加水分解されたクロロゲン酸を含む、コーヒー飲料を調製するための組成物
本発明は、飲料を調製するための組成物に関する。組成物は、コーヒー抽出物のクロロゲン酸をフェノール酸に加水分解することができる微生物及び／又は酵素を含む。発明の組成物によって調製された飲料が消費される場合、コーヒー抽出物中に存在するクロロゲン酸は加水分解されて、同様の従来の飲料と比較して、抗酸化及び／又は抗炎症性特性を向上させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲料を調製するための組成物に関する。組成物は、コーヒー抽出物のクロロゲン酸をフェノール酸に加水分解することができる微生物及び／又は酵素を含む。発明の組成物によって調製された飲料は、改良された抗酸化及び／又は抗炎症性特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー並びにカフェイン及びジテルペン（例えば、カフェストール、カーウェオール）などのコーヒー活性化合物は、げっ歯動物において解毒酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧＳＴ）を誘導することが示された（Ｃａｖｉｎ Ｃ．ら、１９９８年、「コーヒーに特有のジテルペンであるカフェストール及びカーウェオールは、二重機構によってアフラトキシンＢ１に誘導される遺伝毒性を防ぐ（Ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｃａｆｅｓｔｏｌ ａｎｄ ｋａｈｗｅｏｌ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｏｕｇｈ ａ ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）。」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９巻、１３６９〜１３７５頁、Ｃａｖｉｎ，Ｃ．ら、２００３年、「コーヒーのジテルペンは、ラット及びヒトの培養系において、ベンゾ［ａ］ピレンの遺伝毒性を妨げる（Ｃｏｆｆｅｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．）。」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、３０６巻、４８８〜４９５頁、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ら、２００２年ａ、「コーヒー成分であるカーウェオール及びカフェストールによる、ラットの特定の器官における化学的予防酵素であるグルクロニルトランスフェラーゼ及びグルタチオントランスフェラーゼの強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｋａｈｗｅｏｌ ａｎｄ ｃａｆｅｓｔｏｌ．）。」、Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、７６巻、２０９〜２１７頁）。コーヒーにより増進したＧＳＴ活性は、５日間でコーヒー８００ｍｌを摂取した後のヒトにおいて、さらに実証された（Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ，Ｈ．ら、２００５年、「コーヒー摂取は、血漿においてＧＳＴＰを誘導し、（＋／−）−抗−ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシドによって誘導されるＤＮＡ損傷からリンパ球を保護する：対照ヒト介入試験の結果（Ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＧＳＴＰ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ （＋／−）−ａｎｔｉ−ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ−９，１０−ｅｐｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌｓ．）。」、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．５９１巻、２６４〜２７５頁）。
【０００３】
この種の抗酸化活性は、例えば癌、心臓病、退行性脳障害、及び老化に関与することがある損傷を与える遊離基を減少させることによって、「酸化ストレス」を防ぐことが知られている。
【０００４】
食物及び飲料製品の健康上の利益を増進させるために、増進した抗酸化活性やその他の有益な生物活性を有する製品を生産することが望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物又は酵素でコーヒー抽出物を処理すると、コーヒー抽出物の抗酸化及び／又は抗炎症性特性を向上することを見出した。さらに、ヒト又は動物が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる酵素又は微生物と組み合わせてコーヒー抽出物を摂取すると、この処理が生体内で起こり得ることが見出された。
【０００６】
したがって、本発明は、ａ）乾燥コーヒー抽出物、及びｂ）カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む飲料粉末に関する。さらなる態様において、本発明は、ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキットに関する。またさらなる態様において、本発明は、本発明の生成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（ＮＥＳＣＡＦＥ ＲＥＤ ＣＵＰ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００及び４００ｕｇ／ｍｌ、及びラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）で処理したネスカフェプロテクト（ＮＥＳＣＡＦＥ ＰＲＯＴＥＣＴ）（登録商標）２００及び４００ｕｇ／ｍｌで処理したラットの初代培養肝細胞、並びにコーヒー抽出物で処理していない対照試料におけるＧＳＴのサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現を示すウェスタンブロットゲルの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【図２】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）（ＲＮ）、クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）（Ｐ）、及びラクトバチルス・ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）（Ｌａ１−Ｐ）を５％含む食餌を２週間与えた雄性のラットの肝臓中での解毒酵素発現の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）を示すウェスタンブロットの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
コーヒー飲料を調製するためにコーヒー抽出物と混合する組成物、例えばミルク、クリーム、コーヒーホワイトナー、及びコーヒークリーマーは、当技術分野においてよく知られている。かかる組成物は、例えばコーヒーの香り、外見、及び質感を改変するために、消費者によって使用される。組成物は、液体、又は、１杯のコーヒー、例えば淹れたてのコーヒー若しくは純粋な可溶性コーヒーを水中に溶解することによって調製されたコーヒーに溶解及び／又は懸濁させる、例えば粉末のような乾燥形態であってもよい。
【０００９】
本発明の一実施形態において、コーヒー抽出物と混合する組成物は、コーヒークリーマー又はコーヒーホワイトナーである。クリーマーは、乳タンパク質及び／又は乳脂肪を例えばベースにしてもよく、クリーマーは、野菜タンパク質及び／又は野菜脂肪をベースにした非乳製品のクリーマーであってもよい。組成物は、例えば粉末のような乾燥形態であってもよく、水分量は例えば５％未満である。組成物は、液体の形態でもよい。
【００１０】
本発明によるコーヒー抽出物と混合する組成物は、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む。クロロゲン酸は、トランス桂皮酸とキナ酸の間に形成されるエステルのファミリーである。クロロゲン酸は、主にキナ酸の種々の位置に結合したフェノール基（例えばコーヒー基、フェルラ基、クマル基、メトキシ桂皮基）のモノ−及びジエステルとして、コーヒー中に天然に存在する。本発明の一実施形態において、微生物及び／又は酵素は、カフェオイルキナ酸及びジエステル（例えば３−、４−、若しくは５−カフェオイルキナ酸及びジエステル）、及び／又はフェルロイルキナ酸及びジエステル（例えば３−、４−、若しくは５−フェルロイルキナ酸及びジエステル）を加水分解して、コーヒー酸及びフェルラ酸をそれぞれ生成することができる。
【００１１】
本発明の組成物は、貯蔵の間に、微生物及び／又は酵素が、発酵したり又は組成物と反応しないように配合調製するべきである。これは、例えば、乾燥粉末として組成物を配合調製することによって、及び／又は、組成物がコーヒー抽出物と混合されるとき又は消化の間にのみ微生物及び／又は酵素が放出されるように、微生物及び／又は酵素をカプセル封入することによって達成できる。
【００１２】
本発明の組成物は、飲料を調製するためにコーヒー抽出物と混合する組成物中に含有するのに適切な任意の成分をさらに含んでもよい。通常の成分は、例えば、砂糖、人工甘味料、乳化剤、安定剤、増粘剤、流動化剤、着色料、香味料、芳香料等であってよい。適切な人工甘味料としては、サッカリン、チクロ、アセトスルファム、アスパルテームなどのＬ−アスパルチルをベースとする甘味料、及びこれらの混合物が挙げられる。適切な乳化剤としては、モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン、モノ−ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、乳化デンプン、及びそれらの混合物が挙げられる。適切な安定剤としては、リン酸二カリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。適切な流動化剤は、アルミノ珪酸ナトリウムである。一実施形態において、組成物は、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む。さらなる実施形態において、組成物は、乳脂肪及び／又は野菜脂肪を含む。
【００１３】
コーヒー抽出物
本発明によるコーヒー抽出物は、水又は蒸気による生コーヒー豆及び／又は焙煎したコーヒー豆の抽出物である。コーヒー抽出物を生成する多数の方法が、当技術分野において、例えばＥＰ０９１６２６７から知られている。コーヒー抽出物は、例えば純粋な可溶性コーヒーであってもよい。純粋な可溶性コーヒー製品は容易に入手可能であり、純粋な可溶性コーヒー製品を製造する多数の方法が、当術分野において、例えばＥＰ１０６９３０から知られている。
【００１４】
微生物
クロロゲン酸を加水分解することができる微生物は、例えば、本明細書の実施例中に開示されている通り確認することができる。適切な微生物は、酵母、真菌、又は細菌から選択することができる。適切な微生物は、例えば、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばＬ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）などのラクトバチルス、例えばＢ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６）などのビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又は例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母であってもよい。
【００１５】
酵素
適切な酵素は、例えばエステル分解酵素、例えば、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）に由来するクロロゲン酸エステラーゼ（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）、アスペルギルス・オリザエからのタンナーゼ（ＥＣ３．１．１．２０）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）、及びパラターゼ（Ｐａｌａｔａｓｅ）２００００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）（デンマークのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから市販されている）である。酵素は、精製酵素として、又は例えば微生物の細胞可溶化物の形態で存在してもよい。適切な細胞は、例えば、上述の微生物の細胞であってもよい。細胞溶解物を作製する適切な方法は、当技術分野において知られている。
【００１６】
微生物及び／又は酵素は、消化の間にコーヒー抽出物中に存在するかなりの量のクロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するための十分な量で存在すべきである。必要とされる微生物及び／又は酵素の量は、例えば、本明細書中の実施例３に記載されているＴＩＭ消化モデルにおいて、消化実験の間に加水分解されるクロロゲン酸の量を測定することによって決定することができる。コーヒー抽出物中に存在するカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）及び／又はフェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）の好ましくは少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％が加水分解される。
【００１７】
部分のキット
一実施形態において、本発明は、ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキットに関する。２つの部分は、飲料の調製のために一緒に販売されるが、製品の包装において物理的に分離されている。消費される最終飲料は、消費直前に２つの部分を混合することによって調製される。１つ又は両方の部分が液体形態である場合、直接混合することができ、場合によっては、さらなる液体、例えば水又はミルクを添加してもよい。２つの部分は、液体、例えば水又はミルクに溶解又は懸濁させることによって混合されてもまたよい。液体を使用する場合、熱い飲料が望まれるか又は冷たい飲料が望まれるかによって、熱くても又は冷たくてもよい。熱い液体が使用される場合、好ましくは、飲料の摂取前に微生物及び／又は酵素を不活化させるほど高くない温度であり得る。
【００１８】
キットの第１の部分は、コーヒー抽出物を含む。好ましい実施形態において、第１の部分は、乾燥形態、例えば粉末の形態である。コーヒー抽出物は、例えば、従来の純粋な可溶性コーヒー粉末、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥コーヒー抽出物であってよい。純粋な可溶性コーヒー粉末は容易に入手可能であり、当技術分野において広範に記載されている。第１の部分は、液体の形態であってもまたよい。液体コーヒー抽出物は、例えばすぐに飲めるコーヒー飲料として、容易に入手可能である。第１の部分は、その他の任意の適切な成分、例えばチコリ抽出物、芳香添加物、安定剤、塩、及び／又は甘味料をさらに含んでもよい。第１の部分は、任意の適切な方法で、例えば、小袋、ビン、又はカンに包装されてもよい。
【００１９】
第２の部分は、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む。この部分は、本明細書中に記載されている通り、好ましくはコーヒー抽出物と混合する組成物の形態、好ましくはコーヒーホワイトナー又はコーヒークリーマーの形態であってもよい。第２の部分は、その他の任意の適切な成分、例えばコーヒー抽出物と混合する組成物の成分として、本明細書中に記述されている成分などのコーヒークリーマー又はコーヒーホワイトナー中に、通常見出される成分も含んでもよい。第２の部分は、乾燥形態で、例えば粉末として、又は液体形態であってもよく、任意の適切な方法で、例えば小袋、ビン、又はカンに包装されてもよい。第２の部分は、微生物及び／又は酵素が、貯蔵の間に、発酵したり又はその他の成分と反応したりしないように配合調製されるべきである。これは、例えば乾燥粉末として組成物を配合調製することによって、及び／又は、組成物がコーヒー抽出物と混合するとき若しくは消化の間にのみ、微生物及び／又は酵素が放出されるように、微生物及び／又は酵素をカプセル封入することによって達成できる。
【００２０】
少なくとも２つの部分は、任意の適切な方法で一緒に包装することができる。２つの部分は、貯蔵の間、物理的に分離されたままであり、例えば、容器を開けたときに混合される連結した容器に包装してもよく、又は、２つの部分を、飲料の調製のために一緒に販売される分離した容器に包装してもよい。
【００２１】
飲料粉末
一実施形態において、本発明は、ａ）乾燥コーヒー抽出物、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む、飲料粉末に関する。
【００２２】
本発明による飲料粉末は、液体、例えば水又はミルクに粉末を溶解又は懸濁することによる飲料の調製のために使用される粉末である。粉末から調製される飲料は、ブラックコーヒー、カフェラテ、カフェマキアート、カプチーノ、又は他のいかなるコーヒーベースの飲料であっても、例えばよい。
【００２３】
乾燥コーヒー抽出物は、例えば、従来の純粋な可溶性コーヒー粉末、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥コーヒー抽出物であってもよい。純粋な可溶性コーヒー粉末は容易に入手可能であり、当技術分野において広範に記載されている。
【００２４】
微生物及び／又は酵素は、乾燥粉末形態で、例えば凍結乾燥粉末として存在する。微生物及び／又は酵素はカプセル封入してもよい。
【００２５】
飲料粉末は、微生物及び／又は酵素が、貯蔵の間に、発酵したり又はコーヒーの抽出物及び／又はその他の成分と反応しないように配合調製するべきである
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、飲料粉末は、乾燥形態での本明細書中に記載された通りのコーヒー抽出物と混合される組成物を含む。本発明のより好ましい実施形態において、飲料粉末はクリーマーを含む。
【００２７】
飲料粉末は、望ましい飲料を調製するために適切なその他のいかなる成分を含んでもよい。適切な成分は、例えば、当技術分野においてよく知られており、砂糖、人工甘味料、乳化剤、安定剤、増粘剤、流動化剤、着色料、香味料、芳香料等であってよい。適切な人工甘味料としては、サッカリン、チクロ、アスパルテームなどＬ−アスパルチルをベースとする甘味料、及びこれらの混合物が挙げられる。適切な乳化剤としては、モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン、モノ−ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（データエステル）、乳化デンプン、及びそれらの混合物が挙げられる。適切な安定剤としては、リン酸二カリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。適切な流動化剤は、アルミノ珪酸ナトリウムである。一実施形態において、飲料粉末は、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む。別の実施形態において、飲料粉末は、乳脂肪又は野菜脂肪を含む。さらなる実施形態において、飲料粉末は甘味料を含む。
【００２８】
発明の生成物の使用
本発明の生成物は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの解毒酵素を誘導することによって、及びＮｒｆ２−仲介遺伝子発現経路を増加させることによって、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するために使用することができる。増加したＮｒｆ２活性関連遺伝子は、解毒作用を強化し、酸化ストレスに対する内因性防御を刺激することが報告された。
【００２９】
本発明の生成物は、例えばプロスタグランジンＥ２レベルを低下させることによって、炎症を抑制するために使用することができる。
【００３０】
多くの健康問題及び障害は、酸化ストレス及び炎症に関連している。本発明の生成物は、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物における、かかる問題又は障害などを治療又は予防するために使用することができる。関連する問題及び障害は、例えば、例えば紫外線放射によって引き起こされる光損傷、アトピー性皮膚炎、湿疹、落屑性、掻痒性、アレルギー性症状などの皮膚障害、脳障害、炎症、肥満、並びに、例えば皮膚癌及び肺癌などの癌である。
【００３１】
本発明の生成物は、例えば血糖値を低下させることによる及び／又はレプチン、インシュリン、及び／又はｃ−ペプチドの血中濃度を上昇させることによる抗糖尿病薬として、例えば骨ミネラル濃度を上昇させることによる、例えばエストロゲン及び／又はプロゲステロンの血清濃度及び／又はアルカリホスファターゼ活性を上昇させることによる骨再構築剤として、例えば抗血管新生効果を有する抗転移薬としても使用することができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニイの新鮮細胞によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物）３０ｍｇ／ｍｌを添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３３】
同一の反応条件下であるが細菌なしで、平行して反応対照を実施した。
【００３４】
ラクトバチルス・ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。次に、ガラスビーズ法を使用して、細胞を溶解させた。細胞調製物６００μｌをスクリューキャップチューブに入れ、０℃でガラスビーズ６００μｌを添加した。次に、チューブをミニビードビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）中に強振動下で１分間入れ、氷で冷却し、ミニビードビーター中に、さらに１分間入れた。次に、ネスカフェプロテクト（登録商標）（３０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０）の溶液９００μｌに、粗細胞抽出物を添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３５】
ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
ネスカフェプロテクト（登録商標）３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３６】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理
乾燥生コーヒー抽出物３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３７】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の濃縮調製物でのネスカフェ（ＮＥＳＣＡＦＥ）（登録商標）の処理
ネスカフェスペシャルフィルター（ＮＥＳＣＡＦＥ ＳＰＥＣＩＡＬ ＦＩＬＴＲＥ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の乾燥抽出物）４００ｍｇを沸騰水１ｍｌに溶解し、室温で３７℃まで、この溶液を冷却した。このコーヒー溶液２５０μｌに、ラクトバチルス・ジョンソニイの異なる量の濃縮調製物（５０μｌ、１００μｌ、３５０μｌ、７５０μｌ）を添加し、水で１ｍｌになるまで量を調整した。次に、混合物を３７℃で２時間及び４時間インキュベートした。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析
コーヒー試料を１％ｗ／ｗに希釈し、ＣＣ２５０／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５−Ｃ１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶離系は、流量１ｍＬ／分で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水、０．１％ＴＦＡ、及びＣＨ３ＣＮであった。この方法により、外部標準検量線を使用して、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）、フェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）、フェルオイルキナ酸−ラクトン、コーヒー酸（ＣＡ）、及びフェルラ酸（ＦＡ）を同時に測定（３２５ｍｍでの吸光度）できた。時間０（ｔ０）での基準、又は細菌なしでの同時間の基準に対して結果を示した。
【００３９】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ネオマイシン選択可能マーカーを含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドと一緒に、ラットのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡ２（ＧＳＴＡ２）中に存在するＡＲＥ８コピーを含むｐＧＬ−８ｘＡＲＥを、ヒトＭＣＦ７細胞に安定的に形質移入した（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６巻、１０９８３〜１０９９４頁、２００６年）。ＡＲＥ（抗酸化剤応答配列）は、解毒作用及び酸化ストレスに対する内因性防御に関与する遺伝子を制御する転写因子Ｎｒｆ２の結合部位である。プラスミドｐＧＬ−８ｘＡＲＥは、Ｎｒｆ２活性の監視を可能にする、８個のＮｒｆ２結合部位の下流にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００４０】
コーヒーでの処理のために、ＤＭＥＭ成長培地の９６ウェルマイクロタイタープレートにＡＲＥｃ３２細胞を播種した。異なるコーヒーで２４時間処理した後、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４１】
タンパク質発現
コラゲナーゼ溶液でのスプラーグドーリーラットの肝臓の灌流によって、初代培養肝細胞を得た（Ｓｉｄｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０１巻、１０３〜１１３頁、１９９３年）。トリパンブルー排除試験によって測定された細胞生存率は９０〜９５％の間の範囲であることがわかった。２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１０ｍＭヘペスｐＨ７．４を、ＩＴＳ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン１５０００Ｕ、１００ｎＭデキサメタゾン、及び５％ウシ胎仔血清（ハイ−クローン）を補ったウィリアムス培地３ｍｌで、６０ｍｍプラスチック組織培養皿上に、１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。肝細胞を２時間付着させ、次に、ＥＢＳＳで洗浄して、細胞片及び付着しなかった細胞を除去した。デキサメタゾン２５ｎＭを含む、新鮮な血清を含まない培地を添加し、次に、マトリゲルのオーバーレイ（２３３ｇ／ｍｌ）を適用した。培地交換に続いて、２日に一度、新鮮なマトリゲルを培養物に添加した。解毒酵素及び抗酸化タンパク質発現についてのコーヒーの効果を研究するために、タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析の前に、４８時間の細胞播種の２４時間後に、培地に試験材料を添加した（Ｃａｖｉｎら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘ．、４６巻、１２３９〜４８頁、２００８年）。
【００４２】
プロスタグランジンＥ２の生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞を、異なるコーヒーで１５時間処理し、続いて炎症誘発剤ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に６時間共培養した。競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して、ＨＴ−２９細胞中のＰＧＥ２生成の分析を測定した（Ｃａｖｉｎら、ＢＢＲＣ、３２７巻、７４２〜４９頁、２００５年）。
【００４３】
結果
フェノール酸生成のためのクロロゲン酸の加水分解
実験１：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ新鮮細胞でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実験２：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
実験３：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験４：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理。結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
実験５：ラクトバチルス・ジョンソニイの濃縮調製物でのネスカフェ（登録商標）の処理。結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表６は、クロロゲン酸を加水分解するための処理をしなかった生コーヒー豆の抽出物（対照試料）の２つの異なる試料における、いくつかの化合物の絶対濃度を示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
タンパク質の発現
ラット初代培養肝細胞において、ネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００ｕｇ／ｍｌは４８時間の処理後、ウェスタンブロットにより、４００ｕｇ／ｍｌで、ＧＳＴサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現の増加をもたらさず、ＧＳＴＰ１及びＨＯ−１発現の弱い誘導をもたらした。対照的に、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１、及びＨＯ−１について、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）２００ｕｇ／ｍｌ及び４００ｕｇ／ｍｌの両方で、異なるタンパク質発現のより強い誘導を観察した。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図１に示す。
【００５６】
ネスカフェレッドカップ（登録商標）対ネスカフェプロテクト（登録商標）及びＬ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）を５％有する食餌を２週間与えたオスのラットの肝臓において得られたデータは、ラット初代培養肝細胞において観察された効果を確認した。未処理のネスカフェプロテクト（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）及び未処理のネスカフェレッドカップ（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）と比較して、解毒酵素発現の最強の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）が、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）について見られた。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図２に示す。
【００５７】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物は、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表７を参照されたい）。
【００５８】
【表７】
【００５９】
プロスタグランジンＥ２生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞で、Ｌ．ジョンソニイで処理した生コーヒー抽出物の潜在的な抗炎症性効果を分析した。炎症誘発剤ＴＮＦ−αによる処理後、結腸細胞においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルが誘導される。この研究において、異なるコーヒー抽出物（クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物）で、細胞を２４時間前処理した。実験の最後の６時間に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。データ（表８を参照されたい）は、ＴＮＦ−αで処理した対照細胞と比較した、ＰＧＥ２生成のコーヒーによる明白な用量依存的減少を示した。
【００６０】
【表８】
【００６１】
実施例２
コーヒー試料
１００％ロブスタ生豆からの生コーヒー抽出物
ネスカフェプロテクト（登録商標）、生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物
【００６２】
酵素及び細胞
微生物 培地
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５） ＭＲＳ
ビフィズス菌ラクティスＢＢ１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６） ＭＲＳ＋システイン
ビフィズス菌ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９） ＭＲＳ＋システイン
【００６３】
アスペルギルス・ジャポニクス（日本のキッコーマン株式会社）由来のクロロゲン酸エステラーゼ（２４Ｕ／ｇ）。
アスペルギルス・オリザエ（日本のキッコーマン株式会社）からのタンナーゼ
【００６４】
細菌細胞の調製
攪拌せずに、嫌気性環境で、３７℃での培地における１６時間の培養に対応する静止期に十分到達した後で、試験した菌株を採取した（５０００ｇで１０分間の遠心分離）。菌株の最初の活性化のために、凍結保存培養物を新鮮な培地中に植菌し、一晩成長させた。この前培養物を使用して、培養物を植菌した。
【００６５】
細菌細胞でのコーヒー抽出物の処理
細菌の培養及び遠心分離の後で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。この細胞調製物２００μｌに、コーヒー溶液（３％）８００μｌを添加し、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。
【００６６】
クロロゲン酸エステラーゼでのコーヒー抽出物の培養
コーヒー溶液（３％）８００μｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ中のクロロゲン酸エステラーゼ（２５ｍｇ）の溶液を添加した。次に、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。反応時間の後で、熱処理（３分、９０℃）によって酵素活性を止め、分析の前に混合物を濾過した。
【００６７】
ＡＲＥルシフェラーゼ分析
実施例１の通り
【００６８】
結果
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによる抗酸化Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない（未処理）生コーヒー抽出物、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌｊ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、ビフィズス菌ラクティス（Ｂｌ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、及びクロロゲン酸エステラーゼ（ＣＥ）で４時間処理した生コーヒー抽出物は全て、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表９）。
【００６９】
【表９】
【００７０】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、生コーヒー抽出物を処理して、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１０に示す。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、ネスカフェプロテクト（登録商標）を処理し、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１１に示す。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
実施例３
胃小腸モデル（ＴＩＭ）
胃小腸モデルであるＴＩＭ−１は、胃、十二指腸、空腸、及び回腸をそれぞれ表わす４つの連結した区画を含む。各区画は、可撓性の内壁を有するガラスの外壁からなる。可撓性の壁は、壁を圧迫する３７℃の水で囲まれており、胃−腸管におけるぜん動運動によって分泌された酵素で、食物の混合を確実に行う。
【００７５】
胃−腸管の平均的な生理的条件下で、モデル内での実験を実施した。実験の間、温度を３７℃で維持し、唾液、胃液、胆汁、及び膵液の分泌を模擬実験した。モデル内の消化過程を６時間監視した。最初の３．５時間に、胃の内容物は小腸「幽門弁」内へ徐々に送達された。実験の終了時には、約８０％の小腸内容物が回盲弁を介して「大腸」内へ徐々に送達された。胃のｐＨは、１ＭのＨＣｌの分泌によって、約５時間で、６．５から２．０へ徐々に低下した。小腸内容物のｐＨは、十二指腸内で６．５、空腸内で６．８、及び回腸内で７．２を維持した。約５０００ダルトンの分子量カットオフを有する中空繊維膜を通して、透析液を汲み出すことによって、空腸及び回腸の区画から、消化産物及び水を吸収した。
【００７６】
コーヒー抽出物消化模擬実験
ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）４．５ｇを、酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）３１０ｍｌに溶解した。出発残留物（ペプシン５ｇ及びリパ−ゼ酵素５ｇ溶液）１０ｍｌ添加後、ＴＩＭの胃の区画内へ溶液を注入した。消化の間、全透析液を０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間に収集した。６時間の実験の後で、胃、十二指腸、空腸、及び回腸の区画からの残留物を分析し、クロロゲン酸の物質収支を算出した。実施例１に記載の通り、孔径０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）に試料を通過させ、ＨＰＬＣによって分析した。ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）での実験では、出発残留物１０ｍｌを添加した後で、Ｌ．ジョンソニイの噴霧乾燥調製物を全部で３．３Ｅ９ｃｆｕ含む酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）３１０ｍｌを、胃の区画内に入れた。次に、消化模擬実験を始めた１５分後に、ネスカフェプロテクト４．５ｇを含む酢酸緩衝液１０ｍｌを、注射器によって胃の区画内へ注入した。消化の間、空腸及び回腸の区画に連結した半透性の中空繊維膜を通過させた後、０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間に、全透析液を収集した。０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間、全回腸送達物を収集した。ネスカフェプロテクト（商標登録）の添加の直後及び１時間の時点で、胃の区画からアリコート（１ｍｌ）を取った。６時間後、胃、十二指腸、空腸、及び回腸の区画からの残留物をＨＰＬＣによって分析して、５−カフェオイルキナ酸の物質収支を算出した。ネスカフェクール（ＮＥＳＣＡＦＥ ＣＯＯＬ）（登録商標）（クリーマー及び甘味料を有する焙煎したコーヒーの抽出物）、及びクリーマーを添加した、焙煎及び挽いたコーヒーの通常のフィルターで淹れたもの、及び市販されている５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）で、同様の試みを行った。
【００７７】
結果
Ｌ．ジョンソニイの添加で、実験の間に加水分解された５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）のパーセントを、表１２に示す。Ｌ．ジョンソニイを添加しない対照実験において、５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）の加水分解は観察されなかった。
【００７８】
【表１２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲料を調製するための組成物に関する。組成物は、コーヒー抽出物のクロロゲン酸をフェノール酸に加水分解することができる微生物及び／又は酵素を含む。発明の組成物によって調製された飲料は、改良された抗酸化及び／又は抗炎症性特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー並びにカフェイン及びジテルペン（例えば、カフェストール、カーウェオール）などのコーヒー活性化合物は、げっ歯動物において解毒酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧＳＴ）を誘導することが示された（Ｃａｖｉｎ Ｃ．ら、１９９８年、「コーヒーに特有のジテルペンであるカフェストール及びカーウェオールは、二重機構によってアフラトキシンＢ１に誘導される遺伝毒性を防ぐ（Ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｃａｆｅｓｔｏｌ ａｎｄ ｋａｈｗｅｏｌ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｏｕｇｈ ａ ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）。」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９巻、１３６９〜１３７５頁、Ｃａｖｉｎ，Ｃ．ら、２００３年、「コーヒーのジテルペンは、ラット及びヒトの培養系において、ベンゾ［ａ］ピレンの遺伝毒性を妨げる（Ｃｏｆｆｅｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．）。」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、３０６巻、４８８〜４９５頁、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ら、２００２年ａ、「コーヒー成分であるカーウェオール及びカフェストールによる、ラットの特定の器官における化学的予防酵素であるグルクロニルトランスフェラーゼ及びグルタチオントランスフェラーゼの強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｋａｈｗｅｏｌ ａｎｄ ｃａｆｅｓｔｏｌ．）。」、Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、７６巻、２０９〜２１７頁）。コーヒーにより増進したＧＳＴ活性は、５日間でコーヒー８００ｍｌを摂取した後のヒトにおいて、さらに実証された（Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ，Ｈ．ら、２００５年、「コーヒー摂取は、血漿においてＧＳＴＰを誘導し、（＋／−）−抗−ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシドによって誘導されるＤＮＡ損傷からリンパ球を保護する：対照ヒト介入試験の結果（Ｃｏｆｆｅｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＧＳＴＰ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ （＋／−）−ａｎｔｉ−ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ−９，１０−ｅｐｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌｓ．）。」、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．５９１巻、２６４〜２７５頁）。
【０００３】
この種の抗酸化活性は、例えば癌、心臓病、退行性脳障害、及び老化に関与することがある損傷を与える遊離基を減少させることによって、「酸化ストレス」を防ぐことが知られている。
【０００４】
食物及び飲料製品の健康上の利益を増進させるために、増進した抗酸化活性やその他の有益な生物活性を有する製品を生産することが望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物又は酵素でコーヒー抽出物を処理すると、コーヒー抽出物の抗酸化及び／又は抗炎症性特性を向上することを見出した。さらに、ヒト又は動物が、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる酵素又は微生物と組み合わせてコーヒー抽出物を摂取すると、この処理が生体内で起こり得ることが見出された。
【０００６】
したがって、本発明は、ａ）乾燥コーヒー抽出物、及びｂ）カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む飲料粉末に関する。さらなる態様において、本発明は、ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキットに関する。またさらなる態様において、本発明は、本発明の生成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（ＮＥＳＣＡＦＥ ＲＥＤ ＣＵＰ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００及び４００ｕｇ／ｍｌ、及びラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）で処理したネスカフェプロテクト（ＮＥＳＣＡＦＥ ＰＲＯＴＥＣＴ）（登録商標）２００及び４００ｕｇ／ｍｌで処理したラットの初代培養肝細胞、並びにコーヒー抽出物で処理していない対照試料におけるＧＳＴのサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現を示すウェスタンブロットゲルの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【図２】クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）（ＲＮ）、クロロゲン酸を加水分解する処理をしていないネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）（Ｐ）、及びラクトバチルス・ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）（Ｌａ１−Ｐ）を５％含む食餌を２週間与えた雄性のラットの肝臓中での解毒酵素発現の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）を示すウェスタンブロットの図である。詳細については、実施例１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
コーヒー飲料を調製するためにコーヒー抽出物と混合する組成物、例えばミルク、クリーム、コーヒーホワイトナー、及びコーヒークリーマーは、当技術分野においてよく知られている。かかる組成物は、例えばコーヒーの香り、外見、及び質感を改変するために、消費者によって使用される。組成物は、液体、又は、１杯のコーヒー、例えば淹れたてのコーヒー若しくは純粋な可溶性コーヒーを水中に溶解することによって調製されたコーヒーに溶解及び／又は懸濁させる、例えば粉末のような乾燥形態であってもよい。
【０００９】
本発明の一実施形態において、コーヒー抽出物と混合する組成物は、コーヒークリーマー又はコーヒーホワイトナーである。クリーマーは、乳タンパク質及び／又は乳脂肪を例えばベースにしてもよく、クリーマーは、野菜タンパク質及び／又は野菜脂肪をベースにした非乳製品のクリーマーであってもよい。組成物は、例えば粉末のような乾燥形態であってもよく、水分量は例えば５％未満である。組成物は、液体の形態でもよい。
【００１０】
本発明によるコーヒー抽出物と混合する組成物は、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む。クロロゲン酸は、トランス桂皮酸とキナ酸の間に形成されるエステルのファミリーである。クロロゲン酸は、主にキナ酸の種々の位置に結合したフェノール基（例えばコーヒー基、フェルラ基、クマル基、メトキシ桂皮基）のモノ−及びジエステルとして、コーヒー中に天然に存在する。本発明の一実施形態において、微生物及び／又は酵素は、カフェオイルキナ酸及びジエステル（例えば３−、４−、若しくは５−カフェオイルキナ酸及びジエステル）、及び／又はフェルロイルキナ酸及びジエステル（例えば３−、４−、若しくは５−フェルロイルキナ酸及びジエステル）を加水分解して、コーヒー酸及びフェルラ酸をそれぞれ生成することができる。
【００１１】
本発明の組成物は、貯蔵の間に、微生物及び／又は酵素が、発酵したり又は組成物と反応しないように配合調製するべきである。これは、例えば、乾燥粉末として組成物を配合調製することによって、及び／又は、組成物がコーヒー抽出物と混合されるとき又は消化の間にのみ微生物及び／又は酵素が放出されるように、微生物及び／又は酵素をカプセル封入することによって達成できる。
【００１２】
本発明の組成物は、飲料を調製するためにコーヒー抽出物と混合する組成物中に含有するのに適切な任意の成分をさらに含んでもよい。通常の成分は、例えば、砂糖、人工甘味料、乳化剤、安定剤、増粘剤、流動化剤、着色料、香味料、芳香料等であってよい。適切な人工甘味料としては、サッカリン、チクロ、アセトスルファム、アスパルテームなどのＬ−アスパルチルをベースとする甘味料、及びこれらの混合物が挙げられる。適切な乳化剤としては、モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン、モノ−ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、乳化デンプン、及びそれらの混合物が挙げられる。適切な安定剤としては、リン酸二カリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。適切な流動化剤は、アルミノ珪酸ナトリウムである。一実施形態において、組成物は、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む。さらなる実施形態において、組成物は、乳脂肪及び／又は野菜脂肪を含む。
【００１３】
コーヒー抽出物
本発明によるコーヒー抽出物は、水又は蒸気による生コーヒー豆及び／又は焙煎したコーヒー豆の抽出物である。コーヒー抽出物を生成する多数の方法が、当技術分野において、例えばＥＰ０９１６２６７から知られている。コーヒー抽出物は、例えば純粋な可溶性コーヒーであってもよい。純粋な可溶性コーヒー製品は容易に入手可能であり、純粋な可溶性コーヒー製品を製造する多数の方法が、当術分野において、例えばＥＰ１０６９３０から知られている。
【００１４】
微生物
クロロゲン酸を加水分解することができる微生物は、例えば、本明細書の実施例中に開示されている通り確認することができる。適切な微生物は、酵母、真菌、又は細菌から選択することができる。適切な微生物は、例えば、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばＬ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）などのラクトバチルス、例えばＢ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６）などのビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又は例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母であってもよい。
【００１５】
酵素
適切な酵素は、例えばエステル分解酵素、例えば、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）に由来するクロロゲン酸エステラーゼ（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）、アスペルギルス・オリザエからのタンナーゼ（ＥＣ３．１．１．２０）（日本のキッコーマン株式会社から市販されている）、及びパラターゼ（Ｐａｌａｔａｓｅ）２００００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）（デンマークのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから市販されている）である。酵素は、精製酵素として、又は例えば微生物の細胞可溶化物の形態で存在してもよい。適切な細胞は、例えば、上述の微生物の細胞であってもよい。細胞溶解物を作製する適切な方法は、当技術分野において知られている。
【００１６】
微生物及び／又は酵素は、消化の間にコーヒー抽出物中に存在するかなりの量のクロロゲン酸をフェノール酸に加水分解するための十分な量で存在すべきである。必要とされる微生物及び／又は酵素の量は、例えば、本明細書中の実施例３に記載されているＴＩＭ消化モデルにおいて、消化実験の間に加水分解されるクロロゲン酸の量を測定することによって決定することができる。コーヒー抽出物中に存在するカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）及び／又はフェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）の好ましくは少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％が加水分解される。
【００１７】
部分のキット
一実施形態において、本発明は、ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキットに関する。２つの部分は、飲料の調製のために一緒に販売されるが、製品の包装において物理的に分離されている。消費される最終飲料は、消費直前に２つの部分を混合することによって調製される。１つ又は両方の部分が液体形態である場合、直接混合することができ、場合によっては、さらなる液体、例えば水又はミルクを添加してもよい。２つの部分は、液体、例えば水又はミルクに溶解又は懸濁させることによって混合されてもまたよい。液体を使用する場合、熱い飲料が望まれるか又は冷たい飲料が望まれるかによって、熱くても又は冷たくてもよい。熱い液体が使用される場合、好ましくは、飲料の摂取前に微生物及び／又は酵素を不活化させるほど高くない温度であり得る。
【００１８】
キットの第１の部分は、コーヒー抽出物を含む。好ましい実施形態において、第１の部分は、乾燥形態、例えば粉末の形態である。コーヒー抽出物は、例えば、従来の純粋な可溶性コーヒー粉末、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥コーヒー抽出物であってよい。純粋な可溶性コーヒー粉末は容易に入手可能であり、当技術分野において広範に記載されている。第１の部分は、液体の形態であってもまたよい。液体コーヒー抽出物は、例えばすぐに飲めるコーヒー飲料として、容易に入手可能である。第１の部分は、その他の任意の適切な成分、例えばチコリ抽出物、芳香添加物、安定剤、塩、及び／又は甘味料をさらに含んでもよい。第１の部分は、任意の適切な方法で、例えば、小袋、ビン、又はカンに包装されてもよい。
【００１９】
第２の部分は、クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む。この部分は、本明細書中に記載されている通り、好ましくはコーヒー抽出物と混合する組成物の形態、好ましくはコーヒーホワイトナー又はコーヒークリーマーの形態であってもよい。第２の部分は、その他の任意の適切な成分、例えばコーヒー抽出物と混合する組成物の成分として、本明細書中に記述されている成分などのコーヒークリーマー又はコーヒーホワイトナー中に、通常見出される成分も含んでもよい。第２の部分は、乾燥形態で、例えば粉末として、又は液体形態であってもよく、任意の適切な方法で、例えば小袋、ビン、又はカンに包装されてもよい。第２の部分は、微生物及び／又は酵素が、貯蔵の間に、発酵したり又はその他の成分と反応したりしないように配合調製されるべきである。これは、例えば乾燥粉末として組成物を配合調製することによって、及び／又は、組成物がコーヒー抽出物と混合するとき若しくは消化の間にのみ、微生物及び／又は酵素が放出されるように、微生物及び／又は酵素をカプセル封入することによって達成できる。
【００２０】
少なくとも２つの部分は、任意の適切な方法で一緒に包装することができる。２つの部分は、貯蔵の間、物理的に分離されたままであり、例えば、容器を開けたときに混合される連結した容器に包装してもよく、又は、２つの部分を、飲料の調製のために一緒に販売される分離した容器に包装してもよい。
【００２１】
飲料粉末
一実施形態において、本発明は、ａ）乾燥コーヒー抽出物、及びｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む、飲料粉末に関する。
【００２２】
本発明による飲料粉末は、液体、例えば水又はミルクに粉末を溶解又は懸濁することによる飲料の調製のために使用される粉末である。粉末から調製される飲料は、ブラックコーヒー、カフェラテ、カフェマキアート、カプチーノ、又は他のいかなるコーヒーベースの飲料であっても、例えばよい。
【００２３】
乾燥コーヒー抽出物は、例えば、従来の純粋な可溶性コーヒー粉末、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥コーヒー抽出物であってもよい。純粋な可溶性コーヒー粉末は容易に入手可能であり、当技術分野において広範に記載されている。
【００２４】
微生物及び／又は酵素は、乾燥粉末形態で、例えば凍結乾燥粉末として存在する。微生物及び／又は酵素はカプセル封入してもよい。
【００２５】
飲料粉末は、微生物及び／又は酵素が、貯蔵の間に、発酵したり又はコーヒーの抽出物及び／又はその他の成分と反応しないように配合調製するべきである
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、飲料粉末は、乾燥形態での本明細書中に記載された通りのコーヒー抽出物と混合される組成物を含む。本発明のより好ましい実施形態において、飲料粉末はクリーマーを含む。
【００２７】
飲料粉末は、望ましい飲料を調製するために適切なその他のいかなる成分を含んでもよい。適切な成分は、例えば、当技術分野においてよく知られており、砂糖、人工甘味料、乳化剤、安定剤、増粘剤、流動化剤、着色料、香味料、芳香料等であってよい。適切な人工甘味料としては、サッカリン、チクロ、アスパルテームなどＬ−アスパルチルをベースとする甘味料、及びこれらの混合物が挙げられる。適切な乳化剤としては、モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン、モノ−ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（データエステル）、乳化デンプン、及びそれらの混合物が挙げられる。適切な安定剤としては、リン酸二カリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。適切な流動化剤は、アルミノ珪酸ナトリウムである。一実施形態において、飲料粉末は、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む。別の実施形態において、飲料粉末は、乳脂肪又は野菜脂肪を含む。さらなる実施形態において、飲料粉末は甘味料を含む。
【００２８】
発明の生成物の使用
本発明の生成物は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの解毒酵素を誘導することによって、及びＮｒｆ２−仲介遺伝子発現経路を増加させることによって、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するために使用することができる。増加したＮｒｆ２活性関連遺伝子は、解毒作用を強化し、酸化ストレスに対する内因性防御を刺激することが報告された。
【００２９】
本発明の生成物は、例えばプロスタグランジンＥ２レベルを低下させることによって、炎症を抑制するために使用することができる。
【００３０】
多くの健康問題及び障害は、酸化ストレス及び炎症に関連している。本発明の生成物は、本発明の生成物から調製される飲料を摂取するヒト又は動物における、かかる問題又は障害などを治療又は予防するために使用することができる。関連する問題及び障害は、例えば、例えば紫外線放射によって引き起こされる光損傷、アトピー性皮膚炎、湿疹、落屑性、掻痒性、アレルギー性症状などの皮膚障害、脳障害、炎症、肥満、並びに、例えば皮膚癌及び肺癌などの癌である。
【００３１】
本発明の生成物は、例えば血糖値を低下させることによる及び／又はレプチン、インシュリン、及び／又はｃ−ペプチドの血中濃度を上昇させることによる抗糖尿病薬として、例えば骨ミネラル濃度を上昇させることによる、例えばエストロゲン及び／又はプロゲステロンの血清濃度及び／又はアルカリホスファターゼ活性を上昇させることによる骨再構築剤として、例えば抗血管新生効果を有する抗転移薬としても使用することができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニイの新鮮細胞によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物）３０ｍｇ／ｍｌを添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３３】
同一の反応条件下であるが細菌なしで、平行して反応対照を実施した。
【００３４】
ラクトバチルス・ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の細胞を成長させ（７．０Ｅ０８ｃｆｕ／ｍｌ）、遠心分離した（５０００ｇ、１０分）。０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。次に、ガラスビーズ法を使用して、細胞を溶解させた。細胞調製物６００μｌをスクリューキャップチューブに入れ、０℃でガラスビーズ６００μｌを添加した。次に、チューブをミニビードビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）中に強振動下で１分間入れ、氷で冷却し、ミニビードビーター中に、さらに１分間入れた。次に、ネスカフェプロテクト（登録商標）（３０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０）の溶液９００μｌに、粗細胞抽出物を添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。異なる反応時間で試料を抜き出し、遠心分離し（３０００ｇ、５分）、０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）を通して濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００３５】
ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理
ネスカフェプロテクト（登録商標）３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３６】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理
乾燥生コーヒー抽出物３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１ｍｌ又は水１ｍｌに溶解した。この溶液に、ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物（３．３Ｅ９ｃｆｕ／ｇ）１０ｍｇを添加した。次に、混合物を３７℃でインキュベートし、異なる反応時間で試料を抜き出した。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過（０．４５μｍ孔径のシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３７】
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）の濃縮調製物でのネスカフェ（ＮＥＳＣＡＦＥ）（登録商標）の処理
ネスカフェスペシャルフィルター（ＮＥＳＣＡＦＥ ＳＰＥＣＩＡＬ ＦＩＬＴＲＥ）（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の乾燥抽出物）４００ｍｇを沸騰水１ｍｌに溶解し、室温で３７℃まで、この溶液を冷却した。このコーヒー溶液２５０μｌに、ラクトバチルス・ジョンソニイの異なる量の濃縮調製物（５０μｌ、１００μｌ、３５０μｌ、７５０μｌ）を添加し、水で１ｍｌになるまで量を調整した。次に、混合物を３７℃で２時間及び４時間インキュベートした。遠心分離（３０００ｇ、５分）及び濾過後、ＨＰＬＣによって、試料を分析した。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析
コーヒー試料を１％ｗ／ｗに希釈し、ＣＣ２５０／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５−Ｃ１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。溶離系は、流量１ｍＬ／分で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水、０．１％ＴＦＡ、及びＣＨ３ＣＮであった。この方法により、外部標準検量線を使用して、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）、フェルロイルキナ酸（ＦＱＡ）、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）、フェルオイルキナ酸−ラクトン、コーヒー酸（ＣＡ）、及びフェルラ酸（ＦＡ）を同時に測定（３２５ｍｍでの吸光度）できた。時間０（ｔ０）での基準、又は細菌なしでの同時間の基準に対して結果を示した。
【００３９】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ネオマイシン選択可能マーカーを含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドと一緒に、ラットのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡ２（ＧＳＴＡ２）中に存在するＡＲＥ８コピーを含むｐＧＬ−８ｘＡＲＥを、ヒトＭＣＦ７細胞に安定的に形質移入した（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６巻、１０９８３〜１０９９４頁、２００６年）。ＡＲＥ（抗酸化剤応答配列）は、解毒作用及び酸化ストレスに対する内因性防御に関与する遺伝子を制御する転写因子Ｎｒｆ２の結合部位である。プラスミドｐＧＬ−８ｘＡＲＥは、Ｎｒｆ２活性の監視を可能にする、８個のＮｒｆ２結合部位の下流にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００４０】
コーヒーでの処理のために、ＤＭＥＭ成長培地の９６ウェルマイクロタイタープレートにＡＲＥｃ３２細胞を播種した。異なるコーヒーで２４時間処理した後、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４１】
タンパク質発現
コラゲナーゼ溶液でのスプラーグドーリーラットの肝臓の灌流によって、初代培養肝細胞を得た（Ｓｉｄｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０１巻、１０３〜１１３頁、１９９３年）。トリパンブルー排除試験によって測定された細胞生存率は９０〜９５％の間の範囲であることがわかった。２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１０ｍＭヘペスｐＨ７．４を、ＩＴＳ＋、ペニシリン／ストレプトマイシン１５０００Ｕ、１００ｎＭデキサメタゾン、及び５％ウシ胎仔血清（ハイ−クローン）を補ったウィリアムス培地３ｍｌで、６０ｍｍプラスチック組織培養皿上に、１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。肝細胞を２時間付着させ、次に、ＥＢＳＳで洗浄して、細胞片及び付着しなかった細胞を除去した。デキサメタゾン２５ｎＭを含む、新鮮な血清を含まない培地を添加し、次に、マトリゲルのオーバーレイ（２３３ｇ／ｍｌ）を適用した。培地交換に続いて、２日に一度、新鮮なマトリゲルを培養物に添加した。解毒酵素及び抗酸化タンパク質発現についてのコーヒーの効果を研究するために、タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析の前に、４８時間の細胞播種の２４時間後に、培地に試験材料を添加した（Ｃａｖｉｎら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘ．、４６巻、１２３９〜４８頁、２００８年）。
【００４２】
プロスタグランジンＥ２の生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞を、異なるコーヒーで１５時間処理し、続いて炎症誘発剤ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に６時間共培養した。競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して、ＨＴ−２９細胞中のＰＧＥ２生成の分析を測定した（Ｃａｖｉｎら、ＢＢＲＣ、３２７巻、７４２〜４９頁、２００５年）。
【００４３】
結果
フェノール酸生成のためのクロロゲン酸の加水分解
実験１：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ新鮮細胞でのネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実験２：様々な反応時間及び細胞調製物量による、Ｌ．ジョンソニイ抽出物（溶解細胞）によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
実験３：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物によるネスカフェプロテクト（登録商標）の処理。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験４：ラクトバチルス・ジョンソニイの噴霧乾燥調製物での生コーヒー抽出物の処理。結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
実験５：ラクトバチルス・ジョンソニイの濃縮調製物でのネスカフェ（登録商標）の処理。結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表６は、クロロゲン酸を加水分解するための処理をしなかった生コーヒー豆の抽出物（対照試料）の２つの異なる試料における、いくつかの化合物の絶対濃度を示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
タンパク質の発現
ラット初代培養肝細胞において、ネスカフェレッドカップ（登録商標）（焙煎したコーヒー豆の抽出物）２００ｕｇ／ｍｌは４８時間の処理後、ウェスタンブロットにより、４００ｕｇ／ｍｌで、ＧＳＴサブユニット（ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１）及びヘム−オキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質発現の増加をもたらさず、ＧＳＴＰ１及びＨＯ−１発現の弱い誘導をもたらした。対照的に、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＰ１、及びＨＯ−１について、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）２００ｕｇ／ｍｌ及び４００ｕｇ／ｍｌの両方で、異なるタンパク質発現のより強い誘導を観察した。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図１に示す。
【００５６】
ネスカフェレッドカップ（登録商標）対ネスカフェプロテクト（登録商標）及びＬ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）を５％有する食餌を２週間与えたオスのラットの肝臓において得られたデータは、ラット初代培養肝細胞において観察された効果を確認した。未処理のネスカフェプロテクト（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）及び未処理のネスカフェレッドカップ（登録商標）（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）と比較して、解毒酵素発現の最強の誘導（ＧＳＴＰ１、ＮＱＯ１）が、Ｌ．ジョンソニイで処理したネスカフェプロテクト（登録商標）について見られた。結果を、ウェスタンブロットゲルとして図２に示す。
【００５７】
抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）ルシフェラーゼ分析
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物は、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表７を参照されたい）。
【００５８】
【表７】
【００５９】
プロスタグランジンＥ２生成のアッセイ
ヒト結腸ＨＴ−２９細胞で、Ｌ．ジョンソニイで処理した生コーヒー抽出物の潜在的な抗炎症性効果を分析した。炎症誘発剤ＴＮＦ−αによる処理後、結腸細胞においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルが誘導される。この研究において、異なるコーヒー抽出物（クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない生コーヒー抽出物、及びＬ．ジョンソニイで２４時間処理した異なる生コーヒー抽出物）で、細胞を２４時間前処理した。実験の最後の６時間に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。データ（表８を参照されたい）は、ＴＮＦ−αで処理した対照細胞と比較した、ＰＧＥ２生成のコーヒーによる明白な用量依存的減少を示した。
【００６０】
【表８】
【００６１】
実施例２
コーヒー試料
１００％ロブスタ生豆からの生コーヒー抽出物
ネスカフェプロテクト（登録商標）、生及び焙煎したコーヒー豆の乾燥共抽出物
【００６２】
酵素及び細胞
微生物 培地
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５） ＭＲＳ
ビフィズス菌ラクティスＢＢ１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３４４６） ＭＲＳ＋システイン
ビフィズス菌ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９） ＭＲＳ＋システイン
【００６３】
アスペルギルス・ジャポニクス（日本のキッコーマン株式会社）由来のクロロゲン酸エステラーゼ（２４Ｕ／ｇ）。
アスペルギルス・オリザエ（日本のキッコーマン株式会社）からのタンナーゼ
【００６４】
細菌細胞の調製
攪拌せずに、嫌気性環境で、３７℃での培地における１６時間の培養に対応する静止期に十分到達した後で、試験した菌株を採取した（５０００ｇで１０分間の遠心分離）。菌株の最初の活性化のために、凍結保存培養物を新鮮な培地中に植菌し、一晩成長させた。この前培養物を使用して、培養物を植菌した。
【００６５】
細菌細胞でのコーヒー抽出物の処理
細菌の培養及び遠心分離の後で、０．６１ｇ／ｍｌの濃度で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にペレットを再懸濁した。この細胞調製物２００μｌに、コーヒー溶液（３％）８００μｌを添加し、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。
【００６６】
クロロゲン酸エステラーゼでのコーヒー抽出物の培養
コーヒー溶液（３％）８００μｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ中のクロロゲン酸エステラーゼ（２５ｍｇ）の溶液を添加した。次に、３７℃で、４時間、１６時間、及び２４時間、混合物をインキュベートした。反応時間の後で、熱処理（３分、９０℃）によって酵素活性を止め、分析の前に混合物を濾過した。
【００６７】
ＡＲＥルシフェラーゼ分析
実施例１の通り
【００６８】
結果
ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥレポーター構築体の数コピーで、安定的に形質移入されたヒト乳癌細胞（ＡＲＥｃ３２）を使用して、コーヒーによる抗酸化Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を実証した。クロロゲン酸を加水分解するための処理をしていない（未処理）生コーヒー抽出物、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌｊ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、ビフィズス菌ラクティス（Ｂｌ）で２４時間処理した生コーヒー抽出物、及びクロロゲン酸エステラーゼ（ＣＥ）で４時間処理した生コーヒー抽出物は全て、Ｎｒｆ２−ルシフェラーゼレポーター活性における用量依存的上昇をもたらした（表９）。
【００６９】
【表９】
【００７０】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、生コーヒー抽出物を処理して、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１０に示す。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
異なる微生物及びクロロゲン酸エステラーゼで、ネスカフェプロテクト（登録商標）を処理し、クロロゲン酸を加水分解した。結果を表１１に示す。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
実施例３
胃小腸モデル（ＴＩＭ）
胃小腸モデルであるＴＩＭ−１は、胃、十二指腸、空腸、及び回腸をそれぞれ表わす４つの連結した区画を含む。各区画は、可撓性の内壁を有するガラスの外壁からなる。可撓性の壁は、壁を圧迫する３７℃の水で囲まれており、胃−腸管におけるぜん動運動によって分泌された酵素で、食物の混合を確実に行う。
【００７５】
胃−腸管の平均的な生理的条件下で、モデル内での実験を実施した。実験の間、温度を３７℃で維持し、唾液、胃液、胆汁、及び膵液の分泌を模擬実験した。モデル内の消化過程を６時間監視した。最初の３．５時間に、胃の内容物は小腸「幽門弁」内へ徐々に送達された。実験の終了時には、約８０％の小腸内容物が回盲弁を介して「大腸」内へ徐々に送達された。胃のｐＨは、１ＭのＨＣｌの分泌によって、約５時間で、６．５から２．０へ徐々に低下した。小腸内容物のｐＨは、十二指腸内で６．５、空腸内で６．８、及び回腸内で７．２を維持した。約５０００ダルトンの分子量カットオフを有する中空繊維膜を通して、透析液を汲み出すことによって、空腸及び回腸の区画から、消化産物及び水を吸収した。
【００７６】
コーヒー抽出物消化模擬実験
ネスカフェプロテクト（登録商標）（生及び焙煎したコーヒー豆の共抽出物）４．５ｇを、酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）３１０ｍｌに溶解した。出発残留物（ペプシン５ｇ及びリパ−ゼ酵素５ｇ溶液）１０ｍｌ添加後、ＴＩＭの胃の区画内へ溶液を注入した。消化の間、全透析液を０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間に収集した。６時間の実験の後で、胃、十二指腸、空腸、及び回腸の区画からの残留物を分析し、クロロゲン酸の物質収支を算出した。実施例１に記載の通り、孔径０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＨＡ０２５ＢＳ）に試料を通過させ、ＨＰＬＣによって分析した。ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）での実験では、出発残留物１０ｍｌを添加した後で、Ｌ．ジョンソニイの噴霧乾燥調製物を全部で３．３Ｅ９ｃｆｕ含む酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）３１０ｍｌを、胃の区画内に入れた。次に、消化模擬実験を始めた１５分後に、ネスカフェプロテクト４．５ｇを含む酢酸緩衝液１０ｍｌを、注射器によって胃の区画内へ注入した。消化の間、空腸及び回腸の区画に連結した半透性の中空繊維膜を通過させた後、０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間に、全透析液を収集した。０〜２、２〜４、及び４〜６時間の間、全回腸送達物を収集した。ネスカフェプロテクト（商標登録）の添加の直後及び１時間の時点で、胃の区画からアリコート（１ｍｌ）を取った。６時間後、胃、十二指腸、空腸、及び回腸の区画からの残留物をＨＰＬＣによって分析して、５−カフェオイルキナ酸の物質収支を算出した。ネスカフェクール（ＮＥＳＣＡＦＥ ＣＯＯＬ）（登録商標）（クリーマー及び甘味料を有する焙煎したコーヒーの抽出物）、及びクリーマーを添加した、焙煎及び挽いたコーヒーの通常のフィルターで淹れたもの、及び市販されている５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）で、同様の試みを行った。
【００７７】
結果
Ｌ．ジョンソニイの添加で、実験の間に加水分解された５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）のパーセントを、表１２に示す。Ｌ．ジョンソニイを添加しない対照実験において、５−カフェオイルキナ酸（５−ＣＱＡ）の加水分解は観察されなかった。
【００７８】
【表１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）乾燥コーヒー抽出物、及び
ｂ）カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物及び／又は酵素
を含む、飲料粉末。
【請求項２】
クリーマーを含む、請求項１に記載の飲料粉末。
【請求項３】
甘味料を含む、請求項１又は２に記載の飲料粉末。
【請求項４】
乳タンパク質及び／又は乳脂肪を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飲料粉末。
【請求項５】
カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物が、乳酸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飲料粉末。
【請求項６】
ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及び
ｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分
の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキット。
【請求項７】
第１の部分が純粋な可溶性コーヒーを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
第２の部分が、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
第２の部分が、クリーマー及び／又は甘味料を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物が、乳酸菌である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
飲料粉末又はキットから調製された飲料を消費するヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飲料粉末又は請求項６〜１０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項１】
ａ）乾燥コーヒー抽出物、及び
ｂ）カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物及び／又は酵素
を含む、飲料粉末。
【請求項２】
クリーマーを含む、請求項１に記載の飲料粉末。
【請求項３】
甘味料を含む、請求項１又は２に記載の飲料粉末。
【請求項４】
乳タンパク質及び／又は乳脂肪を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飲料粉末。
【請求項５】
カフェオイルキナ酸及びジエステルを加水分解して、コーヒー酸を生成することができる微生物が、乳酸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飲料粉末。
【請求項６】
ａ）コーヒー抽出物を含む第１の部分、及び
ｂ）クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物及び／又は酵素を含む第２の部分
の少なくとも２つの部分を含む、飲料を調製するためのキット。
【請求項７】
第１の部分が純粋な可溶性コーヒーを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
第２の部分が、乳タンパク質及び／又は野菜タンパク質を含む、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
第２の部分が、クリーマー及び／又は甘味料を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
クロロゲン酸を加水分解して、フェノール酸を生成することができる微生物が、乳酸菌である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
飲料粉末又はキットから調製された飲料を消費するヒト又は動物において、生体内で抗酸化能力を強化するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飲料粉末又は請求項６〜１０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５１８５６９（Ｐ２０１１−５１８５６９Ａ）
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６６２５（Ｐ２０１１−５０６６２５）
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２８８７
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２８８７
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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