免疫療法のための組成物および方法
感染性疾患、主として特に転移性新生物性疾患、例えば限定されないが、ヒト肉腫、癌腫および黒色腫の予防および処置のための方法および組成物が提供される。特に、疾患組織または疾患細胞の細胞表面上の特定のあるリガンドの存在によって媒介および／または指示される感染性疾患および癌の予防および処置を記載する。これらにより、該組織または細胞は免疫療法に対して感受性となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、免疫療法の分野に関する。より詳しくは、本発明は、感染性疾患、主として特に、転移性新生物性疾患、例えば限定されないが、ヒト肉腫、癌腫および黒色腫の予防および処置のための方法および組成物に関する。本発明によれば、感染性疾患および癌の予防および処置の実施は、疾患組織または疾患細胞の細胞表面上の特定のあるリガンドの存在によって媒介および／または指示され、該リガンドは該組織または細胞を免疫療法、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞系療法に対して感受性にする。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫学の時代は、メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導型肉腫上の抗原が、移植アッセイにおいて、マウスの正常組織ではこの抗原が検出され得なかった点で腫瘍特異的であることを示したＰｒｅｈｎおよびＭａｉｎの実験とともに始まった（Ｐｒｅｈｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１（１９５７），７６９ ７７８）。この概念は、ＭＣＡ誘導型腫瘍に対する腫瘍特異的抵抗性が、自発性（ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ）宿主、すなわち腫瘍が最初に発生したマウスにおいて誘発され得ることを示すさらなる実験によって確認された。放射線は癌療法において、単独レジメンとして、または細胞増殖抑制薬との組み合わせで放射線化学療法としてのいずれかで、高頻度に使用されている。しかしながら、照射抵抗性腫瘍クローンは、治療効率を制限している。
【０００３】
ストレス誘導性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０は、アポトーシスに対して細胞を保護することがよく知られた分子シャペロンである（１）。ＨＳＰ７０の過剰発現は、種々の腫瘍で報告されており、腫瘍形成性の増強および治療抵抗性と関連していることがわかった（２）。このような知見と一致して、腫瘍細胞におけるＨＳＰ７０の実験的下方調節により、動物モデルにおいて腫瘍後退が増強されることが報告された（３〜５）。しかしながら、数例の他の動物モデルでは、反対の観察結果が得られた。ＨＳＰ７０発現は、腫瘍後退と関連していることがわかった（６〜９）。これらの場合では、ＨＳＰ７０は、腫瘍の免疫原性を増大させるようであった。数多くの研究において、ＨＳＰ７０は、先天免疫反応および養子免疫反応を活性化させることが示されている（１０，１１）。ＨＳＰ７０は、抗原性ペプチドをシャペロン輸送し、受容体媒介型様式で、プロフェッショナル抗原提示細胞の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ提示経路内にチャネル通過させ、次いで、ペプチド特異的ＣＴＬをプライムする。したがって、腫瘍由来のＨＳＰ７０調製物は、腫瘍特異的ワクチン接種に使用され得る（１０，１１）。ＨＳＰ７０はまた、先天免疫細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を誘発し、共刺激分子の発現を増大させる（１０，１１）。さらに、ＨＳＰ７０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、細胞表面にＨＳＰ７０を発現する腫瘍細胞を特異的に死滅させることが示されている（１２）。これらの特徴により、ＨＳＰ７０は、内因性アジュバントおよび免疫学的危険シグナルとみなされている（１３，１４）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、免疫学の技術分野、ならびに疾患組織または疾患細胞の細胞表面上のＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄリガンド、例えば主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子などの存在によって媒介および／または指示される疾患の処置に関する。特に、本発明は、ストレス誘導性内因性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂが腫瘍に対してＮＫ細胞を相乗的に活性化させるという驚くべき知見を利用する。
【０００５】
ＨＳＰ７０は抗アポトーシス性であるがＣＴＬ応答を惹起し得ることが知られているため、提示された１つの疑問は、ＨＳＰ７０が腫瘍細胞を、ＣＴＬによって媒介されるアポトーシスから保護するかどうかに関することであった。ヒト黒色腫細胞株Ｇｅのモデルにおいて、以前に、ＭＨＣ連鎖ストレス誘導性ＨＳＰ７０の構成的過剰発現では、顆粒エキソサイトーシス経路においてＣＴＬによって媒介されるアポトーシスに対する防御はなされないことが示された（１５）。急性的なＨＳＰ７０過剰発現は、インビトロでＣＴＬに対する感受性を増大させることすらあり得る（１５，１６）。免疫系は、別様式の防御的ストレス応答を受けている標的細胞を死滅させることができるようである。
【０００６】
本発明の目的は、養子免疫伝達されたＣＴＬに対するＧｅ黒色腫細胞の感受性に対するＨＳＰ７０発現のインビボでの効果を調べることであった。しかしながら、ＢおよびＴリンパ球が欠損した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスでは、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖は、いずれの養子免疫療法前であっても、対照腫瘍と比べて低減された。より印象的なことには、浸潤性の増殖および局所転移は、非ＨＳＰ７０過剰発現対照腫瘍を有する動物でのみ観察された。本発明によれば、驚くべきことに、ストレス誘導性危険シグナルＨＳＰ７０が、ＳＣＩＤマウスにおいてマウスＮＫ細胞を、ならびにヒトＮＫ細胞をインビトロで活性化し、これによって腫瘍細胞上の第２のストレス誘導性危険シグナルであるＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子が認識されることを示すことができた。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子はＭＨＣ内にコードされており、ストレス誘導性であり、腸上皮細胞および腫瘍に限定された様式で発現される（１７）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢは、活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである（１８）。内因性ストレス誘導性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂはともに、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞媒介型免疫応答を相乗的に惹起した。動物モデルにおいて、この２つの危険シグナル誘導型先天免疫応答によって、原発腫瘍の増殖が低減され、転移を抑制することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞、好ましくは活性化ＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子に関し、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与する。好ましくは、前記リガンドはＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡまたはＢであり、前記ＮＫ細胞は、患者への投与前に活性化されるか、またはＮＫ細胞の活性化因子、例えば、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドとともに投与されるように設計される。
【０００８】
本発明による化合物の使用は、インターロイキン、インターフェロンまたは他の抗癌薬などのさらなる治療用薬剤の使用を伴い得る。さらに、本発明の医薬組成物は、細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子、例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害因子、例えばトリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などを含み得るか、または該因子とともに投与されるように設計され得る。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、望ましくない細胞に対する免疫応答、すなわち、ＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のためのＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子の使用を提供することである。前記医薬組成物には、さらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含めてもよい。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、対象における腫瘍または感染性疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用を提供することであり、該疾患は、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドを過剰発現する細胞を根拠に陽性と判定されている。前記ＮＫ細胞は、対象への投与前に活性化させてもよく、あるいはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記活性化因子はＨｓｐ７０のペプチドを含む。さらに、疾患細胞が実質的に細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を欠く場合、前記細胞をまた、細胞表面上にＨＳＰ７０を発現するように誘導してもよい。
【００１１】
また、本発明は、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子を、ＮＫ細胞の活性化因子、例えば、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドおよび／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む、腫瘍または感染性疾患の標的化および／または処置に有用な併用調製物に関する。
【００１２】
当然、該医薬組成物は、化学療法剤などの他の薬物と組み合わせて投与してもよい。好適な化学療法剤は、当業者には公知であり、アントラサイクリン類、例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン、タクソール、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリケアマイシンが挙げられる。その選択は、処置が意図される疾患に依存性であり得る。
【００１３】
ほとんどの実施形態は、医学的用途との関連で記載したが、本発明の範囲、したがって添付の特許請求の範囲には、研究目的のみの細胞／組織培養方法および動物試験もまた包含されることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｈｓｐ７０過剰発現黒色腫細胞由来の腫瘍の増殖が遅く、局所転移が起こらないことを示す図である。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ細胞をＳＣＩＤマウスの側腹に皮下注射した（ＰＢＳ中１×１０６細胞／動物）。腫瘍増殖が観察されたＳＣＩＤマウスの腫瘍の大きさの平均±ＳＤ。
【図２】図２は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞の増殖およびアポトーシス速度は、インビトロで異ならないことを示す図である。Ａは、Ｇｅ−ｃｏｎ（Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ、Ｇｅ−ＧＦＰ−Ｂ）およびＧｅ−Ｈｓｐ７０（Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ）細胞のインビトロでの増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みによってアッセイした。３つの独立したアッセイの代表的な実験の３連のｃｐｍの平均±ＳＤを示す。Ｂは、黒色腫細胞を、低酸素雰囲気中またはグルコース無含有培地中で２４時間培養した。アポトーシス細胞の割合（ＤＮＡヒストグラムのサブＧ１のピークにおける細胞の％）を、フローサイトメトリーによって、処理前（ｐｒｅ）ならびに処理の２、２４および４８時間後に測定した。４つの独立した実験のアポトーシス細胞の平均＋ＳＤを示す。
【図３】図３は、ＮＫ細胞が、ＳＣＩＤマウスにおけるＨｓｐ７０過剰発現黒色腫細胞の増殖の低減を担うことを示す図である。Ａは、脾臓中のＮＫ細胞の割合の平均＋ＳＤ。抗ＤＸ５ ｍＡを使用した。フローサイトメトリーによって検出。Ｇｅ−ｃｏｎもしくはＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を有するＳＣＩＤマウス、または腫瘍細胞が拒絶された（腫瘍なし）動物間で著しく異ならない。Ｂは、種々のエフェクター標的比における、Ｇｅ−ｃｏｎ腫瘍を有する３匹のＳＣＩＤマウスおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を有する３匹のＳＣＩＤマウス由来の脾細胞によるＹＡＣ−１標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。ここに示した実験は、５つの独立したアッセイの代表である。Ｃは、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ細胞を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの側腹に皮下注射した（ＰＢＳ中１×１０６細胞／動物）。腫瘍増殖が観察された動物の腫瘍の大きさの平均±ＳＤ。
【図４】図４は、細胞表面にＨＳＰ７０を発現しない腫瘍が、エキソソーム内でＨＳＰ７０を放出すること示す図である。エキソソームは、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞から調製した。１０μｇのエキソソームタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＨＳＰ７０の存在について、誘導性ＨＳＰ７０に特異的なｍＡｂ Ｃ９２を用いたイムノブロットによって解析した。抗Ｒａｂ４ Ａｂを、エキソソームタンパク質の負荷対照として使用した。
【図５】図５は、ＬＡＫ細胞が容易にＭＩＣＡトランスフェクト標的細胞を溶解することを示す図である。Ａは、ＭＩＣＡトランスフェクトＬ−ＭＩＣＡ細胞および親Ｌ細胞上でのＭＩＣＡおよびＨＳＰ７０発現のフローサイトメトリーによる解析。ＭＩＣＡ細胞表面発現は、抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに対する２種類のモノクローナル抗体での染色によって、ならびに組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質の結合によって示される。それぞれ一次試薬（黒線）およびＦＩＴＣ標識二次試薬のみ（破線）での染色を、非染色細胞（点線）とともに示す。抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清について、免疫前血清＋二次抗体（破線）での染色を対照として示す。結果は、３つより多くの独立した実験の代表である。ともにヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと反応するクローンＢＡＭＯ３およびＩＩＩＣ１由来のハイブリドーマの上清みを使用した。抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清は、ＦＶＢ／Ｎマウスを、トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスに由来し、アカゲザルのＭＩＣＡ遺伝子を有するコスミドＡ１５８を含むＭＩＣＡ発現リンパ球で免疫処置することにより生成した。Ｂは、インビトロで４日間ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）によって刺激した同じドナー由来の新鮮単離ＰＢＭＣまたはＬＡＫ細胞によるＫ５６２、ＬおよびＬ−ＭＩＣＡ標的細胞の３連の特異的溶解の平均＋ＳＤ。Ｃは、８つの独立した実験で測定した、ＰＢＭＣまたはＬＡＫエフェクター細胞によるＫ５６２、Ｌ−ＭＩＣＡおよびＬ標的細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。最大エフェクター標的比（１００：１）でのＰＢＭＣによるＫ５６２細胞の溶解割合を各試験において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比でのＰＢＭＣおよびＬＡＫ細胞による種々の標的細胞の相対溶解を計算した。各細胞型について別々にＡＮＯＶＡによって解析したように、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞は、ヒトＬＡＫ細胞によって非刺激ＰＢＭＣよりも有意に良好に死滅された（ｐ＝００００３）が、古典的なＮＫ標的細胞株Ｋ５６２は、ＰＢＭＣによって、より容易に溶解された（ｐ＝０．０１２１）。
【図６】図６は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現が、細胞表面にＨＳＰ７０を発現しない腫瘍において誘導されることを示す図である。Ａは、Ｇｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍から単離した細胞上でのＨＳＰ７０細胞表面発現のフローサイトメトリーによる解析。陽性細胞の割合を示す。図示した実験は、ＳＣＩＤ由来の８つの腫瘍およびＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の１０個の腫瘍の代表である。Ｋ５６２細胞を陽性対照として供した。Ｂは、ノザンブロット解析および濃度測定により、β−アクチンに対する比として測定した、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ヒトＨＳＰ７０−２およびラットＨｓｐ７０−１ ｍＲＮＡ発現の平均＋ＳＤ。本発明者らは、ＳＣＩＤマウス由来の１８個のＧｅ−ｃｏｎ腫瘍および２１個のＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍、ならびにＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の１６個のＧｅ−ｃｏｎ腫瘍および１４個のＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を解析した。インビトロでの該細胞株データは、７〜１２の個々の実験から収集した。Ｃは、Ｇｅ−ｃｏｎ由来腫瘍から単離した細胞上でのＭＩＣＡ／Ｂ（ｍＡｂ ＢＡＭＯ−１）、ＨＳＰ７０（ｍＡｂ ＲＰＮ １１９７）およびＮＫＧ２Ｄリガンド細胞表面発現のフローサイトメトリーによる解析。９５％より多くのゲート（ｇａｔｅｄ）細胞がヒト黒色腫細胞であり、これは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子（ｍＡｂ Ｗ６／３２）に対して陽性であった。上側パネルと下側パネルは、異なる個体の腫瘍に由来する。
【図７】図７は、ＬＡＫ細胞がＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤによって刺激され、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させることを示す図である。Ａは、インビトロで７日間、ＩＬ−２のみ（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋組換えＨＳＰ７０（２μｇ／ｍｌ）またはＨＳＣ７０（２μｇ／ｍｌ）で刺激したＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ（黒記号）またはＬ（白記号）標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。図示した実験は、３つの独立した実験の代表である。Ｂは、６つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−２＋ＨＳＰ７０（２μｇ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＬＡＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。最大エフェクター標的比（５０：１）でのＩＬ−２刺激ＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ細胞の溶解割合を各試験において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比での種々のエフェクター細胞による標的細胞の相対溶解を計算した。Ｃは、６つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＬＡＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。
【図８】図８は、ＮＫ細胞がＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤによって刺激され、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させることを示す図である。Ａは、ＰＢＭＣ（ＭＡＣＳ分離前）およびＮＫ細胞富化（ＮＫ＋）ならびにＮＫ細胞枯渇（ＮＫ−）細胞集団のフローサイトメトリーによる解析。７つの独立した実験のマーカー陽性細胞の割合の平均＋ＳＤを示す。Ｂは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）によりインビトロで５日間刺激した単離ＮＫ細胞（ＮＫ＋）またはＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ（ＮＫ−）によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。図示した実験は、ＮＫ−の３つの実験およびエフェクター細胞としてのＮＫ＋細胞の７つの実験の代表である。Ｃは、７つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で５日間刺激したＮＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。
【図９】図９は、Ｇｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０黒色腫細胞でのＭＩＣＡ／Ｂの誘導により、ＬＡＫ細胞媒介型細胞傷害性に対する感受性が増大することを示す図である。Ａでは、ＨＳＰ７０（ｍＡｂ ＲＰＮ １１９７）、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ（ｍＡｂ ＢＡＭＯ１）、およびＮＫＧ２Ｄリガンド（ヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質）の細胞表面発現に対するＧｅ−ｃｏｎ細胞のフローサイトメトリーによる解析を行なった。細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。９つの独立した実験で得たＭＩＣＡ／Ｂ、ヒトＮＫＧ２Ｄのリガンド、およびＨＳＰ７０の細胞表面発現を示す細胞の平均＋ＳＤ、ならびにＧｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−ＨＳＰ７０細胞の平均蛍光強度（ＭＩＦ）＋ＳＤ。Ｂは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で４日間刺激したＰＢＭＣによるＧｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。最大エフェクター標的比（１００：１）でのＬＡＫ細胞によるそれぞれの細胞の溶解割合を、各試験（ｎ＝４）において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比での種々のエフェクター細胞による標的細胞の相対溶解を計算した。ＳＡＨＡ処理細胞は、未処理細胞よりも有意に良好に溶解された（ｐ＝０．００３０、処理に対して三元配置ＡＮＯＶＡ、標的細胞型およびエフェクター：標的比は１００：１および５０：１）。標的細胞型はまた、ＳＡＨＡ処理との組み合わせにおいても重要であったため（ｐ＝００００６）、細胞型による層化ＡＮＯＶＡを行ない、両方の標的細胞株に対してこの結果を確認した（Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ：ｐ＝０．００７５およびＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ：ｐ＝０．００４５）。
【図１０】図１０は、ＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ処理と、Ｇｅ−ｃｏｎ標的細胞におけるＭＩＣＡ／Ｂ誘導との併用により、死滅が相乗的に増大されることを示す図である。これは、ＴＫＤでの刺激後、増大量のグランザイムＢの発現のためである可能性がある。Ａは、ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）を併用して、または併用せずにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）とともに、またはなしで５日間培養したＮＫ細胞によるＧｅ−ｃｏｎ標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。Ｂは、４つの独立した実験で測定した、ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）を併用して、または併用せずにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で５日間刺激したＮＫ細胞によるＧｅ−ｃｏｎ細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。Ｃは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）との５日間の培養前（ＮＫ＋）および培養後のＭＡＣＳ富化ＮＫ細胞のフローサイトメトリーによる解析。７つの独立した実験のマーカー陽性細胞の割合の平均＋ＳＤを示す。Ｄは、細胞内染色後、フローサイトメトリーによって測定した、５つの独立した実験のグランザイムＢの平均蛍光強度（ＭＦＩ）＋ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、原発性および転移性新生物性疾患および感染性疾患の研究、予防および処置のため、および哺乳動物、特にヒト個体の所望の標的細胞に対して免疫応答を惹起するための方法および組成物に関する。特に、本発明の一態様によれば、対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用が提供され、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与する。
【００１６】
本発明は、腫瘍の免疫原性を増大させてＣＴＬ応答を誘導し得る内因性危険シグナルとして機能を果たすことが公知であるストレス誘導性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０が、腫瘍細胞上のストレス誘導性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子を認識するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄにより活性化させることもできるという観察結果に基づく。後述する実施例に示すように、ＨＳＰ７０過剰発現ヒト黒色腫細胞からの腫瘍の大きさおよび転移速度は、Ｔ細胞およびＢ細胞欠損ＳＣＩＤマウスにおいて低下したが、機能性ＮＫ細胞がさらに欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスでは低下しなかった。ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍におけるＭＩＣＡ／Ｂ発現に対する対抗選択は、ＳＣＩＤマウスにおいて観察されたが、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでは観察されなかった。腫瘍由来ＨＳＰ７０は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現腫瘍細胞を死滅させると思われるＳＣＩＤマウスにおいてＮＫ細胞を活性化させることができた。この動物モデルにおける観察結果に従い、完全長ＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドは、インビトロでヒトＮＫ細胞を活性化し、ＭＩＣＡ／Ｂ発現を薬理学的手段によって誘導させたＭＩＣＡトランスフェクト標的細胞および黒色腫細胞を死滅させることができた。したがって、２つのストレス誘導性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂの相乗作用的活性によってＮＫ細胞の活性化増強がもたらされ、腫瘍増殖の低減および転移の抑制がもたらされる。
【００１７】
ＮＫ細胞およびＨＳＰ７０は、それぞれ、感染性疾患の対処にも関与することが公知であるため、本発明は、腫瘍および感染性疾患に対して実施され得る。したがって、原則的には本発明により、細胞表面上にＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する所望の細胞または望ましくない細胞を作製することにより、任意の標的細胞が免疫療法に対して感受性となり得る。
【００１８】
「ＮＫ細胞」は、本明細書で用いる場合、典型的には、細胞表面マーカーとして発現されたＣＤ１６および／またはＮＣＡＭおよび／またはＣＤ５６分子を有するがＣＤ３を発現しないリンパ球、好ましくはヒト起源のリンパ球をいう。ＮＫ細胞は、哺乳動物のインビボで存在する細胞またはインビトロで精製細胞集団の形態で存在する細胞をいう。ＮＫ細胞活性化剤」または「ＮＫ細胞の活性化因子」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物の癌細胞またはウイルス感染細胞の休止（または未処置）ＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強または増大させることができる薬剤をいう。かかる薬剤としては、限定されないが、１種類以上のＴｏｌｌ受容体を活性化させる薬剤、例えば、グランザイムＡまたはグランザイムＢ、種々のインターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２ ＩＬ−１５など、およびインターフェロン、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどが挙げられる。
【００１９】
ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄの（に対する）リガンドは、当業者には周知であり、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＵＬ１６結合タンパク質ファミリーの構成員（ＵＬＢＰ）１〜４が包含される；例えば、Ｆｒｉｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３（２００３）、８９９６−９００６を参照のこと。ＮＫＧ２Ｄ受容体のヒトリガンドであるＵＬＢＰもまた特徴付けされており、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｂｌｏｏｄ １０８（２００６）、１３１３−１３１９に記載されている。また、国際特許出願ＷＯ２００５／０８０４２６には、ＵＬ１６およびＮＫＧ２Ｄ受容体に高い親和性で結合するＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰタンパク質ファミリーの新規な構成員（ＲＡＥＴ１Ｇ）が記載されている。
【００２０】
さらに、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体などの人工リガンドを使用してもよい。例えば、国際特許出願ＷＯ０２／０６８６１５を参照のこと。これには、とりわけ、人工的に操作された細胞集団を含むＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞を刺激するための抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびリガンド誘導体の使用が記載されている。これに関連して、本発明によれば、標的細胞は、所与の細胞が本発明の処置および使用に対して感受性となるように、ＮＫＧ２Ｄの天然または人工リガンドを新たに、または誘導／増強レベルでのいずれかで発現するように遺伝子操作されてもよいことは理解されよう。
【００２１】
用語「処置」、「処置すること」などは、本明細書では、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味するために用いる。該効果は、疾患もしくはその症状を完全にまたは一部防ぐ点から予防的であり、ならびに／あるいは疾患および／もしくは疾患に起因する有害効果が完全にまたは一部治癒する点から治療的であり得る。用語「処置」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるがまだ該疾患を有すると診断されていない対象において該疾患が発症するのを予防すること；（ｂ）疾患を抑止すること、すなわち、その進行を停止させること；または（ｃ）疾患を軽減させること、すなわち、該疾患の後退をもたらすことが挙げられる。
【００２２】
さらに、用語「対象」は、本明細書で用いる場合、免疫療法、例えば、新生物性または感染性疾患の改善、処置および／または予防を必要とする動物に関する。最も好ましくは、前記対象はヒトである。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた方法に従って製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。好適な医薬用担体の例は、当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョンなど、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体を含む組成物は、よく知られた慣用的な方法によって製剤化され得る。このような医薬組成物は、対象に適当な用量で投与され得る。適当な組成物の投与は、種々の様式によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的または皮内投与によって行なわれ得る。エーロゾル製剤、例えば経鼻スプレー製剤などには、活性薬剤の精製水溶液または他の溶液が、保存剤および等張剤とともに含まれる。かかる製剤は、好ましくは、鼻の粘膜と適合するｐＨと等張性状態に調整される。経直腸または経膣投与のための製剤は、適当な担体を有する坐剤として提示され得る。
【００２４】
投薬レジメンは、主治医および臨床因子によって決定される。医学分野でよく知られているように、任意のある患者に対する投薬量は、多くの要素、例えば、患者の体格、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の期間および経路、一般健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内（この範囲内での発現もしくは発現の阻害のための核酸）であり得る。しかしながら、特に上記の要素を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量も想定される。一般的に、医薬組成物の規則的な投与としてのレジメンは、１μｇ〜１０ｍｇ単位／日の範囲内であるのがよい。レジメンが連続注入である場合でも、それぞれ、１μｇ〜１０ｍｇ単位／キログラム体重／分の範囲内であるのがよい。進行は、定期的な評価によってモニターされ得る。
【００２５】
非経口投与のための調製物には、滅菌された水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えばオリーブ油など、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどである。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、体液および栄養分補給物質、電解質補給物質（リンゲルデキストロース系のものなど）などが挙げられる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート試薬および不活性ガスなどを存在させてもよい。さらに、本発明の医薬組成物の意図される用途に応じて、該医薬組成物にインターロイキンまたはインターフェロンなどのさらなる薬剤を含めてもよい。さらに、例えば、本発明の医薬組成物に受動免疫処置のためのＮＫＧ２Ｄのリガンドが含まれる場合、医薬組成物はワクチンとしても製剤化され得る。
【００２６】
また、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましいことがあり得る。治療有効用量または治療有効量は、症状または病状が改善されるのに充分な活性成分の量をいう。かかる化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物での標準的な製薬手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で示され得る。
【００２７】
本発明による医薬組成物は、免疫応答障害に関連する疾患の処置、好ましくは感染性疾患、敗血症、糖尿病の処置、または腫瘍の処置のために使用され得る。好ましくは、処置される腫瘍は、婦人科腫瘍、例えば前立腺腫瘍など、神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、未分化神経外胚葉性腫、脳幹神経膠腫癌、結腸癌、気管支の癌、扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、結腸、頚部または膵臓の癌、頭部／首部の癌、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、中皮腫、白血病、黒色腫、婦人科腫瘍、例えば前立腺など、および髄膜癌腫（ｍｅｎｉｎｇｅｏｍａ）からなる群より選択される。
【００２８】
上記および後の実施例に示すように、本発明の基礎をなす概念は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡとＢをそれぞれ、ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして用いて確認した。したがって、ＭＩＣＡ／Ｂまたは機能的に等価な分子は、本発明に従って使用される好ましいリガンドである。
【００２９】
ヒトＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、先行技術に示されており、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースで容易に検索することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１２４６５２（ＮＭ＿０００２４７）および、例えば、ＶｅｒｎｅｔらによるＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８（１９９３），４７−５３などの刊行物を参照のこと。同様に、ＭＩＣＢのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９３１およびＢＣ０４４２１８ならびに例えば、ＢａｈｒａｍらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１９９４），６２５９−６２６３；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５（１９９６），１６１−１６２；ならびにＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３（１９９６），２３０−２３３などの刊行物を参照のこと。
【００３０】
対象由来の試料において、ＭＩＣポリペプチド、ＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢのいずれかまたは両方の存在を調べるための手段および方法は、当業者には周知である。例えば、国際特許出願ＷＯ０３／０８９６１６を参照のこと。このような方法は、本発明の医学的用途、例えば、疾患細胞上のＭＩＣポリペプチドについてアッセイすることにより対象において癌を検出すること、および次いで、本明細書に記載の癌療法剤を投与することを伴う癌療法のために実施され得る。
【００３１】
前記ＮＫ細胞は、患者への投与前に活性化させてもよく、ＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計されてもよい。好ましくは、前記活性化因子は、Ｈｓｐ７０のペプチドを含み、これは、後の実施例で、この目的に最も有効であることが示された。さらに、Ｈｓｐ７０タンパク質またはその断片の使用によるＮＫ細胞の活性化方法、およびそのようにして得られる生成物の医学的適用、例えば、Ｈｓｐ７０タンパク質もしくはその断片または活性化ＮＫ細胞を含有する調合薬、医薬品または医薬用アジュバントなどが、国際特許出願ＷＯ９９／４９８８１に記載されている。さらに、Ｈｓｐ７０タンパク質由来の免疫調節ペプチドおよびＮＫ細胞活性の刺激のためのかかるペプチドの使用が、国際特許出願ＷＯ０２／２２６５６に開示されている。本発明の特に好ましい実施形態において、ＮＫ活性化剤は、実質的にアミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）からなるＨＳＰ７０ペプチドである。後の実施例も参照のこと。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、さらなる免疫調節性の薬剤、好ましくは、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのインターロイキンとともに投与され得る。実施例に示すように、インターロイキンＩＬ−２の使用は、悪性細胞の処置のために免疫細胞を活性化させるのに好都合であり、したがって好ましく使用される。
【００３３】
本発明の範囲において行なった実験によって、さらに、Ｇｅ黒色腫細胞においてＮＫＧ２Ｄのリガンド、すなわちＭＩＣＡ／Ｂの発現を薬理学的に誘導すると、これらは、ＨＳＰ７０活性化型ヒトＮＫ細胞の標的となり得ることが明らかになった。後の実施例９を参照。したがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドの発現の誘導因子を含むか、または該誘導因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記誘導因子はヒストンデアセチラーゼ阻害因子、例えば、実施例で使用したトリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である。しかしながら、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドの発現の他の誘導因子、例えば、バルプロ酸ナトリウム（Ａｒｍｅａｎｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（２００５），６３２１）、電離放射線、マイトマイシンＣ、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、アフィジコリン、クロロキン（Ｇａｓｓｅｒら Ｎａｔｕｒｅ ４６３（２００５），１１８６）も同様に使用され得る。
【００３４】
さらに、ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＮＫ細胞によって媒介される細胞溶解的攻撃の標的認識構造として提供され得る。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のための、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子の使用に関する。前記ＮＫ細胞は、対象への投与前に活性化させてもよく、あるいはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記活性化因子はＨｓｐ７０のペプチドを含む。前掲参照。さらに、疾患細胞が実質的に細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を欠く場合、前記細胞を、細胞表面上にＨＳＰ７０を発現するように誘導してもよい。
【００３５】
したがって、前記医薬組成物は、さらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含み得る。
【００３６】
さらに、前記医薬組成物は、免疫応答を増強する少なくとも１種類の化合物をさらに含むか、またはかかる化合物とともに投与されるように設計され得る。また、前掲も参照のこと。好ましくは、処置対象の前記望ましくない細胞は、腫瘍細胞または感染細胞である。すでに先に記載のように、前記医薬組成物は、望ましくない細胞がＮＫ活性化剤に曝露される前、曝露中または曝露後に投与されるように設計され得る。
【００３７】
本明細書において先に記載のように、疾患細胞または疾患組織の細胞表面上に発現されたＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃の有効な標的化のための新規な認識構造を提供する。細胞溶解的攻撃に対する腫瘍細胞上でのＨＳＰ７０と該リガンド、すなわちＭＩＣＡ／Ｂの存在の相乗作用効果が観察されたため、細胞表面上で該クラスの分子の発現／存在をともに示す細胞および組織は好ましい標的細胞であるが、ＮＫＧ２Ｄのリガンドの存在だけで、望ましくない細胞／所望の細胞をＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃に対して感受性にするのに既に充分である。
【００３８】
したがって、本発明の使用、方法および医薬組成物は、細胞表面上でのＨＳＰ、例えば、ＨＳＰ４０、６０、７０、９０および／または１１０の発現を欠き、したがって、これまで免疫療法によってアプローチがなされ得なかった、または効率的にアプローチがなされ得なかった疾患細胞の処置にもまた好適である。好ましい実施形態において、処置される細胞は、細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を実質的に欠いていることを特徴とする。
【００３９】
このような状況下、疾患細胞または疾患組織もしくは疾患臓器と関連する細胞の細胞表面上でのＨＳＰ、特にＨＳＰ７０の発現を誘導または増強し、該細胞に対してＮＫ細胞を相乗的に活性化させることは特に好ましい。ＨＳＰ７０の発現の誘導は、高体温、化学療法、放射線療法またはその任意の組み合わせによって達成され得る。また、ＨＳＰ７０に関連して言及した先行技術（前掲）も参照のこと。腫瘍に対する化学療法は、この疾患に非常に多くの異なる形態が存在するため種々である。処置は、単独抗癌薬物療法、すなわち単独薬剤での化学療法に依存し得るか、またはいくつかの異なる抗癌薬との併用化学療法を含み得る。かかる薬物は癌細胞を、急速な増殖および分裂を妨げることにより崩壊させる。本発明の好ましい実施形態では、前記細胞傷害的アプローチによりアポトーシスが誘導される。細胞の内在的死滅プログラムであり組織恒常性の重要な調節因子であるアポトーシスに関する概要は、例えば、ＦｕｌｄａおよびＤｅｂａｔｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃ．Ａｇｅｎｔｓ ３（２００３），２５３−２６２に示されている。国際特許出願ＷＯ０３／０８６３８３には、腫瘍／感染細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０発現の誘導による腫瘍、細菌感染もしくはウイルス感染の処置のための医薬組成物の調製のための、細胞内タンパク質凝集を誘導し得る薬物、特にビンクリスチンおよびパクリタキセルの使用が記載されている。これらの薬物は抗腫瘍剤であるため、この実施形態は、相乗作用効果を奏するはずである併用療法のさらなる利点を提供する。
【００４０】
したがって、本発明ではまた、細胞傷害性の第２の薬剤の活性に対して腫瘍細胞を感作させるための、記載された医薬組成物の使用が想定される。この実施形態により、他の場合ではあまり有効でないか、さらには全く有効でない化学療法剤の有効性が改善されるレジメンが可能になる。したがって、本発明はまた、化学療法薬、γ−照射およびデス受容体、例えばＣＤ９５などの誘発による細胞傷害性のアプローチ、例えばアポトーシス誘導などの活性に対して、腫瘍細胞および感染細胞を感作させるための上記の医薬組成物の使用に関する。また、前掲も参照のこと。特に、本発明は、化学療法剤の活性に対して腫瘍細胞、特に、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄに対する／ＮＫＧ２Ｄのリガンド、特にＭＩＣＡ／Ｂおよび／またはＨＳＰ、好ましくはＨＳＰ７０の存在について陽性と判定された細胞を感作させるための医薬組成物に関する。同様のアプローチが、疾患組織または疾患細胞の細胞表面上での抗アポトーシス性のＢｃｌ−２関連アタノジーン（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ）（Ｂａｇ）ファミリーの構成員、特に、Ｂａｇ４およびＨＳＰの存在および共局在に関して、特に、使用される化学療法剤に関して国際特許出願ＷＯ２００５／０５４８６８に記載されており、その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。免疫原性特性を有する抗原提示細胞および膜小胞を感作させるための別の方法、ならびにインビトロまたはインビボで抗原を媒介および提示するためのその使用、ならびに癌、感染性疾患、寄生虫病または自己免疫疾患を処置するための方法または組成物が、特にＷＯ９９／０３４９９に記載される。
【００４１】
他の併用療法は、例えば、サイトカイン、インターロイキンまたは好ましくはグランザイムＢの使用を含み得る。特に、グランザイムＢは、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染症または炎症性疾患の処置に最も有効であることが示されており、この場合、腫瘍細胞または前記感染もしくは炎症に冒された細胞は、その細胞表面上にＨｓｐ７０を発現する。国際特許出願ＷＯ２００４／０１８００２および後の実施例１０を参照のこと。
【００４２】
本明細書に記載の知見をさらに、誘導性ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍に対するマウスＮＫ細胞の活性が熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０によって促進されることが実証されたマウスモデルを用いて確認した。Ｅｌｓｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（２００７），５５２３−５５３３を参照のこと。これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本明細書において先に記載し、後の実施例に例証した知見に基づき、本発明はまた、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子または本明細書において先に定義した誘導因子を、ＮＫ活性化剤および／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む併用調製物に関する。例えば、一実施形態において、該調製物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害因子とＨＳＰ７０ペプチドを含み得る。
【００４４】
本発明は、さらに、対象に、治療有効量の上記の医薬組成物の任意の１種類を投与すること、および／または上記の薬物療法計画を適用することを含む、本明細書において定義した疾患と関連する望ましくない状態を有する対象の処置方法を提供する。記載のように、原則的には、免疫療法に対して感受性である任意の疾患、最も顕著なものの例を挙げると、感染性疾患、ウイルス疾患、癌などが、本発明の薬物療法に従って処置され得る。
【００４５】
本発明の方法によって処置または予防され得る感染性疾患は、感染性因子、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫によって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る細菌性疾患は、細菌、例えば限定されないが、マイコバクテリア リケッチア、マイコプラスマ、ナイセリアおよびレジオネラによって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る原生動物疾患は、原生動物、例えば限定されないが、リーシュマニア、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、およびトリパノソーマによって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る寄生虫疾患は、寄生虫、例えば限定されないが、クラミジアおよびリケッチアによって引き起こされる。
【００４６】
本発明の方法によって処置または予防され得るウイルス疾患としては、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹Ｉ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純疱疹ＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノ（ｅｃｈｉｎｏ）ウイルス、アルボウイルス、フンタ（ｈｕｎｔａ）ウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｈｉｅ）ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）によって引き起こされるものが挙げられる。
【００４７】
本発明の方法によって処置または予防され得る癌としては、限定されないが、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、頭部／首部の癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ならびに重鎖病が挙げられる。
【００４８】
具体的な実施形態では、癌は転移性である。別の具体的な実施形態では、癌を有する対象は、本発明の組成物の投与前に抗癌療法（例えば、化学療法放射線）を受けたという理由で免疫抑制されている。
【００４９】
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例によって開示および包含される。本発明に従って使用される材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて、公共の図書館およびデータベースから検索され得る。例えば、公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が利用され得、このホストは、国立生物工学情報センターおよび／または米国立衛生研究所のアメリカ医学図書館である。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部門である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のものなどは、当業者には公知であり、また、インターネット検索エンジンを用いて入手することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概観ならびに回顧的検索およびカレント・アウェアネス（ｃｕｒｒｅｎｔ ａｗａｒｅｎｅｓｓ）に有用な関連特許情報源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４），３５２−３６４に示されている。
【００５０】
上記の開示は、本発明を一般的に記載する。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができよう。いくつかの文献を、場合によっては、括弧書きで番号を引用して本明細書の本文中に挙げている。すべての引用書誌は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前を見るとよい。引用したすべての参考文献（例えば、本出願書類中に引用した参照文献、発行済特許、公開された特許出願および製造業者の仕様書、使用説明書など）の内容は、引用により明示的に本明細書に組み込まれる。しかしながら、引用した文献が、本発明に関する先行技術であることを自認するものではない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、なんら本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書において使用されたものなどの慣用的な方法の詳細な説明は、引用した文献を見るとよい。また、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”第１７版、ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．２００３）も参照のこと。
【００５２】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野における技能の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が使用される。本明細書に挙げたすべての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
分子遺伝学および遺伝子操作における方法は、現行版のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＦｒｅｓｈｎｅｙおよびＡｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（Ａｕｓｕｂｅｌら編）；ならびにＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；学術論文Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）に一般的に記載されている。本開示において言及した遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈなどの市販の販売元から入手可能である。細胞培養および培地回収における一般的な手法は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（１９９１），７３）；Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１）；Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ａｒｒａｙｓ，Ｈｅｒｚｅｌら，ＣＨＡＯＳ １１（２００１），９８−１０７に概略が示されている。
【００５４】
実験手順
動物実験
ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７／Ｚｔｍ−ｓｃｉｄ）マウスとＳＣＩＤ／ベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−ｓｃｉｄ−ｂｇ）マウスを、個々に換気孔を設けたケージ内で病原体なしの状態下、そのままの群で繁殖させた。ＳＣＩＤマウスは、初めにＨ．Ｊ．Ｈｅｄｒｉｃｈ博士（Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ＳＣＩＤ／ベージュマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ケージ、床敷きおよび水はオートクレーブ処理し、殺菌処理した実験用齧歯類飼料を与えた。すべての操作は、層流フードを使用した無菌条件下で行なった。ＥＬＩＳＡを用いて血清免疫グロブリンを測定することにより漏出性の（ｌｅａｋｙ）マウスを除外した後、１２〜２０週齢の雌および雄のマウスを実験に使用した。動物実験はすべて、地方自治体によって承認されたものであり、動物愛護機関のガイドラインに従った。腫瘍細胞（１００μｌのＰＢＳ中１×１０６）をマウスの側腹内に皮下注射した。腫瘍の増殖を触診によって２日毎にモニターし、大きさを線型カリパスを用いて記録した。腫瘍体積を、式Ｖ＝πａｂｃ／２（式中、ａ、ｂ、ｃは、直交する直径である）によって計算した。動物を、腫瘍体積が１ｃｍ３に達する前に致死させたが、このとき、１０％より大きい体重減少が起こるか、またはなんらかの痛みもしくは苦しみの行動的徴候が観察された。すべての動物について剖検を行ない、腹および胸腔を転移の存在について体系的に調べた。ＳＣＩＤマウスの脾臓を取り出し、後の免疫学的解析用に細胞培養培地中に入れた。原発腫瘍の一部を遺伝子発現解析用に、液体窒素中で即座に凍結した。腫瘍組織および転移が疑われる組織をリン酸緩衝４％ホルマリン中に１６時間入れ、次いで、パラフィン中に包埋した。組織切片（２．５μｍ）を、常套的な組織学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色し、肉眼検査の観察結果を確認した。増殖マーカーＫｉ６７の免疫組織化学的染色を既報のとおりに行なった（１９）。腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析では、腫瘍組織を小片に切断し、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃で９０分間インキュベートした。単離細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳ中に再懸濁した後染色した。
【００５５】
遺伝子発現解析
既報のとおりに、ＲＮＡを調製し、ノザンブロットを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブとハイブリダイズさせた（２０）。濃度測定のためにオートラジオグラフをスキャンした（Ｅｐｓｏｎ ＧＴ−８０００ Ｓｃａｎｎｅｒ，ＳｃａｎＰａｃｋ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＨＣ連鎖ラットＨｓｐ７０−１（２８７５〜３０７０位；受託番号Ｘ７７２０７）（２１）およびヒトＨＳＰ７０−２遺伝子（２２２５〜２４０７位、受託番号Ｍ５９８３０）（２２）に特異的なハイブリダイゼーションプローブを、それぞれの遺伝子の３’非翻訳領域からゲノムのＰＣＲ増幅によって誘導した。エキソン２〜５（２３）を含むアカゲザルＭＩＣ３遺伝子から誘導した遺伝子プローブを用いて、大きさによって識別され得るＭＩＣＡとＭＩＣＢの転写物を検出した。ヒトＭＩＣ遺伝子とアカゲザルＭＩＣ遺伝子の類似性は約９０％であり、したがって、プローブは、ノザンブロットハイブリダイゼーションにおいて交差反応性である。ヒトβ−アクチンｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００５６】
標的細胞株および細胞培養
ヒト黒色腫細胞株ＧｅであるＧｅ−Ｈｓｐ７０ならびに該細胞株から誘導したＧｅ−ｃｏｎ亜株（クローンＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ、Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ、およびＧｅ−ＧＦＰ−Ｂ）（１５）、マウス線維芽細胞Ｌ細胞、ならびにトランスフェクトＬ細胞を、３７℃で１０％ＣＯ２雰囲気中で、組織培養用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内の１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）（Ｓｉｇｍａ）を補給したＮａＨＣＯ３緩衝ＤＭＥＭ中で維持した。ヒト赤白血病Ｋ５６２およびマウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞を、同じ条件下にて懸濁細胞用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内に維持した。ＭＩＣＡとＭＩＣＢの発現を誘導するため、試験前に、Ｇｅ細胞を、１０μＭのヒストンデアセチラーゼ阻害因子スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を含むＤＭＥＭ中で２０時間培養した（２４）。Ｌ細胞を、ヒトＭＩＣＡに対してオーソロガスであるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のＭＩＣ３遺伝子を含む３０μｇのコスミドＡ１５８（２５）、およびジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対する耐性を付与する１μｇのｄｓＲＥＤベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＵＳＡ）でのエレクトロポレーションによってコトランスフェクトした。ジェネティシン（ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ）（１ｍｇ／ｍｌ）での選択後、安定なクローンを限界希釈によって確立し、特異的プライマー（５’−ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＧＧ Ａ−３’（配列番号：１）および５’−ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号：２）、特異的ＰＣＲ産物の長さ１３９６ｂｐ）を用いたＰＣＲによってコスミド存在について試験した。ＭＩＣＡ ｍＲＮＡの発現をノザンブロットによっておよび細胞表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。４つの独立したクローンを標的細胞として、ヒトおよびアカゲザルリンホカイン活性化型キラー（ＬＡＫ）細胞について試験すると結果は類似し、ＭＩＣＡ発現がＬＡＫ細胞に対して感受性を付与することが確認された。クローンＫ４３（Ｌ−ＭＩＣＡ）をさらなる試験に選択した。
【００５７】
Ｇｅ黒色腫細胞の増殖およびアポトーシス
Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞のインビトロ増殖を、［メチル−３Ｈ］チミジン取り込みの測定によって解析した。２００μｌのＤＭＥＭ中２×１０４細胞／ウェルを、細胞培養用マイクロタイタープレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に、各時点での測定（１２、２４、４８および７２時間）に対して３連で播種した。採取１２時間前、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］−チミジン（比活性５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、５０μｌのＤＭＥＭ中それぞれのウェルに添加した。３連のものは、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ細胞採取装置５５０（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）を用いて採取した。取り込まれた放射能は、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンターを用いた液体シンチレーション計数によって測定した。該黒色腫細胞において、アポトーシスを低酸素状態およびグルコース飢餓によって誘導した。細胞を低酸素性条件に曝露するため、ペトリ皿を、通常嫌気性細菌の培養に供されるＧａｓＰａｋ １００システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内に入れた。２時間後、該システム内のＯ２濃度は１％未満となり、ＣＯ２濃度は１０％に達する（Ｓｅｉｐ，Ｗ．Ｆ．およびＥｖａｎｓ，Ｇ．Ｌ．１９８０．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＧａｓＰａｋ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１（１９８０），２２６−２３３）。ＧａｓＰａｋシステムを３７℃のインキュベーター内に２４時間入れた。グルコース飢餓のため、該黒色腫細胞を、標準的なＤＭＥＭと同様の補給物を添加したグルコース無含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で２４時間培養した。ＤＮＡヒストグラムのサブＧ１のピークに出現したヨウ化プロピジウム陽性死細胞およびアポトーシス細胞を、既報のとおりに測定した（２０）。
【００５８】
エキソソームの調製およびイムノブロットブロット解析
Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞株を約８０％コンフルエンスまで培養した後、新鮮なＤＭＥＭ中で７２時間培養した。トリパンブルー排除で測定したところ、バイアビリティは＞９５％であった。上清みを採取し、エキソソームを既報のとおりに調製し（２６）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。Ｈｓｐ７０の誘導性形態に特異的な抗体（Ａｂ）（クローンＣ９２Ｆ３Ａ−５，マウスＩｇＧ１，ＳＰＡ−８１０，ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ，Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＲａｂ４に対する抗体（ｓｃ−３１２，ウサギＡｂ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）を用いて、イムノブロッティングを行った（２６）。
【００５９】
組換えタンパク質
ラットＨｓｐ７０−１遺伝子から誘導されるＨｉｓタグ化組換えＨＳＰ７０タンパク質は、以前に報告された（２０）。ラットＨｓｃ７０遺伝子を、ラットリンパ球ｃＤＮＡから、ＰＣＲ（フォワード：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：３）およびリバース５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号：４））によって増幅した。フォワードプライマーにはＢａｍＨＩを、リバースプライマーにはＥｃｏＲＩ制限部位をこれらの５’末端に含めた。増幅産物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによってｐＧＥＸ−４Ｔ−２発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内にクローニングした。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限断片をこのベクターから単離し、Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質を生成するために、ｐＱＥ３０−１発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に再クローニングした。この構築物を配列決定し、ミスセンス変異を排除した。大腸菌株Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ）をこの構築物で形質転換し、Ｈｉｓタグ化タンパク質の過剰発現用の宿主として使用した。該タンパク質の誘導および精製は、既報のようにして行なった（２０）。組換えヒトＨＳＰ７０（ＥＳＰ−５５５、内毒素濃度＜５０ＥＵ／ｍｇ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎから購入した。
【００６０】
エフェクター細胞およびエフェクター細胞の培養
Ｔｅｎｂｒｏｅｃｋホモジナイザーを用いてＳＣＩＤマウス由来の脾細胞を得、溶解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４−７．８）中での５分間のインキュベーションによって赤血球を除去した。その後、細胞を、細胞傷害性エフェクター細胞として直接使用するか、または１０％ＦＣＳおよびコンカナバリンＡ刺激リンパ球由来の２０％上清みを含むＤＭＥＭ中で２４時間培養した後、５１クロム放出アッセイに使用するかのいずれかとした。ヒトエフェクター細胞を、健常な実験共同作業者うちの志願者の末梢血から、Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）での密度勾配遠心分離によって得た。ＮＫ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、陰性選択キット（ＮＫ細胞単離キットＩＩ、１３０−０９１−１５２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）によって単離した。このキットには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａに対する抗体のカクテルが含まれる。ＬＡＫ細胞を得るため、ＰＢＭＣを、５ｍｌ容組織培養用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内で、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を補給したＤＭＥＭ中、５〜１０×１０６細胞／ｍｌの密度で４〜７日間培養した。ＭＡＣＳが富化されたＮＫ細胞を、組織培養用２４ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内で、２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。一部の培養物には、２μｇ／ｍｌの組換えＨＳＰ７０、組換えＨＳＣ７０、またはＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加した。ＴＫＤは、ヒトＨＳＰ７０のＣ末端基質結合ドメインの適正製造基準（ＧＭＰ）等級の１４量体ペプチド（ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）、ａａ４５０〜４６３）である（２７）。大腸菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ製（Ｌ４３９１）であり、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で一部の培養物に添加した。
【００６１】
５１クロム放出アッセイ
標的細胞を、１００μｌのＦＣＳを含有する２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ中１×１０６細胞と５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｅｓｃｈｗｅｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを１時間３７℃でインキュベートすることにより標識し、ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭで３回洗浄した。エフェクター細胞を５×１０３の５１Ｃｒ標識標的細胞に３連で、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／丸底マイクロタイタープレートのウェル中、ＬＡＫ細胞には約１００：１〜１．５：１の比率で、ＮＫ細胞には１０：１〜０．６：１の比率でで添加した。自発的放出を、エフェクター細胞の非存在下での標的細胞のインキュベーションによって測定した。マイクロタイタープレートを４０×ｇで５分間遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートした後、再度遠心分離し、上清みと沈降物を別々に取り出し、各ウェル内の放射能を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｏｅｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。特異的溶解割合を、自発的５１Ｃｒ放出パーセントを差し引くことにより計算した（２０）。
【００６２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行なった。それぞれＧｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎクローンにおける細胞内ＨＳＰ７０、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を、フローサイトメトリーによって既報（１５）のようにして定期的に制御した。ＨＳＰ７０の細胞表面発現を、原形質膜上のＨＳＰ７０を検出することが報告されている（２８）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＲＰＮ １１９７、マウスＩｇＧ１、多免疫、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってヨウ化プロピジウム陰性細胞において調べた。ＭＩＣＡ／Ｂ細胞表面発現は、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（マウスＩｇＧ１、Ｉｍｍａｔｉｃｓ，Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と反応するｍＡｂ ＢＡＭＯ１を用いて調べた。ヒトＭＨＣクラスＩ分子の染色には、ｍＡｂ Ｗ６／３２（マウスＩｇＧ１、Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。細胞内グランザイムＢ発現を、ＨＳＰ７０について既報（１５）のとおりに０．２５％サポニンでの細胞の透過処理後、ｍＡｂ Ｂ１８．１（マウスＩｇＧ１、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。この非標識マウスＩｇＧ抗体の二次試薬は、ポリクローナルＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１１５−０９５−０６２；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とした。組換えヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃキメラタンパク質（１２９９−ＮＫ、１３９−ＮＫ）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＮＫＧ２Ｄリガンドの細胞表面発現を検出した。このとき、ポリクローナルＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０９−０９５−０９８；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｎｏｖａ）を二次試薬として使用した。ＳＣＩＤマウスの脾臓中のＮＫ細胞の割合を、ｐａｎ−ＮＫ細胞マーカーＤＸ５（ラットＩｇＭ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。ヒトＰＢＭＣおよびＮＫ細胞富化および枯渇画分は、ＣＤ３（クローンＭＥＭ ５７、マウスＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣコンジュゲート、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ＣＤ４（クローンＳ３．５、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ８（クローン３Ｂ５、マウスＩｇＧ２ａ、ＴＣコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ１４（クローンＴｕｅｋ４、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ１６（クローン３Ｇ３、マウスＩｇＧ１−ＴＣコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ５６（クローンＭＥＭ １８８、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ９４（クローンＨＰ−３Ｄ９、マウスＩｇＧ１、ＦＩＴＣコンジュゲート、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＮＫＧ２Ｄ（クローン１４９８１０、マウスＩｇＧ１、ＰＥコンジュゲート、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体を特徴とした。アイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびラットＩｇＭ）は、Ｃａｌｔａｇから購入した。
【００６３】
統計
すべてのデータは、ソフトウェアＳＡＳバージョン９．１を用いて解析した。すべての設計実験で、反復測定の分散解析（ＡＮＯＶＡ）を行なった。種々の要素を、相互作用を伴う二元配置または三元配置ＡＮＯＶＡに組み込んだ。一部の実験ではサンプルサイズが限定的であったため、一部の要素については、サブグループの解析（生物学的に最も興味深い要素レベルのみ）または層別解析（要素レベルによる）しか行なうことができなかった。α＝０．０５の有意性レベルを使用した。
【００６４】
その他
化学薬品は、特に記載のない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＲｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のものとした。
【００６５】
実施例１：ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞の腫瘍増殖の低減
ヒト黒色腫細胞株Ｇｅをレトロウイルスによって形質導入し、通常ストレス誘導性のＭＨＣ連鎖ラットＨｓｐ７０−１（Ｈｓｐａ１）遺伝子を構成的に過剰発現させた。ラットおよびヒトのＭＨＣ連鎖誘導性ＨＳＰ７０タンパク質は、９６．３％同一で９８．４％類似しているが、これらは、３’非翻訳領域に特異的なプローブによってｍＲＮＡレベルで識別され得る。対照細胞クローン（Ｇｅ−ｃｏｎ）は、同じベクター由来のラットＴＣＲβまたはＧＦＰ発現構築物での形質導入によって得た。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎクローンはともに、既報のものであり、インビトロ解析によって詳細に特徴付けられた（１５）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞を、ＴおよびＢリンパ球が欠損したＳＣＩＤマウスの側腹に皮下注射した。これらの実験には、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞の２種類のクローン（Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−ＡおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ）対照細胞の２種類のクローン（Ｇｅ−ＴＣＲ−ＣおよびＧｅ−ＧＦＰ−Ｂ）を使用した。原発腫瘍の進行的増殖を継続させ、第２６日に、最初の動物を致死させた。驚いたことに、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖は、対照腫瘍と比べて低減した（表１）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞の注射後、最初の動物を致死させる前の第２４日に採取した（ｔａｋｅ）腫瘍は、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞（８６％）と比べてわずかに縮小した（７３％）。ほとんどの腫瘍は局所的に増殖したが、数例において、原発腫瘍の浸潤性の増殖および腸間膜内への局所転移が観察された。ある程度の転移が、さらに横隔膜および限局リンパ節において観察された。興味深いことに、転移の頻度（表１）は、Ｇｅ−ｃｏｎで２１％および親Ｇｅ腫瘍で１８％であったが、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍はいずれも転移が起こっていなかった。したがって、恒常的ＨＳＰ７０過剰発現により、Ｇｅ黒色腫細胞の悪性度が低下するようであった。さらに、腫瘍がＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞から発生したとしても、その増殖速度は、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞由来の腫瘍と比べて有意に低かった（ｐ＝０．００３９、ＡＮＯＶＡ）（図１）。
【００６６】
実施例２：増殖およびアポトーシスに対して構成的ＨＳＰ７０過剰発現の効果はない
増殖マーカーＫｉ６７を用いた腫瘍の組織病理学的評価および染色では、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍とＧｅ−ｃｏｎ派生腫瘍との間になんら大きな違いは示されなかった。また、インビトロ増殖も、［３Ｈ］チミジン取り込み（図２Ａ）および細胞計数にて測定されるようにＨＳＰ７０過剰発現クローンと対照クローンとの間で異ならなかった。したがって、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖の低減は、増殖速度の差では説明され得なかった。したがって、腫瘍において出現する条件、例えば、低酸素状態およびグルコース飢餓に細胞を曝露した後の細胞死とアポトーシスを解析した。この場合も、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞とＧｅ−ｃｏｎ細胞との間に差は観察されなかった。このとき、低酸素状態またはグルコース無含有培地に２４時間曝露後、アポトーシスはサブＧ１のピーク測定（図２Ｂ）によって、または細胞死はヨウ化プロピジウム染色によって評価した。
【００６７】
実施例３：ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＮＫ細胞活性の増大
次いで、ＳＣＩＤマウスに依然として存在する先天免疫系が、ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫の増殖の制御の一部に寄与し得るという仮説をたてた。この疑問に取り組むため、ＮＫ細胞の数および細胞傷害活性を、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍または対照腫瘍を有するマウスで解析した。腫瘍が拒絶されたマウスとＧｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ腫瘍が増殖したマウスの脾臓ＮＫ細胞の割合は、著しくは異ならなかった（図３Ａ）。その代わり、Ｈｓｐ７０過剰発現腫瘍を有するマウス由来の脾細胞の細胞傷害活性は、図３Ｂに例証するように、ＮＫ細胞感受性標的細胞株ＹＡＣ−１と比べて増大した。ＳＣＩＤマウス由来の脾細胞の細胞傷害活性は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞と比べてインビトロで一般的に低いが、この結果は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍の増殖の制御におけるＮＫ細胞の役割を示した。
【００６８】
実施例４：ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞の腫瘍の増殖は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいて低減されない
インビボでのＮＫ細胞の役割をさらに確認するため、前述のものと同じ細胞クローンを、ＴおよびＢリンパ球に加えて機能性ＮＫ細胞も欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスに注射した。このとき、採取した腫瘍（表２）およびこれらのマウスにおける腫瘍の増殖（図３Ｃ）は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞とＧｅ−ｃｏｎ細胞の注射後、類似していた。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞由来の腫瘍では、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞からの腫瘍と同じ頻度で転移に至る（表２）。これらの結果により、ＳＣＩＤマウスにおいて観察された差は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍の増殖を一部制御し、転移を完全に抑制するというＮＫ細胞の活性によるものであることが明白に示された。
【００６９】
実施例５：ＨＳＰ７０含有エキソソームは、ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞から放出される
細胞外ＨＳＰ７０は、ＮＫ細胞を活性化し、ＨＳＰ７０細胞表面陽性腫瘍細胞を特異的に溶解させることが示されている（１２）。したがって、ＨＳＰ７０が黒色腫細胞から放出されているか否かを調べた。腫瘍細胞などの細胞は、熱ショックタンパク質を含有するエキソソームを放出させ得ることが知られている（２６，２９）。Ｇｅ−ｃｏｎ細胞とは対照的に生存能力のあるＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞は、実際に、誘導性ＨＳＰ７０を含有するエキソソームを放出した（図４）。また、ＨＳＰ７０は、腫瘍内に通常存在する壊死性領域からもインビボで放出されている可能性がある。
【００７０】
実施例６：腫瘍においてＨＳＰ７０細胞表面はないがＭＩＣＡ／Ｂ発現は起こる
ＨＳＰ７０がＮＫ細胞の標的構造としても機能を果たし得る（１２）か否かを調べるため、黒色腫細胞上でのＨＳＰ７０の発現を、ＨＳＰ７０細胞表面染色に適した抗体を用いて解析した。培養Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞ならびにＧｅ−ｃｏｎ細胞は、ＨＳＰ７０細胞表面染色に対して陰性であった（図５Ａ、７Ｂ）。ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の新鮮な調製腫瘍から得た細胞もまた、細胞表面においてＨＳＰ７０の発現を示さなかった（図６Ａ）が、トランスジェニックラットＨｓｐ７０−１ ｍＲＮＡは、依然としてＧｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍において強く発現されていることがわかった（図６Ｂ）。したがって、ＮＫ受容体を活性化させるための他のリガンドが腫瘍上に存在しているのかどうかという問いが生じた。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ分子を選択した。とりわけ、これらのヒトリガンドは、マウスの活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄとも相互作用することが示されていた（３０〜３２）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡの発現は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０、Ｇｅ−ｃｏｎおよび親Ｇｅ細胞において、インビトロで非常に低かった（図６Ｂ）。この観察結果により、ＳＣＩＤマウスから得たＮＫ細胞のインビトロで観察された低い細胞傷害活性が説明され得る。しかしながら、腫瘍では、両方のＭＩＣ遺伝子の発現が明らかに誘導された（図６Ｂ）。興味深いことに、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡ発現は、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖した腫瘍と比べ、ＳＣＩＤ／ベージュにおいて増殖した腫瘍において高かった（ＭＩＣＡ：ｐ＝０．０１４６およびＭＩＣＢ：ｐ＜００００１）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０対Ｇｅ−ｃｏｎ腫瘍におけるＭＩＣＢ ｍＲＮＡの差示的発現は、宿主によって変更された。これは、ＳＣＩＤマウスでは低減されたが、かかる変更はＳＣＩＤ／ベージュマウスでは見られ得なかった（相互作用：ｐ＝０．０４３７）。類似しているが統計学的に有意でない効果が、ＭＩＣＡ ｍＲＮＡ発現に対しても存在しているようであった。同様にストレス誘導性の内因性ヒトＨＳＰ７０−２ ｍＲＮＡの発現も同じように変化しなかったため、ＭＩＣＡ／Ｂ発現におけるこのような差が、種々の腫瘍における細胞のストレスのレベルの違いのためであった可能性は低い（図６Ｂ）。後者の実験では、ＭＩＣＡ／Ｂ分子は腫瘍細胞の細胞表面にてインビボで発現されることが、腫瘍由来の単独の細胞懸濁液を、抗ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂまたは組換えヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄで染色することにより確認された（図６Ｃ）。
【００７１】
これらのデータにより、腫瘍でのＭＩＣＡ／Ｂ発現の機能的役割が示された。ＳＣＩＤマウスでは、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する腫瘍細胞がＮＫ細胞の標的となると考えた。したがって、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ発現腫瘍細胞に対する選択が、ＳＣＩＤでは起こったがＮＫ細胞欠損ＳＣＩＤ／ベージュマウスでは起こらず、ＳＣＩＤマウスの腫瘍においてＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡ発現のレベルの低下がもたらされたのかもしれない。ＨＳＰ７０が腫瘍に対してＮＫ細胞を活性化させるようであるため、この淘汰圧は、明らかに対照腫瘍よりもＨＳＰ７０過剰発現腫瘍にとって、より重要である。これらの知見を総合すると、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍細胞から放出されたＨＳＰ７０により、ＮＫ細胞が活性化されてＭＩＣＡ／Ｂ発現腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍増殖の低減と転移の抑制がもたらされ得ることが示された。
【００７２】
実施例７：ＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤは、インビトロでヒトＰＢＭＣを活性化し、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させる
次に、動物実験から推論された仮説を、マウス細胞の代わりにヒトエフェクター細胞を用いて試験した。したがって、一連のインビトロ実験を行なった。先の実験から、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来のＭＩＣＡ遺伝子を含むコスミドでトランスフェクトしたマウスＬ細胞が利用可能であった。このＬ−ＭＩＣＡ細胞は、細胞表面にＭＩＣＡを発現する（図５Ａ）。しかしながら、該細胞は、原形質膜においてＨＳＰ７０を発現しない（図５Ａ）。Ｌ−ＭＩＣＡ細胞は、ヒトＬＡＫ細胞によって死滅され得るが、非刺激ＰＢＭＣではほとんど死滅され得ない（図５Ｂ、５Ｃ）。同様の結果が、ＭＩＣＡ遺伝子を含むコスミドまたはＭＩＣＡ ｃＤＮＡ発現構築物でトランスフェクトしたさらなるクローンで得られた。これらの実験では、ベクターでトランスフェクトした対照細胞だけが親Ｌ細胞と異ならなかった。さらなる実験では、ＭＩＣＡ発現Ｌ細胞を、ＨＳＰ７０活性化型キラー細胞の標的として使用した。
【００７３】
ヒトＰＢＭＣを、低用量のＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で７日間培養し、並行培養物である組換えＨＳＰ７０分子、２μｇ／ｍｌのストレス誘導性ＨＳＰ７０または構成的発現ＨＳＣ７０のいずれかに添加した。ＩＬ−２処理ＰＢＭＣは、ＭＩＣＡ発現Ｌ細胞を溶解したが、対照Ｌ細胞はほとんど溶解しなかった（図７Ａ）。ＨＳＰ７０処理では、ＨＳＣ７０処理とは対照的に、さらなる刺激効果が提供され、ＩＬ−２処理ＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ細胞の溶解のさらなる増大がもたらされた（図７Ａ）。したがって、ＨＳＰ７０は、ＰＢＭＣがＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させるようにさらに活性化することができたが、ＨＳＣ７０はできなかった。タンパク質ＨＳＰ７０およびＨＳＣ７０はともに、大腸菌内で組換えタンパク質として調製されたが、ＬＰＳが混入していることが予測され得る。したがって、さらに組換え「低内毒素」（＜５０ＥＵ／ｍｇ）ヒトＨＳＰ７０を使用すると、同様の効果が観察された。さらに、並行して、ＬＡＫ細胞刺激に対するＨＳＰ７０とＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）の効果を試験した。これらの試験において、ＨＳＰ７０処理により、ＬＡＫ細胞がＬ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させる能力が有意に増大した（ｐ＝０．０３７４）（図７Ｂ）。ＨＳＰ７０調製物のＬＰＳ混入を完全に回避するため、ＧＭＰ条件下で化学合成によって作製されるＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ）を使用した。ペプチドＴＫＤは、以前に、ＮＫ細胞を刺激してＨＳＰ７０細胞表面陽性標的細胞を溶解する能力において、完全長ＨＳＰ７０と同等であることが示された（２７）。ＩＬ−２およびＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＰＢＭＣは、ＩＬ−２のみとともに培養した細胞よりも、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞を有意に良好に（ｐ＝０．００１２）溶解することがわかり、組換え完全長ＨＳＰ７０で得られたデータが確認された。
【００７４】
実施例８：ＮＫ細胞は、インビトロでＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤによって活性化されてＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させるエフェクター細胞である
上記に示したインビボデータに基づき、ＮＫ細胞は、ＩＬ−２＋ＨＳＰ７０またはＩＬ−２＋ＴＫＤによって活性化されるＰＢＭＣの中でも細胞傷害性エフェクター細胞であると考えた。しかしながら、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはγδＴ細胞などの他の細胞は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ受容体ＮＫＧ２Ｄを発現することができ、インビトロで観察された効果に寄与している可能性がある。この仮説を試験するため、インビトロ培養前に、ＭＡＣＳによってボランティアドナーの末梢血からＮＫ細胞を単離した（図８Ａ）。並行して、ＮＫ細胞枯渇細胞集団の細胞傷害活性を試験した。ＮＫ細胞富化画分は、Ｌ細胞よりもずっと良好にＬ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させ（図８Ｂ）、ＴＫＤ刺激により、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞に対するＮＫ細胞の活性が有意に改善され得た（ｐ＜００００１）（図８Ｃ）。ＩＬ−２またはＩＬ−２＋ＴＫＤによるＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣの刺激では、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させ得る細胞集団は得られなかった（図８Ｂ）。高いエフェクター：標的比（２００：１まで）でさえ、Ｌ−ＭＩＣＡならびにＬ細胞の溶解は、非常に低いままであった。したがって、ＮＫ細胞は、ＭＩＣＡ発現標的細胞に対してＴＫＤ効果を奏するのに必要な細胞傷害細胞であった。
【００７５】
実施例９：Ｇｅ黒色腫細胞上でのＭＩＣＡ／Ｂ発現およびＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ活性化により、相乗的に腫瘍細胞の高い死滅性がもたらされる
次に、インビボ実験に使用したＭＩＣＡ／Ｂ発現ヒトＧｅ黒色腫細胞が、ＨＳＰ７０活性化型ヒトＮＫ細胞の標的となり得るか否かを調べた。これらの細胞は、以前に、ＭＨＣクラスＩ分子を実際に発現することが示された（１５，１６）。しかしながら、活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２ＤのリガンドとしてのＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの発現により、ＮＫ細胞のＭＨＣクラスＩ媒介型阻害が克服され得ることが知られている（１８，３３）。ＭＩＣＡ／Ｂを、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞ならびにＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞において、トリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などのヒストンデアセチラーゼ阻害因子（２４）によって誘導した（図９Ａ）。重要なことに、ＨＳＰ７０細胞表面発現は、この処理後では見られなかった。処理細胞は未処理細胞よりも、ＬＡＫ細胞による溶解に対して有意により感受性であった（図９Ｂ）。
【００７６】
単離ＮＫ細胞を、ＩＬ−２なし、ＩＬ−２とともに、またはＩＬ−２＋ＴＫＤとともに５日間培養した後、該細胞を、事前に標準条件下で培養したＧｅ−ｃｏｎ標的細胞、またはヒストンデアセチラーゼ阻害因子（１０μＭ ＳＡＨＡ）の存在下で２０時間培養したＧｅ−ｃｏｎ標的細胞のエフェクター細胞として使用した。図１０Ａに示されるように、ＩＬ−２は、Ｇｅ−ｃｏｎ黒色腫細胞を死滅させ得るＮＫ細胞を得るのに不可欠であった。ＮＫ細胞のＴＫＤ処理により、標的細胞を溶解する能力が増大した（ｐ＝０．００５５；このパラグラフの結果については、すべて三元配置ＡＮＯＶＡを使用し、エフェクター：標的比は２．５：１および１．２５：１）。Ｇｅ標的細胞のＳＡＨＡ処理により、ＮＫ細胞に対する感受性が増大した（ｐ＜００００１）。ＮＫ細胞のＴＫＤ処理と標的細胞のＳＡＨＡ処理を併用すると、これらの実験では、特に低エフェクター：標的比で、相乗的作用が生じ（相互作用のｐ値はｐ＝００００３）、標的細胞の死滅の増大がもたらされた（図１０Ｂ）。同様の結果が、完全長組換えＨＳＰ７０でのＮＫ細胞の刺激後、および標的細胞としてのＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞で得られた。したがって、マウスのインビボ実験と一致して、ＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂは協働して、インビトロでヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞の死滅を増大させ得る。
【００７７】
実施例１０：ＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ刺激により、グランザイムＢの発現が増大する
ＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤの効果をさらに解析するため、新鮮な単離ＮＫ細胞上でのＮＫ細胞マーカーＣＤ５６、ＣＤ９４、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄの発現を調べた。ＩＬ−２またはＩＬ−２＋ＴＫＤの存在下で５日間の培養後（図１０Ｃ）、ＣＤ５６陽性細胞の割合は増大した。しかしながら、ＩＬ−２処理とＩＬ−２＋ＴＫＤ処理とで、差は観察されなかった。ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ９４の平均蛍光強度はともに、ＩＬ−２およびＴＫＤ処理後に増大したが、ＩＬ−２刺激単独と比べて、有意差は検出され得なかった。したがって、これらのマーカーでは、ＴＫＤとの培養中、ＮＫ細胞の表現型の大きな変化は観察されなかった。同様の結果が、完全長組換えＨＳＰ７０によるＮＫ細胞の刺激後で得られた。次いで、ＴＫＤ処理により、活性化ＮＫ細胞において細胞傷害性エフェクター分子の発現が増大されるかもしれないと推測した。実際、細胞内グランザイムＢのフローサイトメトリーによる解析で、ＩＬ−２刺激単独と比べ、ＩＬ−２＋ＴＫＤ刺激による発現増大の傾向が示された（図１０Ｄ）。したがって、観察されたＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０の効果は、少なくとも一部、細胞傷害性エフェクター分子の発現増大によって説明され得る。
【００７８】
考察
先天免疫および養子免疫の成分は、進化的にずっと古いストレス応答系に関与していた。このストレス応答は、有害な環境条件に曝露された細胞の生存を維持するように運命づけられている。正常に機能するためには、免疫系は、細胞保護のために開始されたストレス応答が進行中であっても、標的細胞を破壊できる必要がある。さらに、被ストレス細胞、例えばウイルス感染細胞または腫瘍細胞は、通常、ストレスのない細胞よりも、免疫系の細胞傷害性エフェクター細胞のより適切な標的となるようである。以前に、種々の有害な条件に対して細胞を効率的に保護することが公知のＨＳＰ７０は、インビトロで顆粒エキソサイトーシス経路において媒介されるＣＴＬの特異的細胞傷害性エフェクター機構に対して保護しないことが示されていた（１５，１６，２０）。したがって、細胞性免疫系の細胞傷害性エフェクター機構は、防御的ストレス応答を支配しているようである。この考えと一致して、ストレス応答系の一部のある成分が、免疫応答の開始を誘発する「危険シグナル」としての機能を果たすことが示された（１３，１４）。典型的な外因性危険シグナルは、病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ）であり、これは、先天免疫系の細胞上のＰＡＭＰ受容体によって認識される。内因性危険シグナルは、その生物体が危険に曝されることによって生成される。これは、細胞表面に出現され得、放出された状態となり得る。細胞ストレス応答の一部の要素、例えば、ストレス誘導性ＨＳＰ７０などは、実際に、先天免疫反応および養子免疫反応の両方を活性化することができ、これらに関連しているようであり（１０，１１）、内因性危険シグナルの基準を満たす。潜在的内因性危険シグナルのさらなる例は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドである。ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍に対するＮＫ細胞応答を誘発する活性化受容体として供されることが示されており（１８）、腫瘍でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現により、腫瘍拒絶が誘導されることが報告された（３２，３４，３５）。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢが挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ ｉｎ）。これらおよびさらなるＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞ストレス（１７）または遺伝子毒性ストレス（３６）に応答して上方調節され、免疫系に潜在的に危険な細胞の存在をシグナル伝達する（３７）ようである。
【００７９】
本発明に従って行なった実験は、２つのストレス誘導性内因性危険シグナルＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂによって、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性が相乗的に改善されることを示す。ＨＳＰ７０の存在下で培養したヒトＰＢＭＣは、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡを発現するようにトランスフェクトしたか、または内因性ＭＩＣＡ／Ｂを薬理学的手段によって誘導したかのいずれかである腫瘍細胞に対し、細胞傷害活性の増大を獲得した。後者の実験により、両方の処理の併用によって相乗効果が奏され、標的細胞の死滅の有意な増強がもたらされることが示された。細胞分離実験では、細胞傷害効果の奏功にＮＫ細胞が必要とされることが明白に示され、該効果はＨＳＰ７０によって刺激された。ＨＳＰ７０は、直接ＮＫ細胞に対して（３８）、または他の細胞に対してのいずれかで作用し得る。例えば、樹状細胞は、熱ショックタンパク質受容体を発現すること（１０，１１）およびＮＫ細胞とクロストークすること（３９）が公知である。
【００８０】
ＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０の刺激効果は、刺激アッセイでの組換えＨＳＰ７０とＨＳＣ７０の直接比較によって示されるように、構成的発現ＨＳＣ７０とは対照的に、ストレス誘導性ＨＳＰ７０の特異的な性質のようである。この観察結果と一致して、ＨＳＰ７０に由来しＨＳＣ７０タンパク質中には存在しないペプチドＴＫＤ（２７）は、完全長ＨＳＰ７０タンパク質の代わりに使用することができた。
【００８１】
免疫系の細胞に対する組換えタンパク質の効果は、常に、ＬＰＳ混入によって引き起こされたものであることが疑われる。しかしながら、ＨＳＰ７０と同じ条件下で生成されたＨＳＣ７０は、ＮＫ細胞に対して同じ効果を有しなかった。さらに、市販の「低内毒素」ＨＳＰ７０は、依然としてＮＫ細胞を刺激することができた。さらにより重要なことには、ＧＭＰ条件下で化学合成によって作製したＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤもまた、ＮＫ細胞を刺激し、ＬＰＳ効果のみが観察されたというのは排除された。
【００８２】
この点において、どのようにしてＨＳＰ７０またはペプチドＴＫＤがＮＫ細胞を活性化させるのかは、解明の余地がある。ＩＬ−２のみと比べ、ＩＬ−２＋ＴＫＤとのＮＫ細胞の培養中で、ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞集団の有意な増加は観察されなかった。また、ＮＫＧ２Ｄの発現レベルは、フローサイトメトリーによる解析でも、有意に増大しなかった。ＮＫＧ２Ｄは、主に、ＮＫ細胞顆粒媒介型細胞傷害性の受容体として供されることが示されている（１８）。一貫して、ＴＫＤに曝露されたＮＫ細胞では、細胞傷害性エフェクターであるプロテアーゼグランザイムＢの発現レベルが高い傾向がみとめられた。ＨＳＰ７０およびＴＫＤは、細胞傷害性エフェクター分子の発現を誘導することにより、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増大させている可能性がある。しかしながら、これが、ＨＳＰ７０によってＮＫ細胞の活性が増大され得る唯一または主要な機構であるのかどうかは明らかでない。
【００８３】
それでもなお、ＭＩＣＡ／Ｂ発現標的細胞に対するＨＳＰ７０によるＮＫ細胞の活性化は、腫瘍免疫監視機構に対し、インビボでも関連性があるようである。ＨＳＰ７０過剰発現Ｇｅ黒色腫細胞の増殖は、ＳＣＩＤマウスにおいて有意に低減された。さらに、これらの腫瘍は、対照腫瘍とは対照的に、浸潤的に増殖せず、局所転移は起こらなかった。このような効果は、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の腫瘍増殖および転移速度が、ＢおよびＴリンパ球に加えて機能性ＮＫ細胞も欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスにおける対照腫瘍とは異ならなかったため、明らかにＳＣＩＤマウスのＮＫ細胞に起因するものであり得る。
【００８４】
以前に、ＨＳＰ７０過剰発現Ｇｅ黒色腫細胞が、代償的にＨＳＣ７０発現を下方調節することが示された（１５）。したがって、これらの細胞では、ＨＳＣ７０発現は、基本的にＨＳＰ７０発現の方向にシフトされる（１５）。
【００８５】
本実験によると、ここに、ＨＳＰ７０含有エキソソームがＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞から放出されることが示され得る。ＨＳＰ７０の放出量が増大すると、ＮＫ細胞は、ＨＳＣ７０ではなくＨＳＰ７０によって活性化されるようであるため、続いて、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍を有するマウスにおいて、ＮＫ細胞のより良好な活性化がもたらされ得る。腫瘍中に存在するＨＳＰ７０はすべて真核生物供給源のものであったことに注目することは重要である。したがって、ＬＰＳの効果が、動物モデルで見られた観察結果に関連性がある可能性は排除され得る。
【００８６】
Ｇｅ黒色腫細胞は、ＭＩＣＡとＭＩＣＢをインビボで発現するが、インビトロではほどんど発現しない。腫瘍におけるこの発現は、両方の遺伝子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの発現レベルがＳＣＩＤ／ベージュマウスと比べ、ＳＣＩＤで増殖させたＨＳＰ７０過剰発現腫瘍において低減されたため、ＳＣＩＤマウスにおいて機能的に関連性があるようである。このＭＩＣＡ／Ｂ発現の低減は、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒおよび共同作業者（４０）によって示された「癌の免疫編集（ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」の一例として解釈される。ＭＩＣＡ／Ｂ過剰発現腫瘍細胞は、ＳＣＩＤマウスに存在するＨＳＰ７０活性化ＮＫ細胞の優先的標的となり、その減少がもたらされる。このＮＫ細胞活性により、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の大きさの縮小が説明される。ＭＩＣＡ／Ｂの発現の低減もまた、潜在的な免疫逸出（ｅｓｃａｐｅ）機構を示すが、原発腫瘍におけるＨＳＰ７０過剰発現およびその後のＮＫ細胞の活性化（これによりＭＩＣＡ／Ｂ過剰発現腫瘍細胞が死滅され得る）は、浸潤性の増殖および局所転移を完全に抑制するのに明らかに充分であった。
【００８７】
ＮＫＤ２ＤリガンドＭＩＣＡ／Ｂの発現が本モデルの腫瘍において内因的に調節され得たことは、重要であり得る。ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の過剰刺激、ならびに連続してＮＫＧ２Ｄの下方調節およびＮＫ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞の不活性をもたらすＭＩＣＡ／Ｂの強い異所性発現が報告された（４１〜４３）。
【００８８】
数多くの試験で、腫瘍由来熱ショックタンパク質、例えば、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４（ｇｐ９６、ＨＳＰ９６）およびＨＳＰ７０が免疫療法に使用された（１０）。ＣＴＬ応答の誘導に重点が置かれていたが、ＮＫ細胞枯渇によってｇｐ９６またはＨＳＰ７０での免疫処置の有効性が無効となり得ることもまた注目されている（４４）。さらに、パーフォリン依存性ＮＫ細胞活性は、ｇｐ９６を分泌するように操作された腫瘍細胞のＣＴＬ媒介型拒絶の誘導に必要とされることが報告された（４５）。また、ＮＫ細胞は、ＣＴＬ応答の誘導におけるＨＳＰ７０のアジュバント様活性に必要であると思われる（４６）。これらの報告と一致して、最近、自己腫瘍由来のＨＳＰ９６で処置した患者は、ＮＫ細胞活性の有意な刺激を受けることが観察された（４７）。したがって、腫瘍細胞の初期のＮＫ細胞媒介型溶解および／またはＮＫ放出サイトカインは、腫瘍特異的ＣＴＬの効率的なプライミングに必要である可能性がある。興味深いことに、以前に、ＨＳＰ７０（４８）およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（２７）は、ＮＫ細胞を刺激して、ＨＳＰ７０を原形質膜に発現する腫瘍細胞を特異的に溶解し得ることが記載された（１２）。ＨＳＰ７０は、この場合、刺激分子として、およびＮＫ細胞の標的構造としての機能を果たしているが、原形質膜内でＨＳＰ７０がどのようにして発現されるのかは明らかでない。ＨＳＰ７０とＴＫＤによるＮＫ細胞の活性化を示す本結果は、このデータと整合する。しかしながら、ここで解析された腫瘍細胞は、インビトロでもインビボでも細胞表面でＨＳＰ７０を発現しなかった。その代わり、充分に定義された活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである膜貫通タンパク質ＭＩＣＡ／Ｂは、ＨＳＰ７０／ＴＫＤ刺激ＮＫ細胞の標的構造として供され得ることが示されている。
【００８９】
ＴＫＤ活性化ＮＫ細胞の養子免疫伝達は、原形質膜にＨＳＰ７０を発現する腫瘍に対する新しい有望な免疫療法であり、これは、前臨床動物モデルにおいて（４９）、また第Ｉ期臨床試験において（５０）、好成績で評価されている。すべての腫瘍が細胞表面にＨＳＰ７０を発現するわけではないため、ＨＳＰ７０刺激ＮＫ細胞によってＮＫＧ２Ｄリガンドが標的構造として使用され得るという本発明の知見によって、この種の免疫療法の恩恵を得る患者の範囲が実質的に広がる。腫瘍細胞に対するＨＳＰ７０とＮＫＧ２Ｄリガンド発現の併用によって治療成績が改善されるか否かを評価しなければならない。ＨＳＰ７０を誘導するための高体温と、ＭＩＣＡ／Ｂを誘導するためのヒストンデアセチラーゼ阻害因子による薬物療法との併用（２４）もまた、腫瘍に対するＮＫ細胞活性を改善するための有望なストラテジーであり得る。重要なことに、ＮＫ細胞は、細胞傷害性エフェクター細胞としての機能を果たすだけでなく、その後のＣＴＬ応答の誘導に本質的に寄与しているようである（３９，４５，４６）。したがって、腫瘍細胞からのどのシグナルの組み合わせでＮＫ細胞の最良の活性化がもたらされるかを理解することは、さらにより必要である。２つの危険シグナルの存在下でＮＫ細胞活性が増強されたという本結果によって、癌免疫療法のストラテジーの改善が補助され得よう。さらに、腫瘍生物学におけるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂの種々の役割に対する洞察が提供される。
【００９０】
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８．Ｃｌａｒｋ ＰＲ，Ｍｅｎｏｒｅｔ Ａ．Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｈｓｐ７０ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ ２００１；６：１２１−５．
９．Ｍａｓｓａ Ｃ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ Ｃ，Ａｒｉｏｌｉ Ｉ，Ｐａｒｅｎｚａ Ｍ，Ｃｏｌｏｍｂｏ ＭＰ，Ｍｅｌａｎｉ Ｃ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ｈｓｐ７０．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：１５０２−８．
１０．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｐ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；２：１８５−９４．
１１．Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ ＣＶ．Ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；３：４２７−３２．
１２．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｂｏｔｚｌｅｒ Ｃ，Ｊｅｎｎｅｎ Ｌ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ，Ｅｌｌｗａｒｔ Ｊ，Ｉｓｓｅｌｓ Ｒ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７２ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１５８：４３４１−５０．
１３．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ Ｐ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｄａｎｇｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆａｍｉｌｙ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；１２：９９１−１０４５．
１４．Ｔｏｄｒｙｋ ＳＭ，Ｍｅｌｃｈｅｒ ＡＡ，Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ ＡＧ，Ｖｉｌｅ ＲＧ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｄａｎｇｅｒ ｔｈｅｏｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００；９９：３３４−７．
１５．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｇｒｚｅｓｚｉｋ Ｃ，Ｋｒｅｉｓｓ Ｍ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｌｙｓａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：８２１２−２０．
１６．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｌｕｅｂｂｅｒｓ Ｍ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｈｅｒｒ Ｗ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；２９：３９２５−３５．
１７．Ｇｒｏｈ Ｖ，Ｂａｈｒａｍ Ｓ，Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｈｅｒｍａｎ Ａ，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ Ｍ，Ｓｐｉｅｓ Ｔ．Ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１２４４５−５０．
１８．Ｈａｙａｋａｗａ Ｙ，Ｓｍｙｔｈ ＭＪ．ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１８：１７６−８５．
１９．Ａｌｖｅｓ Ｆ，Ｃｏｎｔａｇ Ｓ，Ｍｉｓｓｂａｃｈ Ｍら Ａｎ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ａｌｌ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｃａｄｅ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ２００１；２３：２２７−３５．
２０．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｅｌｓｎｅｒ Ｌ，Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｔ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＴＬ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６４：２３６２−７１．
２１．Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｒａｕｈ Ｆ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （Ｈｓｐ７０）ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９４；４０：３２５−３０．
２２．Ｍｉｌｎｅｒ ＣＭ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＲＤ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＭＨＣ−ｌｉｎｋｅｄ ＨＳＰ７０ ｇｅｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９０；３２：２４２−５１．
２３．Ｓｅｏ ＪＷ，Ｂｏｎｔｒｏｐ Ｒ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｌｉｎｋｅｄ ＭＩＣ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９；５０：３５８−６２．
２４．Ｓｋｏｖ Ｓ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＭＴ，Ａｎｄｒｅｓｅｎ Ｌ，Ｓｔｒａｔｅｎ ＰＴ，Ｗｏｅｔｍａｎｎ Ａ，Ｏｄｕｍ Ｎ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｃｏｍｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：１１１３６−４５．
２５．Ｓｅｏ ＪＷ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＩＣ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ２００１；５８：１５９−６５．
２６．Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ｇｅｈｒｍａｎｎ Ｍ，Ｂａｕｓｅｒｏ ＭＡら Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：５２３８−４７．
２７．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｐｆｉｓｔｅｒ Ｋ，Ｇｅｈｒｍａｎｎ Ｍら Ａ １４−ｍｅｒ Ｈｓｐ７０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ （ＮＫ）ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ ２００１；６：３３７−４４．
２８．Ｂｏｔｚｌｅｒ Ｃ，Ｌｉ Ｇ，Ｉｓｓｅｌｓ ＲＤ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ ＮＫ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ １９９８；３：６−１１．
２９．Ｔｈｅｒｙ Ｃ，Ｒｅｇｎａｕｌｔ Ａ，Ｇａｒｉｎ Ｊら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｓｃ７３．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９；１４７：５９９−６１０．
３０．Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ Ａ，Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＭ，Ｌｉｕ ＳＤ，Ｓｈａｓｔｒｉ Ｎ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１：１１９−２６．
３１．Ｗｏｌａｎ ＤＷ，Ｔｅｙｔｏｎ Ｌ，Ｒｕｄｏｌｐｈ ＭＧら Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＮＫ ｃｅｌｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｔ １．９５Å．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；２：２４８−５４．
３２．Ｆｒｉｅｓｅ ＭＡ，Ｐｌａｔｔｅｎ Ｍ，Ｌｕｔｚ ＳＺら ＭＩＣＡ／ＮＫＧ２Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：８９９６−９００６．
３３．Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｇｒｏｈ Ｖ，Ｗｕ Ｊら Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：７２７−９．
３４．Ｃｅｒｗｅｎｋａ Ａ，Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ，ＭｃＣｌａｎａｈａｎ Ｔら Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００；１２：７２１−７．
３５．Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ Ａ，Ｊｅｎｓｅｎ ＥＲ，Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＭ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ Ｒａｅ１ ａｎｄ Ｈ６０ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１３：１６５−７１．
３６．Ｇａｓｓｅｒ Ｓ，Ｏｒｓｕｌｉｃ Ｓ，Ｂｒｏｗｎ ＥＪ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３６：１１８６−１９０．
３７．Ｇａｓｓｅｒ Ｓ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｒｏｕｓｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３９５９−６２．
３８．Ｇｒｏｓｓ Ｃ，Ｈａｎｓｃｈ Ｄ，Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ＮＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ９４．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；３８４：２６７−７９．
３９．Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ ＭＡ，Ｓｍｙｔｈ，ＭＪ．Ｃｌｏｓｅ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｔａｋｅ ｃｅｎｔｒｅ ｓｔａｇｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；５：１１２−２４．
４０．Ｄｕｎｎ ＧＰ，Ｏｌｄ ＬＪ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＲＤ．Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；２２：３２９−６０．
４１．Ｗｉｅｍａｎｎ Ｋ，Ｍｉｔｔｒｕｅｃｋｅｒ ＨＷ，Ｆｅｇｅｒ Ｕら Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｓ ＮＫ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７５：７２０−９．
４２．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ＤＥ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＳＪ，Ｃｌａｒｋｅ ＳＬら Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｓ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；６：９２８−３７．
４３．Ｃｏｕｄｅｒｔ ＪＤ，Ｚｉｍｍｅｒ Ｊ，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ Ｅら Ａｌｔｅｒｅｄ ＮＫＧ２Ｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６：１７１１−７．
４４．Ｔａｍｕｒａ Ｙ，Ｐｅｎｇ Ｐ，Ｌｉｕ Ｋ，Ｄａｏｕ Ｍ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＰＫ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７８：１１７−２０．
４５．Ｓｔｒｂｏ Ｎ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｓｏｔｏｓｅｋ−Ｔｏｋｍａｄｚｉｃ Ｖ，Ｐｏｄａｃｋ ＥＲ．Ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００３；１８：３８１−９０．
４６．Ｍａｓｓａ Ｃ，Ｍｅｌａｎｉ Ｃ，Ｃｏｌｏｍｂｏ ＭＰ．Ｃｈａｐｅｒｏｎ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｓｐ７０：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ ａｎｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：７９４２−９．
４７．Ｐｉｌｌａ Ｌ，Ｓｑｕａｒｃｉｎａ Ｐ，Ｃｏｐｐａ Ｊら Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｎｄ ＮＫ−Ｌｉｋｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：３９４２−９．
４８．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｍｉｚｚｅｎ Ｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ＣＣら Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （Ｈｓｐ７０）ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９；２７：１６２７−３６．
４９．Ｓｔａｎｇｌ Ｓ，Ｗｏｒｔｍａｎｎ Ａ，Ｇｕｅｒｔｌｅｒ Ｕ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ＩＬ−２／ＴＫＤ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１７６：６２７０−６．
５０．Ｋｒａｕｓｅ ＳＷ，Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘ ｖｉｖｏ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：３６９９−７０７．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、免疫療法の分野に関する。より詳しくは、本発明は、感染性疾患、主として特に、転移性新生物性疾患、例えば限定されないが、ヒト肉腫、癌腫および黒色腫の予防および処置のための方法および組成物に関する。本発明によれば、感染性疾患および癌の予防および処置の実施は、疾患組織または疾患細胞の細胞表面上の特定のあるリガンドの存在によって媒介および／または指示され、該リガンドは該組織または細胞を免疫療法、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞系療法に対して感受性にする。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫学の時代は、メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導型肉腫上の抗原が、移植アッセイにおいて、マウスの正常組織ではこの抗原が検出され得なかった点で腫瘍特異的であることを示したＰｒｅｈｎおよびＭａｉｎの実験とともに始まった（Ｐｒｅｈｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１（１９５７），７６９ ７７８）。この概念は、ＭＣＡ誘導型腫瘍に対する腫瘍特異的抵抗性が、自発性（ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ）宿主、すなわち腫瘍が最初に発生したマウスにおいて誘発され得ることを示すさらなる実験によって確認された。放射線は癌療法において、単独レジメンとして、または細胞増殖抑制薬との組み合わせで放射線化学療法としてのいずれかで、高頻度に使用されている。しかしながら、照射抵抗性腫瘍クローンは、治療効率を制限している。
【０００３】
ストレス誘導性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０は、アポトーシスに対して細胞を保護することがよく知られた分子シャペロンである（１）。ＨＳＰ７０の過剰発現は、種々の腫瘍で報告されており、腫瘍形成性の増強および治療抵抗性と関連していることがわかった（２）。このような知見と一致して、腫瘍細胞におけるＨＳＰ７０の実験的下方調節により、動物モデルにおいて腫瘍後退が増強されることが報告された（３〜５）。しかしながら、数例の他の動物モデルでは、反対の観察結果が得られた。ＨＳＰ７０発現は、腫瘍後退と関連していることがわかった（６〜９）。これらの場合では、ＨＳＰ７０は、腫瘍の免疫原性を増大させるようであった。数多くの研究において、ＨＳＰ７０は、先天免疫反応および養子免疫反応を活性化させることが示されている（１０，１１）。ＨＳＰ７０は、抗原性ペプチドをシャペロン輸送し、受容体媒介型様式で、プロフェッショナル抗原提示細胞の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ提示経路内にチャネル通過させ、次いで、ペプチド特異的ＣＴＬをプライムする。したがって、腫瘍由来のＨＳＰ７０調製物は、腫瘍特異的ワクチン接種に使用され得る（１０，１１）。ＨＳＰ７０はまた、先天免疫細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を誘発し、共刺激分子の発現を増大させる（１０，１１）。さらに、ＨＳＰ７０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、細胞表面にＨＳＰ７０を発現する腫瘍細胞を特異的に死滅させることが示されている（１２）。これらの特徴により、ＨＳＰ７０は、内因性アジュバントおよび免疫学的危険シグナルとみなされている（１３，１４）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、免疫学の技術分野、ならびに疾患組織または疾患細胞の細胞表面上のＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄリガンド、例えば主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子などの存在によって媒介および／または指示される疾患の処置に関する。特に、本発明は、ストレス誘導性内因性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂが腫瘍に対してＮＫ細胞を相乗的に活性化させるという驚くべき知見を利用する。
【０００５】
ＨＳＰ７０は抗アポトーシス性であるがＣＴＬ応答を惹起し得ることが知られているため、提示された１つの疑問は、ＨＳＰ７０が腫瘍細胞を、ＣＴＬによって媒介されるアポトーシスから保護するかどうかに関することであった。ヒト黒色腫細胞株Ｇｅのモデルにおいて、以前に、ＭＨＣ連鎖ストレス誘導性ＨＳＰ７０の構成的過剰発現では、顆粒エキソサイトーシス経路においてＣＴＬによって媒介されるアポトーシスに対する防御はなされないことが示された（１５）。急性的なＨＳＰ７０過剰発現は、インビトロでＣＴＬに対する感受性を増大させることすらあり得る（１５，１６）。免疫系は、別様式の防御的ストレス応答を受けている標的細胞を死滅させることができるようである。
【０００６】
本発明の目的は、養子免疫伝達されたＣＴＬに対するＧｅ黒色腫細胞の感受性に対するＨＳＰ７０発現のインビボでの効果を調べることであった。しかしながら、ＢおよびＴリンパ球が欠損した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスでは、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖は、いずれの養子免疫療法前であっても、対照腫瘍と比べて低減された。より印象的なことには、浸潤性の増殖および局所転移は、非ＨＳＰ７０過剰発現対照腫瘍を有する動物でのみ観察された。本発明によれば、驚くべきことに、ストレス誘導性危険シグナルＨＳＰ７０が、ＳＣＩＤマウスにおいてマウスＮＫ細胞を、ならびにヒトＮＫ細胞をインビトロで活性化し、これによって腫瘍細胞上の第２のストレス誘導性危険シグナルであるＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子が認識されることを示すことができた。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子はＭＨＣ内にコードされており、ストレス誘導性であり、腸上皮細胞および腫瘍に限定された様式で発現される（１７）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢは、活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである（１８）。内因性ストレス誘導性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂはともに、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞媒介型免疫応答を相乗的に惹起した。動物モデルにおいて、この２つの危険シグナル誘導型先天免疫応答によって、原発腫瘍の増殖が低減され、転移を抑制することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞、好ましくは活性化ＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子に関し、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与する。好ましくは、前記リガンドはＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡまたはＢであり、前記ＮＫ細胞は、患者への投与前に活性化されるか、またはＮＫ細胞の活性化因子、例えば、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドとともに投与されるように設計される。
【０００８】
本発明による化合物の使用は、インターロイキン、インターフェロンまたは他の抗癌薬などのさらなる治療用薬剤の使用を伴い得る。さらに、本発明の医薬組成物は、細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子、例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害因子、例えばトリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などを含み得るか、または該因子とともに投与されるように設計され得る。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、望ましくない細胞に対する免疫応答、すなわち、ＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のためのＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子の使用を提供することである。前記医薬組成物には、さらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含めてもよい。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、対象における腫瘍または感染性疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用を提供することであり、該疾患は、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドを過剰発現する細胞を根拠に陽性と判定されている。前記ＮＫ細胞は、対象への投与前に活性化させてもよく、あるいはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記活性化因子はＨｓｐ７０のペプチドを含む。さらに、疾患細胞が実質的に細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を欠く場合、前記細胞をまた、細胞表面上にＨＳＰ７０を発現するように誘導してもよい。
【００１１】
また、本発明は、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子を、ＮＫ細胞の活性化因子、例えば、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドおよび／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む、腫瘍または感染性疾患の標的化および／または処置に有用な併用調製物に関する。
【００１２】
当然、該医薬組成物は、化学療法剤などの他の薬物と組み合わせて投与してもよい。好適な化学療法剤は、当業者には公知であり、アントラサイクリン類、例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン、タクソール、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリケアマイシンが挙げられる。その選択は、処置が意図される疾患に依存性であり得る。
【００１３】
ほとんどの実施形態は、医学的用途との関連で記載したが、本発明の範囲、したがって添付の特許請求の範囲には、研究目的のみの細胞／組織培養方法および動物試験もまた包含されることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｈｓｐ７０過剰発現黒色腫細胞由来の腫瘍の増殖が遅く、局所転移が起こらないことを示す図である。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ細胞をＳＣＩＤマウスの側腹に皮下注射した（ＰＢＳ中１×１０６細胞／動物）。腫瘍増殖が観察されたＳＣＩＤマウスの腫瘍の大きさの平均±ＳＤ。
【図２】図２は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞の増殖およびアポトーシス速度は、インビトロで異ならないことを示す図である。Ａは、Ｇｅ−ｃｏｎ（Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ、Ｇｅ−ＧＦＰ−Ｂ）およびＧｅ−Ｈｓｐ７０（Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ）細胞のインビトロでの増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みによってアッセイした。３つの独立したアッセイの代表的な実験の３連のｃｐｍの平均±ＳＤを示す。Ｂは、黒色腫細胞を、低酸素雰囲気中またはグルコース無含有培地中で２４時間培養した。アポトーシス細胞の割合（ＤＮＡヒストグラムのサブＧ１のピークにおける細胞の％）を、フローサイトメトリーによって、処理前（ｐｒｅ）ならびに処理の２、２４および４８時間後に測定した。４つの独立した実験のアポトーシス細胞の平均＋ＳＤを示す。
【図３】図３は、ＮＫ細胞が、ＳＣＩＤマウスにおけるＨｓｐ７０過剰発現黒色腫細胞の増殖の低減を担うことを示す図である。Ａは、脾臓中のＮＫ細胞の割合の平均＋ＳＤ。抗ＤＸ５ ｍＡを使用した。フローサイトメトリーによって検出。Ｇｅ−ｃｏｎもしくはＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を有するＳＣＩＤマウス、または腫瘍細胞が拒絶された（腫瘍なし）動物間で著しく異ならない。Ｂは、種々のエフェクター標的比における、Ｇｅ−ｃｏｎ腫瘍を有する３匹のＳＣＩＤマウスおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を有する３匹のＳＣＩＤマウス由来の脾細胞によるＹＡＣ−１標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。ここに示した実験は、５つの独立したアッセイの代表である。Ｃは、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ細胞を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの側腹に皮下注射した（ＰＢＳ中１×１０６細胞／動物）。腫瘍増殖が観察された動物の腫瘍の大きさの平均±ＳＤ。
【図４】図４は、細胞表面にＨＳＰ７０を発現しない腫瘍が、エキソソーム内でＨＳＰ７０を放出すること示す図である。エキソソームは、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞から調製した。１０μｇのエキソソームタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＨＳＰ７０の存在について、誘導性ＨＳＰ７０に特異的なｍＡｂ Ｃ９２を用いたイムノブロットによって解析した。抗Ｒａｂ４ Ａｂを、エキソソームタンパク質の負荷対照として使用した。
【図５】図５は、ＬＡＫ細胞が容易にＭＩＣＡトランスフェクト標的細胞を溶解することを示す図である。Ａは、ＭＩＣＡトランスフェクトＬ−ＭＩＣＡ細胞および親Ｌ細胞上でのＭＩＣＡおよびＨＳＰ７０発現のフローサイトメトリーによる解析。ＭＩＣＡ細胞表面発現は、抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに対する２種類のモノクローナル抗体での染色によって、ならびに組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質の結合によって示される。それぞれ一次試薬（黒線）およびＦＩＴＣ標識二次試薬のみ（破線）での染色を、非染色細胞（点線）とともに示す。抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清について、免疫前血清＋二次抗体（破線）での染色を対照として示す。結果は、３つより多くの独立した実験の代表である。ともにヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと反応するクローンＢＡＭＯ３およびＩＩＩＣ１由来のハイブリドーマの上清みを使用した。抗アカゲザルＭＩＣＡ抗血清は、ＦＶＢ／Ｎマウスを、トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスに由来し、アカゲザルのＭＩＣＡ遺伝子を有するコスミドＡ１５８を含むＭＩＣＡ発現リンパ球で免疫処置することにより生成した。Ｂは、インビトロで４日間ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）によって刺激した同じドナー由来の新鮮単離ＰＢＭＣまたはＬＡＫ細胞によるＫ５６２、ＬおよびＬ−ＭＩＣＡ標的細胞の３連の特異的溶解の平均＋ＳＤ。Ｃは、８つの独立した実験で測定した、ＰＢＭＣまたはＬＡＫエフェクター細胞によるＫ５６２、Ｌ−ＭＩＣＡおよびＬ標的細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。最大エフェクター標的比（１００：１）でのＰＢＭＣによるＫ５６２細胞の溶解割合を各試験において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比でのＰＢＭＣおよびＬＡＫ細胞による種々の標的細胞の相対溶解を計算した。各細胞型について別々にＡＮＯＶＡによって解析したように、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞は、ヒトＬＡＫ細胞によって非刺激ＰＢＭＣよりも有意に良好に死滅された（ｐ＝００００３）が、古典的なＮＫ標的細胞株Ｋ５６２は、ＰＢＭＣによって、より容易に溶解された（ｐ＝０．０１２１）。
【図６】図６は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現が、細胞表面にＨＳＰ７０を発現しない腫瘍において誘導されることを示す図である。Ａは、Ｇｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍から単離した細胞上でのＨＳＰ７０細胞表面発現のフローサイトメトリーによる解析。陽性細胞の割合を示す。図示した実験は、ＳＣＩＤ由来の８つの腫瘍およびＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の１０個の腫瘍の代表である。Ｋ５６２細胞を陽性対照として供した。Ｂは、ノザンブロット解析および濃度測定により、β−アクチンに対する比として測定した、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ヒトＨＳＰ７０−２およびラットＨｓｐ７０−１ ｍＲＮＡ発現の平均＋ＳＤ。本発明者らは、ＳＣＩＤマウス由来の１８個のＧｅ−ｃｏｎ腫瘍および２１個のＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍、ならびにＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の１６個のＧｅ−ｃｏｎ腫瘍および１４個のＧｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍を解析した。インビトロでの該細胞株データは、７〜１２の個々の実験から収集した。Ｃは、Ｇｅ−ｃｏｎ由来腫瘍から単離した細胞上でのＭＩＣＡ／Ｂ（ｍＡｂ ＢＡＭＯ−１）、ＨＳＰ７０（ｍＡｂ ＲＰＮ １１９７）およびＮＫＧ２Ｄリガンド細胞表面発現のフローサイトメトリーによる解析。９５％より多くのゲート（ｇａｔｅｄ）細胞がヒト黒色腫細胞であり、これは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子（ｍＡｂ Ｗ６／３２）に対して陽性であった。上側パネルと下側パネルは、異なる個体の腫瘍に由来する。
【図７】図７は、ＬＡＫ細胞がＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤによって刺激され、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させることを示す図である。Ａは、インビトロで７日間、ＩＬ−２のみ（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋組換えＨＳＰ７０（２μｇ／ｍｌ）またはＨＳＣ７０（２μｇ／ｍｌ）で刺激したＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ（黒記号）またはＬ（白記号）標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。図示した実験は、３つの独立した実験の代表である。Ｂは、６つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−２＋ＨＳＰ７０（２μｇ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＬＡＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。最大エフェクター標的比（５０：１）でのＩＬ−２刺激ＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ細胞の溶解割合を各試験において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比での種々のエフェクター細胞による標的細胞の相対溶解を計算した。Ｃは、６つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＬＡＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。
【図８】図８は、ＮＫ細胞がＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤによって刺激され、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させることを示す図である。Ａは、ＰＢＭＣ（ＭＡＣＳ分離前）およびＮＫ細胞富化（ＮＫ＋）ならびにＮＫ細胞枯渇（ＮＫ−）細胞集団のフローサイトメトリーによる解析。７つの独立した実験のマーカー陽性細胞の割合の平均＋ＳＤを示す。Ｂは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）によりインビトロで５日間刺激した単離ＮＫ細胞（ＮＫ＋）またはＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ（ＮＫ−）によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。図示した実験は、ＮＫ−の３つの実験およびエフェクター細胞としてのＮＫ＋細胞の７つの実験の代表である。Ｃは、７つの独立した実験で測定した、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で５日間刺激したＮＫ細胞によるＬ−ＭＩＣＡおよびＬ標的の相対溶解の平均＋ＳＤ。
【図９】図９は、Ｇｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０黒色腫細胞でのＭＩＣＡ／Ｂの誘導により、ＬＡＫ細胞媒介型細胞傷害性に対する感受性が増大することを示す図である。Ａでは、ＨＳＰ７０（ｍＡｂ ＲＰＮ １１９７）、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ（ｍＡｂ ＢＡＭＯ１）、およびＮＫＧ２Ｄリガンド（ヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質）の細胞表面発現に対するＧｅ−ｃｏｎ細胞のフローサイトメトリーによる解析を行なった。細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。９つの独立した実験で得たＭＩＣＡ／Ｂ、ヒトＮＫＧ２Ｄのリガンド、およびＨＳＰ７０の細胞表面発現を示す細胞の平均＋ＳＤ、ならびにＧｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−ＨＳＰ７０細胞の平均蛍光強度（ＭＩＦ）＋ＳＤ。Ｂは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で４日間刺激したＰＢＭＣによるＧｅ−ｃｏｎおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。最大エフェクター標的比（１００：１）でのＬＡＫ細胞によるそれぞれの細胞の溶解割合を、各試験（ｎ＝４）において１００％に調整し、種々のエフェクター：標的比での種々のエフェクター細胞による標的細胞の相対溶解を計算した。ＳＡＨＡ処理細胞は、未処理細胞よりも有意に良好に溶解された（ｐ＝０．００３０、処理に対して三元配置ＡＮＯＶＡ、標的細胞型およびエフェクター：標的比は１００：１および５０：１）。標的細胞型はまた、ＳＡＨＡ処理との組み合わせにおいても重要であったため（ｐ＝００００６）、細胞型による層化ＡＮＯＶＡを行ない、両方の標的細胞株に対してこの結果を確認した（Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ：ｐ＝０．００７５およびＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ：ｐ＝０．００４５）。
【図１０】図１０は、ＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ処理と、Ｇｅ−ｃｏｎ標的細胞におけるＭＩＣＡ／Ｂ誘導との併用により、死滅が相乗的に増大されることを示す図である。これは、ＴＫＤでの刺激後、増大量のグランザイムＢの発現のためである可能性がある。Ａは、ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）を併用して、または併用せずにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）とともに、またはなしで５日間培養したＮＫ細胞によるＧｅ−ｃｏｎ標的細胞の３連の特異的溶解の平均±ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。Ｂは、４つの独立した実験で測定した、ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）を併用して、または併用せずにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で５日間刺激したＮＫ細胞によるＧｅ−ｃｏｎ細胞の相対溶解の平均＋ＳＤ。標的細胞は、標準条件下で培養する（ｃｏ）か、または試験前に２０時間１０μＭのＳＡＨＡに曝露するかのいずれかとした。Ｃは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）＋ＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）との５日間の培養前（ＮＫ＋）および培養後のＭＡＣＳ富化ＮＫ細胞のフローサイトメトリーによる解析。７つの独立した実験のマーカー陽性細胞の割合の平均＋ＳＤを示す。Ｄは、細胞内染色後、フローサイトメトリーによって測定した、５つの独立した実験のグランザイムＢの平均蛍光強度（ＭＦＩ）＋ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、原発性および転移性新生物性疾患および感染性疾患の研究、予防および処置のため、および哺乳動物、特にヒト個体の所望の標的細胞に対して免疫応答を惹起するための方法および組成物に関する。特に、本発明の一態様によれば、対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用が提供され、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与する。
【００１６】
本発明は、腫瘍の免疫原性を増大させてＣＴＬ応答を誘導し得る内因性危険シグナルとして機能を果たすことが公知であるストレス誘導性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０が、腫瘍細胞上のストレス誘導性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）Ａ分子およびＢ分子を認識するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄにより活性化させることもできるという観察結果に基づく。後述する実施例に示すように、ＨＳＰ７０過剰発現ヒト黒色腫細胞からの腫瘍の大きさおよび転移速度は、Ｔ細胞およびＢ細胞欠損ＳＣＩＤマウスにおいて低下したが、機能性ＮＫ細胞がさらに欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスでは低下しなかった。ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍におけるＭＩＣＡ／Ｂ発現に対する対抗選択は、ＳＣＩＤマウスにおいて観察されたが、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでは観察されなかった。腫瘍由来ＨＳＰ７０は、ＭＩＣＡ／Ｂ発現腫瘍細胞を死滅させると思われるＳＣＩＤマウスにおいてＮＫ細胞を活性化させることができた。この動物モデルにおける観察結果に従い、完全長ＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドは、インビトロでヒトＮＫ細胞を活性化し、ＭＩＣＡ／Ｂ発現を薬理学的手段によって誘導させたＭＩＣＡトランスフェクト標的細胞および黒色腫細胞を死滅させることができた。したがって、２つのストレス誘導性危険シグナルであるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂの相乗作用的活性によってＮＫ細胞の活性化増強がもたらされ、腫瘍増殖の低減および転移の抑制がもたらされる。
【００１７】
ＮＫ細胞およびＨＳＰ７０は、それぞれ、感染性疾患の対処にも関与することが公知であるため、本発明は、腫瘍および感染性疾患に対して実施され得る。したがって、原則的には本発明により、細胞表面上にＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する所望の細胞または望ましくない細胞を作製することにより、任意の標的細胞が免疫療法に対して感受性となり得る。
【００１８】
「ＮＫ細胞」は、本明細書で用いる場合、典型的には、細胞表面マーカーとして発現されたＣＤ１６および／またはＮＣＡＭおよび／またはＣＤ５６分子を有するがＣＤ３を発現しないリンパ球、好ましくはヒト起源のリンパ球をいう。ＮＫ細胞は、哺乳動物のインビボで存在する細胞またはインビトロで精製細胞集団の形態で存在する細胞をいう。ＮＫ細胞活性化剤」または「ＮＫ細胞の活性化因子」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物の癌細胞またはウイルス感染細胞の休止（または未処置）ＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強または増大させることができる薬剤をいう。かかる薬剤としては、限定されないが、１種類以上のＴｏｌｌ受容体を活性化させる薬剤、例えば、グランザイムＡまたはグランザイムＢ、種々のインターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２ ＩＬ−１５など、およびインターフェロン、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどが挙げられる。
【００１９】
ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄの（に対する）リガンドは、当業者には周知であり、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＵＬ１６結合タンパク質ファミリーの構成員（ＵＬＢＰ）１〜４が包含される；例えば、Ｆｒｉｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３（２００３）、８９９６−９００６を参照のこと。ＮＫＧ２Ｄ受容体のヒトリガンドであるＵＬＢＰもまた特徴付けされており、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｂｌｏｏｄ １０８（２００６）、１３１３−１３１９に記載されている。また、国際特許出願ＷＯ２００５／０８０４２６には、ＵＬ１６およびＮＫＧ２Ｄ受容体に高い親和性で結合するＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰタンパク質ファミリーの新規な構成員（ＲＡＥＴ１Ｇ）が記載されている。
【００２０】
さらに、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体などの人工リガンドを使用してもよい。例えば、国際特許出願ＷＯ０２／０６８６１５を参照のこと。これには、とりわけ、人工的に操作された細胞集団を含むＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞を刺激するための抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびリガンド誘導体の使用が記載されている。これに関連して、本発明によれば、標的細胞は、所与の細胞が本発明の処置および使用に対して感受性となるように、ＮＫＧ２Ｄの天然または人工リガンドを新たに、または誘導／増強レベルでのいずれかで発現するように遺伝子操作されてもよいことは理解されよう。
【００２１】
用語「処置」、「処置すること」などは、本明細書では、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味するために用いる。該効果は、疾患もしくはその症状を完全にまたは一部防ぐ点から予防的であり、ならびに／あるいは疾患および／もしくは疾患に起因する有害効果が完全にまたは一部治癒する点から治療的であり得る。用語「処置」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるがまだ該疾患を有すると診断されていない対象において該疾患が発症するのを予防すること；（ｂ）疾患を抑止すること、すなわち、その進行を停止させること；または（ｃ）疾患を軽減させること、すなわち、該疾患の後退をもたらすことが挙げられる。
【００２２】
さらに、用語「対象」は、本明細書で用いる場合、免疫療法、例えば、新生物性または感染性疾患の改善、処置および／または予防を必要とする動物に関する。最も好ましくは、前記対象はヒトである。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた方法に従って製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。好適な医薬用担体の例は、当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョンなど、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体を含む組成物は、よく知られた慣用的な方法によって製剤化され得る。このような医薬組成物は、対象に適当な用量で投与され得る。適当な組成物の投与は、種々の様式によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的または皮内投与によって行なわれ得る。エーロゾル製剤、例えば経鼻スプレー製剤などには、活性薬剤の精製水溶液または他の溶液が、保存剤および等張剤とともに含まれる。かかる製剤は、好ましくは、鼻の粘膜と適合するｐＨと等張性状態に調整される。経直腸または経膣投与のための製剤は、適当な担体を有する坐剤として提示され得る。
【００２４】
投薬レジメンは、主治医および臨床因子によって決定される。医学分野でよく知られているように、任意のある患者に対する投薬量は、多くの要素、例えば、患者の体格、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の期間および経路、一般健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内（この範囲内での発現もしくは発現の阻害のための核酸）であり得る。しかしながら、特に上記の要素を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量も想定される。一般的に、医薬組成物の規則的な投与としてのレジメンは、１μｇ〜１０ｍｇ単位／日の範囲内であるのがよい。レジメンが連続注入である場合でも、それぞれ、１μｇ〜１０ｍｇ単位／キログラム体重／分の範囲内であるのがよい。進行は、定期的な評価によってモニターされ得る。
【００２５】
非経口投与のための調製物には、滅菌された水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えばオリーブ油など、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどである。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、体液および栄養分補給物質、電解質補給物質（リンゲルデキストロース系のものなど）などが挙げられる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート試薬および不活性ガスなどを存在させてもよい。さらに、本発明の医薬組成物の意図される用途に応じて、該医薬組成物にインターロイキンまたはインターフェロンなどのさらなる薬剤を含めてもよい。さらに、例えば、本発明の医薬組成物に受動免疫処置のためのＮＫＧ２Ｄのリガンドが含まれる場合、医薬組成物はワクチンとしても製剤化され得る。
【００２６】
また、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましいことがあり得る。治療有効用量または治療有効量は、症状または病状が改善されるのに充分な活性成分の量をいう。かかる化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物での標準的な製薬手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で示され得る。
【００２７】
本発明による医薬組成物は、免疫応答障害に関連する疾患の処置、好ましくは感染性疾患、敗血症、糖尿病の処置、または腫瘍の処置のために使用され得る。好ましくは、処置される腫瘍は、婦人科腫瘍、例えば前立腺腫瘍など、神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、未分化神経外胚葉性腫、脳幹神経膠腫癌、結腸癌、気管支の癌、扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、結腸、頚部または膵臓の癌、頭部／首部の癌、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、中皮腫、白血病、黒色腫、婦人科腫瘍、例えば前立腺など、および髄膜癌腫（ｍｅｎｉｎｇｅｏｍａ）からなる群より選択される。
【００２８】
上記および後の実施例に示すように、本発明の基礎をなす概念は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡとＢをそれぞれ、ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして用いて確認した。したがって、ＭＩＣＡ／Ｂまたは機能的に等価な分子は、本発明に従って使用される好ましいリガンドである。
【００２９】
ヒトＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、先行技術に示されており、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースで容易に検索することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１２４６５２（ＮＭ＿０００２４７）および、例えば、ＶｅｒｎｅｔらによるＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８（１９９３），４７−５３などの刊行物を参照のこと。同様に、ＭＩＣＢのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９３１およびＢＣ０４４２１８ならびに例えば、ＢａｈｒａｍらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１９９４），６２５９−６２６３；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５（１９９６），１６１−１６２；ならびにＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３（１９９６），２３０−２３３などの刊行物を参照のこと。
【００３０】
対象由来の試料において、ＭＩＣポリペプチド、ＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢのいずれかまたは両方の存在を調べるための手段および方法は、当業者には周知である。例えば、国際特許出願ＷＯ０３／０８９６１６を参照のこと。このような方法は、本発明の医学的用途、例えば、疾患細胞上のＭＩＣポリペプチドについてアッセイすることにより対象において癌を検出すること、および次いで、本明細書に記載の癌療法剤を投与することを伴う癌療法のために実施され得る。
【００３１】
前記ＮＫ細胞は、患者への投与前に活性化させてもよく、ＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計されてもよい。好ましくは、前記活性化因子は、Ｈｓｐ７０のペプチドを含み、これは、後の実施例で、この目的に最も有効であることが示された。さらに、Ｈｓｐ７０タンパク質またはその断片の使用によるＮＫ細胞の活性化方法、およびそのようにして得られる生成物の医学的適用、例えば、Ｈｓｐ７０タンパク質もしくはその断片または活性化ＮＫ細胞を含有する調合薬、医薬品または医薬用アジュバントなどが、国際特許出願ＷＯ９９／４９８８１に記載されている。さらに、Ｈｓｐ７０タンパク質由来の免疫調節ペプチドおよびＮＫ細胞活性の刺激のためのかかるペプチドの使用が、国際特許出願ＷＯ０２／２２６５６に開示されている。本発明の特に好ましい実施形態において、ＮＫ活性化剤は、実質的にアミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）からなるＨＳＰ７０ペプチドである。後の実施例も参照のこと。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、さらなる免疫調節性の薬剤、好ましくは、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのインターロイキンとともに投与され得る。実施例に示すように、インターロイキンＩＬ−２の使用は、悪性細胞の処置のために免疫細胞を活性化させるのに好都合であり、したがって好ましく使用される。
【００３３】
本発明の範囲において行なった実験によって、さらに、Ｇｅ黒色腫細胞においてＮＫＧ２Ｄのリガンド、すなわちＭＩＣＡ／Ｂの発現を薬理学的に誘導すると、これらは、ＨＳＰ７０活性化型ヒトＮＫ細胞の標的となり得ることが明らかになった。後の実施例９を参照。したがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドの発現の誘導因子を含むか、または該誘導因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記誘導因子はヒストンデアセチラーゼ阻害因子、例えば、実施例で使用したトリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である。しかしながら、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのリガンドの発現の他の誘導因子、例えば、バルプロ酸ナトリウム（Ａｒｍｅａｎｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（２００５），６３２１）、電離放射線、マイトマイシンＣ、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、アフィジコリン、クロロキン（Ｇａｓｓｅｒら Ｎａｔｕｒｅ ４６３（２００５），１１８６）も同様に使用され得る。
【００３４】
さらに、ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＮＫ細胞によって媒介される細胞溶解的攻撃の標的認識構造として提供され得る。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のための、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子の使用に関する。前記ＮＫ細胞は、対象への投与前に活性化させてもよく、あるいはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される。好ましくは、前記活性化因子はＨｓｐ７０のペプチドを含む。前掲参照。さらに、疾患細胞が実質的に細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を欠く場合、前記細胞を、細胞表面上にＨＳＰ７０を発現するように誘導してもよい。
【００３５】
したがって、前記医薬組成物は、さらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含み得る。
【００３６】
さらに、前記医薬組成物は、免疫応答を増強する少なくとも１種類の化合物をさらに含むか、またはかかる化合物とともに投与されるように設計され得る。また、前掲も参照のこと。好ましくは、処置対象の前記望ましくない細胞は、腫瘍細胞または感染細胞である。すでに先に記載のように、前記医薬組成物は、望ましくない細胞がＮＫ活性化剤に曝露される前、曝露中または曝露後に投与されるように設計され得る。
【００３７】
本明細書において先に記載のように、疾患細胞または疾患組織の細胞表面上に発現されたＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃の有効な標的化のための新規な認識構造を提供する。細胞溶解的攻撃に対する腫瘍細胞上でのＨＳＰ７０と該リガンド、すなわちＭＩＣＡ／Ｂの存在の相乗作用効果が観察されたため、細胞表面上で該クラスの分子の発現／存在をともに示す細胞および組織は好ましい標的細胞であるが、ＮＫＧ２Ｄのリガンドの存在だけで、望ましくない細胞／所望の細胞をＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃に対して感受性にするのに既に充分である。
【００３８】
したがって、本発明の使用、方法および医薬組成物は、細胞表面上でのＨＳＰ、例えば、ＨＳＰ４０、６０、７０、９０および／または１１０の発現を欠き、したがって、これまで免疫療法によってアプローチがなされ得なかった、または効率的にアプローチがなされ得なかった疾患細胞の処置にもまた好適である。好ましい実施形態において、処置される細胞は、細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を実質的に欠いていることを特徴とする。
【００３９】
このような状況下、疾患細胞または疾患組織もしくは疾患臓器と関連する細胞の細胞表面上でのＨＳＰ、特にＨＳＰ７０の発現を誘導または増強し、該細胞に対してＮＫ細胞を相乗的に活性化させることは特に好ましい。ＨＳＰ７０の発現の誘導は、高体温、化学療法、放射線療法またはその任意の組み合わせによって達成され得る。また、ＨＳＰ７０に関連して言及した先行技術（前掲）も参照のこと。腫瘍に対する化学療法は、この疾患に非常に多くの異なる形態が存在するため種々である。処置は、単独抗癌薬物療法、すなわち単独薬剤での化学療法に依存し得るか、またはいくつかの異なる抗癌薬との併用化学療法を含み得る。かかる薬物は癌細胞を、急速な増殖および分裂を妨げることにより崩壊させる。本発明の好ましい実施形態では、前記細胞傷害的アプローチによりアポトーシスが誘導される。細胞の内在的死滅プログラムであり組織恒常性の重要な調節因子であるアポトーシスに関する概要は、例えば、ＦｕｌｄａおよびＤｅｂａｔｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃ．Ａｇｅｎｔｓ ３（２００３），２５３−２６２に示されている。国際特許出願ＷＯ０３／０８６３８３には、腫瘍／感染細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０発現の誘導による腫瘍、細菌感染もしくはウイルス感染の処置のための医薬組成物の調製のための、細胞内タンパク質凝集を誘導し得る薬物、特にビンクリスチンおよびパクリタキセルの使用が記載されている。これらの薬物は抗腫瘍剤であるため、この実施形態は、相乗作用効果を奏するはずである併用療法のさらなる利点を提供する。
【００４０】
したがって、本発明ではまた、細胞傷害性の第２の薬剤の活性に対して腫瘍細胞を感作させるための、記載された医薬組成物の使用が想定される。この実施形態により、他の場合ではあまり有効でないか、さらには全く有効でない化学療法剤の有効性が改善されるレジメンが可能になる。したがって、本発明はまた、化学療法薬、γ−照射およびデス受容体、例えばＣＤ９５などの誘発による細胞傷害性のアプローチ、例えばアポトーシス誘導などの活性に対して、腫瘍細胞および感染細胞を感作させるための上記の医薬組成物の使用に関する。また、前掲も参照のこと。特に、本発明は、化学療法剤の活性に対して腫瘍細胞、特に、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄに対する／ＮＫＧ２Ｄのリガンド、特にＭＩＣＡ／Ｂおよび／またはＨＳＰ、好ましくはＨＳＰ７０の存在について陽性と判定された細胞を感作させるための医薬組成物に関する。同様のアプローチが、疾患組織または疾患細胞の細胞表面上での抗アポトーシス性のＢｃｌ−２関連アタノジーン（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ）（Ｂａｇ）ファミリーの構成員、特に、Ｂａｇ４およびＨＳＰの存在および共局在に関して、特に、使用される化学療法剤に関して国際特許出願ＷＯ２００５／０５４８６８に記載されており、その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。免疫原性特性を有する抗原提示細胞および膜小胞を感作させるための別の方法、ならびにインビトロまたはインビボで抗原を媒介および提示するためのその使用、ならびに癌、感染性疾患、寄生虫病または自己免疫疾患を処置するための方法または組成物が、特にＷＯ９９／０３４９９に記載される。
【００４１】
他の併用療法は、例えば、サイトカイン、インターロイキンまたは好ましくはグランザイムＢの使用を含み得る。特に、グランザイムＢは、腫瘍、ウイルスもしくは細菌感染症または炎症性疾患の処置に最も有効であることが示されており、この場合、腫瘍細胞または前記感染もしくは炎症に冒された細胞は、その細胞表面上にＨｓｐ７０を発現する。国際特許出願ＷＯ２００４／０１８００２および後の実施例１０を参照のこと。
【００４２】
本明細書に記載の知見をさらに、誘導性ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍に対するマウスＮＫ細胞の活性が熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０によって促進されることが実証されたマウスモデルを用いて確認した。Ｅｌｓｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（２００７），５５２３−５５３３を参照のこと。これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本明細書において先に記載し、後の実施例に例証した知見に基づき、本発明はまた、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子または本明細書において先に定義した誘導因子を、ＮＫ活性化剤および／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む併用調製物に関する。例えば、一実施形態において、該調製物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害因子とＨＳＰ７０ペプチドを含み得る。
【００４４】
本発明は、さらに、対象に、治療有効量の上記の医薬組成物の任意の１種類を投与すること、および／または上記の薬物療法計画を適用することを含む、本明細書において定義した疾患と関連する望ましくない状態を有する対象の処置方法を提供する。記載のように、原則的には、免疫療法に対して感受性である任意の疾患、最も顕著なものの例を挙げると、感染性疾患、ウイルス疾患、癌などが、本発明の薬物療法に従って処置され得る。
【００４５】
本発明の方法によって処置または予防され得る感染性疾患は、感染性因子、例えば限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫によって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る細菌性疾患は、細菌、例えば限定されないが、マイコバクテリア リケッチア、マイコプラスマ、ナイセリアおよびレジオネラによって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る原生動物疾患は、原生動物、例えば限定されないが、リーシュマニア、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、およびトリパノソーマによって引き起こされる。本発明の方法によって処置または予防され得る寄生虫疾患は、寄生虫、例えば限定されないが、クラミジアおよびリケッチアによって引き起こされる。
【００４６】
本発明の方法によって処置または予防され得るウイルス疾患としては、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹Ｉ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純疱疹ＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノ（ｅｃｈｉｎｏ）ウイルス、アルボウイルス、フンタ（ｈｕｎｔａ）ウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｈｉｅ）ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）によって引き起こされるものが挙げられる。
【００４７】
本発明の方法によって処置または予防され得る癌としては、限定されないが、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、頭部／首部の癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ならびに重鎖病が挙げられる。
【００４８】
具体的な実施形態では、癌は転移性である。別の具体的な実施形態では、癌を有する対象は、本発明の組成物の投与前に抗癌療法（例えば、化学療法放射線）を受けたという理由で免疫抑制されている。
【００４９】
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例によって開示および包含される。本発明に従って使用される材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて、公共の図書館およびデータベースから検索され得る。例えば、公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が利用され得、このホストは、国立生物工学情報センターおよび／または米国立衛生研究所のアメリカ医学図書館である。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部門である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のものなどは、当業者には公知であり、また、インターネット検索エンジンを用いて入手することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概観ならびに回顧的検索およびカレント・アウェアネス（ｃｕｒｒｅｎｔ ａｗａｒｅｎｅｓｓ）に有用な関連特許情報源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４），３５２−３６４に示されている。
【００５０】
上記の開示は、本発明を一般的に記載する。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができよう。いくつかの文献を、場合によっては、括弧書きで番号を引用して本明細書の本文中に挙げている。すべての引用書誌は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前を見るとよい。引用したすべての参考文献（例えば、本出願書類中に引用した参照文献、発行済特許、公開された特許出願および製造業者の仕様書、使用説明書など）の内容は、引用により明示的に本明細書に組み込まれる。しかしながら、引用した文献が、本発明に関する先行技術であることを自認するものではない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、なんら本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書において使用されたものなどの慣用的な方法の詳細な説明は、引用した文献を見るとよい。また、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”第１７版、ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ編（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．２００３）も参照のこと。
【００５２】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野における技能の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が使用される。本明細書に挙げたすべての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
分子遺伝学および遺伝子操作における方法は、現行版のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＦｒｅｓｈｎｅｙおよびＡｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（Ａｕｓｕｂｅｌら編）；ならびにＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；学術論文Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）に一般的に記載されている。本開示において言及した遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈなどの市販の販売元から入手可能である。細胞培養および培地回収における一般的な手法は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（１９９１），７３）；Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１）；Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ａｒｒａｙｓ，Ｈｅｒｚｅｌら，ＣＨＡＯＳ １１（２００１），９８−１０７に概略が示されている。
【００５４】
実験手順
動物実験
ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７／Ｚｔｍ−ｓｃｉｄ）マウスとＳＣＩＤ／ベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−ｓｃｉｄ−ｂｇ）マウスを、個々に換気孔を設けたケージ内で病原体なしの状態下、そのままの群で繁殖させた。ＳＣＩＤマウスは、初めにＨ．Ｊ．Ｈｅｄｒｉｃｈ博士（Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ＳＣＩＤ／ベージュマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ケージ、床敷きおよび水はオートクレーブ処理し、殺菌処理した実験用齧歯類飼料を与えた。すべての操作は、層流フードを使用した無菌条件下で行なった。ＥＬＩＳＡを用いて血清免疫グロブリンを測定することにより漏出性の（ｌｅａｋｙ）マウスを除外した後、１２〜２０週齢の雌および雄のマウスを実験に使用した。動物実験はすべて、地方自治体によって承認されたものであり、動物愛護機関のガイドラインに従った。腫瘍細胞（１００μｌのＰＢＳ中１×１０６）をマウスの側腹内に皮下注射した。腫瘍の増殖を触診によって２日毎にモニターし、大きさを線型カリパスを用いて記録した。腫瘍体積を、式Ｖ＝πａｂｃ／２（式中、ａ、ｂ、ｃは、直交する直径である）によって計算した。動物を、腫瘍体積が１ｃｍ３に達する前に致死させたが、このとき、１０％より大きい体重減少が起こるか、またはなんらかの痛みもしくは苦しみの行動的徴候が観察された。すべての動物について剖検を行ない、腹および胸腔を転移の存在について体系的に調べた。ＳＣＩＤマウスの脾臓を取り出し、後の免疫学的解析用に細胞培養培地中に入れた。原発腫瘍の一部を遺伝子発現解析用に、液体窒素中で即座に凍結した。腫瘍組織および転移が疑われる組織をリン酸緩衝４％ホルマリン中に１６時間入れ、次いで、パラフィン中に包埋した。組織切片（２．５μｍ）を、常套的な組織学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色し、肉眼検査の観察結果を確認した。増殖マーカーＫｉ６７の免疫組織化学的染色を既報のとおりに行なった（１９）。腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析では、腫瘍組織を小片に切断し、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃で９０分間インキュベートした。単離細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳ中に再懸濁した後染色した。
【００５５】
遺伝子発現解析
既報のとおりに、ＲＮＡを調製し、ノザンブロットを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブとハイブリダイズさせた（２０）。濃度測定のためにオートラジオグラフをスキャンした（Ｅｐｓｏｎ ＧＴ−８０００ Ｓｃａｎｎｅｒ，ＳｃａｎＰａｃｋ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＨＣ連鎖ラットＨｓｐ７０−１（２８７５〜３０７０位；受託番号Ｘ７７２０７）（２１）およびヒトＨＳＰ７０−２遺伝子（２２２５〜２４０７位、受託番号Ｍ５９８３０）（２２）に特異的なハイブリダイゼーションプローブを、それぞれの遺伝子の３’非翻訳領域からゲノムのＰＣＲ増幅によって誘導した。エキソン２〜５（２３）を含むアカゲザルＭＩＣ３遺伝子から誘導した遺伝子プローブを用いて、大きさによって識別され得るＭＩＣＡとＭＩＣＢの転写物を検出した。ヒトＭＩＣ遺伝子とアカゲザルＭＩＣ遺伝子の類似性は約９０％であり、したがって、プローブは、ノザンブロットハイブリダイゼーションにおいて交差反応性である。ヒトβ−アクチンｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００５６】
標的細胞株および細胞培養
ヒト黒色腫細胞株ＧｅであるＧｅ−Ｈｓｐ７０ならびに該細胞株から誘導したＧｅ−ｃｏｎ亜株（クローンＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ａ、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ、Ｇｅ−ＴＣＲ−Ｃ、およびＧｅ−ＧＦＰ−Ｂ）（１５）、マウス線維芽細胞Ｌ細胞、ならびにトランスフェクトＬ細胞を、３７℃で１０％ＣＯ２雰囲気中で、組織培養用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内の１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）（Ｓｉｇｍａ）を補給したＮａＨＣＯ３緩衝ＤＭＥＭ中で維持した。ヒト赤白血病Ｋ５６２およびマウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞を、同じ条件下にて懸濁細胞用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内に維持した。ＭＩＣＡとＭＩＣＢの発現を誘導するため、試験前に、Ｇｅ細胞を、１０μＭのヒストンデアセチラーゼ阻害因子スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を含むＤＭＥＭ中で２０時間培養した（２４）。Ｌ細胞を、ヒトＭＩＣＡに対してオーソロガスであるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のＭＩＣ３遺伝子を含む３０μｇのコスミドＡ１５８（２５）、およびジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対する耐性を付与する１μｇのｄｓＲＥＤベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＵＳＡ）でのエレクトロポレーションによってコトランスフェクトした。ジェネティシン（ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ）（１ｍｇ／ｍｌ）での選択後、安定なクローンを限界希釈によって確立し、特異的プライマー（５’−ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＧＧ Ａ−３’（配列番号：１）および５’−ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号：２）、特異的ＰＣＲ産物の長さ１３９６ｂｐ）を用いたＰＣＲによってコスミド存在について試験した。ＭＩＣＡ ｍＲＮＡの発現をノザンブロットによっておよび細胞表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。４つの独立したクローンを標的細胞として、ヒトおよびアカゲザルリンホカイン活性化型キラー（ＬＡＫ）細胞について試験すると結果は類似し、ＭＩＣＡ発現がＬＡＫ細胞に対して感受性を付与することが確認された。クローンＫ４３（Ｌ−ＭＩＣＡ）をさらなる試験に選択した。
【００５７】
Ｇｅ黒色腫細胞の増殖およびアポトーシス
Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞のインビトロ増殖を、［メチル−３Ｈ］チミジン取り込みの測定によって解析した。２００μｌのＤＭＥＭ中２×１０４細胞／ウェルを、細胞培養用マイクロタイタープレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に、各時点での測定（１２、２４、４８および７２時間）に対して３連で播種した。採取１２時間前、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］−チミジン（比活性５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、５０μｌのＤＭＥＭ中それぞれのウェルに添加した。３連のものは、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ細胞採取装置５５０（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）を用いて採取した。取り込まれた放射能は、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンターを用いた液体シンチレーション計数によって測定した。該黒色腫細胞において、アポトーシスを低酸素状態およびグルコース飢餓によって誘導した。細胞を低酸素性条件に曝露するため、ペトリ皿を、通常嫌気性細菌の培養に供されるＧａｓＰａｋ １００システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内に入れた。２時間後、該システム内のＯ２濃度は１％未満となり、ＣＯ２濃度は１０％に達する（Ｓｅｉｐ，Ｗ．Ｆ．およびＥｖａｎｓ，Ｇ．Ｌ．１９８０．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＧａｓＰａｋ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１（１９８０），２２６−２３３）。ＧａｓＰａｋシステムを３７℃のインキュベーター内に２４時間入れた。グルコース飢餓のため、該黒色腫細胞を、標準的なＤＭＥＭと同様の補給物を添加したグルコース無含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で２４時間培養した。ＤＮＡヒストグラムのサブＧ１のピークに出現したヨウ化プロピジウム陽性死細胞およびアポトーシス細胞を、既報のとおりに測定した（２０）。
【００５８】
エキソソームの調製およびイムノブロットブロット解析
Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞株を約８０％コンフルエンスまで培養した後、新鮮なＤＭＥＭ中で７２時間培養した。トリパンブルー排除で測定したところ、バイアビリティは＞９５％であった。上清みを採取し、エキソソームを既報のとおりに調製し（２６）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。Ｈｓｐ７０の誘導性形態に特異的な抗体（Ａｂ）（クローンＣ９２Ｆ３Ａ−５，マウスＩｇＧ１，ＳＰＡ−８１０，ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ，Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＲａｂ４に対する抗体（ｓｃ−３１２，ウサギＡｂ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）を用いて、イムノブロッティングを行った（２６）。
【００５９】
組換えタンパク質
ラットＨｓｐ７０−１遺伝子から誘導されるＨｉｓタグ化組換えＨＳＰ７０タンパク質は、以前に報告された（２０）。ラットＨｓｃ７０遺伝子を、ラットリンパ球ｃＤＮＡから、ＰＣＲ（フォワード：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：３）およびリバース５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号：４））によって増幅した。フォワードプライマーにはＢａｍＨＩを、リバースプライマーにはＥｃｏＲＩ制限部位をこれらの５’末端に含めた。増幅産物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによってｐＧＥＸ−４Ｔ−２発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内にクローニングした。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限断片をこのベクターから単離し、Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質を生成するために、ｐＱＥ３０−１発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に再クローニングした。この構築物を配列決定し、ミスセンス変異を排除した。大腸菌株Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ）をこの構築物で形質転換し、Ｈｉｓタグ化タンパク質の過剰発現用の宿主として使用した。該タンパク質の誘導および精製は、既報のようにして行なった（２０）。組換えヒトＨＳＰ７０（ＥＳＰ−５５５、内毒素濃度＜５０ＥＵ／ｍｇ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎから購入した。
【００６０】
エフェクター細胞およびエフェクター細胞の培養
Ｔｅｎｂｒｏｅｃｋホモジナイザーを用いてＳＣＩＤマウス由来の脾細胞を得、溶解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４−７．８）中での５分間のインキュベーションによって赤血球を除去した。その後、細胞を、細胞傷害性エフェクター細胞として直接使用するか、または１０％ＦＣＳおよびコンカナバリンＡ刺激リンパ球由来の２０％上清みを含むＤＭＥＭ中で２４時間培養した後、５１クロム放出アッセイに使用するかのいずれかとした。ヒトエフェクター細胞を、健常な実験共同作業者うちの志願者の末梢血から、Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）での密度勾配遠心分離によって得た。ＮＫ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、陰性選択キット（ＮＫ細胞単離キットＩＩ、１３０−０９１−１５２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）によって単離した。このキットには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａに対する抗体のカクテルが含まれる。ＬＡＫ細胞を得るため、ＰＢＭＣを、５ｍｌ容組織培養用ペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内で、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を補給したＤＭＥＭ中、５〜１０×１０６細胞／ｍｌの密度で４〜７日間培養した。ＭＡＣＳが富化されたＮＫ細胞を、組織培養用２４ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内で、２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。一部の培養物には、２μｇ／ｍｌの組換えＨＳＰ７０、組換えＨＳＣ７０、またはＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加した。ＴＫＤは、ヒトＨＳＰ７０のＣ末端基質結合ドメインの適正製造基準（ＧＭＰ）等級の１４量体ペプチド（ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）、ａａ４５０〜４６３）である（２７）。大腸菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ製（Ｌ４３９１）であり、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で一部の培養物に添加した。
【００６１】
５１クロム放出アッセイ
標的細胞を、１００μｌのＦＣＳを含有する２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ中１×１０６細胞と５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｅｓｃｈｗｅｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを１時間３７℃でインキュベートすることにより標識し、ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭで３回洗浄した。エフェクター細胞を５×１０３の５１Ｃｒ標識標的細胞に３連で、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／丸底マイクロタイタープレートのウェル中、ＬＡＫ細胞には約１００：１〜１．５：１の比率で、ＮＫ細胞には１０：１〜０．６：１の比率でで添加した。自発的放出を、エフェクター細胞の非存在下での標的細胞のインキュベーションによって測定した。マイクロタイタープレートを４０×ｇで５分間遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートした後、再度遠心分離し、上清みと沈降物を別々に取り出し、各ウェル内の放射能を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｏｅｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。特異的溶解割合を、自発的５１Ｃｒ放出パーセントを差し引くことにより計算した（２０）。
【００６２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行なった。それぞれＧｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎクローンにおける細胞内ＨＳＰ７０、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を、フローサイトメトリーによって既報（１５）のようにして定期的に制御した。ＨＳＰ７０の細胞表面発現を、原形質膜上のＨＳＰ７０を検出することが報告されている（２８）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＲＰＮ １１９７、マウスＩｇＧ１、多免疫、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってヨウ化プロピジウム陰性細胞において調べた。ＭＩＣＡ／Ｂ細胞表面発現は、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（マウスＩｇＧ１、Ｉｍｍａｔｉｃｓ，Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と反応するｍＡｂ ＢＡＭＯ１を用いて調べた。ヒトＭＨＣクラスＩ分子の染色には、ｍＡｂ Ｗ６／３２（マウスＩｇＧ１、Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。細胞内グランザイムＢ発現を、ＨＳＰ７０について既報（１５）のとおりに０．２５％サポニンでの細胞の透過処理後、ｍＡｂ Ｂ１８．１（マウスＩｇＧ１、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。この非標識マウスＩｇＧ抗体の二次試薬は、ポリクローナルＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１１５−０９５−０６２；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とした。組換えヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃキメラタンパク質（１２９９−ＮＫ、１３９−ＮＫ）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＮＫＧ２Ｄリガンドの細胞表面発現を検出した。このとき、ポリクローナルＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０９−０９５−０９８；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｎｏｖａ）を二次試薬として使用した。ＳＣＩＤマウスの脾臓中のＮＫ細胞の割合を、ｐａｎ−ＮＫ細胞マーカーＤＸ５（ラットＩｇＭ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。ヒトＰＢＭＣおよびＮＫ細胞富化および枯渇画分は、ＣＤ３（クローンＭＥＭ ５７、マウスＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣコンジュゲート、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ＣＤ４（クローンＳ３．５、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ８（クローン３Ｂ５、マウスＩｇＧ２ａ、ＴＣコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ１４（クローンＴｕｅｋ４、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ１６（クローン３Ｇ３、マウスＩｇＧ１−ＴＣコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ５６（クローンＭＥＭ １８８、マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥコンジュゲート、Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ９４（クローンＨＰ−３Ｄ９、マウスＩｇＧ１、ＦＩＴＣコンジュゲート、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＮＫＧ２Ｄ（クローン１４９８１０、マウスＩｇＧ１、ＰＥコンジュゲート、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体を特徴とした。アイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびラットＩｇＭ）は、Ｃａｌｔａｇから購入した。
【００６３】
統計
すべてのデータは、ソフトウェアＳＡＳバージョン９．１を用いて解析した。すべての設計実験で、反復測定の分散解析（ＡＮＯＶＡ）を行なった。種々の要素を、相互作用を伴う二元配置または三元配置ＡＮＯＶＡに組み込んだ。一部の実験ではサンプルサイズが限定的であったため、一部の要素については、サブグループの解析（生物学的に最も興味深い要素レベルのみ）または層別解析（要素レベルによる）しか行なうことができなかった。α＝０．０５の有意性レベルを使用した。
【００６４】
その他
化学薬品は、特に記載のない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＲｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のものとした。
【００６５】
実施例１：ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞の腫瘍増殖の低減
ヒト黒色腫細胞株Ｇｅをレトロウイルスによって形質導入し、通常ストレス誘導性のＭＨＣ連鎖ラットＨｓｐ７０−１（Ｈｓｐａ１）遺伝子を構成的に過剰発現させた。ラットおよびヒトのＭＨＣ連鎖誘導性ＨＳＰ７０タンパク質は、９６．３％同一で９８．４％類似しているが、これらは、３’非翻訳領域に特異的なプローブによってｍＲＮＡレベルで識別され得る。対照細胞クローン（Ｇｅ−ｃｏｎ）は、同じベクター由来のラットＴＣＲβまたはＧＦＰ発現構築物での形質導入によって得た。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎクローンはともに、既報のものであり、インビトロ解析によって詳細に特徴付けられた（１５）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞を、ＴおよびＢリンパ球が欠損したＳＣＩＤマウスの側腹に皮下注射した。これらの実験には、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞の２種類のクローン（Ｇｅ−Ｈｓｐ７０−ＡおよびＧｅ−Ｈｓｐ７０−Ｃ）対照細胞の２種類のクローン（Ｇｅ−ＴＣＲ−ＣおよびＧｅ−ＧＦＰ−Ｂ）を使用した。原発腫瘍の進行的増殖を継続させ、第２６日に、最初の動物を致死させた。驚いたことに、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖は、対照腫瘍と比べて低減した（表１）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞の注射後、最初の動物を致死させる前の第２４日に採取した（ｔａｋｅ）腫瘍は、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞（８６％）と比べてわずかに縮小した（７３％）。ほとんどの腫瘍は局所的に増殖したが、数例において、原発腫瘍の浸潤性の増殖および腸間膜内への局所転移が観察された。ある程度の転移が、さらに横隔膜および限局リンパ節において観察された。興味深いことに、転移の頻度（表１）は、Ｇｅ−ｃｏｎで２１％および親Ｇｅ腫瘍で１８％であったが、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍はいずれも転移が起こっていなかった。したがって、恒常的ＨＳＰ７０過剰発現により、Ｇｅ黒色腫細胞の悪性度が低下するようであった。さらに、腫瘍がＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞から発生したとしても、その増殖速度は、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞由来の腫瘍と比べて有意に低かった（ｐ＝０．００３９、ＡＮＯＶＡ）（図１）。
【００６６】
実施例２：増殖およびアポトーシスに対して構成的ＨＳＰ７０過剰発現の効果はない
増殖マーカーＫｉ６７を用いた腫瘍の組織病理学的評価および染色では、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍とＧｅ−ｃｏｎ派生腫瘍との間になんら大きな違いは示されなかった。また、インビトロ増殖も、［３Ｈ］チミジン取り込み（図２Ａ）および細胞計数にて測定されるようにＨＳＰ７０過剰発現クローンと対照クローンとの間で異ならなかった。したがって、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の増殖の低減は、増殖速度の差では説明され得なかった。したがって、腫瘍において出現する条件、例えば、低酸素状態およびグルコース飢餓に細胞を曝露した後の細胞死とアポトーシスを解析した。この場合も、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞とＧｅ−ｃｏｎ細胞との間に差は観察されなかった。このとき、低酸素状態またはグルコース無含有培地に２４時間曝露後、アポトーシスはサブＧ１のピーク測定（図２Ｂ）によって、または細胞死はヨウ化プロピジウム染色によって評価した。
【００６７】
実施例３：ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＮＫ細胞活性の増大
次いで、ＳＣＩＤマウスに依然として存在する先天免疫系が、ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫の増殖の制御の一部に寄与し得るという仮説をたてた。この疑問に取り組むため、ＮＫ細胞の数および細胞傷害活性を、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍または対照腫瘍を有するマウスで解析した。腫瘍が拒絶されたマウスとＧｅ−Ｈｓｐ７０またはＧｅ−ｃｏｎ腫瘍が増殖したマウスの脾臓ＮＫ細胞の割合は、著しくは異ならなかった（図３Ａ）。その代わり、Ｈｓｐ７０過剰発現腫瘍を有するマウス由来の脾細胞の細胞傷害活性は、図３Ｂに例証するように、ＮＫ細胞感受性標的細胞株ＹＡＣ−１と比べて増大した。ＳＣＩＤマウス由来の脾細胞の細胞傷害活性は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０およびＧｅ−ｃｏｎ細胞と比べてインビトロで一般的に低いが、この結果は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０腫瘍の増殖の制御におけるＮＫ細胞の役割を示した。
【００６８】
実施例４：ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞の腫瘍の増殖は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいて低減されない
インビボでのＮＫ細胞の役割をさらに確認するため、前述のものと同じ細胞クローンを、ＴおよびＢリンパ球に加えて機能性ＮＫ細胞も欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスに注射した。このとき、採取した腫瘍（表２）およびこれらのマウスにおける腫瘍の増殖（図３Ｃ）は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞とＧｅ−ｃｏｎ細胞の注射後、類似していた。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞由来の腫瘍では、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞からの腫瘍と同じ頻度で転移に至る（表２）。これらの結果により、ＳＣＩＤマウスにおいて観察された差は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍の増殖を一部制御し、転移を完全に抑制するというＮＫ細胞の活性によるものであることが明白に示された。
【００６９】
実施例５：ＨＳＰ７０含有エキソソームは、ＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞から放出される
細胞外ＨＳＰ７０は、ＮＫ細胞を活性化し、ＨＳＰ７０細胞表面陽性腫瘍細胞を特異的に溶解させることが示されている（１２）。したがって、ＨＳＰ７０が黒色腫細胞から放出されているか否かを調べた。腫瘍細胞などの細胞は、熱ショックタンパク質を含有するエキソソームを放出させ得ることが知られている（２６，２９）。Ｇｅ−ｃｏｎ細胞とは対照的に生存能力のあるＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞は、実際に、誘導性ＨＳＰ７０を含有するエキソソームを放出した（図４）。また、ＨＳＰ７０は、腫瘍内に通常存在する壊死性領域からもインビボで放出されている可能性がある。
【００７０】
実施例６：腫瘍においてＨＳＰ７０細胞表面はないがＭＩＣＡ／Ｂ発現は起こる
ＨＳＰ７０がＮＫ細胞の標的構造としても機能を果たし得る（１２）か否かを調べるため、黒色腫細胞上でのＨＳＰ７０の発現を、ＨＳＰ７０細胞表面染色に適した抗体を用いて解析した。培養Ｇｅ−Ｈｓｐ７０細胞ならびにＧｅ−ｃｏｎ細胞は、ＨＳＰ７０細胞表面染色に対して陰性であった（図５Ａ、７Ｂ）。ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ／ベージュマウス由来の新鮮な調製腫瘍から得た細胞もまた、細胞表面においてＨＳＰ７０の発現を示さなかった（図６Ａ）が、トランスジェニックラットＨｓｐ７０−１ ｍＲＮＡは、依然としてＧｅ−Ｈｓｐ７０由来腫瘍において強く発現されていることがわかった（図６Ｂ）。したがって、ＮＫ受容体を活性化させるための他のリガンドが腫瘍上に存在しているのかどうかという問いが生じた。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ分子を選択した。とりわけ、これらのヒトリガンドは、マウスの活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄとも相互作用することが示されていた（３０〜３２）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡの発現は、Ｇｅ−Ｈｓｐ７０、Ｇｅ−ｃｏｎおよび親Ｇｅ細胞において、インビトロで非常に低かった（図６Ｂ）。この観察結果により、ＳＣＩＤマウスから得たＮＫ細胞のインビトロで観察された低い細胞傷害活性が説明され得る。しかしながら、腫瘍では、両方のＭＩＣ遺伝子の発現が明らかに誘導された（図６Ｂ）。興味深いことに、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡ発現は、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖した腫瘍と比べ、ＳＣＩＤ／ベージュにおいて増殖した腫瘍において高かった（ＭＩＣＡ：ｐ＝０．０１４６およびＭＩＣＢ：ｐ＜００００１）。Ｇｅ−Ｈｓｐ７０対Ｇｅ−ｃｏｎ腫瘍におけるＭＩＣＢ ｍＲＮＡの差示的発現は、宿主によって変更された。これは、ＳＣＩＤマウスでは低減されたが、かかる変更はＳＣＩＤ／ベージュマウスでは見られ得なかった（相互作用：ｐ＝０．０４３７）。類似しているが統計学的に有意でない効果が、ＭＩＣＡ ｍＲＮＡ発現に対しても存在しているようであった。同様にストレス誘導性の内因性ヒトＨＳＰ７０−２ ｍＲＮＡの発現も同じように変化しなかったため、ＭＩＣＡ／Ｂ発現におけるこのような差が、種々の腫瘍における細胞のストレスのレベルの違いのためであった可能性は低い（図６Ｂ）。後者の実験では、ＭＩＣＡ／Ｂ分子は腫瘍細胞の細胞表面にてインビボで発現されることが、腫瘍由来の単独の細胞懸濁液を、抗ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＡｂまたは組換えヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄで染色することにより確認された（図６Ｃ）。
【００７１】
これらのデータにより、腫瘍でのＭＩＣＡ／Ｂ発現の機能的役割が示された。ＳＣＩＤマウスでは、ＭＩＣＡ／Ｂを発現する腫瘍細胞がＮＫ細胞の標的となると考えた。したがって、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ発現腫瘍細胞に対する選択が、ＳＣＩＤでは起こったがＮＫ細胞欠損ＳＣＩＤ／ベージュマウスでは起こらず、ＳＣＩＤマウスの腫瘍においてＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ ｍＲＮＡ発現のレベルの低下がもたらされたのかもしれない。ＨＳＰ７０が腫瘍に対してＮＫ細胞を活性化させるようであるため、この淘汰圧は、明らかに対照腫瘍よりもＨＳＰ７０過剰発現腫瘍にとって、より重要である。これらの知見を総合すると、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍細胞から放出されたＨＳＰ７０により、ＮＫ細胞が活性化されてＭＩＣＡ／Ｂ発現腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍増殖の低減と転移の抑制がもたらされ得ることが示された。
【００７２】
実施例７：ＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤは、インビトロでヒトＰＢＭＣを活性化し、ＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させる
次に、動物実験から推論された仮説を、マウス細胞の代わりにヒトエフェクター細胞を用いて試験した。したがって、一連のインビトロ実験を行なった。先の実験から、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来のＭＩＣＡ遺伝子を含むコスミドでトランスフェクトしたマウスＬ細胞が利用可能であった。このＬ−ＭＩＣＡ細胞は、細胞表面にＭＩＣＡを発現する（図５Ａ）。しかしながら、該細胞は、原形質膜においてＨＳＰ７０を発現しない（図５Ａ）。Ｌ−ＭＩＣＡ細胞は、ヒトＬＡＫ細胞によって死滅され得るが、非刺激ＰＢＭＣではほとんど死滅され得ない（図５Ｂ、５Ｃ）。同様の結果が、ＭＩＣＡ遺伝子を含むコスミドまたはＭＩＣＡ ｃＤＮＡ発現構築物でトランスフェクトしたさらなるクローンで得られた。これらの実験では、ベクターでトランスフェクトした対照細胞だけが親Ｌ細胞と異ならなかった。さらなる実験では、ＭＩＣＡ発現Ｌ細胞を、ＨＳＰ７０活性化型キラー細胞の標的として使用した。
【００７３】
ヒトＰＢＭＣを、低用量のＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で７日間培養し、並行培養物である組換えＨＳＰ７０分子、２μｇ／ｍｌのストレス誘導性ＨＳＰ７０または構成的発現ＨＳＣ７０のいずれかに添加した。ＩＬ−２処理ＰＢＭＣは、ＭＩＣＡ発現Ｌ細胞を溶解したが、対照Ｌ細胞はほとんど溶解しなかった（図７Ａ）。ＨＳＰ７０処理では、ＨＳＣ７０処理とは対照的に、さらなる刺激効果が提供され、ＩＬ−２処理ＰＢＭＣによるＬ−ＭＩＣＡ細胞の溶解のさらなる増大がもたらされた（図７Ａ）。したがって、ＨＳＰ７０は、ＰＢＭＣがＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させるようにさらに活性化することができたが、ＨＳＣ７０はできなかった。タンパク質ＨＳＰ７０およびＨＳＣ７０はともに、大腸菌内で組換えタンパク質として調製されたが、ＬＰＳが混入していることが予測され得る。したがって、さらに組換え「低内毒素」（＜５０ＥＵ／ｍｇ）ヒトＨＳＰ７０を使用すると、同様の効果が観察された。さらに、並行して、ＬＡＫ細胞刺激に対するＨＳＰ７０とＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）の効果を試験した。これらの試験において、ＨＳＰ７０処理により、ＬＡＫ細胞がＬ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させる能力が有意に増大した（ｐ＝０．０３７４）（図７Ｂ）。ＨＳＰ７０調製物のＬＰＳ混入を完全に回避するため、ＧＭＰ条件下で化学合成によって作製されるＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ）を使用した。ペプチドＴＫＤは、以前に、ＮＫ細胞を刺激してＨＳＰ７０細胞表面陽性標的細胞を溶解する能力において、完全長ＨＳＰ７０と同等であることが示された（２７）。ＩＬ−２およびＴＫＤ（２μｇ／ｍｌ）で７日間刺激したＰＢＭＣは、ＩＬ−２のみとともに培養した細胞よりも、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞を有意に良好に（ｐ＝０．００１２）溶解することがわかり、組換え完全長ＨＳＰ７０で得られたデータが確認された。
【００７４】
実施例８：ＮＫ細胞は、インビトロでＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤによって活性化されてＭＩＣＡ発現標的細胞を死滅させるエフェクター細胞である
上記に示したインビボデータに基づき、ＮＫ細胞は、ＩＬ−２＋ＨＳＰ７０またはＩＬ−２＋ＴＫＤによって活性化されるＰＢＭＣの中でも細胞傷害性エフェクター細胞であると考えた。しかしながら、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはγδＴ細胞などの他の細胞は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ受容体ＮＫＧ２Ｄを発現することができ、インビトロで観察された効果に寄与している可能性がある。この仮説を試験するため、インビトロ培養前に、ＭＡＣＳによってボランティアドナーの末梢血からＮＫ細胞を単離した（図８Ａ）。並行して、ＮＫ細胞枯渇細胞集団の細胞傷害活性を試験した。ＮＫ細胞富化画分は、Ｌ細胞よりもずっと良好にＬ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させ（図８Ｂ）、ＴＫＤ刺激により、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞に対するＮＫ細胞の活性が有意に改善され得た（ｐ＜００００１）（図８Ｃ）。ＩＬ−２またはＩＬ−２＋ＴＫＤによるＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣの刺激では、Ｌ−ＭＩＣＡ細胞を死滅させ得る細胞集団は得られなかった（図８Ｂ）。高いエフェクター：標的比（２００：１まで）でさえ、Ｌ−ＭＩＣＡならびにＬ細胞の溶解は、非常に低いままであった。したがって、ＮＫ細胞は、ＭＩＣＡ発現標的細胞に対してＴＫＤ効果を奏するのに必要な細胞傷害細胞であった。
【００７５】
実施例９：Ｇｅ黒色腫細胞上でのＭＩＣＡ／Ｂ発現およびＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ活性化により、相乗的に腫瘍細胞の高い死滅性がもたらされる
次に、インビボ実験に使用したＭＩＣＡ／Ｂ発現ヒトＧｅ黒色腫細胞が、ＨＳＰ７０活性化型ヒトＮＫ細胞の標的となり得るか否かを調べた。これらの細胞は、以前に、ＭＨＣクラスＩ分子を実際に発現することが示された（１５，１６）。しかしながら、活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２ＤのリガンドとしてのＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの発現により、ＮＫ細胞のＭＨＣクラスＩ媒介型阻害が克服され得ることが知られている（１８，３３）。ＭＩＣＡ／Ｂを、Ｇｅ−ｃｏｎ細胞ならびにＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞において、トリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などのヒストンデアセチラーゼ阻害因子（２４）によって誘導した（図９Ａ）。重要なことに、ＨＳＰ７０細胞表面発現は、この処理後では見られなかった。処理細胞は未処理細胞よりも、ＬＡＫ細胞による溶解に対して有意により感受性であった（図９Ｂ）。
【００７６】
単離ＮＫ細胞を、ＩＬ−２なし、ＩＬ−２とともに、またはＩＬ−２＋ＴＫＤとともに５日間培養した後、該細胞を、事前に標準条件下で培養したＧｅ−ｃｏｎ標的細胞、またはヒストンデアセチラーゼ阻害因子（１０μＭ ＳＡＨＡ）の存在下で２０時間培養したＧｅ−ｃｏｎ標的細胞のエフェクター細胞として使用した。図１０Ａに示されるように、ＩＬ−２は、Ｇｅ−ｃｏｎ黒色腫細胞を死滅させ得るＮＫ細胞を得るのに不可欠であった。ＮＫ細胞のＴＫＤ処理により、標的細胞を溶解する能力が増大した（ｐ＝０．００５５；このパラグラフの結果については、すべて三元配置ＡＮＯＶＡを使用し、エフェクター：標的比は２．５：１および１．２５：１）。Ｇｅ標的細胞のＳＡＨＡ処理により、ＮＫ細胞に対する感受性が増大した（ｐ＜００００１）。ＮＫ細胞のＴＫＤ処理と標的細胞のＳＡＨＡ処理を併用すると、これらの実験では、特に低エフェクター：標的比で、相乗的作用が生じ（相互作用のｐ値はｐ＝００００３）、標的細胞の死滅の増大がもたらされた（図１０Ｂ）。同様の結果が、完全長組換えＨＳＰ７０でのＮＫ細胞の刺激後、および標的細胞としてのＧｅ−Ｈｓｐ７０細胞で得られた。したがって、マウスのインビボ実験と一致して、ＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂは協働して、インビトロでヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞の死滅を増大させ得る。
【００７７】
実施例１０：ＮＫ細胞のＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤ刺激により、グランザイムＢの発現が増大する
ＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤの効果をさらに解析するため、新鮮な単離ＮＫ細胞上でのＮＫ細胞マーカーＣＤ５６、ＣＤ９４、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄの発現を調べた。ＩＬ−２またはＩＬ−２＋ＴＫＤの存在下で５日間の培養後（図１０Ｃ）、ＣＤ５６陽性細胞の割合は増大した。しかしながら、ＩＬ−２処理とＩＬ−２＋ＴＫＤ処理とで、差は観察されなかった。ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ９４の平均蛍光強度はともに、ＩＬ−２およびＴＫＤ処理後に増大したが、ＩＬ−２刺激単独と比べて、有意差は検出され得なかった。したがって、これらのマーカーでは、ＴＫＤとの培養中、ＮＫ細胞の表現型の大きな変化は観察されなかった。同様の結果が、完全長組換えＨＳＰ７０によるＮＫ細胞の刺激後で得られた。次いで、ＴＫＤ処理により、活性化ＮＫ細胞において細胞傷害性エフェクター分子の発現が増大されるかもしれないと推測した。実際、細胞内グランザイムＢのフローサイトメトリーによる解析で、ＩＬ−２刺激単独と比べ、ＩＬ−２＋ＴＫＤ刺激による発現増大の傾向が示された（図１０Ｄ）。したがって、観察されたＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０の効果は、少なくとも一部、細胞傷害性エフェクター分子の発現増大によって説明され得る。
【００７８】
考察
先天免疫および養子免疫の成分は、進化的にずっと古いストレス応答系に関与していた。このストレス応答は、有害な環境条件に曝露された細胞の生存を維持するように運命づけられている。正常に機能するためには、免疫系は、細胞保護のために開始されたストレス応答が進行中であっても、標的細胞を破壊できる必要がある。さらに、被ストレス細胞、例えばウイルス感染細胞または腫瘍細胞は、通常、ストレスのない細胞よりも、免疫系の細胞傷害性エフェクター細胞のより適切な標的となるようである。以前に、種々の有害な条件に対して細胞を効率的に保護することが公知のＨＳＰ７０は、インビトロで顆粒エキソサイトーシス経路において媒介されるＣＴＬの特異的細胞傷害性エフェクター機構に対して保護しないことが示されていた（１５，１６，２０）。したがって、細胞性免疫系の細胞傷害性エフェクター機構は、防御的ストレス応答を支配しているようである。この考えと一致して、ストレス応答系の一部のある成分が、免疫応答の開始を誘発する「危険シグナル」としての機能を果たすことが示された（１３，１４）。典型的な外因性危険シグナルは、病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ）であり、これは、先天免疫系の細胞上のＰＡＭＰ受容体によって認識される。内因性危険シグナルは、その生物体が危険に曝されることによって生成される。これは、細胞表面に出現され得、放出された状態となり得る。細胞ストレス応答の一部の要素、例えば、ストレス誘導性ＨＳＰ７０などは、実際に、先天免疫反応および養子免疫反応の両方を活性化することができ、これらに関連しているようであり（１０，１１）、内因性危険シグナルの基準を満たす。潜在的内因性危険シグナルのさらなる例は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドである。ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍に対するＮＫ細胞応答を誘発する活性化受容体として供されることが示されており（１８）、腫瘍でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現により、腫瘍拒絶が誘導されることが報告された（３２，３４，３５）。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢが挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ ｉｎ）。これらおよびさらなるＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞ストレス（１７）または遺伝子毒性ストレス（３６）に応答して上方調節され、免疫系に潜在的に危険な細胞の存在をシグナル伝達する（３７）ようである。
【００７９】
本発明に従って行なった実験は、２つのストレス誘導性内因性危険シグナルＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂによって、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性が相乗的に改善されることを示す。ＨＳＰ７０の存在下で培養したヒトＰＢＭＣは、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡを発現するようにトランスフェクトしたか、または内因性ＭＩＣＡ／Ｂを薬理学的手段によって誘導したかのいずれかである腫瘍細胞に対し、細胞傷害活性の増大を獲得した。後者の実験により、両方の処理の併用によって相乗効果が奏され、標的細胞の死滅の有意な増強がもたらされることが示された。細胞分離実験では、細胞傷害効果の奏功にＮＫ細胞が必要とされることが明白に示され、該効果はＨＳＰ７０によって刺激された。ＨＳＰ７０は、直接ＮＫ細胞に対して（３８）、または他の細胞に対してのいずれかで作用し得る。例えば、樹状細胞は、熱ショックタンパク質受容体を発現すること（１０，１１）およびＮＫ細胞とクロストークすること（３９）が公知である。
【００８０】
ＮＫ細胞に対するＨＳＰ７０の刺激効果は、刺激アッセイでの組換えＨＳＰ７０とＨＳＣ７０の直接比較によって示されるように、構成的発現ＨＳＣ７０とは対照的に、ストレス誘導性ＨＳＰ７０の特異的な性質のようである。この観察結果と一致して、ＨＳＰ７０に由来しＨＳＣ７０タンパク質中には存在しないペプチドＴＫＤ（２７）は、完全長ＨＳＰ７０タンパク質の代わりに使用することができた。
【００８１】
免疫系の細胞に対する組換えタンパク質の効果は、常に、ＬＰＳ混入によって引き起こされたものであることが疑われる。しかしながら、ＨＳＰ７０と同じ条件下で生成されたＨＳＣ７０は、ＮＫ細胞に対して同じ効果を有しなかった。さらに、市販の「低内毒素」ＨＳＰ７０は、依然としてＮＫ細胞を刺激することができた。さらにより重要なことには、ＧＭＰ条件下で化学合成によって作製したＨＳＰ７０ペプチドＴＫＤもまた、ＮＫ細胞を刺激し、ＬＰＳ効果のみが観察されたというのは排除された。
【００８２】
この点において、どのようにしてＨＳＰ７０またはペプチドＴＫＤがＮＫ細胞を活性化させるのかは、解明の余地がある。ＩＬ−２のみと比べ、ＩＬ−２＋ＴＫＤとのＮＫ細胞の培養中で、ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞集団の有意な増加は観察されなかった。また、ＮＫＧ２Ｄの発現レベルは、フローサイトメトリーによる解析でも、有意に増大しなかった。ＮＫＧ２Ｄは、主に、ＮＫ細胞顆粒媒介型細胞傷害性の受容体として供されることが示されている（１８）。一貫して、ＴＫＤに曝露されたＮＫ細胞では、細胞傷害性エフェクターであるプロテアーゼグランザイムＢの発現レベルが高い傾向がみとめられた。ＨＳＰ７０およびＴＫＤは、細胞傷害性エフェクター分子の発現を誘導することにより、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増大させている可能性がある。しかしながら、これが、ＨＳＰ７０によってＮＫ細胞の活性が増大され得る唯一または主要な機構であるのかどうかは明らかでない。
【００８３】
それでもなお、ＭＩＣＡ／Ｂ発現標的細胞に対するＨＳＰ７０によるＮＫ細胞の活性化は、腫瘍免疫監視機構に対し、インビボでも関連性があるようである。ＨＳＰ７０過剰発現Ｇｅ黒色腫細胞の増殖は、ＳＣＩＤマウスにおいて有意に低減された。さらに、これらの腫瘍は、対照腫瘍とは対照的に、浸潤的に増殖せず、局所転移は起こらなかった。このような効果は、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の腫瘍増殖および転移速度が、ＢおよびＴリンパ球に加えて機能性ＮＫ細胞も欠損したＳＣＩＤ／ベージュマウスにおける対照腫瘍とは異ならなかったため、明らかにＳＣＩＤマウスのＮＫ細胞に起因するものであり得る。
【００８４】
以前に、ＨＳＰ７０過剰発現Ｇｅ黒色腫細胞が、代償的にＨＳＣ７０発現を下方調節することが示された（１５）。したがって、これらの細胞では、ＨＳＣ７０発現は、基本的にＨＳＰ７０発現の方向にシフトされる（１５）。
【００８５】
本実験によると、ここに、ＨＳＰ７０含有エキソソームがＨＳＰ７０過剰発現黒色腫細胞から放出されることが示され得る。ＨＳＰ７０の放出量が増大すると、ＮＫ細胞は、ＨＳＣ７０ではなくＨＳＰ７０によって活性化されるようであるため、続いて、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍を有するマウスにおいて、ＮＫ細胞のより良好な活性化がもたらされ得る。腫瘍中に存在するＨＳＰ７０はすべて真核生物供給源のものであったことに注目することは重要である。したがって、ＬＰＳの効果が、動物モデルで見られた観察結果に関連性がある可能性は排除され得る。
【００８６】
Ｇｅ黒色腫細胞は、ＭＩＣＡとＭＩＣＢをインビボで発現するが、インビトロではほどんど発現しない。腫瘍におけるこの発現は、両方の遺伝子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの発現レベルがＳＣＩＤ／ベージュマウスと比べ、ＳＣＩＤで増殖させたＨＳＰ７０過剰発現腫瘍において低減されたため、ＳＣＩＤマウスにおいて機能的に関連性があるようである。このＭＩＣＡ／Ｂ発現の低減は、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒおよび共同作業者（４０）によって示された「癌の免疫編集（ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」の一例として解釈される。ＭＩＣＡ／Ｂ過剰発現腫瘍細胞は、ＳＣＩＤマウスに存在するＨＳＰ７０活性化ＮＫ細胞の優先的標的となり、その減少がもたらされる。このＮＫ細胞活性により、ＨＳＰ７０過剰発現腫瘍の大きさの縮小が説明される。ＭＩＣＡ／Ｂの発現の低減もまた、潜在的な免疫逸出（ｅｓｃａｐｅ）機構を示すが、原発腫瘍におけるＨＳＰ７０過剰発現およびその後のＮＫ細胞の活性化（これによりＭＩＣＡ／Ｂ過剰発現腫瘍細胞が死滅され得る）は、浸潤性の増殖および局所転移を完全に抑制するのに明らかに充分であった。
【００８７】
ＮＫＤ２ＤリガンドＭＩＣＡ／Ｂの発現が本モデルの腫瘍において内因的に調節され得たことは、重要であり得る。ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の過剰刺激、ならびに連続してＮＫＧ２Ｄの下方調節およびＮＫ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞の不活性をもたらすＭＩＣＡ／Ｂの強い異所性発現が報告された（４１〜４３）。
【００８８】
数多くの試験で、腫瘍由来熱ショックタンパク質、例えば、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４（ｇｐ９６、ＨＳＰ９６）およびＨＳＰ７０が免疫療法に使用された（１０）。ＣＴＬ応答の誘導に重点が置かれていたが、ＮＫ細胞枯渇によってｇｐ９６またはＨＳＰ７０での免疫処置の有効性が無効となり得ることもまた注目されている（４４）。さらに、パーフォリン依存性ＮＫ細胞活性は、ｇｐ９６を分泌するように操作された腫瘍細胞のＣＴＬ媒介型拒絶の誘導に必要とされることが報告された（４５）。また、ＮＫ細胞は、ＣＴＬ応答の誘導におけるＨＳＰ７０のアジュバント様活性に必要であると思われる（４６）。これらの報告と一致して、最近、自己腫瘍由来のＨＳＰ９６で処置した患者は、ＮＫ細胞活性の有意な刺激を受けることが観察された（４７）。したがって、腫瘍細胞の初期のＮＫ細胞媒介型溶解および／またはＮＫ放出サイトカインは、腫瘍特異的ＣＴＬの効率的なプライミングに必要である可能性がある。興味深いことに、以前に、ＨＳＰ７０（４８）およびＨＳＰ７０由来ペプチドＴＫＤ（２７）は、ＮＫ細胞を刺激して、ＨＳＰ７０を原形質膜に発現する腫瘍細胞を特異的に溶解し得ることが記載された（１２）。ＨＳＰ７０は、この場合、刺激分子として、およびＮＫ細胞の標的構造としての機能を果たしているが、原形質膜内でＨＳＰ７０がどのようにして発現されるのかは明らかでない。ＨＳＰ７０とＴＫＤによるＮＫ細胞の活性化を示す本結果は、このデータと整合する。しかしながら、ここで解析された腫瘍細胞は、インビトロでもインビボでも細胞表面でＨＳＰ７０を発現しなかった。その代わり、充分に定義された活性化ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである膜貫通タンパク質ＭＩＣＡ／Ｂは、ＨＳＰ７０／ＴＫＤ刺激ＮＫ細胞の標的構造として供され得ることが示されている。
【００８９】
ＴＫＤ活性化ＮＫ細胞の養子免疫伝達は、原形質膜にＨＳＰ７０を発現する腫瘍に対する新しい有望な免疫療法であり、これは、前臨床動物モデルにおいて（４９）、また第Ｉ期臨床試験において（５０）、好成績で評価されている。すべての腫瘍が細胞表面にＨＳＰ７０を発現するわけではないため、ＨＳＰ７０刺激ＮＫ細胞によってＮＫＧ２Ｄリガンドが標的構造として使用され得るという本発明の知見によって、この種の免疫療法の恩恵を得る患者の範囲が実質的に広がる。腫瘍細胞に対するＨＳＰ７０とＮＫＧ２Ｄリガンド発現の併用によって治療成績が改善されるか否かを評価しなければならない。ＨＳＰ７０を誘導するための高体温と、ＭＩＣＡ／Ｂを誘導するためのヒストンデアセチラーゼ阻害因子による薬物療法との併用（２４）もまた、腫瘍に対するＮＫ細胞活性を改善するための有望なストラテジーであり得る。重要なことに、ＮＫ細胞は、細胞傷害性エフェクター細胞としての機能を果たすだけでなく、その後のＣＴＬ応答の誘導に本質的に寄与しているようである（３９，４５，４６）。したがって、腫瘍細胞からのどのシグナルの組み合わせでＮＫ細胞の最良の活性化がもたらされるかを理解することは、さらにより必要である。２つの危険シグナルの存在下でＮＫ細胞活性が増強されたという本結果によって、癌免疫療法のストラテジーの改善が補助され得よう。さらに、腫瘍生物学におけるＨＳＰ７０とＭＩＣＡ／Ｂの種々の役割に対する洞察が提供される。
【００９０】
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８．Ｃｌａｒｋ ＰＲ，Ｍｅｎｏｒｅｔ Ａ．Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｈｓｐ７０ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ ２００１；６：１２１−５．
９．Ｍａｓｓａ Ｃ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ Ｃ，Ａｒｉｏｌｉ Ｉ，Ｐａｒｅｎｚａ Ｍ，Ｃｏｌｏｍｂｏ ＭＰ，Ｍｅｌａｎｉ Ｃ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ｈｓｐ７０．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：１５０２−８．
１０．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｐ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；２：１８５−９４．
１１．Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ ＣＶ．Ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；３：４２７−３２．
１２．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｂｏｔｚｌｅｒ Ｃ，Ｊｅｎｎｅｎ Ｌ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ，Ｅｌｌｗａｒｔ Ｊ，Ｉｓｓｅｌｓ Ｒ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７２ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１５８：４３４１−５０．
１３．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ Ｐ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｄａｎｇｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆａｍｉｌｙ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；１２：９９１−１０４５．
１４．Ｔｏｄｒｙｋ ＳＭ，Ｍｅｌｃｈｅｒ ＡＡ，Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ ＡＧ，Ｖｉｌｅ ＲＧ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｄａｎｇｅｒ ｔｈｅｏｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００；９９：３３４−７．
１５．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｇｒｚｅｓｚｉｋ Ｃ，Ｋｒｅｉｓｓ Ｍ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｌｙｓａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：８２１２−２０．
１６．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｌｕｅｂｂｅｒｓ Ｍ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｈｅｒｒ Ｗ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；２９：３９２５−３５．
１７．Ｇｒｏｈ Ｖ，Ｂａｈｒａｍ Ｓ，Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｈｅｒｍａｎ Ａ，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ Ｍ，Ｓｐｉｅｓ Ｔ．Ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１２４４５−５０．
１８．Ｈａｙａｋａｗａ Ｙ，Ｓｍｙｔｈ ＭＪ．ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１８：１７６−８５．
１９．Ａｌｖｅｓ Ｆ，Ｃｏｎｔａｇ Ｓ，Ｍｉｓｓｂａｃｈ Ｍら Ａｎ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ａｌｌ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｃａｄｅ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ２００１；２３：２２７−３５．
２０．Ｄｒｅｓｓｅｌ Ｒ，Ｅｌｓｎｅｒ Ｌ，Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｔ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＴＬ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６４：２３６２−７１．
２１．Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｒａｕｈ Ｆ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （Ｈｓｐ７０）ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９４；４０：３２５−３０．
２２．Ｍｉｌｎｅｒ ＣＭ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＲＤ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＭＨＣ−ｌｉｎｋｅｄ ＨＳＰ７０ ｇｅｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９０；３２：２４２−５１．
２３．Ｓｅｏ ＪＷ，Ｂｏｎｔｒｏｐ Ｒ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｌｉｎｋｅｄ ＭＩＣ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９；５０：３５８−６２．
２４．Ｓｋｏｖ Ｓ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＭＴ，Ａｎｄｒｅｓｅｎ Ｌ，Ｓｔｒａｔｅｎ ＰＴ，Ｗｏｅｔｍａｎｎ Ａ，Ｏｄｕｍ Ｎ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｃｏｍｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｕｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：１１１３６−４５．
２５．Ｓｅｏ ＪＷ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＩＣ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ２００１；５８：１５９−６５．
２６．Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ｇｅｈｒｍａｎｎ Ｍ，Ｂａｕｓｅｒｏ ＭＡら Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：５２３８−４７．
２７．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｐｆｉｓｔｅｒ Ｋ，Ｇｅｈｒｍａｎｎ Ｍら Ａ １４−ｍｅｒ Ｈｓｐ７０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ （ＮＫ）ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ ２００１；６：３３７−４４．
２８．Ｂｏｔｚｌｅｒ Ｃ，Ｌｉ Ｇ，Ｉｓｓｅｌｓ ＲＤ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ ＮＫ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎ １９９８；３：６−１１．
２９．Ｔｈｅｒｙ Ｃ，Ｒｅｇｎａｕｌｔ Ａ，Ｇａｒｉｎ Ｊら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｓｃ７３．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９；１４７：５９９−６１０．
３０．Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ Ａ，Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＭ，Ｌｉｕ ＳＤ，Ｓｈａｓｔｒｉ Ｎ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１：１１９−２６．
３１．Ｗｏｌａｎ ＤＷ，Ｔｅｙｔｏｎ Ｌ，Ｒｕｄｏｌｐｈ ＭＧら Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＮＫ ｃｅｌｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｔ １．９５Å．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；２：２４８−５４．
３２．Ｆｒｉｅｓｅ ＭＡ，Ｐｌａｔｔｅｎ Ｍ，Ｌｕｔｚ ＳＺら ＭＩＣＡ／ＮＫＧ２Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：８９９６−９００６．
３３．Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｇｒｏｈ Ｖ，Ｗｕ Ｊら Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：７２７−９．
３４．Ｃｅｒｗｅｎｋａ Ａ，Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ，ＭｃＣｌａｎａｈａｎ Ｔら Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００；１２：７２１−７．
３５．Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ Ａ，Ｊｅｎｓｅｎ ＥＲ，Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＭ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ Ｒａｅ１ ａｎｄ Ｈ６０ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１３：１６５−７１．
３６．Ｇａｓｓｅｒ Ｓ，Ｏｒｓｕｌｉｃ Ｓ，Ｂｒｏｗｎ ＥＪ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３６：１１８６−１９０．
３７．Ｇａｓｓｅｒ Ｓ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｒｏｕｓｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３９５９−６２．
３８．Ｇｒｏｓｓ Ｃ，Ｈａｎｓｃｈ Ｄ，Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ＮＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ９４．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；３８４：２６７−７９．
３９．Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ ＭＡ，Ｓｍｙｔｈ，ＭＪ．Ｃｌｏｓｅ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｔａｋｅ ｃｅｎｔｒｅ ｓｔａｇｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；５：１１２−２４．
４０．Ｄｕｎｎ ＧＰ，Ｏｌｄ ＬＪ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＲＤ．Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；２２：３２９−６０．
４１．Ｗｉｅｍａｎｎ Ｋ，Ｍｉｔｔｒｕｅｃｋｅｒ ＨＷ，Ｆｅｇｅｒ Ｕら Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＮＫＧ２Ｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｓ ＮＫ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７５：７２０−９．
４２．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ＤＥ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＳＪ，Ｃｌａｒｋｅ ＳＬら Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｓ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；６：９２８−３７．
４３．Ｃｏｕｄｅｒｔ ＪＤ，Ｚｉｍｍｅｒ Ｊ，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ Ｅら Ａｌｔｅｒｅｄ ＮＫＧ２Ｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６：１７１１−７．
４４．Ｔａｍｕｒａ Ｙ，Ｐｅｎｇ Ｐ，Ｌｉｕ Ｋ，Ｄａｏｕ Ｍ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＰＫ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７８：１１７−２０．
４５．Ｓｔｒｂｏ Ｎ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｓｏｔｏｓｅｋ−Ｔｏｋｍａｄｚｉｃ Ｖ，Ｐｏｄａｃｋ ＥＲ．Ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００３；１８：３８１−９０．
４６．Ｍａｓｓａ Ｃ，Ｍｅｌａｎｉ Ｃ，Ｃｏｌｏｍｂｏ ＭＰ．Ｃｈａｐｅｒｏｎ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｓｐ７０：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ ａｎｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：７９４２−９．
４７．Ｐｉｌｌａ Ｌ，Ｓｑｕａｒｃｉｎａ Ｐ，Ｃｏｐｐａ Ｊら Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｎｄ ＮＫ−Ｌｉｋｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：３９４２−９．
４８．Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ，Ｍｉｚｚｅｎ Ｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ＣＣら Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （Ｈｓｐ７０）ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９；２７：１６２７−３６．
４９．Ｓｔａｎｇｌ Ｓ，Ｗｏｒｔｍａｎｎ Ａ，Ｇｕｅｒｔｌｅｒ Ｕ，Ｍｕｌｔｈｏｆｆ Ｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ＩＬ−２／ＴＫＤ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１７６：６２７０−６．
５０．Ｋｒａｕｓｅ ＳＷ，Ｇａｓｔｐａｒ Ｒ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘ ｖｉｖｏ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：３６９９−７０７．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用であって、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与するものである、使用。
【請求項２】
前記疾患が腫瘍または感染性疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記リガンドがＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡまたはＢである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞が、患者への投与前に活性化されるか、またはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される、請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記活性化因子が、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドを含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、実質的にアミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）からなる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、インターロイキンとともに投与されるように設計される、請求項１〜６いずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記インターロイキンがインターロイキンＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬組成物が、細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子を含むか、または該誘導因子とともに投与されるように設計される、請求項１〜８いずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記誘導因子がヒストンデアセチラーゼ阻害因子である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害因子（ｉｎｈｉｂｔｏｒ）が、トリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
望ましくない細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１１いずれか１項に記載のリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または請求項９〜１１いずれか１項に記載の誘導因子の使用。
【請求項１３】
前記医薬組成物がさらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬組成物がさらに、免疫応答を増強する少なくとも１種類の化合物を含むか、またはかかる化合物とともに投与されるように設計される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記望ましくない細胞が腫瘍細胞または感染細胞である、請求項１２〜１４いずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、望ましくない細胞が請求項４〜１１いずれか１項に記載の活性化因子に曝露される前、曝露中または曝露後に投与されるように設計される、請求項１２〜１５いずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞（複数または１つ）が、細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を実質的に欠いていることを特徴とする、請求項１〜１６いずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記細胞（複数または１つ）が、細胞表面上でのＨＳＰ７０を発現するように誘導される、請求項１〜１６いずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
ＨＳＰ７０の発現が、高体温、化学療法、放射線療法またはその任意の組合せによって誘導される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１１いずれか１項に記載のリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または請求項９〜１１いずれか１項に記載の誘導因子を、請求項４〜１１いずれか１項に記載の活性化因子および／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む、併用調製物。
【請求項１】
対象における疾患の処置のための医薬組成物の調製のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞の活性化因子の使用であって、前記疾患は、細胞表面上のＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドを発現するか、または該リガンドを発現するように誘導された細胞が関与するものである、使用。
【請求項２】
前記疾患が腫瘍または感染性疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記リガンドがＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）ＡまたはＢである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞が、患者への投与前に活性化されるか、またはＮＫ細胞の活性化因子とともに投与されるように設計される、請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記活性化因子が、ＨＳＰ７０またはこれに由来するペプチドを含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、実質的にアミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号：５）からなる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、インターロイキンとともに投与されるように設計される、請求項１〜６いずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記インターロイキンがインターロイキンＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬組成物が、細胞表面上の前記リガンドの発現の誘導因子を含むか、または該誘導因子とともに投与されるように設計される、請求項１〜８いずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記誘導因子がヒストンデアセチラーゼ阻害因子である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害因子（ｉｎｈｉｂｔｏｒ）が、トリコスタチンＡまたはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
望ましくない細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解的攻撃を誘導および／または増強するための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１１いずれか１項に記載のリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または請求項９〜１１いずれか１項に記載の誘導因子の使用。
【請求項１３】
前記医薬組成物がさらに、前記望ましくない細胞の細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導または増強するための薬剤を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬組成物がさらに、免疫応答を増強する少なくとも１種類の化合物を含むか、またはかかる化合物とともに投与されるように設計される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記望ましくない細胞が腫瘍細胞または感染細胞である、請求項１２〜１４いずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、望ましくない細胞が請求項４〜１１いずれか１項に記載の活性化因子に曝露される前、曝露中または曝露後に投与されるように設計される、請求項１２〜１５いずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞（複数または１つ）が、細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を実質的に欠いていることを特徴とする、請求項１〜１６いずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記細胞（複数または１つ）が、細胞表面上でのＨＳＰ７０を発現するように誘導される、請求項１〜１６いずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
ＨＳＰ７０の発現が、高体温、化学療法、放射線療法またはその任意の組合せによって誘導される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１１いずれか１項に記載のリガンド、前記リガンドをコードする核酸分子、または請求項９〜１１いずれか１項に記載の誘導因子を、請求項４〜１１いずれか１項に記載の活性化因子および／または細胞表面上でのＨＳＰ７０の発現を誘導し得る薬剤との組み合わせで含む、併用調製物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５０９２５７（Ｐ２０１０−５０９２５７Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５６３７（Ｐ２００９−５３５６３７）
【出願日】平成１９年１１月１４日（２００７．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５８７２８
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０７９５８１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１４日（２００７．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５８７２８
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０７９５８１）
【Ｆターム（参考）】
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