媒体中の含有が疑われる少なくとも１つの分析物を検索する方法
【課題】
本発明は、プローブに結合される分析物の存在を検索する、新規方法に関する。
【解決手段】
回折システム（２）を構成する周期的幾何学パターン（２４）が、プローブＡを有する領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有して形成される。上記回折システム（２）は、感作工程、すなわちプローブを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前に回折性があるように作成される。上記方法は、少なくとも以下の工程：
‐未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
‐プローブＡを感作し、
‐回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
‐測定された強度Ｐ１及びＰ１ａを比較する、
ことを特徴とする。
本発明は、プローブに結合される分析物の存在を検索する、新規方法に関する。
【解決手段】
回折システム（２）を構成する周期的幾何学パターン（２４）が、プローブＡを有する領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有して形成される。上記回折システム（２）は、感作工程、すなわちプローブを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前に回折性があるように作成される。上記方法は、少なくとも以下の工程：
‐未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
‐プローブＡを感作し、
‐回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
‐測定された強度Ｐ１及びＰ１ａを比較する、
ことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物検出の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、媒体中の存在が疑われる少なくとも１つの分析物の存在を検索する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
媒体中の生物学的または有機物質の存在を検出することは、特に、多くの疾患の診断において重要な工程である。
【０００３】
この検出に通常使用される方法は、分析物、すなわち検出される物質と、この分析物に特異的に結合できる物質である、プローブと称される分析物に特異的な補体との間の特異的な結合反応を形成することに基づいている。
【０００４】
通常、上記のように形成された反応は、分析物と関連付けられたマーカー、例えば、蛍光マーカーにより強調される。
【０００５】
分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを接触させた後、その特異的な反応を、蛍光マーカーを励起させ、マーカーにより再発光された蛍光を検出することにより測定する。
【０００６】
しかし、マーカーの存在に加えて、蛍光検出には、特異的な相互作用、すなわち、分析物と補体との結合が起きたかどうかを決定するために測定の陰性コントロールが必要である。
【０００７】
形成された反応を強調する他の方法として、回折格子が使用される。
【０００８】
格子を光源で照らした場合、光線は格子により回折され、回折パターンが作成されることが知られている。観察される回折場は、特に、格子の特性、例えば、格子の間隔と厚みに左右される。
【０００９】
特許文献１には、媒体中の含有が疑われる分析物を検出する方法の例が記載されている。上記発明によれば、分析物の含有が疑われる媒体と一時的に接触させる前は非回折性であり、分析物との特異的な結合反応が形成されると回折性があるように、プローブを有する格子が作成されている。プローブに分析物が結合すると、格子の特性、特に、その厚みを変化させ、それにより回折場を形成する。
【００１０】
特許文献２には、特許文献１に記載の原理に基づく分析物の検出装置および方法が記載されている。格子の作成に使用されるリソグラフィー技術は、１マイクロメーター以上の格子周期による、マイクロメーターのスケールである。これにより、次数の異なる回折光を小さな角度差により分離するものであるが、複雑な検出装置が必要である。上記発明は、構造化基板を使用するために平坦でなく、格子の形成が複雑になるという問題も有する。さらに、上記発明には、２つの格子を重ねて、異なる２つの分析物を検出することも可能であると記載されている。２つの格子はそれぞれ、空間的に異なる回折次数により異なる回折場を形成する。したがって、各格子に対応する分析物を検出するためには、各回折場の回折光を特異的に測定する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ特許４８７６２０８公報
【特許文献２】ＵＳ２００２／００２５５３４明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、プローブに結合される分析物の存在を検索する新しい方法を提案するものであり、回折システムを構成する規則的な幾何学的パターンは、プローブＡと称されるプローブを有する領域とプローブＡを有さない領域とが交互に形成されることによりなる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、回折システムは、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程の前には回折性があるように作成される。本方法は少なくとも以下の工程を有する。
ａ）未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
ｂ）プローブＡを感作し、
ｃ）回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
ｄ）上記の順に行われた工程で測定された光の強度Ｐ１及びＰ１ａを比較する。
【００１４】
本発明によれば、周期的幾何学パターンの周期ｐは、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲であって、一次回折光のみが可視光である。幾何学パターンを作成するリソグラフィー技術はナノスケールの技術として知られている。
【００１５】
好ましくは、上記比較は、感度Ｓと称される、信号の相対的な変化を下記式を用いて決定することにより行われる。
【００１６】
【数１】
【００１７】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
‐ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ２より小さい場合、プローブＡ上に分析物が存在しないことを示し、
‐ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、プローブＡ上に分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す。
【００１８】
上記方法の特定の実施では、プローブＡを有さない周期的幾何学パターンの領域が、プローブＡが感受性を示さない分析物に感受性を示すプローブＢを基本的に有する場合、ｂ）工程においてプローブＢの感作も行われる。感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
‐ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ２より小さい場合、プローブＢ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す。
【００１９】
本方法の１つの実施形態では、一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａそれぞれを、感作工程の前後に測定されたそれぞれの入力光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａの強度により、測定が行われている間に標準化する。
【００２０】
好ましくは、本方法に関連する装置の感度を改良するために、回折システムを以下のように設計する。
‐周期的幾何学パターンの周期ｐは、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲にあり、
‐プローブＡを有する周期的幾何学パターン領域の幅と周期ｐの比率を定義する充足率ｒを０．５以下とし、
‐プローブを有する回折システム（２）の周期的幾何学パターン領域を、プローブを有する厚さがｅｓの特異層（２５）と呼ばれる分析物が結合する層と、厚さがｅｃの結合層（２６）と呼ばれるプローブを固定する層とにより形成する。
【００２１】
本方法に関連する装置の感度の改良に加え、幾何学パターンの周期をλ〜２λの範囲にすることにより、単一の一次回折光を得ることができ、これによりさらに、ゼロオーダーの高度角分離とすることができる。具体的な実施例では、実質的に１μｍの周期の回折システムに対して、６３３ｎｍの波長では、角度β１は実質的に４０度である。
【００２２】
好ましくは、結合層は、厚さｅｃが０〜５００ｎｍであるように形成する。
【００２３】
好ましくは、特異層は、ｅｓ／ｅanalyte比が１より小さくなるように形成する。ここで、ｅanalyteは、感作工程後にプローブ上に配置された分析物層の厚さである。
【００２４】
本発明に係わる方法の一実施形態では、ｂ）及びｃ）工程を同時に行う。
【００２５】
本方法の一実施例では、回折システムを、入射光を反射することができる物質により形成する。
【００２６】
本方法の他の実施例では、回折システムを、入射光を透過させることができる物質により形成する。
【００２７】
好ましくは、回折システムを、可視及び赤外スペクトルから選択される波長λで、レーザーなどの平行化単色光源により照射する。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも１つのプローブを有する幾何学パターンを基板上に有する、本方法を実施するための回折システムに関する。
【００２９】
好ましくは、基板は、平らで、例えば、ガラス、シリコン、またはプラスチックなどの物質により形成される。
【００３０】
本発明はまた、コヒーレント入射光を使用して回折システムを照射する手段を有する、回折システムを形成しているプローブに結合される分析物の存在を検索するための装置に関する。本装置はまた、
‐上記回折システムによる入射光の回折後に、一次回折光の強度を測定する手段、
‐単一の回折システムにより、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前後において測定された一次回折光の強度を比較して、感度Ｓと称される信号の相対的変化を計算する手段、及び
‐感度Ｓを特徴付ける情報を提供する手段、を有する。
【００３１】
本発明はまた、少なくとも１つのプローブを有する複数の回折システムを基材の表面に並置した、分析チップに関する。
【００３２】
一実施例においては、分析チップは、周期的幾何学パターン、及び／または、プローブの少なくとも１つが異なる、少なくとも２つの回折システムを有する。
【００３３】
本発明を、図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】格子上の回折の原理を説明する図である。
【図２ａ】感作工程前の本発明に係る回折システムの断面図である。
【図２ｂ】感作工程後の本発明に係る回折システムの断面図である。
【図３ａ】プローブの異なる指標に対する、本発明に係る回折システムの結合層の厚さｅｃの関数としての回折光の強度を示す図である。
【図３ｂ】プローブの異なる指標に対する、本発明に係る回折システムの結合層の厚さｅｃの関数としての感度を示す図である。
【図４】プローブを有する特異層の厚さｅＳと本発明に係る分析物ｅanalyteの厚さの比の関数としての感度を示す図である。
【図５ａ】本発明に係る充足率の関数としての感度を示す図である。
【図５ｂ】プローブ上に結合している分析物の第１の例を示す回折システムの断面図である。
【図６】本発明に係る分析物を検索する測定装置の模式図である。
【図７ａ】感作工程後の、実験的に作成した回折システムの模式図である。
【図７ｂ】図７ａの回折システムの結合層の厚さの関数としての感度を示す図である。
【図８ａ】感作工程後の、実験的に作成した回折システムの模式図である。
【図８ｂ】図８ａの回折システムの結合層の厚さの関数としての感度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明に係る方法は、プローブと呼ばれる受容体を使用し、回折システムを形成して、媒体中に含有することが疑われる分析物の存在を検索することからなる。
【００３６】
「分析物」とは、検出される物質を意味する。
【００３７】
検出される分析物としては、例えば、
‐細菌、酵母菌、抗体、糖類、ペプチド、揮発性有機化合物などの生物学的物質、
‐殺虫剤、糖類、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、医薬物質などの化学または生化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「プローブ」とは、分析物に特異的な補体、分析物に親和性を有する物質、分析物に特異的に結合できる物質を意味する。この物質は、例えば、
‐細胞、または細菌などの微生物等の生物学的物質、
‐シランなどの分子、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミド、タンパク質、抗体、オリゴサッカライド、ポルサッカライドなどの生物分子等の化学または生物学的物質、
‐分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）などの合成物質、
‐プルシアンブルー類似体、鉄系配位重合体（例えば、ＦｅＩＩ（ピラジン）、（Ｐｔ（ＣＮ）４））などの双安定物質、である。
【００３９】
本発明によれば、図１に記載のように、プローブＡと称されるプローブを有する回折システム２を、波長λのコヒーレント入射光３１で照射する。回折システム２は、基板２３上に配置され、プローブＡを有する浮き彫り状の領域と、プローブＡを有さない領域とを交互に有した、周期的幾何学パターン２４により形成され、プローブＡに結合する分析物を含有すると思われる。
【００４０】
入射光３１は、回折システム２の回折表面２１に対する法線２０に対して角度αをなす。
【００４１】
コヒーレント入射光３１は、回折光４１を生成する回折システム２と相互作用し、法線２０に対して角度β１を形成する。各角度β１は、回折システム２により作成される回折場の一次回折次数に対応する（図１では、例えば、角度β１である一次回折光のみを示す）。
【００４２】
回折光は、各回折光の強度の測定値を与える、図示されない測定手段により測定される。各回折光の強度の測定値は、回折次数の増加とともに低下する。
【００４３】
回折システム上で入射光を回折させた後に得られた回折場は、特に、回折システムの幾何学特性に依存する。幾何学特性は、回折システム２のプローブ上に分析物が存在するか否かに依存して変化する。
【００４４】
本方法によれば、回折システムがプローブに結合する可能性のある分析物との接触にさらされる前に、第１工程において、一次回折光の強度Ｐ１の第一の測定を行う。
【００４５】
感作工程と呼ばれる第２工程では、プローブＡを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させる。感作工程では、分析物が存在する場合にプローブＡに結合する。
【００４６】
感作工程は従来の方法、例えば、回折システムを媒体中に浸すか、または媒体をマイクロピペットなどでプローブ上に滴下した後、乾燥するなどの方法で行われるので、ここではその説明を省略する。
【００４７】
第３工程では、感作工程後に得られた回折システムを使用して、一次回折光の強度Ｐ１ａを測定する。
【００４８】
この第３工程では、回折システム２を再度、法線２０に対して同じ角度αをなすコヒーレント入射光３１で照射する。
【００４９】
本発明に係る方法の特定の実施形態では、感作工程である第２工程を、プローブを液体に浸すことによって行い、第２及び第３工程を、その成果を変化させることなく、同時に行うことができる。
【００５０】
第４工程では、２つの強度Ｐ１及びＰ１ａの測定値を比較して、回折システム上、すなわち、媒体中に分析物が存在するか否かを推測する。
【００５１】
２つの強度の値を比較して、感度Ｓと称される信号（代数値）の相対的変化を、次のように決定する。
【００５２】
【数２】
【００５３】
上記式から、閾値Ｓ１及びＳ２は、以下のように決定される。
‐Ｓ＞Ｓ１の場合、分析物はプローブＡ上に存在すると判断され、
‐Ｓ＜Ｓ２の場合、分析物はプローブＡ上に存在しないと判断され、
‐Ｓ２＜Ｓ＜Ｓ１の場合、プローブＡ上に分析物が存在かどうかを決定することができない。
最後のケースでは、必要に応じて操作手順を補正して、違う測定を行うことが求められる。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、周期的幾何学パターンのプローブＡを有さない領域は、基本的にプローブＢを有する。
【００５５】
上記プローブＢは、プローブＡが感受性を有さない分析物に対して感受性を有する。
【００５６】
本発明に係る方法により、媒体中に含有が疑われる２つの分析物の１つの存在を検索することができる。
【００５７】
２つの分析物の検出は、一次回折光である単一の回折光により実現できる。
【００５８】
２つの異なる分析物の検出は鑑別と称される。
【００５９】
この感度Ｓもまた式（１）により定義される。
【００６０】
閾値Ｓ１及びＳ２は、以下のように決定される。
‐Ｓ＞Ｓ１の場合、分析物はプローブＡ上に存在すると判断され、
‐Ｓ＜Ｓ２の場合、分析物はプローブＢ上に存在すると判断され、
‐Ｓ２＜Ｓ＜Ｓ１の場合、プローブＡまたはプローブＢ上に分析物が存在かどうかを決定することができない。
最後のケースでは、必要に応じて操作手順を補正して、違う測定を行うことが求められる。
【００６１】
閾値Ｓ１及びＳ２は、回折システムの幾何学特性、入射光の波長、入射角、入射光の形状、基板指標、基板粗さなど、全て、測定の正確さに影響する多数のパラメーターにより、実験的に決定することができる。
【００６２】
好ましくは、閾値Ｓ１は実質的に５％に等しく、閾値Ｓ２は実質的に−５％に等しい。
【００６３】
放射された入射光の強度の変動もまた、不確かさをもたらすため、感作工程の前後の回折光強度の測定時の補正値を考慮にいれる。
【００６４】
上記変動を補うための方法として実施される手段は、感作工程の前後に測定された一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａのそれぞれを、それぞれの入射光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａにより標準化することにより行うものである。回折光の強度を測定する際に入射光の強度を同時に測定するために、本方法に関連する測定装置の感度を余り下げない程度に、入射光の強度のγ部、例えば、１０〜２０％を集める。
【００６５】
従って、感度Ｓは以下のように表現される。
【００６６】
【数３】
【００６７】
回折光の角度値が法線２０または互いに近すぎると、方法の実施を困難にする。
【００６８】
回折光の角度を広くする方法に採用される手段は、好ましくは４００〜１２００ｎｍの範囲の波長を使用することを前提として、λ〜２λの範囲の周期ｐ、好ましくは１μｍ、を有する回折システムを使用することからなる。
【００６９】
好ましくは、さらに、入射光３１が回折システム２に対して法線入射（α＝０）で放射される場合、一次回折光のみが目に見える。一次回折光の角度β１が十分広い（例えば、実質的に１μｍの周期の回折システム及び６３３ｎｍの波長に対して、角度β１は実質的に４０度である）場合、反射及び回折光の角度的及び空間的分離を可能にする。
【００７０】
一次回折光のみを取得することにより、最大回折の強度は一次回折光１に位置し、信号対ノイズ比を改良する。
【００７１】
さらに、感作工程後における回折システムの幾何学特性の変化は、プローブ上の分析物の存在と一致し、一次光の強度レベルにのみ反映され、いくつもの高次光に分散されない。
【００７２】
本方法を実施する回折システム２は、図２ａに示すように、基板２３の表面２３１上に、ｎｓｕｂインデックスで配置された、プローブＡを有する浮き彫り状の領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有する、周期的幾何学パターン２４を有する。
【００７３】
プローブＡを有する浮き彫り状の平行線２４からなる格子の場合の回折システムを詳細に説明する。この選択に限定されるものではなく、他の周期的幾何学パターン、例えば、グリッドなどの二次元の格子や、光を回折することが可能な複雑な幾何学的図形などの周期的幾何学パターンも使用することができる。
【００７４】
好ましくは、方法の感度を上げるためには、格子線はナノスケールとする。
【００７５】
好ましい実施形態では、図１から２ｂに示されるように、基板２３は、平坦な表面２３１を有する。
【００７６】
基板２３は、例えば、ガラス、シリコンまたは金材料により形成される。
【００７７】
好ましくは、プローブＡを有する線状部分は、銃眼状の断面を有するが、正弦状や三角形の断面など、その他の断面を有することもできる。
【００７８】
格子は上述のように、周期ｐを有し、線状部の幅をｌ、充足率をｒとすると、幅ｌと周期ｐの間の比：ｒ＝ｌ／ｐが定義される。
【００７９】
充足率ｒは、感度Ｓと回折光の強度とのバランスである。充足率ｒが低下すると、感度Ｓは上昇するが、回折光は弱くなり、回折光の強度の測定が困難になる。
【００８０】
好ましくは、回折光の強度を十分な値に保ちながら方法の感度Ｓを改良するためには、格子を充足率ｒが０．５未満になるような大きさに形成する。
【００８１】
浮き彫り状の平行線２４は、厚さｅＣとインデックスｎＣを有する結合層２６と称される第一の層を有する。
【００８２】
接着層は、プローブＡを固定することができる物質を有する。
【００８３】
装置の感度Ｓを改善するためには、結合層２６の物質としては、結合層上のプローブＡをその表面に結合させることができるような物質を選択する。「表面に結合」とは、基板２３に対して反対側の結合層の上面２６１、及び上記結合層の側面２６２に結合することを意味する。
【００８４】
このような物質としては、例えば、以下のようなものがある。
‐基板がシリコンの場合には、シラン
‐基板が金の場合には、チオール
‐糖類
‐デンドリマー
‐金属ナノアイランド
‐ナノ粒子
‐ＭＩＰ
‐双安定物質
【００８５】
接着層の厚さｅｃは、感度Ｓと回折光の強度とのバランスである。厚さｅｃが上昇すると、回折光が強くなるが、感度Ｓが低下する。
【００８６】
有利には、厚さｅｃは０ｎｍから５００ｎｍの範囲であり、好ましくは、実質的に５ｎｍオーダーである。
【００８７】
浮き彫り状の平行線２４は、分析物と結合させるためにプローブＡを有する特異層２５と称される厚さｅＳとインデックスｎＳを有する第二の層を有する。
【００８８】
厚さｅＳは、感作工程後の特異層２５上に配置されている可能性のある分析物層２８（図２ｂ）の厚さｅanalyteとに関連して決められる。比ｅＳ／ｅanalyteは、感度Ｓと回折光の強度のバランスである。比ｅＳ／ｅanalyteが低下すると、感度Ｓは上昇するが、回折光は弱くなる。
【００８９】
好ましくは、回折光の強度を十分に保ったまま、装置の感度Ｓを改良するためには、特異層の厚さｅＳは、比ｅＳ／ｅanalyteが１より小さくなるような大きさにする。
【００９０】
有利には、特異層２５の厚さｅＳは０．５ｎｍから１５０ｎｍの範囲であり、好ましくは、実質的に１０ｎｍオーダーである。
【００９１】
第１の実施例では、図２ａ及び２ｂに示されるように、格子２は平行線２４の間に、厚さｅＰの保護層２７と称される基板２３を覆う層を有する。この保護層は、分析物へのプローブの接着選択性を上昇させることができる物質からなる。分析物へのプローブの接着選択性を上昇させることにより、装置の感度が改善される。
【００９２】
具体的な実施例では、保護層はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）またはエタノールアミンである。
【００９３】
結合層の結合表面を低下させないために、保護層の厚さｅＰは結合層の厚さｅＣに比較して小さく、例えば、数オングストロームのオーダーである。
【００９４】
さらに複雑な実施形態では、図示しないが、格子２は、平行線２４の間に、基板を覆い、プローブＡが感受性を有さない分析物を結合させるために、プローブＢ及びプローブＢの固定層を有する、第２特異層と称される層を有する。
【００９５】
好ましくは、２種の分析物を区別して効率的に検出するためには、プローブＡ上に配置された分析物層２８の厚さｅanalyteは、少なくとも１ｎｍより小さいか、プローブＢ上に配置された分析物層の厚さよりも少なくとも１ｎｍ以上大きい。
【００９６】
有利には、この実施形態では、充足率ｒは実質的に０．５である。
【００９７】
一実施形態では、線状の格子は線状の反射格子であり、基板は使用される波長λに対して光透過性であることが好ましい。
【００９８】
他の実施形態では、線状の格子は線状の反射格子であり、基板は使用される波長λに対して光透過性でないことが好ましい。
【実施例１】
【００９９】
［結合層厚さｅＣシミュレーション］
実施例１は、図３ａ及び３ｂから、感度Ｓと感作工程前の標準化した一次回折光の強度Ｐ１／Ｐｉｎｃとのバランスを、結合層２６の厚さｅＣを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
プローブＡのｎＳインデックスが何であっても、結合層の厚さｅＣが増加すると、感作工程前の標準化した一次回折光の強度Ｐ１／Ｐｉｎｃは大きくなるが（図３ａ）、感度Ｓは急速に低下する（図３ｂ）。
【実施例２】
【０１０２】
［比ｅＳ／ｅanalyteの関数としての感度Ｓのシミュレーション］
実施例２は、図４から、回折システムの比ｅＳ／ｅanalyteの関数としての感度Ｓを、特異層の厚さｅＳを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
異なる曲線が同じ分析結果を示し、比ｅＳ／ｅanalyteが１未満であれば、感度Ｓが改善されることが確認された。
【実施例３】
【０１０５】
［充足率ｒと感度Ｓのシミュレーション］
実施例３は、図５ａから、回折システムの充足率ｒの関数としての感度Ｓを、周期ｐを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
曲線１は、（図５ｂに示されるように）結合層の上部のみにプローブＡが結合されている場合を説明する。回折システムの充足率及び周期にかかわりなく、感度Ｓは一定に保たれることが確認された。
【０１０８】
曲線２は、（図２ｂに示されるように）結合層の全体（上部及び側面）にプローブＡが結合されている場合を説明する。回折システムの周期ｐにかかわりなく、充足率ｒが０．５未満であれば感度Ｓが改善されることが確認された。
【実施例４】
【０１０９】
［感度Ｓの実験的測定］
実施例４は、図７ａ及び７ｂから、結合層の厚さを変えて、下記のパラメーターに対して実験的に得られた感度Ｓについて説明する。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
この実施例４では、基板はシラン処理したガラスである。結合層はストレプトアビジン層である。プローブＡはビオチン化プロテインＡである。分析物は、抗プロテインＡ抗体である。
【０１１２】
一次回折光の角度は４０度である。
【０１１３】
図７ａは、本方法を実施するための回折システムを模式的に示している。回折システムは１０００ｎｍの周期を有し、それぞれ幅が５００ｎｍの４００の線状部からなる。回折システムを形成する第１工程は、分子バッファリングにより結合層２６を付着させることからなる。第２工程では、プローブ分子のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液と称されるリン酸緩衝食塩水で洗浄する。最後の工程では、分析物のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する。
【０１１４】
下記の２つの相互作用が観察される。
‐分析物とプローブＡとの間の第１相互作用（特異的相互作用）
‐分析物と基板との間の第２相互作用
【０１１５】
図７ｂは、結合層と相違する、異なる厚さｅＣ（厚さは１．５ｎｍから２．５ｎｍの範囲にある）を有する４つの格子について得られた感度を示す。
【０１１６】
シミュレーション（図３ｂ）と同様に、結合層の厚さｅＣが小さくなると、感度Ｓが上昇することが確認できる。また、感度Ｓは陽性である。
【実施例５】
【０１１７】
［感度Ｓの実験的測定］
実施例５は、図８ａ及び８ｂから、結合層の厚さを変えて、下記のパラメーターに対して実験的に得られた感度Ｓについて説明する。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
この実施例５では、基板はシラン処理したガラスである。結合層はストレプトアビジン層である。分析物は、抗プロテインＡ抗体である。
【０１２０】
一次回折光の角度は４０度である。
【０１２１】
図８ａは、本方法を実施するための回折システムを模式的に示している。回折システムは１０００ｎｍの周期を有し、それぞれ幅が５００ｎｍの４００の線状部からなる。回折システムを形成する第１工程は、分子バッファリングにより結合層２６を付着させることからなる。第２工程では、分析物のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液での洗浄を行う。プローブ分子のインキュベーション工程を有さない。
【０１２２】
下記の２つの相互作用が観察される。
‐分析物と結合層との間の第１相互作用
‐分析物と基板との間の第２相互作用
【０１２３】
図８ｂは、結合層と相違する、異なる厚さｅＣ（厚さは１．５ｎｍから２．５ｎｍの範囲にある）を有する６つの格子について得られた感度を示す。
【０１２４】
感度Ｓは陰性であることが認められる。実際、分析物と結合層との間の相互作用は、実質的に存在しない。分析物と基板との間の相互作用が主として認められる。したがって、線状部と分析物との間に相互作用がない場合には、感度Ｓが陰性である。
【０１２５】
この実施例は、１つの測定で２つの相互作用を測定することが可能であることを示している。
【０１２６】
回折システム２を形成しているプローブに結合される分析物の含有が疑われる媒体中の上記分析物を検索するための測定装置１は、図６に示すように、
‐コヒーレント入射光３１で回折システム２を照射する手段、
‐一次回折光３１の強度を測定する手段５、
‐回折システム２により回折光３１を回折した後の、一次回折光４１の強度を測定する手段４、
‐感度Ｓを計算する手段６、及び
‐得られた情報を表示する手段７、を有する。
【０１２７】
回折システム２を、λ〜２λの範囲にある周期的幾何学パターンの周期ｐで、一次回折光のみが可視光となるように形成することにより、回折光を分離するためのプリズムなどの光学スプリッターを使用する必要がない。したがって、測定装置はコスト及び簡易さの双方を達成できる。
【０１２８】
光照射手段３は、光源３２を有する。
【０１２９】
有利には、光源の波長λは可視〜赤外の範囲である。
【０１３０】
具体的な実施例では、光源の波長λは実質的に６３３ｎｍのオーダーである。
【０１３１】
具体的な実施例では、光源３２は連続またはパルス単色光源である。
【０１３２】
好ましくは、光源３２は、レーザーダイオードやヘリウムネオンレーザーなどのレーザーである。
【０１３３】
具体的な実施例では、光源３２は、白色光である。光照射手段３はさらに、所望の波長のための（図示せず）少なくとも１つの選択フィルターと入射光を平行化するための（図示せず）平行光学系を有する。
【０１３４】
測定手段４、５は、それぞれ少なくとも１つの検出器４２、５１を有する。検出器５１は、例えば半反射鏡９を使って入射光を遮り、検出器４２は、一次回折光を遮る。
【０１３５】
検出器４２、５１はそれぞれ検出器により伝達された測定信号を処理することができる処理手段４３、５３に接続されている。処理手段５３は、入射光の強度の値を提供し、処理手段４３は、一次回折光の強度の値を提供する。
【０１３６】
検出器は、例えば、フォトダイオードや少なくとも１つの光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）などの感光素子である。
【０１３７】
具体的な実施例では、光は、光ファイバーなどの導波管を介して検出器へ導かれる。
【０１３８】
一実施形態では、単一の測定手段が、入射光の強度と回折光の強度を測定する２つの測定手段４及び５を提供する。
【０１３９】
計算手段６は、測定手段４及び５に接続され、感度Ｓの値を決定する。
【０１４０】
例えば、計算手段は、感度Ｓを計算することができる少なくとも１つのコンピューターを有する。
【０１４１】
情報表示手段７は、計算手段６に接続され、特に、感度Ｓを特徴付けする。
【０１４２】
情報表示手段７は、例えば、分析物の存在、不存在または存在の不確実さを報告する表示手段７１を有する。
【０１４３】
具体的な実施例では、回折システムがプローブＡを有する場合、表示手段７１は、感度Ｓの値に依存して点滅または点灯する一連の３つのダイオードを有し、
‐緑のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在することを意味し、
‐赤のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在しないことを意味し、
‐黄色のダイオードは、分析物が存在するか否か不確実であることを意味する。
【０１４４】
回折システムがプローブＡ及びプローブＢを有する場合、表示手段７１は、感度Ｓの値に依存して点滅または点灯する一連の３つのダイオードを有し、
‐緑のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在することを意味し、
‐赤のダイオードは、プローブＢ上に分析物が存在することを意味し、
‐黄色のダイオードは、分析物がプローブＡまたはプローブＢのいずれかに存在するか否か不確実であることを意味する。
【０１４５】
好ましくは、情報表示手段７はさらに、感作工程前の信号対ノイズ比を示す回折量の指標を有する。
【０１４６】
具体的な他の実施例では、表示手段７１は、回折光の強さにより色分けされた、回折システムの画像である。例えば、感度ＳがＳ１より大きい場合には、回折光の強さとともに青色の強さが上昇し、感度ＳがＳ２より小さい場合には、回折光の強さが低下するとともに赤色の強さが上昇し、感度がＳ１とＳ２の間である場合には、黒色となる。
【０１４７】
本発明の一実施形態では、（プローブに結合される少なくとも１つの分析物の存在を検索する）複数の分析を、多数の回折システム上で短時間に実現する。分析チップは、基材の表面上に並置された複数の回折システムを有し、通常、例えば行と列のマトリックス状に規則的に配置される。上記回折システムは、例えば、測定装置を動かすか、基材を動かすか、またはそれらの動きを組み合わせて、基材の表面上の複数の回折システムを連続的にスイープして、上述の測定装置により、本発明の方法にしたがってそれぞれ測定される。各回折システムは、少なくとも１つのプローブを有し、特異的な特性を有する。
【０１４８】
第１の実施例では、重複する測定に対して、回折システムは同一である。
【０１４９】
第２の実施例では、少なくとも２つの回折システムは、周期的幾何学パターンが異なる。
【０１５０】
第３の実施例では、少なくとも２つの回折システムは、そのプローブの少なくとも１つが異なり、異なる分析物の存在を検索する。例えば、第１の回折システムは第１の分析物に結合するプローブにより形成され、第２の回折システムは、第１の分析物には感受性でない、異なる分析物に結合するプローブにより形成される。この第３の実施例では、好適なプローブを選択することにより、単一のチップ上で検索できる分析物の数を増やすことができる。
【０１５１】
第４の実施例では、少なくとも２つの回折システムにおいて、まず周期的幾何学パターンが相違し、次いでそのプローブの少なくとも１つが相違する。
【０１５２】
好ましくは、回折システムの全てを有する基材のマップが形成され、マップ上の各着色領域は、回折システムの位置に一致する。具体的な実施例では、色は、回折光の強さによる色分けに一致し、例えば、感度ＳがＳ１より大きい場合には、回折光の強さとともに青色の強さが上昇し、感度ＳがＳ２より小さい場合には、回折光の強さが低下するとともに赤色の強さが上昇し、感度がＳ１とＳ２の間である場合には、黒色となる。
【符号の説明】
【０１５３】
１ 一次回折光
２ 回折システム
３ 光照射手段
４ 強度測定手段
５ 強度測定手段
６ 感度計算手段
７ 情報表示手段
７１ 表示手段
９ 半反射鏡
２０ 法線
２１ 回折表面
２３ 基板
２３１ 表面
２４ 周期的幾何学パターン
２５ 特異層
２６ 結合層
２６１ 上面
２６２ 側面
２７ 保護層
２８ 分析物層
３１ コヒーレント入射光
３２ 光源
４１ 一次回折光
４２、５１ 検出器
４３、５３ 処理手段
Ａ プローブ
β１ 角度
λ 波長
Ｐ１、Ｐ１ａ （光の）強度
Ｓ 感度
Ｓ１、Ｓ２ 閾値
Ｂ プローブ
Ｐｉｎｃ、Ｐｉｎｃａ 入力光
ｐ 周期
α 法線入射
ｒ 充足率
ｌ 幅
ｅｃ （結合層）厚さ
ｅｐ （保護層）厚さ
ｎｓ インデックス
ｅｓ／ｅａｎａｌｙｔｅ 比
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物検出の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、媒体中の存在が疑われる少なくとも１つの分析物の存在を検索する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
媒体中の生物学的または有機物質の存在を検出することは、特に、多くの疾患の診断において重要な工程である。
【０００３】
この検出に通常使用される方法は、分析物、すなわち検出される物質と、この分析物に特異的に結合できる物質である、プローブと称される分析物に特異的な補体との間の特異的な結合反応を形成することに基づいている。
【０００４】
通常、上記のように形成された反応は、分析物と関連付けられたマーカー、例えば、蛍光マーカーにより強調される。
【０００５】
分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを接触させた後、その特異的な反応を、蛍光マーカーを励起させ、マーカーにより再発光された蛍光を検出することにより測定する。
【０００６】
しかし、マーカーの存在に加えて、蛍光検出には、特異的な相互作用、すなわち、分析物と補体との結合が起きたかどうかを決定するために測定の陰性コントロールが必要である。
【０００７】
形成された反応を強調する他の方法として、回折格子が使用される。
【０００８】
格子を光源で照らした場合、光線は格子により回折され、回折パターンが作成されることが知られている。観察される回折場は、特に、格子の特性、例えば、格子の間隔と厚みに左右される。
【０００９】
特許文献１には、媒体中の含有が疑われる分析物を検出する方法の例が記載されている。上記発明によれば、分析物の含有が疑われる媒体と一時的に接触させる前は非回折性であり、分析物との特異的な結合反応が形成されると回折性があるように、プローブを有する格子が作成されている。プローブに分析物が結合すると、格子の特性、特に、その厚みを変化させ、それにより回折場を形成する。
【００１０】
特許文献２には、特許文献１に記載の原理に基づく分析物の検出装置および方法が記載されている。格子の作成に使用されるリソグラフィー技術は、１マイクロメーター以上の格子周期による、マイクロメーターのスケールである。これにより、次数の異なる回折光を小さな角度差により分離するものであるが、複雑な検出装置が必要である。上記発明は、構造化基板を使用するために平坦でなく、格子の形成が複雑になるという問題も有する。さらに、上記発明には、２つの格子を重ねて、異なる２つの分析物を検出することも可能であると記載されている。２つの格子はそれぞれ、空間的に異なる回折次数により異なる回折場を形成する。したがって、各格子に対応する分析物を検出するためには、各回折場の回折光を特異的に測定する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ特許４８７６２０８公報
【特許文献２】ＵＳ２００２／００２５５３４明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、プローブに結合される分析物の存在を検索する新しい方法を提案するものであり、回折システムを構成する規則的な幾何学的パターンは、プローブＡと称されるプローブを有する領域とプローブＡを有さない領域とが交互に形成されることによりなる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、回折システムは、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程の前には回折性があるように作成される。本方法は少なくとも以下の工程を有する。
ａ）未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
ｂ）プローブＡを感作し、
ｃ）回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
ｄ）上記の順に行われた工程で測定された光の強度Ｐ１及びＰ１ａを比較する。
【００１４】
本発明によれば、周期的幾何学パターンの周期ｐは、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲であって、一次回折光のみが可視光である。幾何学パターンを作成するリソグラフィー技術はナノスケールの技術として知られている。
【００１５】
好ましくは、上記比較は、感度Ｓと称される、信号の相対的な変化を下記式を用いて決定することにより行われる。
【００１６】
【数１】
【００１７】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
‐ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ２より小さい場合、プローブＡ上に分析物が存在しないことを示し、
‐ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、プローブＡ上に分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す。
【００１８】
上記方法の特定の実施では、プローブＡを有さない周期的幾何学パターンの領域が、プローブＡが感受性を示さない分析物に感受性を示すプローブＢを基本的に有する場合、ｂ）工程においてプローブＢの感作も行われる。感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
‐ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ２より小さい場合、プローブＢ上に分析物が存在することを示し、
‐ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す。
【００１９】
本方法の１つの実施形態では、一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａそれぞれを、感作工程の前後に測定されたそれぞれの入力光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａの強度により、測定が行われている間に標準化する。
【００２０】
好ましくは、本方法に関連する装置の感度を改良するために、回折システムを以下のように設計する。
‐周期的幾何学パターンの周期ｐは、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲にあり、
‐プローブＡを有する周期的幾何学パターン領域の幅と周期ｐの比率を定義する充足率ｒを０．５以下とし、
‐プローブを有する回折システム（２）の周期的幾何学パターン領域を、プローブを有する厚さがｅｓの特異層（２５）と呼ばれる分析物が結合する層と、厚さがｅｃの結合層（２６）と呼ばれるプローブを固定する層とにより形成する。
【００２１】
本方法に関連する装置の感度の改良に加え、幾何学パターンの周期をλ〜２λの範囲にすることにより、単一の一次回折光を得ることができ、これによりさらに、ゼロオーダーの高度角分離とすることができる。具体的な実施例では、実質的に１μｍの周期の回折システムに対して、６３３ｎｍの波長では、角度β１は実質的に４０度である。
【００２２】
好ましくは、結合層は、厚さｅｃが０〜５００ｎｍであるように形成する。
【００２３】
好ましくは、特異層は、ｅｓ／ｅanalyte比が１より小さくなるように形成する。ここで、ｅanalyteは、感作工程後にプローブ上に配置された分析物層の厚さである。
【００２４】
本発明に係わる方法の一実施形態では、ｂ）及びｃ）工程を同時に行う。
【００２５】
本方法の一実施例では、回折システムを、入射光を反射することができる物質により形成する。
【００２６】
本方法の他の実施例では、回折システムを、入射光を透過させることができる物質により形成する。
【００２７】
好ましくは、回折システムを、可視及び赤外スペクトルから選択される波長λで、レーザーなどの平行化単色光源により照射する。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも１つのプローブを有する幾何学パターンを基板上に有する、本方法を実施するための回折システムに関する。
【００２９】
好ましくは、基板は、平らで、例えば、ガラス、シリコン、またはプラスチックなどの物質により形成される。
【００３０】
本発明はまた、コヒーレント入射光を使用して回折システムを照射する手段を有する、回折システムを形成しているプローブに結合される分析物の存在を検索するための装置に関する。本装置はまた、
‐上記回折システムによる入射光の回折後に、一次回折光の強度を測定する手段、
‐単一の回折システムにより、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前後において測定された一次回折光の強度を比較して、感度Ｓと称される信号の相対的変化を計算する手段、及び
‐感度Ｓを特徴付ける情報を提供する手段、を有する。
【００３１】
本発明はまた、少なくとも１つのプローブを有する複数の回折システムを基材の表面に並置した、分析チップに関する。
【００３２】
一実施例においては、分析チップは、周期的幾何学パターン、及び／または、プローブの少なくとも１つが異なる、少なくとも２つの回折システムを有する。
【００３３】
本発明を、図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】格子上の回折の原理を説明する図である。
【図２ａ】感作工程前の本発明に係る回折システムの断面図である。
【図２ｂ】感作工程後の本発明に係る回折システムの断面図である。
【図３ａ】プローブの異なる指標に対する、本発明に係る回折システムの結合層の厚さｅｃの関数としての回折光の強度を示す図である。
【図３ｂ】プローブの異なる指標に対する、本発明に係る回折システムの結合層の厚さｅｃの関数としての感度を示す図である。
【図４】プローブを有する特異層の厚さｅＳと本発明に係る分析物ｅanalyteの厚さの比の関数としての感度を示す図である。
【図５ａ】本発明に係る充足率の関数としての感度を示す図である。
【図５ｂ】プローブ上に結合している分析物の第１の例を示す回折システムの断面図である。
【図６】本発明に係る分析物を検索する測定装置の模式図である。
【図７ａ】感作工程後の、実験的に作成した回折システムの模式図である。
【図７ｂ】図７ａの回折システムの結合層の厚さの関数としての感度を示す図である。
【図８ａ】感作工程後の、実験的に作成した回折システムの模式図である。
【図８ｂ】図８ａの回折システムの結合層の厚さの関数としての感度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明に係る方法は、プローブと呼ばれる受容体を使用し、回折システムを形成して、媒体中に含有することが疑われる分析物の存在を検索することからなる。
【００３６】
「分析物」とは、検出される物質を意味する。
【００３７】
検出される分析物としては、例えば、
‐細菌、酵母菌、抗体、糖類、ペプチド、揮発性有機化合物などの生物学的物質、
‐殺虫剤、糖類、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、医薬物質などの化学または生化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「プローブ」とは、分析物に特異的な補体、分析物に親和性を有する物質、分析物に特異的に結合できる物質を意味する。この物質は、例えば、
‐細胞、または細菌などの微生物等の生物学的物質、
‐シランなどの分子、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミド、タンパク質、抗体、オリゴサッカライド、ポルサッカライドなどの生物分子等の化学または生物学的物質、
‐分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）などの合成物質、
‐プルシアンブルー類似体、鉄系配位重合体（例えば、ＦｅＩＩ（ピラジン）、（Ｐｔ（ＣＮ）４））などの双安定物質、である。
【００３９】
本発明によれば、図１に記載のように、プローブＡと称されるプローブを有する回折システム２を、波長λのコヒーレント入射光３１で照射する。回折システム２は、基板２３上に配置され、プローブＡを有する浮き彫り状の領域と、プローブＡを有さない領域とを交互に有した、周期的幾何学パターン２４により形成され、プローブＡに結合する分析物を含有すると思われる。
【００４０】
入射光３１は、回折システム２の回折表面２１に対する法線２０に対して角度αをなす。
【００４１】
コヒーレント入射光３１は、回折光４１を生成する回折システム２と相互作用し、法線２０に対して角度β１を形成する。各角度β１は、回折システム２により作成される回折場の一次回折次数に対応する（図１では、例えば、角度β１である一次回折光のみを示す）。
【００４２】
回折光は、各回折光の強度の測定値を与える、図示されない測定手段により測定される。各回折光の強度の測定値は、回折次数の増加とともに低下する。
【００４３】
回折システム上で入射光を回折させた後に得られた回折場は、特に、回折システムの幾何学特性に依存する。幾何学特性は、回折システム２のプローブ上に分析物が存在するか否かに依存して変化する。
【００４４】
本方法によれば、回折システムがプローブに結合する可能性のある分析物との接触にさらされる前に、第１工程において、一次回折光の強度Ｐ１の第一の測定を行う。
【００４５】
感作工程と呼ばれる第２工程では、プローブＡを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させる。感作工程では、分析物が存在する場合にプローブＡに結合する。
【００４６】
感作工程は従来の方法、例えば、回折システムを媒体中に浸すか、または媒体をマイクロピペットなどでプローブ上に滴下した後、乾燥するなどの方法で行われるので、ここではその説明を省略する。
【００４７】
第３工程では、感作工程後に得られた回折システムを使用して、一次回折光の強度Ｐ１ａを測定する。
【００４８】
この第３工程では、回折システム２を再度、法線２０に対して同じ角度αをなすコヒーレント入射光３１で照射する。
【００４９】
本発明に係る方法の特定の実施形態では、感作工程である第２工程を、プローブを液体に浸すことによって行い、第２及び第３工程を、その成果を変化させることなく、同時に行うことができる。
【００５０】
第４工程では、２つの強度Ｐ１及びＰ１ａの測定値を比較して、回折システム上、すなわち、媒体中に分析物が存在するか否かを推測する。
【００５１】
２つの強度の値を比較して、感度Ｓと称される信号（代数値）の相対的変化を、次のように決定する。
【００５２】
【数２】
【００５３】
上記式から、閾値Ｓ１及びＳ２は、以下のように決定される。
‐Ｓ＞Ｓ１の場合、分析物はプローブＡ上に存在すると判断され、
‐Ｓ＜Ｓ２の場合、分析物はプローブＡ上に存在しないと判断され、
‐Ｓ２＜Ｓ＜Ｓ１の場合、プローブＡ上に分析物が存在かどうかを決定することができない。
最後のケースでは、必要に応じて操作手順を補正して、違う測定を行うことが求められる。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、周期的幾何学パターンのプローブＡを有さない領域は、基本的にプローブＢを有する。
【００５５】
上記プローブＢは、プローブＡが感受性を有さない分析物に対して感受性を有する。
【００５６】
本発明に係る方法により、媒体中に含有が疑われる２つの分析物の１つの存在を検索することができる。
【００５７】
２つの分析物の検出は、一次回折光である単一の回折光により実現できる。
【００５８】
２つの異なる分析物の検出は鑑別と称される。
【００５９】
この感度Ｓもまた式（１）により定義される。
【００６０】
閾値Ｓ１及びＳ２は、以下のように決定される。
‐Ｓ＞Ｓ１の場合、分析物はプローブＡ上に存在すると判断され、
‐Ｓ＜Ｓ２の場合、分析物はプローブＢ上に存在すると判断され、
‐Ｓ２＜Ｓ＜Ｓ１の場合、プローブＡまたはプローブＢ上に分析物が存在かどうかを決定することができない。
最後のケースでは、必要に応じて操作手順を補正して、違う測定を行うことが求められる。
【００６１】
閾値Ｓ１及びＳ２は、回折システムの幾何学特性、入射光の波長、入射角、入射光の形状、基板指標、基板粗さなど、全て、測定の正確さに影響する多数のパラメーターにより、実験的に決定することができる。
【００６２】
好ましくは、閾値Ｓ１は実質的に５％に等しく、閾値Ｓ２は実質的に−５％に等しい。
【００６３】
放射された入射光の強度の変動もまた、不確かさをもたらすため、感作工程の前後の回折光強度の測定時の補正値を考慮にいれる。
【００６４】
上記変動を補うための方法として実施される手段は、感作工程の前後に測定された一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａのそれぞれを、それぞれの入射光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａにより標準化することにより行うものである。回折光の強度を測定する際に入射光の強度を同時に測定するために、本方法に関連する測定装置の感度を余り下げない程度に、入射光の強度のγ部、例えば、１０〜２０％を集める。
【００６５】
従って、感度Ｓは以下のように表現される。
【００６６】
【数３】
【００６７】
回折光の角度値が法線２０または互いに近すぎると、方法の実施を困難にする。
【００６８】
回折光の角度を広くする方法に採用される手段は、好ましくは４００〜１２００ｎｍの範囲の波長を使用することを前提として、λ〜２λの範囲の周期ｐ、好ましくは１μｍ、を有する回折システムを使用することからなる。
【００６９】
好ましくは、さらに、入射光３１が回折システム２に対して法線入射（α＝０）で放射される場合、一次回折光のみが目に見える。一次回折光の角度β１が十分広い（例えば、実質的に１μｍの周期の回折システム及び６３３ｎｍの波長に対して、角度β１は実質的に４０度である）場合、反射及び回折光の角度的及び空間的分離を可能にする。
【００７０】
一次回折光のみを取得することにより、最大回折の強度は一次回折光１に位置し、信号対ノイズ比を改良する。
【００７１】
さらに、感作工程後における回折システムの幾何学特性の変化は、プローブ上の分析物の存在と一致し、一次光の強度レベルにのみ反映され、いくつもの高次光に分散されない。
【００７２】
本方法を実施する回折システム２は、図２ａに示すように、基板２３の表面２３１上に、ｎｓｕｂインデックスで配置された、プローブＡを有する浮き彫り状の領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有する、周期的幾何学パターン２４を有する。
【００７３】
プローブＡを有する浮き彫り状の平行線２４からなる格子の場合の回折システムを詳細に説明する。この選択に限定されるものではなく、他の周期的幾何学パターン、例えば、グリッドなどの二次元の格子や、光を回折することが可能な複雑な幾何学的図形などの周期的幾何学パターンも使用することができる。
【００７４】
好ましくは、方法の感度を上げるためには、格子線はナノスケールとする。
【００７５】
好ましい実施形態では、図１から２ｂに示されるように、基板２３は、平坦な表面２３１を有する。
【００７６】
基板２３は、例えば、ガラス、シリコンまたは金材料により形成される。
【００７７】
好ましくは、プローブＡを有する線状部分は、銃眼状の断面を有するが、正弦状や三角形の断面など、その他の断面を有することもできる。
【００７８】
格子は上述のように、周期ｐを有し、線状部の幅をｌ、充足率をｒとすると、幅ｌと周期ｐの間の比：ｒ＝ｌ／ｐが定義される。
【００７９】
充足率ｒは、感度Ｓと回折光の強度とのバランスである。充足率ｒが低下すると、感度Ｓは上昇するが、回折光は弱くなり、回折光の強度の測定が困難になる。
【００８０】
好ましくは、回折光の強度を十分な値に保ちながら方法の感度Ｓを改良するためには、格子を充足率ｒが０．５未満になるような大きさに形成する。
【００８１】
浮き彫り状の平行線２４は、厚さｅＣとインデックスｎＣを有する結合層２６と称される第一の層を有する。
【００８２】
接着層は、プローブＡを固定することができる物質を有する。
【００８３】
装置の感度Ｓを改善するためには、結合層２６の物質としては、結合層上のプローブＡをその表面に結合させることができるような物質を選択する。「表面に結合」とは、基板２３に対して反対側の結合層の上面２６１、及び上記結合層の側面２６２に結合することを意味する。
【００８４】
このような物質としては、例えば、以下のようなものがある。
‐基板がシリコンの場合には、シラン
‐基板が金の場合には、チオール
‐糖類
‐デンドリマー
‐金属ナノアイランド
‐ナノ粒子
‐ＭＩＰ
‐双安定物質
【００８５】
接着層の厚さｅｃは、感度Ｓと回折光の強度とのバランスである。厚さｅｃが上昇すると、回折光が強くなるが、感度Ｓが低下する。
【００８６】
有利には、厚さｅｃは０ｎｍから５００ｎｍの範囲であり、好ましくは、実質的に５ｎｍオーダーである。
【００８７】
浮き彫り状の平行線２４は、分析物と結合させるためにプローブＡを有する特異層２５と称される厚さｅＳとインデックスｎＳを有する第二の層を有する。
【００８８】
厚さｅＳは、感作工程後の特異層２５上に配置されている可能性のある分析物層２８（図２ｂ）の厚さｅanalyteとに関連して決められる。比ｅＳ／ｅanalyteは、感度Ｓと回折光の強度のバランスである。比ｅＳ／ｅanalyteが低下すると、感度Ｓは上昇するが、回折光は弱くなる。
【００８９】
好ましくは、回折光の強度を十分に保ったまま、装置の感度Ｓを改良するためには、特異層の厚さｅＳは、比ｅＳ／ｅanalyteが１より小さくなるような大きさにする。
【００９０】
有利には、特異層２５の厚さｅＳは０．５ｎｍから１５０ｎｍの範囲であり、好ましくは、実質的に１０ｎｍオーダーである。
【００９１】
第１の実施例では、図２ａ及び２ｂに示されるように、格子２は平行線２４の間に、厚さｅＰの保護層２７と称される基板２３を覆う層を有する。この保護層は、分析物へのプローブの接着選択性を上昇させることができる物質からなる。分析物へのプローブの接着選択性を上昇させることにより、装置の感度が改善される。
【００９２】
具体的な実施例では、保護層はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）またはエタノールアミンである。
【００９３】
結合層の結合表面を低下させないために、保護層の厚さｅＰは結合層の厚さｅＣに比較して小さく、例えば、数オングストロームのオーダーである。
【００９４】
さらに複雑な実施形態では、図示しないが、格子２は、平行線２４の間に、基板を覆い、プローブＡが感受性を有さない分析物を結合させるために、プローブＢ及びプローブＢの固定層を有する、第２特異層と称される層を有する。
【００９５】
好ましくは、２種の分析物を区別して効率的に検出するためには、プローブＡ上に配置された分析物層２８の厚さｅanalyteは、少なくとも１ｎｍより小さいか、プローブＢ上に配置された分析物層の厚さよりも少なくとも１ｎｍ以上大きい。
【００９６】
有利には、この実施形態では、充足率ｒは実質的に０．５である。
【００９７】
一実施形態では、線状の格子は線状の反射格子であり、基板は使用される波長λに対して光透過性であることが好ましい。
【００９８】
他の実施形態では、線状の格子は線状の反射格子であり、基板は使用される波長λに対して光透過性でないことが好ましい。
【実施例１】
【００９９】
［結合層厚さｅＣシミュレーション］
実施例１は、図３ａ及び３ｂから、感度Ｓと感作工程前の標準化した一次回折光の強度Ｐ１／Ｐｉｎｃとのバランスを、結合層２６の厚さｅＣを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
プローブＡのｎＳインデックスが何であっても、結合層の厚さｅＣが増加すると、感作工程前の標準化した一次回折光の強度Ｐ１／Ｐｉｎｃは大きくなるが（図３ａ）、感度Ｓは急速に低下する（図３ｂ）。
【実施例２】
【０１０２】
［比ｅＳ／ｅanalyteの関数としての感度Ｓのシミュレーション］
実施例２は、図４から、回折システムの比ｅＳ／ｅanalyteの関数としての感度Ｓを、特異層の厚さｅＳを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
異なる曲線が同じ分析結果を示し、比ｅＳ／ｅanalyteが１未満であれば、感度Ｓが改善されることが確認された。
【実施例３】
【０１０５】
［充足率ｒと感度Ｓのシミュレーション］
実施例３は、図５ａから、回折システムの充足率ｒの関数としての感度Ｓを、周期ｐを変えて下記のパラメーターに対して説明する。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
曲線１は、（図５ｂに示されるように）結合層の上部のみにプローブＡが結合されている場合を説明する。回折システムの充足率及び周期にかかわりなく、感度Ｓは一定に保たれることが確認された。
【０１０８】
曲線２は、（図２ｂに示されるように）結合層の全体（上部及び側面）にプローブＡが結合されている場合を説明する。回折システムの周期ｐにかかわりなく、充足率ｒが０．５未満であれば感度Ｓが改善されることが確認された。
【実施例４】
【０１０９】
［感度Ｓの実験的測定］
実施例４は、図７ａ及び７ｂから、結合層の厚さを変えて、下記のパラメーターに対して実験的に得られた感度Ｓについて説明する。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
この実施例４では、基板はシラン処理したガラスである。結合層はストレプトアビジン層である。プローブＡはビオチン化プロテインＡである。分析物は、抗プロテインＡ抗体である。
【０１１２】
一次回折光の角度は４０度である。
【０１１３】
図７ａは、本方法を実施するための回折システムを模式的に示している。回折システムは１０００ｎｍの周期を有し、それぞれ幅が５００ｎｍの４００の線状部からなる。回折システムを形成する第１工程は、分子バッファリングにより結合層２６を付着させることからなる。第２工程では、プローブ分子のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液と称されるリン酸緩衝食塩水で洗浄する。最後の工程では、分析物のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する。
【０１１４】
下記の２つの相互作用が観察される。
‐分析物とプローブＡとの間の第１相互作用（特異的相互作用）
‐分析物と基板との間の第２相互作用
【０１１５】
図７ｂは、結合層と相違する、異なる厚さｅＣ（厚さは１．５ｎｍから２．５ｎｍの範囲にある）を有する４つの格子について得られた感度を示す。
【０１１６】
シミュレーション（図３ｂ）と同様に、結合層の厚さｅＣが小さくなると、感度Ｓが上昇することが確認できる。また、感度Ｓは陽性である。
【実施例５】
【０１１７】
［感度Ｓの実験的測定］
実施例５は、図８ａ及び８ｂから、結合層の厚さを変えて、下記のパラメーターに対して実験的に得られた感度Ｓについて説明する。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
この実施例５では、基板はシラン処理したガラスである。結合層はストレプトアビジン層である。分析物は、抗プロテインＡ抗体である。
【０１２０】
一次回折光の角度は４０度である。
【０１２１】
図８ａは、本方法を実施するための回折システムを模式的に示している。回折システムは１０００ｎｍの周期を有し、それぞれ幅が５００ｎｍの４００の線状部からなる。回折システムを形成する第１工程は、分子バッファリングにより結合層２６を付着させることからなる。第２工程では、分析物のインキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液での洗浄を行う。プローブ分子のインキュベーション工程を有さない。
【０１２２】
下記の２つの相互作用が観察される。
‐分析物と結合層との間の第１相互作用
‐分析物と基板との間の第２相互作用
【０１２３】
図８ｂは、結合層と相違する、異なる厚さｅＣ（厚さは１．５ｎｍから２．５ｎｍの範囲にある）を有する６つの格子について得られた感度を示す。
【０１２４】
感度Ｓは陰性であることが認められる。実際、分析物と結合層との間の相互作用は、実質的に存在しない。分析物と基板との間の相互作用が主として認められる。したがって、線状部と分析物との間に相互作用がない場合には、感度Ｓが陰性である。
【０１２５】
この実施例は、１つの測定で２つの相互作用を測定することが可能であることを示している。
【０１２６】
回折システム２を形成しているプローブに結合される分析物の含有が疑われる媒体中の上記分析物を検索するための測定装置１は、図６に示すように、
‐コヒーレント入射光３１で回折システム２を照射する手段、
‐一次回折光３１の強度を測定する手段５、
‐回折システム２により回折光３１を回折した後の、一次回折光４１の強度を測定する手段４、
‐感度Ｓを計算する手段６、及び
‐得られた情報を表示する手段７、を有する。
【０１２７】
回折システム２を、λ〜２λの範囲にある周期的幾何学パターンの周期ｐで、一次回折光のみが可視光となるように形成することにより、回折光を分離するためのプリズムなどの光学スプリッターを使用する必要がない。したがって、測定装置はコスト及び簡易さの双方を達成できる。
【０１２８】
光照射手段３は、光源３２を有する。
【０１２９】
有利には、光源の波長λは可視〜赤外の範囲である。
【０１３０】
具体的な実施例では、光源の波長λは実質的に６３３ｎｍのオーダーである。
【０１３１】
具体的な実施例では、光源３２は連続またはパルス単色光源である。
【０１３２】
好ましくは、光源３２は、レーザーダイオードやヘリウムネオンレーザーなどのレーザーである。
【０１３３】
具体的な実施例では、光源３２は、白色光である。光照射手段３はさらに、所望の波長のための（図示せず）少なくとも１つの選択フィルターと入射光を平行化するための（図示せず）平行光学系を有する。
【０１３４】
測定手段４、５は、それぞれ少なくとも１つの検出器４２、５１を有する。検出器５１は、例えば半反射鏡９を使って入射光を遮り、検出器４２は、一次回折光を遮る。
【０１３５】
検出器４２、５１はそれぞれ検出器により伝達された測定信号を処理することができる処理手段４３、５３に接続されている。処理手段５３は、入射光の強度の値を提供し、処理手段４３は、一次回折光の強度の値を提供する。
【０１３６】
検出器は、例えば、フォトダイオードや少なくとも１つの光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）などの感光素子である。
【０１３７】
具体的な実施例では、光は、光ファイバーなどの導波管を介して検出器へ導かれる。
【０１３８】
一実施形態では、単一の測定手段が、入射光の強度と回折光の強度を測定する２つの測定手段４及び５を提供する。
【０１３９】
計算手段６は、測定手段４及び５に接続され、感度Ｓの値を決定する。
【０１４０】
例えば、計算手段は、感度Ｓを計算することができる少なくとも１つのコンピューターを有する。
【０１４１】
情報表示手段７は、計算手段６に接続され、特に、感度Ｓを特徴付けする。
【０１４２】
情報表示手段７は、例えば、分析物の存在、不存在または存在の不確実さを報告する表示手段７１を有する。
【０１４３】
具体的な実施例では、回折システムがプローブＡを有する場合、表示手段７１は、感度Ｓの値に依存して点滅または点灯する一連の３つのダイオードを有し、
‐緑のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在することを意味し、
‐赤のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在しないことを意味し、
‐黄色のダイオードは、分析物が存在するか否か不確実であることを意味する。
【０１４４】
回折システムがプローブＡ及びプローブＢを有する場合、表示手段７１は、感度Ｓの値に依存して点滅または点灯する一連の３つのダイオードを有し、
‐緑のダイオードは、プローブＡ上に分析物が存在することを意味し、
‐赤のダイオードは、プローブＢ上に分析物が存在することを意味し、
‐黄色のダイオードは、分析物がプローブＡまたはプローブＢのいずれかに存在するか否か不確実であることを意味する。
【０１４５】
好ましくは、情報表示手段７はさらに、感作工程前の信号対ノイズ比を示す回折量の指標を有する。
【０１４６】
具体的な他の実施例では、表示手段７１は、回折光の強さにより色分けされた、回折システムの画像である。例えば、感度ＳがＳ１より大きい場合には、回折光の強さとともに青色の強さが上昇し、感度ＳがＳ２より小さい場合には、回折光の強さが低下するとともに赤色の強さが上昇し、感度がＳ１とＳ２の間である場合には、黒色となる。
【０１４７】
本発明の一実施形態では、（プローブに結合される少なくとも１つの分析物の存在を検索する）複数の分析を、多数の回折システム上で短時間に実現する。分析チップは、基材の表面上に並置された複数の回折システムを有し、通常、例えば行と列のマトリックス状に規則的に配置される。上記回折システムは、例えば、測定装置を動かすか、基材を動かすか、またはそれらの動きを組み合わせて、基材の表面上の複数の回折システムを連続的にスイープして、上述の測定装置により、本発明の方法にしたがってそれぞれ測定される。各回折システムは、少なくとも１つのプローブを有し、特異的な特性を有する。
【０１４８】
第１の実施例では、重複する測定に対して、回折システムは同一である。
【０１４９】
第２の実施例では、少なくとも２つの回折システムは、周期的幾何学パターンが異なる。
【０１５０】
第３の実施例では、少なくとも２つの回折システムは、そのプローブの少なくとも１つが異なり、異なる分析物の存在を検索する。例えば、第１の回折システムは第１の分析物に結合するプローブにより形成され、第２の回折システムは、第１の分析物には感受性でない、異なる分析物に結合するプローブにより形成される。この第３の実施例では、好適なプローブを選択することにより、単一のチップ上で検索できる分析物の数を増やすことができる。
【０１５１】
第４の実施例では、少なくとも２つの回折システムにおいて、まず周期的幾何学パターンが相違し、次いでそのプローブの少なくとも１つが相違する。
【０１５２】
好ましくは、回折システムの全てを有する基材のマップが形成され、マップ上の各着色領域は、回折システムの位置に一致する。具体的な実施例では、色は、回折光の強さによる色分けに一致し、例えば、感度ＳがＳ１より大きい場合には、回折光の強さとともに青色の強さが上昇し、感度ＳがＳ２より小さい場合には、回折光の強さが低下するとともに赤色の強さが上昇し、感度がＳ１とＳ２の間である場合には、黒色となる。
【符号の説明】
【０１５３】
１ 一次回折光
２ 回折システム
３ 光照射手段
４ 強度測定手段
５ 強度測定手段
６ 感度計算手段
７ 情報表示手段
７１ 表示手段
９ 半反射鏡
２０ 法線
２１ 回折表面
２３ 基板
２３１ 表面
２４ 周期的幾何学パターン
２５ 特異層
２６ 結合層
２６１ 上面
２６２ 側面
２７ 保護層
２８ 分析物層
３１ コヒーレント入射光
３２ 光源
４１ 一次回折光
４２、５１ 検出器
４３、５３ 処理手段
Ａ プローブ
β１ 角度
λ 波長
Ｐ１、Ｐ１ａ （光の）強度
Ｓ 感度
Ｓ１、Ｓ２ 閾値
Ｂ プローブ
Ｐｉｎｃ、Ｐｉｎｃａ 入力光
ｐ 周期
α 法線入射
ｒ 充足率
ｌ 幅
ｅｃ （結合層）厚さ
ｅｐ （保護層）厚さ
ｎｓ インデックス
ｅｓ／ｅａｎａｌｙｔｅ 比
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブに結合される分析物の存在を検索する方法であって、回折システム（２）を構成する周期的幾何学パターン（２４）が、プローブＡと称されるプローブを有する領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有して形成され、上記回折システム（２）は、感作工程、すなわちプローブを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させ、存在した分析物をプローブに結合させる工程、の前に回折性があるように作成され、少なくとも以下の工程：
ａ）未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
ｂ）プローブＡを感作し、
ｃ）回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
ｄ）測定された光の強度Ｐ１及びＰ１ａを比較することを含み、
上記工程は上述の順に行われ、回折システム（２）は、周期的幾何学パターンの周期ｐが、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲にあり、一次回折光のみが可視光であるように構成されることを特徴とする検索方法。
【請求項２】
比較を感度Ｓと称される信号の相対的変化を、
式：Ｓ＝（Ｐ１−Ｐ１ａ）／Ｐ１
にしたがって決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
i）ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
ii）ＳがＳ２より小さい場合、プローブＡ上に分析物が存在しないことを示し、
iii）ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、プローブＡ上に分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プローブＡを有さない周期的幾何学パターンの領域が、基本的にプローブＡが感受性を示さない分析物に感受性を示すプローブＢを有し、感作工程ｂ）がプローブＢの感作も行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
i）ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
ii）ＳがＳ２より小さい場合、プローブＢ上に分析物が存在することを示し、
iii）ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａそれぞれを、感作工程の前後に測定されたそれぞれの入力光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａの強度により、測定が行われる間に標準化することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
回折システム（２）が、プローブＡを有する周期的幾何学パターン領域の幅と周期ｐの比率を定義する充足率ｒが０．５以下となるように、設計されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プローブを有する回折システム（２）の周期的幾何学パターン領域が、プローブを有する厚さがｅｓである特異層（２５）と呼ばれる分析物が結合する層と、厚さがｅｃである結合層（２６）と称されるプローブを固定する層とにより形成されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
結合層（２６）の厚さｅｃが０〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特異層（２５）は、ｅanalyteを感作工程後にプローブ上に配置された分析物層の厚さとした場合、比ｅｓ／ｅanalyteが１より小さくなるように形成されていることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ）及びｃ）の工程を同時に行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
回折システム（２）が入射光を反射することができる物質により形成されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
回折システム（２）が入射光を透過させることができる物質により形成されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
回折システム（２）が平行化単色光源により照射されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
回折システム（２）がレーザーにより照射されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
回折システム（２）が可視及び赤外スペクトルから選択される波長λの光で照射されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施するための回折システム（２）であって、少なくとも１つのプローブを有する幾何学パターン（２４）を基板（２３）上に有することを特徴とする回折システム。
【請求項１８】
コヒーレント入射光（３１）を使用して回折システム（２）を照射する手段を有する、請求項１７に記載の回折システム（２）を形成するプローブに結合される分析物の存在を検索する装置であって、上記装置が、
‐上記回折システム（２）による入射光の回折後に、一次回折光（４１）の強度を測定する手段（４、５）、
‐単一の回折システムにより、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前後において測定された一次回折光の強度を比較して、感度Ｓと称される信号の相対的変化を計算する手段（６）、及び
‐感度Ｓを特徴付ける情報を提供する手段、を有することを特徴とする検索装置。
【請求項１９】
請求項１７に記載の回折システム（２）が複数、基材の表面上に並置されていることを特徴とする分析チップ。
【請求項２０】
周期的幾何学パターンが異なり、及び／またはプローブの少なくとも１つが異なる、少なくとも２つの回折システム（２）を有する請求項１９に記載の分析チップ。
【請求項１】
プローブに結合される分析物の存在を検索する方法であって、回折システム（２）を構成する周期的幾何学パターン（２４）が、プローブＡと称されるプローブを有する領域とプローブＡを有さない領域とを交互に有して形成され、上記回折システム（２）は、感作工程、すなわちプローブを分析物の含有が疑われる媒体に一時的に接触させ、存在した分析物をプローブに結合させる工程、の前に回折性があるように作成され、少なくとも以下の工程：
ａ）未感作のプローブを有する回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１を測定し、
ｂ）プローブＡを感作し、
ｃ）回折システムにより作成された回折場の一次回折光の強度Ｐ１ａを測定し、
ｄ）測定された光の強度Ｐ１及びＰ１ａを比較することを含み、
上記工程は上述の順に行われ、回折システム（２）は、周期的幾何学パターンの周期ｐが、λが回折システムの照射波長に対応する、λ〜２λの範囲にあり、一次回折光のみが可視光であるように構成されることを特徴とする検索方法。
【請求項２】
比較を感度Ｓと称される信号の相対的変化を、
式：Ｓ＝（Ｐ１−Ｐ１ａ）／Ｐ１
にしたがって決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
i）ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
ii）ＳがＳ２より小さい場合、プローブＡ上に分析物が存在しないことを示し、
iii）ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、プローブＡ上に分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プローブＡを有さない周期的幾何学パターンの領域が、基本的にプローブＡが感受性を示さない分析物に感受性を示すプローブＢを有し、感作工程ｂ）がプローブＢの感作も行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
感度Ｓを、２つの閾値Ｓ１及びＳ２と比較し、
i）ＳがＳ１より大きい場合、プローブＡ上に分析物が存在することを示し、
ii）ＳがＳ２より小さい場合、プローブＢ上に分析物が存在することを示し、
iii）ＳがＳ１とＳ２の間にある場合、分析物が存在するかどうか、不確実であることを示す、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一次回折光の強度Ｐ１及びＰ１ａそれぞれを、感作工程の前後に測定されたそれぞれの入力光Ｐｉｎｃ及びＰｉｎｃａの強度により、測定が行われる間に標準化することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
回折システム（２）が、プローブＡを有する周期的幾何学パターン領域の幅と周期ｐの比率を定義する充足率ｒが０．５以下となるように、設計されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プローブを有する回折システム（２）の周期的幾何学パターン領域が、プローブを有する厚さがｅｓである特異層（２５）と呼ばれる分析物が結合する層と、厚さがｅｃである結合層（２６）と称されるプローブを固定する層とにより形成されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
結合層（２６）の厚さｅｃが０〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特異層（２５）は、ｅanalyteを感作工程後にプローブ上に配置された分析物層の厚さとした場合、比ｅｓ／ｅanalyteが１より小さくなるように形成されていることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ）及びｃ）の工程を同時に行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
回折システム（２）が入射光を反射することができる物質により形成されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
回折システム（２）が入射光を透過させることができる物質により形成されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
回折システム（２）が平行化単色光源により照射されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
回折システム（２）がレーザーにより照射されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
回折システム（２）が可視及び赤外スペクトルから選択される波長λの光で照射されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施するための回折システム（２）であって、少なくとも１つのプローブを有する幾何学パターン（２４）を基板（２３）上に有することを特徴とする回折システム。
【請求項１８】
コヒーレント入射光（３１）を使用して回折システム（２）を照射する手段を有する、請求項１７に記載の回折システム（２）を形成するプローブに結合される分析物の存在を検索する装置であって、上記装置が、
‐上記回折システム（２）による入射光の回折後に、一次回折光（４１）の強度を測定する手段（４、５）、
‐単一の回折システムにより、感作工程、すなわち、分析物を含有することが疑われる媒体にプローブを一時的に接触させ、存在するであろう分析物をプローブに結合させる工程、の前後において測定された一次回折光の強度を比較して、感度Ｓと称される信号の相対的変化を計算する手段（６）、及び
‐感度Ｓを特徴付ける情報を提供する手段、を有することを特徴とする検索装置。
【請求項１９】
請求項１７に記載の回折システム（２）が複数、基材の表面上に並置されていることを特徴とする分析チップ。
【請求項２０】
周期的幾何学パターンが異なり、及び／またはプローブの少なくとも１つが異なる、少なくとも２つの回折システム（２）を有する請求項１９に記載の分析チップ。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５０２２９１（Ｐ２０１２−５０２２９１Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６４９４（Ｐ２０１１−５２６４９４）
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１７７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９１３９
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０８２７７４２７）
【出願人】（５００５３１１４１）セントレ・ナショナル・デ・ラ・レシェルシェ・サイエンティフィーク (84)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１７７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９１３９
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０８２７７４２７）
【出願人】（５００５３１１４１）セントレ・ナショナル・デ・ラ・レシェルシェ・サイエンティフィーク (84)
【Ｆターム（参考）】
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