単離発光タンパク質ｍｔクリシンおよびその使用
本発明は、発光タンパク質mtクリシン、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、および発光タンパク質mtクリシンの活性および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、発光タンパク質mtクリシン(mtＣlytin)、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、および該活性、および発光タンパク質mtクリシンの使用に関する。
【０００２】
発光タンパク質
生物による光生成の現象は生物発光と呼ばれる。それは細胞内の生化学反応の結果であり、この反応中に化学エネルギーが光量子の形で放出される（化学発光手段による冷陰極放出と呼ばれるものである)。この方法で生成される光は、離散電子移動に関連して放出されるのでその光は単色であるが、それはより長波長のスペクトル領域へと二次蛍光染色体[例えば、エクオリア（Aequoria）属の蛍光クラゲの場合には蛍光タンパク質]により変化され得る。
【０００３】
生物発光は、生物学的機能の違いを有する：２００〜１０００m(中深海)の深海では、約９０％の全生物が発光する。この場合では、蛍光シグナルはパートナーの誘引、偽装および擬似餌として用いられる。ツチボタルおよびホタルは、パートナーを探すために光のシグナルを用いる。一方、細菌、菌類および単細胞藻類の発光に関する重要性は明らかでない。大規模な集団において多数の個体調整のために使用されるか、あるいは生物時計の一つのタイプを示すと考えられている。
【０００４】
多数の腔腸動物は生物発光している（Morin et al., 1974)。これらの生物は、青色または緑色を放出する。単離タンパク質としてオワンクラゲ(Shimomura et al., 1969)から得られ、１９６２年に同定された最初の発光タンパク質であるイクオリンは、オワンクラゲの場合、表現型として見られるように緑色光ではなく、青色光を放出した。イクオリンによって活性化された結果として、オワンクラゲを表現型的に緑色に見せる緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)がこのクラゲ（medusa）から単離された(Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969;Inouye et al., 1994)。同定され、記載されたその他の発光タンパク質はクリシン（clytin）、ミトロコミン（mitrocomin）(Fagan et al., 1993)およびオベリン（obelin）(Illarionov et al., 1995)である(Inouye et al., 1993)。
【０００５】
表１：いくつかの発光タンパク質の概略
表には、名前、単離タンパク質の由来生物、データベース登録の識別番号(Acc. No.)を示す。
【０００６】
表２：幾つかの発光タンパク質の概略
表には、単離タンパク質の由来生物、発光タンパク質の名前および特許および出願の選択を示す。
【０００７】
生物発光は、現在、広範で多様な方法における技術、例えば環境汚染のバイオインジケーターの形態で、あるいは生化学的にタンパク質を感度よく検出するためかまたは特定化合物を定量するため、あるいは細胞内での遺伝子調節の研究に関するレポーターと呼ばれるものとして使用される。
【０００８】
発光タンパク質は、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列においてだけではなく、それらの生物化学的および物理特性においても異なる。
【０００９】
発光タンパク質の物理的および生物化学的特性は、これらのタンパク質のアミノ酸配列を変えることによって変化し得ることが示されてきた。突然変異した発光タンパク質の例示は、文献(US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986)に記載されている。
【００１０】
上記発光タンパク質は、セレンテラジン（coelenterazine）を酸化することによって発光する(Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999)。
【００１１】
レポーターシステム
一般的に、簡単な生物化学的方法または組織化学的方法を用いて、遺伝子産物を容易に検知し得る遺伝子は、レポーター遺伝子またはインジケーター遺伝子と呼ばれる。少なくとも２つの型のレポーター遺伝子が分類される。
【００１２】
１．耐性遺伝子。これは、その発現により、耐性遺伝子がなければ細胞死へと導く成長培地中に存在する抗生物質またはその他の物質に対して耐性を細胞に与える遺伝子に使用される用語である。
２．レポーター遺伝子。レポーター遺伝子の製品は、融合されたまたは融合されていないインジケーターとして、遺伝子操作において使用される。最も一般的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ(Alam et al., 1990)、アルカリフォスファタ−ゼ(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992)およびルシフェラーゼおよび他の発光タンパク質(Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)が包含される。
【００１３】
可視スペクトルの範囲における光量子の放出は、励起した放出分子によって作用される放出によるもので、発光と呼ばれる。蛍光とは対照的に、この場合、該エネルギーは短波長の発光の形で外部から供給されるものではない。
【００１４】
化学発光と生物発光とは区別される。励起電子が基底状態へと戻る場合にそれ自体が発光する励起分子によりもたらされる化学反応は、化学発光と呼ばれる。該反応が酵素によって触媒される場合に、該現象は、生物発光であると言われる。この反応に関与する酵素が、一般的にルシフェラーゼと呼ばれる。
【００１５】
クリティア・グレガリア種の分類
口刺胞動物門（Cnidaria）→軟クラゲ目（Leptomedusae）→ウミサカズキガヤ科（Campanulariidae）→クリティア・グレガリア
このクリティア・グレガリア種は、口刺胞動物門、具体的にはクラゲに属する。生物発光および蛍光の表現型は、1998年(Ward et al., 1998)にはすでに記載されていた。
【００１６】
cＤＮＡの単離
クリティア・グレガリア種の生物発光活性を調べるために、試料を白海(Kartesh Biological Station, Russia)で採集し、液体窒素中に貯蔵した。クリティア・グレガリアのcＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ(ａ)＋ＲＮＡを、Novagen (USA)の"Straight A"単離法を用いて単離した。
【００１７】
ＲＴ−ＰＣＲを、cＤＮＡを調製するために実施した。ＲＴ−ＰＣＲのために、ＲＮＡ（１μg）を、下記スキームに従って逆転写酵素(Superscript Gold II)と共にインキュベートした。
【表１】
【００１８】
この反応産物を、ポリメラーゼを不活性化するために３７℃で３０分プロテアーゼＫと共にインキュベートし、cＤＮＡをエタノールで沈殿させた。cＤＮＡ発現ライブラリーを、製造者指示書に従ってClontech (USA) "SMART cＤＮＡ"ライブラリー構築キットを用いて構築した。cＤＮＡを、発現ベクターpTriplEx2 (Clontech; USA)にクローニングした。発現ベクターを、エレクトロポレーションによってE.coli XL1 blue株の細菌に形質転換した。
【００１９】
該細菌を固体ＬＢ栄養培地上で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、レプリカプレーティングを行い、該細菌を、ニトロセルロースフィルターを用いて別の固体栄養培地プレートに移した。レプリカプレートを順に３７℃で２４時間インキュベートし、増殖させた細菌のコロニーを液体ＬＢ培地に移した。ＩＰＴＧ(終濃度、０.１ｍＭ)が添加された後、該細菌を３７℃で４時間振とう器上でインキュベートした。該細菌を遠心分離により集菌し、細菌塊を０℃で破砕緩衝液(５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９.０) (０.５ml）に再懸濁した。次いで、該細菌を超音波処理によって破砕した。
【００２０】
セレンテラジン（終濃度、１０Ｅ−０７Ｍ)を添加した後、溶解物を４℃３時間でインキュベートした。次いで、生物発光を塩化カルシウム(終濃度、２０ｍＭ)添加後にルミノメーターで測定した。
発光タンパク質を同定した。その発光タンパク質をmtクリシンと呼ぶ。発光タンパク質mtクリシンは、次に詳細に説明される。
【００２１】
mtクリシン
発光タンパク質mtクリシンは、クリティア・グレガリア由来のクリシンとアミノ酸レベルで最も高い相同性を示す８７％の同一性を有し、オベリア・ジェニキュラタ(実施例８に示される；図８）由来のオベリンと７７％の同一性を有す。クリシンに対する８７％の相同性はタンパク質のＣ末端で生じ、複数のアミノ酸置換は全タンパク質にわたって分散して同定され得る。核酸レベルでは、同一性は３０％よりも低い(実施例７；図７に示される)。ＢＬＡＳＴ法（Altschul et al., 1997)を配列比較に使用した。
【００２２】
発光タンパク質クリシン-２は、アミノ酸レベルでクリティア・グレガリア由来のクリシンと最も高い相同性を示す。しかし、配列は、実施例１１(図９）に示されたこれらの相違を有し、アミノ酸配列中に多くの相違を示す。これらの相違は、物理化学、生物化学および生物発光特性の変化を導き得る。発光タンパク質クリシン-２は、いずれのシグナルペプチドをも有さない(実施例１０に示したとおりである)。
【００２３】
発光タンパク質mtクリシンは、ミトコンドリアへ輸送させるように発光タンパク質を導き得るシグナルペプチドを有する。そのシグナルペプチドは、コンピュータープログラムＭＩＴＯＰＲＯＴによって同定された(Claros et al., 1996) (実施例１０に示される)。ＭＩＴＯＰＲＯＴによって決定されたシグナルペプチドは、配列番号：３に示される。発光タンパク質mtクリシンは、ミトコンドリアへの輸送のための天然のシグナルペプチドが同定された最初の発光タンパク質である。
【００２４】
本発明は、mtクリシンの機能的等価物にも関する。機能的等価物とは、同等の物理化学特性を持ち、配列番号：２と少なくとも７０％の相同性であるタンパク質である。好ましくは、少なくとも８０％または９０％の相同性を示すものである。少なくとも９５％の相同性が特に好まれる。
【００２５】
本発明は、mtクリシン シグナルペプチドの機能的等価物にも関する。機能的等価物とは、同等の物理化学特性を持ち、配列番号：３に対して少なくとも７０％の相同性であるそれらのタンパク質またはペプチドである。好ましいものは、少なくとも８０％または９０％の相同性を与えるものであ。少なくとも９５％の相同性が特に好ましい。
【００２６】
発光タンパク質mtクリシンは、レポーター遺伝子として、細胞系、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクターまたは誘導系に使用されるのが適当である。
【００２７】
また、mtクリシンシグナルペプチドは、細胞系、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクターまたは誘導系に対する融合レポーター遺伝子として使用されるために、レポーター遺伝子に融合されるのが適当である。
【００２８】
また、発光タンパク質mtクリシンは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアを、標識、同定および特性分析することにより、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００２９】
また、mtクリシン シグナルペプチドは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアへの輸送のために、ペプチドまたはタンパク質に融合されるのが適当である。
【００３０】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアの内外のパラメーター、特にカルシウム濃度を決定するために、レポーター遺伝子として使用されるのがまた適当である。
【００３１】
また、mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアの内外のパラメーター、特にカルシウム濃度を決定するために、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３２】
発光タンパク質mtクリシンは、細菌および真核生物系、特に哺乳動物細胞、細菌、酵母、バキュロおよび植物においてレポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３３】
発光タンパク質mtクリシンは、レポーター遺伝子として、生物発光または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼまたはホスファターゼを用いる系とを組合せた細胞系に使用されるのが適当である。
【００３４】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、生物発光または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼまたはホスファターゼを用いる系とを組合せた細胞系にレポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３５】
発光タンパク質mtクリシンは、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクター、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質および糖タンパク質に融合ペプチドとして使用されるのが適当である。
【００３６】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして使用されるために、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクター、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスファチジルエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質および糖タンパク質のための融合タンパク質ペプチドとして使用されるのが適当である。
【００３７】
発光タンパク質mtクリシンは、特に抗体、ビオチンまたは磁性または磁化し得る支持体によって固定されるのに適当である。
【００３８】
発光タンパク質mtクリシンは、エネルギー転位系、特にＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)、ＢＲＥＴ(生物発光共鳴エネルギー転位：fluorescence resonance energy transfer)、ＦＥＴ(フィールド効果トランジスター）、ＦＰ(蛍光分極化)およびＨＴＲＦ(均一時間分解蛍光)系のためのタンパク質として使用されるのが適当である。
【００３９】
発光タンパク質mtクリシンは、基質またはリガンド、特にプロテアーゼ、キナーゼまたはトランスフェラーゼを標識するのに適当である。
発光タンパク質mtクリシンは、細菌系で発現されるため、特に滴定量決定のため、生物化学系の基質、特にプロテイナーゼとキナーゼのための基質として適当である。
【００４０】
発光タンパク質mtクリシンは、標識として、特に抗生物質と結合した、酵素と結合した、受容体と結合した、またはイオンチャンネルおよび他のタンパク質と結合した標識として使用されるのが適当である。
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、特に抗生物質に結合した、酵素に結合した、受容体に結合したまたはイオンチャンネルおよび他のタンパク質に結合した標識として使用されるのが適当である。
【００４１】
発光タンパク質mtクリシンは、医薬活性化合物の探索、特にＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング)において、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
mtクリシン シグナルペプチドは、医薬活性化合物の探索、特にＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング)において、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００４２】
発光タンパク質mtクリシンは、検出系の成分として、特にＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)、免疫組織化学、ウェスタンブロッティングまたは共焦点顕微鏡検査法に対する検出系の成分として使用されるのが適当である。
【００４３】
発光タンパク質mtクリシンは、相互作用、特にタンパク質-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用またはＲＮＡ-タンパク質相互作用(ＤＮＡ:デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸)を分析するための標識として使用されるのが適当である。
【００４４】
発光タンパク質mtクリシンは、遺伝子導入生物、特にマウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚、虫または植物における発現のための標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４５】
mtクリシン シグナルペプチドは、遺伝子導入生物、特にマウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚、虫または植物における発現のための標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４６】
発光タンパク質mtクリシンは、胚発生を分析するのに標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４７】
発光タンパク質mtクリシンは、カップリングメディエーター、特にビオチン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）またはＣＮ−Ｂｒを介する標識として使用されるのが適当である。
【００４８】
発光タンパク質mtクリシンは、核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡに結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００４９】
発光タンパク質mtクリシンは、タンパク質またはペプチドと結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５０】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、タンパク質またはペプチドと結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５１】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞内外のカルシウム濃度を測定するためのレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５２】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞系におけるシグナルカスケードを特徴分析するために適当である。
【００５３】
核酸またはペプチドと結合された発光タンパク質mtクリシンは、特にノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、核酸配列決定、タンパク質分析またはチップ分析のためのプローブとして使用されるのが適当である。
【００５４】
発光タンパク質mtクリシンは、医薬製剤、特に感染物質、抗体または「小分子」を標識するために使用されるのが適当である。
【００５５】
発光タンパク質mtクリシンは、地質調査、特に海、地下水および川に使用されるのが適当である。
【００５６】
発光タンパク質mtクリシンは、発現系、特にイン・ビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系および真核生物系において発現するために適切である。
【００５７】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、発現系、特にイン・ビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系および真核生物系において発現されるのに適当である。
【００５８】
発光タンパク質mtクリシンは、外科的介入、特に侵襲性、非侵襲性および最小の侵襲性介入との関連において、組織または細胞を可視化するために適当である。
【００５９】
発光タンパク質mtクリシンは、特に組織学的調査および外科的介入との関連において腫瘍組織およびその他の表現型的に変化した組織を標識するためにも適当である。
【００６０】
本発明は、特に野生型タンパク質、融合タンパク質および突然変異タンパク質として発光タンパク質mtクリシンの精製にも関する。
【００６１】
本発明は、特に野生型タンパク質、融合タンパク質および突然変異タンパク質としてmtクリシン シグナルペプチドの精製にも関する。
【００６２】
本発明は、化粧品の分野、特に入浴剤、ローション、ソープ、身体用染料、歯磨き粉および身体用パウダーにおける、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６３】
本発明は、染色のため、特に食材、入浴剤、インク、服飾およびプラスチックを染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６４】
本発明は、紙、特にグリーティングカード、紙類製品、壁紙および手工芸物品を染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６５】
本発明は、液体、特に水鉄砲、噴水、飲料および氷を染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６６】
本発明は、装身物を製造するための、特にマニキュア（finger dye）および化粧品製造のための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６７】
本発明は、配列番号：２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００６８】
本発明は、配列番号：３に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００６９】
本発明は、配列番号：６に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７０】
本発明は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７１】
本発明は、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７２】
本発明は、配列番号：６アミノ酸配列に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７３】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列番号：１と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：１と少なくとも６５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に関する。
【００７４】
本発明は、配列番号：１または配列番号：５と、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％または６０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の特性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７５】
本発明は、配列番号：４と、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％または６０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの特性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７６】
本発明は、配列が、発光タンパク質をコードしている配列またはリーダーまたはシグナル配列をコードしている配列に対して５'側の機能プロモーターを含有する上記核酸分子に関する。
【００７７】
本発明は、先に記載した組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの構成物質である核酸分子にも関する。
【００７８】
本発明は、かかるベクターを担持する生物に関する。
本発明は、本発明のmtクリシン分子または他の分子のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と同一または相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００７９】
本発明は、先に記載したヌクレオチド配列によってコードされた発光タンパク質に関する。
【００８０】
本発明は、細菌、真核細胞またはイン・ビトロ発現系において本発明の発光タンパク質ポリペプチドを発現するための方法に関する。
【００８１】
本発明は、本発明の発光タンパク質ポリペプチドを精製する／単離するための方法にも関する。
【００８２】
本発明は、本発明の発光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【００８３】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００８４】
本発明は、標識またはレポーターとして、またはマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、本発明の発光タンパク質または発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００８５】
本発明は、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、発光タンパク質mtクリシンの使用、あるいは標識もしくはレポーターとしてまたは標識もしくはレポーター遺伝子としての発光タンパク質mtクリシン (配列番号：２)をコードする核酸の使用に関する。
【００８６】
本発明は、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、配列番号：１を示す核酸の使用に関する。
【００８７】
本発明は、特に活性化合物および診断薬を探索するための、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、配列番号：６に記載のペプチドおよびその基礎を為す核酸配列の配列番号：５の使用に関する。
【００８８】
本発明は、本発明のポリペプチドを認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
【００８９】
本発明は、発光タンパク質mtクリシン (配列番号：２)または発光タンパク質クリシン-２(配列番号：６)を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体にも関する。
【００９０】
本発明は、発光タンパク質mtクリシンのシグナルペプチド(配列番号：３)を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体にも関する。
【００９１】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：４に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を示すペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子；
ｆ）配列番号：４と少なくとも６５％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子、
からなる群からさらに選択される核酸分子に関する。
【００９２】
同様に、本発明は、
ａ）配列番号：６によって示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：５に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：５と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：５と少なくとも８０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に関する。
【００９３】
本発明は、コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する、前段落に記載したとおりの核酸に関する。
【００９４】
本発明は、先に記載した核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターに関する。
【００９５】
同様に、本発明は、先に記載したベクターを担持する生物に関する。
【００９６】
本発明は、先に記載した核酸分子の構成配列と同一かまたは相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００９７】
本発明は、先に記載した核酸配列によってコードされるポリペプチドに関する。
【００９８】
本発明は、細菌、ウイルス細胞、酵母または真核細胞において、またはイン・ビトロ発現系において、上記ポリペプチドを発現するための方法にも関する。
【００９９】
本発明は、本発明のポリペプチドを精製/単離するための方法に関する。
【０１００】
本発明は、発光タンパク質mtクリシンに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドにも関する。
【０１０１】
さらに、本発明は、発光タンパク質クリシン-２に対する抗体により免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１０２】
本発明は、配列番号：３に示されたシグナルまたはリーダーペプチドに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１０３】
本発明は、配列番号：６(クリシン-２)に示された発光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドにも関する。
【０１０４】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、本発明の核酸の使用に関する。
【０１０５】
本発明は、標識またはレポーターとして、本発明の発光タンパク質の使用に関する。
【０１０６】
本発明はさらに、シグナルまたはリーダー配列として、配列番号：４に記載の配列または配列番号：４と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含有する核酸の使用に関する。
【０１０７】
本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドとして、配列番号：３に記載の配列または配列番号：３と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含有するペプチドの使用にも関する。
【０１０８】
同様に、本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドと融合されたタンパク質を細胞オルガネラに輸送するための、２つの前段落で述べられている使用に関する。
【０１０９】
本発明は、細胞オルガネラがミトコンドリアである前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１０】
本発明は、細胞オルガネラが小胞体(ＥＲ)である前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１１】
本発明は、シグナルまたはリーダー配列として、配列番号：４に記載される核酸配列のさらなる使用に関する。
【０１１２】
本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドとして、配列番号：３に示され、そしてこの配列を含有するペプチドの使用にも関する。
【０１１３】
同様に、本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドと融合されたタンパク質を細胞オルガネラに輸送するための２つの前段落に述べられている使用に関する。
【０１１４】
本発明は、細胞オルガネラがミトコンドリアである前段落において述べられている使用にも関する。
本発明は、細胞オルガネラが小胞体（ＥＲ）である前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１５】
同様に、本発明は、医薬活性化合物の探索において、レポータータンパク質として本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１１６】
最終的に、本発明は、医薬活性化合物の探索において、レポーター遺伝子として、本発明の核酸の使用にも関する。
【０１１７】
本発明の発光タンパク質の発現
遺伝子が適当な宿主細胞中に導入された後、発現ベクター中にクローニングされた外来遺伝子を転写および翻訳し得る分子の産生が発現と呼ばれる。発現ベクターは、原核生物または真核細胞において遺伝子を発現するために必要とされるコントロールシグナルを含有する。
【０１１８】
基本的には、発現ベクターは２つの異なる方法で構築される。転写融合と呼ばれる場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、オーセンティックな生物学的に活性なタンパク質として合成される。この目的のために、発現ベクターは、発現に必要とされる全ての５'および３'側にコントロールシグナルを担持する。
【０１１９】
翻訳融合と呼ばれるものの場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、ハイブリッドタンパク質として、簡単に検出され得る別のタンパク質と共に発現される。発現に必要とされる５'および３'側のコントロールシグナルは、開始コドンとおそらく、形成されるべきハイブリッドタンパク質のＮ末端領域をコードする配列の一部を包含するもので、ベクターに由来する。付加的に挿入されたタンパク質部分は、多くの場合に、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質を細胞性プロテアーによる分解に対して安定化させるだけでなく、形成されるハイブリッドタンパク質を検出および単離するために使用され得る。発現は、一過的または安定的に起こる。適当な宿主生物は、細菌、酵母、ウイルスまたは真核生物系である。
【０１２０】
本発明の発光タンパク質の精製
タンパク質の単離(それらがさらに過剰発現した後)は、しばしばタンパク質精製と呼ばれる。多くの確立された方法は、タンパク質を精製するために利用し得る。
【０１２１】
固体/液体分離は、タンパク質を単離することに関連した基本操作である。この手順のステップは、細胞を培養培地から分離する時、細胞を破砕させ、細胞破砕物を除去した後に粗製抽出物を清澄する時、および沈殿化後に沈殿物を分離する時に必要とされる。それは、遠心分離および濾過によって行う。
【０１２２】
細胞内タンパク質を得るために、細胞壁は、破壊されるかまたは透過し得るようにされるべきである。高圧ホモゲナイザーまたは攪拌ボールミルまたはガラスビーズは、スケールや生物によって、この目的のために使用される。機械的な細胞インテグレーション(Mechanical cell integrations)および超音波処置が、とりわけ研究室スケールに対して使用される。
【０１２３】
細胞外タンパク質および細胞内タンパク質(細胞破砕後)の両方の場合、塩類(特に、硫酸アンモニウム)または有機溶媒(アルコールまたはアセトン)を用いる様々な沈殿方法は、タンパク質を濃縮するための迅速かつ有効な方法を示す。細胞内タンパク質が精製される場合、可溶性核酸を除去すること（例えば、硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミンによる沈殿）が望ましい。細胞外性タンパク質が単離される場合、担体（例えば、スターチまたは珪藻土）は、取扱いが容易な沈殿物を得るために、沈降剤を添加する前に添加されることが多い。
【０１２４】
多くのクロマトグラフィー法および分配方法(吸収クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーおよび電気泳動)は、高度な精製のために利用し得る。カラムクロマトグラフィーは、工業的スケールで使用される。ステップあたりの精製係数を数１００sまで上げることが可能であるアフィニティークロマトグラフィーは、研究室スケールでは特に重要である。
【０１２５】
細胞外タンパク質は、相対的に希薄な溶液中に存在する。細胞外タンパク質と同様に、それらは、さらなる使用に供する前に濃縮されるべきである。すでに記載された方法に加えて、限外濾過は工業スケールとしても価値のあるものと証明されてきた。
【０１２６】
タンパク質を伴う無機塩は、特定の用途には好ましくないことが多い。
【０１２７】
それらは、特にゲル濾過、透析および膜分離精製によって除去され得る。
【０１２８】
多くのタンパク質は乾燥調製物として使用される。重要な乾燥方法は、真空乾燥、凍結乾燥および噴霧乾燥である。
【０１２９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
発光タンパク質mtクリシンは、次のヌクレオチド配列(配列番号：１）によってコードされる:
５'- gacagataaaaaattcactccttagattatttagtgaataagagaaaaaaaggataagaaatcaagatgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgcaagatcaagattgcaacgcacggcaaattttcacaccagcatactcttggctacagattcaaaatacgcggtcaaactcgatcctgattttgcaaatccaaaatggatcaacagacacaaatttatgttcaactttttggacataaacggtaaggggaaaatcacattagatgaaatcgtctccaaagcttcagacgacatttgtgctaaactggatgcaacaccagaacagaccaaacgtcaccaggatgctgttgaagcctttttcaagaaaatgggcatggattatggtaaagaagttgcattcccagaatttattaagggatgggaagagttggccgaacacgacttggaactctggtctcaaaacaaaagtacattgatccgtgaatggggagatgctgttttcgacattttcgacaaagacgcaagtggctcaatcagtttagacgaatggaaggcttacggacgaatctctggaatctgtccatcagacgaagacgctgagaagacgttcaaacattgtgatttggacaacagtggcaaacttgatgttgatgagatgaccaggcaacatttaggcttctggtacacattggatccaacttctgatggtctttatggcaattttgttccctaagaagcgttcagttaaaaacgctaaacattgttcagttgtaaaattatattcattttcatttcgtaaaattagtatttataaatttgtatcataaattgtatccatgttgtagactaaataagactcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa -３'。
【０１３０】
この配列により、(配列番号：２)のアミノ酸配列を生じる:
MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRHKFMFNFLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGMDYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLDEWKAYGRISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDGLYGNFVP。
【０１３１】
発光タンパク質mtクリシンの推定シグナルペプチドは、次の配列(配列番号：３):ＭＱＲＦＴＮＲＬＬＳＭＳＡＬＲＡ
を持ち、
次の核酸配列:
５’−atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgca −３’(配列番号：４)を有する。
発光タンパク質クリシン-２は、次のヌクレオチド配列（配列番号：５)によってコードされる:
５'- GATCTCAGCTCAACTTGCAATAAGTATCAGATCAAATTTTGCAACTCAAAGCAAATCATCAACTTCATCATAATGACTGACACTGCTTCAAAATACGCTGTCAAACTCAAGACCAACTTTGAAGATCCAAAATGGGTCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATTAACGGCAACGGAAAAATCACTTTGGATGAAATTGTCTCCAAAGCTTCGGATGACATTTGCGCCAAACTTGGAGCTACACCAGCTCAAACCCAACGTCATCAGGAAGCTGTTGAAGCTTTCTTCAAGAAGATTGGTTTGGATTATGGCAAAGAAGTCGAATTCCCAGCTTTCGTTAACGGATGGAAAGAACTGGCCAAACATGACTTGAAACTTTGGTCCCAAAACAAGAAATCTTTGATCCGCAATTGGGGAGAAGCTGTATTCGACATTTTCGACAAGGACGGAAGTGGCTCAATCAGTTTGGACGAATGGAAAACATACGGAGGAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACGAAGACGCTGAAAAGACCTTCAAACATTGCGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGACGAGATGACCAGACAACATTTGGGATTCTGGTACACCTTGGACCCTAACGCTGATGGTCTTTATGGCAACTTTGTCCCTTAAAAACTTTTTTTGCTGTAAATTCTTTACGGGTTATTTTTTCATAATTGTCATTTGATTTTAACTTTGTTTCGGAAAATGAAAAATATTCTTTATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - ３'。
【０１３２】
この配列により、(配列番号：６)のアミノ酸配列を生じる：
MTDTASKYAVKLKTNFEDPKWVNRHKFMFNFLDINGNGKITLDEIVSKASDDICAKLGATPAQTQRHQEAVEAFFKKIGLDYGKEVEFPAFVNGWKELAKHDLKLWSQNKKSLIRNWGEAVFDIFDKDGSGSISLDEWKTYGGISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPNADGLYGNFVP。
これらの配列は配列表に再現される。
【０１３３】
実施例
実施例１
Clontech plasmid pTriplE ｘ２を、下記に述べる構築体を調製するためのベクターとして使用した。ベクターの誘導体をpTriplEx2-mtクリシンと称す。ベクター pTriplEx2- mtクリシン を細菌系においてmtクリシンを発現するために使用した。図１は、ベクター pTriplEX2-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【０１３４】
実施例２
Clontech plasmid pcＤＮＡ3.1(＋)を、下記に述べる構築体を調製するためのベクターとして使用した。ベクターの誘導体をpcＤＮＡ3-mtクリシンと称する。ベクター pcＤＮＡ3-mtクリシン を、真核生物系においてmtクリシン を発現するために使用した。図２は、ベクター pcＤＮＡ３- mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【０１３５】
実施例３
細菌発現
細菌的発現は、Ｅ．coli 株 BL21(DE3) において、発現プラスミドpTriplEX2- mtＣlytin および pTriplEX2を用いて細菌を形質転換することによって行った。形質転換細菌を、ＬＢ培地で３７℃で３時間インキュベートし、発現を１ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加して４時間誘導した。誘導された細菌を、遠心分離により集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ ９．０)＋５ ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、超音波処理により破砕した。溶解物を、１３.０００ rpm (１６０００ ref)で１５分間遠心分離し、上清を取出した。上清(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０を用いて１：５、１：１０；１：２０および１：５０希釈)を、セレンテラジン(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０中１０Ｅ−０７Ｍセレンテラジン)と共に、３時間暗所でインキュベートした。生物発光を、５ｍＭ塩化カルシウムを添加した後、ルミノメーターで直接測定した。測定集積時間は４０秒であった。
図３は、細菌中のmtクリシンの生物発光の測定結果を示す。
【０１３６】
実施例４
真核生物系の発現
構成的真核生物系発現を、ＣＨＯ細胞で為した。一過的発現において発現プラスミド pcＤＮＡ３- mtＣlytin および pcＤＮＡ3.1(＋)を用いて、細胞を形質転換した。このために、ウェルあたり１００００個の細胞を、９６-ウェルマイクロタイタープレート上のＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に播種し、プレートを終夜３７℃でインキュベートした。形質転換を、製造指示書に従ってＦｕ遺伝子６キット(Roche)を用いて為した。形質転換細胞を、終夜ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地において３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、セレンテラジン(ＰＢＳ中１０Ｅ ０７Ｍ セレンテラジン)（５０ μl）で置換した。細胞を、３７℃３時間でインキュベートし、ＡＴＰ(アデノシン３リン酸)を終濃度１μＭまで添加した。ルミノメーターにおける測定を添加後に直接開始した。積算時間は１秒であり、総測定時間は６０秒であった。
図４は、ＣＨＯ細胞中のmtクリシンの生物発光の測定結果を示す。
【０１３７】
実施例５
ＢＬＡＳＴ
アミノ酸レベルでのmtクリシンＢＬＡＳＴ分析の結果：
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６５５．１|未詳タンパク質産物［Clytia gregaria］、長さ＝１９８、スコア＝３６８bits (９４５)、期待数＝ｅ−１０１、同一性＝１７１/１９５(８７％)、陽性＝１８２/１９５(９２％)。
＞ｓｐ｜Ｑ０８１２１｜ＣＬＹＴ＿ＣＬＹＧＲ Clytin 前駆体(Phialidin)、ｐｉｒ｜｜Ｓ２８８６０ ｃｌｙｔｉｎ - ヒドロクラゲ (Clytia gregarium)、ｅｍｂ｜ＣＡＡ４９７５４．１｜ ｃｌｙｔｉｎ ［Ｃｌｙｔｉａ ｇｒｅｇａｒｉａ]、ｇｂ｜ＡＡＡ２８２９３．１｜ アポクリシン(apoclytin）、長さ＝１９８、スコア＝３６８ bits (９４５)、期待数＝ e−１０１、同一性＝１７１/１９５(８７％)、陽性＝１８２/１９５(９２％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６５８．１|未詳タンパク質産物 [合成構築体]、長さ＝１９８、スコア＝３６７ bits (９４３)、期待数＝ｅ−１０１、同一性＝１７０/１９５(８７％)、陽性＝ １８２/１９５(９３％)
＞ｓｐ｜Ｑ２７７０９|ＯＢＬ＿ＯＢＥＬＯ オベリン前駆体(OBL)、ｐｄｂ｜１ＥＬ４｜Ａ鎖、カルシウム調節発光タンパク質オベリンの構造、Sulfur Sas, ｇｂ｜ＡＡＡ６７７０８．１｜未詳タンパク質産物により決定、長さ＝１９５、スコア＝３２７ bits (８３７)、期待数＝1ｅ−８８、同一性＝１５０/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７４．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体］、長さ＝１９５、スコア＝３２６ bits (８３５)、期待数＝２ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７２．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体]、長さ＝１９５、 スコア＝３２５ bits (８３４)、期待数＝３ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３（７７％)、陽性＝１７０/１９３（８７％）
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７３．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体]、長さ＝１９５、スコア＝３２５bits (８３３）、期待数＝４ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｐｄｂ｜１ＪＦ０｜鎖Ａ、Obelia Geniculata由来のオブリン結晶構造 At 1.82 溶解、ｇｂ｜ＡＡＬ８６３７２．１|ＡＦ３９４６８８＿１ アポオブレン（apoobelin）［Obelia geniculata］、長さ＝１９５、スコア＝３２５ bits (８３３)、期待数＝４ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１６８/１９３(８６％)
【０１３８】
実施例６
ＢＬＡＳＴ
核酸レベルでのmtクリシンのＢＬＡＳＴ分析の結果：
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１２５．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２３、長さ＝５９７、スコア＝６６９bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１１９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列１７、長さ＝５９７、スコア＝６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜Ｘ７０２２１．１|クリシンに対するＣＧＣＬＹＴＩＮ C.gregaria mＲＮＡ、長さ＝７４７、スコア＝６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｇｂ｜Ｌ１３２４７．１|ＣＹ１ＡＰＯＣＬＹＴ Clytia gregarium のアポクリシンmＲＮＡ、完全なcds、長さ＝７４７、スコア＝ ６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８７．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８５、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８５．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８３、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８３．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８１、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８１．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列７９、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％）
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１７９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列７７、長さ＝ ５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１３１．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２９、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３／５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１２９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２７、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
【０１３９】
実施例７
図７は、核酸レベルでのクリシン(Clytia gregaria)とmtクリシンアラインメントを示す。
【０１４０】
実施例８
図８は、アミノ酸レベルでのクリシン(Clytia gregaria)とmtクリシンアラインメントを示す。
【０１４１】
実施例９
mtクリシンの速度論的分析
mtクリシンの生物発光の速度論的分析のために、ＣＨＯ細胞を、pcＤＮＡ３ mtクリシン または pcＤＮＡオベリン または pcＤＮＡ３(いずれの合成cＤＮＡも含まない)により、一過的に形質転換した。形質転換および測定を、実施例４に記載のとおりに実施した。読み取りを、１秒間の積算時間を用いて６０秒間要した。
図５および６は、mtクリシンとオベリンの速度論的分析の結果を示す。
【０１４２】
実施例１０
ＭＩＴＯＰＲＯＴ分析
コンピュータープログラム ＭＩＴＯＰＲＯＴを使用して、mtクリシン シグナルペプチド (Claros et al., 1996)を分析した。次の発光タンパク質を分析した：オベリン(Q27709)、イクオリン(P07164)、クリシン(Q08121)およびmtクリシン(配列番号：２)。
【０１４３】
分析結果：
オベリン:
配列名：ＯＢＥＬＩＮ
インプット配列長：１９５ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -11
分析領域 : 11
標的配列中の塩基性残基数 : 3
標的配列中の酸性残基数 : 0
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : −
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.624 0.259 -0.308 0.295
MesoH : -1.573 -0.241 -0.642 0.060
MuHd_075 : 14.019 3.641 4.408 1.523
MuHd_095 : 7.994 7.898 3.285 1.838
MuHd_100 : 13.734 9.836 5.597 2.742
MuHd_105 : 21.195 11.755 7.339 4.117
Hmax_075 : -9.450 -2.800 -4.008 1.132
Hmax_095 : -0.963 1.837 -1.971 1.103
Hmax_100 : 0.400 1.300 -1.942 2.240
Hmax_105 : 10.617 6.067 0.733 3.127
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.1479
【０１４４】
イクオリン:
配列名：ＡＥＱＵＯＲＩＮ
インプット配列長: １９６ aa
---------------------------------------------------------
算定パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -13
分析領域 : 3
標的配列中の塩基性残基数 : 0
標的配列中の酸性残基数: 0
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : 0.006 0.794 -0.263 0.368
MesoH : -1.673 -0.382 -0.703 0.048
MuHd_075 : 24.326 4.153 5.947 2.450
MuHd_095 : 12.638 7.213 4.218 1.796
MuHd_100 : 13.748 8.827 4.477 2.427
MuHd_105 : 16.581 11.426 5.056 3.453
Hmax_075 : 0.438 0.233 -2.490 1.692
Hmax_095 : 0.525 -1.400 -2.394 0.674
Hmax_100 : -0.100 -1.200 -2.292 1.550
Hmax_105 : 0.500 -0.000 -2.164 1.540
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.0148
【０１４５】
クリシン:
配列名: ＣＬＹＴＩＮ
インプット配列長: １９８ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -9
分析領域 : 32
標的配列中の塩基性残基数 : 6
標的配列中の酸性残基数: 2
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.429 0.341 -0.313 0.313
MesoH : -1.778 -0.307 -0.718 0.053
MuHd_075 : 32.928 17.509 7.351 5.708
MuHd_095 : 30.874 20.344 9.074 5.834
MuHd_100 : 36.596 22.666 10.051 6.762
MuHd_105 : 39.174 19.336 10.379 7.609
Hmax_075 : 4.900 7.087 -1.223 3.684
Hmax_095 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_100 : 14.000 12.600 1.601 5.060
Hmax_105 : 6.650 13.067 -0.468 3.920
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.2047
【０１４６】
クリシン-２ :
配列名: ＣＬＹＴＩＮ−２
インプット配列長: １９８ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -7
分析領域 : 16
標的配列中の塩基性残基数 : 3
標的配列中の酸性残基数: 1
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.288 0.341 -0.213 0.313
MesoH : -1.519 -0.206 -0.681 0.081
MuHd_075 : 32.594 15.092 8.192 4.075
MuHd_095 : 36.090 19.707 8.836 6.716
MuHd_100 : 38.617 20.269 9.682 6.851
MuHd_105 : 30.267 16.082 8.229 5.470
Hmax_075 : 6.533 6.417 -0.793 2.508
Hmax_095 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_100 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_105 : 13.417 10.150 1.612 3.862
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.3974
【０１４７】
mtクリシン:
配列名: mtＣlytin
インプット配列長: 228 aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -8
分析領域 : 34
標的配列中の塩基性残基数 : 6
標的配列中の酸性残基数: 0
開裂部位 : 17
開裂配列 : MQRFTNRLLSMSALRA
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.135 0.453 -0.343 0.309
MesoH : -1.623 -0.215 -0.701 0.073
MuHd_075 : 33.394 19.322 8.634 7.593
MuHd_095 : 34.726 19.634 8.110 8.861
MuHd_100 : 32.825 16.596 7.376 7.520
MuHd_105 : 28.005 19.893 7.410 7.865
Hmax_075 : 16.683 17.733 2.851 5.763
Hmax_095 : 13.125 13.388 2.299 4.314
Hmax_100 : 8.300 11.500 1.845 3.830
Hmax_105 : 1.700 9.500 -1.171 2.390
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.9974
分析したペプチドのミトコンドリアへの輸送確率は、計算したファクターアプローチ１を高める。
【０１４８】
オベリン、イクオリン、クリシン、クリシン−２およびmtクリシンのタンパク質配列の分析は、唯一mtクリシンが、ミトコンドリアに輸送され得るタンパク質の機能を有するということを示す。
【０１４９】
実施例１１
図９は、アミノ酸レベルでのmtクリシン、クリシン(Clytia gregaria) および クリシン-タイプ２のアラインメントを示す。
【０１５０】
文献/特許
US 6,495,355
US 5,541,309
US 5,093,240
US-0908909
US 6,152,358
JP-0176125
GB-0024357
WO03006497
WO200168824
【０１５１】
Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1;188(2):245-54
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
Chiesa A, Rapizzi E, Tosello V, Pinton P, de Virgilio M, Fogarty KE, Rizzuto R. Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signalling. Biochem J. 2001 Apr 1;355(Pt 1):1-12.
Claros, M.G., Vincens, P. (1996); Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting seqeunces. Eur. J. Biochem 241, 779-786.
Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology. 216:362ff
Fagan TF, Ohmiya Y, Blinks JR, Inouye S, Tsuji FI. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin. FEBS Lett. 1993 Nov 1;333(3):301-5
Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry of calcium-activated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull. 137, 402.
Haddock SH, Rivers TJ, Robison BH. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Sep 25;98(20):11148-51
Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994 Mar 21;341(2-3):277-80
Inouye S, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. 1993 Jan 11;315(3):343-6.
Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca(2+)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 Feb 14;153(2):273-4.
Jones K, Hibbert F, Keenan M. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Trends Biotechnol 1999 Dec;17(12):477-81
Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds, G.T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85-103.
Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.
Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec;7(6):821-7
Sambrook, J., Fritsch, E. Maniatis, T. 1989, Molecular cloning. A laboratory manual Vol 1-3, Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press
Shimomura O, Johnson FH. Properties of the bioluminescent protein aequorin. Biochemistry 969 ct;8(10):3991-7
Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symp Soc Exp Biol. 1985;39:351-72
Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms of aequorin.
Biochem J. 1986 Mar 1;234(2):271-7.
Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. Am J Physiol. 1984 Nov;247(5 Pt 1):C396-408.
Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In: Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols (Chalfie, M. and Kain, S., eds) pp. 45-70. Wiley-Liss, Inc.
Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ff
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、ベクター pTriplEX2-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【図２】図２は、ベクター pcＤＮＡ3-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、mtクリシンの細菌的発現および細菌的発現後のmtクリシンの生物発光活性の結果を示す(Ｙ＝ＲＬＵ：相対的光ユニット＝希釈；黒の棒線＝mtクリシン；灰色棒線＝コントロールの溶菌物）。
【図４】図４は、mtクリシンの真核生物系発現およびＣＨＯ細胞における発現後のmtクリシンの生物発光活性の結果を示す(Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝ＡＴＰ(mol/lの対数表示）)。
【図５】図５は、mtクリシンの生物発光に関する速度論的分析を示す（Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝時間［秒］）。
【図６】図６は、オベリンの生物発光に関する速度論的分析を示す（Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝時間［秒］）。
【図７】図７は、アミノ酸レベルでのクリシンおよびmtクリシンのアラインメントを示す。
【図８】図８は、核酸レベルでのクリシンおよびmtクリシンのアラインメントを示す。
【図９】図９は、アミノ酸レベルでのクリシンおよびクリシン-２のアラインメントを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、発光タンパク質mtクリシン(mtＣlytin)、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、および該活性、および発光タンパク質mtクリシンの使用に関する。
【０００２】
発光タンパク質
生物による光生成の現象は生物発光と呼ばれる。それは細胞内の生化学反応の結果であり、この反応中に化学エネルギーが光量子の形で放出される（化学発光手段による冷陰極放出と呼ばれるものである)。この方法で生成される光は、離散電子移動に関連して放出されるのでその光は単色であるが、それはより長波長のスペクトル領域へと二次蛍光染色体[例えば、エクオリア（Aequoria）属の蛍光クラゲの場合には蛍光タンパク質]により変化され得る。
【０００３】
生物発光は、生物学的機能の違いを有する：２００〜１０００m(中深海)の深海では、約９０％の全生物が発光する。この場合では、蛍光シグナルはパートナーの誘引、偽装および擬似餌として用いられる。ツチボタルおよびホタルは、パートナーを探すために光のシグナルを用いる。一方、細菌、菌類および単細胞藻類の発光に関する重要性は明らかでない。大規模な集団において多数の個体調整のために使用されるか、あるいは生物時計の一つのタイプを示すと考えられている。
【０００４】
多数の腔腸動物は生物発光している（Morin et al., 1974)。これらの生物は、青色または緑色を放出する。単離タンパク質としてオワンクラゲ(Shimomura et al., 1969)から得られ、１９６２年に同定された最初の発光タンパク質であるイクオリンは、オワンクラゲの場合、表現型として見られるように緑色光ではなく、青色光を放出した。イクオリンによって活性化された結果として、オワンクラゲを表現型的に緑色に見せる緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)がこのクラゲ（medusa）から単離された(Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969;Inouye et al., 1994)。同定され、記載されたその他の発光タンパク質はクリシン（clytin）、ミトロコミン（mitrocomin）(Fagan et al., 1993)およびオベリン（obelin）(Illarionov et al., 1995)である(Inouye et al., 1993)。
【０００５】
表１：いくつかの発光タンパク質の概略
表には、名前、単離タンパク質の由来生物、データベース登録の識別番号(Acc. No.)を示す。
【０００６】
表２：幾つかの発光タンパク質の概略
表には、単離タンパク質の由来生物、発光タンパク質の名前および特許および出願の選択を示す。
【０００７】
生物発光は、現在、広範で多様な方法における技術、例えば環境汚染のバイオインジケーターの形態で、あるいは生化学的にタンパク質を感度よく検出するためかまたは特定化合物を定量するため、あるいは細胞内での遺伝子調節の研究に関するレポーターと呼ばれるものとして使用される。
【０００８】
発光タンパク質は、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列においてだけではなく、それらの生物化学的および物理特性においても異なる。
【０００９】
発光タンパク質の物理的および生物化学的特性は、これらのタンパク質のアミノ酸配列を変えることによって変化し得ることが示されてきた。突然変異した発光タンパク質の例示は、文献(US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986)に記載されている。
【００１０】
上記発光タンパク質は、セレンテラジン（coelenterazine）を酸化することによって発光する(Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999)。
【００１１】
レポーターシステム
一般的に、簡単な生物化学的方法または組織化学的方法を用いて、遺伝子産物を容易に検知し得る遺伝子は、レポーター遺伝子またはインジケーター遺伝子と呼ばれる。少なくとも２つの型のレポーター遺伝子が分類される。
【００１２】
１．耐性遺伝子。これは、その発現により、耐性遺伝子がなければ細胞死へと導く成長培地中に存在する抗生物質またはその他の物質に対して耐性を細胞に与える遺伝子に使用される用語である。
２．レポーター遺伝子。レポーター遺伝子の製品は、融合されたまたは融合されていないインジケーターとして、遺伝子操作において使用される。最も一般的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ(Alam et al., 1990)、アルカリフォスファタ−ゼ(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992)およびルシフェラーゼおよび他の発光タンパク質(Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)が包含される。
【００１３】
可視スペクトルの範囲における光量子の放出は、励起した放出分子によって作用される放出によるもので、発光と呼ばれる。蛍光とは対照的に、この場合、該エネルギーは短波長の発光の形で外部から供給されるものではない。
【００１４】
化学発光と生物発光とは区別される。励起電子が基底状態へと戻る場合にそれ自体が発光する励起分子によりもたらされる化学反応は、化学発光と呼ばれる。該反応が酵素によって触媒される場合に、該現象は、生物発光であると言われる。この反応に関与する酵素が、一般的にルシフェラーゼと呼ばれる。
【００１５】
クリティア・グレガリア種の分類
口刺胞動物門（Cnidaria）→軟クラゲ目（Leptomedusae）→ウミサカズキガヤ科（Campanulariidae）→クリティア・グレガリア
このクリティア・グレガリア種は、口刺胞動物門、具体的にはクラゲに属する。生物発光および蛍光の表現型は、1998年(Ward et al., 1998)にはすでに記載されていた。
【００１６】
cＤＮＡの単離
クリティア・グレガリア種の生物発光活性を調べるために、試料を白海(Kartesh Biological Station, Russia)で採集し、液体窒素中に貯蔵した。クリティア・グレガリアのcＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ(ａ)＋ＲＮＡを、Novagen (USA)の"Straight A"単離法を用いて単離した。
【００１７】
ＲＴ−ＰＣＲを、cＤＮＡを調製するために実施した。ＲＴ−ＰＣＲのために、ＲＮＡ（１μg）を、下記スキームに従って逆転写酵素(Superscript Gold II)と共にインキュベートした。
【表１】
【００１８】
この反応産物を、ポリメラーゼを不活性化するために３７℃で３０分プロテアーゼＫと共にインキュベートし、cＤＮＡをエタノールで沈殿させた。cＤＮＡ発現ライブラリーを、製造者指示書に従ってClontech (USA) "SMART cＤＮＡ"ライブラリー構築キットを用いて構築した。cＤＮＡを、発現ベクターpTriplEx2 (Clontech; USA)にクローニングした。発現ベクターを、エレクトロポレーションによってE.coli XL1 blue株の細菌に形質転換した。
【００１９】
該細菌を固体ＬＢ栄養培地上で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、レプリカプレーティングを行い、該細菌を、ニトロセルロースフィルターを用いて別の固体栄養培地プレートに移した。レプリカプレートを順に３７℃で２４時間インキュベートし、増殖させた細菌のコロニーを液体ＬＢ培地に移した。ＩＰＴＧ(終濃度、０.１ｍＭ)が添加された後、該細菌を３７℃で４時間振とう器上でインキュベートした。該細菌を遠心分離により集菌し、細菌塊を０℃で破砕緩衝液(５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９.０) (０.５ml）に再懸濁した。次いで、該細菌を超音波処理によって破砕した。
【００２０】
セレンテラジン（終濃度、１０Ｅ−０７Ｍ)を添加した後、溶解物を４℃３時間でインキュベートした。次いで、生物発光を塩化カルシウム(終濃度、２０ｍＭ)添加後にルミノメーターで測定した。
発光タンパク質を同定した。その発光タンパク質をmtクリシンと呼ぶ。発光タンパク質mtクリシンは、次に詳細に説明される。
【００２１】
mtクリシン
発光タンパク質mtクリシンは、クリティア・グレガリア由来のクリシンとアミノ酸レベルで最も高い相同性を示す８７％の同一性を有し、オベリア・ジェニキュラタ(実施例８に示される；図８）由来のオベリンと７７％の同一性を有す。クリシンに対する８７％の相同性はタンパク質のＣ末端で生じ、複数のアミノ酸置換は全タンパク質にわたって分散して同定され得る。核酸レベルでは、同一性は３０％よりも低い(実施例７；図７に示される)。ＢＬＡＳＴ法（Altschul et al., 1997)を配列比較に使用した。
【００２２】
発光タンパク質クリシン-２は、アミノ酸レベルでクリティア・グレガリア由来のクリシンと最も高い相同性を示す。しかし、配列は、実施例１１(図９）に示されたこれらの相違を有し、アミノ酸配列中に多くの相違を示す。これらの相違は、物理化学、生物化学および生物発光特性の変化を導き得る。発光タンパク質クリシン-２は、いずれのシグナルペプチドをも有さない(実施例１０に示したとおりである)。
【００２３】
発光タンパク質mtクリシンは、ミトコンドリアへ輸送させるように発光タンパク質を導き得るシグナルペプチドを有する。そのシグナルペプチドは、コンピュータープログラムＭＩＴＯＰＲＯＴによって同定された(Claros et al., 1996) (実施例１０に示される)。ＭＩＴＯＰＲＯＴによって決定されたシグナルペプチドは、配列番号：３に示される。発光タンパク質mtクリシンは、ミトコンドリアへの輸送のための天然のシグナルペプチドが同定された最初の発光タンパク質である。
【００２４】
本発明は、mtクリシンの機能的等価物にも関する。機能的等価物とは、同等の物理化学特性を持ち、配列番号：２と少なくとも７０％の相同性であるタンパク質である。好ましくは、少なくとも８０％または９０％の相同性を示すものである。少なくとも９５％の相同性が特に好まれる。
【００２５】
本発明は、mtクリシン シグナルペプチドの機能的等価物にも関する。機能的等価物とは、同等の物理化学特性を持ち、配列番号：３に対して少なくとも７０％の相同性であるそれらのタンパク質またはペプチドである。好ましいものは、少なくとも８０％または９０％の相同性を与えるものであ。少なくとも９５％の相同性が特に好ましい。
【００２６】
発光タンパク質mtクリシンは、レポーター遺伝子として、細胞系、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクターまたは誘導系に使用されるのが適当である。
【００２７】
また、mtクリシンシグナルペプチドは、細胞系、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクターまたは誘導系に対する融合レポーター遺伝子として使用されるために、レポーター遺伝子に融合されるのが適当である。
【００２８】
また、発光タンパク質mtクリシンは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアを、標識、同定および特性分析することにより、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００２９】
また、mtクリシン シグナルペプチドは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアへの輸送のために、ペプチドまたはタンパク質に融合されるのが適当である。
【００３０】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアの内外のパラメーター、特にカルシウム濃度を決定するために、レポーター遺伝子として使用されるのがまた適当である。
【００３１】
また、mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアの内外のパラメーター、特にカルシウム濃度を決定するために、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３２】
発光タンパク質mtクリシンは、細菌および真核生物系、特に哺乳動物細胞、細菌、酵母、バキュロおよび植物においてレポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３３】
発光タンパク質mtクリシンは、レポーター遺伝子として、生物発光または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼまたはホスファターゼを用いる系とを組合せた細胞系に使用されるのが適当である。
【００３４】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、生物発光または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼまたはホスファターゼを用いる系とを組合せた細胞系にレポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３５】
発光タンパク質mtクリシンは、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクター、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質および糖タンパク質に融合ペプチドとして使用されるのが適当である。
【００３６】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして使用されるために、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクター、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスファチジルエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質および糖タンパク質のための融合タンパク質ペプチドとして使用されるのが適当である。
【００３７】
発光タンパク質mtクリシンは、特に抗体、ビオチンまたは磁性または磁化し得る支持体によって固定されるのに適当である。
【００３８】
発光タンパク質mtクリシンは、エネルギー転位系、特にＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)、ＢＲＥＴ(生物発光共鳴エネルギー転位：fluorescence resonance energy transfer)、ＦＥＴ(フィールド効果トランジスター）、ＦＰ(蛍光分極化)およびＨＴＲＦ(均一時間分解蛍光)系のためのタンパク質として使用されるのが適当である。
【００３９】
発光タンパク質mtクリシンは、基質またはリガンド、特にプロテアーゼ、キナーゼまたはトランスフェラーゼを標識するのに適当である。
発光タンパク質mtクリシンは、細菌系で発現されるため、特に滴定量決定のため、生物化学系の基質、特にプロテイナーゼとキナーゼのための基質として適当である。
【００４０】
発光タンパク質mtクリシンは、標識として、特に抗生物質と結合した、酵素と結合した、受容体と結合した、またはイオンチャンネルおよび他のタンパク質と結合した標識として使用されるのが適当である。
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、特に抗生物質に結合した、酵素に結合した、受容体に結合したまたはイオンチャンネルおよび他のタンパク質に結合した標識として使用されるのが適当である。
【００４１】
発光タンパク質mtクリシンは、医薬活性化合物の探索、特にＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング)において、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
mtクリシン シグナルペプチドは、医薬活性化合物の探索、特にＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング)において、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００４２】
発光タンパク質mtクリシンは、検出系の成分として、特にＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)、免疫組織化学、ウェスタンブロッティングまたは共焦点顕微鏡検査法に対する検出系の成分として使用されるのが適当である。
【００４３】
発光タンパク質mtクリシンは、相互作用、特にタンパク質-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用またはＲＮＡ-タンパク質相互作用(ＤＮＡ:デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸)を分析するための標識として使用されるのが適当である。
【００４４】
発光タンパク質mtクリシンは、遺伝子導入生物、特にマウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚、虫または植物における発現のための標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４５】
mtクリシン シグナルペプチドは、遺伝子導入生物、特にマウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚、虫または植物における発現のための標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４６】
発光タンパク質mtクリシンは、胚発生を分析するのに標識または融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００４７】
発光タンパク質mtクリシンは、カップリングメディエーター、特にビオチン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）またはＣＮ−Ｂｒを介する標識として使用されるのが適当である。
【００４８】
発光タンパク質mtクリシンは、核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡに結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００４９】
発光タンパク質mtクリシンは、タンパク質またはペプチドと結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５０】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、タンパク質またはペプチドと結合されるレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５１】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞内外のカルシウム濃度を測定するためのレポーターとして使用されるのが適当である。
【００５２】
発光タンパク質mtクリシンは、細胞系におけるシグナルカスケードを特徴分析するために適当である。
【００５３】
核酸またはペプチドと結合された発光タンパク質mtクリシンは、特にノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、核酸配列決定、タンパク質分析またはチップ分析のためのプローブとして使用されるのが適当である。
【００５４】
発光タンパク質mtクリシンは、医薬製剤、特に感染物質、抗体または「小分子」を標識するために使用されるのが適当である。
【００５５】
発光タンパク質mtクリシンは、地質調査、特に海、地下水および川に使用されるのが適当である。
【００５６】
発光タンパク質mtクリシンは、発現系、特にイン・ビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系および真核生物系において発現するために適切である。
【００５７】
mtクリシン シグナルペプチドは、融合ペプチドとして、発現系、特にイン・ビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系および真核生物系において発現されるのに適当である。
【００５８】
発光タンパク質mtクリシンは、外科的介入、特に侵襲性、非侵襲性および最小の侵襲性介入との関連において、組織または細胞を可視化するために適当である。
【００５９】
発光タンパク質mtクリシンは、特に組織学的調査および外科的介入との関連において腫瘍組織およびその他の表現型的に変化した組織を標識するためにも適当である。
【００６０】
本発明は、特に野生型タンパク質、融合タンパク質および突然変異タンパク質として発光タンパク質mtクリシンの精製にも関する。
【００６１】
本発明は、特に野生型タンパク質、融合タンパク質および突然変異タンパク質としてmtクリシン シグナルペプチドの精製にも関する。
【００６２】
本発明は、化粧品の分野、特に入浴剤、ローション、ソープ、身体用染料、歯磨き粉および身体用パウダーにおける、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６３】
本発明は、染色のため、特に食材、入浴剤、インク、服飾およびプラスチックを染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６４】
本発明は、紙、特にグリーティングカード、紙類製品、壁紙および手工芸物品を染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６５】
本発明は、液体、特に水鉄砲、噴水、飲料および氷を染色するための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６６】
本発明は、装身物を製造するための、特にマニキュア（finger dye）および化粧品製造のための、発光タンパク質mtクリシンの使用にも関する。
【００６７】
本発明は、配列番号：２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００６８】
本発明は、配列番号：３に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００６９】
本発明は、配列番号：６に示されるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７０】
本発明は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７１】
本発明は、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７２】
本発明は、配列番号：６アミノ酸配列に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００７３】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列番号：１と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：１と少なくとも６５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に関する。
【００７４】
本発明は、配列番号：１または配列番号：５と、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％または６０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の特性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７５】
本発明は、配列番号：４と、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％または６０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの特性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００７６】
本発明は、配列が、発光タンパク質をコードしている配列またはリーダーまたはシグナル配列をコードしている配列に対して５'側の機能プロモーターを含有する上記核酸分子に関する。
【００７７】
本発明は、先に記載した組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの構成物質である核酸分子にも関する。
【００７８】
本発明は、かかるベクターを担持する生物に関する。
本発明は、本発明のmtクリシン分子または他の分子のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と同一または相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００７９】
本発明は、先に記載したヌクレオチド配列によってコードされた発光タンパク質に関する。
【００８０】
本発明は、細菌、真核細胞またはイン・ビトロ発現系において本発明の発光タンパク質ポリペプチドを発現するための方法に関する。
【００８１】
本発明は、本発明の発光タンパク質ポリペプチドを精製する／単離するための方法にも関する。
【００８２】
本発明は、本発明の発光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【００８３】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００８４】
本発明は、標識またはレポーターとして、またはマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、本発明の発光タンパク質または発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００８５】
本発明は、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、発光タンパク質mtクリシンの使用、あるいは標識もしくはレポーターとしてまたは標識もしくはレポーター遺伝子としての発光タンパク質mtクリシン (配列番号：２)をコードする核酸の使用に関する。
【００８６】
本発明は、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、配列番号：１を示す核酸の使用に関する。
【００８７】
本発明は、特に活性化合物および診断薬を探索するための、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、配列番号：６に記載のペプチドおよびその基礎を為す核酸配列の配列番号：５の使用に関する。
【００８８】
本発明は、本発明のポリペプチドを認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
【００８９】
本発明は、発光タンパク質mtクリシン (配列番号：２)または発光タンパク質クリシン-２(配列番号：６)を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体にも関する。
【００９０】
本発明は、発光タンパク質mtクリシンのシグナルペプチド(配列番号：３)を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体にも関する。
【００９１】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：４に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を示すペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子；
ｆ）配列番号：４と少なくとも６５％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子、
からなる群からさらに選択される核酸分子に関する。
【００９２】
同様に、本発明は、
ａ）配列番号：６によって示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：５に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：５と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：５と少なくとも８０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に関する。
【００９３】
本発明は、コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する、前段落に記載したとおりの核酸に関する。
【００９４】
本発明は、先に記載した核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターに関する。
【００９５】
同様に、本発明は、先に記載したベクターを担持する生物に関する。
【００９６】
本発明は、先に記載した核酸分子の構成配列と同一かまたは相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００９７】
本発明は、先に記載した核酸配列によってコードされるポリペプチドに関する。
【００９８】
本発明は、細菌、ウイルス細胞、酵母または真核細胞において、またはイン・ビトロ発現系において、上記ポリペプチドを発現するための方法にも関する。
【００９９】
本発明は、本発明のポリペプチドを精製/単離するための方法に関する。
【０１００】
本発明は、発光タンパク質mtクリシンに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドにも関する。
【０１０１】
さらに、本発明は、発光タンパク質クリシン-２に対する抗体により免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１０２】
本発明は、配列番号：３に示されたシグナルまたはリーダーペプチドに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１０３】
本発明は、配列番号：６(クリシン-２)に示された発光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチドにも関する。
【０１０４】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、本発明の核酸の使用に関する。
【０１０５】
本発明は、標識またはレポーターとして、本発明の発光タンパク質の使用に関する。
【０１０６】
本発明はさらに、シグナルまたはリーダー配列として、配列番号：４に記載の配列または配列番号：４と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含有する核酸の使用に関する。
【０１０７】
本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドとして、配列番号：３に記載の配列または配列番号：３と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含有するペプチドの使用にも関する。
【０１０８】
同様に、本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドと融合されたタンパク質を細胞オルガネラに輸送するための、２つの前段落で述べられている使用に関する。
【０１０９】
本発明は、細胞オルガネラがミトコンドリアである前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１０】
本発明は、細胞オルガネラが小胞体(ＥＲ)である前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１１】
本発明は、シグナルまたはリーダー配列として、配列番号：４に記載される核酸配列のさらなる使用に関する。
【０１１２】
本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドとして、配列番号：３に示され、そしてこの配列を含有するペプチドの使用にも関する。
【０１１３】
同様に、本発明は、シグナルまたはリーダーペプチドと融合されたタンパク質を細胞オルガネラに輸送するための２つの前段落に述べられている使用に関する。
【０１１４】
本発明は、細胞オルガネラがミトコンドリアである前段落において述べられている使用にも関する。
本発明は、細胞オルガネラが小胞体（ＥＲ）である前段落において述べられている使用にも関する。
【０１１５】
同様に、本発明は、医薬活性化合物の探索において、レポータータンパク質として本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１１６】
最終的に、本発明は、医薬活性化合物の探索において、レポーター遺伝子として、本発明の核酸の使用にも関する。
【０１１７】
本発明の発光タンパク質の発現
遺伝子が適当な宿主細胞中に導入された後、発現ベクター中にクローニングされた外来遺伝子を転写および翻訳し得る分子の産生が発現と呼ばれる。発現ベクターは、原核生物または真核細胞において遺伝子を発現するために必要とされるコントロールシグナルを含有する。
【０１１８】
基本的には、発現ベクターは２つの異なる方法で構築される。転写融合と呼ばれる場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、オーセンティックな生物学的に活性なタンパク質として合成される。この目的のために、発現ベクターは、発現に必要とされる全ての５'および３'側にコントロールシグナルを担持する。
【０１１９】
翻訳融合と呼ばれるものの場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、ハイブリッドタンパク質として、簡単に検出され得る別のタンパク質と共に発現される。発現に必要とされる５'および３'側のコントロールシグナルは、開始コドンとおそらく、形成されるべきハイブリッドタンパク質のＮ末端領域をコードする配列の一部を包含するもので、ベクターに由来する。付加的に挿入されたタンパク質部分は、多くの場合に、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質を細胞性プロテアーによる分解に対して安定化させるだけでなく、形成されるハイブリッドタンパク質を検出および単離するために使用され得る。発現は、一過的または安定的に起こる。適当な宿主生物は、細菌、酵母、ウイルスまたは真核生物系である。
【０１２０】
本発明の発光タンパク質の精製
タンパク質の単離(それらがさらに過剰発現した後)は、しばしばタンパク質精製と呼ばれる。多くの確立された方法は、タンパク質を精製するために利用し得る。
【０１２１】
固体/液体分離は、タンパク質を単離することに関連した基本操作である。この手順のステップは、細胞を培養培地から分離する時、細胞を破砕させ、細胞破砕物を除去した後に粗製抽出物を清澄する時、および沈殿化後に沈殿物を分離する時に必要とされる。それは、遠心分離および濾過によって行う。
【０１２２】
細胞内タンパク質を得るために、細胞壁は、破壊されるかまたは透過し得るようにされるべきである。高圧ホモゲナイザーまたは攪拌ボールミルまたはガラスビーズは、スケールや生物によって、この目的のために使用される。機械的な細胞インテグレーション(Mechanical cell integrations)および超音波処置が、とりわけ研究室スケールに対して使用される。
【０１２３】
細胞外タンパク質および細胞内タンパク質(細胞破砕後)の両方の場合、塩類(特に、硫酸アンモニウム)または有機溶媒(アルコールまたはアセトン)を用いる様々な沈殿方法は、タンパク質を濃縮するための迅速かつ有効な方法を示す。細胞内タンパク質が精製される場合、可溶性核酸を除去すること（例えば、硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミンによる沈殿）が望ましい。細胞外性タンパク質が単離される場合、担体（例えば、スターチまたは珪藻土）は、取扱いが容易な沈殿物を得るために、沈降剤を添加する前に添加されることが多い。
【０１２４】
多くのクロマトグラフィー法および分配方法(吸収クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーおよび電気泳動)は、高度な精製のために利用し得る。カラムクロマトグラフィーは、工業的スケールで使用される。ステップあたりの精製係数を数１００sまで上げることが可能であるアフィニティークロマトグラフィーは、研究室スケールでは特に重要である。
【０１２５】
細胞外タンパク質は、相対的に希薄な溶液中に存在する。細胞外タンパク質と同様に、それらは、さらなる使用に供する前に濃縮されるべきである。すでに記載された方法に加えて、限外濾過は工業スケールとしても価値のあるものと証明されてきた。
【０１２６】
タンパク質を伴う無機塩は、特定の用途には好ましくないことが多い。
【０１２７】
それらは、特にゲル濾過、透析および膜分離精製によって除去され得る。
【０１２８】
多くのタンパク質は乾燥調製物として使用される。重要な乾燥方法は、真空乾燥、凍結乾燥および噴霧乾燥である。
【０１２９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
発光タンパク質mtクリシンは、次のヌクレオチド配列(配列番号：１）によってコードされる:
５'- gacagataaaaaattcactccttagattatttagtgaataagagaaaaaaaggataagaaatcaagatgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgcaagatcaagattgcaacgcacggcaaattttcacaccagcatactcttggctacagattcaaaatacgcggtcaaactcgatcctgattttgcaaatccaaaatggatcaacagacacaaatttatgttcaactttttggacataaacggtaaggggaaaatcacattagatgaaatcgtctccaaagcttcagacgacatttgtgctaaactggatgcaacaccagaacagaccaaacgtcaccaggatgctgttgaagcctttttcaagaaaatgggcatggattatggtaaagaagttgcattcccagaatttattaagggatgggaagagttggccgaacacgacttggaactctggtctcaaaacaaaagtacattgatccgtgaatggggagatgctgttttcgacattttcgacaaagacgcaagtggctcaatcagtttagacgaatggaaggcttacggacgaatctctggaatctgtccatcagacgaagacgctgagaagacgttcaaacattgtgatttggacaacagtggcaaacttgatgttgatgagatgaccaggcaacatttaggcttctggtacacattggatccaacttctgatggtctttatggcaattttgttccctaagaagcgttcagttaaaaacgctaaacattgttcagttgtaaaattatattcattttcatttcgtaaaattagtatttataaatttgtatcataaattgtatccatgttgtagactaaataagactcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa -３'。
【０１３０】
この配列により、(配列番号：２)のアミノ酸配列を生じる:
MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRHKFMFNFLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGMDYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLDEWKAYGRISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDGLYGNFVP。
【０１３１】
発光タンパク質mtクリシンの推定シグナルペプチドは、次の配列(配列番号：３):ＭＱＲＦＴＮＲＬＬＳＭＳＡＬＲＡ
を持ち、
次の核酸配列:
５’−atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgca −３’(配列番号：４)を有する。
発光タンパク質クリシン-２は、次のヌクレオチド配列（配列番号：５)によってコードされる:
５'- GATCTCAGCTCAACTTGCAATAAGTATCAGATCAAATTTTGCAACTCAAAGCAAATCATCAACTTCATCATAATGACTGACACTGCTTCAAAATACGCTGTCAAACTCAAGACCAACTTTGAAGATCCAAAATGGGTCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATTAACGGCAACGGAAAAATCACTTTGGATGAAATTGTCTCCAAAGCTTCGGATGACATTTGCGCCAAACTTGGAGCTACACCAGCTCAAACCCAACGTCATCAGGAAGCTGTTGAAGCTTTCTTCAAGAAGATTGGTTTGGATTATGGCAAAGAAGTCGAATTCCCAGCTTTCGTTAACGGATGGAAAGAACTGGCCAAACATGACTTGAAACTTTGGTCCCAAAACAAGAAATCTTTGATCCGCAATTGGGGAGAAGCTGTATTCGACATTTTCGACAAGGACGGAAGTGGCTCAATCAGTTTGGACGAATGGAAAACATACGGAGGAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACGAAGACGCTGAAAAGACCTTCAAACATTGCGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGACGAGATGACCAGACAACATTTGGGATTCTGGTACACCTTGGACCCTAACGCTGATGGTCTTTATGGCAACTTTGTCCCTTAAAAACTTTTTTTGCTGTAAATTCTTTACGGGTTATTTTTTCATAATTGTCATTTGATTTTAACTTTGTTTCGGAAAATGAAAAATATTCTTTATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - ３'。
【０１３２】
この配列により、(配列番号：６)のアミノ酸配列を生じる：
MTDTASKYAVKLKTNFEDPKWVNRHKFMFNFLDINGNGKITLDEIVSKASDDICAKLGATPAQTQRHQEAVEAFFKKIGLDYGKEVEFPAFVNGWKELAKHDLKLWSQNKKSLIRNWGEAVFDIFDKDGSGSISLDEWKTYGGISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPNADGLYGNFVP。
これらの配列は配列表に再現される。
【０１３３】
実施例
実施例１
Clontech plasmid pTriplE ｘ２を、下記に述べる構築体を調製するためのベクターとして使用した。ベクターの誘導体をpTriplEx2-mtクリシンと称す。ベクター pTriplEx2- mtクリシン を細菌系においてmtクリシンを発現するために使用した。図１は、ベクター pTriplEX2-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【０１３４】
実施例２
Clontech plasmid pcＤＮＡ3.1(＋)を、下記に述べる構築体を調製するためのベクターとして使用した。ベクターの誘導体をpcＤＮＡ3-mtクリシンと称する。ベクター pcＤＮＡ3-mtクリシン を、真核生物系においてmtクリシン を発現するために使用した。図２は、ベクター pcＤＮＡ３- mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【０１３５】
実施例３
細菌発現
細菌的発現は、Ｅ．coli 株 BL21(DE3) において、発現プラスミドpTriplEX2- mtＣlytin および pTriplEX2を用いて細菌を形質転換することによって行った。形質転換細菌を、ＬＢ培地で３７℃で３時間インキュベートし、発現を１ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加して４時間誘導した。誘導された細菌を、遠心分離により集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ ９．０)＋５ ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、超音波処理により破砕した。溶解物を、１３.０００ rpm (１６０００ ref)で１５分間遠心分離し、上清を取出した。上清(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０を用いて１：５、１：１０；１：２０および１：５０希釈)を、セレンテラジン(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０中１０Ｅ−０７Ｍセレンテラジン)と共に、３時間暗所でインキュベートした。生物発光を、５ｍＭ塩化カルシウムを添加した後、ルミノメーターで直接測定した。測定集積時間は４０秒であった。
図３は、細菌中のmtクリシンの生物発光の測定結果を示す。
【０１３６】
実施例４
真核生物系の発現
構成的真核生物系発現を、ＣＨＯ細胞で為した。一過的発現において発現プラスミド pcＤＮＡ３- mtＣlytin および pcＤＮＡ3.1(＋)を用いて、細胞を形質転換した。このために、ウェルあたり１００００個の細胞を、９６-ウェルマイクロタイタープレート上のＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に播種し、プレートを終夜３７℃でインキュベートした。形質転換を、製造指示書に従ってＦｕ遺伝子６キット(Roche)を用いて為した。形質転換細胞を、終夜ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地において３７℃でインキュベートした。次いで、培地を除去し、セレンテラジン(ＰＢＳ中１０Ｅ ０７Ｍ セレンテラジン)（５０ μl）で置換した。細胞を、３７℃３時間でインキュベートし、ＡＴＰ(アデノシン３リン酸)を終濃度１μＭまで添加した。ルミノメーターにおける測定を添加後に直接開始した。積算時間は１秒であり、総測定時間は６０秒であった。
図４は、ＣＨＯ細胞中のmtクリシンの生物発光の測定結果を示す。
【０１３７】
実施例５
ＢＬＡＳＴ
アミノ酸レベルでのmtクリシンＢＬＡＳＴ分析の結果：
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６５５．１|未詳タンパク質産物［Clytia gregaria］、長さ＝１９８、スコア＝３６８bits (９４５)、期待数＝ｅ−１０１、同一性＝１７１/１９５(８７％)、陽性＝１８２/１９５(９２％)。
＞ｓｐ｜Ｑ０８１２１｜ＣＬＹＴ＿ＣＬＹＧＲ Clytin 前駆体(Phialidin)、ｐｉｒ｜｜Ｓ２８８６０ ｃｌｙｔｉｎ - ヒドロクラゲ (Clytia gregarium)、ｅｍｂ｜ＣＡＡ４９７５４．１｜ ｃｌｙｔｉｎ ［Ｃｌｙｔｉａ ｇｒｅｇａｒｉａ]、ｇｂ｜ＡＡＡ２８２９３．１｜ アポクリシン(apoclytin）、長さ＝１９８、スコア＝３６８ bits (９４５)、期待数＝ e−１０１、同一性＝１７１/１９５(８７％)、陽性＝１８２/１９５(９２％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６５８．１|未詳タンパク質産物 [合成構築体]、長さ＝１９８、スコア＝３６７ bits (９４３)、期待数＝ｅ−１０１、同一性＝１７０/１９５(８７％)、陽性＝ １８２/１９５(９３％)
＞ｓｐ｜Ｑ２７７０９|ＯＢＬ＿ＯＢＥＬＯ オベリン前駆体(OBL)、ｐｄｂ｜１ＥＬ４｜Ａ鎖、カルシウム調節発光タンパク質オベリンの構造、Sulfur Sas, ｇｂ｜ＡＡＡ６７７０８．１｜未詳タンパク質産物により決定、長さ＝１９５、スコア＝３２７ bits (８３７)、期待数＝1ｅ−８８、同一性＝１５０/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７４．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体］、長さ＝１９５、スコア＝３２６ bits (８３５)、期待数＝２ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７２．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体]、長さ＝１９５、 スコア＝３２５ bits (８３４)、期待数＝３ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３（７７％)、陽性＝１７０/１９３（８７％）
＞ｅｍｂ｜ＣＡＤ８７６７３．１｜未詳タンパク質産物［合成構築体]、長さ＝１９５、スコア＝３２５bits (８３３）、期待数＝４ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１７０/１９３(８７％)
＞ｐｄｂ｜１ＪＦ０｜鎖Ａ、Obelia Geniculata由来のオブリン結晶構造 At 1.82 溶解、ｇｂ｜ＡＡＬ８６３７２．１|ＡＦ３９４６８８＿１ アポオブレン（apoobelin）［Obelia geniculata］、長さ＝１９５、スコア＝３２５ bits (８３３)、期待数＝４ｅ−８８、同一性＝１４９/１９３(７７％)、陽性＝１６８/１９３(８６％)
【０１３８】
実施例６
ＢＬＡＳＴ
核酸レベルでのmtクリシンのＢＬＡＳＴ分析の結果：
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１２５．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２３、長さ＝５９７、スコア＝６６９bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１１９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列１７、長さ＝５９７、スコア＝６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜Ｘ７０２２１．１|クリシンに対するＣＧＣＬＹＴＩＮ C.gregaria mＲＮＡ、長さ＝７４７、スコア＝６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｇｂ｜Ｌ１３２４７．１|ＣＹ１ＡＰＯＣＬＹＴ Clytia gregarium のアポクリシンmＲＮＡ、完全なcds、長さ＝７４７、スコア＝ ６６９ bits (３４８)、期待数＝０.０、同一性＝５０４/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８７．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８５、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８５．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８３、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８３．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列８１、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１８１．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列７９、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％）
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１７９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列７７、長さ＝ ５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１３１．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２９、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３／５８２(８６％)
＞ｅｍｂ｜ＡＸ７０２１２９．１｜特許ＷＯ０３００６４９７からの配列２７、長さ＝５９７、スコア＝６６４ bits (３４５)、期待数＝０.０、同一性＝５０３/５８２(８６％)
【０１３９】
実施例７
図７は、核酸レベルでのクリシン(Clytia gregaria)とmtクリシンアラインメントを示す。
【０１４０】
実施例８
図８は、アミノ酸レベルでのクリシン(Clytia gregaria)とmtクリシンアラインメントを示す。
【０１４１】
実施例９
mtクリシンの速度論的分析
mtクリシンの生物発光の速度論的分析のために、ＣＨＯ細胞を、pcＤＮＡ３ mtクリシン または pcＤＮＡオベリン または pcＤＮＡ３(いずれの合成cＤＮＡも含まない)により、一過的に形質転換した。形質転換および測定を、実施例４に記載のとおりに実施した。読み取りを、１秒間の積算時間を用いて６０秒間要した。
図５および６は、mtクリシンとオベリンの速度論的分析の結果を示す。
【０１４２】
実施例１０
ＭＩＴＯＰＲＯＴ分析
コンピュータープログラム ＭＩＴＯＰＲＯＴを使用して、mtクリシン シグナルペプチド (Claros et al., 1996)を分析した。次の発光タンパク質を分析した：オベリン(Q27709)、イクオリン(P07164)、クリシン(Q08121)およびmtクリシン(配列番号：２)。
【０１４３】
分析結果：
オベリン:
配列名：ＯＢＥＬＩＮ
インプット配列長：１９５ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -11
分析領域 : 11
標的配列中の塩基性残基数 : 3
標的配列中の酸性残基数 : 0
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : −
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.624 0.259 -0.308 0.295
MesoH : -1.573 -0.241 -0.642 0.060
MuHd_075 : 14.019 3.641 4.408 1.523
MuHd_095 : 7.994 7.898 3.285 1.838
MuHd_100 : 13.734 9.836 5.597 2.742
MuHd_105 : 21.195 11.755 7.339 4.117
Hmax_075 : -9.450 -2.800 -4.008 1.132
Hmax_095 : -0.963 1.837 -1.971 1.103
Hmax_100 : 0.400 1.300 -1.942 2.240
Hmax_105 : 10.617 6.067 0.733 3.127
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.1479
【０１４４】
イクオリン:
配列名：ＡＥＱＵＯＲＩＮ
インプット配列長: １９６ aa
---------------------------------------------------------
算定パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -13
分析領域 : 3
標的配列中の塩基性残基数 : 0
標的配列中の酸性残基数: 0
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : 0.006 0.794 -0.263 0.368
MesoH : -1.673 -0.382 -0.703 0.048
MuHd_075 : 24.326 4.153 5.947 2.450
MuHd_095 : 12.638 7.213 4.218 1.796
MuHd_100 : 13.748 8.827 4.477 2.427
MuHd_105 : 16.581 11.426 5.056 3.453
Hmax_075 : 0.438 0.233 -2.490 1.692
Hmax_095 : 0.525 -1.400 -2.394 0.674
Hmax_100 : -0.100 -1.200 -2.292 1.550
Hmax_105 : 0.500 -0.000 -2.164 1.540
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.0148
【０１４５】
クリシン:
配列名: ＣＬＹＴＩＮ
インプット配列長: １９８ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -9
分析領域 : 32
標的配列中の塩基性残基数 : 6
標的配列中の酸性残基数: 2
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.429 0.341 -0.313 0.313
MesoH : -1.778 -0.307 -0.718 0.053
MuHd_075 : 32.928 17.509 7.351 5.708
MuHd_095 : 30.874 20.344 9.074 5.834
MuHd_100 : 36.596 22.666 10.051 6.762
MuHd_105 : 39.174 19.336 10.379 7.609
Hmax_075 : 4.900 7.087 -1.223 3.684
Hmax_095 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_100 : 14.000 12.600 1.601 5.060
Hmax_105 : 6.650 13.067 -0.468 3.920
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.2047
【０１４６】
クリシン-２ :
配列名: ＣＬＹＴＩＮ−２
インプット配列長: １９８ aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -7
分析領域 : 16
標的配列中の塩基性残基数 : 3
標的配列中の酸性残基数: 1
開裂部位 : 予測不可
開裂配列 : -
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.288 0.341 -0.213 0.313
MesoH : -1.519 -0.206 -0.681 0.081
MuHd_075 : 32.594 15.092 8.192 4.075
MuHd_095 : 36.090 19.707 8.836 6.716
MuHd_100 : 38.617 20.269 9.682 6.851
MuHd_105 : 30.267 16.082 8.229 5.470
Hmax_075 : 6.533 6.417 -0.793 2.508
Hmax_095 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_100 : 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_105 : 13.417 10.150 1.612 3.862
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.3974
【０１４７】
mtクリシン:
配列名: mtＣlytin
インプット配列長: 228 aa
---------------------------------------------------------
算出パラメーターの値
検索配列の正味電荷 : -8
分析領域 : 34
標的配列中の塩基性残基数 : 6
標的配列中の酸性残基数: 0
開裂部位 : 17
開裂配列 : MQRFTNRLLSMSALRA
---------------------------------------------------------
使用した疎水性スケール
GES KD GVH1 ECS
H17 : -0.135 0.453 -0.343 0.309
MesoH : -1.623 -0.215 -0.701 0.073
MuHd_075 : 33.394 19.322 8.634 7.593
MuHd_095 : 34.726 19.634 8.110 8.861
MuHd_100 : 32.825 16.596 7.376 7.520
MuHd_105 : 28.005 19.893 7.410 7.865
Hmax_075 : 16.683 17.733 2.851 5.763
Hmax_095 : 13.125 13.388 2.299 4.314
Hmax_100 : 8.300 11.500 1.845 3.830
Hmax_105 : 1.700 9.500 -1.171 2.390
---------------------------------------------------------
確率
ミトコンドリアへの輸送確率: 0.9974
分析したペプチドのミトコンドリアへの輸送確率は、計算したファクターアプローチ１を高める。
【０１４８】
オベリン、イクオリン、クリシン、クリシン−２およびmtクリシンのタンパク質配列の分析は、唯一mtクリシンが、ミトコンドリアに輸送され得るタンパク質の機能を有するということを示す。
【０１４９】
実施例１１
図９は、アミノ酸レベルでのmtクリシン、クリシン(Clytia gregaria) および クリシン-タイプ２のアラインメントを示す。
【０１５０】
文献/特許
US 6,495,355
US 5,541,309
US 5,093,240
US-0908909
US 6,152,358
JP-0176125
GB-0024357
WO03006497
WO200168824
【０１５１】
Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1;188(2):245-54
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
Chiesa A, Rapizzi E, Tosello V, Pinton P, de Virgilio M, Fogarty KE, Rizzuto R. Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signalling. Biochem J. 2001 Apr 1;355(Pt 1):1-12.
Claros, M.G., Vincens, P. (1996); Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting seqeunces. Eur. J. Biochem 241, 779-786.
Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology. 216:362ff
Fagan TF, Ohmiya Y, Blinks JR, Inouye S, Tsuji FI. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin. FEBS Lett. 1993 Nov 1;333(3):301-5
Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry of calcium-activated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull. 137, 402.
Haddock SH, Rivers TJ, Robison BH. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Sep 25;98(20):11148-51
Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994 Mar 21;341(2-3):277-80
Inouye S, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. 1993 Jan 11;315(3):343-6.
Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca(2+)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 Feb 14;153(2):273-4.
Jones K, Hibbert F, Keenan M. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Trends Biotechnol 1999 Dec;17(12):477-81
Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds, G.T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85-103.
Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.
Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec;7(6):821-7
Sambrook, J., Fritsch, E. Maniatis, T. 1989, Molecular cloning. A laboratory manual Vol 1-3, Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press
Shimomura O, Johnson FH. Properties of the bioluminescent protein aequorin. Biochemistry 969 ct;8(10):3991-7
Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symp Soc Exp Biol. 1985;39:351-72
Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms of aequorin.
Biochem J. 1986 Mar 1;234(2):271-7.
Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. Am J Physiol. 1984 Nov;247(5 Pt 1):C396-408.
Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In: Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols (Chalfie, M. and Kain, S., eds) pp. 45-70. Wiley-Liss, Inc.
Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ff
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、ベクター pTriplEX2-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【図２】図２は、ベクター pcＤＮＡ3-mtＣlytinのプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、mtクリシンの細菌的発現および細菌的発現後のmtクリシンの生物発光活性の結果を示す(Ｙ＝ＲＬＵ：相対的光ユニット＝希釈；黒の棒線＝mtクリシン；灰色棒線＝コントロールの溶菌物）。
【図４】図４は、mtクリシンの真核生物系発現およびＣＨＯ細胞における発現後のmtクリシンの生物発光活性の結果を示す(Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝ＡＴＰ(mol/lの対数表示）)。
【図５】図５は、mtクリシンの生物発光に関する速度論的分析を示す（Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝時間［秒］）。
【図６】図６は、オベリンの生物発光に関する速度論的分析を示す（Ｙ＝ＲＬＵ：相対的な光ユニット；Ｘ＝時間［秒］）。
【図７】図７は、アミノ酸レベルでのクリシンおよびmtクリシンのアラインメントを示す。
【図８】図８は、核酸レベルでのクリシンおよびmtクリシンのアラインメントを示す。
【図９】図９は、アミノ酸レベルでのクリシンおよびクリシン-２のアラインメントを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：１と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：１と少なくとも６５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：４に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を示すペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：４と少なくとも９０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子；
ｆ）配列番号：４と少なくとも６０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項３】
ａ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：５に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列番号：５と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：５と少なくとも８０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項４】
コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する、請求項１、２または３に記載の核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを担持する生物。
【請求項７】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子の構成的配列と、同一または相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項９】
細菌、ウイルス系、酵母または真核細胞において、またはイン・ビトロ発現系において、請求項８に記載のポリペプチドを発現するための方法。
【請求項１０】
請求項８記載の発光タンパク質ポリペプチドを精製/単離するための方法。
【請求項１１】
発光タンパク質mtクリシンに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１２】
発光タンパク質クリシン-２に対する抗原によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１３】
配列番号：３によって開示されるシグナルまたはリーダーペプチドに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１４】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１５】
標識またはレポーターとしての請求項８に記載の発光タンパク質の使用。
【請求項１６】
シグナルまたはリーダー配列としての配列番号：４に示す配列を含有する核酸の使用。
【請求項１７】
シグナルまたはリーダーペプチドとしての配列番号：３に記載の配列を含有するペプチドの使用。
【請求項１８】
細胞オルガネラ中へ、シグナルまたはリーダーペプチドと融合したタンパク質を輸送するための、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞オルガネラがミトコンドリアまたは小胞体(ＥＲ)である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
医薬活性化合物を探索する際の、レポータータンパク質としての請求項８に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２１】
医薬活性化合物を探索する際の、レポーター遺伝子としての請求項１−３のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１】
ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：１と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：１と少なくとも６５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：４に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を示すペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
ｅ）配列番号：４と少なくとも９０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子；
ｆ）配列番号：４と少なくとも６０％の配列相同性を示し、シグナルまたはリーダーペプチドの生物学的機能を持つペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項３】
ａ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：５に示された配列を含有する核酸分子；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発光タンパク質の生物学的機能を示すポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列番号：５と少なくとも９５％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子；および
ｆ）配列番号：５と少なくとも８０％の配列相同性を示し、発光タンパク質の生物学的機能を持つポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項４】
コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する、請求項１、２または３に記載の核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを担持する生物。
【請求項７】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子の構成的配列と、同一または相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項９】
細菌、ウイルス系、酵母または真核細胞において、またはイン・ビトロ発現系において、請求項８に記載のポリペプチドを発現するための方法。
【請求項１０】
請求項８記載の発光タンパク質ポリペプチドを精製/単離するための方法。
【請求項１１】
発光タンパク質mtクリシンに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１２】
発光タンパク質クリシン-２に対する抗原によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１３】
配列番号：３によって開示されるシグナルまたはリーダーペプチドに対する抗体によって免疫学的に認識される１０をこえる連続するアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１４】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１５】
標識またはレポーターとしての請求項８に記載の発光タンパク質の使用。
【請求項１６】
シグナルまたはリーダー配列としての配列番号：４に示す配列を含有する核酸の使用。
【請求項１７】
シグナルまたはリーダーペプチドとしての配列番号：３に記載の配列を含有するペプチドの使用。
【請求項１８】
細胞オルガネラ中へ、シグナルまたはリーダーペプチドと融合したタンパク質を輸送するための、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞オルガネラがミトコンドリアまたは小胞体(ＥＲ)である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
医薬活性化合物を探索する際の、レポータータンパク質としての請求項８に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２１】
医薬活性化合物を探索する際の、レポーター遺伝子としての請求項１−３のいずれかに記載の核酸の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２７７０８（Ｐ２００７−５２７７０８Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６５４６（Ｐ２００６−５２６５４６）
【出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９８４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５５９
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０３４１２１４８）バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト (206)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９８４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５５９
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０３４１２１４８）バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト (206)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]