共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法
【課題】 標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のための光との標本面上での深さ方向の励起光強度分布をそれぞれ独立に変化させることができる共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法を提供すること。
【解決手段】 第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系（１００、１００′）と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系（２００）と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構（１０２、２０２）とを備えた。
【解決手段】 第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系（１００、１００′）と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系（２００）と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構（１０２、２０２）とを備えた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、励起波長を用いて励起して、前記試料から放出された蛍光を検出する共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを備えた走査型レーザ顕微鏡が提案されている（特開２０００−２７５５２９号公報参照）。この走査型レーザ顕微鏡では、第１の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の特定部位を照射して標本又は標本に注入された化学物質に刺激を加え、第２の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の上記とは異なる特定部位を励起して蛍光を検出し画像化する。なお、本明細書では、特に明記しない限り、標本の画像取得するための走査光学系を「第１の走査光学系」と称し、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための走査光学系を「第２の走査光学系」と称する。
【０００３】
一般的に、共焦点顕微鏡では、標本上の焦点と共役な焦点を検出器前に設けて、そこにピンホールを設置することにより、標本の深さ方向の分解能を１．２２λ／ＮＡとして、通常の顕微鏡観察よりも小さくする共焦点効果を利用している。この共焦点効果により、分解能があがるので、標本上を走査している断面の切れの良い画像（すなわち、深さ方向に対して薄いスライス像を得られる画像）が得られる。
【０００４】
なお、高速に画像を取るときや暗い標本では、ピンホールを開いて共焦点効果を弱め、蛍光の分解能を犠牲にして画像を明るくすることが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この様に、共焦点顕微鏡は、ピンホールを開いて深さ方向の分解能を落とすことにより、深さ方向の情報を得ることができる。しかし、標本上での焦点深度は対物レンズに入射するコヒーレント光の光束径で決定されるので、ピンホールで、焦点深度を変えることは不可能である。
【０００６】
一方、顕微鏡による標本への照明としてケーラー照明がよく用いられている。このケーラー照明による標本断面の厚さ方向の照明は、一様に近い励起をしている。
【０００７】
上記のような従来の共焦点顕微鏡において、２つのレーザ走査光路と一つの対物レンズを用いて装置を実現した場合に、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布が、波長の差しか生じず、ほぼ同一となってしまう。
【０００８】
本発明は、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光（インコヒーレント光でも良い）との標本面上での深さ方向の励起光強度分布を変化させることができる共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする。
【００１０】
本発明の第２局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第３局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、を具備することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、刺激を与える光学系と画像を取得する励起光の標本面での深さ方向の強度分布を変えることにより、異なる３次元空間の動的解析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。
【図２】第１のビーム径可変機構と第２のビーム径可変機構の構成例を示す図。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。
【図４】本発明に適用される回転ディスクの一例を示す図。
【図５】神経組織の観察を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。
図１において、共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源１０１からのレーザ光で標本１３４の焦点面上を走査する観察用（又は、画像取得用）の第１の走査光学系１００と、第２のレーザ光源２０１から出力されるレーザ光を標本１３４の任意の位置に照射してケージド試薬を開裂させるため（すなわち、標本刺激用）の第２の走査光学系２００とを備えている。第１の走査光学系１００の光路と第２の走査光学系２００の光路とはダイクロイックミラー１２０で一致している。これにより、第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００とが、１つの対物レンズ１３２を共用している。
【００１６】
第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００において、第１のレーザ光源１０１から出力されたコヒーレント光は第１のビーム径可変機構１０２及び第１の走査光学ユニット１０４を介してダイクロイックミラー１２０に至る。また、第２のレーザ光源２０１出力されたコヒーレント光は第２のビーム径可変機構２０２及び第２の走査光学ユニット２０３を介してダイクロイックミラー１２０に至る。
【００１７】
また、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２は、励起光強度分布算出手段１６０に電気的又は間接的に接続されている。これにより、励起光強度分布算出手段１６０が第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２から出力されるビーム径の情報を得ることができる。
【００１８】
第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２は、例えば、図２に示すように、ビームエクスパンダーなどのように光束径を変化できるものが、回転するターレツトに複数個（本）装着されているもので良い。又は、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２として、複数のレンズ等の光学素子を組み合わせて、レーザのコヒーレントを保ったまま光束径を変化させるような機構（例えば、ズーム機構）を採用しても良い。
【００１９】
上記のように構成された第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作について説明する。
【００２０】
第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００は、標本１３４の任意の（所望の）位置にコヒーレント光を照射するために用いる。具体的には、以下の通りである。
【００２１】
すなわち、第１のレーザ光源１０１と第２のレーザ光源２０１から発せられたコヒーレント光は、それぞれ、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２で光束径が可変（調整）される。
【００２２】
第１のビーム径可変機構１０２からの出力光は、ダイクロイックミラー１５０を通過して、第１の走査光学ユニット１０４の各走査ミラー１０４ａ、１０４ｂによってＸＹ方向に任意に偏向される。偏向された光は、リレーレンズ１０５を透過した後に、ミラー１０６で反射されて、ダイクロイックミラー１２０に入射する。一方、第２のビーム径可変機構２０２からの出力光は、第２の走査光学ユニット２０３の各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂによってＸＹ方向に任意に偏向される。偏向された光は、リレーレンズ２０４を透過してダイクロイックミラー１２０に入射し、ダイクロイックミラー１２０で光路が偏向される。
【００２３】
そして、ダイクロイックミラー１２０からのコヒーレント光は、結像レンズ１３０に入射する。なお、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２で第１のレーザ光源からのレーザビームと第２のレーザ光源からのレーザビームの光束径を対物レンズ１３２の瞳径に対して変化させることにより、各走査光学系に対応する標本１３４面における深さ方向の励起光分布（そして／又は強度分布）の幅を変化させることができる。
【００２４】
結像レンズ１３０を透過した光は、対物レンズ１３２に至り、この対物レンズ１３２を透過して、ステージ１３６上に載置された標本１３４の任意の断面１３８に集光される。なお、ステージ１３６は、ＸＹ平面方向と高さ方向（Ｚ軸方向：図１における矢印方向）に移動可能である。
【００２５】
上記のように、標本１３４を走査する場合において、用途に応じて、各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂによってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポット的に照射させてもよい。更に、各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。一方、第１のレーザ光源１０１から発せられたコヒーレント光は、上記のように、ダイクロイックミラー１５０を透過し、第１の走査光学ユニット１０４の各走査ミラー１０４ａ、１０４ｂによって偏向される。
【００２６】
第１の走査光学系１００によって標本１３４に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。
【００２７】
この標本１３４からの蛍光は、標本１３４への入射光路とは逆方向に、対物レンズ１３２から結像レンズ１３０、ダイクロイックミラー１２０、第１の走査光学ユニット１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０４ｂ、１０４ａを通ってダイクロイックミラー１５０に到達し、このダイクロイックミラー１５０で反射して測光フィルタ１４０に入射する。
【００２８】
この測光フィルタ１４０に入射した光は、標本１３４からの蛍光波長のみが選択され、標本１３４からの蛍光波長のみを有する光がレンズ１４２によってピンホール１４４面に結像される。このピンホール１４４を通過した蛍光は、光電変換素子１４６によって計測される。
【００２９】
励起光強度分布算出手段１６０は、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２より出力されるビーム径及び現在使用されている対物レンズの性能（仕様）の情報を入力して標本面上での励起光強度分布を算出したり、既に記憶されている値を図では示されていないコンピュータ又はディスプレイなどのインターフェースに出力したりするなどの機能を有する。
【００３０】
上記のような、本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置によれば、第１の走査光学系１００により標本画像を観察・記録している最中に、第２の走査光学系２００によりコヒーレント光を標本１３４に照射することによって、第２の走査光学系２００によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１３４の動的特性（化学反応）などを第１の走査光学系１００で調査できる。
【００３１】
この場合において、第１の実施形態では、第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００による標本面上での深さ方向の励起光分布を、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２によって独立に設定できる。従って、例えば、第２の走査光学系によって標本を刺激している範囲の励起光分布の幅が狭い場合であって、その刺激によって標本の厚み方向に対して広い領域に影響があった場合でも、第１の走査光学系の励起光分布の幅を広くすることによって、その様子を観察することが可能である。
【００３２】
また、上記とは逆に、第２の走査光学系で標本の厚み方向に対して広範囲な部分を刺激して、第１の走査光学系では深さ方向の励起光分布の幅を狭くすることにより、標本の断面１３８を高分解能で観察することもできる。
【００３３】
第１の実施形態において、第１のレーザ光源１０１として、ＩＲパルスレーザを用いて、２光子吸収により蛍光画像を取得する構成としても良い。この場合において、２光子吸収現象は結像位置でのみ発生するので、ピンホール１４４は理論的には不要になる。また、ダイクロイックミラー１５０は、ＩＲレーザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１４６に導くために、短波長反射の特性を持つものとなる。また、第１のビーム径可変機構１０２は使用しない構成とする。
【００３４】
上記のように、第１のレーザ光源１０１として、ＩＲパルスレーザを用いることにより、第１の走査光学系の構成を簡略化することができる。加えて、第１のビーム径可変機構１０２を使用しない場合であっても、走査光学系１００の標本面上での深さ方向の励起光分布の幅は、２光子吸収現象により第２の走査光学系２００の深さ方向の励起光分布の幅よりも狭くなる。また、標本を刺激する標本の厚みを変化させたい場合は、第２のビーム径可変機構２０２によって第２の走査光学系２００の励起光分布の幅を狭くすることができる。
【００３５】
（第２の実施形態）
図３を参照して、本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置を説明する。図３は、本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。図３において、第２の走査光学系２００は、第１の実施形態と同じであるので、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【００３６】
第２の実施形態において、第１の走査光学系１００′は、光源３０１として水銀光源やハロゲン光源（これらの光源を「ランプ」とも称する）やＬＥＤ光源等のコヒーレントではない光源を有している。光源３０１から出射される光の光路上には、光学レンズ３０２や、偏光板３０３や、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）３０４が配置されている。
【００３７】
ＰＢＳ３０４の反射光路上には、回転ディスク３０５と、第１結像レンズ３０７と、１／４波長板３０８と、対物レンズ３０９とが配置されており、これらを介して光源からの光が標本３１０に入射する。
【００３８】
回転ディスク３０５は、回転軸３０６を介して図示しないモータの軸に連結されており、一定の回転速度で回転するようになっている。なお、回転ディスク３０５は、例えば、直線状の光が通過する通過部分と光を遮蔽する遮蔽部分が交互に並んで配置されている。そして、遮蔽部分のラインの幅は、通過部分より広く、例えば、遮蔽部分と通過部分のラインの幅の比は、１：９になっている（図４参照）。
【００３９】
また、光が透過する部分の幅をＷとすれば、ピンホールの場合と同じく、試料像がディスクに投影される倍率をＭ、光の波長をλ、対物レンズの開口率をＮＡとして、
Ｗ＝ｋλＭ／ＮＡ
となる。ここで、ｋは係数であり、ｋ＝０．５〜１程度の値がよく使われる。
【００４０】
また、ＰＢＳ３０４の透過光路上には、第２の結像レンズ３１１を介してＣＣＤカメラ３１２が配置されている。ＣＣＤカメラ３１２には、ＣＣＤカメラ３１２で撮像した画像を観察するモニタ３１３が接続されている。
【００４１】
上記のように構成された第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作を説明する。
【００４２】
光源３０１から出射された光は、光学レンズ３０２を通って、偏光板３０３で、所定の偏光のみの直線偏光となって、ＰＢＳ３０４に入射する。ＰＢＳ３０４は、偏光板を透過してきた方向の偏光は反射し、それに垂直な方向の偏光は透過する。
【００４３】
ＰＢＳ３０４で反射された光は、一定の速度で回転する回転ディスク３０５に入射する。回転ディスク３０５の透過部分を透過した光は第１の結像レンズ３０７を通り、１／４波長板３０８で円偏光となって、対物レンズ３０９によって結像され、標本３１０に入射される。
【００４４】
標本３１０で反射された光は、対物レンズ３０９を通り、１／４波長板３０８で、入射時と直交した直線偏光となり、第２の結像レンズ３１１を介して回転ディスク３０５上に標本３１０の像を結像する。
【００４５】
回転ディスク３０５上に結像された像のうち、焦点の合っている成分は、回転ディスク３０５上の透過部分を通過する。回転ディスク３０５を通過した成分は、ＰＢＳ３０４を透過して、第２結像レンズ３１１を介してＣＣＤカメラ３１２に到達し、その結像面（撮像面）に試料像が結像される。
【００４６】
標本３１０を観察しているときのある瞬間を考えれば、標本３１０上には図４のように、ある方向にラインが投影されている。
【００４７】
このような状態で、標本３１０から反射した光が回転ディスク３０５上に結像された場合には、標本３１０について、その焦点が合っている部分は回転ディスク上にラインが投影される。しかし、非合焦部分は回転ディスク３０５に投影された像がボケているので、非合焦像の大部分はディスクを透過できないことになる。従って、合焦した像のみが回転ディスク３０５を透過することになる。
【００４８】
なお、回転ディスク３０５が回転しない場合には、このままの状態であって、単にサンプルとラインが重なった像である。しかし、回転ディスク３０５を回転させることによって、透過部分と遮蔽部分からなるラインが標本３１０上を方向を変えながら移動して行くことになるので、平均化されてライン像は消えて、焦点のあった画像が観察される。従って、ＣＣＤカメラ３１２の露出時間に対して、回転ディスク３０５の回転が十分速ければ、合焦画像をＣＣＤカメラ３１２で撮像しモニタ３１３で観察できることになる。例えば、ＣＣＤカメラ３１２が通常でＴＶレートならば、露出時間は１／６０秒か１／３０秒であるから露出時間中に回転ディスク３０５の回転数を、半回転する程度の１８００ｒｐｍくらいにすれば良い。
【００４９】
この時における第１の走査光学系１００′の標本３１０面上での深さ方向の励起光分布は、スリットの長手方向では、顕微鏡のケーラー照明の照射分布と同じである。スリットの幅方向では、第２の走査光学系と同じ分布である。
【００５０】
従って、第１の走査光学系の標本面上での探さ方向の励起光分布は、長手方向と幅方向のものとが合成されたものになる。なお、励起光の深さ方向の強度分布を変更させるには、回転ディスク３０５のスリット幅及びスリット間隔を変えることで可変可能である。
【００５１】
第２の実施形態では、第１の実施形態で示した第２の走査光学系により照射された光の反応を受けた動的変化を第１の走査光学系１００′で検出することで、第１と第２の標本面上での深さ方向の励起光分布が違って出来る。従って、第２の走査光学系２００が励起している範囲よりもより広範囲な測定が第１の走査光学系１００′で可能である。
【００５２】
特に神経系の測定では、標本の厚み方向に伸びている神経の動きを捉えるには、高速に画像を取得する必要がある。通常、共焦点顕微鏡装置では、標本面上での深さ方向の励起光分布の幅が狭いため、標本の厚み方向に伸びていると一度の測定では、画像を捉えることが出来ない。よって、第２の実施の形態のように、標本面上での探さ方向の励起光分布の幅を広くして測定することにより広範囲の画像測定が出来る効果がある。このため、第２の実施形態において、回転ディスク３０５を省略した構成としても良い。また、回転ディスクは、図４に示したものに限られず、共焦点効果が得られるようなものであれば、どのような形状或いは、構成のものを用いてもよい。例えば、回転ディスクにピンホールが形成されているものであっても良いし、上記の実施の形態のような透過型ではなく、反射型のものとしても良い。
【００５３】
また、第２の実施形態では、第２のビーム径可変機構２０２は必ずしも必要ではないが、第２のビーム径可変機構２０２があれば、第１の断面と第２の断面の比を変えることが可能であり、画像を取得する範囲と刺激を与える部分の微調整により、実験（そして／又は観察）の自由度が広がる。また、第２のビーム径可変機構２０２を設ける場合には、第１の実施形態と同様に励起光強度分布算出手段１６０を設けることが好ましい。
【００５４】
また、上記の構成において、第１の走査光学系１００′をケーラー照明による顕微鏡光学系で構成することにより、より広い励起範囲での画像取得が可能である。なお、この場合には、回転ディスク３０５は不要になる。
【００５５】
上記の第２の実施形態において、ＰＢＳ３０４をダイクロイックミラーに変更しても良い。このようにした場合には、ダイクロイックミラーで光源からの光を反射させ、標本からの蛍光を通過させることによって、励起光学系と測定光学系の光路を分離できるので、偏光板３０３は不要になる。
【００５６】
上記の各実施形態における共焦点顕微鏡装置の用途としては、例えば、細胞における研究分野では、局所的に励起し、励起した部位からの反応を観察する用途がある。
【００５７】
アンケージド（Ｕｎｃａｇｅｄ）という手法では、局所的に励起することで活性物質の濃度が変化する。その濃度変化を計測する場合に、局所的に励起した部位以外の周辺部分を同時に計測することで、細胞内の機能解析が行なうことが可能である。
【００５８】
フォトブリーチという手法では、細胞を局所的に励起することによって、当該部位の退色を施す。その部位は、周辺のタンパク質の移動により時間とともに退色した部位が復帰する現象が見られる。従って、局所的に励起した部位と周辺部分との両者での計測が必要になる。
【００５９】
図５を参照してその一例を示す。図５は神経組織の観察を模式的に示した図である。
【００６０】
例えば細胞体１から細胞体２に軸索３を伝わるイオンを細胞体１に注入されたケージド蛍光色素をプローブとして観察しようとする場合には、まず、細胞体１上の焦点面４に標本を刺激するためのレーザ光を照射する。そして、その後の変化を標本観察用のレーザ光で観察する。しかし、観察用のレーザ光の深さ方向の励起光強度分布は、通常は刺激用のレーザ光と同じ深さの励起光強度分布５となるので、従来では、その分布の範囲内に入っていない軸索３を伝わる蛍光色素は励起光が当たらないため観察できないことがある。これに対して、本発明の各実施形態においては、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光との標本面上での深さ方向の励起光強度分布をそれぞれ独立に変化させることができるので、従来の問題を解決できる。
【００６１】
上記の各実施形態から下記の発明が抽出される。なお、本発明は、上記の発明の実施の形態に限定されるものではない。本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。
【００６２】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする。レーザ光学系とレーザ走査型顕微鏡の組合せによる、標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。具体的には、以下の通りである。
【００６３】
従来においては、標本の動的解析をする場合は、刺激を加える範囲と画像を取得する範囲が異なることはもとより、刺激を加えるレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布と画像を取得するレーザ光の深さ方向の励起光強度分布を互いに異なるようにしたいことがある。その上で、深さ方向の励起光強度分布の幅を意図的に狭くしたいこともある。
【００６４】
本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
【００６５】
すなわち、例えば、上記の各実施形態から下記の発明が抽出できる。なお、下記の各発明は単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。
【００６６】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、各走査光学系のレーザ光の射出口に、レーザ光の光束径を変化させるビーム径可変機構を備えている。このビーム径可変機構によってレーザ光の光束径を小さくした場合、対物レンズの開口数は光束径が大きい場合に比べて小さくなる。その結果、対物レンズを交換しなくても標本面上で探さ方向の励起光強度分布の幅が狭くなる。更に、ビーム径可変機構を各光学系に備えることで、各光学系の標本面上での探さ方向の励起光強度分布を独立に変化させることができる。更にその標本面上での深さ方向の励起光分布の幅を意図的に変えることが可能である。
【００６７】
本発明の第２局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする。レーザ光学系とディスクタイプの共焦点顕微鏡装置の組合せによる標本面上での探さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。
【００６８】
本発明の第３局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備することを特徴とする。レーザ光学系とケーラー照明における顕微鏡の組合せによる標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。
【００６９】
上記の共焦点顕微鏡装置の好ましい実施態様は以下のとおりである。なお、以下の各実施態様は、単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。
（１） 前記第２の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えること。
（２） 前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備すること。
（３） 前記第１のレーザ光源はＩＲパルスレーザであり、前記ビーム可変機構は、前記第２の走査光学系に設けられていること。
（４） 前記ビーム径可変機構から出力されたレーザ光の標本面上での深さ方向の強度分布を算出する深さ方向強度分布算出手段を更に備えること。
（５） 前記コヒーレントではない光源は、ランプもしくはＬＥＤ光源であること。
【００７０】
なお、本発明は、上記の共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法としても成立する。
また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【符号の説明】
【００７１】
１００、１００′…第１の走査光学系、１０１…第１のレーザ光源、１０２…第１のビーム径可変機構、１０３…リレーレンズ、１０４…第１の走査光学ユニット、１０４ａ、１０４ｂ…走査ミラー、１０５…リレーレンズ、１０６…ミラー、１２０…ダイクロイックミラー、１３０…結像レンズ、１３２…対物レンズ、１３４…標本、１３６…ステージ、１４０…測光フィルタ、１４２…レンズ、１４４…ピンホール、１４６…光電変換素子、１５０…ダイクロイックミラー、１６０…励起光強度分布算出手段、２００…第２の走査光学系、２０１…第２のレーザ光源、２０２…第２のビーム径可変機構、２０３…第２の走査光学ユニット、２０３ａ、２０３ｂ…走査ミラー、２０４…リレーレンズ、３０１…光源、３０２…光学レンズ、３０３…偏光板、３０４…偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）、３０５…回転ディスク、３０６…回転軸、３０７…第１の結像レンズ、３０８…波長板、３０９…対物レンズ、３１０…標本、３１１…第２の結像レンズ、３１２…ＣＣＤカメラ、３１３…モニタ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、励起波長を用いて励起して、前記試料から放出された蛍光を検出する共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを備えた走査型レーザ顕微鏡が提案されている（特開２０００−２７５５２９号公報参照）。この走査型レーザ顕微鏡では、第１の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の特定部位を照射して標本又は標本に注入された化学物質に刺激を加え、第２の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の上記とは異なる特定部位を励起して蛍光を検出し画像化する。なお、本明細書では、特に明記しない限り、標本の画像取得するための走査光学系を「第１の走査光学系」と称し、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための走査光学系を「第２の走査光学系」と称する。
【０００３】
一般的に、共焦点顕微鏡では、標本上の焦点と共役な焦点を検出器前に設けて、そこにピンホールを設置することにより、標本の深さ方向の分解能を１．２２λ／ＮＡとして、通常の顕微鏡観察よりも小さくする共焦点効果を利用している。この共焦点効果により、分解能があがるので、標本上を走査している断面の切れの良い画像（すなわち、深さ方向に対して薄いスライス像を得られる画像）が得られる。
【０００４】
なお、高速に画像を取るときや暗い標本では、ピンホールを開いて共焦点効果を弱め、蛍光の分解能を犠牲にして画像を明るくすることが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この様に、共焦点顕微鏡は、ピンホールを開いて深さ方向の分解能を落とすことにより、深さ方向の情報を得ることができる。しかし、標本上での焦点深度は対物レンズに入射するコヒーレント光の光束径で決定されるので、ピンホールで、焦点深度を変えることは不可能である。
【０００６】
一方、顕微鏡による標本への照明としてケーラー照明がよく用いられている。このケーラー照明による標本断面の厚さ方向の照明は、一様に近い励起をしている。
【０００７】
上記のような従来の共焦点顕微鏡において、２つのレーザ走査光路と一つの対物レンズを用いて装置を実現した場合に、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布が、波長の差しか生じず、ほぼ同一となってしまう。
【０００８】
本発明は、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光（インコヒーレント光でも良い）との標本面上での深さ方向の励起光強度分布を変化させることができる共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする。
【００１０】
本発明の第２局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第３局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、を具備することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、刺激を与える光学系と画像を取得する励起光の標本面での深さ方向の強度分布を変えることにより、異なる３次元空間の動的解析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。
【図２】第１のビーム径可変機構と第２のビーム径可変機構の構成例を示す図。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。
【図４】本発明に適用される回転ディスクの一例を示す図。
【図５】神経組織の観察を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。
図１において、共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源１０１からのレーザ光で標本１３４の焦点面上を走査する観察用（又は、画像取得用）の第１の走査光学系１００と、第２のレーザ光源２０１から出力されるレーザ光を標本１３４の任意の位置に照射してケージド試薬を開裂させるため（すなわち、標本刺激用）の第２の走査光学系２００とを備えている。第１の走査光学系１００の光路と第２の走査光学系２００の光路とはダイクロイックミラー１２０で一致している。これにより、第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００とが、１つの対物レンズ１３２を共用している。
【００１６】
第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００において、第１のレーザ光源１０１から出力されたコヒーレント光は第１のビーム径可変機構１０２及び第１の走査光学ユニット１０４を介してダイクロイックミラー１２０に至る。また、第２のレーザ光源２０１出力されたコヒーレント光は第２のビーム径可変機構２０２及び第２の走査光学ユニット２０３を介してダイクロイックミラー１２０に至る。
【００１７】
また、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２は、励起光強度分布算出手段１６０に電気的又は間接的に接続されている。これにより、励起光強度分布算出手段１６０が第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２から出力されるビーム径の情報を得ることができる。
【００１８】
第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２は、例えば、図２に示すように、ビームエクスパンダーなどのように光束径を変化できるものが、回転するターレツトに複数個（本）装着されているもので良い。又は、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２として、複数のレンズ等の光学素子を組み合わせて、レーザのコヒーレントを保ったまま光束径を変化させるような機構（例えば、ズーム機構）を採用しても良い。
【００１９】
上記のように構成された第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作について説明する。
【００２０】
第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００は、標本１３４の任意の（所望の）位置にコヒーレント光を照射するために用いる。具体的には、以下の通りである。
【００２１】
すなわち、第１のレーザ光源１０１と第２のレーザ光源２０１から発せられたコヒーレント光は、それぞれ、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２で光束径が可変（調整）される。
【００２２】
第１のビーム径可変機構１０２からの出力光は、ダイクロイックミラー１５０を通過して、第１の走査光学ユニット１０４の各走査ミラー１０４ａ、１０４ｂによってＸＹ方向に任意に偏向される。偏向された光は、リレーレンズ１０５を透過した後に、ミラー１０６で反射されて、ダイクロイックミラー１２０に入射する。一方、第２のビーム径可変機構２０２からの出力光は、第２の走査光学ユニット２０３の各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂによってＸＹ方向に任意に偏向される。偏向された光は、リレーレンズ２０４を透過してダイクロイックミラー１２０に入射し、ダイクロイックミラー１２０で光路が偏向される。
【００２３】
そして、ダイクロイックミラー１２０からのコヒーレント光は、結像レンズ１３０に入射する。なお、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２で第１のレーザ光源からのレーザビームと第２のレーザ光源からのレーザビームの光束径を対物レンズ１３２の瞳径に対して変化させることにより、各走査光学系に対応する標本１３４面における深さ方向の励起光分布（そして／又は強度分布）の幅を変化させることができる。
【００２４】
結像レンズ１３０を透過した光は、対物レンズ１３２に至り、この対物レンズ１３２を透過して、ステージ１３６上に載置された標本１３４の任意の断面１３８に集光される。なお、ステージ１３６は、ＸＹ平面方向と高さ方向（Ｚ軸方向：図１における矢印方向）に移動可能である。
【００２５】
上記のように、標本１３４を走査する場合において、用途に応じて、各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂによってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポット的に照射させてもよい。更に、各走査ミラー２０３ａ、２０３ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。一方、第１のレーザ光源１０１から発せられたコヒーレント光は、上記のように、ダイクロイックミラー１５０を透過し、第１の走査光学ユニット１０４の各走査ミラー１０４ａ、１０４ｂによって偏向される。
【００２６】
第１の走査光学系１００によって標本１３４に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。
【００２７】
この標本１３４からの蛍光は、標本１３４への入射光路とは逆方向に、対物レンズ１３２から結像レンズ１３０、ダイクロイックミラー１２０、第１の走査光学ユニット１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０４ｂ、１０４ａを通ってダイクロイックミラー１５０に到達し、このダイクロイックミラー１５０で反射して測光フィルタ１４０に入射する。
【００２８】
この測光フィルタ１４０に入射した光は、標本１３４からの蛍光波長のみが選択され、標本１３４からの蛍光波長のみを有する光がレンズ１４２によってピンホール１４４面に結像される。このピンホール１４４を通過した蛍光は、光電変換素子１４６によって計測される。
【００２９】
励起光強度分布算出手段１６０は、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２より出力されるビーム径及び現在使用されている対物レンズの性能（仕様）の情報を入力して標本面上での励起光強度分布を算出したり、既に記憶されている値を図では示されていないコンピュータ又はディスプレイなどのインターフェースに出力したりするなどの機能を有する。
【００３０】
上記のような、本発明の第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置によれば、第１の走査光学系１００により標本画像を観察・記録している最中に、第２の走査光学系２００によりコヒーレント光を標本１３４に照射することによって、第２の走査光学系２００によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１３４の動的特性（化学反応）などを第１の走査光学系１００で調査できる。
【００３１】
この場合において、第１の実施形態では、第１の走査光学系１００と第２の走査光学系２００による標本面上での深さ方向の励起光分布を、第１のビーム径可変機構１０２と第２のビーム径可変機構２０２によって独立に設定できる。従って、例えば、第２の走査光学系によって標本を刺激している範囲の励起光分布の幅が狭い場合であって、その刺激によって標本の厚み方向に対して広い領域に影響があった場合でも、第１の走査光学系の励起光分布の幅を広くすることによって、その様子を観察することが可能である。
【００３２】
また、上記とは逆に、第２の走査光学系で標本の厚み方向に対して広範囲な部分を刺激して、第１の走査光学系では深さ方向の励起光分布の幅を狭くすることにより、標本の断面１３８を高分解能で観察することもできる。
【００３３】
第１の実施形態において、第１のレーザ光源１０１として、ＩＲパルスレーザを用いて、２光子吸収により蛍光画像を取得する構成としても良い。この場合において、２光子吸収現象は結像位置でのみ発生するので、ピンホール１４４は理論的には不要になる。また、ダイクロイックミラー１５０は、ＩＲレーザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１４６に導くために、短波長反射の特性を持つものとなる。また、第１のビーム径可変機構１０２は使用しない構成とする。
【００３４】
上記のように、第１のレーザ光源１０１として、ＩＲパルスレーザを用いることにより、第１の走査光学系の構成を簡略化することができる。加えて、第１のビーム径可変機構１０２を使用しない場合であっても、走査光学系１００の標本面上での深さ方向の励起光分布の幅は、２光子吸収現象により第２の走査光学系２００の深さ方向の励起光分布の幅よりも狭くなる。また、標本を刺激する標本の厚みを変化させたい場合は、第２のビーム径可変機構２０２によって第２の走査光学系２００の励起光分布の幅を狭くすることができる。
【００３５】
（第２の実施形態）
図３を参照して、本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置を説明する。図３は、本発明の第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。図３において、第２の走査光学系２００は、第１の実施形態と同じであるので、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【００３６】
第２の実施形態において、第１の走査光学系１００′は、光源３０１として水銀光源やハロゲン光源（これらの光源を「ランプ」とも称する）やＬＥＤ光源等のコヒーレントではない光源を有している。光源３０１から出射される光の光路上には、光学レンズ３０２や、偏光板３０３や、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）３０４が配置されている。
【００３７】
ＰＢＳ３０４の反射光路上には、回転ディスク３０５と、第１結像レンズ３０７と、１／４波長板３０８と、対物レンズ３０９とが配置されており、これらを介して光源からの光が標本３１０に入射する。
【００３８】
回転ディスク３０５は、回転軸３０６を介して図示しないモータの軸に連結されており、一定の回転速度で回転するようになっている。なお、回転ディスク３０５は、例えば、直線状の光が通過する通過部分と光を遮蔽する遮蔽部分が交互に並んで配置されている。そして、遮蔽部分のラインの幅は、通過部分より広く、例えば、遮蔽部分と通過部分のラインの幅の比は、１：９になっている（図４参照）。
【００３９】
また、光が透過する部分の幅をＷとすれば、ピンホールの場合と同じく、試料像がディスクに投影される倍率をＭ、光の波長をλ、対物レンズの開口率をＮＡとして、
Ｗ＝ｋλＭ／ＮＡ
となる。ここで、ｋは係数であり、ｋ＝０．５〜１程度の値がよく使われる。
【００４０】
また、ＰＢＳ３０４の透過光路上には、第２の結像レンズ３１１を介してＣＣＤカメラ３１２が配置されている。ＣＣＤカメラ３１２には、ＣＣＤカメラ３１２で撮像した画像を観察するモニタ３１３が接続されている。
【００４１】
上記のように構成された第２の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作を説明する。
【００４２】
光源３０１から出射された光は、光学レンズ３０２を通って、偏光板３０３で、所定の偏光のみの直線偏光となって、ＰＢＳ３０４に入射する。ＰＢＳ３０４は、偏光板を透過してきた方向の偏光は反射し、それに垂直な方向の偏光は透過する。
【００４３】
ＰＢＳ３０４で反射された光は、一定の速度で回転する回転ディスク３０５に入射する。回転ディスク３０５の透過部分を透過した光は第１の結像レンズ３０７を通り、１／４波長板３０８で円偏光となって、対物レンズ３０９によって結像され、標本３１０に入射される。
【００４４】
標本３１０で反射された光は、対物レンズ３０９を通り、１／４波長板３０８で、入射時と直交した直線偏光となり、第２の結像レンズ３１１を介して回転ディスク３０５上に標本３１０の像を結像する。
【００４５】
回転ディスク３０５上に結像された像のうち、焦点の合っている成分は、回転ディスク３０５上の透過部分を通過する。回転ディスク３０５を通過した成分は、ＰＢＳ３０４を透過して、第２結像レンズ３１１を介してＣＣＤカメラ３１２に到達し、その結像面（撮像面）に試料像が結像される。
【００４６】
標本３１０を観察しているときのある瞬間を考えれば、標本３１０上には図４のように、ある方向にラインが投影されている。
【００４７】
このような状態で、標本３１０から反射した光が回転ディスク３０５上に結像された場合には、標本３１０について、その焦点が合っている部分は回転ディスク上にラインが投影される。しかし、非合焦部分は回転ディスク３０５に投影された像がボケているので、非合焦像の大部分はディスクを透過できないことになる。従って、合焦した像のみが回転ディスク３０５を透過することになる。
【００４８】
なお、回転ディスク３０５が回転しない場合には、このままの状態であって、単にサンプルとラインが重なった像である。しかし、回転ディスク３０５を回転させることによって、透過部分と遮蔽部分からなるラインが標本３１０上を方向を変えながら移動して行くことになるので、平均化されてライン像は消えて、焦点のあった画像が観察される。従って、ＣＣＤカメラ３１２の露出時間に対して、回転ディスク３０５の回転が十分速ければ、合焦画像をＣＣＤカメラ３１２で撮像しモニタ３１３で観察できることになる。例えば、ＣＣＤカメラ３１２が通常でＴＶレートならば、露出時間は１／６０秒か１／３０秒であるから露出時間中に回転ディスク３０５の回転数を、半回転する程度の１８００ｒｐｍくらいにすれば良い。
【００４９】
この時における第１の走査光学系１００′の標本３１０面上での深さ方向の励起光分布は、スリットの長手方向では、顕微鏡のケーラー照明の照射分布と同じである。スリットの幅方向では、第２の走査光学系と同じ分布である。
【００５０】
従って、第１の走査光学系の標本面上での探さ方向の励起光分布は、長手方向と幅方向のものとが合成されたものになる。なお、励起光の深さ方向の強度分布を変更させるには、回転ディスク３０５のスリット幅及びスリット間隔を変えることで可変可能である。
【００５１】
第２の実施形態では、第１の実施形態で示した第２の走査光学系により照射された光の反応を受けた動的変化を第１の走査光学系１００′で検出することで、第１と第２の標本面上での深さ方向の励起光分布が違って出来る。従って、第２の走査光学系２００が励起している範囲よりもより広範囲な測定が第１の走査光学系１００′で可能である。
【００５２】
特に神経系の測定では、標本の厚み方向に伸びている神経の動きを捉えるには、高速に画像を取得する必要がある。通常、共焦点顕微鏡装置では、標本面上での深さ方向の励起光分布の幅が狭いため、標本の厚み方向に伸びていると一度の測定では、画像を捉えることが出来ない。よって、第２の実施の形態のように、標本面上での探さ方向の励起光分布の幅を広くして測定することにより広範囲の画像測定が出来る効果がある。このため、第２の実施形態において、回転ディスク３０５を省略した構成としても良い。また、回転ディスクは、図４に示したものに限られず、共焦点効果が得られるようなものであれば、どのような形状或いは、構成のものを用いてもよい。例えば、回転ディスクにピンホールが形成されているものであっても良いし、上記の実施の形態のような透過型ではなく、反射型のものとしても良い。
【００５３】
また、第２の実施形態では、第２のビーム径可変機構２０２は必ずしも必要ではないが、第２のビーム径可変機構２０２があれば、第１の断面と第２の断面の比を変えることが可能であり、画像を取得する範囲と刺激を与える部分の微調整により、実験（そして／又は観察）の自由度が広がる。また、第２のビーム径可変機構２０２を設ける場合には、第１の実施形態と同様に励起光強度分布算出手段１６０を設けることが好ましい。
【００５４】
また、上記の構成において、第１の走査光学系１００′をケーラー照明による顕微鏡光学系で構成することにより、より広い励起範囲での画像取得が可能である。なお、この場合には、回転ディスク３０５は不要になる。
【００５５】
上記の第２の実施形態において、ＰＢＳ３０４をダイクロイックミラーに変更しても良い。このようにした場合には、ダイクロイックミラーで光源からの光を反射させ、標本からの蛍光を通過させることによって、励起光学系と測定光学系の光路を分離できるので、偏光板３０３は不要になる。
【００５６】
上記の各実施形態における共焦点顕微鏡装置の用途としては、例えば、細胞における研究分野では、局所的に励起し、励起した部位からの反応を観察する用途がある。
【００５７】
アンケージド（Ｕｎｃａｇｅｄ）という手法では、局所的に励起することで活性物質の濃度が変化する。その濃度変化を計測する場合に、局所的に励起した部位以外の周辺部分を同時に計測することで、細胞内の機能解析が行なうことが可能である。
【００５８】
フォトブリーチという手法では、細胞を局所的に励起することによって、当該部位の退色を施す。その部位は、周辺のタンパク質の移動により時間とともに退色した部位が復帰する現象が見られる。従って、局所的に励起した部位と周辺部分との両者での計測が必要になる。
【００５９】
図５を参照してその一例を示す。図５は神経組織の観察を模式的に示した図である。
【００６０】
例えば細胞体１から細胞体２に軸索３を伝わるイオンを細胞体１に注入されたケージド蛍光色素をプローブとして観察しようとする場合には、まず、細胞体１上の焦点面４に標本を刺激するためのレーザ光を照射する。そして、その後の変化を標本観察用のレーザ光で観察する。しかし、観察用のレーザ光の深さ方向の励起光強度分布は、通常は刺激用のレーザ光と同じ深さの励起光強度分布５となるので、従来では、その分布の範囲内に入っていない軸索３を伝わる蛍光色素は励起光が当たらないため観察できないことがある。これに対して、本発明の各実施形態においては、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光との標本面上での深さ方向の励起光強度分布をそれぞれ独立に変化させることができるので、従来の問題を解決できる。
【００６１】
上記の各実施形態から下記の発明が抽出される。なお、本発明は、上記の発明の実施の形態に限定されるものではない。本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。
【００６２】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする。レーザ光学系とレーザ走査型顕微鏡の組合せによる、標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。具体的には、以下の通りである。
【００６３】
従来においては、標本の動的解析をする場合は、刺激を加える範囲と画像を取得する範囲が異なることはもとより、刺激を加えるレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布と画像を取得するレーザ光の深さ方向の励起光強度分布を互いに異なるようにしたいことがある。その上で、深さ方向の励起光強度分布の幅を意図的に狭くしたいこともある。
【００６４】
本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
【００６５】
すなわち、例えば、上記の各実施形態から下記の発明が抽出できる。なお、下記の各発明は単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。
【００６６】
本発明の第１局面に係る共焦点顕微鏡装置は、各走査光学系のレーザ光の射出口に、レーザ光の光束径を変化させるビーム径可変機構を備えている。このビーム径可変機構によってレーザ光の光束径を小さくした場合、対物レンズの開口数は光束径が大きい場合に比べて小さくなる。その結果、対物レンズを交換しなくても標本面上で探さ方向の励起光強度分布の幅が狭くなる。更に、ビーム径可変機構を各光学系に備えることで、各光学系の標本面上での探さ方向の励起光強度分布を独立に変化させることができる。更にその標本面上での深さ方向の励起光分布の幅を意図的に変えることが可能である。
【００６７】
本発明の第２局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする。レーザ光学系とディスクタイプの共焦点顕微鏡装置の組合せによる標本面上での探さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。
【００６８】
本発明の第３局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備することを特徴とする。レーザ光学系とケーラー照明における顕微鏡の組合せによる標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。
【００６９】
上記の共焦点顕微鏡装置の好ましい実施態様は以下のとおりである。なお、以下の各実施態様は、単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。
（１） 前記第２の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えること。
（２） 前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備すること。
（３） 前記第１のレーザ光源はＩＲパルスレーザであり、前記ビーム可変機構は、前記第２の走査光学系に設けられていること。
（４） 前記ビーム径可変機構から出力されたレーザ光の標本面上での深さ方向の強度分布を算出する深さ方向強度分布算出手段を更に備えること。
（５） 前記コヒーレントではない光源は、ランプもしくはＬＥＤ光源であること。
【００７０】
なお、本発明は、上記の共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法としても成立する。
また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【符号の説明】
【００７１】
１００、１００′…第１の走査光学系、１０１…第１のレーザ光源、１０２…第１のビーム径可変機構、１０３…リレーレンズ、１０４…第１の走査光学ユニット、１０４ａ、１０４ｂ…走査ミラー、１０５…リレーレンズ、１０６…ミラー、１２０…ダイクロイックミラー、１３０…結像レンズ、１３２…対物レンズ、１３４…標本、１３６…ステージ、１４０…測光フィルタ、１４２…レンズ、１４４…ピンホール、１４６…光電変換素子、１５０…ダイクロイックミラー、１６０…励起光強度分布算出手段、２００…第２の走査光学系、２０１…第２のレーザ光源、２０２…第２のビーム径可変機構、２０３…第２の走査光学ユニット、２０３ａ、２０３ｂ…走査ミラー、２０４…リレーレンズ、３０１…光源、３０２…光学レンズ、３０３…偏光板、３０４…偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）、３０５…回転ディスク、３０６…回転軸、３０７…第１の結像レンズ、３０８…波長板、３０９…対物レンズ、３１０…標本、３１１…第２の結像レンズ、３１２…ＣＣＤカメラ、３１３…モニタ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、
前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、
前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項２】
コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、
レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、
前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、
前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、
前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項３】
コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、
レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項４】
請求項２又は請求項３記載の共焦点顕微鏡装置において、前記コヒーレントではない光源は、ランプもしくはＬＥＤ光源であることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項５】
請求項２又は請求項３記載の共焦点顕微鏡装置において、前記第２の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項６】
請求項１又は請求項５記載の共焦点顕微鏡装置において、前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項７】
請求項１記載の共焦点顕微鏡において、前記第１のレーザ光源はＩＲパルスレーザであり、前記ビーム可変機構は、前記第２の走査光学系に設けられていることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項８】
請求項７記載の共焦点顕微鏡において、前記ビーム径可変機構から出力されたレーザ光の標本面上での深さ方向の強度分布を算出する深さ方向強度分布算出手段を更に備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項９】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
蛍光を励起するために標本に励起光を照射する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を所望の位置に照射する第２のステップと、
励起された標本を検出して画像化する第３のステップとを具備し、
前記第１のステップは、前記励起光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを更に含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１０】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
蛍光を励起するために標本に励起光を照射する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を所望の位置に照射する第２のステップと、
励起された標本を検出して画像化する第３のステップとを具備し、
前記第２のステップは、前記特異現象を発現させるための光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１１】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
回転ディスクを介して標本に励起光を照射し、ディスク走査により標本の蛍光像を取得する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を標本の所望の位置に照射する第２のステップとを具備することを特徴とする観察方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の観察方法において、前記第２のステップは、前記特異現象を発現させるための光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを更に含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１】
第１のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、
前記第１のレーザ光源とは異なる第２のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、
前記第１の走査光学系と前記第２の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項２】
コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の走査光学系と、
レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備し、
前記第１の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、
前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、
前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項３】
コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第１の光学系と、
レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第２の走査光学系とを具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項４】
請求項２又は請求項３記載の共焦点顕微鏡装置において、前記コヒーレントではない光源は、ランプもしくはＬＥＤ光源であることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項５】
請求項２又は請求項３記載の共焦点顕微鏡装置において、前記第２の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項６】
請求項１又は請求項５記載の共焦点顕微鏡装置において、前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項７】
請求項１記載の共焦点顕微鏡において、前記第１のレーザ光源はＩＲパルスレーザであり、前記ビーム可変機構は、前記第２の走査光学系に設けられていることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項８】
請求項７記載の共焦点顕微鏡において、前記ビーム径可変機構から出力されたレーザ光の標本面上での深さ方向の強度分布を算出する深さ方向強度分布算出手段を更に備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項９】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
蛍光を励起するために標本に励起光を照射する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を所望の位置に照射する第２のステップと、
励起された標本を検出して画像化する第３のステップとを具備し、
前記第１のステップは、前記励起光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを更に含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１０】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
蛍光を励起するために標本に励起光を照射する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を所望の位置に照射する第２のステップと、
励起された標本を検出して画像化する第３のステップとを具備し、
前記第２のステップは、前記特異現象を発現させるための光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１１】
共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
回転ディスクを介して標本に励起光を照射し、ディスク走査により標本の蛍光像を取得する第１のステップと、
特異現象を発現させるための光を標本の所望の位置に照射する第２のステップとを具備することを特徴とする観察方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の観察方法において、前記第２のステップは、前記特異現象を発現させるための光の標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを更に含むことを特徴とする観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２７７１０３（Ｐ２０１０−２７７１０３Ａ）
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５８８５４（Ｐ２０１０−１５８８５４）
【出願日】平成２２年７月１３日（２０１０．７．１３）
【分割の表示】特願２００３−８６２１２（Ｐ２００３−８６２１２）の分割
【原出願日】平成１５年３月２６日（２００３．３．２６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１３日（２０１０．７．１３）
【分割の表示】特願２００３−８６２１２（Ｐ２００３−８６２１２）の分割
【原出願日】平成１５年３月２６日（２００３．３．２６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]