受容体特異的ナノ容器を使用するショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子の送達
所定受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するために受容体特異的ナノ容器を使用する。細胞の内側に入ると、前記遺伝子はヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡ等の癌遺伝子や他の疾患原因ヌクレオチド配列の少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含むショートヘアピンＲＮＡを発現する。ショートヘアピンＲＮＡは細胞質において発癌遺伝子又は疾患原因遺伝子を不活性化（ノックダウン）するのに有効な短いＲＮＡデュプレックスに変換される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般には脳を含む体内臓器及び組織への遺伝子薬の送達に関する。より詳細には、本発明はリポソーム技術、受容体技術、ペグ化技術及び治療遺伝子技術を併用したアンチセンス遺伝子治療に関する。本発明は脳腫瘍及び他の固形癌の治療に有用な製剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を記載するため及びその実施に関する更に詳細を記載するために本明細書に言及する刊行物及び他の参考文献は参考資料として本明細書に組込む。便宜のために、参考文献に番号を付け、末尾に一覧にまとめる。
【０００３】
遺伝子治療は１０年以上前から５０００人を越える患者で使用されているが、脳腫瘍を含むヒトにおける癌の治療では成功していない（１）。ペトリ皿や基礎動物モデルで癌治療の成功例は多いが、癌をもつヒトではこの進歩が得られていない。ペトリ皿からヒトに発展できないのは細胞培養系には存在しない数種の遺伝子送達障害が人体に存在するためである。脳腫瘍の遺伝子治療では、治療遺伝子をウイルスベクターに組込み、開頭術後に脳に注入している（１）。しかし、このアプローチは２つの理由で問題がある。第１に、血管脳関門（ＢＢＢ）を形成する腫瘍の血管関門を通って遺伝子を送達するのが脳内の全癌遺伝子に治療遺伝子を送達する唯一の方法である。患者の頭部に穴を開け、この穴を通して遺伝子を注入するので、遺伝子を送達する癌細胞の率が低い（１）。第２に、ウイルスベクターの使用は問題がある。
【０００４】
アデノウイルスやヘルペスウイルス等のウイルスベクターは脳に炎症を生じ、脱髄をもたらす（２，３）。レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルスベクターは患者の染色体にランダム及び永久的組込みを生じ（４，５）、挿入突然変異誘発による二次癌を誘発する恐れがある。従って、遺伝子治療の制限因子は非ウイルス送達システムの必要性と、静脈内注射後にＢＢＢを通過する遺伝子送達システムの必要性の両面に関する送達である。このような遺伝子送達システムは脳を含む組織及び臓器に遺伝子を送達するためにペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）を使用する米国特許第６，３７２，２５０号に教示されている。
【０００５】
疾患遺伝子の発現をノックダウンすることを目的とする特殊な型の遺伝子治療をアンチセンス遺伝子治療と言う。治療遺伝子は細胞内で標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスの長鎖ＲＮＡをコードする。アンチセンスＲＮＡは標的ｍＲＮＡとデュプレックスを形成し、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するか又はｍＲＮＡ翻訳を阻止し、ある種の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を生じる。過去数年以内に、約２０ヌクレオチド長の短いＲＮＡデュプレックスを細胞に注入することによりＰＴＧＳを誘発できることが発見された（６）。
【０００６】
ＲＮＡデュプレックスは標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスの規定配列をもち、ＲＮＡデュプレックスと標的ｍＲＮＡの複合体が形成されると、標的ｍＲＮＡの分解又はｍＲＮＡ翻訳阻止とＰＴＧＳを生じる。この形態のＰＴＧＳは短いＲＮＡデュプレックスにより媒介されることからＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる（７）。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでは非常に不安定であるので、発現プラスミドがステム−ループ構造からなるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ形態のＲＮＡｉが開発された（６）。ｓｈＲＮＡは細胞で発現されると、細胞質に輸送され、短いＲＮＡデュプレックスにプロセシングされた後、標的ｍＲＮＡのＰＴＧＳを生じることができる（６）。ｓｈＲＮＡは標的ｍＲＮＡに１００％相補的であり、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能し、標的ｍＲＮＡ分解を誘導することができる。あるいは、ｓｈＲＮＡは標的ｍＲＮＡ配列に対して不完全な相補性をもち、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として機能し、標的ｍＲＮＡ翻訳阻止を生じることもできる。ＲＮＡｉは癌、ウイルス感染症及び他の疾患の治療に大いに期待されるが、ヒトにおけるＲＮＡｉの適用はまだ別形態の遺伝子治療であるため、他の形態の遺伝子治療と同一の送達の問題により制限されている（８）。ヒトでは如何なる形態の遺伝子治療も臨床的に成功していないので、過去に使用されている標準アプローチによりＲＮＡｉ遺伝子治療が成功するとは殆ど考えられない。
【０００７】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）と呼ばれる原発性極悪性脳腫瘍の９０％で過剰発現され（９）、固形癌一般の７０％で過剰発現される（１０）。ＥＧＦＲはこれらの癌で腫瘍形成の役割を果たし、新癌治療の開発で現在最も集中的に研究されているターゲットである。癌におけるＥＧＦＲをノックダウンするために小分子（１１）や、ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体（１２）を含む各種のアプローチが試みられている。ペトリ皿での研究ではアンチセンス遺伝子治療によるＥＧＦＲのターゲティングを実施できることが示されている（１３）が、送達の問題を解決できないため、脳腫瘍を含む癌をもつ動物生体でこのアプローチを実施するには至っていない。
【０００８】
ｎｔ２３００−３０００のヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡに対してアンチセンスの７００ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡをコードする非ウイルス発現プラスミドが作製されている（１４）。ＰＩＬ遺伝子ターゲティングアプローチを使用して脳腫瘍をもつマウスにこの発現プラスミドを送達し、マウスの生存時間の１００％増加が達成された（１５）。しかし、この発現プラスミドの効力を増加するためには、エプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）−１をコードする遺伝子をプラスミドに加える必要があった（１５）。ＥＢＮＡ−１は分割細胞で遺伝子発現を増加し、ＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術による細胞送達後にヒト脳腫瘍における外来遺伝子発現を１０倍に増加した（１６）。しかし、ＥＢＮＡ−１は腫瘍形成性であり（１７）、ヒトで使用する遺伝子に組込むと癌を発生する恐れがある。従って、ＥＧＦＲに特異的であり、所望治療効果を達成するためにＥＢＮＡ−１を使用する必要のない新規でより強力な形態のアンチセンス遺伝子治療が必要である。
【０００９】
ある報告はカチオン脂質と共に送達した合成ＲＮＡデュプレックスにより細胞培養でヒトＥＧＦＲのＰＴＧＳを達成できることを示している（１８）。しかし、ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡから細胞内で生産されたｓｈＲＮＡでヒトＥＧＦＲのＰＴＧＳを生ずること即ちＤＮＡによるＲＮＡｉが可能であるということは従来の研究では立証されていない。ＤＮＡによるＲＮＡｉによりＥＧＦＲをノックダウンできるか否かに関する不確実性を増すのは、一般に完全なＲＮＡｉ効果を生じる標的配列をｍＲＮＡ内で見いだすことは困難であり、一般に全試験配列の２０％しか有効でないという事実である（６）。
【００１０】
ＰＩＬ遺伝子ターゲティングアプローチを使用して脳腫瘍をもつ成体ラットにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを送達できることは従来の研究に示されている（１９）。しかし、この形態の脳腫瘍で発現されるルシフェラーゼ遺伝子は単にレポーター遺伝子であったので、ＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術によるＲＮＡｉをコードする遺伝子の脳腫瘍送達が生存に有効であるか否かを評価することはできなかった。
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２５０号
【特許文献２】米国特許出願第１０／０２５，７３２号
【特許文献３】米国特許出願第１０／６４７，１９７号
【特許文献４】米国特許第４，８０１，５７５号
【特許文献５】米国特許第５，１５４，９２４号
【特許文献６】米国特許第５，１８２，１０７号
【特許文献７】米国特許第５，５２７，５２７号
【特許文献８】米国特許第５，６７２，６８３号
【特許文献９】米国特許第５，８３３，９８８号
【特許文献１０】米国特許第５，９７７，３０７号
【特許文献１１】米国特許出願第１０／３０７，２７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明によると、所定受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡ遺伝子を送達するために受容体特異的ナノ容器を使用する。細胞の内側に入ると、前記遺伝子はヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡ等の発癌遺伝子又は他の疾患原因遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含むショートヘアピンＲＮＡを発現する。ショートヘアピンＲＮＡは細胞質において発癌遺伝子又は疾患原因遺伝子を不活性化（ノックダウン）するのに有効な短いＲＮＡデュプレックスに変換される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ等の発癌遺伝子の所定領域は本発明の受容体特異的ナノ容器を使用して攻撃し易いことが発見された。例えば、ヌクレオチド２３００〜３８００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのショートヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子は癌の治療に有効であることが判明した。更に、ヌクレオチド２５００〜３０００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのショートヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子は癌の治療に特に有効であることが判明した。ヌクレオチド２５００〜２６００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分は本発明のショートヘアピンＲＮＡにより特に攻撃し易いことが判明した。
【００１３】
本発明は受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するための方法にも関する。前記方法は本発明のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを含む受容体特異的ナノ容器と受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤーを含む有効量の製剤を動物に投与する段階を含む。製剤は静脈内注射等の非侵襲的方法により投与される。本発明による週１回静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療を使用して実施した生存試験では、頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスで生存時間の有意増加が観察された。
【００１４】
本発明の上記及び他の多くの特徴とそれに伴う利点は添付図面と共に詳細な説明を参照することにより更によく理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は遺伝子治療と、ショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と、遺伝子ターゲティング技術を併用して動物における疾患遺伝子を不活性化（「ノックダウン」）するために有効な組成物と方法を提供する。本発明は治療遺伝子の非侵襲的な非ウイルス送達方法及び組成物を教示する米国特許第６，３７２，２５０号に記載されている遺伝子ターゲティング技術に基づく。この技術は遺伝子薬の非ウイルス製剤の単純な静脈内注射後に治療遺伝子を遠位部位にターゲティングすることができる。この遺伝子ターゲティング技術とアンチセンス遺伝子治療の１形態であるＲＮＡｉを併用することにより、動物における疾患原因遺伝子をノックダウンすることができる。
【００１６】
本発明の受容体特異的ナノ容器は受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するように設計される。組成物は外部表面と内部コンパートメントをもつナノ容器を含む。複数の受容体ターゲティング剤が結合剤によりナノ容器の表面に結合されている。ターゲティング剤はナノ容器にその受容体特異的ターゲティング能を付与する。ナノ容器の内部コンパートメント内に遺伝子を配置する。遺伝子はショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含む。ショートヘアピンＲＮＡのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ又は受容体標的細胞が機能するために必要な他のヌクレオチド配列の少なくとも一部に対してアンチセンスなヌクレオチドを含む。
【００１７】
ナノ容器はリポソームであることが好ましいが、外部表面とショートヘアピンＲＮＡを収容するための内部コンパートメントを含む適切な他の任意ナノ容器でもよい。リポソームは直径２００ナノメートル未満であることが好ましい。直径５０〜１５０ナノメートルのリポソームが好ましい。外径約８０〜１００ナノメートルのリポソーム又は他のナノ容器が特に好ましい。適切な型のリポソームは１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、又はコレステロール等の中性リン脂質と、リポソーム内のアニオン性ＤＮＡを安定化するために少量（１−５％）のジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）等のカチオン性脂質から構成される。非侵襲的遺伝子ターゲティング用ナノ容器としてのリポソームの作製及び使用方法は米国特許第６，３７２，２５０号や係属中の米国特許出願第１０／０２５，７３２号及び１０／６４７，１９７号に教示されているように周知である。
【００１８】
リポソーム又は他のナノ容器に内包される遺伝子は標的ｍＲＮＡ又は他のヌクレオチド配列を不活性化又は少なくとも減弱させるために十分な量のアンチセンス配列を含むショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする任意遺伝子とすることができる。本明細書の目的で「ショートヘアピンＲＮＡ」とは１９〜２９ヌクレオチドのステム長と、５〜１０ヌクレオチドのループ長と、図１Ｂに示すようなヘアピン形状をもつＲＮＡである。ショートヘアピンＲＮＡはショートヘアピンＲＮＡのアンチセンス部分を含み、１９〜２９ヌクレオチド長が好ましいが、標的ｍＲＮＡ内の接近可能な部位の寸法により異なる場合もある。使用可能な代表的ショートヘアピンＲＮＡとしてはＥＧＦＲやｒａｓ等の発癌遺伝子受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）等の血管形成因子又は受容体に対してアンチセンスのものが挙げられる。ショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子はリポソーム又はナノ容器の内部コンパートメント内に内包されたプラスミドＤＮＡにより発現されることが好ましい。
【００１９】
ショートヘアピン遺伝子は周知薬剤内包法の任意のものに従ってリポソーム内に内包することができる。例えば、内包は音波処理、凍結／解凍、蒸発、洗浄剤透析、及びメンブレンフィルターによる押出により実施することができる。
【００２０】
リポソーム混合物内に内包される遺伝子数は治療する疾患に応じて１から多数までとすることができるが、各ナノ容器はプラスミドＤＮＡの有効半径に応じて１又は２個以下のプラスミドＤＮＡ分子を含むことができる。制限因子は内包される遺伝子の寸法とリポソームの内部コンパートメントの寸法である。ヒストン、プロタミン、又はポリリジン等のポリカチオン性蛋白質を使用すると、数千ヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡの寸法を直径１０〜３０ｎｍの構造まで圧縮することができる。ショートヘアピンＲＮＡを発現させるために使用される遺伝子は比較的小さいため、多数の遺伝子を単一のタンデム発現プラスミドＤＮＡに組込むことができる。必要に応じて、リポソームの内側にＤＮＡを内包する前に、同一遺伝子の多数のコピー又は多重遺伝子の多重コピーを発現プラスミドＤＮＡの内側に内包することができる。一般に、任意所定ナノ容器に存在する遺伝子数をできるだけ多くすることが望ましい。
【００２１】
内包した遺伝子を所望標的細胞に（必要に応じて血液脳関門を通って）輸送するためには、多数のターゲティング剤をナノ容器に結合する。適切なターゲティング剤としては細胞表面に位置する所望受容体にナノ容器をターゲティングできる任意物質が挙げられる。任意数のターゲティング剤を使用することができるが、好ましい物質としてはインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、レプチン、線維芽細胞増殖因子等の内在受容体リガンド、又は内在リガンドと同様に受容体に結合するペプチドミメティックモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が挙げられる。内在リガンド又はペプチドミメティックＭＡｂはいずれも細胞の外部表面への受容体結合後に細胞の内部に受容体によるエンドサイトーシスが行われるようにエンドサイトーシス性リガンドでなければならない。一般に、ターゲティングリガンドは血管関門の背後の血管内皮細胞と標的腫瘍細胞の両者の細胞膜を通ってリポソームのエンドサイトーシスを開始しなければならない。血管内皮細胞膜関門と標的細胞膜関門の両者を通ってリポソームをターゲティングすることができるターゲティング剤が好ましい。このためには、標的受容体が血管内皮細胞関門と標的細胞膜の両者で発現されなければならない。脳の場合には、血管内皮細胞膜はＢＢＢである。このようなターゲティング剤ないし「輸送型ペプチド」としてはＢＢＢと脳細胞膜（ＢＣＭ）の両者で発現される全標的コグネイト受容体としてのインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、もしくはレプチン、又はその対応するペプチドミメティックＭＡｂが挙げられる。あるいは、内在ＢＢＢ受容体をターゲティングするペプチドと内在ＢＣＭをターゲティングするペプチドの２種の異なる「輸送型ペプチド」をリポソームの表面に結合することができる。後者ペプチドはニューロン、グリア細胞、ペリサイト、平滑筋細胞、又は小グリア細胞等の脳内の特定細胞に対して特異的であると考えられる。ターゲティングペプチドは受容体の内在ペプチドリガンドでもよいし、内在リガンドの類似体でもよいし、内在リガンドの同一受容体と結合するペプチドミメティックＭＡｂでもよい。輸送型ペプチド一般の使用と、ターゲティングリガンドとしてのトランスフェリン又はインスリンの使用は米国特許第４，８０１，５７５号に詳細に記載されている。ＢＢＢ「輸送型ペプチド」としての受容体（ＴｆＲ）特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体は米国特許第５，１５４，９２４号；５，１８２，１０７号；５，５２７，５２７号；５，６７２，６８３号；５，８３３，９８８号；及び５，９７７，３０７号に詳細に記載されている。ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するＭＡｂをＢＢＢ「輸送型ペプチド」として使用することが好ましい。ヒトインスリン受容体に対する代表的な好ましいＭＡｂは米国特許出願第１０／３０７，２７６号に開示されている。
【００２２】
ターゲティング剤をリポソームの表面に結合するために使用される結合剤はスフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他の有機ポリマー等の周知ポリマー結合剤の任意のものとすることができる。ＰＥＧが特に好ましい結合剤である。結合剤の分子量は１０００〜５０，０００ＤＡが好ましい。特に好ましい結合剤は一端に脂質を含み、他端にマレイミド基を含む二官能性２０００ＤＡ ＰＥＧである。ＰＥＧの脂質端はリポソームの表面に挿入し、マレイミド基は受容体特異的モノクローナル抗体又は他の血液脳関門ターゲティングビヒクルと共有結合を形成する。各リポソームに５〜１０００個のターゲティングビヒクルを結合することが好ましい。約２５〜７５個のターゲティングビヒクルを結合したリポソームが特に好ましい。
【００２３】
リポソームが好ましいナノ容器であるが、当業者に自明の通り、他のナノ容器も使用できる。例えば、リポソームの代わりにナノ粒子を使用してもよいし、遺伝子を内包することができ、製剤が血液中にあるか又は血液から標的細胞の細胞内コンパートメントに移動している間に核酸をヌクレアーゼから保護することができる直径＜２００ｎｍの他の任意ナノ容器を使用してもよい。同様に、リポソーム又はナノ容器の表面に結合しており、「輸送型ペプチド」を結合するため及び製剤が血液から除去されるのを遅らせるための足場を提供すると共に血漿薬物動態を最適化するという二重の目的をもつ他の多重ポリマー物質（例えばスフィンゴミエリン）をＰＥＧ鎖の代わりに使用することができる。更に、本発明は脳、肝臓、肺及び脾臓を含む特異的標的受容体をもつ各種細胞又は臓器にショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子を送達することを意図する。更に、本発明は係属中の米国特許出願第１０／０２５，７３２号に詳細に記載されているように、血液網膜関門を通って網膜及び他の眼構造にｓｈＲＮＡを発現する遺伝子を送達することを意図する。本発明の受容体特異的ナノ容器は静脈内投与に適した任意医薬キャリヤーと併用することができる。受容体特異的ナノ容器の静脈内投与は侵襲性が最低であるので好ましい経路である。必要に応じて他の投与経路も可能である。適切な医薬的に許容可能なキャリヤーとしては食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、又は他の任意水溶液が挙げられる。
【００２４】
受容体特異的ナノ容器の治療有効量は治療する個体と投与する特定遺伝子により多様である。適切な投与量は当業者に周知の方法により設定される。
【００２５】
脳腫瘍及び大半の固形癌一般は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する。ＥＧＦＲはこれらの癌において腫瘍形成の役割を果たす。多くの現在の癌治療はＥＧＦＲの阻害を目的としている。以下の本発明の好ましい代表的態様の記載はウイルスベクターを使用せずに単純な静脈内投与しか必要としない非侵襲的遺伝子治療でＥＧＦＲを脳腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏノックアウトする方法を立証する。
【００２６】
以下の詳細な記載の実施例に記載する代表的標的遺伝子は脳腫瘍（２０，２１）及び大半の固形癌一般（１０）において腫瘍形成の役割を果たすヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である。以下の記載では、本発明が癌患者を延命できることを立証するためにヒト頭蓋内脳腫瘍のマウスモデルを使用する。当業者に自明の通り、本発明は癌又は他の疾患に関与する可能性のある他の標的遺伝子をノックダウンするために使用することもできる。ショートヘアピンＲＮＡアンチセンス治療を使用してターゲティングすることができる他の発癌原因遺伝子としては、発癌性キナーゼドメインが構成的に活性であり、野生型ＥＧＦＲとは異なる配列をもつＥＧＦＲｍＲＮＡの突然変異体形により発現されるＥＧＦＲの突然変異体が挙げられる。多くの脳腫瘍及び他の固形癌はｖＩＩＩ ＥＧＦＲ突然変異体等の各種ＥＧＦＲ突然変異体を発現する。受容体である他の発癌遺伝子ターゲットとしてはＧＢＭ、乳癌、卵巣癌、肺癌、及び頭頸部癌におけるＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、肺癌、卵巣癌及び乳癌における線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＧＢＭにおける血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、充実性腫瘍におけるインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）が挙げられる（３９）。増殖因子である他の発癌遺伝子ターゲットとしてはＥＧＦＲを過剰発現する癌におけるトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ＧＢＭにおけるＰＤＧＦ、又は癌における血管形成を阻止するためのＶＥＧＦが挙げられる（３９）。改変蛋白質キナーゼを含む他の発現遺伝子ターゲットとしては慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるＢｃｒ−Ａｂｌ、腎臓癌におけるｃ−Ｍｅｔ、胃癌におけるｃ−Ｋｉｔ、多発癌におけるｒａｓ、膀胱癌、結腸癌、肺癌、もしくは乳癌におけるｒａｆ、又は多発癌におけるＣｄＫが挙げられる（３９）。疾患原因遺伝子のアンチセンスノックダウンが有効であると思われる癌以外の慢性疾患としては、標的遺伝子がウイルス複製に不可欠のウイルス特異的遺伝子である慢性肝炎や後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等のウイルス感染症が挙げられる。加齢性失明の最も一般的な原因はＶＥＧＦにより誘導される血管肥大に起因する加齢性黄斑変性ないしＡＭＤであり、眼におけるＶＥＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ−Ｒ遺伝子のアンチセンスノックダウンはＡＭＤの新規治療となると思われる（４０）。
【００２７】
以下に示すように、予め形成した頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスに本発明の代表的１態様（クローン９６７により発現されるｓｈＲＮＡ）を使用してＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術により脳腫瘍に送達することによりクローン９６７プラスミドＤＮＡを週１回投与後に生存時間の８８％増加が達成された。クローン９６７はヒトＥＧＦＲのｎｔ２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡをコードする代表的真核発現プラスミドである。脳腫瘍の治療と他の固形癌一般の治療にこの型のｓｈＲＮＡを使用することができる。生存時間の増加は開頭術又は他の侵襲的投与形態を用いずに達成され、単純な週１回静脈内注射しか必要としなかった。治療効果はウイルス又は腫瘍形成性ＤＮＡエレメント（例えばＥＢＮＡ−１）を使用せずに達成された。本発明は原発性脳腫瘍又は脳に転移した脳以外の癌においてＥＧＦＲ以外の癌原因遺伝子をノックダウンするために使用可能なＤＮＡによるＲＮＡｉ技術とＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術の併用を提供する。更に、受容体特異的ナノ容器は癌以外の疾患の脳における疾患原因遺伝子をノックダウンするために使用することができる。
【００２８】
脳腫瘍の遺伝子治療はＥＧＦＲ等の発癌遺伝子の発現を特異的にノックダウンすると期待される。しかし、遺伝子治療はＢＢＢの存在により特に脳では困難な送達の問題により制限される。ＢＢＢを回避するために、開頭術アプローチにより治療薬を脳腫瘍に送達する試みが行われている（１）。しかし、腫瘍内注射後の腫瘍内の治療薬の分布は非常に制限されるので、このアプローチは有効ではない（１）。ＢＢＢを通る経血管経路により脳腫瘍内の全細胞に治療薬を送達することができる（２２）。従来記載されているようにペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）を使用する新規非ウイルス遺伝子導入技術を使用して非ウイルス遺伝子を脳に経血管送達することは現在可能である（米国特許第６，３７２，２５０号参照）。このアプローチでは、非ウイルスプラスミドＤＮＡを８５ｎｍアニオン性リポソームの内側に内包し、リポソームの表面を数千個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖と結合する。この「ＰＥＧ化」法は網膜内皮系によるリポソームの取込みを制限し、血液滞留時間を延長することができる（２３）。その後、図１Ａに示すように生体関門を通って受容体特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と共にＰＥＧ化リポソームをｉｎ ｖｉｖｏ送達する。
【００２９】
ＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術を適用すると、ヒトＥＧＦＲに対するアンチセンス遺伝子治療の週１回静脈内注射により頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつマウスの生存時間を１００％増加することができた（１５）。ヒトＥＧＦＲのヌクレオチド２３１７−３００６に対してアンチセンスの７００ヌクレオチドＲＮＡをコードする真核発現プラスミド（クローン８８２と言う）をＰＩＬに内包し（１４）、受容体特異性の異なる２種のＭＡｂで脳腫瘍に二重にｉｎ ｖｉｖｏターゲティングした（１５）。第１のＭＡｂであるマウストランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するラット８Ｄ３ ＭＡｂは頭蓋内癌に血管形成したマウスＢＢＢを通ってＰＩＬを輸送することができ、これらの癌血管はマウス脳に由来し、マウスＴｆＲを発現した。第２のＭＡｂはヒト脳腫瘍血漿膜で発現されたヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）にターゲティングした（図１Ａ）。ターゲティングＭＡｂは膜関門を通ってＰＩＬを輸送するための分子のトロイの木馬として機能し、これらのＭＡｂは種特異的である（２４）。マウスＴｆＲに対する８Ｄ３は最初の関門を通ってマウスＢＢＢを輸送することができたが、第２の関門であるヒト脳腫瘍細胞膜を通ってＰＩＬを輸送することはできなかった。これは同様にマウス血管内皮細胞インスリン受容体と反応しないＨＩＲＭＡｂで達成された。二重結合ＰＩＬをＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬと言う（図１Ａ）。
【００３０】
クローン８８２発現プラスミドの効力を増加するために、癌細胞の分裂毎に発現プラスミドを１回複製させるｏｒｉＰ及びエプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）−１エレメント（１４７）をこのベクターに加えた（２５）。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エレメントを発現プラスミド内に加えると、ヒトＵ８７神経膠腫細胞における遺伝子発現レベルを１０倍に増加することができる（１６）。しかし、ＥＢＮＡ−１遺伝子は腫瘍形成性トランス作用因子をコードし（１７）、この製剤はヒト遺伝子治療では望ましくないと思われる。ＤＮＡによるＲＮＡｉ等のより強力な形態のアンチセンス遺伝子治療を使用したならばＥＢＮＡ−１エレメントは必要ないと思われる。
【００３１】
ＤＮＡによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は発現プラスミドＤＮＡがステムループ構造から構成されるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする強力な形態のアンチセンス遺伝子治療である（６）。このｓｈＲＮＡは細胞内でプロセシングされて３’−オーバーハングをもつＲＮＡデュプレックスとなり、この短いＲＮＡデュプレックスはＲＮＡｉ又は転写後遺伝子サイレンシングを媒介する。従来記載されているように、ＲＮＡｉによる遺伝子治療は癌治療に大いに期待される。しかし、重要な制限因子は細胞へのｓｈＲＮＡの送達である。
【００３２】
以下の実施例では、本発明による代表的な受容体特異的ナノ容器を作製及び試験し、脳腫瘍をもつマウスにおけるヒトＥＧＦＲに対する静脈内経路のＲＮＡｉによる遺伝子治療の治療効力を立証する。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エレメントをもたず、ヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡにおける特定配列に対するｓｈＲＮＡをコードする代表的な発現プラスミドを提供する。これらの代表的なプラスミドをＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに組込んだ。頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつマウスにこれらのＰＩＬを週１回スケジュールで静脈内投与した。
【００３３】
実施例は以下の通りである。実施例で使用した材料は以下の販売業者から入手した。
【００３４】
ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ２０００（ここで、ＰＥＧ２０００は２０００ ダルトンポリエチレングリコールである）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（ＭＡＬ）、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。Ｎ−スクシンイミジル［２，３−３Ｈ］プロピオネート（３Ｈ−ＮＳＰ，１０１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ、２−イミノチオラン（トラウト試薬）、及びビシンコニン酸，（ＢＣＡ）蛋白質アッセイ。本試験で使用した抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（ＴｆＲＭＡｂ）はマウスＴｆＲに対する８Ｄ３ラットＭＡｂである［２６］。８Ｄ３ ＭＡｂはマウスＴｆＲに特異的であり、ヒト細胞では不活性である。ヒト細胞への遺伝子ターゲティングに使用した抗インスリン受容体ＭＡｂはヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するマウス８３−１４ ＭＡｂである［２７］。ＴｆＲＭＡｂとＨＩＲＭＡｂはハイブリドーマから生成した腹水からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで個々に精製した。カスタムオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手した。
【実施例１】
【００３５】
ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドの設計と細胞培養における生物活性の立証。各種ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡに対応するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）デュプレックスを文献（２８）に記載されているように設計した（表１参照）。
【表１】
【００３６】
クローニング中のＤＮＡヘアピンの形成を減らすためにｓｈＲＮＡ配列に故意にセンス鎖（図１Ｂ）のヌクレオチドミスマッチを加えた。アンチセンス鎖は変わらないので、これらのＧ−Ｕ置換はＲＮＡｉ効果を妨げない（２９）。フォワードＯＤＮはＵ６ポリメラーゼ停止シグナル（Ｔ６）を含む（表１）。リバースＯＤＮは標準真核発現プラスミドの付着末端へのサブクローニングを誘導するために、夫々５’及び３’末端のＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限部位に特異的な４ヌクレオチドオーバーハングを含む（表１）。空の発現プラスミドをクローン９５９と言う（表２）。相補的ＯＤＮを熱変性（９４℃で４分間）し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．４），１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃で１６時間アニールした。二本鎖ＯＤＮをプラスミドのＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ部位にライゲーションした。大腸菌ＤＨ５ａコンピテント細胞を形質転換し、Ｔ３プライマーを使用するＤＮＡシーケンシングとＮａｅＩによる制限エンドヌクレアーゼマッピングにより正しいＲＮＡｉインサートをもつクローンを確認した。
【表２】
【００３７】
合計６種の抗ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドＤＮＡを作製し、９６２−９６４及び９６６−９６８と命名した（表１）。これらの６種のｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドのＥＧＦＲノックダウン効力を従来記載されている真核発現プラスミドであるクローン８８２のＥＧＦＲノックダウン効果と比較した（１５）。クローン８８２はｐＣＥＰ４に由来し、ＳＶ４０プロモーターにより駆動され、ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰエレメントを含み、ヒトＥＧＦＲのｎｔ２３１７−３００６に相補的な７００ｎｔアンチセンスＲＮＡをコードする（１５）。組織培養におけるヒトＵ８７神経膠腫への［３Ｈ］−チミジン取込み率を測定することによりヒトＥＧＦＲに対するＲＮＡｉ効果をスクリーニングした。ヌクレオチド１８７−２１９（クローン９６２）、２０８７−２１１９（クローン９６３）、及び３６８３−３７１５（クローン９６４）のヒトＥＧＦＲｍＲＮＡの３種の広い間隔の領域に対するｓｈＲＮＡを作製するようにフォワード及びリバース合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を設計し、ＯＤＮ配列を表１に示す。
【００３８】
Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞への［３Ｈ］−チミジン取込みの阻害を測定することによりこれらのＥＧＦＲ ＲＮＡｉプラスミドの生物活性を試験した（表２）。クローン９６２−９６３はＥＧＦＲ作用のノックダウンを生じず、クローン９６４の効果は中間であった（表２）。従って、ヒトＥＧＦＲｍＲＮＡのヌクレオチド２３００−３０００内の３種の異なる領域として表１に示すような２３４６−２３７４（クローン９６６）、２５２９−２５５７（クローン９６７）、及び２９３７−２９６５（クローン９６８）に対するｓｈＲＮＡを作製するように、第２組のＯＤＮを設計した。ＥＧＦＲ機能のノックダウンはクローン９６６及び９６８では中間であったが、クローン９６７はクローン８８２と同等レベルの［３Ｈ］−チミジン取込みを生じた（表２）。クローン９６７により生産されたｓｈＲＮＡの配列と二次構造を図１Ｂに示す。
【００３９】
ヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は公知である（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号Ｘ００５８８）。ヌクレオチド配列はヌクレオチド番号１から開始し、ヌクレオチド番号５５３２までである。上記結果によると、ｓｈＲＮＡはヌクレオチド２３４６位〜３７１５位のＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域に位置するヌクレオチドに対してアンチセンスであると思われる。ｓｈＲＮＡは２５２９位〜２９６５位のＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域に対してアンチセンスであることが好ましい。アンチセンスでターゲティングされるＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域は２５２９位〜２５５７位がより好ましい。
【実施例２】
【００４０】
ウェスタンブロッティング。細胞培養でＲＮＡｉによる機能的ＥＧＦＲ発現の阻害を確認するために、クローン９６７プラスミドＤＮＡに４８時間暴露後に培養Ｕ８７細胞でウェスタンブロッティング（図５）により免疫反応性ＥＧＦＲを測定した。対照として、クローン８８２（ＥＢＮＡ−１による従来のアンチセンス遺伝子治療）、クローン９６２（無効な抗ＥＧＦＲ ＲＮＡｉクローン（表２））、及びクローン９５２［ＥＧＦＲに無効であると思われる抗ルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡｉクローン（１９参照）］に暴露後に免疫反応性ＥＧＦＲのレベルを測定した。ウェスタンブロットの定量の結果、クローン９６７及び８８２はＥＧＦＲを夫々６８％及び８８％ノックダウンした（図５）。
【００４１】
ウェスタンブロットの詳細は以下の通りである。
【００４２】
ヒトＵ８７神経膠腫細胞を３５ｍｍ皿で８０％コンフルエントまで培養した。各プラスミドＤＮＡ（クローン９６７，８８２，９５２，及び９６２）をＤＮＡ１．５ｍｇ／皿の用量でリポフェクタミンに４時間添加した。次に培地を捨て、１０％胎仔ウシ血清を加えた新鮮な培地に交換し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を溶解用緩衝液で回収した後、ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後にニトロセルロースフィルターにブロットした。ＥＧＦＲをヒトＥＧＦＲに対する市販抗体で検出し、ウェスタンブロットシグナルを化学ルミネッセンス法で測定した。ｘ線フィルムをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐでスキャンし、積分密度をＮＩＨ画像ソフトウェアにより定量し、図５に示す平均及び標準誤差結果を得た。
【実施例３】
【００４３】
クローン８８２（ＥＢＮＡ−１による従来のアンチセンス治療）及びクローン９６７（ＥＢＮＡ−１を使用しないＤＮＡによるＲＮＡｉ遺伝子治療）の等価性の実証。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を加えたＭＥＭ培地を入れた６ウェルクラスター皿でＵ８７ヒト神経膠腫細胞を増殖させた。細胞が５０−６０％コンフルエントに達した後に各プラスミドＤＮＡ（クローン９５９，９６２−９６４，９６６−９６８，又は８８２）１μｇとリポフェクタミン１０μｌ（２０μｇ）を加えた無血清ＭＥＭ１．５ｍｌに増殖培地を交換し、４時間３７℃でインキュベートした。１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭ培地に培地を交換し、２４時間インキュベートした。終濃度２μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−チミジンと１０μＭの未標識チミジンを各皿に加え、皿を３７℃で４８時間インキュベートした。従来記載されているように［３Ｈ］−チミジン取込みを測定するために細胞を回収した（１４）。Ｕ８７細胞にリポフェクタミンをトランスフェクションした結果、クローン９６７がＥＧＦＲ発現のＲＮＡ干渉を生じる最も強力なクローンであり、高用量ではクローン８８２とちょうど同程度に有効であることが立証された（表２）。
【００４４】
クローン８８２及び９６７の効力を更に試験するために、７００ｎｔ ＥＧＦＲアンチセンスＲＮＡをコードするクローン８８２（１４）の用量応答試験と平行してクローン９６７による用量応答試験を実施した。これらの用量応答試験では、クローン８８２又はクローン９６７ＤＮＡをＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬにより細胞培養中のヒト神経膠腫細胞に送達した。Ｕ８７細胞を３５ｍｍコラーゲン処理皿で増殖させた。細胞が５０−６０％コンフルエントに達した後に培地を吸引し、１０％ＦＢＳを加えた新鮮なＭＥＭ培地２ｍｌとＤＮＡ１．４、０．１４、０．０１４又は０．００１４μｇ／皿の用量のクローン９６７又はクローン８８２を内包したＨＩＲＭＡｂ−ＰＩＬを加えた。細胞を５日間３７℃でインキュベートした。この期間に３日間インキュベーション後に新鮮な培地２ｍｌを加えた。５日目に培地を吸引し、［３Ｈ］−チミジン２μＣｉ／ｍｌと未標識チミジン１０μＭを加えた新鮮な増殖培地２ｍｌを各皿に加えた後に４８時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に［３Ｈ］−チミジン取込みを測定し、従来記載されているように、細胞蛋白質１ｍｇ当たりに取り込まれたチミジンのｎｍｏｌとして表した（１４）。次にクローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡをＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬに内包し、リポフェクタミンの不在下で１．４−１４００ｎｇ／皿の各種プラスミドＤＮＡ用量でＵ８７細胞に加えた。どちらのプラスミドＤＮＡも約１００ｎｇ／皿のＥＤ５０でチミジン取込みの抑制に同等に有効であった（図１Ｃ）。この組織培養実験の結果、ＥＢＮＡ−１遺伝子をもたないが、ＥＢＮＡ−１の影響下で長い７００ｎｔ ＲＮＡをコードするプラスミド（クローン８８２）と同等に有効なヒトＥＧＦＲに対するＲＮＡｉ発現プラスミド（クローン９６７）を作製できることが判明した。他方、この試験以前にクローン９６７のｉｎ ｖｉｖｏ相対効力は不明であり、クローン９６７がヒト脳腫瘍をもつ動物における生存時間を延ばすか否かも不明であった。
【００４５】
ペグ化イムノリポソームの合成。クローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡを従来記載されているようにＰＩＬに内包した（米国特許第６，３７２，２５０号（１４））。リポソームは直径８５−１００ｎｍであり、リポソームの表面に数千個の２０００Ｄａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を結合した。ＰＥＧ鎖の約１−２％の先端を従来記載されているように８３−１４ ＨＩＲＭＡｂ及び８Ｄ３ ＴｆＲＭＡｂと結合した（１５）。リポソームの内部に内包されなかったプラスミドＤＮＡを徹底的なヌクレアーゼ処理により定量的に除去した（２３）。典型的な合成では、初期プラスミドＤＮＡ（２００μｇ）の３０−４０％が脂質２０μｍｏｌに内包され、各リポソームのＰＥＧ鎖に４３−８７ＭＡｂ分子が結合した（１４）。
【実施例４】
【００４６】
頭蓋内脳腫瘍の静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療による延命。体重１９−２１ｇの雌重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。正中線右２．５ｍｍ及びブレグマ前１ｍｍにバーホールを開けた。１．２％メチルセルロースを加えた無血清ＭＥＭにＵ８７神経膠腫細胞を懸濁した。固定針付き１０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して細胞懸濁液５μｌ（５×１０５細胞）を右尾状核−被殻に深さ３．５ｍｍに２分間かけて注入した。移植後５日目に開始して週１回動物に静脈内投与した。Ｕ８７細胞５００，０００個の移植後５日まで腫瘍は大きく、脳の線条体の容積全体に充満している（３２）。移植後５、１２、１９及び２６日に週１回静脈内遺伝子治療を実施した。食塩水又はＨＩＲＭＡｂ／ｍＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに内包したクローン９６７ＤＮＡ５μｇ／匹をマウスに投与した。大きな頭蓋内腫瘍の増殖後１４−２０日に死亡を生じるヒトＵ８７神経膠腫細胞を成体マウスの尾状核−被殻に移植した。移植後５日に開始し、食塩水又はＨＩＲに対する８３−１４マウスＭＡｂとマウスＴｆＲに対する８Ｄ３ラットＭＡｂで二重ターゲティングしたＰＩＬに内包したクローン９６７プラスミドＤＮＡ５μｇ／匹をマウスに週１回静脈内注射した（図１Ａ）。食塩水を投与したマウスは移植後１４〜２０日に死亡し、ＥＤ５０は１７日であった（図２）。静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療したマウスは移植後３１〜３４日に死亡し、ＥＤ５０は３２日であった（図２）。
【実施例５】
【００４７】
ＲＮＡｉ遺伝子治療及びＰＩＬ遺伝子ターゲティングによる脳腫瘍におけるＥＧＦＲのｉｎ ｖｉｖｏ減少。屠殺直後に脳を取出し、腫瘍の中心から冠状スラブに切断した。スラブをＯ．Ｃ．Ｔ．培地に埋込み、ドライアイス粉末で凍結した。マウス脳の凍結切片（２０μｍ）をＭｉｋｒｏｎ ＨＭ５０５Ｅクリオスタットで切断した。切片を冷１００％メタノールで２０分間−２０℃にて固定した。共焦点顕微鏡分析のために、蛋白質の非特異的結合を１０％ロバ血清リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３０分間ブロックした。切片を一次抗体中、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体はマウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）と、ヒトＥＧＦＲに対するマウス５２８ ＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）であった。ＰＢＳ洗浄後、ローダミンに結合したロバ抗ラットＩｇＧ二次抗体５μｇ／ｍｌを３０分間室温で加えた。次にスライドを洗浄し、フルオレセインと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ５μｇ／ｍｌの存在下に３０分間室温でインキュベートした。切片をスライドに載置し、デュアルアルゴン及びヘリウム／ネオンレーザーを使用して４０倍対物レンズとＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬ共焦点顕微鏡で観察した。フルオレセインシグナルがローダミンチャネルに漏れるのを避けるためにサンプルをマルチトラックモードでスキャンした。切片を０．８μｍ間隔でスキャンし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭソフトウェアで再構成した。対照実験は夫々ラット抗マウスＴｆＲ又はマウス抗ヒトＥＧＦＲ抗体の代わりにラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）又はマウスＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として使用した。
【００４８】
アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）免疫ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により免疫細胞化学試験を実施した。ヒトＥＧＦＲを染色するために、マウス５２８ ＭＡｂ 抗ヒトＥＧＦＲを一次抗体として使用し（３３）、マウスＴｆＲを染色するためにラット８Ｄ３ ＭＡｂ抗マウスＴｆＲを一次抗体として使用した（１５）。内在ペルオキシダーゼを０．３％ウマ血清リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．３％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロックし、蛋白質の非特異的結合をＰＢＳ中３％ウマ又はウサギ血清で３０分間ブロックした。ラット８Ｄ３ ＭＡｂを使用するマウスＴｆＲ染色には、ウサギ血清をブロッキング段階で使用した。次に切片を一次抗体１０μｇ／ｍｌ中、４℃でインキュベートした。同一濃度のアイソタイプ対照も一次抗体として使用した。次にマウスＩｇＧ１を５２８ＭＡｂのアイソタイプ抗体として使用し、ラットＩｇＧを８Ｄ３ＭＡｂのアイソタイプ対照抗体として使用した。インキュベーションとＰＢＳで洗浄後、切片をビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（５２８ＭＡｂ）又はビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ（８Ｄ３ＭＡｂ）中で３０分間インキュベートした後、ＡＥＣで発色させた。スライドは対比染色しなかった。
【００４９】
マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ＭＡｂを使用して免疫細胞化学法により腫瘍を剖検で試験した（図３）。食塩水を投与した動物からの腫瘍は血管新生が多く、マウスＴｆＲを発現した。（図３Ａ，Ｂ，Ｃ）。図３Ｂは正常脳と腫瘍の血管内皮上の免疫反応性マウスＴｆＲを示す。正常脳から腫瘍に伸びる血管が認められる（図３Ｂ）。腫瘍と正常脳の間の境界は図３Ｂに示すように血管密度が低いことが多かった。ＲＮＡｉで治療したマウスの腫瘍における血管密度は図３Ｄに示すように一般に低かったが、ＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療は図３Ｅに示すように正常脳に血管密度の低下を生じなかった。血管マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（赤線）と腫瘍ＨＩＲに対するマウス８３−１４ ＭＡｂ（緑線）による二重免疫標識後の腫瘍切片の共焦点顕微鏡写真を図４に示す。ＲＮＡｉで治療した腫瘍（図４Ａ，Ｂ，及びＣ）では食塩水を投与した腫瘍（図４Ｄ，Ｅ，及びＦ）に比較して免疫反応性ＥＧＦＲのダウンレギュレーションが認められる。
【実施例６】
【００５０】
ＥＧＦＲの癌特異的突然変異体のＲＮＡｉ。脳腫瘍を含む多くの固形癌は突然変異体形のＥＧＦＲを特異的に発現する（３４，３５）。最も一般的な突然変異体はリガンド結合に独立してアップレギュレートされるＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体である（３４，３５）。ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体は野生型ＥＧＦＲ又は他の遺伝子に存在しない特異的ヌクレオチド配列をもつ。従って、ユニークなＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体に対するｓｈＲＮＡを発現するプラスミドは癌に１００％特異的であり、非癌細胞でＥＧＦＲを抑制しない。ｈＥＧＦＲｖＩＩＩのスプライス部位に対する各種ｓｈＲＮＡに対応するＯＤＮデュプレックスを実施例１に記載したと同様に設計し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ｓｈＲＮＡを表３に示す。
【表３】
【００５１】
クローニング中のＤＮＡヘアピンの形成を減らすためにｓｈＲＮＡ配列に故意にセンス鎖のヌクレオチドミスマッチを加えた。アンチセンス鎖は変わらないので、これらのＧ−Ｕ置換はＲＮＡｉ効果を妨げない。フォワードＯＤＮはＵ６ポリメラーゼ停止シグナル（Ｔ６）を含む（表３）。リバースＯＤＮはＵ６発現ベクターの付着末端へのサブクローニングを誘導するために、夫々５’及び３’末端のＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限部位に特異的な４ヌクレオチドオーバーハングを含む。本発明に教示する方法を使用し、当業者は表３に記載するＯＤＮを使用して脳又はＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体のユニークな発現に起因する他の発癌組織における癌のＤＮＡによるＲＮＡｉ遺伝子治療を可能にする発現プラスミドを作製することができる。正常細胞中のＥＧＦＲはＥＧＦＲｖＩＩＩｍＲＮＡ内のユニーク配列を選択的にターゲティングするｓｈＲＮＡにより変化しないので、この形態の癌遺伝子治療は非常に望ましい。
【００５２】
上記実施例はヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡのヌクレオチド２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドを使用するＲＮＡｉによる遺伝子治療でＥＧＦＲ遺伝子発現をノックダウンできることを立証するものである（表２）。更に、ＥＧＦＲ発現ノックダウンは組織培養でヒトＵ８７神経膠腫細胞へのチミジン取込みの阻害（表２）と、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応性ＥＧＦＲの脳腫瘍発現の低下（図４）により立証される。最後に、腫瘍サイズが大きい場合には移植後５日まで治療が遅れる（３２）が、週１回静脈内ＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療の結果、生存時間が８８％増加した（図２）。
【００５３】
ヒトＥＧＦＲ転写産物内のＲＮＡｉ活性標的配列の発見には数種の相互作用が必要であった（表１及び表２）。これらの知見は標的配列の約５分の１がＲＮＡｉで治療効果を生じるというＭｃＭａｎｕｓとＳｈａｒｐ（６）の示唆に一致した。従来の研究によると、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターを使用せずにオリゴフェクタミンを使用して培養細胞に送達したＲＮＡデュプレックスでＥＧＦＲ遺伝子発現を抑制できることが示されている（１８）。本実施例は細胞内ｓｈＲＮＡを生産するＲＮＡｉによる発現プラスミドでＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害することができ、ＤＮＡによるＲＮＡｉが細胞培養とｉｎ ｖｉｖｏヒト細胞の両者で有効であることを立証する。チミジン取込みを評価する細胞培養に基づき、ヒトＥＧＦＲ遺伝子発現をノックダウンするためのＲＮＡｉによる遺伝子治療を更に評価するためにクローン９６７を選択した。クローン９６７はヌクレオチド２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡを生産し（図１Ｂ）、この標的配列はクローン８８２により発現されるアンチセンスＲＮＡによりターゲティングされるヒトＥＧＦＲｍＲＮＡの７００ヌクレオチド領域内にある（１５）。クローン９６７とクローン８８２はヒトＵ８７細胞へのチミジン取込みを同様に阻害し（図１Ｃ）、これはＲＮＡｉによるアンチセンス遺伝子治療形態の高い効力を証明するものである。クローン８８２プラスミドは培養Ｕ８７細胞におけるトランスジーンの発現を１０に増加することができる（１６）ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰ遺伝子エレメントを含む（１４）。従って、アンチセンス遺伝子治療のＲＮＡｉアプローチの高い効力により、発現プラスミドで潜在的に腫瘍形成性のＥＢＮＡ−１エレメントが不要になった。
【００５４】
クローン９６７をＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬで培養Ｕ８７細胞に送達すると、クローン９６７はチミジン取込み阻害に関して用量依存メカニズムでＥＧＦＲ機能をノックダウンし（図１Ｃ）、ＥＤ５０はプラスミドＤＮＡ約１００ｎｇ／皿であった。脳腫瘍における免疫反応性ＥＧＦＲの発現はＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療の最後の静脈内投与後５−８日でもまだ顕著に低下している（図４）。
【００５５】
上記実施例はＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに内包したクローン９６７を使用する週１回静脈内遺伝子治療で生存時間の８８％増加を示す（図２）。週１回静脈内遺伝子治療によるこの生存時間の延長はＥＧＦＲ−チロシンキナーゼ阻害剤ＺＤ１８３９（イレッサ）を高用量で毎日投与したマウスの生存時間の延長と同等である（１１）。神経膠腫細胞１００，０００個の頭蓋内移植後３日目に顕微鏡で腫瘍が認められた場合にイレッサの毎日経口化学療法を開始した（１１）。しかし、イレッサはＥＧＦＲの突然変異体形を発現する脳腫瘍の治療には無効であった（１１）。多くの一次及び転移脳腫瘍はヒトＥＧＦＲの突然変異を発現し（３４−３５）、実施例５に記載したように野生型と突然変異体の両者のＥＧＦＲをノックダウンするＲＮＡｉによる遺伝子治療を設計することが可能である。
【００５６】
要約すると、本発明の実施例はヒトＥＧＦＲに対する週１回静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療により頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスの生存時間が８８％増加することを立証する。発癌遺伝子をノックダウンし、脳腫瘍における突然変異腫瘍サプレッサー遺伝子を置換するためにＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術を使用することができる。ＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術の効果は霊長類で立証されており、霊長類脳における遺伝子発現レベルは齧歯類脳における同等遺伝子発現レベルの５０倍である（３６）。遺伝子組換えモノクローナル抗体を使用して治療遺伝子を内包したＰＩＬをヒト脳腫瘍に送達することができる。キメラＨＩＲＭＡｂ（３７）はこれらの実施例で使用した元のマウスＨＩＲＭＡｂと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＢＢＢとの結合に関して同一活性をもつか、又はｉｎ ｖｉｖｏで霊長類ＢＢＢを通って輸送する。ＰＩＬ遺伝子導入技術の高い治療効果はこのアプローチが経血管経路により治療遺伝子を脳及び他の臓器に送達することにより可能である（２２）。
【００５７】
上記実施例は本発明の受容体によるナノ容器がマウスモデルでヒト脳腫瘍を治療するのに有効であることを示す。ヒト使用には、ＰＩＬ製剤中にただ１個のターゲティングリガンドＨＩＲＭＡｂだけを使用すればよい（図１Ａ）。これはＨＩＲがヒト脳腫瘍の腫瘍細胞膜と腫瘍毛細血管の両者で発現されるためである（３８）。クローン９６７はヒトＥＧＦＲに対するｓｈＲＮＡを生産する。これらの試験でＰＩＬを処方するために使用したマウスＨＩＲＭＡｂをヒトで使用することはできなかった。しかし、ＨＩＲＭＡｂの遺伝子組換え形態は作製されており、ヒトでの使用に現在利用可能である（（３７）及び米国特許出願第１０／３０７，２７６号）。
【００５８】
以上、本発明の代表的態様を記載したが、当業者に自明の通り、上記開示は例証に過ぎず、本発明の範囲内で他の種々の改変、応用及び変形が可能である。従って、本発明は上記好適態様及び実施例に制限されず、特許請求の範囲のみに制限される。
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４０．Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｆ．ａｎｄ Ｙｏｒｉｏ，Ｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２，４４８−４５９（２００３）．
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１Ａは本発明の代表的ペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）の模式図である。リポソーム表面は表面から突出する鎖として示す２０００ダルトンポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の数千個の結合剤と結合している。ＰＥＧ鎖の約１−２％の先端はマウストランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ）に対する８Ｄ３ラットモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）又はヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するマウス８３−１４モノクローナル抗体（ＭＡｂ２）から構成されるターゲティングリガンドと結合している。ＰＩＬの内側にはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を生じるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡが内包されている。ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子はＵ６プロモーター（ｐｒｏ）により駆動され、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼのＴ５終結配列を３’末端にもつ。（Ｂ）上段はヒトＥＧＦＲのＧｅｎｂａｎｋ登録配列（アクセション番号Ｘ００５８８）に由来するヌクレオチド２５２９−２５５７のヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）配列のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１Ｂの下段にはクローン９６７により生産されるｓｈＲＮＡの配列と二次構造を示す（配列番号２）。アンチセンス鎖は８ヌクレオチドループの５’側であり、センス鎖はループの３’側である。センス鎖はステムループ構造のハイブリダイゼーションＴｍを低下させるために４Ｇ／Ｕミスマッチを含み、アンチセンス鎖の配列はターゲットｍＲＮＡ配列に１００％相補的である。図１Ｃは［３Ｈ］−チミジンの存在下でヒトＵ８７神経膠腫細胞を４８時間インキュベートした後にクローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡを内包したＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬの存在下で細胞を５日間インキュベートした試験結果を示す。プラスミドＤＮＡ１．４、１４、１４０、又は１４００ｎｇ／皿の用量を各実験で使用した。データは平均±ＳＥである（ｎ＝３皿）。
【図２】ｓｃｉｄマウスの尾状核−被殻にＵ８７細胞５００，０００個を移植後５日目に本発明によるヒトＥＧＦＲに対する静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療を開始した生存試験の結果を示す。１２日、１９日及び２６日（矢印）に週１回静脈内遺伝子治療を繰返した。対照群は同一日に食塩水を投与した。２つの処理群の各々でマウス１１匹とした。マウスの５０％が死亡した時間（ＥＤ５０）は食塩水群とＲＮＡｉ群で夫々１７日と３２日である。本発明のショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡｉ遺伝子治療では生存時間が８８％増加し、ｐ＜０．００５レベルで有意であった（フィッシャーの正確確率検定）。
【図３】マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（パネルＡ−Ｅ）又はラットＩｇＧ（パネルＦ）でマウス脳剖検切片を染色した免疫細胞化学試験の結果を示す。切片に対比染色はしなかった。パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、及びＦの倍率は同一であり、パネルＡの倍率線は１３５μｍである。パネルＣの倍率線は３４μｍである。パネルＡ−Ｃは食塩水を投与したマウスの脳から採取した切片であり、パネルＤ−Ｆはクローン９６７遺伝子治療で治療したマウスから採取した切片である。パネルＡ−Ｃは食塩水を投与したマウスにおける腫瘍血管構造の密度を示す。パネルＢはパネルの下部の正常脳とパネルの上部の腫瘍を含む切片を示し、腫瘍は正常脳からの血管により血管新生している。パネルＤはパネルの左側に腫瘍を示し、パネルの右側に正常脳を示し、この切片はＲＮＡｉ遺伝子治療で治療したマウスから採取し、ＲＮＡｉを投与した動物における血管密度の低下を示す。パネルＥに示すように正常脳の血管密度はＲＮＡｉを投与した動物で変化しない。
【図４】本発明のＲＮＡｉ遺伝子治療によるｉｎ ｖｉｖｏ ＥＧＦＲダウンレギュレーションの結果を示す。ＲＮＡｉ治療したマウス（Ａ−Ｃ）又は食塩水を投与したマウス（Ｄ−Ｆ）からの脳腫瘍について頭蓋内神経膠腫切片の共焦点顕微鏡写真を示す。ＨＩＲに対するマウス８３−１４ ＭＡｂ（緑）とマウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（赤）で切片を二重標識した。ＲＮＡｉ治療したマウス（Ａ−Ｃ）では食塩水を投与したマウス（Ｄ−Ｆ）に比較して腫瘍細胞における免疫反応性ＥＧＦＲが減少している。食塩水を投与した動物は移植後１４−１５日で死亡した（Ｄ、Ｅ、及びＦ）が、ＲＮＡｉ治療した動物は夫々静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療の最終投与後５、７、及び８日である移植後３１日（Ａ）、３３日（Ｂ）、及び３４日（Ｃ）に死亡した（図２）。
【図５】クローン９５２又はクローン９６２に暴露せずにクローン９６７又はクローン８８２に暴露したヒトＵ８７細胞における免疫反応性ＥＧＦＲの選択的ノックダウンをウェスタンブロットにより測定した結果を示す。細胞培養におけるこれらのウェスタンブロット試験は図４に示すｉｎ ｖｉｖｏ脳腫瘍結果の共焦点顕微鏡写真を裏付けるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般には脳を含む体内臓器及び組織への遺伝子薬の送達に関する。より詳細には、本発明はリポソーム技術、受容体技術、ペグ化技術及び治療遺伝子技術を併用したアンチセンス遺伝子治療に関する。本発明は脳腫瘍及び他の固形癌の治療に有用な製剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を記載するため及びその実施に関する更に詳細を記載するために本明細書に言及する刊行物及び他の参考文献は参考資料として本明細書に組込む。便宜のために、参考文献に番号を付け、末尾に一覧にまとめる。
【０００３】
遺伝子治療は１０年以上前から５０００人を越える患者で使用されているが、脳腫瘍を含むヒトにおける癌の治療では成功していない（１）。ペトリ皿や基礎動物モデルで癌治療の成功例は多いが、癌をもつヒトではこの進歩が得られていない。ペトリ皿からヒトに発展できないのは細胞培養系には存在しない数種の遺伝子送達障害が人体に存在するためである。脳腫瘍の遺伝子治療では、治療遺伝子をウイルスベクターに組込み、開頭術後に脳に注入している（１）。しかし、このアプローチは２つの理由で問題がある。第１に、血管脳関門（ＢＢＢ）を形成する腫瘍の血管関門を通って遺伝子を送達するのが脳内の全癌遺伝子に治療遺伝子を送達する唯一の方法である。患者の頭部に穴を開け、この穴を通して遺伝子を注入するので、遺伝子を送達する癌細胞の率が低い（１）。第２に、ウイルスベクターの使用は問題がある。
【０００４】
アデノウイルスやヘルペスウイルス等のウイルスベクターは脳に炎症を生じ、脱髄をもたらす（２，３）。レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルスベクターは患者の染色体にランダム及び永久的組込みを生じ（４，５）、挿入突然変異誘発による二次癌を誘発する恐れがある。従って、遺伝子治療の制限因子は非ウイルス送達システムの必要性と、静脈内注射後にＢＢＢを通過する遺伝子送達システムの必要性の両面に関する送達である。このような遺伝子送達システムは脳を含む組織及び臓器に遺伝子を送達するためにペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）を使用する米国特許第６，３７２，２５０号に教示されている。
【０００５】
疾患遺伝子の発現をノックダウンすることを目的とする特殊な型の遺伝子治療をアンチセンス遺伝子治療と言う。治療遺伝子は細胞内で標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスの長鎖ＲＮＡをコードする。アンチセンスＲＮＡは標的ｍＲＮＡとデュプレックスを形成し、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するか又はｍＲＮＡ翻訳を阻止し、ある種の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を生じる。過去数年以内に、約２０ヌクレオチド長の短いＲＮＡデュプレックスを細胞に注入することによりＰＴＧＳを誘発できることが発見された（６）。
【０００６】
ＲＮＡデュプレックスは標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスの規定配列をもち、ＲＮＡデュプレックスと標的ｍＲＮＡの複合体が形成されると、標的ｍＲＮＡの分解又はｍＲＮＡ翻訳阻止とＰＴＧＳを生じる。この形態のＰＴＧＳは短いＲＮＡデュプレックスにより媒介されることからＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる（７）。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでは非常に不安定であるので、発現プラスミドがステム−ループ構造からなるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ形態のＲＮＡｉが開発された（６）。ｓｈＲＮＡは細胞で発現されると、細胞質に輸送され、短いＲＮＡデュプレックスにプロセシングされた後、標的ｍＲＮＡのＰＴＧＳを生じることができる（６）。ｓｈＲＮＡは標的ｍＲＮＡに１００％相補的であり、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として機能し、標的ｍＲＮＡ分解を誘導することができる。あるいは、ｓｈＲＮＡは標的ｍＲＮＡ配列に対して不完全な相補性をもち、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として機能し、標的ｍＲＮＡ翻訳阻止を生じることもできる。ＲＮＡｉは癌、ウイルス感染症及び他の疾患の治療に大いに期待されるが、ヒトにおけるＲＮＡｉの適用はまだ別形態の遺伝子治療であるため、他の形態の遺伝子治療と同一の送達の問題により制限されている（８）。ヒトでは如何なる形態の遺伝子治療も臨床的に成功していないので、過去に使用されている標準アプローチによりＲＮＡｉ遺伝子治療が成功するとは殆ど考えられない。
【０００７】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）と呼ばれる原発性極悪性脳腫瘍の９０％で過剰発現され（９）、固形癌一般の７０％で過剰発現される（１０）。ＥＧＦＲはこれらの癌で腫瘍形成の役割を果たし、新癌治療の開発で現在最も集中的に研究されているターゲットである。癌におけるＥＧＦＲをノックダウンするために小分子（１１）や、ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体（１２）を含む各種のアプローチが試みられている。ペトリ皿での研究ではアンチセンス遺伝子治療によるＥＧＦＲのターゲティングを実施できることが示されている（１３）が、送達の問題を解決できないため、脳腫瘍を含む癌をもつ動物生体でこのアプローチを実施するには至っていない。
【０００８】
ｎｔ２３００−３０００のヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡに対してアンチセンスの７００ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡをコードする非ウイルス発現プラスミドが作製されている（１４）。ＰＩＬ遺伝子ターゲティングアプローチを使用して脳腫瘍をもつマウスにこの発現プラスミドを送達し、マウスの生存時間の１００％増加が達成された（１５）。しかし、この発現プラスミドの効力を増加するためには、エプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）−１をコードする遺伝子をプラスミドに加える必要があった（１５）。ＥＢＮＡ−１は分割細胞で遺伝子発現を増加し、ＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術による細胞送達後にヒト脳腫瘍における外来遺伝子発現を１０倍に増加した（１６）。しかし、ＥＢＮＡ−１は腫瘍形成性であり（１７）、ヒトで使用する遺伝子に組込むと癌を発生する恐れがある。従って、ＥＧＦＲに特異的であり、所望治療効果を達成するためにＥＢＮＡ−１を使用する必要のない新規でより強力な形態のアンチセンス遺伝子治療が必要である。
【０００９】
ある報告はカチオン脂質と共に送達した合成ＲＮＡデュプレックスにより細胞培養でヒトＥＧＦＲのＰＴＧＳを達成できることを示している（１８）。しかし、ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡから細胞内で生産されたｓｈＲＮＡでヒトＥＧＦＲのＰＴＧＳを生ずること即ちＤＮＡによるＲＮＡｉが可能であるということは従来の研究では立証されていない。ＤＮＡによるＲＮＡｉによりＥＧＦＲをノックダウンできるか否かに関する不確実性を増すのは、一般に完全なＲＮＡｉ効果を生じる標的配列をｍＲＮＡ内で見いだすことは困難であり、一般に全試験配列の２０％しか有効でないという事実である（６）。
【００１０】
ＰＩＬ遺伝子ターゲティングアプローチを使用して脳腫瘍をもつ成体ラットにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを送達できることは従来の研究に示されている（１９）。しかし、この形態の脳腫瘍で発現されるルシフェラーゼ遺伝子は単にレポーター遺伝子であったので、ＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術によるＲＮＡｉをコードする遺伝子の脳腫瘍送達が生存に有効であるか否かを評価することはできなかった。
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２５０号
【特許文献２】米国特許出願第１０／０２５，７３２号
【特許文献３】米国特許出願第１０／６４７，１９７号
【特許文献４】米国特許第４，８０１，５７５号
【特許文献５】米国特許第５，１５４，９２４号
【特許文献６】米国特許第５，１８２，１０７号
【特許文献７】米国特許第５，５２７，５２７号
【特許文献８】米国特許第５，６７２，６８３号
【特許文献９】米国特許第５，８３３，９８８号
【特許文献１０】米国特許第５，９７７，３０７号
【特許文献１１】米国特許出願第１０／３０７，２７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明によると、所定受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡ遺伝子を送達するために受容体特異的ナノ容器を使用する。細胞の内側に入ると、前記遺伝子はヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡ等の発癌遺伝子又は他の疾患原因遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含むショートヘアピンＲＮＡを発現する。ショートヘアピンＲＮＡは細胞質において発癌遺伝子又は疾患原因遺伝子を不活性化（ノックダウン）するのに有効な短いＲＮＡデュプレックスに変換される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ等の発癌遺伝子の所定領域は本発明の受容体特異的ナノ容器を使用して攻撃し易いことが発見された。例えば、ヌクレオチド２３００〜３８００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのショートヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子は癌の治療に有効であることが判明した。更に、ヌクレオチド２５００〜３０００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのショートヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子は癌の治療に特に有効であることが判明した。ヌクレオチド２５００〜２６００に位置するＥＧＦＲ ｍＲＮＡの部分は本発明のショートヘアピンＲＮＡにより特に攻撃し易いことが判明した。
【００１３】
本発明は受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するための方法にも関する。前記方法は本発明のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを含む受容体特異的ナノ容器と受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤーを含む有効量の製剤を動物に投与する段階を含む。製剤は静脈内注射等の非侵襲的方法により投与される。本発明による週１回静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療を使用して実施した生存試験では、頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスで生存時間の有意増加が観察された。
【００１４】
本発明の上記及び他の多くの特徴とそれに伴う利点は添付図面と共に詳細な説明を参照することにより更によく理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は遺伝子治療と、ショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と、遺伝子ターゲティング技術を併用して動物における疾患遺伝子を不活性化（「ノックダウン」）するために有効な組成物と方法を提供する。本発明は治療遺伝子の非侵襲的な非ウイルス送達方法及び組成物を教示する米国特許第６，３７２，２５０号に記載されている遺伝子ターゲティング技術に基づく。この技術は遺伝子薬の非ウイルス製剤の単純な静脈内注射後に治療遺伝子を遠位部位にターゲティングすることができる。この遺伝子ターゲティング技術とアンチセンス遺伝子治療の１形態であるＲＮＡｉを併用することにより、動物における疾患原因遺伝子をノックダウンすることができる。
【００１６】
本発明の受容体特異的ナノ容器は受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するように設計される。組成物は外部表面と内部コンパートメントをもつナノ容器を含む。複数の受容体ターゲティング剤が結合剤によりナノ容器の表面に結合されている。ターゲティング剤はナノ容器にその受容体特異的ターゲティング能を付与する。ナノ容器の内部コンパートメント内に遺伝子を配置する。遺伝子はショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含む。ショートヘアピンＲＮＡのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ又は受容体標的細胞が機能するために必要な他のヌクレオチド配列の少なくとも一部に対してアンチセンスなヌクレオチドを含む。
【００１７】
ナノ容器はリポソームであることが好ましいが、外部表面とショートヘアピンＲＮＡを収容するための内部コンパートメントを含む適切な他の任意ナノ容器でもよい。リポソームは直径２００ナノメートル未満であることが好ましい。直径５０〜１５０ナノメートルのリポソームが好ましい。外径約８０〜１００ナノメートルのリポソーム又は他のナノ容器が特に好ましい。適切な型のリポソームは１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、又はコレステロール等の中性リン脂質と、リポソーム内のアニオン性ＤＮＡを安定化するために少量（１−５％）のジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）等のカチオン性脂質から構成される。非侵襲的遺伝子ターゲティング用ナノ容器としてのリポソームの作製及び使用方法は米国特許第６，３７２，２５０号や係属中の米国特許出願第１０／０２５，７３２号及び１０／６４７，１９７号に教示されているように周知である。
【００１８】
リポソーム又は他のナノ容器に内包される遺伝子は標的ｍＲＮＡ又は他のヌクレオチド配列を不活性化又は少なくとも減弱させるために十分な量のアンチセンス配列を含むショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする任意遺伝子とすることができる。本明細書の目的で「ショートヘアピンＲＮＡ」とは１９〜２９ヌクレオチドのステム長と、５〜１０ヌクレオチドのループ長と、図１Ｂに示すようなヘアピン形状をもつＲＮＡである。ショートヘアピンＲＮＡはショートヘアピンＲＮＡのアンチセンス部分を含み、１９〜２９ヌクレオチド長が好ましいが、標的ｍＲＮＡ内の接近可能な部位の寸法により異なる場合もある。使用可能な代表的ショートヘアピンＲＮＡとしてはＥＧＦＲやｒａｓ等の発癌遺伝子受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）等の血管形成因子又は受容体に対してアンチセンスのものが挙げられる。ショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子はリポソーム又はナノ容器の内部コンパートメント内に内包されたプラスミドＤＮＡにより発現されることが好ましい。
【００１９】
ショートヘアピン遺伝子は周知薬剤内包法の任意のものに従ってリポソーム内に内包することができる。例えば、内包は音波処理、凍結／解凍、蒸発、洗浄剤透析、及びメンブレンフィルターによる押出により実施することができる。
【００２０】
リポソーム混合物内に内包される遺伝子数は治療する疾患に応じて１から多数までとすることができるが、各ナノ容器はプラスミドＤＮＡの有効半径に応じて１又は２個以下のプラスミドＤＮＡ分子を含むことができる。制限因子は内包される遺伝子の寸法とリポソームの内部コンパートメントの寸法である。ヒストン、プロタミン、又はポリリジン等のポリカチオン性蛋白質を使用すると、数千ヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡの寸法を直径１０〜３０ｎｍの構造まで圧縮することができる。ショートヘアピンＲＮＡを発現させるために使用される遺伝子は比較的小さいため、多数の遺伝子を単一のタンデム発現プラスミドＤＮＡに組込むことができる。必要に応じて、リポソームの内側にＤＮＡを内包する前に、同一遺伝子の多数のコピー又は多重遺伝子の多重コピーを発現プラスミドＤＮＡの内側に内包することができる。一般に、任意所定ナノ容器に存在する遺伝子数をできるだけ多くすることが望ましい。
【００２１】
内包した遺伝子を所望標的細胞に（必要に応じて血液脳関門を通って）輸送するためには、多数のターゲティング剤をナノ容器に結合する。適切なターゲティング剤としては細胞表面に位置する所望受容体にナノ容器をターゲティングできる任意物質が挙げられる。任意数のターゲティング剤を使用することができるが、好ましい物質としてはインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、レプチン、線維芽細胞増殖因子等の内在受容体リガンド、又は内在リガンドと同様に受容体に結合するペプチドミメティックモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が挙げられる。内在リガンド又はペプチドミメティックＭＡｂはいずれも細胞の外部表面への受容体結合後に細胞の内部に受容体によるエンドサイトーシスが行われるようにエンドサイトーシス性リガンドでなければならない。一般に、ターゲティングリガンドは血管関門の背後の血管内皮細胞と標的腫瘍細胞の両者の細胞膜を通ってリポソームのエンドサイトーシスを開始しなければならない。血管内皮細胞膜関門と標的細胞膜関門の両者を通ってリポソームをターゲティングすることができるターゲティング剤が好ましい。このためには、標的受容体が血管内皮細胞関門と標的細胞膜の両者で発現されなければならない。脳の場合には、血管内皮細胞膜はＢＢＢである。このようなターゲティング剤ないし「輸送型ペプチド」としてはＢＢＢと脳細胞膜（ＢＣＭ）の両者で発現される全標的コグネイト受容体としてのインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、もしくはレプチン、又はその対応するペプチドミメティックＭＡｂが挙げられる。あるいは、内在ＢＢＢ受容体をターゲティングするペプチドと内在ＢＣＭをターゲティングするペプチドの２種の異なる「輸送型ペプチド」をリポソームの表面に結合することができる。後者ペプチドはニューロン、グリア細胞、ペリサイト、平滑筋細胞、又は小グリア細胞等の脳内の特定細胞に対して特異的であると考えられる。ターゲティングペプチドは受容体の内在ペプチドリガンドでもよいし、内在リガンドの類似体でもよいし、内在リガンドの同一受容体と結合するペプチドミメティックＭＡｂでもよい。輸送型ペプチド一般の使用と、ターゲティングリガンドとしてのトランスフェリン又はインスリンの使用は米国特許第４，８０１，５７５号に詳細に記載されている。ＢＢＢ「輸送型ペプチド」としての受容体（ＴｆＲ）特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体は米国特許第５，１５４，９２４号；５，１８２，１０７号；５，５２７，５２７号；５，６７２，６８３号；５，８３３，９８８号；及び５，９７７，３０７号に詳細に記載されている。ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するＭＡｂをＢＢＢ「輸送型ペプチド」として使用することが好ましい。ヒトインスリン受容体に対する代表的な好ましいＭＡｂは米国特許出願第１０／３０７，２７６号に開示されている。
【００２２】
ターゲティング剤をリポソームの表面に結合するために使用される結合剤はスフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他の有機ポリマー等の周知ポリマー結合剤の任意のものとすることができる。ＰＥＧが特に好ましい結合剤である。結合剤の分子量は１０００〜５０，０００ＤＡが好ましい。特に好ましい結合剤は一端に脂質を含み、他端にマレイミド基を含む二官能性２０００ＤＡ ＰＥＧである。ＰＥＧの脂質端はリポソームの表面に挿入し、マレイミド基は受容体特異的モノクローナル抗体又は他の血液脳関門ターゲティングビヒクルと共有結合を形成する。各リポソームに５〜１０００個のターゲティングビヒクルを結合することが好ましい。約２５〜７５個のターゲティングビヒクルを結合したリポソームが特に好ましい。
【００２３】
リポソームが好ましいナノ容器であるが、当業者に自明の通り、他のナノ容器も使用できる。例えば、リポソームの代わりにナノ粒子を使用してもよいし、遺伝子を内包することができ、製剤が血液中にあるか又は血液から標的細胞の細胞内コンパートメントに移動している間に核酸をヌクレアーゼから保護することができる直径＜２００ｎｍの他の任意ナノ容器を使用してもよい。同様に、リポソーム又はナノ容器の表面に結合しており、「輸送型ペプチド」を結合するため及び製剤が血液から除去されるのを遅らせるための足場を提供すると共に血漿薬物動態を最適化するという二重の目的をもつ他の多重ポリマー物質（例えばスフィンゴミエリン）をＰＥＧ鎖の代わりに使用することができる。更に、本発明は脳、肝臓、肺及び脾臓を含む特異的標的受容体をもつ各種細胞又は臓器にショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子を送達することを意図する。更に、本発明は係属中の米国特許出願第１０／０２５，７３２号に詳細に記載されているように、血液網膜関門を通って網膜及び他の眼構造にｓｈＲＮＡを発現する遺伝子を送達することを意図する。本発明の受容体特異的ナノ容器は静脈内投与に適した任意医薬キャリヤーと併用することができる。受容体特異的ナノ容器の静脈内投与は侵襲性が最低であるので好ましい経路である。必要に応じて他の投与経路も可能である。適切な医薬的に許容可能なキャリヤーとしては食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、又は他の任意水溶液が挙げられる。
【００２４】
受容体特異的ナノ容器の治療有効量は治療する個体と投与する特定遺伝子により多様である。適切な投与量は当業者に周知の方法により設定される。
【００２５】
脳腫瘍及び大半の固形癌一般は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する。ＥＧＦＲはこれらの癌において腫瘍形成の役割を果たす。多くの現在の癌治療はＥＧＦＲの阻害を目的としている。以下の本発明の好ましい代表的態様の記載はウイルスベクターを使用せずに単純な静脈内投与しか必要としない非侵襲的遺伝子治療でＥＧＦＲを脳腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏノックアウトする方法を立証する。
【００２６】
以下の詳細な記載の実施例に記載する代表的標的遺伝子は脳腫瘍（２０，２１）及び大半の固形癌一般（１０）において腫瘍形成の役割を果たすヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である。以下の記載では、本発明が癌患者を延命できることを立証するためにヒト頭蓋内脳腫瘍のマウスモデルを使用する。当業者に自明の通り、本発明は癌又は他の疾患に関与する可能性のある他の標的遺伝子をノックダウンするために使用することもできる。ショートヘアピンＲＮＡアンチセンス治療を使用してターゲティングすることができる他の発癌原因遺伝子としては、発癌性キナーゼドメインが構成的に活性であり、野生型ＥＧＦＲとは異なる配列をもつＥＧＦＲｍＲＮＡの突然変異体形により発現されるＥＧＦＲの突然変異体が挙げられる。多くの脳腫瘍及び他の固形癌はｖＩＩＩ ＥＧＦＲ突然変異体等の各種ＥＧＦＲ突然変異体を発現する。受容体である他の発癌遺伝子ターゲットとしてはＧＢＭ、乳癌、卵巣癌、肺癌、及び頭頸部癌におけるＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、肺癌、卵巣癌及び乳癌における線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＧＢＭにおける血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、充実性腫瘍におけるインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）が挙げられる（３９）。増殖因子である他の発癌遺伝子ターゲットとしてはＥＧＦＲを過剰発現する癌におけるトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ＧＢＭにおけるＰＤＧＦ、又は癌における血管形成を阻止するためのＶＥＧＦが挙げられる（３９）。改変蛋白質キナーゼを含む他の発現遺伝子ターゲットとしては慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるＢｃｒ−Ａｂｌ、腎臓癌におけるｃ−Ｍｅｔ、胃癌におけるｃ−Ｋｉｔ、多発癌におけるｒａｓ、膀胱癌、結腸癌、肺癌、もしくは乳癌におけるｒａｆ、又は多発癌におけるＣｄＫが挙げられる（３９）。疾患原因遺伝子のアンチセンスノックダウンが有効であると思われる癌以外の慢性疾患としては、標的遺伝子がウイルス複製に不可欠のウイルス特異的遺伝子である慢性肝炎や後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等のウイルス感染症が挙げられる。加齢性失明の最も一般的な原因はＶＥＧＦにより誘導される血管肥大に起因する加齢性黄斑変性ないしＡＭＤであり、眼におけるＶＥＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ−Ｒ遺伝子のアンチセンスノックダウンはＡＭＤの新規治療となると思われる（４０）。
【００２７】
以下に示すように、予め形成した頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスに本発明の代表的１態様（クローン９６７により発現されるｓｈＲＮＡ）を使用してＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術により脳腫瘍に送達することによりクローン９６７プラスミドＤＮＡを週１回投与後に生存時間の８８％増加が達成された。クローン９６７はヒトＥＧＦＲのｎｔ２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡをコードする代表的真核発現プラスミドである。脳腫瘍の治療と他の固形癌一般の治療にこの型のｓｈＲＮＡを使用することができる。生存時間の増加は開頭術又は他の侵襲的投与形態を用いずに達成され、単純な週１回静脈内注射しか必要としなかった。治療効果はウイルス又は腫瘍形成性ＤＮＡエレメント（例えばＥＢＮＡ−１）を使用せずに達成された。本発明は原発性脳腫瘍又は脳に転移した脳以外の癌においてＥＧＦＲ以外の癌原因遺伝子をノックダウンするために使用可能なＤＮＡによるＲＮＡｉ技術とＰＩＬ遺伝子ターゲティング技術の併用を提供する。更に、受容体特異的ナノ容器は癌以外の疾患の脳における疾患原因遺伝子をノックダウンするために使用することができる。
【００２８】
脳腫瘍の遺伝子治療はＥＧＦＲ等の発癌遺伝子の発現を特異的にノックダウンすると期待される。しかし、遺伝子治療はＢＢＢの存在により特に脳では困難な送達の問題により制限される。ＢＢＢを回避するために、開頭術アプローチにより治療薬を脳腫瘍に送達する試みが行われている（１）。しかし、腫瘍内注射後の腫瘍内の治療薬の分布は非常に制限されるので、このアプローチは有効ではない（１）。ＢＢＢを通る経血管経路により脳腫瘍内の全細胞に治療薬を送達することができる（２２）。従来記載されているようにペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）を使用する新規非ウイルス遺伝子導入技術を使用して非ウイルス遺伝子を脳に経血管送達することは現在可能である（米国特許第６，３７２，２５０号参照）。このアプローチでは、非ウイルスプラスミドＤＮＡを８５ｎｍアニオン性リポソームの内側に内包し、リポソームの表面を数千個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖と結合する。この「ＰＥＧ化」法は網膜内皮系によるリポソームの取込みを制限し、血液滞留時間を延長することができる（２３）。その後、図１Ａに示すように生体関門を通って受容体特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と共にＰＥＧ化リポソームをｉｎ ｖｉｖｏ送達する。
【００２９】
ＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術を適用すると、ヒトＥＧＦＲに対するアンチセンス遺伝子治療の週１回静脈内注射により頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつマウスの生存時間を１００％増加することができた（１５）。ヒトＥＧＦＲのヌクレオチド２３１７−３００６に対してアンチセンスの７００ヌクレオチドＲＮＡをコードする真核発現プラスミド（クローン８８２と言う）をＰＩＬに内包し（１４）、受容体特異性の異なる２種のＭＡｂで脳腫瘍に二重にｉｎ ｖｉｖｏターゲティングした（１５）。第１のＭＡｂであるマウストランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するラット８Ｄ３ ＭＡｂは頭蓋内癌に血管形成したマウスＢＢＢを通ってＰＩＬを輸送することができ、これらの癌血管はマウス脳に由来し、マウスＴｆＲを発現した。第２のＭＡｂはヒト脳腫瘍血漿膜で発現されたヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）にターゲティングした（図１Ａ）。ターゲティングＭＡｂは膜関門を通ってＰＩＬを輸送するための分子のトロイの木馬として機能し、これらのＭＡｂは種特異的である（２４）。マウスＴｆＲに対する８Ｄ３は最初の関門を通ってマウスＢＢＢを輸送することができたが、第２の関門であるヒト脳腫瘍細胞膜を通ってＰＩＬを輸送することはできなかった。これは同様にマウス血管内皮細胞インスリン受容体と反応しないＨＩＲＭＡｂで達成された。二重結合ＰＩＬをＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬと言う（図１Ａ）。
【００３０】
クローン８８２発現プラスミドの効力を増加するために、癌細胞の分裂毎に発現プラスミドを１回複製させるｏｒｉＰ及びエプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）−１エレメント（１４７）をこのベクターに加えた（２５）。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エレメントを発現プラスミド内に加えると、ヒトＵ８７神経膠腫細胞における遺伝子発現レベルを１０倍に増加することができる（１６）。しかし、ＥＢＮＡ−１遺伝子は腫瘍形成性トランス作用因子をコードし（１７）、この製剤はヒト遺伝子治療では望ましくないと思われる。ＤＮＡによるＲＮＡｉ等のより強力な形態のアンチセンス遺伝子治療を使用したならばＥＢＮＡ−１エレメントは必要ないと思われる。
【００３１】
ＤＮＡによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は発現プラスミドＤＮＡがステムループ構造から構成されるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする強力な形態のアンチセンス遺伝子治療である（６）。このｓｈＲＮＡは細胞内でプロセシングされて３’−オーバーハングをもつＲＮＡデュプレックスとなり、この短いＲＮＡデュプレックスはＲＮＡｉ又は転写後遺伝子サイレンシングを媒介する。従来記載されているように、ＲＮＡｉによる遺伝子治療は癌治療に大いに期待される。しかし、重要な制限因子は細胞へのｓｈＲＮＡの送達である。
【００３２】
以下の実施例では、本発明による代表的な受容体特異的ナノ容器を作製及び試験し、脳腫瘍をもつマウスにおけるヒトＥＧＦＲに対する静脈内経路のＲＮＡｉによる遺伝子治療の治療効力を立証する。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エレメントをもたず、ヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡにおける特定配列に対するｓｈＲＮＡをコードする代表的な発現プラスミドを提供する。これらの代表的なプラスミドをＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに組込んだ。頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつマウスにこれらのＰＩＬを週１回スケジュールで静脈内投与した。
【００３３】
実施例は以下の通りである。実施例で使用した材料は以下の販売業者から入手した。
【００３４】
ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ２０００（ここで、ＰＥＧ２０００は２０００ ダルトンポリエチレングリコールである）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（ＭＡＬ）、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。Ｎ−スクシンイミジル［２，３−３Ｈ］プロピオネート（３Ｈ−ＮＳＰ，１０１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ、２−イミノチオラン（トラウト試薬）、及びビシンコニン酸，（ＢＣＡ）蛋白質アッセイ。本試験で使用した抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（ＴｆＲＭＡｂ）はマウスＴｆＲに対する８Ｄ３ラットＭＡｂである［２６］。８Ｄ３ ＭＡｂはマウスＴｆＲに特異的であり、ヒト細胞では不活性である。ヒト細胞への遺伝子ターゲティングに使用した抗インスリン受容体ＭＡｂはヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するマウス８３−１４ ＭＡｂである［２７］。ＴｆＲＭＡｂとＨＩＲＭＡｂはハイブリドーマから生成した腹水からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで個々に精製した。カスタムオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手した。
【実施例１】
【００３５】
ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドの設計と細胞培養における生物活性の立証。各種ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡに対応するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）デュプレックスを文献（２８）に記載されているように設計した（表１参照）。
【表１】
【００３６】
クローニング中のＤＮＡヘアピンの形成を減らすためにｓｈＲＮＡ配列に故意にセンス鎖（図１Ｂ）のヌクレオチドミスマッチを加えた。アンチセンス鎖は変わらないので、これらのＧ−Ｕ置換はＲＮＡｉ効果を妨げない（２９）。フォワードＯＤＮはＵ６ポリメラーゼ停止シグナル（Ｔ６）を含む（表１）。リバースＯＤＮは標準真核発現プラスミドの付着末端へのサブクローニングを誘導するために、夫々５’及び３’末端のＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限部位に特異的な４ヌクレオチドオーバーハングを含む（表１）。空の発現プラスミドをクローン９５９と言う（表２）。相補的ＯＤＮを熱変性（９４℃で４分間）し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．４），１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃で１６時間アニールした。二本鎖ＯＤＮをプラスミドのＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ部位にライゲーションした。大腸菌ＤＨ５ａコンピテント細胞を形質転換し、Ｔ３プライマーを使用するＤＮＡシーケンシングとＮａｅＩによる制限エンドヌクレアーゼマッピングにより正しいＲＮＡｉインサートをもつクローンを確認した。
【表２】
【００３７】
合計６種の抗ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドＤＮＡを作製し、９６２−９６４及び９６６−９６８と命名した（表１）。これらの６種のｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドのＥＧＦＲノックダウン効力を従来記載されている真核発現プラスミドであるクローン８８２のＥＧＦＲノックダウン効果と比較した（１５）。クローン８８２はｐＣＥＰ４に由来し、ＳＶ４０プロモーターにより駆動され、ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰエレメントを含み、ヒトＥＧＦＲのｎｔ２３１７−３００６に相補的な７００ｎｔアンチセンスＲＮＡをコードする（１５）。組織培養におけるヒトＵ８７神経膠腫への［３Ｈ］−チミジン取込み率を測定することによりヒトＥＧＦＲに対するＲＮＡｉ効果をスクリーニングした。ヌクレオチド１８７−２１９（クローン９６２）、２０８７−２１１９（クローン９６３）、及び３６８３−３７１５（クローン９６４）のヒトＥＧＦＲｍＲＮＡの３種の広い間隔の領域に対するｓｈＲＮＡを作製するようにフォワード及びリバース合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を設計し、ＯＤＮ配列を表１に示す。
【００３８】
Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞への［３Ｈ］−チミジン取込みの阻害を測定することによりこれらのＥＧＦＲ ＲＮＡｉプラスミドの生物活性を試験した（表２）。クローン９６２−９６３はＥＧＦＲ作用のノックダウンを生じず、クローン９６４の効果は中間であった（表２）。従って、ヒトＥＧＦＲｍＲＮＡのヌクレオチド２３００−３０００内の３種の異なる領域として表１に示すような２３４６−２３７４（クローン９６６）、２５２９−２５５７（クローン９６７）、及び２９３７−２９６５（クローン９６８）に対するｓｈＲＮＡを作製するように、第２組のＯＤＮを設計した。ＥＧＦＲ機能のノックダウンはクローン９６６及び９６８では中間であったが、クローン９６７はクローン８８２と同等レベルの［３Ｈ］−チミジン取込みを生じた（表２）。クローン９６７により生産されたｓｈＲＮＡの配列と二次構造を図１Ｂに示す。
【００３９】
ヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は公知である（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号Ｘ００５８８）。ヌクレオチド配列はヌクレオチド番号１から開始し、ヌクレオチド番号５５３２までである。上記結果によると、ｓｈＲＮＡはヌクレオチド２３４６位〜３７１５位のＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域に位置するヌクレオチドに対してアンチセンスであると思われる。ｓｈＲＮＡは２５２９位〜２９６５位のＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域に対してアンチセンスであることが好ましい。アンチセンスでターゲティングされるＥＧＦＲ ｍＲＮＡの領域は２５２９位〜２５５７位がより好ましい。
【実施例２】
【００４０】
ウェスタンブロッティング。細胞培養でＲＮＡｉによる機能的ＥＧＦＲ発現の阻害を確認するために、クローン９６７プラスミドＤＮＡに４８時間暴露後に培養Ｕ８７細胞でウェスタンブロッティング（図５）により免疫反応性ＥＧＦＲを測定した。対照として、クローン８８２（ＥＢＮＡ−１による従来のアンチセンス遺伝子治療）、クローン９６２（無効な抗ＥＧＦＲ ＲＮＡｉクローン（表２））、及びクローン９５２［ＥＧＦＲに無効であると思われる抗ルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡｉクローン（１９参照）］に暴露後に免疫反応性ＥＧＦＲのレベルを測定した。ウェスタンブロットの定量の結果、クローン９６７及び８８２はＥＧＦＲを夫々６８％及び８８％ノックダウンした（図５）。
【００４１】
ウェスタンブロットの詳細は以下の通りである。
【００４２】
ヒトＵ８７神経膠腫細胞を３５ｍｍ皿で８０％コンフルエントまで培養した。各プラスミドＤＮＡ（クローン９６７，８８２，９５２，及び９６２）をＤＮＡ１．５ｍｇ／皿の用量でリポフェクタミンに４時間添加した。次に培地を捨て、１０％胎仔ウシ血清を加えた新鮮な培地に交換し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を溶解用緩衝液で回収した後、ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後にニトロセルロースフィルターにブロットした。ＥＧＦＲをヒトＥＧＦＲに対する市販抗体で検出し、ウェスタンブロットシグナルを化学ルミネッセンス法で測定した。ｘ線フィルムをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐでスキャンし、積分密度をＮＩＨ画像ソフトウェアにより定量し、図５に示す平均及び標準誤差結果を得た。
【実施例３】
【００４３】
クローン８８２（ＥＢＮＡ−１による従来のアンチセンス治療）及びクローン９６７（ＥＢＮＡ−１を使用しないＤＮＡによるＲＮＡｉ遺伝子治療）の等価性の実証。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を加えたＭＥＭ培地を入れた６ウェルクラスター皿でＵ８７ヒト神経膠腫細胞を増殖させた。細胞が５０−６０％コンフルエントに達した後に各プラスミドＤＮＡ（クローン９５９，９６２−９６４，９６６−９６８，又は８８２）１μｇとリポフェクタミン１０μｌ（２０μｇ）を加えた無血清ＭＥＭ１．５ｍｌに増殖培地を交換し、４時間３７℃でインキュベートした。１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭ培地に培地を交換し、２４時間インキュベートした。終濃度２μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−チミジンと１０μＭの未標識チミジンを各皿に加え、皿を３７℃で４８時間インキュベートした。従来記載されているように［３Ｈ］−チミジン取込みを測定するために細胞を回収した（１４）。Ｕ８７細胞にリポフェクタミンをトランスフェクションした結果、クローン９６７がＥＧＦＲ発現のＲＮＡ干渉を生じる最も強力なクローンであり、高用量ではクローン８８２とちょうど同程度に有効であることが立証された（表２）。
【００４４】
クローン８８２及び９６７の効力を更に試験するために、７００ｎｔ ＥＧＦＲアンチセンスＲＮＡをコードするクローン８８２（１４）の用量応答試験と平行してクローン９６７による用量応答試験を実施した。これらの用量応答試験では、クローン８８２又はクローン９６７ＤＮＡをＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬにより細胞培養中のヒト神経膠腫細胞に送達した。Ｕ８７細胞を３５ｍｍコラーゲン処理皿で増殖させた。細胞が５０−６０％コンフルエントに達した後に培地を吸引し、１０％ＦＢＳを加えた新鮮なＭＥＭ培地２ｍｌとＤＮＡ１．４、０．１４、０．０１４又は０．００１４μｇ／皿の用量のクローン９６７又はクローン８８２を内包したＨＩＲＭＡｂ−ＰＩＬを加えた。細胞を５日間３７℃でインキュベートした。この期間に３日間インキュベーション後に新鮮な培地２ｍｌを加えた。５日目に培地を吸引し、［３Ｈ］−チミジン２μＣｉ／ｍｌと未標識チミジン１０μＭを加えた新鮮な増殖培地２ｍｌを各皿に加えた後に４８時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に［３Ｈ］−チミジン取込みを測定し、従来記載されているように、細胞蛋白質１ｍｇ当たりに取り込まれたチミジンのｎｍｏｌとして表した（１４）。次にクローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡをＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬに内包し、リポフェクタミンの不在下で１．４−１４００ｎｇ／皿の各種プラスミドＤＮＡ用量でＵ８７細胞に加えた。どちらのプラスミドＤＮＡも約１００ｎｇ／皿のＥＤ５０でチミジン取込みの抑制に同等に有効であった（図１Ｃ）。この組織培養実験の結果、ＥＢＮＡ−１遺伝子をもたないが、ＥＢＮＡ−１の影響下で長い７００ｎｔ ＲＮＡをコードするプラスミド（クローン８８２）と同等に有効なヒトＥＧＦＲに対するＲＮＡｉ発現プラスミド（クローン９６７）を作製できることが判明した。他方、この試験以前にクローン９６７のｉｎ ｖｉｖｏ相対効力は不明であり、クローン９６７がヒト脳腫瘍をもつ動物における生存時間を延ばすか否かも不明であった。
【００４５】
ペグ化イムノリポソームの合成。クローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡを従来記載されているようにＰＩＬに内包した（米国特許第６，３７２，２５０号（１４））。リポソームは直径８５−１００ｎｍであり、リポソームの表面に数千個の２０００Ｄａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を結合した。ＰＥＧ鎖の約１−２％の先端を従来記載されているように８３−１４ ＨＩＲＭＡｂ及び８Ｄ３ ＴｆＲＭＡｂと結合した（１５）。リポソームの内部に内包されなかったプラスミドＤＮＡを徹底的なヌクレアーゼ処理により定量的に除去した（２３）。典型的な合成では、初期プラスミドＤＮＡ（２００μｇ）の３０−４０％が脂質２０μｍｏｌに内包され、各リポソームのＰＥＧ鎖に４３−８７ＭＡｂ分子が結合した（１４）。
【実施例４】
【００４６】
頭蓋内脳腫瘍の静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療による延命。体重１９−２１ｇの雌重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。正中線右２．５ｍｍ及びブレグマ前１ｍｍにバーホールを開けた。１．２％メチルセルロースを加えた無血清ＭＥＭにＵ８７神経膠腫細胞を懸濁した。固定針付き１０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して細胞懸濁液５μｌ（５×１０５細胞）を右尾状核−被殻に深さ３．５ｍｍに２分間かけて注入した。移植後５日目に開始して週１回動物に静脈内投与した。Ｕ８７細胞５００，０００個の移植後５日まで腫瘍は大きく、脳の線条体の容積全体に充満している（３２）。移植後５、１２、１９及び２６日に週１回静脈内遺伝子治療を実施した。食塩水又はＨＩＲＭＡｂ／ｍＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに内包したクローン９６７ＤＮＡ５μｇ／匹をマウスに投与した。大きな頭蓋内腫瘍の増殖後１４−２０日に死亡を生じるヒトＵ８７神経膠腫細胞を成体マウスの尾状核−被殻に移植した。移植後５日に開始し、食塩水又はＨＩＲに対する８３−１４マウスＭＡｂとマウスＴｆＲに対する８Ｄ３ラットＭＡｂで二重ターゲティングしたＰＩＬに内包したクローン９６７プラスミドＤＮＡ５μｇ／匹をマウスに週１回静脈内注射した（図１Ａ）。食塩水を投与したマウスは移植後１４〜２０日に死亡し、ＥＤ５０は１７日であった（図２）。静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療したマウスは移植後３１〜３４日に死亡し、ＥＤ５０は３２日であった（図２）。
【実施例５】
【００４７】
ＲＮＡｉ遺伝子治療及びＰＩＬ遺伝子ターゲティングによる脳腫瘍におけるＥＧＦＲのｉｎ ｖｉｖｏ減少。屠殺直後に脳を取出し、腫瘍の中心から冠状スラブに切断した。スラブをＯ．Ｃ．Ｔ．培地に埋込み、ドライアイス粉末で凍結した。マウス脳の凍結切片（２０μｍ）をＭｉｋｒｏｎ ＨＭ５０５Ｅクリオスタットで切断した。切片を冷１００％メタノールで２０分間−２０℃にて固定した。共焦点顕微鏡分析のために、蛋白質の非特異的結合を１０％ロバ血清リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３０分間ブロックした。切片を一次抗体中、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体はマウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）と、ヒトＥＧＦＲに対するマウス５２８ ＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）であった。ＰＢＳ洗浄後、ローダミンに結合したロバ抗ラットＩｇＧ二次抗体５μｇ／ｍｌを３０分間室温で加えた。次にスライドを洗浄し、フルオレセインと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ５μｇ／ｍｌの存在下に３０分間室温でインキュベートした。切片をスライドに載置し、デュアルアルゴン及びヘリウム／ネオンレーザーを使用して４０倍対物レンズとＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬ共焦点顕微鏡で観察した。フルオレセインシグナルがローダミンチャネルに漏れるのを避けるためにサンプルをマルチトラックモードでスキャンした。切片を０．８μｍ間隔でスキャンし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭソフトウェアで再構成した。対照実験は夫々ラット抗マウスＴｆＲ又はマウス抗ヒトＥＧＦＲ抗体の代わりにラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）又はマウスＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として使用した。
【００４８】
アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）免疫ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により免疫細胞化学試験を実施した。ヒトＥＧＦＲを染色するために、マウス５２８ ＭＡｂ 抗ヒトＥＧＦＲを一次抗体として使用し（３３）、マウスＴｆＲを染色するためにラット８Ｄ３ ＭＡｂ抗マウスＴｆＲを一次抗体として使用した（１５）。内在ペルオキシダーゼを０．３％ウマ血清リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．３％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロックし、蛋白質の非特異的結合をＰＢＳ中３％ウマ又はウサギ血清で３０分間ブロックした。ラット８Ｄ３ ＭＡｂを使用するマウスＴｆＲ染色には、ウサギ血清をブロッキング段階で使用した。次に切片を一次抗体１０μｇ／ｍｌ中、４℃でインキュベートした。同一濃度のアイソタイプ対照も一次抗体として使用した。次にマウスＩｇＧ１を５２８ＭＡｂのアイソタイプ抗体として使用し、ラットＩｇＧを８Ｄ３ＭＡｂのアイソタイプ対照抗体として使用した。インキュベーションとＰＢＳで洗浄後、切片をビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（５２８ＭＡｂ）又はビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ（８Ｄ３ＭＡｂ）中で３０分間インキュベートした後、ＡＥＣで発色させた。スライドは対比染色しなかった。
【００４９】
マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ＭＡｂを使用して免疫細胞化学法により腫瘍を剖検で試験した（図３）。食塩水を投与した動物からの腫瘍は血管新生が多く、マウスＴｆＲを発現した。（図３Ａ，Ｂ，Ｃ）。図３Ｂは正常脳と腫瘍の血管内皮上の免疫反応性マウスＴｆＲを示す。正常脳から腫瘍に伸びる血管が認められる（図３Ｂ）。腫瘍と正常脳の間の境界は図３Ｂに示すように血管密度が低いことが多かった。ＲＮＡｉで治療したマウスの腫瘍における血管密度は図３Ｄに示すように一般に低かったが、ＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療は図３Ｅに示すように正常脳に血管密度の低下を生じなかった。血管マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（赤線）と腫瘍ＨＩＲに対するマウス８３−１４ ＭＡｂ（緑線）による二重免疫標識後の腫瘍切片の共焦点顕微鏡写真を図４に示す。ＲＮＡｉで治療した腫瘍（図４Ａ，Ｂ，及びＣ）では食塩水を投与した腫瘍（図４Ｄ，Ｅ，及びＦ）に比較して免疫反応性ＥＧＦＲのダウンレギュレーションが認められる。
【実施例６】
【００５０】
ＥＧＦＲの癌特異的突然変異体のＲＮＡｉ。脳腫瘍を含む多くの固形癌は突然変異体形のＥＧＦＲを特異的に発現する（３４，３５）。最も一般的な突然変異体はリガンド結合に独立してアップレギュレートされるＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体である（３４，３５）。ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体は野生型ＥＧＦＲ又は他の遺伝子に存在しない特異的ヌクレオチド配列をもつ。従って、ユニークなＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体に対するｓｈＲＮＡを発現するプラスミドは癌に１００％特異的であり、非癌細胞でＥＧＦＲを抑制しない。ｈＥＧＦＲｖＩＩＩのスプライス部位に対する各種ｓｈＲＮＡに対応するＯＤＮデュプレックスを実施例１に記載したと同様に設計し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ｓｈＲＮＡを表３に示す。
【表３】
【００５１】
クローニング中のＤＮＡヘアピンの形成を減らすためにｓｈＲＮＡ配列に故意にセンス鎖のヌクレオチドミスマッチを加えた。アンチセンス鎖は変わらないので、これらのＧ−Ｕ置換はＲＮＡｉ効果を妨げない。フォワードＯＤＮはＵ６ポリメラーゼ停止シグナル（Ｔ６）を含む（表３）。リバースＯＤＮはＵ６発現ベクターの付着末端へのサブクローニングを誘導するために、夫々５’及び３’末端のＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限部位に特異的な４ヌクレオチドオーバーハングを含む。本発明に教示する方法を使用し、当業者は表３に記載するＯＤＮを使用して脳又はＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体のユニークな発現に起因する他の発癌組織における癌のＤＮＡによるＲＮＡｉ遺伝子治療を可能にする発現プラスミドを作製することができる。正常細胞中のＥＧＦＲはＥＧＦＲｖＩＩＩｍＲＮＡ内のユニーク配列を選択的にターゲティングするｓｈＲＮＡにより変化しないので、この形態の癌遺伝子治療は非常に望ましい。
【００５２】
上記実施例はヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡのヌクレオチド２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡをコードする発現プラスミドを使用するＲＮＡｉによる遺伝子治療でＥＧＦＲ遺伝子発現をノックダウンできることを立証するものである（表２）。更に、ＥＧＦＲ発現ノックダウンは組織培養でヒトＵ８７神経膠腫細胞へのチミジン取込みの阻害（表２）と、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応性ＥＧＦＲの脳腫瘍発現の低下（図４）により立証される。最後に、腫瘍サイズが大きい場合には移植後５日まで治療が遅れる（３２）が、週１回静脈内ＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療の結果、生存時間が８８％増加した（図２）。
【００５３】
ヒトＥＧＦＲ転写産物内のＲＮＡｉ活性標的配列の発見には数種の相互作用が必要であった（表１及び表２）。これらの知見は標的配列の約５分の１がＲＮＡｉで治療効果を生じるというＭｃＭａｎｕｓとＳｈａｒｐ（６）の示唆に一致した。従来の研究によると、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターを使用せずにオリゴフェクタミンを使用して培養細胞に送達したＲＮＡデュプレックスでＥＧＦＲ遺伝子発現を抑制できることが示されている（１８）。本実施例は細胞内ｓｈＲＮＡを生産するＲＮＡｉによる発現プラスミドでＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害することができ、ＤＮＡによるＲＮＡｉが細胞培養とｉｎ ｖｉｖｏヒト細胞の両者で有効であることを立証する。チミジン取込みを評価する細胞培養に基づき、ヒトＥＧＦＲ遺伝子発現をノックダウンするためのＲＮＡｉによる遺伝子治療を更に評価するためにクローン９６７を選択した。クローン９６７はヌクレオチド２５２９−２５５７に対するｓｈＲＮＡを生産し（図１Ｂ）、この標的配列はクローン８８２により発現されるアンチセンスＲＮＡによりターゲティングされるヒトＥＧＦＲｍＲＮＡの７００ヌクレオチド領域内にある（１５）。クローン９６７とクローン８８２はヒトＵ８７細胞へのチミジン取込みを同様に阻害し（図１Ｃ）、これはＲＮＡｉによるアンチセンス遺伝子治療形態の高い効力を証明するものである。クローン８８２プラスミドは培養Ｕ８７細胞におけるトランスジーンの発現を１０に増加することができる（１６）ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰ遺伝子エレメントを含む（１４）。従って、アンチセンス遺伝子治療のＲＮＡｉアプローチの高い効力により、発現プラスミドで潜在的に腫瘍形成性のＥＢＮＡ−１エレメントが不要になった。
【００５４】
クローン９６７をＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬで培養Ｕ８７細胞に送達すると、クローン９６７はチミジン取込み阻害に関して用量依存メカニズムでＥＧＦＲ機能をノックダウンし（図１Ｃ）、ＥＤ５０はプラスミドＤＮＡ約１００ｎｇ／皿であった。脳腫瘍における免疫反応性ＥＧＦＲの発現はＥＧＦＲ ＲＮＡｉ遺伝子治療の最後の静脈内投与後５−８日でもまだ顕著に低下している（図４）。
【００５５】
上記実施例はＨＩＲＭＡｂ／ＴｆＲＭＡｂ−ＰＩＬに内包したクローン９６７を使用する週１回静脈内遺伝子治療で生存時間の８８％増加を示す（図２）。週１回静脈内遺伝子治療によるこの生存時間の延長はＥＧＦＲ−チロシンキナーゼ阻害剤ＺＤ１８３９（イレッサ）を高用量で毎日投与したマウスの生存時間の延長と同等である（１１）。神経膠腫細胞１００，０００個の頭蓋内移植後３日目に顕微鏡で腫瘍が認められた場合にイレッサの毎日経口化学療法を開始した（１１）。しかし、イレッサはＥＧＦＲの突然変異体形を発現する脳腫瘍の治療には無効であった（１１）。多くの一次及び転移脳腫瘍はヒトＥＧＦＲの突然変異を発現し（３４−３５）、実施例５に記載したように野生型と突然変異体の両者のＥＧＦＲをノックダウンするＲＮＡｉによる遺伝子治療を設計することが可能である。
【００５６】
要約すると、本発明の実施例はヒトＥＧＦＲに対する週１回静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療により頭蓋内ヒト脳腫瘍をもつ成体マウスの生存時間が８８％増加することを立証する。発癌遺伝子をノックダウンし、脳腫瘍における突然変異腫瘍サプレッサー遺伝子を置換するためにＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術を使用することができる。ＰＩＬ非ウイルス遺伝子導入技術の効果は霊長類で立証されており、霊長類脳における遺伝子発現レベルは齧歯類脳における同等遺伝子発現レベルの５０倍である（３６）。遺伝子組換えモノクローナル抗体を使用して治療遺伝子を内包したＰＩＬをヒト脳腫瘍に送達することができる。キメラＨＩＲＭＡｂ（３７）はこれらの実施例で使用した元のマウスＨＩＲＭＡｂと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＢＢＢとの結合に関して同一活性をもつか、又はｉｎ ｖｉｖｏで霊長類ＢＢＢを通って輸送する。ＰＩＬ遺伝子導入技術の高い治療効果はこのアプローチが経血管経路により治療遺伝子を脳及び他の臓器に送達することにより可能である（２２）。
【００５７】
上記実施例は本発明の受容体によるナノ容器がマウスモデルでヒト脳腫瘍を治療するのに有効であることを示す。ヒト使用には、ＰＩＬ製剤中にただ１個のターゲティングリガンドＨＩＲＭＡｂだけを使用すればよい（図１Ａ）。これはＨＩＲがヒト脳腫瘍の腫瘍細胞膜と腫瘍毛細血管の両者で発現されるためである（３８）。クローン９６７はヒトＥＧＦＲに対するｓｈＲＮＡを生産する。これらの試験でＰＩＬを処方するために使用したマウスＨＩＲＭＡｂをヒトで使用することはできなかった。しかし、ＨＩＲＭＡｂの遺伝子組換え形態は作製されており、ヒトでの使用に現在利用可能である（（３７）及び米国特許出願第１０／３０７，２７６号）。
【００５８】
以上、本発明の代表的態様を記載したが、当業者に自明の通り、上記開示は例証に過ぎず、本発明の範囲内で他の種々の改変、応用及び変形が可能である。従って、本発明は上記好適態様及び実施例に制限されず、特許請求の範囲のみに制限される。
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１Ａは本発明の代表的ペグ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）の模式図である。リポソーム表面は表面から突出する鎖として示す２０００ダルトンポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の数千個の結合剤と結合している。ＰＥＧ鎖の約１−２％の先端はマウストランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ）に対する８Ｄ３ラットモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）又はヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するマウス８３−１４モノクローナル抗体（ＭＡｂ２）から構成されるターゲティングリガンドと結合している。ＰＩＬの内側にはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を生じるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡが内包されている。ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子はＵ６プロモーター（ｐｒｏ）により駆動され、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼのＴ５終結配列を３’末端にもつ。（Ｂ）上段はヒトＥＧＦＲのＧｅｎｂａｎｋ登録配列（アクセション番号Ｘ００５８８）に由来するヌクレオチド２５２９−２５５７のヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）配列のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１Ｂの下段にはクローン９６７により生産されるｓｈＲＮＡの配列と二次構造を示す（配列番号２）。アンチセンス鎖は８ヌクレオチドループの５’側であり、センス鎖はループの３’側である。センス鎖はステムループ構造のハイブリダイゼーションＴｍを低下させるために４Ｇ／Ｕミスマッチを含み、アンチセンス鎖の配列はターゲットｍＲＮＡ配列に１００％相補的である。図１Ｃは［３Ｈ］−チミジンの存在下でヒトＵ８７神経膠腫細胞を４８時間インキュベートした後にクローン９６７又は８８２プラスミドＤＮＡを内包したＨＩＲＭＡｂ標的ＰＩＬの存在下で細胞を５日間インキュベートした試験結果を示す。プラスミドＤＮＡ１．４、１４、１４０、又は１４００ｎｇ／皿の用量を各実験で使用した。データは平均±ＳＥである（ｎ＝３皿）。
【図２】ｓｃｉｄマウスの尾状核−被殻にＵ８７細胞５００，０００個を移植後５日目に本発明によるヒトＥＧＦＲに対する静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療を開始した生存試験の結果を示す。１２日、１９日及び２６日（矢印）に週１回静脈内遺伝子治療を繰返した。対照群は同一日に食塩水を投与した。２つの処理群の各々でマウス１１匹とした。マウスの５０％が死亡した時間（ＥＤ５０）は食塩水群とＲＮＡｉ群で夫々１７日と３２日である。本発明のショートヘアピンアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡｉ遺伝子治療では生存時間が８８％増加し、ｐ＜０．００５レベルで有意であった（フィッシャーの正確確率検定）。
【図３】マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（パネルＡ−Ｅ）又はラットＩｇＧ（パネルＦ）でマウス脳剖検切片を染色した免疫細胞化学試験の結果を示す。切片に対比染色はしなかった。パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、及びＦの倍率は同一であり、パネルＡの倍率線は１３５μｍである。パネルＣの倍率線は３４μｍである。パネルＡ−Ｃは食塩水を投与したマウスの脳から採取した切片であり、パネルＤ−Ｆはクローン９６７遺伝子治療で治療したマウスから採取した切片である。パネルＡ−Ｃは食塩水を投与したマウスにおける腫瘍血管構造の密度を示す。パネルＢはパネルの下部の正常脳とパネルの上部の腫瘍を含む切片を示し、腫瘍は正常脳からの血管により血管新生している。パネルＤはパネルの左側に腫瘍を示し、パネルの右側に正常脳を示し、この切片はＲＮＡｉ遺伝子治療で治療したマウスから採取し、ＲＮＡｉを投与した動物における血管密度の低下を示す。パネルＥに示すように正常脳の血管密度はＲＮＡｉを投与した動物で変化しない。
【図４】本発明のＲＮＡｉ遺伝子治療によるｉｎ ｖｉｖｏ ＥＧＦＲダウンレギュレーションの結果を示す。ＲＮＡｉ治療したマウス（Ａ−Ｃ）又は食塩水を投与したマウス（Ｄ−Ｆ）からの脳腫瘍について頭蓋内神経膠腫切片の共焦点顕微鏡写真を示す。ＨＩＲに対するマウス８３−１４ ＭＡｂ（緑）とマウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ ＭＡｂ（赤）で切片を二重標識した。ＲＮＡｉ治療したマウス（Ａ−Ｃ）では食塩水を投与したマウス（Ｄ−Ｆ）に比較して腫瘍細胞における免疫反応性ＥＧＦＲが減少している。食塩水を投与した動物は移植後１４−１５日で死亡した（Ｄ、Ｅ、及びＦ）が、ＲＮＡｉ治療した動物は夫々静脈内ＲＮＡｉ遺伝子治療の最終投与後５、７、及び８日である移植後３１日（Ａ）、３３日（Ｂ）、及び３４日（Ｃ）に死亡した（図２）。
【図５】クローン９５２又はクローン９６２に暴露せずにクローン９６７又はクローン８８２に暴露したヒトＵ８７細胞における免疫反応性ＥＧＦＲの選択的ノックダウンをウェスタンブロットにより測定した結果を示す。細胞培養におけるこれらのウェスタンブロット試験は図４に示すｉｎ ｖｉｖｏ脳腫瘍結果の共焦点顕微鏡写真を裏付けるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器であって、
外部表面と内部コンパートメントをもつリポソームと；
ショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内に配置された遺伝子と；
前記受容体にターゲティングすることが可能な複数の受容体ターゲティング剤と；
その少なくとも１個を介して各ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している複数の結合剤を含む前記受容体特異的ナノ容器。
【請求項２】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体、ＥＧＦＲの突然変異体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はその受容体、ＶＥＧＦＲ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ｒａｓ、ｒａｆ、又はＣｄＫを含む改変蛋白質キナーゼをコードするｍＲＮＡから構成される群から選択されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項３】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含み、前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡがヌクレオチド番号１〜５５３２のヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項４】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヌクレオチド番号２３００〜３８００に位置する前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項５】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜３０００に位置する請求項４に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項６】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜２６００に位置する請求項５に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項７】
前記リポソームの外部表面が２００ナノメートル未満の直径をもつ球形を規定する請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項８】
５〜５００個の受容体−ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項９】
前記結合剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン及び有機ポリマーから構成される群から選択される請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１０】
前記結合剤の分子量が１０００〜５０，０００ダルトンである請求項９に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１１】
１００〜１０，０００個の結合剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１２】
前記ターゲティング剤が充実性腫瘍に位置する受容体にターゲティングすることができる請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１３】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、脾臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、眼腫瘍、胃腸腫瘍、骨腫瘍、血液腫瘍、内分泌腫瘍、皮膚腫瘍、又はリンパ節腫瘍から構成される群から選択される請求項１２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１４】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である請求項１３に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１５】
前記ターゲティング剤がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子受容体、レプチン受容体、低密度リポ蛋白質受容体、線維芽細胞増殖因子受容体から選択される受容体にターゲティングすることができる請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１６】
請求項１に記載の受容体特異的ナノ容器と前記受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する組成物。
【請求項１７】
前記ショートヘアピンＲＮＡをコードする前記遺伝子を送達する前記細胞が動物の体内に位置する請求項１６に記載の受容体特異的ナノ容器を含む組成物。
【請求項１８】
ａ）外部表面と内部コンパートメントをもつリポソームと；
ショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内に配置された遺伝子と；
前記受容体にターゲティングすることが可能な複数の受容体ターゲティング剤と；
その少なくとも１個を介して各ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している複数の結合剤を含む受容体特異的ナノ容器と；
ｂ）前記受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤー
を含む有効量の製剤を動物に投与する段階を含む、受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するための方法。
【請求項１９】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体、ＥＧＦＲの突然変異体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はその受容体、ＶＥＧＦＲ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ｒａｓ、ｒａｆ、又はＣｄＫを含む改変蛋白質キナーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２０】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含み、前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡがヌクレオチド番号１〜５５３２のヌクレオチド配列を含む請求項１９に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２１】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヌクレオチド番号２３００〜３８００に位置する前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２２】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜３０００に位置する請求項２１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２３】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜２６００に位置する請求項２２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２４】
前記リポソームの外部表面が２００ナノメートル未満の直径をもつ球形を規定する請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２５】
５〜５００個の受容体−ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２６】
前記結合剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン及び有機ポリマーから構成される群から選択される請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２７】
前記結合剤の分子量が１０００〜５０，０００ダルトンである請求項２６に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２８】
１００〜１０，０００個の結合剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２９】
前記ターゲティング剤が充実性腫瘍に位置する受容体にターゲティングすることができる請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３０】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、脾臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、眼腫瘍、胃腸腫瘍、骨腫瘍、血液腫瘍、内分泌腫瘍、皮膚腫瘍、又はリンパ節腫瘍から構成される群から選択される請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３１】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３２】
前記ターゲティング剤がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子受容体、レプチン受容体、低密度リポ蛋白質受容体、線維芽細胞増殖因子受容体から選択される受容体にターゲティングすることができる請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項１】
受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器であって、
外部表面と内部コンパートメントをもつリポソームと；
ショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内に配置された遺伝子と；
前記受容体にターゲティングすることが可能な複数の受容体ターゲティング剤と；
その少なくとも１個を介して各ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している複数の結合剤を含む前記受容体特異的ナノ容器。
【請求項２】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体、ＥＧＦＲの突然変異体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はその受容体、ＶＥＧＦＲ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ｒａｓ、ｒａｆ、又はＣｄＫを含む改変蛋白質キナーゼをコードするｍＲＮＡから構成される群から選択されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項３】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含み、前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡがヌクレオチド番号１〜５５３２のヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項４】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヌクレオチド番号２３００〜３８００に位置する前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項５】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜３０００に位置する請求項４に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項６】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜２６００に位置する請求項５に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項７】
前記リポソームの外部表面が２００ナノメートル未満の直径をもつ球形を規定する請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項８】
５〜５００個の受容体−ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項９】
前記結合剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン及び有機ポリマーから構成される群から選択される請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１０】
前記結合剤の分子量が１０００〜５０，０００ダルトンである請求項９に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１１】
１００〜１０，０００個の結合剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１２】
前記ターゲティング剤が充実性腫瘍に位置する受容体にターゲティングすることができる請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１３】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、脾臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、眼腫瘍、胃腸腫瘍、骨腫瘍、血液腫瘍、内分泌腫瘍、皮膚腫瘍、又はリンパ節腫瘍から構成される群から選択される請求項１２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１４】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である請求項１３に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１５】
前記ターゲティング剤がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子受容体、レプチン受容体、低密度リポ蛋白質受容体、線維芽細胞増殖因子受容体から選択される受容体にターゲティングすることができる請求項１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための受容体特異的ナノ容器。
【請求項１６】
請求項１に記載の受容体特異的ナノ容器と前記受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する組成物。
【請求項１７】
前記ショートヘアピンＲＮＡをコードする前記遺伝子を送達する前記細胞が動物の体内に位置する請求項１６に記載の受容体特異的ナノ容器を含む組成物。
【請求項１８】
ａ）外部表面と内部コンパートメントをもつリポソームと；
ショートヘアピンＲＮＡをコードするために十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内に配置された遺伝子と；
前記受容体にターゲティングすることが可能な複数の受容体ターゲティング剤と；
その少なくとも１個を介して各ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している複数の結合剤を含む受容体特異的ナノ容器と；
ｂ）前記受容体特異的ナノ容器の医薬的に許容可能なキャリヤー
を含む有効量の製剤を動物に投与する段階を含む、受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡを送達するための方法。
【請求項１９】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体、ＥＧＦＲの突然変異体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はその受容体、ＶＥＧＦＲ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ｒａｓ、ｒａｆ、又はＣｄＫを含む改変蛋白質キナーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２０】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの一部に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含み、前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡがヌクレオチド番号１〜５５３２のヌクレオチド配列を含む請求項１９に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２１】
前記ショートヘアピンＲＮＡがヌクレオチド番号２３００〜３８００に位置する前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの部分に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２２】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜３０００に位置する請求項２１に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２３】
前記ヒト上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの前記部分がヌクレオチド番号２５００〜２６００に位置する請求項２２に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２４】
前記リポソームの外部表面が２００ナノメートル未満の直径をもつ球形を規定する請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２５】
５〜５００個の受容体−ターゲティング剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２６】
前記結合剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン及び有機ポリマーから構成される群から選択される請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２７】
前記結合剤の分子量が１０００〜５０，０００ダルトンである請求項２６に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２８】
１００〜１０，０００個の結合剤が前記リポソームの外部表面に結合している請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項２９】
前記ターゲティング剤が充実性腫瘍に位置する受容体にターゲティングすることができる請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３０】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、脾臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、眼腫瘍、胃腸腫瘍、骨腫瘍、血液腫瘍、内分泌腫瘍、皮膚腫瘍、又はリンパ節腫瘍から構成される群から選択される請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３１】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【請求項３２】
前記ターゲティング剤がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子受容体、レプチン受容体、低密度リポ蛋白質受容体、線維芽細胞増殖因子受容体から選択される受容体にターゲティングすることができる請求項１８に記載の受容体をもつ細胞にショートヘアピンＲＮＡをコードする遺伝子を送達するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２８８９９（Ｐ２００７−５２８８９９Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０２９２８（Ｐ２００７−５０２９２８）
【出願日】平成１７年３月８日（２００５．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７５７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９１４８
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月８日（２００５．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７５７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９１４８
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
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