呼吸器多核体ウイルスによる樹状細胞の寛容誘導
本発明は、単離された抗原提示細胞に、かかる抗原提示細胞を感染させるのに十分な、有効量の呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）又はその一部分を感染させ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を、ＲＳＶ感染抗原提示細胞に接触させることによる、抗原提示細胞を用いた免疫寛容を誘導するための組成物、方法及び系を含む。混合白血球反応により、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４とＣＤ８＋との両方のＴ細胞が寛容原性となっていることがインビトロで測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、免疫細胞寛容の分野、より具体的には、免疫抑制を誘導するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を寛容原性との関連において記載する。Robbins et al.に対して発行された米国特許第６９３６４６８号明細書は、宿主における寛容原性を増進するための寛容原性樹状細胞の使用と、それを作製するための方法を教示している。簡潔に、この方法は、寛容原性哺乳類樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）と、寛容原性ＤＣの産生方法に関する。さらに、本発明の免疫原性哺乳類ＤＣを宿主に投与するステップを含む、宿主における寛容原性を増進するための方法が教示されている。寛容原性ＤＣは、１又は複数のＮＦ−κＢ結合部位を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ，oligodeoxyribonucleotide）を含む。本発明の寛容原性ＤＣは、かかるＤＣ中に存在する場合に寛容原性ＤＣの寛容原性に影響しないウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターをさらに含み得る。宿主における増進された寛容原性は、外来移植片の生存を長引かせるため、及び自己免疫疾患のような炎症関連疾患を治療するために有用である。
【０００３】
Beschornerに対して発行された米国特許第５５９７５６３号明細書は、抗原特異的免疫寛容を誘導する方法を教示している。常在性胸腺抗原提示細胞（ＡＰＣ，antigen presenting cell）の除去（depletion）及び寛容のための抗原を含む新しいＡＰＣを含む胸腺の再増殖により抗原特異的免疫寛容を誘導する方法は、レシピエント動物に、樹状細胞が除去される量の免疫抑制剤を、前記レシピエントの胸腺髄質における樹状細胞の除去のために十分な時間及び条件下で投与するステップと、前記レシピエント動物に、寛容原性量の種内樹状細胞集団を、抗原と組み合わせて、免疫抑制剤と実質的に同時に存在するように投与するステップであって、種内樹状細胞集団が、抗原に対して寛容原性の種内樹状細胞に富み、投与が、前記レシピエントの樹状細胞が除去された胸腺髄質を再増殖させるのに十分な条件下で行われるステップと、胸腺再生剤を、樹状細胞の胸腺への動員を誘導するのに十分な時間及び条件下で投与するステップであって、胸腺再生剤が、免疫抑制剤の後で、かつ樹状細胞の投与と同時又はその後に投与されるステップとを含む。
【０００４】
Thomas, et al.により出願された米国特許出願第２００６０１８２７２６号明細書は、免疫調節組成物、その製造方法及びその使用を教示している。この出願は、プライミングされた免疫応答を含む免疫応答の抗原特異的抑制のための組成物及び方法を開示している。特に、この発明は、そのＣＤ４０若しくはその等価物のレベル及び機能的活性が損なわれたか、妨げられたか又はそうでなければ低減された抗原提示細胞、特に樹状細胞と、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶において発現するものを含む望ましくないか若しくは有害な免疫応答を治療及び／又は予防するためのそれらの使用を開示する。
【０００５】
Leishmanに対して発行された米国特許出願第２００４００７２３４８号明細書は、寛容原性抗原提示細胞を教示している。成熟できないが、Ｔ細胞に対する最初のシグナルを提供でき、しかし同時刺激シグナルを提供できない樹状細胞が調製できる。永続的に未熟な樹状細胞により刺激されるＴ細胞は、よって、アネルギーになり、よって、樹状細胞は、免疫原性というよりは寛容原性である。細胞は、通常、ＣＤ４０−、ＣＤ８０−及びＣＤ８６−であり、この状態を、リポ多糖のような炎症性メディエーターにより刺激された場合も維持する。細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で接着胚幹細胞を培養することにより簡便に調製できる。
【０００６】
最後に、Qianにより出願された米国特許出願第２００４００４３４８３号明細書は、新規な寛容原性樹状細胞及びその治療への使用について教示している。この出願は、寛容原性樹状細胞（ＤＣ）と、組織調製物中でこれらの細胞を濃縮するための方法及び移植片拒絶を予防若しくは最小限にするため又は自己免疫疾患を治療若しくは予防するためにこれらの細胞を用いる方法とに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６９３６４６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５５９７５６３号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００６０１８２７２６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００４００７２３４８号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００４００４３４８３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗原提示細胞を用いて免疫寛容を誘導するための組成物及び方法を含む。ある実施形態において、本発明は、アネルギーの又は寛容化された免疫細胞と、単離された抗原提示細胞に、かかる抗原提示細胞を感染させるのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ，respiratory syncytial virus）又はその一部分を感染させ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を、ＲＳＶ感染抗原提示細胞と接触させることによりそのような細胞を作製するための方法であって、混合白血球反応により、前記ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４とＣＤ８＋との両方のＴ細胞が、寛容原性となっていることがインビトロで測定される方法とを含む。ある態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、末梢血単核細胞、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞又はランゲルハンス細胞である。別の態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、１：１〜１：１００の寛容原性抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である。別の態様において、ＲＳＶ感染細胞は、Ｔ細胞との接触前に固定される。この方法を用いて作られる細胞は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗであるＲＳＶ感染抗原提示細胞であってよい。別の態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、インフルエンザ感染抗原提示細胞と比較した場合に、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導することが見出されている。ＲＳＶ感染抗原提示細胞はＩＬ−１０を分泌し、未処理の抗原提示細胞よりも、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４、ＨＬＡ−Ｇ、ＳＬＡＭ及びＬＡＩＲの発現が増加している。ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、未処理の抗原提示細胞と比較した場合に、ＩＬ−１０、ＬＡＩＲ２、ＳＯＣＳ２、ＰＴＰＮ２、ＩＬＴ−６、ＡＱＰ９、ＰＴＸ３及びＳＬＡＭＦ１の遺伝子発現も増加し得る。
【０００９】
別の実施形態において、寛容化樹状細胞を作製するための方法は、樹状細胞に、有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップを含み、ここで、呼吸器多核体ウイルスは、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を寛容化し、サプレッサーＴ細胞増殖を引き起こし、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する樹状細胞の能力を増加させ、感染した樹状細胞は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。別の態様において、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害は、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、単離された樹状細胞に有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせることにより対象における樹状細胞の抗ウイルス免疫を抑制するための方法であって、呼吸器多核体ウイルスが、患者に再導入されたときに、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ナイーブＴ細胞制御応答を誘導し、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＫＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する樹状細胞の能力を阻害する方法を含む。ある態様において、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害は、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである単離された樹状細胞を含む寛容原性樹状細胞である。寛容原性樹状細胞は、末梢血単核細胞に、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を寛容原性にするのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス又はその一部分を感染させる方法により作製され、かかる寛容原性は、混合白血球反応によりインビトロで測定される。ここで、前記樹状細胞はＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、Ｔ細胞を、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶ又はその一部分に感染した樹状細胞と接触させることにより、寛容原性Ｔ細胞媒介免疫応答を促進する方法である。別の実施形態は、アネルギーＴヘルパー細胞を誘導する方法であって、単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、かかる抗原提示細胞を感染させ、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶと共にインキュベートするステップと、ＲＳＶ感染抗原提示細胞を、Ｔ細胞を寛容化する条件下でＴ細胞と接触させるステップであって、前記寛容化が、混合リンパ球反応によりインビトロで測定されるステップとを含む方法である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、単離された樹状細胞を、かかる樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスと共に、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの細胞表面発現を引き起こす条件下でインキュベートすることにより、単離された寛容原性樹状細胞を作製する方法である。本発明は、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有する単離された寛容原性樹状細胞を含む、哺乳類宿主において寛容原性を増進するためのキットも含む。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、ＡＰＣに、かかる樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスを感染させ、以下の細胞表面マーカー発現ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを引き起こし、それにより寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生成させることにより、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製する方法を含む。哺乳動物対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、哺乳類対象に、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含み、寛容原性樹状細胞が、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有し、細胞が、自己免疫疾患を低減させるか若しくは消失させるか、又はその発生若しくは再発を予防するのに有効な量で投与される方法を用いてもよい。本発明を用いて治療され得る自己免疫疾患の限定しない例として、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、網膜ブドウ膜炎、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、抗原に対する免疫応答を調節する処置を必要とする患者に、単離された寛容化抗原提示細胞を、免疫応答を調節するのに十分な時間及び条件下で投与することにより、抗原に対する免疫応答を調節するための方法であって、抗原特異的抗原提示細胞が、抗原提示細胞を、抗原提示細胞がＴ細胞に対して寛容化するのに十分な時間及び条件下でＲＳＶと接触させることにより作製され、寛容化抗原提示細胞が、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを発現することを特徴とし、寛容化抗原提示細胞が、１：５〜１：１００の寛容化抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である方法を含む。
【００１６】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、ここで、添付の図面に従って本発明の詳細な説明について言及する。添付の図面においては次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】急性ＲＳＶ感染の小児科患者及び健常成人提供者から単離したＰＢＭＣを示す図である。健常提供者のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、フローサイトメトリーにより、ＲＳＶ感染個体又は健常個体からの照射ＰＢＭＣとの共培養の６日後に評価した。
【図１Ｂ】急性感染幼児の鼻粘膜洗浄液からのＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の直接選別により単離されたｍＤＣを示す図である。細胞を、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞と培養し、増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
【図２Ａ】記載されるようにして単離し、１８時間、インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１．０）に曝露したか又は曝露せず、十分に洗浄した血液ｍＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進するそれらの能力を、次いで評価した。
【図２Ｂ】インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）、又はＵＶ照射ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）のいずれかに、３７℃にて２４時間曝露した２×１０＾４細胞のｍＤＣを示す図である。１．５×１０＾５のＣＳＦＥ標識Ｔ細胞を、２．５×１０＾３のインフルエンザ、ＲＳＶ又はＵＶ−ＲＳＶ処理ｍＤＣと６日間インキュベートした。細胞増殖は、ＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図２Ｃ】ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１０又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３又は記載される組合せの存在下で６日間分化したＤＣを示す図である。第６日に、薬剤処理したＤＣを２日間、ＬＰＳの存在下でインキュベートした。第８日に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進するこれらのＤＣの能力を、ＲＳＶ ＤＣに対してチミジンの取り込みにより評価した。
【図２Ｄ】図１に記載されるようにして単離した血液ｍＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞選別により精製し、次いでＣＳＦＥ標識した。１．５×１０５細胞を、１ＭＯＩのインフルエンザ、ＲＳＶ又は対照条件のいずれかに曝露した。細胞を、次いで、３７℃にて６日間、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８マイクロビーズの存在下でインキュベートした。細胞を、次いで、ＣＤ４発現について染色し、増殖をＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図２Ｅ】図１に概説する方法を用いて単離した血液ｍＤＣ（緑色の三角形）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ，plasmacytoid DC）（青色のＸ）を示す図である。細胞に、ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）を、９６ウェルプレート中で接種した。Ｈｅｌａ細胞（赤色のＸ）は、ウイルス複製についての陽性対照であった。細胞の非存在下で培養したＲＳＶ（黄色の丸）は、陰性対照であった。感染性ウイルス粒子産生は、２４時間ごとに７日間評価した。ＲＳＶの新しく融解したバイアル（濃い青色の菱形）を用いて、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０，tissue culture infectious dose）の計算を確認した。
【図２Ｆ】図１に概説する方法を用いて単離した血液ｍＤＣを示す図であり、ＧＭ−ＣＳＦ ＩＬ４培養単球に由来するＤＣを、第６日に単離した（ＧＭ／４ＤＣ）。細胞を、インフルエンザウイルス（ＭＯＩ＝１）又はＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）のいずれかと９６ウェルプレート中で培養した。２４時間後に、細胞生存能を、トリパンブルー染色により評価した。データは、４回の独立した研究の平均及び標準偏差を表す。
【図３Ａ】（パネル１）精製し、ウイルスなし、ＲＳＶ（青色）又はインフルエンザウイルス（赤色）のいずれかに１８時間曝露したｍＤＣを示す図である。１８時間後に、同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないＤＣと、漸増数のＲＳＶ曝露若しくはインフルエンザ曝露ＤＣとともに共培養した。共培養６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した。（パネル２）提供者適合ｍＤＣを用いる５回の独立した研究からの結果を示す図である（ｐ＝０．０３対応ｔ検定）。
【図３Ｂ】図３Ａに記載されるようにして調製したｍＤＣと、直接（青色）又は０．３ｕＭトランスウェルを横切ってのいずれかでｍＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物中に滴定した漸増数の曝露していないＤＣ（丸）又はＲＳＶ曝露（三角）ＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、上記のようにして評価した。
【図３Ｃ】ウイルスなし（対照）、ＲＳＶ又はインフルエンザウイルスのいずれかに１８時間曝露した血液ｍＤＣを示す図である。曝露した樹状細胞を、次いで、室温にて３０分間、CytoChex固定試薬（ＢＤ）を用いて固定し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。ウイルス曝露及び固定の後に、細胞を、イントランスアロ阻害アッセイに用いた。同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないＤＣと、固定しているか若しくは固定していない漸増数のＲＳＶ曝露又はインフルエンザ曝露ＤＣとともに共培養した。共培養の６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図３Ｄ】図１に記載されるようにして調製したＤＣを示す図である。ウイルスにより又は薬理学的に操作した漸増数のＤＣを、ｍＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物に加えた。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、上記のようにして評価した。
【図３Ｅ】インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）又はウイルスなし（対照）と２４時間培養して採集した血液ｍＤＣを示す図である。対照ｍＤＣ（ウイルス曝露なし）を、漸増濃度のインフルエンザ又はＲＳＶ曝露ＤＣのいずれかの存在下で、５．０ｕｇ／ｍｌ抗Ｆタンパク質抗体とともに又は抗体なしでインキュベートし、ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞と１００，０００のＣＤ４＋Ｔ細胞あたり１，２５０の対照ｍＤＣの一定濃度にて共培養した。６日後に、細胞をＣＤ４発現について染色し、増殖をＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図４Ａ】本発明の方法を用いて単離し、インフルエンザ又はＲＳＶのいずれか（ＭＯＩ＝１）と培養したｍＤＣを示す図である。２４時間後に、細胞をＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ８０について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ピンク色のヒストグラムは、同じマーカーについて染色した、曝露していないｍＤＣを表す。緑色のヒストグラムはＲＳＶと培養したｍＤＣを表し、青色のヒストグラムは、インフルエンザと培養したｍＤＣを表す。
【図４Ｂ】１６時間、インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１．０）のいずれかに曝露したか又は曝露せず、その後ＲＮＡを抽出し、標識し、U133 2 plusチップ（Affymetrix社製）にハイブリッド形成させたｍＤＣ（３名の提供者）の結果を示す図である。差分解析を、Gene Spring 6.2ソフトウェアパッケージ（Silicon Genetics社製）を用いて行った。１５プローブの発現パターンは、インフルエンザ若しくはＲＳＶに曝露したか又は曝露しなかったｍＤＣからの寛容原性ＤＣと関連した。
【図４Ｃ】インフルエンザ又はＲＳＶのいずれかへの１８時間の曝露の後にフローサイトメトリーにより評価したＩＴＩＭ受容体及びリガンドの発現を示す図である。
【図４Ｄ】曝露していないｍＤＣに対する３名の提供者のインフルエンザ又はＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）の１８時間後のｍＤＣにおけるＩＦＮラムダ及びＩＦＮアルファファミリーメンバーの発現を示す図である。
【図４Ｅ】図１に記載されるようにして単離した血液ｍＤＣからの結果を示す図である。ＤＣは、３７℃にて２４時間、未処理（対照）、インフルエンザ（ＭＯＩ＝１）で処理、ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）で処理、又はＩＦＮ−アルファ（５００ｐｇ／ｍｌ）とＩＦＮ−ラムダとＩＬ−２９（１又は５ｎｇ／ｍｌ）とで処理した。同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、次いで、各処理のＤＣと３７℃にて６時間共培養した。サイトカイン処理ＤＣの場合、ＩＦＮ−ラムダ、ＩＦＮ−アルファ及びＩＬ−２９の濃度は、Ｔ細胞共培養の間、維持した。共培養の６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した（上のパネル）。組換えＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９の生物活性を、曝露したＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣにおけるＳＴＡＴ−１リン酸化を監視することにより評価した。単球由来ＤＣを、５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９に、それぞれ０、１０、３０及び６０分間曝露した。ＳＴＡＴ−１リン酸化の程度（Ｐ−ＳＴＡＴ１）を、次いで、全細胞可溶化液中で、ウェスタンブロットにより、全ＳＴＡＴ−１タンパク質に対して評価した。５００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−アルファで６０分間処理した単球由来ＤＣは、ＳＴＡＴ−１リン酸化についての陽性対照であった（下のパネル）。
【図５Ａ】１ＭＯＩのインフルエンザ又はＲＳＶのいずれかに１８時間曝露したｍＤＣからの結果を示す図である。細胞培養上清を、ＩＬ−１０Luminex Multiplex Analysisの発現について分析した。データは、１１回の独立した研究の平均及びＳＤを表す。
【図５Ｂ】アイソタイプ対照（パネル１及び３）又はＩＬ−１０及びＩＬ−１０受容体に対する遮断抗体（パネル２及び４）と、ウイルス曝露の３０分前（パネル２）又はＲＳＶ曝露の１８時間後（パネル４）のいずれかにインキュベートしたｍＤＣからの結果を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞アロ増殖を誘導するこれらの細胞の能力を、次いで、評価した（ｎ＝４）。 ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないか又はインフルエンザ若しくはＲＳＶに曝露したｍＤＣのいずれかと培養した。
【図６Ａ】各条件からのＣＤ４＋Ｔ細胞集団（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）の第１及び第２世代を示す図であり、これらは、ＤＣ共培養の５日後に細胞選別により単離された。曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣから選別した１，５００のＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣと５００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。ＣＤ４＋Ｔ細胞アロ増殖を誘導する曝露していないＤＣの能力を、次いで評価した。
【図６Ｂ】３回の独立した研究からのデータを示す図である。
【図６Ｃ】３回の独立した研究からのデータを示す図である。
【図６Ｄ】研究プロセスの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の種々の実施形態を作製して用いることについて以下に詳細に論じるが、本発明は、様々な具体的な状況において具体化できる多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書において論じる具体的な実施形態は、本発明を作製し、用いるための具体的な様式の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものでない。
【００１９】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下において定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する領域における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明において単数で表記されている用語は、単数形の物体にのみ言及することを意図せず、全般的なクラスを含むことを意図し、その具体例は、例示のために用いられ得る。本明細書における専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されることを除いて、本発明を限定しない。
【００２０】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）感染は、誕生して一年目の入院の主な原因である。今回、我々は、幼児における自然感染の経過の間に、ＲＳＶが、樹状細胞（ＤＣ）の抗原提示機能を遮断することを示す。ＲＳＶに曝露されたヒトＤＣは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できず、これらは、ＩＬ−１０を分泌して、阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する。ＲＳＶ曝露ＤＣは、同種Ｔ細胞増殖を、混合白血球反応において、細胞接触依存的機構により阻害する。さらに、ＲＳＶ曝露ＤＣと共培養したナイーブＴ細胞は、制御性Ｔ細胞機能を獲得する。ＲＳＶが、抗ウイルス免疫を、寛容原性表現型及び機能の方向へＤＣ成熟をゆがめることにより抑制することが見出された。
【００２１】
一本鎖ＲＮＡパラミクソウイルスである呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は世界的に、幼児及び若年の子供における主要な呼吸器病原体である。ＲＳＶ感染は、不完全免疫を導く。なぜなら子供は同じ株のウイルスに再感染する場合があり（Henderson,F.W., Collier,A.M., Clyde,W.A., Jr. & Denny,F.W. Respiratory-syncytial-virus infections, reinfections and immunity. A prospective, longitudinal study in young children. N. Engl. J. Med. 300, 530-534 (1979)）、免疫能が正常な成人も、再発ＲＳＶ感染を経験するからである（Zambon,M.C., Stockton,J.D., Clewley,J.P. & Fleming,D.M. Contribution of influenza and respiratory syncytial virus to community cases of influenza-like illness: an observational study. Lancet 358, 1410-1416 (2001)、Hall,C.B., Walsh,E.E., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Immunity to and frequency of reinfection with respiratory syncytial virus. J. Infect. Dis. 163, 693-698 (1991)、Hall,C.B., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Respiratory syncytial virus infections in previously healthy working adults. Clin. Infect. Dis. 33, 792-796 (2001)）。ＲＳＶには急性及び長期の病的状態が伴うので、有効なワクチンが非常に望まれている。残念なことに、ワクチン開発に対する初期の試みは、代わりにＲＳＶに対する感作を導き、これは、適応免疫系に対するＲＳＶの提示が、普通とは異なることを示唆している（Chin,J., Magoffin,R.L., Shearer,L.A., Schieble,J.H. & Lennette,E.H. Field evaluation of a respiratory syncytial virus vaccine and a trivalent parainfluenza virus vaccine in a pediatric population. Am. J. Epidemiol. 89, 449-463 (1969)、Fulginiti,V.A. et al. Respiratory virus immunization. I. A field trial of two inactivated respiratory virus vaccines; an aqueous trivalent parainfluenza virus vaccine and an alum-precipitated respiratory syncytial virus vaccine. Am. J. Epidemiol. 89, 435-448 (1969)、Kapikian,A.Z., Mitchell,R.H., Chanock,R.M., Shvedoff,R.A. & Stewart,C.E. An epidemiologic study of altered clinical reactivity to respiratory syncytial (RS) virus infection in children previously vaccinated with an inactivated RS virus vaccine. Am. J. Epidemiol. 89, 405-421 (1969)）。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、適応免疫応答の発達及び極性化を導く主な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Banchereau,J. & Steinman,R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252 (1998)）。これらの細胞は、ウイルス免疫回避機構の主要な標的でもある（Palucka,K. & Banchereau,J. How dendritic cells and microbes interact to elicit or subvert protective immune responses. Curr. Opin. Immunol. 14, 420-431 (2002)、Tortorella,D., Gewurz,B.E., Furman,M.H., Schust,D.J. & Ploegh,H.L. Viral subversion of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 18, 861-926 (2000)）。ＤＣは、Ｔ細胞アネルギーと制御性Ｔ細胞の生成との両方を誘導することにより、一次免疫応答を誘導し、免疫寛容を制御する独特の能力を有する（Steinman,R.M., Hawiger,D. & Nussenzweig,M.C. Tolerogenic dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 685-711 (2003)）。最初は、未熟ＤＣのみの範囲と理論づけられていたが（Roncarolo,M.G., Levings,M.K. & Traversari,C. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J. Exp. Med. 193, F5-F9 (2001)）、最近の研究は、部分的成熟ＤＣ又は完全成熟ＤＣでさえインビボでの免疫寛容の誘導において中心的な役割を有し得ることを示す（Steinman,R.M. The control of immunity and tolerance by dendritic cell. Pathol Biol (Paris) 51, 59-60 (2003)、Bergwelt-Baildon,M.S. et al. CD25 and indoleamine 2,3-dioxygenase are up-regulated by prostaglandin E2 and expressed by tumor-associated dendritic cells in vivo: additional mechanisms of T-cell inhibition. Blood 108, 228-237 (2006)、Min,S.Y. et al. Antigen-induced, tolerogenic CD11c+,CD11b+ dendritic cells are abundant in Peyer's patches during the induction of oral tolerance to type II collagen and suppress experimental collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 54, 887-898 (2006)、Fujita,S. et al. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response. Blood 107, 3656-3664 (2006)、Moser,M. Dendritic cells in immunity and tolerance-do they display opposite functions? Immunity 19, 5-8 (2003)、Probst,H.C., McCoy,K., Okazaki,T., Honjo,T. & Van Den,B.M. Resting dendritic cells induce peripheral CD8+ T cell tolerance through PD-1 and CTLA-4. Nat. Immunol. 6, 280-286 (2005)）。ＲＳＶに対する保護免疫応答を開始するための正常な個体の限られた能力に導かれて、我々は、急性ウイルス感染の間のＡＰＣの状態を調査し、ＲＳＶ感染に対するＤＣの応答を分析した（Zambon,M.C., Stockton,J.D., Clewley,J.P. & Fleming,D.M. Contribution of influenza and respiratory syncytial virus to community cases of influenza-like illness: an observational study. Lancet 358, 1410-1416 (2001)、Hall,C.B., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Respiratory syncytial virus infections in previously healthy working adults. Clin. Infect. Dis. 33, 792-796 (2001)）。
【００２３】
混合白血球反応。ＰＢＭＣを、急性ＲＳＶ感染小児科患者及び健常成人提供者から、密度遠心分離により単離した。健常「レスポンダー」からのＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、１ｍｌあたり５００ｋの濃度にて６日間、ＲＳＶ患者又は健常提供者のいずれかからの「刺激物質」である照射ＰＢＭＣの多様な濃度とともに培養した。レスポンダーＰＢＭＣ培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激する、ＲＳＶ患者からのＰＢＭＣ対非感染提供者からのＰＢＭＣの能力を、以下の刺激物質：レスポンダーＰＢＭＣの比率にて測定した：０：５００ｋ、１２５：５００ｋ、２５０：５００ｋ、及び５００：５００ｋ。健常レスポンダーＰＢＭＣ内でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、ＲＳＶ感染個体又は健常個体からの照射ＰＢＭＣとの共培養の６日後に、フローサイトメトリーにより（ＣＦＳＥ色素希釈として）評価した。
【００２４】
気道ｍＤＣ。鼻洗浄液試料を、急性ＲＳＶ又はインフルエンザ感染で入院した子供からの鼻咽頭吸引により得た。これらの試料からの細胞を、ＬＩＮＥＡＧＥ−ＦＩＴＣ（抗ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ５６を含むＦＩＴＣコンジュゲート抗体のカクテル）、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ（BD Biosciences社製、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で標識した。ｍＤＣを、次いで、FACS ARIAでの直接選別により、ＬＩＮＥＡＧＥ−ネガティブ、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞として単離した。
【００２５】
血液ｍＤＣ。白血球濃縮血液試料を、地域の血液バンクから得た。ＰＢＭＣを、Ficoll勾配（密度遠心分離）を用いて得た。次いで、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ５６とコンジュゲートした磁気マイクロビーズとインキュベートし、次いで、磁気カラムを通過させた。ネガティブ画分を回収し、ＬＩＮＥＡＧＥ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣについて染色した。染色された細胞を、次いで、FACS ARIA細胞ソーターにて選別した。ｍＤＣは、ＬＩＮＥＡＧＥｎｅｇ、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞と定義した。単離ｍＤＣの純度は、平均で９７％であった。
【００２６】
フローサイトメトリー分析のための細胞染色。ＰＢＭＣ又は精製ｍＤＣを、５マイクロリットルの蛍光色素コンジュゲート抗ヒト抗体と４℃にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。試料を、次いで、FACSCalibur又はFACS ARIAにて獲得し、Cellquestソフトウェア（BD Biosciences社製、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）又はFloJoソフトウェア（Tree Star Inc.社製、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）のいずれかを用いて分析した。以下の蛍光色素コンジュゲート抗ヒト抗体を用いた：ＣＤ８３−ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ−Ｐｅｒ−ＣＰ、ＣＤ８６−Ａｌｅｘａ−４０５、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ及びＣＤ４０−ＰＥ（精製ｍＤＣ研究のため）並びにＣＤ８ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ４−ＡＰＣ（ＰＢＭＣ研究のため）。
【００２７】
ＣＦＳＥ染色。細胞を、０．５ｍｌあたり１〜５百万細胞の濃度にて、１．２５マイクロモルのカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，CarboxyFluoroscein Succinimidyl Ester）中で１０分間インキュベートし、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ヒトＡＢ血清の溶液中で４℃にて洗浄した。遠心分離及び洗浄のステップを２回繰り返し、その後、細胞を１６４０ＲＰＭＩ／１０％ヒトＡＢ血清に再懸濁した。細胞増殖を、染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞上でＣＦＳＥの色素希釈を監視することにより評価した。いくつかの研究において、ＣＦＳＥを用いて、１又は２回分裂したＴ細胞集団を同定した。これらの集団は、その後選別され、本文中に記載されるＴ細胞増殖アッセイにおいて用いた。
【００２８】
ウイルス複製の定量。ＲＳＶ複製を、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の計算により評価した。ＴＣＩＤ５０は、接種された感受性Ｈｅｌａ細胞培養物の５０％が感染する、アッセイ試料の希釈と定義される。簡潔に、ＴＣＩＤ５０の値：−ｍ＝ｌｏｇ１０最初の希釈−［ｐ−０．５］×ｄ。この等式では、ｍは、ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０（同型培養あたりに接種された単位用量あたり）、ｄは、ｌｏｇ１０希釈係数、ｐは、ウイルス感染について陽性のウェルの割合と定義される。
【００２９】
ｍＤＣのインビトロでのウイルス曝露。精製血液ｍＤＣを、１８〜２４時間、２００マイクロリットルあたり２５，０００のｍＤＣの濃度にて、９６ウェルプレート中で、１の感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）にてインフルエンザＡウイルス（Charles Rivers Laboratories社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡからのＡ／ＰＲ／８／３４Ｈ１Ｎ１）又はＲＳＶ Ａ２（ＨｅＬＡ細胞上で生成させ、スクロース勾配により精製）とともに培養した。
【００３０】
寛容原性ＤＣの調製。ＰＢＭＣを、ヒト末梢血からFicoll-Hypaque遠心分離により精製した。単球を、接着により精製し、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４（ＤＣ ＧＭ＋ＩＬ−４）又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍｌ、R&D社製）（ＤＣ ＧＭ＋ＩＬ−１０）又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３（１００ｎＭ、Calbiochem社製））（ＤＣ ＧＭ＋ＶｉｔＤ３）の存在下で６日後にｍｏＤＣに分化させた。第６日に、ＤＣを洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦ若しくはＧＭ−ＣＳＦとデキサメタゾン（１０ｎＭ、Sigma-Aldrich社製）、又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３の存在下で２日間再培養した。ＤＣを２回洗浄し、２５００のＤＣを１０５の同種Ｔリンパ球と、Ｕ底９６ウェルにおいて、５％ＡＢ培地中で５日間培養した（３重）。１ｕＣｉの［３Ｈ］−チミジンを、培養の最後の１８時間加えた。プレートをTomtec Harvester 96上で採集し、増殖をWallac microbeta trilux-uシンチレーションカウンタ（PerkinElmer社製、Ｗｅｌｌｅｓｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で検出した。
【００３１】
ＲＳＶ感染患者からのＡＰＣは、同種Ｔ細胞を活性化しない。抗原提示能力の指標として、ＲＳＶに急性感染した患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進するそれらの能力について（混合白血球反応（ＭＬＲ，mixed leukocyte reaction））、ＣＦＳＥ色素の希釈を評価することにより試験した。図１ａに示すように、急性ＲＳＶ感染に罹患した患者からのＰＢＭＣ（赤色の線）は、２名の健常個体からのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進できなかった。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、健常個体からのＰＢＭＣに曝露された場合に増殖できる（緑色及び青色の線）。ＲＳＶ複製は、上気道にて主に生じるので、我々は、急性感染ＲＳＶ患者の鼻粘膜からＤＣを単離した。精製ＤＣは、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進できなかった（図１ｂの中央のパネル）（Gill,M.A. et al. Mobilization of plasmacytoid and myeloid dendritic cells to mucosal sites in children with respiratory syncytial virus and other viral respiratory infections. J. Infect. Dis. 191, 1105-1115 (2005)）。これとは対照的に、インフルエンザ患者の粘膜から単離されたｍＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲｈｉｇｈ）は、同種Ｔ細胞の強力な刺激物質であった（図１ｂ、左のパネル）。このことは、ＲＳＶに感染した６名の患者及びインフルエンザに感染した３名の患者から単離された細胞を用いて観察された（ｐ＜０．０５）（図１ｂの右のパネル）。これらの患者のうちの１人から、ＲＳＶ感染の消散の１ヶ月後に単離したｍＤＣは、アロ反応性を誘導でき、このことは、ＡＰＣ機能についてのＲＳＶの遮断効果が一過性であることを示唆する（データは示さず）。よって、急性ＲＳＶ感染に罹患した患者からのＤＣを含む抗原提示細胞は、同種抗原を有効に提示しない。
【００３２】
ＲＳＶに曝露した血液ｍＤＣは、アロ反応を誘導できない。ＲＳＶがＤＣの抗原提示能力を変化させる機構を理解するために、一連のインビトロ研究を行った。細胞選別により末梢血から単離されたヒトｍＤＣ（ＣＤ１１ｃ（＋）ＨＬＡ−ＤＲ（＋）ＬＩＮ）を、１８時間、インフルエンザ（インフルエンザ）又は呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のいずれかに曝露した。ＲＳＶ曝露ＤＣ（ＲＳＶ−ＤＣ）は、ＣＳＦＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進できなかったが、インフルエンザ曝露ＤＣは、曝露していないＤＣよりも効果があった（図２Ａ）。増殖の欠如は、ＲＳＶにより誘導されるＴ細胞死が原因ではなかった。なぜなら、ウイルス曝露ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／２８に応答して増殖したからである（図２Ｄ）。ｍＤＣ曝露の前のＵＶ照射は、同種Ｔ細胞刺激の遮断の点でウイルスを失活させ、このことは、ウイルス複製又は非構造タンパク質合成が必要であることを示唆する（図２Ｂ）。感染性粒子産生の分析は、ＲＳＶが初代ヒトＤＣにおいて複製しないことを示した（図２Ｅ）。ＲＳＶによる前記阻害効果は、細胞死が原因ではなかった。なぜなら、初代ｍＤＣの生存能は、曝露細胞及び未処理細胞の間で等しかったからである（図２Ｆ）。インビトロで作製されたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣに対するＲＳＶの効果について矛盾する報告が存在する（Jones,A., Morton,I., Hobson,L., Evans,G.S. & Everard,M.L. Differentiation and immune function of human dendritic cells following infection by respiratory syncytial virus. Clin. Exp. Immunol. 143, 513-522 (2006)、de Graaff,P.M. et al. Respiratory syncytial virus infection of monocyte-derived dendritic cells decreases their capacity to activate CD4 T cells. J. Immunol. 175, 5904-5911 (2005)）。初代ヒトｍＤＣとは異なって、ＲＳＶに曝露された単球由来ＤＣの大部分が２４時間以内に死滅する（図２Ｆ）。
【００３３】
制御機能を有するＤＣを、ＧＭＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下での単球前駆体からのその分化の間に薬理学的操作によりインビトロで作製できると他の者が報告している。ＲＳＶ曝露ＤＣと単球由来ＤＣとの制御活性を比較するために、我々は、ＧＭ−ＣＳＦと、デキサメタゾン（Woltman,A.M. et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur. J. Immunol. 30, 1807-1812 (2000)、Xia,C.Q., Peng,R., Beato,F. & Clare-Salzler,M.J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scand. J. Immunol. 62, 45-54 (2005)）、ＩＬ−１０（Steinbrink,K., Graulich,E., Kubsch,S., Knop,J. & Enk,A.H. CD4(+) and CD8(+) anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity. Blood 99, 2468-2476 (2002)）、１アルファ，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ（３）（ＶｉｔＤ３）（Pedersen,A.E., Gad,M., Walter,M.R. & Claesson,M.H. Induction of regulatory dendritic cells by dexamethasone and 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D(3). Immunol. Lett. 91, 63-69 (2004)）又はそれらの組合せのいずれかとの存在下で後者を作製し、それらを用いて同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。これらの細胞調製物のそれぞれは、ＣＤ１４ｈｉｇｈ及びＤＣ−ＳＩＧＮ陽性であったＧＭ−ＣＳＦ ＩＬ−１０培養ＤＣを除いて、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスII及びマンノース受容体（ＣＤ２０６）並びに低レベルのＣＤ１４を含むＤＣ分化の表現型マーカーを示した（データは示さず）。これらの薬理学的に操作したＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて生成させたＤＣと比較した場合に、ＭＬＲの誘導について効果がより低かった。しかし、全ての場合において、これらのＤＣは、ＲＳＶ−ＤＣと比較した場合に、著しくより高いＭＬＲを誘導した（図２Ｃ）。
【００３４】
ＲＳＶ ＤＣは、ＭＬＲに対する効力のあるサプレッサーである。ＲＳＶ ＤＣが同種Ｔ細胞を刺激できないことに導かれて、我々は、ＲＳＶ曝露ｍＤＣが、曝露されていないｍＤＣがＴ細胞アロ増殖を促進することを阻害するのではないかと考えた。提供者ＡからのＲＳＶ又はインフルエンザのいずれかに曝露した漸増数のｍＤＣを、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣ提供者Ａと提供者Ｂからの１００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。図３Ａのパネル１及び２に示すように（青色の線）、２５〜５０程の少ないＲＳＶ曝露ｍＤＣが、曝露していないｍＤＣにより誘導されるアロ反応を、８５％を超えて阻害したが（パネル３、ｎ＝５ ｐ＜０．０５）、インフルエンザ曝露ＤＣは効果を示さなかった（図３ａパネル１、赤色の線）。興味深いことに、ＲＳＶ感染ＤＣは、関連しない提供者からのＤＣとＴ細胞との間のＭＬＲを遮断できた（データは示さず）。この阻害は、ウイルス曝露ｍＤＣに依存し、培養系におけるＲＳＶの持ち越しが原因ではなかった。なぜなら、遮断抗体をＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）に加えても、ＲＳＶ−ＤＣの阻害能力を妨げることができなかったからである（図３Ｅ）。ＲＳＶ−ＤＣにより誘導されるこのＭＬＲの阻害は、細胞間の直接の接触を必要とした。なぜなら、０．３ｕｍのトランスウェルの上部のチャンバに加えたＲＳＶ−ＤＣは、下部のウェルのアロ増殖応答を阻害しなかったからである（図３Ｂ、青色の線対緑色の線）。さらに、ＲＳＶ−ＤＣは、パラホルムアルデヒド固定の後にそれらの抑制能力を維持した（図３Ｃ）。薬理学的に創製した寛容原性ＤＣのうち、ＶｉｔＤ３及びＶｉｔＤ３デキサメタゾン分化ＤＣのみが、トランスにアロ反応を阻害できたが、それらの阻害能力は、ＲＳＶ−ＤＣのものよりはるかに小さかった（図３Ｄ）。よって、ＲＳＶ ＤＣが、アロ反応性応答の抑制により測定して、最も効力のある寛容原性ＤＣである。
【００３５】
ＲＳＶ ＤＣは、独特の表現型を示す。初期の研究は、低レベルの共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現する寛容原性ＤＣについて記載した（Roncarolo,M.G., Levings,M.K. & Traversari,C. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J. Exp. Med. 193, F5-F9 (2001)、Woltman,A.M. et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur. J. Immunol. 30, 1807-1812 (2000)、Xia,C.Q., Peng,R., Beato,F. & Clare-Salzler,M.J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scand. J. Immunol. 62, 45-54 (2005)、Pedersen,A.E., Gad,M., Walter,M.R. & Claesson,M.H. Induction of regulatory dendritic cells by dexamethasone and 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D(3). Immunol. Lett. 91, 63-69 (2004)）。これとは対照的に、ＲＳＶ−ＤＣは、高レベルのＣＤ８０及びＣＤ８６を発現した（図４Ａ）。ＣＤ４０のレベルは、ＲＳＶ−ＤＣ上でインフルエンザ−ＤＣよりも一貫してより高かったが、ＣＤ８３のレベルはインフルエンザ−ＤＣ上でより高かった（図４Ａ）。これらの結果は、ＲＳＶ曝露の後に観察されたｍＤＣ機能の選択的阻害が、共刺激を提供するそれらの能力の遮断を原因とするのでないことを示す。ＤＣに対するウイルス曝露の影響をさらに理解するために、我々は、ＲＳＶ又はインフルエンザのいずれかに１６時間曝露したｍＤＣのＲＮＡ転写プロファイルを分析した（図４Ｂ）。ＲＳＶ特異的遺伝子発現プロファイリングの著しい特徴は、阻害機能に伴う分子の上方制御であった。これらの分子は、２つの主要なクラス、ＩＴＩＭ含有阻害受容体及び下流変換分子に分けられる。阻害クラスＩ免疫受容体ＩＬＴ４、ＩＬＴ５及びＩＬＴ６は、ＤＣにおける寛容原性機能と関連付けられてきた（Chang,C.C. et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat. Immunol. 3, 237-243 (2002)、Manavalan,J.S. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells. Transpl. Immunol. 11, 245-258 (2003)）。ＩＴＩＭ含有受容体であるＬＡＩＲ１及びＬＡＩＲ２は、ＤＣ分化を阻害する（Poggi,A., Tomasello,E., Ferrero,E., Zocchi,M.R. & Moretta,L. p40/LAIR-1 regulates the differentiation of peripheral blood precursors to dendritic cells induced by granulocyte-monocyte colony-stimulating factor. Eur. J. Immunol. 28, 2086-2091 (1998)）。ＩＴＩＭ含有受容体ＳＬＡＭＦ１は、寛容原性ＤＣ及びＩＬ−１０処理単球において上方制御される（Velten,F.W., Duperrier,K., Bohlender,J., Metharom,P. & Goerdt,S. A gene signature of inhibitory MHC receptors identifies a BDCA3(+) subset of IL-10-induced dendritic cells with reduced allostimulatory capacity in vitro. Eur. J. Immunol. 34, 2800-2811 (2004)、Jung,M. et al. Expression profiling of IL-10-regulated genes in human monocytes and peripheral blood mononuclear cells from psoriatic patients during IL-10 therapy. Eur. J. Immunol. 34, 481-493 (2004)）。サイトカインシグナル伝達のサプレッサーとしてのＳＯＣＳ２は、ＤＣ炎症性サイトカイン産生の負の制御因子である（Machado,F.S. et al. Anti-inflammatory actions of lipoxin A4 and aspirin-triggered lipoxin are SOCS-2 dependent. Nat. Med. 12, 330-334 (2006)）。ＳＴＡＴ３は、ＩＬ−１０受容体シグナル伝達のメディエーターであり、その活性化は、多くのその免疫抑制特性のために必要である（Kortylewski,M. et al. Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity. Nat. Med. 11, 1314-1321 (2005)）。同様に、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＮ２は、炎症性シグナル伝達の重要な負の制御因子である（van Vliet,C. et al. Selective regulation of tumor necrosis factor-induced Erk signaling by Src family kinases and the T cell protein tyrosine phosphatase. Nat. Immunol. 6, 253-260 (2005)）。いくつかのＩＴＩＭ含有阻害受容体及びリガンドの発現は、その後、ＲＳＶ曝露の２４時間後にｍＤＣの表面上で確認された（図４Ｃ）。ＲＳＶ−ＤＣは、表面ＰＤ−Ｌ１の著しく増加した発現を示した。ＰＤ−Ｌ１のＴ細胞認識は、ＩＬ−２産生を阻害し、自己抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞寛容を媒介する（Keir,M.E. et al. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance. J. Exp. Med. 203, 883-895 (2006)、Sharpe,A.H., Wherry,E.J., Ahmed,R. & Freeman,G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nat. Immunol. 8, 239-245 (2007)）。さらに、樹状細胞上へのＰＤ−Ｌ１の結合は、ＤＣ ＩＬ−１０産生を直接誘導することが示されている（Kuipers,H. et al. Contribution of the PD-1 ligands/PD-1 signaling pathway to dendritic cell-mediated CD4+ T cell activation. Eur. J. Immunol. 36, 2472-2482 (2006)、Van Keulen,V.P. et al. Immunomodulation using the recombinant monoclonal human B7-DC cross-linking antibody rHIgM12. Clin. Exp. Immunol. 143, 314-321 (2006)）。興味深いことに、ＲＳＶ曝露は、ＩＬＴ−４及びその高親和性リガンドＨＬＡ−Ｇの両方の発現を誘導した。これらの分子のそれぞれは、ＩＬ−１０誘導性であり、寛容原性樹状細胞機能と関連する（Chang,C.C. et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat. Immunol. 3, 237-243 (2002)、Manavalan,J.S. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells. Transpl. Immunol. 11, 245-258 (2003)、Moreau,P. et al. IL-10 selectively induces HLA-G expression in human trophoblasts and monocytes. Int. Immunol. 11, 803-811 (1999)、Spencer,J.V. et al. Potent immunosuppressive activities of cytomegalovirus-encoded interleukin-10. J. Virol. 76, 1285-1292 (2002)）。
【００３６】
自己分泌ＩＬ−１０は、寛容原性変換に必要である。ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣをＲＳＶにインビトロで曝露することは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９を含むいくつかの潜在的に抑制性の因子を誘導すると報告されている（Chi,B. et al. Alpha and lambda interferon together mediate suppression of CD4 T cells induced by respiratory syncytial virus. J. Virol. 80, 5032-5040 (2006)）。しかし、これらの因子は、ＲＳＶ曝露に応答して初代ヒトｍＤＣにおいて発現されなかった（図４Ｄ）。むしろ、インフルエンザは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９の効力のある誘導因子であり、インフルエンザ曝露ＤＣは、強力なアロ刺激能力を維持した（図４Ｄ）。さらに、これらの因子をアロ増殖アッセイに加えても、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を抑制できなかった（図４Ｅ）。ＩＬ−１０転写（図４Ｂ）及び分泌（図５Ａ）を誘導するインフルエンザでなくＲＳＶの能力に導かれて、我々は、これがｍＤＣの寛容原性変換に関与するかを調査した。ＩＬ−１０受容体シグナル伝達を（ＩＬ−１０及びＩＬ−１０受容体に対する抗体を用いて）アロ増殖アッセイの間に遮断すると、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖をできなかった（図５Ｂパネル４）。しかし、ＩＬ−１０受容体シグナル伝達をウイルス曝露の間に遮断すると、ＲＳＶ曝露ｍＤＣのアロ刺激能力を部分的に回復できる（図５Ｂパネル２）。これらの結果は、ｍＤＣのＲＳＶ媒介成熟の間の自己分泌ＩＬ−１０産生が、寛容原性変換において重要な役割を有することを示す。さらに、これらの結果は、ｍＤＣがウイルスに一旦曝露されると、ＩＬ−１０は、ＲＳＶ−ＤＣアロ阻害効果のためになくてもよいことを示す。
【００３７】
ＲＳＶ曝露ＤＣは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する。曝露されていないｍＤＣにより引き起こされる同種ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害する少数のＲＳＶ曝露ｍＤＣの能力に導かれて、我々は、これらが制御性Ｔ細胞の分化を誘導するのではないかと考えた。ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣのいずれかとともに培養した。制御性Ｔ細胞は、限られた増殖能力を有すると報告されているので、１又は２回しか分裂していない同種ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、ＤＣ共培養の５日後に細胞選別により単離した（Malek,T.R. & Bayer,A.L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004)、Lohr,J., Knoechel,B. & Abbas,A.K. Regulatory T cells in the periphery. Immunol. Rev. 212, 149-162 (2006)）。次に、曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣ共培養物から選別した１，５００のＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣと５００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。図６に示すように、ＲＳＶ曝露ｍＤＣに由来するＴ細胞は、それら自体で、曝露していないｍＤＣにより誘導されるアロ反応を阻害できた。これとは対照的に、曝露していないか又はインフルエンザに曝露したＤＣに由来するＴ細胞は、阻害効果を示さなかった（図６）。つまり、ＲＳＶ曝露ＤＣは、制御性Ｔ細胞の効力のある誘導因子である。
【００３８】
ＤＣとのＲＳＶの相互作用についてのこれらの研究により、ヒトにおけるＲＳＶに対する適応免疫応答がなぜ効果がなく、個体の一生の間になぜ反復感染が生じるのかを説明し得る２つの主な結論が得られる。第１に、ＲＳＶ感染は、自然感染の間にＡＰＣ機能を遮断する。急性ＲＳＶ感染は、血液ＡＰＣの同種抗原提示能力の著しい欠陥をもたらす。感染の部位から単離されたｍＤＣは、同様に、アロ増殖応答を開始できない。我々のインビトロ研究は、患者において観察される免疫抑制が、ＤＣに対するＲＳＶの直接の影響の結果であり得ることを証明する。
【００３９】
これらの研究から導かれる第２の主な結論は、ＲＳＶが、強力な寛容原性機能を生じるようにＤＣを誘導することである。実際に、著しく少ないＲＳＶ−ＤＣがアロ増殖応答をトランスに阻害できる。我々の手のうちでは、この抑制機能は、以前に記載された薬理学的に創製された寛容原性樹状細胞よりも効力がある。制御性Ｔ細胞を誘導するＲＳＶ曝露ｍＤＣの能力は、この阻害シグナルを伝達することにおけるこれらの細胞の役割を示す。実際に、ＲＳＶ−ＤＣ自体を用いる場合と同様に、ＲＳＶ−ＤＣに曝露された非常に少ない（１５００）Ｔ細胞が、１００，０００のＴ細胞を用いて行われるアロ反応を阻害できる。
【００４０】
広く多様な阻害受容体及びリガンドがＲＳＶにより上方制御されるが、寛容原性ＤＣ抑制の機構は明確にされないままである。細胞間の接触の必要性と、固定細胞の阻害能力は、この抑制におけるＩＬ−１０又はＩＦＮ−ラムダのような可溶性阻害因子の直接の役割を排除する。寛容原性ＤＣのＲＳＶにより媒介される誘導は、ＲＳＶ特異的免疫が効果的に生じないことを説明し得る。ＲＳＶは、自己分泌ＩＬ−１０を必要とする機構によりＤＣ成熟をゆがめることにより、寛容原性ＤＣを誘導する。これらのＤＣは、次いで、制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を駆動できる。免疫破壊のこの効果的な機構は、ＲＳＶワクチン設計に対してだけでなく、自己免疫疾患及び臓器移植のような過免疫疾患の治療においても密接な関係を有する。
【００４１】
本明細書で論じられるいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法、キット、試薬又は組成物に関しても実行でき、またその逆も同じであると考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００４２】
本明細書に記載される具体的な実施形態は、例示のために示され、本発明の限定として示されるのでないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の実施形態において用いることができる。当業者は、日常的なものを超える実験を行うことなく、本明細書に記載される特定の手順の多数の等価物を認識するか、又は確認できる。このような等価物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲によりカバーされる。
【００４３】
本明細書で言及する全ての出版物及び特許出願は、本発明が関する当かかる技術における当業者のレベルを示す。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個別の出版物又は特許出願が、参照により組み込まれると具体的にかつ個別に記載されているのと同程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」とともに用いる場合の単数表記の使用は、「１つ（one）」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１及び１より多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、それが選択肢のみ及び「及び／又は」に言及するという定義を開示が支持しても、選択肢のみに言及すると明記するか、又は選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するために用いられる。本出願をとおして、用語「約」は、値が、値を決定するために用いた装置、方法についての固有の誤差の変動、又は研究対象のうちに存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００４５】
本明細書及び特許請求の範囲において用いる場合、語句「含んでいる（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」のような含んでいる（comprising）の任意の形）、「有している（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」のような有している（having）の任意の形）、「含んでいる（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」のような含んでいる（including）の任意の形）、又は「含有している（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」のような含有している（containing）の任意の形）は、包括的又は拡張可能であり、追加の明記されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「又はそれらの組合せ」とは、この用語に先行する列挙された項目の全ての順列及び組合せに言及する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、もし特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例の続きとして、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１若しくは複数の項目又は用語の反復を含む組合せも明確に含まれる。当業者は、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組合せの項目又は用語の数に制限がないことを理解する。
【００４７】
本明細書に開示され、請求される組成物及び／又は方法の全ては、本発明の開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製して実行できる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の点で記載されているが、組成物及び／又は方法並びに本明細書に記載される方法のステップ又はステップの順序を、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、変動し得ることが当業者に明らかである。当業者にとって明らかな全てのこのような類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の精神、範囲及び概念内であるとみなされる。
【００４８】
（参考文献）
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、免疫細胞寛容の分野、より具体的には、免疫抑制を誘導するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を寛容原性との関連において記載する。Robbins et al.に対して発行された米国特許第６９３６４６８号明細書は、宿主における寛容原性を増進するための寛容原性樹状細胞の使用と、それを作製するための方法を教示している。簡潔に、この方法は、寛容原性哺乳類樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）と、寛容原性ＤＣの産生方法に関する。さらに、本発明の免疫原性哺乳類ＤＣを宿主に投与するステップを含む、宿主における寛容原性を増進するための方法が教示されている。寛容原性ＤＣは、１又は複数のＮＦ−κＢ結合部位を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ，oligodeoxyribonucleotide）を含む。本発明の寛容原性ＤＣは、かかるＤＣ中に存在する場合に寛容原性ＤＣの寛容原性に影響しないウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターをさらに含み得る。宿主における増進された寛容原性は、外来移植片の生存を長引かせるため、及び自己免疫疾患のような炎症関連疾患を治療するために有用である。
【０００３】
Beschornerに対して発行された米国特許第５５９７５６３号明細書は、抗原特異的免疫寛容を誘導する方法を教示している。常在性胸腺抗原提示細胞（ＡＰＣ，antigen presenting cell）の除去（depletion）及び寛容のための抗原を含む新しいＡＰＣを含む胸腺の再増殖により抗原特異的免疫寛容を誘導する方法は、レシピエント動物に、樹状細胞が除去される量の免疫抑制剤を、前記レシピエントの胸腺髄質における樹状細胞の除去のために十分な時間及び条件下で投与するステップと、前記レシピエント動物に、寛容原性量の種内樹状細胞集団を、抗原と組み合わせて、免疫抑制剤と実質的に同時に存在するように投与するステップであって、種内樹状細胞集団が、抗原に対して寛容原性の種内樹状細胞に富み、投与が、前記レシピエントの樹状細胞が除去された胸腺髄質を再増殖させるのに十分な条件下で行われるステップと、胸腺再生剤を、樹状細胞の胸腺への動員を誘導するのに十分な時間及び条件下で投与するステップであって、胸腺再生剤が、免疫抑制剤の後で、かつ樹状細胞の投与と同時又はその後に投与されるステップとを含む。
【０００４】
Thomas, et al.により出願された米国特許出願第２００６０１８２７２６号明細書は、免疫調節組成物、その製造方法及びその使用を教示している。この出願は、プライミングされた免疫応答を含む免疫応答の抗原特異的抑制のための組成物及び方法を開示している。特に、この発明は、そのＣＤ４０若しくはその等価物のレベル及び機能的活性が損なわれたか、妨げられたか又はそうでなければ低減された抗原提示細胞、特に樹状細胞と、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶において発現するものを含む望ましくないか若しくは有害な免疫応答を治療及び／又は予防するためのそれらの使用を開示する。
【０００５】
Leishmanに対して発行された米国特許出願第２００４００７２３４８号明細書は、寛容原性抗原提示細胞を教示している。成熟できないが、Ｔ細胞に対する最初のシグナルを提供でき、しかし同時刺激シグナルを提供できない樹状細胞が調製できる。永続的に未熟な樹状細胞により刺激されるＴ細胞は、よって、アネルギーになり、よって、樹状細胞は、免疫原性というよりは寛容原性である。細胞は、通常、ＣＤ４０−、ＣＤ８０−及びＣＤ８６−であり、この状態を、リポ多糖のような炎症性メディエーターにより刺激された場合も維持する。細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で接着胚幹細胞を培養することにより簡便に調製できる。
【０００６】
最後に、Qianにより出願された米国特許出願第２００４００４３４８３号明細書は、新規な寛容原性樹状細胞及びその治療への使用について教示している。この出願は、寛容原性樹状細胞（ＤＣ）と、組織調製物中でこれらの細胞を濃縮するための方法及び移植片拒絶を予防若しくは最小限にするため又は自己免疫疾患を治療若しくは予防するためにこれらの細胞を用いる方法とに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６９３６４６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５５９７５６３号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００６０１８２７２６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００４００７２３４８号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００４００４３４８３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗原提示細胞を用いて免疫寛容を誘導するための組成物及び方法を含む。ある実施形態において、本発明は、アネルギーの又は寛容化された免疫細胞と、単離された抗原提示細胞に、かかる抗原提示細胞を感染させるのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ，respiratory syncytial virus）又はその一部分を感染させ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を、ＲＳＶ感染抗原提示細胞と接触させることによりそのような細胞を作製するための方法であって、混合白血球反応により、前記ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４とＣＤ８＋との両方のＴ細胞が、寛容原性となっていることがインビトロで測定される方法とを含む。ある態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、末梢血単核細胞、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞又はランゲルハンス細胞である。別の態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、１：１〜１：１００の寛容原性抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である。別の態様において、ＲＳＶ感染細胞は、Ｔ細胞との接触前に固定される。この方法を用いて作られる細胞は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗであるＲＳＶ感染抗原提示細胞であってよい。別の態様において、ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、インフルエンザ感染抗原提示細胞と比較した場合に、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導することが見出されている。ＲＳＶ感染抗原提示細胞はＩＬ−１０を分泌し、未処理の抗原提示細胞よりも、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４、ＨＬＡ−Ｇ、ＳＬＡＭ及びＬＡＩＲの発現が増加している。ＲＳＶ感染抗原提示細胞は、未処理の抗原提示細胞と比較した場合に、ＩＬ−１０、ＬＡＩＲ２、ＳＯＣＳ２、ＰＴＰＮ２、ＩＬＴ−６、ＡＱＰ９、ＰＴＸ３及びＳＬＡＭＦ１の遺伝子発現も増加し得る。
【０００９】
別の実施形態において、寛容化樹状細胞を作製するための方法は、樹状細胞に、有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップを含み、ここで、呼吸器多核体ウイルスは、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を寛容化し、サプレッサーＴ細胞増殖を引き起こし、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する樹状細胞の能力を増加させ、感染した樹状細胞は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。別の態様において、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害は、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、単離された樹状細胞に有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせることにより対象における樹状細胞の抗ウイルス免疫を抑制するための方法であって、呼吸器多核体ウイルスが、患者に再導入されたときに、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ナイーブＴ細胞制御応答を誘導し、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＫＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する樹状細胞の能力を阻害する方法を含む。ある態様において、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害は、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである単離された樹状細胞を含む寛容原性樹状細胞である。寛容原性樹状細胞は、末梢血単核細胞に、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を寛容原性にするのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス又はその一部分を感染させる方法により作製され、かかる寛容原性は、混合白血球反応によりインビトロで測定される。ここで、前記樹状細胞はＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、Ｔ細胞を、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶ又はその一部分に感染した樹状細胞と接触させることにより、寛容原性Ｔ細胞媒介免疫応答を促進する方法である。別の実施形態は、アネルギーＴヘルパー細胞を誘導する方法であって、単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、かかる抗原提示細胞を感染させ、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶと共にインキュベートするステップと、ＲＳＶ感染抗原提示細胞を、Ｔ細胞を寛容化する条件下でＴ細胞と接触させるステップであって、前記寛容化が、混合リンパ球反応によりインビトロで測定されるステップとを含む方法である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、単離された樹状細胞を、かかる樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスと共に、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの細胞表面発現を引き起こす条件下でインキュベートすることにより、単離された寛容原性樹状細胞を作製する方法である。本発明は、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有する単離された寛容原性樹状細胞を含む、哺乳類宿主において寛容原性を増進するためのキットも含む。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、ＡＰＣに、かかる樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスを感染させ、以下の細胞表面マーカー発現ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを引き起こし、それにより寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生成させることにより、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製する方法を含む。哺乳動物対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、哺乳類対象に、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含み、寛容原性樹状細胞が、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有し、細胞が、自己免疫疾患を低減させるか若しくは消失させるか、又はその発生若しくは再発を予防するのに有効な量で投与される方法を用いてもよい。本発明を用いて治療され得る自己免疫疾患の限定しない例として、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、網膜ブドウ膜炎、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、抗原に対する免疫応答を調節する処置を必要とする患者に、単離された寛容化抗原提示細胞を、免疫応答を調節するのに十分な時間及び条件下で投与することにより、抗原に対する免疫応答を調節するための方法であって、抗原特異的抗原提示細胞が、抗原提示細胞を、抗原提示細胞がＴ細胞に対して寛容化するのに十分な時間及び条件下でＲＳＶと接触させることにより作製され、寛容化抗原提示細胞が、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを発現することを特徴とし、寛容化抗原提示細胞が、１：５〜１：１００の寛容化抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である方法を含む。
【００１６】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、ここで、添付の図面に従って本発明の詳細な説明について言及する。添付の図面においては次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】急性ＲＳＶ感染の小児科患者及び健常成人提供者から単離したＰＢＭＣを示す図である。健常提供者のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、フローサイトメトリーにより、ＲＳＶ感染個体又は健常個体からの照射ＰＢＭＣとの共培養の６日後に評価した。
【図１Ｂ】急性感染幼児の鼻粘膜洗浄液からのＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の直接選別により単離されたｍＤＣを示す図である。細胞を、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞と培養し、増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
【図２Ａ】記載されるようにして単離し、１８時間、インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１．０）に曝露したか又は曝露せず、十分に洗浄した血液ｍＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進するそれらの能力を、次いで評価した。
【図２Ｂ】インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）、又はＵＶ照射ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）のいずれかに、３７℃にて２４時間曝露した２×１０＾４細胞のｍＤＣを示す図である。１．５×１０＾５のＣＳＦＥ標識Ｔ細胞を、２．５×１０＾３のインフルエンザ、ＲＳＶ又はＵＶ−ＲＳＶ処理ｍＤＣと６日間インキュベートした。細胞増殖は、ＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図２Ｃ】ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１０又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３又は記載される組合せの存在下で６日間分化したＤＣを示す図である。第６日に、薬剤処理したＤＣを２日間、ＬＰＳの存在下でインキュベートした。第８日に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進するこれらのＤＣの能力を、ＲＳＶ ＤＣに対してチミジンの取り込みにより評価した。
【図２Ｄ】図１に記載されるようにして単離した血液ｍＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞選別により精製し、次いでＣＳＦＥ標識した。１．５×１０５細胞を、１ＭＯＩのインフルエンザ、ＲＳＶ又は対照条件のいずれかに曝露した。細胞を、次いで、３７℃にて６日間、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８マイクロビーズの存在下でインキュベートした。細胞を、次いで、ＣＤ４発現について染色し、増殖をＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図２Ｅ】図１に概説する方法を用いて単離した血液ｍＤＣ（緑色の三角形）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ，plasmacytoid DC）（青色のＸ）を示す図である。細胞に、ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）を、９６ウェルプレート中で接種した。Ｈｅｌａ細胞（赤色のＸ）は、ウイルス複製についての陽性対照であった。細胞の非存在下で培養したＲＳＶ（黄色の丸）は、陰性対照であった。感染性ウイルス粒子産生は、２４時間ごとに７日間評価した。ＲＳＶの新しく融解したバイアル（濃い青色の菱形）を用いて、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０，tissue culture infectious dose）の計算を確認した。
【図２Ｆ】図１に概説する方法を用いて単離した血液ｍＤＣを示す図であり、ＧＭ−ＣＳＦ ＩＬ４培養単球に由来するＤＣを、第６日に単離した（ＧＭ／４ＤＣ）。細胞を、インフルエンザウイルス（ＭＯＩ＝１）又はＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）のいずれかと９６ウェルプレート中で培養した。２４時間後に、細胞生存能を、トリパンブルー染色により評価した。データは、４回の独立した研究の平均及び標準偏差を表す。
【図３Ａ】（パネル１）精製し、ウイルスなし、ＲＳＶ（青色）又はインフルエンザウイルス（赤色）のいずれかに１８時間曝露したｍＤＣを示す図である。１８時間後に、同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないＤＣと、漸増数のＲＳＶ曝露若しくはインフルエンザ曝露ＤＣとともに共培養した。共培養６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した。（パネル２）提供者適合ｍＤＣを用いる５回の独立した研究からの結果を示す図である（ｐ＝０．０３対応ｔ検定）。
【図３Ｂ】図３Ａに記載されるようにして調製したｍＤＣと、直接（青色）又は０．３ｕＭトランスウェルを横切ってのいずれかでｍＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物中に滴定した漸増数の曝露していないＤＣ（丸）又はＲＳＶ曝露（三角）ＤＣを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、上記のようにして評価した。
【図３Ｃ】ウイルスなし（対照）、ＲＳＶ又はインフルエンザウイルスのいずれかに１８時間曝露した血液ｍＤＣを示す図である。曝露した樹状細胞を、次いで、室温にて３０分間、CytoChex固定試薬（ＢＤ）を用いて固定し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。ウイルス曝露及び固定の後に、細胞を、イントランスアロ阻害アッセイに用いた。同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないＤＣと、固定しているか若しくは固定していない漸増数のＲＳＶ曝露又はインフルエンザ曝露ＤＣとともに共培養した。共培養の６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図３Ｄ】図１に記載されるようにして調製したＤＣを示す図である。ウイルスにより又は薬理学的に操作した漸増数のＤＣを、ｍＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物に加えた。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、上記のようにして評価した。
【図３Ｅ】インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）又はウイルスなし（対照）と２４時間培養して採集した血液ｍＤＣを示す図である。対照ｍＤＣ（ウイルス曝露なし）を、漸増濃度のインフルエンザ又はＲＳＶ曝露ＤＣのいずれかの存在下で、５．０ｕｇ／ｍｌ抗Ｆタンパク質抗体とともに又は抗体なしでインキュベートし、ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞と１００，０００のＣＤ４＋Ｔ細胞あたり１，２５０の対照ｍＤＣの一定濃度にて共培養した。６日後に、細胞をＣＤ４発現について染色し、増殖をＣＦＳＥ色素希釈により評価した。
【図４Ａ】本発明の方法を用いて単離し、インフルエンザ又はＲＳＶのいずれか（ＭＯＩ＝１）と培養したｍＤＣを示す図である。２４時間後に、細胞をＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ８０について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ピンク色のヒストグラムは、同じマーカーについて染色した、曝露していないｍＤＣを表す。緑色のヒストグラムはＲＳＶと培養したｍＤＣを表し、青色のヒストグラムは、インフルエンザと培養したｍＤＣを表す。
【図４Ｂ】１６時間、インフルエンザ若しくはＲＳＶ（ＭＯＩ＝１．０）のいずれかに曝露したか又は曝露せず、その後ＲＮＡを抽出し、標識し、U133 2 plusチップ（Affymetrix社製）にハイブリッド形成させたｍＤＣ（３名の提供者）の結果を示す図である。差分解析を、Gene Spring 6.2ソフトウェアパッケージ（Silicon Genetics社製）を用いて行った。１５プローブの発現パターンは、インフルエンザ若しくはＲＳＶに曝露したか又は曝露しなかったｍＤＣからの寛容原性ＤＣと関連した。
【図４Ｃ】インフルエンザ又はＲＳＶのいずれかへの１８時間の曝露の後にフローサイトメトリーにより評価したＩＴＩＭ受容体及びリガンドの発現を示す図である。
【図４Ｄ】曝露していないｍＤＣに対する３名の提供者のインフルエンザ又はＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）の１８時間後のｍＤＣにおけるＩＦＮラムダ及びＩＦＮアルファファミリーメンバーの発現を示す図である。
【図４Ｅ】図１に記載されるようにして単離した血液ｍＤＣからの結果を示す図である。ＤＣは、３７℃にて２４時間、未処理（対照）、インフルエンザ（ＭＯＩ＝１）で処理、ＲＳＶ（ＭＯＩ＝１）で処理、又はＩＦＮ−アルファ（５００ｐｇ／ｍｌ）とＩＦＮ−ラムダとＩＬ−２９（１又は５ｎｇ／ｍｌ）とで処理した。同種ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を、次いで、各処理のＤＣと３７℃にて６時間共培養した。サイトカイン処理ＤＣの場合、ＩＦＮ−ラムダ、ＩＦＮ−アルファ及びＩＬ−２９の濃度は、Ｔ細胞共培養の間、維持した。共培養の６日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーにより評価した（上のパネル）。組換えＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９の生物活性を、曝露したＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣにおけるＳＴＡＴ−１リン酸化を監視することにより評価した。単球由来ＤＣを、５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９に、それぞれ０、１０、３０及び６０分間曝露した。ＳＴＡＴ−１リン酸化の程度（Ｐ−ＳＴＡＴ１）を、次いで、全細胞可溶化液中で、ウェスタンブロットにより、全ＳＴＡＴ−１タンパク質に対して評価した。５００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−アルファで６０分間処理した単球由来ＤＣは、ＳＴＡＴ−１リン酸化についての陽性対照であった（下のパネル）。
【図５Ａ】１ＭＯＩのインフルエンザ又はＲＳＶのいずれかに１８時間曝露したｍＤＣからの結果を示す図である。細胞培養上清を、ＩＬ−１０Luminex Multiplex Analysisの発現について分析した。データは、１１回の独立した研究の平均及びＳＤを表す。
【図５Ｂ】アイソタイプ対照（パネル１及び３）又はＩＬ−１０及びＩＬ−１０受容体に対する遮断抗体（パネル２及び４）と、ウイルス曝露の３０分前（パネル２）又はＲＳＶ曝露の１８時間後（パネル４）のいずれかにインキュベートしたｍＤＣからの結果を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞アロ増殖を誘導するこれらの細胞の能力を、次いで、評価した（ｎ＝４）。 ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を、曝露していないか又はインフルエンザ若しくはＲＳＶに曝露したｍＤＣのいずれかと培養した。
【図６Ａ】各条件からのＣＤ４＋Ｔ細胞集団（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）の第１及び第２世代を示す図であり、これらは、ＤＣ共培養の５日後に細胞選別により単離された。曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣから選別した１，５００のＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣと５００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。ＣＤ４＋Ｔ細胞アロ増殖を誘導する曝露していないＤＣの能力を、次いで評価した。
【図６Ｂ】３回の独立した研究からのデータを示す図である。
【図６Ｃ】３回の独立した研究からのデータを示す図である。
【図６Ｄ】研究プロセスの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の種々の実施形態を作製して用いることについて以下に詳細に論じるが、本発明は、様々な具体的な状況において具体化できる多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書において論じる具体的な実施形態は、本発明を作製し、用いるための具体的な様式の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものでない。
【００１９】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下において定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する領域における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明において単数で表記されている用語は、単数形の物体にのみ言及することを意図せず、全般的なクラスを含むことを意図し、その具体例は、例示のために用いられ得る。本明細書における専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されることを除いて、本発明を限定しない。
【００２０】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）感染は、誕生して一年目の入院の主な原因である。今回、我々は、幼児における自然感染の経過の間に、ＲＳＶが、樹状細胞（ＤＣ）の抗原提示機能を遮断することを示す。ＲＳＶに曝露されたヒトＤＣは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できず、これらは、ＩＬ−１０を分泌して、阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する。ＲＳＶ曝露ＤＣは、同種Ｔ細胞増殖を、混合白血球反応において、細胞接触依存的機構により阻害する。さらに、ＲＳＶ曝露ＤＣと共培養したナイーブＴ細胞は、制御性Ｔ細胞機能を獲得する。ＲＳＶが、抗ウイルス免疫を、寛容原性表現型及び機能の方向へＤＣ成熟をゆがめることにより抑制することが見出された。
【００２１】
一本鎖ＲＮＡパラミクソウイルスである呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は世界的に、幼児及び若年の子供における主要な呼吸器病原体である。ＲＳＶ感染は、不完全免疫を導く。なぜなら子供は同じ株のウイルスに再感染する場合があり（Henderson,F.W., Collier,A.M., Clyde,W.A., Jr. & Denny,F.W. Respiratory-syncytial-virus infections, reinfections and immunity. A prospective, longitudinal study in young children. N. Engl. J. Med. 300, 530-534 (1979)）、免疫能が正常な成人も、再発ＲＳＶ感染を経験するからである（Zambon,M.C., Stockton,J.D., Clewley,J.P. & Fleming,D.M. Contribution of influenza and respiratory syncytial virus to community cases of influenza-like illness: an observational study. Lancet 358, 1410-1416 (2001)、Hall,C.B., Walsh,E.E., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Immunity to and frequency of reinfection with respiratory syncytial virus. J. Infect. Dis. 163, 693-698 (1991)、Hall,C.B., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Respiratory syncytial virus infections in previously healthy working adults. Clin. Infect. Dis. 33, 792-796 (2001)）。ＲＳＶには急性及び長期の病的状態が伴うので、有効なワクチンが非常に望まれている。残念なことに、ワクチン開発に対する初期の試みは、代わりにＲＳＶに対する感作を導き、これは、適応免疫系に対するＲＳＶの提示が、普通とは異なることを示唆している（Chin,J., Magoffin,R.L., Shearer,L.A., Schieble,J.H. & Lennette,E.H. Field evaluation of a respiratory syncytial virus vaccine and a trivalent parainfluenza virus vaccine in a pediatric population. Am. J. Epidemiol. 89, 449-463 (1969)、Fulginiti,V.A. et al. Respiratory virus immunization. I. A field trial of two inactivated respiratory virus vaccines; an aqueous trivalent parainfluenza virus vaccine and an alum-precipitated respiratory syncytial virus vaccine. Am. J. Epidemiol. 89, 435-448 (1969)、Kapikian,A.Z., Mitchell,R.H., Chanock,R.M., Shvedoff,R.A. & Stewart,C.E. An epidemiologic study of altered clinical reactivity to respiratory syncytial (RS) virus infection in children previously vaccinated with an inactivated RS virus vaccine. Am. J. Epidemiol. 89, 405-421 (1969)）。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、適応免疫応答の発達及び極性化を導く主な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Banchereau,J. & Steinman,R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252 (1998)）。これらの細胞は、ウイルス免疫回避機構の主要な標的でもある（Palucka,K. & Banchereau,J. How dendritic cells and microbes interact to elicit or subvert protective immune responses. Curr. Opin. Immunol. 14, 420-431 (2002)、Tortorella,D., Gewurz,B.E., Furman,M.H., Schust,D.J. & Ploegh,H.L. Viral subversion of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 18, 861-926 (2000)）。ＤＣは、Ｔ細胞アネルギーと制御性Ｔ細胞の生成との両方を誘導することにより、一次免疫応答を誘導し、免疫寛容を制御する独特の能力を有する（Steinman,R.M., Hawiger,D. & Nussenzweig,M.C. Tolerogenic dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 685-711 (2003)）。最初は、未熟ＤＣのみの範囲と理論づけられていたが（Roncarolo,M.G., Levings,M.K. & Traversari,C. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J. Exp. Med. 193, F5-F9 (2001)）、最近の研究は、部分的成熟ＤＣ又は完全成熟ＤＣでさえインビボでの免疫寛容の誘導において中心的な役割を有し得ることを示す（Steinman,R.M. The control of immunity and tolerance by dendritic cell. Pathol Biol (Paris) 51, 59-60 (2003)、Bergwelt-Baildon,M.S. et al. CD25 and indoleamine 2,3-dioxygenase are up-regulated by prostaglandin E2 and expressed by tumor-associated dendritic cells in vivo: additional mechanisms of T-cell inhibition. Blood 108, 228-237 (2006)、Min,S.Y. et al. Antigen-induced, tolerogenic CD11c+,CD11b+ dendritic cells are abundant in Peyer's patches during the induction of oral tolerance to type II collagen and suppress experimental collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 54, 887-898 (2006)、Fujita,S. et al. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response. Blood 107, 3656-3664 (2006)、Moser,M. Dendritic cells in immunity and tolerance-do they display opposite functions? Immunity 19, 5-8 (2003)、Probst,H.C., McCoy,K., Okazaki,T., Honjo,T. & Van Den,B.M. Resting dendritic cells induce peripheral CD8+ T cell tolerance through PD-1 and CTLA-4. Nat. Immunol. 6, 280-286 (2005)）。ＲＳＶに対する保護免疫応答を開始するための正常な個体の限られた能力に導かれて、我々は、急性ウイルス感染の間のＡＰＣの状態を調査し、ＲＳＶ感染に対するＤＣの応答を分析した（Zambon,M.C., Stockton,J.D., Clewley,J.P. & Fleming,D.M. Contribution of influenza and respiratory syncytial virus to community cases of influenza-like illness: an observational study. Lancet 358, 1410-1416 (2001)、Hall,C.B., Long,C.E. & Schnabel,K.C. Respiratory syncytial virus infections in previously healthy working adults. Clin. Infect. Dis. 33, 792-796 (2001)）。
【００２３】
混合白血球反応。ＰＢＭＣを、急性ＲＳＶ感染小児科患者及び健常成人提供者から、密度遠心分離により単離した。健常「レスポンダー」からのＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、１ｍｌあたり５００ｋの濃度にて６日間、ＲＳＶ患者又は健常提供者のいずれかからの「刺激物質」である照射ＰＢＭＣの多様な濃度とともに培養した。レスポンダーＰＢＭＣ培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激する、ＲＳＶ患者からのＰＢＭＣ対非感染提供者からのＰＢＭＣの能力を、以下の刺激物質：レスポンダーＰＢＭＣの比率にて測定した：０：５００ｋ、１２５：５００ｋ、２５０：５００ｋ、及び５００：５００ｋ。健常レスポンダーＰＢＭＣ内でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、ＲＳＶ感染個体又は健常個体からの照射ＰＢＭＣとの共培養の６日後に、フローサイトメトリーにより（ＣＦＳＥ色素希釈として）評価した。
【００２４】
気道ｍＤＣ。鼻洗浄液試料を、急性ＲＳＶ又はインフルエンザ感染で入院した子供からの鼻咽頭吸引により得た。これらの試料からの細胞を、ＬＩＮＥＡＧＥ−ＦＩＴＣ（抗ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ５６を含むＦＩＴＣコンジュゲート抗体のカクテル）、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ（BD Biosciences社製、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で標識した。ｍＤＣを、次いで、FACS ARIAでの直接選別により、ＬＩＮＥＡＧＥ−ネガティブ、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞として単離した。
【００２５】
血液ｍＤＣ。白血球濃縮血液試料を、地域の血液バンクから得た。ＰＢＭＣを、Ficoll勾配（密度遠心分離）を用いて得た。次いで、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ５６とコンジュゲートした磁気マイクロビーズとインキュベートし、次いで、磁気カラムを通過させた。ネガティブ画分を回収し、ＬＩＮＥＡＧＥ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣについて染色した。染色された細胞を、次いで、FACS ARIA細胞ソーターにて選別した。ｍＤＣは、ＬＩＮＥＡＧＥｎｅｇ、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞と定義した。単離ｍＤＣの純度は、平均で９７％であった。
【００２６】
フローサイトメトリー分析のための細胞染色。ＰＢＭＣ又は精製ｍＤＣを、５マイクロリットルの蛍光色素コンジュゲート抗ヒト抗体と４℃にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。試料を、次いで、FACSCalibur又はFACS ARIAにて獲得し、Cellquestソフトウェア（BD Biosciences社製、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）又はFloJoソフトウェア（Tree Star Inc.社製、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）のいずれかを用いて分析した。以下の蛍光色素コンジュゲート抗ヒト抗体を用いた：ＣＤ８３−ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ−Ｐｅｒ−ＣＰ、ＣＤ８６−Ａｌｅｘａ−４０５、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ及びＣＤ４０−ＰＥ（精製ｍＤＣ研究のため）並びにＣＤ８ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ４−ＡＰＣ（ＰＢＭＣ研究のため）。
【００２７】
ＣＦＳＥ染色。細胞を、０．５ｍｌあたり１〜５百万細胞の濃度にて、１．２５マイクロモルのカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，CarboxyFluoroscein Succinimidyl Ester）中で１０分間インキュベートし、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ヒトＡＢ血清の溶液中で４℃にて洗浄した。遠心分離及び洗浄のステップを２回繰り返し、その後、細胞を１６４０ＲＰＭＩ／１０％ヒトＡＢ血清に再懸濁した。細胞増殖を、染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞上でＣＦＳＥの色素希釈を監視することにより評価した。いくつかの研究において、ＣＦＳＥを用いて、１又は２回分裂したＴ細胞集団を同定した。これらの集団は、その後選別され、本文中に記載されるＴ細胞増殖アッセイにおいて用いた。
【００２８】
ウイルス複製の定量。ＲＳＶ複製を、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の計算により評価した。ＴＣＩＤ５０は、接種された感受性Ｈｅｌａ細胞培養物の５０％が感染する、アッセイ試料の希釈と定義される。簡潔に、ＴＣＩＤ５０の値：−ｍ＝ｌｏｇ１０最初の希釈−［ｐ−０．５］×ｄ。この等式では、ｍは、ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０（同型培養あたりに接種された単位用量あたり）、ｄは、ｌｏｇ１０希釈係数、ｐは、ウイルス感染について陽性のウェルの割合と定義される。
【００２９】
ｍＤＣのインビトロでのウイルス曝露。精製血液ｍＤＣを、１８〜２４時間、２００マイクロリットルあたり２５，０００のｍＤＣの濃度にて、９６ウェルプレート中で、１の感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）にてインフルエンザＡウイルス（Charles Rivers Laboratories社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡからのＡ／ＰＲ／８／３４Ｈ１Ｎ１）又はＲＳＶ Ａ２（ＨｅＬＡ細胞上で生成させ、スクロース勾配により精製）とともに培養した。
【００３０】
寛容原性ＤＣの調製。ＰＢＭＣを、ヒト末梢血からFicoll-Hypaque遠心分離により精製した。単球を、接着により精製し、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４（ＤＣ ＧＭ＋ＩＬ−４）又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍｌ、R&D社製）（ＤＣ ＧＭ＋ＩＬ−１０）又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３（１００ｎＭ、Calbiochem社製））（ＤＣ ＧＭ＋ＶｉｔＤ３）の存在下で６日後にｍｏＤＣに分化させた。第６日に、ＤＣを洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦ若しくはＧＭ−ＣＳＦとデキサメタゾン（１０ｎＭ、Sigma-Aldrich社製）、又はＧＭ−ＣＳＦとビタミンＤ３の存在下で２日間再培養した。ＤＣを２回洗浄し、２５００のＤＣを１０５の同種Ｔリンパ球と、Ｕ底９６ウェルにおいて、５％ＡＢ培地中で５日間培養した（３重）。１ｕＣｉの［３Ｈ］−チミジンを、培養の最後の１８時間加えた。プレートをTomtec Harvester 96上で採集し、増殖をWallac microbeta trilux-uシンチレーションカウンタ（PerkinElmer社製、Ｗｅｌｌｅｓｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で検出した。
【００３１】
ＲＳＶ感染患者からのＡＰＣは、同種Ｔ細胞を活性化しない。抗原提示能力の指標として、ＲＳＶに急性感染した患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進するそれらの能力について（混合白血球反応（ＭＬＲ，mixed leukocyte reaction））、ＣＦＳＥ色素の希釈を評価することにより試験した。図１ａに示すように、急性ＲＳＶ感染に罹患した患者からのＰＢＭＣ（赤色の線）は、２名の健常個体からのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進できなかった。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、健常個体からのＰＢＭＣに曝露された場合に増殖できる（緑色及び青色の線）。ＲＳＶ複製は、上気道にて主に生じるので、我々は、急性感染ＲＳＶ患者の鼻粘膜からＤＣを単離した。精製ＤＣは、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進できなかった（図１ｂの中央のパネル）（Gill,M.A. et al. Mobilization of plasmacytoid and myeloid dendritic cells to mucosal sites in children with respiratory syncytial virus and other viral respiratory infections. J. Infect. Dis. 191, 1105-1115 (2005)）。これとは対照的に、インフルエンザ患者の粘膜から単離されたｍＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲｈｉｇｈ）は、同種Ｔ細胞の強力な刺激物質であった（図１ｂ、左のパネル）。このことは、ＲＳＶに感染した６名の患者及びインフルエンザに感染した３名の患者から単離された細胞を用いて観察された（ｐ＜０．０５）（図１ｂの右のパネル）。これらの患者のうちの１人から、ＲＳＶ感染の消散の１ヶ月後に単離したｍＤＣは、アロ反応性を誘導でき、このことは、ＡＰＣ機能についてのＲＳＶの遮断効果が一過性であることを示唆する（データは示さず）。よって、急性ＲＳＶ感染に罹患した患者からのＤＣを含む抗原提示細胞は、同種抗原を有効に提示しない。
【００３２】
ＲＳＶに曝露した血液ｍＤＣは、アロ反応を誘導できない。ＲＳＶがＤＣの抗原提示能力を変化させる機構を理解するために、一連のインビトロ研究を行った。細胞選別により末梢血から単離されたヒトｍＤＣ（ＣＤ１１ｃ（＋）ＨＬＡ−ＤＲ（＋）ＬＩＮ）を、１８時間、インフルエンザ（インフルエンザ）又は呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のいずれかに曝露した。ＲＳＶ曝露ＤＣ（ＲＳＶ−ＤＣ）は、ＣＳＦＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進できなかったが、インフルエンザ曝露ＤＣは、曝露していないＤＣよりも効果があった（図２Ａ）。増殖の欠如は、ＲＳＶにより誘導されるＴ細胞死が原因ではなかった。なぜなら、ウイルス曝露ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／２８に応答して増殖したからである（図２Ｄ）。ｍＤＣ曝露の前のＵＶ照射は、同種Ｔ細胞刺激の遮断の点でウイルスを失活させ、このことは、ウイルス複製又は非構造タンパク質合成が必要であることを示唆する（図２Ｂ）。感染性粒子産生の分析は、ＲＳＶが初代ヒトＤＣにおいて複製しないことを示した（図２Ｅ）。ＲＳＶによる前記阻害効果は、細胞死が原因ではなかった。なぜなら、初代ｍＤＣの生存能は、曝露細胞及び未処理細胞の間で等しかったからである（図２Ｆ）。インビトロで作製されたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣに対するＲＳＶの効果について矛盾する報告が存在する（Jones,A., Morton,I., Hobson,L., Evans,G.S. & Everard,M.L. Differentiation and immune function of human dendritic cells following infection by respiratory syncytial virus. Clin. Exp. Immunol. 143, 513-522 (2006)、de Graaff,P.M. et al. Respiratory syncytial virus infection of monocyte-derived dendritic cells decreases their capacity to activate CD4 T cells. J. Immunol. 175, 5904-5911 (2005)）。初代ヒトｍＤＣとは異なって、ＲＳＶに曝露された単球由来ＤＣの大部分が２４時間以内に死滅する（図２Ｆ）。
【００３３】
制御機能を有するＤＣを、ＧＭＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下での単球前駆体からのその分化の間に薬理学的操作によりインビトロで作製できると他の者が報告している。ＲＳＶ曝露ＤＣと単球由来ＤＣとの制御活性を比較するために、我々は、ＧＭ−ＣＳＦと、デキサメタゾン（Woltman,A.M. et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur. J. Immunol. 30, 1807-1812 (2000)、Xia,C.Q., Peng,R., Beato,F. & Clare-Salzler,M.J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scand. J. Immunol. 62, 45-54 (2005)）、ＩＬ−１０（Steinbrink,K., Graulich,E., Kubsch,S., Knop,J. & Enk,A.H. CD4(+) and CD8(+) anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity. Blood 99, 2468-2476 (2002)）、１アルファ，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ（３）（ＶｉｔＤ３）（Pedersen,A.E., Gad,M., Walter,M.R. & Claesson,M.H. Induction of regulatory dendritic cells by dexamethasone and 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D(3). Immunol. Lett. 91, 63-69 (2004)）又はそれらの組合せのいずれかとの存在下で後者を作製し、それらを用いて同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。これらの細胞調製物のそれぞれは、ＣＤ１４ｈｉｇｈ及びＤＣ−ＳＩＧＮ陽性であったＧＭ−ＣＳＦ ＩＬ−１０培養ＤＣを除いて、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスII及びマンノース受容体（ＣＤ２０６）並びに低レベルのＣＤ１４を含むＤＣ分化の表現型マーカーを示した（データは示さず）。これらの薬理学的に操作したＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて生成させたＤＣと比較した場合に、ＭＬＲの誘導について効果がより低かった。しかし、全ての場合において、これらのＤＣは、ＲＳＶ−ＤＣと比較した場合に、著しくより高いＭＬＲを誘導した（図２Ｃ）。
【００３４】
ＲＳＶ ＤＣは、ＭＬＲに対する効力のあるサプレッサーである。ＲＳＶ ＤＣが同種Ｔ細胞を刺激できないことに導かれて、我々は、ＲＳＶ曝露ｍＤＣが、曝露されていないｍＤＣがＴ細胞アロ増殖を促進することを阻害するのではないかと考えた。提供者ＡからのＲＳＶ又はインフルエンザのいずれかに曝露した漸増数のｍＤＣを、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣ提供者Ａと提供者Ｂからの１００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。図３Ａのパネル１及び２に示すように（青色の線）、２５〜５０程の少ないＲＳＶ曝露ｍＤＣが、曝露していないｍＤＣにより誘導されるアロ反応を、８５％を超えて阻害したが（パネル３、ｎ＝５ ｐ＜０．０５）、インフルエンザ曝露ＤＣは効果を示さなかった（図３ａパネル１、赤色の線）。興味深いことに、ＲＳＶ感染ＤＣは、関連しない提供者からのＤＣとＴ細胞との間のＭＬＲを遮断できた（データは示さず）。この阻害は、ウイルス曝露ｍＤＣに依存し、培養系におけるＲＳＶの持ち越しが原因ではなかった。なぜなら、遮断抗体をＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）に加えても、ＲＳＶ−ＤＣの阻害能力を妨げることができなかったからである（図３Ｅ）。ＲＳＶ−ＤＣにより誘導されるこのＭＬＲの阻害は、細胞間の直接の接触を必要とした。なぜなら、０．３ｕｍのトランスウェルの上部のチャンバに加えたＲＳＶ−ＤＣは、下部のウェルのアロ増殖応答を阻害しなかったからである（図３Ｂ、青色の線対緑色の線）。さらに、ＲＳＶ−ＤＣは、パラホルムアルデヒド固定の後にそれらの抑制能力を維持した（図３Ｃ）。薬理学的に創製した寛容原性ＤＣのうち、ＶｉｔＤ３及びＶｉｔＤ３デキサメタゾン分化ＤＣのみが、トランスにアロ反応を阻害できたが、それらの阻害能力は、ＲＳＶ−ＤＣのものよりはるかに小さかった（図３Ｄ）。よって、ＲＳＶ ＤＣが、アロ反応性応答の抑制により測定して、最も効力のある寛容原性ＤＣである。
【００３５】
ＲＳＶ ＤＣは、独特の表現型を示す。初期の研究は、低レベルの共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現する寛容原性ＤＣについて記載した（Roncarolo,M.G., Levings,M.K. & Traversari,C. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J. Exp. Med. 193, F5-F9 (2001)、Woltman,A.M. et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur. J. Immunol. 30, 1807-1812 (2000)、Xia,C.Q., Peng,R., Beato,F. & Clare-Salzler,M.J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scand. J. Immunol. 62, 45-54 (2005)、Pedersen,A.E., Gad,M., Walter,M.R. & Claesson,M.H. Induction of regulatory dendritic cells by dexamethasone and 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D(3). Immunol. Lett. 91, 63-69 (2004)）。これとは対照的に、ＲＳＶ−ＤＣは、高レベルのＣＤ８０及びＣＤ８６を発現した（図４Ａ）。ＣＤ４０のレベルは、ＲＳＶ−ＤＣ上でインフルエンザ−ＤＣよりも一貫してより高かったが、ＣＤ８３のレベルはインフルエンザ−ＤＣ上でより高かった（図４Ａ）。これらの結果は、ＲＳＶ曝露の後に観察されたｍＤＣ機能の選択的阻害が、共刺激を提供するそれらの能力の遮断を原因とするのでないことを示す。ＤＣに対するウイルス曝露の影響をさらに理解するために、我々は、ＲＳＶ又はインフルエンザのいずれかに１６時間曝露したｍＤＣのＲＮＡ転写プロファイルを分析した（図４Ｂ）。ＲＳＶ特異的遺伝子発現プロファイリングの著しい特徴は、阻害機能に伴う分子の上方制御であった。これらの分子は、２つの主要なクラス、ＩＴＩＭ含有阻害受容体及び下流変換分子に分けられる。阻害クラスＩ免疫受容体ＩＬＴ４、ＩＬＴ５及びＩＬＴ６は、ＤＣにおける寛容原性機能と関連付けられてきた（Chang,C.C. et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat. Immunol. 3, 237-243 (2002)、Manavalan,J.S. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells. Transpl. Immunol. 11, 245-258 (2003)）。ＩＴＩＭ含有受容体であるＬＡＩＲ１及びＬＡＩＲ２は、ＤＣ分化を阻害する（Poggi,A., Tomasello,E., Ferrero,E., Zocchi,M.R. & Moretta,L. p40/LAIR-1 regulates the differentiation of peripheral blood precursors to dendritic cells induced by granulocyte-monocyte colony-stimulating factor. Eur. J. Immunol. 28, 2086-2091 (1998)）。ＩＴＩＭ含有受容体ＳＬＡＭＦ１は、寛容原性ＤＣ及びＩＬ−１０処理単球において上方制御される（Velten,F.W., Duperrier,K., Bohlender,J., Metharom,P. & Goerdt,S. A gene signature of inhibitory MHC receptors identifies a BDCA3(+) subset of IL-10-induced dendritic cells with reduced allostimulatory capacity in vitro. Eur. J. Immunol. 34, 2800-2811 (2004)、Jung,M. et al. Expression profiling of IL-10-regulated genes in human monocytes and peripheral blood mononuclear cells from psoriatic patients during IL-10 therapy. Eur. J. Immunol. 34, 481-493 (2004)）。サイトカインシグナル伝達のサプレッサーとしてのＳＯＣＳ２は、ＤＣ炎症性サイトカイン産生の負の制御因子である（Machado,F.S. et al. Anti-inflammatory actions of lipoxin A4 and aspirin-triggered lipoxin are SOCS-2 dependent. Nat. Med. 12, 330-334 (2006)）。ＳＴＡＴ３は、ＩＬ−１０受容体シグナル伝達のメディエーターであり、その活性化は、多くのその免疫抑制特性のために必要である（Kortylewski,M. et al. Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity. Nat. Med. 11, 1314-1321 (2005)）。同様に、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＮ２は、炎症性シグナル伝達の重要な負の制御因子である（van Vliet,C. et al. Selective regulation of tumor necrosis factor-induced Erk signaling by Src family kinases and the T cell protein tyrosine phosphatase. Nat. Immunol. 6, 253-260 (2005)）。いくつかのＩＴＩＭ含有阻害受容体及びリガンドの発現は、その後、ＲＳＶ曝露の２４時間後にｍＤＣの表面上で確認された（図４Ｃ）。ＲＳＶ−ＤＣは、表面ＰＤ−Ｌ１の著しく増加した発現を示した。ＰＤ−Ｌ１のＴ細胞認識は、ＩＬ−２産生を阻害し、自己抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞寛容を媒介する（Keir,M.E. et al. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance. J. Exp. Med. 203, 883-895 (2006)、Sharpe,A.H., Wherry,E.J., Ahmed,R. & Freeman,G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nat. Immunol. 8, 239-245 (2007)）。さらに、樹状細胞上へのＰＤ−Ｌ１の結合は、ＤＣ ＩＬ−１０産生を直接誘導することが示されている（Kuipers,H. et al. Contribution of the PD-1 ligands/PD-1 signaling pathway to dendritic cell-mediated CD4+ T cell activation. Eur. J. Immunol. 36, 2472-2482 (2006)、Van Keulen,V.P. et al. Immunomodulation using the recombinant monoclonal human B7-DC cross-linking antibody rHIgM12. Clin. Exp. Immunol. 143, 314-321 (2006)）。興味深いことに、ＲＳＶ曝露は、ＩＬＴ−４及びその高親和性リガンドＨＬＡ−Ｇの両方の発現を誘導した。これらの分子のそれぞれは、ＩＬ−１０誘導性であり、寛容原性樹状細胞機能と関連する（Chang,C.C. et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat. Immunol. 3, 237-243 (2002)、Manavalan,J.S. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells. Transpl. Immunol. 11, 245-258 (2003)、Moreau,P. et al. IL-10 selectively induces HLA-G expression in human trophoblasts and monocytes. Int. Immunol. 11, 803-811 (1999)、Spencer,J.V. et al. Potent immunosuppressive activities of cytomegalovirus-encoded interleukin-10. J. Virol. 76, 1285-1292 (2002)）。
【００３６】
自己分泌ＩＬ−１０は、寛容原性変換に必要である。ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４単球由来ＤＣをＲＳＶにインビトロで曝露することは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９を含むいくつかの潜在的に抑制性の因子を誘導すると報告されている（Chi,B. et al. Alpha and lambda interferon together mediate suppression of CD4 T cells induced by respiratory syncytial virus. J. Virol. 80, 5032-5040 (2006)）。しかし、これらの因子は、ＲＳＶ曝露に応答して初代ヒトｍＤＣにおいて発現されなかった（図４Ｄ）。むしろ、インフルエンザは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ及びＩＬ−２９の効力のある誘導因子であり、インフルエンザ曝露ＤＣは、強力なアロ刺激能力を維持した（図４Ｄ）。さらに、これらの因子をアロ増殖アッセイに加えても、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を抑制できなかった（図４Ｅ）。ＩＬ−１０転写（図４Ｂ）及び分泌（図５Ａ）を誘導するインフルエンザでなくＲＳＶの能力に導かれて、我々は、これがｍＤＣの寛容原性変換に関与するかを調査した。ＩＬ−１０受容体シグナル伝達を（ＩＬ−１０及びＩＬ−１０受容体に対する抗体を用いて）アロ増殖アッセイの間に遮断すると、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖をできなかった（図５Ｂパネル４）。しかし、ＩＬ−１０受容体シグナル伝達をウイルス曝露の間に遮断すると、ＲＳＶ曝露ｍＤＣのアロ刺激能力を部分的に回復できる（図５Ｂパネル２）。これらの結果は、ｍＤＣのＲＳＶ媒介成熟の間の自己分泌ＩＬ−１０産生が、寛容原性変換において重要な役割を有することを示す。さらに、これらの結果は、ｍＤＣがウイルスに一旦曝露されると、ＩＬ−１０は、ＲＳＶ−ＤＣアロ阻害効果のためになくてもよいことを示す。
【００３７】
ＲＳＶ曝露ＤＣは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する。曝露されていないｍＤＣにより引き起こされる同種ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害する少数のＲＳＶ曝露ｍＤＣの能力に導かれて、我々は、これらが制御性Ｔ細胞の分化を誘導するのではないかと考えた。ＣＦＳＥ標識同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣのいずれかとともに培養した。制御性Ｔ細胞は、限られた増殖能力を有すると報告されているので、１又は２回しか分裂していない同種ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、ＤＣ共培養の５日後に細胞選別により単離した（Malek,T.R. & Bayer,A.L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004)、Lohr,J., Knoechel,B. & Abbas,A.K. Regulatory T cells in the periphery. Immunol. Rev. 212, 149-162 (2006)）。次に、曝露していないか、インフルエンザ又はＲＳＶに曝露したｍＤＣ共培養物から選別した１，５００のＣＤ４＋Ｔ細胞を、よって、１，２５０の曝露していないｍＤＣと５００，０００の標識ＣＤ４＋Ｔ細胞とからなるＭＬＲに加えた。図６に示すように、ＲＳＶ曝露ｍＤＣに由来するＴ細胞は、それら自体で、曝露していないｍＤＣにより誘導されるアロ反応を阻害できた。これとは対照的に、曝露していないか又はインフルエンザに曝露したＤＣに由来するＴ細胞は、阻害効果を示さなかった（図６）。つまり、ＲＳＶ曝露ＤＣは、制御性Ｔ細胞の効力のある誘導因子である。
【００３８】
ＤＣとのＲＳＶの相互作用についてのこれらの研究により、ヒトにおけるＲＳＶに対する適応免疫応答がなぜ効果がなく、個体の一生の間になぜ反復感染が生じるのかを説明し得る２つの主な結論が得られる。第１に、ＲＳＶ感染は、自然感染の間にＡＰＣ機能を遮断する。急性ＲＳＶ感染は、血液ＡＰＣの同種抗原提示能力の著しい欠陥をもたらす。感染の部位から単離されたｍＤＣは、同様に、アロ増殖応答を開始できない。我々のインビトロ研究は、患者において観察される免疫抑制が、ＤＣに対するＲＳＶの直接の影響の結果であり得ることを証明する。
【００３９】
これらの研究から導かれる第２の主な結論は、ＲＳＶが、強力な寛容原性機能を生じるようにＤＣを誘導することである。実際に、著しく少ないＲＳＶ−ＤＣがアロ増殖応答をトランスに阻害できる。我々の手のうちでは、この抑制機能は、以前に記載された薬理学的に創製された寛容原性樹状細胞よりも効力がある。制御性Ｔ細胞を誘導するＲＳＶ曝露ｍＤＣの能力は、この阻害シグナルを伝達することにおけるこれらの細胞の役割を示す。実際に、ＲＳＶ−ＤＣ自体を用いる場合と同様に、ＲＳＶ−ＤＣに曝露された非常に少ない（１５００）Ｔ細胞が、１００，０００のＴ細胞を用いて行われるアロ反応を阻害できる。
【００４０】
広く多様な阻害受容体及びリガンドがＲＳＶにより上方制御されるが、寛容原性ＤＣ抑制の機構は明確にされないままである。細胞間の接触の必要性と、固定細胞の阻害能力は、この抑制におけるＩＬ−１０又はＩＦＮ−ラムダのような可溶性阻害因子の直接の役割を排除する。寛容原性ＤＣのＲＳＶにより媒介される誘導は、ＲＳＶ特異的免疫が効果的に生じないことを説明し得る。ＲＳＶは、自己分泌ＩＬ−１０を必要とする機構によりＤＣ成熟をゆがめることにより、寛容原性ＤＣを誘導する。これらのＤＣは、次いで、制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を駆動できる。免疫破壊のこの効果的な機構は、ＲＳＶワクチン設計に対してだけでなく、自己免疫疾患及び臓器移植のような過免疫疾患の治療においても密接な関係を有する。
【００４１】
本明細書で論じられるいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法、キット、試薬又は組成物に関しても実行でき、またその逆も同じであると考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００４２】
本明細書に記載される具体的な実施形態は、例示のために示され、本発明の限定として示されるのでないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の実施形態において用いることができる。当業者は、日常的なものを超える実験を行うことなく、本明細書に記載される特定の手順の多数の等価物を認識するか、又は確認できる。このような等価物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲によりカバーされる。
【００４３】
本明細書で言及する全ての出版物及び特許出願は、本発明が関する当かかる技術における当業者のレベルを示す。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個別の出版物又は特許出願が、参照により組み込まれると具体的にかつ個別に記載されているのと同程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」とともに用いる場合の単数表記の使用は、「１つ（one）」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１及び１より多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、それが選択肢のみ及び「及び／又は」に言及するという定義を開示が支持しても、選択肢のみに言及すると明記するか、又は選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するために用いられる。本出願をとおして、用語「約」は、値が、値を決定するために用いた装置、方法についての固有の誤差の変動、又は研究対象のうちに存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００４５】
本明細書及び特許請求の範囲において用いる場合、語句「含んでいる（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」のような含んでいる（comprising）の任意の形）、「有している（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」のような有している（having）の任意の形）、「含んでいる（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」のような含んでいる（including）の任意の形）、又は「含有している（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」のような含有している（containing）の任意の形）は、包括的又は拡張可能であり、追加の明記されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「又はそれらの組合せ」とは、この用語に先行する列挙された項目の全ての順列及び組合せに言及する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、もし特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例の続きとして、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１若しくは複数の項目又は用語の反復を含む組合せも明確に含まれる。当業者は、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組合せの項目又は用語の数に制限がないことを理解する。
【００４７】
本明細書に開示され、請求される組成物及び／又は方法の全ては、本発明の開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製して実行できる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の点で記載されているが、組成物及び／又は方法並びに本明細書に記載される方法のステップ又はステップの順序を、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、変動し得ることが当業者に明らかである。当業者にとって明らかな全てのこのような類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の精神、範囲及び概念内であるとみなされる。
【００４８】
（参考文献）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞を用いて免疫寛容を誘導するための方法であって、
単離された抗原提示細胞に、該抗原提示細胞を感染させるのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）又はその一部分を感染させるステップと、
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を、ＲＳＶ感染抗原提示細胞と接触させるステップであって、混合白血球反応により、前記ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４とＣＤ８＋との両方のＴ細胞が寛容原性となっていることがインビトロで測定されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、末梢血単核細胞、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞又はランゲルハンス細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、１：１〜１：１００の寛容原性抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＳＶ感染細胞が、Ｔ細胞との接触前に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、インフルエンザ感染抗原提示細胞と比較した場合に、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、ＩＬ−１０を分泌し、未処理の抗原提示細胞よりも、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４、ＨＬＡ−Ｇ、ＳＬＡＭ及びＬＡＩＲの発現が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、未処理の抗原提示細胞と比較した場合に、ＩＬ−１０、ＬＡＩＲ２、ＳＯＣＳ２、ＰＴＰＮ２、ＩＬＴ−６、ＡＱＰ９、ＰＴＸ３及びＳＬＡＭＦ１の遺伝子発現が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
寛容化樹状細胞を作製するための方法であって、
樹状細胞に、有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップであって、呼吸器多核体ウイルスが、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を寛容化し、サプレッサーＴ細胞増殖を引き起こし、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する前記樹状細胞の能力を増加させ、感染した樹状細胞が、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗであるステップ
を含む方法。
【請求項１１】
同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害が、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象における樹状細胞の抗ウイルス免疫を抑制するための方法であって、
単離された樹状細胞に有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップであって、呼吸器多核体ウイルスが、患者に再導入されたときに、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ナイーブＴ細胞制御応答を誘導し、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＫＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する前記樹状細胞の能力を阻害するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害が、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである単離された樹状細胞を含む寛容原性樹状細胞。
【請求項１５】
末梢血単核細胞に、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を寛容原性にするのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス又はその一部分を感染させ、混合白血球反応により、前記寛容原性がインビトロで測定される方法により作製される寛容原性樹状細胞であって、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである樹状細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞を、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶ又はその一部分に感染した樹状細胞と接触させることにより、寛容原性Ｔ細胞媒介免疫応答を促進する方法。
【請求項１７】
アネルギーＴヘルパー細胞を誘導する方法であって、
単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、該抗原提示細胞を感染させ、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶとインキュベートするステップと、
ＲＳＶ感染抗原提示細胞を、Ｔ細胞を寛容化する条件下でＴ細胞と接触させるステップであって、前記寛容化が、混合リンパ球反応においてインビトロで測定されるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
単離された寛容原性樹状細胞を作製する方法であって、
単離された樹状細胞を、該樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスと、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの細胞表面発現を引き起こす条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１９】
ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有する単離された寛容原性樹状細胞を含む、哺乳動物宿主において寛容原性を増進させるためのキット。
【請求項２０】
寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製する方法であって、
ＡＰＣに、樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスを感染させるステップと、
以下の細胞表面マーカー発現ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを引き起こし、それにより寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
哺乳動物対象における自己免疫疾患を治療するための方法であって、哺乳動物対象に、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含み、前記寛容原性樹状細胞が、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有し、前記細胞が、自己免疫疾患を低減させるか若しくは消失させるか、又はその発生若しくは再発を予防するのに有効な量で投与される方法。
【請求項２２】
自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、網膜ブドウ膜炎、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗原に対する免疫応答を調節するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、単離された寛容化抗原提示細胞を、免疫応答を調節するのに十分な時間及び条件下で投与するステップを含み、抗原特異的抗原提示細胞が、前記抗原提示細胞を、該抗原提示細胞がＴ細胞に対して寛容化するのに十分な時間及び条件下でＲＳＶと接触させることにより作製され、寛容化抗原提示細胞が、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを発現することを特徴とし、前記寛容化抗原提示細胞が、１：５〜１：１００の寛容化抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である方法。
【請求項１】
抗原提示細胞を用いて免疫寛容を誘導するための方法であって、
単離された抗原提示細胞に、該抗原提示細胞を感染させるのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）又はその一部分を感染させるステップと、
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を、ＲＳＶ感染抗原提示細胞と接触させるステップであって、混合白血球反応により、前記ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４とＣＤ８＋との両方のＴ細胞が寛容原性となっていることがインビトロで測定されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、末梢血単核細胞、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞又はランゲルハンス細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、１：１〜１：１００の寛容原性抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＳＶ感染細胞が、Ｔ細胞との接触前に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、インフルエンザ感染抗原提示細胞と比較した場合に、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、ＩＬ−１０を分泌し、未処理の抗原提示細胞よりも、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４、ＨＬＡ−Ｇ、ＳＬＡＭ及びＬＡＩＲの発現が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＳＶ感染抗原提示細胞が、未処理の抗原提示細胞と比較した場合に、ＩＬ−１０、ＬＡＩＲ２、ＳＯＣＳ２、ＰＴＰＮ２、ＩＬＴ−６、ＡＱＰ９、ＰＴＸ３及びＳＬＡＭＦ１の遺伝子発現が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
寛容化樹状細胞を作製するための方法であって、
樹状細胞に、有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップであって、呼吸器多核体ウイルスが、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を寛容化し、サプレッサーＴ細胞増殖を引き起こし、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＬＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する前記樹状細胞の能力を増加させ、感染した樹状細胞が、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗであるステップ
を含む方法。
【請求項１１】
同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害が、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象における樹状細胞の抗ウイルス免疫を抑制するための方法であって、
単離された樹状細胞に有効量の呼吸器多核体ウイルスを感染させてＩＬ−１０依存性寛容原性免疫機能を生じさせるステップであって、呼吸器多核体ウイルスが、患者に再導入されたときに、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ナイーブＴ細胞制御応答を誘導し、ＩＬ−１０を分泌し、かつ阻害分子ＰＤＬ−１、ＩＫＴ−４及びＨＬＡ−Ｇを発現する前記樹状細胞の能力を阻害するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の能力の阻害が、樹状細胞同士の細胞間接触を必要とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである単離された樹状細胞を含む寛容原性樹状細胞。
【請求項１５】
末梢血単核細胞に、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方を寛容原性にするのに十分な有効量の呼吸器多核体ウイルス又はその一部分を感染させ、混合白血球反応により、前記寛容原性がインビトロで測定される方法により作製される寛容原性樹状細胞であって、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗである樹状細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞を、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶ又はその一部分に感染した樹状細胞と接触させることにより、寛容原性Ｔ細胞媒介免疫応答を促進する方法。
【請求項１７】
アネルギーＴヘルパー細胞を誘導する方法であって、
単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、該抗原提示細胞を感染させ、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの少なくとも１つの表面発現を引き起こすのに十分な量のＲＳＶとインキュベートするステップと、
ＲＳＶ感染抗原提示細胞を、Ｔ細胞を寛容化する条件下でＴ細胞と接触させるステップであって、前記寛容化が、混合リンパ球反応においてインビトロで測定されるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
単離された寛容原性樹状細胞を作製する方法であって、
単離された樹状細胞を、該樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスと、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗの細胞表面発現を引き起こす条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１９】
ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有する単離された寛容原性樹状細胞を含む、哺乳動物宿主において寛容原性を増進させるためのキット。
【請求項２０】
寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製する方法であって、
ＡＰＣに、樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスを感染させるステップと、
以下の細胞表面マーカー発現ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを引き起こし、それにより寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を創製するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
哺乳動物対象における自己免疫疾患を治療するための方法であって、哺乳動物対象に、寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与するステップを含み、前記寛容原性樹状細胞が、ＲＳＶに予め感染し、以下の細胞表面ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを有し、前記細胞が、自己免疫疾患を低減させるか若しくは消失させるか、又はその発生若しくは再発を予防するのに有効な量で投与される方法。
【請求項２２】
自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、網膜ブドウ膜炎、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗原に対する免疫応答を調節するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、単離された寛容化抗原提示細胞を、免疫応答を調節するのに十分な時間及び条件下で投与するステップを含み、抗原特異的抗原提示細胞が、前記抗原提示細胞を、該抗原提示細胞がＴ細胞に対して寛容化するのに十分な時間及び条件下でＲＳＶと接触させることにより作製され、寛容化抗原提示細胞が、以下の細胞表面マーカーＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈ、ＣＤ４０ｈｉｇｈ及びＣＤ８３ｌｏｗを発現することを特徴とし、前記寛容化抗原提示細胞が、１：５〜１：１００の寛容化抗原提示細胞対Ｔ細胞の比率にて寛容原性である方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【公表番号】特表２０１１−５２２８３７（Ｐ２０１１−５２２８３７Ａ）
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２７１４（Ｐ２０１１−５１２７１４）
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９３９７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９３９７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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