本発明は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する腎臓の細胞集団を含む単離された腎細胞、ならびにそれを単離および培養する方法、そして必要としている対象をその細胞集団を用いて治療する方法を対象とする。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む、第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、ヒト腎細胞の混合物であって、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、混合物。
【請求項２】
Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項１に記載の混合物。
【請求項５】
前記細胞の混合物は、受容体介在性のアルブミン取り込みができる、請求項１に記載の混合物。
【請求項６】
前記細胞の混合物は、酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ができる、請求項１に記載の混合物。
【請求項７】
前記混合物は、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生するおよび／またはその産生を刺激することができるＨＡＳ−２を発現する細胞を含有する、請求項１に記載の混合物。
【請求項８】
前記混合物は、インビボでの送達の際、再生刺激を提供することができる、請求項１に記載の混合物。
【請求項９】
前記混合物は、インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、請求項１に記載の混合物。
【請求項１０】
前記第１および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項１に記載の混合物。
【請求項１１】
Ｂ２は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、請求項１に記載の混合物。
【請求項１２】
Ｂ２細胞集団を含むヒト腎細胞の単離された、濃縮された集団であって、Ｂ２は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含み、濃縮された集団は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含むＢ４細胞集団を含まない、単離された、濃縮された集団。
【請求項１３】
前記Ｂ２細胞集団は、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素−２）の発現を介して、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができる、請求項１に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１４】
集合管上皮細胞をさらに含む、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１５】
受容体介在性のアルブミン取り込みができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１６】
インビボでの送達の際に、再生刺激を提供することができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１７】
インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１８】
腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項１９】
メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項２０】
約１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む前記Ｂ３細胞集団を含まない、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項２１】
約１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
【請求項２２】
ヒトＢ２細胞集団を調製する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
ｃ）前記Ｂ２細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｂ２細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合の尿細管細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトＢ４細胞集団を調製する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
ｃ）前記Ｂ４細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記Ｂ４細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞、非血管細胞、および非糸球体細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ４細胞調製物を生成する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）前記細胞懸濁液をフロ−サイトメトリ−機器に適用することと、
ｃ）血管、糸球体、および内分泌細胞マ−カ−を使用して、前記細胞集団から細胞の亜集団を選択することと、
ｄ）前記細胞集団から細胞の亜集団を選別することと、
ｅ）前記細胞集団から前記Ｂ４細胞の亜集団を単離することと、を含み、
前記Ｂ４細胞の亜集団は、前記集団の大部分と比較して、前記血管、前記糸球体、および前記内分泌細胞マ−カ−の発現を特徴とする、方法。
【請求項２７】
腎機能の改善を必要としている対象に移植するための構造体であって、
ａ）１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料と、
ｂ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、哺乳動物腎細胞の混合物と、を含み、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、構造体。
【請求項２８】
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項２７に記載の構造体。
【請求項２９】
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３０】
前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３１】
前記生体材料は、前記混合物の捕捉および／または付着に適した三次元（３−Ｄ）の多孔性生体材料として構成される、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３２】
前記生体材料は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、懸濁させる、または被覆することに適した液体または半流動体ゲルとして構成される、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３３】
前記生体材料は、ハイドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）の主に高分子量の種を含む、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３４】
前記生体材料は、多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸の主に高分子量の種を含む、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３５】
前記生体材料は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの細孔を有するポリ乳酸系の発泡体を含む、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３６】
前記細胞集団は、自己腎臓試料に由来する、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３７】
前記試料は腎生検である、請求項３６に記載の構造体。
【請求項３８】
前記細胞集団は、非自己腎臓試料に由来する、請求項２７に記載の構造体。
【請求項３９】
前記改善された腎機能は赤血球恒常性である、請求項２７に記載の構造体。
【請求項４０】
必要としている対象における腎臓疾患の治療に使用するための組成物であって、
ａ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む哺乳動物腎細胞の混合物を含む組成物を、前記対象に投与することであって、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、投与することと、
ｂ）腎機能の指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを、前記対象からの試験試料において判定することであって、指標レベルの前記差異は、前記対象の１つ以上の腎機能の低下の減少、安定化、または改善を示すことと、を含む、方法。
【請求項４１】
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記腎臓疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏症を伴う、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＥＰＯ欠乏症は貧血である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は前記対象において腎不全に二次的に発生する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏症、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄癌、ＨＩＶ感染、肝臓疾患、心不全、リウマチ性関節炎、または多臓器系不全からなる群から選択される疾患に二次的に発生する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物は、１つ以上の生体適合性合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料をさらに含み、前記混合物は、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４８】
前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養された哺乳動物腎臓細胞に由来する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４９】
前記混合物は自己腎臓試料に由来する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項５０】
前記試料は腎生検である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記混合物は非自己腎臓試料に由来する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項５２】
１２〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）少なくとも１つの尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする腎臓の尿細管の細胞集団を含み、（ｉｉｉ）受容体介在性アルブミン輸送ができる腎臓の尿細管細胞の亜集団を含み、（ｉｖ）１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、（ｖ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができる、腎細胞の選択された集団。
【請求項５３】
１２時間〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）を発現する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含み、（ｉｉｉ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができ、（ｉｖ）同時投与の際に、請求項５２に記載の腎細胞の集団によって１つ以上の腎機能の前記調節を増強することができる、腎細胞の選択された集団。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【図１４Ｆ】

【図１４Ｇ】

【図１４Ｈ】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７】

【図２８】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図２９Ｃ】

【図２９Ｄ】

【図２９Ｅ】

【図３０】

【図３１Ａ】

【図３１Ｂ】

【図３１Ｃ】

【図３１Ｄ】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３３Ｃ】

【図３３Ｄ】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３４Ｃ】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３５Ｃ】

【図３６Ａ】

【図３６Ｂ】

【図３６Ｃ】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０Ａ】

【図４０Ｂ】

【図４１Ａ】

【図４１Ｂ】

【図４２】

【図４３】

【図４４Ａ】

【図４４Ｂ】

【図４５Ａ】

【図４５Ｂ】

【図４６Ａ】

【図４６Ｂ】

【図４７】

【図４８】

【図４９Ａ】

【図４９Ｂ】

【図５０Ａ】

【図５０Ｂ】

【図５０Ｃ】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６Ａ】

【図５６Ｂ】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４Ａ】

【図７４Ｂ】

【図７４Ｃ】

【図７４Ｄ】

【図７４Ｅ】

【図７４Ｆ】

【図７４Ｇ】

【図７４Ｈ】

【図７４Ｉ】

【図７４Ｊ】

【図７４Ｋ】

【図７５Ａ】

【図７５Ｂ】

【図７５Ｃ】

【図７６Ａ】

【図７６Ｂ】

【図７６Ｃ】

【図７７Ａ】

【図７７Ｂ】

【図７７Ｃ】

【図７７Ｄ】

【図７７Ｅ】

【図７７Ｆ】

【図７８Ａ】

【図７８Ｂ】

【図７８Ｃ】

【図７９Ａ】

【図７９Ｂ】

【図８０】

【図８１Ａ】

【図８１Ｂ】

【図８１Ｃ】

【図８１Ｄ】

【図８２Ａ】

【図８２Ｂ】

【図８３Ａ】

【図８３Ｂ】

【図８４】

【図８５】

【図８６】

【図８７】

【図８８】

【図８９】

【図９０】

【図９１】

【図９２】

【図９３】

【図９４】

【図９５】

【図９６】

【図９７】

【図９８】

【図９９】

【図１００】

【図１０１】

【図１０２】

【図１０３】


【図１０４】

【図１０５】

【図１０６】

【図１０７】

【図１０８】

【図１０９】

【図１１０】

【図１１１】

【図１１２】

【図１１３】

【図１１４】

【図１１５】

【図１１６】

【図１１７】

【図１１８】

【図１１９】

【図１２０Ａ】

【図１２０Ｂ】

【図１２０Ｃ−１２０Ｄ】

【図１２０Ｅ−１２０Ｆ】

【図１２１Ａ】

【図１２１Ｂ】

【図１２１Ｃ】

【図１２２Ａ】

【図１２２Ｂ】

【図１２２Ｃ】

【図１２２Ｄ】

【図１２３】

【図１２４Ａ】

【図１２４Ｂ】

【図１２４Ｃ】

【図１２４Ｄ】

【図１２５Ａ】

【図１２５Ｂ】

【図１２５Ｃ】

【図１２６】

【図１２７】

【図１２８】

【図１２９】

【図１３０】

【図１３１】

【図１３２】

【図１３３】

【公表番号】特表２０１２−５０８６９１（Ｐ２０１２−５０８６９１Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５５７２（Ｐ２０１１−５３５５７２）
【出願日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００６０８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６３２８
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１１１３４４２）テンジオン，　インク． (2)
【Ｆターム（参考）】