化学修飾タンパク質組成物及び方法
本発明は、広くはタンパク質修飾の分野に関し、より詳細には、水溶性ブロックポリマー、薬剤へのこれらの結合、及びこれらを製造する方法及びこれらの使用方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くはタンパク質修飾の分野に関し、より詳細には、水溶性ブロックポリマー、薬剤へのこれらの結合、及びこれらを製造する方法及びこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤への水溶性ポリマーの結合は、分子の溶解度、耐久性及び有効性の増強を提供することができる。例えばタンパク質をポリマーに結合するとき、この修飾は、立体相互作用を通して物理的接触をブロックし、分解を防ぐことによってタンパク質分解を阻止し得る。付加的な利点は、ある種の状況下で、薬剤の安定性と循環時間を上昇させること及び免疫原性を低下させることを含む。
【０００３】
薬剤への結合のために最も一般的に使用される水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。「ＰＥＧ化する（ＰＥＧｙｌａｔｅ）」という用語は、少なくとも１個のＰＥＧ分子の第二分子への結合を意味するようになった。ＰＥＧ分子は、構造内の反復単位の数に基づいて大きさが異なり、典型的には分子量で表わされ、例えば数百ダルトンから４０−５０キロダルトン又はそれ以上である。
【０００４】
ＰＥＧ化は治療タンパク質の血清半減期を延長することができ、これによってこの効果期間を上昇させ、投与頻度を低下させ得る。ＰＥＧがタンパク質ベースの薬剤の血清半減期を上昇させる１つの機構は、タンパク質分解から保護することによる、Ｓａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７１：１３７−１３９（１９９１）。実際に、レプチンのＮ末端における１個の２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーによる化学修飾は、非修飾天然タンパク質に比べて投与すべきレプチンの必要量の低下を生じさせ、溶解度を上昇させる；例えばＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９６／４０９１２号参照。総説については、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ．（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．ｐｐ．３６７−３８３（１９８１））参照。
【０００５】
実際に、ＰＥＧはいくつかの市販の治療タンパク質に結合されており、この例は、重症複合免疫不全症を治療するためのＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（登録商標））；好中球減少症を治療するためのＮｅｕｌａｓｔａ（商標）（ペグフィルグラスチム）；Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）Ｖｉａｌ（ペルフルトレン脂肪ミクロスフェア）注射用懸濁液（ＰＥＧ）；先端巨大症を治療するためのＳｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）（ペグビソマント）；急性リンパ芽球性白血病又は非ホジキンリンパ腫の治療のためのＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））；及び肝炎を治療するためのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ａ）及びＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ｂ）を含む。
【０００６】
しかし、このような化学修飾に関連した制限がある。例えば慢性適用における及び／又は比較的多量でのこれらの結合体の使用は、分解に対する抵抗性の故に高分子量ポリマーの蓄積をもたらし得る。加えて、ＰＥＧ−薬剤結合体は、高用量で長期にわたって定期的に投与したとき腎空胞に蓄積することが認められた；例えばＣｏｎｏｖｅｒら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ，２１（５）：３６９−３７８（１９９７）；Ｂｅｎｄｅｌｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４２：１５２（１９９８）参照。このような空胞が個人の健康に有害であるかどうかは不明であるが、薬剤投与は関連するいかなる異常も伴わないことが好ましい。そこで、薬剤に結合した水溶性ポリマーを得ることは、この水溶性ポリマーが、例えば腎空砲の形成によって測定したとき、望ましくない蓄積を伴わずに患者の体内から排出される場合、有益である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、不安定結合基によって連結された水溶性ブロックポリマー、これらを製造する方法及びこれらを使用する方法に関する。従って、本発明の１つの態様は、リンカーを通してもう１つ別の同じ（ブロックホモポリマー）又は異なるポリマー（ブロックコポリマー）に共有結合されたポリマー及びこれらを使用するための方法を含み、該ポリマー−リンカー構造は、必要とされるブロックポリマー長を達成するためにもう１つ別のポリマー−リンカーに繰り返し結合することができる。１つの実施形態では、Ａはポリマーを表わし、Ｂはリンカーを表わす。従って、ブロックホモポリマーは（Ａ−Ｂ）ｎ［式中、ｎは反復単位の所望数を表わす整数である］の構造を有する。
【０００８】
別の実施形態では、１個のポリマーをＡで表わし、リンカーをＢで表わし、第二の異種ポリマーをＣで表わす。このブロックコポリマーの例では、ポリマー全体では、所望Ａ−Ｂ又はＣ−Ｂ単位を交換可能に含むことができ、これらの単位は交代することができ、例えばｎが１−１，０００である（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−）ｎ又はブロックコポリマーは、このポリマー内で互いに対して可変数の各ポリマー型を有し得る。
【０００９】
別の実施形態では、不安定リンカーは、水溶性ポリマーの内部分子結合よりも加水分解及び／又はタンパク質分解を受けやすい。従って、薬剤に結合した水溶性ブロックポリマーは、反復して及び／又は慢性的に投与されたとき、例えばＰＥＧ化後に、伝統的水溶性ポリマーへの結合によって提供される利点と一致する血清半減期延長及び／又は抗原性低下を示すが、腎空胞形成によって測定される望ましくない蓄積を低減又は排除する。
【００１０】
以下でより詳細に述べるように、本発明は、タンパク質又はこの類似体を含む薬剤を化学修飾することに関する多くの態様を有する。ある態様では、本発明は、治療タンパク質に結合した水溶性ブロックポリマーの結合に関する。特定態様では、タンパク質治療薬は、レプチン、可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦＲ）及びＬ１−７と称されるペプチドから選択される。
【００１１】
ここで使用する、水溶性ブロックポリマーは、５００ダルトンから３，０００ダルトンまでのより小さなポリマーフラグメントと、分解に対して加水分解的又はタンパク質分解的に感受性である、ポリマーブロックの間のリンカーから構築される。代表的ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、代表的結合はアミド基を通した結合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーと薬剤、特にタンパク質治療薬の結合は、抗原性の低下及び血清半減期の延長を含む重要な治療上の恩恵を与える。しかし、より高い分子量のポリマー、例えば５ｋＤａ以上のＰＥＧの慢性又は高用量投与は、例えば腎空胞におけるポリマーの蓄積によって測定したとき、被験者からの排泄遅延をもたらし得る。
【００１３】
これに対し、より低い分子量形態のポリマー、例えば２ｋＤａ未満のＰＥＧは、腎空砲に蓄積されることなく血清から清掃されることが発見された。実際に、ＰＥＧの分子量が高くなると共に空胞形成が上昇する傾向がある（図１）。これらの実験において、様々な分子量、すなわち１、２及び２０ｋＤａのＰＥＧの等量をレプチン分子にモノＰＥＧ化したとき、腎空胞形成を誘発した２及び２０ｋＤａのＰＥＧ−レプチン結合体と異なり、１ｋＤａのＰＥＧ−レプチン結合体だけは測定可能な腎空胞形成を示さなかった。分子量傾向はこれらのポリＰＥＧ化レプチンに関しても当てはまり、またレプチンを１ｋＤａ ＰＥＧで多重ＰＥＧ化したとき、腎空胞スコアはＰＢＳ対照又は非修飾レプチンに比肩し得た。さらに、１ｋＤａ ＰＥＧ化レプチンは、インビボでレプチンと等しい活性を有し、生理的ｐＨでより可溶性であり、高濃度で注射部位反応を引き起こさず、腎空胞形成の証拠を示さないことが認められた。しかし、より小さいＰＥＧ、例えば５ｋＤａ未満のＰＥＧを薬剤に結合したときは、より大きなＰＥＧ結合体、例えば２０ｋＤａ ＰＥＧの結合体に関して認められるような血清半減期上昇は提供されない。
【００１４】
そこで、発明者は、約１ｋＤａを有する水溶性分子のブロックを、総ブロックポリマーの大きさが１０ｋＤａ以上であるように、不安定結合を通して同種又は異種ブロックのいずれかに連結することによって血清半減期が上昇することを発見した。重要な点として、この上昇は非ブロックポリマーへの結合に比肩し得るものであり、従来のＰＥＧ化タンパク質の慢性投与で認められる腎空胞形成は低減するか又は排除される。
【００１５】
従って、本発明は、ブロックポリマー、これらの分子を製造し、使用する方法、及び薬剤に結合したブロックポリマーに関する。本発明のブロックポリマーは、高分子量ポリマーの薬理的恩恵、例えば血清半減期上昇及び免疫原性低下を示すが、より分解性であり、従って望ましくない性質を有さないと考えられる。以下で述べる、本発明のブロックポリマーの一例に結合した薬剤の実施例が提供され、これらは、２０ｋＤａ ＰＥＧによってＮ末端でモノＰＥＧ化されている治療分子と同様の薬物動態学的特性を有する。しかし、水溶性ブロックポリマー結合分子は、２０ｋＤａポリマーでＰＥＧ化されたものと異なり、慢性投与時に腎空胞の形成を誘発する傾向が低いことをさらに明らかにする。
【００１６】
ブロックポリマーの大きさは、好ましくは約１０から５０ｋＤａ、より好ましくは約１５から４０ｋＤａ、さらに一層好ましくは約１５から３０ｋＤａであり、代表的な大きさは２０ｋＤａである。種々の水溶性ポリマーは性質に関して多少の変動性を有し、従って理想的な大きさは結合する薬剤との使用に応じて決定される必要があることは、当業者には容易に了解される。理想的組成物及びまた、ブロックポリマー中のブロックの大きさ及びブロックポリマーの大きさを決定するための実験は、ここでの開示に照らすと単なる常套的な実験である。
【００１７】
ここで使用するとき、「不安定結合」は、水溶性ポリマーにおいて認められる通常の分子結合よりもプロテアーゼ又は加水分解のいずれかによる破壊に対してより感受性であることと理解される。
【００１８】
本ブロックポリマー組成物に関しては、様々な水溶性ポリマー（分子量、分枝等別に）、反応混合物中の水溶性ポリマー対薬剤分子の比率、実施する結合反応の種類、選択した結合薬剤を入手する方法、及び使用する薬剤の種類から選択し得る。
【００１９】
ブロックポリマーは、これが結合する薬剤が生理環境などの水性環境において沈殿しないように、水溶性であるべきである。ポリマーは分枝又は非分枝のいずれでもよい。好ましくは、最終生成物製剤の治療用途のために、ポリマーは医薬的に許容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療的に使用されるかどうか、もしそうであれば、所望用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性この他のような配慮に基づいて所望ポリマーを選択することができる。
【００２０】
薬剤への結合に適する典型的な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸、デキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル及びポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。これらのポリマー−薬剤結合体製剤のいくつかは、改善された薬理的性質、例えば血清半減期の延長、改善された安定性、溶解度を有することが示されており、及び／又は免疫原性の低下も認められた（Ｔｒａｋａｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０（１−２）：４２−９（２００１））。
【００２１】
本発明のブロックポリマー中のブロックのために有用な水溶性ポリマーに関して、分子量は約５００ダルトンから約３０００ダルトンの間である。ここで使用するとき、「約」という用語は、水溶性ポリマーの製剤において、一部の分子は指定分子量よりも重く、また別の分子はより軽いこと、及び指定分子量は単に製剤からとった平均であることを示す。所望治療プロフィール（例えば所望する持続放出の期間、もしあれば、生物活性への作用、取り扱いの容易さ、抗原性及び治療タンパク質又は類似体へのポリエチレングリコールの他の公知の作用の程度又は欠如）に依存して、他の大きさも使用し得る。従って、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約１，６００、約１，７００、約１，８００、約１，９００、又は約２，０００のポリマーが本発明に従って使用できると考えられる。以下の実施例は、精製の容易さのため及び適切なモデル系を提供するために選択した、ＰＥＧ１０００の使用を含む。
【００２２】
特定実施形態では、本発明の水溶性ポリマーは、薬剤のための担体として有用なＰＥＧベースのブロックポリマーである。この実施例では、アミド基によって連結されたブロックポリマーを生産するための二官能性低分子量ＰＥＧジアミン（すなわち３，０００ダルトン未満）と二官能性酸の１段階重付加重合によってポリマーを合成することができる。チオール反応性ポリマー末端基は、マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルとアミノ末端基の反応によって形成した。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明のポリマー中のリンカーは、二塩基酸、例えばオキサリルクロリドである。より特定すると、１つの実施例ではブロックポリマー−薬剤結合体は、以下の式：Ｒ’−［−ＨＮ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−］ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−Ｓ−薬剤［式中、Ｒ’はマレイミドなどの二官能基であり、Ｒはスペーサー分子であって、炭素、メチレン又は分子の構造及び機能を妨げない他の何らかの基であり得、ｎは１０から５００であり、及びｘは５から２５である］を有する。
【００２４】
別の実施例では、ブロックポリマー−不安定リンカーは、式：Ｒ’−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−［−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−］ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−薬剤［式中、薬剤はタンパク質又はペプチドであり得、式中、ｘは１−１０００であり、及びＲとＲ’は結合基である。別の実施形態では、ブロックポリマーは、以下の式：Ｒ−［−Ｃ（＝Ｏ）−ＰＥＧ１Ｋ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＰＥＧ１Ｋ−ＮＨ−］ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−ｓ−薬剤［式中、ｎは３から３０、より好ましくは５から２５、より好ましくは７から２０、最も好ましくは１０−１５である］を有する。どちらの場合もＲ基は適切なキャッピング基であり得る。これらの実施例のどちらにおいても、マレイミドを薬剤上の遊離チオールと反応させて、薬剤とのチオエーテル結合を形成する。本発明のポリマーは、このポリマーが結合するシステイン残基を含むタンパク質である薬剤に結合すると考えられる。
【００２５】
以下の実施例では、ＰＥＧベースのブロックポリマーを、ブロックポリマー−薬剤結合体を生産するために可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦＲ）、ペプチドＬ１−７、及び遊離システインを含むレプチン分子に結合した。しかし、本発明のポリマーは、これらがポリマーと結合するための適切な連結基を有する限り、タンパク質、ペプチド（例えば精製天然、組換え、融合、突然変異又は合成タンパク質及び／又はペプチド）を含むいかなる治療分子、又は他の分子にも結合できることは了解される。
【００２６】
ここで有用なタンパク質及びペプチドの代表的な例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及び他のアイソタイプを含む抗体、Ｂ１アンタゴニストペプチド、インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養増殖因子（ＮＧＦ）、オステオプロテグリン（破骨細胞形成抑制因子）（ＯＰＧ）などの骨成長因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨誘導因子（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及びカリクレインを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーの結合に適用できる方法は、ここで述べるブロックポリマーの結合にも適することが理解される。そこで、一般に、ポリエチレングリコールのような水溶性分子は、薬剤上に認められる反応基によって薬剤に結合される。リシン残基上又はタンパク質のＮ末端などのアミノ基はこのような結合のために好都合である。例えばＲｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、上記）は、酵素へのポリエチレングリコール分子の結合のために還元的アルキル化を使用したと述べている。欧州特許第０ ５３９ １６７号は、遊離アミノ基を有するペプチド及び有機化合物をＰＥＧの中間誘導体又は関連水溶性有機ポリマーで修飾することを述べている。１９９０年２月２７日発行のＳｈａｗへの米国特許第４，９０４，５８４号は、反応性アミン基によるポリエチレングリコール分子の結合のためのタンパク質中のリシン残基の数の修飾に関する。
【００２８】
水溶性ポリマーの結合のための付加的な方法も使用可能である。例えば米国特許第４，１７９，３３７号；及び米国特許第４，００２，５３１号参照。米国特許第５，８２４，７８４号は、Ｎ末端モノペグ化タンパク質を開示しており、「Ｎ末端モノペグ化」は、タンパク質部分がＮ末端で１個のポリエチレングリコール部分に結合していることを表わし、前記タンパク質は、中でも特に、長い血清半減期及び改善された安定性を示す。
【００２９】
さらに別の実施形態では、薬剤を２個以上のポリマーに結合する。そこで、様々な数のブロックポリマー部分を薬剤に結合し得る（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−等）。同様に、ポリマー−薬剤結合体の組合せを混合物として組合せてもよい。
【００３０】
欧州特許第０ ４０１ ３８４号は、ポリエチレングリコール分子が結合したＧ−ＣＳＦを作製するための材料及び方法を述べる。Ｇ−ＣＳＦ及びコンセンサスインターフェロンを含む治療タンパク質のＮ末端特異的ＰＥＧ化の一般的方法は、米国特許第５，９８５，２６５号の中で教示される。加えて、ペグ化ＩＬ−６は、ＩＬ−６に結合したポリエチレングリコール分子を開示する米国特許第５，２６４，２０９号において教示される。さらに、国際公開公報第ＷＯ／８５０３８６８号は、リンホカインをポリエチレングリコールのアルデヒドと反応させることを報告している。
【００３１】
一般に、本発明の実施において有用な薬剤は、化学合成手順から又は天然哺乳生物から又は選択的に、ゲノム又はｃＤＮＡクローニング又はＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核又は真核生物宿主発現から単離された形態であり得る。適切な原核生物宿主は、様々な細菌（例えば大腸菌）を含み、適切な真核生物宿主は、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及び哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）を含む。例えば細胞において発現される外来性ＤＮＡ配列の産物であるタンパク質は、発現の結果として、α−アミノ基を有するＮ末端メチオニル残基を有し得る。上記で指摘したように、ペプチドミメティック及び他の修飾タンパク質と同様に、ペプチドが包含される。使用する宿主細胞に依存して、タンパク質の発現産物は哺乳動物又は他の真核生物炭水化物でグリコシル化され得るか、又は非グリコシル化され得る。
【００３２】
タンパク質発現産物はまた、初期メチオニンアミノ酸残基（−１位）を含んでもよく、成熟形態へと翻訳後切断され得る、例えばシグナルペプチドを含む分泌タンパク質は切断されたシグナルペプチドを有し得る。タンパク質類似体及び非天然タンパク質、例えばコンセンサスインターフェロンも、米国特許第５，８２４，７８４号及び同第５，９８５，２６５号に述べられている方法に適する。
【００３３】
一般に、本発明における薬剤及びこの類似体の有用性は、薬剤を化学修飾するためにここで提供する化学修飾手順を実施すること、及び生じた生成物を、生物活性アッセイなどの所望特徴に関して試験することによって確認され得る。タンパク質の場合は、非ヒト哺乳動物を処置するとき所望に応じて、組換えマウス、ウシ、イヌ等のような組換え非ヒトタンパク質を使用し得る。例えばＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９１０５７９８号及びＰＣＴ 国際公開公報第ＷＯ８９１０９３２号参照。
【００３４】
さらに、本発明の組成物及び方法は、医薬組成物の製剤、治療方法及び薬剤の製造の方法を含む。
【００３５】
ブロックポリマー対薬剤分子の比率は、反応混合物中のこれらの濃度と同様に、様々である。一般に、最適比率は選択するポリマーの分子量によって決定される。加えて、１つの実施例は、所望ポリマー−薬剤種の非特異的ペグ化及び後の精製を含み、この比率は、使用可能なアミン反応基（典型的にはアミノ基）又は使用可能な遊離チオール基の数に依存し得る。モノ−ポリマー物質を得るための薬剤対ポリマー分子の低い反応比率の一例は、一般に薬剤分子当り１．５ポリマー分子である。この比率は、タンパク質対ＰＥＧ結合体において得に有用である。
【００３６】
水溶性ポリマー、例えばここで述べるブロックポリマーを、ポリマー部分とタンパク質部分の間に結合基を含まないタンパク質に連結する有用な方法は、Ｆｒａｎｃｉｓら（Ａｈｅｒｎ．，Ｔ．及びＭａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．編集）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に述べられている。また、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｆｉｓｈｅｒら編集、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．，１９８９ ｐｐ．２１１−２１３は、ポリエチレングリコール部分とタンパク質部分の間に結合基を生じない、塩化トレシルの使用を含む。塩化トレシルの使用は毒性副産物を生産し得るので、この方法は治療生成物を生産するために使用することは困難であると考えられる。代替法は、カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルの使用である。
【００３７】
ブロック水溶性ポリマー結合薬剤の特定種を分離することが必要な場合、例えば必要に応じて、Ｎ末端結合タンパク質を他の部分から単離し得る。この精製は、結合タンパク質分子の個体群からの分離を含む。例えば一実施例は、単結合物質に特徴的な電荷を有する物質を得るために（同じ見かけ電荷を有する他の多結合物質が存在してもよい）イオン交換クロマトグラフィーによって結合タンパク質を分離して、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを用いてモノ結合物質を分離する。このようにして、Ｎ末端結合タンパク質を他のモノ結合種並びに他の多結合種から分離することができる。
【００３８】
他の同様の方法が報告されている。例えば１９９０年５月３日公開のＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９０／０４６０６号は、ポリマー含有水性二相系において結合体を分配することを含む、水溶性ポリマー−タンパク質付加物の混合物を分画するための工程を教示する。
【００３９】
別の態様では、水溶性ポリマーを選択的にＮ末端でタンパク質に結合する。これは、特定タンパク質における誘導体化のために使用可能な異なる種類の第一級アミノ基（リシン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用した還元的アルキル化による修飾を含む。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。反応は、リシン残基のα−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基のｐＫａ差を利用することができるｐＨで実施される。このような選択的誘導体化により、タンパク質への水溶性ポリマーの結合が制御される：ポリマーとの結合は主としてタンパク質のＮ末端で起こり、リシン側鎖アミノ基などの他の反応基の有意の修飾は起こらない。この方法によれば、モノポリマー／タンパク質結合体は、Ｎ末端に位置するポリマー部分を有するが、リシンに関するようなアミノ側基にはポリマー部分を持たない。製剤は、好ましくは８０％以上のモノポリマー／タンパク質結合体、より好ましくは９５％以上のモノポリマー／タンパク質結合体である。
【００４０】
還元的アルキル化のためには、還元剤は水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは還元的アルキル化の初期工程で形成されるシッフ塩基だけを還元することができるものである。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミン及びホウ酸ピリジンから成る群より選択され得る。
【００４１】
（レプチン分子）
本発明における使用に適するレプチンは、組換えヒト及びマウスメチオニルタンパク質から選択され得る。特に有用な形態のレプチンは、天然システインが突然変異して、７８位がシステインに変化し、１個のシステインだけが水溶性ポリマーのマレイミド基のための反応部位として残っているものである。天然ヒト及びマウスレプチン配列を以下に示す。
【００４２】
ヒトレプチン：
ＭＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＡＫＱＲＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＳＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＶＬＴＳＬＰＳＱＮＶＬＱＩＡＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＬＬＡＦＳＫＳＣＳＬＰＱＴＳＧＬＱＫＰＥＳＬＤＧＶＬＥＡＳＬＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＩＬＱＱＬＤＶＳＰＥＣ
マウスレプチン：
ＭＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＲＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＬＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ
【００４３】
加えて、適切なレプチンは、２８位のグルタミニル残基を欠くものを含み、この場合１位は第一バリンであると考えられ、第一メチオニンは−１位である（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３２（１９９４）；また、ｔｈｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ａｔ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：４７９（１９９５）も参照のこと）。組換えヒトレプチン遺伝子産物は、成熟タンパク質として、１４６アミノ酸であり、Ｎ末端メチオニンを持たない。マウスタンパク質は、特に成熟タンパク質として、さらに、特にＮ末端において、ヒトタンパク質に実質的に相同である。組換えヒト配列において、マウス配列と相違するアミノ酸を変化させる（例えばアミノ酸残基を置換する）ことによって組換えヒトタンパク質の類似体を作製し得る。組換えヒトタンパク質はマウスにおいて生物活性を有するので、このような類似体は活性である可能性が高い。真核生物発現によって生産されるもののような、Ｎ末端メチオニル残基を欠くタンパク質も使用のために入手可能である。
【００４４】
（可溶性腫瘍壊死因子結合タンパク質）
本発明に関して、ＴＮＦ阻害剤に関する以下の参考文献中で開示される分子及びｓＴＮＦＲ及びｓＴＮＦＲの変異体と誘導体及びこの参考文献中で開示される分子（以下参照）を集合的に「ＴＮＦ−α阻害剤」と称する。これらは、ＴＮＦ受容体Ｉ型又はＩＩ型の可溶性形態を含む。以下の実施例で使用するように、ＴＮＦ結合タンパク質を使用することが注目されるが、付加的なポリペプチドもここで述べる組成物及び方法に関して有用であると考えられる。代表的なＴＮＦ結合タンパク質は、米国特許第６，５４１，６２０号、同第６，２７１，３４６号及び同第６，１４３，８６６号に述べられている。
【００４５】
米国特許第６，５４１，６２０号は、集合的に「ｓＴＮＦＲ」と称される、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ型（ｓＴＮＦＲ−Ｉ又は３０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られる）及び可溶性ＴＮＦ受容体ＩＩ型（ｓＴＮＦＲ−ＩＩ又は４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られる）、並びにこれらの修飾形態（例えばフラグメント、機能性誘導体及び変異体）の配列を教示する。さらに、欧州特許第３９３ ４３８号は、それぞれ成熟タンパク質のカルボキシル末端で５１又は５３アミノ酸残基が除去された、完全長組換え４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤タンパク質のトランケート型である、４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤Ｄ５１及び４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤Ｄ５３を教示する。ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０、Ｆａｓ抗原、及びＣＤ２７及びＣＤ３０抗原を含む、神経成長因子／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体の成員である（Ｓｍｉｔｈら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３）。
【００４６】
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４号は、第四ドメイン（ｓＴＮＦＲ−ＩのＴｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）；第三ドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）；及び、場合により、第一ドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）を含まない、ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのトランケート形態を教示する。本発明において有用なトランケート型ｓＴＮＦＲは、式Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２及びＲ４−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ５によって表わされるタンパク質を含む。これらのタンパク質はそれぞれｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのトランケート形態であり、システインアミノ酸によって与えられるチオール側基における二重修飾の機会を提供する。「Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２」とは、［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］が、アミノ酸残基であるｓＴＮＦＲ−Ｉの残基１９から１０３を表わし、Ｒ１が、Ｃｙｓ１９又はＣｙｓ１８からＡｓｐ１のいずれか１個から選択されるアミノ末端アミノ酸残基のメチオニル化又は非メチオニル化アミン基を表わし、及びＲ２が、Ｃｙｓ１０３又はＰｈｅ１０４からＬｅｕ１１０のいずれか１個から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を表わす、１又はそれ以上のタンパク質を意味する。
【００４７】
本発明の例示的なトランケート型ｓＴＮＦＲ−Ｉは、メチオニル化又は非メチオニル化の以下の分子（集合的に２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉと称する）：ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０５とも称する）；ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０６とも称する）；ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ａｓｎ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５とも称する）；ＮＨ２−［Ｔｙｒ９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ８とも称する）；ＮＨ２−［Ｃｙｓ１９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１８とも称する）；及びＮＨ２−［Ｓｅｒ１６−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１５とも称する）、及びこれらの変異体及び誘導体を含む。
【００４８】
様々な種類のＴＮＦ−α阻害剤が、以下の参考文献：米国特許第５，１３６，０２１号；同第５，９２９，１１７号；同第５，９４８，６３８号；同第５，８０７，８６２号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８１７，８２２号；同第５８３０７４２号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８５１，５５６号；同第５，８５３，９７７号；同第５，３５９，０３７号；同第５，５１２，５４４号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８１１，２６１号；同第５，６３３，１４５号；同第５，８６３，９２６号；同第５，８６６，６１６号；同第５，６４１，６７３号；同第５，８６９，６７７号；同第５，８６９，５１１号；同第５，８７２，１４６号；同第５，８５４，００３号；同第５，８５６，１６１号；同第５，８７７，２２２号；同第５，８７７，２００号；同第５，８７７，１５１号；同第５，８８６，０１０号；同第５，８６９，６６０号；同第５，８５９，２０７号；同第５，８９１，８８３号；同第５，８７７，１８０号；同第５，９５５，４８０号；同第５，９５５，４７６号；同第５，９５５，４３５号；同第５，９９４，３５１号；同第５，９９０，１１９号；同第５，９５２，３２０号；同第５，９６２，４８１号を含めて、当技術分野において開示されている。これらの開示の関連部分は参照によりここに組み込まれる。
【００４９】
（治療方法）
本発明のさらに別の態様では、治療方法及び薬剤の製造方法が提供される。本発明のブロックポリマー−薬剤結合体の投与によって軽減される又は緩和される状態は、結合する薬剤に依存する。例えば薬剤がレプチンであるとき、本発明のブロックポリマー−レプチン結合体の投与によって軽減又は緩和され得る状態は、レプチンが適用できるものであり、肥満を含む。以下の作用実施例は、本発明のブロックポリマーで化学修飾されたレプチンが、ＰＥＧ分子で化学修飾されたレプチンとほぼ同等に活性であることを明らかにする。同様に、本発明のブロックポリマーに結合したｓＴＮＦＲは、腎空胞形成を誘発する傾向はより少ないが、炎症状態を治療する上で有効であることが示される。
【００５０】
本発明のブロックポリマーに結合した可溶性腫瘍壊死因子受容体は、ＴＮＦの過剰発現に関連する状態、例えば炎症を治療するために使用することができる。本発明のＴＮＦ阻害剤組成物で治療できる急性及び慢性ＴＮＦ仲介性疾患の非排他的なリストは、以下のものを含むが、これらに限定されない：悪液質／食欲不振；癌（例えば白血病）：慢性疲労症候群；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈状態及び適応症；うつ病；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性（例えば肥満に関連する）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；線維筋痛又は痛覚脱失症；対宿主性移植片拒絶反応；痛覚過敏；クローン病及びクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連性下痢を含む炎症性腸疾患；脳虚血（各々が神経変性を導き得る、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含む虚血；肺疾患（例えば成人呼吸促進症候群、喘息及び肺線維症）；多発性硬化症；神経炎症性疾患；角膜移植、眼変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び状態；癌関連疼痛を含む疼痛；膵炎；歯周疾患；毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（細菌性又は非細菌性）及び関連状態；乾癬及び関連状態；肺線維症；再灌流障害；関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（「敗血症性」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎を含むリウマチ病；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えばＨＩＶ、クロストリジウム・ディフィシル及び関連種）又は他の疾患過程。
【００５１】
ここで述べる別の態様は、上記の医薬組成物である。このような医薬組成物は、注射による投与用、又は経口、肺、鼻又は他の形態の投与用であり得る。一般に、医薬適合性の希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に有効量のモノポリマー／タンパク質結合体生成物を含有する医薬組成物は本発明に包含される。このような組成物は、様々な緩衝剤含量（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えばトゥイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロソール、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子製剤又はリポソームへの物質の組込みを含む。このような組成物は、本発明の化学修飾タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば参照によりここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。
【００５２】
さらなる試験が実施されると共に、様々な患者における様々な状態の治療のための適切な用量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、治療背景、受容者の年齢及び全般的健康状態を考慮して、適切な用量を確認することができるであろう。一般に、注射又は注入に関して、用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重（化学修飾なしのタンパク質単独の量を算定）から１００μｇ／ｋｇ（前記と同じベースで）の間である。
【００５３】
以下の実施例は、上記で述べた様々な態様を例示する。
【実施例１】
【００５４】
（ＰＥＧ１Ｋ＋ＧＬＵＴ−ポリエステル）−レプチン
実験材料
分子量＝１０００ｋＤａの２個のヒドロキシ末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジオール）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、使用前に一晩真空オーブン（５０−６０℃）で乾燥した。塩化グルタリル（Ｆｌｕｋａ）、無水クロロホルム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水ジエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水イソプロパノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（９９％＋、Ｂ＆Ｊ）、Ｎ，Ｎ−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００５５】
装置器具
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎｓ（公称分子量３ｋＤａカットオフ膜）及びＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ、公称分子量７ｋＤａカットオフ）を濃縮、精製又は緩衝液交換のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ（ＴＳＫ）２５００及び４０００カラムを使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０から５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／塩化メチレン（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００５６】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジオール（２４．０６ｇ、２４．０６ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（６０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４．８７ｇ、４８．１２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を氷浴中で攪拌し、無水クロロホルム５ｍｌ中の塩化グルタリル（４．０７ｇ、２４．０８ｍｏｌ）を５−６時間かけて滴下した。反応物を室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で追加の０．５Ｍ塩化グルタリル（２．０３ｇ、１２．０１ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩放置した。ポリマーをアミンで末端キャップするために、無水クロロホルム２００ｍｌ中５倍過剰の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１７．８３ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を反応混合物中に滴下した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。クロロホルム：エーテル：イソプロパノール（４００ｍｌ：１３３３ｍｌ：６６７ｍｌ）の低温（４℃）溶媒混合物でポリマーを沈殿させた。沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥した。
【００５７】
活性化
ジクロロメタン１００ｍｌ中のマレイミドプロピオン酸（Ｓｉｇｍａ、０．７３８ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．０５ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）の溶液をＤＣＣ（１８．７７ｍｇ、９０．９６ｍｍｏｌ）で１時間処理し、次いで上記のアミンキャップしたポリマー（３．０５５ｇ、１５２．８μｍｏｌ、Ｍｎ＝２０Ｋ、多分散性＝１．３−１．５）を添加した。反応物を４℃で２日間放置した。沈殿したジシクロヘキシル尿素をろ過によって除去した。ろ液をクロロホルム：エーテル：イソプロパノール（１２０ｍｌ：８００ｍｌ：４００ｍｌ）の混合物で希釈し、沈殿物をろ過によって除去した。ろ液を減圧下で乾燥して、粗生成物１．８６３ｇ（６１．０％）を得、次にこれをＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットにおいて２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５ ２Ｌに対して透析した。
【００５８】
結合
５ｍＭ ＥＤＴＡ及びレプチンＳ７８Ｃ（９７ｍｇ、６．０μｍｏｌ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のポリマー（１．８２６９ｇ、９０μｍｏｌ）を、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌまで添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
精製
ポリマー結合体反応混合物のｐＨを３．５に調整し、次にＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０カラムを用いてＦＰＬＣによって精製した。分画１８−２７を高分子量結合体として一緒にし、分画２８−３０を中分子量結合体として一緒にし、分画３１−３２を低分子量結合体として一緒にした。
【００６０】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＰａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ遠心濃縮機（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、Ａｃｒｏｄｉｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター（２５ｍｍ、０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を通して５ｍｌ無菌バイアルにろ過した。
【００６１】
結果
ＰＥＧ１Ｋ＋ＧＬＵＴ−ポリエステル−レプチンを、図１及び２に示すように、インビトロでの加水分解に対する抵抗性及び動物において体重減少を誘導する上での効果に関して試験した。データは、ＰＥＧ化レプチン及び本発明のブロックポリマーでＰＥＧ化したレプチンで処置したマウスが体重減少すること（図２）、及びブロックポリマー−レプチン結合体では腎空胞の形成が実質的に低下し、腎空胞が検出不能であった（図３）ことを示す。
【実施例２】
【００６２】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ−レプチン
材料
分子量＝１ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、５０℃−６０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、次いで室温に冷却した。塩化オキサリル（９９＋％、Ｆｌｕｋａ）、ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、無水ジエチルエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（＞９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００６３】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラム（ＴＳＫ）を使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの２５ＣＶ、０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／塩化メチレン（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００６４】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（７．１０ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４４ｇ、１４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をドライアイス浴中で攪拌し、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の塩化オキサリル（０．９ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下して、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で無水アセトニトリル７０ｍｌ中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌに溶解し、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水２Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。残留物を無水ジエチルエーテル２００ｍｌで沈殿させ、真空下で乾燥した。生成物の重量は５．１８ｇ（６４．７重量％）であった。
【００６５】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（５．１８ｇ、２８７μｍｏｌ、Ｍｎ＝１８Ｋ、多分散性＝１．３５）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４８．２ｍｇ、４７６μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，０．２２８７ｇ、８５９μｍｏｌ）で処理した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがニンヒドリン陰性になるまで活性化反応を観測した。１時間後に反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを共沸蒸留（３×３０ｍｌトルエン）によって除去して、次いで一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．５９ｇ（〜６９重量％）であった。
【００６６】
結合
ポリマー（６１０ｍｇ、３３．８μｍｏｌ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解し、レプチンＳ７８Ｃ（１００ｍｇ、６．２μｍｏｌ）を添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００６７】
精製
ポリマー結合体溶液をｐＨ３．５に調整した後、カラムに負荷した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５ｍＭ ＮａＣｌを溶離液として用いるＦＰＬＣによって結合体を精製した。分画３２−５０を高分子量結合体として一緒にし、分画５１−６０を中分子量結合体として一緒にし、分画６１−６８を低分子量結合体として一緒にした。
【００６８】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５ｍｌ無菌バイアルにろ過した（２５ｍｍ、０．２ｕｍ Ａｃｒｏｄｉｃｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター、ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００６９】
結果
マウスに、レプチンに結合した低、中及び高分子量ＰＥＧブロックポリマー（この実施例で上記に述べた）、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質又は２０ｋＤａ ＰＥＧ化レプチンを注射した。これらの注射からの体重減少の結果を図４に示し、腎空胞形成を図５に示す。これらの結果は、タンパク質に結合した通常ＰＥＧポリマーと比較して同じタンパク質に結合したブロックポリマーの改善を明らかに示す。
【実施例３】
【００７０】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＰＥＧ１Ｋ−レプチン
材料
分子量＝１０００ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）及び分子量＝１０５６ＫＤａの２個のカルボン酸末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−二酸）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、各々回転蒸発器で共沸蒸留によって乾燥した（５０−６０℃、３Ｘ、３０ｍｌトルエン）。ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、塩化チオニル（９９％低鉄、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９９．８％、Ａｌｄｒｉｃｈ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００７１】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒ及び０．１％トリエチルアミンを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラムを使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／クロロホルム（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００７２】
ＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物
トルエン３５ｍｌ中の蒸留塩化チオニル（２．１３ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（０．１４２ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を、ＰＥＧ１Ｋ−二酸（４．７２８９ｇ、４．４７８ｍｍｏｌ）を含む１００ｍｌ丸底フラスコに緩やかに導入した。反応物をさらに１−２時間室温で反応させ、次いで回転蒸発器（５０−６０℃）で濃縮して、ＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物の油性残留物を残し、これをアルゴンガス下で保存した。
【００７３】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（４．５２ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（０．９１４５ｇ、９．０４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で攪拌し、無水アセトニトリル３０ｍｌ中のＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物（４．７２８９ｇ、４．４７８ｍｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下し、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（０．０３４ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌに溶解し、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水２Ｌで精製した。溶液を濃縮し、残留水を回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。生成物の重量は３．７ｇ（４０％収率）であった。
【００７４】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（３．７６ｇ、１８８μｍｏｌ、Ｍｎ＝２０ｋＤａ、多分散性＝１．６４）を無水アセトニトリル（４０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２８．５５ｍｇ、２８２μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６．８ｍｇ、２８８μｍｏｌ）で処理した。１時間後にＴＬＣによって（ニンヒドリン陰性）反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−３膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。溶液を濃縮し、共沸蒸留（３回、３０ｍｌトルエン）によって乾燥して、一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．１３ｇ（８４．７％収率）であった。
【００７５】
結合
活性化したマレイミドポリマー（３．１３ｇ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及びｐＨ６．５緩衝液に溶解した。レプチンＳ７８Ｃ（１２６ｍｇ、７．７９８μｍｏｌ）を添加した。反応物の最終濃度はタンパク質２ｍｇ／ｍｌ（全６５ｍｌ緩衝液）であった。反応混合物を４℃で一晩放置した。
【００７６】
精製
ポリマー結合体のｐＨを３．５に調整し、１ｍｇタンパク質／ｍｌに希釈した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５Ｍ ＮａＣｌを溶離液として用いるＦＰＬＣによって結合体を精製した。分画を４−２０％トリ−グリミニゲル（Ｎｏｖｅｘ、クマシーブルー染色）で分析した。分画２９−４９を高分子量結合体として一緒にし、分画５０−５７を中分子量結合体として一緒にし、分画５８−６５を低分子量結合体として一緒にした。
【００７７】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において４℃で５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。試料を２ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、Ａｃｒｏｄｉｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター（２５ｍｍ、０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を通して５ｍｌ無菌バイアルにろ過した。
【００７８】
実施例１−３の結論
上述したアミド−レプチンポリマーを製剤し、マウスに注射して、制御された期間にわたって体重減少を測定した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として使用し、これらの体重を用いてゼロの基線値を算定した。ゼロ日目の単回投与での１０ｍｇ／ｋｇのＦｃ−レプチン融合物は、４日目に１１％という体重減少のピークを誘導し、体重は８日目までに基線値近くに戻った。同様に、ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合、中分子量結合及び低分子量結合のレプチン結合体は、同じく単回投与での１０ｍｇ／ｋｇで、ほぼ４日目又は５日目頃にピーク体重減少を誘導した。しかし、Ｆｃ−レプチンと異なり、ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ中分子量結合レプチン及びＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合レプチン結合体は、１４日間の試験期間を超えて２％以上の体重減少を維持した。
【００７９】
２０ｋモノＰＥＧ−レプチン結合体も、単回投与での１０ｍｇ／ｋｇで投与し、３日目に９％のピーク体重減少を誘導し、動物は８日目までに体重を基線値の１％内に回復し、１１日目まで基線値体重以下であった（図４）。これらの実験を反復し、比肩し得る結果を得た。
【００８０】
別の実験において、結合体を注射した後に腎空胞を特定し、以下の尺度を用いて評点した。グレードゼロは腎空胞なしに等しい。グレード１＋は、まれで小さな空胞によって示される最小腎空胞に等しい。グレード２＋は、中等度の数の直径約３μｍの空胞によって示される軽度腎空胞に等しい。グレード３＋は、多数の直径約３−約５μｍの空胞によって示される中等度の腎空胞に等しい。グレード４＋は、無数の大きな、すなわち直径５μｍ以上の空胞が存在することを意味する著明な腎空胞に等しい。尿細管上皮が空胞形成に関して分析した主要部位であった。
【００８１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０又は２５ｍｇ／ｋｇの１日量の結合体又は対照を７日間又は１４日間注射した。ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合レプチンは、７又は１４日間の毎日の皮下注射後に尿細管上皮における空胞を誘発しなかった。
【００８２】
ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ中分子量結合レプチンは、毎日２５ｍｇ／ｋｇの７日間の注射後にグレード１＋又は１４日間の注射後にグレード２＋の尿細管上皮空胞を誘発し、１０ｍｇ／ｋｇを１４日間毎日注射した後最小腎空胞（グレード１＋）を誘発した。この結合体に関して１０ｍｇ／ｋｇを７日間毎日注射したときには、腎空胞は検出されなかった。
【００８３】
ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ低分子量結合レプチンは、毎日２５ｍｇ／ｋｇの７日間（グレード２＋）又は１４日間（グレード３＋）の皮下注射後に腎空胞を誘発した。病変は、１０ｍｇ／ｋｇ／日の７日間（グレード２＋）又は１４日間（グレード２＋）の投与後にも認められた。
【００８４】
陽性対照である２０ｋモノＰＥＧ−レプチンは、投与期間に関わりなく１０ｍｇ／ｋｇ／日又は２５ｍｇ／ｋｇ／日の注射後に最小でもグレード３＋の腎空胞を誘発した。
【実施例４】
【００８５】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ／Ｌ１−７ペプチド
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬポリマー（分子量＝１５ＫＤａ、９６．２９ｍｇ（６．４μｍｏｌ）を、５０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中のＬ１−７ペプチド（５．３９ｍｇ、１．５μｍｏｌ）の溶液に添加した。ペプチドの最終濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであった。溶液を４℃で一晩インキュベートした。種々の分子量プールへの結合体の分離は、Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＳＰ ＨＰ １ｍｌカラムを用いてＦＰＬＣによって実施した。カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０の５ＣＶで平衡させ、結合体を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ４．０の３０ＣＶで１ｍｌ分画に溶出した。分画１−４から高分子量プールを形成し、分画９−３９から低分子量プールを形成した。
【００８６】
両方のプールを濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【実施例５】
【００８７】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ−ｓＴＮＦ
材料
分子量＝１ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、５０−６０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、次いで室温に冷却した。塩化オキサリル（９９＋％、Ｆｌｕｋａ）、ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、無水ジエチルエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（＞９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００８８】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラム（ＴＳＫ）を使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／クロロホルム（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００８９】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（７．１０ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４４ｇ、１４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をドライアイス浴中で攪拌し、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の塩化オキサリル（０．９ｇ、７．１０ｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下して、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で無水アセトニトリル７０ｍｌ中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌ及びｖａｑｕｅ膜に溶解した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。残留物を無水ジエチルエーテル２００ｍｌで沈殿させ、真空下で乾燥した。生成物の重量は５．１８ｇ（６４．７重量％）であった。
【００９０】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（５．１８ｇ、２８７μｍｏｌ、Ｍｎ＝１８Ｋ、多分散性＝１．３５）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４８．２ｍｇ、４７６μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，０．２２８７ｇ、８５９μｍｏｌ）で処理した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがニンヒドリン陰性になるまで活性化反応を観測した。１時間後に反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを共沸蒸留（３×３０ｍｌトルエン）によって除去して、次いで一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．５９ｇ（〜６９重量％）であった。
【００９１】
結合
ポリマー（５４９ｍｇ、３０．５μｍｏｌ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解した。ｓＴＮＦ受容体（６５．５ｍｇ、５．４μｍｏｌ）を添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００９２】
精製
ポリマー結合体溶液をｐＨ３．５に調整した後、カラムに負荷した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５ｍＭ ＮａＣｌを溶離液として使用するＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨＲカラムを用いてＦＰＬＣによって結合体を精製した。結合ｓＴＮＦ不含及び結合ｓＴＮＦを含む分画番号７０−８０をプールし、濃縮した。プールをＳＥＣ２６／６０ＳｅｐｈａｃｒｙｌカラムＳ３００に負荷した。結合体を２つのプール中で高分子量結合体及び低分子量結合体として収集した。
【００９３】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５ｍｌ無菌バイアルにろ過した（２５ｍｍ、０．２ｕｍ Ａｃｒｏｄｉｃｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター、ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００９４】
実施例５の結合体のインビボ実験
可溶性ＴＮＦ−ＲＩ結合体を、炎症のマウスモデルを治療する上での効果に関して試験した。コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を有するルイスラットに、上述したように作製し、ｓＴＮＦ／ＰＥＧ＋ＯＸＬと命名した結合体を注射した。ポリマー鎖は、連結した１ｋＤａ ＰＥＧ分子から成る。
【００９５】
８０から１００ｇの９０匹の雌性ラットを入手し、以下のように関節炎を誘発した。ブタＩＩ型コラーゲンを０．１Ｎ酢酸（２ｍｇコラーゲン／ｍｌ酢酸）に溶解した。１６ゲージ乳化針をアジュバントと１：１で使用した。ラットに、足蹠の背面上の１０の異なる部位に１００μｌの乳剤を皮内注射した。
【００９６】
疾患の発症は足の腫脹と定義され、１１日目に発生した。結合体を発症時から開始して４ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、３日間毎日注射した。正常対照（Ｎ＝５）、未処置対照（Ｎ＝８）、ＰＥＧ−ｒ−ｍｅｔＨｕ−ｓＴＮＦ−ｒＩ（Ｎ＝８）、ｓＴＮＦ／ＰＥＧ＋ＯＸＬ−１４（Ｎ＝８）及びｓＴＮＦ−ＲＩ（Ｎ＝８）として５群に分けた。関節炎対照マウスは、発症から３日目の試験終了時まで毎日カリパスで測定したとき、３日目に約１ｍｍの（平均±ＳＥ；ｎ＝８）の足腫脹を有していた。ｓＴＮＦ−ＲＩ処置マウスは、３日目に約０．５ｍｍの足腫脹を有していた。これに対し、ＰＥＧ及びＰＥＧ＋ＯＸＬポリマーは、どちらも３日の期間にわたってほとんどの検出不能なレベルまで足腫脹を抑制した（図６）。
【００９７】
本発明を好ましい実施形態の見地から説明したが、当業者には変法及び修正が生じることは了解される。従って、付属の特許請求の範囲は、特許請求の範囲内に含まれる、このような全ての等価変法をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】１、２又は２０ｋＤａのＰＥＧ化レプチンを慢性注射した時の腎空胞形成を示す。Ｙ軸上で、０は可視空胞が存在せず、０．５は、散在して分布するまれなごく小さい空胞であり、１．０は、細管内の細胞の刷子縁の下のごく小さな空胞の最小限の連なりであり、１．５は、分散した、いずれの細胞又は細管にも影響を及ぼさない、明らかな小空胞であり、２．０は、虫食い状の外観を有する、細管内の軽度であるが明らかな空胞であり、２．５は、より重症であるが、まだ細胞容積全体には影響を及ぼさない空胞であり、３．０は、細管の５０％未満の中等度で明白な、大きく透明な空胞であり、３．５は、明白な空胞（３．０におけるような）及び核変性であり、４．０は、細管の５０％を超える著明な空胞形成及び核変性である。
【図２】本発明の高、中又は低ブロックポリマーでＰＥＧ化したレプチンと比較した、２０キロダルトンのＰＥＧ化レプチンで処置したマウスの体重減少を示す（四角は２０ｋＤａのＰＥＧ化レプチンからのデータを示し、Ｘは低分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、黒枠を伴うＸは低分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、＋は高分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、及びダイアモンド形はＰＢＳ対照からのデータを示す。
【図３】図２に従って処置したマウスにおいて腎空胞形成を測定した。
【図４】データは、実施例２で作製した結合体の単回注射の結果を示す。データの記号参照は図２と同じであり、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質についての三角が追加されている。
【図５】図３に従って処置したマウスにおいて腎空胞形成を測定した。
【図６】足の腫脹とブロックポリマーＰＥＧ又は２０ｋＤａ ＰＥＧのいずれかに結合したｓＴＮＦＲ１の作用を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くはタンパク質修飾の分野に関し、より詳細には、水溶性ブロックポリマー、薬剤へのこれらの結合、及びこれらを製造する方法及びこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤への水溶性ポリマーの結合は、分子の溶解度、耐久性及び有効性の増強を提供することができる。例えばタンパク質をポリマーに結合するとき、この修飾は、立体相互作用を通して物理的接触をブロックし、分解を防ぐことによってタンパク質分解を阻止し得る。付加的な利点は、ある種の状況下で、薬剤の安定性と循環時間を上昇させること及び免疫原性を低下させることを含む。
【０００３】
薬剤への結合のために最も一般的に使用される水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。「ＰＥＧ化する（ＰＥＧｙｌａｔｅ）」という用語は、少なくとも１個のＰＥＧ分子の第二分子への結合を意味するようになった。ＰＥＧ分子は、構造内の反復単位の数に基づいて大きさが異なり、典型的には分子量で表わされ、例えば数百ダルトンから４０−５０キロダルトン又はそれ以上である。
【０００４】
ＰＥＧ化は治療タンパク質の血清半減期を延長することができ、これによってこの効果期間を上昇させ、投与頻度を低下させ得る。ＰＥＧがタンパク質ベースの薬剤の血清半減期を上昇させる１つの機構は、タンパク質分解から保護することによる、Ｓａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７１：１３７−１３９（１９９１）。実際に、レプチンのＮ末端における１個の２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーによる化学修飾は、非修飾天然タンパク質に比べて投与すべきレプチンの必要量の低下を生じさせ、溶解度を上昇させる；例えばＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９６／４０９１２号参照。総説については、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ．（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．ｐｐ．３６７−３８３（１９８１））参照。
【０００５】
実際に、ＰＥＧはいくつかの市販の治療タンパク質に結合されており、この例は、重症複合免疫不全症を治療するためのＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（登録商標））；好中球減少症を治療するためのＮｅｕｌａｓｔａ（商標）（ペグフィルグラスチム）；Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）Ｖｉａｌ（ペルフルトレン脂肪ミクロスフェア）注射用懸濁液（ＰＥＧ）；先端巨大症を治療するためのＳｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）（ペグビソマント）；急性リンパ芽球性白血病又は非ホジキンリンパ腫の治療のためのＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））；及び肝炎を治療するためのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ａ）及びＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ｂ）を含む。
【０００６】
しかし、このような化学修飾に関連した制限がある。例えば慢性適用における及び／又は比較的多量でのこれらの結合体の使用は、分解に対する抵抗性の故に高分子量ポリマーの蓄積をもたらし得る。加えて、ＰＥＧ−薬剤結合体は、高用量で長期にわたって定期的に投与したとき腎空胞に蓄積することが認められた；例えばＣｏｎｏｖｅｒら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ，２１（５）：３６９−３７８（１９９７）；Ｂｅｎｄｅｌｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４２：１５２（１９９８）参照。このような空胞が個人の健康に有害であるかどうかは不明であるが、薬剤投与は関連するいかなる異常も伴わないことが好ましい。そこで、薬剤に結合した水溶性ポリマーを得ることは、この水溶性ポリマーが、例えば腎空砲の形成によって測定したとき、望ましくない蓄積を伴わずに患者の体内から排出される場合、有益である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、不安定結合基によって連結された水溶性ブロックポリマー、これらを製造する方法及びこれらを使用する方法に関する。従って、本発明の１つの態様は、リンカーを通してもう１つ別の同じ（ブロックホモポリマー）又は異なるポリマー（ブロックコポリマー）に共有結合されたポリマー及びこれらを使用するための方法を含み、該ポリマー−リンカー構造は、必要とされるブロックポリマー長を達成するためにもう１つ別のポリマー−リンカーに繰り返し結合することができる。１つの実施形態では、Ａはポリマーを表わし、Ｂはリンカーを表わす。従って、ブロックホモポリマーは（Ａ−Ｂ）ｎ［式中、ｎは反復単位の所望数を表わす整数である］の構造を有する。
【０００８】
別の実施形態では、１個のポリマーをＡで表わし、リンカーをＢで表わし、第二の異種ポリマーをＣで表わす。このブロックコポリマーの例では、ポリマー全体では、所望Ａ−Ｂ又はＣ−Ｂ単位を交換可能に含むことができ、これらの単位は交代することができ、例えばｎが１−１，０００である（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−）ｎ又はブロックコポリマーは、このポリマー内で互いに対して可変数の各ポリマー型を有し得る。
【０００９】
別の実施形態では、不安定リンカーは、水溶性ポリマーの内部分子結合よりも加水分解及び／又はタンパク質分解を受けやすい。従って、薬剤に結合した水溶性ブロックポリマーは、反復して及び／又は慢性的に投与されたとき、例えばＰＥＧ化後に、伝統的水溶性ポリマーへの結合によって提供される利点と一致する血清半減期延長及び／又は抗原性低下を示すが、腎空胞形成によって測定される望ましくない蓄積を低減又は排除する。
【００１０】
以下でより詳細に述べるように、本発明は、タンパク質又はこの類似体を含む薬剤を化学修飾することに関する多くの態様を有する。ある態様では、本発明は、治療タンパク質に結合した水溶性ブロックポリマーの結合に関する。特定態様では、タンパク質治療薬は、レプチン、可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦＲ）及びＬ１−７と称されるペプチドから選択される。
【００１１】
ここで使用する、水溶性ブロックポリマーは、５００ダルトンから３，０００ダルトンまでのより小さなポリマーフラグメントと、分解に対して加水分解的又はタンパク質分解的に感受性である、ポリマーブロックの間のリンカーから構築される。代表的ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、代表的結合はアミド基を通した結合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーと薬剤、特にタンパク質治療薬の結合は、抗原性の低下及び血清半減期の延長を含む重要な治療上の恩恵を与える。しかし、より高い分子量のポリマー、例えば５ｋＤａ以上のＰＥＧの慢性又は高用量投与は、例えば腎空胞におけるポリマーの蓄積によって測定したとき、被験者からの排泄遅延をもたらし得る。
【００１３】
これに対し、より低い分子量形態のポリマー、例えば２ｋＤａ未満のＰＥＧは、腎空砲に蓄積されることなく血清から清掃されることが発見された。実際に、ＰＥＧの分子量が高くなると共に空胞形成が上昇する傾向がある（図１）。これらの実験において、様々な分子量、すなわち１、２及び２０ｋＤａのＰＥＧの等量をレプチン分子にモノＰＥＧ化したとき、腎空胞形成を誘発した２及び２０ｋＤａのＰＥＧ−レプチン結合体と異なり、１ｋＤａのＰＥＧ−レプチン結合体だけは測定可能な腎空胞形成を示さなかった。分子量傾向はこれらのポリＰＥＧ化レプチンに関しても当てはまり、またレプチンを１ｋＤａ ＰＥＧで多重ＰＥＧ化したとき、腎空胞スコアはＰＢＳ対照又は非修飾レプチンに比肩し得た。さらに、１ｋＤａ ＰＥＧ化レプチンは、インビボでレプチンと等しい活性を有し、生理的ｐＨでより可溶性であり、高濃度で注射部位反応を引き起こさず、腎空胞形成の証拠を示さないことが認められた。しかし、より小さいＰＥＧ、例えば５ｋＤａ未満のＰＥＧを薬剤に結合したときは、より大きなＰＥＧ結合体、例えば２０ｋＤａ ＰＥＧの結合体に関して認められるような血清半減期上昇は提供されない。
【００１４】
そこで、発明者は、約１ｋＤａを有する水溶性分子のブロックを、総ブロックポリマーの大きさが１０ｋＤａ以上であるように、不安定結合を通して同種又は異種ブロックのいずれかに連結することによって血清半減期が上昇することを発見した。重要な点として、この上昇は非ブロックポリマーへの結合に比肩し得るものであり、従来のＰＥＧ化タンパク質の慢性投与で認められる腎空胞形成は低減するか又は排除される。
【００１５】
従って、本発明は、ブロックポリマー、これらの分子を製造し、使用する方法、及び薬剤に結合したブロックポリマーに関する。本発明のブロックポリマーは、高分子量ポリマーの薬理的恩恵、例えば血清半減期上昇及び免疫原性低下を示すが、より分解性であり、従って望ましくない性質を有さないと考えられる。以下で述べる、本発明のブロックポリマーの一例に結合した薬剤の実施例が提供され、これらは、２０ｋＤａ ＰＥＧによってＮ末端でモノＰＥＧ化されている治療分子と同様の薬物動態学的特性を有する。しかし、水溶性ブロックポリマー結合分子は、２０ｋＤａポリマーでＰＥＧ化されたものと異なり、慢性投与時に腎空胞の形成を誘発する傾向が低いことをさらに明らかにする。
【００１６】
ブロックポリマーの大きさは、好ましくは約１０から５０ｋＤａ、より好ましくは約１５から４０ｋＤａ、さらに一層好ましくは約１５から３０ｋＤａであり、代表的な大きさは２０ｋＤａである。種々の水溶性ポリマーは性質に関して多少の変動性を有し、従って理想的な大きさは結合する薬剤との使用に応じて決定される必要があることは、当業者には容易に了解される。理想的組成物及びまた、ブロックポリマー中のブロックの大きさ及びブロックポリマーの大きさを決定するための実験は、ここでの開示に照らすと単なる常套的な実験である。
【００１７】
ここで使用するとき、「不安定結合」は、水溶性ポリマーにおいて認められる通常の分子結合よりもプロテアーゼ又は加水分解のいずれかによる破壊に対してより感受性であることと理解される。
【００１８】
本ブロックポリマー組成物に関しては、様々な水溶性ポリマー（分子量、分枝等別に）、反応混合物中の水溶性ポリマー対薬剤分子の比率、実施する結合反応の種類、選択した結合薬剤を入手する方法、及び使用する薬剤の種類から選択し得る。
【００１９】
ブロックポリマーは、これが結合する薬剤が生理環境などの水性環境において沈殿しないように、水溶性であるべきである。ポリマーは分枝又は非分枝のいずれでもよい。好ましくは、最終生成物製剤の治療用途のために、ポリマーは医薬的に許容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療的に使用されるかどうか、もしそうであれば、所望用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性この他のような配慮に基づいて所望ポリマーを選択することができる。
【００２０】
薬剤への結合に適する典型的な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸、デキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル及びポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。これらのポリマー−薬剤結合体製剤のいくつかは、改善された薬理的性質、例えば血清半減期の延長、改善された安定性、溶解度を有することが示されており、及び／又は免疫原性の低下も認められた（Ｔｒａｋａｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０（１−２）：４２−９（２００１））。
【００２１】
本発明のブロックポリマー中のブロックのために有用な水溶性ポリマーに関して、分子量は約５００ダルトンから約３０００ダルトンの間である。ここで使用するとき、「約」という用語は、水溶性ポリマーの製剤において、一部の分子は指定分子量よりも重く、また別の分子はより軽いこと、及び指定分子量は単に製剤からとった平均であることを示す。所望治療プロフィール（例えば所望する持続放出の期間、もしあれば、生物活性への作用、取り扱いの容易さ、抗原性及び治療タンパク質又は類似体へのポリエチレングリコールの他の公知の作用の程度又は欠如）に依存して、他の大きさも使用し得る。従って、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約１，６００、約１，７００、約１，８００、約１，９００、又は約２，０００のポリマーが本発明に従って使用できると考えられる。以下の実施例は、精製の容易さのため及び適切なモデル系を提供するために選択した、ＰＥＧ１０００の使用を含む。
【００２２】
特定実施形態では、本発明の水溶性ポリマーは、薬剤のための担体として有用なＰＥＧベースのブロックポリマーである。この実施例では、アミド基によって連結されたブロックポリマーを生産するための二官能性低分子量ＰＥＧジアミン（すなわち３，０００ダルトン未満）と二官能性酸の１段階重付加重合によってポリマーを合成することができる。チオール反応性ポリマー末端基は、マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルとアミノ末端基の反応によって形成した。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明のポリマー中のリンカーは、二塩基酸、例えばオキサリルクロリドである。より特定すると、１つの実施例ではブロックポリマー−薬剤結合体は、以下の式：Ｒ’−［−ＨＮ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−］ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−Ｓ−薬剤［式中、Ｒ’はマレイミドなどの二官能基であり、Ｒはスペーサー分子であって、炭素、メチレン又は分子の構造及び機能を妨げない他の何らかの基であり得、ｎは１０から５００であり、及びｘは５から２５である］を有する。
【００２４】
別の実施例では、ブロックポリマー−不安定リンカーは、式：Ｒ’−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−［−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−］ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−薬剤［式中、薬剤はタンパク質又はペプチドであり得、式中、ｘは１−１０００であり、及びＲとＲ’は結合基である。別の実施形態では、ブロックポリマーは、以下の式：Ｒ−［−Ｃ（＝Ｏ）−ＰＥＧ１Ｋ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＰＥＧ１Ｋ−ＮＨ−］ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−マレイミド−ｓ−薬剤［式中、ｎは３から３０、より好ましくは５から２５、より好ましくは７から２０、最も好ましくは１０−１５である］を有する。どちらの場合もＲ基は適切なキャッピング基であり得る。これらの実施例のどちらにおいても、マレイミドを薬剤上の遊離チオールと反応させて、薬剤とのチオエーテル結合を形成する。本発明のポリマーは、このポリマーが結合するシステイン残基を含むタンパク質である薬剤に結合すると考えられる。
【００２５】
以下の実施例では、ＰＥＧベースのブロックポリマーを、ブロックポリマー−薬剤結合体を生産するために可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦＲ）、ペプチドＬ１−７、及び遊離システインを含むレプチン分子に結合した。しかし、本発明のポリマーは、これらがポリマーと結合するための適切な連結基を有する限り、タンパク質、ペプチド（例えば精製天然、組換え、融合、突然変異又は合成タンパク質及び／又はペプチド）を含むいかなる治療分子、又は他の分子にも結合できることは了解される。
【００２６】
ここで有用なタンパク質及びペプチドの代表的な例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及び他のアイソタイプを含む抗体、Ｂ１アンタゴニストペプチド、インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養増殖因子（ＮＧＦ）、オステオプロテグリン（破骨細胞形成抑制因子）（ＯＰＧ）などの骨成長因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨誘導因子（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及びカリクレインを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーの結合に適用できる方法は、ここで述べるブロックポリマーの結合にも適することが理解される。そこで、一般に、ポリエチレングリコールのような水溶性分子は、薬剤上に認められる反応基によって薬剤に結合される。リシン残基上又はタンパク質のＮ末端などのアミノ基はこのような結合のために好都合である。例えばＲｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、上記）は、酵素へのポリエチレングリコール分子の結合のために還元的アルキル化を使用したと述べている。欧州特許第０ ５３９ １６７号は、遊離アミノ基を有するペプチド及び有機化合物をＰＥＧの中間誘導体又は関連水溶性有機ポリマーで修飾することを述べている。１９９０年２月２７日発行のＳｈａｗへの米国特許第４，９０４，５８４号は、反応性アミン基によるポリエチレングリコール分子の結合のためのタンパク質中のリシン残基の数の修飾に関する。
【００２８】
水溶性ポリマーの結合のための付加的な方法も使用可能である。例えば米国特許第４，１７９，３３７号；及び米国特許第４，００２，５３１号参照。米国特許第５，８２４，７８４号は、Ｎ末端モノペグ化タンパク質を開示しており、「Ｎ末端モノペグ化」は、タンパク質部分がＮ末端で１個のポリエチレングリコール部分に結合していることを表わし、前記タンパク質は、中でも特に、長い血清半減期及び改善された安定性を示す。
【００２９】
さらに別の実施形態では、薬剤を２個以上のポリマーに結合する。そこで、様々な数のブロックポリマー部分を薬剤に結合し得る（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−等）。同様に、ポリマー−薬剤結合体の組合せを混合物として組合せてもよい。
【００３０】
欧州特許第０ ４０１ ３８４号は、ポリエチレングリコール分子が結合したＧ−ＣＳＦを作製するための材料及び方法を述べる。Ｇ−ＣＳＦ及びコンセンサスインターフェロンを含む治療タンパク質のＮ末端特異的ＰＥＧ化の一般的方法は、米国特許第５，９８５，２６５号の中で教示される。加えて、ペグ化ＩＬ−６は、ＩＬ−６に結合したポリエチレングリコール分子を開示する米国特許第５，２６４，２０９号において教示される。さらに、国際公開公報第ＷＯ／８５０３８６８号は、リンホカインをポリエチレングリコールのアルデヒドと反応させることを報告している。
【００３１】
一般に、本発明の実施において有用な薬剤は、化学合成手順から又は天然哺乳生物から又は選択的に、ゲノム又はｃＤＮＡクローニング又はＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核又は真核生物宿主発現から単離された形態であり得る。適切な原核生物宿主は、様々な細菌（例えば大腸菌）を含み、適切な真核生物宿主は、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及び哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）を含む。例えば細胞において発現される外来性ＤＮＡ配列の産物であるタンパク質は、発現の結果として、α−アミノ基を有するＮ末端メチオニル残基を有し得る。上記で指摘したように、ペプチドミメティック及び他の修飾タンパク質と同様に、ペプチドが包含される。使用する宿主細胞に依存して、タンパク質の発現産物は哺乳動物又は他の真核生物炭水化物でグリコシル化され得るか、又は非グリコシル化され得る。
【００３２】
タンパク質発現産物はまた、初期メチオニンアミノ酸残基（−１位）を含んでもよく、成熟形態へと翻訳後切断され得る、例えばシグナルペプチドを含む分泌タンパク質は切断されたシグナルペプチドを有し得る。タンパク質類似体及び非天然タンパク質、例えばコンセンサスインターフェロンも、米国特許第５，８２４，７８４号及び同第５，９８５，２６５号に述べられている方法に適する。
【００３３】
一般に、本発明における薬剤及びこの類似体の有用性は、薬剤を化学修飾するためにここで提供する化学修飾手順を実施すること、及び生じた生成物を、生物活性アッセイなどの所望特徴に関して試験することによって確認され得る。タンパク質の場合は、非ヒト哺乳動物を処置するとき所望に応じて、組換えマウス、ウシ、イヌ等のような組換え非ヒトタンパク質を使用し得る。例えばＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９１０５７９８号及びＰＣＴ 国際公開公報第ＷＯ８９１０９３２号参照。
【００３４】
さらに、本発明の組成物及び方法は、医薬組成物の製剤、治療方法及び薬剤の製造の方法を含む。
【００３５】
ブロックポリマー対薬剤分子の比率は、反応混合物中のこれらの濃度と同様に、様々である。一般に、最適比率は選択するポリマーの分子量によって決定される。加えて、１つの実施例は、所望ポリマー−薬剤種の非特異的ペグ化及び後の精製を含み、この比率は、使用可能なアミン反応基（典型的にはアミノ基）又は使用可能な遊離チオール基の数に依存し得る。モノ−ポリマー物質を得るための薬剤対ポリマー分子の低い反応比率の一例は、一般に薬剤分子当り１．５ポリマー分子である。この比率は、タンパク質対ＰＥＧ結合体において得に有用である。
【００３６】
水溶性ポリマー、例えばここで述べるブロックポリマーを、ポリマー部分とタンパク質部分の間に結合基を含まないタンパク質に連結する有用な方法は、Ｆｒａｎｃｉｓら（Ａｈｅｒｎ．，Ｔ．及びＭａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．編集）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に述べられている。また、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｆｉｓｈｅｒら編集、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．，１９８９ ｐｐ．２１１−２１３は、ポリエチレングリコール部分とタンパク質部分の間に結合基を生じない、塩化トレシルの使用を含む。塩化トレシルの使用は毒性副産物を生産し得るので、この方法は治療生成物を生産するために使用することは困難であると考えられる。代替法は、カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルの使用である。
【００３７】
ブロック水溶性ポリマー結合薬剤の特定種を分離することが必要な場合、例えば必要に応じて、Ｎ末端結合タンパク質を他の部分から単離し得る。この精製は、結合タンパク質分子の個体群からの分離を含む。例えば一実施例は、単結合物質に特徴的な電荷を有する物質を得るために（同じ見かけ電荷を有する他の多結合物質が存在してもよい）イオン交換クロマトグラフィーによって結合タンパク質を分離して、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを用いてモノ結合物質を分離する。このようにして、Ｎ末端結合タンパク質を他のモノ結合種並びに他の多結合種から分離することができる。
【００３８】
他の同様の方法が報告されている。例えば１９９０年５月３日公開のＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９０／０４６０６号は、ポリマー含有水性二相系において結合体を分配することを含む、水溶性ポリマー−タンパク質付加物の混合物を分画するための工程を教示する。
【００３９】
別の態様では、水溶性ポリマーを選択的にＮ末端でタンパク質に結合する。これは、特定タンパク質における誘導体化のために使用可能な異なる種類の第一級アミノ基（リシン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用した還元的アルキル化による修飾を含む。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。反応は、リシン残基のα−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基のｐＫａ差を利用することができるｐＨで実施される。このような選択的誘導体化により、タンパク質への水溶性ポリマーの結合が制御される：ポリマーとの結合は主としてタンパク質のＮ末端で起こり、リシン側鎖アミノ基などの他の反応基の有意の修飾は起こらない。この方法によれば、モノポリマー／タンパク質結合体は、Ｎ末端に位置するポリマー部分を有するが、リシンに関するようなアミノ側基にはポリマー部分を持たない。製剤は、好ましくは８０％以上のモノポリマー／タンパク質結合体、より好ましくは９５％以上のモノポリマー／タンパク質結合体である。
【００４０】
還元的アルキル化のためには、還元剤は水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは還元的アルキル化の初期工程で形成されるシッフ塩基だけを還元することができるものである。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミン及びホウ酸ピリジンから成る群より選択され得る。
【００４１】
（レプチン分子）
本発明における使用に適するレプチンは、組換えヒト及びマウスメチオニルタンパク質から選択され得る。特に有用な形態のレプチンは、天然システインが突然変異して、７８位がシステインに変化し、１個のシステインだけが水溶性ポリマーのマレイミド基のための反応部位として残っているものである。天然ヒト及びマウスレプチン配列を以下に示す。
【００４２】
ヒトレプチン：
ＭＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＡＫＱＲＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＳＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＶＬＴＳＬＰＳＱＮＶＬＱＩＡＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＬＬＡＦＳＫＳＣＳＬＰＱＴＳＧＬＱＫＰＥＳＬＤＧＶＬＥＡＳＬＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＩＬＱＱＬＤＶＳＰＥＣ
マウスレプチン：
ＭＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＲＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＬＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ
【００４３】
加えて、適切なレプチンは、２８位のグルタミニル残基を欠くものを含み、この場合１位は第一バリンであると考えられ、第一メチオニンは−１位である（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３２（１９９４）；また、ｔｈｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ａｔ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：４７９（１９９５）も参照のこと）。組換えヒトレプチン遺伝子産物は、成熟タンパク質として、１４６アミノ酸であり、Ｎ末端メチオニンを持たない。マウスタンパク質は、特に成熟タンパク質として、さらに、特にＮ末端において、ヒトタンパク質に実質的に相同である。組換えヒト配列において、マウス配列と相違するアミノ酸を変化させる（例えばアミノ酸残基を置換する）ことによって組換えヒトタンパク質の類似体を作製し得る。組換えヒトタンパク質はマウスにおいて生物活性を有するので、このような類似体は活性である可能性が高い。真核生物発現によって生産されるもののような、Ｎ末端メチオニル残基を欠くタンパク質も使用のために入手可能である。
【００４４】
（可溶性腫瘍壊死因子結合タンパク質）
本発明に関して、ＴＮＦ阻害剤に関する以下の参考文献中で開示される分子及びｓＴＮＦＲ及びｓＴＮＦＲの変異体と誘導体及びこの参考文献中で開示される分子（以下参照）を集合的に「ＴＮＦ−α阻害剤」と称する。これらは、ＴＮＦ受容体Ｉ型又はＩＩ型の可溶性形態を含む。以下の実施例で使用するように、ＴＮＦ結合タンパク質を使用することが注目されるが、付加的なポリペプチドもここで述べる組成物及び方法に関して有用であると考えられる。代表的なＴＮＦ結合タンパク質は、米国特許第６，５４１，６２０号、同第６，２７１，３４６号及び同第６，１４３，８６６号に述べられている。
【００４５】
米国特許第６，５４１，６２０号は、集合的に「ｓＴＮＦＲ」と称される、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ型（ｓＴＮＦＲ−Ｉ又は３０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られる）及び可溶性ＴＮＦ受容体ＩＩ型（ｓＴＮＦＲ−ＩＩ又は４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤としても知られる）、並びにこれらの修飾形態（例えばフラグメント、機能性誘導体及び変異体）の配列を教示する。さらに、欧州特許第３９３ ４３８号は、それぞれ成熟タンパク質のカルボキシル末端で５１又は５３アミノ酸残基が除去された、完全長組換え４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤タンパク質のトランケート型である、４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤Ｄ５１及び４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤Ｄ５３を教示する。ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０、Ｆａｓ抗原、及びＣＤ２７及びＣＤ３０抗原を含む、神経成長因子／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体の成員である（Ｓｍｉｔｈら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３）。
【００４６】
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４号は、第四ドメイン（ｓＴＮＦＲ−ＩのＴｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）；第三ドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）；及び、場合により、第一ドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）を含まない、ｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのトランケート形態を教示する。本発明において有用なトランケート型ｓＴＮＦＲは、式Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２及びＲ４−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ５によって表わされるタンパク質を含む。これらのタンパク質はそれぞれｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩのトランケート形態であり、システインアミノ酸によって与えられるチオール側基における二重修飾の機会を提供する。「Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２」とは、［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］が、アミノ酸残基であるｓＴＮＦＲ−Ｉの残基１９から１０３を表わし、Ｒ１が、Ｃｙｓ１９又はＣｙｓ１８からＡｓｐ１のいずれか１個から選択されるアミノ末端アミノ酸残基のメチオニル化又は非メチオニル化アミン基を表わし、及びＲ２が、Ｃｙｓ１０３又はＰｈｅ１０４からＬｅｕ１１０のいずれか１個から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を表わす、１又はそれ以上のタンパク質を意味する。
【００４７】
本発明の例示的なトランケート型ｓＴＮＦＲ−Ｉは、メチオニル化又は非メチオニル化の以下の分子（集合的に２．６Ｄ ｓＴＮＦＲ−Ｉと称する）：ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０５とも称する）；ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｃ１０６とも称する）；ＮＨ２−［Ａｓｐ１−Ａｓｎ１０５］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．６Ｄ／Ｎ１０５とも称する）；ＮＨ２−［Ｔｙｒ９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ８とも称する）；ＮＨ２−［Ｃｙｓ１９−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１８とも称する）；及びＮＨ２−［Ｓｅｒ１６−Ｌｅｕ１０８］−ＣＯＯＨ（ｓＴＮＦＲ−Ｉ ２．３Ｄ／ｄ１５とも称する）、及びこれらの変異体及び誘導体を含む。
【００４８】
様々な種類のＴＮＦ−α阻害剤が、以下の参考文献：米国特許第５，１３６，０２１号；同第５，９２９，１１７号；同第５，９４８，６３８号；同第５，８０７，８６２号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８１７，８２２号；同第５８３０７４２号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８５１，５５６号；同第５，８５３，９７７号；同第５，３５９，０３７号；同第５，５１２，５４４号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８１１，２６１号；同第５，６３３，１４５号；同第５，８６３，９２６号；同第５，８６６，６１６号；同第５，６４１，６７３号；同第５，８６９，６７７号；同第５，８６９，５１１号；同第５，８７２，１４６号；同第５，８５４，００３号；同第５，８５６，１６１号；同第５，８７７，２２２号；同第５，８７７，２００号；同第５，８７７，１５１号；同第５，８８６，０１０号；同第５，８６９，６６０号；同第５，８５９，２０７号；同第５，８９１，８８３号；同第５，８７７，１８０号；同第５，９５５，４８０号；同第５，９５５，４７６号；同第５，９５５，４３５号；同第５，９９４，３５１号；同第５，９９０，１１９号；同第５，９５２，３２０号；同第５，９６２，４８１号を含めて、当技術分野において開示されている。これらの開示の関連部分は参照によりここに組み込まれる。
【００４９】
（治療方法）
本発明のさらに別の態様では、治療方法及び薬剤の製造方法が提供される。本発明のブロックポリマー−薬剤結合体の投与によって軽減される又は緩和される状態は、結合する薬剤に依存する。例えば薬剤がレプチンであるとき、本発明のブロックポリマー−レプチン結合体の投与によって軽減又は緩和され得る状態は、レプチンが適用できるものであり、肥満を含む。以下の作用実施例は、本発明のブロックポリマーで化学修飾されたレプチンが、ＰＥＧ分子で化学修飾されたレプチンとほぼ同等に活性であることを明らかにする。同様に、本発明のブロックポリマーに結合したｓＴＮＦＲは、腎空胞形成を誘発する傾向はより少ないが、炎症状態を治療する上で有効であることが示される。
【００５０】
本発明のブロックポリマーに結合した可溶性腫瘍壊死因子受容体は、ＴＮＦの過剰発現に関連する状態、例えば炎症を治療するために使用することができる。本発明のＴＮＦ阻害剤組成物で治療できる急性及び慢性ＴＮＦ仲介性疾患の非排他的なリストは、以下のものを含むが、これらに限定されない：悪液質／食欲不振；癌（例えば白血病）：慢性疲労症候群；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈状態及び適応症；うつ病；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性（例えば肥満に関連する）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；線維筋痛又は痛覚脱失症；対宿主性移植片拒絶反応；痛覚過敏；クローン病及びクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連性下痢を含む炎症性腸疾患；脳虚血（各々が神経変性を導き得る、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含む虚血；肺疾患（例えば成人呼吸促進症候群、喘息及び肺線維症）；多発性硬化症；神経炎症性疾患；角膜移植、眼変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び状態；癌関連疼痛を含む疼痛；膵炎；歯周疾患；毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（細菌性又は非細菌性）及び関連状態；乾癬及び関連状態；肺線維症；再灌流障害；関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（「敗血症性」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎を含むリウマチ病；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えばＨＩＶ、クロストリジウム・ディフィシル及び関連種）又は他の疾患過程。
【００５１】
ここで述べる別の態様は、上記の医薬組成物である。このような医薬組成物は、注射による投与用、又は経口、肺、鼻又は他の形態の投与用であり得る。一般に、医薬適合性の希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に有効量のモノポリマー／タンパク質結合体生成物を含有する医薬組成物は本発明に包含される。このような組成物は、様々な緩衝剤含量（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えばトゥイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロソール、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子製剤又はリポソームへの物質の組込みを含む。このような組成物は、本発明の化学修飾タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば参照によりここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。
【００５２】
さらなる試験が実施されると共に、様々な患者における様々な状態の治療のための適切な用量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、治療背景、受容者の年齢及び全般的健康状態を考慮して、適切な用量を確認することができるであろう。一般に、注射又は注入に関して、用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重（化学修飾なしのタンパク質単独の量を算定）から１００μｇ／ｋｇ（前記と同じベースで）の間である。
【００５３】
以下の実施例は、上記で述べた様々な態様を例示する。
【実施例１】
【００５４】
（ＰＥＧ１Ｋ＋ＧＬＵＴ−ポリエステル）−レプチン
実験材料
分子量＝１０００ｋＤａの２個のヒドロキシ末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジオール）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、使用前に一晩真空オーブン（５０−６０℃）で乾燥した。塩化グルタリル（Ｆｌｕｋａ）、無水クロロホルム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水ジエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水イソプロパノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（９９％＋、Ｂ＆Ｊ）、Ｎ，Ｎ−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００５５】
装置器具
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎｓ（公称分子量３ｋＤａカットオフ膜）及びＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ、公称分子量７ｋＤａカットオフ）を濃縮、精製又は緩衝液交換のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ（ＴＳＫ）２５００及び４０００カラムを使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０から５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／塩化メチレン（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００５６】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジオール（２４．０６ｇ、２４．０６ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（６０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４．８７ｇ、４８．１２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を氷浴中で攪拌し、無水クロロホルム５ｍｌ中の塩化グルタリル（４．０７ｇ、２４．０８ｍｏｌ）を５−６時間かけて滴下した。反応物を室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で追加の０．５Ｍ塩化グルタリル（２．０３ｇ、１２．０１ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩放置した。ポリマーをアミンで末端キャップするために、無水クロロホルム２００ｍｌ中５倍過剰の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１７．８３ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を反応混合物中に滴下した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。クロロホルム：エーテル：イソプロパノール（４００ｍｌ：１３３３ｍｌ：６６７ｍｌ）の低温（４℃）溶媒混合物でポリマーを沈殿させた。沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥した。
【００５７】
活性化
ジクロロメタン１００ｍｌ中のマレイミドプロピオン酸（Ｓｉｇｍａ、０．７３８ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．０５ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）の溶液をＤＣＣ（１８．７７ｍｇ、９０．９６ｍｍｏｌ）で１時間処理し、次いで上記のアミンキャップしたポリマー（３．０５５ｇ、１５２．８μｍｏｌ、Ｍｎ＝２０Ｋ、多分散性＝１．３−１．５）を添加した。反応物を４℃で２日間放置した。沈殿したジシクロヘキシル尿素をろ過によって除去した。ろ液をクロロホルム：エーテル：イソプロパノール（１２０ｍｌ：８００ｍｌ：４００ｍｌ）の混合物で希釈し、沈殿物をろ過によって除去した。ろ液を減圧下で乾燥して、粗生成物１．８６３ｇ（６１．０％）を得、次にこれをＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットにおいて２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５ ２Ｌに対して透析した。
【００５８】
結合
５ｍＭ ＥＤＴＡ及びレプチンＳ７８Ｃ（９７ｍｇ、６．０μｍｏｌ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のポリマー（１．８２６９ｇ、９０μｍｏｌ）を、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌまで添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
精製
ポリマー結合体反応混合物のｐＨを３．５に調整し、次にＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０カラムを用いてＦＰＬＣによって精製した。分画１８−２７を高分子量結合体として一緒にし、分画２８−３０を中分子量結合体として一緒にし、分画３１−３２を低分子量結合体として一緒にした。
【００６０】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＰａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ遠心濃縮機（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、Ａｃｒｏｄｉｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター（２５ｍｍ、０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を通して５ｍｌ無菌バイアルにろ過した。
【００６１】
結果
ＰＥＧ１Ｋ＋ＧＬＵＴ−ポリエステル−レプチンを、図１及び２に示すように、インビトロでの加水分解に対する抵抗性及び動物において体重減少を誘導する上での効果に関して試験した。データは、ＰＥＧ化レプチン及び本発明のブロックポリマーでＰＥＧ化したレプチンで処置したマウスが体重減少すること（図２）、及びブロックポリマー−レプチン結合体では腎空胞の形成が実質的に低下し、腎空胞が検出不能であった（図３）ことを示す。
【実施例２】
【００６２】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ−レプチン
材料
分子量＝１ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、５０℃−６０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、次いで室温に冷却した。塩化オキサリル（９９＋％、Ｆｌｕｋａ）、ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、無水ジエチルエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（＞９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００６３】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラム（ＴＳＫ）を使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの２５ＣＶ、０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／塩化メチレン（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００６４】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（７．１０ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４４ｇ、１４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をドライアイス浴中で攪拌し、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の塩化オキサリル（０．９ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下して、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で無水アセトニトリル７０ｍｌ中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌに溶解し、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水２Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。残留物を無水ジエチルエーテル２００ｍｌで沈殿させ、真空下で乾燥した。生成物の重量は５．１８ｇ（６４．７重量％）であった。
【００６５】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（５．１８ｇ、２８７μｍｏｌ、Ｍｎ＝１８Ｋ、多分散性＝１．３５）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４８．２ｍｇ、４７６μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，０．２２８７ｇ、８５９μｍｏｌ）で処理した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがニンヒドリン陰性になるまで活性化反応を観測した。１時間後に反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを共沸蒸留（３×３０ｍｌトルエン）によって除去して、次いで一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．５９ｇ（〜６９重量％）であった。
【００６６】
結合
ポリマー（６１０ｍｇ、３３．８μｍｏｌ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解し、レプチンＳ７８Ｃ（１００ｍｇ、６．２μｍｏｌ）を添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００６７】
精製
ポリマー結合体溶液をｐＨ３．５に調整した後、カラムに負荷した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５ｍＭ ＮａＣｌを溶離液として用いるＦＰＬＣによって結合体を精製した。分画３２−５０を高分子量結合体として一緒にし、分画５１−６０を中分子量結合体として一緒にし、分画６１−６８を低分子量結合体として一緒にした。
【００６８】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５ｍｌ無菌バイアルにろ過した（２５ｍｍ、０．２ｕｍ Ａｃｒｏｄｉｃｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター、ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００６９】
結果
マウスに、レプチンに結合した低、中及び高分子量ＰＥＧブロックポリマー（この実施例で上記に述べた）、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質又は２０ｋＤａ ＰＥＧ化レプチンを注射した。これらの注射からの体重減少の結果を図４に示し、腎空胞形成を図５に示す。これらの結果は、タンパク質に結合した通常ＰＥＧポリマーと比較して同じタンパク質に結合したブロックポリマーの改善を明らかに示す。
【実施例３】
【００７０】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＰＥＧ１Ｋ−レプチン
材料
分子量＝１０００ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）及び分子量＝１０５６ＫＤａの２個のカルボン酸末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−二酸）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、各々回転蒸発器で共沸蒸留によって乾燥した（５０−６０℃、３Ｘ、３０ｍｌトルエン）。ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、塩化チオニル（９９％低鉄、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９９．８％、Ａｌｄｒｉｃｈ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００７１】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒ及び０．１％トリエチルアミンを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラムを使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／クロロホルム（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００７２】
ＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物
トルエン３５ｍｌ中の蒸留塩化チオニル（２．１３ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（０．１４２ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を、ＰＥＧ１Ｋ−二酸（４．７２８９ｇ、４．４７８ｍｍｏｌ）を含む１００ｍｌ丸底フラスコに緩やかに導入した。反応物をさらに１−２時間室温で反応させ、次いで回転蒸発器（５０−６０℃）で濃縮して、ＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物の油性残留物を残し、これをアルゴンガス下で保存した。
【００７３】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（４．５２ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（０．９１４５ｇ、９．０４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で攪拌し、無水アセトニトリル３０ｍｌ中のＰＥＧ１Ｋ−二酸塩化物（４．７２８９ｇ、４．４７８ｍｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下し、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（０．０３４ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌに溶解し、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水２Ｌで精製した。溶液を濃縮し、残留水を回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。生成物の重量は３．７ｇ（４０％収率）であった。
【００７４】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（３．７６ｇ、１８８μｍｏｌ、Ｍｎ＝２０ｋＤａ、多分散性＝１．６４）を無水アセトニトリル（４０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２８．５５ｍｇ、２８２μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６．８ｍｇ、２８８μｍｏｌ）で処理した。１時間後にＴＬＣによって（ニンヒドリン陰性）反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−３膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。溶液を濃縮し、共沸蒸留（３回、３０ｍｌトルエン）によって乾燥して、一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．１３ｇ（８４．７％収率）であった。
【００７５】
結合
活性化したマレイミドポリマー（３．１３ｇ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及びｐＨ６．５緩衝液に溶解した。レプチンＳ７８Ｃ（１２６ｍｇ、７．７９８μｍｏｌ）を添加した。反応物の最終濃度はタンパク質２ｍｇ／ｍｌ（全６５ｍｌ緩衝液）であった。反応混合物を４℃で一晩放置した。
【００７６】
精製
ポリマー結合体のｐＨを３．５に調整し、１ｍｇタンパク質／ｍｌに希釈した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５Ｍ ＮａＣｌを溶離液として用いるＦＰＬＣによって結合体を精製した。分画を４−２０％トリ−グリミニゲル（Ｎｏｖｅｘ、クマシーブルー染色）で分析した。分画２９−４９を高分子量結合体として一緒にし、分画５０−５７を中分子量結合体として一緒にし、分画５８−６５を低分子量結合体として一緒にした。
【００７７】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高、中及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において４℃で５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。試料を２ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、Ａｃｒｏｄｉｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター（２５ｍｍ、０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を通して５ｍｌ無菌バイアルにろ過した。
【００７８】
実施例１−３の結論
上述したアミド−レプチンポリマーを製剤し、マウスに注射して、制御された期間にわたって体重減少を測定した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として使用し、これらの体重を用いてゼロの基線値を算定した。ゼロ日目の単回投与での１０ｍｇ／ｋｇのＦｃ−レプチン融合物は、４日目に１１％という体重減少のピークを誘導し、体重は８日目までに基線値近くに戻った。同様に、ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合、中分子量結合及び低分子量結合のレプチン結合体は、同じく単回投与での１０ｍｇ／ｋｇで、ほぼ４日目又は５日目頃にピーク体重減少を誘導した。しかし、Ｆｃ−レプチンと異なり、ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ中分子量結合レプチン及びＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合レプチン結合体は、１４日間の試験期間を超えて２％以上の体重減少を維持した。
【００７９】
２０ｋモノＰＥＧ−レプチン結合体も、単回投与での１０ｍｇ／ｋｇで投与し、３日目に９％のピーク体重減少を誘導し、動物は８日目までに体重を基線値の１％内に回復し、１１日目まで基線値体重以下であった（図４）。これらの実験を反復し、比肩し得る結果を得た。
【００８０】
別の実験において、結合体を注射した後に腎空胞を特定し、以下の尺度を用いて評点した。グレードゼロは腎空胞なしに等しい。グレード１＋は、まれで小さな空胞によって示される最小腎空胞に等しい。グレード２＋は、中等度の数の直径約３μｍの空胞によって示される軽度腎空胞に等しい。グレード３＋は、多数の直径約３−約５μｍの空胞によって示される中等度の腎空胞に等しい。グレード４＋は、無数の大きな、すなわち直径５μｍ以上の空胞が存在することを意味する著明な腎空胞に等しい。尿細管上皮が空胞形成に関して分析した主要部位であった。
【００８１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０又は２５ｍｇ／ｋｇの１日量の結合体又は対照を７日間又は１４日間注射した。ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ高分子量結合レプチンは、７又は１４日間の毎日の皮下注射後に尿細管上皮における空胞を誘発しなかった。
【００８２】
ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ中分子量結合レプチンは、毎日２５ｍｇ／ｋｇの７日間の注射後にグレード１＋又は１４日間の注射後にグレード２＋の尿細管上皮空胞を誘発し、１０ｍｇ／ｋｇを１４日間毎日注射した後最小腎空胞（グレード１＋）を誘発した。この結合体に関して１０ｍｇ／ｋｇを７日間毎日注射したときには、腎空胞は検出されなかった。
【００８３】
ＰＥＧ１ｋ＋ｏｘｌ低分子量結合レプチンは、毎日２５ｍｇ／ｋｇの７日間（グレード２＋）又は１４日間（グレード３＋）の皮下注射後に腎空胞を誘発した。病変は、１０ｍｇ／ｋｇ／日の７日間（グレード２＋）又は１４日間（グレード２＋）の投与後にも認められた。
【００８４】
陽性対照である２０ｋモノＰＥＧ−レプチンは、投与期間に関わりなく１０ｍｇ／ｋｇ／日又は２５ｍｇ／ｋｇ／日の注射後に最小でもグレード３＋の腎空胞を誘発した。
【実施例４】
【００８５】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ／Ｌ１−７ペプチド
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬポリマー（分子量＝１５ＫＤａ、９６．２９ｍｇ（６．４μｍｏｌ）を、５０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中のＬ１−７ペプチド（５．３９ｍｇ、１．５μｍｏｌ）の溶液に添加した。ペプチドの最終濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであった。溶液を４℃で一晩インキュベートした。種々の分子量プールへの結合体の分離は、Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＳＰ ＨＰ １ｍｌカラムを用いてＦＰＬＣによって実施した。カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０の５ＣＶで平衡させ、結合体を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス５００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ４．０の３０ＣＶで１ｍｌ分画に溶出した。分画１−４から高分子量プールを形成し、分画９−３９から低分子量プールを形成した。
【００８６】
両方のプールを濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【実施例５】
【００８７】
ＰＥＧ１Ｋ＋ＯＸＬ−ｓＴＮＦ
材料
分子量＝１ＫＤａの２個のアミン末端基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．）を、５０−６０℃の真空オーブンで一晩乾燥し、次いで室温に冷却した。塩化オキサリル（９９＋％、Ｆｌｕｋａ）、ジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、無水ジエチルエーテル（Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ）、無水アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｆｌｕｋａ）、トリエチルアミン（＞９９．９％、Ｒｏｍｉｌ Ｌｔｄ．）及び無菌水（Ｂａｘｔｅｒ）を受領したままの状態で使用した。
【００８８】
装置器具
ＹＭ−３及びＹＭ−１０膜（公称分子量３０００及び１０，０００ＫＤａカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌｓを精製のために使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、５１０ポンプ、４９０Ｅ多波長検出器及び４１０示差屈折計；メタノール中２０ｍＭ ＬｉＢｒを移動相とするＡｌｐｈａ Ｓｅｒｉｅｓ２５００及び４０００カラム（ＴＳＫ）を使用し、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエアと共にポリ（エチレングリコール）標準品を用いてＧＰＣを実施した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０プラス０．５Ｍ ＮａＣｌの０−５５％勾配により２．５ｍｌ／分で溶出するＨｉＬｏａｄ ＳＰ２６／１０陽イオン交換カラムにおいてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの１００プレート（ＴＬＣ ６０°Ｆ２５４）で実施し、メタノール／クロロホルム（１：４）で展開して、ヨウ素蒸気及びニンヒドリンスプレーで視覚化した。
【００８９】
重合
ＰＥＧ１Ｋ−ジアミン（７．１０ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４４ｇ、１４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をドライアイス浴中で攪拌し、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の塩化オキサリル（０．９ｇ、７．１０ｍｏｌ）を３−４時間かけて滴下して、次いで室温で一晩攪拌した。生成物の分子量を、所望範囲（２０−５０ｋＤａ）が達成されるまでＧＰＣによって追跡し、達成された時点で無水アセトニトリル７０ｍｌ中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがさらなる変化を示さなくなるまでキャッピング反応を観測した。減圧下に回転蒸発器でアセトニトリルを蒸発させ、油性残留物を残した。この油性残留物を無菌水２０ｍｌ及びｖａｑｕｅ膜に溶解した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを回転蒸発器での共沸蒸留（１００ｍｌトルエン３回）によって除去した。残留物を無水ジエチルエーテル２００ｍｌで沈殿させ、真空下で乾燥した。生成物の重量は５．１８ｇ（６４．７重量％）であった。
【００９０】
活性化
上記のアミンキャップしたポリマー（５．１８ｇ、２８７μｍｏｌ、Ｍｎ＝１８Ｋ、多分散性＝１．３５）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４８．２ｍｇ、４７６μｍｏｌ）及びマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，０．２２８７ｇ、８５９μｍｏｌ）で処理した。ＴＬＣのニンヒドリン陽性ポリマースポットがニンヒドリン陰性になるまで活性化反応を観測した。１時間後に反応が完了したことを認めた。溶媒を蒸発させ、生成物を、ＹＭ−１０膜を用いる攪拌セルにおいて無菌水１Ｌで精製した。バルクの水を蒸発によって除去し、残りを共沸蒸留（３×３０ｍｌトルエン）によって除去して、次いで一晩真空乾燥した。生成物の重量は３．５９ｇ（〜６９重量％）であった。
【００９１】
結合
ポリマー（５４９ｍｇ、３０．５μｍｏｌ）を２０ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解した。ｓＴＮＦ受容体（６５．５ｍｇ、５．４μｍｏｌ）を添加した。反応物を４℃で一晩インキュベートした。
【００９２】
精製
ポリマー結合体溶液をｐＨ３．５に調整した後、カラムに負荷した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムプラス０．５ｍＭ ＮａＣｌを溶離液として使用するＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨＲカラムを用いてＦＰＬＣによって結合体を精製した。結合ｓＴＮＦ不含及び結合ｓＴＮＦを含む分画番号７０−８０をプールし、濃縮した。プールをＳＥＣ２６／６０ＳｅｐｈａｃｒｙｌカラムＳ３００に負荷した。結合体を２つのプール中で高分子量結合体及び低分子量結合体として収集した。
【００９３】
バイオアッセイのための試料を調製するために、高及び低分子量プールをＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（ＹＭ−３膜）において濃縮し、次いで各々のプールを、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて４℃で２４時間にわたってＰＢＳに対して２回（１Ｌ）透析した。最後に、試料を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５ｍｌ無菌バイアルにろ過した（２５ｍｍ、０．２ｕｍ Ａｃｒｏｄｉｃｃ Ｓｙｒｉｎｇｅフィルター、ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００９４】
実施例５の結合体のインビボ実験
可溶性ＴＮＦ−ＲＩ結合体を、炎症のマウスモデルを治療する上での効果に関して試験した。コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を有するルイスラットに、上述したように作製し、ｓＴＮＦ／ＰＥＧ＋ＯＸＬと命名した結合体を注射した。ポリマー鎖は、連結した１ｋＤａ ＰＥＧ分子から成る。
【００９５】
８０から１００ｇの９０匹の雌性ラットを入手し、以下のように関節炎を誘発した。ブタＩＩ型コラーゲンを０．１Ｎ酢酸（２ｍｇコラーゲン／ｍｌ酢酸）に溶解した。１６ゲージ乳化針をアジュバントと１：１で使用した。ラットに、足蹠の背面上の１０の異なる部位に１００μｌの乳剤を皮内注射した。
【００９６】
疾患の発症は足の腫脹と定義され、１１日目に発生した。結合体を発症時から開始して４ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、３日間毎日注射した。正常対照（Ｎ＝５）、未処置対照（Ｎ＝８）、ＰＥＧ−ｒ−ｍｅｔＨｕ−ｓＴＮＦ−ｒＩ（Ｎ＝８）、ｓＴＮＦ／ＰＥＧ＋ＯＸＬ−１４（Ｎ＝８）及びｓＴＮＦ−ＲＩ（Ｎ＝８）として５群に分けた。関節炎対照マウスは、発症から３日目の試験終了時まで毎日カリパスで測定したとき、３日目に約１ｍｍの（平均±ＳＥ；ｎ＝８）の足腫脹を有していた。ｓＴＮＦ−ＲＩ処置マウスは、３日目に約０．５ｍｍの足腫脹を有していた。これに対し、ＰＥＧ及びＰＥＧ＋ＯＸＬポリマーは、どちらも３日の期間にわたってほとんどの検出不能なレベルまで足腫脹を抑制した（図６）。
【００９７】
本発明を好ましい実施形態の見地から説明したが、当業者には変法及び修正が生じることは了解される。従って、付属の特許請求の範囲は、特許請求の範囲内に含まれる、このような全ての等価変法をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】１、２又は２０ｋＤａのＰＥＧ化レプチンを慢性注射した時の腎空胞形成を示す。Ｙ軸上で、０は可視空胞が存在せず、０．５は、散在して分布するまれなごく小さい空胞であり、１．０は、細管内の細胞の刷子縁の下のごく小さな空胞の最小限の連なりであり、１．５は、分散した、いずれの細胞又は細管にも影響を及ぼさない、明らかな小空胞であり、２．０は、虫食い状の外観を有する、細管内の軽度であるが明らかな空胞であり、２．５は、より重症であるが、まだ細胞容積全体には影響を及ぼさない空胞であり、３．０は、細管の５０％未満の中等度で明白な、大きく透明な空胞であり、３．５は、明白な空胞（３．０におけるような）及び核変性であり、４．０は、細管の５０％を超える著明な空胞形成及び核変性である。
【図２】本発明の高、中又は低ブロックポリマーでＰＥＧ化したレプチンと比較した、２０キロダルトンのＰＥＧ化レプチンで処置したマウスの体重減少を示す（四角は２０ｋＤａのＰＥＧ化レプチンからのデータを示し、Ｘは低分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、黒枠を伴うＸは低分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、＋は高分子量ブロックポリマー−レプチン結合体からのデータを示し、及びダイアモンド形はＰＢＳ対照からのデータを示す。
【図３】図２に従って処置したマウスにおいて腎空胞形成を測定した。
【図４】データは、実施例２で作製した結合体の単回注射の結果を示す。データの記号参照は図２と同じであり、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質についての三角が追加されている。
【図５】図３に従って処置したマウスにおいて腎空胞形成を測定した。
【図６】足の腫脹とブロックポリマーＰＥＧ又は２０ｋＤａ ＰＥＧのいずれかに結合したｓＴＮＦＲ１の作用を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，０００ダルトン未満の第一水溶性ポリマー、不安定リンカー、及び２，０００ダルトン未満の第二水溶性ポリマーを含むブロックポリマー。
【請求項２】
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールから成る群より選択される、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項３】
総分子量が４０ｋＤａ未満である、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項４】
総分子量が約２０ｋＤａである、請求項３に記載のブロックポリマー。
【請求項５】
ブロックコポリマー構造を含む、請求項２に記載のブロックポリマー。
【請求項６】
少なくとも２個のポリマーの混合物を含む、請求項５に記載のブロックポリマー。
【請求項７】
ブロックホモポリマー構造を含む、請求項２に記載のブロックポリマー。
【請求項８】
ポリエチレングリコールのブロックから成る、請求項７に記載のブロックホモポリマー。
【請求項９】
ブロックポリマーの９０％が２，０００ダルトン未満である、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項１０】
ポリマーブロックの大部分が約１，０００ダルトンである、請求項９に記載のブロックポリマー。
【請求項１１】
タンパク質分解感受性リンカーがアミド結合を含む、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項１２】
薬剤及び医薬的に許容される担体に結合された請求項１のいずれかのブロックポリマーを含む製剤。
【請求項１３】
請求項１のいずれかのブロックポリマーを製造する方法。
【請求項１４】
請求項１のいずれかのブロックポリマーを投与することを含む、患者を治療する方法。
【請求項１】
２，０００ダルトン未満の第一水溶性ポリマー、不安定リンカー、及び２，０００ダルトン未満の第二水溶性ポリマーを含むブロックポリマー。
【請求項２】
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールから成る群より選択される、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項３】
総分子量が４０ｋＤａ未満である、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項４】
総分子量が約２０ｋＤａである、請求項３に記載のブロックポリマー。
【請求項５】
ブロックコポリマー構造を含む、請求項２に記載のブロックポリマー。
【請求項６】
少なくとも２個のポリマーの混合物を含む、請求項５に記載のブロックポリマー。
【請求項７】
ブロックホモポリマー構造を含む、請求項２に記載のブロックポリマー。
【請求項８】
ポリエチレングリコールのブロックから成る、請求項７に記載のブロックホモポリマー。
【請求項９】
ブロックポリマーの９０％が２，０００ダルトン未満である、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項１０】
ポリマーブロックの大部分が約１，０００ダルトンである、請求項９に記載のブロックポリマー。
【請求項１１】
タンパク質分解感受性リンカーがアミド結合を含む、請求項１に記載のブロックポリマー。
【請求項１２】
薬剤及び医薬的に許容される担体に結合された請求項１のいずれかのブロックポリマーを含む製剤。
【請求項１３】
請求項１のいずれかのブロックポリマーを製造する方法。
【請求項１４】
請求項１のいずれかのブロックポリマーを投与することを含む、患者を治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５３０５６９（Ｐ２００７−５３０５６９Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０５１４２（Ｐ２００７−５０５１４２）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４８９８
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４８９８
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
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