含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物及びその製造方法
植物中のプロアントシアニジン類を生体の腸管を通じた吸収が容易な程度に低分子量化した含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法を提供し、得られた含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする活性酸素種の生成等が原因となる各種生活習慣病、脳疾病の治療・予防、老化の予防に有用な健康食品組成物及び医薬品組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は含硫プロアントシアニジンオリゴマー及びその組成物、それらの製造方法及び用途に関する。さらに詳しく言えば、植物中のプロアントシアニジン類を生体の腸管を通じた吸収が容易な程度に低分子量化する含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法、その方法で得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする、活性酸素種の生成等が原因となる各種生活習慣病、脳疾病の治療・予防に有用な健康食品組成物及び医薬品組成物を提供するものである。
【背景技術】
食生活の変化による脂肪摂取の過多や、環境の変化、オゾン層破壊等による紫外線への暴露量の増加、環境汚染物質の増加等により、高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病、癌等のいわゆる生活習慣病が増加し、さらにアレルギー、痴呆症などの脳疾患の患者も増加しつつある。今後、高齢化社会の進展と共に痴呆、アルツハイマー症候群等の患者の増加も危惧されるが、これらの要因に生体内で生成する活性酸素種の関与が指摘されている（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０（２００２），２４９７−２５０９）。しかし活性酸素種の完全な生成抑制ないし制御技術は開発されていないため、現状では生活習慣病や脳疾患等に有効・確実な予防・治療技術は十分に確立されていない。
植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフェノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフェノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療・予防剤として期待できるものである。
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフェノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウイルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。
ポリフェノールの中でもプロアントシアニジン類は幅広い植物に含まれるポリフェノールである。プロアントシアニジン類が、前述のような多彩な生理活性を示すには、プロアントシアニジン化合物が腸管を通じて生体内に吸収される必要がある。しかしプロアントシアニジン類の分子量は一般に数千乃至数万のオーダーと言われている。このような分子の大きな物質は腸管を通じての吸収は困難で、摂取しても生体に吸収されずに利用されない事が多い。
本発明者らも、ソバ種子から抽出したポリフェノールが脂質代謝改善、脳機能改善等の作用を有することを見出して特許出願しているが（特開平１０−２１８７８６号公報）、その有効成分はプロアントシアニジンのポリマーであり、生体への吸収の面では必ずしも十分とは言えなかった。
【発明の開示】
本発明は、腸管を通じて生体に吸収され難いプロアントシアニジン化合物を吸収され易い形に変え、プロアントシアニジン化合物の示す多彩な生理活性効果を十分に発揮させることで生体の抗酸化活性を向上させ、活性酸素種が原因とされる生活習慣病や脳疾病の治療・予防に有用な医薬品、健康食品等を提供することにある。
本発明者らは、プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物の反応で得られる低分子の含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、容易に腸管を通じて生体に吸収され、経口摂取により各種の生理活性を示すことを知見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は医薬品や健康食品組成物として有用な以下の含硫プロアントシアニジンオリゴマーとその組成物、それらの製造方法に関する。
１．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。
２．オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である前記１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
３．プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる前記１に記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
４．ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される前記１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
５．生活習慣病の治療及び／または予防用の医薬組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
６．老化の予防用の医薬組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
７．生活習慣病の改善及び／または予防用の健康食品組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
８．老化の予防用の健康食品組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
９．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させて得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
１０．オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である前記９記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
１１．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の製造方法。
１２．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法。
１３．プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる前記１１または１２記載の製造方法。
１４．ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される前記１１または１２記載の製造方法。
１５．無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする前記１１または１２記載の製造方法。
１６．塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する前記１５記載の製造方法。
１７．式（４）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
１８．式（５）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
１９．式（６）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
２０．式（７）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
２１．式（８）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の実施例１による含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物（分画前の粉末；物質１）及びその原料（ブドウ種子ポリフェノール抽出物：比較物質１）を投与したマウスの血清中ＬＰＯ濃度を示すグラフであり、（Ａ）は低用量投与群、（Ｂ）は高用量投与群についての結果を示す。
図２は本発明の実施例１による含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物（物質１）及びその原料（比較物質１）を投与したマウスの肝臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）及び脳（Ｃ）中のＬＰＯ濃度を示すグラフである。
図３（Ａ）はＬＰＯ濃度初期値正常者、（Ｂ）はＬＰＯ濃度初期値異常者について、各々実施例１の本発明組成物（物質１）及び実施例１の原料（比較物質１）を投与したヒトの血清中のＬＰＯ濃度を示す。
図４（Ａ）はＳＯＤ濃度初期値正常者、（Ｂ）はＳＯＤ濃度初期値異常者について、各々実施例１の本発明組成物（物質１）及び実施例１の原料（比較物質１）を投与したヒトの血清中のＳＯＤ活性濃度を示す。
図５は実施例１における本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞死に対する抑制効果を示すグラフである。
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１における本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるミトコンドリア膜電位の低下に対する抑制効果を示す写真及びグラフである。
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞内への活性酸素種蓄積に対する減少効果を示す写真及びグラフである。
図８は本発明物質１及び比較物質１の細胞内抗酸化活性効果を示すグラフである。
図９は本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによる細胞膜過酸化抑制効果を示すグラフである。
図１０は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する空腹時血糖値の低減効果を示すグラフである。
図１１は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する尿糖値の低減効果を示すグラフである。
図１２は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する尿タンパク値の低減効果を示すグラフである。
図１３は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する血中ＰＬＯ値の低減効果を示すグラフである。
図１４は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する血中ＴＥＡＣ値（抗酸化能）の上昇効果を示すグラフである。
図１５は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中ポリフェノール濃度の上昇効果を示すグラフである。
図１６は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）の上昇効果を示すグラフである。
図１７は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中過酸化脂質濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
図１８は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中尿素窒素濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
図１９は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中クレアチニン濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明の含硫オリゴマーは通常、プロアントシアニジンの２量体から５量体程度であり、分子量は通常１５００以下である。
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物との反応は酸性条件下で行うのが好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類、あるいは酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸等の有機酸類から選ばれる適宜の酸が０．１Ｎ〜１．０Ｎ程度、好ましくは０．５Ｎの濃度で用いられる。
なお、本明細書において、プロアントシアニジンとはカテキン重合体を指し、具体的には、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートまたはこれらを構成単位とするものが含まれる。
プロアントシアニジン類を含む植物には、カキ、ナシ、ブドウ、イチゴ、バナナ、アボカド、コケモモ、レンコン、ソバ等の果菜類、緑茶、紅茶、ウーロン茶等の茶類一般、ハーブ・スパイス類、木材・マツ樹皮等広範・多種に亘る植物が含まれる。これらのプロアントシアニジン類を含む植物やその抽出物（搾汁、果汁、野菜汁を含む）が好適に用いられる。
本発明で用いられるＳＨ基含有化合物としては、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ含有ペプチドまたはこれらの塩類等が挙げられるが、その他にイオウを含むネギ、ニンニク等の天然物も挙げられる。メルカプタン類も使用可能ではあるが、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーが食品、医薬品組成物に利用される点を考慮すると、ＳＨ基含有化合物としては食品、医薬品に使用が許されている物質が好ましい。
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物との反応は、室温〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃で数時間乃至１週間、好ましくは２４〜４８時間行われる。
反応溶媒には、水、メタノール、エタノール等の１種類または２種以上の混合物が用いられるが、食品、医薬品等の用途を考慮すれば、水、エタノールが好ましい。
反応後は残渣をろ別して、ろ液を濃縮した後、常法により精製する。
すなわち、濃縮液の精製は抽出エキスを膜処理（限外ろ過、逆浸透等）、吸着剤で処理することにより行なうことができる。吸着剤としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤、メタクリル酸系吸着剤、親水性ビニルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリカゲル、イオン交換樹脂等が用いられる。これらの吸着剤を用いる場合には、これに吸着する画分（以下、吸着画分という。）にＳＨ基含有化合物と反応し低分子量化したポリフェノール化合物（含硫プロアントシアニジンオリゴマー）が含まれている。この吸着画分を含水アルコール、アルコール、アセトン等で溶出させることにより種々の分子量の成分を得ることができる。
このようにして得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、順相ＨＰＬＣ及びＮＭＲ測定値から、下記一般式（９）に示されるプロアントシアニジンの２量体から５量体であることが確認されている。
式中、ｎは０または１〜３の整数であり、Ｒ１は水素原子または下記式
で示されるガロイル基を表し、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表し、Ｒ４はシステイン、シスチン、グルタチオンまたはＳＨ基含有ペプチド残基を表す。
含硫プロアントシアニジンオリゴマーは分子量１５００以下の低分子のため腸管を通じて生体に容易に吸収され、後述の試験例で示されるように、強いＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様活性増加作用、Ｐ４５０系脂質過酸化抑制作用、ＦＮＴ酸化ストレスに対する保護作用、ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護作用、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）誘発糖尿病に対する予防作用等を示し、他のポリフェノール素材と比較して高い抗酸化能を有する。またヒトに対する抗酸化指標のモニター試験で、抗酸化効果に基くと判断されるデータも得られている。
従って、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、生体の過酸化脂質生成抑制作用を有するだけでなく、活性酸素により起こる酸化障害に起因する疾病に効果を有するので、過酸化脂質あるいは活性酸素生成に起因する各種臓器の障害、老化の防止効果を有し、それにより生ずる各種疾病の治療及び防止に有効である。また脳の老化が原因と考えられる痴呆等の脳機能障害の抑制・防止・治療にも有効と考えられる。同時に脳機能の改善により、学習機能の向上、イライラ感の減少、不眠症解消、落着き回復等の効果も期待出来る。このため、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、医薬組成物ならびに健康食品組成物として利用することが出来る。
本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物には毒性は全く認められず、十分安全に使用できる。これら組成物は経口または非経口で用いられるが、経口的に使用される場合の投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、１００から２０００ｍｇの範囲である。本発明組成物を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の補助資材（澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の実施例、試験例を挙げて、発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの範囲内に限定されるものではない。
実施例１：ブドウ種子由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）ブドウ種子ポリフェノールの抽出
乾燥ブドウ種子８ｋｇを８０％メタノール（３０Ｌ）で３日間室温で抽出し、残渣をろ過してろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学）２００ｍｍφ×３０ｃｍ（約２５Ｌ）にチャージし、水１００Ｌで洗浄した。メタノール５０Ｌで溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して４５６ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たブドウ種子ポリフェノール４００ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬工業（株）製）４００ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）４ｇ、クエン酸（和光純薬工業（株）製）０．８ｋｇ、水４Ｌを混合し、４０℃で４８時間反応させた。反応液を直径２００ｍｍ、高さ８００ｍｍのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容量約２５Ｌ）にチャージし、非吸着画分を水１００Ｌで洗浄した後、４０％エタノール５０Ｌで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、水、メタノール、エタノールに易溶の赤褐色粉末（収量４０８ｇ）を得た。この粉末をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）を担体として充填したカラム（直径５０ｍｍ、高さ５００ｍｍ、容積約１Ｌ）により、エタノール−水混合液で分画し、分画物のオリゴマー組成を野中らの方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３４（２），６３３−６４２（１９８６））により分析した結果、組成は次のとおりであった。
システイン結合エピカテキン単量体画分 １９％
システイン結合エピカテキン２量体画分 ２１％
システイン結合エピカテキン３量体画分 １１％
システイン結合エピカテキン４〜６量体画分 １６％
（３）システイン結合エピカテキン単量体
得られたシステイン結合エピカテキン単量体画分をニンヒドリン−酢酸試液の噴霧加熱によって桃褐色に呈色するスポットを対象としてＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（水−メタノール−アセトン）によって精製して、下記（１）〜（３）式で示される化合物（以下化合物１〜３と略記することがある）を単離した。
式（１）の化合物（化合物１）はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：高分解能高速原子衝撃法質量スペクトル）の測定で分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）４１０．０９２５を示し、分子式Ｃ１８Ｈ２０Ｏ８ＮＳに相当する計算値４１０．０９１０と３．６ｐｐｍ（１０ｐｐｍ以内）の誤差で一致した。したがって、化合物１は分子式Ｃ１８Ｈ１９Ｏ８ＮＳを有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにＬ−システインのイオウ原子が結合した化学構造が考えられる。また、化合物１の１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル、表１参照）測定において、カテキンまたはエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナルの他に、酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ５．０９（ｂｒ．ｓ）、δ４．０７（ｍ）およびδ３．８６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）に各々プロトン１個分として認められた。前者はエピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ３．８６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）のプロトンシグナルは４α配置に帰属され、イオウ原子が４βに配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。その他、δ４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，４Ｈｚ）ならびにδ２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５，９Ｈｚ）およびδ３．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５，４Ｈｚ）にＡＢＸ型のシグナル群が認められ、システインのメチン基にメチレン基が隣接する部分構造を示唆している。これらの情報に基づき、化合物１の化学構造を式（１）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。化合物１の１３Ｃ−ＮＭＲ（炭素−１３核磁気共鳴スペクトル、表２参照）（ＤＥＰＴ法）において認められた各炭素級数を含めて１８個の炭素シグナルもこの構造を支持した。
式（２）の化合物（化合物２）の１Ｈ−ＮＭＲ（表１参照）において酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ４．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，６Ｈｚ）、δ４．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，４．３Ｈｚ）およびδ４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）に各々プロトン１個分として認められた。前２者は各々カテキンの２β、３β配置、δ４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）は４α配置に帰属され、イオウ原子が４βに配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。したがって、化合物１と化合物２は３位の立体配置のみが異なると考えられ、化合物２の化学構造を式（２）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
式（３）の化合物（化合物３）はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳの測定で分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）４２６．０８４４を示し、化合物１よりも酸素原子が１個多い分子式Ｃ１８Ｈ２０Ｏ９ＮＳに相当する計算値４２６．０８５９と３．５ｐｐｍの誤差で一致した。また１Ｈ−ＮＭＲ（表１参照）の測定で、芳香環領域のδ６．５７（２Ｈ，ｓ）に２′および６′位の水素が等価シグナルとして認められた他は、化合物１と対応、類似していた。表２に示す１３Ｃ−ＮＭＲのシグナル帰属と考え併せ、化合物３の構造を式（３）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
（４）システイン結合エピカテキン２量体
システイン結合エピカテキン２量体画分粉末を同様に精製して下記式（４）で示される化合物（以下、化合物４と略記することがある。）を単離した。
化合物４はＦＡＢ−ＭＳの測定で、分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）６９８を示し、化合物１よりもカテキンユニットが１個多い構造が考えられた。ＴＬＣおよびＨＰＬＣにおいて各々単一挙動を示したにも拘わらず、化合物４の１Ｈ−ＮＭＲはブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスペクトルを示した。この特徴的な１Ｈ−ＮＭＲシグナル分布から、縮合の結合位置は、４→６または４→８のうち、強く回転障害を生じる後者が考えられた。４→８結合に直結する各ベンゾピラン由来シグナル群はブロードに変形して認められた。すなわち、δ４．２２、δ４．５４、δ４．９６（ｅａｃｈ １Ｈ，ｂｒ．ｍ，Ｃ−３，−４，−２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）は上端ユニットに、よりシャープなδ３．８３、δ３．９０（ｅａｃｈ １Ｈ，ｓ，Ｃ−４′，−３′，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）、５．２０（１Ｈ，ｂｒ．ｍ，Ｃ−２′）はイオウ原子と結合しているユニット（下端）に各々帰属された。分子模型による考察からも、下端ユニットは上端に比較して回転障害を免れていることが伺えた。δ５．９２の芳香環領域にはＣ−６、−８、−６′に帰属されるプロトン３個分のシグナルがｅｎｖｅｌｏｐｅとして認められた。δ６．６０からδ７．０９にかけて両ユニットＢ環上のプロトン群が認められ、その中の結合定数８．３Ｈｚのシャープなｄｏｕｂｌｅｔシグナルは回転障害を免れている下端ユニットの５位に帰属されると考えられた。残されたシグナルδ２．９５、δ３．４４（ｅａｃｈ １Ｈ，ｂｒ．ｍ，ｃｙｓ−Ｃ−３）、δ４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，４Ｈｚ，ｃｙｓ−Ｃ−２）は各々システイン残基由来と推定された。化合物４の１３Ｃ−ＮＭＲ（表３参照）は化合物１に相当するシグナル群が認められ、式（４）に示される化合物４の構造を支持している。したがって、化合物４の構造を４β（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−（４β→８）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
（５）システイン結合エピカテキン３量体
システイン結合エピカテキン単量体画分粉末を同様に精製して下記式（５）で示される化合物（以下、化合物５と略記することがある。）を単離した。
化合物５はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳの測定で、分子イオンピークを［Ｍ−Ｈ］＋（ｍ／ｚ）９８４．１９５６に示し、分子式Ｃ４８Ｈ４２Ｏ２０ＮＳに相当する計算値９８４．２０１１と５．５ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物５は分子式Ｃ４８Ｈ４３Ｏ２０ＮＳを有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンから構成される３分子縮合体にＬ−システインが結合した化学構造が考えられた。また、化合物５の１Ｈ−ＮＭＲシグナルは全体としてブロードであり、３ユニットはいずれも４→８結合に直鎖状に縮合、Ｌ−システインが下端ユニットに結合していることが示唆された。芳香環上のシグナルとしてδ５．９８に認められたシングレットからＡ環−６−Ｈ、−８−Ｈ、Ａ′環６−Ｈ、Ａ″環−６−Ｈと帰属される。より低磁場に認められるシグナル群（δ６．０４，ｓ；δ６．９１，７．０１，ｓ；δ７．１１，ｓ）は、高さ比が約３：２：１：３であり、Ｂ環−、Ｂ′環−、Ｂ″環上の２−Ｈ由来シグナルに帰属され、δ６．９１およびδ７．０１（２：１）のシグナルは中間に位置するＢ′−２−Ｈが最も回転障害を受けているために分裂して現れたと考えられた。これらの情報に基づいて、化合物５の平面構造を暫定的に式（５）と推定した。
実施例２：ブドウ種子由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
実施例１と同じ原料、条件でブドウ種子ポリフェノールを抽出し、実施例１と同じ条件で精製した。この精製物を以下の条件でグルタチオンと反応させ、低分子化した。
すなわち、得たブドウ種子ポリフェノール１．０ｇ、グルタチオン（和光純薬工業（株）製）３．０ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．５ｇ、１Ｎ塩酸５０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させた。この反応液をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、ＭＣＩｇｅｌ ＣＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）等により精製し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末を得た（収量１２０ｍｇ）。
１）グルタチオン結合モノマー
得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲル、およびＯＤＳ系シリカゲルを担体に、水とメタノールの混合液を移動相としたカラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し式（６）で示される化合物（化合物６）を得た。
化合物６はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：高分解能エレクトロスプレー・イオン化質量スペクトル）の測定で、分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）５９６．１５５０を示し、分子式Ｃ２５Ｈ３０Ｏ１２Ｎ３Ｓに相当する計算値５９６．１５５１と０．１７ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物６はカテキンまたはエピカテキンにグルタチオンのＬ−システイン由来イオウ原子が結合した化学構造が考えられた。化合物６の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、カテキンまたはエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナル群（δ５．８４，５．９６，６．９１（ｅａｃｈ １Ｈ，８−，６−，２′−Ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｒｙ）；δ６．７３−６．７８（２Ｈ，ｍ，５′−，６′−Ｈ））の他に、酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ３．９０，３．９１，５．１５（ｅａｃｈ １Ｈ，３−，４−，５−Ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に認められ、化合物１と同様にエピカテキンの４位にイオウ原子が４βに配置する構造が類推された。その他、システイン部分（δ３．６３（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９，４Ｈｚ，ｃｙｓ−２−Ｈ），３．７２，３．８０（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，ｃｙｓ−３−Ｈ２））、グルタミン酸部分（δ１．７２（２Ｈ，ｍ，ｇｌｕ−４−Ｈ２），１．７８（２Ｈ，ｍ，ｇｌｕ−３−Ｈ２），３．０５（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，ｇｌｕ−２−Ｈ））およびグリシン部分（δ３．２０（２Ｈ，ｓ，ｇｌｙ−２−Ｈ２））に相当するシグナル群が認められた。この構造は化合物６の１３Ｃ−ＮＭＲ（表４参照）の測定における２５個の炭素シグナルが観測からも支持された。
したがって、化合物６の構造を、グルタチオン分子のシステイン部分に由来するイオウ原子がエピカテキンの４βに結合した式（６）で示される４β−（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
実施例３：松樹由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）パインバークポリフェノールの抽出
トドマツ樹皮４００ｇを８０％メタノール１．５Ｌにより室温で３日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
濃縮液の全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）５０ｍｍφ×３０ｃｍ（約６００ｍＬ）にチャージし、２５００ｍＬの水で洗浄した。メタノール１２００ｍＬ溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して１８．４ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たパインバーグポリフェノール１．０ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬（株）製）１．７ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．２５ｇ、１Ｎ塩酸２０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させ、反応液を直径２５ｍｍ、高さ１５０ｍｍのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容積約１００ｍＬ）にチャージし、非吸着画分を水４００ｍＬで洗浄した後、メタノール４００ｍＬで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、赤褐色粉末（収量０．９５ｇ）を得た。
プロアントシアニジンは試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では強い抗酸化活性を示すが、経口的摂取では必ずしも生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で十分な効果を発揮しない。その理由は、高分子のプロアントシアニジンは腸管で吸収され難いためと考えられる。これに対し、本発明のＳＨ基含有物質により低分子化した含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では高分子のプロアントシアニジンと同等の抗酸化活性を示し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも高分子のプロアントシアニジンより優れた抗酸化活性を示す。
実施例４：ヤマモモ由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）ヤマモモポリフェノールの抽出
ヤマモモ樹皮（揚梅皮）４００ｇを８０％メタノールの１．５Ｌにより室温で３日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
濃縮液の全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）５０ｍｍφ×３０ｃｍ（約６００ｍＬ）にチャージし、２５００ｍＬの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール１２００ｍＬで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して３８．０ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たヤマモモポリフェノール１．０ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬（株）製）１．７ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．２５ｇ、１Ｎ塩酸２０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させ、反応液をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）２５ｍｍφ×１５０ｍｍ（約１００ｍＬ）にチャージし、４００ｍＬの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール４００ｍＬで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末０．９５ｇを得た。
（３）楊梅皮ポリフェノールとＬ−システインの結合体について
１）Ｌ−システイン結合エピガロカテキンガレート・モノマー
前記（２）で得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲル、およびＯＤＳ系シリカゲルを担体に、水、メタノール、アセトンの任意の混合液を移動相としたカラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し、エピカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）（４β→８）エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）および前記化合物３の他、以下の式（７）および（８）に示す化合物（化合物７および化合物８）を単離した。
化合物７は、ＥＳＩ−ＭＳの測定で、分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］＋（ｍ／ｚ）５７５を示した。また、１Ｈ−ＮＭＲ（表５参照）の測定結果は化合物１および化合物３と類似していたが、約１．３ｐｐｍ低磁場シフトした３−βＨ（１Ｈ，５．２９，ｓ）、ならびに芳香環領域のＡ環上６、８位の他、６．６８と６．９６に各プロトン２個分の鋭い２組の鋭い等価なシングレット・シグナル（１，３，４，５置換ベンゼン上の２と６位水素由来）が認められた。これらのシグナルはエピガロカテキンのガレートであることを示唆している。
これらの情報と表６に示す１３Ｃ−ＮＭＲシグナル群の帰属とを併せて、化合物７の構造を式（７）で示される４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅと推定した。
２）Ｌ−システイン結合エピガロカテキンガレート・ダイマー
化合物８はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳの測定で分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］＋（Ｍ／Ｚ）１０３２．１５１７を示し、分子式Ｃ２５Ｈ３０Ｏ１２Ｎ３Ｓに相当する計算値１０３２．１５０３と１．４ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物７よりもエピカテキンガレート・ユニットが１個多い構造が考えられた。化合物８の１Ｈ−ＮＭＲは化合物４と同様ブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスペクトルを示し、４→８縮合型であると考えられた。１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲのシグナル群は化合物４と同様に帰属され（各々表５および６）、化合物８の構造を式（８）に示される４β（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ−（４β→８）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅと推定した。
試験例１：ＤＰＰＨラジカル消去作用
実施例１の分画前の粉末（物質１）、物質１を分画して得た単量体画分（物質２）、物質１を分画して得た２量体及び３量体画分（物質３）、物質１を分画して得た４〜６量体画分（物質４）、実施例１の原料（ブドウ種子ポリフェノール抽出物）（比較物質１）及び市販カテキン（和光純薬（株）製）（比較物質２）について、１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ラジカルの消去作用を次の方法で測定した。
９６穴のマイクロプレートに１００μＬのＤＰＰＨ溶液（６０μＭエタノール溶液）を入れ、試験試料のエタノール溶液１００μＬ、またはコントロールとしてのエタノール１００μＬをそれぞれ加え、静かに混合して室温で３０分間放置した後、５２０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカル消去能を下記の式で算出した。段階的に希釈した試験試料のＤＰＰＨラジカル消去能と濃度から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去能（％）＝［（１−試験試料の吸光度）／コントロールの吸光度］
×１００
各試料の段階的な濃度のＤＰＰＨラジカル消去能から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。結果を表７に示す。
ＤＰＰＨラジカル消去能は、低濃度では物質４が比較的高かった。それ以外の試料は同様な活性を示し、高濃度では各試料とも高い活性を示した。
試験例２：活性酸素除去酵素（ＳＯＤ）様活性
試験例１と同じ物質１〜４、比較物質１〜２について、血中ＳＯＤ活性測定キット（ＳＯＤテストワコー：和光純薬（株）製）を用いてＳＯＤ様活性を測定した。下式でＳＯＤ様活性を算出し、試験試料の濃度との関係から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。
ＳＯＤ様活性（％）
＝［（１−試験試料の吸光度）／コントロールの吸光度］×１００
各試料の段階的な濃度におけるＳＯＤ様活性からＥＣ５０を算出して、結果を表８に示した。物質２〜４の各分画物は、比較物質１〜２に比べ高いＳＯＤ様活性を示した。
試験例３：亜急性ＦｅＮＴＡ誘導多臓器障害モデルに対する効果
生体に投与すると大量の活性酸素を発生し、多臓器障害を誘発するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）酸化モデルとして知られるＦｅＮＴＡ（硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３）とニトリロ三酢酸ナトリウム（ＮＴＡ３Ｎａ）の混合物）を用いて試験した。
すなわち、硝酸鉄九水和物（関東化学（株）製）２４０ｍｇを４０ｍＬの冷水に溶解したものと、ニトリロ三酢酸ナトリウム一水和物３９０ｍｇを４０ｍＬの冷水に溶解したものを氷冷下で混合し、１Ｎ塩酸によりｐＨを７．５に調整して１００ｍＬに定溶したものをＦｅＮＴＡ溶液とする。調製後１０分以内にＦｅとして体重ｋｇ当り２２．５ｍｇのＦｅＮＴＡ溶液を、雄性ｄｄＹ系マウス７週齢（平均体重３０ｇ）に１日おきに腹腔内投与した。物質１及び比較物質１をそれぞれ体重Ｋｇ当り２５ｍｇ（低用量投与群）、または５０ｍｇ（高用量投与群）を毎日強制経口投与した。対照群には水道水を摂取させ、ＦｅＮＴＡ投与しない陰性対照群と、ＦｅＮＴＡ投与する陽性対照群を設けた。飲料水、食餌は自由摂取とした。投与開始から７、１４、２１、２８日目に採血し、血清中の過酸化脂質（ＬＰＯ）濃度を測定した。投与開始から２８日目に解剖し、肝臓、腎臓、脳を摘出して各臓器のホモジナイズのＬＰＯ濃度を測定した。
［試験結果］
（１）血清中のＬＰＯ濃度を図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。低用量投与群では物質１は２１日目で血清中ＬＰＯ濃度は、比較物質１及び陽性対照群に対して有意に低下した（図１（Ａ））。高用量投与群でも物質１は、投与開始から２１日目以降に有意に低下した（図１（Ｂ））。比較物質１も２１日目に低値を示したが、本発明の物質の方が高い効果を示した。
（２）各臓器中のＬＰＯ濃度
肝臓、腎臓及び脳中のＬＰＯ濃度を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
肝臓ではＦｅＮＴＡ投与によるＬＰＯ濃度の有意な上昇は認められず、各投与群でも変化は認められなかった。腎臓と脳では、ＦｅＮＴＡ投与によりホモジナイズ中のＬＰＯ濃度は上昇した。物質１及び比較物質１の投与で、ＬＰＯ濃度は低下した。腎臓、脳ともに物質１高用量投与群で、最も低い値を示した。特に脳では、比較物質１投与でも低値を示したが、物質１高用量投与群では他の群に比べ有意に低い値を示した。
［結果のまとめ］
ＦｅＮＴＡの投与は、血清中のＬＰＯ濃度を上昇させた。物質１は比較物質１に比べ、低用量、短期間に効果を発揮した。このことから、低分子化されたことにより、物質１は経口的摂取で腸管から吸収され易く、そのため低用量、短期間で効果を発揮したと考えられる。特に、物質１は腎臓及び脳で強い抗酸化活性を示すことが明らかとなった。
試験例４：ヒトに対するモニター試験
［試験方法］
健康な男女３４名（平均年齢４１．２歳、男性２１名、女性１３名）を表９に示すように２群に分け、物質１及び比較物質１を１日当り５００ｍｇをそれぞれ２８日間投与した。投与開始前、投与２８日後に採血し、血清中のＬＰＯ濃度、ＳＯＤ様活性を測定した。
［結果］
投与前後のＬＰＯ濃度及びＳＯＤ様活性を図３及び図４に示す。図３（Ａ）は初期値が正常者についてＬＰＯ濃度、図３（Ｂ）は初期値異常者についてＬＰＯ濃度を示し、図４（Ａ）は初期値正常者についてＳＯＤ様活性、図４（Ｂ）は初期値異常者についてＳＯＤ様活性についての結果を示す。
比較物質１及び物質１の２８日間の投与でＬＰＯ濃度は低下し、ＳＯＤ様活性は上昇の傾向が認められた。被験者中の初期値異常者でＬＰＯ濃度の初期値が比較的高かった者（ＬＰＯ濃度８．０以上）及びＳＯＤ様活性が比較的低かった者（ＳＯＤ様活性が１２．０以下）について見ると、物質１を投与した群で統計的に有意なＬＰＯ濃度の低下が見られた（図３（Ｂ））。同様に、ＳＯＤ様活性も物質１を投与した群で統計的に有意な上昇が認められた（図４（Ｂ））。このことから、物質１は同量の比較物質１よりも、生体の酸化状態の改善に有効であることが確認された。
試験例５：ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護効果
神経の再生異常による病気であるアルツハイマー病はベータアミロイドを蓄積した老人斑を形成することを特徴とする。ベータアミロイドは活性酸素種を生成し、神経細胞への細胞毒性によりアルツハイマー病の発症と進行において重要な役割を担っている物質である。神経細胞毒性の実験に広く用いられるＰＣ−１２細胞に対するアポトーシス誘導による細胞傷害活性における低分子化ポリフェノール（以下、ＧＳＭと略記することがある。）の神経細胞保護効果を調べた。
［試験方法］
ＰＣ−１２細胞は１０％熱不活化馬血清及び５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で１０％二酸化炭素雰囲気下にて培養した。４×１０４細胞／３００μＬに細胞密度を調整して２４時間予備培養したのち、血清不含のＮ−２培地中にＧＳＭあるいはブドウ種子ポリフェノール（以下、ＧＳＰと略記することがある。）を１、１．５、５、１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、４８穴のプレートに培養した。
（１）細胞生存度試験：
処理後、細胞は終濃度１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液で処理し、深青色のホルマザン産物を緩衝液に溶解して５４０〜５９５ｎｍの吸光度により測定した。結果は無処理の対照細胞の吸光度との比率（％）で示した。
［結果］
ＧＳＭは濃度依存的にベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞死を抑制することが、ＭＴＴ試験により明らかとなった。その効果は特に１及び１．５μｇ／ｍＬの低濃度域においてＧＳＰよりも高かった（図５）。
（２）ミトコンドリア膜電位測定試験：
ミトコンドリア膜電位の測定には脂溶性陽イオン探索子であるＴＭＲＥを使用した。ＧＳＭまたはＧＳＰ存在下あるいは非存在下でＰＣ−１２細胞（１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）を２５μＭのベータアミロイド処理したのち、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し３７℃で３０分間ＴＭＲＥ（１５０ｎＭ）処理した。ミトコンドリアの膜電位に依存してミトコンドリア内に蓄積したＴＭＲＥを、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５９０ｎｍの蛍光で検出した。
［結果］
ミトコンドリアは細胞死の徴候に先んじて膜の完全性に変調を来す。この変化はミトコンドリアの内膜および外膜の両方で起こり、最終的にチトクロームＣのような可溶性膜間タンパクを放出する膜貫通電位の放散と膜透過性の変化を導く。ＰＣ−１２細胞はベータアミロイドに曝露されるとミトコンドリア膜貫通電位を急速に低下させ、それは電位依存型色素であるＴＭＲＥを用いた赤色の蛍光で現わされる（図６（Ａ））。ベータアミロイドによる膜貫通電位の低下はＧＳＭによる前処理で有意に抑制され、その効果はＧＳＰよりも高かった（図６（Ａ）及び（Ｂ））。
（３）細胞内への活性酸素種の蓄積の測定：
活性酸素種の細胞内への蓄積量を観察するために蛍光探索子ＤＣＦ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン−ジアセテート）を用いた。ＧＳＭまたはＧＳＰ存在下あるいは非存在下でＰＣ−１２細胞（１×１０６ｃｅｌｌ／３ｍＬ）を２５μＭのベータアミロイド処理したのち、クレブス・リンゲル液で洗浄し、１０μＭのＤＣＦ−ＤＡを加えた。３７℃で１５分間培養したのちアルゴンレーザーによる共焦点レーザー顕微鏡を用いて励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３０ｎｍで観察した。
［結果］
ベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞の細胞死における酸化ストレスを解明するために、細胞内での活性酸素種の蓄積を、細胞膜を透過できるＤＣＦ−ＤＡにより測定した。細胞内ではＤＣＦ−ＤＡは細胞のエステラーゼ活性によりＤＣＦに加水分解され過酸化物と反応して蛍光物質を生成する。ベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞はＤＣＦ色素により染色されて表示される（図７（Ａ））。ベータアミロイドによる細胞内への活性酸素種蓄積はＧＳＭにより減少し、その効果はＧＳＰよりも高かった（図７（Ａ）及び（Ｂ））。
（４）細胞内グルタチオン濃度：
細胞内グルタチオン濃度は市販のキット（ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＧＳＨ−４００：ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、米国）を使用して測定した。ＧＳＭまたはＧＳＰの存在下／非存在下で培養したベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞を回収してメタリン酸溶液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に色素原塩酸溶液を加え、撹拌後３０％水酸化ナトリウム溶液を加え２５℃で１０分間培養した。さらに遠心分離し澄明な上清の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。ＢＣＡタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりのグルタチオン濃度を無処理の対照と比較した。
［結果］
ベータアミロイドによる細胞死には酸化ダメージが関与している。ベータアミロイド処理された細胞では細胞内グルタチオン濃度が低下する。ＧＳＰ処理された細胞では正常レベルまで細胞内グルタチオン濃度が回復していたが、ＧＳＭでは正常レベルを上回る細胞内グルタチオン濃度を示し、細胞内で高い抗酸化活性を示した（図８）。
（５）過酸化脂質濃度：
過酸化脂質濃度は市販のキット（ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６：ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、米国）を使用して測定した。ＧＳＭまたはＧＳＰの存在下／非存在下で培養したベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞を回収して０．５ｍＭのブチル化ヒドロキシトルエンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に１０．３ｍＭのＮ−メチル−２−フェニルインドールのアセトニトリル溶液に希釈し混合する。３７％塩酸を加えて４５℃で６０分培養した。冷却後、遠心分離し、澄明な上清の５９０ｎｍの吸光度を測定した。ＢＣＡタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりの過酸化脂質濃度を無処理の対照と比較した。
［結果］
ベータアミロイド処理によって生じる細胞膜の過酸化は過酸化脂質から生じるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）によって示される。ＧＳＭまたはＧＳＰの前処理によってベータアミロイドによる脂質の過酸化を抑制し、その効果はＧＳＭで高く、無処理対照レベル以下に過酸化脂質を抑えていた（図９）。
［結果のまとめ］
ＧＳＭは神経細胞のモデル細胞株であるＰＣ−１２細胞において、神経細胞内への活性酸素種の蓄積を減少させることで、ベータアミロイド毒性による神経細胞死を抑制した。その効果はＧＳＰよりも高かった。ベータアミロイド毒性による神経細胞死は細胞に対する酸化ダメージが関与しているが、ＧＳＭは細胞に対する酸化ダメージを抑え、その効果はＧＳＰよりも高かった。
ＧＳＭがアルツハイマー病の発症、進行に深く関与するベータアミロイドによる神経細胞死をその抗酸化作用により抑制したことは、ＧＳＭによりアルツハイマー病の発症、進行を抑えることができることを示している。
試験例６：Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）誘発糖尿病に対する予防効果
物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する予防効果を検討するため、ＳＴＺを低用量頻回（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｗ ｄｏｓｅ：ＭＬＤ）投与することにより誘発される糖尿病の初期に相当する病態モデルを用いた。
［方法］
Ｊｌａ：ｄｄｙマウス（雄性、７週齢）の体重、血糖値及び血中ＬＰＯ値を測定し、各群が均等になるように以下の通り群分けした。
（１）陰性対照群：ＳＴＺ（−）（ｎ＝５、１ケージ）、
（２）陽性対照群：ＳＴＺ（＋）（ｎ＝１５、３ケージ）、
（３）物質１群 ：ＳＴＺ（＋）＋物質１（ｎ＝１０、２ケージ）、
（４）比較物質１群：ＳＴＺ（＋）＋比較物質１（ｎ＝１０、２ケージ）。
２０ｍｇ／ｋｇ用量のＳＴＺを４日間連続腹腔内投与（これを２クール）後、４０ｍｇ／ｋｇ用量のＳＴＺを４日間連続腹腔内投与した。物質１または比較物質１を各０．０６％粉末食餌に混ぜ自由摂取させた（１日あたりの食餌摂取量から、１日の物質１または比較物質１の摂取量は約１００ｍｇ／ｋｇとなる）。また、投与期間は、ＳＴＺ投与開始日の５日前から６５日目までとした。
投与期間中血液及び尿を採取し、血糖、尿糖、尿タンパク、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血中ＬＰＯ／ＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）を測定した。これらの測定結果を図１０〜１４に示す。
［結果のまとめ］
（１）空腹時血糖値
糖尿病では、図１０に示すように空腹時において血糖値が高値を示すが、ＳＴＺ投与後３５日、４９日及び６６日目において、陽性対照群は陰性対照群に比べ有意に血糖値が高く、ＳＴＺを低用量頻回投与することにより、軽度糖尿病モデルが作成されたことが確認された。物質１群、比較物質１群において血糖値は陽性対照群に比べ有意に低い値を示し、血糖値低減効果は物質１の方が比較物質１に比べ強い傾向を示した。
（２）尿糖値
糖尿病においては、尿中への糖排泄量が増加する。ＳＴＺ処理により尿中への糖の排泄量が大幅に増加し、マウスが糖尿病を誘発していることが捕捉できる。図１１に示すように、物質１群及び比較物質１群には、ＳＴＺにより増加する尿糖値の改善効果が観察され、４９日目においては陽性対照群との間にそれぞれ有意差が確認された。また、物質１の方が比較物質１に比較して若干低い値を示した。
（３）尿タンパク値
糖尿病では尿中へのタンパク質の排泄量が増加する。図１２に示すように、物質１及び比較物質１は、ＳＴＺによる尿中へのタンパク質の漏出を抑制することができ、ＳＴＺ投与後４９日目においては両物質共に陽性対照群に比べ有意にタンパク量を低減した。また、物質１の方が比較物質１に比べ、本病態モデルの早期から効果が発現することが予測される。
（４）抗酸化指標
（４−１）血中ＬＰＯ値
図１３に示すように、物質１群では陽性対照群及び比較物質１群に対して低値傾向が認められた。
（４−２）血中ＴＥＡＣ値
ＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）法は、ある化合物が有する抗酸化活性をアルファ−トコフェロール（α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）誘導体であるトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）の抗酸化能に換算して抗酸化強度を相対評価する方法で、抗酸化指標として一般的に広く使用されている。図１４に示すように、血中の抗酸化活性は、４９日目及び６６日目共に比較物質１と陽性対照は、ほぼ同程度の抗酸化能であったのに対し、物質１投与群では高値を示し、抗酸化能が最も高かった。
［まとめ］
ＳＴＺの低用量頻回投与モデルは、マウスに軽度糖尿病を誘発することができ、高用量単回投与モデルと比較して血糖値における個体間の差も少ないため、糖尿病の予防効果を検討するには利便性の高いモデルであると考えられる。物質１は本糖尿病モデルにおいて、病態進行に伴う血糖値や尿糖値の上昇を抑制することができ、糖尿病予防効果を有することが示された。
ＳＴＺによる糖尿病では、膵臓β細胞内に特異的にラジカルを発生させ、このラジカルによりβ細胞が傷害を受け死に至ることにより、糖尿病が誘導される。物質１及び比較物質１をＳＴＺ投与５日前から与えることにより、体内の抗酸化活性をあらかじめ高めることができ、ＳＴＺによるβ細胞に対する傷害を軽減することができたと推察される。
血中ＬＰＯおよびＴＥＡＣの結果から物質１は血中の抗酸化能を有意に上昇させることが明らかとなった。一酸化窒素や活性酸素等のラジカルがインスリン依存性糖尿病における膵ランゲルハンス島の破壊に関与することは周知の事実であり、これらフリーラジカルの細胞傷害を抑制すると糖尿病が改善されることが、ヒト介入試験により判明されつつある。したがって、物質１は糖尿病予備軍といわれる健常人に対する予防効果、更には初期糖尿病患者に対する病態進展抑制効果を有することが示された。
試験例７：臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験
物質１が他の抗酸化ポリフェノール素材と比較してどの程度の抗酸化能を有しているかを明らかにするために、臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験を行った。
［方法］
Ｗｉｓｔａｒラット（雄性、１２週齢）を以下のように群分けした。
陰性対照群：臭素酸カリウム（−）（ｎ＝５）、
陽性対照群：臭素酸カリウム（＋）（ｎ＝５）、
物質１群（ブドウ種子由来）：臭素酸カリウム（＋）＋物質１（ｎ＝５）、
物質５群（松樹皮由来）：臭素酸カリウム（＋）＋物質５（ｎ＝５）、
比較物質２群（カテキン）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質２（ｎ＝５）、
比較物質３群（イチョウ葉抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質３（ｎ＝５）、
比較物質４群（松樹皮抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質４（ｎ＝５）、
比較物質５群（ココア抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質５（ｎ＝５）。
臭素酸カリウムは６５ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内に単回投与した。物質１、物質５及び各比較物質は臭素酸カリウム投与開始日（０日目）の一週間前（−７日目）から翌日まで１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で毎日一回経口投与した。臭素酸カリウム投与日は臭素酸カリウム投与の前後３０分に投与を行った。−７日目、０日目及び２日目に頸静脈より採血を行い、血中のポリフェノール濃度、過酸化脂質濃度、ＴＥＡＣ、尿素窒素及びクレアチニン濃度を測定した。
［結果］
物質１及び各比較物質の臭素酸カリウム誘発急性腎障害に対する効果は抗酸化作用によるものであることから、抗酸化の指標として血中ポリフェノール濃度、血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）、血中過酸化脂質濃度を、腎障害の病態の指標として血中尿素窒素濃度、血中クレアチニン濃度を調べた。これらの測定結果を図１５〜１９に示す。
（１）抗酸化指標
（１−１）血中ポリフェノール濃度
図１５に示すように、臭素酸カリウム投与前の血中のポリフェノール濃度の初期値は各群とも一定であったが、物質１及び各比較物質を７日間投与した後の臭素酸カリウム投与０日目では物質１群で最も高値を示し、ついで比較物質２群であった。物質１の投与が血中のポリフェノール濃度を上昇させ、その上昇率は各比較物質に比べて有意に高いことが確認された。
（１−２）血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）
図１６に示すように、物質１及び各比較物質の一週間の前投与により血中の抗酸化能は上昇傾向を示し、物質１の投与による抗酸化能の上昇は各比較物質投与群に対して有意であった。
（１−３）血中過酸化脂質濃度
物質１及び各比較物質の一週間の前投与は臭素酸カリウム投与による血中過酸化脂質濃度の上昇を抑制した。図１７に示すように、その効果は物質１群で最も高く、各比較物質に対して有意に低い値を示した。
（２）病態指標
（２−１）血中尿素窒素濃度
図１８に示すように、臭素酸カリウムの投与により血中の尿素窒素濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質１及び各比較物質の投与は臭素酸カリウム投与による血中の尿素窒素濃度の上昇を抑制し、物質１の投与による血中尿素窒素濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であった。
（２−２）血中クレアチニン濃度
図１９に示すように、臭素酸カリウムの投与により血中のクレアチニン濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質１及び各比較物質の投与は臭素酸カリウム投与による血中のクレアチニン濃度の上昇を抑制し、物質１の投与による血中クレアチニン濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であった。
［まとめ］
比較物質３、比較物質４及び比較物質５はプロアントシアニジンのポリマー（高分子）が豊富な素材であり、試験管内では高い抗酸化活性を示すが、生体内に摂取された際の抗酸化活性は低分子化された物質１の方が高かった。比較物質２は単量体（カテキン）であるが、やはり物質１の方が活性は高く、血中のポリフェノール量からみても物質１は低分子化されているため生体への吸収に優れ、生体内における抗酸化活性も高いことが示された。物質１の前投与は血中の抗酸化能を高め、抗酸化活性を発揮する。その結果、臭素酸カリウムの投与による血中の過酸化脂質濃度の上昇を抑制し、腎障害を抑制し、血中への尿素窒素、クレアチニンの漏出を抑制した。その効果は各比較物質に比べ有意に高く、これまでに知られている高分子ポリフェノール主体のポリフェノール素材及び単量体（カテキン）よりも生体に摂取された際の抗酸化性に優れることが明らかとなった。
［本発明の物質の安全性］
単回投与毒性試験により、安全性を評価した。すなわち、物質１を体重ｋｇ当り２．５、５．０、７．５、１０．０ｇの投与量で、それぞれ８、７、３、１８匹のｄｄＹ系マウス（９週齢、雄性）に強制経口投与した。投与後の行動変化、死亡例を観察してＬＣ５０を算出した。その結果、物質１の５０％致死濃度（ＬＣ５０）は５．０ｇ／ｋｇ体重であった（９５％信頼限界３．５〜６．４ｇ／ｋｇ体重）。また、投与後の行動の異常や、試験終了時の解剖所見の異常は認められなかった。従って、物質１は食品として極めて安全性の高い物質であることが確認された。
前述の試験例４（ヒトに対するモニター試験）で、アンケート方式で被験者のコメントを収集した。そのうち、睡眠に関するものを表１０に、疲労感、頭の冴え、胃の調子について５段階評価による結果を表１１に示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【技術分野】
本発明は含硫プロアントシアニジンオリゴマー及びその組成物、それらの製造方法及び用途に関する。さらに詳しく言えば、植物中のプロアントシアニジン類を生体の腸管を通じた吸収が容易な程度に低分子量化する含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法、その方法で得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする、活性酸素種の生成等が原因となる各種生活習慣病、脳疾病の治療・予防に有用な健康食品組成物及び医薬品組成物を提供するものである。
【背景技術】
食生活の変化による脂肪摂取の過多や、環境の変化、オゾン層破壊等による紫外線への暴露量の増加、環境汚染物質の増加等により、高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病、癌等のいわゆる生活習慣病が増加し、さらにアレルギー、痴呆症などの脳疾患の患者も増加しつつある。今後、高齢化社会の進展と共に痴呆、アルツハイマー症候群等の患者の増加も危惧されるが、これらの要因に生体内で生成する活性酸素種の関与が指摘されている（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０（２００２），２４９７−２５０９）。しかし活性酸素種の完全な生成抑制ないし制御技術は開発されていないため、現状では生活習慣病や脳疾患等に有効・確実な予防・治療技術は十分に確立されていない。
植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフェノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフェノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療・予防剤として期待できるものである。
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフェノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウイルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。
ポリフェノールの中でもプロアントシアニジン類は幅広い植物に含まれるポリフェノールである。プロアントシアニジン類が、前述のような多彩な生理活性を示すには、プロアントシアニジン化合物が腸管を通じて生体内に吸収される必要がある。しかしプロアントシアニジン類の分子量は一般に数千乃至数万のオーダーと言われている。このような分子の大きな物質は腸管を通じての吸収は困難で、摂取しても生体に吸収されずに利用されない事が多い。
本発明者らも、ソバ種子から抽出したポリフェノールが脂質代謝改善、脳機能改善等の作用を有することを見出して特許出願しているが（特開平１０−２１８７８６号公報）、その有効成分はプロアントシアニジンのポリマーであり、生体への吸収の面では必ずしも十分とは言えなかった。
【発明の開示】
本発明は、腸管を通じて生体に吸収され難いプロアントシアニジン化合物を吸収され易い形に変え、プロアントシアニジン化合物の示す多彩な生理活性効果を十分に発揮させることで生体の抗酸化活性を向上させ、活性酸素種が原因とされる生活習慣病や脳疾病の治療・予防に有用な医薬品、健康食品等を提供することにある。
本発明者らは、プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物の反応で得られる低分子の含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、容易に腸管を通じて生体に吸収され、経口摂取により各種の生理活性を示すことを知見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は医薬品や健康食品組成物として有用な以下の含硫プロアントシアニジンオリゴマーとその組成物、それらの製造方法に関する。
１．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。
２．オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である前記１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
３．プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる前記１に記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
４．ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される前記１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
５．生活習慣病の治療及び／または予防用の医薬組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
６．老化の予防用の医薬組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
７．生活習慣病の改善及び／または予防用の健康食品組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
８．老化の予防用の健康食品組成物である前記１乃至４のいずれかに記載の組成物。
９．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させて得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
１０．オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である前記９記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
１１．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の製造方法。
１２．プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法。
１３．プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる前記１１または１２記載の製造方法。
１４．ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される前記１１または１２記載の製造方法。
１５．無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする前記１１または１２記載の製造方法。
１６．塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する前記１５記載の製造方法。
１７．式（４）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
１８．式（５）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
１９．式（６）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
２０．式（７）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
２１．式（８）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の実施例１による含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物（分画前の粉末；物質１）及びその原料（ブドウ種子ポリフェノール抽出物：比較物質１）を投与したマウスの血清中ＬＰＯ濃度を示すグラフであり、（Ａ）は低用量投与群、（Ｂ）は高用量投与群についての結果を示す。
図２は本発明の実施例１による含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物（物質１）及びその原料（比較物質１）を投与したマウスの肝臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）及び脳（Ｃ）中のＬＰＯ濃度を示すグラフである。
図３（Ａ）はＬＰＯ濃度初期値正常者、（Ｂ）はＬＰＯ濃度初期値異常者について、各々実施例１の本発明組成物（物質１）及び実施例１の原料（比較物質１）を投与したヒトの血清中のＬＰＯ濃度を示す。
図４（Ａ）はＳＯＤ濃度初期値正常者、（Ｂ）はＳＯＤ濃度初期値異常者について、各々実施例１の本発明組成物（物質１）及び実施例１の原料（比較物質１）を投与したヒトの血清中のＳＯＤ活性濃度を示す。
図５は実施例１における本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞死に対する抑制効果を示すグラフである。
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１における本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるミトコンドリア膜電位の低下に対する抑制効果を示す写真及びグラフである。
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞内への活性酸素種蓄積に対する減少効果を示す写真及びグラフである。
図８は本発明物質１及び比較物質１の細胞内抗酸化活性効果を示すグラフである。
図９は本発明物質１及び比較物質１のベータアミロイドによる細胞膜過酸化抑制効果を示すグラフである。
図１０は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する空腹時血糖値の低減効果を示すグラフである。
図１１は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する尿糖値の低減効果を示すグラフである。
図１２は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する尿タンパク値の低減効果を示すグラフである。
図１３は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する血中ＰＬＯ値の低減効果を示すグラフである。
図１４は本発明物質１及び比較物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する血中ＴＥＡＣ値（抗酸化能）の上昇効果を示すグラフである。
図１５は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中ポリフェノール濃度の上昇効果を示すグラフである。
図１６は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）の上昇効果を示すグラフである。
図１７は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中過酸化脂質濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
図１８は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中尿素窒素濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
図１９は本発明物質１の臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中クレアチニン濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明の含硫オリゴマーは通常、プロアントシアニジンの２量体から５量体程度であり、分子量は通常１５００以下である。
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物との反応は酸性条件下で行うのが好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類、あるいは酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸等の有機酸類から選ばれる適宜の酸が０．１Ｎ〜１．０Ｎ程度、好ましくは０．５Ｎの濃度で用いられる。
なお、本明細書において、プロアントシアニジンとはカテキン重合体を指し、具体的には、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートまたはこれらを構成単位とするものが含まれる。
プロアントシアニジン類を含む植物には、カキ、ナシ、ブドウ、イチゴ、バナナ、アボカド、コケモモ、レンコン、ソバ等の果菜類、緑茶、紅茶、ウーロン茶等の茶類一般、ハーブ・スパイス類、木材・マツ樹皮等広範・多種に亘る植物が含まれる。これらのプロアントシアニジン類を含む植物やその抽出物（搾汁、果汁、野菜汁を含む）が好適に用いられる。
本発明で用いられるＳＨ基含有化合物としては、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ含有ペプチドまたはこれらの塩類等が挙げられるが、その他にイオウを含むネギ、ニンニク等の天然物も挙げられる。メルカプタン類も使用可能ではあるが、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーが食品、医薬品組成物に利用される点を考慮すると、ＳＨ基含有化合物としては食品、医薬品に使用が許されている物質が好ましい。
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物とＳＨ基含有化合物との反応は、室温〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃で数時間乃至１週間、好ましくは２４〜４８時間行われる。
反応溶媒には、水、メタノール、エタノール等の１種類または２種以上の混合物が用いられるが、食品、医薬品等の用途を考慮すれば、水、エタノールが好ましい。
反応後は残渣をろ別して、ろ液を濃縮した後、常法により精製する。
すなわち、濃縮液の精製は抽出エキスを膜処理（限外ろ過、逆浸透等）、吸着剤で処理することにより行なうことができる。吸着剤としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤、メタクリル酸系吸着剤、親水性ビニルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリカゲル、イオン交換樹脂等が用いられる。これらの吸着剤を用いる場合には、これに吸着する画分（以下、吸着画分という。）にＳＨ基含有化合物と反応し低分子量化したポリフェノール化合物（含硫プロアントシアニジンオリゴマー）が含まれている。この吸着画分を含水アルコール、アルコール、アセトン等で溶出させることにより種々の分子量の成分を得ることができる。
このようにして得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、順相ＨＰＬＣ及びＮＭＲ測定値から、下記一般式（９）に示されるプロアントシアニジンの２量体から５量体であることが確認されている。
式中、ｎは０または１〜３の整数であり、Ｒ１は水素原子または下記式
で示されるガロイル基を表し、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表し、Ｒ４はシステイン、シスチン、グルタチオンまたはＳＨ基含有ペプチド残基を表す。
含硫プロアントシアニジンオリゴマーは分子量１５００以下の低分子のため腸管を通じて生体に容易に吸収され、後述の試験例で示されるように、強いＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様活性増加作用、Ｐ４５０系脂質過酸化抑制作用、ＦＮＴ酸化ストレスに対する保護作用、ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護作用、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）誘発糖尿病に対する予防作用等を示し、他のポリフェノール素材と比較して高い抗酸化能を有する。またヒトに対する抗酸化指標のモニター試験で、抗酸化効果に基くと判断されるデータも得られている。
従って、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、生体の過酸化脂質生成抑制作用を有するだけでなく、活性酸素により起こる酸化障害に起因する疾病に効果を有するので、過酸化脂質あるいは活性酸素生成に起因する各種臓器の障害、老化の防止効果を有し、それにより生ずる各種疾病の治療及び防止に有効である。また脳の老化が原因と考えられる痴呆等の脳機能障害の抑制・防止・治療にも有効と考えられる。同時に脳機能の改善により、学習機能の向上、イライラ感の減少、不眠症解消、落着き回復等の効果も期待出来る。このため、本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、医薬組成物ならびに健康食品組成物として利用することが出来る。
本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする組成物には毒性は全く認められず、十分安全に使用できる。これら組成物は経口または非経口で用いられるが、経口的に使用される場合の投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、１００から２０００ｍｇの範囲である。本発明組成物を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の補助資材（澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の実施例、試験例を挙げて、発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの範囲内に限定されるものではない。
実施例１：ブドウ種子由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）ブドウ種子ポリフェノールの抽出
乾燥ブドウ種子８ｋｇを８０％メタノール（３０Ｌ）で３日間室温で抽出し、残渣をろ過してろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学）２００ｍｍφ×３０ｃｍ（約２５Ｌ）にチャージし、水１００Ｌで洗浄した。メタノール５０Ｌで溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して４５６ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たブドウ種子ポリフェノール４００ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬工業（株）製）４００ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）４ｇ、クエン酸（和光純薬工業（株）製）０．８ｋｇ、水４Ｌを混合し、４０℃で４８時間反応させた。反応液を直径２００ｍｍ、高さ８００ｍｍのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容量約２５Ｌ）にチャージし、非吸着画分を水１００Ｌで洗浄した後、４０％エタノール５０Ｌで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、水、メタノール、エタノールに易溶の赤褐色粉末（収量４０８ｇ）を得た。この粉末をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）を担体として充填したカラム（直径５０ｍｍ、高さ５００ｍｍ、容積約１Ｌ）により、エタノール−水混合液で分画し、分画物のオリゴマー組成を野中らの方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３４（２），６３３−６４２（１９８６））により分析した結果、組成は次のとおりであった。
システイン結合エピカテキン単量体画分 １９％
システイン結合エピカテキン２量体画分 ２１％
システイン結合エピカテキン３量体画分 １１％
システイン結合エピカテキン４〜６量体画分 １６％
（３）システイン結合エピカテキン単量体
得られたシステイン結合エピカテキン単量体画分をニンヒドリン−酢酸試液の噴霧加熱によって桃褐色に呈色するスポットを対象としてＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（水−メタノール−アセトン）によって精製して、下記（１）〜（３）式で示される化合物（以下化合物１〜３と略記することがある）を単離した。
式（１）の化合物（化合物１）はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：高分解能高速原子衝撃法質量スペクトル）の測定で分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）４１０．０９２５を示し、分子式Ｃ１８Ｈ２０Ｏ８ＮＳに相当する計算値４１０．０９１０と３．６ｐｐｍ（１０ｐｐｍ以内）の誤差で一致した。したがって、化合物１は分子式Ｃ１８Ｈ１９Ｏ８ＮＳを有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにＬ−システインのイオウ原子が結合した化学構造が考えられる。また、化合物１の１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル、表１参照）測定において、カテキンまたはエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナルの他に、酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ５．０９（ｂｒ．ｓ）、δ４．０７（ｍ）およびδ３．８６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）に各々プロトン１個分として認められた。前者はエピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ３．８６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）のプロトンシグナルは４α配置に帰属され、イオウ原子が４βに配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。その他、δ４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，４Ｈｚ）ならびにδ２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５，９Ｈｚ）およびδ３．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５，４Ｈｚ）にＡＢＸ型のシグナル群が認められ、システインのメチン基にメチレン基が隣接する部分構造を示唆している。これらの情報に基づき、化合物１の化学構造を式（１）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。化合物１の１３Ｃ−ＮＭＲ（炭素−１３核磁気共鳴スペクトル、表２参照）（ＤＥＰＴ法）において認められた各炭素級数を含めて１８個の炭素シグナルもこの構造を支持した。
式（２）の化合物（化合物２）の１Ｈ−ＮＭＲ（表１参照）において酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ４．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，６Ｈｚ）、δ４．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，４．３Ｈｚ）およびδ４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）に各々プロトン１個分として認められた。前２者は各々カテキンの２β、３β配置、δ４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）は４α配置に帰属され、イオウ原子が４βに配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。したがって、化合物１と化合物２は３位の立体配置のみが異なると考えられ、化合物２の化学構造を式（２）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
式（３）の化合物（化合物３）はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳの測定で分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）４２６．０８４４を示し、化合物１よりも酸素原子が１個多い分子式Ｃ１８Ｈ２０Ｏ９ＮＳに相当する計算値４２６．０８５９と３．５ｐｐｍの誤差で一致した。また１Ｈ−ＮＭＲ（表１参照）の測定で、芳香環領域のδ６．５７（２Ｈ，ｓ）に２′および６′位の水素が等価シグナルとして認められた他は、化合物１と対応、類似していた。表２に示す１３Ｃ−ＮＭＲのシグナル帰属と考え併せ、化合物３の構造を式（３）に示す４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
（４）システイン結合エピカテキン２量体
システイン結合エピカテキン２量体画分粉末を同様に精製して下記式（４）で示される化合物（以下、化合物４と略記することがある。）を単離した。
化合物４はＦＡＢ−ＭＳの測定で、分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）６９８を示し、化合物１よりもカテキンユニットが１個多い構造が考えられた。ＴＬＣおよびＨＰＬＣにおいて各々単一挙動を示したにも拘わらず、化合物４の１Ｈ−ＮＭＲはブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスペクトルを示した。この特徴的な１Ｈ−ＮＭＲシグナル分布から、縮合の結合位置は、４→６または４→８のうち、強く回転障害を生じる後者が考えられた。４→８結合に直結する各ベンゾピラン由来シグナル群はブロードに変形して認められた。すなわち、δ４．２２、δ４．５４、δ４．９６（ｅａｃｈ １Ｈ，ｂｒ．ｍ，Ｃ−３，−４，−２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）は上端ユニットに、よりシャープなδ３．８３、δ３．９０（ｅａｃｈ １Ｈ，ｓ，Ｃ−４′，−３′，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）、５．２０（１Ｈ，ｂｒ．ｍ，Ｃ−２′）はイオウ原子と結合しているユニット（下端）に各々帰属された。分子模型による考察からも、下端ユニットは上端に比較して回転障害を免れていることが伺えた。δ５．９２の芳香環領域にはＣ−６、−８、−６′に帰属されるプロトン３個分のシグナルがｅｎｖｅｌｏｐｅとして認められた。δ６．６０からδ７．０９にかけて両ユニットＢ環上のプロトン群が認められ、その中の結合定数８．３Ｈｚのシャープなｄｏｕｂｌｅｔシグナルは回転障害を免れている下端ユニットの５位に帰属されると考えられた。残されたシグナルδ２．９５、δ３．４４（ｅａｃｈ １Ｈ，ｂｒ．ｍ，ｃｙｓ−Ｃ−３）、δ４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，４Ｈｚ，ｃｙｓ−Ｃ−２）は各々システイン残基由来と推定された。化合物４の１３Ｃ−ＮＭＲ（表３参照）は化合物１に相当するシグナル群が認められ、式（４）に示される化合物４の構造を支持している。したがって、化合物４の構造を４β（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−（４β→８）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
（５）システイン結合エピカテキン３量体
システイン結合エピカテキン単量体画分粉末を同様に精製して下記式（５）で示される化合物（以下、化合物５と略記することがある。）を単離した。
化合物５はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳの測定で、分子イオンピークを［Ｍ−Ｈ］＋（ｍ／ｚ）９８４．１９５６に示し、分子式Ｃ４８Ｈ４２Ｏ２０ＮＳに相当する計算値９８４．２０１１と５．５ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物５は分子式Ｃ４８Ｈ４３Ｏ２０ＮＳを有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンから構成される３分子縮合体にＬ−システインが結合した化学構造が考えられた。また、化合物５の１Ｈ−ＮＭＲシグナルは全体としてブロードであり、３ユニットはいずれも４→８結合に直鎖状に縮合、Ｌ−システインが下端ユニットに結合していることが示唆された。芳香環上のシグナルとしてδ５．９８に認められたシングレットからＡ環−６−Ｈ、−８−Ｈ、Ａ′環６−Ｈ、Ａ″環−６−Ｈと帰属される。より低磁場に認められるシグナル群（δ６．０４，ｓ；δ６．９１，７．０１，ｓ；δ７．１１，ｓ）は、高さ比が約３：２：１：３であり、Ｂ環−、Ｂ′環−、Ｂ″環上の２−Ｈ由来シグナルに帰属され、δ６．９１およびδ７．０１（２：１）のシグナルは中間に位置するＢ′−２−Ｈが最も回転障害を受けているために分裂して現れたと考えられた。これらの情報に基づいて、化合物５の平面構造を暫定的に式（５）と推定した。
実施例２：ブドウ種子由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
実施例１と同じ原料、条件でブドウ種子ポリフェノールを抽出し、実施例１と同じ条件で精製した。この精製物を以下の条件でグルタチオンと反応させ、低分子化した。
すなわち、得たブドウ種子ポリフェノール１．０ｇ、グルタチオン（和光純薬工業（株）製）３．０ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．５ｇ、１Ｎ塩酸５０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させた。この反応液をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、ＭＣＩｇｅｌ ＣＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）等により精製し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末を得た（収量１２０ｍｇ）。
１）グルタチオン結合モノマー
得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲル、およびＯＤＳ系シリカゲルを担体に、水とメタノールの混合液を移動相としたカラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し式（６）で示される化合物（化合物６）を得た。
化合物６はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：高分解能エレクトロスプレー・イオン化質量スペクトル）の測定で、分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）５９６．１５５０を示し、分子式Ｃ２５Ｈ３０Ｏ１２Ｎ３Ｓに相当する計算値５９６．１５５１と０．１７ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物６はカテキンまたはエピカテキンにグルタチオンのＬ−システイン由来イオウ原子が結合した化学構造が考えられた。化合物６の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、カテキンまたはエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナル群（δ５．８４，５．９６，６．９１（ｅａｃｈ １Ｈ，８−，６−，２′−Ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｒｙ）；δ６．７３−６．７８（２Ｈ，ｍ，５′−，６′−Ｈ））の他に、酸素原子またはイオウ原子を付け根に有するシグナル群がδ３．９０，３．９１，５．１５（ｅａｃｈ １Ｈ，３−，４−，５−Ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に認められ、化合物１と同様にエピカテキンの４位にイオウ原子が４βに配置する構造が類推された。その他、システイン部分（δ３．６３（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９，４Ｈｚ，ｃｙｓ−２−Ｈ），３．７２，３．８０（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，ｃｙｓ−３−Ｈ２））、グルタミン酸部分（δ１．７２（２Ｈ，ｍ，ｇｌｕ−４−Ｈ２），１．７８（２Ｈ，ｍ，ｇｌｕ−３−Ｈ２），３．０５（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，ｇｌｕ−２−Ｈ））およびグリシン部分（δ３．２０（２Ｈ，ｓ，ｇｌｙ−２−Ｈ２））に相当するシグナル群が認められた。この構造は化合物６の１３Ｃ−ＮＭＲ（表４参照）の測定における２５個の炭素シグナルが観測からも支持された。
したがって、化合物６の構造を、グルタチオン分子のシステイン部分に由来するイオウ原子がエピカテキンの４βに結合した式（６）で示される４β−（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎと推定した。
実施例３：松樹由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）パインバークポリフェノールの抽出
トドマツ樹皮４００ｇを８０％メタノール１．５Ｌにより室温で３日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
濃縮液の全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）５０ｍｍφ×３０ｃｍ（約６００ｍＬ）にチャージし、２５００ｍＬの水で洗浄した。メタノール１２００ｍＬ溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して１８．４ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たパインバーグポリフェノール１．０ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬（株）製）１．７ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．２５ｇ、１Ｎ塩酸２０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させ、反応液を直径２５ｍｍ、高さ１５０ｍｍのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容積約１００ｍＬ）にチャージし、非吸着画分を水４００ｍＬで洗浄した後、メタノール４００ｍＬで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、赤褐色粉末（収量０．９５ｇ）を得た。
プロアントシアニジンは試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では強い抗酸化活性を示すが、経口的摂取では必ずしも生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で十分な効果を発揮しない。その理由は、高分子のプロアントシアニジンは腸管で吸収され難いためと考えられる。これに対し、本発明のＳＨ基含有物質により低分子化した含硫プロアントシアニジンオリゴマーは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では高分子のプロアントシアニジンと同等の抗酸化活性を示し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも高分子のプロアントシアニジンより優れた抗酸化活性を示す。
実施例４：ヤマモモ由来含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造
（１）ヤマモモポリフェノールの抽出
ヤマモモ樹皮（揚梅皮）４００ｇを８０％メタノールの１．５Ｌにより室温で３日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。
［精製条件］
濃縮液の全量をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）５０ｍｍφ×３０ｃｍ（約６００ｍＬ）にチャージし、２５００ｍＬの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール１２００ｍＬで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して３８．０ｇの粉末状組成物を回収した。
（２）システインとの低分子化反応
上記（１）の方法で得たヤマモモポリフェノール１．０ｇ、Ｌ−システイン（和光純薬（株）製）１．７ｇ、アスコルビン酸（純正化学（株）製）０．２５ｇ、１Ｎ塩酸２０．０ｍＬを混合し、４０℃で４８時間反応させ、反応液をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）２５ｍｍφ×１５０ｍｍ（約１００ｍＬ）にチャージし、４００ｍＬの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール４００ｍＬで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末０．９５ｇを得た。
（３）楊梅皮ポリフェノールとＬ−システインの結合体について
１）Ｌ−システイン結合エピガロカテキンガレート・モノマー
前記（２）で得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ゲル、およびＯＤＳ系シリカゲルを担体に、水、メタノール、アセトンの任意の混合液を移動相としたカラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し、エピカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）（４β→８）エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）および前記化合物３の他、以下の式（７）および（８）に示す化合物（化合物７および化合物８）を単離した。
化合物７は、ＥＳＩ−ＭＳの測定で、分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］＋（ｍ／ｚ）５７５を示した。また、１Ｈ−ＮＭＲ（表５参照）の測定結果は化合物１および化合物３と類似していたが、約１．３ｐｐｍ低磁場シフトした３−βＨ（１Ｈ，５．２９，ｓ）、ならびに芳香環領域のＡ環上６、８位の他、６．６８と６．９６に各プロトン２個分の鋭い２組の鋭い等価なシングレット・シグナル（１，３，４，５置換ベンゼン上の２と６位水素由来）が認められた。これらのシグナルはエピガロカテキンのガレートであることを示唆している。
これらの情報と表６に示す１３Ｃ−ＮＭＲシグナル群の帰属とを併せて、化合物７の構造を式（７）で示される４β−（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅと推定した。
２）Ｌ−システイン結合エピガロカテキンガレート・ダイマー
化合物８はＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳの測定で分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］＋（Ｍ／Ｚ）１０３２．１５１７を示し、分子式Ｃ２５Ｈ３０Ｏ１２Ｎ３Ｓに相当する計算値１０３２．１５０３と１．４ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、化合物７よりもエピカテキンガレート・ユニットが１個多い構造が考えられた。化合物８の１Ｈ−ＮＭＲは化合物４と同様ブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスペクトルを示し、４→８縮合型であると考えられた。１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲのシグナル群は化合物４と同様に帰属され（各々表５および６）、化合物８の構造を式（８）に示される４β（Ｓ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ−（４β→８）−（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅと推定した。
試験例１：ＤＰＰＨラジカル消去作用
実施例１の分画前の粉末（物質１）、物質１を分画して得た単量体画分（物質２）、物質１を分画して得た２量体及び３量体画分（物質３）、物質１を分画して得た４〜６量体画分（物質４）、実施例１の原料（ブドウ種子ポリフェノール抽出物）（比較物質１）及び市販カテキン（和光純薬（株）製）（比較物質２）について、１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ラジカルの消去作用を次の方法で測定した。
９６穴のマイクロプレートに１００μＬのＤＰＰＨ溶液（６０μＭエタノール溶液）を入れ、試験試料のエタノール溶液１００μＬ、またはコントロールとしてのエタノール１００μＬをそれぞれ加え、静かに混合して室温で３０分間放置した後、５２０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカル消去能を下記の式で算出した。段階的に希釈した試験試料のＤＰＰＨラジカル消去能と濃度から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去能（％）＝［（１−試験試料の吸光度）／コントロールの吸光度］
×１００
各試料の段階的な濃度のＤＰＰＨラジカル消去能から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。結果を表７に示す。
ＤＰＰＨラジカル消去能は、低濃度では物質４が比較的高かった。それ以外の試料は同様な活性を示し、高濃度では各試料とも高い活性を示した。
試験例２：活性酸素除去酵素（ＳＯＤ）様活性
試験例１と同じ物質１〜４、比較物質１〜２について、血中ＳＯＤ活性測定キット（ＳＯＤテストワコー：和光純薬（株）製）を用いてＳＯＤ様活性を測定した。下式でＳＯＤ様活性を算出し、試験試料の濃度との関係から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。
ＳＯＤ様活性（％）
＝［（１−試験試料の吸光度）／コントロールの吸光度］×１００
各試料の段階的な濃度におけるＳＯＤ様活性からＥＣ５０を算出して、結果を表８に示した。物質２〜４の各分画物は、比較物質１〜２に比べ高いＳＯＤ様活性を示した。
試験例３：亜急性ＦｅＮＴＡ誘導多臓器障害モデルに対する効果
生体に投与すると大量の活性酸素を発生し、多臓器障害を誘発するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）酸化モデルとして知られるＦｅＮＴＡ（硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３）とニトリロ三酢酸ナトリウム（ＮＴＡ３Ｎａ）の混合物）を用いて試験した。
すなわち、硝酸鉄九水和物（関東化学（株）製）２４０ｍｇを４０ｍＬの冷水に溶解したものと、ニトリロ三酢酸ナトリウム一水和物３９０ｍｇを４０ｍＬの冷水に溶解したものを氷冷下で混合し、１Ｎ塩酸によりｐＨを７．５に調整して１００ｍＬに定溶したものをＦｅＮＴＡ溶液とする。調製後１０分以内にＦｅとして体重ｋｇ当り２２．５ｍｇのＦｅＮＴＡ溶液を、雄性ｄｄＹ系マウス７週齢（平均体重３０ｇ）に１日おきに腹腔内投与した。物質１及び比較物質１をそれぞれ体重Ｋｇ当り２５ｍｇ（低用量投与群）、または５０ｍｇ（高用量投与群）を毎日強制経口投与した。対照群には水道水を摂取させ、ＦｅＮＴＡ投与しない陰性対照群と、ＦｅＮＴＡ投与する陽性対照群を設けた。飲料水、食餌は自由摂取とした。投与開始から７、１４、２１、２８日目に採血し、血清中の過酸化脂質（ＬＰＯ）濃度を測定した。投与開始から２８日目に解剖し、肝臓、腎臓、脳を摘出して各臓器のホモジナイズのＬＰＯ濃度を測定した。
［試験結果］
（１）血清中のＬＰＯ濃度を図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。低用量投与群では物質１は２１日目で血清中ＬＰＯ濃度は、比較物質１及び陽性対照群に対して有意に低下した（図１（Ａ））。高用量投与群でも物質１は、投与開始から２１日目以降に有意に低下した（図１（Ｂ））。比較物質１も２１日目に低値を示したが、本発明の物質の方が高い効果を示した。
（２）各臓器中のＬＰＯ濃度
肝臓、腎臓及び脳中のＬＰＯ濃度を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
肝臓ではＦｅＮＴＡ投与によるＬＰＯ濃度の有意な上昇は認められず、各投与群でも変化は認められなかった。腎臓と脳では、ＦｅＮＴＡ投与によりホモジナイズ中のＬＰＯ濃度は上昇した。物質１及び比較物質１の投与で、ＬＰＯ濃度は低下した。腎臓、脳ともに物質１高用量投与群で、最も低い値を示した。特に脳では、比較物質１投与でも低値を示したが、物質１高用量投与群では他の群に比べ有意に低い値を示した。
［結果のまとめ］
ＦｅＮＴＡの投与は、血清中のＬＰＯ濃度を上昇させた。物質１は比較物質１に比べ、低用量、短期間に効果を発揮した。このことから、低分子化されたことにより、物質１は経口的摂取で腸管から吸収され易く、そのため低用量、短期間で効果を発揮したと考えられる。特に、物質１は腎臓及び脳で強い抗酸化活性を示すことが明らかとなった。
試験例４：ヒトに対するモニター試験
［試験方法］
健康な男女３４名（平均年齢４１．２歳、男性２１名、女性１３名）を表９に示すように２群に分け、物質１及び比較物質１を１日当り５００ｍｇをそれぞれ２８日間投与した。投与開始前、投与２８日後に採血し、血清中のＬＰＯ濃度、ＳＯＤ様活性を測定した。
［結果］
投与前後のＬＰＯ濃度及びＳＯＤ様活性を図３及び図４に示す。図３（Ａ）は初期値が正常者についてＬＰＯ濃度、図３（Ｂ）は初期値異常者についてＬＰＯ濃度を示し、図４（Ａ）は初期値正常者についてＳＯＤ様活性、図４（Ｂ）は初期値異常者についてＳＯＤ様活性についての結果を示す。
比較物質１及び物質１の２８日間の投与でＬＰＯ濃度は低下し、ＳＯＤ様活性は上昇の傾向が認められた。被験者中の初期値異常者でＬＰＯ濃度の初期値が比較的高かった者（ＬＰＯ濃度８．０以上）及びＳＯＤ様活性が比較的低かった者（ＳＯＤ様活性が１２．０以下）について見ると、物質１を投与した群で統計的に有意なＬＰＯ濃度の低下が見られた（図３（Ｂ））。同様に、ＳＯＤ様活性も物質１を投与した群で統計的に有意な上昇が認められた（図４（Ｂ））。このことから、物質１は同量の比較物質１よりも、生体の酸化状態の改善に有効であることが確認された。
試験例５：ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護効果
神経の再生異常による病気であるアルツハイマー病はベータアミロイドを蓄積した老人斑を形成することを特徴とする。ベータアミロイドは活性酸素種を生成し、神経細胞への細胞毒性によりアルツハイマー病の発症と進行において重要な役割を担っている物質である。神経細胞毒性の実験に広く用いられるＰＣ−１２細胞に対するアポトーシス誘導による細胞傷害活性における低分子化ポリフェノール（以下、ＧＳＭと略記することがある。）の神経細胞保護効果を調べた。
［試験方法］
ＰＣ−１２細胞は１０％熱不活化馬血清及び５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で１０％二酸化炭素雰囲気下にて培養した。４×１０４細胞／３００μＬに細胞密度を調整して２４時間予備培養したのち、血清不含のＮ−２培地中にＧＳＭあるいはブドウ種子ポリフェノール（以下、ＧＳＰと略記することがある。）を１、１．５、５、１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、４８穴のプレートに培養した。
（１）細胞生存度試験：
処理後、細胞は終濃度１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液で処理し、深青色のホルマザン産物を緩衝液に溶解して５４０〜５９５ｎｍの吸光度により測定した。結果は無処理の対照細胞の吸光度との比率（％）で示した。
［結果］
ＧＳＭは濃度依存的にベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞死を抑制することが、ＭＴＴ試験により明らかとなった。その効果は特に１及び１．５μｇ／ｍＬの低濃度域においてＧＳＰよりも高かった（図５）。
（２）ミトコンドリア膜電位測定試験：
ミトコンドリア膜電位の測定には脂溶性陽イオン探索子であるＴＭＲＥを使用した。ＧＳＭまたはＧＳＰ存在下あるいは非存在下でＰＣ−１２細胞（１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）を２５μＭのベータアミロイド処理したのち、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し３７℃で３０分間ＴＭＲＥ（１５０ｎＭ）処理した。ミトコンドリアの膜電位に依存してミトコンドリア内に蓄積したＴＭＲＥを、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５９０ｎｍの蛍光で検出した。
［結果］
ミトコンドリアは細胞死の徴候に先んじて膜の完全性に変調を来す。この変化はミトコンドリアの内膜および外膜の両方で起こり、最終的にチトクロームＣのような可溶性膜間タンパクを放出する膜貫通電位の放散と膜透過性の変化を導く。ＰＣ−１２細胞はベータアミロイドに曝露されるとミトコンドリア膜貫通電位を急速に低下させ、それは電位依存型色素であるＴＭＲＥを用いた赤色の蛍光で現わされる（図６（Ａ））。ベータアミロイドによる膜貫通電位の低下はＧＳＭによる前処理で有意に抑制され、その効果はＧＳＰよりも高かった（図６（Ａ）及び（Ｂ））。
（３）細胞内への活性酸素種の蓄積の測定：
活性酸素種の細胞内への蓄積量を観察するために蛍光探索子ＤＣＦ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン−ジアセテート）を用いた。ＧＳＭまたはＧＳＰ存在下あるいは非存在下でＰＣ−１２細胞（１×１０６ｃｅｌｌ／３ｍＬ）を２５μＭのベータアミロイド処理したのち、クレブス・リンゲル液で洗浄し、１０μＭのＤＣＦ−ＤＡを加えた。３７℃で１５分間培養したのちアルゴンレーザーによる共焦点レーザー顕微鏡を用いて励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３０ｎｍで観察した。
［結果］
ベータアミロイドによるＰＣ−１２細胞の細胞死における酸化ストレスを解明するために、細胞内での活性酸素種の蓄積を、細胞膜を透過できるＤＣＦ−ＤＡにより測定した。細胞内ではＤＣＦ−ＤＡは細胞のエステラーゼ活性によりＤＣＦに加水分解され過酸化物と反応して蛍光物質を生成する。ベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞はＤＣＦ色素により染色されて表示される（図７（Ａ））。ベータアミロイドによる細胞内への活性酸素種蓄積はＧＳＭにより減少し、その効果はＧＳＰよりも高かった（図７（Ａ）及び（Ｂ））。
（４）細胞内グルタチオン濃度：
細胞内グルタチオン濃度は市販のキット（ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＧＳＨ−４００：ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、米国）を使用して測定した。ＧＳＭまたはＧＳＰの存在下／非存在下で培養したベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞を回収してメタリン酸溶液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に色素原塩酸溶液を加え、撹拌後３０％水酸化ナトリウム溶液を加え２５℃で１０分間培養した。さらに遠心分離し澄明な上清の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。ＢＣＡタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりのグルタチオン濃度を無処理の対照と比較した。
［結果］
ベータアミロイドによる細胞死には酸化ダメージが関与している。ベータアミロイド処理された細胞では細胞内グルタチオン濃度が低下する。ＧＳＰ処理された細胞では正常レベルまで細胞内グルタチオン濃度が回復していたが、ＧＳＭでは正常レベルを上回る細胞内グルタチオン濃度を示し、細胞内で高い抗酸化活性を示した（図８）。
（５）過酸化脂質濃度：
過酸化脂質濃度は市販のキット（ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６：ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、米国）を使用して測定した。ＧＳＭまたはＧＳＰの存在下／非存在下で培養したベータアミロイド処理されたＰＣ−１２細胞を回収して０．５ｍＭのブチル化ヒドロキシトルエンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に１０．３ｍＭのＮ−メチル−２−フェニルインドールのアセトニトリル溶液に希釈し混合する。３７％塩酸を加えて４５℃で６０分培養した。冷却後、遠心分離し、澄明な上清の５９０ｎｍの吸光度を測定した。ＢＣＡタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりの過酸化脂質濃度を無処理の対照と比較した。
［結果］
ベータアミロイド処理によって生じる細胞膜の過酸化は過酸化脂質から生じるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）によって示される。ＧＳＭまたはＧＳＰの前処理によってベータアミロイドによる脂質の過酸化を抑制し、その効果はＧＳＭで高く、無処理対照レベル以下に過酸化脂質を抑えていた（図９）。
［結果のまとめ］
ＧＳＭは神経細胞のモデル細胞株であるＰＣ−１２細胞において、神経細胞内への活性酸素種の蓄積を減少させることで、ベータアミロイド毒性による神経細胞死を抑制した。その効果はＧＳＰよりも高かった。ベータアミロイド毒性による神経細胞死は細胞に対する酸化ダメージが関与しているが、ＧＳＭは細胞に対する酸化ダメージを抑え、その効果はＧＳＰよりも高かった。
ＧＳＭがアルツハイマー病の発症、進行に深く関与するベータアミロイドによる神経細胞死をその抗酸化作用により抑制したことは、ＧＳＭによりアルツハイマー病の発症、進行を抑えることができることを示している。
試験例６：Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）誘発糖尿病に対する予防効果
物質１のＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する予防効果を検討するため、ＳＴＺを低用量頻回（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｗ ｄｏｓｅ：ＭＬＤ）投与することにより誘発される糖尿病の初期に相当する病態モデルを用いた。
［方法］
Ｊｌａ：ｄｄｙマウス（雄性、７週齢）の体重、血糖値及び血中ＬＰＯ値を測定し、各群が均等になるように以下の通り群分けした。
（１）陰性対照群：ＳＴＺ（−）（ｎ＝５、１ケージ）、
（２）陽性対照群：ＳＴＺ（＋）（ｎ＝１５、３ケージ）、
（３）物質１群 ：ＳＴＺ（＋）＋物質１（ｎ＝１０、２ケージ）、
（４）比較物質１群：ＳＴＺ（＋）＋比較物質１（ｎ＝１０、２ケージ）。
２０ｍｇ／ｋｇ用量のＳＴＺを４日間連続腹腔内投与（これを２クール）後、４０ｍｇ／ｋｇ用量のＳＴＺを４日間連続腹腔内投与した。物質１または比較物質１を各０．０６％粉末食餌に混ぜ自由摂取させた（１日あたりの食餌摂取量から、１日の物質１または比較物質１の摂取量は約１００ｍｇ／ｋｇとなる）。また、投与期間は、ＳＴＺ投与開始日の５日前から６５日目までとした。
投与期間中血液及び尿を採取し、血糖、尿糖、尿タンパク、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血中ＬＰＯ／ＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）を測定した。これらの測定結果を図１０〜１４に示す。
［結果のまとめ］
（１）空腹時血糖値
糖尿病では、図１０に示すように空腹時において血糖値が高値を示すが、ＳＴＺ投与後３５日、４９日及び６６日目において、陽性対照群は陰性対照群に比べ有意に血糖値が高く、ＳＴＺを低用量頻回投与することにより、軽度糖尿病モデルが作成されたことが確認された。物質１群、比較物質１群において血糖値は陽性対照群に比べ有意に低い値を示し、血糖値低減効果は物質１の方が比較物質１に比べ強い傾向を示した。
（２）尿糖値
糖尿病においては、尿中への糖排泄量が増加する。ＳＴＺ処理により尿中への糖の排泄量が大幅に増加し、マウスが糖尿病を誘発していることが捕捉できる。図１１に示すように、物質１群及び比較物質１群には、ＳＴＺにより増加する尿糖値の改善効果が観察され、４９日目においては陽性対照群との間にそれぞれ有意差が確認された。また、物質１の方が比較物質１に比較して若干低い値を示した。
（３）尿タンパク値
糖尿病では尿中へのタンパク質の排泄量が増加する。図１２に示すように、物質１及び比較物質１は、ＳＴＺによる尿中へのタンパク質の漏出を抑制することができ、ＳＴＺ投与後４９日目においては両物質共に陽性対照群に比べ有意にタンパク量を低減した。また、物質１の方が比較物質１に比べ、本病態モデルの早期から効果が発現することが予測される。
（４）抗酸化指標
（４−１）血中ＬＰＯ値
図１３に示すように、物質１群では陽性対照群及び比較物質１群に対して低値傾向が認められた。
（４−２）血中ＴＥＡＣ値
ＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）法は、ある化合物が有する抗酸化活性をアルファ−トコフェロール（α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）誘導体であるトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）の抗酸化能に換算して抗酸化強度を相対評価する方法で、抗酸化指標として一般的に広く使用されている。図１４に示すように、血中の抗酸化活性は、４９日目及び６６日目共に比較物質１と陽性対照は、ほぼ同程度の抗酸化能であったのに対し、物質１投与群では高値を示し、抗酸化能が最も高かった。
［まとめ］
ＳＴＺの低用量頻回投与モデルは、マウスに軽度糖尿病を誘発することができ、高用量単回投与モデルと比較して血糖値における個体間の差も少ないため、糖尿病の予防効果を検討するには利便性の高いモデルであると考えられる。物質１は本糖尿病モデルにおいて、病態進行に伴う血糖値や尿糖値の上昇を抑制することができ、糖尿病予防効果を有することが示された。
ＳＴＺによる糖尿病では、膵臓β細胞内に特異的にラジカルを発生させ、このラジカルによりβ細胞が傷害を受け死に至ることにより、糖尿病が誘導される。物質１及び比較物質１をＳＴＺ投与５日前から与えることにより、体内の抗酸化活性をあらかじめ高めることができ、ＳＴＺによるβ細胞に対する傷害を軽減することができたと推察される。
血中ＬＰＯおよびＴＥＡＣの結果から物質１は血中の抗酸化能を有意に上昇させることが明らかとなった。一酸化窒素や活性酸素等のラジカルがインスリン依存性糖尿病における膵ランゲルハンス島の破壊に関与することは周知の事実であり、これらフリーラジカルの細胞傷害を抑制すると糖尿病が改善されることが、ヒト介入試験により判明されつつある。したがって、物質１は糖尿病予備軍といわれる健常人に対する予防効果、更には初期糖尿病患者に対する病態進展抑制効果を有することが示された。
試験例７：臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験
物質１が他の抗酸化ポリフェノール素材と比較してどの程度の抗酸化能を有しているかを明らかにするために、臭素酸カリウム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験を行った。
［方法］
Ｗｉｓｔａｒラット（雄性、１２週齢）を以下のように群分けした。
陰性対照群：臭素酸カリウム（−）（ｎ＝５）、
陽性対照群：臭素酸カリウム（＋）（ｎ＝５）、
物質１群（ブドウ種子由来）：臭素酸カリウム（＋）＋物質１（ｎ＝５）、
物質５群（松樹皮由来）：臭素酸カリウム（＋）＋物質５（ｎ＝５）、
比較物質２群（カテキン）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質２（ｎ＝５）、
比較物質３群（イチョウ葉抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質３（ｎ＝５）、
比較物質４群（松樹皮抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質４（ｎ＝５）、
比較物質５群（ココア抽出物）：臭素酸カリウム（＋）＋比較物質５（ｎ＝５）。
臭素酸カリウムは６５ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内に単回投与した。物質１、物質５及び各比較物質は臭素酸カリウム投与開始日（０日目）の一週間前（−７日目）から翌日まで１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で毎日一回経口投与した。臭素酸カリウム投与日は臭素酸カリウム投与の前後３０分に投与を行った。−７日目、０日目及び２日目に頸静脈より採血を行い、血中のポリフェノール濃度、過酸化脂質濃度、ＴＥＡＣ、尿素窒素及びクレアチニン濃度を測定した。
［結果］
物質１及び各比較物質の臭素酸カリウム誘発急性腎障害に対する効果は抗酸化作用によるものであることから、抗酸化の指標として血中ポリフェノール濃度、血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）、血中過酸化脂質濃度を、腎障害の病態の指標として血中尿素窒素濃度、血中クレアチニン濃度を調べた。これらの測定結果を図１５〜１９に示す。
（１）抗酸化指標
（１−１）血中ポリフェノール濃度
図１５に示すように、臭素酸カリウム投与前の血中のポリフェノール濃度の初期値は各群とも一定であったが、物質１及び各比較物質を７日間投与した後の臭素酸カリウム投与０日目では物質１群で最も高値を示し、ついで比較物質２群であった。物質１の投与が血中のポリフェノール濃度を上昇させ、その上昇率は各比較物質に比べて有意に高いことが確認された。
（１−２）血中抗酸化能（ＴＥＡＣ）
図１６に示すように、物質１及び各比較物質の一週間の前投与により血中の抗酸化能は上昇傾向を示し、物質１の投与による抗酸化能の上昇は各比較物質投与群に対して有意であった。
（１−３）血中過酸化脂質濃度
物質１及び各比較物質の一週間の前投与は臭素酸カリウム投与による血中過酸化脂質濃度の上昇を抑制した。図１７に示すように、その効果は物質１群で最も高く、各比較物質に対して有意に低い値を示した。
（２）病態指標
（２−１）血中尿素窒素濃度
図１８に示すように、臭素酸カリウムの投与により血中の尿素窒素濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質１及び各比較物質の投与は臭素酸カリウム投与による血中の尿素窒素濃度の上昇を抑制し、物質１の投与による血中尿素窒素濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であった。
（２−２）血中クレアチニン濃度
図１９に示すように、臭素酸カリウムの投与により血中のクレアチニン濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質１及び各比較物質の投与は臭素酸カリウム投与による血中のクレアチニン濃度の上昇を抑制し、物質１の投与による血中クレアチニン濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であった。
［まとめ］
比較物質３、比較物質４及び比較物質５はプロアントシアニジンのポリマー（高分子）が豊富な素材であり、試験管内では高い抗酸化活性を示すが、生体内に摂取された際の抗酸化活性は低分子化された物質１の方が高かった。比較物質２は単量体（カテキン）であるが、やはり物質１の方が活性は高く、血中のポリフェノール量からみても物質１は低分子化されているため生体への吸収に優れ、生体内における抗酸化活性も高いことが示された。物質１の前投与は血中の抗酸化能を高め、抗酸化活性を発揮する。その結果、臭素酸カリウムの投与による血中の過酸化脂質濃度の上昇を抑制し、腎障害を抑制し、血中への尿素窒素、クレアチニンの漏出を抑制した。その効果は各比較物質に比べ有意に高く、これまでに知られている高分子ポリフェノール主体のポリフェノール素材及び単量体（カテキン）よりも生体に摂取された際の抗酸化性に優れることが明らかとなった。
［本発明の物質の安全性］
単回投与毒性試験により、安全性を評価した。すなわち、物質１を体重ｋｇ当り２．５、５．０、７．５、１０．０ｇの投与量で、それぞれ８、７、３、１８匹のｄｄＹ系マウス（９週齢、雄性）に強制経口投与した。投与後の行動変化、死亡例を観察してＬＣ５０を算出した。その結果、物質１の５０％致死濃度（ＬＣ５０）は５．０ｇ／ｋｇ体重であった（９５％信頼限界３．５〜６．４ｇ／ｋｇ体重）。また、投与後の行動の異常や、試験終了時の解剖所見の異常は認められなかった。従って、物質１は食品として極めて安全性の高い物質であることが確認された。
前述の試験例４（ヒトに対するモニター試験）で、アンケート方式で被験者のコメントを収集した。そのうち、睡眠に関するものを表１０に、疲労感、頭の冴え、胃の調子について５段階評価による結果を表１１に示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。
【請求項２】
オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である請求の範囲１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項３】
プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲１に記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項４】
ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される請求の範囲１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項５】
生活習慣病の治療及び／または予防用の医薬組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
老化の予防用の医薬組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
生活習慣病の改善及び／または予防用の健康食品組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
老化の予防用の健康食品組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
請求の範囲１に記載のプロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させて得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
【請求項１０】
オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である請求の範囲９記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
【請求項１１】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の製造方法。
【請求項１２】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法。
【請求項１３】
プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１４】
ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１５】
無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１６】
塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する請求の範囲１５記載の製造方法。
【請求項１７】
式（４）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項１８】
式（５）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項１９】
式（６）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項２０】
式（７）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項２１】
式（８）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項１】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。
【請求項２】
オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である請求の範囲１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項３】
プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲１に記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項４】
ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される請求の範囲１記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物。
【請求項５】
生活習慣病の治療及び／または予防用の医薬組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
老化の予防用の医薬組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
生活習慣病の改善及び／または予防用の健康食品組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
老化の予防用の健康食品組成物である請求の範囲１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
請求の範囲１に記載のプロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と反応させて得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
【請求項１０】
オリゴマーがプロアントシアニジンの２〜５量体である請求の範囲９記載の含硫プロアントシアニジンオリゴマー。
【請求項１１】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物の製造方法。
【請求項１２】
プロアントシアニジン類を含む植物またはその抽出物をＳＨ基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法。
【請求項１３】
プロアントシアニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ・スパイス類、木材・樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１４】
ＳＨ基含有化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、ＳＨ基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも１種から選択される請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１５】
無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする請求の範囲１１または１２記載の製造方法。
【請求項１６】
塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する請求の範囲１５記載の製造方法。
【請求項１７】
式（４）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項１８】
式（５）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項１９】
式（６）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項２０】
式（７）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【請求項２１】
式（８）
で示されるプロアントシアニジン化合物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０３９８８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６４３８（Ｐ２００５−５０６４３８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７４４８
【国際出願日】平成１６年５月２５日（２００４．５．２５）
【出願人】（５９２１９６１５６）株式会社アミノアップ化学 (7)
【出願人】（３０００６８５６８）ウサイエン製薬株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７４４８
【国際出願日】平成１６年５月２５日（２００４．５．２５）
【出願人】（５９２１９６１５６）株式会社アミノアップ化学 (7)
【出願人】（３０００６８５６８）ウサイエン製薬株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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