外来種由来のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を獲得したコリネバクテリウム属のＬ−リシン生産方法
本発明は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関し、本発明のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法によれば、高収率でＬ−リシンを生産することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、伝統的にアミノ酸と核酸関連物質の生産に最も広く利用される産業用微生物であって、主にＬ−リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、Ｌ−スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｌ−アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ） 及びグルタミン酸などのアミノ酸及び各種核酸を含んだ飼料、医薬品及び食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産するのに利用されるグラム陽性細菌であり、生育にビオチンを要求する。代表的な菌種としては、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含んだコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）を含んだブレビバクテリウム属、アルスロバクター種（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、及びミクロバクテリウム種（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）などがある。
【０００３】
Ｌ−リシンは、Ｌ−アミノ酸の１つであって、その他のアミノ酸の吸収を増加させることによって、飼料の質を向上させ得る能力により動物飼料補充物として商業的に使用されてあり、人体医学では、特に注入用溶液剤の成分として使用され、製薬産業にも使用されている。従って、リシンを産業的に生産することは経済的に重要な産業工程である。
【０００４】
リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させるとか遺伝子のプロモーターを変形させて、生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が利用されて来た。また、外部の他のバクテリア由来の遺伝子を導入する場合もあって、［日本特許公報第（平）７−１２１２２８号］には、エシェリキア・コリ由来のクエン酸シンターゼ を暗号化する遺伝子を導入する方法が記述されている。
【０００５】
一方、リシン生産性を向上させるために生体内中央炭素代謝過程に変形を加えることができる。中央炭素代謝過程に関与する酵素であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、コリネバックテリアではＮＡＤを助酵素として用いてグリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をグリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換させる酵素であるｇａｐＡの形態で存在し、グリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ｐｇｋ遺伝子によって３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換される２つの段階の過程を経る一方に、ストレプトコッカス及びバシラスでは、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の助酵素であるＮＡＤＰを用いて３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換させる非リン酸化ＮＡＤＰ依存的ＧＡＰＤＨ（ｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，以下、ｇａｐＮ）酵素として存在し、ＮＡＤＰＨを生産しながら該当過程で重要な役割を果たし、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ割合によって影響を受け、一段階の過程からなる（Ｉｄｄａｒ， Ａなど， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２５（３）：５１９−２６（２００２））。
【０００６】
コリネバクテリウムには、ｇａｐＮ遺伝子がないと報告されてあり、ｇａｐＮを暗号化する遺伝子をコリネバクテリウム細菌の育種に利用することも公知されていない。しかし、ｇａｐＮ遺伝子を導入してアミノ酸生産を増加した先行文献として、大韓民国特許出願１０−２００４−０１１６９９号及び米国特許出願１１／７２２，８２０号では、大膓菌でｇａｐＮを発現させてリシン生産量を増加させた例があるが、コリネバクテリウムに対してはその実施例がなかった。よって、ｇａｐＮの効果を見るために、コリネバクテリウムのリシン生産菌株でクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のｇａｐＮ発現実験を行ってみたところ、その効果が微小だった。これに、論文探索を介して（Ａｂｄｅｌａｚｉｚ Ｓｏｕｋｒｉ ｅｔ ａｌ． ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ （２００５） ８：２５１−２５８）外来種の細菌に存在する３種のｇａｐＮ遺伝子を見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＮＡＤを助酵素として利用する代りにＮＡＤＰを利用するようにｇａｐＮを発現させてＮＡＤＰＨの量を増やしてリシン生合成過程でエネルギー源である還元力として使用してコリネバクテリウム属菌株のＬ−リシン生産力が向上できるということを見出して発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法を提供するためのものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ストレプトコッカス属及びバシラス属由来のｇａｐＮを暗号化する遺伝子を導入することによってＬ−リシン生産能力を有し、ｇａｐＮ活性を有するコリネバクテリウム菌株を用いて還元力を増加させてリシン生産に必要なエネルギーを供給受けてリシン生産能力が向上したＬ−リシン製造法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）発現プラスミドｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮの開裂地図を示したものである。
【図２】図２は、染色体挿入用ベクターでｇａｐＡ遺伝子を破壊するためのベクターＰＤＺ−ｇａｐＡの開裂地図を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様として、本発明はＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を提供する。
【００１２】
本発明のＬ−リシン生産能が向上したコリネバクテリウム属菌株は、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）をコードする遺伝子を不活性化させ、外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ポスペイトデ−ハイドロジナゼをコードする遺伝子（ｇａｐＮ）を導入して得られることができる。
【００１３】
本発明において、前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質とし、助酵素であるＮＡＤＰを用いて３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換する活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドならいずれも含まれる。
【００１４】
前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の例には、動物、植物、及びバクテリアから由来したＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。好ましくは、バクテリアから由来したＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子であり、最も好ましくは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）から由来するＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子である。より具体的に、前記ストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子は、それぞれ配列番号１１（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４３５０）、１２（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４１１６）、及び１３（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４７２２．１）のヌクレオチド配列を有するものであり得る。
【００１５】
外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、当業界の公知の通常的な方法によってコリネ型細菌内に導入することができる。
【００１６】
具体的に、前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクター内に導入してＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ発現用組換えベクターを製造し、前記ベクターを内在したグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が不活性化されたコリネ型細菌内に導入して形質転換されたコリネ型細菌を生産することによって達成できる。
【００１７】
前記ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ発現用組換えベクターは、通常的な方法、すなわち、適切なベクターに制限酵素を使用して外来ＮＡＤＰ依存的グルリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ−ヒドロゲナゼ遺伝子の塩基配列をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによって製造することができる。本発明において、前記ベクターは、図１の開裂地図を有するベクターであり得る。本発明の具体的な例でストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子を導入するためのベクターは、それぞれｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１、ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ２、及びｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ３である。
【００１８】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリアウム種菌株でＮＡＤを助酵素として用いてグリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてグリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１、３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換させる酵素をコードする遺伝子をいい、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、ＮＣｇｌ１５２６）を有する遺伝子である。
【００１９】
また、前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化するために、コリネバクテリウム属菌株が天然の状態で有しているｇａｐＡ遺伝子を欠失、置換または挿入させる遺伝子操作を加えることができ、好ましくは、ｇａｐＡ遺伝子の一部を含む組換えベクターでコリネ型バクテリアを形質転換することができ、一例として、図２の開裂地図を有するベクターを導入させることによってｇａｐＡ活性が不活性化された菌株を製作することができる。本発明の具体的な例において染色体挿入用ベクターは、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の２つの片が連続的にクローニングされたｐＤＺ−ｇａｐＡ組換えベクターを使用した。このような染色体挿入用ベクターを形質転換するコリネ型バクテリアは、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１があるが、これに制限されない。本発明の具体的な実施例によれば、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されたコリネ型バクテリアは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−００９６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１２Ｐ）であり得る。
【００２０】
本願明細書において使用された用語“形質転換”は、ＤＮＡを宿主として導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書において使用された用語“形質感染”は、任意のコード配列が実際に発現されてもされなくても発現ベクターが宿主細胞によって収容されることを意味する。本願明細書において使用された用語“形質感染された宿主”及び“形質転換された宿主”は、ＤＮＡの細胞への導入を意味する。その細胞は、“宿主細胞”と呼ばれ、原核または真核生物細胞であり得る。典型的な原核宿主細胞は、エシェリキア・コリの各種菌株を含む。用語“ベクター”は、適した宿主内でＤＮＡの発現を行うことができる適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。このような調節配列は、転写を行うためのプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写並びに翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと無関係に複製して機能することができるとか、または一部の場合にゲノムその自体に統合され得る。プラスミドが現在、ベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、“プラスミド”及び“ベクター”は、時々相互交換的に使用される。用語“調節配列”という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びリボゾーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することと知られている。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時“作動可能に連結”になる。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（など）に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列（など）であり得る。例えば、全配列または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する全タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるとか；またはリボゾーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるとか；またはリボゾーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合、接触してリーディング上内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプダーまたはリンカーを使用する。
【００２２】
本願明細書において使用された用語“ベクター”は、異種ＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリアであって、一般に二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡとして定義される。発現ベクターは、一応宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００２３】
当業界に周知されたように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製オリジンを更に含む１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーを更に含まなければならない。
【００２４】
本発明の組換えベクター製造の時に使用可能なベクターとしては、コリネ型バクテリアで自律的に増殖できるベクターから由来したものであり得る。例えば、ファージベクターまたはプラスミドベクターから由来することができる。ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、例えば、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどが挙げられ、プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＥＴ系、ｐＭａｌ系、ｐＱＥ系などが挙げられる。
【００２５】
また、本発明において使用するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）は、コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−リシン生産能を有するものならばいずれも含まれる。前記コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の例としては、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、及びブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）がある。
【００２６】
本発明のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）には、野生型菌株だけではなく、Ｌ−リシン生産能が改善した変異株も含まれる。例えば、メチオニン要求性、スレオニン類似体（ＡＨＶ：α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）に対する耐性、リシン類似体（ＡＥＣ：Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に対する耐性、イソロイシン類似体（α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（エチオニン）に対する耐性などの特性を有した菌株などになり得る。また、Ｌ−リシン生産能を向上させるために、導入された遺伝子のコピー数を増加させるとか遺伝子調節配列を操作することによって、Ｌ−リシン生産能が改善した菌株に変異されることもできる。好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、及びそれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１１００１が含まれることができる。最も好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１である。しかし、これに限定されるのではない。
【００２７】
本発明の具体的な例では、それぞれストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子、及びバチルス・セレウス由来遺伝子を内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１に導入して生産されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６５（受託番号ＫＣＣＭ１１０１３Ｐ）、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１４Ｐ）、及びコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６７（受託番号ＫＣＣＭ１１０１５Ｐ）であるコリネバクテリウム属菌株を提供する。前記菌株などは、ＫＣＣＭ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， 大韓民国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に２００９年７月２日付けで寄託した。
【００２８】
Ｌ−リシン生産能力の向上は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性化によって増加された還元力に起因する。内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの代りに外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウムＬ−リシン生産菌株に導入して、ＮＡＤを助酵素として用いる代りにＮＡＤＰを用いるようにＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼを活性化させ、これを介してＮＡＤＰＨの量を増やしてＬ−リシン生合成過程においてエネルギー源である還元力として使用することができる。
【００２９】
他の態様として、本発明は、前記ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を培養する段階、及び前記培養された細胞または細胞培養物からリシンを回収する段階を含む、Ｌ−リシンを生産する方法を提供する。
【００３０】
本発明によって使用されるコリネバクテリウム属菌株は、バッチ工程 （ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）または注入バッチまたは繰り返し注入バッチ工程（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）で連続式または回分式で培養することができる。これらの公知された培養方法は、文献［Ｃｈｍｉｅｌ，（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １． Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ （Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９９１）；及びＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ， １９９４）］に記述されている。
【００３１】
使用される培養バッジは、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム属菌株に対する培養バッジは、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）］で調べてみることができる。使用され得る糖原としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖、及び炭水化物；大豆油、ヒマワリ種子油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用され得る。使用され得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用できる。使用され得るリン源としては、リン酸水素二カリウムまたはリン酸二水素カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用され得る。また、培養培地に適切な前駆体などが使用され得る。前記の原料などは、培養過程で培養物に適切な方式によって回分式にまたは連続式で添加され得る。
【００３２】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内へ酸素または酸素−含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大で得られるまで続く。このような目的で普通１０〜１６０時間で達成される。
【００３３】
Ｌ−アミノ酸は、陰イオン交換クロマトグラフィー及び後続でニンヒドリン誘導体によって分析することができる（Ｓｐａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３０， （１９５８）， １１９０）。
【実施例】
【００３４】
本発明は、下記実施例を介してより具体的に説明される。しかし、これらの実施例によって本発明が限定されてはいけない。
【００３５】
実施例１．ストレプトコッカス・ミュータンス由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
ストレプトコッカス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は、既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４３５０）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表１で記載された１対のプライマーを合成し、ストレプトコッカス・ミュータンスＡＴＣＣ２５１７５菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ１プラスミドを得た。
【００３６】
プライマー
【００３７】
【表１】
【００３８】
実施例２．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例１で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ１をそれぞれ、制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２（参照；大韓民国特許公開番号１９９２−００００９３３に公知される）に発現プロモーターであるＰｃｊ７（参照；大韓民国特許公開番号２００６−００６８５０５に公知される）を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１を製作した（図１）。
【００３９】
実施例３．ストレプトコッカス・アガラクチア由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
ストレプトコッカス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は、既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４１１６）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表２で記載された１対のプライマーを合成し、ストレプトコッカス・アガラクチアＡＴＣＣＢＡＡ−６１１菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ２プラスミドを得た。
【００４０】
プライマー
【００４１】
【表２】
【００４２】
実施例４．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例３で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ２をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２（参照；大韓民国特許公開番号１９９２−００００９３３に公知される）に発現プロモーターであるＰｃｊ７（参照；大韓民国特許公開番号２００６−００６８５０５に公知される）を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ２を製作した（図１）。
【００４３】
実施例５．バチルス・セレウス由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
バチルス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４７２２．１）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表３で記載された１対のプライマーを合成し、バチルス・セレウスＡＴＣＣ１４５７９菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ３プラスミドを得た。
【００４４】
プライマー
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例６．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例５で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ３をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２に発現プロモーターであるＰｃｊ７を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ３を製作した（図１）。
【００４７】
実施例７．人工変異法によるコリネバクテリウム・グルタミクムリシン生産菌株（ＫＦＣＣ−１０８８１）製造
リシン生合成経路の複数個の遺伝子を挿入する菌株は、人工変異法によって製作されたＳ−（２−アミノエチル）システイン（Ｓ−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃｙｓｔｅｉｎｅ、以下、ＡＥＣ）に対する耐性及びホモセリン漏出（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌｅａｋｙ）の特徴を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＦＣＣ−１０８８１）を用いた。
【００４８】
前記の変異株ＫＦＣＣ−１０８８１は、コリネバクテリウム・グルタミクム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を母菌株として突然変異誘発原であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：以下、ＮＴＧ）を細胞１０７〜１０８／ｍｌに対して３０℃で最終濃度５００μｇ／ｍｌで３０分間処理し、ＡＥＣを５ｇ／Ｌの濃度で含有した複合平板培地で成長する菌株を分離することによって得ることができた。前記の１次変異株に対するＡＥＣ耐性度とリシン生産能を確認した後、ＮＴＧによる２次人工変異を誘導した後獲得した多数のコロニーをホモセリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有した最小培地及びホモセリンが添加されない最小培地に接種（ｔｏｏｔｈ ｐｉｃｋｉｎｇ）してホモセリンが添加されない最小培地で成長できないホモセリン要求性菌株（２次変異株）を分離した。これから再びホモセリン漏出型菌株を分離しようとして３次人工変異を誘導した後、ホモセリン１０ｍｇ／Ｌが含有された最小培地で成長する菌株を分離してリシン生産能を確認した（表４）。最終に、ＡＥＣ耐性及びホモセリン漏出型特徴を有するリシン生産株を獲得し、これを社団法人韓国種菌協会に寄託し、寄託番号第ＫＦＣＣ−１０８８１号を受けた。
【００４９】
ＫＦＣＣ−１０８８１のリシン生産能
【００５０】
【表４】
【００５１】
最小培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、尿素２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．４ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン塩酸塩３０００μｇ、パントテン酸カルシウム１０００μｇ、ニコチンアミド５０００μｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５２】
種培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、尿素５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ（工程水１リットル基準）
【００５３】
生産培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５４】
実施例８．リシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１由来ｇａｐＡ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−ｇａｐＡ）製作、ｇａｐＡ破壊菌株開発
本実施例では、実施例７で製作されたリシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを介して、リシン生合成経路のｇａｐＡ遺伝子を確保した。アメリカ国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）を基にしてｇａｐＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、ＮＣｇｌ１５２６）を確保し、これに基づいて２対のプライマー（表５、配列番号７〜１０）を合成した。
【００５５】
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型にし、前記配列番号７〜１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒；アニーリング５３℃、３０秒；及び重合反応７２℃、３０秒を３０回繰り返した。その結果、６００ｂｐのｇａｐＡ遺伝子断片２対（ｇａｐＡ−Ａ、ｇａｐＡ−Ｂ）を得た。ｇａｐＡ−Ａは、配列番号５と６をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｇａｐＡ−Ｂは、配列番号７と８をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＡ−ＡとｐＣＲ−ｇａｐＡ−Ｂベクターを得た。
【００５６】
プライマー
【００５７】
【表５】
【００５８】
前記ｐＣＲベクターにｇａｐＡ−ＡとｇａｐＡ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｇａｐＡ−Ａ：ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ｇａｐＡ−Ｂ：ＸｂａＩ）を処理して、前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｇａｐＡ遺伝子を分離した。次に、制限酵素ＳａｌＩとＸｂａＩとが処理されたｐＤＺベクター（参照：大韓民国特許公開番号１０−２００８−００２５３５５に公知される）に３片接合（３−ｐｉｅｃｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を介してクローニングし、最終に、ｇａｐＡ断片２つの片が連続的にクローニングされたｐＤＺ−ｇａｐＡ組換えベクターを製作した。図２は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−ｇａｐＡを示す図面である。
【００５９】
製作されたｐＤＺ−ｇａｐＡベクターを実施例５で製作されたリシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１に形質転換し、２次交差過程を経って染色体上でｇａｐＡ遺伝子にｇａｐＡ遺伝子中間部位３００塩基対除去されたベクターを挿入してｇａｐＡ遺伝子が不活性化されたリシン生産株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−００９６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１２Ｐ）を得た。破壊されたｇａｐＡ遺伝子は、野生型ｇａｐＡより３００塩基対が減ったことを配列番号７と１０のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００６０】
実施例９．ＣＡ０１−００９６からｇａｐＮ遺伝子発現誘導
実施例２、４、６で得たｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１〜３ベクターをＣＡ０１−００９６に導入した。ｇａｐＡ遺伝子が破壊されると、一般的なコリネバクテリウム・グルタミクムが育つ培地である最小培地では成長できない特徴があることと知られている（参照論文； Ｈｉｄｅａｋｉ Ｙｕｋａｗａら Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４； ８：９１−１０３ ）
【００６１】
ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１〜３ベクターをＣＡ０１−００９６内へ電気パルス法を用いて形質転換した菌株（菌株番号ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７）を製作してｇａｐＮが発現されると、最小培地で育つことができる特性を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムからｇａｐＮの発現を誘導した。前記ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７は、それぞれ２００９年７月２日にＫＣＣＭ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， 大韓民国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に受託番号ＫＣＣＭ−１１０１３Ｐ、ＫＣＣＭ−１１０１４Ｐ及びＫＣＣＭ−１１０１５Ｐで寄託した。
【００６２】
実施例１０．リシン生産菌株でｇａｐＮ活性確認
炭素源を、ブドウ糖を用いて製作した最小培地で成長可否を測定した結果、ｇａｐＡが破壊された菌株は成長しなかったし、ｇａｐＮが発現された菌株では成長が回復した。
【００６３】
成長可否
【００６４】
【表６】
【００６５】
実施例１１．リシン生産菌株でｇａｐＮ活性確認
ｇａｐＮ発現ベクターから細胞内へｇａｐＮが発現されて活性があるかどうかをｇａｐＮ発現量を測定して確認した。ｇａｐＡが破壊された菌株の中にｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１、２、３ベクターを導入した菌株ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７とｇａｐＡが破壊された菌株ＣＡ０１−００９６、ｇａｐＡが存在する菌株ＫＦＣＣ−１０８８１をそれぞれ種培地で一日ほど培養した後、Ｏ．Ｄ６００＝０．２で同一に希釈してＯ．Ｄ６００＝１０から２５ｍｌ細胞を回収した。Ａ．Ｓｏｕｋｒｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；２５； （２００２） ５１９−５２９に記載されている方法を用いてｇａｐＮの活性を測定した結果、ｇａｐＮ１が１ｕｎｉｔ、ｇａｐＮ２が０．６４ｕｎｉｔ、ｇａｐＮ３が０．０９ｕｎｉｔの活性を有していた（表７）。
【００６６】
ＡＳＳＡＹ結果
【００６７】
【表７】
【００６８】
単位；ｎｍｏｌ／ｍｇ．ｍｉｎ＝ｕｎｉｔ
【００６９】
実施例１２．ｇａｐＮ遺伝子発現菌株のリシン生産能
菌株ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７をＬ−リシン生産能確認のために下記のような方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１、ＣＡ０１−００９６、ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７を接種し、３５℃で２０時間振盪培養（２２０ｒｐｍ）した。生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３５℃で９６時間振盪培養（２２０ｒｐｍ）する。培養終了後、ＨＰＬＣによってＬ−リシンの生産量を測定する。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１、ＣＡ０１−００９６、ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７に対する培養物中のＬ−リシンは、下記表８の通りである。その結果、ｇａｐＡが破壊された菌株では、リシン生産が全然出来なかったし、ｇａｐＡが破壊された菌株に導入したｇａｐＮによってリシンが生産され、その生産量も母菌株であるＫＦＣＣ−１０８８１に比べて１６〜１７％上昇した結果を示した（表８）。
【００７０】
フラスコ培養結果
【００７１】
【表８】
【００７２】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７３】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７４】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７５】
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前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７６】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７７】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７８】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７９】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、伝統的にアミノ酸と核酸関連物質の生産に最も広く利用される産業用微生物であって、主にＬ−リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、Ｌ−スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｌ−アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ） 及びグルタミン酸などのアミノ酸及び各種核酸を含んだ飼料、医薬品及び食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産するのに利用されるグラム陽性細菌であり、生育にビオチンを要求する。代表的な菌種としては、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含んだコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）を含んだブレビバクテリウム属、アルスロバクター種（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、及びミクロバクテリウム種（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）などがある。
【０００３】
Ｌ−リシンは、Ｌ−アミノ酸の１つであって、その他のアミノ酸の吸収を増加させることによって、飼料の質を向上させ得る能力により動物飼料補充物として商業的に使用されてあり、人体医学では、特に注入用溶液剤の成分として使用され、製薬産業にも使用されている。従って、リシンを産業的に生産することは経済的に重要な産業工程である。
【０００４】
リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させるとか遺伝子のプロモーターを変形させて、生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が利用されて来た。また、外部の他のバクテリア由来の遺伝子を導入する場合もあって、［日本特許公報第（平）７−１２１２２８号］には、エシェリキア・コリ由来のクエン酸シンターゼ を暗号化する遺伝子を導入する方法が記述されている。
【０００５】
一方、リシン生産性を向上させるために生体内中央炭素代謝過程に変形を加えることができる。中央炭素代謝過程に関与する酵素であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、コリネバックテリアではＮＡＤを助酵素として用いてグリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をグリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換させる酵素であるｇａｐＡの形態で存在し、グリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ｐｇｋ遺伝子によって３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換される２つの段階の過程を経る一方に、ストレプトコッカス及びバシラスでは、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の助酵素であるＮＡＤＰを用いて３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換させる非リン酸化ＮＡＤＰ依存的ＧＡＰＤＨ（ｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，以下、ｇａｐＮ）酵素として存在し、ＮＡＤＰＨを生産しながら該当過程で重要な役割を果たし、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ割合によって影響を受け、一段階の過程からなる（Ｉｄｄａｒ， Ａなど， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２５（３）：５１９−２６（２００２））。
【０００６】
コリネバクテリウムには、ｇａｐＮ遺伝子がないと報告されてあり、ｇａｐＮを暗号化する遺伝子をコリネバクテリウム細菌の育種に利用することも公知されていない。しかし、ｇａｐＮ遺伝子を導入してアミノ酸生産を増加した先行文献として、大韓民国特許出願１０−２００４−０１１６９９号及び米国特許出願１１／７２２，８２０号では、大膓菌でｇａｐＮを発現させてリシン生産量を増加させた例があるが、コリネバクテリウムに対してはその実施例がなかった。よって、ｇａｐＮの効果を見るために、コリネバクテリウムのリシン生産菌株でクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のｇａｐＮ発現実験を行ってみたところ、その効果が微小だった。これに、論文探索を介して（Ａｂｄｅｌａｚｉｚ Ｓｏｕｋｒｉ ｅｔ ａｌ． ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ （２００５） ８：２５１−２５８）外来種の細菌に存在する３種のｇａｐＮ遺伝子を見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＮＡＤを助酵素として利用する代りにＮＡＤＰを利用するようにｇａｐＮを発現させてＮＡＤＰＨの量を増やしてリシン生合成過程でエネルギー源である還元力として使用してコリネバクテリウム属菌株のＬ−リシン生産力が向上できるということを見出して発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法を提供するためのものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ストレプトコッカス属及びバシラス属由来のｇａｐＮを暗号化する遺伝子を導入することによってＬ−リシン生産能力を有し、ｇａｐＮ活性を有するコリネバクテリウム菌株を用いて還元力を増加させてリシン生産に必要なエネルギーを供給受けてリシン生産能力が向上したＬ−リシン製造法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）発現プラスミドｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮの開裂地図を示したものである。
【図２】図２は、染色体挿入用ベクターでｇａｐＡ遺伝子を破壊するためのベクターＰＤＺ−ｇａｐＡの開裂地図を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様として、本発明はＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を提供する。
【００１２】
本発明のＬ−リシン生産能が向上したコリネバクテリウム属菌株は、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）をコードする遺伝子を不活性化させ、外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ポスペイトデ−ハイドロジナゼをコードする遺伝子（ｇａｐＮ）を導入して得られることができる。
【００１３】
本発明において、前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質とし、助酵素であるＮＡＤＰを用いて３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に転換する活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドならいずれも含まれる。
【００１４】
前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の例には、動物、植物、及びバクテリアから由来したＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。好ましくは、バクテリアから由来したＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子であり、最も好ましくは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）から由来するＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子である。より具体的に、前記ストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子は、それぞれ配列番号１１（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４３５０）、１２（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４１１６）、及び１３（ジーンバンク登録番号：ＮＣ＿００４７２２．１）のヌクレオチド配列を有するものであり得る。
【００１５】
外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、当業界の公知の通常的な方法によってコリネ型細菌内に導入することができる。
【００１６】
具体的に、前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクター内に導入してＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ発現用組換えベクターを製造し、前記ベクターを内在したグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が不活性化されたコリネ型細菌内に導入して形質転換されたコリネ型細菌を生産することによって達成できる。
【００１７】
前記ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ発現用組換えベクターは、通常的な方法、すなわち、適切なベクターに制限酵素を使用して外来ＮＡＤＰ依存的グルリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ−ヒドロゲナゼ遺伝子の塩基配列をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによって製造することができる。本発明において、前記ベクターは、図１の開裂地図を有するベクターであり得る。本発明の具体的な例でストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子を導入するためのベクターは、それぞれｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１、ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ２、及びｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ３である。
【００１８】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリアウム種菌株でＮＡＤを助酵素として用いてグリセルアルデヒド−３−ホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてグリセリン酸−１、３−ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ−１、３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換させる酵素をコードする遺伝子をいい、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、ＮＣｇｌ１５２６）を有する遺伝子である。
【００１９】
また、前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化するために、コリネバクテリウム属菌株が天然の状態で有しているｇａｐＡ遺伝子を欠失、置換または挿入させる遺伝子操作を加えることができ、好ましくは、ｇａｐＡ遺伝子の一部を含む組換えベクターでコリネ型バクテリアを形質転換することができ、一例として、図２の開裂地図を有するベクターを導入させることによってｇａｐＡ活性が不活性化された菌株を製作することができる。本発明の具体的な例において染色体挿入用ベクターは、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の２つの片が連続的にクローニングされたｐＤＺ−ｇａｐＡ組換えベクターを使用した。このような染色体挿入用ベクターを形質転換するコリネ型バクテリアは、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１があるが、これに制限されない。本発明の具体的な実施例によれば、内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されたコリネ型バクテリアは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−００９６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１２Ｐ）であり得る。
【００２０】
本願明細書において使用された用語“形質転換”は、ＤＮＡを宿主として導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書において使用された用語“形質感染”は、任意のコード配列が実際に発現されてもされなくても発現ベクターが宿主細胞によって収容されることを意味する。本願明細書において使用された用語“形質感染された宿主”及び“形質転換された宿主”は、ＤＮＡの細胞への導入を意味する。その細胞は、“宿主細胞”と呼ばれ、原核または真核生物細胞であり得る。典型的な原核宿主細胞は、エシェリキア・コリの各種菌株を含む。用語“ベクター”は、適した宿主内でＤＮＡの発現を行うことができる適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。このような調節配列は、転写を行うためのプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写並びに翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと無関係に複製して機能することができるとか、または一部の場合にゲノムその自体に統合され得る。プラスミドが現在、ベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、“プラスミド”及び“ベクター”は、時々相互交換的に使用される。用語“調節配列”という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びリボゾーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することと知られている。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時“作動可能に連結”になる。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（など）に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列（など）であり得る。例えば、全配列または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する全タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるとか；またはリボゾーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるとか；またはリボゾーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合、接触してリーディング上内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプダーまたはリンカーを使用する。
【００２２】
本願明細書において使用された用語“ベクター”は、異種ＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリアであって、一般に二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡとして定義される。発現ベクターは、一応宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００２３】
当業界に周知されたように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製オリジンを更に含む１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーを更に含まなければならない。
【００２４】
本発明の組換えベクター製造の時に使用可能なベクターとしては、コリネ型バクテリアで自律的に増殖できるベクターから由来したものであり得る。例えば、ファージベクターまたはプラスミドベクターから由来することができる。ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、例えば、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどが挙げられ、プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＥＴ系、ｐＭａｌ系、ｐＱＥ系などが挙げられる。
【００２５】
また、本発明において使用するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）は、コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−リシン生産能を有するものならばいずれも含まれる。前記コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の例としては、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、及びブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）がある。
【００２６】
本発明のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）には、野生型菌株だけではなく、Ｌ−リシン生産能が改善した変異株も含まれる。例えば、メチオニン要求性、スレオニン類似体（ＡＨＶ：α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）に対する耐性、リシン類似体（ＡＥＣ：Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に対する耐性、イソロイシン類似体（α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（エチオニン）に対する耐性などの特性を有した菌株などになり得る。また、Ｌ−リシン生産能を向上させるために、導入された遺伝子のコピー数を増加させるとか遺伝子調節配列を操作することによって、Ｌ−リシン生産能が改善した菌株に変異されることもできる。好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、及びそれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１１００１が含まれることができる。最も好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１である。しかし、これに限定されるのではない。
【００２７】
本発明の具体的な例では、それぞれストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子、及びバチルス・セレウス由来遺伝子を内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１に導入して生産されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６５（受託番号ＫＣＣＭ１１０１３Ｐ）、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１４Ｐ）、及びコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６７（受託番号ＫＣＣＭ１１０１５Ｐ）であるコリネバクテリウム属菌株を提供する。前記菌株などは、ＫＣＣＭ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， 大韓民国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に２００９年７月２日付けで寄託した。
【００２８】
Ｌ−リシン生産能力の向上は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性化によって増加された還元力に起因する。内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの代りに外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウムＬ−リシン生産菌株に導入して、ＮＡＤを助酵素として用いる代りにＮＡＤＰを用いるようにＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼを活性化させ、これを介してＮＡＤＰＨの量を増やしてＬ−リシン生合成過程においてエネルギー源である還元力として使用することができる。
【００２９】
他の態様として、本発明は、前記ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を培養する段階、及び前記培養された細胞または細胞培養物からリシンを回収する段階を含む、Ｌ−リシンを生産する方法を提供する。
【００３０】
本発明によって使用されるコリネバクテリウム属菌株は、バッチ工程 （ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）または注入バッチまたは繰り返し注入バッチ工程（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）で連続式または回分式で培養することができる。これらの公知された培養方法は、文献［Ｃｈｍｉｅｌ，（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １． Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ （Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９９１）；及びＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ， １９９４）］に記述されている。
【００３１】
使用される培養バッジは、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム属菌株に対する培養バッジは、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）］で調べてみることができる。使用され得る糖原としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖、及び炭水化物；大豆油、ヒマワリ種子油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用され得る。使用され得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用できる。使用され得るリン源としては、リン酸水素二カリウムまたはリン酸二水素カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用され得る。また、培養培地に適切な前駆体などが使用され得る。前記の原料などは、培養過程で培養物に適切な方式によって回分式にまたは連続式で添加され得る。
【００３２】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内へ酸素または酸素−含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大で得られるまで続く。このような目的で普通１０〜１６０時間で達成される。
【００３３】
Ｌ−アミノ酸は、陰イオン交換クロマトグラフィー及び後続でニンヒドリン誘導体によって分析することができる（Ｓｐａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３０， （１９５８）， １１９０）。
【実施例】
【００３４】
本発明は、下記実施例を介してより具体的に説明される。しかし、これらの実施例によって本発明が限定されてはいけない。
【００３５】
実施例１．ストレプトコッカス・ミュータンス由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
ストレプトコッカス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は、既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４３５０）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表１で記載された１対のプライマーを合成し、ストレプトコッカス・ミュータンスＡＴＣＣ２５１７５菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ１プラスミドを得た。
【００３６】
プライマー
【００３７】
【表１】
【００３８】
実施例２．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例１で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ１をそれぞれ、制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２（参照；大韓民国特許公開番号１９９２−００００９３３に公知される）に発現プロモーターであるＰｃｊ７（参照；大韓民国特許公開番号２００６−００６８５０５に公知される）を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１を製作した（図１）。
【００３９】
実施例３．ストレプトコッカス・アガラクチア由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
ストレプトコッカス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は、既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４１１６）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表２で記載された１対のプライマーを合成し、ストレプトコッカス・アガラクチアＡＴＣＣＢＡＡ−６１１菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ２プラスミドを得た。
【００４０】
プライマー
【００４１】
【表２】
【００４２】
実施例４．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例３で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ２をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２（参照；大韓民国特許公開番号１９９２−００００９３３に公知される）に発現プロモーターであるＰｃｊ７（参照；大韓民国特許公開番号２００６−００６８５０５に公知される）を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ２を製作した（図１）。
【００４３】
実施例５．バチルス・セレウス由来ｇａｐＮ遺伝子検索及びクローニング
バチルス由来のｇａｐＮ遺伝子の塩基配列は既に明らかになって公開されている。アメリカ国立保健院ジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のｇａｐＮ遺伝子情報（登録番号ＮＣ＿００４７２２．１）を確保した。報告された塩基配列に基づいて下記表３で記載された１対のプライマーを合成し、バチルス・セレウスＡＴＣＣ１４５７９菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして連鎖重合法（ＰＣＲ法）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（ＰＣＲ条件：変性＝９４℃、３０秒／アニーリング＝５０℃、３０秒／重合反応＝７２℃、１分３０秒、３０回）によって１４２８塩基対のｇａｐＮ遺伝子を増幅した後、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＮ３プラスミドを得た。
【００４４】
プライマー
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例６．ｇａｐＮ遺伝子発現ベクター製造
実施例５で得たｇａｐＮ遺伝子が含まれたベクターｐＣＲ−ｇａｐＮ３をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩに切断してｇａｐＮを暗号化する遺伝子断片のみを分離した後、大膓菌とコリネバクテリウムシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１２２に発現プロモーターであるＰｃｊ７を接合してｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ３を製作した（図１）。
【００４７】
実施例７．人工変異法によるコリネバクテリウム・グルタミクムリシン生産菌株（ＫＦＣＣ−１０８８１）製造
リシン生合成経路の複数個の遺伝子を挿入する菌株は、人工変異法によって製作されたＳ−（２−アミノエチル）システイン（Ｓ−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃｙｓｔｅｉｎｅ、以下、ＡＥＣ）に対する耐性及びホモセリン漏出（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌｅａｋｙ）の特徴を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＦＣＣ−１０８８１）を用いた。
【００４８】
前記の変異株ＫＦＣＣ−１０８８１は、コリネバクテリウム・グルタミクム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を母菌株として突然変異誘発原であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：以下、ＮＴＧ）を細胞１０７〜１０８／ｍｌに対して３０℃で最終濃度５００μｇ／ｍｌで３０分間処理し、ＡＥＣを５ｇ／Ｌの濃度で含有した複合平板培地で成長する菌株を分離することによって得ることができた。前記の１次変異株に対するＡＥＣ耐性度とリシン生産能を確認した後、ＮＴＧによる２次人工変異を誘導した後獲得した多数のコロニーをホモセリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有した最小培地及びホモセリンが添加されない最小培地に接種（ｔｏｏｔｈ ｐｉｃｋｉｎｇ）してホモセリンが添加されない最小培地で成長できないホモセリン要求性菌株（２次変異株）を分離した。これから再びホモセリン漏出型菌株を分離しようとして３次人工変異を誘導した後、ホモセリン１０ｍｇ／Ｌが含有された最小培地で成長する菌株を分離してリシン生産能を確認した（表４）。最終に、ＡＥＣ耐性及びホモセリン漏出型特徴を有するリシン生産株を獲得し、これを社団法人韓国種菌協会に寄託し、寄託番号第ＫＦＣＣ−１０８８１号を受けた。
【００４９】
ＫＦＣＣ−１０８８１のリシン生産能
【００５０】
【表４】
【００５１】
最小培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、尿素２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．４ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン塩酸塩３０００μｇ、パントテン酸カルシウム１０００μｇ、ニコチンアミド５０００μｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５２】
種培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、尿素５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ（工程水１リットル基準）
【００５３】
生産培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【００５４】
実施例８．リシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１由来ｇａｐＡ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−ｇａｐＡ）製作、ｇａｐＡ破壊菌株開発
本実施例では、実施例７で製作されたリシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを介して、リシン生合成経路のｇａｐＡ遺伝子を確保した。アメリカ国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）を基にしてｇａｐＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、ＮＣｇｌ１５２６）を確保し、これに基づいて２対のプライマー（表５、配列番号７〜１０）を合成した。
【００５５】
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型にし、前記配列番号７〜１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒；アニーリング５３℃、３０秒；及び重合反応７２℃、３０秒を３０回繰り返した。その結果、６００ｂｐのｇａｐＡ遺伝子断片２対（ｇａｐＡ−Ａ、ｇａｐＡ−Ｂ）を得た。ｇａｐＡ−Ａは、配列番号５と６をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｇａｐＡ−Ｂは、配列番号７と８をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｇａｐＡ−ＡとｐＣＲ−ｇａｐＡ−Ｂベクターを得た。
【００５６】
プライマー
【００５７】
【表５】
【００５８】
前記ｐＣＲベクターにｇａｐＡ−ＡとｇａｐＡ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｇａｐＡ−Ａ：ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ｇａｐＡ−Ｂ：ＸｂａＩ）を処理して、前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｇａｐＡ遺伝子を分離した。次に、制限酵素ＳａｌＩとＸｂａＩとが処理されたｐＤＺベクター（参照：大韓民国特許公開番号１０−２００８−００２５３５５に公知される）に３片接合（３−ｐｉｅｃｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を介してクローニングし、最終に、ｇａｐＡ断片２つの片が連続的にクローニングされたｐＤＺ−ｇａｐＡ組換えベクターを製作した。図２は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−ｇａｐＡを示す図面である。
【００５９】
製作されたｐＤＺ−ｇａｐＡベクターを実施例５で製作されたリシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１に形質転換し、２次交差過程を経って染色体上でｇａｐＡ遺伝子にｇａｐＡ遺伝子中間部位３００塩基対除去されたベクターを挿入してｇａｐＡ遺伝子が不活性化されたリシン生産株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−００９６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１２Ｐ）を得た。破壊されたｇａｐＡ遺伝子は、野生型ｇａｐＡより３００塩基対が減ったことを配列番号７と１０のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００６０】
実施例９．ＣＡ０１−００９６からｇａｐＮ遺伝子発現誘導
実施例２、４、６で得たｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１〜３ベクターをＣＡ０１−００９６に導入した。ｇａｐＡ遺伝子が破壊されると、一般的なコリネバクテリウム・グルタミクムが育つ培地である最小培地では成長できない特徴があることと知られている（参照論文； Ｈｉｄｅａｋｉ Ｙｕｋａｗａら Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４； ８：９１−１０３ ）
【００６１】
ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１〜３ベクターをＣＡ０１−００９６内へ電気パルス法を用いて形質転換した菌株（菌株番号ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７）を製作してｇａｐＮが発現されると、最小培地で育つことができる特性を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムからｇａｐＮの発現を誘導した。前記ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７は、それぞれ２００９年７月２日にＫＣＣＭ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， 大韓民国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に受託番号ＫＣＣＭ−１１０１３Ｐ、ＫＣＣＭ−１１０１４Ｐ及びＫＣＣＭ−１１０１５Ｐで寄託した。
【００６２】
実施例１０．リシン生産菌株でｇａｐＮ活性確認
炭素源を、ブドウ糖を用いて製作した最小培地で成長可否を測定した結果、ｇａｐＡが破壊された菌株は成長しなかったし、ｇａｐＮが発現された菌株では成長が回復した。
【００６３】
成長可否
【００６４】
【表６】
【００６５】
実施例１１．リシン生産菌株でｇａｐＮ活性確認
ｇａｐＮ発現ベクターから細胞内へｇａｐＮが発現されて活性があるかどうかをｇａｐＮ発現量を測定して確認した。ｇａｐＡが破壊された菌株の中にｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１、２、３ベクターを導入した菌株ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７とｇａｐＡが破壊された菌株ＣＡ０１−００９６、ｇａｐＡが存在する菌株ＫＦＣＣ−１０８８１をそれぞれ種培地で一日ほど培養した後、Ｏ．Ｄ６００＝０．２で同一に希釈してＯ．Ｄ６００＝１０から２５ｍｌ細胞を回収した。Ａ．Ｓｏｕｋｒｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；２５； （２００２） ５１９−５２９に記載されている方法を用いてｇａｐＮの活性を測定した結果、ｇａｐＮ１が１ｕｎｉｔ、ｇａｐＮ２が０．６４ｕｎｉｔ、ｇａｐＮ３が０．０９ｕｎｉｔの活性を有していた（表７）。
【００６６】
ＡＳＳＡＹ結果
【００６７】
【表７】
【００６８】
単位；ｎｍｏｌ／ｍｇ．ｍｉｎ＝ｕｎｉｔ
【００６９】
実施例１２．ｇａｐＮ遺伝子発現菌株のリシン生産能
菌株ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７をＬ−リシン生産能確認のために下記のような方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１、ＣＡ０１−００９６、ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７を接種し、３５℃で２０時間振盪培養（２２０ｒｐｍ）した。生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３５℃で９６時間振盪培養（２２０ｒｐｍ）する。培養終了後、ＨＰＬＣによってＬ−リシンの生産量を測定する。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ−１０８８１、ＣＡ０１−００９６、ＣＡ０１−０５６５、ＣＡ０１−０５６６、ＣＡ０１−０５６７に対する培養物中のＬ−リシンは、下記表８の通りである。その結果、ｇａｐＡが破壊された菌株では、リシン生産が全然出来なかったし、ｇａｐＡが破壊された菌株に導入したｇａｐＮによってリシンが生産され、その生産量も母菌株であるＫＦＣＣ−１０８８１に比べて１６〜１７％上昇した結果を示した（表８）。
【００７０】
フラスコ培養結果
【００７１】
【表８】
【００７２】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７３】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７４】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７５】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７６】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７７】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【００７８】
国際様式
特許出願のためのブダペスト国際条約下の微生物受託証明
国際寄託機関によって規則７．１に基づいて発行された原寄託に対する受託証
受信：
シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
大韓民国 ソウル チュン−グ ナムデムンロ ５−ガ ５００ ＣＪビル
【００７９】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
前記翻訳は原文の内容と相違ないことを証明する。
２０１０年０５月２８日
弁理士 孫敏
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項２】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇａｐＡ）が不活性化され、外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇａｐＮ）が導入された請求項１に記載のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項３】
前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ：ＡＴＣＣ２５１７５）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｅ：ＡＴＣＣＢＡＡ−６１１）、またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ１４５７９）由来であることを特徴とする請求項２に記載のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項４】
前記ストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子は、それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のヌクレオチド配列を有するものである請求項３に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項５】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１４のヌクレオチド配列である請求項２に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６５（受託番号ＫＣＣＭ１１０１３Ｐ）、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１４Ｐ）、またはコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６７（受託番号ＫＣＣＭ１１０１５Ｐ）である請求項１に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項７】
前記Ｌ−リシン生産能は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性化によって増加された還元力で得られることを特徴にする請求項１に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項８】
請求項１〜７のうち、いずれか一項によるコリネバクテリウム属菌株を培養する段階；及び前記培養された細胞または細胞培養物からリシンを回収する段階を含む、Ｌ−リシンを生産する方法。
【請求項１】
ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を有し、Ｌ−リシン生産能力が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項２】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇａｐＡ）が不活性化され、外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇａｐＮ）が導入された請求項１に記載のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項３】
前記外来ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ：ＡＴＣＣ２５１７５）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｅ：ＡＴＣＣＢＡＡ−６１１）、またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ１４５７９）由来であることを特徴とする請求項２に記載のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株。
【請求項４】
前記ストレプトコッカス・ミュータンス由来遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア由来遺伝子及びバチルス・セレウス由来遺伝子は、それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のヌクレオチド配列を有するものである請求項３に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項５】
前記内在的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１４のヌクレオチド配列である請求項２に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６５（受託番号ＫＣＣＭ１１０１３Ｐ）、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６６（受託番号ＫＣＣＭ１１０１４Ｐ）、またはコリネバクテリウム・グルタミクムＣＡ０１−０５６７（受託番号ＫＣＣＭ１１０１５Ｐ）である請求項１に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項７】
前記Ｌ−リシン生産能は、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性化によって増加された還元力で得られることを特徴にする請求項１に記載のコリネバクテリウム属菌株。
【請求項８】
請求項１〜７のうち、いずれか一項によるコリネバクテリウム属菌株を培養する段階；及び前記培養された細胞または細胞培養物からリシンを回収する段階を含む、Ｌ−リシンを生産する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５３２６０３（Ｐ２０１２−５３２６０３Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９４５７（Ｐ２０１２−５１９４５７）
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４９６２
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４９６２
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
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