分岐キトサン誘導体
【課題】分岐キトサン誘導体、その製造方法およびその用途を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規分岐キトサン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。さらに詳しくは、キトサン側鎖を有するキトサン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンはＮ−アセチルグルコサミンを繰り返しユニットとする天然由来のムコ多糖の一つである。キトサンも天然由来のムコ多糖の一つであるが、工業的にはキチンの脱アセチル化により製造されている。キチン、キトサンの材料特性は分子量分布、Ｎ−アセチル基の置換度の他、化学修飾により導入した機能性置換基により制御されることが知られている。遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤などの開発をめざした機能化の例も知られているが、水溶性（生体に適した溶媒への溶解性）と機能性（ポリアミンの特性、低粘性）の両立が不十分であったり（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２等参照）、キチン、キトサン以外の分子構造を含む（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５等参照）などの問題があった。
【０００３】
キトサンの水溶性向上技術に関する既存技術との比較を表１にまとめた。水溶性改善のためには親水性基を導入する方法が一般的であり、その中でもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の導入が代表例である（非特許文献６等参照）。しかし、キトサンに対するＰＥＧの割合など、良好な水溶性を付与するには適用可能範囲が限られる。一方、単糖、二糖、オリゴ糖などの比較的短い鎖長の糖側鎖の導入（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２等参照）の効果は限定的であり、不十分である。またキトサンオリゴ糖は、非常に高価であり実用的ではない。キトサンを亜硝酸分解して得られる低分子化物を側鎖に導入する方法は簡便ではあるが（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５等参照）、亜硝酸分解すると還元末端が２、５−デヒドロ−Ｄ−マンノフラノース残基に変質しているため、キトサン鎖とは異なる構造である。
【表１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００２７８８９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biomacromol., 2, 1133-1136, 2001.
【非特許文献２】Trends Glycosci. Glycotechnol., 14, 331-341, 2002.
【非特許文献３】J. Biomed. Mater. Res. A, 82, 201-212 2007.
【非特許文献４】Acta Biomaterialia, 5, 1575-1581 2009.
【非特許文献５】Biomacromol., 9, 3268-3276, 2008.
【非特許文献６】Carbohydr. Polym., 36, 49-59, 1998.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、水溶性（生体に適した溶媒への溶解性）と機能性（ポリアミンの特性、低粘性）が両立した、新規なキトサン誘導体を開発し、多方面に利用することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
キチン、キトサン（化１）はそのままでは水溶性が十分ではなく、また分子量の増大に伴い粘度が大きく上昇するため、応用、利用範囲の拡大に制限があった。
【化１】
【０００８】
すなわち、キチン（化１で、ｘ＋ｙ＝１、一般にｘ＜０．１）は通常の溶媒に難溶であり、キトサン（化１で、ｘ＋ｙ＝１、一般にｙ＜０．２）は、酸性では水溶性を示すものの中性からアルカリ性域では難溶である。本発明者らは、上記解決課題に鑑みて、この問題について種々検討した結果、比較的分子量の大きいキトサン（ＨＭＷ−キトサン）と比較的分子量の小さいキトサン（ＬＭＷ−キトサン）との還元的Ｎ−アルキル化反応により、良好な水溶性とその水溶液が低い粘度を示す新規な分岐キトサン誘導体が得られることを見出した。さらに、本発明者らは、従来のキトサンは酸を用いて溶解させる必要があり、脱アセチル化度（ＤＤＡ）約５０％の部分アセチル化キトサンまたは部分脱アセチル化キチン（化１で、ｘ＝ｙ＝約０．５）の場合のみ中性の水に可溶であったが、分岐キトサン誘導体は、酸性水溶液への溶解性が改善されたのみならず、中性の水に対する良好な溶解・分散性を有することも見出した。加えて、本発明者らは、分岐キトサン誘導体が、免疫系を活性化させる作用を有するという、意外かつ顕著な効果も見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は下記のものを提供する：
（１）式（Ｉ）：
【化２】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
【化３】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、分岐キトサン誘導体；
（２）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む、低粘度キトサン組成物；
（３）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む、免疫系活性化剤；
（４）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む飲食物；ならびに
（５）主鎖用キトサンと、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサンとを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、分岐キトサン誘導体の製造方法；
（６）主鎖用キトサンの重量平均分子量が４５０ｋＤａよりも小さいものである、（５）記載の製造方法；
（７）主鎖用キトサンの重量平均分子量が８０ｋＤａないし１９０ｋＤａの範囲である、（５）記載の製造方法；ならびに
（８）（５）〜（７）のいずれかに記載の方法により得られる分岐キトサン誘導体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分岐キトサン誘導体はカニ殻、エビ殻由来のキチン、キトサンとその低分子化物を原料とするため、アミノ基のアセチル化度を調整することも容易であり、溶解性を制御することも可能である。本発明の分岐キトサン誘導体は水に対する溶解度が大きく、特に中性付近での溶解度が大きい。本発明の分岐キトサン誘導体の水溶液の粘度も低い。したがって、本発明の分岐キトサン誘導体は、従来キチン、キトサンが利用されていた領域、例えば創傷治癒剤、生体内充填剤、生体接着剤やコーティング剤、さらには医薬品などへの、さらに幅広い応用が可能であり、これを用いて優れた特性を有する製品を製造することができる。加えて、本発明の分岐キトサン誘導体は顕著な免疫系活性化効果を有するので、これを用いて優れた医薬品、健康食品などを製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分岐キトサン誘導体の蛍光スペクトルを示す（励起波長 ５１０ｎｍ）。
【図２】図２は、直鎖型のＨＭＷ−キトサンと分岐キトサンの粘度の比較を示すグラフである。
【図３】図３は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合のＣＤ４＋細胞の割合を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】図４は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合のＮＫ細胞の割合を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合の血清ＩＬ−６増加活性を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合の血清ＴＮＦ−α増加活性を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、式（Ｉ）：
【化４】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
【化５】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、新規な分岐キトサン誘導体を提供する。
【００１３】
本発明の分岐キトサン誘導体は、グルコサミン残基（本明細書において「キトサンユニット」または「ＧｌｃＮ」と称する場合がある）、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（本明細書において「キチンユニット」または「ＧｌｃＮａｃ」と称する場合がある）、および式（ＩＩ）で示されるＲ１基が２−位のＮに結合したグルコサミン残基が結合したものである。本発明の分岐キトサン誘導体中のこれらの残基の割合は、ｘ、ｙ、ｚで示され、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１である。
【００１４】
ｘおよびｙの割合は、本発明の分岐キトサン誘導体の製造に使用する原料キトサンの種類によって異なり、また、原料キトサンまたは生成した分岐キトサン誘導体をアセチル化または脱アセチル化することによりコントロールすることができる。分岐残基の割合ｚは（分岐キトサン誘導体中の分岐残基数）／（分岐キトサン誘導体中の全残基数）によって定義されるものであり、本発明の分岐キトサン誘導体の製造方法に関して説明する、原料であるＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンの量比を変更することによって、変更可能である。
【００１５】
ａの値は分岐鎖の長さを規定する。通常は、ａは１ないし５００である。ａの値が大きいほど分岐鎖が長くなる。直鎖型またはそれに近い分岐キトサン誘導体は分子鎖どうしが絡まりやすいので水溶液が高粘度となる傾向があり、球状またはそれに近い分岐キトサン誘導体は分子鎖どうしが絡まりにくいので水溶液が低粘度となる傾向があると考えられる。したがって、水溶液の粘度を低くするためにはａの値をある程度大きくする必要があると思われる。
（ａに関する記載は正しいでしょうか）
【００１６】
本発明の分岐キトサン誘導体の分子量は、用途や必要な物性に応じて幅広く選択あるいは調節することができる。かかる分子量の選択あるいは調節は、本発明の分岐キトサン誘導体の原料である主鎖用キトサン（本明細書において「ＨＭＷ−キトサン」と称することがある）と側鎖用キトサン（本明細書において「ＬＭＷ−キトサン」と称することがある）の分子量を選択あるいは調節すること、あるいは還元剤の種類、反応温度、反応時間などの反応条件を選択することによってコントロール可能である（下記の製造方法に関する説明も参照のこと）。一般に、キチンあるいはキトサンの分子量は、酸、アルカリあるいは酵素でのキチン、キトサンの加水分解の条件を調節することによって調節することができ、その手法は当業者に公知である。また、ＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が約４５０ｋＤａよりも大きい場合は、分岐キトサン誘導体の水溶性が低下し、その水溶液の粘度が上昇する傾向がある。
【００１７】
本発明の分岐キトサン誘導体は、式（Ｉ）で示されるもののほか、その修飾体を包含する。ただし、これらの修飾体が式（Ｉ）に示される本発明の分岐キトサン誘導体の性質を保持していることが条件である。例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上が式（Ｉ）に示されるもの以外の残基であってもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上において、２−位のＮを介して配糖体が形成されていてもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上において、水酸基がメチル化等の修飾を受けていてもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上が非天然型の糖残基であってもよい。また例えば、構成糖残基を連結している結合の１つまたはそれ以上がα−１，４結合以外のものであってもよい。
【００１８】
本発明は、もう１つの態様において、主鎖用キトサン（ＨＭＷ−キトサン）と、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサン（ＬＭＷ−キトサン）とを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、上記の分岐キトサン誘導体の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の分岐キトサン誘導体の原料であるＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンは、キチンを公知の方法に従って脱アセチル化して用いても良いが、市販キトサンをそのまま用いることができる。また、市販品のキトサンを用いる場合にも、アセチル化反応又は脱アセチル化反応を行って、キトサンユニット及びキチンユニットの割合を所望の値に調整することができる。従って、本発明で用いるキトサンの脱アセチル化度は特に限定されず、好ましくは５％以上、より好ましくは３０〜９９％の脱アセチル化度を有するものであればよい。なお、キトサンの脱アセチル化度は、例えば、プロトン核磁気共鳴分析により測定することができる。なお、ＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンは直鎖型であってもよいが、すでに側鎖キトサンが付いた分岐キトサン誘導体であってもよい。
【００２０】
本発明の分岐キトサン誘導体の製造に供されるＨＭＷ−キトサンキトサンは、取り扱い易さの観点から、重量平均分子量（Ｍｗ）は約５，０００〜約６００，０００が好ましく、約５，０００〜約２００，０００がより好ましい。また、数平均分子量（Ｍｎ）は約１，０００〜約５００，０００が好ましく、約２，０００〜約１００，０００がより好ましいが、これらの分子量に限定されない。ただし、ＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が約４５０ｋＤａよりも大きい場合は、得られる分岐キトサン誘導体の水溶性が低下し、その水溶液の粘度が上昇する傾向があるので、用いるＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量は約４５０ｋＤａ未満であることが好ましく、例えば、約８０ｋＤａ以上約４５０ｋＤａ未満であってもよい。また、ＬＭＷ−キトサンの分子量（重量平均分子量または数平均分子量）は、ＨＭＷ−キトサンのそれよりも小さいものである。通常は、ＬＭＷ−キトサンに含まれる糖残基数は１ないし約５００個である。キトサンの重量平均分子量及び数平均分子量は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することができる。ＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンの分子量（あるいはＬＭＷ−キトサンに含まれる糖残基数）は、製造すべき分岐キトサン誘導体の用途や必要な物性に応じて変更することができる。
【００２１】
分岐型キトサンは、分岐度ｚが約０．０１〜約０．６であるものが好ましく、約０．０２〜約０．５がより好ましい。分岐度は、還元的Ｎ−アルキル化反応に用いるキトサン側鎖の量を調節することにより調整することができる。本明細書において、キトサンの分岐度は、例えば、プロトン核磁気共鳴分析及び元素分析に基づいて算出することができる。
【００２２】
ＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンとの還元的Ｎ−アルキル化反応を行うことにより、本発明の分岐キトサン誘導体（式（Ｉ））を得ることができる。還元的Ｎ−アルキル化反応は、還元剤の存在下で行われ、還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素とＰｄ／Ｃ（パラジウム／カーボン）触媒などが挙げられるが、これらに限定されない。還元剤の存在量は、その種類にもよるが、各反応に供される原料１００重量部に対して、５〜５０重量部が好ましく、５〜２０重量部がより好ましい。
【００２３】
還元的Ｎ−アルキル化反応に供するＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンとの量比は、目的とする分岐キトサンの分岐度〔式（Ｉ）におけるｚ〕に応じて、適宜決定することができる。例えば、式（Ｉ）におけるｚが０．３である場合には、反応に供するＨＭＷ−キトサンの糖残基数の合計とＬＭＷ−キトサンのモル比（親水性基／分岐キトサン誘導体の全糖残基）が０．３／１以上となる割合で両者を反応させればよい。
【００２４】
なお、上記製造方法で得られた分岐キトサン誘導体は、公知の方法に従って精製してもよく、例えば、得られた未精製の誘導体を有機溶媒（例、アセトン）中で攪拌した後、吸引ろ過、減圧乾燥することにより精製することができる。本発明の分岐キトサン誘導体は、常法を用いて粉末、溶液、懸濁液などの形態に加工することができる。
【００２５】
本発明の分岐キトサン誘導体は、直鎖状キトサンに比べて水溶性が高く、水溶液の粘度が低いという特徴を有する。この点において、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む低粘度キトサン組成物を提供する。該組成物の溶媒の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液、ブドウ糖水溶液、酢酸水溶液、ビタミンＣ水溶液、クエン酸水溶液などの酸性水溶液、アルコール類、グリコールエーテル類などの各種極性溶媒等、あるいはこれらの混合物が挙げられる。本発明の上記組成物には、必要性や用途に応じて、ｐＨ調整用バッファー、塩類または糖類などの等張性調整物質、保存料、ビタミンＣ、ビタミンＢ群などの水溶液ビタミン、アラニン、グルタミン酸などのアミノ酸、水溶性ゼラチン、ペプチド、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、キサンタンガム、グアーガムなどの各種多糖類等を含んでいてもよい。上記組成物は、従来キチン、キトサンが利用されていた領域のみならず医薬品や飲食品あるいは化粧品などの分野においても利用可能である。本発明は、例えば、遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤の他、創傷治癒材、生体適合性フィルム、コーティング材、保湿剤、抗菌剤、吸着剤、ならびに生体免疫活性化剤などの医薬品、健康食品等の製造において利用可能である。
【００２６】
本発明の分岐キトサン誘導体は、顕著な生体免疫系活性化作用を有する。したがって、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む免疫系活性化剤を提供する。本発明の免疫系活性化剤は、本発明の分岐キトサン誘導体を適当な担体または賦形剤と混合して調製することができる。本発明の免疫系活性化剤の剤形は特に制限はなく、液体（例：溶液、懸濁液）、固体（例：粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤）、半固体（例：パスタ、軟膏、チューブ入り）とすることができる。これらの剤形の製造方法は当業者に公知であり、容易に製造することができる。本発明の免疫系活性化剤はあらゆる動物に投与することができる。投与経路は特に制限はないが、経口投与が好ましい。例えば、ヒトに経口投与する場合において、本発明の分岐キトサン誘導体の用量は、医師が患者の状態を見ながら適宜決定することができる。例えば、本発明の分岐キトサン誘導体のヒトへの投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／体重／日であってもよく、１日に１回〜数回に分けて投与することもできる。免疫系活性化が必要な期間中、本発明の免疫系活性化剤を投与することができる。
【００２７】
本発明の分岐キトサン誘導体は天然素材キチン、キトサンに由来するものである。したがって、本発明の分岐キトサン誘導体は医薬組成物のほか、飲食物に用いることもできる。この点において、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物を提供する。飲食物の種類は特に限定されず、例えば、ドリンクやジュースであってもよく、調味料の形態であってもよい。さらに、本発明の分岐キトサン誘導体を食品原料や素材に直接添加してもよく、できあがった食品に添加してもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体を、クッキー、ビスケット、ケーキなどの菓子類や、インスタントスープやインスタント味噌汁の粉の成分として用いてもよい。本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物は健康食品やいわゆる「トクホ」を包含する。また、本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物はサプリメントの形態であってもよい。サプリメントの製造は、上記医薬組成物の製造方法に準じて行うことができる。
【００２８】
本明細書における用語の意味は、当該分野において一般に認識されている意味に解される。
【００２９】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでの例示説明であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１（分岐キトサン誘導体１ａの合成）
キトサン（１．２０ｇ、アミノ基として６．９９ｍｍｏｌ）〔甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ Ｌ０５２６１、脱アセチル化度（ＤＤＡ） ９５％、重量平均分子量（Ｍｗ） ８０，０００、数平均分子量（Ｍｎ） ２１，０００〕の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．３３ｇ、還元末端残基として３．１７ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（１．６５ｇ、ＤＤＡ ７８％）。分岐型キトサンのプロトン核磁気共鳴スペクトル及び赤外吸収スペクトルを以下に示す。
【００３１】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ２．０７（ＮＨＣＯＣＨ３のＣＨ３由来）、３．１９（ＧｌｃＮのＣ（２）位のＨ）、３．８０−４．２０（ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ（２）位及び糖残基のＣ（３）、Ｃ（４）、Ｃ（５）、Ｃ（６）位のＨ）。
【００３２】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３７００−３１００、２９３１、２８８７、１６４０、１５４８、１４１７、１３８３、１３１９、１１５５、１０７２、１０３１、９２０ｃｍ−１。
【００３３】
なお、各ユニットの構成比率は、以下のように算出した。まず、キトサン誘導体（分岐型キトサン誘導体）のｚを、下記に示す式Ａ、式Ｂにより求めた。
脱アセチル化度（ＤＤＡ）（％）＝［（分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基数）／ＴＲ］×１００ （式Ａ）
ｚ＝（分岐残基数）／ＴＲ （式Ｂ）
ここで、ＴＲは分岐型キトサン誘導体の総残基数を意味する。分岐残基数は、分岐鎖が結合する残基数を意味し、側鎖の本数と同じである。実施例１で用いた原料キトサンのうち、分子量の大きい方を主鎖キトサン、小さい方を側鎖キトサンとすると、主鎖キトサン（ＤＤＡ ９５％、Ｍｎ ２１，０００）の平均残基分子量及び残基数は、グルコサミン残基分子量（ＦＷ）が１６１、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＦＷ）が２０３であることから
主鎖キトサンの平均残基分子量＝１６１×０．９５＋２０３×０．０５＝１６３．１
主鎖キトサンの残基数＝２１０００／１６３．１＝１２９
となる。一方、側鎖キトサン（ＤＤＡ ７１％、Ｍｎ ２，０００）の平均残基分子量及び残基数は、同様にして算出すると、
側鎖キトサンの平均残基分子量＝１６１×０．７１＋２０３×０．２９＝１７３．２
側鎖キトサンの残基数＝２０００／１７３．２＝１１．５
となる。また、主鎖キトサンの残基数に対する分岐鎖キトサンの本数の割合をＤＳとすると、分岐型キトサン誘導体の総残基数、ＴＲは
ＴＲ＝（主鎖の残基数）＋（全側鎖の残基数を合計したもの）
＝（主鎖の残基数）＋［（側鎖の残基数）×（側鎖の本数）］
＝（主鎖の残基数）＋［（側鎖の残基数）×〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］
＝１２９＋［１１．５×〔１２９×ＤＳ〕］
と表わすことができる。実施例１で得られた分岐型キトサンのＤＤＡは７８（％）であることから、式Ａに上記ＴＲを代入すると
７８＝（分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基数）／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋（全側鎖のＧｌｃＮ残基数を合計したもの）〕／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋［（側鎖のＧｌｃＮ残基数）×（側鎖の本数）］／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋［（側鎖のＧｌｃＮ残基数）×〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］／ＴＲ×１００
＝〔（１２９×０．９５）＋［（１１．５×０．７１）×〔１２９×ＤＳ〕］／１２９＋［１１．５×〔１２９×ＤＳ〕］×１００
となる。これより、ＤＳ＝０．２１と算出でき、さらにこの値を代入して、ＴＲ＝４４０となる。また、式Ｂは、
ｚ＝（分岐残基数）／ＴＲ
＝（側鎖の本数）／ＴＲ
＝〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］／ＴＲ
＝〔１２９×０．２１〕／４４０
＝０．０６
となった。
【００３４】
次に、分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮＡｃ残基、即ち、キチンユニットに対応するｙの値は、脱アセチル化度（ＤＤＡ）との間に、ｙ＝１−ＤＤＡ／１００の関係にある。また、１Ｈ−ＮＭＲ分析における［３．１９（ＧｌｃＮ残基のＣ（２）位のＨ）のピーク面積］と、［２．０７（ＧｌｃＮＡｃ残基のＮＨＣＯＣＨ３のＣＨ３由来）のピーク面積］との比率からも算出することができる。この関係は、分岐型キトサンから合成された分岐型キトサン誘導体の１Ｈ−ＮＭＲ分析においても同じであり、ｙ＝０．２２となった。
【００３５】
また、ｙ＝０．２２と算出されたことにより、分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基に対応する（ｘ＋ｚ）の値は、ｘ＋ｚ＝１−ｙ＝０．７８と算出される。一方、１Ｈ−ＮＭＲ分析におけるＧｌｃＮ残基に対応するピーク、即ち、［３．１９（ＧｌｃＮ残基のＣ（２）位のＨ）のピーク］は、キトサンユニット、分岐ユニットのいずれにおいても観測されるピークであるため、該ピークの面積は前記２ユニットの合計量と考えることができる。よって、ｘはｘ＝０．７８−０．０６＝０．７２となった。
【実施例２】
【００３６】
実施例２（分岐キトサン誘導体１ｂの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．３ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、「キトサン５」Ｌｏｔ ＴＳＱ４６３８、ＤＤＡ ８６％、Ｍｗ １００，０００、Ｍｎ ２０，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（６．３３ｇ、還元末端残基として３．１５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．５６ｇ、ＤＤＡ ７７％）。
【００３７】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７１、ｙ＝０．２３、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例３】
【００３８】
実施例３（分岐キトサン誘導体１ｃの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．０ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、「ＳＫ−１０」Ｌｏｔ １０２３−１０、ＤＤＡ ８４％、Ｍｗ １４０，０００、Ｍｎ ３１，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（５．００ｇ、還元末端残基として２．５０ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２０ｇ、ＤＤＡ ７６％）。
【００３９】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．６９、ｙ＝０．２４、ｚ＝０．０７であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例４】
【００４０】
実施例４（分岐キトサン誘導体１ｄの合成）
キトサン（２．５２ｇ、アミノ基として１０．０ｍｍｏｌ）（共和テクノス社製、「Ｆｌｏｎａｃ−ｃ」Ｌｏｔ ９３−１−２０、ＤＤＡ ８４％、Ｍｗ １６０，０００、Ｍｎ ３７，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（６．３３ｇ、還元末端残基として３．１５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（３．２０ｇ、ＤＤＡ ７８％）。
【００４１】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７２、ｙ＝０．２２、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例５】
【００４２】
実施例５（分岐キトサン誘導体１ｅの合成）
キトサン（２．５２ｇ、アミノ基として６．１６ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、「ＤＡＣ−５０」Ｌｏｔ １０７３１１、ＤＤＡ ４５％、Ｍｗ １９０，０００、Ｍｎ ８８，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．３３ｇ、還元末端残基として３．１７ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（３．２５ｇ、ＤＤＡ ５８％）。
【００４３】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．５６、ｙ＝０．４２、ｚ＝０．０４であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例６】
【００４４】
実施例６ （分岐キトサン誘導体１ｆの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．３ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、ＦＭ−８０Ｌ Ｌｏｔ ０８１７−１８、ＤＤＡ ８６％、Ｍｗ ４５０，０００、Ｍｎ ８２，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．５０ｇ、還元末端残基として３．２５ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２５ｇ、ＤＤＡ ７５％）。
【００４５】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．６９、ｙ＝０．２５、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例７】
【００４６】
実施例７ （分岐キトサン誘導体１ｇの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、ＦＨ−８０ Ｌｏｔ １２０８−１５、ＤＤＡ ８７％、Ｍｗ ６５０，０００、Ｍｎ ７３，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．５０ｇ、還元末端残基として３．２５ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２５ｇ、ＤＤＡ ７６％）。
【００４７】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７０、ｙ＝０．２４、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【００４８】
以上の実施例で得られた分岐キトサン誘導体を表２にまとめた。
【表２】
【００４９】
新規分岐キトサン誘導体１は、主鎖であるＨＭＷ−キトサンのアミノ基と側鎖となるＬＭＷ−キトサンの還元末端との反応により合成されるため、反応の初期の生成物を模式的に示すと下式のＡのようなくし型の構造と考えられる。しかし、その側鎖キトサンに存在するアミノ基も主鎖キトサンに存在するアミノ基と同じ反応性をもち、しかも立体障害を考慮すると側鎖キトサンに存在するアミノ基の方が有利であると考えられるので、反応の進行に伴い分岐型のＢ、さらに多重分岐型のＣの構造に進化すると考えられる。多重分岐型のＣの構造は、従来のくし型の構造Ａにおける置換度（ＤＳ）では認識が困難であり、分岐残基の割合ｚ（表２）を下記のように定義した。なお、上記考察は本発明を限定するものではない。
ｚ＝（分岐キトサン誘導体１中の分岐残基数）／（分岐キトサン誘導体１中の全残基数）
【化６】
【実施例８】
【００５０】
実施例８ 本発明の分岐キトサン誘導体が主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことの証明
表２に示したｚの値は、原料キトサンの脱アセチル化度（ＤＤＡ）と生成物１の脱アセチル化度（ＤＤＡ）との比較により計算できる。しかし、主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことの直接的な証明は容易ではない。よって、下のスキームに示すように主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンを、異なる蛍光波長をもつ蛍光プローブで標識したＲ−６ とＦＩＴＣ−８を原料に用いて分岐キトサン誘導体１１を合成した。図１に示したように生成物１１の蛍光スペクトルには、Ｒ−６ とＦＩＴＣ−８に固有の蛍光波長（５７０ｎｍ付近と５３０ｎｍ付近）が両方とも観測されたことから、分子内に主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことを確認することができた。
【化７】
【実施例９】
【００５１】
実施例９ 本発明の分岐キトサン誘導体水溶液の粘度測定
本発明で得られた分岐キトサン誘導体の溶解性と１％酢酸水溶液に溶かした溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の粘度を、表３に示した。原料のＨＭＷ−キトサンはいずれも中性の水に溶解しないことから、本発明による多重分岐化は水溶性向上効果が大きいと言える。酸を用いることなく中性水溶液化できることは、本発明の分岐キトサン誘導体の材料としての応用範囲を拡大するものである。
【表３】
【００５２】
本発明で得られた分岐キトサン誘導体溶液の粘度と直鎖型のＨＭＷ−キトサン溶液の粘度を図２において比較した。原料に用いた直鎖型のＨＭＷ−キトサンの粘度は、その分子量が増大するに伴い増大した。しかし、分岐キトサンの粘度はこの範囲ではほぼ一定の値を示した。しかし、表３のＥｎｔｒｙ ６と７のように、原料に用いた直鎖型のＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が４５０ｋＤａよりも大きい場合は水溶性が低下し、大きく粘度が上昇した。従来、キトサンの分子量増大による溶解度低下および溶液粘度の上昇は、注射、注入などの利用方法を制限してきた問題点であったが、本発明によりこの問題が解決された。本発明の分岐キトサン誘導体の応用範囲は、従来のキチン、キトサン系の材料の応用範囲よりもはるかに拡大されたものといえる。
【実施例１０】
【００５３】
実施例１０ 本発明の分岐キトサン誘導体の免疫系活性化作用
（１）実験方法
（ａ）マウスへの投与ならびに生体サンプルの採取
ＩＣＲマウス（メス、１０週齢）を１週間以上予備飼育した後、実験に供した。マーゲンゾンデを用いて分岐キトサン誘導体（表２のＩａ）、ＨＭＷ−キトサン（Ｍｗ＝８０，０００）、ＬＭＷ−キトサン（Ｍｗ＝８，０００）を、それぞれ２ｍｇ／０．２ｍｌ／ｈｅａｄで、１日１回３日間連続して胃内投与した。コントロール群としては、分岐キトサン誘導体群およびＬＭＷ−キトサン群に対しては水投与群、ＨＭＷ−キトサン群に対しては酢酸水溶液投与群を用いた。３回目投与１〜２時間後にジエチルエーテル麻酔下にて心臓穿刺法にて血液を採取し、血液採取後に脾臓を摘出した。採取した血液から常法にて血清を得て、血清サイトカイン濃度の測定に供した。本発明の分岐キトサン誘導体を上記のごとく動物に投与した場合、動物に対する毒性は認められなかった。
【００５４】
（ｂ）脾細胞の調製
摘出した脾臓はＦＢＳ０．５％加ＰＢＳ（以下ＰＢＳ）に浸し（３〜４ｍｌ）、ピンンセットを用いて周囲の結合組織を取り除いた。ＰＢＳを交換し（３〜４ｍｌ）、２４Ｇ注射針ならびに１ｍｌプラスチックシリンジの内筒を用いて細胞を浮遊させた。浮遊した細胞液を４２μｍナイロンメッシュで濾過し１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。溶血剤を加えよく混和し、同様に遠心分離した。上清を捨てＰＢＳを加え、同様に再び遠心分離した。細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるようにＰＢＳにて希釈し、細胞液とした。
【００５５】
溶血剤は以下のようにして調製した。ＮＨ４Ｃｌ ８２．９ｇ、ＫＨＣＯ３ １０ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（株式会社同仁化学研究所、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）０．３７２ｇを１リットルの超純粋水に溶解し４℃で保存した。使用時にはさらに超純粋水で１０倍希釈した。
【００５６】
（ｃ）免疫細胞活性の測定
以下の抗体を使用した：
ＣＤ４＋細胞（ヘルパーＴ細胞）活性測定用としてＦＩＴＣ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ４：ＢＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）；および
ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞活性測定用としてＲＡＴ ＡＮＴＩ ＭＯＵＳＥ ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ：ＦＩＴＣ（フナコシ株式会社、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。
各抗体は最終希釈倍率が１：２００となるようにＰＢＳにて希釈して抗体液とした。エッペンドルフチューブに細胞液（（ｂ）で調製）１００μｌおよび抗体液１００μｌを加え、遮光し４℃で２０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳを５００μｌ加えよく混和し、４℃にて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清除去後ＰＢＳを５００μｌ加え、測定に供した。フローサイトメトリーを用いて蛍光強度を測定することにより各免疫細胞の割合を測定した。
【００５７】
（ｄ）血清サイトカイン濃度測定
上記（ａ）で得た血清サンプルに、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｔｈ１／Ｔｈ２ １０ｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ｂｅｎｄｅｒｍｅｄｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を適用して、製造元の指示に従ってインターロイキン−６（ＩＬ−６）およびＴＮＦ−α量を測定した。
【００５８】
（２）実験結果
ヘルパーＴ細胞の割合は分岐キトサン誘導体で有意に上昇し、コントロール（蒸留水群）の２倍近い割合となった。ＨＭＷ−キトサンは酢酸の成績と差がなく、ＬＭＷ−キトサンにも効果は認められなかった（図３）。ＮＫ細胞の割合は分岐キトサン誘導体でコントロール、ＨＭＷ−キトサンよりも有意に上昇し、コントロール（蒸留水群）の約１２倍の割合となった（図４）。血清ＩＬ−６、ＴＮＦ−α量も分岐キトサン誘導体で有意に増加し、ＩＬ−６はコントロール（蒸留水群）よりも約１５倍増加し、ＴＮＦ−αはコントロール（蒸留水群）よりも約１０倍増加した（図５、図６）。以上の結果から分岐キトサン誘導体は明らかにヘルパーＴ細胞のＴｈ−１、Ｔｈ−２を活性化させ、バランスとしては細胞性免疫を賦活する成績が得られた。この活性効果はＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンにはなく、分岐キトサン誘導体独自の特徴である。このように、本発明の分岐キトサン誘導体は顕著な生体免疫系活性化作用を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、キトサンに多重分岐構造を付与することにより水溶性の向上と水溶液の粘性を低く保つ分子形態の両立を達成したものである。したがって、従来キチン、キトサンが利用されていた領域のみならず医薬品や飲食品などの分野においても利用可能である。本発明は、例えば、遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤の他、創傷治癒材、生体適合性フィルム、コーティング材、ならびに生体免疫活性化剤などの医薬品、健康食品等の製造において利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規分岐キトサン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。さらに詳しくは、キトサン側鎖を有するキトサン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンはＮ−アセチルグルコサミンを繰り返しユニットとする天然由来のムコ多糖の一つである。キトサンも天然由来のムコ多糖の一つであるが、工業的にはキチンの脱アセチル化により製造されている。キチン、キトサンの材料特性は分子量分布、Ｎ−アセチル基の置換度の他、化学修飾により導入した機能性置換基により制御されることが知られている。遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤などの開発をめざした機能化の例も知られているが、水溶性（生体に適した溶媒への溶解性）と機能性（ポリアミンの特性、低粘性）の両立が不十分であったり（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２等参照）、キチン、キトサン以外の分子構造を含む（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５等参照）などの問題があった。
【０００３】
キトサンの水溶性向上技術に関する既存技術との比較を表１にまとめた。水溶性改善のためには親水性基を導入する方法が一般的であり、その中でもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の導入が代表例である（非特許文献６等参照）。しかし、キトサンに対するＰＥＧの割合など、良好な水溶性を付与するには適用可能範囲が限られる。一方、単糖、二糖、オリゴ糖などの比較的短い鎖長の糖側鎖の導入（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２等参照）の効果は限定的であり、不十分である。またキトサンオリゴ糖は、非常に高価であり実用的ではない。キトサンを亜硝酸分解して得られる低分子化物を側鎖に導入する方法は簡便ではあるが（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５等参照）、亜硝酸分解すると還元末端が２、５−デヒドロ−Ｄ−マンノフラノース残基に変質しているため、キトサン鎖とは異なる構造である。
【表１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００２７８８９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biomacromol., 2, 1133-1136, 2001.
【非特許文献２】Trends Glycosci. Glycotechnol., 14, 331-341, 2002.
【非特許文献３】J. Biomed. Mater. Res. A, 82, 201-212 2007.
【非特許文献４】Acta Biomaterialia, 5, 1575-1581 2009.
【非特許文献５】Biomacromol., 9, 3268-3276, 2008.
【非特許文献６】Carbohydr. Polym., 36, 49-59, 1998.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、水溶性（生体に適した溶媒への溶解性）と機能性（ポリアミンの特性、低粘性）が両立した、新規なキトサン誘導体を開発し、多方面に利用することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
キチン、キトサン（化１）はそのままでは水溶性が十分ではなく、また分子量の増大に伴い粘度が大きく上昇するため、応用、利用範囲の拡大に制限があった。
【化１】
【０００８】
すなわち、キチン（化１で、ｘ＋ｙ＝１、一般にｘ＜０．１）は通常の溶媒に難溶であり、キトサン（化１で、ｘ＋ｙ＝１、一般にｙ＜０．２）は、酸性では水溶性を示すものの中性からアルカリ性域では難溶である。本発明者らは、上記解決課題に鑑みて、この問題について種々検討した結果、比較的分子量の大きいキトサン（ＨＭＷ−キトサン）と比較的分子量の小さいキトサン（ＬＭＷ−キトサン）との還元的Ｎ−アルキル化反応により、良好な水溶性とその水溶液が低い粘度を示す新規な分岐キトサン誘導体が得られることを見出した。さらに、本発明者らは、従来のキトサンは酸を用いて溶解させる必要があり、脱アセチル化度（ＤＤＡ）約５０％の部分アセチル化キトサンまたは部分脱アセチル化キチン（化１で、ｘ＝ｙ＝約０．５）の場合のみ中性の水に可溶であったが、分岐キトサン誘導体は、酸性水溶液への溶解性が改善されたのみならず、中性の水に対する良好な溶解・分散性を有することも見出した。加えて、本発明者らは、分岐キトサン誘導体が、免疫系を活性化させる作用を有するという、意外かつ顕著な効果も見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は下記のものを提供する：
（１）式（Ｉ）：
【化２】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
【化３】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、分岐キトサン誘導体；
（２）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む、低粘度キトサン組成物；
（３）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む、免疫系活性化剤；
（４）（１）記載の分岐キトサン誘導体を含む飲食物；ならびに
（５）主鎖用キトサンと、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサンとを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、分岐キトサン誘導体の製造方法；
（６）主鎖用キトサンの重量平均分子量が４５０ｋＤａよりも小さいものである、（５）記載の製造方法；
（７）主鎖用キトサンの重量平均分子量が８０ｋＤａないし１９０ｋＤａの範囲である、（５）記載の製造方法；ならびに
（８）（５）〜（７）のいずれかに記載の方法により得られる分岐キトサン誘導体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分岐キトサン誘導体はカニ殻、エビ殻由来のキチン、キトサンとその低分子化物を原料とするため、アミノ基のアセチル化度を調整することも容易であり、溶解性を制御することも可能である。本発明の分岐キトサン誘導体は水に対する溶解度が大きく、特に中性付近での溶解度が大きい。本発明の分岐キトサン誘導体の水溶液の粘度も低い。したがって、本発明の分岐キトサン誘導体は、従来キチン、キトサンが利用されていた領域、例えば創傷治癒剤、生体内充填剤、生体接着剤やコーティング剤、さらには医薬品などへの、さらに幅広い応用が可能であり、これを用いて優れた特性を有する製品を製造することができる。加えて、本発明の分岐キトサン誘導体は顕著な免疫系活性化効果を有するので、これを用いて優れた医薬品、健康食品などを製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分岐キトサン誘導体の蛍光スペクトルを示す（励起波長 ５１０ｎｍ）。
【図２】図２は、直鎖型のＨＭＷ−キトサンと分岐キトサンの粘度の比較を示すグラフである。
【図３】図３は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合のＣＤ４＋細胞の割合を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】図４は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合のＮＫ細胞の割合を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合の血清ＩＬ−６増加活性を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、分岐キトサン誘導体、ＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンを投与した場合の血清ＴＮＦ−α増加活性を比較したグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、式（Ｉ）：
【化４】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は式（ＩＩ）：
【化５】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、新規な分岐キトサン誘導体を提供する。
【００１３】
本発明の分岐キトサン誘導体は、グルコサミン残基（本明細書において「キトサンユニット」または「ＧｌｃＮ」と称する場合がある）、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（本明細書において「キチンユニット」または「ＧｌｃＮａｃ」と称する場合がある）、および式（ＩＩ）で示されるＲ１基が２−位のＮに結合したグルコサミン残基が結合したものである。本発明の分岐キトサン誘導体中のこれらの残基の割合は、ｘ、ｙ、ｚで示され、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１である。
【００１４】
ｘおよびｙの割合は、本発明の分岐キトサン誘導体の製造に使用する原料キトサンの種類によって異なり、また、原料キトサンまたは生成した分岐キトサン誘導体をアセチル化または脱アセチル化することによりコントロールすることができる。分岐残基の割合ｚは（分岐キトサン誘導体中の分岐残基数）／（分岐キトサン誘導体中の全残基数）によって定義されるものであり、本発明の分岐キトサン誘導体の製造方法に関して説明する、原料であるＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンの量比を変更することによって、変更可能である。
【００１５】
ａの値は分岐鎖の長さを規定する。通常は、ａは１ないし５００である。ａの値が大きいほど分岐鎖が長くなる。直鎖型またはそれに近い分岐キトサン誘導体は分子鎖どうしが絡まりやすいので水溶液が高粘度となる傾向があり、球状またはそれに近い分岐キトサン誘導体は分子鎖どうしが絡まりにくいので水溶液が低粘度となる傾向があると考えられる。したがって、水溶液の粘度を低くするためにはａの値をある程度大きくする必要があると思われる。
（ａに関する記載は正しいでしょうか）
【００１６】
本発明の分岐キトサン誘導体の分子量は、用途や必要な物性に応じて幅広く選択あるいは調節することができる。かかる分子量の選択あるいは調節は、本発明の分岐キトサン誘導体の原料である主鎖用キトサン（本明細書において「ＨＭＷ−キトサン」と称することがある）と側鎖用キトサン（本明細書において「ＬＭＷ−キトサン」と称することがある）の分子量を選択あるいは調節すること、あるいは還元剤の種類、反応温度、反応時間などの反応条件を選択することによってコントロール可能である（下記の製造方法に関する説明も参照のこと）。一般に、キチンあるいはキトサンの分子量は、酸、アルカリあるいは酵素でのキチン、キトサンの加水分解の条件を調節することによって調節することができ、その手法は当業者に公知である。また、ＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が約４５０ｋＤａよりも大きい場合は、分岐キトサン誘導体の水溶性が低下し、その水溶液の粘度が上昇する傾向がある。
【００１７】
本発明の分岐キトサン誘導体は、式（Ｉ）で示されるもののほか、その修飾体を包含する。ただし、これらの修飾体が式（Ｉ）に示される本発明の分岐キトサン誘導体の性質を保持していることが条件である。例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上が式（Ｉ）に示されるもの以外の残基であってもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上において、２−位のＮを介して配糖体が形成されていてもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上において、水酸基がメチル化等の修飾を受けていてもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体の構成糖残基の１つまたはそれ以上が非天然型の糖残基であってもよい。また例えば、構成糖残基を連結している結合の１つまたはそれ以上がα−１，４結合以外のものであってもよい。
【００１８】
本発明は、もう１つの態様において、主鎖用キトサン（ＨＭＷ−キトサン）と、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサン（ＬＭＷ−キトサン）とを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、上記の分岐キトサン誘導体の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の分岐キトサン誘導体の原料であるＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンは、キチンを公知の方法に従って脱アセチル化して用いても良いが、市販キトサンをそのまま用いることができる。また、市販品のキトサンを用いる場合にも、アセチル化反応又は脱アセチル化反応を行って、キトサンユニット及びキチンユニットの割合を所望の値に調整することができる。従って、本発明で用いるキトサンの脱アセチル化度は特に限定されず、好ましくは５％以上、より好ましくは３０〜９９％の脱アセチル化度を有するものであればよい。なお、キトサンの脱アセチル化度は、例えば、プロトン核磁気共鳴分析により測定することができる。なお、ＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンは直鎖型であってもよいが、すでに側鎖キトサンが付いた分岐キトサン誘導体であってもよい。
【００２０】
本発明の分岐キトサン誘導体の製造に供されるＨＭＷ−キトサンキトサンは、取り扱い易さの観点から、重量平均分子量（Ｍｗ）は約５，０００〜約６００，０００が好ましく、約５，０００〜約２００，０００がより好ましい。また、数平均分子量（Ｍｎ）は約１，０００〜約５００，０００が好ましく、約２，０００〜約１００，０００がより好ましいが、これらの分子量に限定されない。ただし、ＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が約４５０ｋＤａよりも大きい場合は、得られる分岐キトサン誘導体の水溶性が低下し、その水溶液の粘度が上昇する傾向があるので、用いるＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量は約４５０ｋＤａ未満であることが好ましく、例えば、約８０ｋＤａ以上約４５０ｋＤａ未満であってもよい。また、ＬＭＷ−キトサンの分子量（重量平均分子量または数平均分子量）は、ＨＭＷ−キトサンのそれよりも小さいものである。通常は、ＬＭＷ−キトサンに含まれる糖残基数は１ないし約５００個である。キトサンの重量平均分子量及び数平均分子量は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することができる。ＨＭＷ−キトサンおよびＬＭＷ−キトサンの分子量（あるいはＬＭＷ−キトサンに含まれる糖残基数）は、製造すべき分岐キトサン誘導体の用途や必要な物性に応じて変更することができる。
【００２１】
分岐型キトサンは、分岐度ｚが約０．０１〜約０．６であるものが好ましく、約０．０２〜約０．５がより好ましい。分岐度は、還元的Ｎ−アルキル化反応に用いるキトサン側鎖の量を調節することにより調整することができる。本明細書において、キトサンの分岐度は、例えば、プロトン核磁気共鳴分析及び元素分析に基づいて算出することができる。
【００２２】
ＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンとの還元的Ｎ−アルキル化反応を行うことにより、本発明の分岐キトサン誘導体（式（Ｉ））を得ることができる。還元的Ｎ−アルキル化反応は、還元剤の存在下で行われ、還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素とＰｄ／Ｃ（パラジウム／カーボン）触媒などが挙げられるが、これらに限定されない。還元剤の存在量は、その種類にもよるが、各反応に供される原料１００重量部に対して、５〜５０重量部が好ましく、５〜２０重量部がより好ましい。
【００２３】
還元的Ｎ−アルキル化反応に供するＨＭＷ−キトサンとＬＭＷ−キトサンとの量比は、目的とする分岐キトサンの分岐度〔式（Ｉ）におけるｚ〕に応じて、適宜決定することができる。例えば、式（Ｉ）におけるｚが０．３である場合には、反応に供するＨＭＷ−キトサンの糖残基数の合計とＬＭＷ−キトサンのモル比（親水性基／分岐キトサン誘導体の全糖残基）が０．３／１以上となる割合で両者を反応させればよい。
【００２４】
なお、上記製造方法で得られた分岐キトサン誘導体は、公知の方法に従って精製してもよく、例えば、得られた未精製の誘導体を有機溶媒（例、アセトン）中で攪拌した後、吸引ろ過、減圧乾燥することにより精製することができる。本発明の分岐キトサン誘導体は、常法を用いて粉末、溶液、懸濁液などの形態に加工することができる。
【００２５】
本発明の分岐キトサン誘導体は、直鎖状キトサンに比べて水溶性が高く、水溶液の粘度が低いという特徴を有する。この点において、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む低粘度キトサン組成物を提供する。該組成物の溶媒の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液、ブドウ糖水溶液、酢酸水溶液、ビタミンＣ水溶液、クエン酸水溶液などの酸性水溶液、アルコール類、グリコールエーテル類などの各種極性溶媒等、あるいはこれらの混合物が挙げられる。本発明の上記組成物には、必要性や用途に応じて、ｐＨ調整用バッファー、塩類または糖類などの等張性調整物質、保存料、ビタミンＣ、ビタミンＢ群などの水溶液ビタミン、アラニン、グルタミン酸などのアミノ酸、水溶性ゼラチン、ペプチド、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、キサンタンガム、グアーガムなどの各種多糖類等を含んでいてもよい。上記組成物は、従来キチン、キトサンが利用されていた領域のみならず医薬品や飲食品あるいは化粧品などの分野においても利用可能である。本発明は、例えば、遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤の他、創傷治癒材、生体適合性フィルム、コーティング材、保湿剤、抗菌剤、吸着剤、ならびに生体免疫活性化剤などの医薬品、健康食品等の製造において利用可能である。
【００２６】
本発明の分岐キトサン誘導体は、顕著な生体免疫系活性化作用を有する。したがって、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む免疫系活性化剤を提供する。本発明の免疫系活性化剤は、本発明の分岐キトサン誘導体を適当な担体または賦形剤と混合して調製することができる。本発明の免疫系活性化剤の剤形は特に制限はなく、液体（例：溶液、懸濁液）、固体（例：粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤）、半固体（例：パスタ、軟膏、チューブ入り）とすることができる。これらの剤形の製造方法は当業者に公知であり、容易に製造することができる。本発明の免疫系活性化剤はあらゆる動物に投与することができる。投与経路は特に制限はないが、経口投与が好ましい。例えば、ヒトに経口投与する場合において、本発明の分岐キトサン誘導体の用量は、医師が患者の状態を見ながら適宜決定することができる。例えば、本発明の分岐キトサン誘導体のヒトへの投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／体重／日であってもよく、１日に１回〜数回に分けて投与することもできる。免疫系活性化が必要な期間中、本発明の免疫系活性化剤を投与することができる。
【００２７】
本発明の分岐キトサン誘導体は天然素材キチン、キトサンに由来するものである。したがって、本発明の分岐キトサン誘導体は医薬組成物のほか、飲食物に用いることもできる。この点において、本発明は、本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物を提供する。飲食物の種類は特に限定されず、例えば、ドリンクやジュースであってもよく、調味料の形態であってもよい。さらに、本発明の分岐キトサン誘導体を食品原料や素材に直接添加してもよく、できあがった食品に添加してもよい。また例えば、本発明の分岐キトサン誘導体を、クッキー、ビスケット、ケーキなどの菓子類や、インスタントスープやインスタント味噌汁の粉の成分として用いてもよい。本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物は健康食品やいわゆる「トクホ」を包含する。また、本発明の分岐キトサン誘導体を含む飲食物はサプリメントの形態であってもよい。サプリメントの製造は、上記医薬組成物の製造方法に準じて行うことができる。
【００２８】
本明細書における用語の意味は、当該分野において一般に認識されている意味に解される。
【００２９】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでの例示説明であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１（分岐キトサン誘導体１ａの合成）
キトサン（１．２０ｇ、アミノ基として６．９９ｍｍｏｌ）〔甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ Ｌ０５２６１、脱アセチル化度（ＤＤＡ） ９５％、重量平均分子量（Ｍｗ） ８０，０００、数平均分子量（Ｍｎ） ２１，０００〕の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．３３ｇ、還元末端残基として３．１７ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（１．６５ｇ、ＤＤＡ ７８％）。分岐型キトサンのプロトン核磁気共鳴スペクトル及び赤外吸収スペクトルを以下に示す。
【００３１】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ２．０７（ＮＨＣＯＣＨ３のＣＨ３由来）、３．１９（ＧｌｃＮのＣ（２）位のＨ）、３．８０−４．２０（ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ（２）位及び糖残基のＣ（３）、Ｃ（４）、Ｃ（５）、Ｃ（６）位のＨ）。
【００３２】
ＩＲ（ＫＢｒ）：３７００−３１００、２９３１、２８８７、１６４０、１５４８、１４１７、１３８３、１３１９、１１５５、１０７２、１０３１、９２０ｃｍ−１。
【００３３】
なお、各ユニットの構成比率は、以下のように算出した。まず、キトサン誘導体（分岐型キトサン誘導体）のｚを、下記に示す式Ａ、式Ｂにより求めた。
脱アセチル化度（ＤＤＡ）（％）＝［（分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基数）／ＴＲ］×１００ （式Ａ）
ｚ＝（分岐残基数）／ＴＲ （式Ｂ）
ここで、ＴＲは分岐型キトサン誘導体の総残基数を意味する。分岐残基数は、分岐鎖が結合する残基数を意味し、側鎖の本数と同じである。実施例１で用いた原料キトサンのうち、分子量の大きい方を主鎖キトサン、小さい方を側鎖キトサンとすると、主鎖キトサン（ＤＤＡ ９５％、Ｍｎ ２１，０００）の平均残基分子量及び残基数は、グルコサミン残基分子量（ＦＷ）が１６１、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＦＷ）が２０３であることから
主鎖キトサンの平均残基分子量＝１６１×０．９５＋２０３×０．０５＝１６３．１
主鎖キトサンの残基数＝２１０００／１６３．１＝１２９
となる。一方、側鎖キトサン（ＤＤＡ ７１％、Ｍｎ ２，０００）の平均残基分子量及び残基数は、同様にして算出すると、
側鎖キトサンの平均残基分子量＝１６１×０．７１＋２０３×０．２９＝１７３．２
側鎖キトサンの残基数＝２０００／１７３．２＝１１．５
となる。また、主鎖キトサンの残基数に対する分岐鎖キトサンの本数の割合をＤＳとすると、分岐型キトサン誘導体の総残基数、ＴＲは
ＴＲ＝（主鎖の残基数）＋（全側鎖の残基数を合計したもの）
＝（主鎖の残基数）＋［（側鎖の残基数）×（側鎖の本数）］
＝（主鎖の残基数）＋［（側鎖の残基数）×〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］
＝１２９＋［１１．５×〔１２９×ＤＳ〕］
と表わすことができる。実施例１で得られた分岐型キトサンのＤＤＡは７８（％）であることから、式Ａに上記ＴＲを代入すると
７８＝（分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基数）／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋（全側鎖のＧｌｃＮ残基数を合計したもの）〕／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋［（側鎖のＧｌｃＮ残基数）×（側鎖の本数）］／ＴＲ×１００
＝〔（主鎖のＧｌｃＮ残基数）＋［（側鎖のＧｌｃＮ残基数）×〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］／ＴＲ×１００
＝〔（１２９×０．９５）＋［（１１．５×０．７１）×〔１２９×ＤＳ〕］／１２９＋［１１．５×〔１２９×ＤＳ〕］×１００
となる。これより、ＤＳ＝０．２１と算出でき、さらにこの値を代入して、ＴＲ＝４４０となる。また、式Ｂは、
ｚ＝（分岐残基数）／ＴＲ
＝（側鎖の本数）／ＴＲ
＝〔（主鎖の残基数）×ＤＳ〕］／ＴＲ
＝〔１２９×０．２１〕／４４０
＝０．０６
となった。
【００３４】
次に、分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮＡｃ残基、即ち、キチンユニットに対応するｙの値は、脱アセチル化度（ＤＤＡ）との間に、ｙ＝１−ＤＤＡ／１００の関係にある。また、１Ｈ−ＮＭＲ分析における［３．１９（ＧｌｃＮ残基のＣ（２）位のＨ）のピーク面積］と、［２．０７（ＧｌｃＮＡｃ残基のＮＨＣＯＣＨ３のＣＨ３由来）のピーク面積］との比率からも算出することができる。この関係は、分岐型キトサンから合成された分岐型キトサン誘導体の１Ｈ−ＮＭＲ分析においても同じであり、ｙ＝０．２２となった。
【００３５】
また、ｙ＝０．２２と算出されたことにより、分岐型キトサン誘導体のＧｌｃＮ残基に対応する（ｘ＋ｚ）の値は、ｘ＋ｚ＝１−ｙ＝０．７８と算出される。一方、１Ｈ−ＮＭＲ分析におけるＧｌｃＮ残基に対応するピーク、即ち、［３．１９（ＧｌｃＮ残基のＣ（２）位のＨ）のピーク］は、キトサンユニット、分岐ユニットのいずれにおいても観測されるピークであるため、該ピークの面積は前記２ユニットの合計量と考えることができる。よって、ｘはｘ＝０．７８−０．０６＝０．７２となった。
【実施例２】
【００３６】
実施例２（分岐キトサン誘導体１ｂの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．３ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、「キトサン５」Ｌｏｔ ＴＳＱ４６３８、ＤＤＡ ８６％、Ｍｗ １００，０００、Ｍｎ ２０，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（６．３３ｇ、還元末端残基として３．１５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．５６ｇ、ＤＤＡ ７７％）。
【００３７】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７１、ｙ＝０．２３、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例３】
【００３８】
実施例３（分岐キトサン誘導体１ｃの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．０ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、「ＳＫ−１０」Ｌｏｔ １０２３−１０、ＤＤＡ ８４％、Ｍｗ １４０，０００、Ｍｎ ３１，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（５．００ｇ、還元末端残基として２．５０ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２０ｇ、ＤＤＡ ７６％）。
【００３９】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．６９、ｙ＝０．２４、ｚ＝０．０７であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例４】
【００４０】
実施例４（分岐キトサン誘導体１ｄの合成）
キトサン（２．５２ｇ、アミノ基として１０．０ｍｍｏｌ）（共和テクノス社製、「Ｆｌｏｎａｃ−ｃ」Ｌｏｔ ９３−１−２０、ＤＤＡ ８４％、Ｍｗ １６０，０００、Ｍｎ ３７，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン（６．３３ｇ、還元末端残基として３．１５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（３．２０ｇ、ＤＤＡ ７８％）。
【００４１】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７２、ｙ＝０．２２、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例５】
【００４２】
実施例５（分岐キトサン誘導体１ｅの合成）
キトサン（２．５２ｇ、アミノ基として６．１６ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、「ＤＡＣ−５０」Ｌｏｔ １０７３１１、ＤＤＡ ４５％、Ｍｗ １９０，０００、Ｍｎ ８８，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．３３ｇ、還元末端残基として３．１７ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（３．２５ｇ、ＤＤＡ ５８％）。
【００４３】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．５６、ｙ＝０．４２、ｚ＝０．０４であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例６】
【００４４】
実施例６ （分岐キトサン誘導体１ｆの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．３ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、ＦＭ−８０Ｌ Ｌｏｔ ０８１７−１８、ＤＤＡ ８６％、Ｍｗ ４５０，０００、Ｍｎ ８２，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．５０ｇ、還元末端残基として３．２５ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２５ｇ、ＤＤＡ ７５％）。
【００４５】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．６９、ｙ＝０．２５、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【実施例７】
【００４６】
実施例７ （分岐キトサン誘導体１ｇの合成）
キトサン（２．００ｇ、アミノ基として１０．５ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、ＦＨ−８０ Ｌｏｔ １２０８−１５、ＤＤＡ ８７％、Ｍｗ ６５０，０００、Ｍｎ ７３，０００）の１％酢酸溶液（２００ｍＬ）に、室温で、キトサン〔６．５０ｇ、還元末端残基として３．２５ｍｍｏｌ〕（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １１０１−１３Ｔ、ＤＤＡ ７１％、Ｍｗ ８，０００、Ｍｎ ２，０００）を加え、１２時間攪拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．４０ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１２時間攪拌した。透析後、凍結乾燥することにより分岐型キトサンを得た（２．２５ｇ、ＤＤＡ ７６％）。
【００４７】
各ユニットの構成比率は、実施例１と同様にして算出し、ｘ＝０．７０、ｙ＝０．２４、ｚ＝０．０６であった。なお、得られた誘導体の同定は実施例１と同様に行った。
【００４８】
以上の実施例で得られた分岐キトサン誘導体を表２にまとめた。
【表２】
【００４９】
新規分岐キトサン誘導体１は、主鎖であるＨＭＷ−キトサンのアミノ基と側鎖となるＬＭＷ−キトサンの還元末端との反応により合成されるため、反応の初期の生成物を模式的に示すと下式のＡのようなくし型の構造と考えられる。しかし、その側鎖キトサンに存在するアミノ基も主鎖キトサンに存在するアミノ基と同じ反応性をもち、しかも立体障害を考慮すると側鎖キトサンに存在するアミノ基の方が有利であると考えられるので、反応の進行に伴い分岐型のＢ、さらに多重分岐型のＣの構造に進化すると考えられる。多重分岐型のＣの構造は、従来のくし型の構造Ａにおける置換度（ＤＳ）では認識が困難であり、分岐残基の割合ｚ（表２）を下記のように定義した。なお、上記考察は本発明を限定するものではない。
ｚ＝（分岐キトサン誘導体１中の分岐残基数）／（分岐キトサン誘導体１中の全残基数）
【化６】
【実施例８】
【００５０】
実施例８ 本発明の分岐キトサン誘導体が主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことの証明
表２に示したｚの値は、原料キトサンの脱アセチル化度（ＤＤＡ）と生成物１の脱アセチル化度（ＤＤＡ）との比較により計算できる。しかし、主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことの直接的な証明は容易ではない。よって、下のスキームに示すように主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンを、異なる蛍光波長をもつ蛍光プローブで標識したＲ−６ とＦＩＴＣ−８を原料に用いて分岐キトサン誘導体１１を合成した。図１に示したように生成物１１の蛍光スペクトルには、Ｒ−６ とＦＩＴＣ−８に固有の蛍光波長（５７０ｎｍ付近と５３０ｎｍ付近）が両方とも観測されたことから、分子内に主鎖であるＨＭＷ−キトサンと側鎖となるＬＭＷ−キトサンの両方を含むことを確認することができた。
【化７】
【実施例９】
【００５１】
実施例９ 本発明の分岐キトサン誘導体水溶液の粘度測定
本発明で得られた分岐キトサン誘導体の溶解性と１％酢酸水溶液に溶かした溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の粘度を、表３に示した。原料のＨＭＷ−キトサンはいずれも中性の水に溶解しないことから、本発明による多重分岐化は水溶性向上効果が大きいと言える。酸を用いることなく中性水溶液化できることは、本発明の分岐キトサン誘導体の材料としての応用範囲を拡大するものである。
【表３】
【００５２】
本発明で得られた分岐キトサン誘導体溶液の粘度と直鎖型のＨＭＷ−キトサン溶液の粘度を図２において比較した。原料に用いた直鎖型のＨＭＷ−キトサンの粘度は、その分子量が増大するに伴い増大した。しかし、分岐キトサンの粘度はこの範囲ではほぼ一定の値を示した。しかし、表３のＥｎｔｒｙ ６と７のように、原料に用いた直鎖型のＨＭＷ−キトサンの重量平均分子量（Ｍｗ）が４５０ｋＤａよりも大きい場合は水溶性が低下し、大きく粘度が上昇した。従来、キトサンの分子量増大による溶解度低下および溶液粘度の上昇は、注射、注入などの利用方法を制限してきた問題点であったが、本発明によりこの問題が解決された。本発明の分岐キトサン誘導体の応用範囲は、従来のキチン、キトサン系の材料の応用範囲よりもはるかに拡大されたものといえる。
【実施例１０】
【００５３】
実施例１０ 本発明の分岐キトサン誘導体の免疫系活性化作用
（１）実験方法
（ａ）マウスへの投与ならびに生体サンプルの採取
ＩＣＲマウス（メス、１０週齢）を１週間以上予備飼育した後、実験に供した。マーゲンゾンデを用いて分岐キトサン誘導体（表２のＩａ）、ＨＭＷ−キトサン（Ｍｗ＝８０，０００）、ＬＭＷ−キトサン（Ｍｗ＝８，０００）を、それぞれ２ｍｇ／０．２ｍｌ／ｈｅａｄで、１日１回３日間連続して胃内投与した。コントロール群としては、分岐キトサン誘導体群およびＬＭＷ−キトサン群に対しては水投与群、ＨＭＷ−キトサン群に対しては酢酸水溶液投与群を用いた。３回目投与１〜２時間後にジエチルエーテル麻酔下にて心臓穿刺法にて血液を採取し、血液採取後に脾臓を摘出した。採取した血液から常法にて血清を得て、血清サイトカイン濃度の測定に供した。本発明の分岐キトサン誘導体を上記のごとく動物に投与した場合、動物に対する毒性は認められなかった。
【００５４】
（ｂ）脾細胞の調製
摘出した脾臓はＦＢＳ０．５％加ＰＢＳ（以下ＰＢＳ）に浸し（３〜４ｍｌ）、ピンンセットを用いて周囲の結合組織を取り除いた。ＰＢＳを交換し（３〜４ｍｌ）、２４Ｇ注射針ならびに１ｍｌプラスチックシリンジの内筒を用いて細胞を浮遊させた。浮遊した細胞液を４２μｍナイロンメッシュで濾過し１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。溶血剤を加えよく混和し、同様に遠心分離した。上清を捨てＰＢＳを加え、同様に再び遠心分離した。細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるようにＰＢＳにて希釈し、細胞液とした。
【００５５】
溶血剤は以下のようにして調製した。ＮＨ４Ｃｌ ８２．９ｇ、ＫＨＣＯ３ １０ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（株式会社同仁化学研究所、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）０．３７２ｇを１リットルの超純粋水に溶解し４℃で保存した。使用時にはさらに超純粋水で１０倍希釈した。
【００５６】
（ｃ）免疫細胞活性の測定
以下の抗体を使用した：
ＣＤ４＋細胞（ヘルパーＴ細胞）活性測定用としてＦＩＴＣ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ４：ＢＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）；および
ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞活性測定用としてＲＡＴ ＡＮＴＩ ＭＯＵＳＥ ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ：ＦＩＴＣ（フナコシ株式会社、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。
各抗体は最終希釈倍率が１：２００となるようにＰＢＳにて希釈して抗体液とした。エッペンドルフチューブに細胞液（（ｂ）で調製）１００μｌおよび抗体液１００μｌを加え、遮光し４℃で２０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳを５００μｌ加えよく混和し、４℃にて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清除去後ＰＢＳを５００μｌ加え、測定に供した。フローサイトメトリーを用いて蛍光強度を測定することにより各免疫細胞の割合を測定した。
【００５７】
（ｄ）血清サイトカイン濃度測定
上記（ａ）で得た血清サンプルに、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｔｈ１／Ｔｈ２ １０ｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ｂｅｎｄｅｒｍｅｄｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を適用して、製造元の指示に従ってインターロイキン−６（ＩＬ−６）およびＴＮＦ−α量を測定した。
【００５８】
（２）実験結果
ヘルパーＴ細胞の割合は分岐キトサン誘導体で有意に上昇し、コントロール（蒸留水群）の２倍近い割合となった。ＨＭＷ−キトサンは酢酸の成績と差がなく、ＬＭＷ−キトサンにも効果は認められなかった（図３）。ＮＫ細胞の割合は分岐キトサン誘導体でコントロール、ＨＭＷ−キトサンよりも有意に上昇し、コントロール（蒸留水群）の約１２倍の割合となった（図４）。血清ＩＬ−６、ＴＮＦ−α量も分岐キトサン誘導体で有意に増加し、ＩＬ−６はコントロール（蒸留水群）よりも約１５倍増加し、ＴＮＦ−αはコントロール（蒸留水群）よりも約１０倍増加した（図５、図６）。以上の結果から分岐キトサン誘導体は明らかにヘルパーＴ細胞のＴｈ−１、Ｔｈ−２を活性化させ、バランスとしては細胞性免疫を賦活する成績が得られた。この活性効果はＨＭＷ−キトサン、ＬＭＷ−キトサンにはなく、分岐キトサン誘導体独自の特徴である。このように、本発明の分岐キトサン誘導体は顕著な生体免疫系活性化作用を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、キトサンに多重分岐構造を付与することにより水溶性の向上と水溶液の粘性を低く保つ分子形態の両立を達成したものである。したがって、従来キチン、キトサンが利用されていた領域のみならず医薬品や飲食品などの分野においても利用可能である。本発明は、例えば、遺伝子キャリヤー、生体接着剤、シーリング剤の他、創傷治癒材、生体適合性フィルム、コーティング材、ならびに生体免疫活性化剤などの医薬品、健康食品等の製造において利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は、
【化２】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、分岐キトサン誘導体。
【請求項２】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む低粘度キトサン組成物。
【請求項３】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む免疫系活性化剤。
【請求項４】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む飲食物。
【請求項５】
主鎖用キトサンと、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサンとを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、分岐キトサン誘導体の製造方法。
【請求項６】
主鎖用キトサンの重量平均分子量が４５０ｋＤａよりも小さいものである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
主鎖用キトサンの重量平均分子量が８０ｋＤａないし１９０ｋＤａの範囲である、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項記載の方法により得られる分岐キトサン誘導体。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、Ｒ１は、
【化２】
で示されるキトサン側鎖であり、Ｒ２は、Ｈ、アセチル基、該Ｒ１であり、ａは０〜５００の整数を示し、但し、全てのＲ２は同一でも異なっていてもよい］で表わされる、分岐キトサン誘導体。
【請求項２】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む低粘度キトサン組成物。
【請求項３】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む免疫系活性化剤。
【請求項４】
請求項１記載の分岐キトサン誘導体を含む飲食物。
【請求項５】
主鎖用キトサンと、主鎖用キトサンよりも低分子量の側鎖用キトサンとを、還元的Ｎ−アルキル化反応に供することを特徴とする、分岐キトサン誘導体の製造方法。
【請求項６】
主鎖用キトサンの重量平均分子量が４５０ｋＤａよりも小さいものである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
主鎖用キトサンの重量平均分子量が８０ｋＤａないし１９０ｋＤａの範囲である、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項記載の方法により得られる分岐キトサン誘導体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１３２３６９（Ｐ２０１１−１３２３６９Ａ）
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９３０８３（Ｐ２００９−２９３０８３）
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．平成２１年 ７月 １日 日本キチン・キトサン学会の「キチン・キトサン研究」第１５巻 第２号に掲載 ２．平成２１年 ８月２１日 日本キチン・キトサン学会主催の「第２３回キチン・キトサンシンポジウム」において発表
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【出願人】（５９５００４８４９）大村塗料株式会社 (5)
【出願人】（３９１００３１３０）甲陽ケミカル株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．平成２１年 ７月 １日 日本キチン・キトサン学会の「キチン・キトサン研究」第１５巻 第２号に掲載 ２．平成２１年 ８月２１日 日本キチン・キトサン学会主催の「第２３回キチン・キトサンシンポジウム」において発表
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【出願人】（５９５００４８４９）大村塗料株式会社 (5)
【出願人】（３９１００３１３０）甲陽ケミカル株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
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