基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
【課題】基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）を提供する。
【解決手段】野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ、及び／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。また該酵素の遺伝子、ベクター、該遺伝子を導入した形質転換体によるＰＱＱＧＤＨの製造法、さらに該遺伝子を利用したグルコースセンサーと、グルコースの測定方法。
【解決手段】野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ、及び／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。また該酵素の遺伝子、ベクター、該遺伝子を導入した形質転換体によるＰＱＱＧＤＨの製造法、さらに該遺伝子を利用したグルコースセンサーと、グルコースの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性及び／又は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＰＱＱＧＤＨとも略記する。）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（特許文献１参照）。ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べて基質特異性、熱安定性に問題点があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性及び／又は熱安定性を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
１． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２． 野生型のグルコースデヒドロゲナーゼよりも二糖類に対する作用性が低下したことを特徴とする１．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３． 二糖類がマルトースであることを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
４． マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であることを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
５． 二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなったことを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
６． 二糖類がマルトースであることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
７． マルトースに対するＫｍ値が８ｍＭ以上であることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
８． 二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいことを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
９． 二糖類がマルトースであることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１０． マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上であることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１１． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、グルコースやＰＱＱとの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１２． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１３． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１２９位、１３０位、１３１位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位及び４２９位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１４． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ，
Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｅ，Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ａ１７０Ｍ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ，
Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ，Ｔ３４９Ｓ，Ｔ３４９Ｐ，Ｔ３４９Ｙ，Ｎ４２９Ｆ，Ｎ４２９Ｐ，Ｎ４２９Ｌ，Ｎ４２９Ｙ，からなる群から選択される１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１５． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ，
Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１
６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ），
（Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ），
（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ），
（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により基質特異性が向上した１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１６． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１７． １．〜１６．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
１８． １７．に記載の遺伝子を含むベクター。
１９． １８．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
２０． １９．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
２１． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
２２． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
２３． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
２４． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２５． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が４８％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２６． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が５５％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２７． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２８． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨにおいて、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２４．に記載のＰＱＱＧＤＨ。
２９． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ，
Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ，Ｌ１６９Ｇ及びＥ２４５Ｄからなる群から選択される２８．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３０． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ），（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ） からなる群から選択され、該アミノ酸置換により熱安定性が向上した２９．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３１． ２４．〜３０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
３２． ３１．に記載の遺伝子を含むベクター。
３３． ３２．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
３４． ３３．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
３５． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
３６． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
３７． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
３８． 野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．に記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
３９． 野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４０． 基質がグルコースで有る３９．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４１． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４２． 基質がグルコースである４１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４３． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４４．基質がグルコースで有る４３．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上したものである。
【０００９】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものを含む。好ましくは、マルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは６０％以下、特に４０％以下である。
【００１２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であるものを含む。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対するに対するＫｍ値が大きいものを含む。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値が大きいものである。マルトースに対するＫｍ値は、好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１２ｍＭ以上、特
に２０ｍＭ以上である。
【００１４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいものを含む。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいものである。あるいは、好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上、より好ましくは３倍以上である。
【００１５】
本発明における安定性（熱安定性ともいう）は、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率によって評価される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が野生型ＰＱＱＧＤＨよりも高いものを含む。活性残存率は、好ましくは４８％以上、より好ましくは５５％以上、特に好ましくは７０％以上である。
【００１６】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位、１３１位及び４２９位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する、及び／または、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１７】
基質特異性の改良された本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されているＧＤＨが例示される。
【００１８】
好ましくは、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ，
Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｅ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ａ１７０Ｍ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ，
Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ，
Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｔ３４９Ｓ， Ｔ３４９Ｐ， Ｔ３４９Ｙ， Ｎ４２９Ｆ， Ｎ４２９Ｐ， Ｎ４２９Ｌ， Ｎ４２９Ｙ，からなるＡ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選ばれるアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する、及び／または、４２８位と４２９位の間にＬ、ＡまたはＫが挿入されている、改変型ＰＱＱＧＤＨである。
【００１９】
６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位
、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の置換は、１ヶ所であってもよく、また複数箇所であってもよい。
【００２０】
ここで、「Ｑ７６Ｎ」は、７６位のＱ（Ｇｌｎ）をＮ（Ａｓｎ）に置換することを意味する。
【００２１】
次の段落に示すいずれかの置換、及び／または、４２８位と４２９位の間へのＬ、ＡまたはＫの挿入は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与する。
【００２２】
Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ，
Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ），
（Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）
， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）
【００２３】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上した本発明のＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００２４】
好ましくは、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１
６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する。２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の置換は、１ヶ所であってもよく、複数ヶ所であってもよい。
【００２５】
ここで、「Ｋ２０Ｅ」は、２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００２６】
次に示すいずれかのアミノ酸置換は、ＰＱＱＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
特に、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ，
Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）、 （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）
【００２７】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００２８】
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００２９】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、好ましくは二糖類に対する作用性及び／又は安定性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００３０】
ところで、本願出願時において、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ） ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした該酵素の高次構造が明らかとなっている（非特許文献１，２，３，４を参照。）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００３１】
その高次構造に関する知見を基に、該酵素の構造と機能の相関に関する研究が進められているが、まだ完全に明らかになったとは言えない。例えば、水溶性グルコース脱水素酵素の第６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランドを結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコースに対する選択性を改良しうることが考察されている（例えば、特許文献２を参照。）しかしながら、効果が実証されているのは実施例に開示されているものだけである。
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８
【００３２】
一方、発明者らは、本願発明の成果をもとにこれらの高次構造に関する知見を見直したところ、二糖類に対する作用性および／または安定性の改変に、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸 の少なくとも１つ以上が関わっているのではないかと考えている。
【００３３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、および／または、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。非特許文献３および４には、ＰＱＱに結合するアミノ酸として、Ｙ３４４、Ｗ３４６、Ｒ２２８、Ｎ２２９、Ｋ３７７、Ｒ４０６、Ｒ４０８、Ｄ４２４、グルコースに結合するアミノ酸としては、Ｑ７６、Ｄ１４３、Ｈ１４４、Ｄ１６３、Ｑ１６８、Ｌ１６９、などの記載がある。
【００３４】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。非特許文献１には、活性中心のカルシウムイオンに結合するアミノ酸としては、Ｐ２４８、Ｇ２４７、Ｑ２４６、Ｄ２５２、Ｔ３４８などの記載がある。
【００３５】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造における活性中心
から半径１５Å以内、好ましくは半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。
【００３６】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３７】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３８】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３９】
以上の教示にしたがって、当業者は、他の起源に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、当該領域でアミノ酸残基を置換することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００４０】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。そして、本発明にしたがって、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で欠失、置換あるいは挿入等することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨグルコース脱水素酵素も本発明の範囲内に含まれる。
【００４１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
【００４２】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情
報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４３】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４４】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００４５】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００４６】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００４７】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００４８】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４９】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００５０】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００５１】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００５２】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００５３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５５】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５６】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５７】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００５８】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００５９】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはとその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７ 等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００６０】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００６１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６２】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００６３】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６４】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート
剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６６】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６７】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００６８】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６９】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位および２４５位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ａ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｄ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｓ） および （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）が特に好ましい。
【００７０】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。熱安定性に関する
限り、Ｋ２０Ｅ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ，
Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｙ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）及びＱ２４６Ｈの置換が特に望ましい。
【００７１】
改変タンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００７２】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００７３】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００７４】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００７５】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７６】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７７】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合
する方法などが挙げられる。
【００７８】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００７９】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００８０】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００８１】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００８２】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００８３】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００８４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。
【００８６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００８８】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがアスパラギンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがスレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがメチオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがリジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ６）取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴ
ヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ７）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１０記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ８）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１１記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ９）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２２記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２０番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１０）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミドを取得した。更にこのプラスミドと配列番号２４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に、３００番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２４６番目のグルタミンがヒスチジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがプロリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１６）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがグリシンに置換された変異型ＰＱ
Ｑ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１７）を取得した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ１、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００８９】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５Ｍ１のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６Ｍ１と命名した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７と命名した。
【００９０】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６Ｍ１を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７の各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９１】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（
ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００９２】
【表１】
【００９３】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００９４】
ホロ型発現精製酵素の調製方法
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６Ｍ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約１２０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７によるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【００９５】
Ｋｍ値の測定
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法の基質濃度を変化させて実施した。また、マルトースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法のグルコース溶液をマルトース溶液に置き換え、グルコースに対するＫｍ値の測定同様基質濃度を変化させて実施した。結果を表２Ａ表２Ｂ、表６，表９，表１４及び表１８に示す。
【００９６】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表４、表５、表６、表８、表９、表１１、表１３、表１４及び表１８に示す。
【００９７】
熱安定性の測定
各種ＰＱＱＧＤＨを酵素濃度５Ｕ／ｍｌ、緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＰＱＱを含む１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）中で保存し、５８℃で熱処理後の活性残存率を求めた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表６、表９、表１４及び表１８に示す。なお、熱処理を行なった時間は、表２Ｂ、表１８の試験のみ３０分間、その他の試験は２０分間である。
【００９８】
至適ｐＨの測定
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中で酵素活性を測定した。結果を図１に示す。また、最も高い活性を示したｐＨを表２Ａに示す。
【００９９】
【表２】
【０１００】
Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩、同仁化学研究所製）
下記に示すグルコース量の測定方法に従い、試料として精製水、１００ｍｇ／ｄｌ標準液及びグルコース水溶液（６００ｍｇ／ｄｌ）の１０水準の希釈系列を測定し、直線性を確認した。
結果を図２に示した。
【０１０１】
グルコース量の測定方法
試料量３μｌに試薬３００μｌを加え、試薬添加後２分後からの１分間における吸光度変化を求め、精製水及びグルコース１００ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のグルコース量を求めた。尚、測定装置は日立７１５０形自動分析装置を使用し、測定波長は、主波長４８０ｎｍのみ、測定温度は３７℃で実施した。
図２より、０−６００ｍｇ／ｄｌの範囲で良好な直線性が確認された。
【０１０２】
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（同仁化学研究所製）
サンプルとしては１００ｍｇ／ｄｌまたは３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースに０，１２０，２４０，３６０ｍｇ／ｄｌのマルトースを上乗せした物を準備した。 上記、グルコース量の測定方法に従い、測定を実施した。
マルトースを含まない１００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。同様にマルトースを含まない３００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに３００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。結果を図３に示す。
【０１０３】
Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｅを用いて作用性を評価した。酵素は、０．２４Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図４に示す。
【０１０４】
Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｖを用いて作用性を評価した。酵素は、０．３５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図５に示す。
【０１０５】
Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ａを用いて作用性を評価した。酵素は、０．６Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図６に示す。
【０１０６】
野生型酵素のマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様に野生型酵素を用いて作用性を評価した。酵素は、０．１Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図７に示す。
図３、図４、図５、図６、図７より、Ｑ７６Ｋ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｖ及びＱ１６８Ａは野生型酵素に比べ、マルトースに対する作用性が低下していることが確認された。
【０１０７】
実施例５：変異ライブラリーの構築とスクリーニング
発現プラスミドｐＮＰＧ５をテンプレートとして、ＰＣＲ法により構造遺伝子中の１６７−１６９領域にランダム変異を導入した。ＰＣＲ反応は表３に示す組成の溶液中で、９８℃２分間、次に、９８℃２０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃４分間を３０サイクルの条件で行った。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
得られた変異ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形成された各コロニーを１８０μｌ／ｗｅｌｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）の分注されたマイクロタイタープレートに植菌し、３７℃、２４時間培養した。培養液各５０μｌを別のマイクロタイタープレートに移し、凍結融解の繰り返しによって培養菌体を破砕した後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を回収した。回収した上清を２枚のマイクロタイタープレートに各１０μｌ分注した。１枚のマイクロタイタープレートはグルコースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、もう一枚はマルトースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、反応性を比較した。マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
マルトースに対する反応性の変化したクローンをＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）５ｍｌの分注された試験管で培養し、確認実験を行ったところ、マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
結果を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
同様にして６７−６９領域（フォワードプライマー：配列番号１４に記載、リバースプライマー：配列番号１５に記載を使用）、１２９−１３１領域（フォワードプライマー：配列番号１６に記載、リバースプライマー：配列番号１７に記載を使用）、３４１−３４３領域（フォワードプライマー：配列番号１８に記載、リバースプライマー：配列番号１９に記載を使用）にも変異導入した。また、４２８と４２９（フォワードプライマー：配列番号２０に記載、リバースプライマー：配列番号２１に記載を使用）の間に挿入を試みた。
結果を表５に示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
これらのうち、マルトースに対する作用性が大きく低下している変異体を選抜（Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）し、これらの変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
実施例６：Ｑ１６８部位の変異による基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ｃ、Ｑ１６８Ｄ、Ｑ１６８Ｅ，Ｑ１６８Ｆ，Ｑ１６８Ｇ，Ｑ１６８Ｈ，Ｑ１６８Ｋ，Ｑ１６８Ｌ，Ｑ１６８Ｍ，Ｑ１６８Ｎ，Ｑ１６８Ｐ、Ｑ１６８Ｒ，Ｑ１６８Ｓ，Ｑ１６８Ｔ、Ｑ１６８Ｗ、Ｑ１６８Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表７に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表８に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表９に示す。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
実施例７：Ｌ１６９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｌ１６９Ａ，Ｌ１６９Ｖ，Ｌ１６９Ｈ、Ｌ１６９Ｙ、Ｌ１６９Ｋ，Ｌ１６９Ｄ，Ｌ１６９Ｓ，Ｌ１６９Ｎ，Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｃの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１０に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１１に示す。
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
実施例８：Ｑ１６８Ａ変異体に対するＬ１６９部位の変異の組み合わせによる基質特異性
への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１２に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１３に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１４に示す。
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
実施例９：Ａ１７０部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ａ１７０Ｃ、Ａ１７０Ｄ、Ａ１７０Ｅ，Ａ１７０Ｆ，Ａ１７０Ｇ，Ａ１７０Ｈ，Ａ１７０Ｋ，Ａ１７０Ｌ，Ａ１７０Ｍ，Ａ１７０Ｎ，Ａ１７０Ｐ、Ａ１７０Ｒ，Ａ１７０Ｓ，Ａ１７０Ｔ、Ａ１７０Ｗ、Ａ１７０Ｙ，Ａ１７０Ｖ，Ａ１７０Ｉ，Ａ１７０Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号６９記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号６９と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１５に示す。
【０１２７】
【表１５】
【０１２８】
実施例１０：Ｅ２４５部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｅ２４５Ｃ、Ｅ２４５Ｄ、Ｅ２４５Ａ，Ｅ２４５Ｆ，Ｅ２４５Ｇ，Ｅ２４５Ｈ，Ｅ２４５Ｋ，Ｅ２４５Ｌ，Ｅ２４５Ｍ，Ｅ２４５Ｎ，Ｅ２４５Ｐ、Ｅ２４５Ｒ，Ｅ２４５Ｓ，Ｅ２４５Ｔ、Ｅ２４５Ｗ、Ｅ２４５Ｙ，Ｅ２４５Ｖ，Ｅ２４５Ｉ，Ｅ２４５Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７０記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７０と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１６に示す。
【０１２９】
【表１６】
【０１３０】
実施例１１：Ｎ２４９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｎ２４９Ｃ、Ｎ２４９Ｄ、Ｎ２４９Ａ，Ｎ２４９Ｆ，Ｎ２４９Ｇ，Ｎ２４９Ｈ，Ｎ２４９Ｋ，Ｎ２４９Ｌ，Ｎ２４９Ｍ，Ｎ２４９Ｅ，Ｎ２４９Ｐ、Ｎ２４９Ｒ，Ｎ２４９Ｓ，Ｎ２４９Ｔ、Ｎ２４９Ｗ、Ｎ２４９Ｖ，Ｎ２４９Ｉ，Ｎ２４９Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７１記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７１と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１７に示す。
【０１３１】
【表１７】
【０１３２】
実施例１２：Ｅ２４５Ｄ変異の組み合わせによる基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）の各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７２記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７２と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。また、鋳型ＤＮＡとしては実施例８で取得した（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）または（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）のｐｌａｓｍｉｄを使用した。調製した変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１８に示す。
【０１３３】
【表１８】
【０１３４】
実施例１３：Ｔ３４９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｔ３４９Ｓ、Ｔ３４９Ｐ、Ｔ３４９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７３記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７３と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した
。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１９に示す。
【０１３５】
【表１９】
【０１３６】
実施例１４：Ｎ４２９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｎ４２９Ｆ、Ｎ４２９Ｐ、Ｎ４２９Ｌ、Ｎ４２９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７４記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７４と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表２０に示す。
【０１３７】
【表２０】
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明によれば、基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】Ｑ７６Ｎ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｉ、Ｑ１６８Ｖ、Ｑ７６Ｔ、Ｑ７６Ｍ、Ｑ１６８Ａ、野生型、Ｑ７６Ｇ、Ｑ７６Ｋの至適ｐＨの測定結果を示す。横軸はｐＨ、縦軸は相対活性を示す。図中、黒丸（Ａｃｅｔａｔｅ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）で酵素活性を測定した結果である。同様に、黒四角（ＰＩＰＥＳ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、黒三角（Ｋ−ＰＢ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、黒菱形（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中でそれぞれ酵素活性を測定した結果である。なお測定値は最大活性を示したものを１００％とした相対値で示している。
【図２】Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認結果を示す。横軸は１水準の希釈系列、縦軸はグルコース濃度の測定値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。
【図３】Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図４】Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図５】Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図６】Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図７】野生型酵素のマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性及び／又は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＰＱＱＧＤＨとも略記する。）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（特許文献１参照）。ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べて基質特異性、熱安定性に問題点があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性及び／又は熱安定性を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
１． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２． 野生型のグルコースデヒドロゲナーゼよりも二糖類に対する作用性が低下したことを特徴とする１．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３． 二糖類がマルトースであることを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
４． マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であることを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
５． 二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなったことを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
６． 二糖類がマルトースであることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
７． マルトースに対するＫｍ値が８ｍＭ以上であることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
８． 二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいことを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
９． 二糖類がマルトースであることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１０． マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上であることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１１． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、グルコースやＰＱＱとの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１２． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１３． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１２９位、１３０位、１３１位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位及び４２９位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１４． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ，
Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｅ，Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ａ１７０Ｍ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ，
Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ，Ｔ３４９Ｓ，Ｔ３４９Ｐ，Ｔ３４９Ｙ，Ｎ４２９Ｆ，Ｎ４２９Ｐ，Ｎ４２９Ｌ，Ｎ４２９Ｙ，からなる群から選択される１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１５． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ，
Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１
６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ），
（Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ），
（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ），
（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により基質特異性が向上した１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１６． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１７． １．〜１６．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
１８． １７．に記載の遺伝子を含むベクター。
１９． １８．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
２０． １９．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
２１． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
２２． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
２３． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
２４． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２５． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が４８％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２６． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が５５％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２７． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする２４．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２８． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨにおいて、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２４．に記載のＰＱＱＧＤＨ。
２９． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ，
Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ，Ｌ１６９Ｇ及びＥ２４５Ｄからなる群から選択される２８．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３０． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ），（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ） からなる群から選択され、該アミノ酸置換により熱安定性が向上した２９．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３１． ２４．〜３０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
３２． ３１．に記載の遺伝子を含むベクター。
３３． ３２．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
３４． ３３．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
３５． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
３６． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
３７． ２４．〜３３．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
３８． 野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．に記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
３９． 野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４０． 基質がグルコースで有る３９．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４１． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４２． 基質がグルコースである４１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４３． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４４．基質がグルコースで有る４３．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上したものである。
【０００９】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものを含む。好ましくは、マルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは６０％以下、特に４０％以下である。
【００１２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であるものを含む。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対するに対するＫｍ値が大きいものを含む。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値が大きいものである。マルトースに対するＫｍ値は、好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１２ｍＭ以上、特
に２０ｍＭ以上である。
【００１４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいものを含む。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいものである。あるいは、好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上、より好ましくは３倍以上である。
【００１５】
本発明における安定性（熱安定性ともいう）は、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率によって評価される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が野生型ＰＱＱＧＤＨよりも高いものを含む。活性残存率は、好ましくは４８％以上、より好ましくは５５％以上、特に好ましくは７０％以上である。
【００１６】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位、１３１位及び４２９位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する、及び／または、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１７】
基質特異性の改良された本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されているＧＤＨが例示される。
【００１８】
好ましくは、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ，
Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｅ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ａ１７０Ｍ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ，
Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ，
Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｔ３４９Ｓ， Ｔ３４９Ｐ， Ｔ３４９Ｙ， Ｎ４２９Ｆ， Ｎ４２９Ｐ， Ｎ４２９Ｌ， Ｎ４２９Ｙ，からなるＡ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選ばれるアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する、及び／または、４２８位と４２９位の間にＬ、ＡまたはＫが挿入されている、改変型ＰＱＱＧＤＨである。
【００１９】
６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位
、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の置換は、１ヶ所であってもよく、また複数箇所であってもよい。
【００２０】
ここで、「Ｑ７６Ｎ」は、７６位のＱ（Ｇｌｎ）をＮ（Ａｓｎ）に置換することを意味する。
【００２１】
次の段落に示すいずれかの置換、及び／または、４２８位と４２９位の間へのＬ、ＡまたはＫの挿入は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与する。
【００２２】
Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ，
Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ），
（Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）
， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）
【００２３】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上した本発明のＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００２４】
好ましくは、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１
６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する。２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の置換は、１ヶ所であってもよく、複数ヶ所であってもよい。
【００２５】
ここで、「Ｋ２０Ｅ」は、２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００２６】
次に示すいずれかのアミノ酸置換は、ＰＱＱＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
特に、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ，
Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）、 （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）、 （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）
【００２７】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００２８】
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００２９】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、好ましくは二糖類に対する作用性及び／又は安定性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００３０】
ところで、本願出願時において、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ） ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした該酵素の高次構造が明らかとなっている（非特許文献１，２，３，４を参照。）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００３１】
その高次構造に関する知見を基に、該酵素の構造と機能の相関に関する研究が進められているが、まだ完全に明らかになったとは言えない。例えば、水溶性グルコース脱水素酵素の第６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランドを結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコースに対する選択性を改良しうることが考察されている（例えば、特許文献２を参照。）しかしながら、効果が実証されているのは実施例に開示されているものだけである。
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８
【００３２】
一方、発明者らは、本願発明の成果をもとにこれらの高次構造に関する知見を見直したところ、二糖類に対する作用性および／または安定性の改変に、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸 の少なくとも１つ以上が関わっているのではないかと考えている。
【００３３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、および／または、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。非特許文献３および４には、ＰＱＱに結合するアミノ酸として、Ｙ３４４、Ｗ３４６、Ｒ２２８、Ｎ２２９、Ｋ３７７、Ｒ４０６、Ｒ４０８、Ｄ４２４、グルコースに結合するアミノ酸としては、Ｑ７６、Ｄ１４３、Ｈ１４４、Ｄ１６３、Ｑ１６８、Ｌ１６９、などの記載がある。
【００３４】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。非特許文献１には、活性中心のカルシウムイオンに結合するアミノ酸としては、Ｐ２４８、Ｇ２４７、Ｑ２４６、Ｄ２５２、Ｔ３４８などの記載がある。
【００３５】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造における活性中心
から半径１５Å以内、好ましくは半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。
【００３６】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３７】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３８】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３９】
以上の教示にしたがって、当業者は、他の起源に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、当該領域でアミノ酸残基を置換することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００４０】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。そして、本発明にしたがって、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で欠失、置換あるいは挿入等することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨグルコース脱水素酵素も本発明の範囲内に含まれる。
【００４１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
【００４２】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情
報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４３】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４４】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００４５】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００４６】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００４７】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００４８】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４９】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００５０】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００５１】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００５２】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００５３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５５】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５６】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５７】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００５８】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００５９】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはとその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７ 等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００６０】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００６１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６２】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００６３】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６４】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート
剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６６】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６７】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００６８】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６９】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位および２４５位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ａ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｄ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｓ） および （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）が特に好ましい。
【００７０】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４５位、２４６位及び３００位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。熱安定性に関する
限り、Ｋ２０Ｅ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ，
Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ ＋
Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｙ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）及びＱ２４６Ｈの置換が特に望ましい。
【００７１】
改変タンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００７２】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００７３】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００７４】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００７５】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７６】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７７】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合
する方法などが挙げられる。
【００７８】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００７９】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００８０】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００８１】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００８２】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００８３】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００８４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングする。
【００８６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００８８】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがアスパラギンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがスレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがメチオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがリジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ６）取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴ
ヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ７）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１０記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ８）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１１記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ９）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２２記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２０番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１０）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミドを取得した。更にこのプラスミドと配列番号２４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に、３００番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２４６番目のグルタミンがヒスチジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがプロリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１６）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがグリシンに置換された変異型ＰＱ
Ｑ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１７）を取得した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ１、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００８９】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５Ｍ１のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６Ｍ１と命名した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７と命名した。
【００９０】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６Ｍ１を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７の各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９１】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（
ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００９２】
【表１】
【００９３】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００９４】
ホロ型発現精製酵素の調製方法
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６Ｍ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約１２０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７によるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【００９５】
Ｋｍ値の測定
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法の基質濃度を変化させて実施した。また、マルトースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法のグルコース溶液をマルトース溶液に置き換え、グルコースに対するＫｍ値の測定同様基質濃度を変化させて実施した。結果を表２Ａ表２Ｂ、表６，表９，表１４及び表１８に示す。
【００９６】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表４、表５、表６、表８、表９、表１１、表１３、表１４及び表１８に示す。
【００９７】
熱安定性の測定
各種ＰＱＱＧＤＨを酵素濃度５Ｕ／ｍｌ、緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＰＱＱを含む１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）中で保存し、５８℃で熱処理後の活性残存率を求めた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表６、表９、表１４及び表１８に示す。なお、熱処理を行なった時間は、表２Ｂ、表１８の試験のみ３０分間、その他の試験は２０分間である。
【００９８】
至適ｐＨの測定
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中で酵素活性を測定した。結果を図１に示す。また、最も高い活性を示したｐＨを表２Ａに示す。
【００９９】
【表２】
【０１００】
Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩、同仁化学研究所製）
下記に示すグルコース量の測定方法に従い、試料として精製水、１００ｍｇ／ｄｌ標準液及びグルコース水溶液（６００ｍｇ／ｄｌ）の１０水準の希釈系列を測定し、直線性を確認した。
結果を図２に示した。
【０１０１】
グルコース量の測定方法
試料量３μｌに試薬３００μｌを加え、試薬添加後２分後からの１分間における吸光度変化を求め、精製水及びグルコース１００ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のグルコース量を求めた。尚、測定装置は日立７１５０形自動分析装置を使用し、測定波長は、主波長４８０ｎｍのみ、測定温度は３７℃で実施した。
図２より、０−６００ｍｇ／ｄｌの範囲で良好な直線性が確認された。
【０１０２】
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（同仁化学研究所製）
サンプルとしては１００ｍｇ／ｄｌまたは３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースに０，１２０，２４０，３６０ｍｇ／ｄｌのマルトースを上乗せした物を準備した。 上記、グルコース量の測定方法に従い、測定を実施した。
マルトースを含まない１００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。同様にマルトースを含まない３００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに３００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。結果を図３に示す。
【０１０３】
Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｅを用いて作用性を評価した。酵素は、０．２４Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図４に示す。
【０１０４】
Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｖを用いて作用性を評価した。酵素は、０．３５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図５に示す。
【０１０５】
Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ａを用いて作用性を評価した。酵素は、０．６Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図６に示す。
【０１０６】
野生型酵素のマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様に野生型酵素を用いて作用性を評価した。酵素は、０．１Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図７に示す。
図３、図４、図５、図６、図７より、Ｑ７６Ｋ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｖ及びＱ１６８Ａは野生型酵素に比べ、マルトースに対する作用性が低下していることが確認された。
【０１０７】
実施例５：変異ライブラリーの構築とスクリーニング
発現プラスミドｐＮＰＧ５をテンプレートとして、ＰＣＲ法により構造遺伝子中の１６７−１６９領域にランダム変異を導入した。ＰＣＲ反応は表３に示す組成の溶液中で、９８℃２分間、次に、９８℃２０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃４分間を３０サイクルの条件で行った。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
得られた変異ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形成された各コロニーを１８０μｌ／ｗｅｌｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）の分注されたマイクロタイタープレートに植菌し、３７℃、２４時間培養した。培養液各５０μｌを別のマイクロタイタープレートに移し、凍結融解の繰り返しによって培養菌体を破砕した後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を回収した。回収した上清を２枚のマイクロタイタープレートに各１０μｌ分注した。１枚のマイクロタイタープレートはグルコースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、もう一枚はマルトースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、反応性を比較した。マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
マルトースに対する反応性の変化したクローンをＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）５ｍｌの分注された試験管で培養し、確認実験を行ったところ、マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
結果を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
同様にして６７−６９領域（フォワードプライマー：配列番号１４に記載、リバースプライマー：配列番号１５に記載を使用）、１２９−１３１領域（フォワードプライマー：配列番号１６に記載、リバースプライマー：配列番号１７に記載を使用）、３４１−３４３領域（フォワードプライマー：配列番号１８に記載、リバースプライマー：配列番号１９に記載を使用）にも変異導入した。また、４２８と４２９（フォワードプライマー：配列番号２０に記載、リバースプライマー：配列番号２１に記載を使用）の間に挿入を試みた。
結果を表５に示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
これらのうち、マルトースに対する作用性が大きく低下している変異体を選抜（Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）し、これらの変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
実施例６：Ｑ１６８部位の変異による基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ｃ、Ｑ１６８Ｄ、Ｑ１６８Ｅ，Ｑ１６８Ｆ，Ｑ１６８Ｇ，Ｑ１６８Ｈ，Ｑ１６８Ｋ，Ｑ１６８Ｌ，Ｑ１６８Ｍ，Ｑ１６８Ｎ，Ｑ１６８Ｐ、Ｑ１６８Ｒ，Ｑ１６８Ｓ，Ｑ１６８Ｔ、Ｑ１６８Ｗ、Ｑ１６８Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表７に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表８に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表９に示す。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
実施例７：Ｌ１６９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｌ１６９Ａ，Ｌ１６９Ｖ，Ｌ１６９Ｈ、Ｌ１６９Ｙ、Ｌ１６９Ｋ，Ｌ１６９Ｄ，Ｌ１６９Ｓ，Ｌ１６９Ｎ，Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｃの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１０に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１１に示す。
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
実施例８：Ｑ１６８Ａ変異体に対するＬ１６９部位の変異の組み合わせによる基質特異性
への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１２に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１３に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１４に示す。
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
実施例９：Ａ１７０部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ａ１７０Ｃ、Ａ１７０Ｄ、Ａ１７０Ｅ，Ａ１７０Ｆ，Ａ１７０Ｇ，Ａ１７０Ｈ，Ａ１７０Ｋ，Ａ１７０Ｌ，Ａ１７０Ｍ，Ａ１７０Ｎ，Ａ１７０Ｐ、Ａ１７０Ｒ，Ａ１７０Ｓ，Ａ１７０Ｔ、Ａ１７０Ｗ、Ａ１７０Ｙ，Ａ１７０Ｖ，Ａ１７０Ｉ，Ａ１７０Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号６９記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号６９と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１５に示す。
【０１２７】
【表１５】
【０１２８】
実施例１０：Ｅ２４５部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｅ２４５Ｃ、Ｅ２４５Ｄ、Ｅ２４５Ａ，Ｅ２４５Ｆ，Ｅ２４５Ｇ，Ｅ２４５Ｈ，Ｅ２４５Ｋ，Ｅ２４５Ｌ，Ｅ２４５Ｍ，Ｅ２４５Ｎ，Ｅ２４５Ｐ、Ｅ２４５Ｒ，Ｅ２４５Ｓ，Ｅ２４５Ｔ、Ｅ２４５Ｗ、Ｅ２４５Ｙ，Ｅ２４５Ｖ，Ｅ２４５Ｉ，Ｅ２４５Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７０記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７０と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１６に示す。
【０１２９】
【表１６】
【０１３０】
実施例１１：Ｎ２４９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｎ２４９Ｃ、Ｎ２４９Ｄ、Ｎ２４９Ａ，Ｎ２４９Ｆ，Ｎ２４９Ｇ，Ｎ２４９Ｈ，Ｎ２４９Ｋ，Ｎ２４９Ｌ，Ｎ２４９Ｍ，Ｎ２４９Ｅ，Ｎ２４９Ｐ、Ｎ２４９Ｒ，Ｎ２４９Ｓ，Ｎ２４９Ｔ、Ｎ２４９Ｗ、Ｎ２４９Ｖ，Ｎ２４９Ｉ，Ｎ２４９Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７１記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７１と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１７に示す。
【０１３１】
【表１７】
【０１３２】
実施例１２：Ｅ２４５Ｄ変異の組み合わせによる基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）の各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７２記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７２と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。また、鋳型ＤＮＡとしては実施例８で取得した（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）または（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）のｐｌａｓｍｉｄを使用した。調製した変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１８に示す。
【０１３３】
【表１８】
【０１３４】
実施例１３：Ｔ３４９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｔ３４９Ｓ、Ｔ３４９Ｐ、Ｔ３４９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７３記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７３と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した
。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１９に示す。
【０１３５】
【表１９】
【０１３６】
実施例１４：Ｎ４２９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｎ４２９Ｆ、Ｎ４２９Ｐ、Ｎ４２９Ｌ、Ｎ４２９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７４記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７４と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表２０に示す。
【０１３７】
【表２０】
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明によれば、基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】Ｑ７６Ｎ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｉ、Ｑ１６８Ｖ、Ｑ７６Ｔ、Ｑ７６Ｍ、Ｑ１６８Ａ、野生型、Ｑ７６Ｇ、Ｑ７６Ｋの至適ｐＨの測定結果を示す。横軸はｐＨ、縦軸は相対活性を示す。図中、黒丸（Ａｃｅｔａｔｅ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）で酵素活性を測定した結果である。同様に、黒四角（ＰＩＰＥＳ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、黒三角（Ｋ−ＰＢ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、黒菱形（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中でそれぞれ酵素活性を測定した結果である。なお測定値は最大活性を示したものを１００％とした相対値で示している。
【図２】Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認結果を示す。横軸は１水準の希釈系列、縦軸はグルコース濃度の測定値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。
【図３】Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図４】Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図５】Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図６】Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【図７】野生型酵素のマルトース作用性の確認結果を示す。横軸は、上乗せしたマルトース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸はマルトース添加濃度が０のときの測定値を１００％としたときの相対％を示す。図中、黒三角はサンプルとして１００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合、黒菱形はサンプルとして３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースにマルトースを上乗せした場合をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、１７０位のアラニン（Ａ）が他のアミノ酸に置換した、改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項２】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子であって、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質の１７０位のアラニン（Ａ）に該当するコドンを他のアミノ酸に該当するコドンに置換した、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【請求項６】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項７】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項８】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、１７０位のアラニン（Ａ）が他のアミノ酸に置換した、改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項２】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子であって、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質の１７０位のアラニン（Ａ）に該当するコドンを他のアミノ酸に該当するコドンに置換した、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【請求項６】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項７】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項８】
請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−１６１１９１（Ｐ２００８−１６１１９１Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３３５８５（Ｐ２００７−３３３５８５）
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【分割の表示】特願２００４−６０２８３（Ｐ２００４−６０２８３）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【分割の表示】特願２００４−６０２８３（Ｐ２００４−６０２８３）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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