化学物質を追跡し、定量化するためのシステムおよび方法
複雑な分離では、計測器が区別できる範囲内で複数の物質が同じ分子量を持つ可能性がある。保持時間（値
のＮ個の対）５０６を決定するために保持時間のこれまでに知られていない規則性に照らして正確な質量測定が使用される。保持時間マップにより、基準保持時間が１つの分離においてそれぞれの物質に割り当てられるようにできる。次いで、基準保持時間は、正確な質量測定とともに、分離と分離との間で物質７０４、７０８を追跡し比較するために使用することができる。
のＮ個の対）５０６を決定するために保持時間のこれまでに知られていない規則性に照らして正確な質量測定が使用される。保持時間マップにより、基準保持時間が１つの分離においてそれぞれの物質に割り当てられるようにできる。次いで、基準保持時間は、正確な質量測定とともに、分離と分離との間で物質７０４、７０８を追跡し比較するために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年２月１３日に出願した米国仮出願第６０／５４４，５０１号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本特許明細書の開示の一部は、著作権保護の対象となる資料を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録の記載に従い誰が特許文書または特許開示のファクシミリ複製を行おうと異存はないが、その他の点ではいかなる形であれすべての著作権を留保する。
【０００３】
本発明は、一般的に、ＬＣ／ＭＳ分析システムに関する。より具体的には、本発明は、ＬＣ／ＭＳ実験中の一方の注入から他方の注入への物質の追跡に関する。
【背景技術】
【０００４】
分析化学における重要な問題は、複雑な混合物内に含まれる１つまたは複数の分子状物質の濃度を推定することである。液体クロマトグラフィ（ＬＣ）の後に質量分析（ＭＳ）を行うことは、試料中の多数の化学物質を分離しそれぞれの化学物質の濃度または量を測定しやすくするために使用することができるよく知られている技術（ＬＣ／ＭＳ）である。物質の正確な質量を測定することで、複数の試料について物質を追跡することができる。追跡される物質の応答または強度を測定することで、物質の濃度を試料毎に追跡することができる。
【０００５】
ＬＣ／ＭＳでは、分析のため試料がシステム内に注入される。そのような注入毎に、ＬＣ／ＭＳシステムは、イオンの保持時間、分子量、および強度を測定する。複数のイオンが、単一の分子から発生しうる。分子の濃度は、その分子が発生するイオンのうちの１つまたは複数による調査により決定されることができる。
【０００６】
本明細書で使用されているように、「物質」という用語は、１つの分子からの単一イオン、または単一の共通分子から得られるイオンの集まりを意味することができる。例えば、低分子量の小さな分子は、単一イオンを発生することができる。ペプチドまたはタンパク質などの巨大分子は、複数のイオンを発生することができる。１つの分子から複数のイオンを組み合わせて単一の有効な、質量、保持時間、および強度を得るためによく知られている技術が使用できる。それぞれの物質は、質量、保持時間、および強度を有すること、および有効な質量、保持時間、および強度は、それぞれの物質に割り当てられることが仮定される。
【０００７】
質量、保持時間、および強度のこれらの測定結果を使用することで、物質の特性を決定できる。例えば、注入と注入との間の対応する物質の強度の比較は、物質の濃度が対照と未知試料との間で変化するかどうかを判定する基準となる。試料間のタンパク質の濃度の変化は、試料間のタンパク質の発現量の変化を示すものである。
【０００８】
一組の試料は、連続注入を使用して処理することができる。同じ試料を複数回注入して、一組の繰り返し注入を行うことができる。例えば、２つの区別できる試料（標準試料と未知試料）は、それぞれ、３回注入することができ、それにより、合計６回の注入を行える。濃度測定の再現性は、このデータを使用することで、それぞれの物質、さらに対照試料と未知試料との間のそれぞれの物質の濃度の変化について、推論することができる。それぞれの試料は、試料間の相対的較正を行うための一定量の内部標準を含むことができる。
【０００９】
いかなる物質の濃度を判定する技術についても、まず、他のすべてのものからその物質を適切に分別しなければならない。ＬＣ／ＭＳ技術では、質量と保持時間の両方において物質（または物質に関連付けられたイオン）を分離することができる。他の方法では区別がつきようもない、保持時間内に共溶出する物質は、質量で分別することができ、したがって、その検出を行え、その強度の正確な推定を行うことができる。
【００１０】
しかし、一方の注入から他方の注入への物質の関連付けまたは追跡については、正確な質量による分別だけでは十分でない場合がある。例えば、分子の質量および保持時間の特性を考えよう。分子量は、分子の固有特性である。質量分析計は、分子量と電荷との比ｍ／ｚを測定する。記号μは、質量対電荷比ｍ／ｚを示すために使用されることが多い。μに対する値は、注入と注入との間で直接比較できる。同じ物質に関して注入と注入との間のμの測定値の変動は、計測器ノイズ源のみによるものでなければならない。
【００１１】
エレクトロスプレーイオン化などのイオン化技術により、ペプチドまたはタンパク質などの試料について電荷Ｚを決定することができる。決定された荷電状態により、物質の分子量ｍを推論することができる。したがって、分子量ｍは、物質を追跡するための基準を与える。これらの目的のために、経験的に観測された質量対電荷比の値μ、または分子量ｍの推論された値は、同義的に使用することができる。本明細書で使用されているように、質量という用語は、観測された質量対電荷の比の値μ、または推論された分子量ｍを意味する。
【００１２】
十分に高い質量精度により、それぞれの物質は、質量の値に基づき潜在的に一意に区別可能である。そのため、物質をわずかしか含まない試料の場合、物質を分離する十分なクロマトグラフ分解能があると仮定すると、分解能ｍ／Δｍ≒２０，０００の飛行時間型（ＴＯＦ）分析器などの高精度質量分析計を使用することで、質量単独の正確な測定結果に基づいて一方の注入から他方の注入までそれぞれの物質を追跡することができる。このような場合、質量は、物質をその化学組成または構造に関して同定するために必ずしも使用されていない。むしろ、質量は、注入から注入までの間物質を追跡するための物質の経験的な、場合によっては一意的な識別子として使用される。
【００１３】
しかし、質量だけだと、一方の注入から他方の注入まで物質を追跡するのに十分でない場合がある。質量精度が低く、試料が複雑である場合、一方の注入で確認されたような物質の質量が他方の注入における無関係の物質の経験的に観測された質量と一致することがある可能性がある。例えば、それぞれμが１０２４．２００ａｍｕおよび１０２４．３００ａｍｕである２つの物質がありうる。このような物質は０．１００ａｍｕ未満のＭＳ精度で区別可能であるが、０．１００ａｍｕを超える精度のＭＳを使用したのでは区別可能でない。
【００１４】
物質のクロマトグラフ保持時間は、その物質の付加的な潜在的に無関係の識別子とすることができる。物質の保持時間は、固有特性ではない。むしろ、物質の保持時間は、物質（または、むしろ、物質を生じさせる分子）と、いろいろな効果のうち特に、クロマトグラフ分離における液相および固相との相互作用に依存する。しかし、保持時間が固有でないとしても、その値は、与えられた分離方法について再現性の高いものとすることができる。保持時間が正確に再現可能であり、精度が高い場合、質量と保持時間の両方の呼応の組み合わせは、一方の注入から他方の注入までそれぞれの物質を一意に追跡するのに十分でありうるのが理想的である。つまり、２つの異なる物質が正確な同じ質量および保持時間を共有することはまずありえないであろう。しかし、保持時間は、注入から注入までの間必ずしも再現可能であるわけではない。むしろ、物質の保持時間は、注入から注入までの間に変動する可能性がある。
【００１５】
注入から注入までの間のこのような保持時間の変動にもかかわらず、保持時間には知られている規則性がある。つまり、物質が時刻ｔに注入Ａで溶出した場合、その物質は、他の注入Ｂでも溶出し、保持時間は時間枠ｔ±Δｔの範囲にある。つまり、与えられた物質の保持時間は、一方の注入から他方の注入までの間に変動する可能性がある。しかし、このような変動は、時間枠ｔ±Δｔを上下限とする。この境界Δｔは、経験的に決定することができ、本明細書では、粗保持時間閾値Δｔｃと呼ぶ。本明細書で使用されているように、ｔ±Δｔｃという用語は、粗保持時間枠を指す。粗保持時間枠内にあるすべての物質が十分に一意的な質量を有し、一般に粗保持時間枠および質量だけに基づいて、また特に、より複雑な試料の場合に、追跡を行うことができる場合もあるかもしれないが、与えられた粗保持時間枠内で質量が一意にならないような質量値を持つ物質もありえる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の実施形態は、限定はしないが、ＬＣにより分離され、エレクトロスプレーイオン化によりイオン化され、四重極型分析器、飛行時間型分析器、イオントラップ型分析器、またはこれらの分析器の組み合わせを含む、質量分析計により分析される試料を伴う。さらに、本発明の実施形態は、ＭＳ−ＭＳまたはＭＳｎ技術により断片化できる物質に適用可能である。
【００１７】
本発明の実施形態では、クロマトグラフ保持時間のこれまでに知られていない付加的な規則性を、物質が試料中において一意的な質量を有するという事実とあわせて用い、他のいかなる手段でも質量単独では区別可能でないと思われる残留物質を一意に追跡する。このような試料の例は、天然タンパク質試料に由来するペプチドの消化物を含む。例えば、血清のペプチド消化物は、１０，０００個またはそれ以上の区別できるペプチド、つまり物質を含むことができる。クロマトグラフ分離では、３０個またはそれ以上のペプチドは、クロマトグラフピークの幅の範囲内で溶出できる。
【００１８】
第１のこれまでに知られていない規則性は、２つの異なる化学物質が一方の分離において全く同じ保持時間で溶出する場合に、他の分離におけるそれらの物質に対する保持時間の差も０になるというものである。つまり、２つの異なる化学物質が互いに関して一方の分離において同じ時間で溶出する場合、互いに関して他のすべての分離において全く同じ保持時間で溶出する。この対の絶対保持時間は、分離から分離への間に変わる可能性がある。しかし、保持時間の差が一方の分離において物質の対について０である場合、物質のその対の間の保持時間の差は、すべての分離に関して０となる。
【００１９】
この規則性は、ペプチド混合物の重要な場合において生じる。一方の分離において同じ保持時間で溶出する２つのペプチドは、他のすべての分離においても同一保持時間で溶出する。ここでもまた、絶対保持時間は分離から分離までの間に変化しうるが、保持時間の差は０となる。
【００２０】
第２のこれまでに知られていない規則性は、保持時間に関連付けられた固有測定誤差である。２つの物質がすべての注入において互いに関して同じ保持時間で溶出する場合、実際には、いくぶん異なる測定溶出時間で溶出する。そのため、単一の注入の範囲内では、２つの物質の測定された保持時間は、平均をとった場合のみ、一致し、同一となる。これらの測定誤差は、ピークの最高値を求めることと関連する統計誤差としてみなすことができる。例えば、物質が注入において１０．０分で溶出する場合、その測定された保持時間は、±０．２分だけ異なると予測されると考えられ、第２の物質も１０．０分で溶出する場合、その測定された保持時間も、±０．２分だけ異なるであろう。したがって、１つ注入の範囲内では、２つの物質に対する保持時間の測定された値は、９．９０および１０．１５分とすることができる。０．２５分のこの偏差は、２つの物質の実際の相対的保持時間の偏差ではない（０である）。これは、測定誤差によるその注入の範囲内でのそれぞれの物質の保持時間の測定結果の偏差である。
【００２１】
一般に、この統計に基づく測定誤差は、Δｔｃで表される、変動誤差よりも著しく小さい。固有統計測定誤差に関連付けられた閾値は、本明細書では、詳細保持時間閾値と呼ばれ、Δｔｆで表される。
【００２２】
第３のこれまでに知られていない規則性は、近い時間で溶出するが、全く同じ保持時間で溶出するわけではない物質について生じる。このような物質が溶出する保持時間は、分離から分離への間に変わる可能性がある。しかし、２つの時間的に近い溶出物質の間で溶出する第３の物質がある場合、これら２つの間で常に溶出する。
【００２３】
例えば、保持時間変動の結果として、２つの物質の間の時間オフセットは、注入から注入までの間に変化しうる。例えば、物質が一方の注入において２．０分と２．４分で溶出する場合、第２の注入では２．５分と２．７分で溶出する可能性がある。第１の物質の保持時間が注入と注入との間に０．５分だけドリフトしたということは真実であるが、このドリフト量は、２つの物質の間の保持時間の差よりも重要性が低い。この差は、第１の注入では０．４分であり、第２の注入では０．２分であった。
【００２４】
第３のこれまでに知られていない規則性も、これら２つの時間の間に注入１において溶出する第３の物質に適用される。例えば、このような第３の物質が注入１において２．１分で溶出すると仮定する。第３の規則性によれば、第３の物質は、注入１において物質１と２との間で溶出したため、注入２などの他の注入において、物質１と２との間でも溶出する。さらに、第３の物質に対する注入間のオフセットは比例する。そのため、注入２では、第３の物質は、２.５５分で溶出する。
【００２５】
粗時間枠（すでに知られている）に関する規則性および統計誤差または詳細保持時間閾値（すでには知られていない）に関する規則性は、再現可能な測定結果またはロバスト法に特徴的であるためすべてのクロマトグラフ分離において生じる。相対的保持時間（すでには知られていない）に関する規則性および保持時間順序（すでには知られていない）は、複雑な混合物中のすべての物質について生じる場合も生じない場合もある。しかし、これらは、ペプチド消化物中に観察され、物質がクロマトグラフ固定相および移動相との関連する化学的相互作用を持つ混合物について有効である可能性がある。
【００２６】
本発明の実施形態では、これらの規則性の出現を認識し、注入から注入までの物質を追跡するためにそれらを利用することができる。本発明の一実施形態では、試料中のそれぞれの物質に対し、基準保持時間が割り当てられる。基準保持時間は、２つの物質が同じ基準保持時間を持たなければ同じ物質ではありえないという意味で一意である。他方で、それらが同じ基準保持期間を持つ場合、同じ物質である可能性がある。
【００２７】
この仮定を使用することで、本発明の実施形態は、同じ質量および同じ基準保持時間を持つことを要求することにより物質を追跡する。分子量または保持時間のいずれかまたは両方において著しく異なる物質は、同じではない。本発明のいくつかの実施形態によれば、著しい差は、閾値を外れる差である。
【００２８】
要約すれば、複雑な分離では、計測器が区別できる範囲内で複数の物質が同じ質量を持つ可能性がある。本発明のいくつかの実施形態は、保持時間の前記のすでには知られていない規則性に照らして正確な質量測定を使用し、保持時間マップを決定する。次いで、保持時間マップにより、基準保持時間が１つの分離においてそれぞれの物質に割り当てられるようにできる。次に、物質の基準保持時間および質量を分離（注入）の間に比較し、分離から分離まで（注入から注入まで）その物質を追跡することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
一実施形態では、本発明は、ＬＣ／ＭＳシステムで物質を追跡するための方法である。この方法は、第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択することを含む。第１および第２の注入から選択された物質が比較される。一致する物質は、これらの比較に基づいて同定される。一致する物質を使用して、保持時間マップが形成される。保持時間マップは、基準保持時間をそれぞれの物質に割り当てるために使用される。次に、物質の基準保持時間および質量を分離（注入）の間に比較し、分離から分離まで（注入から注入まで）その物質を追跡することができる。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、ＬＣ／ＭＳシステムで物質を追跡するためのシステムである。システムは、液体クロマトグラフに投入される試料を含む。液体クロマトグラフは、試料を１つまたは複数の物質に分離する。システムは、さらに、物質のそれぞれの質量を決定するために物質が投入される質量分析計を含む。コンピュータがシステムに含まれる。コンピュータは、第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択し、第１および第２の注入から選択された物質を比較し、第１および第２の注入における一致する物質を同定し、一致する物質に基づいて保持時間マップを構成し、マップに基づいて基準保持時間をそれぞれの物質に割り当て、物質の基準保持時間および質量を使用して分離と分離（注入）の間に物質を追跡するようにプログラムされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１は、本発明の一実施形態による例示的なＬＣ／ＭＳシステム１０１の概略図である。試料１０２は、液体クロマトグラフ１０４内に自動的に、または手動で注入される。高圧のクロマトグラフ溶媒流は、強制的に試料１０２を液体クロマトグラフ１０４内のクロマトグラフカラム１０６に通す。カラム１０６は、典型的には、結合分子が表面に含まれるシリカビーズの充填カラムを含む。試料中の分子種、溶媒、およびビーズ間の競合的相互作用は、それぞれの分子種の移動速度を決定する。分子種は、カラム１０６内を移動し、保持時間と呼ばれる、特性時間にカラム１０６から出現する、つまり溶出する。
【００３２】
ＬＣ／ＭＳシステムでは、カラム１０６から溶出した後、分子は質量分析計１０８などの検出装置に搬送される。質量分析計１０８は、脱溶媒和システム１１０、イオン化装置１１２、質量分析器１１４、検出装置１１６、およびコンピュータを備える。コンピュータ１１８は、本明細書で説明されている物質追跡機能を実行するように構成またはプログラムできるコンピュータであればどのようなものでもよい。さらにコンピュータ１１８は、本明細書で説明されているように選択された値をユーザが入力できるように、または自動的に決定できるように構成することができる。
【００３３】
試料が質量分析計１０８内に導入されると、脱溶媒和システム１１０が、溶媒を除去し、イオン発生源１１２が、検体分子をイオン化する。イオン化法は、よく知られている電子衝撃（ＥＩ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、およびサーモスプレーを含む。ＡＰＣＩでは、試料は脱溶媒和され、その後イオン化されることに留意されたい。
【００３４】
イオン化された分子は、質量分析器１１４に搬送される。質量分析器１１４は、質量対電荷比により分子をソートまたはフィルタ処理する。質量分析器１１４などの質量分析器は、四重極型（Ｑ）質量分析器、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器、およびフーリエ変換（ＦＴ）質量分析器を含む。さらに、質量分析器は、例えば、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、三連四重極（Ｑ１−Ｑ２−Ｑ３）型、およびＱ１−Ｑ２−ＴＯＦなどの他の四重極飛行時間型構成を含む、さまざまなタンデム構成で配置することができる。
【００３５】
本発明の実施形態によれば、基準保持時間がそれぞれの注入におけるそれぞれの物質に割り当てられる。本発明の実施形態によれば、物質の基準保持時間および質量は、注入と注入との間で物質を追跡するために使用される。
【００３６】
基準保持時間は、一方の注入を基準注入（注入Ａ）として選択し、Ａにおける物質を試料集合内の他の注入で見つかった物質と比較することにより得られる。例えば、２つの注入、注入Ａと注入Ｂを考える。基準注入Ａにおける物質が、注入Ｂにおける物質と比較される。この比較から得られた結果に基づき、この方法は、基準保持時間を注入Ｂにおける物質に割り当てる。第３の注入、注入Ｃが与えられた場合、この方法では、Ａにおける物質をＣにおける物質と比較して、Ｃに対する基準保持時間を求める。この手順は、基準保持時間を他のすべての試料集合内の他のすべての物質に割り当てるために繰り返される。
【００３７】
次いで、ＢおよびＣにおける物質に割り当てられた基準保持時間は、互いに、および／またはＡにおける保持時間と直接比較することができる。実際、本発明の実施形態による方法では、注入ＢおよびＣにおけるそれぞれの物質に対する、注入ＡとＢとの間、および注入ＡとＣとの間の保持時間ドリフトの効果を取り除く。本発明の実施形態は、望む数の試料の望む数の注入に拡張することができる。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、注入ＡとＢにおける物質の部分集合は、注入ＡとＢとの間の保持時間ドリフトを説明する保持時間マップを得るために使用される。このマップから、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。同様に、本発明の実施形態によれば、注入ＡとＣにおける物質の部分集合は、注入ＡとＣとの間の保持時間ドリフトを説明する保持時間マップを得るために使用される。このマップから、注入Ｃにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。本発明の実施形態は、基準注入Ａと望む数の試料の望む数の注入との間の保持時間マップを決定するように拡張できる。
【００３９】
図２は、本発明の一実施形態による２つの注入ＡとＢとの間の保持時間マップを決定するために一致する物質を同定する方法の流れ図である。この方法は、コンピュータにより自動的に、またはユーザからの入力と組み合わせて実行できる。
【００４０】
工程２０２で、注入ＡおよびＢの物質の部分集合が選択される。物質の部分集合は、多数の方法で、手動により、または自動的に選択することができる。例えば、この部分集合は、強度に基づいて選択できる。本発明のこのような一実施形態では、選択された物質の部分集合は、閾値よりも高い強度を持つ物質を含む。
【００４１】
閾値は、多数の方法で選択できる。例えば、閾値は、手動で入力された、または収集データに従って決定された、予め定められている閾値とすることが可能である。データに従って決定されたこのような閾値は、閾値中央値である。閾値中央値は、注入における物質について測定された強度すべての中央値として計算される。収集データに従って決定された他の閾値は、特定の注入における測定された強度の標準偏差に基づく閾値である。必要というわけではないが、それぞれの注入における測定された強度は、閾値を適用する前または後に正規化することが可能である。
【００４２】
保持時間マップを作成する際に使用される物質の部分集合は、この閾値を超える物質を含む。したがって、本発明の実施例の物質の部分集合は、強度が閾値を超える注入ＡおよびＢにおける物質のみを含む。
【００４３】
工程２０４では、粗保持時間閾値Δｔｃが選択される。本発明の一実施形態では、Δｔｃの好ましい値は、５分である。Δｔｃは、保持時間内に生じうる最大変動を定義するものである。粗保持時間閾値は、手動または自動で選択できる。さらに、粗保持時間閾値は、予め定めておき、例えば、工程２０４で読み出し元となる構成ファイル内に格納することができる。
【００４４】
工程２０６では、分子量閾値Δｍが選択される。分子量閾値は、本明細書では、別に質量閾値とも呼ぶ。分子量閾値は、さらに、１００万分の１単位（Δｍ／ｍ）＊１０６、または質量対電荷比Δμとして表すこともできる。分子量閾値は、当業者によく知られている方法を使用してＭＳの特性を知ることで求めることができる。例えば、このような１つの方法では、分子量閾値をスペクトルのピークの幅に関して指定する。スペクトルのピーク幅が半値全幅（ＦＷＨＭ）として指定されている場合、ｐｐｍ単位の閾値は、（ＦＷＨＭ／ｍ）＊１０６と表すことができる。高強度ピークでは、この閾値は、０．２などのＦＷＨＭの小さな数を使用して下げることができ、そのため、ｐｐｍ誤差は、（０．２＊ＦＷＨＭ／ｍ）＊１０６となる。
【００４５】
分子量閾値は、手動または自動で選択できる。さらに、分子量閾値は、予め定めておき、例えば、工程２０６で読み出し元となる構成ファイル内に格納することができる。
【００４６】
工程２０８で、注入Ａにおけるすべての閾値選択物質を注入Ｂにおける物質と比較する探索が実行される。単独で注入Ｂにおける物質に一致する注入Ａにおける物質は、工程２１０で同定される。２つの物質は、質量の差の大きさが質量閾値Δｍよりも小さい場合、保持時間の差の大きさが粗保持時間閾値Δｔｃの範囲内にある場合、Ｂにおいてその基準と合致する単一の物質のみがある場合、両方の物質（注入Ａにおける物質、および注入Ｂにおける可能な一致する物質）の強度がそれぞれの強度中央値よりも高い場合に一致していると考えられる。上の開示に照らしてこのような一致する物質を同定できる探索方法は、当業でよく知られている。
【００４７】
その結果、工程２１０で得られる対の集合は、分子量、粗保持時間の一意的一致特性を有し、強度要件を満足する物質の対のみを含む。つまり、この集合は、物質のＮ個の一致する対を含み、それぞれ、下付き文字ｉにより示され、それぞれ以下の条件を満たす。
【数１】
【００４８】
当業者には、単独で一致する物質を定義する他の要件を強制可能であることは理解されるであろう。これらの他の要件は、前記の要件の１つまたは複数に加える、それらとは別にする、またはそれらと組み合わせることが可能である。例えば、強度比が特定の閾値範囲内にあるという要件を加えることが可能である。このような条件の下で、一致する物質は、条件
【数２】
を満たさなければならない。このような場合、ｒに対する好ましい値は２としてよいであろう。
【００４９】
加えられる他の要件は、知られている荷電状態のイオンが比較される場合に適用される。このような場合、
【数３】
というように荷電状態が一致する要件を加えることが可能である。
【００５０】
次いで、注入ＡおよびＢからの一致する物質の対は、工程２０２から２１０で説明されているように、本発明の一実施形態による探索を実行することにより得られる。物質のこれらの対は、注入ＡおよびＢにおける物質が閾値基準を満たす場合にのみ保持される。つまり、工程２０２から２１０までの効果として、質量閾値、粗保持時間閾値、および可能な強度閾値からなる一致基準を満たす注入ＡおよびＢにおける物質の部分集合を選ぶことになる。
【００５１】
保持され、一致する物質の対から、
【数４】
として定義されている、保持時間差が対毎に得られる。保持時間差Δｔｉは、保持時間
【数５】
での注入Ａにおけるその物質に関する注入Ｂにおける物質の保持時間ドリフトである。２つの保持時間
【数６】
および
【数７】
は、注入ＡおよびＢからのｉ番目の保持されている一致する対である。
【００５２】
図３は、Δｔｉと、一致する物質を同定した後に保持される対から得られた
【数８】
との例示的なグラフである（工程２１０）。図３内の点は、閾値基準を満たす注入ＡおよびＢにおける物質に対応する。図３の例示的なグラフにおいて、閾値基準は、０．０２０ａｍｕの質量閾値Δｍの範囲内で合致しなければならず、５分以内の保持時間差、粗保持時間閾値、および強度閾値中央値を持つ。
【００５３】
図４は、本発明の一実施形態による、図３を拡大した、領域３０２の例示的なグラフである。拡大された水平軸は、一致する対が垂直軸上にどれだけ集中しているかを示している。
【００５４】
図３および４を調べると、点の大半が塊をなしている、密度の高い背骨部分が存在することがわかる。しかし、これらの図から、さらに、背骨部分の周りに点がある程度散在し、外れ値が存在することもわかる。これらの問題は、後述のフィルタ処理などの技術を介して対処することができる。
【００５５】
質量閾値および粗保持時間閾値を使用して一致する物質のリストが同定された後、工程２１２で保持時間マップが構成される。図５は、本発明の一実施形態による保持時間マップを構成するための方法の流れ図である。工程５０２で、一致する対のリストが、注入Ｂのときに観察された保持時間に応じてソートされる。好ましい一実施形態では、リストは、
【数９】
の値が昇順となるようにソートされる。そこで、ｉ＝１，２，...，Ｎ−１について
【数１０】
となる。このソートで、質量および粗保持時間探索から得られた注入ＡおよびＢにおける物質の間の対合が保持される。
【００５６】
図３に示されているグラフを調べると、保持時間差の大半が粗保持時間枠内に入るため、Δｔｃの値の選択が確認される。さらに、このような調査から、Δｔｃの低減された値を使用して物質間の対合、つまりΔｔｃの値を精密化できると判定した可能性があることが示唆される。他方で、図３に例示されているようなグラフを調べて、偏位がΔｔｃの値を超えているように見えた場合、Δｔｃの値を増して、図２に例示されている一致する対を決定する工程２０４〜２１０を繰り返すことが可能である。
【００５７】
工程５０４で、Δｔｉの値のフィルタ処理を行って、Δｔｉの精密化された値を、
【数１１】
の関数として求める。このようなフィルタ処理は、多数の方法で実行できる。例えば、フィルタ処理は、移動平均フィルタ、中央値フィルタ、スプライン、または他の所望のフィルタ処理とすることができる。移動平均フィルタでは、Δｔｉのそれぞれの値は、その隣接要素の加重平均で置き換えられる。しかし、本開示の目的に関して、外れ値の影響をなくすため、中央値平均フィルタが採用される。中央値平均フィルタでは、Δｔｉのそれぞれの値は、それ自体とそのＭ個の隣接要素の中央値で置き換えられる。典型的には、Ｍは５から２０までの範囲であるが、特定のアプリケーションについてはその範囲を外れる可能性もある。
【００５８】
図８は、外れ値を除去するために５点中央値フィルタを例示的なデータセットに適用することを例示する図である。グラフ８０１は、５点中央値フィルタの適用前のデータセットをプロットしたものである。２つの外れ値８０２および８０４は、グラフ８０４内で目立っている。グラフ８０６は、５点中央値フィルタの適用後のデータセットを例示している。５点中央値フィルタが外れ値８０２および８０４を除去したことが容易にわかる。
【００５９】
中央値フィルタによるフィルタ処理により、中央値フィルタ処理値
【数１２】
の集合が生成され、これは、保持時間
【数１３】
に対応する。図９Ａおよび９Ｂは、本発明の一実施形態による、それぞれ図３および４に示されている例示的データに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。図９Ｂは、拡大された図９Ａの領域９０２である。図９Ａおよび９Ｂを調べると、中央値フィルタにより外れ値が取り除かれていることがわかる。ここでは、図９Ａおよび９Ｂにプロットされた点の集合
【数１４】
を背骨と呼ぶ。図９Ａおよび９Ｂの
【数１５】
対
【数１６】
のプロットは、図３および４の高密度領域の中心を通る。
【００６０】
工程５０６において、基準保持時間の集合は、
【数１７】
として計算される。この方程式の効果として、フィルタ処理された保持時間ドリフト
【数１８】
が
【数１９】
から差し引かれる。値
【数２０】
は、注入Ａにあったとすれば物質が持つであろう保持時間である。ステップ５０６の結果、値のＮ個の対
【数２１】
が得られる。値のこれらの対は、２つの注入の間の保持時間マップである。
【００６１】
保持時間マップ
【数２２】
は、対になっている値により記述される、ポイントツーポイントルックアップテーブル（ＬＵＴ）とみなすことができる。上述のように、保持時間マップは、物質の部分集合から導かれる。保持時間マップを使用することで、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。特に、保持時間マップは、ＬＵＴに記述されていようといまいと、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間を決定するために使用される。
【００６２】
図６は、本発明の一実施形態により注入Ｂにおけるすべての物質に対する基準保持時間を決定するために保持時間マップを使用する方法の流れ図である。工程６０２で、注入Ｂにおける与えられた物質がルックアップテーブルの一部であるかどうかが判定される。物質がＬＵＴの一部であるかどうかは、保持時間
【数２３】
に基づく。物質の保持時間がＬＵＴに含まれる場合、物質は、保持時間マップに含まれるものと考えられる。そうでない場合、物質は、保持時間マップに含まれるものとして考えられない。
【００６３】
物質が保持時間マップに含まれる場合、その基準保持時間は、工程５０６において、上で定義されているように
【数２４】
である。他方で、注入Ｂにおける物質が保持時間マップＬＵＴの一部でない場合、本発明の一実施形態では、注入Ｂにおける物質に対する基準保持時間を計算するために線形補間が適用される。線形補間に対する方程式は、
【数２５】
として与えられ、ただし、
【数２６】
である。下付き文字ｉおよびｉ＋１で指定された物質は、保持時間マップ、つまりＬＵＴに含まれる物質を指定する。下付き文字ｋにより指定された物質は、ＬＵＴに含まれない。そこで、補間方程式では、ＬＵＴに含まれない物質について基準保持時間がどのように決定されるかを指定する。
【００６４】
工程５０８で、注入Ａにおけるすべての物質について、基準保持時間が計算される。本発明の好ましい一実施形態では、注入Ａにおけるそれぞれの物質に対する基準保持時間は、元の保持時間である。つまり、注入におけるすべての物質について、基準保持時間は
【数２７】
である。注入Ａにおける物質に対する基準保持時間が割り当てられた後、注入ＡおよびＢにおけるすべての物質について基準保持時間が割り当てられた。注入ＡおよびＢにおける物質のそれぞれに基準保持時間を前記のように割り当てると、注入ＡおよびＢにおける物質間の保持時間オフセットが除去される。
【００６５】
追加の注入が、利用可能であれば、これも考慮することができる。例えば、第３の注入、注入Ｃが利用可能であった場合、上述の工程を繰り返し、注入Ｃにおける物質に対する値を注入Ｂにおける物質の代わりに置き換えて
【数２８】
を決定することができる。
【００６６】
そのため、本発明の実施形態では、試料集合内のすべての注入におけるすべての物質について基準保持時間を決定することができる。基準注入（ここでは、注入Ａ）は、試料集合内の物質について基準保持時間を決定することを目的としてそのような試料集合内の注入とみなすことができる。
【００６７】
図７は、注入ＡおよびＢにおける物質を追跡するための方法の流れ図である。本発明の一実施形態により作成された保持時間マップが与えられた場合、工程７０２では、詳細保持時間閾値Δｔｆを決定する。詳細保持時間閾値は、ピークの保持時間の測定における固有統計誤差である。
【００６８】
詳細保持時間閾値Δｔｆは、それぞれの一致する対について見つかった保持時間差の値Δｔｉとフィルタ処理された値
【数２９】
を考慮することにより計算される。Δｔｉおよび
【数３０】
が与えられた場合、これらの値の差は、
【数３１】
として計算される。Δｔｉの中央値がΔｔ１自体である場合、
【数３２】
のいくつかの値は０である。これらの０値は省かれ、点δｔｉの集合が形成される。δｔｉに対する値は、保持時間の測定における固有統計誤差を表す。
【００６９】
Δｔｆは、例えば、δｔ１の平均を中心とする標準偏差をとり、Δｔｆをその標準偏差の４倍にとることにより、δｔ１から推定できる。それとは別に、Δｔｆは、よく知られているヒストグラム処理技術を使用することによりδｔ１から推定でき、その場合、δｔｉのヒストグラムが生成され、Δｔｆは指定されたわずかな部分の点、例えば、９９％のΔｔｆを含む時間に対応する。
【００７０】
注入と注入との間で物質を追跡する際に、保持時間閾値は、詳細保持時間閾値Δｔｆで使用される。詳細保持時間閾値は、基準保持時間および質量値をともに使用され、これにより、注入と注入との間で物質を追跡する。典型的には、Δｔｆは、０．４分のオーダーであるが、アプリケーション毎に異なっていてよい。そのため、保持時間閾値は、５分の粗保持時間閾値から約０．４分まで短縮される。次に、この短縮は、同じ分子量を持つ物質を比較する際の曖昧さを低減または排除する効果を有する。
【００７１】
Δｔｆを使用して、注入Ａ、Ｂ、およびＣにおけるすべての物質を追跡できる。工程７０４で、注入ＡおよびＢにおけるすべての物質が比較される。追跡基準を満たすものが保持される。例えば、本発明の好ましい一実施形態では、追跡基準は、
【数３３】
である。
【００７２】
探索は、注入Ａにおける物質（インデックスｉで示されている）と注入Ｂにおける物質（インデックスｊで示されている）について実行される。上記の追跡基準からわかるように、質量枠（質量閾値）は無変化であるが、保持時間枠（保持時間閾値）は、保持時間自体ではなく、基準保持時間を詳細探索閾値と比較するために変化させられる。両方の基準が満たされたときに一致が示される。任意であるが、強度基準の適用は必要ない。
追加の注入を分析できる。例えば、第３の注入、注入Ｃが与えられた場合、注入Ｃにおけるすべての物質は、注入Ａにおけるすべての物質と比較される。基準
【数３４】
を満たす物質の対のみが保持される。それとは別に、注入Ｃにおけるすべての物質は、注入Ｂにおけるすべての物質と比較することが可能である。基準
【数３５】
を満たす物質の対のみが保持される。
【００７３】
注入Ａが基準保持時間計算の共通目標として使用されるとしても、一度計算されれば、基準保持時間は、ＢとＣとの間など、２つの注入の間で比較することができることに留意していただきたい。そのため、本発明の実施形態では、いくらでも多くの数の注入における物質追跡について完全に対称的な比較を行う。
【００７４】
図１０ａおよび１０ｂは、本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために詳細保持時間閾値を使用することを例示するグラフである。図１０ａの線１００２は、詳細保持時間閾値を背骨（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に加える
【数３６】
ことにより得られ、線１００４は、詳細保持時間閾値を背骨から差し引く
【数３７】
ことにより得られる。図１０ｂは、図１０ａを拡大した、領域１００１のプロットである。線１００６および１００８は、線１００２および１００４の拡大図である。
【００７５】
図１０ａでは、１００２および１００４内にある点が
【数３８】
を満たす。したがって、１００２および１００４内にあるそれぞれの点は、注入ＡとＢとの間で追跡される物質の対を表す。これは、それぞれの点が２つの基準、詳細保持時間閾値
【数３９】
と質量閾値
【数４０】
とを同時に満たすからである。
【００７６】
要約すると、本発明の実施形態では、注入と注入との間で物質を追跡することができるということである。例えば、本発明の一実施形態では、２つの物質は、同じ分子量（前の指定された誤差の範囲に対し）を持つ場合に、かつ同じ基準保持時間（前の指定された誤差の範囲に対し）を持つ場合に、２つの物質は同じである。誤差は、データ特性を調べることにより決定できる。注入に関する物質のこのような追跡により、分析者は、試料集合内の試料の間の物質の濃度の相対的変化を定量化または追跡することができる。
【００７７】
これからわかるように、本発明の実施形態は、従来の物質追跡方法を使用した場合に必要になるように内部標準を使用する必要はない。これは、本発明の実施形態では一意的な質量とともにどの物質が出現するかを先験的に知る必要がないからである。実際、正確な質量測定により、局所的保持時間標準として保持時間マップ内に出現するそれぞれの物質を使用することができる。
【００７８】
基準保持時間を割り当てるには、粗保持時間閾値および詳細保持時間閾値がある必要がある。粗閾値は、超えられない境界上下限を与える。詳細閾値は、０を中心とする変動を与える。高強度（例えば、高い信号対雑音比）を持つ物質に対するすべての一意的一致は、粗閾値の範囲内で見つかることが予想される。
【００７９】
注入から注入までに物質が追跡された後、試料間の物質の濃度の定量的変化を測定することができる。定量的応答は、物質を定めるイオンまたはイオンの集合についてＬＣ／ＭＳシステムにより測定された応答である。
【００８０】
例えば、Ｍ個の試料のそれぞれについてＮ個の繰り返し注入を含む実験を考える。Ｎ個の繰り返し注入のそれぞれの部分集合内の追跡されるすべての物質に対する質量、強度、および保持時間について平均値、中央値、標準偏差、変動係数を求めることができる。これらの量の平均値は、Ｍ個の試料の間でそれぞれの物質について追跡される類似度とすることができる。
【００８１】
試料の関数としてのそれぞれの物質の応答は、ＳＩＭＣＡ（スイスのＵｍｅｔｒｉｃｓ社から入手可能）、またはＰｉｒｏｕｅｔｔｅ（ワシントン州ウッデンビルのＩｎｆｏｍｅｔｒｉｘ社から入手可能）などの標準統計分析ソフトウェアに入力することができる。このような分析ソフトウェアは、本発明の実施形態により生成される追跡物質のリストを入力として受け取り、試料母集団間の物質の変化を明らかにする。ＳＩＭＣＡおよびＰｉｒｏｕｅｔｔｅソフトウェアパッケージ、さらには他のソフトウェアシステムは、それらのデータに適用できる主成分分析法または因子分析法を機能として備える。
【００８２】
特に、共通タンパク質の消化断片であるトリプシンペプチドに関連する強度は、試料から試料への間に一斉に変化する。一方の試料または試料の集合は、一方のレベルで発現されるタンパク質を含み、他の試料または試料の集合は、同じタンパク質を含むが、今度は異なる濃度レベルで発現されるということを考える。トリプシン消化が実行される場合、そのタンパク質に関連付けられたトリプシンペプチドの濃度は一方の試料から他方の試料へとスケーリングする。つまり、濃度パターンは、一方の試料内に１つの特徴的パターンを形成し、他の試料内に類似のパターンを形成するが、強度値は、親タンパク質の濃度が大きいか小さいかに応じて全体として大きくまたは小さくなるようにスケーリングされる。
【００８３】
濃度のこのような相関性のある変化は、因子分析法、または主成分分析（ＰＣＡ）に基づく方法により容易に確認できる。このような方法は、濃度、つまり発現レベルが試料毎に変化した親タンパク質を同定するために使用できる。つまり、ペプチドの集合がＰＣＡプロット内に特徴的痕跡を生じる場合である。これらのペプチドが共通親タンパク質を指している場合、発現レベルが変化したタンパク質が同定されている。
【００８４】
最終的な同定は、これらの関連するペプチド（一斉に変化したペプチド）の正確な質量をとり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／またはｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕから入手可能なペプチド質量指紋ソフトウェアなどの標準的ペプチド指紋ソフトウェアを使用して同定することにより行うことができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態の前記の開示は、例示および説明を目的として提示された。この説明は網羅的であることを意図しておらず、また本発明を開示した正確な形態だけに限る意図もない。本明細書で説明されている実施形態の多くの変更形態および修正形態は、上記開示に照らして当業者には明白なことであろう。本発明の範囲は、付属の請求項のみにより、またその同等の項目により、定められるものとする。
【００８６】
さらに、本発明の代表的実施形態を説明する際に、明細書において本発明の方法および／またはプロセスを特定の一連の工程として提示している可能性がある。しかし、方法またはプロセスが本明細書に記載されている工程の特定の順序に依存しない限り、方法またはプロセスは、説明されている特定の一連の工程に限定されるべきではない。当業者であれば理解するように、他の一連の工程も可能である。したがって、明細書に記載されている工程の他の順序は、請求項に対する制限と解釈すべきではない。さらに、本発明の方法および／またはプロセスを対象とする請求項は、書かれている順序で工程を実行することに限定されるべきではなく、また当業者であれば、順序を変更することができ、それでも本発明の精神および範囲内あることを容易に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の一実施形態によるＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。
【図２】本発明の一実施形態による２つの注入ＡとＢとの間の保持時間マップを決定するために一致する物質を同定する方法の流れ図である。
【図３】本発明の一実施形態による質量閾値および粗保持時間閾値の探索を実行する保持点の例示的なグラフである。
【図４】本発明の一実施形態による水平軸を拡大した質量閾値および粗保持時間閾値の探索を実行した後保持される点の例示的なグラフである。
【図５】本発明の一実施形態による保持時間マップを構成するために一致する物質を使用する方法の流れ図である。
【図６】本発明の一実施形態による基準保持時間を決定するために保持時間マップを使用する方法の流れ図である。
【図７】本発明の一実施形態による複数の注入にわたって物質を追跡するために基準保持時間および質量を使用する方法の流れ図である。
【図８】５点中央値フィルタを例示的なデータセットに適用することを例示する図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態により、保持時間マップおよび詳細保持時間閾値を決定するためにそれぞれ図３および４に例示されているデータに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態により、保持時間マップおよび詳細保持時間閾値を決定するためにそれぞれ図３および４に例示されているデータに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために基準保持時間、詳細保持時間閾値、質量、質量閾値を使用することを例示するグラフである。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために基準保持時間、詳細保持時間閾値、質量、質量閾値を使用することを例示するグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年２月１３日に出願した米国仮出願第６０／５４４，５０１号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本特許明細書の開示の一部は、著作権保護の対象となる資料を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録の記載に従い誰が特許文書または特許開示のファクシミリ複製を行おうと異存はないが、その他の点ではいかなる形であれすべての著作権を留保する。
【０００３】
本発明は、一般的に、ＬＣ／ＭＳ分析システムに関する。より具体的には、本発明は、ＬＣ／ＭＳ実験中の一方の注入から他方の注入への物質の追跡に関する。
【背景技術】
【０００４】
分析化学における重要な問題は、複雑な混合物内に含まれる１つまたは複数の分子状物質の濃度を推定することである。液体クロマトグラフィ（ＬＣ）の後に質量分析（ＭＳ）を行うことは、試料中の多数の化学物質を分離しそれぞれの化学物質の濃度または量を測定しやすくするために使用することができるよく知られている技術（ＬＣ／ＭＳ）である。物質の正確な質量を測定することで、複数の試料について物質を追跡することができる。追跡される物質の応答または強度を測定することで、物質の濃度を試料毎に追跡することができる。
【０００５】
ＬＣ／ＭＳでは、分析のため試料がシステム内に注入される。そのような注入毎に、ＬＣ／ＭＳシステムは、イオンの保持時間、分子量、および強度を測定する。複数のイオンが、単一の分子から発生しうる。分子の濃度は、その分子が発生するイオンのうちの１つまたは複数による調査により決定されることができる。
【０００６】
本明細書で使用されているように、「物質」という用語は、１つの分子からの単一イオン、または単一の共通分子から得られるイオンの集まりを意味することができる。例えば、低分子量の小さな分子は、単一イオンを発生することができる。ペプチドまたはタンパク質などの巨大分子は、複数のイオンを発生することができる。１つの分子から複数のイオンを組み合わせて単一の有効な、質量、保持時間、および強度を得るためによく知られている技術が使用できる。それぞれの物質は、質量、保持時間、および強度を有すること、および有効な質量、保持時間、および強度は、それぞれの物質に割り当てられることが仮定される。
【０００７】
質量、保持時間、および強度のこれらの測定結果を使用することで、物質の特性を決定できる。例えば、注入と注入との間の対応する物質の強度の比較は、物質の濃度が対照と未知試料との間で変化するかどうかを判定する基準となる。試料間のタンパク質の濃度の変化は、試料間のタンパク質の発現量の変化を示すものである。
【０００８】
一組の試料は、連続注入を使用して処理することができる。同じ試料を複数回注入して、一組の繰り返し注入を行うことができる。例えば、２つの区別できる試料（標準試料と未知試料）は、それぞれ、３回注入することができ、それにより、合計６回の注入を行える。濃度測定の再現性は、このデータを使用することで、それぞれの物質、さらに対照試料と未知試料との間のそれぞれの物質の濃度の変化について、推論することができる。それぞれの試料は、試料間の相対的較正を行うための一定量の内部標準を含むことができる。
【０００９】
いかなる物質の濃度を判定する技術についても、まず、他のすべてのものからその物質を適切に分別しなければならない。ＬＣ／ＭＳ技術では、質量と保持時間の両方において物質（または物質に関連付けられたイオン）を分離することができる。他の方法では区別がつきようもない、保持時間内に共溶出する物質は、質量で分別することができ、したがって、その検出を行え、その強度の正確な推定を行うことができる。
【００１０】
しかし、一方の注入から他方の注入への物質の関連付けまたは追跡については、正確な質量による分別だけでは十分でない場合がある。例えば、分子の質量および保持時間の特性を考えよう。分子量は、分子の固有特性である。質量分析計は、分子量と電荷との比ｍ／ｚを測定する。記号μは、質量対電荷比ｍ／ｚを示すために使用されることが多い。μに対する値は、注入と注入との間で直接比較できる。同じ物質に関して注入と注入との間のμの測定値の変動は、計測器ノイズ源のみによるものでなければならない。
【００１１】
エレクトロスプレーイオン化などのイオン化技術により、ペプチドまたはタンパク質などの試料について電荷Ｚを決定することができる。決定された荷電状態により、物質の分子量ｍを推論することができる。したがって、分子量ｍは、物質を追跡するための基準を与える。これらの目的のために、経験的に観測された質量対電荷比の値μ、または分子量ｍの推論された値は、同義的に使用することができる。本明細書で使用されているように、質量という用語は、観測された質量対電荷の比の値μ、または推論された分子量ｍを意味する。
【００１２】
十分に高い質量精度により、それぞれの物質は、質量の値に基づき潜在的に一意に区別可能である。そのため、物質をわずかしか含まない試料の場合、物質を分離する十分なクロマトグラフ分解能があると仮定すると、分解能ｍ／Δｍ≒２０，０００の飛行時間型（ＴＯＦ）分析器などの高精度質量分析計を使用することで、質量単独の正確な測定結果に基づいて一方の注入から他方の注入までそれぞれの物質を追跡することができる。このような場合、質量は、物質をその化学組成または構造に関して同定するために必ずしも使用されていない。むしろ、質量は、注入から注入までの間物質を追跡するための物質の経験的な、場合によっては一意的な識別子として使用される。
【００１３】
しかし、質量だけだと、一方の注入から他方の注入まで物質を追跡するのに十分でない場合がある。質量精度が低く、試料が複雑である場合、一方の注入で確認されたような物質の質量が他方の注入における無関係の物質の経験的に観測された質量と一致することがある可能性がある。例えば、それぞれμが１０２４．２００ａｍｕおよび１０２４．３００ａｍｕである２つの物質がありうる。このような物質は０．１００ａｍｕ未満のＭＳ精度で区別可能であるが、０．１００ａｍｕを超える精度のＭＳを使用したのでは区別可能でない。
【００１４】
物質のクロマトグラフ保持時間は、その物質の付加的な潜在的に無関係の識別子とすることができる。物質の保持時間は、固有特性ではない。むしろ、物質の保持時間は、物質（または、むしろ、物質を生じさせる分子）と、いろいろな効果のうち特に、クロマトグラフ分離における液相および固相との相互作用に依存する。しかし、保持時間が固有でないとしても、その値は、与えられた分離方法について再現性の高いものとすることができる。保持時間が正確に再現可能であり、精度が高い場合、質量と保持時間の両方の呼応の組み合わせは、一方の注入から他方の注入までそれぞれの物質を一意に追跡するのに十分でありうるのが理想的である。つまり、２つの異なる物質が正確な同じ質量および保持時間を共有することはまずありえないであろう。しかし、保持時間は、注入から注入までの間必ずしも再現可能であるわけではない。むしろ、物質の保持時間は、注入から注入までの間に変動する可能性がある。
【００１５】
注入から注入までの間のこのような保持時間の変動にもかかわらず、保持時間には知られている規則性がある。つまり、物質が時刻ｔに注入Ａで溶出した場合、その物質は、他の注入Ｂでも溶出し、保持時間は時間枠ｔ±Δｔの範囲にある。つまり、与えられた物質の保持時間は、一方の注入から他方の注入までの間に変動する可能性がある。しかし、このような変動は、時間枠ｔ±Δｔを上下限とする。この境界Δｔは、経験的に決定することができ、本明細書では、粗保持時間閾値Δｔｃと呼ぶ。本明細書で使用されているように、ｔ±Δｔｃという用語は、粗保持時間枠を指す。粗保持時間枠内にあるすべての物質が十分に一意的な質量を有し、一般に粗保持時間枠および質量だけに基づいて、また特に、より複雑な試料の場合に、追跡を行うことができる場合もあるかもしれないが、与えられた粗保持時間枠内で質量が一意にならないような質量値を持つ物質もありえる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の実施形態は、限定はしないが、ＬＣにより分離され、エレクトロスプレーイオン化によりイオン化され、四重極型分析器、飛行時間型分析器、イオントラップ型分析器、またはこれらの分析器の組み合わせを含む、質量分析計により分析される試料を伴う。さらに、本発明の実施形態は、ＭＳ−ＭＳまたはＭＳｎ技術により断片化できる物質に適用可能である。
【００１７】
本発明の実施形態では、クロマトグラフ保持時間のこれまでに知られていない付加的な規則性を、物質が試料中において一意的な質量を有するという事実とあわせて用い、他のいかなる手段でも質量単独では区別可能でないと思われる残留物質を一意に追跡する。このような試料の例は、天然タンパク質試料に由来するペプチドの消化物を含む。例えば、血清のペプチド消化物は、１０，０００個またはそれ以上の区別できるペプチド、つまり物質を含むことができる。クロマトグラフ分離では、３０個またはそれ以上のペプチドは、クロマトグラフピークの幅の範囲内で溶出できる。
【００１８】
第１のこれまでに知られていない規則性は、２つの異なる化学物質が一方の分離において全く同じ保持時間で溶出する場合に、他の分離におけるそれらの物質に対する保持時間の差も０になるというものである。つまり、２つの異なる化学物質が互いに関して一方の分離において同じ時間で溶出する場合、互いに関して他のすべての分離において全く同じ保持時間で溶出する。この対の絶対保持時間は、分離から分離への間に変わる可能性がある。しかし、保持時間の差が一方の分離において物質の対について０である場合、物質のその対の間の保持時間の差は、すべての分離に関して０となる。
【００１９】
この規則性は、ペプチド混合物の重要な場合において生じる。一方の分離において同じ保持時間で溶出する２つのペプチドは、他のすべての分離においても同一保持時間で溶出する。ここでもまた、絶対保持時間は分離から分離までの間に変化しうるが、保持時間の差は０となる。
【００２０】
第２のこれまでに知られていない規則性は、保持時間に関連付けられた固有測定誤差である。２つの物質がすべての注入において互いに関して同じ保持時間で溶出する場合、実際には、いくぶん異なる測定溶出時間で溶出する。そのため、単一の注入の範囲内では、２つの物質の測定された保持時間は、平均をとった場合のみ、一致し、同一となる。これらの測定誤差は、ピークの最高値を求めることと関連する統計誤差としてみなすことができる。例えば、物質が注入において１０．０分で溶出する場合、その測定された保持時間は、±０．２分だけ異なると予測されると考えられ、第２の物質も１０．０分で溶出する場合、その測定された保持時間も、±０．２分だけ異なるであろう。したがって、１つ注入の範囲内では、２つの物質に対する保持時間の測定された値は、９．９０および１０．１５分とすることができる。０．２５分のこの偏差は、２つの物質の実際の相対的保持時間の偏差ではない（０である）。これは、測定誤差によるその注入の範囲内でのそれぞれの物質の保持時間の測定結果の偏差である。
【００２１】
一般に、この統計に基づく測定誤差は、Δｔｃで表される、変動誤差よりも著しく小さい。固有統計測定誤差に関連付けられた閾値は、本明細書では、詳細保持時間閾値と呼ばれ、Δｔｆで表される。
【００２２】
第３のこれまでに知られていない規則性は、近い時間で溶出するが、全く同じ保持時間で溶出するわけではない物質について生じる。このような物質が溶出する保持時間は、分離から分離への間に変わる可能性がある。しかし、２つの時間的に近い溶出物質の間で溶出する第３の物質がある場合、これら２つの間で常に溶出する。
【００２３】
例えば、保持時間変動の結果として、２つの物質の間の時間オフセットは、注入から注入までの間に変化しうる。例えば、物質が一方の注入において２．０分と２．４分で溶出する場合、第２の注入では２．５分と２．７分で溶出する可能性がある。第１の物質の保持時間が注入と注入との間に０．５分だけドリフトしたということは真実であるが、このドリフト量は、２つの物質の間の保持時間の差よりも重要性が低い。この差は、第１の注入では０．４分であり、第２の注入では０．２分であった。
【００２４】
第３のこれまでに知られていない規則性も、これら２つの時間の間に注入１において溶出する第３の物質に適用される。例えば、このような第３の物質が注入１において２．１分で溶出すると仮定する。第３の規則性によれば、第３の物質は、注入１において物質１と２との間で溶出したため、注入２などの他の注入において、物質１と２との間でも溶出する。さらに、第３の物質に対する注入間のオフセットは比例する。そのため、注入２では、第３の物質は、２.５５分で溶出する。
【００２５】
粗時間枠（すでに知られている）に関する規則性および統計誤差または詳細保持時間閾値（すでには知られていない）に関する規則性は、再現可能な測定結果またはロバスト法に特徴的であるためすべてのクロマトグラフ分離において生じる。相対的保持時間（すでには知られていない）に関する規則性および保持時間順序（すでには知られていない）は、複雑な混合物中のすべての物質について生じる場合も生じない場合もある。しかし、これらは、ペプチド消化物中に観察され、物質がクロマトグラフ固定相および移動相との関連する化学的相互作用を持つ混合物について有効である可能性がある。
【００２６】
本発明の実施形態では、これらの規則性の出現を認識し、注入から注入までの物質を追跡するためにそれらを利用することができる。本発明の一実施形態では、試料中のそれぞれの物質に対し、基準保持時間が割り当てられる。基準保持時間は、２つの物質が同じ基準保持時間を持たなければ同じ物質ではありえないという意味で一意である。他方で、それらが同じ基準保持期間を持つ場合、同じ物質である可能性がある。
【００２７】
この仮定を使用することで、本発明の実施形態は、同じ質量および同じ基準保持時間を持つことを要求することにより物質を追跡する。分子量または保持時間のいずれかまたは両方において著しく異なる物質は、同じではない。本発明のいくつかの実施形態によれば、著しい差は、閾値を外れる差である。
【００２８】
要約すれば、複雑な分離では、計測器が区別できる範囲内で複数の物質が同じ質量を持つ可能性がある。本発明のいくつかの実施形態は、保持時間の前記のすでには知られていない規則性に照らして正確な質量測定を使用し、保持時間マップを決定する。次いで、保持時間マップにより、基準保持時間が１つの分離においてそれぞれの物質に割り当てられるようにできる。次に、物質の基準保持時間および質量を分離（注入）の間に比較し、分離から分離まで（注入から注入まで）その物質を追跡することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
一実施形態では、本発明は、ＬＣ／ＭＳシステムで物質を追跡するための方法である。この方法は、第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択することを含む。第１および第２の注入から選択された物質が比較される。一致する物質は、これらの比較に基づいて同定される。一致する物質を使用して、保持時間マップが形成される。保持時間マップは、基準保持時間をそれぞれの物質に割り当てるために使用される。次に、物質の基準保持時間および質量を分離（注入）の間に比較し、分離から分離まで（注入から注入まで）その物質を追跡することができる。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、ＬＣ／ＭＳシステムで物質を追跡するためのシステムである。システムは、液体クロマトグラフに投入される試料を含む。液体クロマトグラフは、試料を１つまたは複数の物質に分離する。システムは、さらに、物質のそれぞれの質量を決定するために物質が投入される質量分析計を含む。コンピュータがシステムに含まれる。コンピュータは、第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択し、第１および第２の注入から選択された物質を比較し、第１および第２の注入における一致する物質を同定し、一致する物質に基づいて保持時間マップを構成し、マップに基づいて基準保持時間をそれぞれの物質に割り当て、物質の基準保持時間および質量を使用して分離と分離（注入）の間に物質を追跡するようにプログラムされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１は、本発明の一実施形態による例示的なＬＣ／ＭＳシステム１０１の概略図である。試料１０２は、液体クロマトグラフ１０４内に自動的に、または手動で注入される。高圧のクロマトグラフ溶媒流は、強制的に試料１０２を液体クロマトグラフ１０４内のクロマトグラフカラム１０６に通す。カラム１０６は、典型的には、結合分子が表面に含まれるシリカビーズの充填カラムを含む。試料中の分子種、溶媒、およびビーズ間の競合的相互作用は、それぞれの分子種の移動速度を決定する。分子種は、カラム１０６内を移動し、保持時間と呼ばれる、特性時間にカラム１０６から出現する、つまり溶出する。
【００３２】
ＬＣ／ＭＳシステムでは、カラム１０６から溶出した後、分子は質量分析計１０８などの検出装置に搬送される。質量分析計１０８は、脱溶媒和システム１１０、イオン化装置１１２、質量分析器１１４、検出装置１１６、およびコンピュータを備える。コンピュータ１１８は、本明細書で説明されている物質追跡機能を実行するように構成またはプログラムできるコンピュータであればどのようなものでもよい。さらにコンピュータ１１８は、本明細書で説明されているように選択された値をユーザが入力できるように、または自動的に決定できるように構成することができる。
【００３３】
試料が質量分析計１０８内に導入されると、脱溶媒和システム１１０が、溶媒を除去し、イオン発生源１１２が、検体分子をイオン化する。イオン化法は、よく知られている電子衝撃（ＥＩ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、およびサーモスプレーを含む。ＡＰＣＩでは、試料は脱溶媒和され、その後イオン化されることに留意されたい。
【００３４】
イオン化された分子は、質量分析器１１４に搬送される。質量分析器１１４は、質量対電荷比により分子をソートまたはフィルタ処理する。質量分析器１１４などの質量分析器は、四重極型（Ｑ）質量分析器、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器、およびフーリエ変換（ＦＴ）質量分析器を含む。さらに、質量分析器は、例えば、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、三連四重極（Ｑ１−Ｑ２−Ｑ３）型、およびＱ１−Ｑ２−ＴＯＦなどの他の四重極飛行時間型構成を含む、さまざまなタンデム構成で配置することができる。
【００３５】
本発明の実施形態によれば、基準保持時間がそれぞれの注入におけるそれぞれの物質に割り当てられる。本発明の実施形態によれば、物質の基準保持時間および質量は、注入と注入との間で物質を追跡するために使用される。
【００３６】
基準保持時間は、一方の注入を基準注入（注入Ａ）として選択し、Ａにおける物質を試料集合内の他の注入で見つかった物質と比較することにより得られる。例えば、２つの注入、注入Ａと注入Ｂを考える。基準注入Ａにおける物質が、注入Ｂにおける物質と比較される。この比較から得られた結果に基づき、この方法は、基準保持時間を注入Ｂにおける物質に割り当てる。第３の注入、注入Ｃが与えられた場合、この方法では、Ａにおける物質をＣにおける物質と比較して、Ｃに対する基準保持時間を求める。この手順は、基準保持時間を他のすべての試料集合内の他のすべての物質に割り当てるために繰り返される。
【００３７】
次いで、ＢおよびＣにおける物質に割り当てられた基準保持時間は、互いに、および／またはＡにおける保持時間と直接比較することができる。実際、本発明の実施形態による方法では、注入ＢおよびＣにおけるそれぞれの物質に対する、注入ＡとＢとの間、および注入ＡとＣとの間の保持時間ドリフトの効果を取り除く。本発明の実施形態は、望む数の試料の望む数の注入に拡張することができる。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、注入ＡとＢにおける物質の部分集合は、注入ＡとＢとの間の保持時間ドリフトを説明する保持時間マップを得るために使用される。このマップから、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。同様に、本発明の実施形態によれば、注入ＡとＣにおける物質の部分集合は、注入ＡとＣとの間の保持時間ドリフトを説明する保持時間マップを得るために使用される。このマップから、注入Ｃにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。本発明の実施形態は、基準注入Ａと望む数の試料の望む数の注入との間の保持時間マップを決定するように拡張できる。
【００３９】
図２は、本発明の一実施形態による２つの注入ＡとＢとの間の保持時間マップを決定するために一致する物質を同定する方法の流れ図である。この方法は、コンピュータにより自動的に、またはユーザからの入力と組み合わせて実行できる。
【００４０】
工程２０２で、注入ＡおよびＢの物質の部分集合が選択される。物質の部分集合は、多数の方法で、手動により、または自動的に選択することができる。例えば、この部分集合は、強度に基づいて選択できる。本発明のこのような一実施形態では、選択された物質の部分集合は、閾値よりも高い強度を持つ物質を含む。
【００４１】
閾値は、多数の方法で選択できる。例えば、閾値は、手動で入力された、または収集データに従って決定された、予め定められている閾値とすることが可能である。データに従って決定されたこのような閾値は、閾値中央値である。閾値中央値は、注入における物質について測定された強度すべての中央値として計算される。収集データに従って決定された他の閾値は、特定の注入における測定された強度の標準偏差に基づく閾値である。必要というわけではないが、それぞれの注入における測定された強度は、閾値を適用する前または後に正規化することが可能である。
【００４２】
保持時間マップを作成する際に使用される物質の部分集合は、この閾値を超える物質を含む。したがって、本発明の実施例の物質の部分集合は、強度が閾値を超える注入ＡおよびＢにおける物質のみを含む。
【００４３】
工程２０４では、粗保持時間閾値Δｔｃが選択される。本発明の一実施形態では、Δｔｃの好ましい値は、５分である。Δｔｃは、保持時間内に生じうる最大変動を定義するものである。粗保持時間閾値は、手動または自動で選択できる。さらに、粗保持時間閾値は、予め定めておき、例えば、工程２０４で読み出し元となる構成ファイル内に格納することができる。
【００４４】
工程２０６では、分子量閾値Δｍが選択される。分子量閾値は、本明細書では、別に質量閾値とも呼ぶ。分子量閾値は、さらに、１００万分の１単位（Δｍ／ｍ）＊１０６、または質量対電荷比Δμとして表すこともできる。分子量閾値は、当業者によく知られている方法を使用してＭＳの特性を知ることで求めることができる。例えば、このような１つの方法では、分子量閾値をスペクトルのピークの幅に関して指定する。スペクトルのピーク幅が半値全幅（ＦＷＨＭ）として指定されている場合、ｐｐｍ単位の閾値は、（ＦＷＨＭ／ｍ）＊１０６と表すことができる。高強度ピークでは、この閾値は、０．２などのＦＷＨＭの小さな数を使用して下げることができ、そのため、ｐｐｍ誤差は、（０．２＊ＦＷＨＭ／ｍ）＊１０６となる。
【００４５】
分子量閾値は、手動または自動で選択できる。さらに、分子量閾値は、予め定めておき、例えば、工程２０６で読み出し元となる構成ファイル内に格納することができる。
【００４６】
工程２０８で、注入Ａにおけるすべての閾値選択物質を注入Ｂにおける物質と比較する探索が実行される。単独で注入Ｂにおける物質に一致する注入Ａにおける物質は、工程２１０で同定される。２つの物質は、質量の差の大きさが質量閾値Δｍよりも小さい場合、保持時間の差の大きさが粗保持時間閾値Δｔｃの範囲内にある場合、Ｂにおいてその基準と合致する単一の物質のみがある場合、両方の物質（注入Ａにおける物質、および注入Ｂにおける可能な一致する物質）の強度がそれぞれの強度中央値よりも高い場合に一致していると考えられる。上の開示に照らしてこのような一致する物質を同定できる探索方法は、当業でよく知られている。
【００４７】
その結果、工程２１０で得られる対の集合は、分子量、粗保持時間の一意的一致特性を有し、強度要件を満足する物質の対のみを含む。つまり、この集合は、物質のＮ個の一致する対を含み、それぞれ、下付き文字ｉにより示され、それぞれ以下の条件を満たす。
【数１】
【００４８】
当業者には、単独で一致する物質を定義する他の要件を強制可能であることは理解されるであろう。これらの他の要件は、前記の要件の１つまたは複数に加える、それらとは別にする、またはそれらと組み合わせることが可能である。例えば、強度比が特定の閾値範囲内にあるという要件を加えることが可能である。このような条件の下で、一致する物質は、条件
【数２】
を満たさなければならない。このような場合、ｒに対する好ましい値は２としてよいであろう。
【００４９】
加えられる他の要件は、知られている荷電状態のイオンが比較される場合に適用される。このような場合、
【数３】
というように荷電状態が一致する要件を加えることが可能である。
【００５０】
次いで、注入ＡおよびＢからの一致する物質の対は、工程２０２から２１０で説明されているように、本発明の一実施形態による探索を実行することにより得られる。物質のこれらの対は、注入ＡおよびＢにおける物質が閾値基準を満たす場合にのみ保持される。つまり、工程２０２から２１０までの効果として、質量閾値、粗保持時間閾値、および可能な強度閾値からなる一致基準を満たす注入ＡおよびＢにおける物質の部分集合を選ぶことになる。
【００５１】
保持され、一致する物質の対から、
【数４】
として定義されている、保持時間差が対毎に得られる。保持時間差Δｔｉは、保持時間
【数５】
での注入Ａにおけるその物質に関する注入Ｂにおける物質の保持時間ドリフトである。２つの保持時間
【数６】
および
【数７】
は、注入ＡおよびＢからのｉ番目の保持されている一致する対である。
【００５２】
図３は、Δｔｉと、一致する物質を同定した後に保持される対から得られた
【数８】
との例示的なグラフである（工程２１０）。図３内の点は、閾値基準を満たす注入ＡおよびＢにおける物質に対応する。図３の例示的なグラフにおいて、閾値基準は、０．０２０ａｍｕの質量閾値Δｍの範囲内で合致しなければならず、５分以内の保持時間差、粗保持時間閾値、および強度閾値中央値を持つ。
【００５３】
図４は、本発明の一実施形態による、図３を拡大した、領域３０２の例示的なグラフである。拡大された水平軸は、一致する対が垂直軸上にどれだけ集中しているかを示している。
【００５４】
図３および４を調べると、点の大半が塊をなしている、密度の高い背骨部分が存在することがわかる。しかし、これらの図から、さらに、背骨部分の周りに点がある程度散在し、外れ値が存在することもわかる。これらの問題は、後述のフィルタ処理などの技術を介して対処することができる。
【００５５】
質量閾値および粗保持時間閾値を使用して一致する物質のリストが同定された後、工程２１２で保持時間マップが構成される。図５は、本発明の一実施形態による保持時間マップを構成するための方法の流れ図である。工程５０２で、一致する対のリストが、注入Ｂのときに観察された保持時間に応じてソートされる。好ましい一実施形態では、リストは、
【数９】
の値が昇順となるようにソートされる。そこで、ｉ＝１，２，...，Ｎ−１について
【数１０】
となる。このソートで、質量および粗保持時間探索から得られた注入ＡおよびＢにおける物質の間の対合が保持される。
【００５６】
図３に示されているグラフを調べると、保持時間差の大半が粗保持時間枠内に入るため、Δｔｃの値の選択が確認される。さらに、このような調査から、Δｔｃの低減された値を使用して物質間の対合、つまりΔｔｃの値を精密化できると判定した可能性があることが示唆される。他方で、図３に例示されているようなグラフを調べて、偏位がΔｔｃの値を超えているように見えた場合、Δｔｃの値を増して、図２に例示されている一致する対を決定する工程２０４〜２１０を繰り返すことが可能である。
【００５７】
工程５０４で、Δｔｉの値のフィルタ処理を行って、Δｔｉの精密化された値を、
【数１１】
の関数として求める。このようなフィルタ処理は、多数の方法で実行できる。例えば、フィルタ処理は、移動平均フィルタ、中央値フィルタ、スプライン、または他の所望のフィルタ処理とすることができる。移動平均フィルタでは、Δｔｉのそれぞれの値は、その隣接要素の加重平均で置き換えられる。しかし、本開示の目的に関して、外れ値の影響をなくすため、中央値平均フィルタが採用される。中央値平均フィルタでは、Δｔｉのそれぞれの値は、それ自体とそのＭ個の隣接要素の中央値で置き換えられる。典型的には、Ｍは５から２０までの範囲であるが、特定のアプリケーションについてはその範囲を外れる可能性もある。
【００５８】
図８は、外れ値を除去するために５点中央値フィルタを例示的なデータセットに適用することを例示する図である。グラフ８０１は、５点中央値フィルタの適用前のデータセットをプロットしたものである。２つの外れ値８０２および８０４は、グラフ８０４内で目立っている。グラフ８０６は、５点中央値フィルタの適用後のデータセットを例示している。５点中央値フィルタが外れ値８０２および８０４を除去したことが容易にわかる。
【００５９】
中央値フィルタによるフィルタ処理により、中央値フィルタ処理値
【数１２】
の集合が生成され、これは、保持時間
【数１３】
に対応する。図９Ａおよび９Ｂは、本発明の一実施形態による、それぞれ図３および４に示されている例示的データに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。図９Ｂは、拡大された図９Ａの領域９０２である。図９Ａおよび９Ｂを調べると、中央値フィルタにより外れ値が取り除かれていることがわかる。ここでは、図９Ａおよび９Ｂにプロットされた点の集合
【数１４】
を背骨と呼ぶ。図９Ａおよび９Ｂの
【数１５】
対
【数１６】
のプロットは、図３および４の高密度領域の中心を通る。
【００６０】
工程５０６において、基準保持時間の集合は、
【数１７】
として計算される。この方程式の効果として、フィルタ処理された保持時間ドリフト
【数１８】
が
【数１９】
から差し引かれる。値
【数２０】
は、注入Ａにあったとすれば物質が持つであろう保持時間である。ステップ５０６の結果、値のＮ個の対
【数２１】
が得られる。値のこれらの対は、２つの注入の間の保持時間マップである。
【００６１】
保持時間マップ
【数２２】
は、対になっている値により記述される、ポイントツーポイントルックアップテーブル（ＬＵＴ）とみなすことができる。上述のように、保持時間マップは、物質の部分集合から導かれる。保持時間マップを使用することで、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間が決定される。特に、保持時間マップは、ＬＵＴに記述されていようといまいと、注入Ｂにおけるすべての物質について基準保持時間を決定するために使用される。
【００６２】
図６は、本発明の一実施形態により注入Ｂにおけるすべての物質に対する基準保持時間を決定するために保持時間マップを使用する方法の流れ図である。工程６０２で、注入Ｂにおける与えられた物質がルックアップテーブルの一部であるかどうかが判定される。物質がＬＵＴの一部であるかどうかは、保持時間
【数２３】
に基づく。物質の保持時間がＬＵＴに含まれる場合、物質は、保持時間マップに含まれるものと考えられる。そうでない場合、物質は、保持時間マップに含まれるものとして考えられない。
【００６３】
物質が保持時間マップに含まれる場合、その基準保持時間は、工程５０６において、上で定義されているように
【数２４】
である。他方で、注入Ｂにおける物質が保持時間マップＬＵＴの一部でない場合、本発明の一実施形態では、注入Ｂにおける物質に対する基準保持時間を計算するために線形補間が適用される。線形補間に対する方程式は、
【数２５】
として与えられ、ただし、
【数２６】
である。下付き文字ｉおよびｉ＋１で指定された物質は、保持時間マップ、つまりＬＵＴに含まれる物質を指定する。下付き文字ｋにより指定された物質は、ＬＵＴに含まれない。そこで、補間方程式では、ＬＵＴに含まれない物質について基準保持時間がどのように決定されるかを指定する。
【００６４】
工程５０８で、注入Ａにおけるすべての物質について、基準保持時間が計算される。本発明の好ましい一実施形態では、注入Ａにおけるそれぞれの物質に対する基準保持時間は、元の保持時間である。つまり、注入におけるすべての物質について、基準保持時間は
【数２７】
である。注入Ａにおける物質に対する基準保持時間が割り当てられた後、注入ＡおよびＢにおけるすべての物質について基準保持時間が割り当てられた。注入ＡおよびＢにおける物質のそれぞれに基準保持時間を前記のように割り当てると、注入ＡおよびＢにおける物質間の保持時間オフセットが除去される。
【００６５】
追加の注入が、利用可能であれば、これも考慮することができる。例えば、第３の注入、注入Ｃが利用可能であった場合、上述の工程を繰り返し、注入Ｃにおける物質に対する値を注入Ｂにおける物質の代わりに置き換えて
【数２８】
を決定することができる。
【００６６】
そのため、本発明の実施形態では、試料集合内のすべての注入におけるすべての物質について基準保持時間を決定することができる。基準注入（ここでは、注入Ａ）は、試料集合内の物質について基準保持時間を決定することを目的としてそのような試料集合内の注入とみなすことができる。
【００６７】
図７は、注入ＡおよびＢにおける物質を追跡するための方法の流れ図である。本発明の一実施形態により作成された保持時間マップが与えられた場合、工程７０２では、詳細保持時間閾値Δｔｆを決定する。詳細保持時間閾値は、ピークの保持時間の測定における固有統計誤差である。
【００６８】
詳細保持時間閾値Δｔｆは、それぞれの一致する対について見つかった保持時間差の値Δｔｉとフィルタ処理された値
【数２９】
を考慮することにより計算される。Δｔｉおよび
【数３０】
が与えられた場合、これらの値の差は、
【数３１】
として計算される。Δｔｉの中央値がΔｔ１自体である場合、
【数３２】
のいくつかの値は０である。これらの０値は省かれ、点δｔｉの集合が形成される。δｔｉに対する値は、保持時間の測定における固有統計誤差を表す。
【００６９】
Δｔｆは、例えば、δｔ１の平均を中心とする標準偏差をとり、Δｔｆをその標準偏差の４倍にとることにより、δｔ１から推定できる。それとは別に、Δｔｆは、よく知られているヒストグラム処理技術を使用することによりδｔ１から推定でき、その場合、δｔｉのヒストグラムが生成され、Δｔｆは指定されたわずかな部分の点、例えば、９９％のΔｔｆを含む時間に対応する。
【００７０】
注入と注入との間で物質を追跡する際に、保持時間閾値は、詳細保持時間閾値Δｔｆで使用される。詳細保持時間閾値は、基準保持時間および質量値をともに使用され、これにより、注入と注入との間で物質を追跡する。典型的には、Δｔｆは、０．４分のオーダーであるが、アプリケーション毎に異なっていてよい。そのため、保持時間閾値は、５分の粗保持時間閾値から約０．４分まで短縮される。次に、この短縮は、同じ分子量を持つ物質を比較する際の曖昧さを低減または排除する効果を有する。
【００７１】
Δｔｆを使用して、注入Ａ、Ｂ、およびＣにおけるすべての物質を追跡できる。工程７０４で、注入ＡおよびＢにおけるすべての物質が比較される。追跡基準を満たすものが保持される。例えば、本発明の好ましい一実施形態では、追跡基準は、
【数３３】
である。
【００７２】
探索は、注入Ａにおける物質（インデックスｉで示されている）と注入Ｂにおける物質（インデックスｊで示されている）について実行される。上記の追跡基準からわかるように、質量枠（質量閾値）は無変化であるが、保持時間枠（保持時間閾値）は、保持時間自体ではなく、基準保持時間を詳細探索閾値と比較するために変化させられる。両方の基準が満たされたときに一致が示される。任意であるが、強度基準の適用は必要ない。
追加の注入を分析できる。例えば、第３の注入、注入Ｃが与えられた場合、注入Ｃにおけるすべての物質は、注入Ａにおけるすべての物質と比較される。基準
【数３４】
を満たす物質の対のみが保持される。それとは別に、注入Ｃにおけるすべての物質は、注入Ｂにおけるすべての物質と比較することが可能である。基準
【数３５】
を満たす物質の対のみが保持される。
【００７３】
注入Ａが基準保持時間計算の共通目標として使用されるとしても、一度計算されれば、基準保持時間は、ＢとＣとの間など、２つの注入の間で比較することができることに留意していただきたい。そのため、本発明の実施形態では、いくらでも多くの数の注入における物質追跡について完全に対称的な比較を行う。
【００７４】
図１０ａおよび１０ｂは、本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために詳細保持時間閾値を使用することを例示するグラフである。図１０ａの線１００２は、詳細保持時間閾値を背骨（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に加える
【数３６】
ことにより得られ、線１００４は、詳細保持時間閾値を背骨から差し引く
【数３７】
ことにより得られる。図１０ｂは、図１０ａを拡大した、領域１００１のプロットである。線１００６および１００８は、線１００２および１００４の拡大図である。
【００７５】
図１０ａでは、１００２および１００４内にある点が
【数３８】
を満たす。したがって、１００２および１００４内にあるそれぞれの点は、注入ＡとＢとの間で追跡される物質の対を表す。これは、それぞれの点が２つの基準、詳細保持時間閾値
【数３９】
と質量閾値
【数４０】
とを同時に満たすからである。
【００７６】
要約すると、本発明の実施形態では、注入と注入との間で物質を追跡することができるということである。例えば、本発明の一実施形態では、２つの物質は、同じ分子量（前の指定された誤差の範囲に対し）を持つ場合に、かつ同じ基準保持時間（前の指定された誤差の範囲に対し）を持つ場合に、２つの物質は同じである。誤差は、データ特性を調べることにより決定できる。注入に関する物質のこのような追跡により、分析者は、試料集合内の試料の間の物質の濃度の相対的変化を定量化または追跡することができる。
【００７７】
これからわかるように、本発明の実施形態は、従来の物質追跡方法を使用した場合に必要になるように内部標準を使用する必要はない。これは、本発明の実施形態では一意的な質量とともにどの物質が出現するかを先験的に知る必要がないからである。実際、正確な質量測定により、局所的保持時間標準として保持時間マップ内に出現するそれぞれの物質を使用することができる。
【００７８】
基準保持時間を割り当てるには、粗保持時間閾値および詳細保持時間閾値がある必要がある。粗閾値は、超えられない境界上下限を与える。詳細閾値は、０を中心とする変動を与える。高強度（例えば、高い信号対雑音比）を持つ物質に対するすべての一意的一致は、粗閾値の範囲内で見つかることが予想される。
【００７９】
注入から注入までに物質が追跡された後、試料間の物質の濃度の定量的変化を測定することができる。定量的応答は、物質を定めるイオンまたはイオンの集合についてＬＣ／ＭＳシステムにより測定された応答である。
【００８０】
例えば、Ｍ個の試料のそれぞれについてＮ個の繰り返し注入を含む実験を考える。Ｎ個の繰り返し注入のそれぞれの部分集合内の追跡されるすべての物質に対する質量、強度、および保持時間について平均値、中央値、標準偏差、変動係数を求めることができる。これらの量の平均値は、Ｍ個の試料の間でそれぞれの物質について追跡される類似度とすることができる。
【００８１】
試料の関数としてのそれぞれの物質の応答は、ＳＩＭＣＡ（スイスのＵｍｅｔｒｉｃｓ社から入手可能）、またはＰｉｒｏｕｅｔｔｅ（ワシントン州ウッデンビルのＩｎｆｏｍｅｔｒｉｘ社から入手可能）などの標準統計分析ソフトウェアに入力することができる。このような分析ソフトウェアは、本発明の実施形態により生成される追跡物質のリストを入力として受け取り、試料母集団間の物質の変化を明らかにする。ＳＩＭＣＡおよびＰｉｒｏｕｅｔｔｅソフトウェアパッケージ、さらには他のソフトウェアシステムは、それらのデータに適用できる主成分分析法または因子分析法を機能として備える。
【００８２】
特に、共通タンパク質の消化断片であるトリプシンペプチドに関連する強度は、試料から試料への間に一斉に変化する。一方の試料または試料の集合は、一方のレベルで発現されるタンパク質を含み、他の試料または試料の集合は、同じタンパク質を含むが、今度は異なる濃度レベルで発現されるということを考える。トリプシン消化が実行される場合、そのタンパク質に関連付けられたトリプシンペプチドの濃度は一方の試料から他方の試料へとスケーリングする。つまり、濃度パターンは、一方の試料内に１つの特徴的パターンを形成し、他の試料内に類似のパターンを形成するが、強度値は、親タンパク質の濃度が大きいか小さいかに応じて全体として大きくまたは小さくなるようにスケーリングされる。
【００８３】
濃度のこのような相関性のある変化は、因子分析法、または主成分分析（ＰＣＡ）に基づく方法により容易に確認できる。このような方法は、濃度、つまり発現レベルが試料毎に変化した親タンパク質を同定するために使用できる。つまり、ペプチドの集合がＰＣＡプロット内に特徴的痕跡を生じる場合である。これらのペプチドが共通親タンパク質を指している場合、発現レベルが変化したタンパク質が同定されている。
【００８４】
最終的な同定は、これらの関連するペプチド（一斉に変化したペプチド）の正確な質量をとり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／またはｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕから入手可能なペプチド質量指紋ソフトウェアなどの標準的ペプチド指紋ソフトウェアを使用して同定することにより行うことができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態の前記の開示は、例示および説明を目的として提示された。この説明は網羅的であることを意図しておらず、また本発明を開示した正確な形態だけに限る意図もない。本明細書で説明されている実施形態の多くの変更形態および修正形態は、上記開示に照らして当業者には明白なことであろう。本発明の範囲は、付属の請求項のみにより、またその同等の項目により、定められるものとする。
【００８６】
さらに、本発明の代表的実施形態を説明する際に、明細書において本発明の方法および／またはプロセスを特定の一連の工程として提示している可能性がある。しかし、方法またはプロセスが本明細書に記載されている工程の特定の順序に依存しない限り、方法またはプロセスは、説明されている特定の一連の工程に限定されるべきではない。当業者であれば理解するように、他の一連の工程も可能である。したがって、明細書に記載されている工程の他の順序は、請求項に対する制限と解釈すべきではない。さらに、本発明の方法および／またはプロセスを対象とする請求項は、書かれている順序で工程を実行することに限定されるべきではなく、また当業者であれば、順序を変更することができ、それでも本発明の精神および範囲内あることを容易に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の一実施形態によるＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。
【図２】本発明の一実施形態による２つの注入ＡとＢとの間の保持時間マップを決定するために一致する物質を同定する方法の流れ図である。
【図３】本発明の一実施形態による質量閾値および粗保持時間閾値の探索を実行する保持点の例示的なグラフである。
【図４】本発明の一実施形態による水平軸を拡大した質量閾値および粗保持時間閾値の探索を実行した後保持される点の例示的なグラフである。
【図５】本発明の一実施形態による保持時間マップを構成するために一致する物質を使用する方法の流れ図である。
【図６】本発明の一実施形態による基準保持時間を決定するために保持時間マップを使用する方法の流れ図である。
【図７】本発明の一実施形態による複数の注入にわたって物質を追跡するために基準保持時間および質量を使用する方法の流れ図である。
【図８】５点中央値フィルタを例示的なデータセットに適用することを例示する図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態により、保持時間マップおよび詳細保持時間閾値を決定するためにそれぞれ図３および４に例示されているデータに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態により、保持時間マップおよび詳細保持時間閾値を決定するためにそれぞれ図３および４に例示されているデータに５点中央値フィルタを適用した結果をプロットしたグラフである。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために基準保持時間、詳細保持時間閾値、質量、質量閾値を使用することを例示するグラフである。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態により、注入と注入との間で物質を追跡するために基準保持時間、詳細保持時間閾値、質量、質量閾値を使用することを例示するグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡する方法であって、
第１の注入から物質の部分集合を選択することと、
第２の注入から物質の部分集合を選択することと、
第１の注入から選択された物質を第２の注入から選択された物質と比較することと、
第２の注入から選択された物質と一致する第１の注入から選択された物質を同定することと、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成することと、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当てることと、
基準保持時間および質量値を使用して第１および第２の注入を通して物質を追跡することとを含む、方法。
【請求項２】
粗保持時間閾値を選択することと、
質量閾値を選択することと、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一致した物質をソートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定することと、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用することと、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、
詳細保持時間閾値を決定することと、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行うことと、
一致する物質の間の保持時間差を計算することと、
計算された保持時間差をフィルタ処理することと、
フィルタ処理された保持時間差を使用して保持時間マップを決定することと、
保持時間マップを使用して基準保持時間を決定することと、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡するシステムであって、
第１の注入から物質の部分集合を選択する手段と、
第２の注入から物質の部分集合を選択する手段と、
第１の注入から選択された物質を第２の注入から選択された物質と比較する手段と、
第２の注入から選択された物質と一致する第１の注入から選択された物質を同定する手段と、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成する手段と、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当てる手段と、
保持時間マップおよび質量値を使用して第１および第２の注入を通して物質を追跡する手段とを備える、システム。
【請求項１１】
粗保持時間閾値を選択する手段と、
質量閾値を選択する手段と、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
一致した物質をソートする手段を備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定する手段と、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用するための手段と、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用するための手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
さらに、
詳細保持時間閾値を決定する手段と、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行う手段と、
一致する物質の間の保持時間差を計算する手段と、
計算された保持時間差をフィルタ処理する手段と、
フィルタ処理された保持時間差を使用して保持時間マップを決定する手段と、
保持時間マップを使用して基準保持時間を生成する手段と、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１６】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１８】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡するシステムであって、
試料内の物質を分離し、１つまたは複数の物質のそれぞれに関連付けられた保持時間を決定するために試料が注入される液体クロマトグラフと、
１つまたは複数の物質のそれぞれの質量を決定するために物質が投入される質量分析計と、
コンピュータであって、
第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択し、
第１および第２の注入から選択された物質を比較し、
第１および第２の注入における一致する物質を同定し、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成し、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当て、
保持時間マップおよび質量値を使用して物質を追跡するようにプログラムされたコンピュータとを備える、システム。
【請求項２０】
コンピュータが、さらに、
粗保持時間閾値を選択し、
質量閾値を選択し、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択するようにプログラムされる請求項１９に記載の、システム。
【請求項２１】
コンピュータが、さらに、一致する物質をソートするようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
コンピュータが、さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定し、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用し、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
コンピュータが、さらに、
詳細保持時間閾値を決定し、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２４】
コンピュータが、さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行い、
一致する物質の間の保持時間差を計算し、
計算された保持時間差をフィルタ処理し、
保持時間差を使用して保持時間マップを決定し、
保持時間マップを使用して基準保持時間を決定し、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２５】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２７】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項１】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡する方法であって、
第１の注入から物質の部分集合を選択することと、
第２の注入から物質の部分集合を選択することと、
第１の注入から選択された物質を第２の注入から選択された物質と比較することと、
第２の注入から選択された物質と一致する第１の注入から選択された物質を同定することと、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成することと、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当てることと、
基準保持時間および質量値を使用して第１および第２の注入を通して物質を追跡することとを含む、方法。
【請求項２】
粗保持時間閾値を選択することと、
質量閾値を選択することと、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一致した物質をソートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定することと、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用することと、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、
詳細保持時間閾値を決定することと、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行うことと、
一致する物質の間の保持時間差を計算することと、
計算された保持時間差をフィルタ処理することと、
フィルタ処理された保持時間差を使用して保持時間マップを決定することと、
保持時間マップを使用して基準保持時間を決定することと、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡するシステムであって、
第１の注入から物質の部分集合を選択する手段と、
第２の注入から物質の部分集合を選択する手段と、
第１の注入から選択された物質を第２の注入から選択された物質と比較する手段と、
第２の注入から選択された物質と一致する第１の注入から選択された物質を同定する手段と、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成する手段と、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当てる手段と、
保持時間マップおよび質量値を使用して第１および第２の注入を通して物質を追跡する手段とを備える、システム。
【請求項１１】
粗保持時間閾値を選択する手段と、
質量閾値を選択する手段と、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
一致した物質をソートする手段を備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定する手段と、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用するための手段と、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用するための手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
さらに、
詳細保持時間閾値を決定する手段と、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行う手段と、
一致する物質の間の保持時間差を計算する手段と、
計算された保持時間差をフィルタ処理する手段と、
フィルタ処理された保持時間差を使用して保持時間マップを決定する手段と、
保持時間マップを使用して基準保持時間を生成する手段と、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡する手段とを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１６】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１８】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
ＬＣ／ＭＳシステムにおいて物質を追跡するシステムであって、
試料内の物質を分離し、１つまたは複数の物質のそれぞれに関連付けられた保持時間を決定するために試料が注入される液体クロマトグラフと、
１つまたは複数の物質のそれぞれの質量を決定するために物質が投入される質量分析計と、
コンピュータであって、
第１の注入からの物質の部分集合および第２の注入からの物質の部分集合を選択し、
第１および第２の注入から選択された物質を比較し、
第１および第２の注入における一致する物質を同定し、
一致する物質に基づいて保持時間マップを構成し、
保持時間マップに基づいて基準保持時間を割り当て、
保持時間マップおよび質量値を使用して物質を追跡するようにプログラムされたコンピュータとを備える、システム。
【請求項２０】
コンピュータが、さらに、
粗保持時間閾値を選択し、
質量閾値を選択し、
粗保持時間閾値および質量閾値に応じて、第１の注入からの物質の部分集合、および第２の注入からの物質の部分集合を選択するようにプログラムされる請求項１９に記載の、システム。
【請求項２１】
コンピュータが、さらに、一致する物質をソートするようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
コンピュータが、さらに、
物質が保持時間マップ内に対応するエントリを持つかどうかを判定し、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持つ場合に保持時間の確定した値を使用し、
物質がルックアップテーブル内に対応するエントリを持たない場合に保持時間の補間値を使用するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
コンピュータが、さらに、
詳細保持時間閾値を決定し、
詳細保持時間閾値および質量値を使用して物質を追跡するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２４】
コンピュータが、さらに、
正確な質量および粗保持時間に基づいて物質の照合を行い、
一致する物質の間の保持時間差を計算し、
計算された保持時間差をフィルタ処理し、
保持時間差を使用して保持時間マップを決定し、
保持時間マップを使用して基準保持時間を決定し、
基準保持時間および質量値を使用して注入を通して物質を追跡するようにプログラムされる、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２５】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
さらに、一致した物質をフィルタ処理することを含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２７】
フィルタ処理が中央値フィルタ処理である、請求項２６に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５２２４７７（Ｐ２００７−５２２４７７Ａ）
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５３２１５（Ｐ２００６−５５３２１５）
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４１７６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７９２６１
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４１７６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７９２６１
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
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