料Ｓについて予め定めた撮影回数に達したか否かをチェックする。「否」であれば、ステップＳ８へ移行し、撮影回数ｎを増やしてステップＳ１からステップＳ６を繰り返す。ステップＳ７で、所定の撮影回数ｎ回に達すると、ステップＳ９へ移行し、動画編集を行う。ステップＳ１０で、編集された動画像データを記憶すると、一連の作業を終了する。
【００２４】
図４は、本実施の形態による光学顕微鏡システムにおける動画編集のプロセスを示す図である。図４（ａ）は、撮影された顕微鏡画像を撮影順に並べたものであり、図４（ｂ）は、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像のみを時系列的に並べた動画像である。ｔ１１からｔｎｍまでは、各顕微鏡画像を撮影した時刻を表わす。
【００２５】
ここで図２を参照して、各々のウエル１ａ中の試料Ｓについて、撮影の順番をウエルプレート１の第３列から第７列のウエル１ａで説明する。最初の位置（ａ，３）のウエル１ａからスタートし、図中、矢印に従って下方に向かって位置（ｈ，３）のウエル１ａまで順次進み、位置（ｈ，４）のウエル１ａから上方に向かって位置（ａ，４）まで順次進み、最終の位置（ｈ，７）のウエル１ａに到達すると１回目の撮影が終了する。この一連の撮影は、図４の撮影回数ｎ＝１に対応するものであり、ｍ枚の顕微鏡画像を撮影する。
【００２６】
図４（ａ）に示されるように、待機時間Ｔだけ経過した後に、撮影回数ｎ＝２の過程に入る。図２では、最終の位置（ｈ，７）から最初の位置（ａ，３）へウエルプレート１を移動させる。撮影回数ｎ＝２においても、ｎ＝１と同様の位置設定と撮影を行い、ｍ枚の顕微鏡画像を撮影する。この一連の操作をｎ回繰り返す。すなわち、時刻ｔ１１からｔｎｍまで、ｍ×ｎ枚の顕微鏡画像を撮影する。
【００２７】
図４（ｂ）に示されるように、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像ｎ枚を時系列的に並べると動画像が得られる。各画像の時間間隔は、ｍ枚の画像を撮影するのに要する時間に、待機時間Ｔと最終の位置（ｈ，７）から最初の位置（ａ，３）へウエルプレート１を移動させるためのステージ移動時間とを加えた時間である。このようにして、ｍ個の位置で、すなわちｍ個の試料Ｓについてｎ枚の画像から成る動画像が得られる。
【００２８】
本実施の形態の光学顕微鏡システム１００は、ステージ制御部５１により、顕微鏡装置３０の観察視野に限らず、複数の観察視野を含む広範囲で二次元移動ステージ１２を駆動できるので、観察視野毎に撮影範囲を決める必要はなく、１段階の操作で、複数の異なる観察視野にある多くの試料Ｓを位置決めして撮影できる。この位置決めは、ステージ制御部５１により正確に行われるので、ブレの少ない滑らかな動きの動画が得られる。さらに、ステージ制御部５１に位置補正部５１ａを設けることにより、より一層ブレの少ない滑らかな動きの動画が得られる。なお、位置補正部５１ａを設けず、すべての撮像が終了した後の動画編集段階で、画像データ中のマークやウエル１ａのキズなどが各画面上で同じ位置になるように画像をシフトして編集してもよい。
【００２９】
本実施の形態では、二次元移動ステージ１２を駆動して各々の試料Ｓをその撮影位置へ移動させたが、ウエルプレート１を載置するステージを固定とし、光学顕微鏡３０をＸ−Ｙ方向に移動させてもよいし、二次元移動ステージ１２と光学顕微鏡３０の両者をＸ−Ｙ方向に移動させてもよい。また、観察される試料Ｓの像は、暗視野像でもよいし、位相差像でもよい。
【００３０】
以下、試料室１０内の環境調整方法について図５を参照して説明する。
図５は、図１に示した光学顕微鏡システム１００に環境制御装置６０を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図であり、図１と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。また、ステージ制御部５１、オートフォーカス部５２、ＰＣ５３、画像データ記憶部５４、画像データ編集部５５、表示部５６および透過照明装置４０は図示を省略する。
【００３１】
環境制御装置６０は、所望の温度、湿度および組成のガスを生成し、このガスを試料室１０内へ循環させる装置である。環境制御装置６０は、加湿器６１、加熱器６２、送風機６３、温度／湿度センサー６４、ＣＯ２ガスセンサー６５およびリザーブタンク６６を備えている。送風機６３は、ガス送出チューブ６７によって密閉容器２０の上板２１に配管接続されている。加湿器６１は、ガス吸入チューブ６８によって密閉容器２０の上板２１に配管接続されている。上板２１の配管接続箇所は、試料室１０へ連通している。また、加湿器６１は、リザーブタンク６６に配管接続されている。加熱器５２と送風機５３との間から分岐する経路には電磁弁６９が設けられ、ＣＯ２ガスボンベからガスを導入できるようになっている。
【００３２】
温度／湿度センサー６４は、試料室１０内の温度と湿度をモニタするために、密閉容器２０の上板２１の下面に取り付けられている。ＣＯ２ガスセンサー６５は、試料室１０内のＣＯ２ガス濃度をモニタするために、ガス吸入チューブ６７の経路の途中に取り付けられている。各チューブには断熱処理が施されている。
【００３３】
ガス送出チューブ６７によって試料室１０へ供給されるガスは、次のようにしてガス組成、湿度および温度が調整される。ガス組成の調整は、ＣＯ２ガスセンサー６５の測定値をフィードバックして電磁弁６９の開放量を増減することにより行われる。湿度の調整は、温度／湿度センサー６４の測定値をフィードバックして、加湿器６１の超音波霧化素子への駆動電圧を増減することにより行われる。超音波霧化素子は、加湿器６１内の水から超音波振動によって水蒸気を発生させる。なお、加湿器６１内の水は、リザーブタンク６６からの供給によって常に一定量が確保されている。温度の調整は、温度／湿度センサー５４の測定値をフィードバックして、加熱器５１の電熱ヒーターに流す電流を増減することにより行われる。
【００３４】
このようにして調整されたガスは、例えば、３７℃−１００％ＲＨ、５％ＣＯ２であり、環境制御装置６０からガス送出チューブ６７によって試料室１０へ供給され、試料室１０からガス吸入チューブ６８によって環境制御装置６０へ戻る。循環経路上の調整ガスは、環境制御装置６０によって再び所定の温度、湿度およびガス組成の空気として試料室１０内に送り込まれる。試料室１０は、密閉容器２０に収納されているので、調整ガスが外部に漏れる恐れはない。光学顕微鏡システム１００に環境制御装置６０を付設することにより、試料室１０内は常に所定の環境に維持されるので、試料Ｓも所定の条件に保つことができる。
【００３５】
続いて、試料室１０に配置されたウエルプレート１のウエル１ａ内の試料Ｓの変更方法について図６を参照して説明する。試料Ｓとは、前述したとおり、細胞などの生物試料に培養液などの試薬が添加されたものであり、生物試料と試薬の少なくともいずれかが異なる対象物である。
図６は、図１に示した光学顕微鏡システム１００に注入／吸入機構７０を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図であり、図１と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。また、ステージ制御部５１、オートフォーカス部５２、ＰＣ５３、画像データ記憶部５４、画像データ編集部５５および表示部５６は図示を省略する。
【００３６】
注入／吸入機構７０は、光学顕微鏡システム１００の上方に位置し、不図示の駆動機構によりＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動でき、試薬をピペット７１を介してウェルプレート１のウエル１ａ内に注入したり、ウエル１ａ内の試薬を吸入できるように構成されている。注入、吸入の際には、図示のように透過照明装置４０は光軸ＡＸ上から外される。シャッタ機構２２により密閉容器２０の上板２１の開口２１Ａを開放し、試料室１０の内部を外界に対して開放された状態とする。これにより、試薬の注入、吸入を自由に行うことができる。
【００３７】
試薬の注入、吸入または交換が終了すると、注入／吸入機構７０のピペット７１は上方に後退し、シャッタ機構２２が作動して、開口２１Ａを例えば透明基板で閉鎖し、透過像観察の場合は透過照明装置４０を光軸ＡＸ上へ復帰させる。これにより、試料室１０の内部は、外界に対しても密閉された状態になる。光学顕微鏡システム１００に注入／吸入機構７０を付設することにより、試薬の注入、吸入を自由に行うことができ、試料Ｓの顕微鏡観察および撮影の前でも最中でもウエル１ａ内の環境（試料Ｓの条件）を変えることができるので、多様化するユーザーの要望に迅速に対応することができる。
【００３８】
具体例としては、同じ試料Ｓを入れた各ウエル１ａにそれぞれ異なる試薬を注入し、注入後に各ウエル１ａの試料Ｓの撮像を行い、ウエル１ａ毎に生成された動画を比較することにより、試薬の効果の違いを調べることができる。また、同じ試料Ｓを入れた各ウエル１ａに、撮影順に同一試薬の注入量を段階的に変化させて添加し、各ウエル１ａの試料Ｓの撮像を行い、ウエル１ａ毎に生成された動画を比較することにより、試薬の添加量による試料の変化の状況や添加から変化が現れるまでの時間を知ることができ、試薬の効果が生じる最適な添加量を見究めることができる。このように、異なる条件の試料毎に経時変化を観察することができる。また、注入／吸入機構７０が個々のウエル１ａに試薬を添加するタイミングと撮像装置３７が試料Ｓを撮像するタイミングとを連動して制御する構成とすれば、各ウエル１ａ中の試料Ｓの経時変化をより正確に比較観察することができる。
【００３９】
本発明は、光学顕微鏡システムに、小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置へ各観察試料を移動させるように、試料保持手段と観察手段とを相対的に移動制御する制御手段を設けることに特徴がある。本発明は、その特徴を損なわない限り、以上説明した実施の形態に何ら限定されない。なお、画像データ編集部５５は、動画像生成手段に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムの構成を模式的に示す全体構成図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムで用いられる培養容器（ウエルプレート）の構造を模式的に示す平面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムにおける試料Ｓの撮影から動画編集までの過程を示すフローチャートである。
【図４】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムにおける動画編集のプロセスを示す図である。図４（ａ）は、撮影された顕微鏡画像を撮影順に並べたものであり、図４（ｂ）は、位置（ａ，３）の試料Ｓの画像のみを時系列的に並べた動画像である。
【図５】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムに環境制御装置を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る光学顕微鏡システムに注入／吸入機構を付加した場合の全体構成を模式的に示す構成図である。
【符号の説明】
【００４１】
１：培養容器（ウエルプレート）
１ａ：ウエル
１０：試料室
１２：二次元移動ステージ
２０：密閉容器
２２：シャッタ機構
３０：顕微鏡装置
３１：対物レンズ
３２：焦点調節機構
３７：撮像装置
４０：透過照明装置
５１：ステージ制御部
５２：オートフォーカス部
５３：ＰＣ
５４：画像データ記憶部
５５：画像データ編集部
５６：表示部
６０：環境制御装置
７０：注入／吸入機構
１００：光学顕微鏡システム
Ｓ：試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の小室にそれぞれ観察試料が収容された容器を保持する保持手段と、
前記観察試料の顕微鏡像を形成する観察手段と、
前記観察手段により前記観察試料のそれぞれの顕微鏡像を形成するように、前記保持手段と前記観察手段とを相対移動する相対移動手段と、
前記観察手段による前記顕微鏡像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で撮像した前記顕微鏡像の画像データを記憶する記憶手段と、
前記小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で前記観察試料のそれぞれを前記撮像手段により撮像するように、前記相対移動手段を駆動制御する制御手段と、
前記記憶手段に記憶された前記観察試料のそれぞれの画像データを前記観察試料毎に時系列に並べることにより、前記観察試料のそれぞれの動画像を生成する動画像生成手段とを備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項２】
請求項１に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記各小室に観察試料が収容された容器周辺を所定の温度、湿度および炭酸ガス濃度に保持する環境制御装置をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項３】
請求項１または２に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記各小室内への試薬の追加、除去、交換を行う環境変更手段をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記制御手段は、前記各小室の底面に形成されたマークまたは前記各小室の底面に存在する形態的特徴を位置情報として予め取得し、そのマークまたは形態的特徴を位置基準として前記所定の撮影位置を補正することを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
オートフォーカス機構をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項６】
ウエルプレートの複数のウエルにそれぞれ収容された生体試料を順番に撮像して各生体試料の動画像を生成する試料動画像生成方法において、
前記複数のウエルの位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で前記生体試料の顕微鏡像をそれぞれ撮像し、
前記撮像により得られた前記顕微鏡像の画像データを前記複数のウエルの位置情報とともに記憶し、
所定時間経過後に、前記撮像工程と前記記憶工程とを行い、
前記記憶されたそれぞれの画像データを前記複数のウエルの位置情報に基づいて生体試料毎に時系列に並べることにより、前記生体試料のそれぞれの動画像データを生成することを特徴とする試料動画像生成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の試料動画像生成方法において、
前記撮像工程と前記記憶工程の後に、前記複数のウエルの１以上のウエルに対して試薬の追加或いは除去による環境変化工程をさらに行うことを特徴とする試料動画像生成方法。
【請求項１】
複数の小室にそれぞれ観察試料が収容された容器を保持する保持手段と、
前記観察試料の顕微鏡像を形成する観察手段と、
前記観察手段により前記観察試料のそれぞれの顕微鏡像を形成するように、前記保持手段と前記観察手段とを相対移動する相対移動手段と、
前記観察手段による前記顕微鏡像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で撮像した前記顕微鏡像の画像データを記憶する記憶手段と、
前記小室の位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で前記観察試料のそれぞれを前記撮像手段により撮像するように、前記相対移動手段を駆動制御する制御手段と、
前記記憶手段に記憶された前記観察試料のそれぞれの画像データを前記観察試料毎に時系列に並べることにより、前記観察試料のそれぞれの動画像を生成する動画像生成手段とを備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項２】
請求項１に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記各小室に観察試料が収容された容器周辺を所定の温度、湿度および炭酸ガス濃度に保持する環境制御装置をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項３】
請求項１または２に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記各小室内への試薬の追加、除去、交換を行う環境変更手段をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
前記制御手段は、前記各小室の底面に形成されたマークまたは前記各小室の底面に存在する形態的特徴を位置情報として予め取得し、そのマークまたは形態的特徴を位置基準として前記所定の撮影位置を補正することを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の光学顕微鏡システムにおいて、
オートフォーカス機構をさらに備えることを特徴とする光学顕微鏡システム。
【請求項６】
ウエルプレートの複数のウエルにそれぞれ収容された生体試料を順番に撮像して各生体試料の動画像を生成する試料動画像生成方法において、
前記複数のウエルの位置情報に基づいて予め定められた順番の撮影位置で前記生体試料の顕微鏡像をそれぞれ撮像し、
前記撮像により得られた前記顕微鏡像の画像データを前記複数のウエルの位置情報とともに記憶し、
所定時間経過後に、前記撮像工程と前記記憶工程とを行い、
前記記憶されたそれぞれの画像データを前記複数のウエルの位置情報に基づいて生体試料毎に時系列に並べることにより、前記生体試料のそれぞれの動画像データを生成することを特徴とする試料動画像生成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の試料動画像生成方法において、
前記撮像工程と前記記憶工程の後に、前記複数のウエルの１以上のウエルに対して試薬の追加或いは除去による環境変化工程をさらに行うことを特徴とする試料動画像生成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−３８９７７（Ｐ２００６−３８９７７Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１５２８６（Ｐ２００４−２１５２８６）
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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