哺乳動物サイトカイン；関連試薬
【課題】新規インターロイキン組成物および関連する化合物、およびその使用方法を提供すること。
【解決手段】哺乳動物に由来するサイトカインをコードする精製された遺伝子（単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド）、それに関連する試薬（精製されたタンパク質、特異抗体、およびこの分子をコードする核酸を含む）が提供される。この試薬および診断キットを使用する方法もまた、提供される。本発明はまた、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法を提供し、この方法は、その細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する。
【解決手段】哺乳動物に由来するサイトカインをコードする精製された遺伝子（単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド）、それに関連する試薬（精製されたタンパク質、特異抗体、およびこの分子をコードする核酸を含む）が提供される。この試薬および診断キットを使用する方法もまた、提供される。本発明はまた、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法を提供し、この方法は、その細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９９年７月３０日に出願された、同一人物に譲渡された同時継続米国特許出願ＵＳＳＮ０９／３６４，６７４；および１９９９年８月６日に出願されたＵＳＳＮ０９／３６９，６３４に対する優先権を主張する。これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物免疫系の細胞の生物学および生理学を調節するのに機能するタンパク質に関連する組成物に関する。特に、それは、例えば造血細胞を含む様々な細胞型の活性化、発生、分化、および機能を制御するのに有用な精製遺伝子、タンパク質、抗体、および関連する試薬を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
組換えＤＮＡ技術は、一般的にはドナー供給源からの遺伝情報を、宿主への導入によるような続く処理のためにベクターへ組み込み、それによって転移された遺伝情報が新しい環境下で複製および／または発現される技術を指す。一般的に、遺伝情報は、望ましいタンパク質産物をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形で存在する。担体は、多くの場合、宿主細胞における後の複製のためにｃＤＮＡを組み込む、およびある場合にはｃＤＮＡの発現を実際に制御し、そしてそれによって宿主におけるコードされた産物の合成を指示する能力を有するプラスミドである。
【０００４】
しばらくの間、哺乳動物免疫応答は「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用に基づくことが知られていた。最近の研究が、このネットワークの内部作用に新たな洞察を提供した。反応の多くは実際リンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞のネットワーク様相互作用を循環していることは明らかなままであるが、免疫学者は現在一般的に、リンホカイン、サイトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が、これらの細胞相互作用の制御に決定的な役割を果たしているという意見を持っている。従って、細胞調節因子の単離、特徴付け、および作用メカニズムにかなりの興味があり、その理解は多くの医学的異常、例えば免疫系疾患の診断および治療における重要な進歩を導く。これら因子のいくつかは、造血系増殖および／または分化因子、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）またはＩＬ−１１である。例えば、Ｍｉｒｅ−ＳｌｕｉｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌを参照のこと。
【０００５】
リンホカインは明らかに、様々な方法で細胞活性を媒介する。これらは多能性造血幹細胞の、複雑な免疫系を作る多様な細胞系統を含む多数の祖先への増殖、成長、および分化を支持することが示された。細胞成分間の適当なそしてバランスのとれた相互作用が、健康な免疫反応に必要である。リンホカインが他の薬剤と共に投与された場合、異なる細胞系統は、多くの場合異なる様式で反応する。
【０００６】
免疫反応に特に重要な細胞系統は、２種類のリンパ球を含む：免疫グロブリン（外来性物質を認識および結合してそれを除去する能力を有するタンパク質）を産生および分泌し得るＢ細胞、そしてリンホカインを分泌して、そして免疫ネットワークを形成するＢ細胞および様々な他の細胞（他のＴ細胞を含む）を誘導または抑制する様々なサブセットのＴ細胞。これらのリンパ球は多くの他の細胞型と相互作用する。
【０００７】
別の重要な細胞系統は、体中の基部から毛細血管に位置する顆粒を含む結合組織細胞である、肥満細胞である（これは全ての哺乳動物種で明確に同定されていない）。これらの細胞は、肺、皮膚、および胃腸管および尿生殖路で特に高い濃度で見出される。肥満細胞は、アレルギー関連障害、特に以下のようにアナフィラキシーで中心的な役割を果たす：選択された抗原が、肥満細胞表面の受容体に結合した１種類の免疫グロブリンを架橋すると、肥満細胞は脱顆粒し、そしてメディエーター、例えばヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、およびプロスタグランジンを放出し、それがアレルギー反応、例えばアナフィラキシーを引き起こす。
【０００８】
様々な免疫障害をよりよく理解および治療するための研究は、一般的にインビトロで免疫系の細胞を維持できないことによって妨げられてきた。免疫学者は、これらの細胞の培養は、多くのリンホカインを含む様々な増殖因子を含む、Ｔ細胞および他の細胞の上清を使用することによって達成され得ることを発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のことから、例えばＩＬ−１１に関連する新規リンホカインの発見および開発は、直接または間接的に免疫系および／または造血細胞に関与する広い範囲の変性または異常状態の新規治療に貢献し得ることが明らかである。特に、公知のリンホカインの有用な活性を増強または強化するリンホカインの発見および開発は、非常に有用である。本発明は新規インターロイキン組成物および関連する化合物、およびその使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＤＮＡＸ８０、またはＩＬ−Ｄ８０と番号をふられた哺乳動物、例えばげっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類のインターロイキンおよびその生物学的活性に関する。それは、ポリペプチド自身をコードする核酸、およびその産生および使用方法を含む。本発明の核酸は、部分的には本明細書中で開示された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列との相同性によって、および／または代表的にはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドに適用される、増殖因子またはサイトカイン様活性、例えばＩＬ−１１（Ｔｈｏｍｓｏｎ（１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ 第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）に関する機能的アッセイによって特徴付けられる。増殖因子依存的生理学または免疫反応の制御における修飾または介入の方法が提供される。
【００１１】
本発明は、部分的にはＩＬ−１１に対する有意な配列および構造類似性を示す新規サイトカイン配列の発見に基づく。特に、それは、霊長類、例えばヒト、およびげっ歯類、例えばマウス配列を提供する。有意な配列相同性を示す機能的同等物が、他の哺乳動物、例えばウシ、ウマ、およびラット、マウス、ならびに非哺乳動物種から入手可能である。
【００１２】
様々なタンパク質実施形態で、本発明は、配列番号２、４、８、または１０と少なくとも約１２アミノ酸の長さで同一性を示す本質的に純粋なまたは組換えＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド；配列番号２、４、８、または１０の天然配列ＩＬ−Ｄ８０；および配列番号２、４、８、または１０のＩＬ−Ｄ８０配列を含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、同一の部分は少なくとも約１４、１７、または１９アミノ酸である。他の実施形態では、ＩＬ−Ｄ８０は、表１の配列を含む成熟配列を含む；または天然ＩＬ−Ｄ８０とは違う翻訳後修飾パターンを示す；またはポリペプチドは、霊長類を含む哺乳動物から選択された温血動物由来である；配列番号２、４、８、または１０の少なくとも１つのポリペプチド部分を含む；複数のアミノ酸残基断片を示す；ＩＬ−Ｄ８０の天然対立遺伝子改変体である；少なくとも約３０アミノ酸の長さを有する；霊長類ＩＬ−Ｄ８０に特異的な少なくとも２つの重複しないエピトープを示す；霊長類ＩＬ−Ｄ８０と少なくとも約２０アミノ酸の長さで配列同一性を示す；グリコシル化されている；天然糖鎖付加を有し少なくとも１０ｋＤの分子量を有する；合成ポリペプチドである；固体基質に接着している；別の化学的分子に結合している；天然配列から５倍かそれより少ない置換である；または天然配列の欠失または挿入変異体である。好ましい実施形態は、以下のものを含む組成物を含む：滅菌ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド；またはＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドおよび担体、ここで担体は、水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物である；および／または経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口投与のために処方される。融合タンパク質実施形態では、タンパク質は、表１の成熟ポリペプチド配列；ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、またはＩｇ配列を含む検出または精製タグ；および／またはＩＬ−１１を含む別のサイトカインまたはケモカインの配列を有し得る。
【００１３】
キット実施形態は、ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドを有するもの、およびポリペプチドを含む区画；および／またはキット中の試薬の使用または廃棄に関する指示を含む。
【００１４】
結合化合物実施形態では、化合物は、天然ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を有し得る。ここで：ＩＬ−Ｄ８０は霊長類タンパク質である；結合化合物はＦｖ、Ｆａｂ、またはＦａｂ２断片である；結合化合物は別の化学部分に結合している；または抗体は：表１の成熟ポリペプチド部分のペプチド配列に対して惹起される；成熟ＩＬ−Ｄ８０に対して惹起される；精製霊長類ＩＬ−Ｄ８０に対して惹起される；免疫選択される；ポリクローナル抗体である；変性ＩＬ−Ｄ８０に結合する；少なくとも３０μＭのＫｄを示す；ビーズまたはプラスチック膜を含む固体基質に結合している；滅菌組成物である；または放射活性または蛍光標識を含んで検出可能に標識される。結合化合物を含むキットは、結合化合物を含む区画；および／またはキット中の試薬の使用および廃棄方法に関する指示を有するものを含む。多くの場合、キットは定性または定量分析を行うことができる。好ましい組成物は、滅菌結合化合物；または結合化合物および担体を含む。ここで担体は、水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物である；および／または経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口投与のために処方される。
【００１５】
核酸実施形態は、ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする単離または組換え核酸を含む。ここでＩＬ−Ｄ８０は霊長類由来である；および／または核酸は、表１の抗原性ペプチド配列をコードする；表１の複数の抗原性ペプチド配列をコードする；その部分をコードする天然ｃＤＮＡと同一性を示す；発現ベクターである；さらに複製開始点を含む；天然の供給源由来である；検出可能標識を含む；合成ヌクレオチド配列を含む；６ｋｂより少ない、好ましくは３ｋｂより少ない；ヒトを含む霊長類由来である；天然全長コード配列を含む；ＩＬ−Ｄ８０をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブである；またはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、または変異誘発プライマーである。本発明はまた、そのような組換え核酸を含む細胞、組織、または臓器を提供する。そして好ましくは、細胞は、原核細胞；真核細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳動物細胞；マウス細胞；霊長類細胞；またはヒト細胞である。
【００１６】
キット実施形態は、そのような核酸を有するもの、および核酸を含む区画；さらにＩＬ−Ｄ８０タンパク質またはポリペプチドを含む区画；および／またはキット中の試薬の使用または廃棄に関する指示を含む。代表的には、キットは定性または定量分析を行うことができる。
【００１７】
特定の実施形態では、核酸は、３０℃および２Ｍより少ない塩濃度、または４５℃および／または５００ｍＭの塩濃度、または５５℃および／または１５０ｍＭの塩濃度の洗浄条件下で、配列番号１、３、７、または９にハイブリダイズする；または霊長類ＩＬ−Ｄ８０に対して少なくとも約３０、５５、または７５ヌクレオチドの長さで同一性を示す。
【００１８】
本発明は、細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることを含む、細胞または組織培養細胞の生理学または発生を調節する方法を含む。その方法は、接触はＩＬ−１１のアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせる；または接触はＩＬ−Ｄ８０に特異的に結合する抗体結合部位を含む結合組成物を含むアンタゴニストを用いるものであり得る。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）配列番号２、４、８、または１０に由来する成熟ポリペプチドに由来する少なくとも１７個連続したアミノ酸を含む抗原性ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２）配列番号２、４、８、または１０に由来する成熟ポリペプチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）５５℃、５００ｍＭ未満の塩、および５０％ホルムアミドにおいて、配列番号１、３、７、または９のコード部分にハイブリダイズする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）配列番号１、３、７、または９のコード部分の少なくとも３５個連続したヌクレオチドを含む、項目３に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目６）項目５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、真核生物細胞を含む、宿主細胞。
（項目７）抗原性ポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、項目１に記載の組換えポリヌクレオチドを発現させる工程を包含する、方法。
（項目８）項目１に記載のポリヌクレオチドとの二重鎖を形成するための方法であって、該方法は、該ポリヌクレオチドを、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、７、または９のコード部分の少なくとも２５個連続したヌクレオチドにハイブリダイズするプローブと接触させて、それにより該二重鎖を形成する工程を包含する、方法。
（項目９）項目１に記載のポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、該キットは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、項目１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１７個連続したヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを備える、キット。
（項目１０）前記プローブが検出可能に標識されている、項目９に記載のキット。
（項目１１）配列番号２、４、８、または１０に由来する、少なくとも１７個連続したアミノ酸と特異的に結合する抗体結合部位を含む、結合化合物。
（項目１２）項目１１に記載の結合化合物であって、ここで：
ａ）前記抗体結合部位が、
１）配列番号２、４、８、もしくは１０のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性であるか；
２）精製されたヒトＩＬ−Ｄ８０タンパク質もしくは組換えて産生されたヒトＩＬ−Ｄ８０タンパク質に対して惹起されるか；または
３）モノクローナル抗体、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ）２内にあるか；あるいは
ｂ）該結合化合物が、
１）抗体分子であるか；
２）ポリクローナル抗血清であるか；
３）検出可能に標識されるか；
４）滅菌されているか；または
５）緩衝化組成物内にある、結合化合物。
（項目１３）項目１１に記載の結合化合物を使用する方法であって、該方法は、該結合化合物を、抗原を含む生物学的サンプルと接触させる工程を包含し、ここで該接触させる工程が、結合化合物：抗原複合体の形成を生じる、方法。
（項目１４）前記生物学的サンプルがヒト由来であり、そして前記結合化合物が抗体である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）検出キットであって、該キットは、項目１２に記載の結合化合物、および以下：
ａ）前記検出のための該結合化合物の使用についての使用説明資料；または
ｂ）該結合化合物の隔離を提供する区画、
を備える、検出キット。
（項目１６）実質的に純粋な抗原性ポリペプチドまたは実質的に単離された抗原性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、項目１１に記載の結合組成物と結合し、そして配列番号２、４、８、または１０に由来する少なくとも１７個連続したアミノ酸をさらに含む、ポリペプチド。
（項目１７）項目１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、
ａ）霊長類ＩＬ−Ｄ８０タンパク質に由来する少なくとも２５個連続したアミノ酸残基の少なくとも１つのフラグメントを含むか；
ｂ）可溶性ポリペプチドであるか；
ｃ）検出可能に標識されているか；
ｄ）滅菌組成物内にあるか；
ｅ）緩衝化組成物内にあるか；
ｆ）細胞表面レセプターに結合するか；
ｇ）組換えて産生されるか；または
ｈ）天然に存在するポリペプチド配列を有する、ポリペプチド。
（項目１８）配列番号２、４、８、または１０の少なくとも１７個連続したアミノ酸を含む、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法であって、該方法は、該細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２０）項目１９に記載の方法であって、ここで：
ａ）前記接触させる工程がＩＬ−１１のアゴニストもしくはアンタゴニストとの組み合わせであるか；または
ｂ）該接触させる工程がアンタゴニストを用いるものであり、該アンタゴニストとしては、ＩＬ−Ｄ８０と特異的に結合する抗体結合部位を含む結合組成物が挙げられる、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で引用される全ての参考文献は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ明確におよび個々に参考文献に組み込まれると示されたように同じ程度、本明細書中で参考として援用される。
【００２０】
（Ｉ．概要）
本発明は、サイトカインである、例えば免疫および他の細胞間のシグナルを伝達し得る分泌分子である、様々な哺乳動物タンパク質をコードするアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。例えば、Ｐａｕｌ（１９９７）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。全長サイトカイン、および断片、またはアンタゴニストが、受容体を発現する細胞の生理学的調節に有用である。おそらくＩＬ−Ｄ８０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、樹状細胞、造血祖先等のような、例えばリンパ性細胞を含む造血細胞に対して刺激または阻害効果のいずれかを有する。そのタンパク質はまた、タンパク質上の様々なエピトープ、直線および配座エピトープ両方に対する抗体を産生するために、抗原、例えば免疫原として有用である。
【００２１】
ＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡは、染色体１６のＢＡＣの、様々な霊長類、例えばヒトの配列から同定された。例えばＣＩＴ９８７ＳＫ−Ａ−５７５Ｃ２、およびＣＩＴ９８７ＳＫ−Ａ−７６１Ｈ５を参照のこと。その分子はｈｕＩＬ−Ｄ８０と呼ばれた。ヒトＥＳＴ、ヒトＥＳＴ ＡＩ０８５００７が同定および記載された。マウスＥＳＴ ＡＡ２６６８７２も同定および記載された。
【００２２】
霊長類、例えばヒト遺伝子は、約２１６アミノ酸（配列番号２）または約２４３アミノ酸（配列番号８）の小さい可溶性サイトカイン様タンパク質をコードする。表１および配列番号１、２、７、および８を参照のこと。ＩＬ−Ｄ８０は長鎖サイトカインのメンバーに特徴的な構造モチーフを示す。例えばＧｅｎＢａｎｋから入手可能なＩＬ−Ｄ８０およびＩＬ−１１配列を比較すること。またげっ歯類配列および表２または３も参照のこと。
【００２３】
（表１：霊長類、例えばヒト由来のＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号１））
【００２４】
【化１】
エキソン境界は、約２１９／２２０；３９３／３９４；４９２／４９３；および５５１／５５２に対応するようである。それらの境界に対応するコード部分は、特に興味深い。１９３から９１８までの翻訳アミノ酸配列は配列番号２である。
【００２５】
【化２】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＶＷＧおよびＦＰＲ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＧＲＰおよびＱＬＳ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＱＬＰおよびＤＶＳ．．．間から約．．．ＴＬＱおよびＰＦＨ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＳＴＹおよびＲＬＬ．．．間から約．．．ＨＳＶおよびＷＰＬ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（１３−２０、２２０−２２３、および１６３−１７５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書き（ｐｒｏｖｉｓｏ ｏｕｔ）するつもりである。霊長類、例えばヒト由来の改変体ＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号７）（注記、非コード配列は配列番号１のものと同一であるが、明確さのためのここでは省いた）。
【００２６】
【化３】
翻訳されたアミノ酸配列は配列番号８である：
【００２７】
【化４】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＶＷＧおよびＦＰＲ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＧＲＰおよびＱＬＳ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＱＬＰおよびＤＶＳ．．．間から約．．．ＴＬＱおよびＰＦＨ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＳＴＹおよびＲＬＬ．．．間から約．．．ＨＳＶおよびＷＰＬ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（１３−２０、２２０−２２３、および１６３−１７５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書きするつもりである。
配列番号２および８の比較：
【００２８】
【化５】
げっ歯類、例えばマウス由来のＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号３）。
【００２９】
【化６】
エキソン境界は、約１９８／１９９；３６０／３６１；４５９／４６０；および６１８／６１９である。それらの境界に対応するコード部分は、特に興味深い。１９９から８９１までの翻訳アミノ酸配列は配列番号４である。
【００３０】
【化７】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＳＷＧおよびＦＰＴ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＴＤＰおよびＬＳＬ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＨＬＰおよびＮＶＳ．．．間から約．．．ＰＦＰおよびＡＭＬ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＷＰＱおよびＬＬＹ．．．間から約．．．ＬＳＬおよびＰＲＲ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（残基４−７、２０９−２１２、および１５６−１６５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書きするつもりである。
改変体げっ歯類、例えばマウスＩＬ−Ｄ８０（配列番号９）
【００３１】
【化８】
１−７０２の翻訳；げっ歯類、例えばマウスＩＬ−Ｄ８０（配列番号１０）
【００３２】
【化９】
配列番号４および１０の比較：
【００３３】
【化１０】
表２：様々なＩＬ−１１実施形態のＩＬ−Ｄ８０との比較。ヒトＩＬ−１１は配列番号５；マウスＩＬ−１１は配列番号６である。
【００３４】
【化１１】
配列の比較はまた、進化系統樹を提供する。これは、例えばＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムをＣｌｕｓｔａｌＸ分析ソフトウェアプログラムと組み合わせて使用することによって産生され得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２；およびＴｒｅｅＶｉｅｗ、Ｐａｇｅ、ＩＢＬＳ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｌａｓｇｏｗ、ｅ−ｍａｉｌ ｒｐａｇｅ＠ｂｉｏ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ；ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．ｒｏｄ．ｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００３５】
表３：様々のＩＬ−１１実施形態と霊長類ＩＬ−Ｄ８０（表２の配列番号２の代わりに配列番号８）およびげっ歯類ＩＬ−Ｄ８０（表２の配列番号４の代わりに配列番号１０）とのさらなる比較。霊長類、例えばヒトＩＬ−１１は配列番号５である；げっ歯類、例えばマウスＩＬ−１１は配列番号６である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ（１．４ｂ）複数配列アラインメントプログラムを用いたＩＬ−１１とのアラインメント。
【００３６】
【化１２】
上記のように、配列の比較はまた、進化系統樹を提供する。これは、例えばＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムをＣｌｕｓｔａｌＸ分析ソフトウェアプログラムと組み合わせて使用することによって産生し得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２；およびＴｒｅｅＶｉｅｗ、Ｐａｇｅ、ＩＢＬＳ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｌａｓｇｏｗ、ｅ−ｍａｉｌ ｒｐａｇｅ＠ｂｉｏ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ；ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．ｒｏｄ．ｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００３７】
ＩＬ−Ｄ８０の関連するサイトカインタンパク質に対する構造的相同性は、この分子の関連する機能を示唆する。ＩＬ−Ｄ８０は、ＩＬ−１１と配列類似性を示す長鎖サイトカインである。
【００３８】
ＩＬ−１１の生物学の多くの局面がよく認識されている。例えば、Ｓｏｎｉｓら（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：８３１−８３４；Ｊａｃｑｕｅｓら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３７−７４０；Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら（１９９８）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５６：１２−２１；Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中のＪａｃｏｂｓｅｎ（１９９８）；Ｍａｓｌａｋら（１９９８）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３５：２５３−２６０；Ｌｅｎｇら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１０５９−１０６２；Ｄｕら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：３８９７−３９０８；Ｇｏｌｄｍａｎ（１９９５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １３：４６２−４７１；およびＤｕら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２：１８２−１８８を参照のこと。ＩＬ−Ｄ８０の生物学は同様であると予期され、例えばいくつかの生物学的活性は重複し得る。
【００３９】
ＩＬ−Ｄ８０アゴニストまたはアンタゴニストもまた、機能的または受容体アンタゴニストとして作用し得る。例えばそれはＩＬ−１１の各受容体への結合を阻害し、または反対の作用を媒介する。従って、ＩＬ−Ｄ８０またはそのアンタゴニストは、免疫障害、例えばＴ細胞免疫欠損症、慢性炎症、または組織の拒絶を含む異常な医学的状態の治療に、または心血管または神経生理学的状態で有用であり得る。ＩＬ−Ｄ８０およびＩＬ−１１関連試薬を組み合わせた組成物が多くの場合使用される。
【００４０】
天然の抗原は、標的細胞において生物学的または生理学的反応を導く様々な生化学的反応を媒介することができる。本明細書中で特徴付けられる好ましい実施形態は、ヒト由来であるが、他の霊長類、または他の種の対応物が天然に存在する。他の哺乳動物種、例えば霊長類、イヌ、ネコ、およびげっ歯類、特に家畜種におけるタンパク質のさらなる配列も、入手可能であるはずである。下記を参照のこと。下記の説明は、例示の目的で、ヒトＩＬ−Ｄ８０に向けられるが、他の種由来の関連する実施形態に同様に適用可能である。
【００４１】
（ＩＩ．精製されたＩＬ−Ｄ８０）
霊長類、例えばヒトＩＬ−Ｄ８０アミノ酸配列を、いくつかの実施形態、例えば配列番号２、４、８、または１０に示す。そのタンパク質をコードする他の天然に存在する核酸を、提供された配列を用いて標準的な手順、例えばＰＣＲ技術によって、またはハイブリダイゼーションによって単離し得る。アミノ末端からカルボキシ末端まで提供される、これらのアミノ酸配列は、そのタンパク質抗原を他のタンパク質および例示する多くの変異体から区別するのを可能にする、サイトカインの配列情報を提供するのに重要である。さらに、そのペプチド配列はそのようなセグメントを認識する抗体を産生するペプチドの調製を可能にする、そしてヌクレオチド配列はオリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にする。これらはどちらも、そのような配列をコードする遺伝子の検出または単離、例えばクローニングの戦略である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「ヒト可溶性ＩＬ−Ｄ８０」という用語は、タンパク質の文脈で使用される場合、配列番号２、または８に示した可溶性ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその重要なフラグメントを含む。好ましい実施形態は、指定された長さの複数の区別できる、例えば重複しないセグメントを含む。代表的には、その数は少なくとも２、より通常は少なくとも３、そして好ましくは５、７、またはそれ以上である。長さの最小値が提供されるが、様々な大きさのより長い長さ、例えば１つの長さ７、および２つの長さ１２が適当であり得る。
【００４３】
結合成分、例えば抗体は、代表的にはＩＬ−Ｄ８０に、例えば少なくとも約１００ｎＭ、通常約３０ｎＭよりよい、好ましくは約１０ｎＭよりよい、そしてより好ましくは約３ｎＭよりよい、高い親和性で結合する。対応するタンパク質が、ヒト以外の哺乳動物種、例えば他の霊長類、有蹄動物、またはげっ歯類において見出される。また、非哺乳動物種、例えば鳥類または両生類も構造的または機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有するはずである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、重要なフラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも約１２アミノ酸、代表的には少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましい実施形態では、少なくとも約３０以上のアミノ酸、例えば３５、４０、４５、５０、６０、７５、１００等の一連のアミノ酸残基を含む。そのような断片は、実質的に全ての位置で始まる、および／または終わる末端を有し得る。例えば、全ての実際的な組み合わせで、残基１、２、３等で始まり、そして例えば１５０、１４９、１４８等で終わる。特に興味深いペプチドは、構造ドメイン境界、例えばヘリックスＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤに対応する末端を有する。表１、２、および３を参照のこと。
【００４５】
「結合組成物」という用語は、例えば抗体−抗原相互作用で、ＩＬ−Ｄ８０に特異性をもって結合する分子を指す。特異性は多かれ少なかれ包括的、例えば特定の実施形態に対して、または関連する実施形態、例えば霊長類、げっ歯類等のグループに対して特異的であり得る。それはまた、共有結合または非共有結合のいずれか、天然の生理的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を含んで、ＩＬ−Ｄ８０と特異的に結合する化合物、例えばタンパク質を含む。その分子はポリマー、または化学的試薬であり得る。機能的アナログは、構造的修飾を有するタンパク質であり得、またはそれは適当な結合決定基と相互作用する分子の形を有する分子であり得る。その化合物は、受容体結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（編）Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（最新版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４６】
例えばタンパク質の文脈において、実質的に純粋なとは、代表的には、タンパク質がもとの供給源有機体由来の、他の混入タンパク質、核酸、または他の生物製剤を含まないことを意味する。純度は標準的な方法、代表的には重量によってアッセイされ得、そして普通少なくとも約４０％純粋、一般的には少なくとも約５０％純粋、多くの場合少なくとも約６０％純粋、代表的には少なくとも約８０％純粋、好ましくは少なくとも約９０％純粋、そして最も好ましい実施形態では少なくとも約９５％純粋である。担体または賦形剤が多くの場合加えられる。
【００４７】
ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、環境およびポリペプチドに依存する。温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子の特徴、および溶媒の性質を含む多くのパラメーターがポリペプチドの可溶性に影響する。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は約４℃から約６５℃の範囲である。通常使用温度は約１８℃より高い。診断的目的のためには、温度は通常約室温であるかまたはより暖かいが、アッセイ中の成分の変性温度より低い。治療的目的のためには、温度は通常体温、代表的にはヒトおよびマウスでは約３７℃であるが、特定の状況下では、インサイチュまたはインビトロで温度を上昇または下降させ得る。
【００４８】
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的に、実質的に安定状態であり、そして通常変性状態ではない。ポリペプチドは、例えば可溶性を与えるために、４次構造において他のポリペプチドと、または脂質または界面活性剤と結合し得る。 溶媒および電解質は通常、生物学的活性の保存のために使用される型の、生物学的に適合性の緩衝液であり、そして通常生理的水性溶媒に近似する。通常、溶媒は、代表的には約５および１０の間、そして好ましくは約７．５の中性ｐＨを有する。いくつかの場合には、１つ以上の界面活性剤、代表的には弱い非変性のもの、例えばＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナート）またはＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホナート）が、またはタンパク質の構造的または生理的性質の有意な崩壊を避けるために十分低い濃度で加えられる。他の例では、有意な変性を起こすために強い界面活性剤を使用し得る。
【００４９】
（ＩＩＩ．物理的改変体）
本発明はまた、ＩＬ−Ｄ８０抗原のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを含む。改変体は種、多型、または対立遺伝子改変体を含む。
【００５０】
アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基のマッチを最適化することによって、もし必要なら必要に応じてギャップを導入することによって決定される。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３）Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ， ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍａｐｒｉｓｏｎの第１章、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＭＡ；およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのソフトウェアパッケージも参照のこと。保存的置換をマッチと考えるならば、配列同一性は変化する。保存的置換は、代表的には以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。保存は、生物学的特徴、機能的特徴、または構造的特徴に当てはまり得る。相同的なアミノ酸配列は、代表的にはタンパク質配列の天然の多型または対立遺伝子および種間のバリエーションを含むように意図される。代表的な相同的タンパク質またはペプチドは、ＩＬ−Ｄ８０のアミノ酸配列と２５−１００％の同一性（もしギャップが導入され得るなら）から５０−１００％の同一性（もし保存的置換が含まれるなら）を有する。同一性の測定値は、少なくとも約３５％、一般的に少なくとも４０％、多くの場合少なくとも約５０％、代表的には少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％である。
【００５１】
単離されたＩＬ−Ｄ８０ＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、そして短いヌクレオチド区間の反転によって容易に修飾し得る。これらの修飾は、これら抗原、その誘導体、または同様の生理的、免疫原的、抗原的、または他の機能的活性を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列を産生する。これら修飾配列を、変異抗原を産生する、または発現を増強するために使用し得る。増強された発現は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および他のメカニズムを含み得る。「変異ＩＬ−Ｄ８０」は、他の点では上記で述べたＩＬ−Ｄ８０の配列同一性の定義にあてはまるが、欠失、置換、または挿入のいずれかによって天然に通常見出されるＩＬ−Ｄ８０とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。これは一般的には、配列番号２、４、８、または１０の配列を有するタンパク質と有意な同一性を有する、そしてそれらの配列と様々な生物学的活性、例えば抗原性または免疫原性を共有する、そして好ましい実施形態では天然全長開示配列のほとんどを含むタンパク質を含む。全長配列が代表的には好ましいが、切断されたバージョンも有用であり、同様に、天然の供給源から見出された遺伝子またはタンパク質が代表的には最も望ましい。同様のコンセプトが異なるＩＬ−Ｄ８０タンパク質、特に様々な温血動物、例えば哺乳動物および鳥類で見出されるものにあてはまる。これらの記載は一般的に、多くのＩＬ−Ｄ８０タンパク質を含むことを意味し、具体的に議論される特定の霊長類実施形態に制限されない。
【００５２】
ＩＬ−Ｄ８０変異誘発はまた、アミノ酸を挿入または欠失させることによって行われ得る。置換、欠失、挿入、またはあらゆる組み合わせが、最終構築物に到達するために産生される。挿入はアミノまたはカルボキシル末端融合を含む。無作為変異誘発を標的コドンにおいて行い得、そして発現した変異体を次いで望ましい活性に関してスクリーニングし得る。例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による、公知の配列を有するＤＮＡにおいて、前もって決定した部位で置換変異を起こす方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および増刊）；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２を参照のこと。好ましい実施形態は、例えば１倍、２倍、３倍、５倍、７倍等の、好ましくは保存的置換をヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで含む。好ましくは、置換は保存されたシステインから遠く、そして多くの場合ヘリックス構造ドメインから離れた領域にある。そのような改変体は、特異的な抗体を産生するために有用であり得、そして多くの場合多くのまたは全ての生物学的性質を共有する。
【００５３】
本発明はまた、組換えタンパク質、例えばこれらタンパク質由来のセグメントを使用した異種由来融合タンパク質を提供する。異種由来融合タンパク質は、天然には通常同じ方法で融合しないタンパク質またはセグメントの融合である。同様のコンセプトが異種由来核酸配列にあてはまる。
【００５４】
それに加えて、新規構築物を、他のタンパク質由来の、同様の機能的ドメインを組み合わせることから作成し得る。例えば、標的結合または他のセグメントを、異なる新規融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」し得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２を参照のこと。
【００５５】
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２によって記載されたホスホロアミダイト法は、適当な合成ＤＮＡフラグメントを産生する。二本鎖断片は多くの場合、相補鎖を合成することおよび適当な条件下で鎖を共にアニーリングすることによって、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えること、例えばＰＣＲ技術のいずれかによって得られる。
【００５６】
構造的分析を、サイトカインのＩＬ−１１ファミリーと比較してこの遺伝子に適用し得る。ヒトＩＬ−Ｄ８０配列の、他のＩＬ−１１ファミリーメンバーとのアラインメントは、構造的特徴の決定を可能にするはずである。特に、βシートおよびαヘリックス残基を、例えばＲＡＳＭＯＬプログラムを用いて決定し得る。Ｂａｚａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９：５９１；Ｌｏｄｉら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１７６２−１７６６；ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ（１９９５）ＴＩＢＳ ２０：３７４−３７６；およびＧｒｏｎｅｎｂｅｒｇら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：２６３−２６９を参照のこと。置換に好ましい残基は、受容体と相互作用することが予期される表面に露出した残基を含む。機能を保存する他の残基は、特に表面露出残基から遠い位置では、保存的置換である。
【００５７】
（ＩＶ．機能的変異体）
ＩＬ−Ｄ８０に対する生理的反応の阻害は、リガンドのその受容体に対する結合の競合的阻害により起こり得る。
【００５８】
本発明のインビトロアッセイは、多くの場合単離タンパク質、これらタンパク質の受容体結合部分を含む可溶性断片、または固相基板に結合した断片を使用する。これらのアッセイはまた、結合部分変異および修飾、またはサイトカイン変異および修飾（例えばＩＬ−Ｄ８０アナログ）のいずれかの、効果の診断的決定を可能にする。
【００５９】
本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用を企図する。例えばここで、サイトカインに対する中和抗体、または受容体結合断片が、試験化合物と競合する。
【００６０】
ＩＬ−Ｄ８０抗原の「誘導体」は、天然に存在する形からのアミノ酸配列変異体、糖鎖付加変異体、および他の化学的部分との共有結合物または凝集結合物を含む。共有結合誘導体は、ＩＬ−Ｄ８０アミノ酸側鎖またはＮもしくはＣ末端において見出される基への官能基の結合によって、例えば標準的な手段によって調製され得る。例えば、ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ（１９８８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第１−２巻、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｈｕｇｌｉ（編、１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；およびＷｏｎｇ（１９９１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照のこと。
【００６１】
特に、糖鎖付加の変更が含まれ、例えば、その合成および処理の間、またはさらなる処理工程において、ポリペプチドの糖鎖付加パターンを修飾することによって産生される。例えば、Ｅｌｂｅｉｎ（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４９７−５３４を参照のこと。同じ一次アミノ酸配列を有し、リン酸化アミノ酸残基（例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン）を含む他の小さい修飾を有するペプチドのバージョンも含まれる。
【００６２】
ＩＬ−Ｄ８０と他の同種タンパク質または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドも提供される。多くのサイトカイン受容体または他の表面タンパク質は、多量体（例えばホモ２量体実体）であり、そして反復構築物はタンパク質溶解切断に対する減少した感受性を含む、様々な利点を有し得る。典型的な例は、融合リガンドの存在または位置を容易に決定し得るような、リポーターポリペプチド（例えばルシフェラーゼ）と、タンパク質のセグメントまたはドメイン、例えば受容体結合セグメントとの融合である。例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌βガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、βラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母アルファ交配因子、およびＨｉｓ６配列のＦＬＡＧ配列のような検出または精製タグを含む。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８１２−８１６を参照のこと。
【００６３】
融合ペプチドは、典型的には組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかによって作成される。核酸操作および発現の技術は、一般的に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹに記載されている。ポリペプチド合成の技術は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；およびＧｒａｎｔ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹに記載されている。再フォールディング法を合成タンパク質に適用し得る。
【００６４】
本発明はまた、アミノ酸配列における変化または糖鎖付加以外の、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質誘導体の使用を企図する。そのような誘導体は、化学的部分またはタンパク質担体との共有結合または凝集結合を含み得る。共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイの試薬として、または結合パートナー（例えば他の抗原）のアフィニティー精製のような精製方法において有用である。ＩＬ−Ｄ８０を、抗ＩＬ−Ｄ８０抗体または代替の結合組成物のアッセイまたは精製に使用するために、共有結合によって、臭化シアン活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのような固体支持体へ、当該分野で周知の方法によって固定化し得るか、またはグルタルアルデヒド架橋を用いて、または用いずにポリオレフィン表面上へ吸着し得る。ＩＬ−Ｄ８０タンパク質をまた、例えば診断的アッセイで使用するために、検出可能なグループで標識し得る。ＩＬ−Ｄ８０の精製は、固定化抗体または相補的結合パートナー、例えば受容体の結合部分によって実施し得る。
【００６５】
本発明の可溶化ＩＬ−Ｄ８０または断片を、結合に特異的な抗血清または抗体の産生のために免疫原として使用し得る。精製抗原を、モノクローナル抗体または天然抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、等を含む抗原結合断片をスクリーニングするために使用し得る。精製ＩＬ−Ｄ８０抗原をまた、上昇したレベルのサイトカインの存在に反応して産生された抗体を検出する試薬として使用し得、それは異常なまたは特定の生理的または疾患状態の診断になり得る。本発明は、配列番号第１、３、７、または９番に示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列、またはそれを含むタンパク質の断片に対して産生された抗体を企図する。特に、本発明は特定のドメイン、例えばヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤに対して結合親和性を有するか、またはそれに対して産生された抗体を企図する。
【００６６】
本発明は、さらに密接に関連した種変異体の単離を企図する。サザンブロットおよびノーザンブロット分析が、類似の遺伝子実体が他の哺乳類に存在することを確立する。ＩＬ−Ｄ８０は種変異体、例えばげっ歯類、ウサギ目、肉食動物、偶蹄目、奇蹄目、および霊長類に広く存在するようである。
【００６７】
本発明はまた、構造、発現、および機能において差異および類似性を両方示す関連抗原のグループを単離する手段を提供する。分子の多くの生理的効果を解明することは、さらなる別の種またはその多型変異体の単離および特徴付けによって非常に加速される。特に、本発明は、異なる種においてさらなる相同的遺伝子実体を同定するために有用なプローブを提供する。
【００６８】
単離遺伝子は、ＩＬ−Ｄ８０の発現を欠く細胞（例えば対応するタンパク質を欠きそして負のバックグラウンド活性を示す種の型または細胞）の形質転換を可能にする。これは形質転換していないコントロール細胞と比較してＩＬ−Ｄ８０の機能の分析を可能にする。
【００６９】
これらの抗原によって媒介される様々な生理的機能を可能にする、重要な構造的エレメントの吟味は、近代分子生物学の標準的な技術を用いて、特に関連するクラスのメンバーを比較して可能である。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３９−１３３６に記載されたホモログスキャニング突然変異生成技術；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２で使用されたアプローチ、およびＬｅｃｈｌｅｉｔｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：４３８１−４３９０を参照のこと。
【００７０】
細胞内機能は、おそらく受容体シグナル伝達を含む。しかし、タンパク質の内在化が特定の環境下で起こり得、そして細胞内成分およびサイトカイン間の相互作用が起こり得る。相互作用している成分とのＩＬ−Ｄ８０の特異的な相互作用セグメントを、突然変異生成または直接生化学的手段、例えば架橋またはアフィニティー法によって同定し得る。結晶学的または他の物理的方法による構造的分析も適用可能である。シグナル伝達メカニズムのさらなる調査は、アフィニティー法または遺伝的手段、例えば変異体の相補分析による、単離可能な結合成分の研究を含む。
【００７１】
ＩＬ−Ｄ８０の発現および調節に関するさらなる研究を追及する。抗原に結合している調節エレメントは、特異な生理的、発生的、組織特異的、または他の発現パターンを示す。上流または下流の遺伝領域、例えば調節エレメントが興味深い。
【００７２】
ＩＬ−Ｄ８０抗原の構造的研究は、新規抗原、特に分子に対してアゴニストまたはアンタゴニスト特性を示すアナログの設計を導く。これを、前に記載した望ましい活性のスペクトルを示す抗原を単離するスクリーニング方法と組み合わせ得る。
【００７３】
（Ｖ．抗体）
抗体は、種、多型、または対立遺伝子変異体を含むＩＬ−Ｄ８０タンパク質、およびその断片の、天然に存在する形でおよびその組換えの形の両方で、様々なエピトープに対して惹起され得る。さらに、抗体は、ネイティブまたは変性バージョンを含む、その活性形態またはその不活性形態のいずれかのＩＬ−Ｄ８０に対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体も企図される。
【００７４】
結合断片および一本鎖バージョンを含む、抗原の前もって決定された断片に対する抗体は、動物を断片と免疫原性タンパク質の結合物で免疫することによって産生し得る。モノクローナル抗体を、望ましい抗体を分泌する細胞から調製する。これらの抗体を、正常または不完全なＩＬ−Ｄ８０への結合に関してスクリーニングし得る、または例えば受容体によって媒介されるアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングし得る。抗体は、例えば受容体への結合を立体的に阻害することによって、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。これらのモノクローナル抗体は、通常少なくとも約１ｍＭ、より通常には少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１００μＭ、より典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭかよりよいＫDで結合する。
【００７５】
配列番号第２、４、８、または１０番のアミノ酸配列からなる免疫原のような、規定された免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するか、またはそれと特異的に免疫反応性であるＩＬ−Ｄ８０タンパク質は、典型的にはイムノアッセイで決定される。イムノアッセイは典型的には、例えば配列番号第２、４、８、または１０番のポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、好ましくは同じ種由来の他のＩＬ−１１、例えばヒトまたはげっ歯類ＩＬ−１１に対して低い交差反応性を有するように選択され、そしてそのような交差反応性は、イムノアッセイに使用する前に免疫吸収によって除去される。
【００７６】
イムノアッセイで使用する抗血清を産生するために、配列番号２、４、８、もしくは１０のタンパク質、またはこれらの組み合せを、本明細書中で記載したように単離する。例えば、組換えタンパク質を哺乳動物細胞系統で産生し得る。適当な宿主、例えばＢａｌｂ／ｃのようなマウスの近交系の系統を、選択されたタンパク質で、典型的にはフロイントアジュバントのような標準的なアジュバントおよび標準的なマウス免疫プロトコールを用いて免疫する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）。あるいは、本明細書中で開示された配列由来で、そしてキャリアタンパク質に結合した合成ペプチドを、免疫原として使用し得る。ポリクローナル血清を回収し、そしてイムノアッセイ、例えば固体支持体に固定化された免疫原を用いた固相イムノアッセイにおいて免疫原タンパク質に対して滴定する。１０4以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、そして他のＩＬ−１１ファミリーメンバー（例えば、げっ歯類ＩＬ−１１）に対する交差反応性に関して、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、５７０−５７３頁で記載されているような競合的結合イムノアッセイを用いて試験する。好ましくは、例えば霊長類ＩＬ−１１と組み合わせて、少なくとも１つの他のＩＬ−１１ファミリーメンバーをこの決定に使用する。ＩＬ−１１ファミリーメンバーを、本明細書中で記載されたように、標準的な分子生物学およびタンパク質化学技術を用いて、組換えタンパク質として産生し、そして単離し得る。
【００７７】
競合的結合形式のイムノアッセイを、交差反応性決定のために使用し得る。例えば、配列番号２または８のタンパク質を、固体支持体に固定化し得る。アッセイに加えられたタンパク質は、固定化抗原への抗血清の結合と競合する。固定化タンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタンパク質の能力を、配列番号２または８のタンパク質と比較する。上記タンパク質の交差反応性パーセントを、標準的な計算を用いて計算する。上記に挙げたタンパク質のそれぞれと１０％より低い交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次いで交差反応性抗体を、プールした抗血清から上記で挙げたタンパク質を用いた免疫吸収によって除去する。
【００７８】
免疫吸収しそしてプールしされた抗血清を次いで、２番目のタンパク質を免疫原タンパク質（例えば、配列番号２、４、８、または１０のＩＬ−１１様タンパク質）と比較するために、上記のように競合的結合イムノアッセイで使用する。この比較を行うために、２つのタンパク質をそれぞれ広い範囲の濃度でアッセイし、そして固定化タンパク質への抗血清の結合を５０％阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が決定される。２番目のタンパク質の必要とされる量が、選択されたタンパク質の必要とされるタンパク質量の２倍より少なければ、２番目のタンパク質は、免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合すると言われる。
【００７９】
本発明の抗体はまた、診断的適用において有用であり得る。捕獲または非中和化抗体として、それらを受容体への結合を阻害することなく抗原に結合する能力に関してスクリーニングし得る。中和化抗体として、それらは競合的結合アッセイで有用であり得る。それらはまた、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質またはその受容体を検出または定量するのに有用である。例えば、Ｃｈａｎ（編、１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編、１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＮｇｏ（編、１９８８）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。交差吸収、涸渇、または他の手段が、規定された選択性（例えば、独特のまたは共通の種特異性）の調製物を提供する。これらは様々なグループの抗原を同定する試験の基礎となり得る。
【００８０】
さらに、抗原結合断片を含む本発明の抗体は、抗原に結合し、そして例えば、生物学的応答を誘発し得るレセプターへの機能的結合を阻害する強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、非中和化抗体として有用であり得、そして抗体が抗原に結合する場合、例えば、その抗原を表面に発現する細胞が殺傷されるように、毒素または放射性核種と結合し得る。さらに、これらの抗体を薬物または他の治療的薬剤に、直接かまたはリンカーによって間接的かのいずれかでに結合し得、そして薬剤標的化を行い得る。
【００８１】
抗原フラグメントを、免疫原として使用される融合または共有結合ポリペプチドとして、他の材料、特にポリペプチドと結合し得る。抗原およびその断片を、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素等のような様々な免疫原と融合または共有結合し得る。ポリクローナル抗血清を調製する方法の記載に関しては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ、１９６９；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００８２】
ある場合には、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒト等のような様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。そのようなモノクローナル抗体を調製する技術の記載は、例えばＳｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびそこで引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；および特にモノクローナル抗体を産生する１つの方法を議論しているＮａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に見出し得る。
【００８３】
他の適当な技術としては、リンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロの曝露、あるいはファージベクターまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら（１９８９）「ファージラムダにおける免疫グロブリンレパートリーの大規模コンビナトリアルライブラリーの産生」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体を、改変の有りまたは無しに使用し得、これには、キメラ抗体およびヒト抗体を含む。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合かまたは非共有結合かのいずれかで結合することによって標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方において広範囲に報告されている。適当な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子等を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を含む。また、組換え免疫グロブリンを産生し得る。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，６４２，３３４号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照のこと。
【００８４】
本発明の抗体をまた、タンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーに使用し得る。抗体が固体支持体に結合されるカラムを調製し得る。例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら（１９８４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：３−５５を参照のこと。抗体を精製するためにこの逆を使用し得る。
【００８５】
各ＩＬ−Ｄ８０に対して産生された抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するのに有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する様々な免疫学的状態を検出または診断するのに有用である。
【００８６】
（ＶＩ．核酸）
記載されたペプチド配列および関連する試薬は、例えば天然の供給源からＩＬ−Ｄ８０をコードするＤＮＡクローンを検出、単離、または同定するのに有用である。典型的には、これらは哺乳動物から遺伝子を単離するのに有用であり、そして同様の手順を他の種、例えば鳥類および哺乳動物のような温血動物から遺伝子を単離するのに適用する。クロスハイブリダイゼーションは、同じ、例えば多型変異体、または他の種からＩＬ−Ｄ８０を単離することを可能にする。適当な核酸クローンを首尾良く単離するために、多くの異なるアプローチが利用可能である。
【００８７】
精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記のように、標準的な方法によって抗体を産生するのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を、免疫系に提示して、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生し得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００８８】
例えば、特異的結合組成物を、ＩＬ−Ｄ８０を発現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用し得る。細胞内発現のスクリーニングを、様々な染色または免疫蛍光手順によって行い得る。結合組成物を、アフィニティー精製または表面融合タンパク質を発現する細胞を分類するために使用し得る。
【００８９】
ペプチドセグメントをまた、ライブラリーをスクリーニングするための適切なオリゴヌクレオチドを予測するために使用し得る。遺伝暗号を、スクリーニングのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するために使用し得る。例えば配列番号１、３、７、または９を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドは、ライブラリーから正しいクローンを選択するのに有用である。相補配列もまた、プローブ、プライマー、またはアンチセンス鎖として使用する。例えば、アンカーベクターもしくはポリＡ相補ＰＣＲ技術または他のペプチドの相補的ＤＮＡと結合した、様々なフラグメントが特に有用である。
【００９０】
本発明は、抗原性または生物学的に活性な対応するＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド、特に記載した配列の非翻訳５’部分をコードする部分を欠くものをコードする、単離ＤＮＡまたは単離フラグメントの使用を意図する。それに加えて、本発明は生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードし、そして適当な条件下で、本明細書中で記載されたＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる、単離ＤＮＡまたは組換えＤＮＡを含む。上記の生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトな抗原、またはフラグメントであり得、そして例えば配列番号２、４、８、または１０で開示されたアミノ酸配列を有し、特に成熟した分泌ポリペプチドを有する。さらに、本発明は、分泌ＩＬ−Ｄ８０と高い同一性を示すタンパク質をコードする、単離もしくは組換えのＤＮＡ、またはそれらのフラグメントの使用を含む。単離ＤＮＡは、５’および３’隣接部にそれぞれ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなどを有し得る。あるいは、発現は、コードセグメントを異種プロモーターに作動可能に連結することによって（例えば、内因性遺伝子由来の上流プロモーターを挿入することによって）実施し得る。
【００９１】
「単離」核酸は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）であり、それは自然にネイティブな配列に付随する他の成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、および／またはもとの種由来の隣接するゲノム配列）から実質的に分離している。その用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を含み、そして組換え体またはクローン化ＤＮＡ単離物および化学的に合成されたアナログまたは異種由来の系によって生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形を含む。一般的に、核酸はベクター中または約５０ｋｂより短い、通常約３０ｋｂより短い、典型的には約１０ｋｂより少ない、そして好ましくは約６ｋｂより短い断片である。
【００９２】
単離核酸は、一般的には分子の均一な組成物であるが、ある実施形態では、少ない不均一性を含む。この不均一性は、典型的にはポリマー末端または望ましい生物学的機能または活性に重要でない部分に見出される。
【００９３】
「組換え」核酸は、その産生方法またはその構造のいずれかによって定義される。その産生方法、例えばある過程によって産生される産物に関して、その過程は、ヌクレオチド配列におけるヒトの介入、典型的には選択または産生を含む、組換え核酸技術の使用である。あるいは、それは、天然にはお互いに隣接しない２つの断片の融合を含む配列の産生によって産生される核酸であり得るが、天然の産物、例えば天然に存在する変異体を除くことを意味する。従って、任意の合成オリゴヌクレオチド過程を用いて得られた配列を含む核酸と同様に、例えば任意の天然に存在しないベクターを用いて細胞を形質転換することによって生成した産物が含まれる。同じかまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンでコドンを置換することが多くの場合行われるが、典型的には配列認識部位を導入または除去することが行われる。
【００９４】
あるいは、通常入手可能な天然の形で見出されない、所望の機能の組み合わせを含む単一の遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）を産生するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合させるためにそれを行う。制限酵素認識部位は、しばしばそのような人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的、例えばプロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、コントロール配列、または他の有用な特徴を設計に組み込み得る。同様のコンセプトが組換え（例えば、融合）ポリペプチドについて意図される。遺伝コードの重複性によって、これら抗原の断片に類似したポリペプチドをコードする合成核酸、および様々な異なる種または多型変異体由来の配列の融合が特に含まれる。
【００９５】
核酸関連における有意な「断片」は、少なくとも約１７ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２２ヌクレオチド、普通少なくとも約２９ヌクレオチド、より多くの場合少なくとも約３５ヌクレオチド、典型的には少なくとも約４１ヌクレオチド、通常少なくとも約４７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５５ヌクレオチド、そして特に好ましい実施形態では少なくとも約６０以上のヌクレオチド（例えば、６７、７３、８１、８９、９５等）の連続セグメントである。
【００９６】
ＩＬ−Ｄ８０タンパク質をコードするＤＮＡは、関連するかまたは同様のタンパク質をコードする遺伝子、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡ種、および異なる種由来の相同的タンパク質をコードするＤＮＡを同定するのに特に有用である。霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、鳥類、および魚類を含む他の種においてホモログが存在する。様々なＩＬ−Ｄ８０タンパク質が相同的であり、そして本明細書中に含まれる。しかし、抗原に対してより遠い進化上の関係を有するタンパク質でさえ、それらが十分相同性であるならば、これらの配列を用いて適当な条件下で容易に単離し得る。霊長類ＩＬ−Ｄ８０タンパク質が特に興味深い。
【００９７】
例えばイントロンを含むゲノム配列に由来する組換えクローンは、例えばトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物を含むトランスジェニック研究、および遺伝子治療に有用である。例えば、Ｒｏｉｔｔ（編）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１５０２−１５０４頁のＧｏｏｄｎｏｗ（１９９２）「トランスジェニック動物」；Ｔｒａｖｉｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１３９２−１３９４；Ｋｕｈｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７０７−７１０；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（編、１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１８０−１９９；およびＣｏｕｒｎｏｙｅｒおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９７−３２９を参照のこと。あるいは、発現は、例えば、内因性遺伝子から上流にプロモーターを挿入することによって、コードセグメントを異種由来のプロモーターに、作動可能に連結することによって実施され得る。例えば、Ｔｒｅｃｏら、ＷＯ９６／２９４１１またはＵＳＳＮ０８／４０６，０３０を参照のこと。
【００９８】
核酸配列比較関係における実質的な相同性（例えば、同一性）は、比較したとき、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列した場合、そのセグメント、またはその相補鎖のいずれかが、少なくとも約５０％のヌクレオチド、一般的に少なくとも約５８％、普通少なくとも約６５％、多くの場合少なくとも約７１％、典型的には少なくとも約７７％、通常少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９５から９８％またはそれより多く、そして特定の実施形態では約９９％またはそれ以上のヌクレオチドで同一であることを意味する。あるいは、そのセグメントが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で、鎖、またはその相補鎖に、典型的には例えば配列番号１、３、７、または９のＩＬ−Ｄ８０の配列を用いて、ハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。典型的には、少なくとも約３０ヌクレオチドの区間にわたり少なくとも約５５％、好ましくは約２５ヌクレオチドの区間にわたり少なくとも約７５％、そして最も好ましくは約２０ヌクレオチドにわたり少なくとも約９０％の同一性が存在する時、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３を参照のこと。記載したように、同一性比較の長さは、より長い区間にわたり得、そしてある実施形態では少なくとも約１７ヌクレオチド、通常少なくとも約２８ヌクレオチド、典型的には少なくとも約４０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約７５〜１００またはそれ以上のヌクレオチドの区間である。
【００９９】
ハイブリダイゼーション関連の相同性に関して、ストリンジェントな条件は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター、典型的にはハイブリダイゼーション反応において調節される条件の、ストリンジェントな組み合わせた条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約３０℃を超える、通常約３７℃を超える、典型的には約５５℃、６０℃、または６５℃を超える、そして好ましくは約７０℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通約１０００ｍＭより少なく、通常約４００ｍＭより少なく、典型的には約２５０ｍＭより少なく、好ましくは、約１５０ｍＭより少なく、約１００ｍＭ、５０ｍＭ、または２０ｍＭさえも含む。しかし、パラメーターの組み合わせが、任意の１つのパラメーターの計測値よりはるかに重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０を参照のこと。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、バックグラウンドに対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３−５倍またはそれ以上のバックグラウンドを与える。
【０１００】
配列比較に関して、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いて、試験および参照配列がコンピューターに入力される時、もし必要ならサブシークエンス座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次いで、参照配列に関連する試験配列について配列同一性パーセントを、指定されたプログラムパラメーターに基づいて計算する。
【０１０１】
比較のために配列の最適なアラインメントを、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索法によって、これらアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ博士、ＷＩ）、または視覚的な観察によって（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）行い得る。
【０１０２】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的な対のアラインメントを使用して、関連する配列のグループから複数の配列アラインメントを作成し、関係および配列同一性パーセントを示す。それはまた、アラインメントを作成するために使用された密集する関係を示すツリーまたは系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の連続アラインメント法の簡約化を使用する。その使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３により記載された方法と同様である。そのプログラムは、それぞれ最長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸の、３００の配列までを整列し得る。複数アラインメント手順は、２つの整列した配列の集団を産生する、２つの最も類似した配列の対のアラインメントから始まる。この集団を次いで、次に最も関連した配列または整列配列の集団に対して整列させる。２つの配列の集団を、２つの個々の配列の、対のアラインメントの単純な拡張によって整列させる。最終的なアラインメントを、一連の連続した対のアラインメントによって達成する。そのプログラムは、配列比較の領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメーターを指定することによって実行される。例えば、参照配列を他の試験配列と比較して、以下のパラメーターを使用して配列同一性パーセントの関係を決定し得る：デフォルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）、および重量末端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐｓ）。
【０１０３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適当な、他のアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列中で長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコア配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。これは、データベース配列において同じ長さのワードと整列した場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたは満たす。Ｔは隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これら最初の隣接ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｈｉｔｓ）は、それらを含むより長いＨＳＰｓを発見する探索を開始する種として作用する。ｗｏｒｄ ｈｉｔｓを次いで、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列にそって両方向に拡張する。各方向へのｗｏｒｄ ｈｉｔｓの拡張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値よりＸ量だけ減少する場合；１つ以上のネガティブスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感受性およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして１１のワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【０１０４】
配列同一性パーセント計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の、類似性の統計学的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最少和可能性（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる可能性の指標を示す。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較におけるｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙが約０．１より低い、より好ましくは約０．０１より低い、そして最も好ましくは約０．００１より低いならば、核酸は参照配列と類似していると判断される。
【０１０５】
ポリペプチドの２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる指標は、下記で記載するように、最初の核酸によってコードされるポリペプチドが、２番目の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、下記で記載するように、２つの分子がストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。
【０１０６】
他の哺乳類種由来のＩＬ−Ｄ８０を、密接に関連する種の種間ハイブリダイゼーションによってクローニングおよび単離し得る。相同性は、遠く関連する種の間では比較的低くあり得、従って比較的密接に関連した種のハイブリダイゼーションが賢明である。あるいは、あまり種特異性を示さない抗体製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の調製が、発現クローニングアプローチに有用であり得る。
【０１０７】
（ＶＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０の作成；模倣物）
ＩＬ−Ｄ８０またはその断片をコードするＤＮＡを、化学的合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞系統または組織試料から調製したゲノムライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。例えば、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０；ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９；およびＧｌｏｖｅｒ（編、１９８４）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。あるいは、本明細書中で提供される配列は、有用なＰＣＲプライマーを提供するか、または、ＩＬ−Ｄ８０をコードする適当な遺伝子の合成または他の調製を可能にし、これらには、天然に存在する実施形態が挙げられる。
【０１０８】
次に例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するために使用され得る全長ＩＬ−Ｄ８０または断片の合成のために；結合研究のために；修飾分子の構築および発現のために；そして構造／機能研究のために、このＤＮＡを広範な種々の宿主細胞に発現し得る。効果的な分泌のためにシャペロンタンパク質の必要性が存在し得るか、または細胞内区画からタンパク質を回収するためにさらなる工程が必要であり得る。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、および宿主ゲノムへのＤＮＡ断片の組み込みが可能な他の担体を含む。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（１９８５および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編、１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡを参照のこと。
【０１１０】
本発明の目的のために、ＤＮＡ配列は、それらが互いに機能的に関連している時、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｅｎｃｅ）または分泌リーダーのＤＮＡは、それがプレタンパク質として発現されるか、または細胞膜へのポリペプチドの方向付けに関与するかまたはポリペプチドの分泌に関与する場合、ポリペプチドに作動可能に連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を調節する場合、コード配列と作動可能に連結しており；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置する場合、コード配列と実施可能に連結している。通常、作動可能に連結されて（して）いるとは、隣接およびリーディングフレーム内であることを意味するが、リプレッサー遺伝子のようなある遺伝エレメントは、隣接して連結していないが依然として発現を調節するオペレーター配列に結合する。例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、第１０章、２０５−２３６頁；ＢａｌｂａｓおよびＢｏｌｉｖａｒ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：１４−３７、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。
【０１１１】
適当な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６−１１４２を参照のこと）；ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２を参照のこと）；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバキュロウイルスベターが挙げられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７−１９９を参照のこと。
【０１１２】
特異的または規定されたグリコシル化パターンを提供するシステムでＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドを発現することが、多くの場合望ましい。例えば、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５；およびＫａｕｆｍａｎ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１を参照のこと。
【０１１３】
ＩＬ−Ｄ８０またはその断片は、細胞膜に結合したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）へ操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）を用いた処理によって膜から除取り出され得る。これは、抗原を生物学的に活性な形で放出し、そしてタンパク質化学の標準的手順による精製を可能にする。例えば、Ｌｏｗ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８８：４２７−４５４；Ｔｓｅら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１００３−１００８；およびＢｒｕｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４：１２７５−１２８３を参照のこと。
【０１１４】
ここで、ＩＬ−Ｄ８０が特徴付けられ、その断片または誘導体を、ペプチド合成の従来の処理によって調製し得る。これらは、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＶｉｌｌａｆｒａｎｃａ（編、１９９１）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａで記載されているような手順を含む。
（ＶＩＩＩ．使用）
本発明は、例えばＩＬ−Ｄ８０が媒介する状態、または下記の診断キットの記載において、本明細書中の他の場所で記載されるように、診断的適用において用途を見出す試薬を提供する。その遺伝子は、例えば、げっ歯類をヒトと区別するために、または異なる発現または修飾パターンを示す、異なる細胞間を区別するマーカーとして、法科学において有用であり得る。
【０１１５】
本発明はまた、有意な商業および／または治療的可能性を有する試薬を提供する。ＩＬ−Ｄ８０（天然に存在するまたは組換えの）、その断片、およびそれに対する抗体は、ＩＬ−Ｄ８０に結合親和性を有すると同定された化合物とともに、分子生物学、免疫学、または生理学の技術を教える試薬として有用である。適切なキットを、例えばタンパク質、抗体、クローニング法、組織学等の産生または使用の実際的な研究室実習において、試薬とともに調製し得る。
【０１１６】
その試薬はまた、炎症性状態を含む異常な生理学または発症に関連する状態の治療に有用である。それらは、相互作用する成分の存在または非存在に関するインビトロ試験に有用であり得る。それは特定の治療戦略の成功と関連し得る。特に、様々な、例えば造血またはリンパ性細胞の生理機能の調節を、本明細書中で提供される組成物を用いる適当な治療法によって達成する。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９８８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂを参照のこと。
【０１１７】
例えば、異常な発現またはＩＬ−Ｄ８０による異常なシグナル伝達に関連する疾患または障害は、アゴニストまたはアンタゴニストについての標的であるようである。その新規サイトカインは造血細胞（例えばリンパ球）の調節または発生に役割を果たし、造血細胞は免疫学的反応（例えば、炎症および／または自己免疫疾患）に影響を与える。あるいは、これは血管生理学または発生、または神経効果に影響を与え得る。
【０１１８】
特に、そのサイトカインは、様々な関連で、細胞によるサイトカイン合成、増殖等を媒介する。ＩＬ−Ｄ８０の天然に存在する形のムテイン改変体、または阻害抗体のようなＩＬ−Ｄ８０のアンタゴニストは、例えば炎症性または自己免疫反応のような状況において、免疫反応を阻害する選択的および強力な方法を提供し得る。Ｓａｍｔｅｒら（編）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ 第１および２巻、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．をも参照のこと。
【０１１９】
例えば、ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡ発現によって評価されるように、ＩＬ−Ｄ８０を産生する異なる細胞型における、様々な異常な状態が公知である。Ｂｅｒｋｏｗ（編）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．；Ｔｈｏｒｎら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｙ．；およびＷｅａｔｈｅｒａｌｌら（編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。多くの他の医学的状態および疾患が、マクロファージまたは単球による活性化を含み、そしてこれらの多くが、本明細書中で提供されるアゴニストまたはアンタゴニストによる治療に反応性である。例えば、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（編、１９９１）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ；およびＳａｍｔｅｒら（編）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏを参照のこと。これらの問題は、本明細書中で提供される組成物を使用する予防または治療に感受性である。
【０１２０】
ＩＬ−Ｄ８０、アンタゴニスト、抗体等は、精製し次いで患者、獣医のまたはヒトに投与し得る。これらの試薬を、治療的使用のために、例えば伝統的な薬剤学的に許容できる担体または希釈剤、例えば免疫原性アジュバント中で、生理学的に無害な安定化剤、賦形剤、または保存剤とともに、さらなる活性または不活性成分と組み合わせ得る。これらの組み合せを滅菌濾過し、そして投薬バイアル中における凍結乾燥によるように投薬形式に配置、または安定化水性調製物中で保存し得る。本発明はまた、補体結合をしない形を含む、抗体またはその結合フラグメントの使用を企図する。
【０１２１】
ＩＬ−Ｄ８０またはそのフラグメントを用いた薬剤のスクリーニングを、関連する成分の単離を含んで、結合親和性を有する、またはＩＬ−Ｄ８０機能に対して他の関連する生物学的効果を有する化合物を同定するために実施し得る。次いで続く生物学的アッセイを、その化合物が内因性の刺激活性を有するかどうか、および従ってそのサイトカインの活性を阻害する阻害剤またはアンタゴニストであるかどうかを決定するために利用し得る。同様に、内因性刺激活性を有する化合物は、シグナル伝達経路を活性化し得、そして従ってＩＬ−Ｄ８０の活性を刺激するアゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのＩＬ−Ｄ８０に対する阻害抗体およびアゴニストとしての刺激抗体の治療的使用を企図する。このアプローチは、他のＩＬ−Ｄ８０種変異体で特に有用であるはずである。
【０１２２】
有効な治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、および投与される他の薬剤を含む、多くの異なる因子に依存する。従って、治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投与量が、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量の、有用な指標を提供し得る。特定の障害の治療に関する有効な投与量の動物試験は、ヒト投与量のさらに予期される指標を提供する。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、最新版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎに様々な考慮事項が記載されている。投与方法は、例えば経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散、および他に関して、その中および下記で議論される。薬剤学的に許容できる担体は、水、生理食塩水、緩衝液、および例えばＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙで記載されている他の化合物を含む。投与量範囲は、適当な担体とともに、普通１ｍＭ濃度より低い、代表的には約１０μＭ濃度未満、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル）未満であることが予期される。徐放性の処方または徐放性の装置が、連続的または長期投与のために多くの場合利用される。例えばＬａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと。
【０１２３】
ＩＬ−Ｄ８０、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグメント、アンタゴニスト、およびアゴニストを、治療される宿主へ直接投与し得るか、または化合物の大きさに依存して、投与の前にそれらを卵アルブミンまたは血清アルブミンのような担体タンパク質に結合させることが望ましくあり得る。治療的処方を、多くの伝統的な投薬処方で投与し得る。活性成分を単独で投与することが可能であるが、それを薬剤学的処方として提供することが好ましい。処方は、代表的には上記で定義されたような少なくとも１つの活性成分を、１つ以上のその許容できる担体とともに含む。各担体は、他の成分と適合性であり、そして患者に有害でないという意味で、薬剤学的にもおよび生理学的にも許容可能であるべきである。処方は、経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）投与に適当なものを含む。処方は、単位投薬形式で簡便に提供され得、そして薬学の分野で周知のあらゆる方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編、１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編、１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編、１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編、１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤、例えばＩＬ−１１を含む他のサイトカイン、またはそのアンタゴニストと組み合わせ得る、またはそれと共同して使用し得る。
【０１２４】
本発明のＩＬ−Ｄ８０の天然に存在する形式および組換え形式はどちらも、化合物をそのタンパク質への結合活性に関してスクリーニングすることができるキットおよびアッセイ方法で特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が最近開発され、短い期間で何万もの化合物のスクリーニングを可能にした。例えば、Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３を参照のこと。それは固体基板上で合成された複数の規定されたポリマーによる、結合親和性の試験方法を記載している。適当なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような、大量の精製、可溶性ＩＬ−Ｄ８０が入手可能であることによって非常に促進され得る。
【０１２５】
ＩＬ−Ｄ８０−ＩＬ−Ｄ８０受容体相互作用において決定的な残基を決定するために、他の方法を使用し得る。相互作用および／またはシグナル伝達において決定的な特定の残基を決定するために、突然変異分析を行い得る。例えば、Ｓｏｍｏｚａら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．１７８：５４９−５５８を参照のこと。ＰＨＤ（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９：５５−７２）およびＤＳＣ（ＫｉｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：２２９８−２３１０）は、αヘリックス（Ｈ）、β鎖（Ｅ）またはコイル（Ｌ）の２次構造の予測を提供し得る。受容体相互作用においてヘリックスＡおよびＤが最も重要であり、Ｄヘリックスがより重要な領域である。様々なヘリックスの境界を上記で示す。表面に曝露された残基は、受容体結合に影響し、一方埋め込まれた残基は一般的な構造に影響する。
【０１２６】
例えば、一旦抗原が構造的に定義されれば、例えば３次構造データによって、アンタゴニストは普通見出され得る。可能性のある相互作用アナログの試験は、精製ＩＬ−Ｄ８０を用いた高度に自動化されたアッセイ方法の開発によって現在可能である。特に、新規アゴニストおよびアンタゴニストが、本明細書中で記載されるスクリーニング技術を用いて発見される。ある範囲のＩＬ−Ｄ８０分子に対してあわせた結合親和性を有することが見出された化合物、例えばＩＬ−Ｄ８０の種変異体に対してアンタゴニストとして作用し得る化合物が特に重要である。
【０１２７】
薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＩＬ−Ｄ８０を発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換した真核または原核宿主細胞を利用する。他の分子と離れてＩＬ−Ｄ８０を発現する細胞を単離し得る。そのような細胞を、生存可能なまたは固定された形式のいずれかで、標準的な結合パートナー結合アッセイで使用し得る。Ｐａｒｃｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４００７−４０１１も参照のこと。それは細胞反応を検出する鋭敏な方法を記載している。
【０１２８】
薬剤スクリーニングの別の技術は、ＩＬ−Ｄ８０に対して適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供するアプローチを含み、そしてそれは１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎ、欧州特許出願第８４／０３５６４号に詳しく記載されている。まず、多くの異なる小さなペプチド試験化合物を固体基板、例えばプラスチックピンまたは他の適当な表面上に合成する。Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を参照のこと。次いで全てのピンを可溶化未精製ＩＬ−Ｄ８０、または可溶化精製ＩＬ−Ｄ８０と反応させ、そして洗浄する。次の工程は、結合したＩＬ−Ｄ８０を検出することを含む。
【０１２９】
合理的な薬剤設計も、ＩＬ−Ｄ８０および他のエフェクターまたはアナログの分子形の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、結合に反応して他の機能を媒介する他のタンパク質、または通常ＩＬ−Ｄ８０と相互作用する他のタンパク質、例えば受容体であり得る。特定の他のタンパク質とどの部位が相互作用しているか決定する１つの方法は、物理的構造決定、例えばＸ線結晶学、または２次元ＮＭＲ技術である。これらは、例えば他のサイトカイン−受容体モデルに対してモデルを作ったときに、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかに関して指標を提供する。タンパク質構造決定の詳しい記載に関しては、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１３０】
（ＩＸ．キット）
本発明はまた、別のＩＬ−Ｄ８０または結合パートナーの存在を検出するための、様々な診断キットおよび方法において、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびその融合産物の使用を企図する。代表的には、キットは、規定されたＩＬ−Ｄ８０ペプチドもしくは遺伝子セグメントのいずれか、またはどちらか１つ（例えばＩＬ−Ｄ８０フラグメントもしくは抗体）を認識する試薬を含む区画を有する。
【０１３１】
試験化合物のＩＬ−Ｄ８０への結合親和性を決定するキットは、代表的には試験化合物；標識化合物、例えばＩＬ−Ｄ８０に対して公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体；ＩＬ−Ｄ８０の供給源（天然に存在するものまたは組換え体）；および分子を固定化する固相のような、遊離標識化合物から結合したものを分離する手段を含む。一旦化合物をスクリーニングすると、抗原に対して適当な結合親和性を有するものを、当該分野で周知であるような適当な生物学的アッセイで評価して、それらがＩＬ−Ｄ８０シグナル伝達経路に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうか決定し得る。組換えＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドが入手可能であることはまた、そのようなアッセイを較正する、よく規定された標準を提供する。
【０１３２】
試料中の、例えばＩＬ−Ｄ８０の濃度を決定する好ましいキットは、代表的には標識化合物、例えば抗原に対して公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体、サイトカインの供給源（天然に存在するものまたは組換え体）、およびＩＬ−Ｄ８０を固定化する固相のような、遊離標識化合物から結合したものを分離する手段を含む。試薬および指示を含む区画が正常に提供される。
【０１３３】
ＩＬ−Ｄ８０またはフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを含む抗体は、上昇したレベルのＩＬ−Ｄ８０および／またはそのフラグメントの存在を検出する診断的適用に有用である。そのような診断的アッセイは、溶解物、生きた細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を採用し得、そしてさらに血清等におけるその抗原に関連する抗原の検出を含み得る。診断アッセイは、同種（遊離試薬および抗原−結合パートナー複合体間の分離工程なし）または異種（分離工程あり）であり得る。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）等のような様々な市販のアッセイが存在する。例えば、Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓら（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１−５２５；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８０）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；およびＣｏｌｉｇａｎら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。
【０１３４】
抗イディオタイプ抗体を、様々な異常状態の診断になり得るので、ＩＬ−Ｄ８０に対する抗体の存在を診断するために同様に使用し得る。例えば、ＩＬ−Ｄ８０の過剰産生は、特に癌または異常な活性化または分化のような増殖細胞状態において、異常な生理的状態の診断となり得る様々な免疫反応の産生を引き起こし得る。さらに、入手可能な分布パターンは、そのサイトカインは膵島に発現されているという情報を提供し、そのサイトカインはその臓器の機能、例えば糖尿病に関連する医学的状態に関連し得る可能性を示唆する。
【０１３５】
多くの場合、アッセイの感受性を最適化するために、診断アッセイの試薬はキットで供給される。本発明のために、アッセイの性質に依存して、プロトコール、および標識、標識化もしくは未標識化抗体または結合パートナーのいずれか、または標識化ＩＬ−Ｄ８０が提供される。これは普通、緩衝剤、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル産生に必要な材料等のような、他の添加剤と組み合わせられる。好ましくは、キットはまた、適当な使用および使用後の内容物の廃棄に関する指示を含む。代表的には、キットは各有用な試薬のための区画を有する。望ましくは、試薬は凍結乾燥粉末として提供される。ここで試薬は、アッセイを行うのに適当な試薬濃度を提供する水性溶媒中で再構築され得る。
【０１３６】
薬剤スクリーニングおよび診断アッセイの、多くの前述の成分は、修飾無しで使用し得る、または様々な方法で修飾し得る。例えば、標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分と共有または非共有結合させることによって達成し得る。いかなるこれらのアッセイにおいても、結合パートナー、試験化合物、ＩＬ−Ｄ８０、またはそれに対する抗体は、直接または間接的に標識し得る。直接標識の可能性は、標識グループ：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強度の変化、波長の変化、または蛍光の偏光をモニターすることができる蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）を含む。間接的標識の可能性は、１つの成分のビオチン化、続く上記の標識グループの１つと結合したアビジンへの結合を含む。
【０１３７】
遊離ＩＬ−Ｄ８０から結合したものを、あるいは遊離試験化合物から結合したものを分離する多くの方法も存在する。ＩＬ−Ｄ８０を様々なマトリックスに固定化、続いて洗浄し得る。適当なマトリックスは、ＥＬＩＳＡプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズを含む。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第２章、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。他の適当な分離技術は、制限無しに、Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０：１４５７−１４６１で記載されたフルオレセイン抗体磁化可能粒子法、および米国特許第４，６５９，６７８号で記載されたような二重抗体磁気粒子分離を含む。
【０１３８】
タンパク質またはそのフラグメントを様々な標識に結合させる方法は、文献に広く報告されており、そしてここで詳しく議論する必要はない。その技術の多くは、結合のために、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルの使用による活性化カルボキシル基の使用、メルカプト基のクロロアセチルのような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとの反応によるチオエーテルの形成等を含む。融合タンパク質もこれらの適用において使用される。
【０１３９】
本発明の別の診断的局面は、ＩＬ−Ｄ８０の配列から取られたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列を、異常な状態、例えば炎症または自己免疫を有することが疑われる患者由来の試料中で、ＩＬ−Ｄ８０メッセージのレベルを検出するプローブとして使用し得る。サイトカインは活性化のマーカーまたはメディエーターとなり得るので、例えば効果が有意になりそして進行する前に予防的な様式で、例えばいつ追加治療が要求され得るかを決定するために、活性化細胞の数を決定するのに有用であり得る。ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイズは、文献において豊富に記載および議論されている。例えば、Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：４３８１−４３８５；Ｃａｓｋｅｙ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：９６２−９６７；およびＷｉｌｃｈｅｋら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２を参照のこと。
【０１４０】
他の分子の定性または定量的発現を試験する診断キットもまた企図される。診断または予後はマーカーとして使用される複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットはマーカーの組み合わせに関して試験し得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１：８９−９を参照のこと。他の細胞サブセットを評価するために他のキットを使用し得る。
【０１４１】
（Ｘ．ＩＬ−Ｄ８０受容体の単離）
特異的なリガンド−受容体相互作用のリガンドが単離されたなら、受容体を単離する方法が存在する。Ｇｅａｒｉｎｇら（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：３６６７−３６７６を参照のこと。例えば、その受容体への結合を阻害することなくＩＬ−Ｄ８０サイトカインを標識する手段を決定し得る。例えば、親和性標識をリガンドのアミノまたはカルボキシル末端のいずれかに融合し得る。そのような標識は、ＦＬＡＧエピトープタグ、または、例えばＩｇまたはＦｃドメインであり得る。発現ライブラリーを、例えば細胞分類、または他のスクリーニングによって、サイトカインに対する特異的な結合に関してスクリーニングして、そのような結合成分を発現する部分集団を検出し得る。例えば、Ｈｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２６７−１１２７１；およびＬｉｕら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１８２１−２９を参照のこと。あるいは、パニング法を使用し得る。例えば、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５−３３６９を参照のこと。
【０１４２】
標識とのタンパク質架橋技術を適用して、ＩＬ−Ｄ８０サイトカインの結合パートナーを単離し得る。これは、例えばリガンド−受容体様の方法でサイトカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定を可能にする。ＩＬ−Ｄ８０はＩＬ−１１Ｒαサブユニットまたは密接に相同的な受容体サブユニットに結合することが予期される。受容体のβサブユニットは、ｇｐ１３０であるようであり、おそらくＬＩＦ受容体がさらなる受容体成分として関与している。
【０１４３】
初期の実験は、予期されるように、公知のＩＬ−１１受容体成分がＩＬ−Ｄ８０への反応に関与しているかどうかを決定するために行われる。これらの機能的受容体複合体が、特異的受容体サブユニットまたは補助受容体サブユニットのいずれか、ＩＬ−Ｄ８０受容体複合体と多くのまたは全ての成分を共有し得ることも、かなり可能性がある。
【実施例】
【０１４４】
（実施例）
（Ｉ．一般的な方法）
下記の標準的な方法の多くは、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１−３巻、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および増刊）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；Ｉｎｎｉｓら（編、１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹにおいて記載または参照されている。タンパク質精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法を含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期的な増刊）；Ｄｕｅｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「タンパク質精製ガイド」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、およびこのシリーズの他の巻；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９５および増刊）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（編、１９９３）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；およびタンパク質精製製品を使用する時の製造業者の文献、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡを参照のこと。組換え技術との組み合わせは、例えばプロテアーゼで除去し得る配列による、適当なセグメント（エピトープタグ）の、例えば融合され得るＦＬＡＧ配列または同等物への融合を可能にする。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ １２：６９−７０；Ｓｅｔｌｏｗ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：８７−９８、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹのＨｏｃｈｕｌｉ（１９９０）「金属キレート吸収物質による組換えタンパク質の精製」；およびＣｒｏｗｅら（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱＵＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡを参照のこと。
【０１４５】
標準的な免疫学的技術は、例えば、Ｈｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇら（編、１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１−４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第７０、７３、７４、８４、９２、９３、１０８、１１６、１２１、１３２、１５０、１６２、および１６３巻において記載されている。サイトカインアッセイは、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｍｉｒｅ−ＳｌｕｉｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂ．において記載されている。
【０１４６】
血管生物学的活性に関するアッセイは、当該分野で周知である。それらは、腫瘍、または他の組織、例えば動脈平滑筋の増殖（例えばＫｏｙｏｍａら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：１０６９−１０７８を参照のこと）、血管上皮に対する単球の接着（ＭｃＥｖｏｙら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２０６９−２０７７を参照のこと）等における血管形成および血管形成抑制性（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性を含む。Ｒｏｓｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８０１−８０９；ＲｅｋｈｔｅｒおよびＧｏｒｄｏｎ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：６６８−６７７；Ｔｈｙｂｅｒｇら（１９９０）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０：９６６−９９０；およびＧｕｍｂｉｎｅｒ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：３４５−３５７も参照のこと。
【０１４７】
神経細胞生物学的活性に関するアッセイは、例えばＷｏｕｔｅｒｌｏｏｄ（編、１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、モジュール１０、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＮｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪにおいて記載されている。発生系の方法論は、例えばＭｅｉｓａｍｉ（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにおいて記載されている。
【０１４８】
ＦＡＣＳ分析は、Ｍｅｌａｍｅｄら（１９９０）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ（１９８８）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら（１９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにおいて記載されている。
【０１４９】
（ＩＩ．ヒトＩＬ−Ｄ８０のクローニング）
霊長類、例えばヒト遺伝子の配列が、表１で提供される。これらの配列は配列データベースから得られる。これらの配列は、遺伝子の細胞分布を決定するためのＰＣＲプライマー、またはプローブの調製を可能にする。これらの配列は、メッセージをコードするゲノムＤＮＡの単離を可能にする。
【０１５０】
プローブまたはＰＣＲプライマーを用いて、様々な組織または細胞型を探索（ｐｒｏｂｅ）して細胞分布を決定する。ＰＣＲ産物を、例えばＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングする。できたｃＤＮＡプラスミドを、自動化シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において両端から配列決定する。
【０１５１】
（ＩＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０の細胞発現）
霊長類ＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡに特異的な、適切なプローブまたはプライマーを調製する。典型的には、プローブを例えばランダムプライミングによって標識する。
【０１５２】
サザン分析：１次増幅したｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡ（５μｇ）を、適切な制限酵素で消化して挿入物を放出し、１％アガロースゲルに泳動して、そしてナイロン膜へ転写した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）。
【０１５３】
ヒトｍＲＮＡ単離のための試料は、以下のものを含み得る：末梢血単核細胞（単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球、Ｂ細胞）、休止（Ｔ１００）；末梢血単核細胞、２、６、１２時間抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０１）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、休止（Ｔ１０２）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、３、６、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０３）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、２、７、１２時間特異的ペプチドでアネルギー処理してプール（Ｔ１０４）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、休止（Ｔ１０７）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、３、６、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０８）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、２、６、１２時間特異的なペプチドでアネルギー処理してプール（Ｔ１０９）；Ｔ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５、休止（Ｔ１１０）；Ｔ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５、２、７、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１１１）；Ｔ細胞腫瘍株ＪｕｒｋａｔおよびＨｕｔ７８、休止（Ｔ１１７）；Ｔ細胞クローン、プールしたＡＤ１３０．２、Ｔｃ７８３．１２、Ｔｃ７８３．１３、Ｔｃ７８３．５８、Ｔｃ７８２．６９、休止（Ｔ１１８）；Ｔ細胞ランダムγδＴ細胞クローン、休止（Ｔ１１９）；ＣＤ２８−Ｔ細胞クローン；脾臓細胞、休止（Ｂ１００）；脾臓細胞、抗ＣＤ４０およびＩＬ−４で活性化（Ｂ１０１）；Ｂ細胞ＥＢＶ株、プールしたＷＴ４９、ＲＳＢ、ＪＹ、ＣＶＩＲ、７２１．２２１、ＲＭ３、ＨＳＹ、休止（Ｂ１０２）；Ｂ細胞株ＪＹ、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｂ１０３）；プールしたＮＫ２０クローン、休止（Ｋ１００）；プールしたＮＫ２０クローン、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｋ１０１）；ＮＫＬクローン、ＬＧＬ白血病患者の末梢血由来、ＩＬ−２処理（Ｋ１０６）；造血前駆細胞株ＴＦ１、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１００）；Ｕ９３７前単球株、休止（Ｍ１００）；Ｕ９３７前単球株、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｍ１０１）；溶出（ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）単球、１、２、６、１２、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０２）；溶出単球、１、２、６、１２、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０３）；溶出単球、４、１６時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０６）；溶出単球、４、１６時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０７）；溶出（ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）単球、１時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０８）；溶出単球、６時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０９）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、休止（Ｄ１０１）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、１時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０２）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０３）；ＤＣ９５％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０４）；ＤＣ９５％ ＣＤ１４＋、ｅｘ ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０５）；ＤＣ ＣＤ１ａ＋ ＣＤ８６＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０６）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、休止（Ｄ１０７）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、休止（Ｄ１０８）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、４、１６時間ＬＰＳで活性化してプール（Ｄ１０９）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、４、１６時間ＴＮＦα、単球スープ（ｓｕｐｅ）で活性化してプール（Ｄ１１０）；上皮細胞、未刺激；上皮細胞、ＩＬ−１β活性化；肺線維芽細胞肉腫株ＭＲＣ５、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１０１）；腎臓上皮癌細胞株ＣＨＡ、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１０２）。
【０１５４】
げっ歯類、例えばマウスの対応物が同定され、そしてその分布を同様に評価する。マウスｍＲＮＡ単離の試料は、以下の物を含み得る：休止マウス線維芽Ｌ細胞株（Ｃ２００）；Ｂｒａｆ：ＥＲ（エストロゲンレセプターに融合したＢｒａｆ）トランスフェクト細胞、コントロール（Ｃ２０１）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、休止（Ｔ２０９）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、ＴＨ１細胞へ分極化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）させるためにＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で刺激、６、１２、２４時間ＩＦＮγおよびＩＬ−４へ曝露してプール（Ｔ２１０）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞へ分極化させるためにＩＬ−４および抗ＩＦＮγで刺激、６、１３、２４時間ＩＬ−４および抗ＩＦＮγへ曝露してプール（Ｔ２１１）；Ｔ細胞、ＴＨ１分極化（脾臓由来のＭｅｌ１４光（ｂｒｉｇｈｔ）ＣＤ４＋細胞、ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−４で７日間分極化；Ｔ２００）；Ｔ細胞、ＴＨ２分極化（脾臓由来のＭｅｌ１４光ＣＤ４＋細胞、ＩＬ−４および抗ＩＦＮγで７日間分極化；Ｔ２０１）；Ｔ細胞、トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の高度にＴＨ１分極化３×（Ｏｐｅｎｓｈａｗら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３５７−１３６７を参照のこと；２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２０２）；Ｔ細胞、トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の高度にＴＨ２分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２０３）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ１分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１２）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ２分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１３）；Ｔ細胞、高度にＴＨ１分極化（トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で分極化３×；６、１２、２４時間ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で刺激、プール）；ＣＤ４４− ＣＤ２５＋ 前駆Ｔ細胞、胸腺から分類（Ｔ２０４）；ＴＨ１ Ｔ細胞クローンＤ１．１、抗原による最後の刺激から３週間休止（Ｔ２０５）；ＴＨ１ Ｔ細胞クローン Ｄ１．１、１５時間 １０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激（Ｔ２０６）；ＴＨ２ Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５、抗原による最後の刺激から３週間休止（Ｔ２０７）；ＴＨ２ Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５、１５時間 １０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激（Ｔ２０８）；未刺激Ｂ細胞株ＣＨ１２（Ｂ２０１）；未刺激成熟Ｂ細胞白血病細胞株Ａ２０（Ｂ２００）；脾臓由来の未刺激ラージＢ細胞（Ｂ２０２）；全脾臓由来のＢ細胞、ＬＰＳ刺激（Ｂ２０３）；脾臓由来メトリザマイド濃縮樹状細胞、休止（Ｄ２００）；骨髄由来樹状細胞、休止（Ｄ２０１）；抗Ｂ２２０、抗ＣＤ３、および抗クラスＩＩで枯渇した未刺激骨髄由来樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で培養（Ｄ２０２）；抗Ｂ２２０、抗ＣＤ３、および抗クラスＩＩで枯渇した骨髄由来樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で培養、１、５時間抗ＣＤ４０で刺激、プール（Ｄ２０３）；ＬＰＳで４時間活性化した単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（Ｍ２００）；ＧＭおよびＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ（Ｍ２０１）；ＧＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、およびＩＬ−１０で刺激（Ｍ２０５）；ＧＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および抗ＩＬ−１０で刺激（Ｍ２０６）；腹腔マクロファージ（Ｍ２０７）；マクロファージ細胞株Ｊ７７４、休止（Ｍ２０２）；０．５、１、３、６、１２時間のマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋抗ＩＬ−１０、プール（Ｍ２０３）；０．５、１、３、５、１２時間のマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋ＩＬ−１０、プール（Ｍ２０４）；未刺激肥満細胞株ＭＣ−９およびＭＣＰ−１２（Ｍ２０８）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、未刺激（Ｅ２００）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαで一晩刺激（Ｅ２０１）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαで一晩刺激（Ｅ２０２）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０で一晩刺激（Ｅ２０３）；ｗｔＣ５７ｂｌ／６マウス由来の全大動脈；５ヶ月齢ＡｐｏＥ ＫＯ マウス由来の全大動脈（Ｘ２０７）；１２ヶ月齢ＡｐｏＥ ＫＯ マウス由来の全大動脈（Ｘ２０７）；ｗｔ胸腺（Ｏ２１４）；全胸腺、ｒａｇ−１（Ｏ２０８）；全腎臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０９）；全腎臓、ＮＺ Ｂ／Ｗマウス；および全心臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０２）。ＬＰＳで４時間活性化した単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（Ｍ２００）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ１分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１２）；およびＴ細胞、高度にＴＨ１分極化（トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で分極化３×；ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で６、１２、２４時間刺激してプール）で高いシグナルが検出された。
【０１５５】
（ＩＶ．ＩＬ−Ｄ８０の染色体マッピング）
単離されたＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡを使用する。染色体マッピングは標準的な技術である。例えば、ＢＩＯＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）およびマウス体細胞ハイブリッドパネルをＰＣＲと共に使用する方法を参照のこと。
【０１５６】
（Ｖ．ＩＬ−Ｄ８０タンパク質の精製）
複数のトランスフェクトした細胞株を、他の細胞に比べて高いレベルでサイトカインを発現するものに関してスクリーニングする。様々な細胞株を、操作に好ましい性質に関してスクリーニングおよび選択する。天然ＩＬ−Ｄ８０を天然の供給源から、または適切な発現ベクターを用いて形質転換した細胞からの発現によって単離し得る。発現タンパク質の精製は、標準的な手順によって達成され得る、または細胞溶解物または上清から高い効率で効率的に精製するために遺伝子工学の手段と組み合わせられ得る。ＦＬＡＧ、またはＨｉｓ6セグメントをそのような精製の特徴のために使用し得る。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーを、特異的な抗体と共に使用し得る。下記を参照のこと。
【０１５７】
タンパク質を、望むように、大腸菌、昆虫細胞、または哺乳動物発現系で産生する。ＩＬ−Ｄ８０構築物を、エピトープタグ付加（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、例えばＦＬＡＧと共に調製した。その構築物を一過的に２９３細胞に発現させ、そしてタグイムノアフィニティーカラム技術を用いて上清から精製した。高度に精製されたタンパク質を得た。
【０１５８】
（ＶＩ．相同なＩＬ−Ｄ８０遺伝子の単離）
ＩＬ−Ｄ８０ ｃＤＮＡ、または他の種の対応する配列を、望ましい供給源由来のライブラリー、例えば霊長類細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。多くの異なる種を、容易なハイブリダイゼーションに必要なストリンジェンシーに関して、そしてプローブを用いて存在に関してスクリーニングし得る。適切なハイブリダイゼーション条件を、クロスハイブリダイゼーションの特異性を示すクローンを選択するために使用する。
【０１５９】
ペプチド配列に基づく縮重プローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングはまた、適切なクローンの単離を可能にする。あるいは、ＰＣＲスクリーニングに適切なプライマーの使用は、適切な核酸クローンの濃縮を生じる。
【０１６０】
種変異体、多型変異体、または対立遺伝子変異体のいずれかを単離するのに、同様の方法を適用できる。種変異体を、プローブとして１つの種由来の全長単離物またはフラグメントの単離に基づく種間ハイブリダイゼーション技術を用いて単離する。
【０１６１】
あるいは、ヒトＩＬ−Ｄ８０に対して産生した抗体を、例えば適切なｃＤＮＡライブラリーから交差反応性タンパク質を発現する細胞をスクリーニングするために使用する。精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記で記載されたような、標準的な方法によって抗体を産生するのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を、免疫系に提示して、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。生じた抗体を、記載されたように、スクリーニング、精製、または診断に使用する。
【０１６２】
（ＶＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０に特異的な抗体の調製）
合成ペプチドまたは精製タンパク質を免疫系に提示してモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。ポリクローナル血清、またはハイブリドーマを調製し得る。適切な状況で、結合試薬は、例えば蛍光または他の方法で、上記で記載されたように標識されるか、またはパニング法のために基材に固定化される。免疫選択、吸着、および関連する技術が、例えば結合の選択性の望ましいスペクトルを示す選択的試薬を調製するために利用可能である。
【０１６３】
（ＶＩＩＩ．生物学的機能の範囲の評価）
ＩＬ−Ｄ８０の生物学的活性を、部分的にはＩＬ−Ｄ８０とＩＬ−１１との間の配列および構造的相同性に基づいて試験する。最初に、ＩＬ−１１の生物学的活性を示すアッセイを試験する。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓのＪａｃｏｂｓｅｎ（１９９８）を参照のこと。
【０１６４】
（Ａ．前駆細胞の増殖／分化に対する効果）
様々な細胞型の増殖または分化に対する効果を、様々なサイトカイン濃度で評価する。用量応答性分析を、ある場合には他のサイトカイン、例えば関連するサイトカインＩＬ−１１と相乗作用を示すものと組み合わせて実施する。これらは、例えばＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＰＯ、Ｋｉｔリガンド、またはＦｌｔリガンドを含む。
【０１６５】
特に、ＩＬ−１１は幹細胞において相乗的活性を示す。ＩＬ−Ｄ８０を臍帯血細胞で試験し、ＩＬ−１１から得られた初期の前駆細胞の増殖または分化に効果があるかどうかを見る。好ましくは、細胞は初期前駆細胞、例えば臍帯血、骨髄、胸腺、脾臓、またはＣＤ３４＋前駆細胞由来の、例えば幹細胞である。サイトカインを、Ｂ細胞前駆細胞を含む骨髄および／または赤血球前駆細胞に対する効果に関して試験する。
【０１６６】
（Ｂ．巨核球の増殖に対するＩＬ−Ｄ８０の効果）
全ＰＢＭＣを、正常健康ドナーの軟膜から、記載されたようにフィコール−ハイパーク（ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）による遠心によって単離する（Ｂｏｙｕｍら）。ＰＢＭＣを、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下で、単独または他のサイトカインと組み合わせて、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ）で、１％のヒトＡＢ血清を含む２００μｌのＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。細胞を、培地単独または１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせて１２０時間培養する。３Ｈ−チミジン（０．１ｍＣｉ）を、培養の最後の６時間に加え、そして３Ｈ−チミジンの組み込みを液体シンチレーション計測によって決定する。
【０１６７】
ネイティブ、組換え、および融合タンパク質を、多くの他の生物学的アッセイシステムにおいて、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ、マクロファージ、樹状細胞、造血前駆体等におけるアゴニストおよびアンタゴニスト活性に関して試験する。
【０１６８】
ＩＬ−Ｄ８０を、ＩＬ−１１レセプターおよびコントロールを発現するトランスフェクトした細胞において、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して評価する。
【０１６９】
ＩＬ−Ｄ８０を、マクロファージ／樹状細胞活性化および抗原提示アッセイ、抗原または同種異系刺激に反応するＴ細胞サイトカイン産生および増殖における影響に関して、単独または他のサイトカインと組み合わせて評価する。例えば、ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２０９−１２２０；ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：９１５−９２４；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３８１５−３８２２；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３４４４−３４５１；およびＧｒｏｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１９−２９を参照のこと。
【０１７０】
ＩＬ−Ｄ８０をまた、ＮＫ細胞刺激における効果に関して評価する。アッセイは、例えばＨｓｕら（１９９２）Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５６３−５６９；およびＳｃｈｗａｒｚら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１６：９５−１０４に基づき得る。細胞傷害性Ｔ細胞およびＬＡＫ細胞における効果を評価するために、他のアッセイを適用する。例えば、ＮａｍｉｅｎおよびＭｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ（１９９８）を参照のこと。
【０１７１】
Ｂ細胞の増殖および分化効果を、例えば、ＩｇＧ２およびＩｇＡ２スイッチ因子アッセイを含む、例えばＤｅｆｒａｎｃｅら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：６７１−６８２；Ｒｏｕｓｓｅｔら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８９０−１８９３において記載された方法論によって、分析する。ＣＯＳ７上清と異なり、ＮＩＨ３Ｔ３およびＣＯＰ上清は明らかにヒトＢ細胞アッセイを妨害しないことに注意すること。
【０１７２】
（Ｃ．ヒト単球の細胞表面分子の発現に対する効果）
単球を、正常健康ドナーの末梢血単核細胞からネガティブセレクションによって精製する。簡単には、３×１０8のフィコールバンド化（ｂａｎｄｅｄ）単核細胞を、氷上で例えば２００μｌのαＣＤ２（Ｌｅｕ−５Ａ）、２００μｌのαＣＤ３（Ｌｅｕ−４）、１００μｌのαＣＤ８（Ｌｅｕ ２ａ）、１００μｌのαＣＤ１９（Ｌｅｕ−１２）、１００μｌのαＣＤ２０（Ｌｅｕ−１６）、１００μｌのαＣＤ５６（Ｌｅｕ−１９）、１００μｌのαＣＤ６７（ＩＯＭ ６７；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）、および抗グリコホリン抗体（１０Ｆ７ＭＮ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含むモノクローナル抗体の反応混液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）と共にインキュベートする。抗体に結合した細胞を洗浄し、そして次いでヒツジ抗マウスＩｇＧを結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と共に、ビーズ対細胞の比が２０：１でインキュベートする。抗体に結合した細胞を、磁場の適用によって単球から分離する。続いて、ヒト単球を、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下で、単独または他のサイトカインと組み合わせて、１％ヒトＡＢ血清を含むＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。
【０１７３】
細胞表面分子の発現の分析を、直接免疫蛍光検査によって行い得る。例えば、２×１０5の精製ヒト単球を、１％のヒト血清を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、氷上で２０分間インキュベートする。細胞を２００×ｇでペレット化する。細胞を２０ｍｌのＰＥまたはＦＩＴＣ標識ｍＡｂに再懸濁する。さらに氷上で２０分間インキュベートした後、細胞を、１％ヒト血清を含むＰＢＳ中で洗浄し、続いてＰＢＳ単独で２回洗浄する。細胞を、１％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定化し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析する。代表的なｍＡｂを使用する。例えば：Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＣＤ１１ｂ（抗ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ（抗ｇｐ１５０／９５）、ＣＤ１４（Ｌｅｕ−Ｍ３）、ＣＤ５４（Ｌｅｕ ５４）、ＣＤ８０（抗ＢＢ１／Ｂ７）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、およびＣＤ８６（ＦＵＮ１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ６４（３２．２；Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＣＤ４０（ｍＡｂ８９；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１７４】
（Ｄ．ヒト単球によるサイトカイン産生におけるＩＬ−Ｄ８０の効果）
ヒト単球を、記載したように単離し、そしてＩＬ−Ｄ８０（１／１００希釈バキュロウイルス発現材料）の存在または非存在下で１％ヒトＡＢ血清を含むＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。それに加えて、単球を、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下でＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８ Ｄｉｆｃｏ）で刺激し、そして細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０）濃度をＥＬＩＳＡによって決定する。
【０１７５】
サイトカインの細胞質内染色のために、単球を、ＩＬ−Ｄ８０およびＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８ Ｄｉｆｃｏ）および１０ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在または非存在下で、Ｙｓｓｅｌ培地中で１２時間培養する（１００万／ｍｌ）。細胞をＰＢＳ中で洗浄して、そして２％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で、室温で２０分間インキュベートする。続いて細胞を洗浄し、透過化処理緩衝液（ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．５％）／アジド（１ｍＭ）中０．５％のサポニン（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁し、そして室温で２０分間インキュベートする。細胞（２×１０5）を遠心分離して、そして透過化緩衝液中で１：１０に希釈した２０ｍｌの直接結合抗サイトカインｍＡｂに、室温で２０分間再懸濁する。以下の抗体を使用し得る：ＩＬ−１α−ＰＥ（３６４−３Ｂ３−１４）；ＩＬ−６−ＰＥ（ＭＱ２−１３Ａ５）；ＴＮＦα−ＰＥ（ＭＡｂ１１）；ＧＭ−ＣＳＦ−ＰＥ（ＢＶＤ２−２１Ｃ１１）；およびＩＬ−１２−ＰＥ（Ｃ１１．５．１４；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。続いて、細胞を透過化緩衝液中で２回、およびＰＢＳ／ＢＳＡ／アジド中で１回洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析する。
【０１７６】
骨リモデリング、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｉｏｃｙｔｅ）、ニューロン、脂肪細胞、胃腸上皮、または気管支上皮の領域で、さらなるアッセイを試験する。
【０１７７】
（ＩＸ．遺伝子改変した動物の作製および分析）
トランスジェニックマウスを標準的な方法によって作製し得る。そのような動物は、特定の組織における、または完全に生物体全体で、遺伝子の欠失の効果を決定するのに有用である。そのようなものは、動物または特定の組織の、様々な段階における発生に興味深い洞察を提供し得る。さらに、生物学的ストレスに対する様々な反応に対する効果を評価し得る。例えば、Ｈｏｇａｎら（１９９５）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０１７８】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、個々の出版物または特許出願それぞれが、全体として全ての目的のために参考文献に援用されると明確にそして個々に示されたように同じ程度、本明細書中で参考文献に援用される。
【０１７９】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの修飾および変化が、その意図および範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書中で記載された特定の実施態様は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、このような請求が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限される。
［配列表］
【０１８０】
【表１−１】
【０１８１】
【表１−２】
【０１８２】
【表１−３】
【０１８３】
【表１−４】
【０１８４】
【表１−５】
【０１８５】
【表１−６】
【０１８６】
【表１−７】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９９年７月３０日に出願された、同一人物に譲渡された同時継続米国特許出願ＵＳＳＮ０９／３６４，６７４；および１９９９年８月６日に出願されたＵＳＳＮ０９／３６９，６３４に対する優先権を主張する。これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物免疫系の細胞の生物学および生理学を調節するのに機能するタンパク質に関連する組成物に関する。特に、それは、例えば造血細胞を含む様々な細胞型の活性化、発生、分化、および機能を制御するのに有用な精製遺伝子、タンパク質、抗体、および関連する試薬を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
組換えＤＮＡ技術は、一般的にはドナー供給源からの遺伝情報を、宿主への導入によるような続く処理のためにベクターへ組み込み、それによって転移された遺伝情報が新しい環境下で複製および／または発現される技術を指す。一般的に、遺伝情報は、望ましいタンパク質産物をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形で存在する。担体は、多くの場合、宿主細胞における後の複製のためにｃＤＮＡを組み込む、およびある場合にはｃＤＮＡの発現を実際に制御し、そしてそれによって宿主におけるコードされた産物の合成を指示する能力を有するプラスミドである。
【０００４】
しばらくの間、哺乳動物免疫応答は「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用に基づくことが知られていた。最近の研究が、このネットワークの内部作用に新たな洞察を提供した。反応の多くは実際リンパ球、マクロファージ、顆粒球および他の細胞のネットワーク様相互作用を循環していることは明らかなままであるが、免疫学者は現在一般的に、リンホカイン、サイトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が、これらの細胞相互作用の制御に決定的な役割を果たしているという意見を持っている。従って、細胞調節因子の単離、特徴付け、および作用メカニズムにかなりの興味があり、その理解は多くの医学的異常、例えば免疫系疾患の診断および治療における重要な進歩を導く。これら因子のいくつかは、造血系増殖および／または分化因子、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）またはＩＬ−１１である。例えば、Ｍｉｒｅ−ＳｌｕｉｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌを参照のこと。
【０００５】
リンホカインは明らかに、様々な方法で細胞活性を媒介する。これらは多能性造血幹細胞の、複雑な免疫系を作る多様な細胞系統を含む多数の祖先への増殖、成長、および分化を支持することが示された。細胞成分間の適当なそしてバランスのとれた相互作用が、健康な免疫反応に必要である。リンホカインが他の薬剤と共に投与された場合、異なる細胞系統は、多くの場合異なる様式で反応する。
【０００６】
免疫反応に特に重要な細胞系統は、２種類のリンパ球を含む：免疫グロブリン（外来性物質を認識および結合してそれを除去する能力を有するタンパク質）を産生および分泌し得るＢ細胞、そしてリンホカインを分泌して、そして免疫ネットワークを形成するＢ細胞および様々な他の細胞（他のＴ細胞を含む）を誘導または抑制する様々なサブセットのＴ細胞。これらのリンパ球は多くの他の細胞型と相互作用する。
【０００７】
別の重要な細胞系統は、体中の基部から毛細血管に位置する顆粒を含む結合組織細胞である、肥満細胞である（これは全ての哺乳動物種で明確に同定されていない）。これらの細胞は、肺、皮膚、および胃腸管および尿生殖路で特に高い濃度で見出される。肥満細胞は、アレルギー関連障害、特に以下のようにアナフィラキシーで中心的な役割を果たす：選択された抗原が、肥満細胞表面の受容体に結合した１種類の免疫グロブリンを架橋すると、肥満細胞は脱顆粒し、そしてメディエーター、例えばヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、およびプロスタグランジンを放出し、それがアレルギー反応、例えばアナフィラキシーを引き起こす。
【０００８】
様々な免疫障害をよりよく理解および治療するための研究は、一般的にインビトロで免疫系の細胞を維持できないことによって妨げられてきた。免疫学者は、これらの細胞の培養は、多くのリンホカインを含む様々な増殖因子を含む、Ｔ細胞および他の細胞の上清を使用することによって達成され得ることを発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のことから、例えばＩＬ−１１に関連する新規リンホカインの発見および開発は、直接または間接的に免疫系および／または造血細胞に関与する広い範囲の変性または異常状態の新規治療に貢献し得ることが明らかである。特に、公知のリンホカインの有用な活性を増強または強化するリンホカインの発見および開発は、非常に有用である。本発明は新規インターロイキン組成物および関連する化合物、およびその使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＤＮＡＸ８０、またはＩＬ−Ｄ８０と番号をふられた哺乳動物、例えばげっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類のインターロイキンおよびその生物学的活性に関する。それは、ポリペプチド自身をコードする核酸、およびその産生および使用方法を含む。本発明の核酸は、部分的には本明細書中で開示された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列との相同性によって、および／または代表的にはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドに適用される、増殖因子またはサイトカイン様活性、例えばＩＬ−１１（Ｔｈｏｍｓｏｎ（１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ 第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）に関する機能的アッセイによって特徴付けられる。増殖因子依存的生理学または免疫反応の制御における修飾または介入の方法が提供される。
【００１１】
本発明は、部分的にはＩＬ−１１に対する有意な配列および構造類似性を示す新規サイトカイン配列の発見に基づく。特に、それは、霊長類、例えばヒト、およびげっ歯類、例えばマウス配列を提供する。有意な配列相同性を示す機能的同等物が、他の哺乳動物、例えばウシ、ウマ、およびラット、マウス、ならびに非哺乳動物種から入手可能である。
【００１２】
様々なタンパク質実施形態で、本発明は、配列番号２、４、８、または１０と少なくとも約１２アミノ酸の長さで同一性を示す本質的に純粋なまたは組換えＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド；配列番号２、４、８、または１０の天然配列ＩＬ−Ｄ８０；および配列番号２、４、８、または１０のＩＬ−Ｄ８０配列を含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、同一の部分は少なくとも約１４、１７、または１９アミノ酸である。他の実施形態では、ＩＬ−Ｄ８０は、表１の配列を含む成熟配列を含む；または天然ＩＬ−Ｄ８０とは違う翻訳後修飾パターンを示す；またはポリペプチドは、霊長類を含む哺乳動物から選択された温血動物由来である；配列番号２、４、８、または１０の少なくとも１つのポリペプチド部分を含む；複数のアミノ酸残基断片を示す；ＩＬ−Ｄ８０の天然対立遺伝子改変体である；少なくとも約３０アミノ酸の長さを有する；霊長類ＩＬ−Ｄ８０に特異的な少なくとも２つの重複しないエピトープを示す；霊長類ＩＬ−Ｄ８０と少なくとも約２０アミノ酸の長さで配列同一性を示す；グリコシル化されている；天然糖鎖付加を有し少なくとも１０ｋＤの分子量を有する；合成ポリペプチドである；固体基質に接着している；別の化学的分子に結合している；天然配列から５倍かそれより少ない置換である；または天然配列の欠失または挿入変異体である。好ましい実施形態は、以下のものを含む組成物を含む：滅菌ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド；またはＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドおよび担体、ここで担体は、水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物である；および／または経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口投与のために処方される。融合タンパク質実施形態では、タンパク質は、表１の成熟ポリペプチド配列；ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、またはＩｇ配列を含む検出または精製タグ；および／またはＩＬ−１１を含む別のサイトカインまたはケモカインの配列を有し得る。
【００１３】
キット実施形態は、ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドを有するもの、およびポリペプチドを含む区画；および／またはキット中の試薬の使用または廃棄に関する指示を含む。
【００１４】
結合化合物実施形態では、化合物は、天然ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を有し得る。ここで：ＩＬ−Ｄ８０は霊長類タンパク質である；結合化合物はＦｖ、Ｆａｂ、またはＦａｂ２断片である；結合化合物は別の化学部分に結合している；または抗体は：表１の成熟ポリペプチド部分のペプチド配列に対して惹起される；成熟ＩＬ−Ｄ８０に対して惹起される；精製霊長類ＩＬ−Ｄ８０に対して惹起される；免疫選択される；ポリクローナル抗体である；変性ＩＬ−Ｄ８０に結合する；少なくとも３０μＭのＫｄを示す；ビーズまたはプラスチック膜を含む固体基質に結合している；滅菌組成物である；または放射活性または蛍光標識を含んで検出可能に標識される。結合化合物を含むキットは、結合化合物を含む区画；および／またはキット中の試薬の使用および廃棄方法に関する指示を有するものを含む。多くの場合、キットは定性または定量分析を行うことができる。好ましい組成物は、滅菌結合化合物；または結合化合物および担体を含む。ここで担体は、水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物である；および／または経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口投与のために処方される。
【００１５】
核酸実施形態は、ＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする単離または組換え核酸を含む。ここでＩＬ−Ｄ８０は霊長類由来である；および／または核酸は、表１の抗原性ペプチド配列をコードする；表１の複数の抗原性ペプチド配列をコードする；その部分をコードする天然ｃＤＮＡと同一性を示す；発現ベクターである；さらに複製開始点を含む；天然の供給源由来である；検出可能標識を含む；合成ヌクレオチド配列を含む；６ｋｂより少ない、好ましくは３ｋｂより少ない；ヒトを含む霊長類由来である；天然全長コード配列を含む；ＩＬ−Ｄ８０をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブである；またはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、または変異誘発プライマーである。本発明はまた、そのような組換え核酸を含む細胞、組織、または臓器を提供する。そして好ましくは、細胞は、原核細胞；真核細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳動物細胞；マウス細胞；霊長類細胞；またはヒト細胞である。
【００１６】
キット実施形態は、そのような核酸を有するもの、および核酸を含む区画；さらにＩＬ−Ｄ８０タンパク質またはポリペプチドを含む区画；および／またはキット中の試薬の使用または廃棄に関する指示を含む。代表的には、キットは定性または定量分析を行うことができる。
【００１７】
特定の実施形態では、核酸は、３０℃および２Ｍより少ない塩濃度、または４５℃および／または５００ｍＭの塩濃度、または５５℃および／または１５０ｍＭの塩濃度の洗浄条件下で、配列番号１、３、７、または９にハイブリダイズする；または霊長類ＩＬ−Ｄ８０に対して少なくとも約３０、５５、または７５ヌクレオチドの長さで同一性を示す。
【００１８】
本発明は、細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることを含む、細胞または組織培養細胞の生理学または発生を調節する方法を含む。その方法は、接触はＩＬ−１１のアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせる；または接触はＩＬ−Ｄ８０に特異的に結合する抗体結合部位を含む結合組成物を含むアンタゴニストを用いるものであり得る。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）配列番号２、４、８、または１０に由来する成熟ポリペプチドに由来する少なくとも１７個連続したアミノ酸を含む抗原性ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２）配列番号２、４、８、または１０に由来する成熟ポリペプチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）５５℃、５００ｍＭ未満の塩、および５０％ホルムアミドにおいて、配列番号１、３、７、または９のコード部分にハイブリダイズする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）配列番号１、３、７、または９のコード部分の少なくとも３５個連続したヌクレオチドを含む、項目３に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）項目１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目６）項目５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、真核生物細胞を含む、宿主細胞。
（項目７）抗原性ポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、項目１に記載の組換えポリヌクレオチドを発現させる工程を包含する、方法。
（項目８）項目１に記載のポリヌクレオチドとの二重鎖を形成するための方法であって、該方法は、該ポリヌクレオチドを、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、７、または９のコード部分の少なくとも２５個連続したヌクレオチドにハイブリダイズするプローブと接触させて、それにより該二重鎖を形成する工程を包含する、方法。
（項目９）項目１に記載のポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、該キットは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、項目１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１７個連続したヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを備える、キット。
（項目１０）前記プローブが検出可能に標識されている、項目９に記載のキット。
（項目１１）配列番号２、４、８、または１０に由来する、少なくとも１７個連続したアミノ酸と特異的に結合する抗体結合部位を含む、結合化合物。
（項目１２）項目１１に記載の結合化合物であって、ここで：
ａ）前記抗体結合部位が、
１）配列番号２、４、８、もしくは１０のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性であるか；
２）精製されたヒトＩＬ−Ｄ８０タンパク質もしくは組換えて産生されたヒトＩＬ−Ｄ８０タンパク質に対して惹起されるか；または
３）モノクローナル抗体、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ）２内にあるか；あるいは
ｂ）該結合化合物が、
１）抗体分子であるか；
２）ポリクローナル抗血清であるか；
３）検出可能に標識されるか；
４）滅菌されているか；または
５）緩衝化組成物内にある、結合化合物。
（項目１３）項目１１に記載の結合化合物を使用する方法であって、該方法は、該結合化合物を、抗原を含む生物学的サンプルと接触させる工程を包含し、ここで該接触させる工程が、結合化合物：抗原複合体の形成を生じる、方法。
（項目１４）前記生物学的サンプルがヒト由来であり、そして前記結合化合物が抗体である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）検出キットであって、該キットは、項目１２に記載の結合化合物、および以下：
ａ）前記検出のための該結合化合物の使用についての使用説明資料；または
ｂ）該結合化合物の隔離を提供する区画、
を備える、検出キット。
（項目１６）実質的に純粋な抗原性ポリペプチドまたは実質的に単離された抗原性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、項目１１に記載の結合組成物と結合し、そして配列番号２、４、８、または１０に由来する少なくとも１７個連続したアミノ酸をさらに含む、ポリペプチド。
（項目１７）項目１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、
ａ）霊長類ＩＬ−Ｄ８０タンパク質に由来する少なくとも２５個連続したアミノ酸残基の少なくとも１つのフラグメントを含むか；
ｂ）可溶性ポリペプチドであるか；
ｃ）検出可能に標識されているか；
ｄ）滅菌組成物内にあるか；
ｅ）緩衝化組成物内にあるか；
ｆ）細胞表面レセプターに結合するか；
ｇ）組換えて産生されるか；または
ｈ）天然に存在するポリペプチド配列を有する、ポリペプチド。
（項目１８）配列番号２、４、８、または１０の少なくとも１７個連続したアミノ酸を含む、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法であって、該方法は、該細胞を霊長類ＩＬ−Ｄ８０のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２０）項目１９に記載の方法であって、ここで：
ａ）前記接触させる工程がＩＬ−１１のアゴニストもしくはアンタゴニストとの組み合わせであるか；または
ｂ）該接触させる工程がアンタゴニストを用いるものであり、該アンタゴニストとしては、ＩＬ−Ｄ８０と特異的に結合する抗体結合部位を含む結合組成物が挙げられる、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で引用される全ての参考文献は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ明確におよび個々に参考文献に組み込まれると示されたように同じ程度、本明細書中で参考として援用される。
【００２０】
（Ｉ．概要）
本発明は、サイトカインである、例えば免疫および他の細胞間のシグナルを伝達し得る分泌分子である、様々な哺乳動物タンパク質をコードするアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。例えば、Ｐａｕｌ（１９９７）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。全長サイトカイン、および断片、またはアンタゴニストが、受容体を発現する細胞の生理学的調節に有用である。おそらくＩＬ−Ｄ８０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、樹状細胞、造血祖先等のような、例えばリンパ性細胞を含む造血細胞に対して刺激または阻害効果のいずれかを有する。そのタンパク質はまた、タンパク質上の様々なエピトープ、直線および配座エピトープ両方に対する抗体を産生するために、抗原、例えば免疫原として有用である。
【００２１】
ＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡは、染色体１６のＢＡＣの、様々な霊長類、例えばヒトの配列から同定された。例えばＣＩＴ９８７ＳＫ−Ａ−５７５Ｃ２、およびＣＩＴ９８７ＳＫ−Ａ−７６１Ｈ５を参照のこと。その分子はｈｕＩＬ−Ｄ８０と呼ばれた。ヒトＥＳＴ、ヒトＥＳＴ ＡＩ０８５００７が同定および記載された。マウスＥＳＴ ＡＡ２６６８７２も同定および記載された。
【００２２】
霊長類、例えばヒト遺伝子は、約２１６アミノ酸（配列番号２）または約２４３アミノ酸（配列番号８）の小さい可溶性サイトカイン様タンパク質をコードする。表１および配列番号１、２、７、および８を参照のこと。ＩＬ−Ｄ８０は長鎖サイトカインのメンバーに特徴的な構造モチーフを示す。例えばＧｅｎＢａｎｋから入手可能なＩＬ−Ｄ８０およびＩＬ−１１配列を比較すること。またげっ歯類配列および表２または３も参照のこと。
【００２３】
（表１：霊長類、例えばヒト由来のＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号１））
【００２４】
【化１】
エキソン境界は、約２１９／２２０；３９３／３９４；４９２／４９３；および５５１／５５２に対応するようである。それらの境界に対応するコード部分は、特に興味深い。１９３から９１８までの翻訳アミノ酸配列は配列番号２である。
【００２５】
【化２】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＶＷＧおよびＦＰＲ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＧＲＰおよびＱＬＳ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＱＬＰおよびＤＶＳ．．．間から約．．．ＴＬＱおよびＰＦＨ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＳＴＹおよびＲＬＬ．．．間から約．．．ＨＳＶおよびＷＰＬ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（１３−２０、２２０−２２３、および１６３−１７５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書き（ｐｒｏｖｉｓｏ ｏｕｔ）するつもりである。霊長類、例えばヒト由来の改変体ＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号７）（注記、非コード配列は配列番号１のものと同一であるが、明確さのためのここでは省いた）。
【００２６】
【化３】
翻訳されたアミノ酸配列は配列番号８である：
【００２７】
【化４】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＶＷＧおよびＦＰＲ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＧＲＰおよびＱＬＳ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＱＬＰおよびＤＶＳ．．．間から約．．．ＴＬＱおよびＰＦＨ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＳＴＹおよびＲＬＬ．．．間から約．．．ＨＳＶおよびＷＰＬ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（１３−２０、２２０−２２３、および１６３−１７５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書きするつもりである。
配列番号２および８の比較：
【００２８】
【化５】
げっ歯類、例えばマウス由来のＩＬ−Ｄ８０をコードする核酸（配列番号３）。
【００２９】
【化６】
エキソン境界は、約１９８／１９９；３６０／３６１；４５９／４６０；および６１８／６１９である。それらの境界に対応するコード部分は、特に興味深い。１９９から８９１までの翻訳アミノ酸配列は配列番号４である。
【００３０】
【化７】
予期されるシグナル切断部位は．．．ＳＷＧおよびＦＰＴ．．．間；へリックスＡ境界は約．．．ＴＤＰおよびＬＳＬ．．．間から約．．．ＲＫＬおよびＬＳＥ．．．間まで；へリックスＢ境界は約．．．ＨＬＰおよびＮＶＳ．．．間から約．．．ＰＦＰおよびＡＭＬ．．．間まで；へリックスＣ境界は約．．．ＧＬＧおよびＴＱＧ．．．間から約．．．ＶＬＡおよびＡＧＦ．．．間まで；およびへリックスＤ境界は約．．．ＷＰＱおよびＬＬＹ．．．間から約．．．ＬＳＬおよびＰＲＲ．．．間まで。出願人は、高度に反復される残基、例えばＬおよびＥ反復（残基４−７、２０９−２１２、および１５６−１６５）にマッチする配列、および対応するコード部分を但し書きするつもりである。
改変体げっ歯類、例えばマウスＩＬ−Ｄ８０（配列番号９）
【００３１】
【化８】
１−７０２の翻訳；げっ歯類、例えばマウスＩＬ−Ｄ８０（配列番号１０）
【００３２】
【化９】
配列番号４および１０の比較：
【００３３】
【化１０】
表２：様々なＩＬ−１１実施形態のＩＬ−Ｄ８０との比較。ヒトＩＬ−１１は配列番号５；マウスＩＬ−１１は配列番号６である。
【００３４】
【化１１】
配列の比較はまた、進化系統樹を提供する。これは、例えばＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムをＣｌｕｓｔａｌＸ分析ソフトウェアプログラムと組み合わせて使用することによって産生され得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２；およびＴｒｅｅＶｉｅｗ、Ｐａｇｅ、ＩＢＬＳ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｌａｓｇｏｗ、ｅ−ｍａｉｌ ｒｐａｇｅ＠ｂｉｏ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ；ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．ｒｏｄ．ｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００３５】
表３：様々のＩＬ−１１実施形態と霊長類ＩＬ−Ｄ８０（表２の配列番号２の代わりに配列番号８）およびげっ歯類ＩＬ−Ｄ８０（表２の配列番号４の代わりに配列番号１０）とのさらなる比較。霊長類、例えばヒトＩＬ−１１は配列番号５である；げっ歯類、例えばマウスＩＬ−１１は配列番号６である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ（１．４ｂ）複数配列アラインメントプログラムを用いたＩＬ−１１とのアラインメント。
【００３６】
【化１２】
上記のように、配列の比較はまた、進化系統樹を提供する。これは、例えばＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムをＣｌｕｓｔａｌＸ分析ソフトウェアプログラムと組み合わせて使用することによって産生し得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２；およびＴｒｅｅＶｉｅｗ、Ｐａｇｅ、ＩＢＬＳ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｌａｓｇｏｗ、ｅ−ｍａｉｌ ｒｐａｇｅ＠ｂｉｏ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ；ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．ｒｏｄ．ｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００３７】
ＩＬ−Ｄ８０の関連するサイトカインタンパク質に対する構造的相同性は、この分子の関連する機能を示唆する。ＩＬ−Ｄ８０は、ＩＬ−１１と配列類似性を示す長鎖サイトカインである。
【００３８】
ＩＬ−１１の生物学の多くの局面がよく認識されている。例えば、Ｓｏｎｉｓら（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：８３１−８３４；Ｊａｃｑｕｅｓら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３７−７４０；Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら（１９９８）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５６：１２−２１；Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中のＪａｃｏｂｓｅｎ（１９９８）；Ｍａｓｌａｋら（１９９８）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３５：２５３−２６０；Ｌｅｎｇら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１０５９−１０６２；Ｄｕら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：３８９７−３９０８；Ｇｏｌｄｍａｎ（１９９５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １３：４６２−４７１；およびＤｕら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２：１８２−１８８を参照のこと。ＩＬ−Ｄ８０の生物学は同様であると予期され、例えばいくつかの生物学的活性は重複し得る。
【００３９】
ＩＬ−Ｄ８０アゴニストまたはアンタゴニストもまた、機能的または受容体アンタゴニストとして作用し得る。例えばそれはＩＬ−１１の各受容体への結合を阻害し、または反対の作用を媒介する。従って、ＩＬ−Ｄ８０またはそのアンタゴニストは、免疫障害、例えばＴ細胞免疫欠損症、慢性炎症、または組織の拒絶を含む異常な医学的状態の治療に、または心血管または神経生理学的状態で有用であり得る。ＩＬ−Ｄ８０およびＩＬ−１１関連試薬を組み合わせた組成物が多くの場合使用される。
【００４０】
天然の抗原は、標的細胞において生物学的または生理学的反応を導く様々な生化学的反応を媒介することができる。本明細書中で特徴付けられる好ましい実施形態は、ヒト由来であるが、他の霊長類、または他の種の対応物が天然に存在する。他の哺乳動物種、例えば霊長類、イヌ、ネコ、およびげっ歯類、特に家畜種におけるタンパク質のさらなる配列も、入手可能であるはずである。下記を参照のこと。下記の説明は、例示の目的で、ヒトＩＬ−Ｄ８０に向けられるが、他の種由来の関連する実施形態に同様に適用可能である。
【００４１】
（ＩＩ．精製されたＩＬ−Ｄ８０）
霊長類、例えばヒトＩＬ−Ｄ８０アミノ酸配列を、いくつかの実施形態、例えば配列番号２、４、８、または１０に示す。そのタンパク質をコードする他の天然に存在する核酸を、提供された配列を用いて標準的な手順、例えばＰＣＲ技術によって、またはハイブリダイゼーションによって単離し得る。アミノ末端からカルボキシ末端まで提供される、これらのアミノ酸配列は、そのタンパク質抗原を他のタンパク質および例示する多くの変異体から区別するのを可能にする、サイトカインの配列情報を提供するのに重要である。さらに、そのペプチド配列はそのようなセグメントを認識する抗体を産生するペプチドの調製を可能にする、そしてヌクレオチド配列はオリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にする。これらはどちらも、そのような配列をコードする遺伝子の検出または単離、例えばクローニングの戦略である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「ヒト可溶性ＩＬ−Ｄ８０」という用語は、タンパク質の文脈で使用される場合、配列番号２、または８に示した可溶性ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその重要なフラグメントを含む。好ましい実施形態は、指定された長さの複数の区別できる、例えば重複しないセグメントを含む。代表的には、その数は少なくとも２、より通常は少なくとも３、そして好ましくは５、７、またはそれ以上である。長さの最小値が提供されるが、様々な大きさのより長い長さ、例えば１つの長さ７、および２つの長さ１２が適当であり得る。
【００４３】
結合成分、例えば抗体は、代表的にはＩＬ−Ｄ８０に、例えば少なくとも約１００ｎＭ、通常約３０ｎＭよりよい、好ましくは約１０ｎＭよりよい、そしてより好ましくは約３ｎＭよりよい、高い親和性で結合する。対応するタンパク質が、ヒト以外の哺乳動物種、例えば他の霊長類、有蹄動物、またはげっ歯類において見出される。また、非哺乳動物種、例えば鳥類または両生類も構造的または機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有するはずである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、重要なフラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも約１２アミノ酸、代表的には少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましい実施形態では、少なくとも約３０以上のアミノ酸、例えば３５、４０、４５、５０、６０、７５、１００等の一連のアミノ酸残基を含む。そのような断片は、実質的に全ての位置で始まる、および／または終わる末端を有し得る。例えば、全ての実際的な組み合わせで、残基１、２、３等で始まり、そして例えば１５０、１４９、１４８等で終わる。特に興味深いペプチドは、構造ドメイン境界、例えばヘリックスＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤに対応する末端を有する。表１、２、および３を参照のこと。
【００４５】
「結合組成物」という用語は、例えば抗体−抗原相互作用で、ＩＬ−Ｄ８０に特異性をもって結合する分子を指す。特異性は多かれ少なかれ包括的、例えば特定の実施形態に対して、または関連する実施形態、例えば霊長類、げっ歯類等のグループに対して特異的であり得る。それはまた、共有結合または非共有結合のいずれか、天然の生理的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を含んで、ＩＬ−Ｄ８０と特異的に結合する化合物、例えばタンパク質を含む。その分子はポリマー、または化学的試薬であり得る。機能的アナログは、構造的修飾を有するタンパク質であり得、またはそれは適当な結合決定基と相互作用する分子の形を有する分子であり得る。その化合物は、受容体結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（編）Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（最新版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４６】
例えばタンパク質の文脈において、実質的に純粋なとは、代表的には、タンパク質がもとの供給源有機体由来の、他の混入タンパク質、核酸、または他の生物製剤を含まないことを意味する。純度は標準的な方法、代表的には重量によってアッセイされ得、そして普通少なくとも約４０％純粋、一般的には少なくとも約５０％純粋、多くの場合少なくとも約６０％純粋、代表的には少なくとも約８０％純粋、好ましくは少なくとも約９０％純粋、そして最も好ましい実施形態では少なくとも約９５％純粋である。担体または賦形剤が多くの場合加えられる。
【００４７】
ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、環境およびポリペプチドに依存する。温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子の特徴、および溶媒の性質を含む多くのパラメーターがポリペプチドの可溶性に影響する。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は約４℃から約６５℃の範囲である。通常使用温度は約１８℃より高い。診断的目的のためには、温度は通常約室温であるかまたはより暖かいが、アッセイ中の成分の変性温度より低い。治療的目的のためには、温度は通常体温、代表的にはヒトおよびマウスでは約３７℃であるが、特定の状況下では、インサイチュまたはインビトロで温度を上昇または下降させ得る。
【００４８】
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的に、実質的に安定状態であり、そして通常変性状態ではない。ポリペプチドは、例えば可溶性を与えるために、４次構造において他のポリペプチドと、または脂質または界面活性剤と結合し得る。 溶媒および電解質は通常、生物学的活性の保存のために使用される型の、生物学的に適合性の緩衝液であり、そして通常生理的水性溶媒に近似する。通常、溶媒は、代表的には約５および１０の間、そして好ましくは約７．５の中性ｐＨを有する。いくつかの場合には、１つ以上の界面活性剤、代表的には弱い非変性のもの、例えばＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナート）またはＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホナート）が、またはタンパク質の構造的または生理的性質の有意な崩壊を避けるために十分低い濃度で加えられる。他の例では、有意な変性を起こすために強い界面活性剤を使用し得る。
【００４９】
（ＩＩＩ．物理的改変体）
本発明はまた、ＩＬ−Ｄ８０抗原のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを含む。改変体は種、多型、または対立遺伝子改変体を含む。
【００５０】
アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基のマッチを最適化することによって、もし必要なら必要に応じてギャップを導入することによって決定される。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３）Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ， ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍａｐｒｉｓｏｎの第１章、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＭＡ；およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのソフトウェアパッケージも参照のこと。保存的置換をマッチと考えるならば、配列同一性は変化する。保存的置換は、代表的には以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。保存は、生物学的特徴、機能的特徴、または構造的特徴に当てはまり得る。相同的なアミノ酸配列は、代表的にはタンパク質配列の天然の多型または対立遺伝子および種間のバリエーションを含むように意図される。代表的な相同的タンパク質またはペプチドは、ＩＬ−Ｄ８０のアミノ酸配列と２５−１００％の同一性（もしギャップが導入され得るなら）から５０−１００％の同一性（もし保存的置換が含まれるなら）を有する。同一性の測定値は、少なくとも約３５％、一般的に少なくとも４０％、多くの場合少なくとも約５０％、代表的には少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％である。
【００５１】
単離されたＩＬ−Ｄ８０ＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、そして短いヌクレオチド区間の反転によって容易に修飾し得る。これらの修飾は、これら抗原、その誘導体、または同様の生理的、免疫原的、抗原的、または他の機能的活性を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列を産生する。これら修飾配列を、変異抗原を産生する、または発現を増強するために使用し得る。増強された発現は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および他のメカニズムを含み得る。「変異ＩＬ−Ｄ８０」は、他の点では上記で述べたＩＬ−Ｄ８０の配列同一性の定義にあてはまるが、欠失、置換、または挿入のいずれかによって天然に通常見出されるＩＬ−Ｄ８０とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。これは一般的には、配列番号２、４、８、または１０の配列を有するタンパク質と有意な同一性を有する、そしてそれらの配列と様々な生物学的活性、例えば抗原性または免疫原性を共有する、そして好ましい実施形態では天然全長開示配列のほとんどを含むタンパク質を含む。全長配列が代表的には好ましいが、切断されたバージョンも有用であり、同様に、天然の供給源から見出された遺伝子またはタンパク質が代表的には最も望ましい。同様のコンセプトが異なるＩＬ−Ｄ８０タンパク質、特に様々な温血動物、例えば哺乳動物および鳥類で見出されるものにあてはまる。これらの記載は一般的に、多くのＩＬ−Ｄ８０タンパク質を含むことを意味し、具体的に議論される特定の霊長類実施形態に制限されない。
【００５２】
ＩＬ−Ｄ８０変異誘発はまた、アミノ酸を挿入または欠失させることによって行われ得る。置換、欠失、挿入、またはあらゆる組み合わせが、最終構築物に到達するために産生される。挿入はアミノまたはカルボキシル末端融合を含む。無作為変異誘発を標的コドンにおいて行い得、そして発現した変異体を次いで望ましい活性に関してスクリーニングし得る。例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による、公知の配列を有するＤＮＡにおいて、前もって決定した部位で置換変異を起こす方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および増刊）；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２を参照のこと。好ましい実施形態は、例えば１倍、２倍、３倍、５倍、７倍等の、好ましくは保存的置換をヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで含む。好ましくは、置換は保存されたシステインから遠く、そして多くの場合ヘリックス構造ドメインから離れた領域にある。そのような改変体は、特異的な抗体を産生するために有用であり得、そして多くの場合多くのまたは全ての生物学的性質を共有する。
【００５３】
本発明はまた、組換えタンパク質、例えばこれらタンパク質由来のセグメントを使用した異種由来融合タンパク質を提供する。異種由来融合タンパク質は、天然には通常同じ方法で融合しないタンパク質またはセグメントの融合である。同様のコンセプトが異種由来核酸配列にあてはまる。
【００５４】
それに加えて、新規構築物を、他のタンパク質由来の、同様の機能的ドメインを組み合わせることから作成し得る。例えば、標的結合または他のセグメントを、異なる新規融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」し得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２を参照のこと。
【００５５】
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２によって記載されたホスホロアミダイト法は、適当な合成ＤＮＡフラグメントを産生する。二本鎖断片は多くの場合、相補鎖を合成することおよび適当な条件下で鎖を共にアニーリングすることによって、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えること、例えばＰＣＲ技術のいずれかによって得られる。
【００５６】
構造的分析を、サイトカインのＩＬ−１１ファミリーと比較してこの遺伝子に適用し得る。ヒトＩＬ−Ｄ８０配列の、他のＩＬ−１１ファミリーメンバーとのアラインメントは、構造的特徴の決定を可能にするはずである。特に、βシートおよびαヘリックス残基を、例えばＲＡＳＭＯＬプログラムを用いて決定し得る。Ｂａｚａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９：５９１；Ｌｏｄｉら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１７６２−１７６６；ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ（１９９５）ＴＩＢＳ ２０：３７４−３７６；およびＧｒｏｎｅｎｂｅｒｇら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：２６３−２６９を参照のこと。置換に好ましい残基は、受容体と相互作用することが予期される表面に露出した残基を含む。機能を保存する他の残基は、特に表面露出残基から遠い位置では、保存的置換である。
【００５７】
（ＩＶ．機能的変異体）
ＩＬ−Ｄ８０に対する生理的反応の阻害は、リガンドのその受容体に対する結合の競合的阻害により起こり得る。
【００５８】
本発明のインビトロアッセイは、多くの場合単離タンパク質、これらタンパク質の受容体結合部分を含む可溶性断片、または固相基板に結合した断片を使用する。これらのアッセイはまた、結合部分変異および修飾、またはサイトカイン変異および修飾（例えばＩＬ−Ｄ８０アナログ）のいずれかの、効果の診断的決定を可能にする。
【００５９】
本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用を企図する。例えばここで、サイトカインに対する中和抗体、または受容体結合断片が、試験化合物と競合する。
【００６０】
ＩＬ−Ｄ８０抗原の「誘導体」は、天然に存在する形からのアミノ酸配列変異体、糖鎖付加変異体、および他の化学的部分との共有結合物または凝集結合物を含む。共有結合誘導体は、ＩＬ−Ｄ８０アミノ酸側鎖またはＮもしくはＣ末端において見出される基への官能基の結合によって、例えば標準的な手段によって調製され得る。例えば、ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ（１９８８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第１−２巻、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｈｕｇｌｉ（編、１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；およびＷｏｎｇ（１９９１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照のこと。
【００６１】
特に、糖鎖付加の変更が含まれ、例えば、その合成および処理の間、またはさらなる処理工程において、ポリペプチドの糖鎖付加パターンを修飾することによって産生される。例えば、Ｅｌｂｅｉｎ（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４９７−５３４を参照のこと。同じ一次アミノ酸配列を有し、リン酸化アミノ酸残基（例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン）を含む他の小さい修飾を有するペプチドのバージョンも含まれる。
【００６２】
ＩＬ−Ｄ８０と他の同種タンパク質または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドも提供される。多くのサイトカイン受容体または他の表面タンパク質は、多量体（例えばホモ２量体実体）であり、そして反復構築物はタンパク質溶解切断に対する減少した感受性を含む、様々な利点を有し得る。典型的な例は、融合リガンドの存在または位置を容易に決定し得るような、リポーターポリペプチド（例えばルシフェラーゼ）と、タンパク質のセグメントまたはドメイン、例えば受容体結合セグメントとの融合である。例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌βガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、βラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母アルファ交配因子、およびＨｉｓ６配列のＦＬＡＧ配列のような検出または精製タグを含む。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８１２−８１６を参照のこと。
【００６３】
融合ペプチドは、典型的には組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかによって作成される。核酸操作および発現の技術は、一般的に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹに記載されている。ポリペプチド合成の技術は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；およびＧｒａｎｔ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹに記載されている。再フォールディング法を合成タンパク質に適用し得る。
【００６４】
本発明はまた、アミノ酸配列における変化または糖鎖付加以外の、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質誘導体の使用を企図する。そのような誘導体は、化学的部分またはタンパク質担体との共有結合または凝集結合を含み得る。共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイの試薬として、または結合パートナー（例えば他の抗原）のアフィニティー精製のような精製方法において有用である。ＩＬ−Ｄ８０を、抗ＩＬ−Ｄ８０抗体または代替の結合組成物のアッセイまたは精製に使用するために、共有結合によって、臭化シアン活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのような固体支持体へ、当該分野で周知の方法によって固定化し得るか、またはグルタルアルデヒド架橋を用いて、または用いずにポリオレフィン表面上へ吸着し得る。ＩＬ−Ｄ８０タンパク質をまた、例えば診断的アッセイで使用するために、検出可能なグループで標識し得る。ＩＬ−Ｄ８０の精製は、固定化抗体または相補的結合パートナー、例えば受容体の結合部分によって実施し得る。
【００６５】
本発明の可溶化ＩＬ−Ｄ８０または断片を、結合に特異的な抗血清または抗体の産生のために免疫原として使用し得る。精製抗原を、モノクローナル抗体または天然抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、等を含む抗原結合断片をスクリーニングするために使用し得る。精製ＩＬ−Ｄ８０抗原をまた、上昇したレベルのサイトカインの存在に反応して産生された抗体を検出する試薬として使用し得、それは異常なまたは特定の生理的または疾患状態の診断になり得る。本発明は、配列番号第１、３、７、または９番に示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列、またはそれを含むタンパク質の断片に対して産生された抗体を企図する。特に、本発明は特定のドメイン、例えばヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤに対して結合親和性を有するか、またはそれに対して産生された抗体を企図する。
【００６６】
本発明は、さらに密接に関連した種変異体の単離を企図する。サザンブロットおよびノーザンブロット分析が、類似の遺伝子実体が他の哺乳類に存在することを確立する。ＩＬ−Ｄ８０は種変異体、例えばげっ歯類、ウサギ目、肉食動物、偶蹄目、奇蹄目、および霊長類に広く存在するようである。
【００６７】
本発明はまた、構造、発現、および機能において差異および類似性を両方示す関連抗原のグループを単離する手段を提供する。分子の多くの生理的効果を解明することは、さらなる別の種またはその多型変異体の単離および特徴付けによって非常に加速される。特に、本発明は、異なる種においてさらなる相同的遺伝子実体を同定するために有用なプローブを提供する。
【００６８】
単離遺伝子は、ＩＬ−Ｄ８０の発現を欠く細胞（例えば対応するタンパク質を欠きそして負のバックグラウンド活性を示す種の型または細胞）の形質転換を可能にする。これは形質転換していないコントロール細胞と比較してＩＬ−Ｄ８０の機能の分析を可能にする。
【００６９】
これらの抗原によって媒介される様々な生理的機能を可能にする、重要な構造的エレメントの吟味は、近代分子生物学の標準的な技術を用いて、特に関連するクラスのメンバーを比較して可能である。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３９−１３３６に記載されたホモログスキャニング突然変異生成技術；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２で使用されたアプローチ、およびＬｅｃｈｌｅｉｔｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：４３８１−４３９０を参照のこと。
【００７０】
細胞内機能は、おそらく受容体シグナル伝達を含む。しかし、タンパク質の内在化が特定の環境下で起こり得、そして細胞内成分およびサイトカイン間の相互作用が起こり得る。相互作用している成分とのＩＬ−Ｄ８０の特異的な相互作用セグメントを、突然変異生成または直接生化学的手段、例えば架橋またはアフィニティー法によって同定し得る。結晶学的または他の物理的方法による構造的分析も適用可能である。シグナル伝達メカニズムのさらなる調査は、アフィニティー法または遺伝的手段、例えば変異体の相補分析による、単離可能な結合成分の研究を含む。
【００７１】
ＩＬ−Ｄ８０の発現および調節に関するさらなる研究を追及する。抗原に結合している調節エレメントは、特異な生理的、発生的、組織特異的、または他の発現パターンを示す。上流または下流の遺伝領域、例えば調節エレメントが興味深い。
【００７２】
ＩＬ−Ｄ８０抗原の構造的研究は、新規抗原、特に分子に対してアゴニストまたはアンタゴニスト特性を示すアナログの設計を導く。これを、前に記載した望ましい活性のスペクトルを示す抗原を単離するスクリーニング方法と組み合わせ得る。
【００７３】
（Ｖ．抗体）
抗体は、種、多型、または対立遺伝子変異体を含むＩＬ−Ｄ８０タンパク質、およびその断片の、天然に存在する形でおよびその組換えの形の両方で、様々なエピトープに対して惹起され得る。さらに、抗体は、ネイティブまたは変性バージョンを含む、その活性形態またはその不活性形態のいずれかのＩＬ−Ｄ８０に対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体も企図される。
【００７４】
結合断片および一本鎖バージョンを含む、抗原の前もって決定された断片に対する抗体は、動物を断片と免疫原性タンパク質の結合物で免疫することによって産生し得る。モノクローナル抗体を、望ましい抗体を分泌する細胞から調製する。これらの抗体を、正常または不完全なＩＬ−Ｄ８０への結合に関してスクリーニングし得る、または例えば受容体によって媒介されるアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングし得る。抗体は、例えば受容体への結合を立体的に阻害することによって、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。これらのモノクローナル抗体は、通常少なくとも約１ｍＭ、より通常には少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１００μＭ、より典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭかよりよいＫDで結合する。
【００７５】
配列番号第２、４、８、または１０番のアミノ酸配列からなる免疫原のような、規定された免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するか、またはそれと特異的に免疫反応性であるＩＬ−Ｄ８０タンパク質は、典型的にはイムノアッセイで決定される。イムノアッセイは典型的には、例えば配列番号第２、４、８、または１０番のポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、好ましくは同じ種由来の他のＩＬ−１１、例えばヒトまたはげっ歯類ＩＬ−１１に対して低い交差反応性を有するように選択され、そしてそのような交差反応性は、イムノアッセイに使用する前に免疫吸収によって除去される。
【００７６】
イムノアッセイで使用する抗血清を産生するために、配列番号２、４、８、もしくは１０のタンパク質、またはこれらの組み合せを、本明細書中で記載したように単離する。例えば、組換えタンパク質を哺乳動物細胞系統で産生し得る。適当な宿主、例えばＢａｌｂ／ｃのようなマウスの近交系の系統を、選択されたタンパク質で、典型的にはフロイントアジュバントのような標準的なアジュバントおよび標準的なマウス免疫プロトコールを用いて免疫する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）。あるいは、本明細書中で開示された配列由来で、そしてキャリアタンパク質に結合した合成ペプチドを、免疫原として使用し得る。ポリクローナル血清を回収し、そしてイムノアッセイ、例えば固体支持体に固定化された免疫原を用いた固相イムノアッセイにおいて免疫原タンパク質に対して滴定する。１０4以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、そして他のＩＬ−１１ファミリーメンバー（例えば、げっ歯類ＩＬ−１１）に対する交差反応性に関して、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、５７０−５７３頁で記載されているような競合的結合イムノアッセイを用いて試験する。好ましくは、例えば霊長類ＩＬ−１１と組み合わせて、少なくとも１つの他のＩＬ−１１ファミリーメンバーをこの決定に使用する。ＩＬ−１１ファミリーメンバーを、本明細書中で記載されたように、標準的な分子生物学およびタンパク質化学技術を用いて、組換えタンパク質として産生し、そして単離し得る。
【００７７】
競合的結合形式のイムノアッセイを、交差反応性決定のために使用し得る。例えば、配列番号２または８のタンパク質を、固体支持体に固定化し得る。アッセイに加えられたタンパク質は、固定化抗原への抗血清の結合と競合する。固定化タンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタンパク質の能力を、配列番号２または８のタンパク質と比較する。上記タンパク質の交差反応性パーセントを、標準的な計算を用いて計算する。上記に挙げたタンパク質のそれぞれと１０％より低い交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次いで交差反応性抗体を、プールした抗血清から上記で挙げたタンパク質を用いた免疫吸収によって除去する。
【００７８】
免疫吸収しそしてプールしされた抗血清を次いで、２番目のタンパク質を免疫原タンパク質（例えば、配列番号２、４、８、または１０のＩＬ−１１様タンパク質）と比較するために、上記のように競合的結合イムノアッセイで使用する。この比較を行うために、２つのタンパク質をそれぞれ広い範囲の濃度でアッセイし、そして固定化タンパク質への抗血清の結合を５０％阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が決定される。２番目のタンパク質の必要とされる量が、選択されたタンパク質の必要とされるタンパク質量の２倍より少なければ、２番目のタンパク質は、免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合すると言われる。
【００７９】
本発明の抗体はまた、診断的適用において有用であり得る。捕獲または非中和化抗体として、それらを受容体への結合を阻害することなく抗原に結合する能力に関してスクリーニングし得る。中和化抗体として、それらは競合的結合アッセイで有用であり得る。それらはまた、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質またはその受容体を検出または定量するのに有用である。例えば、Ｃｈａｎ（編、１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編、１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＮｇｏ（編、１９８８）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。交差吸収、涸渇、または他の手段が、規定された選択性（例えば、独特のまたは共通の種特異性）の調製物を提供する。これらは様々なグループの抗原を同定する試験の基礎となり得る。
【００８０】
さらに、抗原結合断片を含む本発明の抗体は、抗原に結合し、そして例えば、生物学的応答を誘発し得るレセプターへの機能的結合を阻害する強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、非中和化抗体として有用であり得、そして抗体が抗原に結合する場合、例えば、その抗原を表面に発現する細胞が殺傷されるように、毒素または放射性核種と結合し得る。さらに、これらの抗体を薬物または他の治療的薬剤に、直接かまたはリンカーによって間接的かのいずれかでに結合し得、そして薬剤標的化を行い得る。
【００８１】
抗原フラグメントを、免疫原として使用される融合または共有結合ポリペプチドとして、他の材料、特にポリペプチドと結合し得る。抗原およびその断片を、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素等のような様々な免疫原と融合または共有結合し得る。ポリクローナル抗血清を調製する方法の記載に関しては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ、１９６９；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００８２】
ある場合には、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒト等のような様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。そのようなモノクローナル抗体を調製する技術の記載は、例えばＳｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびそこで引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；および特にモノクローナル抗体を産生する１つの方法を議論しているＮａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に見出し得る。
【００８３】
他の適当な技術としては、リンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロの曝露、あるいはファージベクターまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら（１９８９）「ファージラムダにおける免疫グロブリンレパートリーの大規模コンビナトリアルライブラリーの産生」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体を、改変の有りまたは無しに使用し得、これには、キメラ抗体およびヒト抗体を含む。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合かまたは非共有結合かのいずれかで結合することによって標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方において広範囲に報告されている。適当な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子等を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を含む。また、組換え免疫グロブリンを産生し得る。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，６４２，３３４号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照のこと。
【００８４】
本発明の抗体をまた、タンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーに使用し得る。抗体が固体支持体に結合されるカラムを調製し得る。例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら（１９８４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：３−５５を参照のこと。抗体を精製するためにこの逆を使用し得る。
【００８５】
各ＩＬ−Ｄ８０に対して産生された抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するのに有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する様々な免疫学的状態を検出または診断するのに有用である。
【００８６】
（ＶＩ．核酸）
記載されたペプチド配列および関連する試薬は、例えば天然の供給源からＩＬ−Ｄ８０をコードするＤＮＡクローンを検出、単離、または同定するのに有用である。典型的には、これらは哺乳動物から遺伝子を単離するのに有用であり、そして同様の手順を他の種、例えば鳥類および哺乳動物のような温血動物から遺伝子を単離するのに適用する。クロスハイブリダイゼーションは、同じ、例えば多型変異体、または他の種からＩＬ−Ｄ８０を単離することを可能にする。適当な核酸クローンを首尾良く単離するために、多くの異なるアプローチが利用可能である。
【００８７】
精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記のように、標準的な方法によって抗体を産生するのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を、免疫系に提示して、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生し得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００８８】
例えば、特異的結合組成物を、ＩＬ−Ｄ８０を発現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用し得る。細胞内発現のスクリーニングを、様々な染色または免疫蛍光手順によって行い得る。結合組成物を、アフィニティー精製または表面融合タンパク質を発現する細胞を分類するために使用し得る。
【００８９】
ペプチドセグメントをまた、ライブラリーをスクリーニングするための適切なオリゴヌクレオチドを予測するために使用し得る。遺伝暗号を、スクリーニングのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するために使用し得る。例えば配列番号１、３、７、または９を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドは、ライブラリーから正しいクローンを選択するのに有用である。相補配列もまた、プローブ、プライマー、またはアンチセンス鎖として使用する。例えば、アンカーベクターもしくはポリＡ相補ＰＣＲ技術または他のペプチドの相補的ＤＮＡと結合した、様々なフラグメントが特に有用である。
【００９０】
本発明は、抗原性または生物学的に活性な対応するＩＬ−Ｄ８０ポリペプチド、特に記載した配列の非翻訳５’部分をコードする部分を欠くものをコードする、単離ＤＮＡまたは単離フラグメントの使用を意図する。それに加えて、本発明は生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードし、そして適当な条件下で、本明細書中で記載されたＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる、単離ＤＮＡまたは組換えＤＮＡを含む。上記の生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトな抗原、またはフラグメントであり得、そして例えば配列番号２、４、８、または１０で開示されたアミノ酸配列を有し、特に成熟した分泌ポリペプチドを有する。さらに、本発明は、分泌ＩＬ−Ｄ８０と高い同一性を示すタンパク質をコードする、単離もしくは組換えのＤＮＡ、またはそれらのフラグメントの使用を含む。単離ＤＮＡは、５’および３’隣接部にそれぞれ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなどを有し得る。あるいは、発現は、コードセグメントを異種プロモーターに作動可能に連結することによって（例えば、内因性遺伝子由来の上流プロモーターを挿入することによって）実施し得る。
【００９１】
「単離」核酸は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）であり、それは自然にネイティブな配列に付随する他の成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、および／またはもとの種由来の隣接するゲノム配列）から実質的に分離している。その用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を含み、そして組換え体またはクローン化ＤＮＡ単離物および化学的に合成されたアナログまたは異種由来の系によって生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形を含む。一般的に、核酸はベクター中または約５０ｋｂより短い、通常約３０ｋｂより短い、典型的には約１０ｋｂより少ない、そして好ましくは約６ｋｂより短い断片である。
【００９２】
単離核酸は、一般的には分子の均一な組成物であるが、ある実施形態では、少ない不均一性を含む。この不均一性は、典型的にはポリマー末端または望ましい生物学的機能または活性に重要でない部分に見出される。
【００９３】
「組換え」核酸は、その産生方法またはその構造のいずれかによって定義される。その産生方法、例えばある過程によって産生される産物に関して、その過程は、ヌクレオチド配列におけるヒトの介入、典型的には選択または産生を含む、組換え核酸技術の使用である。あるいは、それは、天然にはお互いに隣接しない２つの断片の融合を含む配列の産生によって産生される核酸であり得るが、天然の産物、例えば天然に存在する変異体を除くことを意味する。従って、任意の合成オリゴヌクレオチド過程を用いて得られた配列を含む核酸と同様に、例えば任意の天然に存在しないベクターを用いて細胞を形質転換することによって生成した産物が含まれる。同じかまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンでコドンを置換することが多くの場合行われるが、典型的には配列認識部位を導入または除去することが行われる。
【００９４】
あるいは、通常入手可能な天然の形で見出されない、所望の機能の組み合わせを含む単一の遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）を産生するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合させるためにそれを行う。制限酵素認識部位は、しばしばそのような人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的、例えばプロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、コントロール配列、または他の有用な特徴を設計に組み込み得る。同様のコンセプトが組換え（例えば、融合）ポリペプチドについて意図される。遺伝コードの重複性によって、これら抗原の断片に類似したポリペプチドをコードする合成核酸、および様々な異なる種または多型変異体由来の配列の融合が特に含まれる。
【００９５】
核酸関連における有意な「断片」は、少なくとも約１７ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２２ヌクレオチド、普通少なくとも約２９ヌクレオチド、より多くの場合少なくとも約３５ヌクレオチド、典型的には少なくとも約４１ヌクレオチド、通常少なくとも約４７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５５ヌクレオチド、そして特に好ましい実施形態では少なくとも約６０以上のヌクレオチド（例えば、６７、７３、８１、８９、９５等）の連続セグメントである。
【００９６】
ＩＬ−Ｄ８０タンパク質をコードするＤＮＡは、関連するかまたは同様のタンパク質をコードする遺伝子、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡ種、および異なる種由来の相同的タンパク質をコードするＤＮＡを同定するのに特に有用である。霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、鳥類、および魚類を含む他の種においてホモログが存在する。様々なＩＬ−Ｄ８０タンパク質が相同的であり、そして本明細書中に含まれる。しかし、抗原に対してより遠い進化上の関係を有するタンパク質でさえ、それらが十分相同性であるならば、これらの配列を用いて適当な条件下で容易に単離し得る。霊長類ＩＬ−Ｄ８０タンパク質が特に興味深い。
【００９７】
例えばイントロンを含むゲノム配列に由来する組換えクローンは、例えばトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物を含むトランスジェニック研究、および遺伝子治療に有用である。例えば、Ｒｏｉｔｔ（編）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１５０２−１５０４頁のＧｏｏｄｎｏｗ（１９９２）「トランスジェニック動物」；Ｔｒａｖｉｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１３９２−１３９４；Ｋｕｈｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７０７−７１０；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（編、１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１８０−１９９；およびＣｏｕｒｎｏｙｅｒおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９７−３２９を参照のこと。あるいは、発現は、例えば、内因性遺伝子から上流にプロモーターを挿入することによって、コードセグメントを異種由来のプロモーターに、作動可能に連結することによって実施され得る。例えば、Ｔｒｅｃｏら、ＷＯ９６／２９４１１またはＵＳＳＮ０８／４０６，０３０を参照のこと。
【００９８】
核酸配列比較関係における実質的な相同性（例えば、同一性）は、比較したとき、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列した場合、そのセグメント、またはその相補鎖のいずれかが、少なくとも約５０％のヌクレオチド、一般的に少なくとも約５８％、普通少なくとも約６５％、多くの場合少なくとも約７１％、典型的には少なくとも約７７％、通常少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９５から９８％またはそれより多く、そして特定の実施形態では約９９％またはそれ以上のヌクレオチドで同一であることを意味する。あるいは、そのセグメントが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で、鎖、またはその相補鎖に、典型的には例えば配列番号１、３、７、または９のＩＬ−Ｄ８０の配列を用いて、ハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。典型的には、少なくとも約３０ヌクレオチドの区間にわたり少なくとも約５５％、好ましくは約２５ヌクレオチドの区間にわたり少なくとも約７５％、そして最も好ましくは約２０ヌクレオチドにわたり少なくとも約９０％の同一性が存在する時、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３を参照のこと。記載したように、同一性比較の長さは、より長い区間にわたり得、そしてある実施形態では少なくとも約１７ヌクレオチド、通常少なくとも約２８ヌクレオチド、典型的には少なくとも約４０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約７５〜１００またはそれ以上のヌクレオチドの区間である。
【００９９】
ハイブリダイゼーション関連の相同性に関して、ストリンジェントな条件は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター、典型的にはハイブリダイゼーション反応において調節される条件の、ストリンジェントな組み合わせた条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約３０℃を超える、通常約３７℃を超える、典型的には約５５℃、６０℃、または６５℃を超える、そして好ましくは約７０℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通約１０００ｍＭより少なく、通常約４００ｍＭより少なく、典型的には約２５０ｍＭより少なく、好ましくは、約１５０ｍＭより少なく、約１００ｍＭ、５０ｍＭ、または２０ｍＭさえも含む。しかし、パラメーターの組み合わせが、任意の１つのパラメーターの計測値よりはるかに重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０を参照のこと。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、バックグラウンドに対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３−５倍またはそれ以上のバックグラウンドを与える。
【０１００】
配列比較に関して、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いて、試験および参照配列がコンピューターに入力される時、もし必要ならサブシークエンス座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次いで、参照配列に関連する試験配列について配列同一性パーセントを、指定されたプログラムパラメーターに基づいて計算する。
【０１０１】
比較のために配列の最適なアラインメントを、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索法によって、これらアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ博士、ＷＩ）、または視覚的な観察によって（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）行い得る。
【０１０２】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的な対のアラインメントを使用して、関連する配列のグループから複数の配列アラインメントを作成し、関係および配列同一性パーセントを示す。それはまた、アラインメントを作成するために使用された密集する関係を示すツリーまたは系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の連続アラインメント法の簡約化を使用する。その使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３により記載された方法と同様である。そのプログラムは、それぞれ最長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸の、３００の配列までを整列し得る。複数アラインメント手順は、２つの整列した配列の集団を産生する、２つの最も類似した配列の対のアラインメントから始まる。この集団を次いで、次に最も関連した配列または整列配列の集団に対して整列させる。２つの配列の集団を、２つの個々の配列の、対のアラインメントの単純な拡張によって整列させる。最終的なアラインメントを、一連の連続した対のアラインメントによって達成する。そのプログラムは、配列比較の領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメーターを指定することによって実行される。例えば、参照配列を他の試験配列と比較して、以下のパラメーターを使用して配列同一性パーセントの関係を決定し得る：デフォルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）、および重量末端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐｓ）。
【０１０３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適当な、他のアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列中で長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコア配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。これは、データベース配列において同じ長さのワードと整列した場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたは満たす。Ｔは隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これら最初の隣接ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｈｉｔｓ）は、それらを含むより長いＨＳＰｓを発見する探索を開始する種として作用する。ｗｏｒｄ ｈｉｔｓを次いで、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列にそって両方向に拡張する。各方向へのｗｏｒｄ ｈｉｔｓの拡張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値よりＸ量だけ減少する場合；１つ以上のネガティブスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感受性およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして１１のワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【０１０４】
配列同一性パーセント計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の、類似性の統計学的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最少和可能性（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる可能性の指標を示す。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較におけるｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙが約０．１より低い、より好ましくは約０．０１より低い、そして最も好ましくは約０．００１より低いならば、核酸は参照配列と類似していると判断される。
【０１０５】
ポリペプチドの２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる指標は、下記で記載するように、最初の核酸によってコードされるポリペプチドが、２番目の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、下記で記載するように、２つの分子がストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。
【０１０６】
他の哺乳類種由来のＩＬ−Ｄ８０を、密接に関連する種の種間ハイブリダイゼーションによってクローニングおよび単離し得る。相同性は、遠く関連する種の間では比較的低くあり得、従って比較的密接に関連した種のハイブリダイゼーションが賢明である。あるいは、あまり種特異性を示さない抗体製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の調製が、発現クローニングアプローチに有用であり得る。
【０１０７】
（ＶＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０の作成；模倣物）
ＩＬ−Ｄ８０またはその断片をコードするＤＮＡを、化学的合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞系統または組織試料から調製したゲノムライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。例えば、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０；ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９；およびＧｌｏｖｅｒ（編、１９８４）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。あるいは、本明細書中で提供される配列は、有用なＰＣＲプライマーを提供するか、または、ＩＬ−Ｄ８０をコードする適当な遺伝子の合成または他の調製を可能にし、これらには、天然に存在する実施形態が挙げられる。
【０１０８】
次に例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するために使用され得る全長ＩＬ−Ｄ８０または断片の合成のために；結合研究のために；修飾分子の構築および発現のために；そして構造／機能研究のために、このＤＮＡを広範な種々の宿主細胞に発現し得る。効果的な分泌のためにシャペロンタンパク質の必要性が存在し得るか、または細胞内区画からタンパク質を回収するためにさらなる工程が必要であり得る。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、および宿主ゲノムへのＤＮＡ断片の組み込みが可能な他の担体を含む。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（１９８５および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編、１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡを参照のこと。
【０１１０】
本発明の目的のために、ＤＮＡ配列は、それらが互いに機能的に関連している時、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｅｎｃｅ）または分泌リーダーのＤＮＡは、それがプレタンパク質として発現されるか、または細胞膜へのポリペプチドの方向付けに関与するかまたはポリペプチドの分泌に関与する場合、ポリペプチドに作動可能に連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を調節する場合、コード配列と作動可能に連結しており；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置する場合、コード配列と実施可能に連結している。通常、作動可能に連結されて（して）いるとは、隣接およびリーディングフレーム内であることを意味するが、リプレッサー遺伝子のようなある遺伝エレメントは、隣接して連結していないが依然として発現を調節するオペレーター配列に結合する。例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、第１０章、２０５−２３６頁；ＢａｌｂａｓおよびＢｏｌｉｖａｒ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：１４−３７、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。
【０１１１】
適当な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６−１１４２を参照のこと）；ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２を参照のこと）；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバキュロウイルスベターが挙げられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７−１９９を参照のこと。
【０１１２】
特異的または規定されたグリコシル化パターンを提供するシステムでＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドを発現することが、多くの場合望ましい。例えば、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５；およびＫａｕｆｍａｎ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１を参照のこと。
【０１１３】
ＩＬ−Ｄ８０またはその断片は、細胞膜に結合したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）へ操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）を用いた処理によって膜から除取り出され得る。これは、抗原を生物学的に活性な形で放出し、そしてタンパク質化学の標準的手順による精製を可能にする。例えば、Ｌｏｗ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８８：４２７−４５４；Ｔｓｅら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１００３−１００８；およびＢｒｕｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４：１２７５−１２８３を参照のこと。
【０１１４】
ここで、ＩＬ−Ｄ８０が特徴付けられ、その断片または誘導体を、ペプチド合成の従来の処理によって調製し得る。これらは、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＶｉｌｌａｆｒａｎｃａ（編、１９９１）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａで記載されているような手順を含む。
（ＶＩＩＩ．使用）
本発明は、例えばＩＬ−Ｄ８０が媒介する状態、または下記の診断キットの記載において、本明細書中の他の場所で記載されるように、診断的適用において用途を見出す試薬を提供する。その遺伝子は、例えば、げっ歯類をヒトと区別するために、または異なる発現または修飾パターンを示す、異なる細胞間を区別するマーカーとして、法科学において有用であり得る。
【０１１５】
本発明はまた、有意な商業および／または治療的可能性を有する試薬を提供する。ＩＬ−Ｄ８０（天然に存在するまたは組換えの）、その断片、およびそれに対する抗体は、ＩＬ−Ｄ８０に結合親和性を有すると同定された化合物とともに、分子生物学、免疫学、または生理学の技術を教える試薬として有用である。適切なキットを、例えばタンパク質、抗体、クローニング法、組織学等の産生または使用の実際的な研究室実習において、試薬とともに調製し得る。
【０１１６】
その試薬はまた、炎症性状態を含む異常な生理学または発症に関連する状態の治療に有用である。それらは、相互作用する成分の存在または非存在に関するインビトロ試験に有用であり得る。それは特定の治療戦略の成功と関連し得る。特に、様々な、例えば造血またはリンパ性細胞の生理機能の調節を、本明細書中で提供される組成物を用いる適当な治療法によって達成する。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９８８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂを参照のこと。
【０１１７】
例えば、異常な発現またはＩＬ−Ｄ８０による異常なシグナル伝達に関連する疾患または障害は、アゴニストまたはアンタゴニストについての標的であるようである。その新規サイトカインは造血細胞（例えばリンパ球）の調節または発生に役割を果たし、造血細胞は免疫学的反応（例えば、炎症および／または自己免疫疾患）に影響を与える。あるいは、これは血管生理学または発生、または神経効果に影響を与え得る。
【０１１８】
特に、そのサイトカインは、様々な関連で、細胞によるサイトカイン合成、増殖等を媒介する。ＩＬ−Ｄ８０の天然に存在する形のムテイン改変体、または阻害抗体のようなＩＬ−Ｄ８０のアンタゴニストは、例えば炎症性または自己免疫反応のような状況において、免疫反応を阻害する選択的および強力な方法を提供し得る。Ｓａｍｔｅｒら（編）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ 第１および２巻、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．をも参照のこと。
【０１１９】
例えば、ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡ発現によって評価されるように、ＩＬ−Ｄ８０を産生する異なる細胞型における、様々な異常な状態が公知である。Ｂｅｒｋｏｗ（編）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．；Ｔｈｏｒｎら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｙ．；およびＷｅａｔｈｅｒａｌｌら（編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。多くの他の医学的状態および疾患が、マクロファージまたは単球による活性化を含み、そしてこれらの多くが、本明細書中で提供されるアゴニストまたはアンタゴニストによる治療に反応性である。例えば、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（編、１９９１）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ；およびＳａｍｔｅｒら（編）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏを参照のこと。これらの問題は、本明細書中で提供される組成物を使用する予防または治療に感受性である。
【０１２０】
ＩＬ−Ｄ８０、アンタゴニスト、抗体等は、精製し次いで患者、獣医のまたはヒトに投与し得る。これらの試薬を、治療的使用のために、例えば伝統的な薬剤学的に許容できる担体または希釈剤、例えば免疫原性アジュバント中で、生理学的に無害な安定化剤、賦形剤、または保存剤とともに、さらなる活性または不活性成分と組み合わせ得る。これらの組み合せを滅菌濾過し、そして投薬バイアル中における凍結乾燥によるように投薬形式に配置、または安定化水性調製物中で保存し得る。本発明はまた、補体結合をしない形を含む、抗体またはその結合フラグメントの使用を企図する。
【０１２１】
ＩＬ−Ｄ８０またはそのフラグメントを用いた薬剤のスクリーニングを、関連する成分の単離を含んで、結合親和性を有する、またはＩＬ−Ｄ８０機能に対して他の関連する生物学的効果を有する化合物を同定するために実施し得る。次いで続く生物学的アッセイを、その化合物が内因性の刺激活性を有するかどうか、および従ってそのサイトカインの活性を阻害する阻害剤またはアンタゴニストであるかどうかを決定するために利用し得る。同様に、内因性刺激活性を有する化合物は、シグナル伝達経路を活性化し得、そして従ってＩＬ−Ｄ８０の活性を刺激するアゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのＩＬ−Ｄ８０に対する阻害抗体およびアゴニストとしての刺激抗体の治療的使用を企図する。このアプローチは、他のＩＬ−Ｄ８０種変異体で特に有用であるはずである。
【０１２２】
有効な治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、および投与される他の薬剤を含む、多くの異なる因子に依存する。従って、治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投与量が、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量の、有用な指標を提供し得る。特定の障害の治療に関する有効な投与量の動物試験は、ヒト投与量のさらに予期される指標を提供する。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、最新版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎに様々な考慮事項が記載されている。投与方法は、例えば経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散、および他に関して、その中および下記で議論される。薬剤学的に許容できる担体は、水、生理食塩水、緩衝液、および例えばＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙで記載されている他の化合物を含む。投与量範囲は、適当な担体とともに、普通１ｍＭ濃度より低い、代表的には約１０μＭ濃度未満、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル）未満であることが予期される。徐放性の処方または徐放性の装置が、連続的または長期投与のために多くの場合利用される。例えばＬａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと。
【０１２３】
ＩＬ−Ｄ８０、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグメント、アンタゴニスト、およびアゴニストを、治療される宿主へ直接投与し得るか、または化合物の大きさに依存して、投与の前にそれらを卵アルブミンまたは血清アルブミンのような担体タンパク質に結合させることが望ましくあり得る。治療的処方を、多くの伝統的な投薬処方で投与し得る。活性成分を単独で投与することが可能であるが、それを薬剤学的処方として提供することが好ましい。処方は、代表的には上記で定義されたような少なくとも１つの活性成分を、１つ以上のその許容できる担体とともに含む。各担体は、他の成分と適合性であり、そして患者に有害でないという意味で、薬剤学的にもおよび生理学的にも許容可能であるべきである。処方は、経口、直腸内、鼻腔内、局所、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）投与に適当なものを含む。処方は、単位投薬形式で簡便に提供され得、そして薬学の分野で周知のあらゆる方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編、１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編、１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編、１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編、１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤、例えばＩＬ−１１を含む他のサイトカイン、またはそのアンタゴニストと組み合わせ得る、またはそれと共同して使用し得る。
【０１２４】
本発明のＩＬ−Ｄ８０の天然に存在する形式および組換え形式はどちらも、化合物をそのタンパク質への結合活性に関してスクリーニングすることができるキットおよびアッセイ方法で特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が最近開発され、短い期間で何万もの化合物のスクリーニングを可能にした。例えば、Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３を参照のこと。それは固体基板上で合成された複数の規定されたポリマーによる、結合親和性の試験方法を記載している。適当なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような、大量の精製、可溶性ＩＬ−Ｄ８０が入手可能であることによって非常に促進され得る。
【０１２５】
ＩＬ−Ｄ８０−ＩＬ−Ｄ８０受容体相互作用において決定的な残基を決定するために、他の方法を使用し得る。相互作用および／またはシグナル伝達において決定的な特定の残基を決定するために、突然変異分析を行い得る。例えば、Ｓｏｍｏｚａら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．１７８：５４９−５５８を参照のこと。ＰＨＤ（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９：５５−７２）およびＤＳＣ（ＫｉｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：２２９８−２３１０）は、αヘリックス（Ｈ）、β鎖（Ｅ）またはコイル（Ｌ）の２次構造の予測を提供し得る。受容体相互作用においてヘリックスＡおよびＤが最も重要であり、Ｄヘリックスがより重要な領域である。様々なヘリックスの境界を上記で示す。表面に曝露された残基は、受容体結合に影響し、一方埋め込まれた残基は一般的な構造に影響する。
【０１２６】
例えば、一旦抗原が構造的に定義されれば、例えば３次構造データによって、アンタゴニストは普通見出され得る。可能性のある相互作用アナログの試験は、精製ＩＬ−Ｄ８０を用いた高度に自動化されたアッセイ方法の開発によって現在可能である。特に、新規アゴニストおよびアンタゴニストが、本明細書中で記載されるスクリーニング技術を用いて発見される。ある範囲のＩＬ−Ｄ８０分子に対してあわせた結合親和性を有することが見出された化合物、例えばＩＬ−Ｄ８０の種変異体に対してアンタゴニストとして作用し得る化合物が特に重要である。
【０１２７】
薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＩＬ−Ｄ８０を発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換した真核または原核宿主細胞を利用する。他の分子と離れてＩＬ−Ｄ８０を発現する細胞を単離し得る。そのような細胞を、生存可能なまたは固定された形式のいずれかで、標準的な結合パートナー結合アッセイで使用し得る。Ｐａｒｃｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４００７−４０１１も参照のこと。それは細胞反応を検出する鋭敏な方法を記載している。
【０１２８】
薬剤スクリーニングの別の技術は、ＩＬ−Ｄ８０に対して適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供するアプローチを含み、そしてそれは１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎ、欧州特許出願第８４／０３５６４号に詳しく記載されている。まず、多くの異なる小さなペプチド試験化合物を固体基板、例えばプラスチックピンまたは他の適当な表面上に合成する。Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を参照のこと。次いで全てのピンを可溶化未精製ＩＬ−Ｄ８０、または可溶化精製ＩＬ−Ｄ８０と反応させ、そして洗浄する。次の工程は、結合したＩＬ−Ｄ８０を検出することを含む。
【０１２９】
合理的な薬剤設計も、ＩＬ−Ｄ８０および他のエフェクターまたはアナログの分子形の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、結合に反応して他の機能を媒介する他のタンパク質、または通常ＩＬ−Ｄ８０と相互作用する他のタンパク質、例えば受容体であり得る。特定の他のタンパク質とどの部位が相互作用しているか決定する１つの方法は、物理的構造決定、例えばＸ線結晶学、または２次元ＮＭＲ技術である。これらは、例えば他のサイトカイン−受容体モデルに対してモデルを作ったときに、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかに関して指標を提供する。タンパク質構造決定の詳しい記載に関しては、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１３０】
（ＩＸ．キット）
本発明はまた、別のＩＬ−Ｄ８０または結合パートナーの存在を検出するための、様々な診断キットおよび方法において、ＩＬ−Ｄ８０タンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびその融合産物の使用を企図する。代表的には、キットは、規定されたＩＬ−Ｄ８０ペプチドもしくは遺伝子セグメントのいずれか、またはどちらか１つ（例えばＩＬ−Ｄ８０フラグメントもしくは抗体）を認識する試薬を含む区画を有する。
【０１３１】
試験化合物のＩＬ−Ｄ８０への結合親和性を決定するキットは、代表的には試験化合物；標識化合物、例えばＩＬ−Ｄ８０に対して公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体；ＩＬ−Ｄ８０の供給源（天然に存在するものまたは組換え体）；および分子を固定化する固相のような、遊離標識化合物から結合したものを分離する手段を含む。一旦化合物をスクリーニングすると、抗原に対して適当な結合親和性を有するものを、当該分野で周知であるような適当な生物学的アッセイで評価して、それらがＩＬ−Ｄ８０シグナル伝達経路に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうか決定し得る。組換えＩＬ−Ｄ８０ポリペプチドが入手可能であることはまた、そのようなアッセイを較正する、よく規定された標準を提供する。
【０１３２】
試料中の、例えばＩＬ−Ｄ８０の濃度を決定する好ましいキットは、代表的には標識化合物、例えば抗原に対して公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体、サイトカインの供給源（天然に存在するものまたは組換え体）、およびＩＬ−Ｄ８０を固定化する固相のような、遊離標識化合物から結合したものを分離する手段を含む。試薬および指示を含む区画が正常に提供される。
【０１３３】
ＩＬ−Ｄ８０またはフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを含む抗体は、上昇したレベルのＩＬ−Ｄ８０および／またはそのフラグメントの存在を検出する診断的適用に有用である。そのような診断的アッセイは、溶解物、生きた細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を採用し得、そしてさらに血清等におけるその抗原に関連する抗原の検出を含み得る。診断アッセイは、同種（遊離試薬および抗原−結合パートナー複合体間の分離工程なし）または異種（分離工程あり）であり得る。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）等のような様々な市販のアッセイが存在する。例えば、Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓら（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１−５２５；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８０）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；およびＣｏｌｉｇａｎら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。
【０１３４】
抗イディオタイプ抗体を、様々な異常状態の診断になり得るので、ＩＬ−Ｄ８０に対する抗体の存在を診断するために同様に使用し得る。例えば、ＩＬ−Ｄ８０の過剰産生は、特に癌または異常な活性化または分化のような増殖細胞状態において、異常な生理的状態の診断となり得る様々な免疫反応の産生を引き起こし得る。さらに、入手可能な分布パターンは、そのサイトカインは膵島に発現されているという情報を提供し、そのサイトカインはその臓器の機能、例えば糖尿病に関連する医学的状態に関連し得る可能性を示唆する。
【０１３５】
多くの場合、アッセイの感受性を最適化するために、診断アッセイの試薬はキットで供給される。本発明のために、アッセイの性質に依存して、プロトコール、および標識、標識化もしくは未標識化抗体または結合パートナーのいずれか、または標識化ＩＬ−Ｄ８０が提供される。これは普通、緩衝剤、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル産生に必要な材料等のような、他の添加剤と組み合わせられる。好ましくは、キットはまた、適当な使用および使用後の内容物の廃棄に関する指示を含む。代表的には、キットは各有用な試薬のための区画を有する。望ましくは、試薬は凍結乾燥粉末として提供される。ここで試薬は、アッセイを行うのに適当な試薬濃度を提供する水性溶媒中で再構築され得る。
【０１３６】
薬剤スクリーニングおよび診断アッセイの、多くの前述の成分は、修飾無しで使用し得る、または様々な方法で修飾し得る。例えば、標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分と共有または非共有結合させることによって達成し得る。いかなるこれらのアッセイにおいても、結合パートナー、試験化合物、ＩＬ−Ｄ８０、またはそれに対する抗体は、直接または間接的に標識し得る。直接標識の可能性は、標識グループ：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強度の変化、波長の変化、または蛍光の偏光をモニターすることができる蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）を含む。間接的標識の可能性は、１つの成分のビオチン化、続く上記の標識グループの１つと結合したアビジンへの結合を含む。
【０１３７】
遊離ＩＬ−Ｄ８０から結合したものを、あるいは遊離試験化合物から結合したものを分離する多くの方法も存在する。ＩＬ−Ｄ８０を様々なマトリックスに固定化、続いて洗浄し得る。適当なマトリックスは、ＥＬＩＳＡプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズを含む。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編、１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第２章、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ、ＮＹを参照のこと。他の適当な分離技術は、制限無しに、Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０：１４５７−１４６１で記載されたフルオレセイン抗体磁化可能粒子法、および米国特許第４，６５９，６７８号で記載されたような二重抗体磁気粒子分離を含む。
【０１３８】
タンパク質またはそのフラグメントを様々な標識に結合させる方法は、文献に広く報告されており、そしてここで詳しく議論する必要はない。その技術の多くは、結合のために、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルの使用による活性化カルボキシル基の使用、メルカプト基のクロロアセチルのような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとの反応によるチオエーテルの形成等を含む。融合タンパク質もこれらの適用において使用される。
【０１３９】
本発明の別の診断的局面は、ＩＬ−Ｄ８０の配列から取られたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列を、異常な状態、例えば炎症または自己免疫を有することが疑われる患者由来の試料中で、ＩＬ−Ｄ８０メッセージのレベルを検出するプローブとして使用し得る。サイトカインは活性化のマーカーまたはメディエーターとなり得るので、例えば効果が有意になりそして進行する前に予防的な様式で、例えばいつ追加治療が要求され得るかを決定するために、活性化細胞の数を決定するのに有用であり得る。ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイズは、文献において豊富に記載および議論されている。例えば、Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：４３８１−４３８５；Ｃａｓｋｅｙ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：９６２−９６７；およびＷｉｌｃｈｅｋら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２を参照のこと。
【０１４０】
他の分子の定性または定量的発現を試験する診断キットもまた企図される。診断または予後はマーカーとして使用される複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットはマーカーの組み合わせに関して試験し得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１：８９−９を参照のこと。他の細胞サブセットを評価するために他のキットを使用し得る。
【０１４１】
（Ｘ．ＩＬ−Ｄ８０受容体の単離）
特異的なリガンド−受容体相互作用のリガンドが単離されたなら、受容体を単離する方法が存在する。Ｇｅａｒｉｎｇら（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：３６６７−３６７６を参照のこと。例えば、その受容体への結合を阻害することなくＩＬ−Ｄ８０サイトカインを標識する手段を決定し得る。例えば、親和性標識をリガンドのアミノまたはカルボキシル末端のいずれかに融合し得る。そのような標識は、ＦＬＡＧエピトープタグ、または、例えばＩｇまたはＦｃドメインであり得る。発現ライブラリーを、例えば細胞分類、または他のスクリーニングによって、サイトカインに対する特異的な結合に関してスクリーニングして、そのような結合成分を発現する部分集団を検出し得る。例えば、Ｈｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２６７−１１２７１；およびＬｉｕら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１８２１−２９を参照のこと。あるいは、パニング法を使用し得る。例えば、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５−３３６９を参照のこと。
【０１４２】
標識とのタンパク質架橋技術を適用して、ＩＬ−Ｄ８０サイトカインの結合パートナーを単離し得る。これは、例えばリガンド−受容体様の方法でサイトカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定を可能にする。ＩＬ−Ｄ８０はＩＬ−１１Ｒαサブユニットまたは密接に相同的な受容体サブユニットに結合することが予期される。受容体のβサブユニットは、ｇｐ１３０であるようであり、おそらくＬＩＦ受容体がさらなる受容体成分として関与している。
【０１４３】
初期の実験は、予期されるように、公知のＩＬ−１１受容体成分がＩＬ−Ｄ８０への反応に関与しているかどうかを決定するために行われる。これらの機能的受容体複合体が、特異的受容体サブユニットまたは補助受容体サブユニットのいずれか、ＩＬ−Ｄ８０受容体複合体と多くのまたは全ての成分を共有し得ることも、かなり可能性がある。
【実施例】
【０１４４】
（実施例）
（Ｉ．一般的な方法）
下記の標準的な方法の多くは、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１−３巻、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および増刊）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；Ｉｎｎｉｓら（編、１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹにおいて記載または参照されている。タンパク質精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法を含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期的な増刊）；Ｄｕｅｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「タンパク質精製ガイド」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、およびこのシリーズの他の巻；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９５および増刊）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（編、１９９３）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；およびタンパク質精製製品を使用する時の製造業者の文献、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡを参照のこと。組換え技術との組み合わせは、例えばプロテアーゼで除去し得る配列による、適当なセグメント（エピトープタグ）の、例えば融合され得るＦＬＡＧ配列または同等物への融合を可能にする。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ １２：６９−７０；Ｓｅｔｌｏｗ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：８７−９８、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹのＨｏｃｈｕｌｉ（１９９０）「金属キレート吸収物質による組換えタンパク質の精製」；およびＣｒｏｗｅら（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱＵＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡを参照のこと。
【０１４５】
標準的な免疫学的技術は、例えば、Ｈｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇら（編、１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１−４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第７０、７３、７４、８４、９２、９３、１０８、１１６、１２１、１３２、１５０、１６２、および１６３巻において記載されている。サイトカインアッセイは、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ（編、１９９８）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｍｉｒｅ−ＳｌｕｉｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ（１９９５）Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂ．において記載されている。
【０１４６】
血管生物学的活性に関するアッセイは、当該分野で周知である。それらは、腫瘍、または他の組織、例えば動脈平滑筋の増殖（例えばＫｏｙｏｍａら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：１０６９−１０７８を参照のこと）、血管上皮に対する単球の接着（ＭｃＥｖｏｙら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２０６９−２０７７を参照のこと）等における血管形成および血管形成抑制性（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性を含む。Ｒｏｓｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８０１−８０９；ＲｅｋｈｔｅｒおよびＧｏｒｄｏｎ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：６６８−６７７；Ｔｈｙｂｅｒｇら（１９９０）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０：９６６−９９０；およびＧｕｍｂｉｎｅｒ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４：３４５−３５７も参照のこと。
【０１４７】
神経細胞生物学的活性に関するアッセイは、例えばＷｏｕｔｅｒｌｏｏｄ（編、１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、モジュール１０、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＮｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪにおいて記載されている。発生系の方法論は、例えばＭｅｉｓａｍｉ（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにおいて記載されている。
【０１４８】
ＦＡＣＳ分析は、Ｍｅｌａｍｅｄら（１９９０）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ（１９８８）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら（１９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにおいて記載されている。
【０１４９】
（ＩＩ．ヒトＩＬ−Ｄ８０のクローニング）
霊長類、例えばヒト遺伝子の配列が、表１で提供される。これらの配列は配列データベースから得られる。これらの配列は、遺伝子の細胞分布を決定するためのＰＣＲプライマー、またはプローブの調製を可能にする。これらの配列は、メッセージをコードするゲノムＤＮＡの単離を可能にする。
【０１５０】
プローブまたはＰＣＲプライマーを用いて、様々な組織または細胞型を探索（ｐｒｏｂｅ）して細胞分布を決定する。ＰＣＲ産物を、例えばＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングする。できたｃＤＮＡプラスミドを、自動化シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において両端から配列決定する。
【０１５１】
（ＩＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０の細胞発現）
霊長類ＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡに特異的な、適切なプローブまたはプライマーを調製する。典型的には、プローブを例えばランダムプライミングによって標識する。
【０１５２】
サザン分析：１次増幅したｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡ（５μｇ）を、適切な制限酵素で消化して挿入物を放出し、１％アガロースゲルに泳動して、そしてナイロン膜へ転写した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）。
【０１５３】
ヒトｍＲＮＡ単離のための試料は、以下のものを含み得る：末梢血単核細胞（単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球、Ｂ細胞）、休止（Ｔ１００）；末梢血単核細胞、２、６、１２時間抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０１）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、休止（Ｔ１０２）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、３、６、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０３）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、２、７、１２時間特異的ペプチドでアネルギー処理してプール（Ｔ１０４）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、休止（Ｔ１０７）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、３、６、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１０８）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、２、６、１２時間特異的なペプチドでアネルギー処理してプール（Ｔ１０９）；Ｔ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５、休止（Ｔ１１０）；Ｔ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５、２、７、１２時間抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化してプール（Ｔ１１１）；Ｔ細胞腫瘍株ＪｕｒｋａｔおよびＨｕｔ７８、休止（Ｔ１１７）；Ｔ細胞クローン、プールしたＡＤ１３０．２、Ｔｃ７８３．１２、Ｔｃ７８３．１３、Ｔｃ７８３．５８、Ｔｃ７８２．６９、休止（Ｔ１１８）；Ｔ細胞ランダムγδＴ細胞クローン、休止（Ｔ１１９）；ＣＤ２８−Ｔ細胞クローン；脾臓細胞、休止（Ｂ１００）；脾臓細胞、抗ＣＤ４０およびＩＬ−４で活性化（Ｂ１０１）；Ｂ細胞ＥＢＶ株、プールしたＷＴ４９、ＲＳＢ、ＪＹ、ＣＶＩＲ、７２１．２２１、ＲＭ３、ＨＳＹ、休止（Ｂ１０２）；Ｂ細胞株ＪＹ、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｂ１０３）；プールしたＮＫ２０クローン、休止（Ｋ１００）；プールしたＮＫ２０クローン、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｋ１０１）；ＮＫＬクローン、ＬＧＬ白血病患者の末梢血由来、ＩＬ−２処理（Ｋ１０６）；造血前駆細胞株ＴＦ１、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１００）；Ｕ９３７前単球株、休止（Ｍ１００）；Ｕ９３７前単球株、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｍ１０１）；溶出（ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）単球、１、２、６、１２、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０２）；溶出単球、１、２、６、１２、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０３）；溶出単球、４、１６時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０６）；溶出単球、４、１６時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０で活性化してプール（Ｍ１０７）；溶出（ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）単球、１時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０８）；溶出単球、６時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０９）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、休止（Ｄ１０１）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、１時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０２）；ＤＣ７０％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０３）；ＤＣ９５％ ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０４）；ＤＣ９５％ ＣＤ１４＋、ｅｘ ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０５）；ＤＣ ＣＤ１ａ＋ ＣＤ８６＋、ＣＤ３４＋ ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα １２日間、ＦＡＣＳ分類、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｄ１０６）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、休止（Ｄ１０７）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、休止（Ｄ１０８）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、４、１６時間ＬＰＳで活性化してプール（Ｄ１０９）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４ ５日間、４、１６時間ＴＮＦα、単球スープ（ｓｕｐｅ）で活性化してプール（Ｄ１１０）；上皮細胞、未刺激；上皮細胞、ＩＬ−１β活性化；肺線維芽細胞肉腫株ＭＲＣ５、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１０１）；腎臓上皮癌細胞株ＣＨＡ、１、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化してプール（Ｃ１０２）。
【０１５４】
げっ歯類、例えばマウスの対応物が同定され、そしてその分布を同様に評価する。マウスｍＲＮＡ単離の試料は、以下の物を含み得る：休止マウス線維芽Ｌ細胞株（Ｃ２００）；Ｂｒａｆ：ＥＲ（エストロゲンレセプターに融合したＢｒａｆ）トランスフェクト細胞、コントロール（Ｃ２０１）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、休止（Ｔ２０９）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、ＴＨ１細胞へ分極化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）させるためにＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で刺激、６、１２、２４時間ＩＦＮγおよびＩＬ−４へ曝露してプール（Ｔ２１０）；脾臓由来Ｍｅｌ１４＋未処理Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞へ分極化させるためにＩＬ−４および抗ＩＦＮγで刺激、６、１３、２４時間ＩＬ−４および抗ＩＦＮγへ曝露してプール（Ｔ２１１）；Ｔ細胞、ＴＨ１分極化（脾臓由来のＭｅｌ１４光（ｂｒｉｇｈｔ）ＣＤ４＋細胞、ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−４で７日間分極化；Ｔ２００）；Ｔ細胞、ＴＨ２分極化（脾臓由来のＭｅｌ１４光ＣＤ４＋細胞、ＩＬ−４および抗ＩＦＮγで７日間分極化；Ｔ２０１）；Ｔ細胞、トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の高度にＴＨ１分極化３×（Ｏｐｅｎｓｈａｗら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３５７−１３６７を参照のこと；２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２０２）；Ｔ細胞、トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の高度にＴＨ２分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２０３）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ１分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１２）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ２分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１３）；Ｔ細胞、高度にＴＨ１分極化（トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で分極化３×；６、１２、２４時間ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で刺激、プール）；ＣＤ４４− ＣＤ２５＋ 前駆Ｔ細胞、胸腺から分類（Ｔ２０４）；ＴＨ１ Ｔ細胞クローンＤ１．１、抗原による最後の刺激から３週間休止（Ｔ２０５）；ＴＨ１ Ｔ細胞クローン Ｄ１．１、１５時間 １０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激（Ｔ２０６）；ＴＨ２ Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５、抗原による最後の刺激から３週間休止（Ｔ２０７）；ＴＨ２ Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５、１５時間 １０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激（Ｔ２０８）；未刺激Ｂ細胞株ＣＨ１２（Ｂ２０１）；未刺激成熟Ｂ細胞白血病細胞株Ａ２０（Ｂ２００）；脾臓由来の未刺激ラージＢ細胞（Ｂ２０２）；全脾臓由来のＢ細胞、ＬＰＳ刺激（Ｂ２０３）；脾臓由来メトリザマイド濃縮樹状細胞、休止（Ｄ２００）；骨髄由来樹状細胞、休止（Ｄ２０１）；抗Ｂ２２０、抗ＣＤ３、および抗クラスＩＩで枯渇した未刺激骨髄由来樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で培養（Ｄ２０２）；抗Ｂ２２０、抗ＣＤ３、および抗クラスＩＩで枯渇した骨髄由来樹状細胞、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で培養、１、５時間抗ＣＤ４０で刺激、プール（Ｄ２０３）；ＬＰＳで４時間活性化した単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（Ｍ２００）；ＧＭおよびＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ（Ｍ２０１）；ＧＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、およびＩＬ−１０で刺激（Ｍ２０５）；ＧＭ−ＣＳＦで得た骨髄マクロファージ、２４時間ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および抗ＩＬ−１０で刺激（Ｍ２０６）；腹腔マクロファージ（Ｍ２０７）；マクロファージ細胞株Ｊ７７４、休止（Ｍ２０２）；０．５、１、３、６、１２時間のマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋抗ＩＬ−１０、プール（Ｍ２０３）；０．５、１、３、５、１２時間のマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋ＩＬ−１０、プール（Ｍ２０４）；未刺激肥満細胞株ＭＣ−９およびＭＣＰ−１２（Ｍ２０８）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、未刺激（Ｅ２００）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαで一晩刺激（Ｅ２０１）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαで一晩刺激（Ｅ２０２）；脳微小血管内皮細胞由来の不死化内皮細胞株、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０で一晩刺激（Ｅ２０３）；ｗｔＣ５７ｂｌ／６マウス由来の全大動脈；５ヶ月齢ＡｐｏＥ ＫＯ マウス由来の全大動脈（Ｘ２０７）；１２ヶ月齢ＡｐｏＥ ＫＯ マウス由来の全大動脈（Ｘ２０７）；ｗｔ胸腺（Ｏ２１４）；全胸腺、ｒａｇ−１（Ｏ２０８）；全腎臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０９）；全腎臓、ＮＺ Ｂ／Ｗマウス；および全心臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０２）。ＬＰＳで４時間活性化した単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（Ｍ２００）；Ｔ細胞、トランスジェニックＣ５７ｂｌ／６由来の高度にＴＨ１分極化３×（２、６、２４時間抗ＣＤ３で活性化してプール；Ｔ２１２）；およびＴ細胞、高度にＴＨ１分極化（トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃ由来の未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で分極化３×；ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４で６、１２、２４時間刺激してプール）で高いシグナルが検出された。
【０１５５】
（ＩＶ．ＩＬ−Ｄ８０の染色体マッピング）
単離されたＩＬ−Ｄ８０をコードするｃＤＮＡを使用する。染色体マッピングは標準的な技術である。例えば、ＢＩＯＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）およびマウス体細胞ハイブリッドパネルをＰＣＲと共に使用する方法を参照のこと。
【０１５６】
（Ｖ．ＩＬ−Ｄ８０タンパク質の精製）
複数のトランスフェクトした細胞株を、他の細胞に比べて高いレベルでサイトカインを発現するものに関してスクリーニングする。様々な細胞株を、操作に好ましい性質に関してスクリーニングおよび選択する。天然ＩＬ−Ｄ８０を天然の供給源から、または適切な発現ベクターを用いて形質転換した細胞からの発現によって単離し得る。発現タンパク質の精製は、標準的な手順によって達成され得る、または細胞溶解物または上清から高い効率で効率的に精製するために遺伝子工学の手段と組み合わせられ得る。ＦＬＡＧ、またはＨｉｓ6セグメントをそのような精製の特徴のために使用し得る。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーを、特異的な抗体と共に使用し得る。下記を参照のこと。
【０１５７】
タンパク質を、望むように、大腸菌、昆虫細胞、または哺乳動物発現系で産生する。ＩＬ−Ｄ８０構築物を、エピトープタグ付加（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、例えばＦＬＡＧと共に調製した。その構築物を一過的に２９３細胞に発現させ、そしてタグイムノアフィニティーカラム技術を用いて上清から精製した。高度に精製されたタンパク質を得た。
【０１５８】
（ＶＩ．相同なＩＬ−Ｄ８０遺伝子の単離）
ＩＬ−Ｄ８０ ｃＤＮＡ、または他の種の対応する配列を、望ましい供給源由来のライブラリー、例えば霊長類細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。多くの異なる種を、容易なハイブリダイゼーションに必要なストリンジェンシーに関して、そしてプローブを用いて存在に関してスクリーニングし得る。適切なハイブリダイゼーション条件を、クロスハイブリダイゼーションの特異性を示すクローンを選択するために使用する。
【０１５９】
ペプチド配列に基づく縮重プローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングはまた、適切なクローンの単離を可能にする。あるいは、ＰＣＲスクリーニングに適切なプライマーの使用は、適切な核酸クローンの濃縮を生じる。
【０１６０】
種変異体、多型変異体、または対立遺伝子変異体のいずれかを単離するのに、同様の方法を適用できる。種変異体を、プローブとして１つの種由来の全長単離物またはフラグメントの単離に基づく種間ハイブリダイゼーション技術を用いて単離する。
【０１６１】
あるいは、ヒトＩＬ−Ｄ８０に対して産生した抗体を、例えば適切なｃＤＮＡライブラリーから交差反応性タンパク質を発現する細胞をスクリーニングするために使用する。精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記で記載されたような、標準的な方法によって抗体を産生するのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を、免疫系に提示して、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。生じた抗体を、記載されたように、スクリーニング、精製、または診断に使用する。
【０１６２】
（ＶＩＩ．ＩＬ−Ｄ８０に特異的な抗体の調製）
合成ペプチドまたは精製タンパク質を免疫系に提示してモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。ポリクローナル血清、またはハイブリドーマを調製し得る。適切な状況で、結合試薬は、例えば蛍光または他の方法で、上記で記載されたように標識されるか、またはパニング法のために基材に固定化される。免疫選択、吸着、および関連する技術が、例えば結合の選択性の望ましいスペクトルを示す選択的試薬を調製するために利用可能である。
【０１６３】
（ＶＩＩＩ．生物学的機能の範囲の評価）
ＩＬ−Ｄ８０の生物学的活性を、部分的にはＩＬ−Ｄ８０とＩＬ−１１との間の配列および構造的相同性に基づいて試験する。最初に、ＩＬ−１１の生物学的活性を示すアッセイを試験する。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓのＪａｃｏｂｓｅｎ（１９９８）を参照のこと。
【０１６４】
（Ａ．前駆細胞の増殖／分化に対する効果）
様々な細胞型の増殖または分化に対する効果を、様々なサイトカイン濃度で評価する。用量応答性分析を、ある場合には他のサイトカイン、例えば関連するサイトカインＩＬ−１１と相乗作用を示すものと組み合わせて実施する。これらは、例えばＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＰＯ、Ｋｉｔリガンド、またはＦｌｔリガンドを含む。
【０１６５】
特に、ＩＬ−１１は幹細胞において相乗的活性を示す。ＩＬ−Ｄ８０を臍帯血細胞で試験し、ＩＬ−１１から得られた初期の前駆細胞の増殖または分化に効果があるかどうかを見る。好ましくは、細胞は初期前駆細胞、例えば臍帯血、骨髄、胸腺、脾臓、またはＣＤ３４＋前駆細胞由来の、例えば幹細胞である。サイトカインを、Ｂ細胞前駆細胞を含む骨髄および／または赤血球前駆細胞に対する効果に関して試験する。
【０１６６】
（Ｂ．巨核球の増殖に対するＩＬ−Ｄ８０の効果）
全ＰＢＭＣを、正常健康ドナーの軟膜から、記載されたようにフィコール−ハイパーク（ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）による遠心によって単離する（Ｂｏｙｕｍら）。ＰＢＭＣを、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下で、単独または他のサイトカインと組み合わせて、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ）で、１％のヒトＡＢ血清を含む２００μｌのＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。細胞を、培地単独または１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせて１２０時間培養する。３Ｈ−チミジン（０．１ｍＣｉ）を、培養の最後の６時間に加え、そして３Ｈ−チミジンの組み込みを液体シンチレーション計測によって決定する。
【０１６７】
ネイティブ、組換え、および融合タンパク質を、多くの他の生物学的アッセイシステムにおいて、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ、マクロファージ、樹状細胞、造血前駆体等におけるアゴニストおよびアンタゴニスト活性に関して試験する。
【０１６８】
ＩＬ−Ｄ８０を、ＩＬ−１１レセプターおよびコントロールを発現するトランスフェクトした細胞において、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して評価する。
【０１６９】
ＩＬ−Ｄ８０を、マクロファージ／樹状細胞活性化および抗原提示アッセイ、抗原または同種異系刺激に反応するＴ細胞サイトカイン産生および増殖における影響に関して、単独または他のサイトカインと組み合わせて評価する。例えば、ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２０９−１２２０；ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：９１５−９２４；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３８１５−３８２２；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３４４４−３４５１；およびＧｒｏｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１９−２９を参照のこと。
【０１７０】
ＩＬ−Ｄ８０をまた、ＮＫ細胞刺激における効果に関して評価する。アッセイは、例えばＨｓｕら（１９９２）Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５６３−５６９；およびＳｃｈｗａｒｚら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１６：９５−１０４に基づき得る。細胞傷害性Ｔ細胞およびＬＡＫ細胞における効果を評価するために、他のアッセイを適用する。例えば、ＮａｍｉｅｎおよびＭｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ（１９９８）を参照のこと。
【０１７１】
Ｂ細胞の増殖および分化効果を、例えば、ＩｇＧ２およびＩｇＡ２スイッチ因子アッセイを含む、例えばＤｅｆｒａｎｃｅら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：６７１−６８２；Ｒｏｕｓｓｅｔら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８９０−１８９３において記載された方法論によって、分析する。ＣＯＳ７上清と異なり、ＮＩＨ３Ｔ３およびＣＯＰ上清は明らかにヒトＢ細胞アッセイを妨害しないことに注意すること。
【０１７２】
（Ｃ．ヒト単球の細胞表面分子の発現に対する効果）
単球を、正常健康ドナーの末梢血単核細胞からネガティブセレクションによって精製する。簡単には、３×１０8のフィコールバンド化（ｂａｎｄｅｄ）単核細胞を、氷上で例えば２００μｌのαＣＤ２（Ｌｅｕ−５Ａ）、２００μｌのαＣＤ３（Ｌｅｕ−４）、１００μｌのαＣＤ８（Ｌｅｕ ２ａ）、１００μｌのαＣＤ１９（Ｌｅｕ−１２）、１００μｌのαＣＤ２０（Ｌｅｕ−１６）、１００μｌのαＣＤ５６（Ｌｅｕ−１９）、１００μｌのαＣＤ６７（ＩＯＭ ６７；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）、および抗グリコホリン抗体（１０Ｆ７ＭＮ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含むモノクローナル抗体の反応混液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）と共にインキュベートする。抗体に結合した細胞を洗浄し、そして次いでヒツジ抗マウスＩｇＧを結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と共に、ビーズ対細胞の比が２０：１でインキュベートする。抗体に結合した細胞を、磁場の適用によって単球から分離する。続いて、ヒト単球を、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下で、単独または他のサイトカインと組み合わせて、１％ヒトＡＢ血清を含むＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。
【０１７３】
細胞表面分子の発現の分析を、直接免疫蛍光検査によって行い得る。例えば、２×１０5の精製ヒト単球を、１％のヒト血清を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、氷上で２０分間インキュベートする。細胞を２００×ｇでペレット化する。細胞を２０ｍｌのＰＥまたはＦＩＴＣ標識ｍＡｂに再懸濁する。さらに氷上で２０分間インキュベートした後、細胞を、１％ヒト血清を含むＰＢＳ中で洗浄し、続いてＰＢＳ単独で２回洗浄する。細胞を、１％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定化し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析する。代表的なｍＡｂを使用する。例えば：Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＣＤ１１ｂ（抗ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ（抗ｇｐ１５０／９５）、ＣＤ１４（Ｌｅｕ−Ｍ３）、ＣＤ５４（Ｌｅｕ ５４）、ＣＤ８０（抗ＢＢ１／Ｂ７）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、およびＣＤ８６（ＦＵＮ１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ６４（３２．２；Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＣＤ４０（ｍＡｂ８９；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１７４】
（Ｄ．ヒト単球によるサイトカイン産生におけるＩＬ−Ｄ８０の効果）
ヒト単球を、記載したように単離し、そしてＩＬ−Ｄ８０（１／１００希釈バキュロウイルス発現材料）の存在または非存在下で１％ヒトＡＢ血清を含むＹｓｓｅｌ培地（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）中で培養する。それに加えて、単球を、ＩＬ−Ｄ８０の存在または非存在下でＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８ Ｄｉｆｃｏ）で刺激し、そして細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０）濃度をＥＬＩＳＡによって決定する。
【０１７５】
サイトカインの細胞質内染色のために、単球を、ＩＬ−Ｄ８０およびＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８ Ｄｉｆｃｏ）および１０ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在または非存在下で、Ｙｓｓｅｌ培地中で１２時間培養する（１００万／ｍｌ）。細胞をＰＢＳ中で洗浄して、そして２％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で、室温で２０分間インキュベートする。続いて細胞を洗浄し、透過化処理緩衝液（ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．５％）／アジド（１ｍＭ）中０．５％のサポニン（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁し、そして室温で２０分間インキュベートする。細胞（２×１０5）を遠心分離して、そして透過化緩衝液中で１：１０に希釈した２０ｍｌの直接結合抗サイトカインｍＡｂに、室温で２０分間再懸濁する。以下の抗体を使用し得る：ＩＬ−１α−ＰＥ（３６４−３Ｂ３−１４）；ＩＬ−６−ＰＥ（ＭＱ２−１３Ａ５）；ＴＮＦα−ＰＥ（ＭＡｂ１１）；ＧＭ−ＣＳＦ−ＰＥ（ＢＶＤ２−２１Ｃ１１）；およびＩＬ−１２−ＰＥ（Ｃ１１．５．１４；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。続いて、細胞を透過化緩衝液中で２回、およびＰＢＳ／ＢＳＡ／アジド中で１回洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析する。
【０１７６】
骨リモデリング、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｉｏｃｙｔｅ）、ニューロン、脂肪細胞、胃腸上皮、または気管支上皮の領域で、さらなるアッセイを試験する。
【０１７７】
（ＩＸ．遺伝子改変した動物の作製および分析）
トランスジェニックマウスを標準的な方法によって作製し得る。そのような動物は、特定の組織における、または完全に生物体全体で、遺伝子の欠失の効果を決定するのに有用である。そのようなものは、動物または特定の組織の、様々な段階における発生に興味深い洞察を提供し得る。さらに、生物学的ストレスに対する様々な反応に対する効果を評価し得る。例えば、Ｈｏｇａｎら（１９９５）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０１７８】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、個々の出版物または特許出願それぞれが、全体として全ての目的のために参考文献に援用されると明確にそして個々に示されたように同じ程度、本明細書中で参考文献に援用される。
【０１７９】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの修飾および変化が、その意図および範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書中で記載された特定の実施態様は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、このような請求が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限される。
［配列表］
【０１８０】
【表１−１】
【０１８１】
【表１−２】
【０１８２】
【表１−３】
【０１８３】
【表１−４】
【０１８４】
【表１−５】
【０１８５】
【表１−６】
【０１８６】
【表１−７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【公開番号】特開２０１０−２２７１２０（Ｐ２０１０−２２７１２０Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５７２０２（Ｐ２０１０−１５７２０２）
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【分割の表示】特願２００１−５１３９８２（Ｐ２００１−５１３９８２）の分割
【原出願日】平成１２年７月２７日（２０００．７．２７）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【分割の表示】特願２００１−５１３９８２（Ｐ２００１−５１３９８２）の分割
【原出願日】平成１２年７月２７日（２０００．７．２７）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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