反応性複素環置換７−ヒドロキシクマリンおよびその複合体
【解決手段】化学反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素、その生体複合体、およびその使用方法を提供する。
【効果】反応性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素から得られた複合体は、４０５ｎｍでのその強力な吸収と高い蛍光量子収率とに起因して、励起源として紫色レーザーを備えたフローサイトメーターを用いた生物学的化合物を分析に使用され、抗体や核酸プローブなどのバイオポリマー検出試薬用蛍光標識として特に有用である。
【効果】反応性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素から得られた複合体は、４０５ｎｍでのその強力な吸収と高い蛍光量子収率とに起因して、励起源として紫色レーザーを備えたフローサイトメーターを用いた生物学的化合物を分析に使用され、抗体や核酸プローブなどのバイオポリマー検出試薬用蛍光標識として特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性色素および色素複合体を含む蛍光化学物質とその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
分析物特異的蛍光プローブは、サンプル中の分析物の分析に有用な試薬である。分析物は、プローブへの特異的結合を介して標識されるようになり、その標識は、分析物の検出を促進させる。サンプル中の分析物を分析するための蛍光プローブの適用例には、フローサイトメトリーによる細胞の混合物中の細胞の部分母集団の同定および／または分離を含む蛍光免疫測定法、蛍光顕微鏡法、および蛍光染色によるゲル分離された分析物の可視化が含まれる。これらの技法については、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている文献に記述されている（例えば、非特許文献１、２、および３参照）。
【０００３】
上記目的のために蛍光色素を用いる場合、その蛍光色素の選択に影響を及ぼす多くの問題点がある。１つの問題点は、蛍光色素の吸収特性および放出特性であるが、それは、試験中のサンプル、例えば血液、尿、脳脊髄液中の多くのリガンド、受容体、および材料が蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確な決定を妨げることになるからである。この現象を、自己蛍光またはバックグラウンド蛍光と呼ぶ。第２の問題点は、蛍光色素をリガンド、受容体、およびその他の生体材料および非生体材料に複合させる能力と、そのような複合が蛍光色素に及ぼす影響である。多くの状況では、別の分子との複合は、蛍光色素の蛍光特性にかなりの変化をもたらす可能性があり、場合によっては、蛍光色素の量子効率を実質的に破壊しまたは低下させる可能性がある。蛍光色素との複合は、標識される分子の機能を不活性化することになる可能性もある。第３の問題点は、蛍光色素の量子効率であり、これは高感度検出の場合に高いことが好ましい。第４の問題点は、蛍光色素の光吸収能力または吸光係数であり、これは可能な限り大きいことが好ましい。他の問題点は、蛍光分子が非常に近接したときに互いに相互に作用して、自己消光をもたらすことになるか否かである。別の問題点は、蛍光色素が単独でまたはこの蛍光色素が複合している化合物と複合した状態で、その他の化合物または容器壁面と非特異的に結合するか否かである。
【０００４】
上記方法の適用可能性および価値は、適切な蛍光化合物の利用可能性と密接な関係がある。特に、紫色レーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、およびＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）など、商業的に実用可能なレーザー源によって励起される蛍光物質が求められている。アルゴンレーザー（４８８ｎｍ励起）およびＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ励起）用に開発された多くの蛍光色素がある。例えば、４８８ｎｍアルゴンレーザーによって十分励起されるフルオレセインは、緑色領域で有用な発光体である。しかし、４０５ｎｍ紫色レーザーで利用可能な蛍光色素はほとんどない。
【０００５】
あるクマリン色素は、様々な生物学的検出の適用例に対する有用性が実証されている。例えば、文献を参照されたい（例えば、Ｍｉｌｌｅｒらの特許文献１；Ｇｅｅらの特許文献２；およびＲｏｂｉｎｓｏｎの特許文献３参照）。フルオレセイン、ローダミン、およびシアニンなどのその他の蛍光色素と比較すると、多くのクマリン色素は、ある有利な性質を有する。より小さいサイズのクマリン色素は、色素標識抗原特異的試薬の親和性および特異性に対する色素の影響を、最小限に抑える。さらに、より小さいクマリンは、フルオレセイン、ローダミン、およびシアニンよりも高い標識効率を有する。それにも関わらず、多くのクマリン色素は、それらの強力な疎水性および高いｐＫａに起因する、タンパク質と複合したヒドロキシルクマリン色素の蛍光の極度の消光など、ある欠点を共有することが知られている。クマリン蛍光消光は、自己消光（クマリンタグ間の距離が近い。）および／または電子に富むアミノ酸残基（ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシン）による消光から生ずる。さらにクマリンの、４０５ｎｍでの典型的に弱い吸収は、一部のフローサイトメーターで使用されるような紫色励起レーザーを使用した、細胞を分析するためのその用途を大幅に制限する。
【０００６】
塩素化クマリンは、小さい有機分子を標識するのに使用されてきた（例えば、非特許文献４および特許文献４参照）。小さい有機分子の標識では、単一のクマリン分子しか各複合体中に存在しないので、自己消光も基質による消光も重大な問題ではない。対照的に、抗体の標識では、多数の色素分子を各抗体に複合させることが望ましいので、自己消光および基質による消光は共に重大な関心事である。一般に、クマリンまたはフルオレセインの塩素化は、いわゆる「重原子効果」および高い疎水性に起因して、不十分な抗体標識をもたらす可能性があると見なされる（例えば、Ｐａｒｋらの特許文献５；Ｇｅｅらの特許文献２；ＴｓｉｅｎおよびＺｌｏｋａｒｎｉｋの特許文献６：および非特許文献５参照）。
【０００７】
ある文献は（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００８年７月２９日出願の同時係属の特許文献７参照）、複数のモノ塩素化７−ヒドロキシクマリン色素に複合した抗体と、生物学的アッセイでのその使用について記述している。これらのモノ塩素化ヒドロキシクマリン色素は、抗体当たり多数の色素を有する抗体標識として使用したときに、思いがけなく低下した自己消光を示す。これらの色素標識抗体は、典型的には、４０５ｎｍ近くで吸光度の最大値を示し、青色の最大放出を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６２０７４０４号明細書
【特許文献２】米国特許第５８３０９１２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９５６４８０号明細書
【特許文献４】米国特許第５９５５６０４号明細書
【特許文献５】米国特許第５５１６６２９号明細書
【特許文献６】米国特許第６４７２２０５号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１２／２２０９３９号明細書
【特許文献８】米国特許第５５３９０８２号明細書
【特許文献９】米国特許第５５８０９９０号明細書
【特許文献１０】米国特許第５７１４３２７号明細書
【特許文献１１】米国特許第５９８５５６６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６５６６５０８号明細書
【特許文献１３】米国特許第５０４７５１９号明細書
【特許文献１４】米国特許第４７１１９５５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５６８４１４２号明細書
【特許文献１６】米国特許第５６５９０２５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５６６８２６８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５６７９７８５号明細書
【特許文献１９】米国特許第６１５０５１０号明細書
【特許文献２０】米国特許第５２０８１４８号明細書
【特許文献２１】米国特許第５４０５９７５号明細書
【特許文献２２】米国特許第５４５３５１７号明細書
【特許文献２３】米国特許第５５１６９１１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５０４９６７３号明細書
【特許文献２５】米国特許第５６４８２７０号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Herzenberg et al., "CELLULAR IMMUNOLOGY" 3rd ed., Chapter 22; Blackwell Scientific Publications (1978)
【非特許文献２】Goldman, "FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS" Academic Press, New York, (1968)
【非特許文献３】Taylor et al., APPLICATIONS OF FLUORESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES, Alan Liss Inc., (1986)
【非特許文献４】Zlokarnil et al., 1998, Science 279:84
【非特許文献５】Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 9th ed., pp 7-74, 2002
【非特許文献６】Katritzky,Alan R., Charles W.Ress,およびColin J.Drayton. 1984. Comprehensive heterocyclic chemistry: the structure, reactions, synthesis, and use of heterocyclic compounds. Volume 8, Part 6. Indexes. Oxford [Oxfordshire]: Pergamon Press.
【非特許文献７】Dittmer et al. 2005, J.Org.Chem. 70: 4682
【非特許文献８】Shi et al., 2005, Fen Xi Hua Xue 33: 1452
【非特許文献９】Sivakumar et al., 2004, Org.Lett 6: 4603
【非特許文献１０】Zhao et al., 2004, J.Am.Chem.Soc. 126: 4653
【非特許文献１１】Huang et al., 1994, J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1:102
【非特許文献１２】KuznetsovaおよびKaliya, 1992, Russ.Chem.Rev. 61: 1243
【非特許文献１３】"A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair." Atamna et al., 2000, Proc Natl Acad Sci 97:686-691
【非特許文献１４】Am.J.Physiol. 256, C540 (1989)
【非特許文献１５】"Single-step synthesis and characterization of biotinylated nitrilotriacetic acid, a unique reagent for the detection of histidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose", McMahan et al., 1996, Anal Biochem 236: 101-106
【非特許文献１６】Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, NY)
【非特許文献１７】Haugland, 1995, Method Mol.Biol. 45: 205-21
【非特許文献１８】Brinkley, 1992, Bioconjugate Chemistry 3:2
【非特許文献１９】Landy et al.,(eds.), Clinical Flow Cytometry, Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677 (1993)
【非特許文献２０】Bauer et al.(eds.), Clinical Flow Cytometry: Principles and Applications, Williams & Wilkins (1993)
【非特許文献２１】Ormerod(ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997)
【非特許文献２２】Jaroszeski et al.(eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No.91, Humana Press (1997)
【非特許文献２３】Practical Shapiro, Flow Cytometry, 4th ed., Wiley-Liss (2003)
【非特許文献２４】Pawley(ed), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1989)
【非特許文献２５】Haugland et al. 1995, Meth.Mol.Biol. 45:205
【非特許文献２６】Haugland, 1995, Meth.Mol.Biol. 45:223
【非特許文献２７】Haugland, 1995, Meth.Mol.Biol. 45:235
【非特許文献２８】Haugland, 2000, Current Protocols In Cell Biology 16.5.1-16.5.22
【非特許文献２９】EstepおよびMiller, 1986, Anal.Biochem. 157: 100-105
【非特許文献３０】M.Nimmakayalu et al., 2000, Biotechniques 28, 518-522
【非特許文献３１】Muhlegger et al., 1990. Biol Chem Hoppe Seyler 371, 953-965
【非特許文献３２】Giaid et al., 1989, Histochemistry 93, 191-196
【非特許文献３３】Maecker et al, 2004, Cytometry Part A 62A: 169-173
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素、および水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素の誘導体であって、反応性色素および色素複合体を含むものを提供する。
【００１１】
本発明の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、これら蛍光色素を、バイオポリマーの標識としての使用を含めた生物学的アッセイでの使用に特に適したものにする性質の新規な組合せを示す。本発明者らは、７−ヒドロキシクマリンの複素環置換と水溶性基の付加は、意外にも、生物学的アッセイに有用でありかつ４０５ｎｍで強力な吸収を有すると共に高い蛍光性を示す生物学的複合体を調製するのに有用な、新しい種類の蛍光クマリンをもたらすことを発見した。さらに、複素環置換７−ヒドロキシクマリンのハロゲン化は、クマリン色素のｐＫａを著しく低下させ、その結果、得られたクマリン複合体は生理学的ｐＨ範囲でその最大蛍光を有するようになる。これらの複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は強力に蛍光を発し、本発明の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素複合体の高い蛍光強度はより大きなアッセイ感度をもたらす。
【００１２】
本発明の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、典型的には４０５ｎｍの近くで吸光度の最大値を示し、本発明の色素は、例えば多くのフローサイトメーターで存在するように、紫色レーザーの主要輝線と一致するように選択することができる。本発明の反応性色素および色素複合体の特定の利点は、この種類の色素が典型的には、緑色（約５００〜５４０ｎｍ）で最大放出を示すことである。本発明者の知る限りでは、本発明は、緑色で放出する種類の小分子蛍光色素に関して初めて記述しており、典型的な生物学的アッセイの反応条件化で生体分子を標識するのに有用である。
【００１３】
一態様では、本発明は、蛍光色素として有用な、化学的反応性がある水溶性の複素環置換７−ヒドロキシクマリン化合物を提供する。本発明の、反応性がある水溶性の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた、広く様々な有機物質または無機物質（「基質」）と反応することができ、その結果色素と物質との複合が行われる。本発明の一態様では、本発明の反応性色素を使用して、サンプルを直接蛍光染色しまたは蛍光標識し、それによって、サンプルを検出し、同定し、または定量することができるようにする。
【００１４】
別の態様では、本発明は、基質と複合した本発明の１種または複数の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリンを含む、色素複合体を提供する。好ましい実施形態では、色素複合体を蛍光検出試薬として使用して、サンプル中の分析物を検出し、同定し、位置付け、または定量する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、色素複合体基質がバイオポリマーであり、このバイオポリマーは、本発明の１種または複数の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリンと複合して、蛍光バイオポリマーを得る。本発明の蛍光バイオポリマー色素複合体は、分析物特異的検出試薬を含めた検出試薬として、またはそのような検出試薬の一部として、有用性がある。有用なバイオポリマーには、例えば、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、多糖、炭水化物、および脂質が含まれる。好ましい実施形態では、色素バイオポリマー複合体のバイオポリマー成分は、本明細書で広く定義されるように、アミノ酸ポリマーである。好ましい実施形態では、バイオポリマーはモノクローナル抗体である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明の反応性色素または色素複合体を含有するキットを提供する。本発明のキットは、その他の試薬や緩衝液など、意図される適用例を実施するのに有用な追加の構成要素を含有することができる。
【００１７】
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式１の構造を有し：
【００１８】
【化１】
【００１９】
上式で、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧにより１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００２０】
好ましくは、複素環部分、ＨＣは、下式から選択される。
【００２１】
【化２】
【００２２】
好ましくは、反応性基、ＲＧは、アクリルアミド、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはソラレン誘導体である。
【００２３】
好ましくは、任意選択のリンカー、Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールである。
【００２４】
好ましくは、水溶性基、ＷＳＧは、スルホネート、チオスルホネート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジウム、キノリウム、またはアクリジニウム基である。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式２の構造を有し：
【００２６】
【化３】
【００２７】
上式で、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式３の構造を有し：
【００２９】
【化４】
【００３０】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式４の構造を有し：
【００３２】
【化５】
【００３３】
上式で、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、Ｌ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、ＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式５の構造を有し：
【００３５】
【化６】
【００３６】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式６の構造を有し：
【００３８】
【化７】
【００３９】
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールである、任意選択のリンカーであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式７の構造を有し：
【００４１】
【化８】
【００４２】
式中、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ｎは、１〜１０の整数であり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式８の構造を有し：
【００４４】
【化９】
【００４５】
式中、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素、クロロ、フルオロ、またはスルホネートであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４６】
本発明の反応性色素の、選択された実施形態を、以下の表１に示す。表１中の反応性色素の番号は、実施例で記述される化合物に付与された番号に相当する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
本発明の色素複合体は、本発明の複数の色素の１つが複合する基質を含む。典型的には、色素複合体は、本発明の反応性色素と、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた基質との間の反応によって生成され、その結果、色素と基質との化学結合が生じる。反応性色素と、基質上の官能基との間の複合反応の結果、色素反応性基の１個または複数の原子が、典型的には、色素を基質に結合させる新しい結合に組み込まれる。
【００５４】
一般に、本発明の色素複合体は、式９の構造を有し：
【００５５】
【化１０】
【００５６】
式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、ＷＳＧである。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１０の構造を有し：
【００５８】
【化１１】
【００５９】
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１１の構造を有し：
【００６１】
【化１２】
【００６２】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１２の構造を有し：
【００６４】
【化１３】
【００６５】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つはＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１３の構造を有し：
【００６７】
【化１４】
【００６８】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
Ｌは任意選択のリンカーであり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つは、スルホネートである。
【００６９】
複素環部分、リンカー、および水溶性基の好ましい実施形態は、上記にて反応性色素に関して述べた通りである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸化合物との塩基触媒縮合（方法Ａ）による反応性クマリンの合成の概略を示す図である。
【図１Ｂ】４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸化合物との無水酢酸ベースの縮合（方法Ｂ）による反応性クマリンの合成の概略を示す図である。
【図２】ｐＨ＝９．０緩衝液中の、化合物７の吸収スペクトルおよび放出スペクトルを示す図である。化合物７は、４１４ｎｍ付近でその最大吸収を有し、これは、典型的なフローサイトメーターの４０５ｎｍ紫色レーザー励起に非常によく一致している。
【図３】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ３抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図４】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ４抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図５】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ８抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図６】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書の本発明を完全に理解できるようにするために、いくつかの用語を以下に明示的に定義する。明示的に定義されない用語は、化学および生物学の分野での通常の意味を有するものとする。上記および下記の両方において本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本明細書で使用される、「７−ヒドロキシクマリン」または「７−ヒドロキシクマリン誘導体」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、下記の縮合環構造またはその誘導体の１つまたは複数を含有する任意の化合物または置換基を意味する。
【００７３】
【化１５】
【００７４】
本発明のクマリン色素は、１つのまたは別の、特定の電子共鳴構造に描かれたことを理解すべきである。対象色素上の電子電荷は、色素そのもの全体にわたって非局在化しているので、本発明の全ての態様は、その他の認められた共鳴構造に正式に描かれた色素に等しく適用される。
【００７５】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、酸素原子（「Ｏ」）、硫黄原子（「Ｓ」）、または窒素原子（「Ｎ」）を意味する。ヘテロ原子が窒素の場合、ＮＲ1Ｒ2部分を形成することができ、ただしＲ1およびＲ2は、互いに独立して、水素またはアルキルであり、またはこれらが結合する窒素と一緒になって、飽和または不飽和の５員環、６員環、または７員環を形成することが理解されよう。
【００７６】
本明細書で使用される「複素環」または「ヘテロアリール」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、５から１４個の環原子を有しかつ炭素原子と１個、２個、３個、または４個の酸素ヘテロ原子、窒素ヘテロ原子、または硫黄ヘテロ原子を含有する基を指す。複素環基の例には、チエニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル、ピラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾキサゾリル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、イソキサゾリル、フラザニル、フェノキサジニル、およびテトラゾリル基が含まれる。複素環基は、文献に広く記述されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献６参照）。
【００７７】
任意のアリールまたはヘテロアリール環系は、置換されていなくてもよく、または任意選択でおよび独立して、Ｈ、ハロゲン、シアノ、スルホ、スルホのアルカリもしくはアンモニウム塩、ニトロ、カルボキシ、アルキル、パーフルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルアミドなどの任意の合成により入手可能なおよび化学的に安定な置換基の組合せであって、このアルキル部分が１８個以下の炭素を有する置換基の組合せによって置換されていてもよい。
【００７８】
本明細書で使用される「置換され」という用語は、化学部分または官能基の水素の、代替的な基との形式的な置換を指す。化合物、化学部分、または官能基が、置換されたと記述される場合、代替的な基の置換部分は一般に、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルコキシ、アルキレンジオキシ、アミノアルキル、アミノアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルコキシアルコキシ、モノアルキルアミノアルコキシ、ジアルキルアミノアルコキシモノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（カルボキシアルキル）アミノ、アルコキシカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、アルキルスルホンアミド、カルボキシアルコキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシ、パーフルオロエトキシ、グアニジン、アミジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノ、ホルミルイミノ、アシルニトリル、アシルアジド、アセチルアジド、ジクロロトリアゼン、イソチオシアンテ（isothiocyante）、ハロゲン化スルホニル、スルホスクシニミジルエステル、イソシアンテ（isocyante）、ハロゲン化アシル、アルデヒド、ハロアセトアミド、マレイミド、アジリジニル、アルキルチオ（ジスルフィド）、アクリロ、ハロアルキルカルボニル、ボロネート、ヒドラジド、セミカルバジド、カルボヒドラジド、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、シクロヘテロアルキルアルキル、およびシクロヘテロアルケニルアルキルからなる群から選択される。
【００７９】
本明細書で使用される、「ＲＧ」で示される「反応性基」は、共有結合が形成されるように、別の化合物の官能基と化学的に反応することが可能な化合物上の部分を指す。
【００８０】
本明細書で使用される、２つの部分の間の「Ｌ」で示される「リンカー」は、これら２つの部分が互いに直接結合することができまたは中間体としてのリンカーを介して結合することができる場合、「任意選択」と見なされる。この言語は、リンカーが存在するかしないかのみが異なる代替的構造の記述を単純化するのに使用される。本発明では、例えば、クマリン色素分子を直接バイオポリマーに複合させることができ、あるいは、リンカーＬを介して間接的にバイオポリマーに複合させることができる。表記を簡略にするために、両方の代替例を、本明細書では、任意選択のリンカーを有する単一構造によって記述する。リンカーが存在しない、任意選択のリンカーＬを有する構造の実施形態は、「Ｌ」が「無い」構造として記述される。
【００８１】
本明細書で使用される「水溶性基」または「ＷＳＧ」という用語は、任意の置換基が結合される化合物の水溶性を高める、その任意の置換基を指す。好ましくは、水溶性基、ＷＳＧは、スルホネート、チオスルホネート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジニウム、キノリウム、アクリジニウム、またはポリヒドロキシ（例えば、グルコースなどの糖）基である。
【００８２】
「スルホネート」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、下記の構造を有する１つまたは複数の部分を含有する任意の化合物または置換基を指し：
【００８３】
【化１６】
【００８４】
式中、Ｒは、水素、または金属イオンやアンモニウムイオンなどのその他の対イオンである。
【００８５】
本明細書で使用される「色素複合体」という用語は、色素と「基質」または「物質」との間の複合体を指す。
【００８６】
本明細書で使用される「分析物」という用語は、分析され、検出され、測定され、または標識されることになる任意の物質を広く指す。分析物の例には、限定するものではないがタンパク質、ペプチド、ホルモン、ハプテン、抗原、抗体、受容体、酵素、核酸、多糖、化学物質、ポリマー、病原体、毒素、有機薬物、無機薬物、細胞、組織、微生物、ウイルス、細菌、真菌、藻類、寄生虫、アレルゲン、汚染物質、およびこれらの組合せが含まれる。慣例により、所与の細胞型の細胞が検出される場合、両方の細胞成分分子または細胞自体を分析物と見なすことができる。
【００８７】
「分析物特異的試薬」または「標的特異的試薬」という用語は、サンプル中に潜在的に存在するその他の分析物に比べ、問題の分析物または標的に優先的に結合する任意の試薬を指すのに広く本明細書では使用される。標的（分析物）および標的特異的（分析物特異的）試薬は、結合対のメンバーであり、この対のどちらのメンバーも、この対の他方のメンバーに選択的に結合するために標的特異的試薬として使用することができる。標的および標的特異的試薬対の例には、限定するものではないが下記の表２に示されるものが含まれる。好ましい標的特異的試薬は、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む抗体である。
【００８８】
【表７】
【００８９】
本明細書で使用される「検出試薬」は、分析物の光学的検出を促進させるのに使用される任意の化合物を指す。検出試薬は、典型的には、蛍光標識と複合した分析物特異的試薬を含み、基質成分、典型的にはバイオポリマーそのものが分析物特異的試薬である色素複合体と、蛍光標識として機能する色素複合体に結合した分析物特異的試薬との両方を含む。
【００９０】
本明細書で使用される「バイオポリマー」という用語は、それぞれ本明細書で広く定義されるように、一般に、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、炭水化物、多糖、および脂質を指すのに使用される。
【００９１】
本明細書で使用される「アミノ酸ポリマー」という用語は、一般に、ペプチド、ポリペプチド、および糖タンパク質などの同時翻訳または翻訳後修飾にかけられたタンパク質を含めたタンパク質を含む、アミノ酸の任意のポリマーを指すのに使用される。アミノ酸ポリマーは、標準的な（即ち、タンパク質原性とも呼ばれる、標準的な遺伝コードによってコード化された２０アミノ酸の１つ）および非標準的なアミノ酸を共に含んでもよく、例えばホスフェート、炭水化物、またはＣ1からＣ25カルボン酸によって、誘導体化し、保護し、または置換してもよい。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では、ポリマーの長さに関して区別することなく同義に使用されるが、アミノ酸の短いポリマーは、典型的にはペプチドまたはポリペプチドと呼ばれ、アミノ酸のより長いポリマー、特に天然に生じかつ／または生物学的機能を有するものを、タンパク質と呼ぶ。
【００９２】
本明細書で使用される「抗体」という用語には、標的特異的結合試薬として有用な、抗体からまたは抗体遺伝子から誘導されまたは誘導可能な全ての生成物が含まれる。したがって「抗体」には、とりわけ天然の抗体、抗体断片、抗体誘導体と、遺伝子組換え抗体、抗体断片、および抗体誘導体とが含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される「核酸ポリマー」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する。）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する。）、およびプリンもしくはピリミジン塩基のＮグルコシドでありまたは修飾プリンもしくはピリミジン塩基である任意のその他のタイプのポリヌクレオチドを指す。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」という用語の間には、長さに関して意図された区別はなく、これら用語は同義に使用されることになる。これらの用語は、分子の主要構造のみ指す。したがってこれらの用語には、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖および１本鎖ＲＮＡが含まれる。核酸ポリマーは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸を含むものとする（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮｉｅｌｓｅｎらの特許文献８参照）。
【００９４】
反応性色素
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンは、式１〜８のいずれかに示される一般構造を有する。特定の例について表１に示し、実施例で記述する。
【００９５】
反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、任意選択のリンカーによってこの色素に共有結合された、１つの反応性基、ＲＧを含有する。ある実施形態では、色素をＲＧに結合させる共有結合は、スペーサとして働く多数の介在原子を含有する。
【００９６】
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた広く様々な有機または無機物質と反応することができ、その結果、色素と物質との化学結合が行われる。典型的には、物質上での反応性色素と官能基との間の複合反応では、反応性基ＲＧの１個または複数の原子が、この物質に色素を結合させる新たな結合に組み込まれることになる。
【００９７】
典型的には、反応性基は、それぞれ求核物質または求電子物質である対応する官能基に曝すことによって共有結合を形成することができる、求電子物質または求核物質である。求電子性および求核性基の反応性対の、選択された実施例を、それらの反応から得られた共有結合と共に、以下の表３に示す。
【００９８】
【表８−１】
【００９９】
【表８−２】
【０１００】
色素と、複合される物質とを結合するのに使用される反応性基に何を選択するかは、典型的には、複合される物質上の官能基と、所望の共有結合のタイプまたは長さに依存する。有機または無機物質上に典型的に存在する官能基のタイプには、限定するものではないがアミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組合せが含まれる。単一タイプの反応性部位が物質上で利用可能であってもよく（多糖で典型的）、またはタンパク質で典型的であるように、様々な部位が生じてもよい（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。複合物質は、同じでも異なっていてもよい複数の色素と、またはビオチンなどハプテンによってさらに修飾された物質と、複合してもよい。一部の選択性は、反応条件の慎重な制御によって得ることができるが、標識の選択性は、適切な反応性色素を選択することによって最も良く得られる。
【０１０１】
典型的には、反応性基ＲＧは、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、またはケトンと反応することになる。好ましくはＲＧは、アミンまたはチオール官能基と反応する。ある実施形態では、ＲＧは、アクリルアミド、反応性アミン（カダベリンまたはエチレンジアミンを含む。）、カルボン酸の活性化エステル（典型的にはカルボン酸のスクシニミジルエステル）、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む。）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはチオール基である。「反応性白金錯体」とは、参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、特許文献９、１０、および１１参照）に記述されるような、化学反応性白金錯体を特に意味する。
【０１０２】
ＲＧがカルボン酸の活性化エステルである場合、反応性色素は、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンの色素複合体を調製するのに特に有用である。ＲＧがマレイミドまたはハロアセトアミドである場合、反応性色素は、チオール含有物質と複合するのに特に有用である。ＲＧがヒドラジドである場合、反応性基は、過ヨウ素酸酸化炭水化物および糖タンパク質との複合に特に有用であり、さらに、細胞微量注入用のアルデヒド固定化極性トレーサである。好ましくはＲＧは、カルボン酸、カルボン酸のスクシニミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、パーフルオロベンズアミド、アジドパーフルオロベンズアミド基、またはソラレンである。より好ましくは、ＲＧは、カルボン酸のスクシニミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、または反応性白金錯体である。
【０１０３】
あるいは、反応性基ＲＧは、アジド、ジアジリニル、アジドアリール、またはソラレン誘導体などの光活性化可能な基であり、その場合、色素は、適切な波長の光で照射した後に初めて化学的に反応性になる。
【０１０４】
反応性色素の合成
本発明の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンは、４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸との無水酢酸ベースの縮合から、または４−カルボニルレゾルシノールと活性メチレン化合物との塩基触媒縮合から調製される。これらの基本構造は、上記にて定義された対応するクマリン色素置換基が得られるように、合成中または合成後に、任意選択でさらに置換される。均等な結果をもたらすことができる、多くの可能な変形例があることが理解される。本発明の、反応性クマリン色素の典型的な合成を、図１に示す。文献におけるクマリンのその他の知られている合成方法は、当業者に知られているある修正によって、本発明の化学反応性クマリンを調製するのに適合させることができる（例えば、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｔｓｅｎらの特許文献１２と、非特許文献７、８、９、１０、１１、および１２参照）。
【０１０５】
反応性基を含有する色素の合成方法は、当技術分野において文書で十分証明されている。カルボン酸の「活性化エステル」などのアミン反応性色素は、典型的にはカルボン酸と比較的酸性の「離脱基」とをカップリングすることによって合成される。その他の好ましいアミン反応性基には、ＰＣｌ5やＰＯＣｌ3などのハロゲン化剤を使用してスルホン酸から調製されるハロゲン化スルホニル；ハロゲン化シアヌルとアミンとの反応によって調製されるハロトリアジン；アミンおよびホスゲンまたはチオホスゲンからそれぞれ調製されるイソシアネートまたはイソチオシアネートが含まれる。
【０１０６】
カルボン酸、アルデヒド、およびケトンとの複合に特に有用なアミンおよびヒドラジドを含有する色素は、カルボン酸またはハロゲン化スルホニルの活性化エステルと、カダベリンなどのジアミンまたはヒドラジンとの反応によって、最も頻繁に合成される。あるいは、芳香族アミンは、ニトロ芳香族化合物の化学的還元によって一般に合成される。アミンおよびヒドラジンは、標準的な方法によってチオール反応性ハロアセトアミドまたはマレイミドを合成するための、特に有用な前駆体である。
【０１０７】
色素複合体
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性された広く様々な有機または無機物質（本明細書では、「基質」と呼ぶ。）と反応することができ、その結果、色素と物質との複合が行われる。有用な色素複合体には、とりわけ、基質がアミノ酸、ヌクレオチド、バイオポリマー（例えば、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、多糖、炭水化物、または脂質）、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、イオン錯体形成部分、もしくはガラス、プラスチック、またはその他の非生物学的ポリマーである複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、基質は、細胞、細胞系、細胞断片もしくは成分、または細胞下粒子（例えば、ウイルス粒子、細菌粒子、またはこれらの成分）である。反応性色素は、典型的には、細胞表面で、細胞膜、オルガネラ、または細胞質において、官能基を標識する。
【０１０８】
生物学的アッセイで使用する場合、基質は、典型的にはアミノ酸、ヌクレオチド、または、アミノ酸ポリマーや核酸ポリマー、炭水化物、多糖などのバイオポリマーである。色素ポリマー複合体は、色素複合体からの蛍光シグナルを増大させるために、基質と複合した複数の色素分子が組み込まれたものを調製することができる。
【０１０９】
一実施形態では、基質は、ペプチドやタンパク質などのアミノ酸またはアミノ酸ポリマーである。本発明で使用可能なアミノ酸ポリマーの例には、限定するものではないが抗体（上記にて広く定義された通り）、ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇなど）、酵素、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、フィコビリタンパク質、およびその他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が含まれる。好ましい実施形態では、バイオポリマー基質がモノクローナル抗体である。
【０１１０】
別の実施形態では、基質は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーである。核酸ポリマーには、アルキニル結合（例えば、特許文献１３参照）、アミノアリル結合（例えば、特許文献１４参照）、ヘテロ原子置換リンカー（例えば、特許文献１５参照）、またはその他の結合など、本発明の色素と結合させるために追加のリンカーまたはスペーサを有するよう修飾したものが含まれる。別の実施形態では、複合物質は、非環状スペーサを介してプリンまたはピリミジン塩基をホスフェートまたはポリホスフェート部分に結合するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である。別の実施形態では、色素は、典型的にはヒドロキシル基を介して、あるいはチオールまたはアミノ基を介して、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの炭水化物部分と複合する（例えば、特許文献１６、１７、１８に記載されるように）。典型的には、複合ヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸である。ホスフェートまたはポリホスフェート部分へのメチレン部分または窒素もしくは硫黄ヘテロ原子の組込みも、有用である。７−デアザプリン（例えば、特許文献１９参照）などの非プリンおよび非ピリミジン塩基と、そのような塩基を含有する核酸も、本発明の色素に結合することができる。脱プリン化核酸とアミン、ヒドラジド、またはヒドロキシルアミン誘導体との反応によって調製された核酸付加物は、核酸を標識し検出する追加の手段を提供し、例えば、文献を参照されたい（例えば、非特許文献１３参照）。
【０１１１】
好ましい核酸ポリマー複合体は、標識された、１本鎖または２本鎖の天然または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、または、モルホリン誘導体化ホスフェートなどの通常とは異なるリンカーもしくはＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸を組み込む。核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合、典型的には、５０よりも少ないヌクレオチド、より典型的には２５よりも少ないヌクレオチドを含有する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）の複合体（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎらの特許文献８参照）は、一般にそのハイブリダイゼーション速度がより速いので、いくつかの適用例に好ましいことがある。
【０１１２】
別の実施形態では、基質は、典型的にはデキストランやヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、インスリン、デンプン、アガロース、セルロースなどの多糖である炭水化物である。あるいは、炭水化物は、リポ多糖である多糖である。好ましい多糖複合体は、デキストラン、またはリポ多糖複合体である。
【０１１３】
別の実施形態では、基質は、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロイドを含めた脂質（典型的には６〜６０炭素を有する。）である。あるいは複合物質は、リポソームなどの脂質アセンブリである。親油性部分は、文献（例えば、特許文献２０参照）に記載されるように、複合物質を細胞内に保持するのに使用してもよい。本発明の、ある極性色素も、脂質アセンブリ内に捕捉してもよい。
【０１１４】
基質がイオン錯体形成部分である複合体は、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、亜鉛、カリウム、またはその他の生物学的に重要な金属イオンの指標として働く。好ましいイオン錯体形成部分は、クラウンエーテル（例えば、特許文献２１参照）；１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸の誘導体（ＢＡＰＴＡキレート剤；例えば、特許文献２２、２３、および２４参照）；２−カルボキシメトキシアニリン−Ｎ，Ｎ−ジ−酢酸の誘導体（ＡＰＴＲＡキレート剤；例えば、非特許文献１４参照）；またはピリジンおよびフェナントロリンをベースにした金属イオンキレート剤（例えば、特許文献２５参照）；またはニトリロ３酢酸の誘導体であり、例えば、文献を参照されたい（例えば、非特許文献１５参照）。好ましくは、イオン錯体形成部分は、クラウンエーテルキレート剤、ＢＡＰＴＡキレート剤、ＡＰＴＲＡキレート剤、またはニトリロ３酢酸の誘導体である。
【０１１５】
非生体材料のその他の複合体には、有機または無機ポリマー、ポリマー被膜、ポリマーウェーハ、ポリマー膜、ポリマー粒子、またはポリマー微粒子の色素複合体が含まれ；磁性および非磁性微小球を含み；鉄、金、または銀粒子；伝導性および非伝導性金属および非金属；ガラスおよびプラスチックの表面および粒子が含まれる。複合体は、ポリマーを調製しながら適切な官能基を含有する色素の共重合によって、または適切な化学反応性を有する官能基を含有するポリマーの化学的修飾によって、任意選択で調製される。ポリマーの色素複合体を調製するのに有用なその他のタイプの反応には、アルケンの触媒重合または共重合と、ジエンおよびジエノフィルの反応、エステル交換、またはアミノ基転移が含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、色素複合体は、エネルギー転移対を形成するために、任意選択で本発明の追加の色素である少なくとも１種の第２のルミネセンス色素でさらに標識される。本発明のいくつかの態様では、標識された複合体が酵素基質として機能し、酵素的加水分解がエネルギー転移を妨げる。
【０１１７】
蛍光色素複合体は、特に基質がバイオポリマーの場合、基質分子当たり多数の色素を組み込んで蛍光シグナルを増大させることができる。好ましくは、色素の少なくとも３分子が、色素−バイオポリマー複合体に組み込まれる。バイオポリマーが抗体である実施形態では、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも６個の色素分子が抗体と複合する。いくつかの実施形態では、著しい自己消光を伴わずに約３５個も多くの色素分子を抗体と複合させることができるが、より典型的には約１５〜２０個もの分子である。記述された複合基質当たりの色素の範囲のそれぞれは、その範囲内の全ての値について述べるものとすることが、当業者に理解されよう。したがって例えば、意図される蛍光バイオポリマーが６〜１５個の色素分子を含有すると言う場合、６、７、８、．．．、または１５個の色素分子を含有するバイオポリマーも本発明の一部である。
【０１１８】
色素複合体の調製
本発明の蛍光色素複合体は、典型的には基質と反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素との間の反応の生成物として合成される。反応性色素を使用する色素複合体の調製は、十分に文書で証明されており、例えば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれている文献を参照されたい（例えば、非特許文献１６、１７、および１８参照）。複合体は、典型的には、適切な反応性色素と、複合される物質とを、これらが共に可溶性である適切な溶媒中で混合することから得られる。本明細書に記述される反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクメリン色素の水溶液は、容易に生成され、ほとんどの生体材料との複合反応を促進させる。光活性化されたこれら反応性色素の場合、複合は、この反応性色素を活性化するために反応混合物を照射することを必要とする。
【０１１９】
本発明の蛍光バイオポリマーは、典型的には、バイオポリマーと反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンとの間の反応の生成物として合成され、このときの反応条件は、多数の色素分子と各バイオポリマーとの複合をもたらすものである。あるいは、蛍光バイオポリマーは、サブユニット分子の重合反応として合成することができ、このサブユニット分子の１つまたは複数は、バイオポリマーの重合前に、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンと複合しているものである。後者の方法の例は、標準的なホスホラミダイトの化学的性質を使用したオリゴヌクレオチドの合成であり、少なくとも１つのホスホラミダイトが色素標識される。
【０１２０】
適用および使用方法
本発明の一態様では、本発明の反応性色素は、サンプルまたはサンプルの成分を直接染色しまたは標識するのに使用され、したがってサンプルを特定しまたは定量することができるようになる。化学的反応性色素化合物は、広く様々な材料上で対応する官能基に共有結合することになり、上述のように色素複合体を形成する。
【０１２１】
好ましい実施形態では、本発明の反応性色素化合物は、生物学的成分でサンプルを直接染色しまたは標識するのに使用される。サンプルは、成分の不均質な混合物（無傷の細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、オルガネラ、およびこれらの混合物を含む。）、または単一成分、または成分の均質な群（例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸、または炭水化物ポリマー、または脂質膜錯体）を含んでもよい。これらの色素は、一般に、典型的な使用濃度内では、生細胞およびその他の生物学的成分に対して無毒性である。
【０１２２】
直接染色の場合、色素化合物と問題のサンプル成分との間の接触が促進されるような任意の方法で、色素化合物をサンプルと組み合わせる。典型的には、色素化合物または色素化合物を含有する溶液を、単にサンプルに添加する。本発明のある色素、特に１つまたは複数のスルホン酸部分によって置換される色素は、生体細胞の膜を透過しない傾向があり、一旦内部に入ると、生存可能な細胞は典型的には十分に保持される。エレクトロポレーションなど、原形質膜を透過性にする処理、衝撃処理、または高細胞外ＡＴＰを使用して、選択された色素化合物を細胞内に導入することができる。あるいは、選択された色素化合物を、例えば圧力微量注入、スクレープローディング、パッチクランプ法、または食作用によって、細胞内に物理的に挿入することができる。
【０１２３】
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を組み込んだ色素を、細胞内に微量注入することができ、この色素を、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのアルデヒド固定液によって所定位置に固定することができる。このように固定することができるので、そのような色素は、神経トレーシングなどの細胞内適用例に役立つようになる。
【０１２４】
リン脂質などの親油性置換基を有する色素化合物は、例えば膜構造のプローブとして使用するために、またはリポソーム、リポタンパク質、被膜、プラスチック、親油性微小球、もしくは同様の材料に組み込むために、またはトレーシングのために、非共有結合によって脂質アセンブリ内に組み込まれることになる。親油性色素は、膜構造の蛍光プローブとして有用である。
【０１２５】
生物学的適用例における分析物の直接染色では、本発明の色素化合物を、典型的には当技術分野で一般に知られている方法により調製された水性の、ほぼ水性の、または水性混和溶液で使用する。色素化合物の正確な濃度は、実験条件および所望の結果に依存するが、典型的には約１ナノモルから１ミリモル以上に及ぶ。最適な濃度は、バックグラウンド蛍光が最小限に抑えられた満足のいく結果が実現されるまで、系統的な変更によって決定される。
【０１２６】
本発明の別の態様では、本発明の蛍光色素複合体は、分析物の光学的検出および分析を促進させるための、検出試薬、典型的には分析物特異的検出試薬として、またはそのような検出試薬の一部として有用である。一実施形態では、色素複合体基質そのものが分析物特異的試薬であり、蛍光色素複合体は、問題の分析物を標識する検出試薬として使用される。代替的実施形態では、蛍光色素複合体が分析物特異的試薬に結合され、組み合わせた部分を検出試薬として使用して、問題の分析物を標識する。この代替的実施形態では、色素複合体が、分析物特異的試薬に結合した蛍光標識として作用する。
【０１２７】
問題の１種または複数の分析物を、分析物特異的検出試薬を使用して標識し、その後、光学的に分析するアッセイは、当技術分野で周知であり、本発明の蛍光色素複合体は、一般に、そのようなアッセイでの検出試薬として有用である。例えばサンプル中のタンパク質は、分析物タンパク質に特異的に結合する、標識されたタンパク質、典型的には抗体からなる検出試薬を使用して、標識することができる。得られた標識済み分析物タンパク質の検出は、フローサイトメトリー、走査型サイトメトリー、撮像、およびゲル分析を含めたいくつかの周知のアッセイフォーマットおよび機器を使用して実施することができる。フローサイトメトリーは、例えば、参照により本明細書に全て組み込まれている文献（例えば、非特許文献１９、２０、２１、２２、および２３参照）を含めた、この分野での広範な文献に十分に記載されている。蛍光撮像顕微鏡法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれた文献（例えば、非特許文献２４参照）に記載されている。
【０１２８】
本発明の蛍光ポリマーを励起するのに有用な光源には、限定するものではないが手持ち式紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザー、およびレーザーダイオードが含まれる。これらの光源は、任意選択で、レーザースキャナ、蛍光マイクロプレートリーダ、標準のもしくは小型フルオロメーター、またはクロマトグラフィー検出器に一体化される。本発明の好ましい蛍光ポリマーは、４０５ｎｍでまたはその付近で励起可能であり、比較的安価な紫色レーザー励起源を使用して励起することができる。
【０１２９】
キット
本発明の一態様は、上述の本発明の色素のいずれかを使用した、様々なアッセイの実施を促進させるキットの作製である。本発明のキットは、典型的には本発明の着色または蛍光色素を含み、これらはどちらも、色素複合体を調製するのに有用な化学的反応性標識として存在するものであり、または、複合物質が特異的結合対メンバー、もしくはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、ペプチド、もしくはタンパク質である色素複合体として存在するものである。キットは、任意選択でさらに、典型的には水溶液として存在する１種または複数の緩衝剤を含む。本発明のキットは、任意選択でさらに、追加の検出試薬、得られる標識済み物質を精製するための精製媒体、ルミネセンス標準、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、または本発明のアッセイを実施するための取扱い説明書を含む。
【０１３０】
実施例
選択された色素の合成戦略、選択された蛍光バイオポリマーの合成、それらの特徴付け、および使用方法の例を、以下の実施例に示す。他の修正例および置換例は、当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の実施が例示されるように示すものであり、本発明の範囲全体を限定しまたは画定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１３１】
化合物１の調製
【０１３２】
【化１７】
【０１３３】
４−クロロレゾルシノール（５０ｇ）を乾燥エーテル（２００ｍｌ）に溶解する。溶液に、微粉化したシアン化亜鉛（６０ｇ）および塩化カリウム（１２ｇ）を撹拌しながら添加する。懸濁液を０℃に冷却する。強力な塩化水素ガスの流れを、激しく撹拌しながら溶液に吹き込む。約３０〜６０分後、反応物が溶解する。塩化水素ガスの添加は、エーテル溶液への吸収が停止するまで継続する。懸濁液をさらに１時間、氷上で撹拌する。エーテル溶液を、氷で処理した固体から注ぎ、水浴中で１００℃に加熱する。溶液から光沢あるプレート内で結晶化した生成物を冷却したら、濾過によって除去し、空気乾燥することによって、所望のアルデヒドが得られる。
【実施例２】
【０１３４】
化合物２の調製
【０１３５】
【化１８】
【０１３６】
２−チオフェネン酢酸エチル（１０ｇ）および６−ブロモヘキサン酸エチル（１２ｇ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）中に溶解する。溶液に、無水ＡｌＣｌ3（２４ｇ）を乾燥窒素保護下で激しく撹拌しながら、０℃で添加する。反応混合物を、０℃で乾燥窒素保護下で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに室温に温める。反応混合物を氷水に注ぎ、クロロホルム（３×２００ｍｌ）で抽出する。クロロホルム層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製の固体が得られる。未精製の固体を、溶離剤としてクロロホルム／酢酸エチルの勾配を用いてシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２が得られる。
【実施例３】
【０１３７】
化合物３の調製
【０１３８】
【化１９】
【０１３９】
化合物２（１０ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解する。溶液に、５Ｍ ＮａＯＨ（６５ｍｌ）を添加する。反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに濃ＨＣｌで中和する。得られた混合物を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、所望の化合物３が得られる。
【実施例４】
【０１４０】
化合物４の調製
【０１４１】
【化２０】
【０１４２】
化合物１（６ｇ）および化合物３（５．８ｇ）を無水酢酸（１００ｍｌ）中に懸濁する。懸濁液に、トリエチルアミン（６ｍｌ）を室温で添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで１２０〜１４０℃で加熱する。室温に冷却した後、混合物を氷水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別することにより、固体を収集し空気乾燥する。未精製生成物を再結晶することによって、所望の化合物４が得られる。
【実施例５】
【０１４３】
化合物５の調製
【０１４４】
【化２１】
【０１４５】
化合物４（５ｇ）を２０％ＨＣｌ（３００ｍｌ）に懸濁する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、６０〜７０℃に加熱する。反応混合物を水（２００ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（３×３００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製化合物５が得られる。未精製物質を、溶離剤としてクロロホルム／メタノールの勾配を用いてシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物５が得られる。
【実施例６】
【０１４６】
化合物６の調製
【０１４７】
【化２２】
【０１４８】
化合物５（１ｇ）を濃Ｈ2ＳＯ4（５ｍｌ）中に懸濁する。懸濁液に、２０％発煙Ｈ2ＳＯ4（５ｍｌ）を添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで０℃で撹拌する。冷エーテル（２００ｍｌ）に、反応混合物を１滴ずつ、激しく撹拌しながら添加することにより、未精製化合物６が黄色の沈殿物として得られる。未精製物質を、水に溶かした０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮに溶かした０．１％ＴＦＡの緩衝液系を使用して、さらに分取ＨＰＬＣで精製することにより、所望の化合物６が得られる。
【実施例７】
【０１４９】
化合物７の調製
【０１５０】
【化２３】
【０１５１】
化合物６（１００ｍｇ）およびＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（８５ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解する。溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）および無水トリエチルアミン（０．１ｍｌ）を、乾燥窒素保護下で、室温で激しく撹拌しながら添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで室温で、乾燥窒素保護下で撹拌する。反応混合物をエーテルに注ぎ、得られた沈殿物を濾過によって収集する。固体をエーテルで洗浄することにより、所望の化合物７が得られる。
【実施例８】
【０１５２】
化合物８の調製
【０１５３】
【化２４】
【０１５４】
無水ヒドラジン（１００μｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶かしたものに、化合物７（１００ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶かしたものを添加する。混合物を周囲温度で１５分間撹拌する。反応溶液を水に注ぎ、得られた沈殿物を遠心分離にかけて固体を収集し、水で洗浄し、空気乾燥する。未精製生成物を、ＨＰＬＣによってさらに精製する。
【実施例９】
【０１５５】
化合物９の調製
【０１５６】
【化２５】
【０１５７】
化合物７（１０ｍｇ）をＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶かしたものに、室温で、４当量のトリエチルアミンおよび１．２当量のＮ−（２−アミノエチル）マレイミド、トリフルオロ酢酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。混合物を周囲温度で６０分間撹拌する。ＤＭＦ溶液を水に注ぎ、得られた懸濁液を遠心分離にかけて固体を収集し、空気乾燥する。未精製生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製することにより、所望の化合物９が得られる。
【実施例１０】
【０１５８】
化合物１０の調製
【０１５９】
【化２６】
【０１６０】
化合物１０は、４−クロロ−２−フルオロレゾルシノール（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．，北京、中国）から、化合物１を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１１】
【０１６１】
化合物１１の調製
【０１６２】
【化２７】
【０１６３】
化合物１１は、化合物１０と化合物３との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１２】
【０１６４】
化合物１２の調製
【０１６５】
【化２８】
【０１６６】
化合物１２は、２０％ＨＣｌによる化合物１１の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１３】
【０１６７】
化合物１３の調製
【０１６８】
【化２９】
【０１６９】
化合物１３は、化合物１２のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１４】
【０１７０】
化合物１４の調製
【０１７１】
【化３０】
【０１７２】
化合物１４は、化合物１３とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１５】
【０１７３】
化合物１５の調製
【０１７４】
【化３１】
【０１７５】
化合物１５は、２，４−ジクロロレゾルシノール（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）から、化合物１を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１６】
【０１７６】
化合物１６の調製
【０１７７】
【化３２】
【０１７８】
化合物１６は、化合物１５と化合物３との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１７】
【０１７９】
化合物１７の調製
【０１８０】
【化３３】
【０１８１】
化合物１７は、２０％ＨＣｌによる化合物１６の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１８】
【０１８２】
化合物１８の調製
【０１８３】
【化３４】
【０１８４】
化合物１８は、化合物１７のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１９】
【０１８５】
化合物１９の調製
【０１８６】
【化３５】
【０１８７】
化合物１９は、化合物１８とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２０】
【０１８８】
化合物２０の調製
【０１８９】
【化３６】
【０１９０】
２−チオフェネン酢酸エチル（５ｇ）および４−ブロモメチル安息香酸メチル（６．２ｇ）を、ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解する。溶液に、無水ＡｌＣｌ3（１２ｇ）を乾燥窒素保護下で、０℃で激しく撹拌しながら添加する。反応混合物を、０℃で乾燥窒素保護下で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに室温に温める。反応混合物を氷水に注ぎ、クロロホルム（３×２００ｍｌ）で抽出する。クロロホルム層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製固体が得られる。未精製固体を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチルの勾配を用いたシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２０が得られる。
【実施例２１】
【０１９１】
化合物２１の調製
【０１９２】
【化３７】
【０１９３】
化合物２０（５ｇ）をエタノール（５０ｍｌ）に溶解する。溶液に、５Ｍ ＮａＯＨ（６５ｍｌ）を添加する。反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに、濃ＨＣｌで中和する。反応混合物を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、所望の化合物２１が得られる。
【実施例２２】
【０１９４】
化合物２２の調製
【０１９５】
【化３８】
【０１９６】
化合物２２は、化合物２１と化合物１との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２３】
【０１９７】
化合物２３の調製
【０１９８】
【化３９】
【０１９９】
化合物２３は、２０％ＨＣｌによる化合物２２の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２４】
【０２００】
化合物２４の調製
【０２０１】
【化４０】
【０２０２】
化合物２４は、化合物２３のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２５】
【０２０３】
化合物２５の調製
【０２０４】
【化４１】
【０２０５】
化合物２５は、化合物２４とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２６】
【０２０６】
化合物２６の調製
【０２０７】
【化４２】
【０２０８】
化合物１（１ｇ）および２，５−ジカルボキシメチルチオフェン（６ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、無水酢酸（１００ｍｌ）に懸濁する。懸濁液に、トリエチルアミン（６ｍｌ）を室温で添加する。得られた反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、１２０〜１４０℃で加熱する。室温に冷却した後、混合物を氷水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別して、固体を収集し、空気乾燥する。未精製固体を、溶離剤としてクロロホルム／メタノールの勾配を有するシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２６が得られる。
【実施例２７】
【０２０９】
化合物２７の調製
【０２１０】
【化４３】
【０２１１】
化合物２７は、２０％ＨＣｌによる化合物２６の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２８】
【０２１２】
化合物２８の調製
【０２１３】
【化４４】
【０２１４】
化合物２８は、化合物２７のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２９】
【０２１５】
化合物２９の調製
【０２１６】
【化４５】
【０２１７】
化合物２９は、化合物２４とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３０】
【０２１８】
化合物３０の調製
【０２１９】
【化４６】
【０２２０】
化合物３０は、２，４−ジヒドロキシ−５−ホルミル安息香酸（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）と２−チオフェン酢酸との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３１】
【０２２１】
化合物３１の調製
【０２２２】
【化４７】
【０２２３】
化合物３１は、２０％ＨＣｌによる化合物３０の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３２】
【０２２４】
化合物３２の調製
【０２２５】
【化４８】
【０２２６】
化合物３２は、化合物３１のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３３】
【０２２７】
化合物３３の調製
【０２２８】
【化４９】
【０２２９】
化合物３３は、化合物３２とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３４】
【０２３０】
化合物３４の調製
【０２３１】
【化５０】
【０２３２】
２−ベンゾチアゾール酢酸エチル（５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，４−ジヒドロキシ−５−ホルミル安息香酸（２ｇ、Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）、ピペリジン０．５ｍｌ、および酢酸０．３ｍｌを、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、メタノール１００ｍｌ中で還流下で加熱する。室温に冷却した後、混合物を濾過し、濾液を濃縮する。濃縮した濾液を水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別して固体を収集し、空気乾燥する。未精製生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製することにより、所望の化合物３４が得られる。
【実施例３５】
【０２３３】
化合物３５の調製
【０２３４】
【化５１】
【０２３５】
化合物３５は、化合物３４のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３６】
【０２３６】
化合物３６の調製
【０２３７】
【化５２】
【０２３８】
化合物３６は、化合物３５とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３７】
【０２３９】
化合物３７の調製
【０２４０】
【化５３】
【０２４１】
メチル４−カルボキシメチルピリジン（５ｇ）および６−ブロモヘキサン酸メチル（８ｇ）を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、１，２−ジクロロベンゼン（５０ｍｌ）中で加熱する。室温に冷却した後、混合物を濾過して固体を収集し、エーテルで洗浄し、空気乾燥する。未精製生成物を、さらに精製することなく次のステップの反応で直接使用する。
【実施例３８】
【０２４２】
化合物３８の調製
【０２４３】
【化５４】
【０２４４】
化合物３８は、化合物３７とレゾルシノールとのピペリジン触媒縮合から、化合物３４を調製するため手順と同様に調製する。
【実施例３９】
【０２４５】
化合物３９の調製
【０２４６】
【化５５】
【０２４７】
化合物３９は、化合物３８の加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例４０】
【０２４８】
化合物４０の調製
【０２４９】
【化５６】
【０２５０】
化合物４０は、化合物３９とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例４１】
【０２５１】
タンパク質−色素複合体の調製
タンパク質−色素複合体は、例えば、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献２５、２６、２７、２８参照）に記載されているような、標準的な手段によって調製することができる。例えばタンパク質−色素複合体は、下記のように本発明のスクシニミジルエステルを使用して調製することができる。
【０２５２】
タンパク質の溶液は、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中に約１０ｍｇ／ｍＬで調製する。標識試薬を、水またはＤＭＦもしくはＤＭＳＯなどの適切な溶媒に、約１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。所定量の標識試薬を、撹拌しながらタンパク質溶液に添加する。反応混合物を、室温で１時間または氷上で数時間インキュベートする。色素−タンパク質複合体は、典型的には、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で平衡にしたＡｍｅｒｓｈａｍ ＰＤ−１０樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などのサイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離未反応試薬から分離される。初期のタンパク質含有着色バンドを収集し、置換度を、遊離蛍光団の吸光係数を使用して各蛍光団の吸収最大値での吸光度から決定する。このように得られた色素−タンパク質複合体を細画分することにより、より高い、より低い、またはより均一なＤＯＳを得ることができる。
【０２５３】
色素標識抗体を生成するような多くの適用例では、色素が１０から５０当量とタンパク質が１当量のモル比を使用する。最適な反応条件および反応物濃度は、典型的には実験によって決定されることが理解されよう。色素−タンパク質複合体の最適化は、当技術分野で周知であり、例えば本明細書に引用される参考文献に記載されている。
【実施例４２】
【０２５４】
抗体−色素複合体の調製
ＩｇＧモノクローナル抗体の色素複合体を調製するための好ましいプロトコルについて、以下に記述する。化合物７、１３、１４、１９、２５、および６０の色素複合体を、以下に述べるように多少変更を加えた状態で、本質的に同じプロトコルを使用して調製した。
【０２５５】
ステップ１．抗体溶液の調製：抗体を標識緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ、ｐＨ８．０＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋２０％グリセロール）に溶かした溶液を、約２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。
【０２５６】
溶液中の色素の濃度は、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法、Ａ280＝εp・Ｃ・Ｌから計算することができ、ただしＡ280は２８０ｎｍ（タンパク質の最大吸収波長である。）で測定された吸光度であり、εpは抗体タンパク質のモル吸光係数であり、Ｃは濃度であり、Ｌは溶液を通過する光路の長さである。典型的なＩｇＧ抗体は、２２４０００ｃｍ-1Ｍ-1のεp値を有する。
【０２５７】
ステップ２．色素溶液の調製：色素溶液を、色素をＤＭＳＯに溶解することによって調製する。色素溶液の濃度は、以下に記述するように決定する。色素濃度の測定精度は、最初にｐＨ９．６の１Ｍグリシン中で色素を１／１００に希釈することによって改善してもよい。
【０２５８】
溶液中の色素の濃度は、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法、Ａmax＝ε色素・Ｃ・Ｌから計算することができ、ただしＡmaxは、色素の最大吸収波長で測定された吸光度であり、ε色素は色素のモル吸光係数であり、Ｃは濃度であり、Ｌは溶液を通過する光路の長さである。例として、化合物７アミドの最大吸収波長は約４１５ｎｍである。その他の色素化合物の場合、反応性色素の最大吸収波長は、複合前に測定すべきである。
【０２５９】
ステップ３．複合反応の実施：反応で所望のモル過剰の色素を得るために、抗体および色素溶液の量を計算する。最適化の研究では、反応を、過剰なモル数範囲の色素を使用して、典型的には２×から６０×の間のモル過剰の色素を使用して実施する。抗体溶液を、効果的に撹拌しながらまたは振盪させながら色素溶液に添加し、反応混合物を１〜２時間撹拌または振盪させたままにして、抗体−色素複合体を得る。
【０２６０】
ステップ４．複合体の精製：抗体−色素複合体は、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラムを使用して精製することができる。抗体−色素複合体溶液５０μｌおよび追跡緩衝液（ＰＢＳ＋２０％グリセロール＋０．１％ＮａＮ3）５０μｌをＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラムに投入し、追跡緩衝液１ｍｌをスピンカラムの受容管に入れ、分離する。分離後、撹拌する。
【０２６１】
あるいは、抗体−色素複合体は、製造業者のプロトコルに従って、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して精製することができる。
【０２６２】
ステップ５．抗体−色素複合体の置換度の決定：置換度（ＤＯＳ）は、下記の方程式を使用して計算し：
ＤＯＳ＝［色素］／［抗体］＝Ａmax・εp／（ε色素・（Ａ280−０．５５・Ａmax））、
ただし［色素］は色素濃度であり、［抗体］は抗体濃度であり、Ａmaxは色素の最大吸収波長で測定された吸光度であり、Ａ280は２８０ｎｍで測定された吸光度であり、εpは抗体タンパク質のモル吸光係数であり、ε色素は色素のモル吸光係数である。正確なＤＯＳを得るには、複合体が非複合色素を含むべきではないことに留意すべきである。
【０２６３】
効果的な標識のため、置換度は、典型的には抗体１モルに対して色素が３〜２０モルの間に含まれるべきである。当技術分野で周知のように、最適な標識をもたらすＤＯＳは、抗体に依存することになり、場合によっては、より高いＤＯＳが改善された標識をもたらすことができる。最適な標識は、ＤＯＳの範囲全体にわたって色素複合体を調製し、測定された蛍光強度を比較することにより、実験で決定される。例を、図に示す。
【実施例４３】
【０２６４】
過ヨウ素酸酸化糖タンパク質の色素複合体の調製
ヤギＩｇＧ抗体（タンパク質に結合した多糖鎖を有する。）５ｍｇを１ｍＬの０．１Ｍ酢酸、０．１３５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に溶かしたサンプルを、メタ過ヨウ素酸ナトリウム２．１ｍｇを用い、氷上で、糖タンパク質上に所望量のアルデヒド基を得るのに十分であることが実験により決定された時間にわたって処理し、次いで化合物５と反応させる。反応を、３０μＬのエチレングリコールを添加することによって停止させる。抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳに充填されたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで精製する。１Ｍ重炭酸ナトリウムの１０分の１体積を添加して、ｐＨを上昇させ、化合物５を、色素とタンパク質とのモル比５０：１で添加する。反応を、室温で、所望の色素／タンパク質の比を得るのに十分であることが実験により決定された時間にわたって撹拌する。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを、１０ｍＭの最終濃度まで添加し、反応を室温で４時間撹拌する。抗体複合体を、透析によりまた上述のようにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで精製する。ゲル中およびブロット上の過ヨウ素酸酸化糖タンパク質も、本質的には参照により本明細書に組み込まれた文献（例えば、非特許文献２９参照）に記載されているように、標識することができる。
【実施例４４】
【０２６５】
チオール反応性色素を使用したタンパク質−色素複合体の調製
β−ガラクトシダーゼ、遊離チオール基に富むタンパク質の溶液を、ＰＢＳ中に調製する（４００μＬ中２．０ｍｇ）。次いでタンパク質溶液を、ＤＭＦに溶かしたマレイミド誘導体化合物９の１０ｍｇ／Ｌ溶液で処理する。未反応の色素をスピンカラムで除去する。色素による置換度を、実施例４２に記載されるように、遊離色素の吸光係数を使用して推測する。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度から推測し、その波長での化合物９の吸光度に合わせて補正される。
【実施例４５】
【０２６６】
アミノデキストラン−色素複合体の調製
アミノデキストラン−色素複合体を、例として平均で１３アミノ基により誘導体化された７００００ＭＷアミノデキストラン（５０ｍｇ）を使用して、以下に記述されるように調製する。アミノデキストラン（５０ｍｇ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を、約１０〜１５の色素／デキストラン比が得られるように添加する。６〜１２時間後、得られた複合体をＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−５０で精製し、水で溶離する。典型的には６〜１０モルの色素が７００００ＭＷデキストランと複合する。
【実施例４６】
【０２６７】
色素標識微小球の調製
微小球を、いくつかの周知のプロトコルのいずれかを使用して、本発明の色素で標識することができる。例を以下に示す。
【０２６８】
表面にアミノ、カルボキシル、またはアルデヒドなどの官能基を有するように化学修飾された微小球は、表面の基および表１に列挙した対応する反応性色素とを共有結合によって複合させることにより、表面標識することができる。例えば、アミン修飾微小球は、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０などのスクシニミジルエステルを介して、本発明の色素と容易に複合する。
【０２６９】
上述のように調製された色素標識タンパク質は、そのアミン残基を介して、エチル３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用して微小球上のカルボキシレート基に共有結合することができる。あるいは、色素標識タンパク質は、微小球に受動的に吸着させることができる。例えば、カルボキシレート修飾微小球を、溶液色素標識タンパク質に懸濁し、タンパク質を微小球に受動的に吸着させ、過剰なタンパク質を遠心分離および洗浄によって除去する。遠心分離できないサイズの微粒子を、高ＭＷカットオフを有する半透膜を通した透析によって、またはゲル濾過クロマトグラフィーによって、過剰なタンパク質から分離する。
【０２７０】
ビオチニル化微小球は、上述のように、本発明の色素に複合したストレプトアビジン、アビジン、または抗ビオチンで処理することができる。
【実施例４７】
【０２７１】
ヌクレオチド−色素複合体の調製
本発明の色素と複合したヌクレオチドは、参照によりそれぞれが本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献３０、３１、および３２参照）に記載されているような、周知の公開されている手順に従って、当業者が容易に調製することができる。特定の複合の例を、以下に記述する。
【０２７２】
５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｍｇを１００μｌの水に溶かした溶液に、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を１００μＬ ＤＭＦおよび５μＬトリエチルアミンに溶かした溶液を添加する。３時間後、溶液を蒸発させ、残留物をＨＰＬＣによって精製する。生成物の画分を凍結乾燥することにより、蛍光ヌクレオチド複合体が得られる。
【０２７３】
あるいは、デオキシウリジン５’−三リン酸の蛍光色素複合体を、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸から調製し、またはチオール化ヌクレオチドもしくはチオリン酸ヌクレオチドを本発明のチオール反応性色素（マレイミド化合物９など）で処理することによって、調製する。
【０２７４】
あるいは、２’−（または３’）−２−アミノエチルアミノカルボニルアデノシン５’−三リン酸を、僅かに過剰な化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０と反応させ、その後、エタノールで沈殿させ、リボース修飾生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。
【実施例４８】
【０２７５】
オリゴヌクレオチド−色素複合体の調製
５’−アミン修飾、１８塩基Ｍ１３プライマー配列（約１００μｇ）を、４μｌの水に溶解する。ここに、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を１００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５に溶かした溶液２５０μｇを添加する。１６時間後、５Ｍ ＮａＣｌ １０μｌおよび冷エタノール３体積を添加する。混合物を−２０℃に冷却し、遠心分離し、上澄みをデカンテーションし、ペレットをエタノールで濯ぎ、次いでペレットを１００μＬの水に溶解する。標識オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製する。所望のピークを収集し、蒸発させることにより、蛍光オリゴヌクレオチチド−色素複合体が得られる。
【実施例４９】
【０２７６】
色素−抗体複合体を使用したフローサイトメトリーによる細胞分析
本発明の色素化合物に複合した分析物特異的抗体（即ち、標識抗体）は、フローサイトメトリーによる血液細胞（例えば、全血サンプル）の分析に有用である。標識抗体は、細胞タンパク質を標識（染色）するのに使用され、標識細胞は、フローサイトメトリーによって検出する。
【０２７７】
全血サンプル（１００μＬ）（好ましくはＥＤＴＡで収集）は、典型的には抗体−色素複合体で３０〜６０分間、暗所で、血液０．１ｍｌ当たり色素複合体濃度が１μｇ以下で染色される。染色後、１Ｘ ＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）２ｍＬをサンプルに添加し、サンプルを中程度の速度でボルテックスミキサで混合し、次いで室温で１０分間インキュベートする。サンプルを２〜５００ｇ（好ましくは２〜３００）で５分間遠心分離し、上澄みをデカンテーションする。サンプルを２回洗浄し（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ洗浄緩衝液２ｍＬに再懸濁し、混合し、遠心分離する。）、洗浄緩衝液０．５ｍＬまたは固定安定化緩衝液１５０μｌに再懸濁し、フローサイトメトリー分析まで４℃で保持する。
【０２７８】
染色細胞の分析は、好ましくは、青（４８８ｎｍ）、赤（約６３３ｎｍ）、および紫（４０５ｎｍ）レーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施される。検出光学部品は、５２５／５０ｎｍ蛍光検出チャネルでの検出を含む。化合物７、１３、および２５などの色素化合物を組み込む蛍光バイオポリマーは、紫色レーザー４０５ｎｍ放出と厳密に一致する励起最大値を示し、バイオポリマーからの放出は、５２５／５０ｎｍ検出チャネルで測定される。フローサイトメーターは、製造業者の取扱い説明書に従って設定される。染色細胞のサンプルのフローサイトメトリー分析は、製造業者のプロトコルに従って実施され、データは、問題の細胞集団に関するメジアン蛍光強度を得るための、当技術分野で周知の標準的な技法を使用して分析される。
【０２７９】
使用される特定の抗体複合体および特定の反応成分および使用される特定の反応条件は、得られる結果に影響を及ぼす可能性があることが理解されよう。通常の実験は、緩衝液や溶解溶液などの好ましい反応成分と、染色時間および温度を含めた反応条件を決定するのに実施されるべきである。アッセイ条件の、そのような通常の最適化は、免疫染色ベースのアッセイの分野で標準的に実施される。
【実施例５０】
【０２８０】
抗ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体
色素複合体を、色素とタンパク質との比のある範囲にわたり、化合物７、１３、および２５に個別の調製物としてそれぞれ複合されたＣＤ４およびＣＤ４５に特異的な抗体（それぞれ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡからのクローンＳＫ３および２ＤＤ１）を使用して調製した。抗体−色素複合体は、本質的に上記実施例４２で述べたように調製した。ＣＤ４およびＣＤ４５抗体の抗体複合体を使用して、本質的に上記実施例４９で述べたように、全血サンプル中のリンパ球を分析した。
【０２８１】
データは、各抗体−色素対に関し、最適な色素とタンパク質との比を示した。各抗体ごとに、３つの色素のそれぞれに関して最適な色素とタンパク質との比が、同様の比で生じた。同じ色素と複合した種々の抗体を比較すると、最適な色素とタンパク質との比は著しく異なっており、ＣＤ４に関しては、より高い比で最適な蛍光が観察された。これらの実験において、色素とタンパク質との比が最適な比よりも高い（試験範囲全体にわたって）ＣＤ４色素複合体では、目に見える自己消光が観察されず、蛍光は最適なレベルで維持された。対照的に、色素とタンパク質との比が最適な比よりも高いＣＤ４５色素複合体では、著しい自己消光が観察された。各色素化合物を使用して得られた最大蛍光染色を比較すると、化合物７は、化合物１３で行われたよりも良好な蛍光染色をもたらし、この化合物１３は、化合物２５で行われたよりも良好な蛍光染色をもたらした。
【０２８２】
結果は、３種の色素複合体の全てが、フローサイトメトリーによって分析される免疫蛍光アッセイ用の抗原特異的検出試薬を調製するのに有用であることを示す。一般に、色素とタンパク質との最適な比のそれぞれは、標識がなされる特定の抗体それぞれに関して実験により決定される（通常の最適化による）。
【実施例５１】
【０２８３】
抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体
色素複合体を、色素／タンパク質の比のある範囲にわたり、化合物７に対して個別の調製物としてそれぞれ複合された４種の異なる抗体、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体（それぞれ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡからのクローンＳＫ７、ＳＫ３、ＳＫ１、および２Ｄ１）を使用して調製した。抗体−色素複合体を、本質的に上記実施例４２で述べたように調製した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して、本質的に上記実施例４９で述べたように、全血サンプル中のリンパ球を分析した。
【０２８４】
分析の結果を図３〜６にまとめるが、これらは、色素複合体により標識されたリンパ球集団の蛍光強度を、各色素複合体に関する色素とタンパク質との比に対してプロットしたものを示す。図３〜５では、蛍光強度を、非染色集団から測定された蛍光分布の幅に対する、非染色「陰性」集団（即ち、バックグラウンド）から測定されたシグナル全体にわたる染色細胞集団の蛍光強度の尺度をもたらす「染色インデックス」として報告する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる文献参照（例えば、非特許文献３３参照））。染色インデックスは、下記の通り定義され：
染色インデックス＝（Ｓ−Ｕ）／（２×ＳＤ＿陰性）、
ただし、Ｓは染色細胞集団から測定されたメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）であり、Ｕは非染色細胞集団のＭＦＩであり、ＳＤ＿陰性は非染色細胞集団の蛍光強度の標準偏差である。図６で、蛍光強度は、メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）として報告される。ＣＤ４５抗体は全てのリンパ球に結合するので、これらの実験ではバックグラウンドを測定するのに使用される非染色リンパ球集団がなく、染色インデックスを計算することができない。
【０２８５】
色素複合抗体のそれぞれに関する最適な色素とタンパク質との比を、以下の表４に示す。
【０２８６】
【表９】
【０２８７】
図３は、色素とタンパク質との比のある範囲にわたる、化合物７に複合したＣＤ３抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ３抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体にわたり、染色されたリンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときに自己消光が観察された。
【０２８８】
図４は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたる、化合物７に複合したＣＤ４抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ４抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体を通して染色リンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときにごく僅かな自己消光しか観察されず、広範にわたる使用可能な比が得られた。
【０２８９】
図５は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたり、化合物７に複合したＣＤ８抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ８抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体にわたり、染色されたリンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときにごく僅かの自己消光しか観察されず、広範にわたる使用可能な比が得られた。
【０２９０】
図６は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたり、化合物７に複合したＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。ＭＦＩは、例えば光検出器利得に依存するので、得られた最大ＭＦＩは、細胞集団を区別するための色素複合体の有用性を直接示さない。しかし、化合物７で標識されたこのＣＤ４５抗体の色素複合体は、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイで使用されるリンパ球集団の適切な標識をもたらすことが観察された。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときに自己消光が観察され、使用可能な比がより狭い範囲であることを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性色素および色素複合体を含む蛍光化学物質とその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
分析物特異的蛍光プローブは、サンプル中の分析物の分析に有用な試薬である。分析物は、プローブへの特異的結合を介して標識されるようになり、その標識は、分析物の検出を促進させる。サンプル中の分析物を分析するための蛍光プローブの適用例には、フローサイトメトリーによる細胞の混合物中の細胞の部分母集団の同定および／または分離を含む蛍光免疫測定法、蛍光顕微鏡法、および蛍光染色によるゲル分離された分析物の可視化が含まれる。これらの技法については、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている文献に記述されている（例えば、非特許文献１、２、および３参照）。
【０００３】
上記目的のために蛍光色素を用いる場合、その蛍光色素の選択に影響を及ぼす多くの問題点がある。１つの問題点は、蛍光色素の吸収特性および放出特性であるが、それは、試験中のサンプル、例えば血液、尿、脳脊髄液中の多くのリガンド、受容体、および材料が蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確な決定を妨げることになるからである。この現象を、自己蛍光またはバックグラウンド蛍光と呼ぶ。第２の問題点は、蛍光色素をリガンド、受容体、およびその他の生体材料および非生体材料に複合させる能力と、そのような複合が蛍光色素に及ぼす影響である。多くの状況では、別の分子との複合は、蛍光色素の蛍光特性にかなりの変化をもたらす可能性があり、場合によっては、蛍光色素の量子効率を実質的に破壊しまたは低下させる可能性がある。蛍光色素との複合は、標識される分子の機能を不活性化することになる可能性もある。第３の問題点は、蛍光色素の量子効率であり、これは高感度検出の場合に高いことが好ましい。第４の問題点は、蛍光色素の光吸収能力または吸光係数であり、これは可能な限り大きいことが好ましい。他の問題点は、蛍光分子が非常に近接したときに互いに相互に作用して、自己消光をもたらすことになるか否かである。別の問題点は、蛍光色素が単独でまたはこの蛍光色素が複合している化合物と複合した状態で、その他の化合物または容器壁面と非特異的に結合するか否かである。
【０００４】
上記方法の適用可能性および価値は、適切な蛍光化合物の利用可能性と密接な関係がある。特に、紫色レーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、およびＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）など、商業的に実用可能なレーザー源によって励起される蛍光物質が求められている。アルゴンレーザー（４８８ｎｍ励起）およびＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ励起）用に開発された多くの蛍光色素がある。例えば、４８８ｎｍアルゴンレーザーによって十分励起されるフルオレセインは、緑色領域で有用な発光体である。しかし、４０５ｎｍ紫色レーザーで利用可能な蛍光色素はほとんどない。
【０００５】
あるクマリン色素は、様々な生物学的検出の適用例に対する有用性が実証されている。例えば、文献を参照されたい（例えば、Ｍｉｌｌｅｒらの特許文献１；Ｇｅｅらの特許文献２；およびＲｏｂｉｎｓｏｎの特許文献３参照）。フルオレセイン、ローダミン、およびシアニンなどのその他の蛍光色素と比較すると、多くのクマリン色素は、ある有利な性質を有する。より小さいサイズのクマリン色素は、色素標識抗原特異的試薬の親和性および特異性に対する色素の影響を、最小限に抑える。さらに、より小さいクマリンは、フルオレセイン、ローダミン、およびシアニンよりも高い標識効率を有する。それにも関わらず、多くのクマリン色素は、それらの強力な疎水性および高いｐＫａに起因する、タンパク質と複合したヒドロキシルクマリン色素の蛍光の極度の消光など、ある欠点を共有することが知られている。クマリン蛍光消光は、自己消光（クマリンタグ間の距離が近い。）および／または電子に富むアミノ酸残基（ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシン）による消光から生ずる。さらにクマリンの、４０５ｎｍでの典型的に弱い吸収は、一部のフローサイトメーターで使用されるような紫色励起レーザーを使用した、細胞を分析するためのその用途を大幅に制限する。
【０００６】
塩素化クマリンは、小さい有機分子を標識するのに使用されてきた（例えば、非特許文献４および特許文献４参照）。小さい有機分子の標識では、単一のクマリン分子しか各複合体中に存在しないので、自己消光も基質による消光も重大な問題ではない。対照的に、抗体の標識では、多数の色素分子を各抗体に複合させることが望ましいので、自己消光および基質による消光は共に重大な関心事である。一般に、クマリンまたはフルオレセインの塩素化は、いわゆる「重原子効果」および高い疎水性に起因して、不十分な抗体標識をもたらす可能性があると見なされる（例えば、Ｐａｒｋらの特許文献５；Ｇｅｅらの特許文献２；ＴｓｉｅｎおよびＺｌｏｋａｒｎｉｋの特許文献６：および非特許文献５参照）。
【０００７】
ある文献は（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００８年７月２９日出願の同時係属の特許文献７参照）、複数のモノ塩素化７−ヒドロキシクマリン色素に複合した抗体と、生物学的アッセイでのその使用について記述している。これらのモノ塩素化ヒドロキシクマリン色素は、抗体当たり多数の色素を有する抗体標識として使用したときに、思いがけなく低下した自己消光を示す。これらの色素標識抗体は、典型的には、４０５ｎｍ近くで吸光度の最大値を示し、青色の最大放出を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６２０７４０４号明細書
【特許文献２】米国特許第５８３０９１２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９５６４８０号明細書
【特許文献４】米国特許第５９５５６０４号明細書
【特許文献５】米国特許第５５１６６２９号明細書
【特許文献６】米国特許第６４７２２０５号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１２／２２０９３９号明細書
【特許文献８】米国特許第５５３９０８２号明細書
【特許文献９】米国特許第５５８０９９０号明細書
【特許文献１０】米国特許第５７１４３２７号明細書
【特許文献１１】米国特許第５９８５５６６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６５６６５０８号明細書
【特許文献１３】米国特許第５０４７５１９号明細書
【特許文献１４】米国特許第４７１１９５５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５６８４１４２号明細書
【特許文献１６】米国特許第５６５９０２５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５６６８２６８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５６７９７８５号明細書
【特許文献１９】米国特許第６１５０５１０号明細書
【特許文献２０】米国特許第５２０８１４８号明細書
【特許文献２１】米国特許第５４０５９７５号明細書
【特許文献２２】米国特許第５４５３５１７号明細書
【特許文献２３】米国特許第５５１６９１１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５０４９６７３号明細書
【特許文献２５】米国特許第５６４８２７０号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Herzenberg et al., "CELLULAR IMMUNOLOGY" 3rd ed., Chapter 22; Blackwell Scientific Publications (1978)
【非特許文献２】Goldman, "FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS" Academic Press, New York, (1968)
【非特許文献３】Taylor et al., APPLICATIONS OF FLUORESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES, Alan Liss Inc., (1986)
【非特許文献４】Zlokarnil et al., 1998, Science 279:84
【非特許文献５】Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 9th ed., pp 7-74, 2002
【非特許文献６】Katritzky,Alan R., Charles W.Ress,およびColin J.Drayton. 1984. Comprehensive heterocyclic chemistry: the structure, reactions, synthesis, and use of heterocyclic compounds. Volume 8, Part 6. Indexes. Oxford [Oxfordshire]: Pergamon Press.
【非特許文献７】Dittmer et al. 2005, J.Org.Chem. 70: 4682
【非特許文献８】Shi et al., 2005, Fen Xi Hua Xue 33: 1452
【非特許文献９】Sivakumar et al., 2004, Org.Lett 6: 4603
【非特許文献１０】Zhao et al., 2004, J.Am.Chem.Soc. 126: 4653
【非特許文献１１】Huang et al., 1994, J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1:102
【非特許文献１２】KuznetsovaおよびKaliya, 1992, Russ.Chem.Rev. 61: 1243
【非特許文献１３】"A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair." Atamna et al., 2000, Proc Natl Acad Sci 97:686-691
【非特許文献１４】Am.J.Physiol. 256, C540 (1989)
【非特許文献１５】"Single-step synthesis and characterization of biotinylated nitrilotriacetic acid, a unique reagent for the detection of histidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose", McMahan et al., 1996, Anal Biochem 236: 101-106
【非特許文献１６】Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, NY)
【非特許文献１７】Haugland, 1995, Method Mol.Biol. 45: 205-21
【非特許文献１８】Brinkley, 1992, Bioconjugate Chemistry 3:2
【非特許文献１９】Landy et al.,(eds.), Clinical Flow Cytometry, Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677 (1993)
【非特許文献２０】Bauer et al.(eds.), Clinical Flow Cytometry: Principles and Applications, Williams & Wilkins (1993)
【非特許文献２１】Ormerod(ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997)
【非特許文献２２】Jaroszeski et al.(eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No.91, Humana Press (1997)
【非特許文献２３】Practical Shapiro, Flow Cytometry, 4th ed., Wiley-Liss (2003)
【非特許文献２４】Pawley(ed), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1989)
【非特許文献２５】Haugland et al. 1995, Meth.Mol.Biol. 45:205
【非特許文献２６】Haugland, 1995, Meth.Mol.Biol. 45:223
【非特許文献２７】Haugland, 1995, Meth.Mol.Biol. 45:235
【非特許文献２８】Haugland, 2000, Current Protocols In Cell Biology 16.5.1-16.5.22
【非特許文献２９】EstepおよびMiller, 1986, Anal.Biochem. 157: 100-105
【非特許文献３０】M.Nimmakayalu et al., 2000, Biotechniques 28, 518-522
【非特許文献３１】Muhlegger et al., 1990. Biol Chem Hoppe Seyler 371, 953-965
【非特許文献３２】Giaid et al., 1989, Histochemistry 93, 191-196
【非特許文献３３】Maecker et al, 2004, Cytometry Part A 62A: 169-173
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素、および水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素の誘導体であって、反応性色素および色素複合体を含むものを提供する。
【００１１】
本発明の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、これら蛍光色素を、バイオポリマーの標識としての使用を含めた生物学的アッセイでの使用に特に適したものにする性質の新規な組合せを示す。本発明者らは、７−ヒドロキシクマリンの複素環置換と水溶性基の付加は、意外にも、生物学的アッセイに有用でありかつ４０５ｎｍで強力な吸収を有すると共に高い蛍光性を示す生物学的複合体を調製するのに有用な、新しい種類の蛍光クマリンをもたらすことを発見した。さらに、複素環置換７−ヒドロキシクマリンのハロゲン化は、クマリン色素のｐＫａを著しく低下させ、その結果、得られたクマリン複合体は生理学的ｐＨ範囲でその最大蛍光を有するようになる。これらの複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は強力に蛍光を発し、本発明の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素複合体の高い蛍光強度はより大きなアッセイ感度をもたらす。
【００１２】
本発明の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、典型的には４０５ｎｍの近くで吸光度の最大値を示し、本発明の色素は、例えば多くのフローサイトメーターで存在するように、紫色レーザーの主要輝線と一致するように選択することができる。本発明の反応性色素および色素複合体の特定の利点は、この種類の色素が典型的には、緑色（約５００〜５４０ｎｍ）で最大放出を示すことである。本発明者の知る限りでは、本発明は、緑色で放出する種類の小分子蛍光色素に関して初めて記述しており、典型的な生物学的アッセイの反応条件化で生体分子を標識するのに有用である。
【００１３】
一態様では、本発明は、蛍光色素として有用な、化学的反応性がある水溶性の複素環置換７−ヒドロキシクマリン化合物を提供する。本発明の、反応性がある水溶性の複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた、広く様々な有機物質または無機物質（「基質」）と反応することができ、その結果色素と物質との複合が行われる。本発明の一態様では、本発明の反応性色素を使用して、サンプルを直接蛍光染色しまたは蛍光標識し、それによって、サンプルを検出し、同定し、または定量することができるようにする。
【００１４】
別の態様では、本発明は、基質と複合した本発明の１種または複数の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリンを含む、色素複合体を提供する。好ましい実施形態では、色素複合体を蛍光検出試薬として使用して、サンプル中の分析物を検出し、同定し、位置付け、または定量する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、色素複合体基質がバイオポリマーであり、このバイオポリマーは、本発明の１種または複数の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリンと複合して、蛍光バイオポリマーを得る。本発明の蛍光バイオポリマー色素複合体は、分析物特異的検出試薬を含めた検出試薬として、またはそのような検出試薬の一部として、有用性がある。有用なバイオポリマーには、例えば、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、多糖、炭水化物、および脂質が含まれる。好ましい実施形態では、色素バイオポリマー複合体のバイオポリマー成分は、本明細書で広く定義されるように、アミノ酸ポリマーである。好ましい実施形態では、バイオポリマーはモノクローナル抗体である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明の反応性色素または色素複合体を含有するキットを提供する。本発明のキットは、その他の試薬や緩衝液など、意図される適用例を実施するのに有用な追加の構成要素を含有することができる。
【００１７】
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式１の構造を有し：
【００１８】
【化１】
【００１９】
上式で、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧにより１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００２０】
好ましくは、複素環部分、ＨＣは、下式から選択される。
【００２１】
【化２】
【００２２】
好ましくは、反応性基、ＲＧは、アクリルアミド、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはソラレン誘導体である。
【００２３】
好ましくは、任意選択のリンカー、Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールである。
【００２４】
好ましくは、水溶性基、ＷＳＧは、スルホネート、チオスルホネート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジウム、キノリウム、またはアクリジニウム基である。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式２の構造を有し：
【００２６】
【化３】
【００２７】
上式で、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式３の構造を有し：
【００２９】
【化４】
【００３０】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式４の構造を有し：
【００３２】
【化５】
【００３３】
上式で、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、Ｌ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、ＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式５の構造を有し：
【００３５】
【化６】
【００３６】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式６の構造を有し：
【００３８】
【化７】
【００３９】
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールである、任意選択のリンカーであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式７の構造を有し：
【００４１】
【化８】
【００４２】
式中、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ｎは、１〜１０の整数であり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素は、式８の構造を有し：
【００４４】
【化９】
【００４５】
式中、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素、クロロ、フルオロ、またはスルホネートであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである。
【００４６】
本発明の反応性色素の、選択された実施形態を、以下の表１に示す。表１中の反応性色素の番号は、実施例で記述される化合物に付与された番号に相当する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
本発明の色素複合体は、本発明の複数の色素の１つが複合する基質を含む。典型的には、色素複合体は、本発明の反応性色素と、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた基質との間の反応によって生成され、その結果、色素と基質との化学結合が生じる。反応性色素と、基質上の官能基との間の複合反応の結果、色素反応性基の１個または複数の原子が、典型的には、色素を基質に結合させる新しい結合に組み込まれる。
【００５４】
一般に、本発明の色素複合体は、式９の構造を有し：
【００５５】
【化１０】
【００５６】
式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、ＷＳＧである。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１０の構造を有し：
【００５８】
【化１１】
【００５９】
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１１の構造を有し：
【００６１】
【化１２】
【００６２】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１２の構造を有し：
【００６４】
【化１３】
【００６５】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つはＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、本発明の色素複合体は、式１３の構造を有し：
【００６７】
【化１４】
【００６８】
式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
Ｌは任意選択のリンカーであり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つは、スルホネートである。
【００６９】
複素環部分、リンカー、および水溶性基の好ましい実施形態は、上記にて反応性色素に関して述べた通りである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸化合物との塩基触媒縮合（方法Ａ）による反応性クマリンの合成の概略を示す図である。
【図１Ｂ】４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸化合物との無水酢酸ベースの縮合（方法Ｂ）による反応性クマリンの合成の概略を示す図である。
【図２】ｐＨ＝９．０緩衝液中の、化合物７の吸収スペクトルおよび放出スペクトルを示す図である。化合物７は、４１４ｎｍ付近でその最大吸収を有し、これは、典型的なフローサイトメーターの４０５ｎｍ紫色レーザー励起に非常によく一致している。
【図３】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ３抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図４】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ４抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図５】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ８抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【図６】リンパ球を標識するための、色素対タンパク質比の範囲にわたる、化合物７と複合したＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書の本発明を完全に理解できるようにするために、いくつかの用語を以下に明示的に定義する。明示的に定義されない用語は、化学および生物学の分野での通常の意味を有するものとする。上記および下記の両方において本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本明細書で使用される、「７−ヒドロキシクマリン」または「７−ヒドロキシクマリン誘導体」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、下記の縮合環構造またはその誘導体の１つまたは複数を含有する任意の化合物または置換基を意味する。
【００７３】
【化１５】
【００７４】
本発明のクマリン色素は、１つのまたは別の、特定の電子共鳴構造に描かれたことを理解すべきである。対象色素上の電子電荷は、色素そのもの全体にわたって非局在化しているので、本発明の全ての態様は、その他の認められた共鳴構造に正式に描かれた色素に等しく適用される。
【００７５】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、酸素原子（「Ｏ」）、硫黄原子（「Ｓ」）、または窒素原子（「Ｎ」）を意味する。ヘテロ原子が窒素の場合、ＮＲ1Ｒ2部分を形成することができ、ただしＲ1およびＲ2は、互いに独立して、水素またはアルキルであり、またはこれらが結合する窒素と一緒になって、飽和または不飽和の５員環、６員環、または７員環を形成することが理解されよう。
【００７６】
本明細書で使用される「複素環」または「ヘテロアリール」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、５から１４個の環原子を有しかつ炭素原子と１個、２個、３個、または４個の酸素ヘテロ原子、窒素ヘテロ原子、または硫黄ヘテロ原子を含有する基を指す。複素環基の例には、チエニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル、ピラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾキサゾリル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、イソキサゾリル、フラザニル、フェノキサジニル、およびテトラゾリル基が含まれる。複素環基は、文献に広く記述されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献６参照）。
【００７７】
任意のアリールまたはヘテロアリール環系は、置換されていなくてもよく、または任意選択でおよび独立して、Ｈ、ハロゲン、シアノ、スルホ、スルホのアルカリもしくはアンモニウム塩、ニトロ、カルボキシ、アルキル、パーフルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルアミドなどの任意の合成により入手可能なおよび化学的に安定な置換基の組合せであって、このアルキル部分が１８個以下の炭素を有する置換基の組合せによって置換されていてもよい。
【００７８】
本明細書で使用される「置換され」という用語は、化学部分または官能基の水素の、代替的な基との形式的な置換を指す。化合物、化学部分、または官能基が、置換されたと記述される場合、代替的な基の置換部分は一般に、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルコキシ、アルキレンジオキシ、アミノアルキル、アミノアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルコキシアルコキシ、モノアルキルアミノアルコキシ、ジアルキルアミノアルコキシモノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（カルボキシアルキル）アミノ、アルコキシカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、アルキルスルホンアミド、カルボキシアルコキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシ、パーフルオロエトキシ、グアニジン、アミジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノ、ホルミルイミノ、アシルニトリル、アシルアジド、アセチルアジド、ジクロロトリアゼン、イソチオシアンテ（isothiocyante）、ハロゲン化スルホニル、スルホスクシニミジルエステル、イソシアンテ（isocyante）、ハロゲン化アシル、アルデヒド、ハロアセトアミド、マレイミド、アジリジニル、アルキルチオ（ジスルフィド）、アクリロ、ハロアルキルカルボニル、ボロネート、ヒドラジド、セミカルバジド、カルボヒドラジド、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、シクロヘテロアルキルアルキル、およびシクロヘテロアルケニルアルキルからなる群から選択される。
【００７９】
本明細書で使用される、「ＲＧ」で示される「反応性基」は、共有結合が形成されるように、別の化合物の官能基と化学的に反応することが可能な化合物上の部分を指す。
【００８０】
本明細書で使用される、２つの部分の間の「Ｌ」で示される「リンカー」は、これら２つの部分が互いに直接結合することができまたは中間体としてのリンカーを介して結合することができる場合、「任意選択」と見なされる。この言語は、リンカーが存在するかしないかのみが異なる代替的構造の記述を単純化するのに使用される。本発明では、例えば、クマリン色素分子を直接バイオポリマーに複合させることができ、あるいは、リンカーＬを介して間接的にバイオポリマーに複合させることができる。表記を簡略にするために、両方の代替例を、本明細書では、任意選択のリンカーを有する単一構造によって記述する。リンカーが存在しない、任意選択のリンカーＬを有する構造の実施形態は、「Ｌ」が「無い」構造として記述される。
【００８１】
本明細書で使用される「水溶性基」または「ＷＳＧ」という用語は、任意の置換基が結合される化合物の水溶性を高める、その任意の置換基を指す。好ましくは、水溶性基、ＷＳＧは、スルホネート、チオスルホネート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジニウム、キノリウム、アクリジニウム、またはポリヒドロキシ（例えば、グルコースなどの糖）基である。
【００８２】
「スルホネート」という用語は、それ自体でまたは別の基の一部として、下記の構造を有する１つまたは複数の部分を含有する任意の化合物または置換基を指し：
【００８３】
【化１６】
【００８４】
式中、Ｒは、水素、または金属イオンやアンモニウムイオンなどのその他の対イオンである。
【００８５】
本明細書で使用される「色素複合体」という用語は、色素と「基質」または「物質」との間の複合体を指す。
【００８６】
本明細書で使用される「分析物」という用語は、分析され、検出され、測定され、または標識されることになる任意の物質を広く指す。分析物の例には、限定するものではないがタンパク質、ペプチド、ホルモン、ハプテン、抗原、抗体、受容体、酵素、核酸、多糖、化学物質、ポリマー、病原体、毒素、有機薬物、無機薬物、細胞、組織、微生物、ウイルス、細菌、真菌、藻類、寄生虫、アレルゲン、汚染物質、およびこれらの組合せが含まれる。慣例により、所与の細胞型の細胞が検出される場合、両方の細胞成分分子または細胞自体を分析物と見なすことができる。
【００８７】
「分析物特異的試薬」または「標的特異的試薬」という用語は、サンプル中に潜在的に存在するその他の分析物に比べ、問題の分析物または標的に優先的に結合する任意の試薬を指すのに広く本明細書では使用される。標的（分析物）および標的特異的（分析物特異的）試薬は、結合対のメンバーであり、この対のどちらのメンバーも、この対の他方のメンバーに選択的に結合するために標的特異的試薬として使用することができる。標的および標的特異的試薬対の例には、限定するものではないが下記の表２に示されるものが含まれる。好ましい標的特異的試薬は、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む抗体である。
【００８８】
【表７】
【００８９】
本明細書で使用される「検出試薬」は、分析物の光学的検出を促進させるのに使用される任意の化合物を指す。検出試薬は、典型的には、蛍光標識と複合した分析物特異的試薬を含み、基質成分、典型的にはバイオポリマーそのものが分析物特異的試薬である色素複合体と、蛍光標識として機能する色素複合体に結合した分析物特異的試薬との両方を含む。
【００９０】
本明細書で使用される「バイオポリマー」という用語は、それぞれ本明細書で広く定義されるように、一般に、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、炭水化物、多糖、および脂質を指すのに使用される。
【００９１】
本明細書で使用される「アミノ酸ポリマー」という用語は、一般に、ペプチド、ポリペプチド、および糖タンパク質などの同時翻訳または翻訳後修飾にかけられたタンパク質を含めたタンパク質を含む、アミノ酸の任意のポリマーを指すのに使用される。アミノ酸ポリマーは、標準的な（即ち、タンパク質原性とも呼ばれる、標準的な遺伝コードによってコード化された２０アミノ酸の１つ）および非標準的なアミノ酸を共に含んでもよく、例えばホスフェート、炭水化物、またはＣ1からＣ25カルボン酸によって、誘導体化し、保護し、または置換してもよい。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では、ポリマーの長さに関して区別することなく同義に使用されるが、アミノ酸の短いポリマーは、典型的にはペプチドまたはポリペプチドと呼ばれ、アミノ酸のより長いポリマー、特に天然に生じかつ／または生物学的機能を有するものを、タンパク質と呼ぶ。
【００９２】
本明細書で使用される「抗体」という用語には、標的特異的結合試薬として有用な、抗体からまたは抗体遺伝子から誘導されまたは誘導可能な全ての生成物が含まれる。したがって「抗体」には、とりわけ天然の抗体、抗体断片、抗体誘導体と、遺伝子組換え抗体、抗体断片、および抗体誘導体とが含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される「核酸ポリマー」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する。）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する。）、およびプリンもしくはピリミジン塩基のＮグルコシドでありまたは修飾プリンもしくはピリミジン塩基である任意のその他のタイプのポリヌクレオチドを指す。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」という用語の間には、長さに関して意図された区別はなく、これら用語は同義に使用されることになる。これらの用語は、分子の主要構造のみ指す。したがってこれらの用語には、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖および１本鎖ＲＮＡが含まれる。核酸ポリマーは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸を含むものとする（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮｉｅｌｓｅｎらの特許文献８参照）。
【００９４】
反応性色素
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンは、式１〜８のいずれかに示される一般構造を有する。特定の例について表１に示し、実施例で記述する。
【００９５】
反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、任意選択のリンカーによってこの色素に共有結合された、１つの反応性基、ＲＧを含有する。ある実施形態では、色素をＲＧに結合させる共有結合は、スペーサとして働く多数の介在原子を含有する。
【００９６】
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性させた広く様々な有機または無機物質と反応することができ、その結果、色素と物質との化学結合が行われる。典型的には、物質上での反応性色素と官能基との間の複合反応では、反応性基ＲＧの１個または複数の原子が、この物質に色素を結合させる新たな結合に組み込まれることになる。
【００９７】
典型的には、反応性基は、それぞれ求核物質または求電子物質である対応する官能基に曝すことによって共有結合を形成することができる、求電子物質または求核物質である。求電子性および求核性基の反応性対の、選択された実施例を、それらの反応から得られた共有結合と共に、以下の表３に示す。
【００９８】
【表８−１】
【００９９】
【表８−２】
【０１００】
色素と、複合される物質とを結合するのに使用される反応性基に何を選択するかは、典型的には、複合される物質上の官能基と、所望の共有結合のタイプまたは長さに依存する。有機または無機物質上に典型的に存在する官能基のタイプには、限定するものではないがアミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組合せが含まれる。単一タイプの反応性部位が物質上で利用可能であってもよく（多糖で典型的）、またはタンパク質で典型的であるように、様々な部位が生じてもよい（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。複合物質は、同じでも異なっていてもよい複数の色素と、またはビオチンなどハプテンによってさらに修飾された物質と、複合してもよい。一部の選択性は、反応条件の慎重な制御によって得ることができるが、標識の選択性は、適切な反応性色素を選択することによって最も良く得られる。
【０１０１】
典型的には、反応性基ＲＧは、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、またはケトンと反応することになる。好ましくはＲＧは、アミンまたはチオール官能基と反応する。ある実施形態では、ＲＧは、アクリルアミド、反応性アミン（カダベリンまたはエチレンジアミンを含む。）、カルボン酸の活性化エステル（典型的にはカルボン酸のスクシニミジルエステル）、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む。）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはチオール基である。「反応性白金錯体」とは、参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、特許文献９、１０、および１１参照）に記述されるような、化学反応性白金錯体を特に意味する。
【０１０２】
ＲＧがカルボン酸の活性化エステルである場合、反応性色素は、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンの色素複合体を調製するのに特に有用である。ＲＧがマレイミドまたはハロアセトアミドである場合、反応性色素は、チオール含有物質と複合するのに特に有用である。ＲＧがヒドラジドである場合、反応性基は、過ヨウ素酸酸化炭水化物および糖タンパク質との複合に特に有用であり、さらに、細胞微量注入用のアルデヒド固定化極性トレーサである。好ましくはＲＧは、カルボン酸、カルボン酸のスクシニミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、パーフルオロベンズアミド、アジドパーフルオロベンズアミド基、またはソラレンである。より好ましくは、ＲＧは、カルボン酸のスクシニミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、または反応性白金錯体である。
【０１０３】
あるいは、反応性基ＲＧは、アジド、ジアジリニル、アジドアリール、またはソラレン誘導体などの光活性化可能な基であり、その場合、色素は、適切な波長の光で照射した後に初めて化学的に反応性になる。
【０１０４】
反応性色素の合成
本発明の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンは、４−カルボニルレゾルシノールと複素環酢酸との無水酢酸ベースの縮合から、または４−カルボニルレゾルシノールと活性メチレン化合物との塩基触媒縮合から調製される。これらの基本構造は、上記にて定義された対応するクマリン色素置換基が得られるように、合成中または合成後に、任意選択でさらに置換される。均等な結果をもたらすことができる、多くの可能な変形例があることが理解される。本発明の、反応性クマリン色素の典型的な合成を、図１に示す。文献におけるクマリンのその他の知られている合成方法は、当業者に知られているある修正によって、本発明の化学反応性クマリンを調製するのに適合させることができる（例えば、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｔｓｅｎらの特許文献１２と、非特許文献７、８、９、１０、１１、および１２参照）。
【０１０５】
反応性基を含有する色素の合成方法は、当技術分野において文書で十分証明されている。カルボン酸の「活性化エステル」などのアミン反応性色素は、典型的にはカルボン酸と比較的酸性の「離脱基」とをカップリングすることによって合成される。その他の好ましいアミン反応性基には、ＰＣｌ5やＰＯＣｌ3などのハロゲン化剤を使用してスルホン酸から調製されるハロゲン化スルホニル；ハロゲン化シアヌルとアミンとの反応によって調製されるハロトリアジン；アミンおよびホスゲンまたはチオホスゲンからそれぞれ調製されるイソシアネートまたはイソチオシアネートが含まれる。
【０１０６】
カルボン酸、アルデヒド、およびケトンとの複合に特に有用なアミンおよびヒドラジドを含有する色素は、カルボン酸またはハロゲン化スルホニルの活性化エステルと、カダベリンなどのジアミンまたはヒドラジンとの反応によって、最も頻繁に合成される。あるいは、芳香族アミンは、ニトロ芳香族化合物の化学的還元によって一般に合成される。アミンおよびヒドラジンは、標準的な方法によってチオール反応性ハロアセトアミドまたはマレイミドを合成するための、特に有用な前駆体である。
【０１０７】
色素複合体
本発明の、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリン色素は、適切な反応性を有する官能基を含有しまたは含有するように変性された広く様々な有機または無機物質（本明細書では、「基質」と呼ぶ。）と反応することができ、その結果、色素と物質との複合が行われる。有用な色素複合体には、とりわけ、基質がアミノ酸、ヌクレオチド、バイオポリマー（例えば、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、多糖、炭水化物、または脂質）、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、イオン錯体形成部分、もしくはガラス、プラスチック、またはその他の非生物学的ポリマーである複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、基質は、細胞、細胞系、細胞断片もしくは成分、または細胞下粒子（例えば、ウイルス粒子、細菌粒子、またはこれらの成分）である。反応性色素は、典型的には、細胞表面で、細胞膜、オルガネラ、または細胞質において、官能基を標識する。
【０１０８】
生物学的アッセイで使用する場合、基質は、典型的にはアミノ酸、ヌクレオチド、または、アミノ酸ポリマーや核酸ポリマー、炭水化物、多糖などのバイオポリマーである。色素ポリマー複合体は、色素複合体からの蛍光シグナルを増大させるために、基質と複合した複数の色素分子が組み込まれたものを調製することができる。
【０１０９】
一実施形態では、基質は、ペプチドやタンパク質などのアミノ酸またはアミノ酸ポリマーである。本発明で使用可能なアミノ酸ポリマーの例には、限定するものではないが抗体（上記にて広く定義された通り）、ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇなど）、酵素、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、フィコビリタンパク質、およびその他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカイン、成長因子、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が含まれる。好ましい実施形態では、バイオポリマー基質がモノクローナル抗体である。
【０１１０】
別の実施形態では、基質は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーである。核酸ポリマーには、アルキニル結合（例えば、特許文献１３参照）、アミノアリル結合（例えば、特許文献１４参照）、ヘテロ原子置換リンカー（例えば、特許文献１５参照）、またはその他の結合など、本発明の色素と結合させるために追加のリンカーまたはスペーサを有するよう修飾したものが含まれる。別の実施形態では、複合物質は、非環状スペーサを介してプリンまたはピリミジン塩基をホスフェートまたはポリホスフェート部分に結合するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である。別の実施形態では、色素は、典型的にはヒドロキシル基を介して、あるいはチオールまたはアミノ基を介して、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの炭水化物部分と複合する（例えば、特許文献１６、１７、１８に記載されるように）。典型的には、複合ヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸である。ホスフェートまたはポリホスフェート部分へのメチレン部分または窒素もしくは硫黄ヘテロ原子の組込みも、有用である。７−デアザプリン（例えば、特許文献１９参照）などの非プリンおよび非ピリミジン塩基と、そのような塩基を含有する核酸も、本発明の色素に結合することができる。脱プリン化核酸とアミン、ヒドラジド、またはヒドロキシルアミン誘導体との反応によって調製された核酸付加物は、核酸を標識し検出する追加の手段を提供し、例えば、文献を参照されたい（例えば、非特許文献１３参照）。
【０１１１】
好ましい核酸ポリマー複合体は、標識された、１本鎖または２本鎖の天然または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、または、モルホリン誘導体化ホスフェートなどの通常とは異なるリンカーもしくはＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸を組み込む。核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合、典型的には、５０よりも少ないヌクレオチド、より典型的には２５よりも少ないヌクレオチドを含有する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）の複合体（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎらの特許文献８参照）は、一般にそのハイブリダイゼーション速度がより速いので、いくつかの適用例に好ましいことがある。
【０１１２】
別の実施形態では、基質は、典型的にはデキストランやヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、インスリン、デンプン、アガロース、セルロースなどの多糖である炭水化物である。あるいは、炭水化物は、リポ多糖である多糖である。好ましい多糖複合体は、デキストラン、またはリポ多糖複合体である。
【０１１３】
別の実施形態では、基質は、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロイドを含めた脂質（典型的には６〜６０炭素を有する。）である。あるいは複合物質は、リポソームなどの脂質アセンブリである。親油性部分は、文献（例えば、特許文献２０参照）に記載されるように、複合物質を細胞内に保持するのに使用してもよい。本発明の、ある極性色素も、脂質アセンブリ内に捕捉してもよい。
【０１１４】
基質がイオン錯体形成部分である複合体は、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、亜鉛、カリウム、またはその他の生物学的に重要な金属イオンの指標として働く。好ましいイオン錯体形成部分は、クラウンエーテル（例えば、特許文献２１参照）；１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸の誘導体（ＢＡＰＴＡキレート剤；例えば、特許文献２２、２３、および２４参照）；２−カルボキシメトキシアニリン−Ｎ，Ｎ−ジ−酢酸の誘導体（ＡＰＴＲＡキレート剤；例えば、非特許文献１４参照）；またはピリジンおよびフェナントロリンをベースにした金属イオンキレート剤（例えば、特許文献２５参照）；またはニトリロ３酢酸の誘導体であり、例えば、文献を参照されたい（例えば、非特許文献１５参照）。好ましくは、イオン錯体形成部分は、クラウンエーテルキレート剤、ＢＡＰＴＡキレート剤、ＡＰＴＲＡキレート剤、またはニトリロ３酢酸の誘導体である。
【０１１５】
非生体材料のその他の複合体には、有機または無機ポリマー、ポリマー被膜、ポリマーウェーハ、ポリマー膜、ポリマー粒子、またはポリマー微粒子の色素複合体が含まれ；磁性および非磁性微小球を含み；鉄、金、または銀粒子；伝導性および非伝導性金属および非金属；ガラスおよびプラスチックの表面および粒子が含まれる。複合体は、ポリマーを調製しながら適切な官能基を含有する色素の共重合によって、または適切な化学反応性を有する官能基を含有するポリマーの化学的修飾によって、任意選択で調製される。ポリマーの色素複合体を調製するのに有用なその他のタイプの反応には、アルケンの触媒重合または共重合と、ジエンおよびジエノフィルの反応、エステル交換、またはアミノ基転移が含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、色素複合体は、エネルギー転移対を形成するために、任意選択で本発明の追加の色素である少なくとも１種の第２のルミネセンス色素でさらに標識される。本発明のいくつかの態様では、標識された複合体が酵素基質として機能し、酵素的加水分解がエネルギー転移を妨げる。
【０１１７】
蛍光色素複合体は、特に基質がバイオポリマーの場合、基質分子当たり多数の色素を組み込んで蛍光シグナルを増大させることができる。好ましくは、色素の少なくとも３分子が、色素−バイオポリマー複合体に組み込まれる。バイオポリマーが抗体である実施形態では、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも６個の色素分子が抗体と複合する。いくつかの実施形態では、著しい自己消光を伴わずに約３５個も多くの色素分子を抗体と複合させることができるが、より典型的には約１５〜２０個もの分子である。記述された複合基質当たりの色素の範囲のそれぞれは、その範囲内の全ての値について述べるものとすることが、当業者に理解されよう。したがって例えば、意図される蛍光バイオポリマーが６〜１５個の色素分子を含有すると言う場合、６、７、８、．．．、または１５個の色素分子を含有するバイオポリマーも本発明の一部である。
【０１１８】
色素複合体の調製
本発明の蛍光色素複合体は、典型的には基質と反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクマリン色素との間の反応の生成物として合成される。反応性色素を使用する色素複合体の調製は、十分に文書で証明されており、例えば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれている文献を参照されたい（例えば、非特許文献１６、１７、および１８参照）。複合体は、典型的には、適切な反応性色素と、複合される物質とを、これらが共に可溶性である適切な溶媒中で混合することから得られる。本明細書に記述される反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシクメリン色素の水溶液は、容易に生成され、ほとんどの生体材料との複合反応を促進させる。光活性化されたこれら反応性色素の場合、複合は、この反応性色素を活性化するために反応混合物を照射することを必要とする。
【０１１９】
本発明の蛍光バイオポリマーは、典型的には、バイオポリマーと反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンとの間の反応の生成物として合成され、このときの反応条件は、多数の色素分子と各バイオポリマーとの複合をもたらすものである。あるいは、蛍光バイオポリマーは、サブユニット分子の重合反応として合成することができ、このサブユニット分子の１つまたは複数は、バイオポリマーの重合前に、反応性の水溶性複素環置換７−ヒドロキシルクマリンと複合しているものである。後者の方法の例は、標準的なホスホラミダイトの化学的性質を使用したオリゴヌクレオチドの合成であり、少なくとも１つのホスホラミダイトが色素標識される。
【０１２０】
適用および使用方法
本発明の一態様では、本発明の反応性色素は、サンプルまたはサンプルの成分を直接染色しまたは標識するのに使用され、したがってサンプルを特定しまたは定量することができるようになる。化学的反応性色素化合物は、広く様々な材料上で対応する官能基に共有結合することになり、上述のように色素複合体を形成する。
【０１２１】
好ましい実施形態では、本発明の反応性色素化合物は、生物学的成分でサンプルを直接染色しまたは標識するのに使用される。サンプルは、成分の不均質な混合物（無傷の細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、オルガネラ、およびこれらの混合物を含む。）、または単一成分、または成分の均質な群（例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸、または炭水化物ポリマー、または脂質膜錯体）を含んでもよい。これらの色素は、一般に、典型的な使用濃度内では、生細胞およびその他の生物学的成分に対して無毒性である。
【０１２２】
直接染色の場合、色素化合物と問題のサンプル成分との間の接触が促進されるような任意の方法で、色素化合物をサンプルと組み合わせる。典型的には、色素化合物または色素化合物を含有する溶液を、単にサンプルに添加する。本発明のある色素、特に１つまたは複数のスルホン酸部分によって置換される色素は、生体細胞の膜を透過しない傾向があり、一旦内部に入ると、生存可能な細胞は典型的には十分に保持される。エレクトロポレーションなど、原形質膜を透過性にする処理、衝撃処理、または高細胞外ＡＴＰを使用して、選択された色素化合物を細胞内に導入することができる。あるいは、選択された色素化合物を、例えば圧力微量注入、スクレープローディング、パッチクランプ法、または食作用によって、細胞内に物理的に挿入することができる。
【０１２３】
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を組み込んだ色素を、細胞内に微量注入することができ、この色素を、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのアルデヒド固定液によって所定位置に固定することができる。このように固定することができるので、そのような色素は、神経トレーシングなどの細胞内適用例に役立つようになる。
【０１２４】
リン脂質などの親油性置換基を有する色素化合物は、例えば膜構造のプローブとして使用するために、またはリポソーム、リポタンパク質、被膜、プラスチック、親油性微小球、もしくは同様の材料に組み込むために、またはトレーシングのために、非共有結合によって脂質アセンブリ内に組み込まれることになる。親油性色素は、膜構造の蛍光プローブとして有用である。
【０１２５】
生物学的適用例における分析物の直接染色では、本発明の色素化合物を、典型的には当技術分野で一般に知られている方法により調製された水性の、ほぼ水性の、または水性混和溶液で使用する。色素化合物の正確な濃度は、実験条件および所望の結果に依存するが、典型的には約１ナノモルから１ミリモル以上に及ぶ。最適な濃度は、バックグラウンド蛍光が最小限に抑えられた満足のいく結果が実現されるまで、系統的な変更によって決定される。
【０１２６】
本発明の別の態様では、本発明の蛍光色素複合体は、分析物の光学的検出および分析を促進させるための、検出試薬、典型的には分析物特異的検出試薬として、またはそのような検出試薬の一部として有用である。一実施形態では、色素複合体基質そのものが分析物特異的試薬であり、蛍光色素複合体は、問題の分析物を標識する検出試薬として使用される。代替的実施形態では、蛍光色素複合体が分析物特異的試薬に結合され、組み合わせた部分を検出試薬として使用して、問題の分析物を標識する。この代替的実施形態では、色素複合体が、分析物特異的試薬に結合した蛍光標識として作用する。
【０１２７】
問題の１種または複数の分析物を、分析物特異的検出試薬を使用して標識し、その後、光学的に分析するアッセイは、当技術分野で周知であり、本発明の蛍光色素複合体は、一般に、そのようなアッセイでの検出試薬として有用である。例えばサンプル中のタンパク質は、分析物タンパク質に特異的に結合する、標識されたタンパク質、典型的には抗体からなる検出試薬を使用して、標識することができる。得られた標識済み分析物タンパク質の検出は、フローサイトメトリー、走査型サイトメトリー、撮像、およびゲル分析を含めたいくつかの周知のアッセイフォーマットおよび機器を使用して実施することができる。フローサイトメトリーは、例えば、参照により本明細書に全て組み込まれている文献（例えば、非特許文献１９、２０、２１、２２、および２３参照）を含めた、この分野での広範な文献に十分に記載されている。蛍光撮像顕微鏡法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれた文献（例えば、非特許文献２４参照）に記載されている。
【０１２８】
本発明の蛍光ポリマーを励起するのに有用な光源には、限定するものではないが手持ち式紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザー、およびレーザーダイオードが含まれる。これらの光源は、任意選択で、レーザースキャナ、蛍光マイクロプレートリーダ、標準のもしくは小型フルオロメーター、またはクロマトグラフィー検出器に一体化される。本発明の好ましい蛍光ポリマーは、４０５ｎｍでまたはその付近で励起可能であり、比較的安価な紫色レーザー励起源を使用して励起することができる。
【０１２９】
キット
本発明の一態様は、上述の本発明の色素のいずれかを使用した、様々なアッセイの実施を促進させるキットの作製である。本発明のキットは、典型的には本発明の着色または蛍光色素を含み、これらはどちらも、色素複合体を調製するのに有用な化学的反応性標識として存在するものであり、または、複合物質が特異的結合対メンバー、もしくはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、ペプチド、もしくはタンパク質である色素複合体として存在するものである。キットは、任意選択でさらに、典型的には水溶液として存在する１種または複数の緩衝剤を含む。本発明のキットは、任意選択でさらに、追加の検出試薬、得られる標識済み物質を精製するための精製媒体、ルミネセンス標準、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、または本発明のアッセイを実施するための取扱い説明書を含む。
【０１３０】
実施例
選択された色素の合成戦略、選択された蛍光バイオポリマーの合成、それらの特徴付け、および使用方法の例を、以下の実施例に示す。他の修正例および置換例は、当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の実施が例示されるように示すものであり、本発明の範囲全体を限定しまたは画定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１３１】
化合物１の調製
【０１３２】
【化１７】
【０１３３】
４−クロロレゾルシノール（５０ｇ）を乾燥エーテル（２００ｍｌ）に溶解する。溶液に、微粉化したシアン化亜鉛（６０ｇ）および塩化カリウム（１２ｇ）を撹拌しながら添加する。懸濁液を０℃に冷却する。強力な塩化水素ガスの流れを、激しく撹拌しながら溶液に吹き込む。約３０〜６０分後、反応物が溶解する。塩化水素ガスの添加は、エーテル溶液への吸収が停止するまで継続する。懸濁液をさらに１時間、氷上で撹拌する。エーテル溶液を、氷で処理した固体から注ぎ、水浴中で１００℃に加熱する。溶液から光沢あるプレート内で結晶化した生成物を冷却したら、濾過によって除去し、空気乾燥することによって、所望のアルデヒドが得られる。
【実施例２】
【０１３４】
化合物２の調製
【０１３５】
【化１８】
【０１３６】
２−チオフェネン酢酸エチル（１０ｇ）および６−ブロモヘキサン酸エチル（１２ｇ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）中に溶解する。溶液に、無水ＡｌＣｌ3（２４ｇ）を乾燥窒素保護下で激しく撹拌しながら、０℃で添加する。反応混合物を、０℃で乾燥窒素保護下で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに室温に温める。反応混合物を氷水に注ぎ、クロロホルム（３×２００ｍｌ）で抽出する。クロロホルム層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製の固体が得られる。未精製の固体を、溶離剤としてクロロホルム／酢酸エチルの勾配を用いてシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２が得られる。
【実施例３】
【０１３７】
化合物３の調製
【０１３８】
【化１９】
【０１３９】
化合物２（１０ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解する。溶液に、５Ｍ ＮａＯＨ（６５ｍｌ）を添加する。反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに濃ＨＣｌで中和する。得られた混合物を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、所望の化合物３が得られる。
【実施例４】
【０１４０】
化合物４の調製
【０１４１】
【化２０】
【０１４２】
化合物１（６ｇ）および化合物３（５．８ｇ）を無水酢酸（１００ｍｌ）中に懸濁する。懸濁液に、トリエチルアミン（６ｍｌ）を室温で添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで１２０〜１４０℃で加熱する。室温に冷却した後、混合物を氷水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別することにより、固体を収集し空気乾燥する。未精製生成物を再結晶することによって、所望の化合物４が得られる。
【実施例５】
【０１４３】
化合物５の調製
【０１４４】
【化２１】
【０１４５】
化合物４（５ｇ）を２０％ＨＣｌ（３００ｍｌ）に懸濁する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、６０〜７０℃に加熱する。反応混合物を水（２００ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（３×３００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製化合物５が得られる。未精製物質を、溶離剤としてクロロホルム／メタノールの勾配を用いてシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物５が得られる。
【実施例６】
【０１４６】
化合物６の調製
【０１４７】
【化２２】
【０１４８】
化合物５（１ｇ）を濃Ｈ2ＳＯ4（５ｍｌ）中に懸濁する。懸濁液に、２０％発煙Ｈ2ＳＯ4（５ｍｌ）を添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで０℃で撹拌する。冷エーテル（２００ｍｌ）に、反応混合物を１滴ずつ、激しく撹拌しながら添加することにより、未精製化合物６が黄色の沈殿物として得られる。未精製物質を、水に溶かした０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮに溶かした０．１％ＴＦＡの緩衝液系を使用して、さらに分取ＨＰＬＣで精製することにより、所望の化合物６が得られる。
【実施例７】
【０１４９】
化合物７の調製
【０１５０】
【化２３】
【０１５１】
化合物６（１００ｍｇ）およびＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（８５ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解する。溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）および無水トリエチルアミン（０．１ｍｌ）を、乾燥窒素保護下で、室温で激しく撹拌しながら添加する。反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで室温で、乾燥窒素保護下で撹拌する。反応混合物をエーテルに注ぎ、得られた沈殿物を濾過によって収集する。固体をエーテルで洗浄することにより、所望の化合物７が得られる。
【実施例８】
【０１５２】
化合物８の調製
【０１５３】
【化２４】
【０１５４】
無水ヒドラジン（１００μｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶かしたものに、化合物７（１００ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶かしたものを添加する。混合物を周囲温度で１５分間撹拌する。反応溶液を水に注ぎ、得られた沈殿物を遠心分離にかけて固体を収集し、水で洗浄し、空気乾燥する。未精製生成物を、ＨＰＬＣによってさらに精製する。
【実施例９】
【０１５５】
化合物９の調製
【０１５６】
【化２５】
【０１５７】
化合物７（１０ｍｇ）をＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶かしたものに、室温で、４当量のトリエチルアミンおよび１．２当量のＮ−（２−アミノエチル）マレイミド、トリフルオロ酢酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。混合物を周囲温度で６０分間撹拌する。ＤＭＦ溶液を水に注ぎ、得られた懸濁液を遠心分離にかけて固体を収集し、空気乾燥する。未精製生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製することにより、所望の化合物９が得られる。
【実施例１０】
【０１５８】
化合物１０の調製
【０１５９】
【化２６】
【０１６０】
化合物１０は、４−クロロ−２−フルオロレゾルシノール（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．，北京、中国）から、化合物１を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１１】
【０１６１】
化合物１１の調製
【０１６２】
【化２７】
【０１６３】
化合物１１は、化合物１０と化合物３との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１２】
【０１６４】
化合物１２の調製
【０１６５】
【化２８】
【０１６６】
化合物１２は、２０％ＨＣｌによる化合物１１の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１３】
【０１６７】
化合物１３の調製
【０１６８】
【化２９】
【０１６９】
化合物１３は、化合物１２のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１４】
【０１７０】
化合物１４の調製
【０１７１】
【化３０】
【０１７２】
化合物１４は、化合物１３とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１５】
【０１７３】
化合物１５の調製
【０１７４】
【化３１】
【０１７５】
化合物１５は、２，４−ジクロロレゾルシノール（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）から、化合物１を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１６】
【０１７６】
化合物１６の調製
【０１７７】
【化３２】
【０１７８】
化合物１６は、化合物１５と化合物３との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１７】
【０１７９】
化合物１７の調製
【０１８０】
【化３３】
【０１８１】
化合物１７は、２０％ＨＣｌによる化合物１６の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１８】
【０１８２】
化合物１８の調製
【０１８３】
【化３４】
【０１８４】
化合物１８は、化合物１７のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例１９】
【０１８５】
化合物１９の調製
【０１８６】
【化３５】
【０１８７】
化合物１９は、化合物１８とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２０】
【０１８８】
化合物２０の調製
【０１８９】
【化３６】
【０１９０】
２−チオフェネン酢酸エチル（５ｇ）および４−ブロモメチル安息香酸メチル（６．２ｇ）を、ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解する。溶液に、無水ＡｌＣｌ3（１２ｇ）を乾燥窒素保護下で、０℃で激しく撹拌しながら添加する。反応混合物を、０℃で乾燥窒素保護下で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに室温に温める。反応混合物を氷水に注ぎ、クロロホルム（３×２００ｍｌ）で抽出する。クロロホルム層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、未精製固体が得られる。未精製固体を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチルの勾配を用いたシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２０が得られる。
【実施例２１】
【０１９１】
化合物２１の調製
【０１９２】
【化３７】
【０１９３】
化合物２０（５ｇ）をエタノール（５０ｍｌ）に溶解する。溶液に、５Ｍ ＮａＯＨ（６５ｍｌ）を添加する。反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣによって示されるように反応が終了したときに、濃ＨＣｌで中和する。反応混合物を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル層を合わせ、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空中で除去することにより、所望の化合物２１が得られる。
【実施例２２】
【０１９４】
化合物２２の調製
【０１９５】
【化３８】
【０１９６】
化合物２２は、化合物２１と化合物１との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２３】
【０１９７】
化合物２３の調製
【０１９８】
【化３９】
【０１９９】
化合物２３は、２０％ＨＣｌによる化合物２２の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２４】
【０２００】
化合物２４の調製
【０２０１】
【化４０】
【０２０２】
化合物２４は、化合物２３のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２５】
【０２０３】
化合物２５の調製
【０２０４】
【化４１】
【０２０５】
化合物２５は、化合物２４とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２６】
【０２０６】
化合物２６の調製
【０２０７】
【化４２】
【０２０８】
化合物１（１ｇ）および２，５−ジカルボキシメチルチオフェン（６ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、無水酢酸（１００ｍｌ）に懸濁する。懸濁液に、トリエチルアミン（６ｍｌ）を室温で添加する。得られた反応混合物を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、１２０〜１４０℃で加熱する。室温に冷却した後、混合物を氷水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別して、固体を収集し、空気乾燥する。未精製固体を、溶離剤としてクロロホルム／メタノールの勾配を有するシリカゲルカラムでさらに精製することにより、所望の化合物２６が得られる。
【実施例２７】
【０２０９】
化合物２７の調製
【０２１０】
【化４３】
【０２１１】
化合物２７は、２０％ＨＣｌによる化合物２６の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２８】
【０２１２】
化合物２８の調製
【０２１３】
【化４４】
【０２１４】
化合物２８は、化合物２７のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例２９】
【０２１５】
化合物２９の調製
【０２１６】
【化４５】
【０２１７】
化合物２９は、化合物２４とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３０】
【０２１８】
化合物３０の調製
【０２１９】
【化４６】
【０２２０】
化合物３０は、２，４−ジヒドロキシ−５−ホルミル安息香酸（Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）と２−チオフェン酢酸との縮合から、化合物４を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３１】
【０２２１】
化合物３１の調製
【０２２２】
【化４７】
【０２２３】
化合物３１は、２０％ＨＣｌによる化合物３０の酸加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３２】
【０２２４】
化合物３２の調製
【０２２５】
【化４８】
【０２２６】
化合物３２は、化合物３１のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３３】
【０２２７】
化合物３３の調製
【０２２８】
【化４９】
【０２２９】
化合物３３は、化合物３２とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３４】
【０２３０】
化合物３４の調製
【０２３１】
【化５０】
【０２３２】
２−ベンゾチアゾール酢酸エチル（５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２，４−ジヒドロキシ−５−ホルミル安息香酸（２ｇ、Ｆａｎｂｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）、ピペリジン０．５ｍｌ、および酢酸０．３ｍｌを、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、メタノール１００ｍｌ中で還流下で加熱する。室温に冷却した後、混合物を濾過し、濾液を濃縮する。濃縮した濾液を水に注ぎ、得られた沈殿物を吸引により濾別して固体を収集し、空気乾燥する。未精製生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製することにより、所望の化合物３４が得られる。
【実施例３５】
【０２３３】
化合物３５の調製
【０２３４】
【化５１】
【０２３５】
化合物３５は、化合物３４のスルホン化から、化合物６を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３６】
【０２３６】
化合物３６の調製
【０２３７】
【化５２】
【０２３８】
化合物３６は、化合物３５とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例３７】
【０２３９】
化合物３７の調製
【０２４０】
【化５３】
【０２４１】
メチル４−カルボキシメチルピリジン（５ｇ）および６−ブロモヘキサン酸メチル（８ｇ）を、ＴＬＣによって示されるように反応が終了するまで、１，２−ジクロロベンゼン（５０ｍｌ）中で加熱する。室温に冷却した後、混合物を濾過して固体を収集し、エーテルで洗浄し、空気乾燥する。未精製生成物を、さらに精製することなく次のステップの反応で直接使用する。
【実施例３８】
【０２４２】
化合物３８の調製
【０２４３】
【化５４】
【０２４４】
化合物３８は、化合物３７とレゾルシノールとのピペリジン触媒縮合から、化合物３４を調製するため手順と同様に調製する。
【実施例３９】
【０２４５】
化合物３９の調製
【０２４６】
【化５５】
【０２４７】
化合物３９は、化合物３８の加水分解から、化合物５を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例４０】
【０２４８】
化合物４０の調製
【０２４９】
【化５６】
【０２５０】
化合物４０は、化合物３９とＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートとの縮合から、化合物７を調製するための手順と同様に調製する。
【実施例４１】
【０２５１】
タンパク質−色素複合体の調製
タンパク質−色素複合体は、例えば、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献２５、２６、２７、２８参照）に記載されているような、標準的な手段によって調製することができる。例えばタンパク質−色素複合体は、下記のように本発明のスクシニミジルエステルを使用して調製することができる。
【０２５２】
タンパク質の溶液は、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中に約１０ｍｇ／ｍＬで調製する。標識試薬を、水またはＤＭＦもしくはＤＭＳＯなどの適切な溶媒に、約１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。所定量の標識試薬を、撹拌しながらタンパク質溶液に添加する。反応混合物を、室温で１時間または氷上で数時間インキュベートする。色素−タンパク質複合体は、典型的には、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で平衡にしたＡｍｅｒｓｈａｍ ＰＤ−１０樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などのサイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離未反応試薬から分離される。初期のタンパク質含有着色バンドを収集し、置換度を、遊離蛍光団の吸光係数を使用して各蛍光団の吸収最大値での吸光度から決定する。このように得られた色素−タンパク質複合体を細画分することにより、より高い、より低い、またはより均一なＤＯＳを得ることができる。
【０２５３】
色素標識抗体を生成するような多くの適用例では、色素が１０から５０当量とタンパク質が１当量のモル比を使用する。最適な反応条件および反応物濃度は、典型的には実験によって決定されることが理解されよう。色素−タンパク質複合体の最適化は、当技術分野で周知であり、例えば本明細書に引用される参考文献に記載されている。
【実施例４２】
【０２５４】
抗体−色素複合体の調製
ＩｇＧモノクローナル抗体の色素複合体を調製するための好ましいプロトコルについて、以下に記述する。化合物７、１３、１４、１９、２５、および６０の色素複合体を、以下に述べるように多少変更を加えた状態で、本質的に同じプロトコルを使用して調製した。
【０２５５】
ステップ１．抗体溶液の調製：抗体を標識緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ、ｐＨ８．０＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋２０％グリセロール）に溶かした溶液を、約２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。
【０２５６】
溶液中の色素の濃度は、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法、Ａ280＝εp・Ｃ・Ｌから計算することができ、ただしＡ280は２８０ｎｍ（タンパク質の最大吸収波長である。）で測定された吸光度であり、εpは抗体タンパク質のモル吸光係数であり、Ｃは濃度であり、Ｌは溶液を通過する光路の長さである。典型的なＩｇＧ抗体は、２２４０００ｃｍ-1Ｍ-1のεp値を有する。
【０２５７】
ステップ２．色素溶液の調製：色素溶液を、色素をＤＭＳＯに溶解することによって調製する。色素溶液の濃度は、以下に記述するように決定する。色素濃度の測定精度は、最初にｐＨ９．６の１Ｍグリシン中で色素を１／１００に希釈することによって改善してもよい。
【０２５８】
溶液中の色素の濃度は、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法、Ａmax＝ε色素・Ｃ・Ｌから計算することができ、ただしＡmaxは、色素の最大吸収波長で測定された吸光度であり、ε色素は色素のモル吸光係数であり、Ｃは濃度であり、Ｌは溶液を通過する光路の長さである。例として、化合物７アミドの最大吸収波長は約４１５ｎｍである。その他の色素化合物の場合、反応性色素の最大吸収波長は、複合前に測定すべきである。
【０２５９】
ステップ３．複合反応の実施：反応で所望のモル過剰の色素を得るために、抗体および色素溶液の量を計算する。最適化の研究では、反応を、過剰なモル数範囲の色素を使用して、典型的には２×から６０×の間のモル過剰の色素を使用して実施する。抗体溶液を、効果的に撹拌しながらまたは振盪させながら色素溶液に添加し、反応混合物を１〜２時間撹拌または振盪させたままにして、抗体−色素複合体を得る。
【０２６０】
ステップ４．複合体の精製：抗体−色素複合体は、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラムを使用して精製することができる。抗体−色素複合体溶液５０μｌおよび追跡緩衝液（ＰＢＳ＋２０％グリセロール＋０．１％ＮａＮ3）５０μｌをＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラムに投入し、追跡緩衝液１ｍｌをスピンカラムの受容管に入れ、分離する。分離後、撹拌する。
【０２６１】
あるいは、抗体−色素複合体は、製造業者のプロトコルに従って、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して精製することができる。
【０２６２】
ステップ５．抗体−色素複合体の置換度の決定：置換度（ＤＯＳ）は、下記の方程式を使用して計算し：
ＤＯＳ＝［色素］／［抗体］＝Ａmax・εp／（ε色素・（Ａ280−０．５５・Ａmax））、
ただし［色素］は色素濃度であり、［抗体］は抗体濃度であり、Ａmaxは色素の最大吸収波長で測定された吸光度であり、Ａ280は２８０ｎｍで測定された吸光度であり、εpは抗体タンパク質のモル吸光係数であり、ε色素は色素のモル吸光係数である。正確なＤＯＳを得るには、複合体が非複合色素を含むべきではないことに留意すべきである。
【０２６３】
効果的な標識のため、置換度は、典型的には抗体１モルに対して色素が３〜２０モルの間に含まれるべきである。当技術分野で周知のように、最適な標識をもたらすＤＯＳは、抗体に依存することになり、場合によっては、より高いＤＯＳが改善された標識をもたらすことができる。最適な標識は、ＤＯＳの範囲全体にわたって色素複合体を調製し、測定された蛍光強度を比較することにより、実験で決定される。例を、図に示す。
【実施例４３】
【０２６４】
過ヨウ素酸酸化糖タンパク質の色素複合体の調製
ヤギＩｇＧ抗体（タンパク質に結合した多糖鎖を有する。）５ｍｇを１ｍＬの０．１Ｍ酢酸、０．１３５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に溶かしたサンプルを、メタ過ヨウ素酸ナトリウム２．１ｍｇを用い、氷上で、糖タンパク質上に所望量のアルデヒド基を得るのに十分であることが実験により決定された時間にわたって処理し、次いで化合物５と反応させる。反応を、３０μＬのエチレングリコールを添加することによって停止させる。抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳに充填されたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで精製する。１Ｍ重炭酸ナトリウムの１０分の１体積を添加して、ｐＨを上昇させ、化合物５を、色素とタンパク質とのモル比５０：１で添加する。反応を、室温で、所望の色素／タンパク質の比を得るのに十分であることが実験により決定された時間にわたって撹拌する。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを、１０ｍＭの最終濃度まで添加し、反応を室温で４時間撹拌する。抗体複合体を、透析によりまた上述のようにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで精製する。ゲル中およびブロット上の過ヨウ素酸酸化糖タンパク質も、本質的には参照により本明細書に組み込まれた文献（例えば、非特許文献２９参照）に記載されているように、標識することができる。
【実施例４４】
【０２６５】
チオール反応性色素を使用したタンパク質−色素複合体の調製
β−ガラクトシダーゼ、遊離チオール基に富むタンパク質の溶液を、ＰＢＳ中に調製する（４００μＬ中２．０ｍｇ）。次いでタンパク質溶液を、ＤＭＦに溶かしたマレイミド誘導体化合物９の１０ｍｇ／Ｌ溶液で処理する。未反応の色素をスピンカラムで除去する。色素による置換度を、実施例４２に記載されるように、遊離色素の吸光係数を使用して推測する。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度から推測し、その波長での化合物９の吸光度に合わせて補正される。
【実施例４５】
【０２６６】
アミノデキストラン−色素複合体の調製
アミノデキストラン−色素複合体を、例として平均で１３アミノ基により誘導体化された７００００ＭＷアミノデキストラン（５０ｍｇ）を使用して、以下に記述されるように調製する。アミノデキストラン（５０ｍｇ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を、約１０〜１５の色素／デキストラン比が得られるように添加する。６〜１２時間後、得られた複合体をＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−５０で精製し、水で溶離する。典型的には６〜１０モルの色素が７００００ＭＷデキストランと複合する。
【実施例４６】
【０２６７】
色素標識微小球の調製
微小球を、いくつかの周知のプロトコルのいずれかを使用して、本発明の色素で標識することができる。例を以下に示す。
【０２６８】
表面にアミノ、カルボキシル、またはアルデヒドなどの官能基を有するように化学修飾された微小球は、表面の基および表１に列挙した対応する反応性色素とを共有結合によって複合させることにより、表面標識することができる。例えば、アミン修飾微小球は、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０などのスクシニミジルエステルを介して、本発明の色素と容易に複合する。
【０２６９】
上述のように調製された色素標識タンパク質は、そのアミン残基を介して、エチル３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用して微小球上のカルボキシレート基に共有結合することができる。あるいは、色素標識タンパク質は、微小球に受動的に吸着させることができる。例えば、カルボキシレート修飾微小球を、溶液色素標識タンパク質に懸濁し、タンパク質を微小球に受動的に吸着させ、過剰なタンパク質を遠心分離および洗浄によって除去する。遠心分離できないサイズの微粒子を、高ＭＷカットオフを有する半透膜を通した透析によって、またはゲル濾過クロマトグラフィーによって、過剰なタンパク質から分離する。
【０２７０】
ビオチニル化微小球は、上述のように、本発明の色素に複合したストレプトアビジン、アビジン、または抗ビオチンで処理することができる。
【実施例４７】
【０２７１】
ヌクレオチド−色素複合体の調製
本発明の色素と複合したヌクレオチドは、参照によりそれぞれが本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献３０、３１、および３２参照）に記載されているような、周知の公開されている手順に従って、当業者が容易に調製することができる。特定の複合の例を、以下に記述する。
【０２７２】
５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｍｇを１００μｌの水に溶かした溶液に、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を１００μＬ ＤＭＦおよび５μＬトリエチルアミンに溶かした溶液を添加する。３時間後、溶液を蒸発させ、残留物をＨＰＬＣによって精製する。生成物の画分を凍結乾燥することにより、蛍光ヌクレオチド複合体が得られる。
【０２７３】
あるいは、デオキシウリジン５’−三リン酸の蛍光色素複合体を、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸から調製し、またはチオール化ヌクレオチドもしくはチオリン酸ヌクレオチドを本発明のチオール反応性色素（マレイミド化合物９など）で処理することによって、調製する。
【０２７４】
あるいは、２’−（または３’）−２−アミノエチルアミノカルボニルアデノシン５’−三リン酸を、僅かに過剰な化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０と反応させ、その後、エタノールで沈殿させ、リボース修飾生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。
【実施例４８】
【０２７５】
オリゴヌクレオチド−色素複合体の調製
５’−アミン修飾、１８塩基Ｍ１３プライマー配列（約１００μｇ）を、４μｌの水に溶解する。ここに、化合物７、１３、１４、１９、２５、または６０を１００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５に溶かした溶液２５０μｇを添加する。１６時間後、５Ｍ ＮａＣｌ １０μｌおよび冷エタノール３体積を添加する。混合物を−２０℃に冷却し、遠心分離し、上澄みをデカンテーションし、ペレットをエタノールで濯ぎ、次いでペレットを１００μＬの水に溶解する。標識オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製する。所望のピークを収集し、蒸発させることにより、蛍光オリゴヌクレオチチド−色素複合体が得られる。
【実施例４９】
【０２７６】
色素−抗体複合体を使用したフローサイトメトリーによる細胞分析
本発明の色素化合物に複合した分析物特異的抗体（即ち、標識抗体）は、フローサイトメトリーによる血液細胞（例えば、全血サンプル）の分析に有用である。標識抗体は、細胞タンパク質を標識（染色）するのに使用され、標識細胞は、フローサイトメトリーによって検出する。
【０２７７】
全血サンプル（１００μＬ）（好ましくはＥＤＴＡで収集）は、典型的には抗体−色素複合体で３０〜６０分間、暗所で、血液０．１ｍｌ当たり色素複合体濃度が１μｇ以下で染色される。染色後、１Ｘ ＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）２ｍＬをサンプルに添加し、サンプルを中程度の速度でボルテックスミキサで混合し、次いで室温で１０分間インキュベートする。サンプルを２〜５００ｇ（好ましくは２〜３００）で５分間遠心分離し、上澄みをデカンテーションする。サンプルを２回洗浄し（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ洗浄緩衝液２ｍＬに再懸濁し、混合し、遠心分離する。）、洗浄緩衝液０．５ｍＬまたは固定安定化緩衝液１５０μｌに再懸濁し、フローサイトメトリー分析まで４℃で保持する。
【０２７８】
染色細胞の分析は、好ましくは、青（４８８ｎｍ）、赤（約６３３ｎｍ）、および紫（４０５ｎｍ）レーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施される。検出光学部品は、５２５／５０ｎｍ蛍光検出チャネルでの検出を含む。化合物７、１３、および２５などの色素化合物を組み込む蛍光バイオポリマーは、紫色レーザー４０５ｎｍ放出と厳密に一致する励起最大値を示し、バイオポリマーからの放出は、５２５／５０ｎｍ検出チャネルで測定される。フローサイトメーターは、製造業者の取扱い説明書に従って設定される。染色細胞のサンプルのフローサイトメトリー分析は、製造業者のプロトコルに従って実施され、データは、問題の細胞集団に関するメジアン蛍光強度を得るための、当技術分野で周知の標準的な技法を使用して分析される。
【０２７９】
使用される特定の抗体複合体および特定の反応成分および使用される特定の反応条件は、得られる結果に影響を及ぼす可能性があることが理解されよう。通常の実験は、緩衝液や溶解溶液などの好ましい反応成分と、染色時間および温度を含めた反応条件を決定するのに実施されるべきである。アッセイ条件の、そのような通常の最適化は、免疫染色ベースのアッセイの分野で標準的に実施される。
【実施例５０】
【０２８０】
抗ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体
色素複合体を、色素とタンパク質との比のある範囲にわたり、化合物７、１３、および２５に個別の調製物としてそれぞれ複合されたＣＤ４およびＣＤ４５に特異的な抗体（それぞれ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡからのクローンＳＫ３および２ＤＤ１）を使用して調製した。抗体−色素複合体は、本質的に上記実施例４２で述べたように調製した。ＣＤ４およびＣＤ４５抗体の抗体複合体を使用して、本質的に上記実施例４９で述べたように、全血サンプル中のリンパ球を分析した。
【０２８１】
データは、各抗体−色素対に関し、最適な色素とタンパク質との比を示した。各抗体ごとに、３つの色素のそれぞれに関して最適な色素とタンパク質との比が、同様の比で生じた。同じ色素と複合した種々の抗体を比較すると、最適な色素とタンパク質との比は著しく異なっており、ＣＤ４に関しては、より高い比で最適な蛍光が観察された。これらの実験において、色素とタンパク質との比が最適な比よりも高い（試験範囲全体にわたって）ＣＤ４色素複合体では、目に見える自己消光が観察されず、蛍光は最適なレベルで維持された。対照的に、色素とタンパク質との比が最適な比よりも高いＣＤ４５色素複合体では、著しい自己消光が観察された。各色素化合物を使用して得られた最大蛍光染色を比較すると、化合物７は、化合物１３で行われたよりも良好な蛍光染色をもたらし、この化合物１３は、化合物２５で行われたよりも良好な蛍光染色をもたらした。
【０２８２】
結果は、３種の色素複合体の全てが、フローサイトメトリーによって分析される免疫蛍光アッセイ用の抗原特異的検出試薬を調製するのに有用であることを示す。一般に、色素とタンパク質との最適な比のそれぞれは、標識がなされる特定の抗体それぞれに関して実験により決定される（通常の最適化による）。
【実施例５１】
【０２８３】
抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体
色素複合体を、色素／タンパク質の比のある範囲にわたり、化合物７に対して個別の調製物としてそれぞれ複合された４種の異なる抗体、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体（それぞれ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡからのクローンＳＫ７、ＳＫ３、ＳＫ１、および２Ｄ１）を使用して調製した。抗体−色素複合体を、本質的に上記実施例４２で述べたように調製した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して、本質的に上記実施例４９で述べたように、全血サンプル中のリンパ球を分析した。
【０２８４】
分析の結果を図３〜６にまとめるが、これらは、色素複合体により標識されたリンパ球集団の蛍光強度を、各色素複合体に関する色素とタンパク質との比に対してプロットしたものを示す。図３〜５では、蛍光強度を、非染色集団から測定された蛍光分布の幅に対する、非染色「陰性」集団（即ち、バックグラウンド）から測定されたシグナル全体にわたる染色細胞集団の蛍光強度の尺度をもたらす「染色インデックス」として報告する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる文献参照（例えば、非特許文献３３参照））。染色インデックスは、下記の通り定義され：
染色インデックス＝（Ｓ−Ｕ）／（２×ＳＤ＿陰性）、
ただし、Ｓは染色細胞集団から測定されたメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）であり、Ｕは非染色細胞集団のＭＦＩであり、ＳＤ＿陰性は非染色細胞集団の蛍光強度の標準偏差である。図６で、蛍光強度は、メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）として報告される。ＣＤ４５抗体は全てのリンパ球に結合するので、これらの実験ではバックグラウンドを測定するのに使用される非染色リンパ球集団がなく、染色インデックスを計算することができない。
【０２８５】
色素複合抗体のそれぞれに関する最適な色素とタンパク質との比を、以下の表４に示す。
【０２８６】
【表９】
【０２８７】
図３は、色素とタンパク質との比のある範囲にわたる、化合物７に複合したＣＤ３抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ３抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体にわたり、染色されたリンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときに自己消光が観察された。
【０２８８】
図４は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたる、化合物７に複合したＣＤ４抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ４抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体を通して染色リンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときにごく僅かな自己消光しか観察されず、広範にわたる使用可能な比が得られた。
【０２８９】
図５は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたり、化合物７に複合したＣＤ８抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。得られた最大染色インデックスは、化合物７で標識されたこのＣＤ８抗体の色素複合体によって、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイでのバックグラウンド蛍光全体にわたり、染色されたリンパ球集団が区別可能であることを実証する。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときにごく僅かの自己消光しか観察されず、広範にわたる使用可能な比が得られた。
【０２９０】
図６は、色素とタンパク質との比の範囲全体にわたり、化合物７に複合したＣＤ４５抗体の色素複合体を使用して得られたデータのプロットを示す。ＭＦＩは、例えば光検出器利得に依存するので、得られた最大ＭＦＩは、細胞集団を区別するための色素複合体の有用性を直接示さない。しかし、化合物７で標識されたこのＣＤ４５抗体の色素複合体は、フローサイトメトリー免疫蛍光アッセイで使用されるリンパ球集団の適切な標識をもたらすことが観察された。この抗体と色素との組合せでは、色素とタンパク質との比が最適な値よりも高い値のときに自己消光が観察され、使用可能な比がより狭い範囲であることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の構造を有することを特徴とする化合物。
【化１】
［式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧにより１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項２】
ＨＣは、下式からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化２】
【請求項３】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化３】
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項４】
下記の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化４】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項５】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化５】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、Ｌ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、ＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する］
【請求項６】
ＲＧは、アクリルアミド、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはソラレン誘導体であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌは存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミド、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ＷＳＧは、スルホネート、チオスルフェート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジウム、キノリウム、またはアクリジウムであることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化６】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１０】
ＲＧは、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、またはマレイミドであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌは、存在せず、または３〜２０個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１２】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化７】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールである任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１３】
ＲＧは、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、またはマレイミドであることを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化８】
［式中、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ｎは、１〜１０の整数であり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１５】
下式を有することを特徴とする色素複合体。
【化９】
［式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、ＷＳＧである］
【請求項１６】
ＨＣは、下式からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１０】
【請求項１７】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１１】
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳＵＢに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項１８】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１２】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項１９】
下式を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１３】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つはＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する］
【請求項２０】
Ｌは存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールであることを特徴とする、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２１】
ＷＳＧは、スルホネート、チオスルフェート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジニウム、キノリウム、またはアクリジウムであることを特徴とする、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２２】
ＳＵＢはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２３】
ＳＵＢは抗体であることを特徴とする、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２４】
下式を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１４】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
Ｌは任意選択のリンカーであり；
ＳＵＢは基質であり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項２５】
Ｌは、存在せず、または３〜２０個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２６】
ＳＵＢはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２７】
ＳＵＢは抗体であることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２８】
サンプル中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルと、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の色素複合体を含む検出試薬とを、前記検出試薬が前記分析物と錯体を形成する条件下で組み合わせるステップと、
ｂ）前記錯体を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
式１、式２、式３、式４、式５、式６、式７、または式８の構造を有する少なくとも反応性色素化合物を含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
式９、式１０、式１１、式１２、または式１３の構造を有する少なくとも色素複合体を含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
下式の構造を有することを特徴とする化合物。
【化１５】
【請求項１】
下式の構造を有することを特徴とする化合物。
【化１】
［式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧにより１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項２】
ＨＣは、下式からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化２】
【請求項３】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化３】
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項４】
下記の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化４】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＬ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項５】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化５】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、ＷＳＧ、または、それ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、Ｌ−ＲＧ、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、Ｌ−ＲＧを含有し；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、ＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する］
【請求項６】
ＲＧは、アクリルアミド、アミン、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、またはソラレン誘導体であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌは存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミド、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ＷＳＧは、スルホネート、チオスルフェート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジウム、キノリウム、またはアクリジウムであることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化６】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１０】
ＲＧは、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、またはマレイミドであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌは、存在せず、または３〜２０個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１２】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化７】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ＲＧは、化学反応性基であり；
Ｌは、存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールである任意選択のリンカーであり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１３】
ＲＧは、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、またはマレイミドであることを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化８】
［式中、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
ｎは、１〜１０の整数であり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項１５】
下式を有することを特徴とする色素複合体。
【化９】
［式中、
ＨＣは複素環であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体がハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは、ＷＳＧである］
【請求項１６】
ＨＣは、下式からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１０】
【請求項１７】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１１】
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ10であり；
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ11、ＣＨ、またはＣＲ12であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳＵＢに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項１８】
下式の構造を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１２】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択で、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12の少なくとも１つはＷＳＧである］
【請求項１９】
下式を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１３】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、チオール、アルキルチオール、アリールチオール、アジド、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、ボロン酸、ＷＳＧ、またはそれ自体が任意選択でハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、カルボニル、ボロン酸、もしくはＷＳＧによって１回もしくは複数回置換されているアルキルもしくはアルコキシであり；
ＷＳＧは、水溶性基であり；
ｎは、１〜３５の整数であり；
ＳＵＢは、基質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つは、任意選択のリンカーＬを介してＳに共有結合されており；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11の少なくとも１つはＷＳＧであり；
Ｒ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートを含有する］
【請求項２０】
Ｌは存在せず、またはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、ポリエチレングリコール、アリール、もしくはヘテロアリールであることを特徴とする、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２１】
ＷＳＧは、スルホネート、チオスルフェート、ホスホネート、ボロネート、アンモニウム、ピリジニウム、キノリウム、またはアクリジウムであることを特徴とする、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２２】
ＳＵＢはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２３】
ＳＵＢは抗体であることを特徴とする、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の色素複合体。
【請求項２４】
下式を有することを特徴とする、請求項１５に記載の色素複合体。
【化１４】
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ10、およびＲ11は独立して、水素、クロロ、フルオロ、シアノ、またはスルホネートであり；
Ｌは任意選択のリンカーであり；
ＳＵＢは基質であり；
ただしＲ10およびＲ11の少なくとも１つはスルホネートである］
【請求項２５】
Ｌは、存在せず、または３〜２０個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、チオアルキル、アミノ酸、スルホアミノ酸、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２６】
ＳＵＢはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２７】
ＳＵＢは抗体であることを特徴とする、請求項２４に記載の色素複合体。
【請求項２８】
サンプル中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルと、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の色素複合体を含む検出試薬とを、前記検出試薬が前記分析物と錯体を形成する条件下で組み合わせるステップと、
ｂ）前記錯体を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
式１、式２、式３、式４、式５、式６、式７、または式８の構造を有する少なくとも反応性色素化合物を含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
式９、式１０、式１１、式１２、または式１３の構造を有する少なくとも色素複合体を含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
下式の構造を有することを特徴とする化合物。
【化１５】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２５４９９３（Ｐ２０１０−２５４９９３Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−８５２６０（Ｐ２０１０−８５２６０）
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８５２６０（Ｐ２０１０−８５２６０）
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
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