反応方法及び反応装置
【課題】気泡の混入を防止し、分析対象物質の検出、定量精度を高めることのできる反応方法及び反応装置を提供する。
【解決手段】第１の流路ＣＨ１において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行うものであって、第２の流路ＣＨ２に分析対象物質を含む液を流す工程と、第２の流路に流れる前記液の一部を、第４の流路ＣＨ４に引き込み、該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、第２の流路から退避させる工程と、前記検体液を前記第２の流路を経て第１の流路に送液する工程と、前記検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、第２の流路から退避させた前記洗浄液を第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、該洗浄液を第１の流路に送液する工程と、を備える。
【解決手段】第１の流路ＣＨ１において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行うものであって、第２の流路ＣＨ２に分析対象物質を含む液を流す工程と、第２の流路に流れる前記液の一部を、第４の流路ＣＨ４に引き込み、該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、第２の流路から退避させる工程と、前記検体液を前記第２の流路を経て第１の流路に送液する工程と、前記検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、第２の流路から退避させた前記洗浄液を第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、該洗浄液を第１の流路に送液する工程と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法及び反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の分子生物学の進歩により、血液等の生体物質を分析する事により、病気の治療における薬剤投与の効果や副作用の体質による個人差を予知することが可能であることが示されてきており、これを利用して、個人個人にとって最適な治療を施していこうという気運が高まっている。
【０００３】
例えば、特定の遺伝子と、特定の治療薬剤の効果や副作用が強く相関することがわかっている場合、この情報を特定の患者の治療に役立てるためには、患者の遺伝子の塩基配列を知る必要がある。内因性遺伝子の変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）に関する情報を得るための遺伝子診断は、そのような変異又は一塩基多型を含む標的核酸の増幅及び検出により行なうことができる。このため、サンプル中の標的核酸を迅速且つ正確に増幅及び検出し得る簡便な方法が求められる。
【０００４】
この場合、分析対象物質を特異的に吸着する抗体又は抗原等のタンパク質或いは一本鎖の核酸をプローブに使い、分析対象物質と抗原抗体反応又は核酸ハイブリダイゼーションを行う。そして、分析対象物質には、分析対象物質に特異的に結合する上記のタンパク質や核酸などを担持した酵素等の検知感度の高い標識物質を結合させておき、この標識物質を検出、定量して、分析対象物質の検出、定量を行っている。
【０００５】
この種の技術として、単一の流路に複数の液を順次投入し、流路内で抗原抗体反応及び洗浄操作を行う技術が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。そして、単一の流路に複数の液を順次投入するものにおいて、液の間に気泡が介入することを防止する技術も知られている（例えば、特許文献３参照）。特許文献３に開示された技術は、流路を疎水性とし、そこに、空気抜き用の穴と撥水バルブとを設け、加圧送液することにより液の間の空気を排出するようにしている。
【特許文献１】国際公開０３／０６２８２３号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−３３７２２１号公報
【特許文献３】特開２００７−８３１９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の特許文献１、２に開示された技術では、順次投入される液の間に気泡が介入する虞がある。気泡が介入すると、液が流路の一辺のみを伝わって不均一な流れとなり易く、送液が安定しない。また、気泡が混入すると先に流れる液の後端に気液界面が生じ、これが流路の反応部を通過することに起因して非特異的吸着が生じやすくなる。
【０００７】
ここで、非特異的吸着とは、本来的に相互作用しない分子に物質が吸着されることをいう。例えば抗原抗体反応において、抗原を分析対象物質とし、反応部に固定された抗体で抗原を特異的に吸着し、吸着された抗原に結合している標識物質を検出、定量して、抗原を検出、定量するところ、標識物質が単独で反応部に吸着されてしまうようなことをいう。
【０００８】
上記の特許文献３に開示された技術では、流路が疎水性であり、標識物質を抗原に結合させるために標識物質に担持させた抗体が疎水面に付着し易いため、標識物質の非特異的吸着が増加し、それに起因して分析対象物質の検出、定量精度の低下が懸念される。
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みなされたものであり、その目的は、気泡の混入を防止し、分析対象物質の検出、定量精度を高めることのできる反応方法及び反応装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１） 第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質を含む液を流す工程と、前記第２の流路に流れる前記液の一部を、該第２の流路から分岐した第４の流路に引き込み、該第４の流路において該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、前記第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、該洗浄液を前記第２の流路から退避させる工程と、前記検体液を前記第２の流路を経て前記第１の流路に送液する工程と、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、前記第２の流路から退避させた前記洗浄液を、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、を備える反応方法。
（２） （１）記載の反応方法であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路に、前記洗浄液を退避させる反応方法。
（３） （２）記載の反応方法であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接している反応方法。
【００１１】
上記の反応方法によれば、第２の流路に供給される液の一部を第４の流路に引き込み、これを前処理して検体液とし、第２の流路に残る液の残部を洗浄液とするので、マイクロ流体チップに複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率を向上させることができる。その場合に、分離された洗浄液は、第３の流路に退避させておいてもよいし、第５の流路を設け、そこに退避させるようにしてもよい。第５の流路が分岐した第２の流路の分岐部と第３の流路が合流した第２の流路の接続部とが隣接していれば、洗浄液が第５の流路から第３の流路に流れる際に経由する第２の流路の区間長が極力短縮され、第２の流路に残留した検体液の成分が洗浄液に混ざることを抑制することができる。
【００１２】
そして、上記の反応方法によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００１３】
（４） （１）〜（３）のいずれか一項記載の反応方法であって、前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【００１４】
上記の反応方法によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００１５】
（５） （４）記載の反応方法であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【００１６】
上記の反応方法によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００１７】
（６） （１）〜（５）のいずれか一項記載の反応方法であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【００１８】
上記の反応方法によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【００１９】
（７） 第１〜第４の流路、及びこれら第１〜第４の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第４のポートを含むマイクロ流体チップと、前記第１〜第４のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第４の流路に送液する送液手段と、前記送液手段を駆動する制御手段と、を備え、前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流し、前記第４の流路は、前記第２の流路から分岐しており、前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、前記第４の流路は、前記分析対象物質に標識物質を結合させる前処理を行い、前記制御手段は、前記分析対象物質を含み前記第２の流路に流れる液の一部を前記第４の流路に引き込んで前記前処理が施された検体液とし、該第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として該洗浄液を該第２の流路から退避させた後に、前記検体液を該第２の流路を経て前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に該第２の流路から退避させた前記洗浄液を前記第３の流路に流して該洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
（８） （７）記載の反応装置であって、前記マイクロ流体チップは、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路をさらに含み、前記制御手段は、前記洗浄液を前記第５の流路に退避させる反応装置。
（９） （８）記載の反応装置であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接する反応装置。
【００２０】
上記の反応装置によれば、第２の流路に供給される液の一部を第４の流路に引き込み、これを前処理して検体液とし、第２の流路に残る液の残部を洗浄液とするので、マイクロ流体チップに複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率を向上させることができる。その場合に、分離された洗浄液は、第３の流路に退避させておいてもよいし、第５の流路を設け、そこに退避させるようにしてもよい。第５の流路が分岐した第２の流路の分岐部と第３の流路が合流した第２の流路の接続部とが隣接していれば、洗浄液が第５の流路から第３の流路に流れる際に経由する第２の流路の区間長が極力短縮され、第２の流路に残留した検体液の成分が洗浄液に混ざることを抑制することができる。
【００２１】
そして、上記の反応装置によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００２２】
（１０） （７）〜（９）のいずれか一項記載の反応装置であって、前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【００２３】
上記の反応装置によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００２４】
（１１） （１０）記載の反応装置であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【００２５】
上記の反応装置によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００２６】
（１２） （７）〜（１１）のいずれか一項記載の反応装置であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【００２７】
上記の反応装置によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、吸着反応を行う第１の流路に順次供給される検体液と洗浄液との間に気泡が介入せず、それにより送液が安定すると共に非特異的吸着が抑制されるので、分析対象物質の検出、定量精度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照して説明する。
【００３０】
図１は本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図、図２は図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図、図３は図１のマイクロ流体チップのIII−III線断面図である。
【００３１】
図１に示すマイクロ流体チップ１０１は、第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、及び第４の流路ＣＨ４と、これらの流路ＣＨ１〜ＣＨ４の基端部にそれぞれ設けられた第１のポートＰＴ１、第２のポートＰＴ２、第３のポートＰＴ３、及び第４のポートＰＴ４と、を備えている。各ポートＰＴ１〜ＰＴ４には、各流路ＣＨ１〜ＣＨ４の内圧を制御するようにそれぞれ圧力が作用し、また、必要に応じて、マイクロ流体チップ１０１に供給される液が投入される。
【００３２】
第１の流路ＣＨ１及び第２の流路ＣＨ２は、それらの先端部ＣＨ１ａ，ＣＨ２ａにおいて互いに接続している。また、第３の流路ＣＨ３は、第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２の接続部（先端部）ＣＨ２ａに合流している。この第１の流路ＣＨ１は、第２の流路ＣＨ２との接続部（先端部）ＣＨ１ａから続く区間であって、その断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さい狭小区間ＣＨ１ｂを有している。そして、第４の流路ＣＨ４は、第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。
【００３３】
接続部ＣＨ１ａの開口４ａは、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａの底面にあって、該底面を形成するエッジから離れた位置にある（図３参照）。エッジから離れていることで、第２の流路ＣＨ２に流れる液が、そのエッジを伝って容易に狭小区間ＣＨ１ｂに流入してしまうことが防止される。それにより、まず第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａが液で満たされ、その後に狭小区間ＣＨ１ｂに流入する。そこで、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに気泡が残留することが防止される。
【００３４】
このマイクロ流体チップ１０１は、図２及び図３に示すように、複数の層Ｌ１〜Ｌ５を積層した構造となっている。第１の層Ｌ１は基板とされ、その上に積層される第２の層Ｌ２には、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが、層を貫通して形成されている。第２の層Ｌ２が第１の層Ｌ１と第３の層Ｌ３とで表裏から挟まれて、溝２ａの位置に狭小区間ＣＨ１ｂが構成される。
【００３５】
第３の層Ｌ３の上に積層される第４の層Ｌ４には、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１を構成するための溝２ｂ、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃ、第３の流路ＣＨ３を構成するための溝２ｄ、及び第４の流路ＣＨ４を構成するための溝２ｅが、それぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４が第３の層Ｌ３と第５の層Ｌ５とで表裏に挟まれて、溝２ｂ〜２ｅの位置に、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４がそれぞれ構成される。また、第４の層Ｌ４には、ポート孔３ｂ〜３ｅが、各溝２ｂ〜２ｅの基端部に層を貫通して形成されている。
【００３６】
第２の層Ｌ２と第４の層Ｌ４との間に介在する第３の層Ｌ３には、通孔４ａ，４ｂがそれぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４の溝２ｃの先端部（第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに相当）と第２の層Ｌ２の溝２ａの一端部（第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａに相当）とは上下に重なっており、通孔４ａはその間に配置されるようになっている。また、第４の層Ｌ４の溝２ｂの先端部と第２の層Ｌ２の溝２ａの他端部とは上下に重なっており、通孔４ｂはその間に配置されるようになっている。通孔４ａは、第２の流路に接続する第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａの開口を構成する。また、通孔４ｂは、狭小区間ＣＨ１ｂ及び該区間を除く第１の流路ＣＨ１を繋ぐ。
【００３７】
マイクロ流体チップ１の蓋となる第５の層Ｌ５には、ポート孔５ｂ〜５ｅがそれぞれ層を貫通して形成されている。ポート孔５ｂ〜５ｅは、第４の層Ｌ４のポート孔３ｂ〜３ｅに重なってポートＰＴ１〜ＰＴ４をそれぞれ構成し、外部から各ポートＰＴ１〜ＰＴ４への接続を提供する。
【００３８】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、その接続口ＣＨ１ｂを介して接続する第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、それらの断面積は、各層の厚みによって変えられている。例えば、流路の幅を２ｍｍで一定とし、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃが形成された第４の層Ｌ４の厚みが０．５〜３ｍｍとし、狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが形成された第２の層Ｌ２の厚みを０．０１〜０．２ｍｍとする。狭小区間ＣＨ１ｂの幅を第２の流路ＣＨ２の幅よりも小さくして、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａを第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくしてもよい。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。
【００３９】
以上の層Ｌ１〜Ｌ５は、例えばポリスチレンやアクリルなどの合成樹脂製の板で形成することができ、層間に両面粘着シートなどの接着材を適宜介在させて相互に接合されるが、例えば第２の層Ｌ２などは、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを形成するために比較的厚みが小さくなるので、それ自体を両面粘着シートで形成するようにしてもよい。各層の溝、ポート孔、及び連通孔は、例えばレーザー加工により形成される。
【００４０】
尚、第３の層Ｌ３において、少なくとも第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には透明な窓部６ａが設けられており、また、第４の層Ｌ４及び第５の層Ｌ５において、同じく第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には、窓孔６ｂ，６ｃが形成されている。層Ｌ１〜Ｌ５が順次積層された状態で、窓孔６ｂ，６ｃ及び窓部６ａにより検出部６が構成され、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、この検出部６を通して外部より視認可能である。
【００４１】
次に、マイクロ流体チップ１０１の使用例を説明する。図４はマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図であり、以下に説明するマイクロ流体チップの使用例では、マイクロ流体チップに分析対象物質としての抗原を含む検体液を供給し、マイクロ流体チップの流路内で抗原抗体反応を行って抗原を検出し、定量するものである。
【００４２】
図４に示すように、マイクロ流体チップ１０１の第２のポートＰＴ２には、抗原を含む未処理の検体液が投入される。
【００４３】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、検体液に含まれる抗原を特異的に吸着するプローブとしての抗体が固定され、抗原抗体反応を行う反応部とされている。尚、少なくとも反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの表面は、適宜な表面処理が施されて親水性とされている。
【００４４】
第４の流路ＣＨ４には、抗原に結合する抗体を担持した標識物質としての蛍光微粒子が固定された前処理部ＣＨ４ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２に流れる検体液の一部は、第４の流路ＣＨ４に引き込まれて前処理部ＣＨ４ａを流れ、その際に蛍光微粒子が抗原に結合し、処理済の検体液（第１の液）とされる。そして、第４の流路ＣＨ４に引き込まれることなく第２の流路ＣＨ２に残った未処理の検体液が、洗浄液（第２の液）とされる。
【００４５】
反応装置１１１は、上記のマイクロ流体チップ１０１と、電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ４と、空気を作動流体とするポンプ１２ａ，１２ｂと、圧力センサ（圧力測定手段）１３と、液位置検出手段１４と、蛍光検出手段１５と、制御手段１６と、を備えている。
【００４６】
第１のポートＰＴ１は、ポートパッド（不図示）及び配管を介してポンプ１２ａに接続されている。そして、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１とを接続する配管から分岐した配管には電磁バルブＳＶ１が接続されている。また、第３のポートＰＴ３、及び第４のポートＰＴ４は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ｂに接続されている。ポンプ１２ｂと第３のポートＰＴ３とを接続する配管には電磁バルブＳＶ３が介在し、電磁バルブＳＶ３と第３のポートＰＴ３とを接続する配管から分岐した配管に電磁バルブＳＶ２が接続されている。また、ポンプ１２ｂと第４のポートＰＴ４とを接続する配管には電磁バルブＳＶ４が介在している。尚、第２のポートＰＴ２は、常時、大気開放となっている。
【００４７】
圧力センサ１３は、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１との間に設けられ、第１のポートＰＴ１に作用する圧力、即ち第１の流路ＣＨ１の内圧を測定する。
【００４８】
液位置検出手段１４は、第１〜第４の流路ＣＨ１〜ＣＨ４の適宜な位置において、その位置に検体液又は洗浄液の先端が到達したことを検出する。検出方法としては、検出位置に光を照射して反射光を検出し、空気と液体との屈折率変化に基づく反射光の光量変化から、液体の有無を判定する方法を例示することができる。
【００４９】
図示の例では、液の検出位置として、第４の流路ＣＨ４における適宜な位置に第１の検出位置ＰＨ１が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第３のポートＰＴ３側の端部に第２の検出位置ＰＨ２が設けられ、第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂから第１のポートＰＴ１側に若干下った位置に第３の検出位置ＰＨ３が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第２の流路ＣＨ２に合流する手前の位置に第４の検出位置ＰＨ４が設けられ、また、第１の流路ＣＨ１において第１のポートＰＴ１の手前の位置に第５の検出位置ＰＨ５が設けられている。
【００５０】
蛍光検出手段１５は、マイクロ流体チップ１の検出部６を通して、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに特定波長の励起光を照射する。狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着された抗原に結合している蛍光微粒子が励起光を吸収して蛍光を発し、蛍光検出手段１５は、この蛍光を検出して抗原を検出し、また、その蛍光強度により抗原を定量する。
【００５１】
制御手段１６は、検査シーケンスを記憶したＲＯＭやＣＰＵなどを有し、圧力センサ１３から送出される測定信号、及び液位置検出手段１４から送出される検出信号を受け、それらの信号などに基づいて適宜なタイミングでポンプ１２ａ，１２ｂ及びバルブＳＶ１〜ＳＶ４を駆動して、ポートＰＴ１〜ＰＴ４を加圧、減圧、大気開放、密閉する。それにより、流路ＣＨ１〜ＣＨ４内で検体液及び洗浄液が自在に搬送される。
【００５２】
上記の反応装置１１１を用いた検査シーケンスを説明する。図５〜図８は検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図、図９は検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。以下において、図９の制御タイミングＶ２−１〜Ｖ２−１２と、図５〜図８の各ステップＳ２−１〜Ｓ２−２０を対応させて説明する。
【００５３】
マイクロ流体チップ１０１を用意し（Ｓ２−１）、マイクロ流体チップ１０１の第２のポートＰＴ２に未処理の検体液を投入する（Ｓ２−２）。
【００５４】
マイクロ流体チップ１０１を反応装置１１１にセットし、ポートＰＴ１〜ＰＴ４にポートパッドをそれぞれ押し付ける。この時、各ポートパッドは大気開とされ、パッドの押し付けにより検体液が移動することはない。
【００５５】
反応装置１１１のスタートスイッチが押されると（Ｖ２−１）、第４のポートＰＴ４が減圧され、検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第２の流路ＣＨ２に流れ、そして、検体液の先端側の一部は第４の流路ＣＨ４に引き込まれる。
【００５６】
第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液の先端が第１の検出位置ＰＨ１に到達し、第１の検出位置ＰＨ１について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｓ２−３、Ｖ２−２）、第４のポートＰＴ４は密閉され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液は第４の流路ＣＨ４において、また、第２の流路ＣＨ２に残った検体液は第２の流路ＣＨ２において停止する。第４の流路ＣＨ４に引き込まれる検体液の量は、第１の検出位置ＰＨ１の位置を調節することにより、任意に設定され得る。
【００５７】
第３のポートＰＴ３が減圧され、第２の流路ＣＨ２にある検体液は、第４の流路ＣＨ４が分岐する第２の流路ＣＨ２の分岐部ＣＨ２ｃにおいて第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液から分離され、高速で（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ２−４〜Ｓ２−５）。分離されて第３の流路ＣＨ３に流れる検体液は、後の工程で、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを洗浄するための洗浄液とされる。
【００５８】
第３の流路ＣＨ３に流れる洗浄液の先端が第２の検出位置ＰＨ２に到達し、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後（Ｓ２−６、Ｖ２−３）、所定時間（例えば１０秒）第３のポートＰＴ３が減圧され、全ての洗浄液が第３のポートＰＴ３に収容される（Ｓ２−７、Ｖ２−４）。その後、第３のポートＰＴ３は密閉される。
【００５９】
また、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後、所定時間（例えば１０秒）第４のポートＰＴ４が減圧され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれている検体液が、高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第４のポートＰＴ４側に送られ、前処理部ＣＨ４ａに流れる（Ｓ２−７、Ｖ２−４）。前処理部ＣＨ４ａに流れた検体液は、前処理部ＣＨ４ａにおいて蛍光微粒子を抗原に結合させ、処理済の検体液（以下、単に検体液という）とされる。尚、蛍光微粒子の結合が促進されるよう、第４のポートＰＴ４を交互に加減圧して、前処理部ＣＨ４ａ及びその近傍区間において検体液を往復移動させる（Ｓ２−８〜Ｓ２−９、Ｖ２−５）。
【００６０】
検体液の往復動作が終了した後（Ｖ２−６）、第４のポートＰＴ４が加圧され、また、第１のポートＰＴ１が減圧される。それにより、検体液は、高速（例えば６０μ／ｍｉｎ）で、第４の流路ＣＨ４から第２の流路ＣＨ２を経て第１の流路ＣＨ１に流れる（Ｓ２−１０〜Ｓ２−１２）。
【００６１】
検体液の先端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを通過して第３の検出位置ＰＨ３に到達し、第３の検出位置ＰＨ３における液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ２−７）、第１のポートＰＴ１は大気開放となり、検体液がその位置で停止する（Ｓ２−１３）。この動作により、検体液を所定の位置で精度よく停止させることができる。この時に検体液の後端が第２の流路ＣＨ２にあるように、第３の検出位置ＰＨ３は設定される。
【００６２】
第１のポートＰＴ１が大気開放となって所定時間（例えば０．５秒）経過すると（Ｖ２−８）、第１のポートＰＴ１が再び減圧され、検体液は、低速（例えば８μｌ／ｍｉｎ）で第１の流路ＣＨ１に流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて所定時間（例えば５分間）抗原抗体反応が行われる（Ｓ２−１４）。
【００６３】
検体液の後端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入すると、検体液が自動的に停止する（Ｓ２−１５）。これは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａが、第２の流路ＣＨ１の断面積Ａよりも小さくなっており、狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力が、搬送圧力よりも大きくなるためである。ポンプ１２ａは継続して吸引し続け、第１の流路ＣＨ３は徐々に減圧されるが、搬送圧力が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力よりも大きくなるまで検体液は停止している。
【００６４】
そこで、第１の流路ＣＨ１の内圧の変動を圧力センサ１３で測定することにより、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを検出することができる。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。これによれば、狭小区間ＣＨ１ｂの毛管力が第２の流路ＣＨ２のそれに比べて十分に大きく、検体液の後端が狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを、より確実に検出することができる。
【００６５】
第１の流路ＣＨ１の内圧が所定圧力（例えば０．３ｋＰａ）まで減圧されると（Ｖ２−９）、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したとして、第４のポートＰＴ４が減圧され、第３のポートＰＴ３に収容されている洗浄液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ２−１６）。この時、第１のポートＰＴ１及び第４のポートＰＴ４は同一の圧力となるようにポンプ１２ａ，１２ｂで吸引され、検体液が第１の流路ＣＨ１から第２の流路ＣＨ２に逆流することはない。
【００６６】
検体液が第１の流路ＣＨ１で停止している間に、第３の流路ＣＨ３に流れる洗浄液の先端が第４の検出位置ＰＨ４に到達し、第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になる（Ｓ２−１７、Ｖ２−１０）。それから所定時間（例えば３秒）経過すると（Ｖ２−１１）、洗浄液は、第３の流路ＣＨ３が合流する第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに到達する。第２の流路ＣＨ２は、その接続部ＣＨ２ａにおいて第１の流路ＣＨ１に接続していることから、洗浄液は、気泡の介入なく検体液の後端に合流する（Ｓ２−１８）。
【００６７】
そして、第４のポートＰＴ４が密閉され、第１のポートＰＴ１のみ減圧される。洗浄液が、気泡の介入なく検体液に連なって、低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で狭小区間ＣＨ１ｂに流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの洗浄が行われる（Ｓ２−１９）。それにより、未反応の抗原及び蛍光微粒子は狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。
【００６８】
洗浄液には抗原が含まれているが、それらの抗原には蛍光微粒子が結合していない。よって、洗浄の際に、洗浄液に含まれる抗原が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着されたとしても、それらの抗原が蛍光検出手段１５によって検出されることはなく、検体液に含まれる抗原の検出、定量に影響を生じない。
【００６９】
検体液及び洗浄液の全てが第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂより下流に流れ、液の先端が第５の検出位置ＰＨ５に到達し、第５の検出位置ＰＨ５について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ２−１２）、ポンプ１２ａが停止して液が停止する（Ｓ２−２０）。また、第１のポートＰＴ１、及び第４のポートＰＴ４が大気開放となる。
【００７０】
図１０に、反応部における抗原抗体反応を模式的に示す。図１０（ａ）〜（ｂ）に示すように、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに、蛍光微粒子（標識物質）Ｉｄが結合している抗原（分析対象物質）Ａｇを含む検体液が流れると、それらの抗原Ａｇは、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体（プローブ）Ｉｇに特異的に吸着される。尚、一部の抗原Ａｇ´が、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体Ｉｇに吸着されることなく検体液中に分散している場合もある。また、検体液には、抗原Ａｇに結合することなく単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄも含まれている。
【００７１】
図１０（ｃ）に示すように、狭小区間ＣＨ１ｂに洗浄液が流れると、抗体Ｉｇに吸着されずに検体液中に分散している抗原Ａｇ´及び検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄは、検体液又は洗浄液に乗って狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。ここで、検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄが抗体Ｉｇに非特異的に吸着されることがあり、非特異的に吸着された蛍光微粒子Ｉｄ´は、洗浄によっても狭小区間ＣＨ１ｂに残留する。
【００７２】
蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【００７３】
蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【００７４】
さらに、第２の流路ＣＨ２に供給される未処理の検体液の一部を第４の流路ＣＨ４の前処理部ＣＨ４ａに引き込んで処理し、これを処理済の検体液とするとともに、その余の未処理の検体液を洗浄液としているので、マイクロ流体チップ１に複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率が向上する。
【００７５】
続いて、図１１、及び図１２を参照して、マイクロ流体チップの他の例を説明する。
【００７６】
図１１は本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの他の例の平面図、図１２は図１１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。尚、上述したマイクロ流体チップ１０１と機能的に共通する要素には、同一符号を付し、説明を省略し、又は簡略する。
【００７７】
図１１に示すマイクロ流体チップ２０１は、第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４、及び第５の流路ＣＨ５と、これらの流路ＣＨ１〜ＣＨ５の基端部にそれぞれ設けられた第１のポートＰＴ１、第２のポートＰＴ２、第３のポートＰＴ３、第４のポートＰＴ４、及び第５のポートＰＴ５と、を備えている。各ポートＰＴ１〜ＰＴ５には、各流路ＣＨ１〜ＣＨ５の内圧を制御するようにそれぞれ圧力が作用し、また、必要に応じて、マイクロ流体チップ２０１に供給される液が投入される。
【００７８】
第１の流路ＣＨ１及び第２の流路ＣＨ２は、それらの先端部ＣＨ１ａ，ＣＨ２ａにおいて互いに接続している。また、第３の流路ＣＨ３は、第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２の接続部（先端部）ＣＨ２ａに合流している。この第１の流路ＣＨ１は、第２の流路ＣＨ２との接続部（先端部）ＣＨ１ａから続く区間であって、その断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さい狭小区間ＣＨ１ｂを有している。そして、第４の流路ＣＨ４は、第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。
【００７９】
第５の流路ＣＨ５は、第２の流路ＣＨ２において第３の流路ＣＨ３が合流した接続部ＣＨ２ａと第４の流路ＣＨ４が分岐した分岐部ＣＨ２ｃとの間で第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。この第５の流路ＣＨ５には、後述する洗浄液を収容するための収容部ＣＨ５ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２において第５の流路ＣＨ５が分岐する分岐部ＣＨ２ｄは、第３の流路ＣＨ３が合流した接続部ＣＨ２ａに隣接（極力接近）していることが好ましい。
【００８０】
このマイクロ流体チップ２０１は、図１２に示すように、複数の層Ｌ１〜Ｌ５を積層した構造となっている。第１の層Ｌ１は基板とされ、その上に積層される第２の層Ｌ２には、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが、層を貫通して形成されている。第２の層Ｌ２が第１の層Ｌ１と第３の層Ｌ３とで表裏から挟まれて、溝２ａの位置に狭小区間ＣＨ１ｂが構成される。
【００８１】
第３の層Ｌ３の上に積層される第４の層Ｌ４には、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１を構成するための溝２ｂ、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃ、第３の流路ＣＨ３を構成するための溝２ｄ、第４の流路ＣＨ４を構成するための溝２ｅ、及び第５の流路ＣＨ５を構成するための溝２ｆが、それぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４が第３の層Ｌ３と第５の層Ｌ５とで表裏に挟まれて、溝２ｂ〜２ｆの位置に、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４、及び第５の流路ＣＨ５がそれぞれ構成される。また、第４の層Ｌ４には、ポート孔３ｂ〜３ｆが、各溝２ｂ〜２ｆの基端部に層を貫通して形成されている。
【００８２】
第２の層Ｌ２と第４の層Ｌ４との間に介在する第３の層Ｌ３には、通孔４ａ，４ｂがそれぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４の溝２ｃの先端部（第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに相当）と第２の層Ｌ２の溝２ａの一端部（第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａに相当）とは上下に重なっており、通孔４ａはその間に配置されるようになっている。また、第４の層Ｌ４の溝２ｂの先端部と第２の層Ｌ２の溝２ａの他端部とは上下に重なっており、通孔４ｂはその間に配置されるようになっている。通孔４ａは、第２の流路に接続する第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａの開口を構成する。また、通孔４ｂは、狭小区間ＣＨ１ｂ及び該区間を除く第１の流路ＣＨ１を繋ぐ。
【００８３】
マイクロ流体チップ１の蓋となる第５の層Ｌ５には、ポート孔５ｂ〜５ｆがそれぞれ層を貫通して形成されている。ポート孔５ｂ〜５ｆは、第４の層Ｌ４のポート孔３ｂ〜３ｆに重なってポートＰＴ１〜ＰＴ５をそれぞれ構成し、外部から各ポートＰＴ１〜ＰＴ５への接続を提供する。
【００８４】
次に、マイクロ流体チップ２０１の使用例を説明する。図１３はマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図であり、以下に説明するマイクロ流体チップの使用例では、マイクロ流体チップに分析対象物質としての抗原を含む検体液を供給し、マイクロ流体チップの流路内で抗原抗体反応を行って抗原を検出し、定量するものである。
【００８５】
図１３に示すように、マイクロ流体チップ２０１の第２のポートＰＴ２には、抗原を含む未処理の検体液が投入される。
【００８６】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、検体液に含まれる抗原を特異的に吸着するプローブとしての抗体が固定され、抗原抗体反応を行う反応部とされている。
【００８７】
第４の流路ＣＨ４には、抗原に結合する抗体を担持した標識物質としての蛍光微粒子が固定された前処理部ＣＨ４ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２に流れる検体液の一部は、第４の流路ＣＨ４に引き込まれて前処理部ＣＨ４ａを流れ、その際に蛍光微粒子が抗原に結合し、処理済の検体液（第１の液）とされる。そして、第４の流路ＣＨ４に引き込まれることなく第２の流路ＣＨ２に残った未処理の検体液が、洗浄液（第２の液）とされる。
【００８８】
反応装置２１１は、上記のマイクロ流体チップ２０１と、電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ５と、空気を作動流体とするポンプ１２ａ，１２ｂと、圧力センサ１３と、液位置検出手段１４と、蛍光検出手段１５と、制御手段１６と、を備えている。
【００８９】
第１のポートＰＴ１、及び第３のポートＰＴ３は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ａに接続されている。ポンプ１２ａと第３のポートＰＴ３とを接続する配管には電磁バルブＳＶ１，ＳＶ３が介在し、また、電磁バルブＳＶ２が電磁バルブＳＶ３と並列に電磁バルブＳＶ１に接続されている。第４のポートＰＴ４、及び第５のポートＰＴ５は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ｂに接続されている。ポンプ１２ｂと第４のポートＰＴ４とを接続する配管には電磁バルブＳＶ５が介在し、また、ポンプ１２ｂと第５のポートＰＴ５とを接続する配管には電磁バルブＳＶ４が介在している。尚、第２のポートＰＴ２は、常時、大気開放となっている。
【００９０】
圧力センサ１３は、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１との間に設けられ、第１のポートＰＴ１に作用する圧力、即ち第１の流路ＣＨ１の内圧を検出する。
【００９１】
液位置検出手段１４は、第１〜第５の流路ＣＨ１〜ＣＨ５の適宜な位置において、その位置に検体液又は洗浄液の先端が到達したことを検出する。
【００９２】
図示の例では、液の検出位置として、第４の流路ＣＨ４における適宜な位置に第１の検出位置ＰＨ１が設けられ、第５の流路ＣＨ５において収容部ＣＨ５ａを第５のポートＰＴ５側に下った位置に第２の検出位置ＰＨ２が設けられ、第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂから第１のポートＰＴ１側に若干下った位置に第３の検出位置ＰＨ３が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第２の流路ＣＨ２に合流する手前の位置に第４の検出位置ＰＨ４が設けられ、また、第１の流路ＣＨ１において第１のポートＰＴ１の手前の位置に第５の検出位置ＰＨ５が設けられている。
【００９３】
制御手段１６は、圧力センサ１３から送出される測定信号、及び液位置検出手段１４から送出される検出信号を受け、それらの信号などに基づいて適宜なタイミングでポンプ１２ａ，１２ｂ及びバルブＳＶ１〜ＳＶ５の動作を制御して、ポートＰＴ１〜ＰＴ５を加圧、減圧、大気開放、密閉する。それにより、流路ＣＨ１〜ＣＨ５内で検体液及び洗浄液が自在に搬送される。
【００９４】
上記の反応装置２１１を用いた検査シーケンスを説明する。図１４〜図１７は検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図、図１８は検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。以下において、図１８の制御タイミングＶ３−１〜Ｖ３−１１と、図１４〜図１７の各ステップＳ３−１〜Ｓ３−２２を対応させて説明する。
【００９５】
マイクロ流体チップ２０１を用意し（Ｓ３−１）、マイクロ流体チップ１の第２のポートＰＴ２に未処理の検体液を投入する（Ｓ３−２）。
【００９６】
マイクロ流体チップ２０１を反応装置２１１にセットし、ポートＰＴ１〜ＰＴ５にポートパッドをそれぞれ押し付ける。この時、各ポートパッドは大気開とされ、パッドの押し付けにより検体液が移動することはない。
【００９７】
反応装置２１１のスタートスイッチが押されると（Ｖ３−１）、まず第４のポートＰＴ４が減圧され、検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第２の流路ＣＨ２に流れ、そして、検体液の先端側の一部は第４の流路ＣＨ４に引き込まれる。
【００９８】
第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液の先端が、第１の検出位置ＰＨ１に到達し、第１の検出位置ＰＨ１について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｓ３−３、Ｖ３−２）、第４のポートＰＴ４は密閉され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液は第４の流路ＣＨ４において、また、第２の流路ＣＨ２に残った検体液は第２の流路ＣＨ２において停止する。第４の流路ＣＨ４に引き込まれる検体液の量は、第１の検出位置ＰＨ１の位置を調節することにより、任意に設定され得る。
【００９９】
第５のポートＰＴ５が減圧され、第２の流路ＣＨ２にある検体液は、第４の流路ＣＨ４が分岐する第２の流路ＣＨ２の分岐部ＣＨ２ｃにおいて第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液から分離されて、高速で（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第５の流路ＣＨ５に流れる（Ｓ３−４〜Ｓ３−５）。分離されて第５の流路ＣＨ５に流れる検体液は、後の工程で、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを洗浄するための洗浄液とされる。
【０１００】
洗浄液の全てが第５の流路ＣＨ５に流入し、収容部ＣＨ５ａに収容された洗浄液の先端が第２の検出位置ＰＨ２に到達し、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となると（Ｓ３−６、Ｖ３−３）、第５のポートＰＴ５は密閉される。
【０１０１】
第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後、所定時間（例えば１０秒）第４のポートＰＴ４が減圧され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれている検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第４のポートＰＴ４側に送られ、前処理部ＣＨ４ａに流れる（Ｓ３−７〜Ｓ３−８、Ｖ３−４）。前処理部ＣＨ４ａに流れた検体液は、前処理部ＣＨ４ａにおいて蛍光微粒子を抗原に結合させ、処理済の検体液（以下、単に検体液という）とされる。尚、蛍光微粒子の結合が促進されるよう、第４のポートＰＴ４を交互に加減圧して、前処理部ＣＨ４ａ及びその近傍区間において、検体液を往復移動させている（Ｓ３−９〜Ｓ３−１０、Ｖ３−５）。
【０１０２】
検体液の往復動作が終了した後（Ｖ３−６）、第４のポートＰＴ４が加圧され、また、第１のポートＰＴ１が減圧される。それにより、検体液は、高速（例えば６０μ／ｍｉｎ）で、第４の流路ＣＨ４から第２の流路ＣＨ２を経て第１の流路ＣＨ１に流れる（Ｓ３−１１〜Ｓ３−１５）。
【０１０３】
検体液の先端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを通過して第３の検出位置ＰＨ３に到達し、第３の検出位置ＰＨ３における液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ３−７）、第１のポートＰＴ１及び第４のポートＰＴ４は大気開放となり、検体液がその位置で停止する（Ｓ３−１６）。この時に検体液の後端が第２の流路ＣＨ２にあるように、第３の検出位置ＰＨ３は設定される。
【０１０４】
第１のポートＰＴ１が大気開放となって所定時間（例えば０．５秒）経過すると（Ｖ３−８）、第１のポートＰＴ１が再び減圧され、検体液は、低速（例えば８μｌ／ｍｉｎ）で第１の流路ＣＨ１に流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて所定時間（例えば５分間）抗原抗体反応が行われる（Ｓ３−１７）。
【０１０５】
検体液の後端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入すると、検体液が自動的に停止する（Ｓ３−１８）。これは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａが、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力が、搬送圧力よりも大きくなるためである。ポンプ１２ａは継続して吸引し続け、第１の流路ＣＨ１は徐々に減圧されるが、搬送圧力が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力よりも大きくなるまで検体液は停止している。
【０１０６】
そこで、第１の流路ＣＨ１の内圧の変動を圧力センサ１３で測定することにより、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを検出することができる。
【０１０７】
第１の流路ＣＨ１の内圧が所定圧力（例えば０．３ｋＰａ）まで減圧されると（Ｖ３−９）、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したとして、第５のポートＰＴ５が加圧される一方で第３のポートＰＴ３が減圧され、第５の流路ＣＨ５の収容部ＣＨ５ａに収容されている洗浄液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ３−１９）。この時、第１のポートＰＴ１及び第３のポートＰＴ３は同一の圧力となるようにポンプ１２ａで吸引され、検体液が第１の流路ＣＨ１から第２の流路ＣＨ２に逆流することはない。
【０１０８】
洗浄液は、第５の流路ＣＨ５から第３の流路ＣＨ３に流れる過程で、検体液が流れた第２の流路ＣＨ２の一部の区間を経由することになるが、第２の流路ＣＨ２において第５の流路ＣＨ５が分岐する分岐部ＣＨ２ｄと第３の流路ＣＨ３が合流する接続部ＣＨ２ａとは隣接していることから、その区間長は極短く、よって、該区間に付着した検体液の成分（蛍光微粒子）が洗浄液に混入することが最小限にとどめられる。
【０１０９】
検体液が第１の流路ＣＨ１で停止している間に、洗浄液の先端が第４の検出位置ＰＨ４に到達し、第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になる（Ｓ３−２０、Ｖ３−１０）。ここで、第４の検出位置ＰＨ４が設けられている第３の流路ＣＨ３には、それ以前に液が流れておらず、空気と液体との屈折率変化に基づく反射光の光量変化から液体の有無を判定する検出方法において、より確実な検出が可能となる。そして、この時、第３の流路ＣＨ３が合流する第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａは第５の流路ＣＨ５から連なる洗浄液で満たされており、第２の流路ＣＨ２は、その接続部ＣＨ２ａにおいて第１の流路ＣＨ１に接続していることから、洗浄液は、気泡の介入なく検体液の後端に合流している。
【０１１０】
第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になった後、第３のポートＰＴ３は密閉され、第１のポートＰＴ１のみ減圧される。洗浄液が、気泡の介入なく検体液に連なって、低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で狭小区間ＣＨ１ｂに流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの洗浄が行われる（Ｓ３−２１）。それにより、未反応の抗原及び蛍光微粒子は狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。
【０１１１】
洗浄液には抗原が含まれているが、それらの抗原には蛍光微粒子が結合しておらず、また、前記のとおり第２の流路ＣＨ２に残留した検体液の成分（蛍光微粒子）の洗浄液への混入は最小限にとどめられている。よって、洗浄の際に、洗浄液に含まれる抗原が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着されたとしても、それらの抗原が蛍光検出手段１５によって検出されることはなく、検体液に含まれる抗原の検出、定量に影響を生じない。
【０１１２】
検体液及び洗浄液の全てが第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂより下流に流れ、液の先端が第５の検出位置ＰＨ５に到達し、第５の検出位置ＰＨ５について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ３−１１）、ポンプ１２ａが停止し、液が停止する（Ｓ３−２２）。
【０１１３】
そして、蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【０１１４】
さらに、第２の流路ＣＨ２に供給される未処理の検体液の一部を第４の流路ＣＨ４の前処理部ＣＨ４ａに引き込んで処理し、これを処理済の検体液とするとともに、その余の未処理の検体液を洗浄液としているので、マイクロ流体チップ１に複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率が向上する。
【実施例】
【０１１５】
図１〜図３に示す構成のマイクロ流体チップを用い、上述した検査シーケンスを経た後に反応部に存在する標識物質を検出、定量した。
【０１１６】
マイクロ流体チップは、ポリスチレン製基板の第１の層（１００×３０×１ｍｍ）、両面粘着シートである第２の層（１００×３０×０．０５ｍｍ）、アクリル製基板の第３の層（１００×３０×０．２ｍｍ）、表面に両面粘着シートを貼付したアクリル製基板の第４の層（１００×３０×０．７ｍｍ）、アクリル製基板の第５の層（１００×３０×０．２ｍｍ）を順次積層して構成されている。各層には、上述のとおり第１〜第４の流路となる溝、及び第１〜第４のポートとなるポート孔がレーザー加工で形成されている。第１の流路の狭小区間は、幅２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍに形成されており、また、反応部とされている。第１の流路に接続する第２の流路は、幅２ｍｍ、深さ０．７ｍｍに形成されている。
【０１１７】
以上の第１〜第５の層を下記の手順により積層した。
１）第１の層には、前処理として、蒸留水で洗浄を行い、乾燥させた後、ＵＶオゾン処理を行う。
２）第１の層と第２の層を、第２の層がチップの上層となるように積層する。
３）第１の層と第２の層を積層して形成した第１の流路の狭小区間の底面部分に、分析対象物質を特異的に吸着するためのプローブを固定する。その後、非特異的吸着を抑制するためのブロッキング処理、固定されたプローブの活性を維持するためのイムノスタビライザー処理を施す。
４）第３〜第５の層にはそれぞれブロッキング処理を施す。
５）第２の層の上に、さらに第３〜第５の層を順次積層する。
【０１１８】
分析対象物質をｈＣＧ抗原とし、反応部に固定されるプローブには抗ｈＣＧ抗体を用いた。検体液には、抗ｈＣＧ抗体を担持したポリスチレン製蛍光微粒子（Yellow Green、φ500nm）を標識物質として含むものを用いた。この検体液には、ｈＣＧ抗原は含まれておらず、よって、マイクロ流体チップの反応部に存在する蛍光微粒子は、非特異的に吸着されたものである。尚、洗浄液にはＰＢＳ−Ｔ溶液を用いた。
【０１１９】
上述した検査シーケンスにて反応を行った場合、即ち、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）、及び従来手法のように検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）について、反応部に非特異的に吸着された蛍光微粒子を定量した。結果を図１９に示す。
【０１２０】
図１９に示すとおり、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）に、蛍光微粒子の非特異的吸着は、検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）の１／１０以下になっており、よって、分析対象物質の検出・定量の精度が向上する。
【０１２１】
以上、分析対象物質を抗原とし、これを抗原抗体反応により特異的に吸着して検出、定量するものとして説明したが、これに限定されるものではない。例えば、分析対象物質を核酸とし、これをハイブリダイゼーションにより特異的に吸着して検出、定量するものにも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図である。
【図２】図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。
【図３】図１のマイクロ流体チップのIII-III線断面図である。
【図４】図１のマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図である。
【図５】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図６】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図７】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図８】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図９】図４の反応装置による検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。
【図１０】反応部における抗原抗体反応を示す模式図である。
【図１１】本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図である。
【図１２】図１１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。
【図１３】図１１のマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図である。
【図１４】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１５】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１６】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１７】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１８】図１３の反応装置による検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。
【図１９】実施例及び比較例の蛍光微粒子の定量結果を示すグラフである。
【０１２３】
１０１，２０１ マイクロ流体チップ
１１１，２１１ 反応装置
１２ａ，１２ｂ ポンプ（送液手段）
１３ 圧力センサ（圧力測定手段）
１６ 制御手段
ＣＨ１ 第１の流路
ＣＨ１ａ 第２の流路に接続する接続部
ＣＨ１ｂ 狭小区間
ＣＨ２ 第２の流路
ＣＨ２ａ 第１の流路に接続する接続部
ＣＨ２ｃ 第４の流路が分岐する分岐部
ＣＨ２ｄ 第５の流路が分岐する分岐部
ＣＨ３ 第３の流路
ＣＨ４ 第４の流路
ＣＨ４ａ 前処理部
ＣＨ５ 第５の流路
ＣＨ５ａ 収容部
ＰＴ１ 第１のポート
ＰＴ２ 第２のポート
ＰＴ３ 第３のポート
ＰＴ４ 第４のポート
ＰＴ５ 第５のポート
ＳＶ１ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ２ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ３ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ４ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ５ 電磁バルブ（送液手段）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法及び反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の分子生物学の進歩により、血液等の生体物質を分析する事により、病気の治療における薬剤投与の効果や副作用の体質による個人差を予知することが可能であることが示されてきており、これを利用して、個人個人にとって最適な治療を施していこうという気運が高まっている。
【０００３】
例えば、特定の遺伝子と、特定の治療薬剤の効果や副作用が強く相関することがわかっている場合、この情報を特定の患者の治療に役立てるためには、患者の遺伝子の塩基配列を知る必要がある。内因性遺伝子の変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）に関する情報を得るための遺伝子診断は、そのような変異又は一塩基多型を含む標的核酸の増幅及び検出により行なうことができる。このため、サンプル中の標的核酸を迅速且つ正確に増幅及び検出し得る簡便な方法が求められる。
【０００４】
この場合、分析対象物質を特異的に吸着する抗体又は抗原等のタンパク質或いは一本鎖の核酸をプローブに使い、分析対象物質と抗原抗体反応又は核酸ハイブリダイゼーションを行う。そして、分析対象物質には、分析対象物質に特異的に結合する上記のタンパク質や核酸などを担持した酵素等の検知感度の高い標識物質を結合させておき、この標識物質を検出、定量して、分析対象物質の検出、定量を行っている。
【０００５】
この種の技術として、単一の流路に複数の液を順次投入し、流路内で抗原抗体反応及び洗浄操作を行う技術が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。そして、単一の流路に複数の液を順次投入するものにおいて、液の間に気泡が介入することを防止する技術も知られている（例えば、特許文献３参照）。特許文献３に開示された技術は、流路を疎水性とし、そこに、空気抜き用の穴と撥水バルブとを設け、加圧送液することにより液の間の空気を排出するようにしている。
【特許文献１】国際公開０３／０６２８２３号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−３３７２２１号公報
【特許文献３】特開２００７−８３１９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の特許文献１、２に開示された技術では、順次投入される液の間に気泡が介入する虞がある。気泡が介入すると、液が流路の一辺のみを伝わって不均一な流れとなり易く、送液が安定しない。また、気泡が混入すると先に流れる液の後端に気液界面が生じ、これが流路の反応部を通過することに起因して非特異的吸着が生じやすくなる。
【０００７】
ここで、非特異的吸着とは、本来的に相互作用しない分子に物質が吸着されることをいう。例えば抗原抗体反応において、抗原を分析対象物質とし、反応部に固定された抗体で抗原を特異的に吸着し、吸着された抗原に結合している標識物質を検出、定量して、抗原を検出、定量するところ、標識物質が単独で反応部に吸着されてしまうようなことをいう。
【０００８】
上記の特許文献３に開示された技術では、流路が疎水性であり、標識物質を抗原に結合させるために標識物質に担持させた抗体が疎水面に付着し易いため、標識物質の非特異的吸着が増加し、それに起因して分析対象物質の検出、定量精度の低下が懸念される。
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みなされたものであり、その目的は、気泡の混入を防止し、分析対象物質の検出、定量精度を高めることのできる反応方法及び反応装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１） 第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質を含む液を流す工程と、前記第２の流路に流れる前記液の一部を、該第２の流路から分岐した第４の流路に引き込み、該第４の流路において該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、前記第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、該洗浄液を前記第２の流路から退避させる工程と、前記検体液を前記第２の流路を経て前記第１の流路に送液する工程と、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、前記第２の流路から退避させた前記洗浄液を、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、を備える反応方法。
（２） （１）記載の反応方法であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路に、前記洗浄液を退避させる反応方法。
（３） （２）記載の反応方法であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接している反応方法。
【００１１】
上記の反応方法によれば、第２の流路に供給される液の一部を第４の流路に引き込み、これを前処理して検体液とし、第２の流路に残る液の残部を洗浄液とするので、マイクロ流体チップに複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率を向上させることができる。その場合に、分離された洗浄液は、第３の流路に退避させておいてもよいし、第５の流路を設け、そこに退避させるようにしてもよい。第５の流路が分岐した第２の流路の分岐部と第３の流路が合流した第２の流路の接続部とが隣接していれば、洗浄液が第５の流路から第３の流路に流れる際に経由する第２の流路の区間長が極力短縮され、第２の流路に残留した検体液の成分が洗浄液に混ざることを抑制することができる。
【００１２】
そして、上記の反応方法によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００１３】
（４） （１）〜（３）のいずれか一項記載の反応方法であって、前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【００１４】
上記の反応方法によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００１５】
（５） （４）記載の反応方法であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【００１６】
上記の反応方法によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００１７】
（６） （１）〜（５）のいずれか一項記載の反応方法であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【００１８】
上記の反応方法によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【００１９】
（７） 第１〜第４の流路、及びこれら第１〜第４の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第４のポートを含むマイクロ流体チップと、前記第１〜第４のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第４の流路に送液する送液手段と、前記送液手段を駆動する制御手段と、を備え、前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流し、前記第４の流路は、前記第２の流路から分岐しており、前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、前記第４の流路は、前記分析対象物質に標識物質を結合させる前処理を行い、前記制御手段は、前記分析対象物質を含み前記第２の流路に流れる液の一部を前記第４の流路に引き込んで前記前処理が施された検体液とし、該第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として該洗浄液を該第２の流路から退避させた後に、前記検体液を該第２の流路を経て前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に該第２の流路から退避させた前記洗浄液を前記第３の流路に流して該洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
（８） （７）記載の反応装置であって、前記マイクロ流体チップは、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路をさらに含み、前記制御手段は、前記洗浄液を前記第５の流路に退避させる反応装置。
（９） （８）記載の反応装置であって、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接する反応装置。
【００２０】
上記の反応装置によれば、第２の流路に供給される液の一部を第４の流路に引き込み、これを前処理して検体液とし、第２の流路に残る液の残部を洗浄液とするので、マイクロ流体チップに複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率を向上させることができる。その場合に、分離された洗浄液は、第３の流路に退避させておいてもよいし、第５の流路を設け、そこに退避させるようにしてもよい。第５の流路が分岐した第２の流路の分岐部と第３の流路が合流した第２の流路の接続部とが隣接していれば、洗浄液が第５の流路から第３の流路に流れる際に経由する第２の流路の区間長が極力短縮され、第２の流路に残留した検体液の成分が洗浄液に混ざることを抑制することができる。
【００２１】
そして、上記の反応装置によれば、第２の流路に流れる検体液の後端が第１の流路に流入した後、検体液の送液を停止させ、第２の流路とは異なる流路であって、第１の流路に接続する第２の流路の接続部に合流した第３の流路に洗浄液を流して、第１の流路に停止する検体液の後端に洗浄液を合流させているので、検体液と洗浄液との間に気泡が介入しない。それにより、送液を安定させることができ、また、第１の流路における非特異的吸着を抑制することができる。
【００２２】
（１０） （７）〜（９）のいずれか一項記載の反応装置であって、前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【００２３】
上記の反応装置によれば、第２の流路より小さい断面積の狭小区間において作用する毛管力は、第２の流路のそれに比べて大きく、よって、検体液の後端が第２の流路から狭小区間に流入すると、狭小区間の毛管力に勝る程に第１の流路の内圧が減圧されるまで検体液は停止し、その間に反応流路の内圧は徐々に減圧される。そこで、第１の流路の内圧の変化により、検体液の後端が第１の流路に流入したことを検出し、検体液の送液を停止させることができる。
【００２４】
（１１） （１０）記載の反応装置であって、前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【００２５】
上記の反応装置によれば、狭小区間の毛管力が、第２の流路のそれに比べて比較的大きく、検体液の後端が第１の流路に流入したことを、より確実に検出できる。
【００２６】
（１２） （７）〜（１１）のいずれか一項記載の反応装置であって、前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【００２７】
上記の反応装置によれば、液がエッジを伝って容易に第１の流路に流入することを防止して、第２の流路の接続部を液で満たすことができ、より確実に気泡を排除することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、吸着反応を行う第１の流路に順次供給される検体液と洗浄液との間に気泡が介入せず、それにより送液が安定すると共に非特異的吸着が抑制されるので、分析対象物質の検出、定量精度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照して説明する。
【００３０】
図１は本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図、図２は図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図、図３は図１のマイクロ流体チップのIII−III線断面図である。
【００３１】
図１に示すマイクロ流体チップ１０１は、第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、及び第４の流路ＣＨ４と、これらの流路ＣＨ１〜ＣＨ４の基端部にそれぞれ設けられた第１のポートＰＴ１、第２のポートＰＴ２、第３のポートＰＴ３、及び第４のポートＰＴ４と、を備えている。各ポートＰＴ１〜ＰＴ４には、各流路ＣＨ１〜ＣＨ４の内圧を制御するようにそれぞれ圧力が作用し、また、必要に応じて、マイクロ流体チップ１０１に供給される液が投入される。
【００３２】
第１の流路ＣＨ１及び第２の流路ＣＨ２は、それらの先端部ＣＨ１ａ，ＣＨ２ａにおいて互いに接続している。また、第３の流路ＣＨ３は、第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２の接続部（先端部）ＣＨ２ａに合流している。この第１の流路ＣＨ１は、第２の流路ＣＨ２との接続部（先端部）ＣＨ１ａから続く区間であって、その断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さい狭小区間ＣＨ１ｂを有している。そして、第４の流路ＣＨ４は、第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。
【００３３】
接続部ＣＨ１ａの開口４ａは、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａの底面にあって、該底面を形成するエッジから離れた位置にある（図３参照）。エッジから離れていることで、第２の流路ＣＨ２に流れる液が、そのエッジを伝って容易に狭小区間ＣＨ１ｂに流入してしまうことが防止される。それにより、まず第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａが液で満たされ、その後に狭小区間ＣＨ１ｂに流入する。そこで、第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに気泡が残留することが防止される。
【００３４】
このマイクロ流体チップ１０１は、図２及び図３に示すように、複数の層Ｌ１〜Ｌ５を積層した構造となっている。第１の層Ｌ１は基板とされ、その上に積層される第２の層Ｌ２には、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが、層を貫通して形成されている。第２の層Ｌ２が第１の層Ｌ１と第３の層Ｌ３とで表裏から挟まれて、溝２ａの位置に狭小区間ＣＨ１ｂが構成される。
【００３５】
第３の層Ｌ３の上に積層される第４の層Ｌ４には、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１を構成するための溝２ｂ、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃ、第３の流路ＣＨ３を構成するための溝２ｄ、及び第４の流路ＣＨ４を構成するための溝２ｅが、それぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４が第３の層Ｌ３と第５の層Ｌ５とで表裏に挟まれて、溝２ｂ〜２ｅの位置に、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４がそれぞれ構成される。また、第４の層Ｌ４には、ポート孔３ｂ〜３ｅが、各溝２ｂ〜２ｅの基端部に層を貫通して形成されている。
【００３６】
第２の層Ｌ２と第４の層Ｌ４との間に介在する第３の層Ｌ３には、通孔４ａ，４ｂがそれぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４の溝２ｃの先端部（第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに相当）と第２の層Ｌ２の溝２ａの一端部（第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａに相当）とは上下に重なっており、通孔４ａはその間に配置されるようになっている。また、第４の層Ｌ４の溝２ｂの先端部と第２の層Ｌ２の溝２ａの他端部とは上下に重なっており、通孔４ｂはその間に配置されるようになっている。通孔４ａは、第２の流路に接続する第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａの開口を構成する。また、通孔４ｂは、狭小区間ＣＨ１ｂ及び該区間を除く第１の流路ＣＨ１を繋ぐ。
【００３７】
マイクロ流体チップ１の蓋となる第５の層Ｌ５には、ポート孔５ｂ〜５ｅがそれぞれ層を貫通して形成されている。ポート孔５ｂ〜５ｅは、第４の層Ｌ４のポート孔３ｂ〜３ｅに重なってポートＰＴ１〜ＰＴ４をそれぞれ構成し、外部から各ポートＰＴ１〜ＰＴ４への接続を提供する。
【００３８】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、その接続口ＣＨ１ｂを介して接続する第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、それらの断面積は、各層の厚みによって変えられている。例えば、流路の幅を２ｍｍで一定とし、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃが形成された第４の層Ｌ４の厚みが０．５〜３ｍｍとし、狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが形成された第２の層Ｌ２の厚みを０．０１〜０．２ｍｍとする。狭小区間ＣＨ１ｂの幅を第２の流路ＣＨ２の幅よりも小さくして、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａを第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくしてもよい。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。
【００３９】
以上の層Ｌ１〜Ｌ５は、例えばポリスチレンやアクリルなどの合成樹脂製の板で形成することができ、層間に両面粘着シートなどの接着材を適宜介在させて相互に接合されるが、例えば第２の層Ｌ２などは、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを形成するために比較的厚みが小さくなるので、それ自体を両面粘着シートで形成するようにしてもよい。各層の溝、ポート孔、及び連通孔は、例えばレーザー加工により形成される。
【００４０】
尚、第３の層Ｌ３において、少なくとも第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には透明な窓部６ａが設けられており、また、第４の層Ｌ４及び第５の層Ｌ５において、同じく第２の層Ｌ２の溝２ａに重なる部位には、窓孔６ｂ，６ｃが形成されている。層Ｌ１〜Ｌ５が順次積層された状態で、窓孔６ｂ，６ｃ及び窓部６ａにより検出部６が構成され、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、この検出部６を通して外部より視認可能である。
【００４１】
次に、マイクロ流体チップ１０１の使用例を説明する。図４はマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図であり、以下に説明するマイクロ流体チップの使用例では、マイクロ流体チップに分析対象物質としての抗原を含む検体液を供給し、マイクロ流体チップの流路内で抗原抗体反応を行って抗原を検出し、定量するものである。
【００４２】
図４に示すように、マイクロ流体チップ１０１の第２のポートＰＴ２には、抗原を含む未処理の検体液が投入される。
【００４３】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、検体液に含まれる抗原を特異的に吸着するプローブとしての抗体が固定され、抗原抗体反応を行う反応部とされている。尚、少なくとも反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの表面は、適宜な表面処理が施されて親水性とされている。
【００４４】
第４の流路ＣＨ４には、抗原に結合する抗体を担持した標識物質としての蛍光微粒子が固定された前処理部ＣＨ４ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２に流れる検体液の一部は、第４の流路ＣＨ４に引き込まれて前処理部ＣＨ４ａを流れ、その際に蛍光微粒子が抗原に結合し、処理済の検体液（第１の液）とされる。そして、第４の流路ＣＨ４に引き込まれることなく第２の流路ＣＨ２に残った未処理の検体液が、洗浄液（第２の液）とされる。
【００４５】
反応装置１１１は、上記のマイクロ流体チップ１０１と、電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ４と、空気を作動流体とするポンプ１２ａ，１２ｂと、圧力センサ（圧力測定手段）１３と、液位置検出手段１４と、蛍光検出手段１５と、制御手段１６と、を備えている。
【００４６】
第１のポートＰＴ１は、ポートパッド（不図示）及び配管を介してポンプ１２ａに接続されている。そして、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１とを接続する配管から分岐した配管には電磁バルブＳＶ１が接続されている。また、第３のポートＰＴ３、及び第４のポートＰＴ４は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ｂに接続されている。ポンプ１２ｂと第３のポートＰＴ３とを接続する配管には電磁バルブＳＶ３が介在し、電磁バルブＳＶ３と第３のポートＰＴ３とを接続する配管から分岐した配管に電磁バルブＳＶ２が接続されている。また、ポンプ１２ｂと第４のポートＰＴ４とを接続する配管には電磁バルブＳＶ４が介在している。尚、第２のポートＰＴ２は、常時、大気開放となっている。
【００４７】
圧力センサ１３は、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１との間に設けられ、第１のポートＰＴ１に作用する圧力、即ち第１の流路ＣＨ１の内圧を測定する。
【００４８】
液位置検出手段１４は、第１〜第４の流路ＣＨ１〜ＣＨ４の適宜な位置において、その位置に検体液又は洗浄液の先端が到達したことを検出する。検出方法としては、検出位置に光を照射して反射光を検出し、空気と液体との屈折率変化に基づく反射光の光量変化から、液体の有無を判定する方法を例示することができる。
【００４９】
図示の例では、液の検出位置として、第４の流路ＣＨ４における適宜な位置に第１の検出位置ＰＨ１が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第３のポートＰＴ３側の端部に第２の検出位置ＰＨ２が設けられ、第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂから第１のポートＰＴ１側に若干下った位置に第３の検出位置ＰＨ３が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第２の流路ＣＨ２に合流する手前の位置に第４の検出位置ＰＨ４が設けられ、また、第１の流路ＣＨ１において第１のポートＰＴ１の手前の位置に第５の検出位置ＰＨ５が設けられている。
【００５０】
蛍光検出手段１５は、マイクロ流体チップ１の検出部６を通して、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに特定波長の励起光を照射する。狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着された抗原に結合している蛍光微粒子が励起光を吸収して蛍光を発し、蛍光検出手段１５は、この蛍光を検出して抗原を検出し、また、その蛍光強度により抗原を定量する。
【００５１】
制御手段１６は、検査シーケンスを記憶したＲＯＭやＣＰＵなどを有し、圧力センサ１３から送出される測定信号、及び液位置検出手段１４から送出される検出信号を受け、それらの信号などに基づいて適宜なタイミングでポンプ１２ａ，１２ｂ及びバルブＳＶ１〜ＳＶ４を駆動して、ポートＰＴ１〜ＰＴ４を加圧、減圧、大気開放、密閉する。それにより、流路ＣＨ１〜ＣＨ４内で検体液及び洗浄液が自在に搬送される。
【００５２】
上記の反応装置１１１を用いた検査シーケンスを説明する。図５〜図８は検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図、図９は検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。以下において、図９の制御タイミングＶ２−１〜Ｖ２−１２と、図５〜図８の各ステップＳ２−１〜Ｓ２−２０を対応させて説明する。
【００５３】
マイクロ流体チップ１０１を用意し（Ｓ２−１）、マイクロ流体チップ１０１の第２のポートＰＴ２に未処理の検体液を投入する（Ｓ２−２）。
【００５４】
マイクロ流体チップ１０１を反応装置１１１にセットし、ポートＰＴ１〜ＰＴ４にポートパッドをそれぞれ押し付ける。この時、各ポートパッドは大気開とされ、パッドの押し付けにより検体液が移動することはない。
【００５５】
反応装置１１１のスタートスイッチが押されると（Ｖ２−１）、第４のポートＰＴ４が減圧され、検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第２の流路ＣＨ２に流れ、そして、検体液の先端側の一部は第４の流路ＣＨ４に引き込まれる。
【００５６】
第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液の先端が第１の検出位置ＰＨ１に到達し、第１の検出位置ＰＨ１について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｓ２−３、Ｖ２−２）、第４のポートＰＴ４は密閉され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液は第４の流路ＣＨ４において、また、第２の流路ＣＨ２に残った検体液は第２の流路ＣＨ２において停止する。第４の流路ＣＨ４に引き込まれる検体液の量は、第１の検出位置ＰＨ１の位置を調節することにより、任意に設定され得る。
【００５７】
第３のポートＰＴ３が減圧され、第２の流路ＣＨ２にある検体液は、第４の流路ＣＨ４が分岐する第２の流路ＣＨ２の分岐部ＣＨ２ｃにおいて第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液から分離され、高速で（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ２−４〜Ｓ２−５）。分離されて第３の流路ＣＨ３に流れる検体液は、後の工程で、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを洗浄するための洗浄液とされる。
【００５８】
第３の流路ＣＨ３に流れる洗浄液の先端が第２の検出位置ＰＨ２に到達し、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後（Ｓ２−６、Ｖ２−３）、所定時間（例えば１０秒）第３のポートＰＴ３が減圧され、全ての洗浄液が第３のポートＰＴ３に収容される（Ｓ２−７、Ｖ２−４）。その後、第３のポートＰＴ３は密閉される。
【００５９】
また、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後、所定時間（例えば１０秒）第４のポートＰＴ４が減圧され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれている検体液が、高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第４のポートＰＴ４側に送られ、前処理部ＣＨ４ａに流れる（Ｓ２−７、Ｖ２−４）。前処理部ＣＨ４ａに流れた検体液は、前処理部ＣＨ４ａにおいて蛍光微粒子を抗原に結合させ、処理済の検体液（以下、単に検体液という）とされる。尚、蛍光微粒子の結合が促進されるよう、第４のポートＰＴ４を交互に加減圧して、前処理部ＣＨ４ａ及びその近傍区間において検体液を往復移動させる（Ｓ２−８〜Ｓ２−９、Ｖ２−５）。
【００６０】
検体液の往復動作が終了した後（Ｖ２−６）、第４のポートＰＴ４が加圧され、また、第１のポートＰＴ１が減圧される。それにより、検体液は、高速（例えば６０μ／ｍｉｎ）で、第４の流路ＣＨ４から第２の流路ＣＨ２を経て第１の流路ＣＨ１に流れる（Ｓ２−１０〜Ｓ２−１２）。
【００６１】
検体液の先端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを通過して第３の検出位置ＰＨ３に到達し、第３の検出位置ＰＨ３における液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ２−７）、第１のポートＰＴ１は大気開放となり、検体液がその位置で停止する（Ｓ２−１３）。この動作により、検体液を所定の位置で精度よく停止させることができる。この時に検体液の後端が第２の流路ＣＨ２にあるように、第３の検出位置ＰＨ３は設定される。
【００６２】
第１のポートＰＴ１が大気開放となって所定時間（例えば０．５秒）経過すると（Ｖ２−８）、第１のポートＰＴ１が再び減圧され、検体液は、低速（例えば８μｌ／ｍｉｎ）で第１の流路ＣＨ１に流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて所定時間（例えば５分間）抗原抗体反応が行われる（Ｓ２−１４）。
【００６３】
検体液の後端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入すると、検体液が自動的に停止する（Ｓ２−１５）。これは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａが、第２の流路ＣＨ１の断面積Ａよりも小さくなっており、狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力が、搬送圧力よりも大きくなるためである。ポンプ１２ａは継続して吸引し続け、第１の流路ＣＨ３は徐々に減圧されるが、搬送圧力が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力よりも大きくなるまで検体液は停止している。
【００６４】
そこで、第１の流路ＣＨ１の内圧の変動を圧力センサ１３で測定することにより、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを検出することができる。好ましくは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａは第２の流路ＣＨ２の断面積Ａの２／５〜１／３００である。これによれば、狭小区間ＣＨ１ｂの毛管力が第２の流路ＣＨ２のそれに比べて十分に大きく、検体液の後端が狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを、より確実に検出することができる。
【００６５】
第１の流路ＣＨ１の内圧が所定圧力（例えば０．３ｋＰａ）まで減圧されると（Ｖ２−９）、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したとして、第４のポートＰＴ４が減圧され、第３のポートＰＴ３に収容されている洗浄液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ２−１６）。この時、第１のポートＰＴ１及び第４のポートＰＴ４は同一の圧力となるようにポンプ１２ａ，１２ｂで吸引され、検体液が第１の流路ＣＨ１から第２の流路ＣＨ２に逆流することはない。
【００６６】
検体液が第１の流路ＣＨ１で停止している間に、第３の流路ＣＨ３に流れる洗浄液の先端が第４の検出位置ＰＨ４に到達し、第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になる（Ｓ２−１７、Ｖ２−１０）。それから所定時間（例えば３秒）経過すると（Ｖ２−１１）、洗浄液は、第３の流路ＣＨ３が合流する第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに到達する。第２の流路ＣＨ２は、その接続部ＣＨ２ａにおいて第１の流路ＣＨ１に接続していることから、洗浄液は、気泡の介入なく検体液の後端に合流する（Ｓ２−１８）。
【００６７】
そして、第４のポートＰＴ４が密閉され、第１のポートＰＴ１のみ減圧される。洗浄液が、気泡の介入なく検体液に連なって、低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で狭小区間ＣＨ１ｂに流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの洗浄が行われる（Ｓ２−１９）。それにより、未反応の抗原及び蛍光微粒子は狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。
【００６８】
洗浄液には抗原が含まれているが、それらの抗原には蛍光微粒子が結合していない。よって、洗浄の際に、洗浄液に含まれる抗原が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着されたとしても、それらの抗原が蛍光検出手段１５によって検出されることはなく、検体液に含まれる抗原の検出、定量に影響を生じない。
【００６９】
検体液及び洗浄液の全てが第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂより下流に流れ、液の先端が第５の検出位置ＰＨ５に到達し、第５の検出位置ＰＨ５について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ２−１２）、ポンプ１２ａが停止して液が停止する（Ｓ２−２０）。また、第１のポートＰＴ１、及び第４のポートＰＴ４が大気開放となる。
【００７０】
図１０に、反応部における抗原抗体反応を模式的に示す。図１０（ａ）〜（ｂ）に示すように、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに、蛍光微粒子（標識物質）Ｉｄが結合している抗原（分析対象物質）Ａｇを含む検体液が流れると、それらの抗原Ａｇは、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体（プローブ）Ｉｇに特異的に吸着される。尚、一部の抗原Ａｇ´が、狭小区間ＣＨ１ｂに固定された抗体Ｉｇに吸着されることなく検体液中に分散している場合もある。また、検体液には、抗原Ａｇに結合することなく単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄも含まれている。
【００７１】
図１０（ｃ）に示すように、狭小区間ＣＨ１ｂに洗浄液が流れると、抗体Ｉｇに吸着されずに検体液中に分散している抗原Ａｇ´及び検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄは、検体液又は洗浄液に乗って狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。ここで、検体液中に単独で存在する蛍光微粒子Ｉｄが抗体Ｉｇに非特異的に吸着されることがあり、非特異的に吸着された蛍光微粒子Ｉｄ´は、洗浄によっても狭小区間ＣＨ１ｂに残留する。
【００７２】
蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【００７３】
蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【００７４】
さらに、第２の流路ＣＨ２に供給される未処理の検体液の一部を第４の流路ＣＨ４の前処理部ＣＨ４ａに引き込んで処理し、これを処理済の検体液とするとともに、その余の未処理の検体液を洗浄液としているので、マイクロ流体チップ１に複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率が向上する。
【００７５】
続いて、図１１、及び図１２を参照して、マイクロ流体チップの他の例を説明する。
【００７６】
図１１は本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの他の例の平面図、図１２は図１１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。尚、上述したマイクロ流体チップ１０１と機能的に共通する要素には、同一符号を付し、説明を省略し、又は簡略する。
【００７７】
図１１に示すマイクロ流体チップ２０１は、第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４、及び第５の流路ＣＨ５と、これらの流路ＣＨ１〜ＣＨ５の基端部にそれぞれ設けられた第１のポートＰＴ１、第２のポートＰＴ２、第３のポートＰＴ３、第４のポートＰＴ４、及び第５のポートＰＴ５と、を備えている。各ポートＰＴ１〜ＰＴ５には、各流路ＣＨ１〜ＣＨ５の内圧を制御するようにそれぞれ圧力が作用し、また、必要に応じて、マイクロ流体チップ２０１に供給される液が投入される。
【００７８】
第１の流路ＣＨ１及び第２の流路ＣＨ２は、それらの先端部ＣＨ１ａ，ＣＨ２ａにおいて互いに接続している。また、第３の流路ＣＨ３は、第１の流路ＣＨ１に接続した第２の流路ＣＨ２の接続部（先端部）ＣＨ２ａに合流している。この第１の流路ＣＨ１は、第２の流路ＣＨ２との接続部（先端部）ＣＨ１ａから続く区間であって、その断面積ａが第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さい狭小区間ＣＨ１ｂを有している。そして、第４の流路ＣＨ４は、第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。
【００７９】
第５の流路ＣＨ５は、第２の流路ＣＨ２において第３の流路ＣＨ３が合流した接続部ＣＨ２ａと第４の流路ＣＨ４が分岐した分岐部ＣＨ２ｃとの間で第２の流路ＣＨ２から分岐して延びている。この第５の流路ＣＨ５には、後述する洗浄液を収容するための収容部ＣＨ５ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２において第５の流路ＣＨ５が分岐する分岐部ＣＨ２ｄは、第３の流路ＣＨ３が合流した接続部ＣＨ２ａに隣接（極力接近）していることが好ましい。
【００８０】
このマイクロ流体チップ２０１は、図１２に示すように、複数の層Ｌ１〜Ｌ５を積層した構造となっている。第１の層Ｌ１は基板とされ、その上に積層される第２の層Ｌ２には、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを構成するための溝２ａが、層を貫通して形成されている。第２の層Ｌ２が第１の層Ｌ１と第３の層Ｌ３とで表裏から挟まれて、溝２ａの位置に狭小区間ＣＨ１ｂが構成される。
【００８１】
第３の層Ｌ３の上に積層される第４の層Ｌ４には、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１を構成するための溝２ｂ、第２の流路ＣＨ２を構成するための溝２ｃ、第３の流路ＣＨ３を構成するための溝２ｄ、第４の流路ＣＨ４を構成するための溝２ｅ、及び第５の流路ＣＨ５を構成するための溝２ｆが、それぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４が第３の層Ｌ３と第５の層Ｌ５とで表裏に挟まれて、溝２ｂ〜２ｆの位置に、狭小区間ＣＨ１ｂを除く第１の流路ＣＨ１、第２の流路ＣＨ２、第３の流路ＣＨ３、第４の流路ＣＨ４、及び第５の流路ＣＨ５がそれぞれ構成される。また、第４の層Ｌ４には、ポート孔３ｂ〜３ｆが、各溝２ｂ〜２ｆの基端部に層を貫通して形成されている。
【００８２】
第２の層Ｌ２と第４の層Ｌ４との間に介在する第３の層Ｌ３には、通孔４ａ，４ｂがそれぞれ層を貫通して形成されている。第４の層Ｌ４の溝２ｃの先端部（第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａに相当）と第２の層Ｌ２の溝２ａの一端部（第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａに相当）とは上下に重なっており、通孔４ａはその間に配置されるようになっている。また、第４の層Ｌ４の溝２ｂの先端部と第２の層Ｌ２の溝２ａの他端部とは上下に重なっており、通孔４ｂはその間に配置されるようになっている。通孔４ａは、第２の流路に接続する第１の流路ＣＨ１の接続部ＣＨ１ａの開口を構成する。また、通孔４ｂは、狭小区間ＣＨ１ｂ及び該区間を除く第１の流路ＣＨ１を繋ぐ。
【００８３】
マイクロ流体チップ１の蓋となる第５の層Ｌ５には、ポート孔５ｂ〜５ｆがそれぞれ層を貫通して形成されている。ポート孔５ｂ〜５ｆは、第４の層Ｌ４のポート孔３ｂ〜３ｆに重なってポートＰＴ１〜ＰＴ５をそれぞれ構成し、外部から各ポートＰＴ１〜ＰＴ５への接続を提供する。
【００８４】
次に、マイクロ流体チップ２０１の使用例を説明する。図１３はマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図であり、以下に説明するマイクロ流体チップの使用例では、マイクロ流体チップに分析対象物質としての抗原を含む検体液を供給し、マイクロ流体チップの流路内で抗原抗体反応を行って抗原を検出し、定量するものである。
【００８５】
図１３に示すように、マイクロ流体チップ２０１の第２のポートＰＴ２には、抗原を含む未処理の検体液が投入される。
【００８６】
第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂは、検体液に含まれる抗原を特異的に吸着するプローブとしての抗体が固定され、抗原抗体反応を行う反応部とされている。
【００８７】
第４の流路ＣＨ４には、抗原に結合する抗体を担持した標識物質としての蛍光微粒子が固定された前処理部ＣＨ４ａが設けられている。第２の流路ＣＨ２に流れる検体液の一部は、第４の流路ＣＨ４に引き込まれて前処理部ＣＨ４ａを流れ、その際に蛍光微粒子が抗原に結合し、処理済の検体液（第１の液）とされる。そして、第４の流路ＣＨ４に引き込まれることなく第２の流路ＣＨ２に残った未処理の検体液が、洗浄液（第２の液）とされる。
【００８８】
反応装置２１１は、上記のマイクロ流体チップ２０１と、電磁バルブＳＶ１〜ＳＶ５と、空気を作動流体とするポンプ１２ａ，１２ｂと、圧力センサ１３と、液位置検出手段１４と、蛍光検出手段１５と、制御手段１６と、を備えている。
【００８９】
第１のポートＰＴ１、及び第３のポートＰＴ３は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ａに接続されている。ポンプ１２ａと第３のポートＰＴ３とを接続する配管には電磁バルブＳＶ１，ＳＶ３が介在し、また、電磁バルブＳＶ２が電磁バルブＳＶ３と並列に電磁バルブＳＶ１に接続されている。第４のポートＰＴ４、及び第５のポートＰＴ５は、それぞれポートパッド（不図示）及び配管を介して並列にポンプ１２ｂに接続されている。ポンプ１２ｂと第４のポートＰＴ４とを接続する配管には電磁バルブＳＶ５が介在し、また、ポンプ１２ｂと第５のポートＰＴ５とを接続する配管には電磁バルブＳＶ４が介在している。尚、第２のポートＰＴ２は、常時、大気開放となっている。
【００９０】
圧力センサ１３は、ポンプ１２ａと第１のポートＰＴ１との間に設けられ、第１のポートＰＴ１に作用する圧力、即ち第１の流路ＣＨ１の内圧を検出する。
【００９１】
液位置検出手段１４は、第１〜第５の流路ＣＨ１〜ＣＨ５の適宜な位置において、その位置に検体液又は洗浄液の先端が到達したことを検出する。
【００９２】
図示の例では、液の検出位置として、第４の流路ＣＨ４における適宜な位置に第１の検出位置ＰＨ１が設けられ、第５の流路ＣＨ５において収容部ＣＨ５ａを第５のポートＰＴ５側に下った位置に第２の検出位置ＰＨ２が設けられ、第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂから第１のポートＰＴ１側に若干下った位置に第３の検出位置ＰＨ３が設けられ、第３の流路ＣＨ３において第２の流路ＣＨ２に合流する手前の位置に第４の検出位置ＰＨ４が設けられ、また、第１の流路ＣＨ１において第１のポートＰＴ１の手前の位置に第５の検出位置ＰＨ５が設けられている。
【００９３】
制御手段１６は、圧力センサ１３から送出される測定信号、及び液位置検出手段１４から送出される検出信号を受け、それらの信号などに基づいて適宜なタイミングでポンプ１２ａ，１２ｂ及びバルブＳＶ１〜ＳＶ５の動作を制御して、ポートＰＴ１〜ＰＴ５を加圧、減圧、大気開放、密閉する。それにより、流路ＣＨ１〜ＣＨ５内で検体液及び洗浄液が自在に搬送される。
【００９４】
上記の反応装置２１１を用いた検査シーケンスを説明する。図１４〜図１７は検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図、図１８は検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。以下において、図１８の制御タイミングＶ３−１〜Ｖ３−１１と、図１４〜図１７の各ステップＳ３−１〜Ｓ３−２２を対応させて説明する。
【００９５】
マイクロ流体チップ２０１を用意し（Ｓ３−１）、マイクロ流体チップ１の第２のポートＰＴ２に未処理の検体液を投入する（Ｓ３−２）。
【００９６】
マイクロ流体チップ２０１を反応装置２１１にセットし、ポートＰＴ１〜ＰＴ５にポートパッドをそれぞれ押し付ける。この時、各ポートパッドは大気開とされ、パッドの押し付けにより検体液が移動することはない。
【００９７】
反応装置２１１のスタートスイッチが押されると（Ｖ３−１）、まず第４のポートＰＴ４が減圧され、検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第２の流路ＣＨ２に流れ、そして、検体液の先端側の一部は第４の流路ＣＨ４に引き込まれる。
【００９８】
第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液の先端が、第１の検出位置ＰＨ１に到達し、第１の検出位置ＰＨ１について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｓ３−３、Ｖ３−２）、第４のポートＰＴ４は密閉され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液は第４の流路ＣＨ４において、また、第２の流路ＣＨ２に残った検体液は第２の流路ＣＨ２において停止する。第４の流路ＣＨ４に引き込まれる検体液の量は、第１の検出位置ＰＨ１の位置を調節することにより、任意に設定され得る。
【００９９】
第５のポートＰＴ５が減圧され、第２の流路ＣＨ２にある検体液は、第４の流路ＣＨ４が分岐する第２の流路ＣＨ２の分岐部ＣＨ２ｃにおいて第４の流路ＣＨ４に引き込まれた検体液から分離されて、高速で（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第５の流路ＣＨ５に流れる（Ｓ３−４〜Ｓ３−５）。分離されて第５の流路ＣＨ５に流れる検体液は、後の工程で、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを洗浄するための洗浄液とされる。
【０１００】
洗浄液の全てが第５の流路ＣＨ５に流入し、収容部ＣＨ５ａに収容された洗浄液の先端が第２の検出位置ＰＨ２に到達し、第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となると（Ｓ３−６、Ｖ３−３）、第５のポートＰＴ５は密閉される。
【０１０１】
第２の検出位置ＰＨ２について液位置検出手段１４がＯＮ状態となった後、所定時間（例えば１０秒）第４のポートＰＴ４が減圧され、第４の流路ＣＨ４に引き込まれている検体液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第４のポートＰＴ４側に送られ、前処理部ＣＨ４ａに流れる（Ｓ３−７〜Ｓ３−８、Ｖ３−４）。前処理部ＣＨ４ａに流れた検体液は、前処理部ＣＨ４ａにおいて蛍光微粒子を抗原に結合させ、処理済の検体液（以下、単に検体液という）とされる。尚、蛍光微粒子の結合が促進されるよう、第４のポートＰＴ４を交互に加減圧して、前処理部ＣＨ４ａ及びその近傍区間において、検体液を往復移動させている（Ｓ３−９〜Ｓ３−１０、Ｖ３−５）。
【０１０２】
検体液の往復動作が終了した後（Ｖ３−６）、第４のポートＰＴ４が加圧され、また、第１のポートＰＴ１が減圧される。それにより、検体液は、高速（例えば６０μ／ｍｉｎ）で、第４の流路ＣＨ４から第２の流路ＣＨ２を経て第１の流路ＣＨ１に流れる（Ｓ３−１１〜Ｓ３−１５）。
【０１０３】
検体液の先端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂを通過して第３の検出位置ＰＨ３に到達し、第３の検出位置ＰＨ３における液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ３−７）、第１のポートＰＴ１及び第４のポートＰＴ４は大気開放となり、検体液がその位置で停止する（Ｓ３−１６）。この時に検体液の後端が第２の流路ＣＨ２にあるように、第３の検出位置ＰＨ３は設定される。
【０１０４】
第１のポートＰＴ１が大気開放となって所定時間（例えば０．５秒）経過すると（Ｖ３−８）、第１のポートＰＴ１が再び減圧され、検体液は、低速（例えば８μｌ／ｍｉｎ）で第１の流路ＣＨ１に流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて所定時間（例えば５分間）抗原抗体反応が行われる（Ｓ３−１７）。
【０１０５】
検体液の後端が、第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入すると、検体液が自動的に停止する（Ｓ３−１８）。これは、狭小区間ＣＨ１ｂの断面積ａが、第２の流路ＣＨ２の断面積Ａよりも小さくなっており、狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力が、搬送圧力よりも大きくなるためである。ポンプ１２ａは継続して吸引し続け、第１の流路ＣＨ１は徐々に減圧されるが、搬送圧力が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて作用する毛管力よりも大きくなるまで検体液は停止している。
【０１０６】
そこで、第１の流路ＣＨ１の内圧の変動を圧力センサ１３で測定することにより、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したことを検出することができる。
【０１０７】
第１の流路ＣＨ１の内圧が所定圧力（例えば０．３ｋＰａ）まで減圧されると（Ｖ３−９）、検体液の後端が第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに流入したとして、第５のポートＰＴ５が加圧される一方で第３のポートＰＴ３が減圧され、第５の流路ＣＨ５の収容部ＣＨ５ａに収容されている洗浄液が高速（例えば６０μＬ／ｍｉｎ）で第３の流路ＣＨ３に流れる（Ｓ３−１９）。この時、第１のポートＰＴ１及び第３のポートＰＴ３は同一の圧力となるようにポンプ１２ａで吸引され、検体液が第１の流路ＣＨ１から第２の流路ＣＨ２に逆流することはない。
【０１０８】
洗浄液は、第５の流路ＣＨ５から第３の流路ＣＨ３に流れる過程で、検体液が流れた第２の流路ＣＨ２の一部の区間を経由することになるが、第２の流路ＣＨ２において第５の流路ＣＨ５が分岐する分岐部ＣＨ２ｄと第３の流路ＣＨ３が合流する接続部ＣＨ２ａとは隣接していることから、その区間長は極短く、よって、該区間に付着した検体液の成分（蛍光微粒子）が洗浄液に混入することが最小限にとどめられる。
【０１０９】
検体液が第１の流路ＣＨ１で停止している間に、洗浄液の先端が第４の検出位置ＰＨ４に到達し、第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になる（Ｓ３−２０、Ｖ３−１０）。ここで、第４の検出位置ＰＨ４が設けられている第３の流路ＣＨ３には、それ以前に液が流れておらず、空気と液体との屈折率変化に基づく反射光の光量変化から液体の有無を判定する検出方法において、より確実な検出が可能となる。そして、この時、第３の流路ＣＨ３が合流する第２の流路ＣＨ２の接続部ＣＨ２ａは第５の流路ＣＨ５から連なる洗浄液で満たされており、第２の流路ＣＨ２は、その接続部ＣＨ２ａにおいて第１の流路ＣＨ１に接続していることから、洗浄液は、気泡の介入なく検体液の後端に合流している。
【０１１０】
第４の検出位置ＰＨ４について液位置検出手段１４がＯＮ状態になった後、第３のポートＰＴ３は密閉され、第１のポートＰＴ１のみ減圧される。洗浄液が、気泡の介入なく検体液に連なって、低速（例えば８μＬ／ｍｉｎ）で狭小区間ＣＨ１ｂに流れ、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂの洗浄が行われる（Ｓ３−２１）。それにより、未反応の抗原及び蛍光微粒子は狭小区間ＣＨ１ｂから排出される。
【０１１１】
洗浄液には抗原が含まれているが、それらの抗原には蛍光微粒子が結合しておらず、また、前記のとおり第２の流路ＣＨ２に残留した検体液の成分（蛍光微粒子）の洗浄液への混入は最小限にとどめられている。よって、洗浄の際に、洗浄液に含まれる抗原が狭小区間ＣＨ１ｂにおいて抗原抗体反応により吸着されたとしても、それらの抗原が蛍光検出手段１５によって検出されることはなく、検体液に含まれる抗原の検出、定量に影響を生じない。
【０１１２】
検体液及び洗浄液の全てが第１の流路ＣＨ１において狭小区間ＣＨ１ｂより下流に流れ、液の先端が第５の検出位置ＰＨ５に到達し、第５の検出位置ＰＨ５について液位置検出手段１４がＯＮ状態になると（Ｖ３−１１）、ポンプ１２ａが停止し、液が停止する（Ｓ３−２２）。
【０１１３】
そして、蛍光検出手段１５により、反応部である第１の流路ＣＨ１の狭小区間ＣＨ１ｂに存在する蛍光微粒子を検出、定量し、それに基づいて抗原を検出、定量する。洗浄液が、気泡の介入なく洗浄液に連なって反応部である狭小区間ＣＨ１ｂを流れることで、検体液中で抗原に結合することなく単独で存在する蛍光微粒子が、反応部である狭小区間ＣＨ１ｂにおいて非特異的に吸着されることが抑制される。それにより、抗原の検出・定量の精度が向上する。
【０１１４】
さらに、第２の流路ＣＨ２に供給される未処理の検体液の一部を第４の流路ＣＨ４の前処理部ＣＨ４ａに引き込んで処理し、これを処理済の検体液とするとともに、その余の未処理の検体液を洗浄液としているので、マイクロ流体チップ１に複数の液を供給する手間を省くことができ、作業効率が向上する。
【実施例】
【０１１５】
図１〜図３に示す構成のマイクロ流体チップを用い、上述した検査シーケンスを経た後に反応部に存在する標識物質を検出、定量した。
【０１１６】
マイクロ流体チップは、ポリスチレン製基板の第１の層（１００×３０×１ｍｍ）、両面粘着シートである第２の層（１００×３０×０．０５ｍｍ）、アクリル製基板の第３の層（１００×３０×０．２ｍｍ）、表面に両面粘着シートを貼付したアクリル製基板の第４の層（１００×３０×０．７ｍｍ）、アクリル製基板の第５の層（１００×３０×０．２ｍｍ）を順次積層して構成されている。各層には、上述のとおり第１〜第４の流路となる溝、及び第１〜第４のポートとなるポート孔がレーザー加工で形成されている。第１の流路の狭小区間は、幅２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍに形成されており、また、反応部とされている。第１の流路に接続する第２の流路は、幅２ｍｍ、深さ０．７ｍｍに形成されている。
【０１１７】
以上の第１〜第５の層を下記の手順により積層した。
１）第１の層には、前処理として、蒸留水で洗浄を行い、乾燥させた後、ＵＶオゾン処理を行う。
２）第１の層と第２の層を、第２の層がチップの上層となるように積層する。
３）第１の層と第２の層を積層して形成した第１の流路の狭小区間の底面部分に、分析対象物質を特異的に吸着するためのプローブを固定する。その後、非特異的吸着を抑制するためのブロッキング処理、固定されたプローブの活性を維持するためのイムノスタビライザー処理を施す。
４）第３〜第５の層にはそれぞれブロッキング処理を施す。
５）第２の層の上に、さらに第３〜第５の層を順次積層する。
【０１１８】
分析対象物質をｈＣＧ抗原とし、反応部に固定されるプローブには抗ｈＣＧ抗体を用いた。検体液には、抗ｈＣＧ抗体を担持したポリスチレン製蛍光微粒子（Yellow Green、φ500nm）を標識物質として含むものを用いた。この検体液には、ｈＣＧ抗原は含まれておらず、よって、マイクロ流体チップの反応部に存在する蛍光微粒子は、非特異的に吸着されたものである。尚、洗浄液にはＰＢＳ−Ｔ溶液を用いた。
【０１１９】
上述した検査シーケンスにて反応を行った場合、即ち、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）、及び従来手法のように検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）について、反応部に非特異的に吸着された蛍光微粒子を定量した。結果を図１９に示す。
【０１２０】
図１９に示すとおり、検体液と洗浄液との間に気泡が介入していない場合（実施例）に、蛍光微粒子の非特異的吸着は、検体液と洗浄液との間に気泡が介入している場合（比較例）の１／１０以下になっており、よって、分析対象物質の検出・定量の精度が向上する。
【０１２１】
以上、分析対象物質を抗原とし、これを抗原抗体反応により特異的に吸着して検出、定量するものとして説明したが、これに限定されるものではない。例えば、分析対象物質を核酸とし、これをハイブリダイゼーションにより特異的に吸着して検出、定量するものにも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図である。
【図２】図１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。
【図３】図１のマイクロ流体チップのIII-III線断面図である。
【図４】図１のマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図である。
【図５】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図６】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図７】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図８】図４の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図９】図４の反応装置による検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。
【図１０】反応部における抗原抗体反応を示す模式図である。
【図１１】本発明の実施形態を説明するためのマイクロ流体チップの一例の平面図である。
【図１２】図１１のマイクロ流体チップを分解して示す平面図である。
【図１３】図１１のマイクロ流体チップを含む反応装置の概略構成を示すブロック図である。
【図１４】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１５】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１６】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１７】図１３の反応装置による検査シーケンスの各ステップにおけるマイクロ流体チップの状態を示す平面図である。
【図１８】図１３の反応装置による検査シーケンスの制御タイミング及び反応装置の各要素の状態を時間軸に沿って示すタイムチャートである。
【図１９】実施例及び比較例の蛍光微粒子の定量結果を示すグラフである。
【０１２３】
１０１，２０１ マイクロ流体チップ
１１１，２１１ 反応装置
１２ａ，１２ｂ ポンプ（送液手段）
１３ 圧力センサ（圧力測定手段）
１６ 制御手段
ＣＨ１ 第１の流路
ＣＨ１ａ 第２の流路に接続する接続部
ＣＨ１ｂ 狭小区間
ＣＨ２ 第２の流路
ＣＨ２ａ 第１の流路に接続する接続部
ＣＨ２ｃ 第４の流路が分岐する分岐部
ＣＨ２ｄ 第５の流路が分岐する分岐部
ＣＨ３ 第３の流路
ＣＨ４ 第４の流路
ＣＨ４ａ 前処理部
ＣＨ５ 第５の流路
ＣＨ５ａ 収容部
ＰＴ１ 第１のポート
ＰＴ２ 第２のポート
ＰＴ３ 第３のポート
ＰＴ４ 第４のポート
ＰＴ５ 第５のポート
ＳＶ１ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ２ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ３ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ４ 電磁バルブ（送液手段）
ＳＶ５ 電磁バルブ（送液手段）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、
前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質を含む液を流す工程と、
前記第２の流路に流れる前記液の一部を、該第２の流路から分岐した第４の流路に引き込み、該第４の流路において該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、
前記第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、該洗浄液を前記第２の流路から退避させる工程と、
前記検体液を前記第２の流路を経て前記第１の流路に送液する工程と、
前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、
前記第２の流路から退避させた前記洗浄液を、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、
前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、
を備える反応方法。
【請求項２】
請求項１記載の反応方法であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路に、前記洗浄液を退避させる反応方法。
【請求項３】
請求項２記載の反応方法であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接している反応方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の反応方法であって、
前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、
前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【請求項５】
請求項４記載の反応方法であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項記載の反応方法であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【請求項７】
第１〜第４の流路、及びこれら第１〜第４の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第４のポートを含むマイクロ流体チップと、
前記第１〜第４のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第４の流路に送液する送液手段と、
前記送液手段を駆動する制御手段と、
を備え、
前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流し、前記第４の流路は、前記第２の流路から分岐しており、
前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、前記第４の流路は、前記分析対象物質に標識物質を結合させる前処理を行い、
前記制御手段は、前記分析対象物質を含み前記第２の流路に流れる液の一部を前記第４の流路に引き込んで前記前処理が施された検体液とし、該第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として該洗浄液を該第２の流路から退避させた後に、前記検体液を該第２の流路を経て前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に該第２の流路から退避させた前記洗浄液を前記第３の流路に流して該洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
【請求項８】
請求項７記載の反応装置であって、
前記マイクロ流体チップは、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路をさらに含み、
前記制御手段は、前記洗浄液を前記第５の流路に退避させる反応装置。
【請求項９】
請求項８記載の反応装置であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接する反応装置。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項記載の反応装置であって、
前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、
前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、
前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の反応装置であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【請求項１２】
請求項７〜請求項１１のいずれか一項記載の反応装置であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【請求項１】
第１の流路において分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行う反応方法であって、
前記第１の流路に接続した第２の流路に前記分析対象物質を含む液を流す工程と、
前記第２の流路に流れる前記液の一部を、該第２の流路から分岐した第４の流路に引き込み、該第４の流路において該液に含まれる前記分析対象物質に標識物質を結合させて検体液とする工程と、
前記第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として、該洗浄液を前記第２の流路から退避させる工程と、
前記検体液を前記第２の流路を経て前記第１の流路に送液する工程と、
前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出し、該検体液の送液を停止させる工程と、
前記第２の流路から退避させた前記洗浄液を、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流した第３の流路に流し、該第１の流路に停止する前記検体液の後端に該洗浄液を合流させる工程と、
前記検体液の後端に前記洗浄液が合流した後に該洗浄液を前記第１の流路に送液する工程と、
を備える反応方法。
【請求項２】
請求項１記載の反応方法であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路に、前記洗浄液を退避させる反応方法。
【請求項３】
請求項２記載の反応方法であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接している反応方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の反応方法であって、
前記第１の流路に、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を設け、
前記第１の流路の内圧の変化に基づいて、前記検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出する反応方法。
【請求項５】
請求項４記載の反応方法であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項記載の反応方法であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応方法。
【請求項７】
第１〜第４の流路、及びこれら第１〜第４の流路の基端部にそれぞれ設けられた第１〜第４のポートを含むマイクロ流体チップと、
前記第１〜第４のポートにそれぞれ圧力を作用させ、前記第１〜第４の流路に送液する送液手段と、
前記送液手段を駆動する制御手段と、
を備え、
前記第１の流路及び前記第２の流路は、それらの先端部において互いに接続し、前記第３の流路は、前記第１の流路に接続する前記第２の流路の接続部に合流し、前記第４の流路は、前記第２の流路から分岐しており、
前記第１の流路は、分析対象物質を特異的に吸着する吸着反応を行い、前記第４の流路は、前記分析対象物質に標識物質を結合させる前処理を行い、
前記制御手段は、前記分析対象物質を含み前記第２の流路に流れる液の一部を前記第４の流路に引き込んで前記前処理が施された検体液とし、該第２の流路に残る前記液の残部を洗浄液として該洗浄液を該第２の流路から退避させた後に、前記検体液を該第２の流路を経て前記第１の流路に送液し、該検体液の後端が該第１の流路に流入したことを検出して、該検体液の送液を停止させると共に該第２の流路から退避させた前記洗浄液を前記第３の流路に流して該洗浄液を該第１の流路に停止する該検体液の後端に合流させ、該検体液の後端に該洗浄液が合流した後に該洗浄液を該第１の流路に送液する反応装置。
【請求項８】
請求項７記載の反応装置であって、
前記マイクロ流体チップは、前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第４の流路が分岐した該第２の流路の分岐部との間で該第２の流路から分岐して延びる第５の流路をさらに含み、
前記制御手段は、前記洗浄液を前記第５の流路に退避させる反応装置。
【請求項９】
請求項８記載の反応装置であって、
前記第３の流路が合流した前記第２の流路の前記接続部と前記第５の流路が分岐した該第２の流路の分岐部とが隣接する反応装置。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項記載の反応装置であって、
前記第１のポートに作用する圧力を測定する圧力測定手段をさらに備え、
前記第１の流路が、前記第２の流路との接続部から続く区間であって、その断面積ａが該第２の流路の断面積Ａよりも小さい狭小区間を有しており、
前記制御手段は、前記圧力測定手段から送出される測定信号に基づいて、前記検体液の後端が前記第１の流路に流入したことを検出する反応装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の反応装置であって、
前記狭小区間の断面積ａは、前記第２の流路の断面積Ａの２／５〜１／３００である反応装置。
【請求項１２】
請求項７〜請求項１１のいずれか一項記載の反応装置であって、
前記第２の流路に接続する前記第１の流路の接続部の開口が、該第２の流路の一面にあって該面のエッジから離れた位置にある反応装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−８５１２８（Ｐ２０１０−８５１２８Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５１８７６（Ｐ２００８−２５１８７６）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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