大腸菌で発現させるためのヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする合成遺伝子
本発明は、発現後の全細胞性タンパク質に対して、改善された発現レベルで大腸菌にて組み換え型ｈＧ−ＣＳＦを発現できる、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌中で改善された発現レベルで発現できる、すなわち発現後の全タンパク質に対して５２％以上の組み換え型ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルを達成することができる、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）をコードする合成遺伝子に関する。
【０００２】
ｈＧ−ＣＳＦは、哺乳動物の造血細胞の分化および増殖を制御する刺激因子のファミリーに属する。これらは好中球の形成に主要な役割を有し、それゆえに、血液学および腫瘍学の分野における薬剤中での使用に好適である。
【０００３】
現在、臨床で使用するためのｈＧ−ＣＳＦの二つの形態が利用可能で市販されている：レノグラスチム（ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ）はグリコシル化されており、哺乳動物のセルラインで発現されて得られるものであり、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）はグリコシル化されておらず、細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）で発現されて得られるものである。
【背景技術】
【０００４】
アルギニンのコドン（ＡＧＧ／ＡＧＡ； ＣＧＡ）、ロイシンのコドン（ＣＴＡ）、イソロイシンのコドン（ＡＴＡ）およびプロリンのコドン（ＣＣＣ）などの幾つかの一連の希有コドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）が、翻訳レベルに与える影響ならびに大腸菌で発現されるタンパク質の量および質の連続的な低下に与える影響について、ケイン，ジェイエフ（Ｋａｎｅ ＪＦ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４９４−５００（１９９５）に記載されている。遺伝子の異なる部位に希有コドンが存在する場合、同様の影響が個々の希有コドンに見られる。
【０００５】
ｍＲＮＡの二次構造内で安定な二本鎖ＲＮＡが形成される場合、ＧＣに富む領域も大腸菌中での翻訳効率に影響を与える。ｍＲＮＡのＧＣに富む領域がＲＢＳに見られる場合、ＲＢＳの直近にみられる場合、または開始コドンの直近にみられる場合のいずれかの場合、この影響は最も強くなる（マクリデス，エスシー（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６０：５１２−５３８（１９９６）；バネイックス，エフ（Ｂａｎｅｙｘ Ｆ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１１−４２１（１９９９））。
【０００６】
二次構造を予測する方法、および最も安定した構造／最もあり得る構造についての基本的なルールと予想されている個々のＲＮＡ分子の最小自由エネルギーを計算する方法は、幾つか知られている（サンタルチア，ジェイ，ジュニアおよびターナー，ディーエイチ（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ Ｊｒ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ ＤＨ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３０９−３１９（１９９７））。正確な二次構造を予測するための信頼できるアルゴリズムは、幾つかのケースを除いて知られていない。発現レベルとの定量的な相関性についての根拠も存在しない（シュミト，エムエイチおよびバンデンデュイン，ジェイジェイ（Ｓｍｉｔ ＭＨ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｕｉｎ ＪＪ）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２４４，１４４−１５０（１９９４））。ＲＮＡの三次構造を予測することは、現在でも不可能である（ティノコ，アイおよびバスタマンテ，シー（Ｔｉｎｏｃｏ Ｉ ａｎｄ Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ Ｃ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ，２９３：２７１−２８１（１９９９））。
【０００７】
ＴＩＲ領域内、ＲＢＳ領域内および開始コドンとＲＢＳ領域との間の領域のＤＮＡ配列を最適化した後に発現レベルが上昇することが、マッカーシー，ジェイイージーおよびブリマコーブ，アール（ＭｃＣａｒｔｈｙ ＪＥＧ ａｎｄ Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ Ｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １０：４０２−４０７（１９９４）に記載されている。このケースでは、翻訳の開始がさらに効率的なことと、ｍＲＮＡのコード領域内の連続性がスムーズであることにより、発現レベルが上昇した。
【０００８】
大腸菌内で発現させることによりインビトロでの生物学的研究を行うのに適切な量のｈＧ−ＣＳＦを生産することは、ソウザ，エルエム（Ｓｏｕｚａ ＬＭ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５（１９８６）およびジェボ，ケイエム（Ｚｓｅｂｏ ＫＭ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４（１９８６）に記載されている。ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルは１％未満であった。
【０００９】
米国特許第４８１０６４３号では、まず第一に、大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換することに基づいて構築された、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を用いることが開示されている。λファージの熱誘導性プロモーターと組み合わせると、ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルは全細胞性タンパク質に対して３から５％になった。このレベルは、ｈＧ−ＣＳＦの経済的な大規模生産レベルとしては十分でない。
【００１０】
ウィングフィールド，ピー（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ，２５６：２１３−２１８（１９８８）に記載されているように、ｈＧ−ＣＳＦの５’末端領域における最初の四つのコドンを変更することによって、全細胞性タンパク質に対するｈＧ−ＣＳＦの蓄積量は８から１０％に達した。
【００１１】
細菌の全細胞性タンパク質に対するｈＧ−ＣＳＦ収率を最大１７％にまで、大腸菌中でｈＧ−ＣＳＦ発現させることは、デブリン，ピーイー（Ｄｅｖｌｉｎ ＰＥ）ら、Ｇｅｎｅ ６５：１３−２２（１９８８）に記載されている。Ｇ−ＣＳＦのコード領域の５’末端（最初の四つのアミノ酸をコードするコドン）におけるＤＮＡ配列を部分的に最適化したことによって、このような収率に達し、ここではＧＣ領域をＡＴ領域によって置換し、λファージの比較的強力なプロモーターを用いた。この発現レベルは非常に高いというものではなく、生産の収率がより低下し、大規模生産における経済性は低い。
【００１２】
合成遺伝子を用いて発現レベルを約３０％としたことがカン，エスエイチ（Ｋａｎｇ ＳＨ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，１７（７）：６８７−６９２（１９９５）に記載されている。大腸菌の優先的コドンを導入し、ＴＩＲ領域内を修飾し、コドンのセットの更なる修飾を用いることにより、このレベルに達した。そこでは、遺伝子の３’末端は本質的に変更されなかった。従って、記載された発現レベルに達するには、ＴＩＲ領域における遺伝子の変更が必要であり、発現レベルが３０％を超えることは無かった。
【００１３】
米国特許第５８４０５４３号には、遺伝子の５’末端に、ＡＴに富む領域を導入し、大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換したｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の構築が記載されている。Ｔｒｐプロモーターの制御下で、全細胞性タンパク質に対する、発現したｈＧ−ＣＳＦの収率は１１％に達した。他方、ロイシンおよびスレオニンまたはそれらの組み合わせを（細菌が培養される）発酵培地に添加すると、全細胞性タンパク質に対してｈＧ−ＣＳＦの蓄積は最大で３５％に達した。従って、アミノ酸を発酵培地に添加することによって、このような発現レベルに達した訳であるが、ｈＧ−ＣＳＦを生産する方法では追加的なコストとなり、工業生産において経済的ではない。ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を最適化することだけでは、ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルをより高くすることはできなかった。
【００１４】
全細胞性タンパク質に関連して、従来技術で最も多いｈＧ−ＣＳＦ蓄積が見られたのは、ブイ，ジェオン（ｖ Ｊｅｏｎｇ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３：３１１−３１８（２００１）に記載されている、４８％である。Ｎ末端を変更し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することによって、このような蓄積が得られた。
【００１５】
天然のヒトの遺伝子の、細菌である大腸菌などの原核生物中での発現レベルを一般に予測可能とする報告は存在しない。λファージまたはＴ７ファージ由来の強力なプロモーターを有する発現プラスミドを用いてでさえ、記載される発現レベルは比較的低いか、または検出するのが困難なレベルである。多数のパラメータ（希有コドンまたはそれらのクラスター化；ＧＣ塩基対に富む領域、好ましくないｍＲＮＡの二次構造、不安定なｍＲＮＡ）が大腸菌中でのヒトタンパク質の蓄積に影響を与えることは、従来技術の文献から集約することができる。
【００１６】
現在までのところ、発現に最適なｍＲＮＡの二次構造または三次構造を得るために、コドンをどのように組み合わせるかに関する公知の完全に確立されたルールは存在しない。二次構造とその熱力学的安定性を予測するための幾つかの数学的モデルおよび構造的モデルは存在するが、信頼性が極めて低く、二次構造を予測することはできない。他方、三次構造を予測するこのようなモデルは存在しない。従って、現在のところアクセス可能なこれらのモデルでは、発現レベルへのコドンの影響を予測することはできない。
【００１７】
特許文献または科学文献のいずれにおいても、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の大腸菌中での発現レベルが低いという問題を解決するための、より効果的な手段に関する報告は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、ｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列であって、大腸菌中での発現レベル（蓄積）を改善できるＤＮＡ配列を提供することであり、及びこのようなＤＮＡ配列を構築するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
請求項１に記載のＤＮＡ配列によって、及び請求項１５に記載のそのようなＤＮＡ配列を構築する方法によって、この目的を解決する。本発明はさらに、請求項６または７に記載の発現プラスミド、請求項１１または１２に記載の発現システム、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現する方法、および請求項２４に記載の医薬組成物を製造する方法を提供する。好ましい実施態様は、下位の請求項に規定されている。
【００２０】
本発明の重要な特徴は、大腸菌中での発現レベル（蓄積）が、大腸菌中の全タンパク質に対して５２％以上の組み換え型ｈＧ−ＣＳＦを達成可能な、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を用いることである。好ましくは、強力なＴ７プロモーターを含む発現プラスミドを発現のために用いる。大腸菌中での発現を最適化された（ｈＧ−ＣＳＦをコードする）合成遺伝子を構築することができる二つの方法を複合的に組み合わせて用いることによって、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する。第一の方法は、大腸菌中での発現に好ましくない幾つかの大腸菌の希有コドンを、大腸菌中での発現により好ましい大腸菌の優先的コドンで置換することを含む。第二の方法は、幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換することを含む。この二つの方法の一つを用いて、本発明の合成遺伝子の幾つかの部分を構築し、幾つかの部分については、二つの方法を組み合わせて用いるのに対して、遺伝子の幾つかの部分には変更が無い。ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する手順（これも本発明の主題である）において、非コード（５’−非翻訳）領域に変更が無いことが好ましい。有利なこととして、これは、翻訳開始領域（ＴＩＲ）もしくはリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）のいずれか、または開始コドンとＲＢＳとの間の領域内には修飾がないことを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の大腸菌中での低い発現レベルに伴う問題は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列を最適化することで解決できることが見出された。ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子を変化させ、ｈＧ−ＣＳＦをコードする特有の合成遺伝子の構築を導く。この特有の合成遺伝子は、配列番号１のＤＮＡ配列によって、または配列番号１もしくは天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の配列を好適に修飾したものを含むヌクレオチド配列によって規定される。
【００２２】
当分野で記載されるデータと比較して、驚くほど高い発現レベルを、本発明によって得ることができる。
【００２３】
本明細書で用いられる「ｈＧ−ＣＳＦ」という用語は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を意味し、大腸菌での発現によって得られる組み換え型ｈＧ−ＣＳＦを含む。
【００２４】
天然のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列に変更を導入することによって、本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を得た。従って、アミノ酸配列は変化しておらず、天然のｈＧ−ＣＳＦと同一のままであった。
【００２５】
本発明は更に、大腸菌で合成遺伝子を発現させる方法を含み、合成遺伝子の発現レベルに関連する。
【００２６】
本明細書で用いられる「発現レベル」という用語は、発現後の全細胞性タンパク質に対して、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の異種発現後に得られるｈＧ−ＣＳＦの比率を意味する。発現後に適切に分離されたタンパク質の定量化から発現レベルを定量し得、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質バンドの染色性を定量すればよい。
【００２７】
本明細書で用いられる「異種発現」という用語は、その発現が生じる生物とは異なる生物での遺伝子の発現を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「同種発現」という用語は、その発現が生じる生物が本来の生物での遺伝子の発現を意味する。
【００２９】
本明細書で用いられる「優先的コドン」という用語は、最も多くのｍＲＮＡ分子を生産するために個々の生物（大腸菌など）に用いられるコドンを意味する。生物は、高レベルの同種発現で遺伝子を発現させるために、これらのコドンを用いる。
【００３０】
本明細書で用いられる「希有コドン」という用語は、低い発現レベルで遺伝子を発現させるにすぎない（大腸菌などの）個々の生物に用いられるコドンを意味する。これらのコドンは、生物で稀にしか用いられない（低レベルの同種発現）。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＧＣに富む領域」という用語は、塩基のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）が支配的である、遺伝子中の領域を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「ＡＴに富む領域」という用語は、塩基のアデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）が支配的である、遺伝子中の領域を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「合成遺伝子」という用語は、合成の相補性オリゴヌクレオチドからなる短い二本鎖ＤＮＡ断片から調製される遺伝子を意味する。この合成遺伝子は、ヌクレオチド配列のみにおいて天然の遺伝子（たとえばｃＤＮＡ）と異なるもので、ここでアミノ酸配列は不変のままである。組み換えＤＮＡ技術によって、合成遺伝子を得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「天然の遺伝子」という用語は、天然のＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡ配列の遺伝子を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる「セグメント」という用語は、両末端上の単一の制限部位が結合する、遺伝子の部分を意味する。これらの部位は、合成的に構築された遺伝子の部分のためのサブクローニング部位として機能する。以下では、ヌクレオチドの位置に従って、開始コドンから５’−３’の方向で制限部位に番号付けしている。
【００３６】
本明細書で用いられる「セグメントＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチドの３位と１９４位（特にＮｄｅＩ（３）およびＳａｃＩ（１９４）の制限部位）との間の５’末端を意味する。すなわち、１９１ｂｐの長さの配列である。セグメントＩはデノボ合成されてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる「セグメントＩＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦについての遺伝子のヌクレオチドの１９４位と３０９位（特にＳａｃＩ（１９４）とＡｐａＩ（３０９）の制限部位）との間の部位を意味する。すなわち、１１５ｂｐの長さの、遺伝子の中央部分である。セグメントＩＩはデノボ合成されてもよい。
【００３８】
本明細書で用いられる「セグメントＩＩＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦについての遺伝子のヌクレオチドの３０９位と４６７位（特にＡｐａＩ（３０９）とＮｈｅＩ（４６７）の制限部位）との間の部位を意味する。すなわち、１５８ｂｐの長さの、遺伝子の部分であり、そこではＡｒｇ１４８とＧｌｙ１５０についてのコドン以外の、ｈＧ−ＣＳＦについての天然のＤＮＡ配列が保存されている。
【００３９】
本明細書で用いられる「セグメントＩＶ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチドの４６７位と５３６位（特にＮｈｅＩ（４６７）およびＢａｍＨＩ（５３６）の制限部位）との間の３’末端を意味する。すなわち、６９ｂｐの長さの、遺伝子の末端部分である。セグメントＩＶはデノボ合成されてもよい。
【００４０】
次の方法を組み合わせることによって、本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する：
・（制限部位のＳａｃＩ（１９４）とＡｐａＩ（３０９）との間の）セグメントＩＩおよび（制限部位のＮｈｅＩ（４６７）とＢａｍＨＩ（５３６）との間の）セグメントＩＶにおいて：大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること。
・（制限部位のＮｄｅＩ（３）とＳａｃＩ（１９４）との間の）セグメントＩにおいて：ＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること。これによって、最も使用頻度が小さい大腸菌のコドンが交換されるが、たいていの場合、大腸菌の優先的コドンに代替されることはない。
【００４１】
・セグメントＩＩＩにおける４６コドン（Ｐｒｏ１０２についてのＣＣＣとＡｒｇ１４７についてのＣＧＣの間の）の全く不変の天然の配列。
【００４２】
・セグメントＩＩＩの末端における二つの大腸菌の希有コドンの置換（ＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０））。
【００４３】
本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を最適化することに、ＴＩＲ、ＲＢＳ、および開始コドンとＲＢＳとの間の領域における変更は含まない。
【００４４】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする本発明の合成遺伝子によって、ｈＧ−ＣＳＦをコードする構築された合成遺伝子を、大腸菌で５２％以上の発現レベルで発現させることが可能となる。さらに、約５５％または約６０％もの発現レベルを得ることもできる。本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子が高い発現レベルであることによって、ｈＧ−ＣＳＦの生産を高収率とすることができ、異種のｈＧ−ＣＳＦの精製および単離がより迅速かつ単純に行うことができ、生産過程の制御がより簡単にでき、そして生産方法の全体をより経済的にできる。従って、工業的規模でｈＧ−ＣＳＦを効率的に生産することができる。生産されたｈＧ−ＣＳＦは、臨床医学で使用するのに適している。
【００４５】
本発明の合成遺伝子を構築することは、ｈＧ−ＣＳＦの天然の遺伝子およびプラスミドを最初に調製することから始まる。天然のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子はヒト起源のものでも良いが、デノボ合成された遺伝子セグメントのサブクローニングのために用いられる単一の制限部位を含む領域内で相同なあらゆる遺伝子に関して、同じ原理を用いることができる。突然変異を誘発するためのプラスミドを、点突然変異を連続的に導入可能なその能力に従って選択した。さらなる選択プライマー（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いることによって、所望の突然変異を含むプラスミドの選択または濃縮を行った。カセット突然変異誘発によって点突然変異を導入できるように、遺伝子およびプラスミドを構築する。
【００４６】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子およびプラスミドを最初に調製した後、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の最適化を実施する。このことは、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築することを意味する。最適化は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子を四つ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）のセグメントに分割することから始まる。このセグメントは、オリゴヌクレオチドの突然変異誘発後に単一の制限部位を有して分離するかまたは分離するはずであり、そして個々のセグメントにおいて変更が導入される。幾つかの個々のセグメントにおいて、遺伝子配列における変更が導入されるのに対して、特定のセグメントにおいては遺伝子は変更されない（図１）。従って、このように得られる、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された合成遺伝子は、部分的に保存された天然の配列（セグメントＩＩＩ）と、デノボ合成される５’コード領域および３’コード領域（セグメントＩ、ＩＩおよびＩＶ）とからなる。
【００４７】
個々のセグメントにおける変更：
セグメントＩ：大腸菌の希有コドンの大腸菌の優先的コドンによる置換と、ＧＣに富む領域のＡＴに富む領域による置換
イタリック体：ＧＣに富む領域／ＡＴに富む領域の置換；下線付きイタリック体：希有コドン／優先的コドンの置換とＧＣに富む領域／ＡＴに富む領域の置換；下線：希有コドン／優先的コドンの置換；Ｇｌｙ１０１（ＧＧＴ→ＧＧＧ）はＡｐａＩ（３０９）制限部位の導入。
【００４８】
【化１】
【００４９】
セグメントＩＩ：大腸菌の希有コドンの大腸菌の優先的コドンによる置換。
【００５０】
【化２】
【００５１】
セグメントＩＩＩ：制限部位ＮｈｅＩの直前に位置する二つの大腸菌の希有コドンの置換
【００５２】
【化３】
【００５３】
セグメントＩＶ：遺伝子の末端にある大腸菌の希有コドンの長いクラスターの、大腸菌の優先的コドンによる置換。
【００５４】
【化４】
【００５５】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築した後、最適化された合成遺伝子を、大腸菌中での発現に適した最終のプラスミドベクター内にサブクローニングする。好ましくは、プラスミドベクターは（Ｎｏｖａｇｅｎから販売されている）ｐＥＴベクター類の群から選択される。これらのベクター類は、強力なＴ７プロモーターを含む。より好ましくは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＥＴ３ａが用いられ、とりわけカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＥＴ９ａが用いられる。その結果、構築される発現プラスミドは次に、適切な生産株の大腸菌内に形質転換される。好ましくは、生産株の大腸菌は、Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼについての染色体の遺伝子または発現プラスミドの遺伝子を保持する株の群から選択される。最も好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が用いられる。
【００５６】
この手順は、接種材料の調製および適切な培地での発酵プロセスにより続ける。好ましくは、約０．１ｍＭから約１ｍＭの範囲の適切な濃度のＩＰＴＧを用いて誘導する。好ましい濃度は約０．３から０．６ｍＭである。約３７℃で発酵を行うことができるが、３０℃未満で行うことが好ましく、約２０から３０℃で行うことがより好ましく、約２５℃で行うことが特に好ましい。通常用いられるよりも低い温度で発酵方法を実施することによって、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの前駆体分子の封入体中への蓄積を有利に支援できる。
【００５７】
プラスミドベクター内に挿入される耐性遺伝子に対応する抗生物質の有無に関わらず、たとえば適切な濃度のアンピシリンもしくはカナマイシンの存在下でまたはそれらの非存在下で、発酵プロセスを実施してもよい。発酵およびその結果としてのｈＧ−ＣＳＦ蓄積の効率は、選択圧がない場合でも非常に高いことが分かっている。
【００５８】
蓄積する異種ｈＧ−ＣＳＦは封入体で見出され、再生プロセスに適しており、かつ単離する手段に用いられる。
【００５９】
ｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦタンパク質の単離および／または精製に好適な技術は、当業者に公知であり、周知の原理（たとえばイオン交換、疎水性相互作用、アフィニティーまたはサイズ排除など）のいずれかを利用する古典的なクロマトグラフィーまたは流動層クロマトグラフィーを用いることができ、ならびに適切なマトリックスまたは溶液を用いる、連続的なおよびバッチモードでの抽出法を用いることができる。好ましい技術は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である。というのは、純粋で生物学的に活性なタンパク質を、自然な条件で高収率で極めて効率的に調製できるからである。
【００６０】
本発明に従って得られる、単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、有効成分としてそれを含有する医薬組成物の製造に用いることができる。医薬組成物は、処置が望まれる患者の疾患に対して治療上有効な量のｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する。
【００６１】
医薬適合性の担体または助剤の適切なものとしては、適切な希釈剤、アジュバントおよび／またはＧ−ＣＳＦ療法に有用な担体が挙げられる。
【００６２】
本発明の方法を用いて得られた生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを薬剤の調製に用いることができる。すなわち次のものを含む群から選択される適応に指示される：好中球減少症および好中球減少症に関連する臨床的な続発症、化学療法後の発熱性の好中球減少症についての入院数の減少、ドナーの白血球の注入に代わるものとしての造血前駆細胞の動員、慢性的な好中球減少症、好中球減少性および好中球非減少性の感染症、被移植者、慢性的な炎症性の状態、敗血症および敗血症性ショック、好中球減少性および好中球非減少性の感染症におけるリスト、罹患率、死亡率、入院日数の減少、好中球減少症の患者および好中球非減少症の患者における感染症および感染症に関連する合併症の予防、院内感染の予防および院内感染による死亡率および院内感染の頻度率の低下、新生児における経腸投与、新生児における免疫系の強化、集中治療室の患者および危篤状態の患者における臨床転帰の改善、外傷／皮膚潰瘍／火傷の治療および処置、化学療法および／または放射線療法の強化、汎血球減少症、抗炎症性サイトカインの増加、フィルグラスチムの予防的な使用による高投与量化学療法の間隔の短縮化、光線力学療法の抗腫瘍効果の増強、脳の種々の機能障害によって生じる疾患の予防および治療、血栓症およびそれら合併症の治療ならびに照射後の赤血球生成の回復。
【００６３】
その他のすべての疾患の治療に用いることもでき、それらはＧ−ＣＳＦの適応となる。
【００６４】
従って、本発明の方法によって得られる純粋で生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物の、上記の疾患の治療に有効な量を、当業者に公知の手法で患者に投与することができる。
【００６５】
本発明を、下記の実施例によって、および添付の図面を参照して詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例および図面は単なる例証に過ぎず、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００６６】
最適な遺伝子：Ｆｏｐｔ５の構築
実施例１ａ：遺伝子およびプラスミドの最初の調製品
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を、ＰＣＲ法を用いてＢＢＧ１３（Ｒ ａｎｄ Ｄ）から増幅した。また、開始オリゴヌクレオチドを用いることによって、制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを遺伝子の開始末端と終止末端に導入することにも用いた。次いで、遺伝子をプラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ（詳細は下記を参照すること）の制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に組み込んだ。大腸菌中での遺伝子発現のためのその他のすべての最適化工程も、このプラスミド内で実施した。
【００６７】
最初の遺伝子を調製している間に、点突然変異によってＥｃｏＲＶ制限部位を無効にした（オリゴＭ２０ｚ１０８）。（個々の）突然変異が導入される可能性を確実なものとするために、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてプラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ内でオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行うことによって、このことを実施した。従って、制限部位ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶを介しての、プラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ−Ｇ−ＣＳＦにおける変異体の選択が可能となった。
【００６８】
構成的発現が可能となる手法にて、開始プラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、ハンブルグ）を再構築した。両方の制限部位ＨｉｎｄＩＩＩの間にある、ｃｌ８５７リプレッサーをコードする遺伝子の一部を切除することによって、このことを実施した。得られたプラスミドをｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈと名付けた。
【００６９】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子からＥｃｏＲＶ部位を無効にするためのオリゴヌクレオチド：
【００７０】
【化５】
【００７１】
実施例１ｂ：コドンの最適化（図１）
最初の最適化工程において、相補性オリゴヌクレオチドからなる五つのカセット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を連結することによって、制限部位ＮｄｅＩとＳａｃＩとの間の合成遺伝子を構築した。遺伝子のこの合成部分はセグメントＩに相当する。セグメントＩを用いて、ｈＧ−ＣＳＦについての天然の遺伝子の、制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｃＩの間の部分を置換した。制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｃＩの間の遺伝子の第一の部分を切断することによって、このことを実施し、そして合成的に調製したカセットで置換した。二工程で方法を実施した。第一の工程において、カセットＡをＮｄｅＩ部位と連結し、そしてカセットＥをＳａｃＩ部位と連結した。１６℃にて１６時間後、連結混合物をエタノールで沈殿させて、余分の（結合していない）オリゴヌクレオチドを除去した。第二の工程において、既に連結した三つの相補的オリゴヌクレオチドに由来するカセット全体（カセットＢ、ＣおよびＤ）の中央部分を添加し、１６℃で１６時間、ライゲーションを行った。
【００７２】
第二の最適化工程において、セグメントＩＩＩに位置する大腸菌にとって最も重要な二つのコドン（すなわちＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０））を、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を利用して置換した。
【００７３】
第三の最適化工程において、途中のエタノール沈殿処理以外はセグメントＩと同様の手法でセグメントＩＶを構築した。セグメントＩＶは、制限部位ＮｈｅＩとＢａｍＨＩとの間の遺伝子の最後の部分を示し、二対の相補性オリゴヌクレオチド（カセットＦおよびＧ）からなる。
【００７４】
第四の最適化工程において、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を利用して、Ｉｌｅ９６をコードする希有コドンを置換した（ＡＴＡ→ＡＴＴ）（セグメントＩＩ）。そしてＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））の制限部位を、セグメントＩＩの３’末端に導入した。次いで、天然の遺伝子のＳａｃＩとＡｐａＩとの間を合成ＤＮＡ（セグメントＩＩ）で置換するために、第五の最適化工程においてＡｐａＩの制限部位を用いた。この合成ＤＮＡは、三対の相補性オリゴヌクレオチド（カセットＨ、ＩおよびＪ）からなる。第一工程と同様にしてこのことを実施し、後にカセットＩを添加した。
【００７５】
第一の最適化工程：
オリゴヌクレオチドの相補性対（ＮｄｅＩ−ＳａｃＩ；図１のセグメントＩ）：
カセットＡ：ｓｐ１ｏｓ２における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ１ｏｓ１からなるもの：
【００７６】
【化６】
【００７７】
カセットＢ：ｓｐ２ｏｓ４における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ２ｏｓ３からなるもの：
【００７８】
【化７】
【００７９】
カセットＣ：ｓｐ３ｏｓ６における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ３ｏｓ５からなるもの：
【００８０】
【化８】
【００８１】
カセットＤ：ｓｐ４ｏｓ８における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ４ｏｓ７からなるもの：
【００８２】
【化９】
【００８３】
カセットＥ：ｓｐ５ｏｓ１０における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ５ｏｓ９からなるもの：
【００８４】
【化１０】
【００８５】
第二の最適化工程：オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を利用することによる最も重要なコドンの置換のためのオリゴヌクレオチド
ＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０）の置換
【００８６】
【化１１】
【００８７】
第三の最適化工程：ヌクレオチドの相補性対（ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ；図１上のセグメントＩＶ）：
カセットＦ：ｓｐ６ｏｓ１２における相補性ヌクレオチドｚｇ６ｏｓ１１からなるもの：
【００８８】
【化１２】
【００８９】
カセットＧ：ｓｐ７ｏｓ１４における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ７ｏｓ１３からなるもの：
【００９０】
【化１３】
第四の最適化工程：オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を利用することによる、ＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））を導入するための、そして希有コドンＡＴＡ→ＡＴＴ（Ｉｌｅ９６）の置換のためのオリゴヌクレオチド
ＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））の挿入とＡＴＡ→ＡＴＴ（Ｉｌｅ９６）の置換：
【００９１】
【化１４】
【００９２】
５．最適化工程：オリゴヌクレオチドの相補性対（ＳａｃＩ−ＡｐａＩ；図１のセグメントＩＩ）：
カセットＨ：ｓｐ８ｏｓ１９における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ８ｏｓ１８からなるもの：
【００９３】
【化１５】
【００９４】
カセットＩ：ｓｐ９ｏｓ２１における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ９ｏｓ２０からなるもの：
【００９５】
【化１６】
【００９６】
カセットＪ：ｓｐ１０ｏｓ２３における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ１０ｏｓ２２からなるもの：
【００９７】
【化１７】
【実施例２】
【００９８】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の大腸菌中での発現
最適化された遺伝子Ｆｏｐｔ５を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＣｙΔＨ，Ｈから切り出した。次いで、遺伝子を最終の発現プラスミドｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、アメリカ合衆国マディソン）（このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する）内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【００９９】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４時間、または４２℃で１５時間かけて調製した：
−ＬＢＧ１０／ａｍｐ１００培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１００】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４時間かけて調製した：
−ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１０１】
−ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、６ｇ／Ｌのグリセリン、４ｇ／Ｌのラクトース、微量の金属、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ラクトースを培地に添加して誘導を行った。
【０１０２】
ＬＢＧ／ａｍｐ１００培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌのグルコース）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンで、２５℃、１６０ｒｐｍで一晩かけて接種材料を調製した。
【０１０３】
分析のために、８ｍＬの培地を５０００ｒｐｍの遠心分離器で処理した。次いでペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／ｐＨ＝８．０に再懸濁させ、０．６６ｍＬの割合の緩衝液を添加してＯＤ６００ｎｍにて１単位を計算した。従って、添加量は平等化された。すなわち、記載された実施例中の培養液の最終的なＯＤ６００ｎｍは等しくはない。サンプルを３：１の割合で、ＤＴＴを含む４×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（ｐＨ＝８．７）と混合し、９５℃で１０分間加熱して遠心分離し、ゲル上に添加した。
【０１０４】
最適化された遺伝子構築物および従来のｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡを用いて得られた種々の発現例のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価によって比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は次の通りとし、結果を図３および図４に示す。
【０１０５】
図３Ａ：発現プラスミドｐＥＴ３ａを有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃および４２℃にて、誘導されたおよび誘導されなかった培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）。培養液はＬＢＧ１０／ａｍｐ１００培地で培養した。
【０１０６】
凡例：
添加例１：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・２５℃で非誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦの痕跡量はなし）
添加例２：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦのわずかな痕跡）
添加例３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・４２℃で非誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦの痕跡量はなし）
添加例４：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・４２℃でＩＰＴＧにて誘導（１０μＬ）（１％未満のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例５：クーマシーブリリアントブルーのための標準としての０．３μｇのフィルグラスチム
添加例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃で非誘導（５μＬ）（６％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５０％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
図３Ｂ：抗体による検出（ウェスタンブロット）；一次抗体はウサギ抗体；二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、基質はβ−ナフトール。
【０１０７】
抗体で検出するためのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）と同じ配列とし、添加した標準を０．０８μｇとした以外は同量ずつ添加した。
【０１０８】
図４：発現プラスミドｐＥＴ３ａを有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃にて誘導した培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）。培養液はＧＹＳＰ／ａｍｐ１００培地およびＬＹＳＰ／ａｍｐ１００培地で培養した。
【０１０９】
凡例：
添加例１：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
添加例２：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液；（６０％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−ＦＯＰＴ５、ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液；（５４％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
添加例４：ｒｈＧ−ＣＳＦ（０．６μｇ）
添加例５：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１．５μｇ）
添加例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液（４μＬ）；（５５％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液（５μＬ）；（５２％のｈＧ−ＣＳＦ）
天然の遺伝子および最適化された遺伝子について封入体の形態で見られたｈＧ−ＣＳＦの累積含有量（％）を、表１に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
ｈＧ−ＣＳＦの含有量についての表示値は、Ｆｏｐｔ５（図３Ａおよび図４）のケースではクーマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析によって、および（最適化されていない遺伝子のケース（図３Ｂ）では）抗体による検出を利用して得られる。Ｆｏｐｔ５のケースでは、発現レベルの評価のために、ゲルのｈＧ−ＣＳＦの相対量を、イメージングデンシトメーター装置Ｍｏｄｅｌ ＧＳ６７０（ＢｉｏＲａｄ）を利用するプロフィール分析（分子分析者のプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。
【０１１２】
この結果から、最適化された合成遺伝子Ｆｏｐｔ５を用いた場合、発現レベルが劇的に改善されることが示される。
【実施例３】
【０１１３】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の大腸菌（カナマイシン耐性）中での発現
最適化された遺伝子Ｆｏｐｔ５を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いてアンピシリン耐性を有するプラスミドｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５から切り出した。次いで、遺伝子をカナマイシン耐性を有する最終の発現プラスミドｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、アメリカ合衆国マディソン）内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【０１１４】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４から３０時間かけて調製した。
【０１１５】
−ＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１６】
−ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１７】
−抗生物質を添加しないＧＹＳＰ培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１８】
ＬＢＰＧ／ｋａｎ３０培地（１０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌのグルコース）と３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンで、２５℃、１６０ｒｐｍで一晩かけて接種材料を調製した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために（ｈＧ−ＣＳＦの含有量の評価；発現レベル）、８ｍＬの培地を５０００ｒｐｍで遠心した。次いでペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／ｐＨ＝８．０に再懸濁させ、０．６６ｍＬの割合の緩衝液を添加してＯＤ６００ｎｍにて１単位を計算した。
【０１２０】
サンプルを３：１の割合で、ＤＴＴを含む４×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（ｐＨ＝８．７）と混合し、９５℃で１０分間加熱して遠心し、清澄な上清をゲル上に添加した。最適化された遺伝子について封入体の形態で見られたｈＧ−ＣＳＦの累積含有量（％）を、表２に示す。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
図５は、発現プラスミドｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５を有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃にて誘導した培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）を示す。培養液は、二種の異なる濃度のカナマイシンと、カナマイシンを含まないもの、具体的にはＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地、ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地およびＧＹＳＰ培地で培養した。
【０１２３】
凡例：
レーン１：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
レーン２：ＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５２％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン３：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
レーン４：ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５４％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン５：ＧＹＳＰ培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５３％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン６：ｈＧ−ＣＳＦの標準
レーン７：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
ｈＧ−ＣＳＦの上記の含有量は、クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析によってによって得られる。発現レベルの評価のために、ｈＧ−ＣＳＦの相対量を、イメージングデンシトメーター装置Ｍｏｄｅｌ ＧＳ６７０（ＢｉｏＲａｄ）を利用するプロフィール分析（分子分析者のプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。
【０１２４】
この結果から、カナマイシンが無い（すなわち選択圧が無い）培養液においてもｈＧ−ＣＳＦの蓄積は（５３％を超える）同程度であることが示される。このことは、この株が工業規模での使用に特に好適であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施態様に従って最適化された、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の構築物の概要を示す図である。
【図２】図２は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の配列のＤＮＡ配列（図２Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０００７５９）およびｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子のＤＮＡ配列（図２Ｂ）を示す図である。天然の遺伝子と異なる塩基は太字である。
【図３】図３は、誘導したおよび誘導していない大腸菌の培養物における、天然のｈＧ−ＣＳＦのＤＮＡ配列の発現物（レーン１から４）およびｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物（レーン６と７）から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色（図３Ａ）およびｈＧ−ＣＳＦタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロット（図３Ｂ）で評価されている。
【図４】図４は、誘導した大腸菌の培養物における、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色で評価されている。
【図５】図５は、別の実施態様に従って誘導した大腸菌の培養物における、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色で評価されている。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌中で改善された発現レベルで発現できる、すなわち発現後の全タンパク質に対して５２％以上の組み換え型ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルを達成することができる、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）をコードする合成遺伝子に関する。
【０００２】
ｈＧ−ＣＳＦは、哺乳動物の造血細胞の分化および増殖を制御する刺激因子のファミリーに属する。これらは好中球の形成に主要な役割を有し、それゆえに、血液学および腫瘍学の分野における薬剤中での使用に好適である。
【０００３】
現在、臨床で使用するためのｈＧ−ＣＳＦの二つの形態が利用可能で市販されている：レノグラスチム（ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ）はグリコシル化されており、哺乳動物のセルラインで発現されて得られるものであり、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）はグリコシル化されておらず、細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）で発現されて得られるものである。
【背景技術】
【０００４】
アルギニンのコドン（ＡＧＧ／ＡＧＡ； ＣＧＡ）、ロイシンのコドン（ＣＴＡ）、イソロイシンのコドン（ＡＴＡ）およびプロリンのコドン（ＣＣＣ）などの幾つかの一連の希有コドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）が、翻訳レベルに与える影響ならびに大腸菌で発現されるタンパク質の量および質の連続的な低下に与える影響について、ケイン，ジェイエフ（Ｋａｎｅ ＪＦ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４９４−５００（１９９５）に記載されている。遺伝子の異なる部位に希有コドンが存在する場合、同様の影響が個々の希有コドンに見られる。
【０００５】
ｍＲＮＡの二次構造内で安定な二本鎖ＲＮＡが形成される場合、ＧＣに富む領域も大腸菌中での翻訳効率に影響を与える。ｍＲＮＡのＧＣに富む領域がＲＢＳに見られる場合、ＲＢＳの直近にみられる場合、または開始コドンの直近にみられる場合のいずれかの場合、この影響は最も強くなる（マクリデス，エスシー（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６０：５１２−５３８（１９９６）；バネイックス，エフ（Ｂａｎｅｙｘ Ｆ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１１−４２１（１９９９））。
【０００６】
二次構造を予測する方法、および最も安定した構造／最もあり得る構造についての基本的なルールと予想されている個々のＲＮＡ分子の最小自由エネルギーを計算する方法は、幾つか知られている（サンタルチア，ジェイ，ジュニアおよびターナー，ディーエイチ（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ Ｊｒ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ ＤＨ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３０９−３１９（１９９７））。正確な二次構造を予測するための信頼できるアルゴリズムは、幾つかのケースを除いて知られていない。発現レベルとの定量的な相関性についての根拠も存在しない（シュミト，エムエイチおよびバンデンデュイン，ジェイジェイ（Ｓｍｉｔ ＭＨ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｕｉｎ ＪＪ）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２４４，１４４−１５０（１９９４））。ＲＮＡの三次構造を予測することは、現在でも不可能である（ティノコ，アイおよびバスタマンテ，シー（Ｔｉｎｏｃｏ Ｉ ａｎｄ Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ Ｃ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ，２９３：２７１−２８１（１９９９））。
【０００７】
ＴＩＲ領域内、ＲＢＳ領域内および開始コドンとＲＢＳ領域との間の領域のＤＮＡ配列を最適化した後に発現レベルが上昇することが、マッカーシー，ジェイイージーおよびブリマコーブ，アール（ＭｃＣａｒｔｈｙ ＪＥＧ ａｎｄ Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ Ｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １０：４０２−４０７（１９９４）に記載されている。このケースでは、翻訳の開始がさらに効率的なことと、ｍＲＮＡのコード領域内の連続性がスムーズであることにより、発現レベルが上昇した。
【０００８】
大腸菌内で発現させることによりインビトロでの生物学的研究を行うのに適切な量のｈＧ−ＣＳＦを生産することは、ソウザ，エルエム（Ｓｏｕｚａ ＬＭ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５（１９８６）およびジェボ，ケイエム（Ｚｓｅｂｏ ＫＭ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４（１９８６）に記載されている。ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルは１％未満であった。
【０００９】
米国特許第４８１０６４３号では、まず第一に、大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換することに基づいて構築された、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を用いることが開示されている。λファージの熱誘導性プロモーターと組み合わせると、ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルは全細胞性タンパク質に対して３から５％になった。このレベルは、ｈＧ−ＣＳＦの経済的な大規模生産レベルとしては十分でない。
【００１０】
ウィングフィールド，ピー（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ，２５６：２１３−２１８（１９８８）に記載されているように、ｈＧ−ＣＳＦの５’末端領域における最初の四つのコドンを変更することによって、全細胞性タンパク質に対するｈＧ−ＣＳＦの蓄積量は８から１０％に達した。
【００１１】
細菌の全細胞性タンパク質に対するｈＧ−ＣＳＦ収率を最大１７％にまで、大腸菌中でｈＧ−ＣＳＦ発現させることは、デブリン，ピーイー（Ｄｅｖｌｉｎ ＰＥ）ら、Ｇｅｎｅ ６５：１３−２２（１９８８）に記載されている。Ｇ−ＣＳＦのコード領域の５’末端（最初の四つのアミノ酸をコードするコドン）におけるＤＮＡ配列を部分的に最適化したことによって、このような収率に達し、ここではＧＣ領域をＡＴ領域によって置換し、λファージの比較的強力なプロモーターを用いた。この発現レベルは非常に高いというものではなく、生産の収率がより低下し、大規模生産における経済性は低い。
【００１２】
合成遺伝子を用いて発現レベルを約３０％としたことがカン，エスエイチ（Ｋａｎｇ ＳＨ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，１７（７）：６８７−６９２（１９９５）に記載されている。大腸菌の優先的コドンを導入し、ＴＩＲ領域内を修飾し、コドンのセットの更なる修飾を用いることにより、このレベルに達した。そこでは、遺伝子の３’末端は本質的に変更されなかった。従って、記載された発現レベルに達するには、ＴＩＲ領域における遺伝子の変更が必要であり、発現レベルが３０％を超えることは無かった。
【００１３】
米国特許第５８４０５４３号には、遺伝子の５’末端に、ＡＴに富む領域を導入し、大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換したｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の構築が記載されている。Ｔｒｐプロモーターの制御下で、全細胞性タンパク質に対する、発現したｈＧ−ＣＳＦの収率は１１％に達した。他方、ロイシンおよびスレオニンまたはそれらの組み合わせを（細菌が培養される）発酵培地に添加すると、全細胞性タンパク質に対してｈＧ−ＣＳＦの蓄積は最大で３５％に達した。従って、アミノ酸を発酵培地に添加することによって、このような発現レベルに達した訳であるが、ｈＧ−ＣＳＦを生産する方法では追加的なコストとなり、工業生産において経済的ではない。ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を最適化することだけでは、ｈＧ−ＣＳＦの発現レベルをより高くすることはできなかった。
【００１４】
全細胞性タンパク質に関連して、従来技術で最も多いｈＧ−ＣＳＦ蓄積が見られたのは、ブイ，ジェオン（ｖ Ｊｅｏｎｇ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３：３１１−３１８（２００１）に記載されている、４８％である。Ｎ末端を変更し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することによって、このような蓄積が得られた。
【００１５】
天然のヒトの遺伝子の、細菌である大腸菌などの原核生物中での発現レベルを一般に予測可能とする報告は存在しない。λファージまたはＴ７ファージ由来の強力なプロモーターを有する発現プラスミドを用いてでさえ、記載される発現レベルは比較的低いか、または検出するのが困難なレベルである。多数のパラメータ（希有コドンまたはそれらのクラスター化；ＧＣ塩基対に富む領域、好ましくないｍＲＮＡの二次構造、不安定なｍＲＮＡ）が大腸菌中でのヒトタンパク質の蓄積に影響を与えることは、従来技術の文献から集約することができる。
【００１６】
現在までのところ、発現に最適なｍＲＮＡの二次構造または三次構造を得るために、コドンをどのように組み合わせるかに関する公知の完全に確立されたルールは存在しない。二次構造とその熱力学的安定性を予測するための幾つかの数学的モデルおよび構造的モデルは存在するが、信頼性が極めて低く、二次構造を予測することはできない。他方、三次構造を予測するこのようなモデルは存在しない。従って、現在のところアクセス可能なこれらのモデルでは、発現レベルへのコドンの影響を予測することはできない。
【００１７】
特許文献または科学文献のいずれにおいても、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の大腸菌中での発現レベルが低いという問題を解決するための、より効果的な手段に関する報告は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、ｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列であって、大腸菌中での発現レベル（蓄積）を改善できるＤＮＡ配列を提供することであり、及びこのようなＤＮＡ配列を構築するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
請求項１に記載のＤＮＡ配列によって、及び請求項１５に記載のそのようなＤＮＡ配列を構築する方法によって、この目的を解決する。本発明はさらに、請求項６または７に記載の発現プラスミド、請求項１１または１２に記載の発現システム、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現する方法、および請求項２４に記載の医薬組成物を製造する方法を提供する。好ましい実施態様は、下位の請求項に規定されている。
【００２０】
本発明の重要な特徴は、大腸菌中での発現レベル（蓄積）が、大腸菌中の全タンパク質に対して５２％以上の組み換え型ｈＧ−ＣＳＦを達成可能な、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を用いることである。好ましくは、強力なＴ７プロモーターを含む発現プラスミドを発現のために用いる。大腸菌中での発現を最適化された（ｈＧ−ＣＳＦをコードする）合成遺伝子を構築することができる二つの方法を複合的に組み合わせて用いることによって、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する。第一の方法は、大腸菌中での発現に好ましくない幾つかの大腸菌の希有コドンを、大腸菌中での発現により好ましい大腸菌の優先的コドンで置換することを含む。第二の方法は、幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換することを含む。この二つの方法の一つを用いて、本発明の合成遺伝子の幾つかの部分を構築し、幾つかの部分については、二つの方法を組み合わせて用いるのに対して、遺伝子の幾つかの部分には変更が無い。ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する手順（これも本発明の主題である）において、非コード（５’−非翻訳）領域に変更が無いことが好ましい。有利なこととして、これは、翻訳開始領域（ＴＩＲ）もしくはリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）のいずれか、または開始コドンとＲＢＳとの間の領域内には修飾がないことを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の大腸菌中での低い発現レベルに伴う問題は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列を最適化することで解決できることが見出された。ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子を変化させ、ｈＧ−ＣＳＦをコードする特有の合成遺伝子の構築を導く。この特有の合成遺伝子は、配列番号１のＤＮＡ配列によって、または配列番号１もしくは天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の配列を好適に修飾したものを含むヌクレオチド配列によって規定される。
【００２２】
当分野で記載されるデータと比較して、驚くほど高い発現レベルを、本発明によって得ることができる。
【００２３】
本明細書で用いられる「ｈＧ−ＣＳＦ」という用語は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を意味し、大腸菌での発現によって得られる組み換え型ｈＧ−ＣＳＦを含む。
【００２４】
天然のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列に変更を導入することによって、本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を得た。従って、アミノ酸配列は変化しておらず、天然のｈＧ−ＣＳＦと同一のままであった。
【００２５】
本発明は更に、大腸菌で合成遺伝子を発現させる方法を含み、合成遺伝子の発現レベルに関連する。
【００２６】
本明細書で用いられる「発現レベル」という用語は、発現後の全細胞性タンパク質に対して、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の異種発現後に得られるｈＧ−ＣＳＦの比率を意味する。発現後に適切に分離されたタンパク質の定量化から発現レベルを定量し得、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質バンドの染色性を定量すればよい。
【００２７】
本明細書で用いられる「異種発現」という用語は、その発現が生じる生物とは異なる生物での遺伝子の発現を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「同種発現」という用語は、その発現が生じる生物が本来の生物での遺伝子の発現を意味する。
【００２９】
本明細書で用いられる「優先的コドン」という用語は、最も多くのｍＲＮＡ分子を生産するために個々の生物（大腸菌など）に用いられるコドンを意味する。生物は、高レベルの同種発現で遺伝子を発現させるために、これらのコドンを用いる。
【００３０】
本明細書で用いられる「希有コドン」という用語は、低い発現レベルで遺伝子を発現させるにすぎない（大腸菌などの）個々の生物に用いられるコドンを意味する。これらのコドンは、生物で稀にしか用いられない（低レベルの同種発現）。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＧＣに富む領域」という用語は、塩基のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）が支配的である、遺伝子中の領域を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「ＡＴに富む領域」という用語は、塩基のアデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）が支配的である、遺伝子中の領域を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「合成遺伝子」という用語は、合成の相補性オリゴヌクレオチドからなる短い二本鎖ＤＮＡ断片から調製される遺伝子を意味する。この合成遺伝子は、ヌクレオチド配列のみにおいて天然の遺伝子（たとえばｃＤＮＡ）と異なるもので、ここでアミノ酸配列は不変のままである。組み換えＤＮＡ技術によって、合成遺伝子を得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「天然の遺伝子」という用語は、天然のＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡ配列の遺伝子を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる「セグメント」という用語は、両末端上の単一の制限部位が結合する、遺伝子の部分を意味する。これらの部位は、合成的に構築された遺伝子の部分のためのサブクローニング部位として機能する。以下では、ヌクレオチドの位置に従って、開始コドンから５’−３’の方向で制限部位に番号付けしている。
【００３６】
本明細書で用いられる「セグメントＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチドの３位と１９４位（特にＮｄｅＩ（３）およびＳａｃＩ（１９４）の制限部位）との間の５’末端を意味する。すなわち、１９１ｂｐの長さの配列である。セグメントＩはデノボ合成されてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる「セグメントＩＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦについての遺伝子のヌクレオチドの１９４位と３０９位（特にＳａｃＩ（１９４）とＡｐａＩ（３０９）の制限部位）との間の部位を意味する。すなわち、１１５ｂｐの長さの、遺伝子の中央部分である。セグメントＩＩはデノボ合成されてもよい。
【００３８】
本明細書で用いられる「セグメントＩＩＩ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦについての遺伝子のヌクレオチドの３０９位と４６７位（特にＡｐａＩ（３０９）とＮｈｅＩ（４６７）の制限部位）との間の部位を意味する。すなわち、１５８ｂｐの長さの、遺伝子の部分であり、そこではＡｒｇ１４８とＧｌｙ１５０についてのコドン以外の、ｈＧ−ＣＳＦについての天然のＤＮＡ配列が保存されている。
【００３９】
本明細書で用いられる「セグメントＩＶ」という用語は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子のヌクレオチドの４６７位と５３６位（特にＮｈｅＩ（４６７）およびＢａｍＨＩ（５３６）の制限部位）との間の３’末端を意味する。すなわち、６９ｂｐの長さの、遺伝子の末端部分である。セグメントＩＶはデノボ合成されてもよい。
【００４０】
次の方法を組み合わせることによって、本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築する：
・（制限部位のＳａｃＩ（１９４）とＡｐａＩ（３０９）との間の）セグメントＩＩおよび（制限部位のＮｈｅＩ（４６７）とＢａｍＨＩ（５３６）との間の）セグメントＩＶにおいて：大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること。
・（制限部位のＮｄｅＩ（３）とＳａｃＩ（１９４）との間の）セグメントＩにおいて：ＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること。これによって、最も使用頻度が小さい大腸菌のコドンが交換されるが、たいていの場合、大腸菌の優先的コドンに代替されることはない。
【００４１】
・セグメントＩＩＩにおける４６コドン（Ｐｒｏ１０２についてのＣＣＣとＡｒｇ１４７についてのＣＧＣの間の）の全く不変の天然の配列。
【００４２】
・セグメントＩＩＩの末端における二つの大腸菌の希有コドンの置換（ＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０））。
【００４３】
本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を最適化することに、ＴＩＲ、ＲＢＳ、および開始コドンとＲＢＳとの間の領域における変更は含まない。
【００４４】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする本発明の合成遺伝子によって、ｈＧ−ＣＳＦをコードする構築された合成遺伝子を、大腸菌で５２％以上の発現レベルで発現させることが可能となる。さらに、約５５％または約６０％もの発現レベルを得ることもできる。本発明のｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子が高い発現レベルであることによって、ｈＧ−ＣＳＦの生産を高収率とすることができ、異種のｈＧ−ＣＳＦの精製および単離がより迅速かつ単純に行うことができ、生産過程の制御がより簡単にでき、そして生産方法の全体をより経済的にできる。従って、工業的規模でｈＧ−ＣＳＦを効率的に生産することができる。生産されたｈＧ−ＣＳＦは、臨床医学で使用するのに適している。
【００４５】
本発明の合成遺伝子を構築することは、ｈＧ−ＣＳＦの天然の遺伝子およびプラスミドを最初に調製することから始まる。天然のｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子はヒト起源のものでも良いが、デノボ合成された遺伝子セグメントのサブクローニングのために用いられる単一の制限部位を含む領域内で相同なあらゆる遺伝子に関して、同じ原理を用いることができる。突然変異を誘発するためのプラスミドを、点突然変異を連続的に導入可能なその能力に従って選択した。さらなる選択プライマー（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いることによって、所望の突然変異を含むプラスミドの選択または濃縮を行った。カセット突然変異誘発によって点突然変異を導入できるように、遺伝子およびプラスミドを構築する。
【００４６】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子およびプラスミドを最初に調製した後、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の最適化を実施する。このことは、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築することを意味する。最適化は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子を四つ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）のセグメントに分割することから始まる。このセグメントは、オリゴヌクレオチドの突然変異誘発後に単一の制限部位を有して分離するかまたは分離するはずであり、そして個々のセグメントにおいて変更が導入される。幾つかの個々のセグメントにおいて、遺伝子配列における変更が導入されるのに対して、特定のセグメントにおいては遺伝子は変更されない（図１）。従って、このように得られる、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された合成遺伝子は、部分的に保存された天然の配列（セグメントＩＩＩ）と、デノボ合成される５’コード領域および３’コード領域（セグメントＩ、ＩＩおよびＩＶ）とからなる。
【００４７】
個々のセグメントにおける変更：
セグメントＩ：大腸菌の希有コドンの大腸菌の優先的コドンによる置換と、ＧＣに富む領域のＡＴに富む領域による置換
イタリック体：ＧＣに富む領域／ＡＴに富む領域の置換；下線付きイタリック体：希有コドン／優先的コドンの置換とＧＣに富む領域／ＡＴに富む領域の置換；下線：希有コドン／優先的コドンの置換；Ｇｌｙ１０１（ＧＧＴ→ＧＧＧ）はＡｐａＩ（３０９）制限部位の導入。
【００４８】
【化１】
【００４９】
セグメントＩＩ：大腸菌の希有コドンの大腸菌の優先的コドンによる置換。
【００５０】
【化２】
【００５１】
セグメントＩＩＩ：制限部位ＮｈｅＩの直前に位置する二つの大腸菌の希有コドンの置換
【００５２】
【化３】
【００５３】
セグメントＩＶ：遺伝子の末端にある大腸菌の希有コドンの長いクラスターの、大腸菌の優先的コドンによる置換。
【００５４】
【化４】
【００５５】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子を構築した後、最適化された合成遺伝子を、大腸菌中での発現に適した最終のプラスミドベクター内にサブクローニングする。好ましくは、プラスミドベクターは（Ｎｏｖａｇｅｎから販売されている）ｐＥＴベクター類の群から選択される。これらのベクター類は、強力なＴ７プロモーターを含む。より好ましくは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＥＴ３ａが用いられ、とりわけカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐＥＴ９ａが用いられる。その結果、構築される発現プラスミドは次に、適切な生産株の大腸菌内に形質転換される。好ましくは、生産株の大腸菌は、Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼについての染色体の遺伝子または発現プラスミドの遺伝子を保持する株の群から選択される。最も好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が用いられる。
【００５６】
この手順は、接種材料の調製および適切な培地での発酵プロセスにより続ける。好ましくは、約０．１ｍＭから約１ｍＭの範囲の適切な濃度のＩＰＴＧを用いて誘導する。好ましい濃度は約０．３から０．６ｍＭである。約３７℃で発酵を行うことができるが、３０℃未満で行うことが好ましく、約２０から３０℃で行うことがより好ましく、約２５℃で行うことが特に好ましい。通常用いられるよりも低い温度で発酵方法を実施することによって、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの前駆体分子の封入体中への蓄積を有利に支援できる。
【００５７】
プラスミドベクター内に挿入される耐性遺伝子に対応する抗生物質の有無に関わらず、たとえば適切な濃度のアンピシリンもしくはカナマイシンの存在下でまたはそれらの非存在下で、発酵プロセスを実施してもよい。発酵およびその結果としてのｈＧ−ＣＳＦ蓄積の効率は、選択圧がない場合でも非常に高いことが分かっている。
【００５８】
蓄積する異種ｈＧ−ＣＳＦは封入体で見出され、再生プロセスに適しており、かつ単離する手段に用いられる。
【００５９】
ｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦタンパク質の単離および／または精製に好適な技術は、当業者に公知であり、周知の原理（たとえばイオン交換、疎水性相互作用、アフィニティーまたはサイズ排除など）のいずれかを利用する古典的なクロマトグラフィーまたは流動層クロマトグラフィーを用いることができ、ならびに適切なマトリックスまたは溶液を用いる、連続的なおよびバッチモードでの抽出法を用いることができる。好ましい技術は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である。というのは、純粋で生物学的に活性なタンパク質を、自然な条件で高収率で極めて効率的に調製できるからである。
【００６０】
本発明に従って得られる、単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、有効成分としてそれを含有する医薬組成物の製造に用いることができる。医薬組成物は、処置が望まれる患者の疾患に対して治療上有効な量のｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する。
【００６１】
医薬適合性の担体または助剤の適切なものとしては、適切な希釈剤、アジュバントおよび／またはＧ−ＣＳＦ療法に有用な担体が挙げられる。
【００６２】
本発明の方法を用いて得られた生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを薬剤の調製に用いることができる。すなわち次のものを含む群から選択される適応に指示される：好中球減少症および好中球減少症に関連する臨床的な続発症、化学療法後の発熱性の好中球減少症についての入院数の減少、ドナーの白血球の注入に代わるものとしての造血前駆細胞の動員、慢性的な好中球減少症、好中球減少性および好中球非減少性の感染症、被移植者、慢性的な炎症性の状態、敗血症および敗血症性ショック、好中球減少性および好中球非減少性の感染症におけるリスト、罹患率、死亡率、入院日数の減少、好中球減少症の患者および好中球非減少症の患者における感染症および感染症に関連する合併症の予防、院内感染の予防および院内感染による死亡率および院内感染の頻度率の低下、新生児における経腸投与、新生児における免疫系の強化、集中治療室の患者および危篤状態の患者における臨床転帰の改善、外傷／皮膚潰瘍／火傷の治療および処置、化学療法および／または放射線療法の強化、汎血球減少症、抗炎症性サイトカインの増加、フィルグラスチムの予防的な使用による高投与量化学療法の間隔の短縮化、光線力学療法の抗腫瘍効果の増強、脳の種々の機能障害によって生じる疾患の予防および治療、血栓症およびそれら合併症の治療ならびに照射後の赤血球生成の回復。
【００６３】
その他のすべての疾患の治療に用いることもでき、それらはＧ−ＣＳＦの適応となる。
【００６４】
従って、本発明の方法によって得られる純粋で生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物の、上記の疾患の治療に有効な量を、当業者に公知の手法で患者に投与することができる。
【００６５】
本発明を、下記の実施例によって、および添付の図面を参照して詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例および図面は単なる例証に過ぎず、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００６６】
最適な遺伝子：Ｆｏｐｔ５の構築
実施例１ａ：遺伝子およびプラスミドの最初の調製品
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を、ＰＣＲ法を用いてＢＢＧ１３（Ｒ ａｎｄ Ｄ）から増幅した。また、開始オリゴヌクレオチドを用いることによって、制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを遺伝子の開始末端と終止末端に導入することにも用いた。次いで、遺伝子をプラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ（詳細は下記を参照すること）の制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に組み込んだ。大腸菌中での遺伝子発現のためのその他のすべての最適化工程も、このプラスミド内で実施した。
【００６７】
最初の遺伝子を調製している間に、点突然変異によってＥｃｏＲＶ制限部位を無効にした（オリゴＭ２０ｚ１０８）。（個々の）突然変異が導入される可能性を確実なものとするために、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてプラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ内でオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行うことによって、このことを実施した。従って、制限部位ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶを介しての、プラスミドｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈ−Ｇ−ＣＳＦにおける変異体の選択が可能となった。
【００６８】
構成的発現が可能となる手法にて、開始プラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１（Ｍｅｄａｃ、ハンブルグ）を再構築した。両方の制限部位ＨｉｎｄＩＩＩの間にある、ｃｌ８５７リプレッサーをコードする遺伝子の一部を切除することによって、このことを実施した。得られたプラスミドをｐＣｙｔｅｘΔＨ，Ｈと名付けた。
【００６９】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子からＥｃｏＲＶ部位を無効にするためのオリゴヌクレオチド：
【００７０】
【化５】
【００７１】
実施例１ｂ：コドンの最適化（図１）
最初の最適化工程において、相補性オリゴヌクレオチドからなる五つのカセット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を連結することによって、制限部位ＮｄｅＩとＳａｃＩとの間の合成遺伝子を構築した。遺伝子のこの合成部分はセグメントＩに相当する。セグメントＩを用いて、ｈＧ−ＣＳＦについての天然の遺伝子の、制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｃＩの間の部分を置換した。制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｃＩの間の遺伝子の第一の部分を切断することによって、このことを実施し、そして合成的に調製したカセットで置換した。二工程で方法を実施した。第一の工程において、カセットＡをＮｄｅＩ部位と連結し、そしてカセットＥをＳａｃＩ部位と連結した。１６℃にて１６時間後、連結混合物をエタノールで沈殿させて、余分の（結合していない）オリゴヌクレオチドを除去した。第二の工程において、既に連結した三つの相補的オリゴヌクレオチドに由来するカセット全体（カセットＢ、ＣおよびＤ）の中央部分を添加し、１６℃で１６時間、ライゲーションを行った。
【００７２】
第二の最適化工程において、セグメントＩＩＩに位置する大腸菌にとって最も重要な二つのコドン（すなわちＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０））を、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を利用して置換した。
【００７３】
第三の最適化工程において、途中のエタノール沈殿処理以外はセグメントＩと同様の手法でセグメントＩＶを構築した。セグメントＩＶは、制限部位ＮｈｅＩとＢａｍＨＩとの間の遺伝子の最後の部分を示し、二対の相補性オリゴヌクレオチド（カセットＦおよびＧ）からなる。
【００７４】
第四の最適化工程において、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）部位特異的突然変異キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を利用して、Ｉｌｅ９６をコードする希有コドンを置換した（ＡＴＡ→ＡＴＴ）（セグメントＩＩ）。そしてＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））の制限部位を、セグメントＩＩの３’末端に導入した。次いで、天然の遺伝子のＳａｃＩとＡｐａＩとの間を合成ＤＮＡ（セグメントＩＩ）で置換するために、第五の最適化工程においてＡｐａＩの制限部位を用いた。この合成ＤＮＡは、三対の相補性オリゴヌクレオチド（カセットＨ、ＩおよびＪ）からなる。第一工程と同様にしてこのことを実施し、後にカセットＩを添加した。
【００７５】
第一の最適化工程：
オリゴヌクレオチドの相補性対（ＮｄｅＩ−ＳａｃＩ；図１のセグメントＩ）：
カセットＡ：ｓｐ１ｏｓ２における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ１ｏｓ１からなるもの：
【００７６】
【化６】
【００７７】
カセットＢ：ｓｐ２ｏｓ４における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ２ｏｓ３からなるもの：
【００７８】
【化７】
【００７９】
カセットＣ：ｓｐ３ｏｓ６における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ３ｏｓ５からなるもの：
【００８０】
【化８】
【００８１】
カセットＤ：ｓｐ４ｏｓ８における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ４ｏｓ７からなるもの：
【００８２】
【化９】
【００８３】
カセットＥ：ｓｐ５ｏｓ１０における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ５ｏｓ９からなるもの：
【００８４】
【化１０】
【００８５】
第二の最適化工程：オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を利用することによる最も重要なコドンの置換のためのオリゴヌクレオチド
ＣＧＧ→ＣＧＴ（Ａｒｇ１４８）およびＧＧＡ→ＧＧＴ（Ｇｌｙ１５０）の置換
【００８６】
【化１１】
【００８７】
第三の最適化工程：ヌクレオチドの相補性対（ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ；図１上のセグメントＩＶ）：
カセットＦ：ｓｐ６ｏｓ１２における相補性ヌクレオチドｚｇ６ｏｓ１１からなるもの：
【００８８】
【化１２】
【００８９】
カセットＧ：ｓｐ７ｏｓ１４における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ７ｏｓ１３からなるもの：
【００９０】
【化１３】
第四の最適化工程：オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を利用することによる、ＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））を導入するための、そして希有コドンＡＴＡ→ＡＴＴ（Ｉｌｅ９６）の置換のためのオリゴヌクレオチド
ＡｐａＩ（３０９）（ＧＧＴ→ＧＧＧ（Ｇｌｙ１０１））の挿入とＡＴＡ→ＡＴＴ（Ｉｌｅ９６）の置換：
【００９１】
【化１４】
【００９２】
５．最適化工程：オリゴヌクレオチドの相補性対（ＳａｃＩ−ＡｐａＩ；図１のセグメントＩＩ）：
カセットＨ：ｓｐ８ｏｓ１９における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ８ｏｓ１８からなるもの：
【００９３】
【化１５】
【００９４】
カセットＩ：ｓｐ９ｏｓ２１における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ９ｏｓ２０からなるもの：
【００９５】
【化１６】
【００９６】
カセットＪ：ｓｐ１０ｏｓ２３における相補性オリゴヌクレオチドｚｇ１０ｏｓ２２からなるもの：
【００９７】
【化１７】
【実施例２】
【００９８】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の大腸菌中での発現
最適化された遺伝子Ｆｏｐｔ５を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＣｙΔＨ，Ｈから切り出した。次いで、遺伝子を最終の発現プラスミドｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、アメリカ合衆国マディソン）（このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する）内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【００９９】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４時間、または４２℃で１５時間かけて調製した：
−ＬＢＧ１０／ａｍｐ１００培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１００】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４時間かけて調製した：
−ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１０１】
−ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、６ｇ／Ｌのグリセリン、４ｇ／Ｌのラクトース、微量の金属、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）において。ラクトースを培地に添加して誘導を行った。
【０１０２】
ＬＢＧ／ａｍｐ１００培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌのグルコース）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンで、２５℃、１６０ｒｐｍで一晩かけて接種材料を調製した。
【０１０３】
分析のために、８ｍＬの培地を５０００ｒｐｍの遠心分離器で処理した。次いでペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／ｐＨ＝８．０に再懸濁させ、０．６６ｍＬの割合の緩衝液を添加してＯＤ６００ｎｍにて１単位を計算した。従って、添加量は平等化された。すなわち、記載された実施例中の培養液の最終的なＯＤ６００ｎｍは等しくはない。サンプルを３：１の割合で、ＤＴＴを含む４×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（ｐＨ＝８．７）と混合し、９５℃で１０分間加熱して遠心分離し、ゲル上に添加した。
【０１０４】
最適化された遺伝子構築物および従来のｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡを用いて得られた種々の発現例のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価によって比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は次の通りとし、結果を図３および図４に示す。
【０１０５】
図３Ａ：発現プラスミドｐＥＴ３ａを有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃および４２℃にて、誘導されたおよび誘導されなかった培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）。培養液はＬＢＧ１０／ａｍｐ１００培地で培養した。
【０１０６】
凡例：
添加例１：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・２５℃で非誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦの痕跡量はなし）
添加例２：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦのわずかな痕跡）
添加例３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・４２℃で非誘導（１０μＬ）（ｈＧ−ＣＳＦの痕跡量はなし）
添加例４：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−ｈＧ−ＣＳＦ・４２℃でＩＰＴＧにて誘導（１０μＬ）（１％未満のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例５：クーマシーブリリアントブルーのための標準としての０．３μｇのフィルグラスチム
添加例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃で非誘導（５μＬ）（６％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５０％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
図３Ｂ：抗体による検出（ウェスタンブロット）；一次抗体はウサギ抗体；二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、基質はβ−ナフトール。
【０１０７】
抗体で検出するためのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）と同じ配列とし、添加した標準を０．０８μｇとした以外は同量ずつ添加した。
【０１０８】
図４：発現プラスミドｐＥＴ３ａを有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃にて誘導した培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）。培養液はＧＹＳＰ／ａｍｐ１００培地およびＬＹＳＰ／ａｍｐ１００培地で培養した。
【０１０９】
凡例：
添加例１：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
添加例２：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液；（６０％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−ＦＯＰＴ５、ＬＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液；（５４％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
添加例４：ｒｈＧ−ＣＳＦ（０．６μｇ）
添加例５：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１．５μｇ）
添加例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液（４μＬ）；（５５％のｈＧ−ＣＳＦ）
添加例７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＧＹＳＰ／ａｍｐ１００で培養した培養液（５μＬ）；（５２％のｈＧ−ＣＳＦ）
天然の遺伝子および最適化された遺伝子について封入体の形態で見られたｈＧ−ＣＳＦの累積含有量（％）を、表１に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
ｈＧ−ＣＳＦの含有量についての表示値は、Ｆｏｐｔ５（図３Ａおよび図４）のケースではクーマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析によって、および（最適化されていない遺伝子のケース（図３Ｂ）では）抗体による検出を利用して得られる。Ｆｏｐｔ５のケースでは、発現レベルの評価のために、ゲルのｈＧ−ＣＳＦの相対量を、イメージングデンシトメーター装置Ｍｏｄｅｌ ＧＳ６７０（ＢｉｏＲａｄ）を利用するプロフィール分析（分子分析者のプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。
【０１１２】
この結果から、最適化された合成遺伝子Ｆｏｐｔ５を用いた場合、発現レベルが劇的に改善されることが示される。
【実施例３】
【０１１３】
ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の大腸菌（カナマイシン耐性）中での発現
最適化された遺伝子Ｆｏｐｔ５を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いてアンピシリン耐性を有するプラスミドｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５から切り出した。次いで、遺伝子をカナマイシン耐性を有する最終の発現プラスミドｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、アメリカ合衆国マディソン）内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【０１１４】
培養液を振盪器上で１６０ｒｐｍにて２５℃で２４から３０時間かけて調製した。
【０１１５】
−ＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１６】
−ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１７】
−抗生物質を添加しないＧＹＳＰ培地（２０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのグルコース、微量の金属）において。ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加して誘導を行った。
【０１１８】
ＬＢＰＧ／ｋａｎ３０培地（１０ｇ／Ｌのフィトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌのグルコース）と３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンで、２５℃、１６０ｒｐｍで一晩かけて接種材料を調製した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために（ｈＧ−ＣＳＦの含有量の評価；発現レベル）、８ｍＬの培地を５０００ｒｐｍで遠心した。次いでペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／ｐＨ＝８．０に再懸濁させ、０．６６ｍＬの割合の緩衝液を添加してＯＤ６００ｎｍにて１単位を計算した。
【０１２０】
サンプルを３：１の割合で、ＤＴＴを含む４×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（ｐＨ＝８．７）と混合し、９５℃で１０分間加熱して遠心し、清澄な上清をゲル上に添加した。最適化された遺伝子について封入体の形態で見られたｈＧ−ＣＳＦの累積含有量（％）を、表２に示す。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
図５は、発現プラスミドｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５を有する生産株の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃にて誘導した培養液からのタンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％の濃縮ゲル、１５％の分離ゲル；クーマシーブリリアントブルーで染色）を示す。培養液は、二種の異なる濃度のカナマイシンと、カナマイシンを含まないもの、具体的にはＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地、ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地およびＧＹＳＰ培地で培養した。
【０１２３】
凡例：
レーン１：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
レーン２：ＧＹＳＰ／ｋａｎ３０培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５２％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン３：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
レーン４：ＧＹＳＰ／ｋａｎ１５培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５４％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン５：ＧＹＳＰ培地でのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ９ａ−Ｆｏｐｔ５・２５℃でＩＰＴＧにて誘導（５μＬ）（５３％を超えるｈＧ−ＣＳＦ）
レーン６：ｈＧ−ＣＳＦの標準
レーン７：ＬＭＷ（ＢｉｏＲａｄ）
ｈＧ−ＣＳＦの上記の含有量は、クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度分析によってによって得られる。発現レベルの評価のために、ｈＧ−ＣＳＦの相対量を、イメージングデンシトメーター装置Ｍｏｄｅｌ ＧＳ６７０（ＢｉｏＲａｄ）を利用するプロフィール分析（分子分析者のプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。
【０１２４】
この結果から、カナマイシンが無い（すなわち選択圧が無い）培養液においてもｈＧ−ＣＳＦの蓄積は（５３％を超える）同程度であることが示される。このことは、この株が工業規模での使用に特に好適であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施態様に従って最適化された、ｈＧ−ＣＳＦをコードする合成遺伝子の構築物の概要を示す図である。
【図２】図２は、ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の遺伝子の配列のＤＮＡ配列（図２Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０００７５９）およびｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子のＤＮＡ配列（図２Ｂ）を示す図である。天然の遺伝子と異なる塩基は太字である。
【図３】図３は、誘導したおよび誘導していない大腸菌の培養物における、天然のｈＧ−ＣＳＦのＤＮＡ配列の発現物（レーン１から４）およびｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物（レーン６と７）から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色（図３Ａ）およびｈＧ−ＣＳＦタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロット（図３Ｂ）で評価されている。
【図４】図４は、誘導した大腸菌の培養物における、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色で評価されている。
【図５】図５は、別の実施態様に従って誘導した大腸菌の培養物における、ｈＧ−ＣＳＦをコードする最適化された（Ｆｏｐｔ５）遺伝子の発現物から得られるタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、色素染色で評価されている。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む配列であることを特徴とする、ｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
（ａ）配列番号１の配列の一部；
（ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする核酸；および
（ｃ）天然のｈＧ−ＣＳＦ配列に関連して次の修飾の少なくとも一つ、好ましくはそれらの組み合わせ：
−（ヌクレオチドの３位と１９４位との間の５’末端に位置する）「セグメントＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの置換およびＡＴに富む領域によるＧＣに富む領域の置換を含む複数の置換、
−（ヌクレオチドの１９４位と３０９位との間に位置する）「セグメントＩＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
−（ヌクレオチドの３０９位と４６７位との間に位置する）「セグメントＩＩＩ」において：変更の非存在または本質的な変更の非存在、
−（ヌクレオチドの４６７位と５３６位との間の３’末端に位置する）「セグメントＩＶ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
を含む群より選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項３】
生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードする、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の発現レベルを与えることができる、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子に関連して変更されていないｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’−非翻訳領域をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
プラスミドが請求項１または５に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項７】
プラスミドが、請求項２から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項８】
プラスミドベクターがＴ７プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
プラスミドベクターがｐＥＴベクター類の群から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項１０】
プラスミドベクターが耐性遺伝子、好ましくはアンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
系が請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１２】
系が請求項７および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１３】
生産株が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の発現システム。
【請求項１４】
抗生物質無しで用いることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法であって、
（ｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列に関連して：
−幾つかの大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること、および／または
−幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること、
によって変更されたＤＮＡ配列を提供するための方法を行う工程；ならびに
（ｉｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列の実質的な部分内の全く変更されていない部位を維持する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
次の部分的な領域：翻訳開始領域、リボゾーム結合部位および開始コドンとリボゾーム結合部位との間の領域の一つ以上における５’−非翻訳領域内には変更が必要ではないことを特徴とする、ＤＮＡ配列がｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’非翻訳領域をさらに含む、請求項１５に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１７】
（ｉｉ）によるところの全く変更されていない配列が、セグメントＩＩＩ内で少なくとも９９ヌクレオチドの長さの配列で維持されている、請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１８】
構築される該ＤＮＡ配列を、Ｔ７プロモーター配列を含むプラスミドベクター内に挿入する工程をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１９】
構築されるＤＮＡ配列が、適切な発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の発現レベルを与えることができる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または請求項６から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドを大腸菌で発現させる工程を含む、ｈＧ−ＣＳＦを発現させるための方法。
【請求項２１】
誘導するために、少なくとも０．１ｍＭから１ｍＭ未満の範囲の濃度、好ましくは約０．３から０．６ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いる、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現させるための方法。
【請求項２２】
約２０℃から３０℃、好ましくは２５℃程度の温度で行う発酵工程を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
有効成分としてｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物を製造するための方法であって：
（ａ）請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって得られるｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを単離および／または精製する工程、ならびに
（ｃ）単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、医薬適合性の担体または助剤と混合する工程、
を含む方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む配列であることを特徴とする、ｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
天然のｈＧ−ＣＳＦ配列に関連して次の修飾の組み合わせ：
−（ヌクレオチドの３位と１９４位との間の５’末端に位置する）「セグメントＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの置換およびＡＴに富む領域によるＧＣに富む領域の置換を含む複数の置換、
−（ヌクレオチドの１９４位と３０９位との間に位置する）「セグメントＩＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
−（ヌクレオチドの３０９位と４６７位との間に位置する）「セグメントＩＩＩ」において：変更の非存在または本質的に変更の非存在、
−（ヌクレオチドの４６７位と５３６位との間の３’末端に位置する）「セグメントＩＶ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
を含む群より選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項３】
生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードする、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の、発現後の全タンパク質に対するＧ−ＣＳＦの発現レベルを与えることができる、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子に対して変更されていないｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’−非翻訳領域をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
プラスミドが請求項１または５に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項７】
プラスミドが、請求項２から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項８】
プラスミドベクターがＴ７プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
プラスミドベクターがｐＥＴベクター類の群から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項１０】
プラスミドベクターが耐性遺伝子、好ましくはアンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
システムが請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１２】
システムが請求項７および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１３】
生産株が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の発現システム。
【請求項１４】
抗生物質無しで用いることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を構築する方法であって、
（ｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列に対して：
−幾つかの大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること、および／または
−幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること、
によって変更されたＤＮＡ配列を提供する方法を行う工程；ならびに
（ｉｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列の実質的な部分において全く非変更部分を維持する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列がｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’非翻訳領域をさらに含み、次の部分的な領域：翻訳開始領域、リボゾーム結合部位および開始コドンとリボゾーム結合部位との間の領域の一つ以上における５’−非翻訳領域内には変更を含まないことを特徴とする、請求項１５に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１７】
（ｉｉ）に従う全く非変更の配列が、セグメントＩＩＩ内で少なくとも９９ヌクレオチドの長さの配列で維持されている、請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１８】
構築された該ＤＮＡ配列を、Ｔ７プロモーター配列を含むプラスミドベクター内に挿入する工程をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１９】
構築されたＤＮＡ配列が、適切な発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の、発現後の全タンパク質に対する発現レベルを与えることができる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または請求項６から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドを大腸菌で発現させる工程を含む、ｈＧ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項２１】
誘導するために、少なくとも０．１ｍＭから１ｍＭ未満の範囲の濃度、好ましくは約０．３から０．６ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いる、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項２２】
約２０℃から３０℃、好ましくは約２５℃の温度で行う発酵工程を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現後の全タンパク質に対する発現レベルが少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
有効成分としてｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって得られるｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを単離および／または精製する工程、ならびに
（ｃ）単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、医薬適合性の担体または助剤と混合する工程、
を含む方法。
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む配列であることを特徴とする、ｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
（ａ）配列番号１の配列の一部；
（ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする核酸；および
（ｃ）天然のｈＧ−ＣＳＦ配列に関連して次の修飾の少なくとも一つ、好ましくはそれらの組み合わせ：
−（ヌクレオチドの３位と１９４位との間の５’末端に位置する）「セグメントＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの置換およびＡＴに富む領域によるＧＣに富む領域の置換を含む複数の置換、
−（ヌクレオチドの１９４位と３０９位との間に位置する）「セグメントＩＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
−（ヌクレオチドの３０９位と４６７位との間に位置する）「セグメントＩＩＩ」において：変更の非存在または本質的な変更の非存在、
−（ヌクレオチドの４６７位と５３６位との間の３’末端に位置する）「セグメントＩＶ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
を含む群より選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項３】
生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードする、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の発現レベルを与えることができる、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子に関連して変更されていないｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’−非翻訳領域をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
プラスミドが請求項１または５に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項７】
プラスミドが、請求項２から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項８】
プラスミドベクターがＴ７プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
プラスミドベクターがｐＥＴベクター類の群から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項１０】
プラスミドベクターが耐性遺伝子、好ましくはアンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
系が請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１２】
系が請求項７および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１３】
生産株が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の発現システム。
【請求項１４】
抗生物質無しで用いることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法であって、
（ｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列に関連して：
−幾つかの大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること、および／または
−幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること、
によって変更されたＤＮＡ配列を提供するための方法を行う工程；ならびに
（ｉｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列の実質的な部分内の全く変更されていない部位を維持する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
次の部分的な領域：翻訳開始領域、リボゾーム結合部位および開始コドンとリボゾーム結合部位との間の領域の一つ以上における５’−非翻訳領域内には変更が必要ではないことを特徴とする、ＤＮＡ配列がｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’非翻訳領域をさらに含む、請求項１５に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１７】
（ｉｉ）によるところの全く変更されていない配列が、セグメントＩＩＩ内で少なくとも９９ヌクレオチドの長さの配列で維持されている、請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１８】
構築される該ＤＮＡ配列を、Ｔ７プロモーター配列を含むプラスミドベクター内に挿入する工程をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項１９】
構築されるＤＮＡ配列が、適切な発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の発現レベルを与えることができる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築するための方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または請求項６から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドを大腸菌で発現させる工程を含む、ｈＧ−ＣＳＦを発現させるための方法。
【請求項２１】
誘導するために、少なくとも０．１ｍＭから１ｍＭ未満の範囲の濃度、好ましくは約０．３から０．６ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いる、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現させるための方法。
【請求項２２】
約２０℃から３０℃、好ましくは２５℃程度の温度で行う発酵工程を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
有効成分としてｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物を製造するための方法であって：
（ａ）請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって得られるｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを単離および／または精製する工程、ならびに
（ｃ）単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、医薬適合性の担体または助剤と混合する工程、
を含む方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む配列であることを特徴とする、ｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
天然のｈＧ−ＣＳＦ配列に関連して次の修飾の組み合わせ：
−（ヌクレオチドの３位と１９４位との間の５’末端に位置する）「セグメントＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの置換およびＡＴに富む領域によるＧＣに富む領域の置換を含む複数の置換、
−（ヌクレオチドの１９４位と３０９位との間に位置する）「セグメントＩＩ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
−（ヌクレオチドの３０９位と４６７位との間に位置する）「セグメントＩＩＩ」において：変更の非存在または本質的に変更の非存在、
−（ヌクレオチドの４６７位と５３６位との間の３’末端に位置する）「セグメントＩＶ」において：大腸菌の優先的コドンによる大腸菌の希有コドンの複数の置換、
を含む群より選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項３】
生物学的に活性なＧ−ＣＳＦをコードする、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の、発現後の全タンパク質に対するＧ−ＣＳＦの発現レベルを与えることができる、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
天然のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子に対して変更されていないｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’−非翻訳領域をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
プラスミドが請求項１または５に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項７】
プラスミドが、請求項２から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列とプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
【請求項８】
プラスミドベクターがＴ７プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
プラスミドベクターがｐＥＴベクター類の群から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項１０】
プラスミドベクターが耐性遺伝子、好ましくはアンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
システムが請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１２】
システムが請求項７および８から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ配列を発現させるための発現システム。
【請求項１３】
生産株が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の発現システム。
【請求項１４】
抗生物質無しで用いることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を構築する方法であって、
（ｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列に対して：
−幾つかの大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること、および／または
−幾つかのＧＣに富む領域をＡＴに富む領域で置換すること、
によって変更されたＤＮＡ配列を提供する方法を行う工程；ならびに
（ｉｉ）ｈＧ−ＣＳＦをコードする天然の配列の実質的な部分において全く非変更部分を維持する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列がｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の５’非翻訳領域をさらに含み、次の部分的な領域：翻訳開始領域、リボゾーム結合部位および開始コドンとリボゾーム結合部位との間の領域の一つ以上における５’−非翻訳領域内には変更を含まないことを特徴とする、請求項１５に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１７】
（ｉｉ）に従う全く非変更の配列が、セグメントＩＩＩ内で少なくとも９９ヌクレオチドの長さの配列で維持されている、請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１８】
構築された該ＤＮＡ配列を、Ｔ７プロモーター配列を含むプラスミドベクター内に挿入する工程をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項１９】
構築されたＤＮＡ配列が、適切な発現システムにおいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％の、発現後の全タンパク質に対する発現レベルを与えることができる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を構築する方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または請求項６から１０のいずれか１項に記載の発現プラスミドを大腸菌で発現させる工程を含む、ｈＧ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項２１】
誘導するために、少なくとも０．１ｍＭから１ｍＭ未満の範囲の濃度、好ましくは約０．３から０．６ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いる、請求項２０に記載のｈＧ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項２２】
約２０℃から３０℃、好ましくは約２５℃の温度で行う発酵工程を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現後の全タンパク質に対する発現レベルが少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５２％である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
有効成分としてｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって得られるｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを単離および／または精製する工程、ならびに
（ｃ）単離および／または精製されたｈＧ−ＣＳＦまたは生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを、医薬適合性の担体または助剤と混合する工程、
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１２０８９（Ｐ２００６−５１２０８９Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６０６９（Ｐ２００５−５０６０６９）
【出願日】平成１５年７月２８日（２００３．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００８３０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１３１７５
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２８日（２００３．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００８３０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１３１７５
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
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