全長抗体の製造方法並びに該方法の実施のためのＥ．コリ菌株
【課題】正しく折り畳まれかつ会合された全長抗体の製造を可能にし、かつ先行技術の欠点を伴わない方法を提供する。
【解決手段】ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【解決手段】ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を発酵培地中に放出する能力を有するエシェリキア・コリ菌株を使用して全長抗体を発酵的に製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質医薬品（バイオロジクス）に関する市場は、近年に大きく成長している。しかしながら、タンパク質ベースの医薬作用物質の製造コストが依然として非常に高いことに基づき、効率化されたことで廉価となったその製造のための方法及び系が絶え間なく探求されている。
【０００３】
特に重要なタンパク質のクラスは、抗体である。抗体は、研究、診断において、かつ療法剤としても広範囲で使用されるので、特に効率的でかつ工業的規模で可能な製造方法が必要である。
【０００４】
抗体では、全長抗体と抗体フラグメントで区別される。全長抗体は、４つのタンパク質鎖、つまり２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とからなる。種々の鎖は、ジスルフィド結合によって互いに結合されている。各重鎖は、可変領域（ＶH）と定常領域とから構成され、後者は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ドメインＣＨ２とＣＨ３とを含みかつＦｃ領域とも呼称される重鎖の領域は、抗原結合に関与せず、例えば補体系の活性化のような他の機能を有する。各軽鎖は、可変領域（ＶL）と定常領域とから構成され、後者はドメインＣLを含む。重鎖のアミノ酸配列に依存して、抗体（免疫グロブリン）は、５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類される。全長抗体という概念とは、軽鎖がそれぞれドメインＶL及びＣLを含み、かつ重鎖が実質的にドメインＶH−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３から構成されているあらゆる抗体であって、従って該抗体が特異抗原を結合できる特性の他に、他の機能（例えば補体系の活性化）を実行できる抗体を表す。
【０００５】
更に、抗体フラグメントは、単に全長抗体の一部から、通常は抗原結合部位を一緒に含む部分からなる。
【０００６】
その非常によく調査された遺伝学及び生理学と、短い発生時間と、容易な取り扱いに基づき、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリは、目下、組み換えタンパク質の製造のために最も頻繁に使用される生物である。前記生物は、同様に抗体フラグメントの製造のために使用される。
【０００７】
抗体フラグメントに対して、今まではＥ．コリにおいて全長抗体を製造する試みは非常に僅かであったに過ぎなかった。全長抗体のサイズと複雑な構造とに基づき、正しく折り畳まれかつ会合された抗体とすることは困難である。その際、Ｅ．コリにおける細胞質での製造は可能ではない。それというのもＥ．コリは細胞質中でジスルフィド結合を形成しないからである。ＷＯ０２／０６１０９０号は、全長抗体をＥ．コリにおいてペリプラズムで製造することを記載している。そのために、軽鎖と重鎖が互いに独立して異なるプロモーター−シストロン対で発現される特別に構成された発現ベクターが使用される。その際、両方の鎖は、それぞれシグナルペプチドに融合されており、通常のＳｅｃ経路を介してＥ．コリではペリプラズムに輸送され、そこでフォールディングとアセンブリングが行われる。抗体を得るためには、その際、細胞を分解することが必要である。収率は、最大で１５６ｍｇ／ｌであった。８８０ｍｇまでのより高い収率は、抗体鎖の他に、ｄｓｂタンパク質もしくはＦｋｐＡのようなペリプラズム性のフォールディング補助因子（シャペロン）をプラスミドで同時発現させた場合にのみ達成された。該抗体は、多くの他のＥ．コリのタンパク質から精製せねばならない。
【０００８】
前記方法は、抗体の工業的な製造のためには、Ｅ．コリ細胞を分解せねばならず、かつ標的タンパク質を多数の他のＥ．コリのタンパク質から精製せねばならないという欠点を有する。ペリプラズム性のシャペロンの随時の同時発現は、付加的なかなりの量の不所望なタンパク質によって前記の精製を、さらに困難にする。
【特許文献１】ＷＯ０２／０６１０９０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、正しく折り畳まれかつ会合された全長抗体の製造を可能にし、かつ先行技術の欠点を伴わない方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題は、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【００１１】
ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株とは、本発明の範囲では、発酵の後に、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも、より高濃度のペリプラズム性のタンパク質を栄養培地中で示すＥ．コリ菌株を表す。
【００１２】
特に、以下のＥ．コリ菌株が好ましい：
− ＢＬＲ：Ｎｏｖａｇｅｎ
− Ｋ８０２：ＣＧＳＣ*＃５６１０
− ＷＣＭ１００：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
− ＭＭ２８：ＣＧＳＣ*＃５８９２
− ＲＶ３０８：ＡＴＣＣ**＃３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
− ＲＲ１：ＡＴＣＣ**＃３１４３４
− ＥＰ４９７７５７号Ｂ１に従って製造されるＥ．コリ菌株
− Ｅ．コリ菌株の"漏出性（Ｌｅａｋｙ）"突然変異体
* 大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
** ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ在）から購入できる
概念"漏出性"突然変異体とは、細胞外膜もしくは細胞壁の構造要素における突然変異に基づき、ペリプラズム性のタンパク質の培地への放出が高まったＥ．コリ−突然変異体をまとめたものを表す（Ｓｈｏｋｒｉ他著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，６０，６５４−６６４）。好ましい代表は、以下の遺伝子：ｏｍｐ遺伝子、ｔｏｌ遺伝子、ｅｘｃＤ遺伝子、ｅｘｃＣ遺伝子、ｌｐｐ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｌｋｙ遺伝子に突然変異を有するＥ．コリ菌株である。
【００１３】
特に、以下のＥ．コリ菌株が好ましい：
− ＪＦ７３３＝ＣＧＳＣ*＃６０４７
− Ａ５９２＝ＣＧＳＣ*＃４９２３
− Ａ５９３＝ＣＧＳＣ*＃４９２４
− Ａ５８６＝ＣＧＳＣ*＃４９２５
− ＣＡＧ１２１８４＝ＣＧＳＣ*＃７４３７
− Ｇ１１ｅ１＝ＣＧＳＣ*＃５１６９
− ＪＥ５５１１＝ＣＧＳＣ*＃６６７３
− Ｅ６１０＝ＣＧＳＣ*＃６６６９
− Ｅ６２３＝ＣＧＳＣ*＃６６７１
− ＪＥ５５０５＝ＣＧＳＣ*＃６６７２
− ＰＭ６１＝ＣＧＳＣ*＃６６２８
− ＰＭ６１Ｒ＝ＣＧＳＣ*＃６６２９
− ＪＰ１２２８＝ＣＧＳＣ*＃６７０３
− ２０７＝ＣＧＳＣ*＃６６８６
− ＡＥ８４０６４＝ＣＧＳＣ*＃６５７５
ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株を、全長抗体の製造のために使用できることは、以下の理由からまったく驚くべきことである。Ｅ．コリのペリプラズムへの組み換えタンパク質の分泌は、通常は、宿主細胞のＳｅｃ装置によって行われる。その際、所望のタンパク質の遺伝子を、通常Ｅ．コリからＳｅｃ装置を利用して排出されるようなタンパク質のシグナル配列と機能的に結合させる。ペリプラズム中への分泌が行われた後に、シグナルペプチダーゼ（例えばＥ．コリの場合にはＬｅｐＢ）によってそれぞれのシグナルペプチドが開裂される。タンパク質は、このように折り畳まれていない状態で細胞質膜を通じて輸送される。ペリプラズムにおいて、これらのタンパク質は、その際、ペリプラズム性のシャペロン、例えばジスルフィド−イソメラーゼ（Ｄｓｂ−タンパク質）又はペプチジルプロリル−シス，トランス−イソメラーゼ（例えばＦｋｐＡ）によって、正しい二次構造、三次構造及び四次構造に折り畳まれて会合される。この過程は、全長抗体の製造においては特に費用のかかるものである。それというのも係るタンパク質では、個々のタンパク質鎖が、Ｓｅｃ系によってまず、ｉ）互いに独立してペリプラズム中に輸送され、ｉｉ）そこで正しく折り畳まれねばならず、ｉｉｉ）ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成され、ｉｖ）２つの軽鎖が２つの重鎖と正しい形で会合され、かつｖ）ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成されねばならないからである。従って、当業者は、今までは、該タンパク質を培地中に遊離させることは、係る複雑なフォールディング過程と会合過程で阻まれ、従って正しく折り畳まれた抗体をより高い収率で発酵培地中に放出させることは不可能であるということから出発している。全長抗体をペリプラズムで製造する場合でさえ高い収率の正しく折り畳まれた抗体は、付加的にペリプラズム性のシャペロンを同時発現させた場合にのみ得られると教示しているのだからなおさらである（ＷＯ０２／０６１０９０号）。
【００１４】
ここで驚くべきことに、本発明による方法によって全長抗体を製造する場合に、細胞外の、正しく折り畳まれた、会合された、機能的な抗体が、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることなく１６０ｍｇ／ｌより高い収率で得られることが判明した。しかしながら、その収率は、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることによって更に高めることもできる。好ましい全長抗体は、ＩｇＧクラス及びＩｇＭクラスの抗体、特に有利にはＩｇＧクラスの抗体である。
【００１５】
細胞質からペリプラズムへの抗体の軽鎖と重鎖の分泌のためには、生産されるべき鎖のそれぞれの遺伝子の５′末端が、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′末端と読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）結合されていることが必要である。そのために、原則的には、Ｅ．コリにおいて標的タンパク質の移行をｓｅｃ装置によって可能とするあらゆるシグナル配列の遺伝子が適している。以下の種々のシグナル配列は、先行技術において記載されており、例えば以下の遺伝子：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ＳｔＩＩなどのシグナル配列である（ＣｈｏｉとＬｅｅ（２００４年））。有利には、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子及びｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列が好ましく、特に配列番号１の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列が好ましい。その際、軽鎖と重鎖の遺伝子は、異なるシグナル配列と５′末端で結合されているなどであってよく、好ましくは異なるシグナル配列と結合されていることが好ましく、特に、一方の鎖がＥ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と結合されており、かつもう一方の鎖がクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来の配列番号１の配列を有するシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列と結合されていることが好ましい。
【００１６】
シグナル配列と組み換え抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子とからなる融合物を含むＤＮＡ分子の製造は、当業者に公知の方法に従って行われる。ここで、組み換えられた重鎖の抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子及び軽鎖の抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子を、まずＰＣＲによってプライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ、それを引き続き通常の分子生物学的技術によって、それぞれシグナルペプチドの配列を含みかつ抗体ペプチド鎖の遺伝子と同様に作製されたＤＮＡ分子と、読み枠内融合において、すなわちシグナル配列とそれぞれのペプチド鎖の配列を含む通しの読み枠が生ずるように結合させることができる。前記のシグナル配列−ペプチド鎖遺伝子融合物を、次いで、ベクター、例えばプラスミド中に導入することもでき、又は直接的に公知の方法に従って宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。その際、重鎖を含む融合遺伝子と、軽鎖を含む融合遺伝子とを、２つの別個の、しかしながら互いに和合性のプラスミドにクローニングするか、又はそれらを１つのプラスミドにクローニングしてもよい。両方の遺伝子融合物をプラスミドに導入する場合には、それらを、１つのオペロンにまとめることができ、又はそれらを、それぞれ別個のシストロンで発現させることもできる。ここでは１つのオペロンにまとめることが好ましく、特に転写開始部位の隣接位に、その都度の抗体の重鎖を有する融合遺伝子を有し、かつ遠位に、その都度の抗体の軽鎖を有する融合遺伝子を有する１つのオペロンにまとめることが好ましい。まさに、両方の遺伝子構築物を、１つのオペロンにまとめることができ、又はそれぞれ別個のシストロンで、宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。ここでも１つのオペロンにまとめることが好ましく、特に転写開始部位の隣接位に、その都度の抗体の重鎖を有する融合遺伝子を有し、かつ遠位に、その都度の抗体の軽鎖を有する融合遺伝子を有する１つのオペロンにまとめることが好ましい。
【００１７】
有利には、シグナル配列と、抗体ペプチド鎖遺伝子とからなるＤＮＡ発現構築物は、Ｅ．コリ中で機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位、ターミネーター）を備えている。
【００１８】
プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば一方では誘導可能なプロモーター、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方では、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーターを使用することによって持続的な発現を行うこともできる。両方の発現構築物を異なるプラスミド上でもしくは１つのプラスミド上で異なるシストロンにおいて発現させる場合に、そのためには同じプロモーター又はそれぞれ異なるプロモーターを使用することができる。異なるプロモーターが好ましい。
【００１９】
産生されるべき全長抗体のための発現構築物（プロモーター−シグナル配列−組み換え遺伝子）を、次いで当業者に公知の方法を使用して、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株の細胞中に導入する。
【００２０】
それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えば公知の発現ベクターの誘導体、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴ上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。特に好ましい抗生物質は、テトラサイクリン及びカナマイシンである。２つの和合性のプラスミドを使用する場合に、通常は、異なる選択マーカーが使用される。
【００２１】
従って本発明は、また、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株に関する。
【００２２】
本発明によるＥ．コリ菌株においては、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子は、有利には更にＥ．コリにおいて機能的な発現シグナル、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターを備えている。それは、有利には既に上述した発現シグナルである。
【００２３】
発現プラスミドで形質転換された細胞の培養は、当業者に自体公知の通常の発酵法に従ってバイオリアクター（発酵器）中で実施される。
【００２４】
発酵は、有利には、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、気泡塔型発酵器又はエアリフト型発酵器中で行われる。特に撹拌槽型発酵器が好ましい。その際、タンパク質産生菌株の細胞を、液体培地中で１６〜１５０時間の期間にわたり培養し、その際、種々のパラメータ、例えば栄養物質の供給、酸素分圧、ｐＨ値及び培養の温度が絶えず調節され、かつ厳密に制御される。培養の時間は、有利には２４〜７２時間である。
【００２５】
発酵培地としては、当業者に公知の、微生物の培養のためのあらゆる通常の培地が該当する。複合培地もしくは完全培地、又は完全培地に対して正確に定義された基質組成を有する最少塩培地、又は規定割合の複合成分、例えばペプトン、トリプトン、酵母エキス、蜜ろう又はコーンスティープリカーが添加された最少塩培地のいずれかを使用することができる。
【００２６】
最も重要な炭素源としては、原則的に、細胞によって利用可能なあらゆる糖、糖アルコール又は有機酸もしくはそれらの塩を使用することができる。その際、グルコース、ラクトース又はグリセリンを使用することが好ましい。特に、グルコース及びラクトースが好ましい。また複数の種々異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。炭素源は、培地中に、例えば１０〜３０ｇ／ｌの濃度で仕込まれ、次いで必要に応じてその培養に外部から追加供給される。
【００２７】
培養中の酸素分圧（ｐＯ2）は、有利には１０〜７０％飽和である。有利には、ｐＯ2は、３０〜６０％飽和であり、特に有利にはｐＯ2は、４５〜５５％飽和である。
【００２８】
培養のｐＨ値は、有利にはｐＨ６〜ｐＨ８である。有利には、ｐＨ値は、６．５〜７．５で調整され、特に有利には培養のｐＨ値は、６．８〜７．２に保持される。
【００２９】
培養の温度は、有利には１５〜４５℃である。２０〜４０℃の温度範囲が好ましく、特に２５〜３５℃の温度範囲が好ましく、殊に３０℃が好ましい。
【００３０】
特に好ましい一実施態様では、発酵の過程における温度を一定に保たず、例えば、考えられる"封入体"の形成を回避するために遺伝子発現の誘導前に温度を低下させる。こうした場合には、３０℃から２５℃への低下が好ましい。特に３０℃から２０℃への低下が好ましい。
【００３１】
分泌された全長抗体の精製は、公知の精製法によって行うことができる。通常は、第一段階において、遠心分離又は濾過のような分離法によって、細胞と分泌された抗体とを分離する。抗体を、例えば限外濾過によって濃縮し、次に沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過のような標準的方法によって更に精製することができる。特に、その場合に、既に正しく折り畳まれた抗体の本来のコンフォメーションを利用する親和性クロマトグラフィーのような方法が好ましい。
【００３２】
次の実施例は、本発明を更に説明するために用いられるものである。
【００３３】
使用される全ての分子生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによるＤＮＡの改変、形質転換などは、当業者に公知のように、文献に記載されるように、又はその都度製造元に推奨されるようにして実施した。
【実施例】
【００３４】
実施例：Ｅ．コリ分泌突然変異体を用いた１０ｌ規模での全長抗体の発酵的製造
本実施例は、抗組織因子（αＴＦ）ＩｇＧ１−抗体の製造を記載している。
【００３５】
抗αＴＦ抗体の遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ（図１）を用いた。該プラスミドは、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８５９６として寄託されている。ｐＪＦ１１８ｕｔは、公知の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するＬａｃＩｑ遺伝子産物によって再始動されかつ例えばＤ−ラクトースもしくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるｔａｃプロモーターをも有する。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗αＴＦ抗体の重鎖もしくは軽鎖についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号２を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、抗αＴＦ抗体の重鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図２）と呼称した。
【００３６】
配列番号３を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列と、抗αＴＦ抗体の軽鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図３）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【００３７】
抗αＴＦ抗体の製造のために、それらの菌株を、それぞれプラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦで、ＣａＣｌ2法によって形質転換させた。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【００３８】
製造は、１０ｌの撹拌槽型発酵器中で実施した。６ｌの培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）で満たされた発酵器に、１：１０の比率で、同じ培地中で一晩培養された前培養を植えた。発酵の間に、３０℃の温度に調整し、そしてｐＨ値をＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4を計量供給することによって７．０の値に一定に保った。グルコースは、発酵にわたって計量供給され、その際、培地中の最大グルコース濃度を１０ｇ／ｌ未満にすることに努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭで添加することによって実施した。
【００３９】
７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を培養培地の遠心分離によって分離した。
【００４０】
培養培地中に分泌された抗αＴＦ抗体の定量化を、ＥＬＩＳＡ試験での活性測定によって、抗原（コーティング）として可溶性の組織因子を用い、かつ二次抗体としてペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）2−フラグメントを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３−４７）に記載されるようにして実施した。
【００４１】
第１表において、前記のように測定された、機能的な抗αＴＦ抗体の収率を列記する。
【００４２】
第１表：７２時間の発酵後の培養上清中での抗αＴＦ抗体の収率
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、実施例からのクローニングベクターｐＪＦ１１８ｕｔを示している。
【図２】図２は、実施例からのプラスミドｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【図３】図３は、実施例からの抗ＴＦ抗体発現プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【符号の説明】
【００４４】
ｔａｃ ｐ／ｏ ｔａｃ−プロモーター／オペレーター、 ｒｒｎＢ ターミネーター、 ｂｌａ β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、 ＣｏｌＥ１ 複製の起点、 ＴｃＲ テトラサイクリン耐性、 ｌａｃＩｑ ｔａｃプロモーターのリプレッサー、 ＳＤ シャイン−ダルガノ配列、 ｏｍｐＡ−ＳＰ ｏｍｐＡ−シグナルペプチド、 ＨＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ） 抗ＴＦ抗体の重鎖の読み枠、 ｃｇｔ−ＳＰ ＣＧＴアーゼのシグナルペプチド、 ＬＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ） 抗ＴＦ抗体の軽鎖の読み枠
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を発酵培地中に放出する能力を有するエシェリキア・コリ菌株を使用して全長抗体を発酵的に製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質医薬品（バイオロジクス）に関する市場は、近年に大きく成長している。しかしながら、タンパク質ベースの医薬作用物質の製造コストが依然として非常に高いことに基づき、効率化されたことで廉価となったその製造のための方法及び系が絶え間なく探求されている。
【０００３】
特に重要なタンパク質のクラスは、抗体である。抗体は、研究、診断において、かつ療法剤としても広範囲で使用されるので、特に効率的でかつ工業的規模で可能な製造方法が必要である。
【０００４】
抗体では、全長抗体と抗体フラグメントで区別される。全長抗体は、４つのタンパク質鎖、つまり２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とからなる。種々の鎖は、ジスルフィド結合によって互いに結合されている。各重鎖は、可変領域（ＶH）と定常領域とから構成され、後者は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ドメインＣＨ２とＣＨ３とを含みかつＦｃ領域とも呼称される重鎖の領域は、抗原結合に関与せず、例えば補体系の活性化のような他の機能を有する。各軽鎖は、可変領域（ＶL）と定常領域とから構成され、後者はドメインＣLを含む。重鎖のアミノ酸配列に依存して、抗体（免疫グロブリン）は、５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類される。全長抗体という概念とは、軽鎖がそれぞれドメインＶL及びＣLを含み、かつ重鎖が実質的にドメインＶH−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３から構成されているあらゆる抗体であって、従って該抗体が特異抗原を結合できる特性の他に、他の機能（例えば補体系の活性化）を実行できる抗体を表す。
【０００５】
更に、抗体フラグメントは、単に全長抗体の一部から、通常は抗原結合部位を一緒に含む部分からなる。
【０００６】
その非常によく調査された遺伝学及び生理学と、短い発生時間と、容易な取り扱いに基づき、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリは、目下、組み換えタンパク質の製造のために最も頻繁に使用される生物である。前記生物は、同様に抗体フラグメントの製造のために使用される。
【０００７】
抗体フラグメントに対して、今まではＥ．コリにおいて全長抗体を製造する試みは非常に僅かであったに過ぎなかった。全長抗体のサイズと複雑な構造とに基づき、正しく折り畳まれかつ会合された抗体とすることは困難である。その際、Ｅ．コリにおける細胞質での製造は可能ではない。それというのもＥ．コリは細胞質中でジスルフィド結合を形成しないからである。ＷＯ０２／０６１０９０号は、全長抗体をＥ．コリにおいてペリプラズムで製造することを記載している。そのために、軽鎖と重鎖が互いに独立して異なるプロモーター−シストロン対で発現される特別に構成された発現ベクターが使用される。その際、両方の鎖は、それぞれシグナルペプチドに融合されており、通常のＳｅｃ経路を介してＥ．コリではペリプラズムに輸送され、そこでフォールディングとアセンブリングが行われる。抗体を得るためには、その際、細胞を分解することが必要である。収率は、最大で１５６ｍｇ／ｌであった。８８０ｍｇまでのより高い収率は、抗体鎖の他に、ｄｓｂタンパク質もしくはＦｋｐＡのようなペリプラズム性のフォールディング補助因子（シャペロン）をプラスミドで同時発現させた場合にのみ達成された。該抗体は、多くの他のＥ．コリのタンパク質から精製せねばならない。
【０００８】
前記方法は、抗体の工業的な製造のためには、Ｅ．コリ細胞を分解せねばならず、かつ標的タンパク質を多数の他のＥ．コリのタンパク質から精製せねばならないという欠点を有する。ペリプラズム性のシャペロンの随時の同時発現は、付加的なかなりの量の不所望なタンパク質によって前記の精製を、さらに困難にする。
【特許文献１】ＷＯ０２／０６１０９０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、正しく折り畳まれかつ会合された全長抗体の製造を可能にし、かつ先行技術の欠点を伴わない方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題は、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【００１１】
ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株とは、本発明の範囲では、発酵の後に、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）よりも、より高濃度のペリプラズム性のタンパク質を栄養培地中で示すＥ．コリ菌株を表す。
【００１２】
特に、以下のＥ．コリ菌株が好ましい：
− ＢＬＲ：Ｎｏｖａｇｅｎ
− Ｋ８０２：ＣＧＳＣ*＃５６１０
− ＷＣＭ１００：ＥＰ０３３８４１０号Ｂ１に従って製造できる
− ＭＭ２８：ＣＧＳＣ*＃５８９２
− ＲＶ３０８：ＡＴＣＣ**＃３１６０８；ＥＰ０６７７１０９号Ｂ１
− ＲＲ１：ＡＴＣＣ**＃３１４３４
− ＥＰ４９７７５７号Ｂ１に従って製造されるＥ．コリ菌株
− Ｅ．コリ菌株の"漏出性（Ｌｅａｋｙ）"突然変異体
* 大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）ＣＧＳＣ（８３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，ＭＣＤ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から購入できる
** ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃａｔｏｒｓｔｒ．５１，４６４８５ Ｗｅｓｅｌ，ドイツ在）から購入できる
概念"漏出性"突然変異体とは、細胞外膜もしくは細胞壁の構造要素における突然変異に基づき、ペリプラズム性のタンパク質の培地への放出が高まったＥ．コリ−突然変異体をまとめたものを表す（Ｓｈｏｋｒｉ他著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，６０，６５４−６６４）。好ましい代表は、以下の遺伝子：ｏｍｐ遺伝子、ｔｏｌ遺伝子、ｅｘｃＤ遺伝子、ｅｘｃＣ遺伝子、ｌｐｐ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｌｋｙ遺伝子に突然変異を有するＥ．コリ菌株である。
【００１３】
特に、以下のＥ．コリ菌株が好ましい：
− ＪＦ７３３＝ＣＧＳＣ*＃６０４７
− Ａ５９２＝ＣＧＳＣ*＃４９２３
− Ａ５９３＝ＣＧＳＣ*＃４９２４
− Ａ５８６＝ＣＧＳＣ*＃４９２５
− ＣＡＧ１２１８４＝ＣＧＳＣ*＃７４３７
− Ｇ１１ｅ１＝ＣＧＳＣ*＃５１６９
− ＪＥ５５１１＝ＣＧＳＣ*＃６６７３
− Ｅ６１０＝ＣＧＳＣ*＃６６６９
− Ｅ６２３＝ＣＧＳＣ*＃６６７１
− ＪＥ５５０５＝ＣＧＳＣ*＃６６７２
− ＰＭ６１＝ＣＧＳＣ*＃６６２８
− ＰＭ６１Ｒ＝ＣＧＳＣ*＃６６２９
− ＪＰ１２２８＝ＣＧＳＣ*＃６７０３
− ２０７＝ＣＧＳＣ*＃６６８６
− ＡＥ８４０６４＝ＣＧＳＣ*＃６５７５
ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株を、全長抗体の製造のために使用できることは、以下の理由からまったく驚くべきことである。Ｅ．コリのペリプラズムへの組み換えタンパク質の分泌は、通常は、宿主細胞のＳｅｃ装置によって行われる。その際、所望のタンパク質の遺伝子を、通常Ｅ．コリからＳｅｃ装置を利用して排出されるようなタンパク質のシグナル配列と機能的に結合させる。ペリプラズム中への分泌が行われた後に、シグナルペプチダーゼ（例えばＥ．コリの場合にはＬｅｐＢ）によってそれぞれのシグナルペプチドが開裂される。タンパク質は、このように折り畳まれていない状態で細胞質膜を通じて輸送される。ペリプラズムにおいて、これらのタンパク質は、その際、ペリプラズム性のシャペロン、例えばジスルフィド−イソメラーゼ（Ｄｓｂ−タンパク質）又はペプチジルプロリル−シス，トランス−イソメラーゼ（例えばＦｋｐＡ）によって、正しい二次構造、三次構造及び四次構造に折り畳まれて会合される。この過程は、全長抗体の製造においては特に費用のかかるものである。それというのも係るタンパク質では、個々のタンパク質鎖が、Ｓｅｃ系によってまず、ｉ）互いに独立してペリプラズム中に輸送され、ｉｉ）そこで正しく折り畳まれねばならず、ｉｉｉ）ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成され、ｉｖ）２つの軽鎖が２つの重鎖と正しい形で会合され、かつｖ）ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成されねばならないからである。従って、当業者は、今までは、該タンパク質を培地中に遊離させることは、係る複雑なフォールディング過程と会合過程で阻まれ、従って正しく折り畳まれた抗体をより高い収率で発酵培地中に放出させることは不可能であるということから出発している。全長抗体をペリプラズムで製造する場合でさえ高い収率の正しく折り畳まれた抗体は、付加的にペリプラズム性のシャペロンを同時発現させた場合にのみ得られると教示しているのだからなおさらである（ＷＯ０２／０６１０９０号）。
【００１４】
ここで驚くべきことに、本発明による方法によって全長抗体を製造する場合に、細胞外の、正しく折り畳まれた、会合された、機能的な抗体が、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることなく１６０ｍｇ／ｌより高い収率で得られることが判明した。しかしながら、その収率は、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることによって更に高めることもできる。好ましい全長抗体は、ＩｇＧクラス及びＩｇＭクラスの抗体、特に有利にはＩｇＧクラスの抗体である。
【００１５】
細胞質からペリプラズムへの抗体の軽鎖と重鎖の分泌のためには、生産されるべき鎖のそれぞれの遺伝子の５′末端が、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′末端と読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）結合されていることが必要である。そのために、原則的には、Ｅ．コリにおいて標的タンパク質の移行をｓｅｃ装置によって可能とするあらゆるシグナル配列の遺伝子が適している。以下の種々のシグナル配列は、先行技術において記載されており、例えば以下の遺伝子：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、スタフィロコッカスのプロテインＡ、ＳｔＩＩなどのシグナル配列である（ＣｈｏｉとＬｅｅ（２００４年））。有利には、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子及びｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列が好ましく、特に配列番号１の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列が好ましい。その際、軽鎖と重鎖の遺伝子は、異なるシグナル配列と５′末端で結合されているなどであってよく、好ましくは異なるシグナル配列と結合されていることが好ましく、特に、一方の鎖がＥ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と結合されており、かつもう一方の鎖がクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来の配列番号１の配列を有するシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列と結合されていることが好ましい。
【００１６】
シグナル配列と組み換え抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子とからなる融合物を含むＤＮＡ分子の製造は、当業者に公知の方法に従って行われる。ここで、組み換えられた重鎖の抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子及び軽鎖の抗体ペプチド鎖のそれぞれの遺伝子を、まずＰＣＲによってプライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ、それを引き続き通常の分子生物学的技術によって、それぞれシグナルペプチドの配列を含みかつ抗体ペプチド鎖の遺伝子と同様に作製されたＤＮＡ分子と、読み枠内融合において、すなわちシグナル配列とそれぞれのペプチド鎖の配列を含む通しの読み枠が生ずるように結合させることができる。前記のシグナル配列−ペプチド鎖遺伝子融合物を、次いで、ベクター、例えばプラスミド中に導入することもでき、又は直接的に公知の方法に従って宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。その際、重鎖を含む融合遺伝子と、軽鎖を含む融合遺伝子とを、２つの別個の、しかしながら互いに和合性のプラスミドにクローニングするか、又はそれらを１つのプラスミドにクローニングしてもよい。両方の遺伝子融合物をプラスミドに導入する場合には、それらを、１つのオペロンにまとめることができ、又はそれらを、それぞれ別個のシストロンで発現させることもできる。ここでは１つのオペロンにまとめることが好ましく、特に転写開始部位の隣接位に、その都度の抗体の重鎖を有する融合遺伝子を有し、かつ遠位に、その都度の抗体の軽鎖を有する融合遺伝子を有する１つのオペロンにまとめることが好ましい。まさに、両方の遺伝子構築物を、１つのオペロンにまとめることができ、又はそれぞれ別個のシストロンで、宿主細胞の染色体中に組み込むこともできる。ここでも１つのオペロンにまとめることが好ましく、特に転写開始部位の隣接位に、その都度の抗体の重鎖を有する融合遺伝子を有し、かつ遠位に、その都度の抗体の軽鎖を有する融合遺伝子を有する１つのオペロンにまとめることが好ましい。
【００１７】
有利には、シグナル配列と、抗体ペプチド鎖遺伝子とからなるＤＮＡ発現構築物は、Ｅ．コリ中で機能的な発現シグナル（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位、ターミネーター）を備えている。
【００１８】
プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば一方では誘導可能なプロモーター、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方では、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーターを使用することによって持続的な発現を行うこともできる。両方の発現構築物を異なるプラスミド上でもしくは１つのプラスミド上で異なるシストロンにおいて発現させる場合に、そのためには同じプロモーター又はそれぞれ異なるプロモーターを使用することができる。異なるプロモーターが好ましい。
【００１９】
産生されるべき全長抗体のための発現構築物（プロモーター−シグナル配列−組み換え遺伝子）を、次いで当業者に公知の方法を使用して、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株の細胞中に導入する。
【００２０】
それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えば公知の発現ベクターの誘導体、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴ上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。特に好ましい抗生物質は、テトラサイクリン及びカナマイシンである。２つの和合性のプラスミドを使用する場合に、通常は、異なる選択マーカーが使用される。
【００２１】
従って本発明は、また、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株に関する。
【００２２】
本発明によるＥ．コリ菌株においては、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子は、有利には更にＥ．コリにおいて機能的な発現シグナル、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターを備えている。それは、有利には既に上述した発現シグナルである。
【００２３】
発現プラスミドで形質転換された細胞の培養は、当業者に自体公知の通常の発酵法に従ってバイオリアクター（発酵器）中で実施される。
【００２４】
発酵は、有利には、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、気泡塔型発酵器又はエアリフト型発酵器中で行われる。特に撹拌槽型発酵器が好ましい。その際、タンパク質産生菌株の細胞を、液体培地中で１６〜１５０時間の期間にわたり培養し、その際、種々のパラメータ、例えば栄養物質の供給、酸素分圧、ｐＨ値及び培養の温度が絶えず調節され、かつ厳密に制御される。培養の時間は、有利には２４〜７２時間である。
【００２５】
発酵培地としては、当業者に公知の、微生物の培養のためのあらゆる通常の培地が該当する。複合培地もしくは完全培地、又は完全培地に対して正確に定義された基質組成を有する最少塩培地、又は規定割合の複合成分、例えばペプトン、トリプトン、酵母エキス、蜜ろう又はコーンスティープリカーが添加された最少塩培地のいずれかを使用することができる。
【００２６】
最も重要な炭素源としては、原則的に、細胞によって利用可能なあらゆる糖、糖アルコール又は有機酸もしくはそれらの塩を使用することができる。その際、グルコース、ラクトース又はグリセリンを使用することが好ましい。特に、グルコース及びラクトースが好ましい。また複数の種々異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。炭素源は、培地中に、例えば１０〜３０ｇ／ｌの濃度で仕込まれ、次いで必要に応じてその培養に外部から追加供給される。
【００２７】
培養中の酸素分圧（ｐＯ2）は、有利には１０〜７０％飽和である。有利には、ｐＯ2は、３０〜６０％飽和であり、特に有利にはｐＯ2は、４５〜５５％飽和である。
【００２８】
培養のｐＨ値は、有利にはｐＨ６〜ｐＨ８である。有利には、ｐＨ値は、６．５〜７．５で調整され、特に有利には培養のｐＨ値は、６．８〜７．２に保持される。
【００２９】
培養の温度は、有利には１５〜４５℃である。２０〜４０℃の温度範囲が好ましく、特に２５〜３５℃の温度範囲が好ましく、殊に３０℃が好ましい。
【００３０】
特に好ましい一実施態様では、発酵の過程における温度を一定に保たず、例えば、考えられる"封入体"の形成を回避するために遺伝子発現の誘導前に温度を低下させる。こうした場合には、３０℃から２５℃への低下が好ましい。特に３０℃から２０℃への低下が好ましい。
【００３１】
分泌された全長抗体の精製は、公知の精製法によって行うことができる。通常は、第一段階において、遠心分離又は濾過のような分離法によって、細胞と分泌された抗体とを分離する。抗体を、例えば限外濾過によって濃縮し、次に沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過のような標準的方法によって更に精製することができる。特に、その場合に、既に正しく折り畳まれた抗体の本来のコンフォメーションを利用する親和性クロマトグラフィーのような方法が好ましい。
【００３２】
次の実施例は、本発明を更に説明するために用いられるものである。
【００３３】
使用される全ての分子生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによるＤＮＡの改変、形質転換などは、当業者に公知のように、文献に記載されるように、又はその都度製造元に推奨されるようにして実施した。
【実施例】
【００３４】
実施例：Ｅ．コリ分泌突然変異体を用いた１０ｌ規模での全長抗体の発酵的製造
本実施例は、抗組織因子（αＴＦ）ＩｇＧ１−抗体の製造を記載している。
【００３５】
抗αＴＦ抗体の遺伝子のクローニングと発現のための出発ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ（図１）を用いた。該プラスミドは、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養収集館（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で番号ＤＳＭ１８５９６として寄託されている。ｐＪＦ１１８ｕｔは、公知の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するＬａｃＩｑ遺伝子産物によって再始動されかつ例えばＤ−ラクトースもしくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるｔａｃプロモーターをも有する。このプラスミド中に、２つの連続した工程において、抗αＴＦ抗体の重鎖もしくは軽鎖についての両方の読み枠を、それぞれシグナル配列を含めてクローニングした。そのために以下のように実施した：
配列番号２を有するＤＮＡ断片（重鎖）を、遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、Ｅ．コリのｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と、抗αＴＦ抗体の重鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあるプラスミドを、ｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図２）と呼称した。
【００３６】
配列番号３を有するＤＮＡ断片（軽鎖）を、同様に遺伝子合成によって製造し、そして該ＤＮＡ断片は、ＣＧＴアーゼのシグナル配列と、抗αＴＦ抗体の軽鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このＤＮＡ断片を、まず、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、引き続き同じ制限酵素で切断されているベクターｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦとライゲーションした。こうして得られたプラスミドを、ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ（図３）と呼称した。前記のようにして、重鎖と軽鎖についてのそれぞれの読み枠からなる、ｔａｃプロモーターの制御下にある人工オペロンを作製した。従って、インデューサー（例えばＩＰＴＧ）の添加によって、両方の遺伝子の同期発現が可能である。
【００３７】
抗αＴＦ抗体の製造のために、それらの菌株を、それぞれプラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦで、ＣａＣｌ2法によって形質転換させた。プラスミド保有細胞についての選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって実施した。
【００３８】
製造は、１０ｌの撹拌槽型発酵器中で実施した。６ｌの培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）で満たされた発酵器に、１：１０の比率で、同じ培地中で一晩培養された前培養を植えた。発酵の間に、３０℃の温度に調整し、そしてｐＨ値をＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4を計量供給することによって７．０の値に一定に保った。グルコースは、発酵にわたって計量供給され、その際、培地中の最大グルコース濃度を１０ｇ／ｌ未満にすることに努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭで添加することによって実施した。
【００３９】
７２時間の発酵後に、試料を取りだし、引き続き細胞を培養培地の遠心分離によって分離した。
【００４０】
培養培地中に分泌された抗αＴＦ抗体の定量化を、ＥＬＩＳＡ試験での活性測定によって、抗原（コーティング）として可溶性の組織因子を用い、かつ二次抗体としてペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）2−フラグメントを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３−４７）に記載されるようにして実施した。
【００４１】
第１表において、前記のように測定された、機能的な抗αＴＦ抗体の収率を列記する。
【００４２】
第１表：７２時間の発酵後の培養上清中での抗αＴＦ抗体の収率
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、実施例からのクローニングベクターｐＪＦ１１８ｕｔを示している。
【図２】図２は、実施例からのプラスミドｐＨＣ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【図３】図３は、実施例からの抗ＴＦ抗体発現プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを示している。
【符号の説明】
【００４４】
ｔａｃ ｐ／ｏ ｔａｃ−プロモーター／オペレーター、 ｒｒｎＢ ターミネーター、 ｂｌａ β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、 ＣｏｌＥ１ 複製の起点、 ＴｃＲ テトラサイクリン耐性、 ｌａｃＩｑ ｔａｃプロモーターのリプレッサー、 ＳＤ シャイン−ダルガノ配列、 ｏｍｐＡ−ＳＰ ｏｍｐＡ−シグナルペプチド、 ＨＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ） 抗ＴＦ抗体の重鎖の読み枠、 ｃｇｔ−ＳＰ ＣＧＴアーゼのシグナルペプチド、 ＬＣ（Ａｎｔｉ−ＴＦ） 抗ＴＦ抗体の軽鎖の読み枠
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正しく折り畳まれた会合された全長抗体をＥ．コリ菌株によって製造するための方法において、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、Ｅ．コリ菌株が、ＢＬＲ、Ｋ８０２、ＷＣＭ１００、ＭＭ２８、ＲＶ３０８、ＲＲ１、ＥＰ４９７７５７号Ｂ１に従って製造されるＥ．コリ菌株、Ｅ．コリ菌株の"漏出性"突然変異体の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の遺伝子：ｏｍｐ遺伝子、ｔｏｌ遺伝子、ｅｘｃＤ遺伝子、ｅｘｃＣ遺伝子、ｌｐｐ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｌｋｙ遺伝子の１つに突然変異を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の群：ＪＦ７３３、Ａ５９２、Ａ５９３、Ａ５８６、ＣＡＧ１２１８４、Ｇ１１ｅ１、ＪＥ５５１１、Ｅ６１０、Ｅ６２３、ＪＥ５５０５、ＰＭ６１、６６２８、ＰＭ６１Ｒ、ＪＰ１２２８、２０７、ＡＥ８４０６４からのＥ．コリ菌株であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法において、抗体が、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることなく１６０ｍｇ／ｌより高い収率で得られることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列が、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列又は配列番号１の配列を有するシグナル配列から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法において、軽鎖と重鎖の遺伝子の５′末端が、読み枠内で、シグナルペプチドをコードする異なるシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、抗体の一方の鎖をコードする遺伝子の５′末端が、読み枠内で、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と機能的に結合されており、かつ抗体のもう一方の鎖をコードする遺伝子の５′末端が、読み枠内で、配列番号１のシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、１つのオペロンにまとめられていることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法において、１６〜１５０時間の時間にわたり発酵させることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法において、発酵を、１０〜７０％飽和の、有利には３０〜６０％飽和の、特に有利には４５〜５５％飽和の酸素分圧（ｐＯ2）で行うことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法において、培養培地中のｐＨ値が、ｐＨ６〜ｐＨ８、有利にはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、特に有利にはｐＨ６．８〜ｐＨ７．２であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法において、温度を、遺伝子発現の誘導前に、３０℃から２５℃に、有利には３０℃から２０℃に低下させることで、"封入体"の形成を回避することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法において、全長抗体の培養培地からの分離を、第一段階においては、遠心分離もしくは濾過のような分離法によって行い、次いで抗体を限外濾過によって濃縮させ、引き続き沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過によって、特に有利には親和性クロマトグラフィーによって更に精製することを特徴とする方法。
【請求項１５】
正しく折り畳まれた全長抗体の製造のための、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株。
【請求項１６】
請求項１５記載のＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナル、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターを備えていることを特徴とするＥ．コリ菌株。
【請求項１】
正しく折り畳まれた会合された全長抗体をＥ．コリ菌株によって製造するための方法において、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該Ｅ．コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、Ｅ．コリ菌株が、ＢＬＲ、Ｋ８０２、ＷＣＭ１００、ＭＭ２８、ＲＶ３０８、ＲＲ１、ＥＰ４９７７５７号Ｂ１に従って製造されるＥ．コリ菌株、Ｅ．コリ菌株の"漏出性"突然変異体の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の遺伝子：ｏｍｐ遺伝子、ｔｏｌ遺伝子、ｅｘｃＤ遺伝子、ｅｘｃＣ遺伝子、ｌｐｐ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｌｋｙ遺伝子の１つに突然変異を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の群：ＪＦ７３３、Ａ５９２、Ａ５９３、Ａ５８６、ＣＡＧ１２１８４、Ｇ１１ｅ１、ＪＥ５５１１、Ｅ６１０、Ｅ６２３、ＪＥ５５０５、ＰＭ６１、６６２８、ＰＭ６１Ｒ、ＪＰ１２２８、２０７、ＡＥ８４０６４からのＥ．コリ菌株であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法において、抗体が、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることなく１６０ｍｇ／ｌより高い収率で得られることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列が、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列又は配列番号１の配列を有するシグナル配列から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法において、軽鎖と重鎖の遺伝子の５′末端が、読み枠内で、シグナルペプチドをコードする異なるシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、抗体の一方の鎖をコードする遺伝子の５′末端が、読み枠内で、Ｅ．コリのｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列と機能的に結合されており、かつ抗体のもう一方の鎖をコードする遺伝子の５′末端が、読み枠内で、配列番号１のシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、１つのオペロンにまとめられていることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法において、１６〜１５０時間の時間にわたり発酵させることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法において、発酵を、１０〜７０％飽和の、有利には３０〜６０％飽和の、特に有利には４５〜５５％飽和の酸素分圧（ｐＯ2）で行うことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法において、培養培地中のｐＨ値が、ｐＨ６〜ｐＨ８、有利にはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、特に有利にはｐＨ６．８〜ｐＨ７．２であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法において、温度を、遺伝子発現の誘導前に、３０℃から２５℃に、有利には３０℃から２０℃に低下させることで、"封入体"の形成を回避することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法において、全長抗体の培養培地からの分離を、第一段階においては、遠心分離もしくは濾過のような分離法によって行い、次いで抗体を限外濾過によって濃縮させ、引き続き沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過によって、特に有利には親和性クロマトグラフィーによって更に精製することを特徴とする方法。
【請求項１５】
正しく折り畳まれた全長抗体の製造のための、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するＥ．コリ菌株。
【請求項１６】
請求項１５記載のＥ．コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナル、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターを備えていることを特徴とするＥ．コリ菌株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−７３０４５（Ｐ２００８−７３０４５Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４８１３４（Ｐ２００７−２４８１３４）
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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