子宮頸がんワクチン
本発明は、（ａ）（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びＨＰＶタイプ１８のＬ１ ＶＬＰの少なくともいずれかと、（ｉｉ）脱アシル化された非毒性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含むヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法に関する。本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、ＨＰＶに対する免疫において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）の両方ともにおいてＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより優れており、子宮頸がんワクチンとして優れた効能を奏する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物、ヒト子宮頸がんの予防方法及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）は、現在８０種以上が知られており、ほぼ３０種が性的な接触により子宮頸部に感染を起こし、その約半数が子宮頸がんと関連があることが知られている（非特許文献１参照）。また、ＨＰＶのうち、特にＨＰＶタイプ１６と１８に感染された女性の癌発生率が非感染者の５００倍も高く、これらは、生殖器の上皮細胞を通じて感染された後、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）に悪性転換（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）されることが知られている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
現在開発された子宮頸がんの予防ワクチンは、高危険タイプのＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を利用して開発された。ＶＬＰは、ＨＰＶの主カプシド蛋白質（Ｌ１蛋白質、約５５ｋＤａ）で、他のウイルス遺伝子産物がなくてもＶＬＰに自己整列される性質を有しており、これは、天然ＨＰＶビリオンとほぼ類似している。また、免疫能は長く持続されて、遺伝子型に特異（Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であって、ワクチン候補として高い効率が期待できる長所がある。
【０００４】
このようなＶＬＰを利用したメルク社の‘ガーダシル’は、最もよく発生する四つのＨＰＶタイプ６、１１、１６及び１８のそれぞれの抗原に一般に利用される免疫補助剤である‘Ａｌｕｍ’を使用して開発されたワクチンである。グラクソ・スミスクライン社の‘サーバリックス’は、最も代表的な子宮頸がんの誘発因子であるＨＰＶタイプ１６及び１８に、独自的に開発した免疫補助剤である‘ＡＳ０４’を使用して開発されたワクチンである。
【０００５】
‘ガーダシル’で使用された免疫補助剤であるＡｌｕｍは、ジフテリア、破傷風及びＢ型肝炎ワクチンなどに使用されており、これは、抗原の安定性を増加させて、サイトカインの放出を誘導するという報告があった。しかし、ワクチンの凍結乾燥や凍結を不可能にし、全ての抗原に対して効果的なわけではなく、体液性免疫反応のみを促進させることから、用途が制限されるという大きな短所がある。
【０００６】
ＧＳＫのサーバリックスに含まれるＡＳ０４は、強力で且つ持続的な免疫反応を誘導するための目標で開発されて、アルミニウムヒドロキシド及びモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）で構成されている。ＭＰＬとは、核心的な免疫メカニズムを直接活性化できる免疫促進物質であって、究極的にワクチンに含まれた抗原に対する免疫反応を強化する役割をする。
【０００７】
最近、免疫補助剤が新たに注目を浴びており、子宮頸がんワクチンと共にインフルエンザワクチンなど、多様に使用されている。このような免疫補助剤のうち、バクテリアＤＮＡは、１９６０年代から抗がん剤として注目を浴びてきて、現在も研究が続いているが、その効能が微弱であって、単独では抗がん剤として使用できない（非特許文献３参照）。しかし、バクテリアＤＮＡは、大きい副作用なしに多様な免疫細胞を活性化させることが知られており、特にアジュバントとしてたくさんの長所があることが確認された（非特許文献４参照）。
【０００８】
バクテリアＤＮＡのこのような効果に対し、日本のＹａｍａｍｏｔｏらは、ＣＧを含む配列が重要な役割をすると主張し、米国のＫｒｉｅｇらの研究により広く知られた（非特許文献５及び６参照）。特に、１９９０年代中盤以後は、ＣＰＧ社の関連研究の結果で、メチル化されていないＣＧを含んだ合成ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の可能性が確認されて、特に短い合成ＤＮＡの分解を抑制するためのジエステル結合におけるＳ置換などが研究された。このような努力を通じて、ＣｐＧ−ＯＤＮ関連製品は、アジュバントだけではなく、抗がん剤としても臨床試験が可能になった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｅｙｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ参照）。
【０００９】
しかしながら、ＣｐＧ−ＯＤＮのジエステル結合のＳ置換に対する免疫原性問題及び今でも物足りない抗癌効果などは、解決すべき問題として残っている。現在臨床に使用中であるＣＰＧ ７９０９は、ａｎｔｉ−ＤＮＡ Ａｂを誘発するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであって（非特許文献７参照）、これは、ＳＬＥ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）など、自己免疫疾患と密接な関係がある（非特許文献８参照）。なお、ホスホロチオエート構造は、ＴＩ抗原（Ａｇ）に作用して、感染に対する免疫防御機能に混乱を与えることが知られている（非特許文献９参照）。
【００１０】
１９５０年代から抗癌効果が知られたＬＰＳの場合、ナノグラム水準の汚染によっても敗血症による死亡を招来する毒性により使用が難しかった。特に、ＬＰＳとＤＮＡの結合は、深刻な毒性を示すということが一般的な意見であって、ＤＮＡ関連医薬品においてＬＰＳの除去は、非常に重要な過程とされた（非特許文献１０参照）。効能面において、ＬＰＳによる免疫増加は、ＤＮＡによるものよりずっと強力であるが、抗癌に重要なＴｈ１タイプではくＴｈ２タイプであるため、抗がん剤として適していないと考えられた（非特許文献１１参照）。特に、Ｔｈ２タイプ免疫活性は、Ｔｈ１タイプ免疫活性を抑制するため、ＬＰＳのこのような特性は、ＬＰＳを抗がん剤として利用することを更に難しくした（非特許文献１２参照）。
【００１１】
ＬＰＳに対する弱毒化の試みは絶えず研究されて、特にポリサッカライドチェーンの除去又はリピドＡの脱アシル基化を通じて毒性を減少させることに成功した（非特許文献１３参照）。特に、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化によって得られたモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）の場合、ＬＰＳの毒性を除去した免疫抗がん剤として開発されたが、その効果が微弱であることが知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍ参照）。
【００１２】
このため、本出願人は、上述の免疫補助剤の短所を補完した新規な免疫補助剤を既に開発した（特許文献１参照）。
【００１３】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】韓国登録特許第０７４０２３７号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ Ｈ， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ８： １４７−１５０
【非特許文献２】Ｈａｕｓｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ． Ａｃｔａ． １２８８： ５５−７８， １９９６
【非特許文献３】Ｇｌｉｃｋ， Ｊ． Ｌ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ＤＮＡ． ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２７：２３３８，１９６７
【非特許文献４】ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ＭＪ， ｅｔ ａｌ． ＣｐＧ ＤＮＡ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｅ． ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｎｏｖ１；１６１（９）：４４６３−６．１９９８
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｉｑｕｅ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＩＦＮ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔ ＩＦＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２，１９９２
【非特許文献６】Ｋｒｉｅｇ ＡＭ， Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｗｉｔｈ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ． Ｍａｒ； ６（２）：８８−９５．２００４
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１ Ａｕｇ；１００（２）：１５７−６３
【非特許文献８】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８６ Ｊｕｌｙ；６（４）：２９２−８
【非特許文献９】Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｄｅｃ；３５（１８）：１１６１−７０
【非特許文献１０】Ｇａｏ ＪＪ． ｅｔ． ａｌ， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６６（１１）：６８５５−６０，２００１
【非特許文献１１】Ｌｅｂｍａｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ｃａｕｓｅｓ ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｔｏ ＩｇＥ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． Ｓｅｐ １；１６８（３）：８５３−６２． １９８８
【非特許文献１２】Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ Ｏｃｔ；２１（１０）：４７９−８３． ２０００
【非特許文献１３】Ｋａｔｚ ＳＳ ｅｔ ａｌ Ｄｅａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｗｈｏｌｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｒａｂｂｉｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｘｕｄａｔｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ｄｅｃ １７；２７４（５１）：３６５７９−８４ １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、上述の従来の子宮頸がんワクチンの問題点を解決できる新規なワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＨＰＶ １６又は１８のＬ１ ＶＬＰを利用する免疫化過程において、リピドＡから一部脂肪酸を除去した非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を免疫補助剤として利用する場合、従来のＶＬＰに基づいたワクチンより大きく改善されたＨＰＶ免疫反応を誘導して、子宮頸がんの予防のための優れたワクチンができることを確認し、本発明を完成した。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、ヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、ヒト子宮頸がんの予防方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のまた他の目的は、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの製造方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、ＨＰＶ １６のＬ１ ＶＬＰをコードする新規な核酸を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、ＨＰＶ １８のＬ１ ＶＬＰをコードする新規な核酸を提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、上記の新規な核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、更に明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶタイプ１８のＬ１ ＶＬＰ又はこれらの組み合わせ、及び（ｉｉ）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含むヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物を提供する。
【００２５】
本発明の他の様態によると、本発明は、前記本発明の薬剤学的組成物をヒトに投与する工程を含むヒト子宮頸がんの予防方法を提供する。
【００２６】
本発明者らは、上述の従来の子宮頸がんワクチンの問題点を解決できる新規なワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＨＰＶ １６又は１８のＬ１ ＶＬＰを利用する免疫化過程において、リピドＡから一部脂肪酸を除去した非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を免疫補助剤として利用する場合、従来のＶＬＰに基づいたワクチンより大きく改善されたＨＰＶ免疫反応を誘導して、子宮頸がんの予防のための優れたワクチンができることを確認した。
【００２７】
本発明の薬剤学的組成物に利用されるＶＬＰは、ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１又はＨＰＶタイプ１８ Ｌ１由来である。ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８は、高危険性ＨＰＶと知られており、子宮頸がんを誘発する代表的なＨＰＶである。
【００２８】
本発明の明細書において用語‘ＨＶＰ Ｌ１蛋白質’は、ＨＰＶのＬ１遺伝子から発現されるもので、ＨＰＶのカプシド（ｃａｐｓｉｄ）を構成する主要（ｍａｊｏｒ）蛋白質を意味する。Ｌ１蛋白質は、カプシドを構成する他のマイナー（ｍｉｎｏｒ）蛋白質であるＬ２蛋白質と共に、あるいはＬ１蛋白質単独で、適した条件下でウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ）される特性を有する。
【００２９】
本発明で利用されるＶＬＰは、ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８のＬ１蛋白質の天然由来（Ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）総配列及びこれの機能的Ｌ１蛋白質誘導体を含む。用語‘ＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体’は、天然由来ＨＰＶ Ｌ１総配列と同一ではないが、ＶＬＰを形成することができて、且つ免疫反応を誘導することができる天然由来ＨＰＶ Ｌ１蛋白質の誘導体を意味する。例えば、前記ＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体は、核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の除去された切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｌ１蛋白質である。例えば、ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１の場合、Ｃ末端の３４個アミノ酸が除去された形態、ＨＰＶタイプ１８ Ｌ１の場合、Ｃ末端の３５個アミノ酸が除去された形態が、本発明で利用できるＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体である。本発明で利用されるＨＰＶ １６及び１８のＬ１ ＶＬＰの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び４に示されている。
【００３０】
本発明の子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物で免疫反応を誘発する抗原として、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ又はＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰが利用されて、好ましくは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰの両方とも利用される。
【００３１】
選択的に、抗原として、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰの他に、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８及びＨＰＶタイプ６８のＬ１ ＶＬＰｓからなる群から選択される少なくとも一つのＬ１ ＶＬＰを更に含むことができる。
【００３２】
選択的に、本発明で利用されるＬ１ ＶＬＰは、他の蛋白質、例えば、Ｌ２蛋白質と融合されることもできる。
【００３３】
本発明のワクチン組成物において最も大きい特徴は、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を利用することである。本明細書で最初に採択される用語‘ＬＯＳ（リポオリゴ糖：Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）’は、ＬＰＳ（リポ多糖：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の変形体であって、天然（Ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＬＰＳより短い糖鎖を有しており、分子量が小さいものを意味する。脱アシル化前のＬＯＳは、好ましくは、分子量が５，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａである。用語‘脱アシル化ＬＯＳ’は、このようなＬＯＳから、リピドＡのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合された脂肪酸が除去されて、ＬＰＯと比較し、毒性が大きく減少されたものを意味する。リピドＡのグルコサミンに、脂肪酸は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合を通じて結合されている。本発明の脱アシル化ＬＯＳは、リピドＡの脱アシル化により、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合された脂肪酸が除去されたものを示す。
【００３４】
脱アシル化非毒性ＬＯＳは、多様な方法を通じて製造できるが、本発明者らの先行特許である韓国登録特許第０４５６６８１号公報；ＷＯ２００４／０３９４１３；韓国登録特許第０７４０２３７号公報；及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって製造できる。例えば、ＬＰＳに強塩基（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ）を処理して脱アシル化して、リピドＡから一部脂肪酸を除去して脱毒素化する。
【００３５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＬＰＳにアルカリ処理して脱アシル化して非毒性化されたものである。前記アルカリの好ましい例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２が挙げられ、より好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であり、更に好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であって、最も好ましくは、ＮａＯＨである。
【００３６】
ＬＰＳの毒性の程度は、当業界に公知された多様な方法を通じて分析できる。例えば、ＬＰＳが処理されたＴＨＰ−１（Ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）に分泌されるＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）の量を測定して毒性を分析することができる。本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、従来のＬＰＳと比較し、相対的に少ない量のＴＮＦ−α分泌を誘導する。
【００３７】
本発明で利用される免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳの他の特徴としては、分子量が、一般に従来に利用されるＬＰＳと比較して小さいということである。本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、好ましくは、１，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、より好ましくは、２，０００Ｄａ〜５，０００Ｄａ、更に好ましくは、２，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａ、より更に好ましくは、３，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａ、最も好ましくは、３，２００Ｄａ〜３，７００Ｄａの分子量を有するものである。このような分子量は、当業界の通常的な方法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳを利用して測定することができる。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来であり、最も好ましくは、本発明者らの独自的な菌であるＥ．ｃｏｌｉ ＥＧ００２１（ＫＣＣＭ １０３７４）由来のものである。
【００３９】
本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、免疫促進（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）効能が従来の免疫補助剤と比較して優れているだけではなく、毒性も著しく減少されており、本発明のワクチン組成物に非常に適している。下記の実施例で立証したように、ＬＰＳの毒性を除去するために、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化を通じて得たモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）より、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、毒性が遥かに少ない。
【００４０】
また、下記実施例（図１２ａ及び１２ｂ参照）に示されたように、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳをＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと共に投与した場合、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）に係わるＩｇＧ２ａだけではなく、Ｔｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）に係わるＩｇＧ１レベルも増加し、脱アシル化非毒性ＬＯＳがＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと共に上昇的な免疫反応を誘導していることが分かる。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、その基本的な組成、即ち、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰ又はその組み合わせと脱アシル化非毒性ＬＯＳのみでも十分な免疫反応を誘導して、子宮頸がん予防効能を発揮することができる。選択的に、本発明のワクチン組成物は、他の免疫補助剤を更に含むことができ、例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素又はアルミニウムの塩又はその水和物を含むことができる。前記塩は、好ましくは、オキシド、ペルオキシド、ヒドロキシド、カーボネート、ホスフェート、パイロホスフェート、ヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、サルフェート又はシリケートと共に形成される。例えば、本発明のワクチン組成物において追加的に利用できる免疫補助剤は、マグネシウムヒドロキシド、マグネシウムカーボネートヒドロキシドペンタヒドレート、チタニウムジオキシド、カルシウムカーボネート、バリウムオキシド、バリウムヒドロキシド、バリウムペルオキシド、バリウムサルフェート、カルシウムサルフェート、カルシウムパイロホスフェート、マグネシウムカーボネート、マグネシウムオキシド、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート及び水和されたアルミニウムカリウムサルフェート（Ａｌｕｍ）を含む。最も好ましくは、本発明のワクチン組成物において追加的に利用できる免疫補助剤は、アルミニウムヒドロキシドである。
【００４２】
本発明の好ましい具現例によると、ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１ ＶＬＰは、（ｉ）ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１をコードするヌクレオチド配列を含む酵母（ｙｅａｓｔ）を培養する工程と、（ｉｉ）前記培養された酵母を溶解（ｌｙｓｉｓ）する工程と、（ｉｉｉ）前記酵母溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、を含む精製工程を通じて得たものである。
【００４３】
以下、上記の精製工程について詳細に説明する。
【００４４】
本発明のワクチン薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であって、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。
【００４６】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、好ましくは、１日当たり、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００４７】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。
【００４８】
本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、従来の子宮頸がんワクチンであるＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭよりＨＰＶに対する免疫反応を大きく誘導し、子宮頸がん予防効能に更に優れているだけではなく、免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳの毒性がほとんどなく、安全性側面でも非常に優れている。
【００４９】
特に、本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、下記の実施例で立証したように、本発明のワクチン組成物を投与した場合、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）に係わるインターフェロン−γ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのレベルがＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより高く、なお、Ｔｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）に係わるＩｇＧ１レベルもＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより高い。即ち、本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、ＨＰＶに対する免疫において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）とにおいて、ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより優れている。
【００５０】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下の工程を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法を提供する：
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１−コーディングヌクレオチド配列を含む酵母（ｙｅａｓｔ）を培養する工程と、
（ｉｉ）前記培養された酵母を溶解（ｌｙｓｉｓ）する工程と、
（ｉｉｉ）前記酵母溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、
（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程。
【００５１】
本発明者らは、ＨＰＶに対するワクチン製造用途のＨＰＶ ＶＬＰｓの酵母発現システムを利用した生産工程において、ＨＰＶ ＶＬＰｓの生産工程を単純化して収率を増加させることのできる精製方法を開発するために鋭意研究した。その結果、酵母細胞破砕液をアンモニウムサルフェートにより沈殿させて、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行うと、精製効率（収率及び精製度）を大きく向上させることができることを確認した。
【００５２】
以下、各工程にしたがって本発明を詳細に説明する。
【００５３】
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を発現する形質転換酵母培養
本発明の方法において、Ｌ１蛋白質が由来するＨＰＶのタイプは特に限定されず、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８及びＨＰＶタイプ６８を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のＬ１蛋白質は、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３及びＨＰＶタイプ４５からなる群から選択されるＨＰＶ由来のものであり、より好ましくは、ＨＰＶタイプ１６及びタイプ１８由来のものである。
【００５４】
本発明において、宿主細胞（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）として利用される細胞は、酵母であり、例えば、パン酵母（ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセスパストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセスエスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などを使用することができるが、これらに限定されない。最も好ましくは、本発明の宿主酵母は、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００５５】
ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を発現する形質転換酵母は、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を成功的に発現させる発現ベクターで形質転換された酵母細胞を意味する。前記発現ベクターで発現しようとするＨＰＶ Ｌ１遺伝子のアップストリームに当業界に公知された多様なプロモーター、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， Ｒ． Ｗ．， Ｍｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４： １４４０−１４４８ （１９８４））、ＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８： ２６７４−２６８２， （１９８３））、ＰＨ０５プロモーター（ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ６７５−６８０， （１９８２））、又はＭＦａｌプロモーターが結合されていてもよく、ポリアデニル化配列、例えば、ＡＤＨＩ、ＭＦａｌ又はＴＰＩ由来ポリＡ配列（Ａｌｂｅｒ， Ｔ． ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｇ．， Ｊ． Ｍｏｌ． ＆ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ４１９−４３４ （１９８２））が含まれてもよい。酵母発現ベクターとしてＹＥｐ６、ＹＥｐ１３ＹＥｐ４、及びＹＥＧα（Ｓ．Ｎ． Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９ （２００７） ２４−３０； Ｒ． Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７ （１９９３） ６９２９−６９３６）が公知である。ＨＰＶ Ｌ１蛋白質発現形質転換された酵母は、当業界に公知された方法を使用して容易に製造することができ、このような方法は、米国特許Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ＵＳ ７２５０１７０、ＵＳ ６６１３５５７、ＵＳ ５８８８５１６、ＵＳ ５８７１９９８、ＵＳ ５６１８５３６、ＵＳ ５４３７９５１などに開示されており、これらの特許文献の内容は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によると、前記形質転換酵母は、炭素源としてグルコース及びガラクトースの一つ以上の炭素源が添加された培地で培養する。本発明のまた他の好ましい具現例によると、前記グルコースとガラクトースの比率は、質量基準でグルコース：ガラクトース＝０〜１：３〜４であり、より好ましくは、質量基準でグルコース：ガラクトース＝０．５〜１：３．５〜４であって、最も好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：３である。本発明の方法において培地に含有されたグルコースとガラクトースの質量比率が上記のような範囲にある場合、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質の発現が最大になる。
【００５７】
形質転換酵母の培養時に利用される例示的な培地は、ＹＰＤＧ培地（酵母抽出液、ペプトン、グルコース及びガラクトースを含む）である。
【００５８】
（ｉｉ）培養された酵母の溶解
本発明で培養された酵母細胞の溶解方法は、酵母細胞の全体溶解物（ｌｙｓａｔｅ）が得られる方法であればよく、特定な方法に限定されない。本発明に使用できる溶解方法は、例えば、ソニケーション、ガラスビーズによる破砕を利用する方法があるが、これに限定されない。
【００５９】
（ｉｉｉ）酵母溶解物の不純物を除去するためのアンモニウムサルフェート沈殿
酵母の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）にアンモニウムサルフェートを添加して発現された蛋白質を沈殿させて、不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）を除去した。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、添加されるアンモニウムサルフェートの濃度は、２０質量％〜６０質量％であり、より好ましくは、４０質量％〜５０質量％であって、最も好ましくは、４２質量％〜４８質量％である。アンモニウムサルフェートの濃度が４０質量％未満であると、本発明で発現されたＨＰＶ Ｌ１蛋白質の沈殿効率が落ちて、５０質量％を超えると、アンモニウムサルフェートの増加分だけのＬ１蛋白質沈殿増加効果が得られない。
【００６１】
選択的に、アンモニウムサルフェート沈殿により形成された蛋白質ペレットを溶解した後、０．５Ｍ以上のＮａＣｌを添加して、少なくとも１２時間以上４℃でインキュベーションする。
【００６２】
（ｉｉｉ−２）低濃度塩（例えば、ＮａＣｌ）における不純物除去
前記工程（ｉｉｉ）で得た溶液を低濃度塩（例えば、ＮａＣｌ）の含まれた緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝液）に透析して交換させた後、常温でインキュベーションし、不純物を不溶性状態にして除去する。
【００６３】
本発明の一具体例において、前記低濃度塩の濃度は、０．００１Ｍ〜０．３Ｍ、より好ましくは、０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、最も好ましくは、０．１Ｍ〜０．８Ｍであって、使用される塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４及び（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる群から選択されて、最も好ましくは、ＮａＣｌである。
【００６４】
本発明の好ましい具現例において、低濃度の塩の処理過程は、非イオン性界面活性剤の存在下で行われて、前記非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エーテル、Ｃ１６−２４脂肪酸、脂肪酸モノ−、ジ−又はポリ−グリセリド、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール、アルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース又はポリオキシアルキレン蓖麻子油誘導体を含み、好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイン２０）、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノラウレート（ツイン２１）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ツイン４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ツイン６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート（ツイン６５）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイン８０）又はポリソルベート８０）又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート（ツイン８５）のようなポリオキシエチレンソルビタンモノ−又はトリ−ラウリル、パルミチル、ステアリル又はオレイルエステルである。また、前記非イオン性界面活性剤は、０．００１％〜０．０１％の濃度であることが好ましい。
【００６５】
この低濃度ＮａＣｌの処理過程は、不純物を除去するに非常に効率的であり、本発明の方法において、工程の短縮化及び精製効率の改善に大きく寄与する工程である。
【００６６】
この工程で生成された不溶性蛋白質を遠心分離して除去する場合、次の工程であるヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーで溶出されるＶＬＰの純度を大きく増加させることができる。したがって、本工程は、簡便な方法で不純物を除去し、精製効率を大きく増加させる効果を有する。
【００６７】
（ｉｖ）ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー
不純物が除去された溶液に対して、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う。
【００６８】
上記の方法を通じて不純物が除去された溶液を、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて精製する場合、残余不純物を非常に効果的に除去することができる。
【００６９】
ヘパリンクロマトグラフィーを行う場合、まず、前記工程（ｉｉｉ）又は（ｉｉｉ−２）の結果物をヘパリンレジンカラムに適用する前に、ヘパリンレジンを適した結合バッファーで平衡化させる。結合バッファーは、好ましくは、ＮａＣｌ及び非イオン性界面活性剤（例えば、ツイン８０）を含み、ＮａＣｌは、低濃度（０．１Ｍ〜０．２Ｍ）が好ましい。次いで、ヘパリンクロマトグラフィーに試料を適用した後、レジンに結合された蛋白質を溶出する。溶出方法は、ＮａＣｌ線形濃度勾配が好ましく、より好ましくは、０．３３Ｍ〜０．６６ＭのＮａＣｌ線形濃度勾配で不純物を溶出させた後、０．６６Ｍ〜２ＭのＮａＣｌ線形濃度勾配で所望のＬ１蛋白質を溶出させる。
【００７０】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、多様なレジンを利用して行うことができ、好ましくは、スルホ、スルホアルキル（例えば、スルホメチル、スルホエチル及びスルホプロピル）、ホスフェート又はホスフェートアルキル作用基が結合された陽イオン交換剤を利用して行って、最も好ましくは、ホスフェート作用基が結合された陽イオン交換剤を利用して行う。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、まず、前記工程（ｉｉｉ）又は（ｉｉｉ−２）の結果物をヘパリンレジンカラムに適用する前に、ヘパリンレジンを適した結合バッファーで平衡化させる。結合バッファーは、好ましくは、ＮａＣｌ及び非イオン性界面活性剤（例えば、ツイン８０）を含み、ＮａＣｌは、低濃度（０．３Ｍ〜０．４Ｍ）が好ましい。次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーに試料を適用した後、レジンに結合された蛋白質を溶出する。溶出方法は、ＮａＣｌ段階濃度勾配が好ましく、より好ましくは、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ及び１ＭのＮａＣｌが含まれた溶出バッファーを利用して所望のＬ１蛋白質を溶出させる。
【００７１】
（濃縮）
本発明の好ましい具現例によると、前記クロマトグラフィー過程を通じて得たＬ１蛋白質分画物をメンブレンフィルターで濃縮させる。好ましくは、クロマトグラフィー分画物を、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレンを使用して濃縮する。平均５０ｎｍ程度の大きさを有するＶＬＰの場合、他の蛋白質に比べて大きい大きさを有するため、メンブレンを通過できず濃縮される反面、大部分の残余不純物は、メンブレンを通過して除去される効果を有する。したがって、この工程は、ＨＰＶ １６ Ｌ１の純度を更に高めると同時に濃度を高める効果を有する。
【００７２】
本発明の製造方法は、クロマトグラフィー工程の前に、細胞破砕液を特定条件で処理して不純物を除去する方法を使用することにより、Ｌ１蛋白質の精製効率を極大化した。細胞破砕液は、アンモニウムサルフェートを添加して沈殿することにより、不純物を１次的に除去して、２次的に低濃度塩条件でインキュベーションして不純物を除去する方法を使用する。上記の場合のように、アンモニウムサルフェートの沈殿後、低濃度塩の条件でインキュベーションして不純物を除去する場合、不純物の８０％を除去することができて、Ｌ１蛋白質は、８０％以上を回収することができて、簡便な方法で純度を高めることができる。したがって、数回のクロマトグラフィー工程を経なくても高い純度のＬ１蛋白質を精製することができて、これをパイロット及び産業的規模で生産及び精製に適用すると、蛋白質生産に要求される時間、製造費用及び労働力を大きく節減できる効果がある。
【００７３】
本発明の他の様態によると、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸を提供する。また、本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸を提供する。
【００７４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、上記のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ）を提供する。また、本発明は、上記のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１０３７Ｐ）を提供する。
【００７５】
配列番号１及び配列番号３のヌクレオチド配列は、ＨＰＶのＬ１蛋白質をコードする核酸が酵母で高効率で発現されるように最適化したものである。
【発明の効果】
【００７６】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ａ）本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、抗原としてＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰ又はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰを利用して、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳを利用する。
（ｂ）免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＨＰＶに対する免疫反応において非常に優れた免疫促進効能を発揮するだけではなく、毒性がほとんどなくて安全性に非常に優れている。
（ｃ）また、脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰにより誘導される免疫反応において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応の両方ともを増加させて、ＨＰＶに対する上昇的な免疫反応を誘導する。
（ｄ）本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、ＨＰＶに対する免疫において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）の両方ともにおいてＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより優れており、子宮頸がんワクチンとして優れた効能を奏する。
（ｅ）本発明のＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの製造方法は、ただ一回のクロマトグラフィー工程を経ることで高い純度のＬ１蛋白質を得ることができ、これをパイロット及び産業的規模で生産及び精製に適用すると、蛋白質生産に要求される時間、製造費用及び労働力を大きく節減できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＶＬＰ蛋白質を発現するＹＥＧ（ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）に対する遺伝子地図である。ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子、Ｕｒａ３は、ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ合成遺伝子であり、２−ｍｉｃｒｏｎは、複製原点であって、他の記号は、制限酵素位置を示す。
【図２】ＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＶＬＰ蛋白質を発現するＹＥＧ（ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）に対する遺伝子地図である。ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子、Ｕｒａ３は、ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ合成遺伝子であり、２−ｍｉｃｒｏｎは、複製原点であって、他の記号は、制限酵素位置を示す。
【図３】ＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１の精製過程の模式図である。アンモニウムサルフェートの沈殿後、低い濃度のＮａＣｌ条件で不溶性に変化された蛋白質を除去した試料は、二種類の方法を通じて精製された。本発明のクロマトグラフィー法ではヘパリンクロマトグラフィー（方法１）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（方法２）を使用した。
【図４】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果である。図４は、不溶性不純物を除去する過程を経ずに、ヘパリンクロマトグラフィーを進行した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図５】図５は、図１ｃの方法１におけるヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図６】図６は、１次ヘパリンクロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図７】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果である。図７は、図１ｃの方法２における陽イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図８】図８は、陽イオン交換クロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図９】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果であって、ヘパリンクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーのＬ１分画を集めた後、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し(ｃｕｔ−ｏｆｆ)できるメンブレンフィルターを使用して濃縮した結果である。パネルＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、Ｂは、ウェスタンブロット結果である。レーン１、２、３は、それぞれＢＳＡ、方法１で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１、方法２で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１を示す。それぞれのサンプルは、ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙで定量されて、２００ｎｇずつ同一量がローディングされた。
【図１０】図１ｃの方法１で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１１】図１ｃの方法２で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１２】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果である。図１２は、不溶性不純物を除去する過程を経ずにヘパリンクロマトグラフィーを進行した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１３】図１３は、図３の方法１（Ｍｅｔｈｏｄ １）におけるヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１４】図１４は、ヘパリンクロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１５】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果である。図１５は、図１ｃの方法２（Ｍｅｔｈｏｄ ２）における陽イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１６】図１６は、陽イオン交換クロマトグラフィーのウェスタンブロットの結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１７】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果であって、ヘパリンクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーのＬ１分画を集めた後、５０ｋＤａから１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレンフィルターを使用して濃縮した結果である。パネルＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂは、ウェスタンブロットの結果である。レーン１、２及び３は、それぞれＢＳＡ、方法１で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１、及び方法２で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１を示す。それぞれのサンプルは、ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙで定量されて、２００ｎｇずつ同一量がローディングされた。
【図１８】図１ｃの方法１で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１９】図１ｃの方法２で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図２０】ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１の中和活性測定結果である。精製されたそれぞれのＬ１蛋白質をマウスに３週間隔で３回免疫して、血清内中和抗体価は、ＳＥＡＰに基づいた中和抗体活性測定法で測定した。Ｘ軸の対照群、ヘパリン及び陽イオン交換は、それぞれ免疫補助剤のみで免疫したグループ、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループ、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループを示す。Ｙ軸の数字は、血清の希釈倍率を示す。
【図２１】ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１の中和活性測定結果である。精製されたそれぞれのＬ１蛋白質をマウスに３週間隔で３回免疫して、血清内中和抗体価は、ＳＥＡＰに基づいた中和抗体活性測定法で測定した。Ｘ軸の対照群、ヘパリン及び陽イオン交換は、それぞれ免疫補助剤のみで免疫したグループ、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループ、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループを示す。Ｙ軸の数字は、血清の希釈倍率を示す。
【図２２】新規免疫補助剤（ＣＩＡ０５）がＭＰＬより細胞毒性（ＴＮＦ−α分泌）が低いことを示すグラフである。
【図２３】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による抗体価（図２３）を示すグラフである。白のバーは、総ＩｇＧ、斜線のバーは、ＩｇＧ１、及び黒のバーは、ＩｇＧ２ａに対するものである。
【図２４】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による抗体価の増加倍数（図２４）を示すグラフである。白のバーは、総ＩｇＧ、斜線のバーは、ＩｇＧ１、及び黒のバーは、ＩｇＧ２ａに対するものである。
【図２５】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による脾臓細胞からのインターフェロン−γ分泌程度を分析した結果である。斜線のバーは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ処理期間が２日間、黒のバーは、３日間に該当するものである。
【図２６】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による血清総ＩｇＧ力価を分析した結果であり、図１３ａは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する総ＩｇＧ力価を分析した結果である。
【図２７】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による血清総ＩｇＧ力価を分析した結果であり、図１３ｂは、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰに対する総ＩｇＧ力価を分析した結果である。
【図２８】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合によるＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する血清内ＩｇＧ１力価（図１４ａ）を分析した結果である。
【図２９】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合によるＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する血清内ＩｇＧ２ａ力価（図１４ｂ）を分析した結果である。
【図３０】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による脾臓細胞からのインターフェロン−γ分泌程度を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８ ＶＬＰ Ｌ１蛋白質の生産及び精製
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質を生産する組み換え酵母発現システムの構築
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１ ＤＮＡ配列の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドン／発現最適化を行って、配列番号１のＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＤＮＡ配列及び配列番号３のＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＤＮＡ配列を得て、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ＢＨＢ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ”サービス（ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ参照）を利用してＤＮＡをそれぞれ合成した（参照:配列番号１及び３）。この際、最適化されたＤＮＡ配列の前と後ろにＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）とＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）制限酵素位置を連結した。その後、クローニング過程を経て、本発明に使用される組み換えＨＰＶ １６ Ｌ１及びＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質を発現できる組み換えプラスミドＤＮＡを、酵母発現ベクター（ＹＥＧ）を使用して構築し、ＹＥＧα−ＨＰＶ１６Ｌ１−ＯＲＳ及びＹＥＧα−ＨＰＶ１８Ｌ１−ＯＲＳを得た（図１）。クローニング過程は、以下のようである：配列番号１のＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＤＮＡ配列又は配列番号３のＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＤＮＡ配列が挿入されたｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び酵母発現ベクターであるＹＥＧ−ＭＣＳベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩで切断した。切断されたＤＮＡをそれぞれ電気泳動した後、ゲル抽出キット（ＨｉＹｉｅｌｄＴＭ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃ＹＤＦ１００、ＲＢＣ））を使用して抽出した。ＨＰＶタイプ１６及び１８のＤＮＡと、ベクターとして使用されるＹＥＧ−ＭＣＳベクターを、リガーゼ（ＤＡＫＡＲＡ、２０１１ａ）を利用して接合させた後、ｄａｍ（−） Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（ＴＡＫＡＲＡ、９１２９）に形質転換させた。形質転換後に形成されたコロニーを計数して、それぞれ培養した後、プラスミドを抽出して、酵素で切断して大きさを確認した。大きさが確認されたプラスミドを酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換させて、ＳＤ（−ｕｒａ）プレートにスプレードした。コロニーが生成されたら、２５個ずつピッキングして接種した（２８０ｒｐｍ、３０℃、振とう、２日間）。ＳＤ（−ｕｒａ）培地からよく育ったもののみを選別して、ＹＰＤＧ培地に接種した。培養が完了すると、培養時のＯ．Ｄ値、細胞破砕時の総蛋白質量、精製（下記の方法で精製）後のＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析をおこなって、最も優れた菌株を選定した。
【００８０】
組み換えＨＰＶ１６Ｌ１及びＨＰＶ１８Ｌ１が導入されたＹＥＧα−ＨＰＶ１６Ｌ１−ＯＲＳ及びＹＥＧα−ＨＰＶ１８Ｌ１−ＯＲＳベクターでそれぞれ形質転換された菌株を寄託機関の韓国微生物保存センターに２００９年１０月８日付にて寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ及びＫＣＣＭ１１０３７Ｐをもらった（ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ − Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＧ０２１６； ＫＣＣＭ１１０３７Ｐ − Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＧ０２１８）。
【００８１】
細胞の培養
バッフル板（ｂａｆｆｌｅ）が付着されたフラスコに、ウラシル（ｕｒａｃｉｌ）のない合成完全培地ＳＤ−ｕｒａ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に前記製造した酵母菌株細胞を接種して、３０℃で振とう培養した。ＧＡＬ１０プロモーターからＨＰＶ１６ Ｌ１及びＨＰＶ１８ Ｌ１蛋白質を発現させるために、ＹＰＤＧ培地を使用した。全ての培地に１％酵母抽出液（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）及び２％ペプトン（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を添加して、１％のグルコースと３％ガラクトースが含まれるようにした。ＹＰＤＧ培地３Ｌにプラスミド前記形質転換された酵母菌株を接種した後、３０℃で４８時間振とう培養した。
【００８２】
細胞溶解物（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ）の製造
培養した細胞をペレットで収得し、得られた細胞ペレットを７０℃で冷凍した。全ての後続過程は、４℃で行った。細胞ペレットを溶かして、氷冷させた１００ｍＬブレークバッファー（ｂｒｅａｋ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）に再懸濁させて、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を添加した。細胞をガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と共にビード−ビーター（Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）のチャンバーに移して、５分間ｖｏｒｔｅｘした後、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１０分間１０，０００ｇで数回遠心分離してきれいに除去した。
【００８３】
アンモニウムサルフェート沈殿
きれいに除去された細胞溶解物にアンモニウムサルフェート（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加して、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を回収した。回収効率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を評価するために、アンモニウムサルフェートを４３％又は４５％濃度で添加した後、それぞれ４℃で３０分間攪拌して、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、蛋白質ペレットを得た。アンモニウムサルフェートで沈殿されたペレットをＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０ 緩衝液で再懸濁した後、ＮａＣｌを更に添加して、最終ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ以上になるようにした。その後、４℃で少なくとも１２時間以上インキュベーションした。
【００８４】
低濃度ＮａＣｌインキュベーションによる不純物の除去
上記の高濃度ＮａＣｌでインキュベーションされた溶液をＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０緩衝液で透析した後、リン酸ナトリウムｐＨ７．２緩衝液に０．１５Ｍ ＮａＣｌと０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０が含まれた溶液で希釈して、最終蛋白質の濃度が２〜５ｍｇ／ｍＬになるようにした。この溶液を常温で２時間以上放置して、非溶解性状態の蛋白質が生成されるようにした。生成された非溶解性蛋白質は、１０，０００ｇで１０分間遠心分離して除去した。
【００８５】
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
上記の低濃度ＮａＣｌでインキュベーションされたサンプルを遠心分離した後、上澄み液を結合バッファー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ＋０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）で透析した。ヘパリンレジン（５ｍＬ又は２０ｍＬ）で充填されたカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）も、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して、平衡を維持した。透析が完了した溶液は、ヘパリンカラムを通過させて結合させた後、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して洗浄した。溶出法は、ＮａＣｌ濃度が０．３３Ｍから０．６６Ｍまで３５分間上昇するように線形濃度勾配を与えて、不純物を溶出させた後、ＮａＣｌ濃度が０．６６Ｍから２Ｍまで線形濃度勾配を与え、Ｌ１蛋白質を溶出させた。
【００８６】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
上記の低濃度ＮａＣｌでインキュベーションされたサンプルを遠心分離した後、上澄み液を結合バッファー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ＋０．３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）で透析した。Ｐ−１１セルロースホスフェートレジン（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ）で充填された８ｃｍ×４ｃｍ Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．、ＵＳＡ）は、上記の結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して、平衡状態を維持した。透析が完了した溶液は、Ｐ−１１カラムを通過させて結合させた後、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して洗浄した。洗浄後、結合バッファーに０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ又は１Ｍ ＮａＣｌが含まれた溶出バッファーをそれぞれ４ｍＬ〜５ｍＬずつ流して、Ｌ１蛋白質を溶出させた。
【００８７】
メンブレンフィルターを利用したＶＬＰ濃縮
前記ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）過程により得たＨＰＶ １６ Ｌ１又はＨＰＶ １８ Ｌ１の分画を集めた後、０．１Ｍ〜０．３２５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０に透析した。透析が完了したサンプルは、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ＹＭ−５０又はＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、製造者が提供する方法によって濃縮した。
【００８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で１２．５％ ＰＡＧＥによって全てのサンプルを分析した（Ｍ．Ｐ． ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｗ．Ｉ． Ｗｈｉｔｅ， Ｆ． Ｐａｌｍｅｒ−Ｈｉｌｌ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｊ．Ａ． Ｓｕｚｉｃｈ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２ （１９９８） ３２−４１）。ＨＰＶ １６ Ｌ１又はＨＰＶ １８ Ｌ１を含むサンプルを、２００ｍＡで１２０分間ＰＶＤＦ膜（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ、ＵＳＡ）に伝達させて、Ｌ１蛋白質を、１次抗体としてラビット抗−ＨＰＶ １６ Ｌ１又は抗−ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）を、２次抗体としてヤギ（ｇｏａｔ）抗−ラビットＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）を使用して検出した。蛋白質は、ウェスタンブロットルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を使用して視覚化した。
【００８９】
電子顕微鏡観察
精製したＨＰＶ Ｌ１蛋白質を、カーボン−コーティングされたグリッドに吸着させた後、２％ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）でネガティブ染色した。透過電子顕微鏡写真は、４１，０００倍の最終倍率でＴＥＭ２００ＣＸを使用して撮影した（Ｓ．Ｎ． Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９ （２００７） ２４−３０）。
【００９０】
シュードウイルスの製作
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質とＬ２蛋白質を発現するプラスミドであるｐ１６ＳｈｅＬＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）とｐ１８ＳｈｅＬＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）を、レポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＳＥＡＰ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）と共に、２９３ＴＴ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してそれぞれ共同−形質転換させた。形質転換された２９３ＴＴ細胞を７２時間培養後、破砕バッファー（ＰＢＳ＋０．５％ Ｂｒｉｊ５８、０．２％ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、０．２％ ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｎａｓｅ）を使用して破砕した。破砕された細胞の細胞デブリスは、１２，０００ｇで１０分間遠心分離して除去し、上澄み液は、中和抗体価の測定に使用した。
【００９１】
マウス免疫
ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーでそれぞれ精製された２μgのＬ１蛋白質で、６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを３週間隔で３回皮下に免疫した。第１の免疫は、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、第１、２のブースティングは、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。対照群は、フロイント完全アジュバントとフロイント不完全アジュバントにＰＢＳを同一比率で希釈して投与した。各グループのマウスに対して、第２のブースティングの十日後、尻尾静脈を通じて血清を採取し、得られた血清は、中和抗体価の測定に使用した。
【００９２】
ＳＥＡＰ−ｂａｓｅｄ中和抗体価の測定
２９３ＴＴ細胞を９６ウェルプレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーションで４時間培養した。ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質で免疫されたマウス血清を１／１００から１／１０，０００，０００まで連続希釈した後、上記のように用意されたＨＰＶタイプ１６及び１８のシュードウイルスと１：４比率で希釈した。希釈された混合液を４℃で１時間反応した後、９６ウェルプレートに用意された２９３ＴＴ細胞に添加した後、７２時間３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。７２時間培養後、培養培地内のＳＥＡＰ発現程度は、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を基質として確認した。マウス血清内中和抗体価は、シュードウイルスだけが適用されたウェルのＯＤ値の半分値で決定した。
【００９３】
実験結果
１. ＨＰＶ １６ Ｌ１精製結果
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ヘパリンクロマトグラフィーによるＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法１のヘパリンクロマトグラフィーの結果である。図４から分かるように、低濃度ＮａＣｌ条件でインキュベーションして不溶性不純物を除去する工程を経なかったサンプルの場合、ヘパリンクロマトグラフィー時、多量の不純物を含んでいた。その反面、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性不純物を除去したサンプルは、ヘパリンクロマトグラフィー時、Ｌ１蛋白質の純度が大きく向上した（図５）。ヘパリンカラムに結合された蛋白質を０．３２５Ｍから０．６６ＭまでＮａＣｌの傾斜勾配で１次溶出させた後、０．６６Ｍから２ＭまでＮａＣｌの濃度勾配で２次溶出させた結果、不純物は、０．３２５Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌ濃度で大部分溶出されて（図５）、ＨＰＶ １６ Ｌ１は、０．５Ｍから１．３ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図６）。この結果は、低濃度ＮａＣｌ条件で不溶性不純物を除去することが、ヘパリンクロマトグラフィーでＬ１蛋白質の純度を大きく増加させるということを意味し、不溶性不純物が除去されたサンプルをヘパリンクロマトグラフィーに適用時、効果的にＬ１蛋白質を精製できることを示す。
【００９４】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
陽イオン交換クロマトグラフィーによるＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法２の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果である。図７及び図８から分かるように、大部分の不純物は、カラムに付着されて除去され（図７）、ＮａＣｌを使用した溶出時、ＨＰＶ １６ Ｌ１は、０．７Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図８）。この結果は、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて純度の高いＬ１を得ることができることを示す。
【００９５】
精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１の純度
上記で精製されたＬ１蛋白質の分画を集めて、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレン（ＹＭ−５０又はＹＭ−１００）で濃縮した。図９から分かるように、Ｌ１蛋白質の純度は、商業的に販売されるＢＳＡ標準物質（９６％以上の純度）とほぼ等しい純度を示すことを確認した（図９のパネルＡ）。ウェスタンブロットの結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される５５ｋＤａのモノマーが検出されて、ＢＳＡのバンドは現れなかった（図９のパネルＢ）。この結果は、上記の精製工程を通じて高い純度のＨＰＶ １６ Ｌ１が精製されたことを示す。
【００９６】
精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）
図１０と図１１から分かるように、上記の二つの工程により精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、ＨＰＶ ＶＬＰｓの大きさと同等の大きさである３５ｎｍ乃至６４ｎｍの直径（平均直径４９ｎｍ）を有するＶＬＰｓに自己組織化された（Ｋ．Ａ． Ａｉｒｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． ３６８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２ （２００６） ７４５−７５２）。したがって、上記の二つの精製方法は、Ｌ１蛋白質の自己組織化に何の影響も及ぼさず、これは、上記の二つの方法ともＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の精製に適していることを意味する。
【００９７】
サンドイッチＥＬＩＳＡを通じて工程別回収率を測定した結果、細胞破砕後、アンモニウムサルフェート沈殿、低濃度ＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する工程まで、不純物は平均８０％が除去されて、この工程までＬ１蛋白質の平均回収率は、８１％であった（表１及び表２）。Ｌ１蛋白質の純度は、細胞破砕工程で０．２％であったが、アンモニウムサルフェート沈殿と不溶性不純物を除去する工程後、０．８％〜１％に向上し、４倍〜５倍程度に純度が向上した（表１及び表２）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
一方、ヘパリンクロマトグラフィーを経て精製されたＬ１蛋白質の回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は、６４％であって（表１）、陽イオン交換クロマトグラフィーを経て精製されたＬ１蛋白質の全体回収率は、６２％であった（表２）。上記の６４％と６２％の回収率は、今まで報告された回収率のうち、最も高い値である。
【０１０１】
２．ＨＰＶ １８ Ｌ１精製結果
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ヘパリンクロマトグラフィーによるＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法１のヘパリンクロマトグラフィーの結果である。図１２から分かるように、低濃度ＮａＣｌ条件でインキュベーションして不溶性不純物を除去する工程を経なかったサンプルの場合、ヘパリンクロマトグラフィー時、多量の不純物を含んでいた。その反面、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性状態に変わった不純物を除去したサンプルは、ヘパリンクロマトグラフィー時、Ｌ１蛋白質の純度が大きく向上したことを確認することができる（図１３）。ヘパリンカラムに付着された蛋白質を０．３２５Ｍから０．６６ＭまでのＮａＣｌ傾斜勾配で１次溶出させた後、０．６６Ｍから２ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配で２次溶出させた結果、大部分の不純物は、０．３２５Ｍから０．５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出されて（図１３）、ＨＰＶ １８ Ｌ１は、１．２Ｍから１．３Ｍ ＮａＣｌ濃度で溶出された（図１４）。この結果は、ＨＰＶ １６ Ｌ１と同様に、ヘパリンクロマトグラフィーを通じてＨＰＶ １８ Ｌ１を効果的に精製することができることを示す。
【０１０２】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
陽イオン交換クロマトグラフィーによるＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図１ｃの方法２の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果である。図１５から分かるように、大部分の不純物は、カラムに結合されて除去され、ＮａＣｌを使用した溶出時、ＨＰＶ １８ Ｌ１は、０．８Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図１６）。この結果は、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて純度の高いＬ１を得ることができることを示す。
【０１０３】
精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１の純度
上記で精製されたＬ１蛋白質の分画を集めて、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレン（ＹＭ−５０又はＹＭ−１００）で濃縮した。図１７から分かるように、濃縮完了後、分子量の小さい不純物が除去されたことを確認し、Ｌ１蛋白質の純度は、商業的に販売されるＢＳＡ標準物質（９６％以上の純度）とほぼ等しい純度を示すことを確認した（図１７のパネルＡ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される５５ｋＤａのＬ１蛋白質は、ウェスタンブロットの結果で同一に検出されて、対照群であるＢＳＡでは、バンドが検出されなかった（図１７のパネルＢ）。この結果は、上記の二つの精製工程を通じて高い純度のＨＰＶ Ｌ１蛋白質を得ることができることを示す。
【０１０４】
精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）
図１８と図１９から分かるように、上記の二つの工程により精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、ＨＰＶ ＶＬＰｓの大きさと同等の大きさである３５ｎｍ乃至６４ｎｍの直径（平均直径４９ｎｍ）を有するＶＬＰｓに自己組織化された（Ｋ．Ａ． Ａｉｒｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． ３６８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２ （２００６） ７４５−７５２）。したがって、上記の二つの方法により精製されたＬ１蛋白質は、ＶＬＰ形成に何の影響も受けず、これは、上記の二つの方法ともＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の精製に適していることを意味する。
【０１０５】
結論的に、複雑な工程と時間が要求されるスクロースクッションや分子ふるいクロマトグラフィーなどの方法を経なくても、高い純度と高い回収率でＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の精製が可能であることを実験的に確認した。
【０１０６】
３．精製されたＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質の中和活性能
上記の方法で精製されたＨＰＶタイプ１６とタイプ１８のＬ１蛋白質をマウスに免疫し、中和抗体価を測定した。その結果、ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶタイプ１６のＬ１は、平均１／１８，０００希釈倍率まで中和抗体価を示した（図２０）。ＨＰＶタイプ１８のＬ１の場合、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１は、平均１／５，０００、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１は、平均１／１７０，０００希釈倍率まで中和抗体価を示した（図２１）。この結果は、上記の方法で精製されたＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質が高い水準で中和抗体を誘導することができることを示す。
【０１０７】
実施例２：新規免疫補助剤としての非常に短いリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ＣＩＡ０５の生産
本発明者らは、健康なヒトの腸に住んでいる大腸菌から、リポポリサッカライド糖鎖の長さが非常に短いＬＰＳを有する菌株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＧ００２１）を既に発掘して、この菌株を寄託機関の韓国微生物保存センターに２００２年５月２日付にて寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ １０３７４をもらった（参照:韓国登録特許第０４５６６８１号公報;ＷＯ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;ＷＯ２００６／１２１２３２）。前記菌株からのＬＰＳ精製は、韓国登録特許第０４５６６８１号公報;ＷＯ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって行った。精製されたＬＰＳの分子量をＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳ（Ｓｈｉｍａｄｚ社,Ａｘｉｍａ−ＬＮＲ Ｖ ２．３．５（Ｍｏｄｅ Ｌｉｎｅｒ、Ｐｏｗｅｒ：１０６））で測定し、測定結果、約３千５百Ｄａの分子量を有することを確認した。精製されたＬＰＳを韓国登録特許第０４５６６８１号公報; ＷＯ ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって、開示されたプロトコールに従って脱毒素化した。簡単に、３ｍｇ／ｍＬの前記精製されたＬＰＳに２Ｎ ＮａＯＨを１：１のボリュームで混ぜた後、６０℃で１０分毎に一回ずつ振って、１４０分間脱アシル化させて、初期０．２Ｎ ＮａＯＨのボリュームの約１／５程度の１Ｎ酢酸を入れてｐＨ７．０に適正した。ｐＨ適正後、エタノール沈殿して、非毒性リポポリサッカライド（ＣＩＡ０５）を得た。
【０１０８】
実施例３：新規免疫補助剤であるＣＩＡ０５と従来の免疫補助剤ＭＰＬとの毒性比較実験
本発明の子宮頸がんワクチンにおいて免疫補助剤として利用される前記実施例で製造したＣＩＡ０５と、既存の子宮頸がんワクチンに使用しているＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）の毒性を比較分析した。健康なヒトの血液を提供してもらってＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）を分離し、これを２４ウェル培養ディッシュに５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で播種した。この際、培養液は、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を混合したものを使用して、一つのウェル当たりの容量は、１ｍＬに均等にした。用意されたディッシュに、下記のような条件でそれぞれ処理した:１）陰性対照群:ＢＳＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μＬ；２）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（ＣＩＡ０５） １０μｇ／１００μＬ；３）ＭＰＬ（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｆ５８３ ＭＰＬ）１０μｇ／１００μＬ。
【０１０９】
１２時間後、処理された培養液を集めて遠心分離し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して、ＴＨＰ−１（Ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）から分泌される炎症性蛋白質であるＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ２１０）を使用してそれぞれ測定した。実験結果、図２２から分かるように、既存の子宮頸がんワクチン補助剤として使用しているＭＰＬより約１／３程度毒性が小さいことを確認した。
【０１１０】
実施例４：本発明の子宮頸がんワクチンの効能探索
マウスを利用した免疫化
前記実験を通じて精製した蛋白質抗原と新規免疫補助剤ＣＩＡ０５を利用して、マウスにおいて免疫反応を誘導した。６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＬＣ、Ｊａｐａｎ）を利用して、実験群当たりマウスをランダムに５匹ずつ割り当てた。前記マウスに、ＣＩＡ０５単独、Ａｌｕｍ（アルミニウムヒドロキシド;Ｂｒｅｎｎｔａｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）単独、又はこの二つの混合物と共に、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ ２μｇ（図１２ａ〜１２ｃ）、ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ １μｇ又は４μｇ（各タイプ０．５μg又は２μg）（図１３ａ〜図１５）を２週間隔で３回筋肉内注射して免疫化させた。対照群マウスには、ＰＢＳを投与した。比較実験のために、既存の市販製品であるＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭを、ヒト基準１／１０容量でマウスに投与した。マウスの血清は、３次接種後、５週目に採取して、ａｎｔｉ−Ｌ１ ＶＬＰ ＩｇＧ力価をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１１１】
エンドポイントＥＬＩＳＡを利用した免疫効能の分析（ＩｇＧ力価分析）
１００μＬのコーティングバッファー（５０ｍＭカーボネート、ｐＨ９．６、４℃）に、前記実施例で製造されたＨＰＶタイプ１６又は１８ ＶＬＰ Ｌ１抗原を０．５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＳＡ）にコーティングした後、一晩中４℃でコーティングした。翌日、ウォッシングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０が溶解されているＰＢＳ）を利用して、各ウェルを３回洗浄して、ブロッキングバッファー（１％のＢＳＡが溶解されているＰＢＳ）を各ウェル当たり３００μＬずつ添加した後、３７℃で１時間ブロッキングした。その後、ウォッシングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０が溶解されているＰＢＳ）を利用して各ウェルを３回洗浄して、採取したマウス試料を、１／２段階希釈法を利用して希釈した後、コーティングされたマイクロプレートに１００μＬずつ入れて、３７℃で２時間反応した。反応が終わった後、マイクロプレートをウォッシングバッファーを利用して２回洗浄して、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されているヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ、８１−６５２０）又はヤギ抗−マウスＩｇＧ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ８１Ｐ）又はヤギ抗−マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ８２Ｐ）を、実験によって１００μＬずつマイクロプレートに入れて、３７℃で２時間反応した。その後、ウォッシングバッファーを利用して２回洗浄し、ＨＲＰと反応して発色する試薬であるＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＢＤ Ｂｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ、５５５５５２１４）を１００μＬずつマイクロプレートに入れて発色させた。常温、暗所で約１０分間発色させた後、発色反応終了のために１Ｎ Ｈ２ＳＯ４ １００μＬをすぐに添加し、このように反応の終わった９６ウェルマイクロプレートをマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）に入れて、４５０ｎｍの波長で各ウェルの発色程度（濃度）を測定した。エンドポイントタイターは、０．１のカット−オフ値を有する非免疫血清の２倍吸収光度を引き起こす最も高い血清希釈で定義されて、平均±ＳＤで示した。
【０１１２】
図２３及び図２４で確認できるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ抗原にＣＩＡ０５を追加した場合、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価のいずれも大きく増加して、特に、力価の増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）で示した図１２ｂからみると、このような増加パターンが明確である。また、Ａｌｕｍよりは、ＣＩＡ０５の免疫促進効果が更に優れていた。したがって、本発明のワクチンの基本的な組成であるＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ抗原とＣＩＡ０５とによりＨＰＶに対する免疫化が非常に優秀に達成できることが分かる。
【０１１３】
また、図２５及び図２６から分かるように、ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ特異総ＩｇＧ力価は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループよりも著しい数値を示した。
【０１１４】
一方、ＩｇＧの亜型で分析した図２７及び図２８から分かるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ特異ＩｇＧ１は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループより少し高く表れた（図２７）。ＩｇＧ２ａの場合は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループよりも著しい数値を示した（図２８）。
【０１１５】
マウス脾臓細胞を利用したインターフェロン−γ濃度分析
上記の方法で免疫化したマウスから最大限無菌的に脾臓を抽出して、ＰＢＳで洗浄した。培養液（５０μＭ β−メルカプトエタノール、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ ＦＢＳ、１×抗生剤が添加されたＲＰＭＩ１６４０）の中で５ｍＬ注射器を利用し、脾臓に１０個の孔を開けた。注射器に培養液を吸い込んだ後、強く吹き出すことを数回繰り返して脾臓細胞を分離し、このように分離された脾臓細胞を集めて、培養液と共に１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。培養液を除去し、１０％ ＦＢＳ １００μｇ／ｍＬストレプトマイシンと５０ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して再懸濁した。次いで、脾臓細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分株して、１５μｇ／ｍＬの濃度でＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰを添加した後、３７℃で４８時間又は７２時間培養した。マウス脾臓細胞から分泌されたインターフェロン−γの濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）で測定した。
【０１１６】
図２５から分かるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ抗原にＣＩＡ０５を追加した場合、インターフェロン−γの濃度が大きく増加して、ＡｌｕｍよりはＣＩＡ０５の免疫促進効果が更に優れていた。したがって、本発明のワクチンの基本的な組成であるＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ抗原とＣＩＡ０５により、ＨＰＶに対する免疫化が非常に優秀に達成できることが分かる。
【０１１７】
また、図３０から分かるように、脾臓細胞により分泌されるインターフェロン−γの濃度は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍとを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで処理されたグループよりも著しい数値を示した。
【０１１８】
一方、図２６、２７、２８及び２９において、本発明のワクチン組成物は、ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１ ＶＬＰｓ、アルミニウムヒドロキシド及びＣＩＡ０５を含むが、これは、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘにおいて、ＭＰＬの代わりにＣＩＡ０５が代替されたと考えられる。即ち、本発明で利用するＣＩＡ０５は、ＭＰＬと比較し、毒性側面だけではなく、ＨＰＶに対する免疫促進能においても著しく優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
結論的に、前記実験結果から、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの両方とも、本発明者らが開発した免疫補助剤のＣＩＡ０５を混合した実験群が、既存の子宮頸がんワクチンで免疫化した実験群より著しい免疫効果を示すことが分かる。これは、現在開発された子宮頸がんワクチンが、持続効果に対する難点があることに鑑みると、本発明の免疫補助剤の添加による免疫力強化は、この問題を解決できる独創的で且つ進歩した発明であるといえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物、ヒト子宮頸がんの予防方法及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）は、現在８０種以上が知られており、ほぼ３０種が性的な接触により子宮頸部に感染を起こし、その約半数が子宮頸がんと関連があることが知られている（非特許文献１参照）。また、ＨＰＶのうち、特にＨＰＶタイプ１６と１８に感染された女性の癌発生率が非感染者の５００倍も高く、これらは、生殖器の上皮細胞を通じて感染された後、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）に悪性転換（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）されることが知られている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
現在開発された子宮頸がんの予防ワクチンは、高危険タイプのＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を利用して開発された。ＶＬＰは、ＨＰＶの主カプシド蛋白質（Ｌ１蛋白質、約５５ｋＤａ）で、他のウイルス遺伝子産物がなくてもＶＬＰに自己整列される性質を有しており、これは、天然ＨＰＶビリオンとほぼ類似している。また、免疫能は長く持続されて、遺伝子型に特異（Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であって、ワクチン候補として高い効率が期待できる長所がある。
【０００４】
このようなＶＬＰを利用したメルク社の‘ガーダシル’は、最もよく発生する四つのＨＰＶタイプ６、１１、１６及び１８のそれぞれの抗原に一般に利用される免疫補助剤である‘Ａｌｕｍ’を使用して開発されたワクチンである。グラクソ・スミスクライン社の‘サーバリックス’は、最も代表的な子宮頸がんの誘発因子であるＨＰＶタイプ１６及び１８に、独自的に開発した免疫補助剤である‘ＡＳ０４’を使用して開発されたワクチンである。
【０００５】
‘ガーダシル’で使用された免疫補助剤であるＡｌｕｍは、ジフテリア、破傷風及びＢ型肝炎ワクチンなどに使用されており、これは、抗原の安定性を増加させて、サイトカインの放出を誘導するという報告があった。しかし、ワクチンの凍結乾燥や凍結を不可能にし、全ての抗原に対して効果的なわけではなく、体液性免疫反応のみを促進させることから、用途が制限されるという大きな短所がある。
【０００６】
ＧＳＫのサーバリックスに含まれるＡＳ０４は、強力で且つ持続的な免疫反応を誘導するための目標で開発されて、アルミニウムヒドロキシド及びモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）で構成されている。ＭＰＬとは、核心的な免疫メカニズムを直接活性化できる免疫促進物質であって、究極的にワクチンに含まれた抗原に対する免疫反応を強化する役割をする。
【０００７】
最近、免疫補助剤が新たに注目を浴びており、子宮頸がんワクチンと共にインフルエンザワクチンなど、多様に使用されている。このような免疫補助剤のうち、バクテリアＤＮＡは、１９６０年代から抗がん剤として注目を浴びてきて、現在も研究が続いているが、その効能が微弱であって、単独では抗がん剤として使用できない（非特許文献３参照）。しかし、バクテリアＤＮＡは、大きい副作用なしに多様な免疫細胞を活性化させることが知られており、特にアジュバントとしてたくさんの長所があることが確認された（非特許文献４参照）。
【０００８】
バクテリアＤＮＡのこのような効果に対し、日本のＹａｍａｍｏｔｏらは、ＣＧを含む配列が重要な役割をすると主張し、米国のＫｒｉｅｇらの研究により広く知られた（非特許文献５及び６参照）。特に、１９９０年代中盤以後は、ＣＰＧ社の関連研究の結果で、メチル化されていないＣＧを含んだ合成ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の可能性が確認されて、特に短い合成ＤＮＡの分解を抑制するためのジエステル結合におけるＳ置換などが研究された。このような努力を通じて、ＣｐＧ−ＯＤＮ関連製品は、アジュバントだけではなく、抗がん剤としても臨床試験が可能になった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｅｙｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ参照）。
【０００９】
しかしながら、ＣｐＧ−ＯＤＮのジエステル結合のＳ置換に対する免疫原性問題及び今でも物足りない抗癌効果などは、解決すべき問題として残っている。現在臨床に使用中であるＣＰＧ ７９０９は、ａｎｔｉ−ＤＮＡ Ａｂを誘発するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであって（非特許文献７参照）、これは、ＳＬＥ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）など、自己免疫疾患と密接な関係がある（非特許文献８参照）。なお、ホスホロチオエート構造は、ＴＩ抗原（Ａｇ）に作用して、感染に対する免疫防御機能に混乱を与えることが知られている（非特許文献９参照）。
【００１０】
１９５０年代から抗癌効果が知られたＬＰＳの場合、ナノグラム水準の汚染によっても敗血症による死亡を招来する毒性により使用が難しかった。特に、ＬＰＳとＤＮＡの結合は、深刻な毒性を示すということが一般的な意見であって、ＤＮＡ関連医薬品においてＬＰＳの除去は、非常に重要な過程とされた（非特許文献１０参照）。効能面において、ＬＰＳによる免疫増加は、ＤＮＡによるものよりずっと強力であるが、抗癌に重要なＴｈ１タイプではくＴｈ２タイプであるため、抗がん剤として適していないと考えられた（非特許文献１１参照）。特に、Ｔｈ２タイプ免疫活性は、Ｔｈ１タイプ免疫活性を抑制するため、ＬＰＳのこのような特性は、ＬＰＳを抗がん剤として利用することを更に難しくした（非特許文献１２参照）。
【００１１】
ＬＰＳに対する弱毒化の試みは絶えず研究されて、特にポリサッカライドチェーンの除去又はリピドＡの脱アシル基化を通じて毒性を減少させることに成功した（非特許文献１３参照）。特に、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化によって得られたモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）の場合、ＬＰＳの毒性を除去した免疫抗がん剤として開発されたが、その効果が微弱であることが知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍ参照）。
【００１２】
このため、本出願人は、上述の免疫補助剤の短所を補完した新規な免疫補助剤を既に開発した（特許文献１参照）。
【００１３】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】韓国登録特許第０７４０２３７号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ Ｈ， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ８： １４７−１５０
【非特許文献２】Ｈａｕｓｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ． Ａｃｔａ． １２８８： ５５−７８， １９９６
【非特許文献３】Ｇｌｉｃｋ， Ｊ． Ｌ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ＤＮＡ． ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２７：２３３８，１９６７
【非特許文献４】ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ＭＪ， ｅｔ ａｌ． ＣｐＧ ＤＮＡ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｅ． ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｎｏｖ１；１６１（９）：４４６３−６．１９９８
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｉｑｕｅ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＩＦＮ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔ ＩＦＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２，１９９２
【非特許文献６】Ｋｒｉｅｇ ＡＭ， Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｗｉｔｈ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ． Ｍａｒ； ６（２）：８８−９５．２００４
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１ Ａｕｇ；１００（２）：１５７−６３
【非特許文献８】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８６ Ｊｕｌｙ；６（４）：２９２−８
【非特許文献９】Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｄｅｃ；３５（１８）：１１６１−７０
【非特許文献１０】Ｇａｏ ＪＪ． ｅｔ． ａｌ， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６６（１１）：６８５５−６０，２００１
【非特許文献１１】Ｌｅｂｍａｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ｃａｕｓｅｓ ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｔｏ ＩｇＥ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． Ｓｅｐ １；１６８（３）：８５３−６２． １９８８
【非特許文献１２】Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ Ｏｃｔ；２１（１０）：４７９−８３． ２０００
【非特許文献１３】Ｋａｔｚ ＳＳ ｅｔ ａｌ Ｄｅａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｗｈｏｌｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｒａｂｂｉｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｘｕｄａｔｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ｄｅｃ １７；２７４（５１）：３６５７９−８４ １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、上述の従来の子宮頸がんワクチンの問題点を解決できる新規なワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＨＰＶ １６又は１８のＬ１ ＶＬＰを利用する免疫化過程において、リピドＡから一部脂肪酸を除去した非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を免疫補助剤として利用する場合、従来のＶＬＰに基づいたワクチンより大きく改善されたＨＰＶ免疫反応を誘導して、子宮頸がんの予防のための優れたワクチンができることを確認し、本発明を完成した。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、ヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、ヒト子宮頸がんの予防方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のまた他の目的は、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの製造方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、ＨＰＶ １６のＬ１ ＶＬＰをコードする新規な核酸を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、ＨＰＶ １８のＬ１ ＶＬＰをコードする新規な核酸を提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、上記の新規な核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、更に明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶタイプ１８のＬ１ ＶＬＰ又はこれらの組み合わせ、及び（ｉｉ）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含むヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物を提供する。
【００２５】
本発明の他の様態によると、本発明は、前記本発明の薬剤学的組成物をヒトに投与する工程を含むヒト子宮頸がんの予防方法を提供する。
【００２６】
本発明者らは、上述の従来の子宮頸がんワクチンの問題点を解決できる新規なワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＨＰＶ １６又は１８のＬ１ ＶＬＰを利用する免疫化過程において、リピドＡから一部脂肪酸を除去した非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を免疫補助剤として利用する場合、従来のＶＬＰに基づいたワクチンより大きく改善されたＨＰＶ免疫反応を誘導して、子宮頸がんの予防のための優れたワクチンができることを確認した。
【００２７】
本発明の薬剤学的組成物に利用されるＶＬＰは、ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１又はＨＰＶタイプ１８ Ｌ１由来である。ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８は、高危険性ＨＰＶと知られており、子宮頸がんを誘発する代表的なＨＰＶである。
【００２８】
本発明の明細書において用語‘ＨＶＰ Ｌ１蛋白質’は、ＨＰＶのＬ１遺伝子から発現されるもので、ＨＰＶのカプシド（ｃａｐｓｉｄ）を構成する主要（ｍａｊｏｒ）蛋白質を意味する。Ｌ１蛋白質は、カプシドを構成する他のマイナー（ｍｉｎｏｒ）蛋白質であるＬ２蛋白質と共に、あるいはＬ１蛋白質単独で、適した条件下でウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ）される特性を有する。
【００２９】
本発明で利用されるＶＬＰは、ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８のＬ１蛋白質の天然由来（Ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）総配列及びこれの機能的Ｌ１蛋白質誘導体を含む。用語‘ＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体’は、天然由来ＨＰＶ Ｌ１総配列と同一ではないが、ＶＬＰを形成することができて、且つ免疫反応を誘導することができる天然由来ＨＰＶ Ｌ１蛋白質の誘導体を意味する。例えば、前記ＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体は、核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の除去された切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｌ１蛋白質である。例えば、ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１の場合、Ｃ末端の３４個アミノ酸が除去された形態、ＨＰＶタイプ１８ Ｌ１の場合、Ｃ末端の３５個アミノ酸が除去された形態が、本発明で利用できるＨＰＶ Ｌ１機能的誘導体である。本発明で利用されるＨＰＶ １６及び１８のＬ１ ＶＬＰの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び４に示されている。
【００３０】
本発明の子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物で免疫反応を誘発する抗原として、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ又はＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰが利用されて、好ましくは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰの両方とも利用される。
【００３１】
選択的に、抗原として、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰの他に、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８及びＨＰＶタイプ６８のＬ１ ＶＬＰｓからなる群から選択される少なくとも一つのＬ１ ＶＬＰを更に含むことができる。
【００３２】
選択的に、本発明で利用されるＬ１ ＶＬＰは、他の蛋白質、例えば、Ｌ２蛋白質と融合されることもできる。
【００３３】
本発明のワクチン組成物において最も大きい特徴は、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を利用することである。本明細書で最初に採択される用語‘ＬＯＳ（リポオリゴ糖：Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）’は、ＬＰＳ（リポ多糖：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の変形体であって、天然（Ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＬＰＳより短い糖鎖を有しており、分子量が小さいものを意味する。脱アシル化前のＬＯＳは、好ましくは、分子量が５，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａである。用語‘脱アシル化ＬＯＳ’は、このようなＬＯＳから、リピドＡのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合された脂肪酸が除去されて、ＬＰＯと比較し、毒性が大きく減少されたものを意味する。リピドＡのグルコサミンに、脂肪酸は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合を通じて結合されている。本発明の脱アシル化ＬＯＳは、リピドＡの脱アシル化により、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合された脂肪酸が除去されたものを示す。
【００３４】
脱アシル化非毒性ＬＯＳは、多様な方法を通じて製造できるが、本発明者らの先行特許である韓国登録特許第０４５６６８１号公報；ＷＯ２００４／０３９４１３；韓国登録特許第０７４０２３７号公報；及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって製造できる。例えば、ＬＰＳに強塩基（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ）を処理して脱アシル化して、リピドＡから一部脂肪酸を除去して脱毒素化する。
【００３５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＬＰＳにアルカリ処理して脱アシル化して非毒性化されたものである。前記アルカリの好ましい例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２が挙げられ、より好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であり、更に好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であって、最も好ましくは、ＮａＯＨである。
【００３６】
ＬＰＳの毒性の程度は、当業界に公知された多様な方法を通じて分析できる。例えば、ＬＰＳが処理されたＴＨＰ−１（Ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）に分泌されるＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）の量を測定して毒性を分析することができる。本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、従来のＬＰＳと比較し、相対的に少ない量のＴＮＦ−α分泌を誘導する。
【００３７】
本発明で利用される免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳの他の特徴としては、分子量が、一般に従来に利用されるＬＰＳと比較して小さいということである。本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、好ましくは、１，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、より好ましくは、２，０００Ｄａ〜５，０００Ｄａ、更に好ましくは、２，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａ、より更に好ましくは、３，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａ、最も好ましくは、３，２００Ｄａ〜３，７００Ｄａの分子量を有するものである。このような分子量は、当業界の通常的な方法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳを利用して測定することができる。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来であり、最も好ましくは、本発明者らの独自的な菌であるＥ．ｃｏｌｉ ＥＧ００２１（ＫＣＣＭ １０３７４）由来のものである。
【００３９】
本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、免疫促進（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）効能が従来の免疫補助剤と比較して優れているだけではなく、毒性も著しく減少されており、本発明のワクチン組成物に非常に適している。下記の実施例で立証したように、ＬＰＳの毒性を除去するために、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化を通じて得たモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）より、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、毒性が遥かに少ない。
【００４０】
また、下記実施例（図１２ａ及び１２ｂ参照）に示されたように、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳをＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと共に投与した場合、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）に係わるＩｇＧ２ａだけではなく、Ｔｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）に係わるＩｇＧ１レベルも増加し、脱アシル化非毒性ＬＯＳがＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと共に上昇的な免疫反応を誘導していることが分かる。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、その基本的な組成、即ち、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰ又はその組み合わせと脱アシル化非毒性ＬＯＳのみでも十分な免疫反応を誘導して、子宮頸がん予防効能を発揮することができる。選択的に、本発明のワクチン組成物は、他の免疫補助剤を更に含むことができ、例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素又はアルミニウムの塩又はその水和物を含むことができる。前記塩は、好ましくは、オキシド、ペルオキシド、ヒドロキシド、カーボネート、ホスフェート、パイロホスフェート、ヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、サルフェート又はシリケートと共に形成される。例えば、本発明のワクチン組成物において追加的に利用できる免疫補助剤は、マグネシウムヒドロキシド、マグネシウムカーボネートヒドロキシドペンタヒドレート、チタニウムジオキシド、カルシウムカーボネート、バリウムオキシド、バリウムヒドロキシド、バリウムペルオキシド、バリウムサルフェート、カルシウムサルフェート、カルシウムパイロホスフェート、マグネシウムカーボネート、マグネシウムオキシド、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート及び水和されたアルミニウムカリウムサルフェート（Ａｌｕｍ）を含む。最も好ましくは、本発明のワクチン組成物において追加的に利用できる免疫補助剤は、アルミニウムヒドロキシドである。
【００４２】
本発明の好ましい具現例によると、ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１ ＶＬＰは、（ｉ）ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１をコードするヌクレオチド配列を含む酵母（ｙｅａｓｔ）を培養する工程と、（ｉｉ）前記培養された酵母を溶解（ｌｙｓｉｓ）する工程と、（ｉｉｉ）前記酵母溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、を含む精製工程を通じて得たものである。
【００４３】
以下、上記の精製工程について詳細に説明する。
【００４４】
本発明のワクチン薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であって、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。
【００４６】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、好ましくは、１日当たり、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００４７】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。
【００４８】
本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、従来の子宮頸がんワクチンであるＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭよりＨＰＶに対する免疫反応を大きく誘導し、子宮頸がん予防効能に更に優れているだけではなく、免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳの毒性がほとんどなく、安全性側面でも非常に優れている。
【００４９】
特に、本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、下記の実施例で立証したように、本発明のワクチン組成物を投与した場合、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）に係わるインターフェロン−γ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのレベルがＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより高く、なお、Ｔｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）に係わるＩｇＧ１レベルもＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより高い。即ち、本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、ＨＰＶに対する免疫において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）とにおいて、ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより優れている。
【００５０】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下の工程を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法を提供する：
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１−コーディングヌクレオチド配列を含む酵母（ｙｅａｓｔ）を培養する工程と、
（ｉｉ）前記培養された酵母を溶解（ｌｙｓｉｓ）する工程と、
（ｉｉｉ）前記酵母溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、
（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程。
【００５１】
本発明者らは、ＨＰＶに対するワクチン製造用途のＨＰＶ ＶＬＰｓの酵母発現システムを利用した生産工程において、ＨＰＶ ＶＬＰｓの生産工程を単純化して収率を増加させることのできる精製方法を開発するために鋭意研究した。その結果、酵母細胞破砕液をアンモニウムサルフェートにより沈殿させて、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行うと、精製効率（収率及び精製度）を大きく向上させることができることを確認した。
【００５２】
以下、各工程にしたがって本発明を詳細に説明する。
【００５３】
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を発現する形質転換酵母培養
本発明の方法において、Ｌ１蛋白質が由来するＨＰＶのタイプは特に限定されず、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８及びＨＰＶタイプ６８を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のＬ１蛋白質は、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３及びＨＰＶタイプ４５からなる群から選択されるＨＰＶ由来のものであり、より好ましくは、ＨＰＶタイプ１６及びタイプ１８由来のものである。
【００５４】
本発明において、宿主細胞（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）として利用される細胞は、酵母であり、例えば、パン酵母（ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセスパストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセスエスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などを使用することができるが、これらに限定されない。最も好ましくは、本発明の宿主酵母は、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００５５】
ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を発現する形質転換酵母は、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を成功的に発現させる発現ベクターで形質転換された酵母細胞を意味する。前記発現ベクターで発現しようとするＨＰＶ Ｌ１遺伝子のアップストリームに当業界に公知された多様なプロモーター、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， Ｒ． Ｗ．， Ｍｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４： １４４０−１４４８ （１９８４））、ＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８： ２６７４−２６８２， （１９８３））、ＰＨ０５プロモーター（ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ６７５−６８０， （１９８２））、又はＭＦａｌプロモーターが結合されていてもよく、ポリアデニル化配列、例えば、ＡＤＨＩ、ＭＦａｌ又はＴＰＩ由来ポリＡ配列（Ａｌｂｅｒ， Ｔ． ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｇ．， Ｊ． Ｍｏｌ． ＆ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ４１９−４３４ （１９８２））が含まれてもよい。酵母発現ベクターとしてＹＥｐ６、ＹＥｐ１３ＹＥｐ４、及びＹＥＧα（Ｓ．Ｎ． Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９ （２００７） ２４−３０； Ｒ． Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７ （１９９３） ６９２９−６９３６）が公知である。ＨＰＶ Ｌ１蛋白質発現形質転換された酵母は、当業界に公知された方法を使用して容易に製造することができ、このような方法は、米国特許Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ＵＳ ７２５０１７０、ＵＳ ６６１３５５７、ＵＳ ５８８８５１６、ＵＳ ５８７１９９８、ＵＳ ５６１８５３６、ＵＳ ５４３７９５１などに開示されており、これらの特許文献の内容は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によると、前記形質転換酵母は、炭素源としてグルコース及びガラクトースの一つ以上の炭素源が添加された培地で培養する。本発明のまた他の好ましい具現例によると、前記グルコースとガラクトースの比率は、質量基準でグルコース：ガラクトース＝０〜１：３〜４であり、より好ましくは、質量基準でグルコース：ガラクトース＝０．５〜１：３．５〜４であって、最も好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：３である。本発明の方法において培地に含有されたグルコースとガラクトースの質量比率が上記のような範囲にある場合、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質の発現が最大になる。
【００５７】
形質転換酵母の培養時に利用される例示的な培地は、ＹＰＤＧ培地（酵母抽出液、ペプトン、グルコース及びガラクトースを含む）である。
【００５８】
（ｉｉ）培養された酵母の溶解
本発明で培養された酵母細胞の溶解方法は、酵母細胞の全体溶解物（ｌｙｓａｔｅ）が得られる方法であればよく、特定な方法に限定されない。本発明に使用できる溶解方法は、例えば、ソニケーション、ガラスビーズによる破砕を利用する方法があるが、これに限定されない。
【００５９】
（ｉｉｉ）酵母溶解物の不純物を除去するためのアンモニウムサルフェート沈殿
酵母の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）にアンモニウムサルフェートを添加して発現された蛋白質を沈殿させて、不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）を除去した。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、添加されるアンモニウムサルフェートの濃度は、２０質量％〜６０質量％であり、より好ましくは、４０質量％〜５０質量％であって、最も好ましくは、４２質量％〜４８質量％である。アンモニウムサルフェートの濃度が４０質量％未満であると、本発明で発現されたＨＰＶ Ｌ１蛋白質の沈殿効率が落ちて、５０質量％を超えると、アンモニウムサルフェートの増加分だけのＬ１蛋白質沈殿増加効果が得られない。
【００６１】
選択的に、アンモニウムサルフェート沈殿により形成された蛋白質ペレットを溶解した後、０．５Ｍ以上のＮａＣｌを添加して、少なくとも１２時間以上４℃でインキュベーションする。
【００６２】
（ｉｉｉ−２）低濃度塩（例えば、ＮａＣｌ）における不純物除去
前記工程（ｉｉｉ）で得た溶液を低濃度塩（例えば、ＮａＣｌ）の含まれた緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝液）に透析して交換させた後、常温でインキュベーションし、不純物を不溶性状態にして除去する。
【００６３】
本発明の一具体例において、前記低濃度塩の濃度は、０．００１Ｍ〜０．３Ｍ、より好ましくは、０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、最も好ましくは、０．１Ｍ〜０．８Ｍであって、使用される塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４及び（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる群から選択されて、最も好ましくは、ＮａＣｌである。
【００６４】
本発明の好ましい具現例において、低濃度の塩の処理過程は、非イオン性界面活性剤の存在下で行われて、前記非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エーテル、Ｃ１６−２４脂肪酸、脂肪酸モノ−、ジ−又はポリ−グリセリド、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール、アルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース又はポリオキシアルキレン蓖麻子油誘導体を含み、好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイン２０）、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノラウレート（ツイン２１）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ツイン４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ツイン６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート（ツイン６５）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイン８０）又はポリソルベート８０）又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート（ツイン８５）のようなポリオキシエチレンソルビタンモノ−又はトリ−ラウリル、パルミチル、ステアリル又はオレイルエステルである。また、前記非イオン性界面活性剤は、０．００１％〜０．０１％の濃度であることが好ましい。
【００６５】
この低濃度ＮａＣｌの処理過程は、不純物を除去するに非常に効率的であり、本発明の方法において、工程の短縮化及び精製効率の改善に大きく寄与する工程である。
【００６６】
この工程で生成された不溶性蛋白質を遠心分離して除去する場合、次の工程であるヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーで溶出されるＶＬＰの純度を大きく増加させることができる。したがって、本工程は、簡便な方法で不純物を除去し、精製効率を大きく増加させる効果を有する。
【００６７】
（ｉｖ）ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー
不純物が除去された溶液に対して、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行う。
【００６８】
上記の方法を通じて不純物が除去された溶液を、ヘパリンクロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて精製する場合、残余不純物を非常に効果的に除去することができる。
【００６９】
ヘパリンクロマトグラフィーを行う場合、まず、前記工程（ｉｉｉ）又は（ｉｉｉ−２）の結果物をヘパリンレジンカラムに適用する前に、ヘパリンレジンを適した結合バッファーで平衡化させる。結合バッファーは、好ましくは、ＮａＣｌ及び非イオン性界面活性剤（例えば、ツイン８０）を含み、ＮａＣｌは、低濃度（０．１Ｍ〜０．２Ｍ）が好ましい。次いで、ヘパリンクロマトグラフィーに試料を適用した後、レジンに結合された蛋白質を溶出する。溶出方法は、ＮａＣｌ線形濃度勾配が好ましく、より好ましくは、０．３３Ｍ〜０．６６ＭのＮａＣｌ線形濃度勾配で不純物を溶出させた後、０．６６Ｍ〜２ＭのＮａＣｌ線形濃度勾配で所望のＬ１蛋白質を溶出させる。
【００７０】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、多様なレジンを利用して行うことができ、好ましくは、スルホ、スルホアルキル（例えば、スルホメチル、スルホエチル及びスルホプロピル）、ホスフェート又はホスフェートアルキル作用基が結合された陽イオン交換剤を利用して行って、最も好ましくは、ホスフェート作用基が結合された陽イオン交換剤を利用して行う。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、まず、前記工程（ｉｉｉ）又は（ｉｉｉ−２）の結果物をヘパリンレジンカラムに適用する前に、ヘパリンレジンを適した結合バッファーで平衡化させる。結合バッファーは、好ましくは、ＮａＣｌ及び非イオン性界面活性剤（例えば、ツイン８０）を含み、ＮａＣｌは、低濃度（０．３Ｍ〜０．４Ｍ）が好ましい。次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーに試料を適用した後、レジンに結合された蛋白質を溶出する。溶出方法は、ＮａＣｌ段階濃度勾配が好ましく、より好ましくは、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ及び１ＭのＮａＣｌが含まれた溶出バッファーを利用して所望のＬ１蛋白質を溶出させる。
【００７１】
（濃縮）
本発明の好ましい具現例によると、前記クロマトグラフィー過程を通じて得たＬ１蛋白質分画物をメンブレンフィルターで濃縮させる。好ましくは、クロマトグラフィー分画物を、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレンを使用して濃縮する。平均５０ｎｍ程度の大きさを有するＶＬＰの場合、他の蛋白質に比べて大きい大きさを有するため、メンブレンを通過できず濃縮される反面、大部分の残余不純物は、メンブレンを通過して除去される効果を有する。したがって、この工程は、ＨＰＶ １６ Ｌ１の純度を更に高めると同時に濃度を高める効果を有する。
【００７２】
本発明の製造方法は、クロマトグラフィー工程の前に、細胞破砕液を特定条件で処理して不純物を除去する方法を使用することにより、Ｌ１蛋白質の精製効率を極大化した。細胞破砕液は、アンモニウムサルフェートを添加して沈殿することにより、不純物を１次的に除去して、２次的に低濃度塩条件でインキュベーションして不純物を除去する方法を使用する。上記の場合のように、アンモニウムサルフェートの沈殿後、低濃度塩の条件でインキュベーションして不純物を除去する場合、不純物の８０％を除去することができて、Ｌ１蛋白質は、８０％以上を回収することができて、簡便な方法で純度を高めることができる。したがって、数回のクロマトグラフィー工程を経なくても高い純度のＬ１蛋白質を精製することができて、これをパイロット及び産業的規模で生産及び精製に適用すると、蛋白質生産に要求される時間、製造費用及び労働力を大きく節減できる効果がある。
【００７３】
本発明の他の様態によると、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸を提供する。また、本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸を提供する。
【００７４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、上記のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ）を提供する。また、本発明は、上記のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１０３７Ｐ）を提供する。
【００７５】
配列番号１及び配列番号３のヌクレオチド配列は、ＨＰＶのＬ１蛋白質をコードする核酸が酵母で高効率で発現されるように最適化したものである。
【発明の効果】
【００７６】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ａ）本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、抗原としてＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰ又はＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰを利用して、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳを利用する。
（ｂ）免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＨＰＶに対する免疫反応において非常に優れた免疫促進効能を発揮するだけではなく、毒性がほとんどなくて安全性に非常に優れている。
（ｃ）また、脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰにより誘導される免疫反応において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応の両方ともを増加させて、ＨＰＶに対する上昇的な免疫反応を誘導する。
（ｄ）本発明の子宮頸がんワクチン組成物は、ＨＰＶに対する免疫において、Ｔｈ１タイプ免疫反応（細胞性免疫）とＴｈ２タイプ免疫反応（体液性免疫）の両方ともにおいてＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭより優れており、子宮頸がんワクチンとして優れた効能を奏する。
（ｅ）本発明のＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの製造方法は、ただ一回のクロマトグラフィー工程を経ることで高い純度のＬ１蛋白質を得ることができ、これをパイロット及び産業的規模で生産及び精製に適用すると、蛋白質生産に要求される時間、製造費用及び労働力を大きく節減できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＶＬＰ蛋白質を発現するＹＥＧ（ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）に対する遺伝子地図である。ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子、Ｕｒａ３は、ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ合成遺伝子であり、２−ｍｉｃｒｏｎは、複製原点であって、他の記号は、制限酵素位置を示す。
【図２】ＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＶＬＰ蛋白質を発現するＹＥＧ（ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）に対する遺伝子地図である。ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子、Ｕｒａ３は、ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ合成遺伝子であり、２−ｍｉｃｒｏｎは、複製原点であって、他の記号は、制限酵素位置を示す。
【図３】ＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１の精製過程の模式図である。アンモニウムサルフェートの沈殿後、低い濃度のＮａＣｌ条件で不溶性に変化された蛋白質を除去した試料は、二種類の方法を通じて精製された。本発明のクロマトグラフィー法ではヘパリンクロマトグラフィー（方法１）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（方法２）を使用した。
【図４】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果である。図４は、不溶性不純物を除去する過程を経ずに、ヘパリンクロマトグラフィーを進行した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図５】図５は、図１ｃの方法１におけるヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図６】図６は、１次ヘパリンクロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１と２は、ローディング試料と非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図７】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果である。図７は、図１ｃの方法２における陽イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図８】図８は、陽イオン交換クロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図９】ＨＰＶ １６ Ｌ１の精製結果であって、ヘパリンクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーのＬ１分画を集めた後、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し(ｃｕｔ−ｏｆｆ)できるメンブレンフィルターを使用して濃縮した結果である。パネルＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、Ｂは、ウェスタンブロット結果である。レーン１、２、３は、それぞれＢＳＡ、方法１で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１、方法２で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１を示す。それぞれのサンプルは、ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙで定量されて、２００ｎｇずつ同一量がローディングされた。
【図１０】図１ｃの方法１で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１１】図１ｃの方法２で精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１２】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果である。図１２は、不溶性不純物を除去する過程を経ずにヘパリンクロマトグラフィーを進行した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１３】図１３は、図３の方法１（Ｍｅｔｈｏｄ １）におけるヘパリンクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１４】図１４は、ヘパリンクロマトグラフィーのウェスタンブロット結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれ分画９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８を示す。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１５】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果である。図１５は、図１ｃの方法２（Ｍｅｔｈｏｄ ２）における陽イオン交換クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１６】図１６は、陽イオン交換クロマトグラフィーのウェスタンブロットの結果である。レーン１及び２は、それぞれローディング試料及び非結合試料であり、レーン３は、ｗａｓｈを示す。レーン４、５、６、７、８、及び９は、分画１、２、３、４、５、及び６を示す。分画１、２及び３は、それぞれ０．６Ｍ、０．７Ｍ、及び０．８ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出されて、分画４、５及び６は、１ＭのＮａＣｌが含まれたバッファーで溶出された。矢印は、Ｌ１蛋白質の分子量を示す。
【図１７】ＨＰＶ １８ Ｌ１の精製結果であって、ヘパリンクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーのＬ１分画を集めた後、５０ｋＤａから１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレンフィルターを使用して濃縮した結果である。パネルＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂは、ウェスタンブロットの結果である。レーン１、２及び３は、それぞれＢＳＡ、方法１で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１、及び方法２で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１を示す。それぞれのサンプルは、ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙで定量されて、２００ｎｇずつ同一量がローディングされた。
【図１８】図１ｃの方法１で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図１９】図１ｃの方法２で精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の電子顕微鏡写真である。精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、カーボンコーティングされた銅グリッド（ｇｒｉｄ）に吸着させて、ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）で染色した後、透過電子顕微鏡で検査した。拡大倍率は、４１，０００倍であり、バー（ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図２０】ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１の中和活性測定結果である。精製されたそれぞれのＬ１蛋白質をマウスに３週間隔で３回免疫して、血清内中和抗体価は、ＳＥＡＰに基づいた中和抗体活性測定法で測定した。Ｘ軸の対照群、ヘパリン及び陽イオン交換は、それぞれ免疫補助剤のみで免疫したグループ、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループ、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループを示す。Ｙ軸の数字は、血清の希釈倍率を示す。
【図２１】ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１の中和活性測定結果である。精製されたそれぞれのＬ１蛋白質をマウスに３週間隔で３回免疫して、血清内中和抗体価は、ＳＥＡＰに基づいた中和抗体活性測定法で測定した。Ｘ軸の対照群、ヘパリン及び陽イオン交換は、それぞれ免疫補助剤のみで免疫したグループ、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループ、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１と免疫補助剤で免疫したグループを示す。Ｙ軸の数字は、血清の希釈倍率を示す。
【図２２】新規免疫補助剤（ＣＩＡ０５）がＭＰＬより細胞毒性（ＴＮＦ−α分泌）が低いことを示すグラフである。
【図２３】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による抗体価（図２３）を示すグラフである。白のバーは、総ＩｇＧ、斜線のバーは、ＩｇＧ１、及び黒のバーは、ＩｇＧ２ａに対するものである。
【図２４】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による抗体価の増加倍数（図２４）を示すグラフである。白のバーは、総ＩｇＧ、斜線のバーは、ＩｇＧ１、及び黒のバーは、ＩｇＧ２ａに対するものである。
【図２５】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による脾臓細胞からのインターフェロン−γ分泌程度を分析した結果である。斜線のバーは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰ処理期間が２日間、黒のバーは、３日間に該当するものである。
【図２６】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による血清総ＩｇＧ力価を分析した結果であり、図１３ａは、ＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する総ＩｇＧ力価を分析した結果である。
【図２７】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による血清総ＩｇＧ力価を分析した結果であり、図１３ｂは、ＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰに対する総ＩｇＧ力価を分析した結果である。
【図２８】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合によるＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する血清内ＩｇＧ１力価（図１４ａ）を分析した結果である。
【図２９】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合によるＨＰＶ １６ Ｌ１ ＶＬＰに対する血清内ＩｇＧ２ａ力価（図１４ｂ）を分析した結果である。
【図３０】新規免疫補助剤ＣＩＡ０５、ＨＰＶ １６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ及びアルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍ）の濃度別混合による脾臓細胞からのインターフェロン−γ分泌程度を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８ ＶＬＰ Ｌ１蛋白質の生産及び精製
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質を生産する組み換え酵母発現システムの構築
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１ ＤＮＡ配列の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドン／発現最適化を行って、配列番号１のＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＤＮＡ配列及び配列番号３のＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＤＮＡ配列を得て、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ＢＨＢ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ”サービス（ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ参照）を利用してＤＮＡをそれぞれ合成した（参照:配列番号１及び３）。この際、最適化されたＤＮＡ配列の前と後ろにＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）とＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）制限酵素位置を連結した。その後、クローニング過程を経て、本発明に使用される組み換えＨＰＶ １６ Ｌ１及びＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質を発現できる組み換えプラスミドＤＮＡを、酵母発現ベクター（ＹＥＧ）を使用して構築し、ＹＥＧα−ＨＰＶ１６Ｌ１−ＯＲＳ及びＹＥＧα−ＨＰＶ１８Ｌ１−ＯＲＳを得た（図１）。クローニング過程は、以下のようである：配列番号１のＨＰＶタイプ１６ Ｌ１ ＤＮＡ配列又は配列番号３のＨＰＶタイプ１８ Ｌ１ ＤＮＡ配列が挿入されたｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び酵母発現ベクターであるＹＥＧ−ＭＣＳベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩで切断した。切断されたＤＮＡをそれぞれ電気泳動した後、ゲル抽出キット（ＨｉＹｉｅｌｄＴＭ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃ＹＤＦ１００、ＲＢＣ））を使用して抽出した。ＨＰＶタイプ１６及び１８のＤＮＡと、ベクターとして使用されるＹＥＧ−ＭＣＳベクターを、リガーゼ（ＤＡＫＡＲＡ、２０１１ａ）を利用して接合させた後、ｄａｍ（−） Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（ＴＡＫＡＲＡ、９１２９）に形質転換させた。形質転換後に形成されたコロニーを計数して、それぞれ培養した後、プラスミドを抽出して、酵素で切断して大きさを確認した。大きさが確認されたプラスミドを酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換させて、ＳＤ（−ｕｒａ）プレートにスプレードした。コロニーが生成されたら、２５個ずつピッキングして接種した（２８０ｒｐｍ、３０℃、振とう、２日間）。ＳＤ（−ｕｒａ）培地からよく育ったもののみを選別して、ＹＰＤＧ培地に接種した。培養が完了すると、培養時のＯ．Ｄ値、細胞破砕時の総蛋白質量、精製（下記の方法で精製）後のＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析をおこなって、最も優れた菌株を選定した。
【００８０】
組み換えＨＰＶ１６Ｌ１及びＨＰＶ１８Ｌ１が導入されたＹＥＧα−ＨＰＶ１６Ｌ１−ＯＲＳ及びＹＥＧα−ＨＰＶ１８Ｌ１−ＯＲＳベクターでそれぞれ形質転換された菌株を寄託機関の韓国微生物保存センターに２００９年１０月８日付にて寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ及びＫＣＣＭ１１０３７Ｐをもらった（ＫＣＣＭ１１０３６Ｐ − Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＧ０２１６； ＫＣＣＭ１１０３７Ｐ − Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＧ０２１８）。
【００８１】
細胞の培養
バッフル板（ｂａｆｆｌｅ）が付着されたフラスコに、ウラシル（ｕｒａｃｉｌ）のない合成完全培地ＳＤ−ｕｒａ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に前記製造した酵母菌株細胞を接種して、３０℃で振とう培養した。ＧＡＬ１０プロモーターからＨＰＶ１６ Ｌ１及びＨＰＶ１８ Ｌ１蛋白質を発現させるために、ＹＰＤＧ培地を使用した。全ての培地に１％酵母抽出液（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）及び２％ペプトン（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を添加して、１％のグルコースと３％ガラクトースが含まれるようにした。ＹＰＤＧ培地３Ｌにプラスミド前記形質転換された酵母菌株を接種した後、３０℃で４８時間振とう培養した。
【００８２】
細胞溶解物（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ）の製造
培養した細胞をペレットで収得し、得られた細胞ペレットを７０℃で冷凍した。全ての後続過程は、４℃で行った。細胞ペレットを溶かして、氷冷させた１００ｍＬブレークバッファー（ｂｒｅａｋ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）に再懸濁させて、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を添加した。細胞をガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と共にビード−ビーター（Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）のチャンバーに移して、５分間ｖｏｒｔｅｘした後、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１０分間１０，０００ｇで数回遠心分離してきれいに除去した。
【００８３】
アンモニウムサルフェート沈殿
きれいに除去された細胞溶解物にアンモニウムサルフェート（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加して、ＨＰＶ Ｌ１蛋白質を回収した。回収効率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を評価するために、アンモニウムサルフェートを４３％又は４５％濃度で添加した後、それぞれ４℃で３０分間攪拌して、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、蛋白質ペレットを得た。アンモニウムサルフェートで沈殿されたペレットをＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０ 緩衝液で再懸濁した後、ＮａＣｌを更に添加して、最終ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ以上になるようにした。その後、４℃で少なくとも１２時間以上インキュベーションした。
【００８４】
低濃度ＮａＣｌインキュベーションによる不純物の除去
上記の高濃度ＮａＣｌでインキュベーションされた溶液をＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０緩衝液で透析した後、リン酸ナトリウムｐＨ７．２緩衝液に０．１５Ｍ ＮａＣｌと０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０が含まれた溶液で希釈して、最終蛋白質の濃度が２〜５ｍｇ／ｍＬになるようにした。この溶液を常温で２時間以上放置して、非溶解性状態の蛋白質が生成されるようにした。生成された非溶解性蛋白質は、１０，０００ｇで１０分間遠心分離して除去した。
【００８５】
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
上記の低濃度ＮａＣｌでインキュベーションされたサンプルを遠心分離した後、上澄み液を結合バッファー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ＋０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）で透析した。ヘパリンレジン（５ｍＬ又は２０ｍＬ）で充填されたカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）も、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して、平衡を維持した。透析が完了した溶液は、ヘパリンカラムを通過させて結合させた後、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して洗浄した。溶出法は、ＮａＣｌ濃度が０．３３Ｍから０．６６Ｍまで３５分間上昇するように線形濃度勾配を与えて、不純物を溶出させた後、ＮａＣｌ濃度が０．６６Ｍから２Ｍまで線形濃度勾配を与え、Ｌ１蛋白質を溶出させた。
【００８６】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
上記の低濃度ＮａＣｌでインキュベーションされたサンプルを遠心分離した後、上澄み液を結合バッファー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ＋０．３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０）で透析した。Ｐ−１１セルロースホスフェートレジン（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ）で充填された８ｃｍ×４ｃｍ Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．、ＵＳＡ）は、上記の結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して、平衡状態を維持した。透析が完了した溶液は、Ｐ−１１カラムを通過させて結合させた後、結合バッファーをレジン容量の５倍量として流して洗浄した。洗浄後、結合バッファーに０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ又は１Ｍ ＮａＣｌが含まれた溶出バッファーをそれぞれ４ｍＬ〜５ｍＬずつ流して、Ｌ１蛋白質を溶出させた。
【００８７】
メンブレンフィルターを利用したＶＬＰ濃縮
前記ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）過程により得たＨＰＶ １６ Ｌ１又はＨＰＶ １８ Ｌ１の分画を集めた後、０．１Ｍ〜０．３２５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０に透析した。透析が完了したサンプルは、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ＹＭ−５０又はＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、製造者が提供する方法によって濃縮した。
【００８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で１２．５％ ＰＡＧＥによって全てのサンプルを分析した（Ｍ．Ｐ． ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｗ．Ｉ． Ｗｈｉｔｅ， Ｆ． Ｐａｌｍｅｒ−Ｈｉｌｌ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｊ．Ａ． Ｓｕｚｉｃｈ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２ （１９９８） ３２−４１）。ＨＰＶ １６ Ｌ１又はＨＰＶ １８ Ｌ１を含むサンプルを、２００ｍＡで１２０分間ＰＶＤＦ膜（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ、ＵＳＡ）に伝達させて、Ｌ１蛋白質を、１次抗体としてラビット抗−ＨＰＶ １６ Ｌ１又は抗−ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）を、２次抗体としてヤギ（ｇｏａｔ）抗−ラビットＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）を使用して検出した。蛋白質は、ウェスタンブロットルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を使用して視覚化した。
【００８９】
電子顕微鏡観察
精製したＨＰＶ Ｌ１蛋白質を、カーボン−コーティングされたグリッドに吸着させた後、２％ホスホタングステン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ）でネガティブ染色した。透過電子顕微鏡写真は、４１，０００倍の最終倍率でＴＥＭ２００ＣＸを使用して撮影した（Ｓ．Ｎ． Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９ （２００７） ２４−３０）。
【００９０】
シュードウイルスの製作
ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質とＬ２蛋白質を発現するプラスミドであるｐ１６ＳｈｅＬＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）とｐ１８ＳｈｅＬＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）を、レポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＳＥＡＰ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）と共に、２９３ＴＴ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ分譲）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してそれぞれ共同−形質転換させた。形質転換された２９３ＴＴ細胞を７２時間培養後、破砕バッファー（ＰＢＳ＋０．５％ Ｂｒｉｊ５８、０．２％ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、０．２％ ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｎａｓｅ）を使用して破砕した。破砕された細胞の細胞デブリスは、１２，０００ｇで１０分間遠心分離して除去し、上澄み液は、中和抗体価の測定に使用した。
【００９１】
マウス免疫
ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーでそれぞれ精製された２μgのＬ１蛋白質で、６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを３週間隔で３回皮下に免疫した。第１の免疫は、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、第１、２のブースティングは、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。対照群は、フロイント完全アジュバントとフロイント不完全アジュバントにＰＢＳを同一比率で希釈して投与した。各グループのマウスに対して、第２のブースティングの十日後、尻尾静脈を通じて血清を採取し、得られた血清は、中和抗体価の測定に使用した。
【００９２】
ＳＥＡＰ−ｂａｓｅｄ中和抗体価の測定
２９３ＴＴ細胞を９６ウェルプレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーションで４時間培養した。ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質で免疫されたマウス血清を１／１００から１／１０，０００，０００まで連続希釈した後、上記のように用意されたＨＰＶタイプ１６及び１８のシュードウイルスと１：４比率で希釈した。希釈された混合液を４℃で１時間反応した後、９６ウェルプレートに用意された２９３ＴＴ細胞に添加した後、７２時間３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。７２時間培養後、培養培地内のＳＥＡＰ発現程度は、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を基質として確認した。マウス血清内中和抗体価は、シュードウイルスだけが適用されたウェルのＯＤ値の半分値で決定した。
【００９３】
実験結果
１. ＨＰＶ １６ Ｌ１精製結果
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ヘパリンクロマトグラフィーによるＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法１のヘパリンクロマトグラフィーの結果である。図４から分かるように、低濃度ＮａＣｌ条件でインキュベーションして不溶性不純物を除去する工程を経なかったサンプルの場合、ヘパリンクロマトグラフィー時、多量の不純物を含んでいた。その反面、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性不純物を除去したサンプルは、ヘパリンクロマトグラフィー時、Ｌ１蛋白質の純度が大きく向上した（図５）。ヘパリンカラムに結合された蛋白質を０．３２５Ｍから０．６６ＭまでＮａＣｌの傾斜勾配で１次溶出させた後、０．６６Ｍから２ＭまでＮａＣｌの濃度勾配で２次溶出させた結果、不純物は、０．３２５Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌ濃度で大部分溶出されて（図５）、ＨＰＶ １６ Ｌ１は、０．５Ｍから１．３ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図６）。この結果は、低濃度ＮａＣｌ条件で不溶性不純物を除去することが、ヘパリンクロマトグラフィーでＬ１蛋白質の純度を大きく増加させるということを意味し、不溶性不純物が除去されたサンプルをヘパリンクロマトグラフィーに適用時、効果的にＬ１蛋白質を精製できることを示す。
【００９４】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
陽イオン交換クロマトグラフィーによるＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法２の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果である。図７及び図８から分かるように、大部分の不純物は、カラムに付着されて除去され（図７）、ＮａＣｌを使用した溶出時、ＨＰＶ １６ Ｌ１は、０．７Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図８）。この結果は、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて純度の高いＬ１を得ることができることを示す。
【００９５】
精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１の純度
上記で精製されたＬ１蛋白質の分画を集めて、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレン（ＹＭ−５０又はＹＭ−１００）で濃縮した。図９から分かるように、Ｌ１蛋白質の純度は、商業的に販売されるＢＳＡ標準物質（９６％以上の純度）とほぼ等しい純度を示すことを確認した（図９のパネルＡ）。ウェスタンブロットの結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される５５ｋＤａのモノマーが検出されて、ＢＳＡのバンドは現れなかった（図９のパネルＢ）。この結果は、上記の精製工程を通じて高い純度のＨＰＶ １６ Ｌ１が精製されたことを示す。
【００９６】
精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）
図１０と図１１から分かるように、上記の二つの工程により精製されたＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質は、ＨＰＶ ＶＬＰｓの大きさと同等の大きさである３５ｎｍ乃至６４ｎｍの直径（平均直径４９ｎｍ）を有するＶＬＰｓに自己組織化された（Ｋ．Ａ． Ａｉｒｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． ３６８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２ （２００６） ７４５−７５２）。したがって、上記の二つの精製方法は、Ｌ１蛋白質の自己組織化に何の影響も及ぼさず、これは、上記の二つの方法ともＨＰＶ １６ Ｌ１蛋白質の精製に適していることを意味する。
【００９７】
サンドイッチＥＬＩＳＡを通じて工程別回収率を測定した結果、細胞破砕後、アンモニウムサルフェート沈殿、低濃度ＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する工程まで、不純物は平均８０％が除去されて、この工程までＬ１蛋白質の平均回収率は、８１％であった（表１及び表２）。Ｌ１蛋白質の純度は、細胞破砕工程で０．２％であったが、アンモニウムサルフェート沈殿と不溶性不純物を除去する工程後、０．８％〜１％に向上し、４倍〜５倍程度に純度が向上した（表１及び表２）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
一方、ヘパリンクロマトグラフィーを経て精製されたＬ１蛋白質の回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は、６４％であって（表１）、陽イオン交換クロマトグラフィーを経て精製されたＬ１蛋白質の全体回収率は、６２％であった（表２）。上記の６４％と６２％の回収率は、今まで報告された回収率のうち、最も高い値である。
【０１０１】
２．ＨＰＶ １８ Ｌ１精製結果
ヘパリンクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ヘパリンクロマトグラフィーによるＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図３の方法１のヘパリンクロマトグラフィーの結果である。図１２から分かるように、低濃度ＮａＣｌ条件でインキュベーションして不溶性不純物を除去する工程を経なかったサンプルの場合、ヘパリンクロマトグラフィー時、多量の不純物を含んでいた。その反面、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性状態に変わった不純物を除去したサンプルは、ヘパリンクロマトグラフィー時、Ｌ１蛋白質の純度が大きく向上したことを確認することができる（図１３）。ヘパリンカラムに付着された蛋白質を０．３２５Ｍから０．６６ＭまでのＮａＣｌ傾斜勾配で１次溶出させた後、０．６６Ｍから２ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配で２次溶出させた結果、大部分の不純物は、０．３２５Ｍから０．５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出されて（図１３）、ＨＰＶ １８ Ｌ１は、１．２Ｍから１．３Ｍ ＮａＣｌ濃度で溶出された（図１４）。この結果は、ＨＰＶ １６ Ｌ１と同様に、ヘパリンクロマトグラフィーを通じてＨＰＶ １８ Ｌ１を効果的に精製することができることを示す。
【０１０２】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
陽イオン交換クロマトグラフィーによるＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の分離能を調べた。本結果は、図１ｃの方法２の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果である。図１５から分かるように、大部分の不純物は、カラムに結合されて除去され、ＮａＣｌを使用した溶出時、ＨＰＶ １８ Ｌ１は、０．８Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された（図１６）。この結果は、低濃度のＮａＣｌ条件で不溶性蛋白質を除去する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて純度の高いＬ１を得ることができることを示す。
【０１０３】
精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１の純度
上記で精製されたＬ１蛋白質の分画を集めて、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａを切り出し（ｃｕｔ−ｏｆｆ）できるメンブレン（ＹＭ−５０又はＹＭ−１００）で濃縮した。図１７から分かるように、濃縮完了後、分子量の小さい不純物が除去されたことを確認し、Ｌ１蛋白質の純度は、商業的に販売されるＢＳＡ標準物質（９６％以上の純度）とほぼ等しい純度を示すことを確認した（図１７のパネルＡ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される５５ｋＤａのＬ１蛋白質は、ウェスタンブロットの結果で同一に検出されて、対照群であるＢＳＡでは、バンドが検出されなかった（図１７のパネルＢ）。この結果は、上記の二つの精製工程を通じて高い純度のＨＰＶ Ｌ１蛋白質を得ることができることを示す。
【０１０４】
精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）
図１８と図１９から分かるように、上記の二つの工程により精製されたＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質は、ＨＰＶ ＶＬＰｓの大きさと同等の大きさである３５ｎｍ乃至６４ｎｍの直径（平均直径４９ｎｍ）を有するＶＬＰｓに自己組織化された（Ｋ．Ａ． Ａｉｒｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． ３６８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２ （２００６） ７４５−７５２）。したがって、上記の二つの方法により精製されたＬ１蛋白質は、ＶＬＰ形成に何の影響も受けず、これは、上記の二つの方法ともＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の精製に適していることを意味する。
【０１０５】
結論的に、複雑な工程と時間が要求されるスクロースクッションや分子ふるいクロマトグラフィーなどの方法を経なくても、高い純度と高い回収率でＨＰＶ １６ Ｌ１とＨＰＶ １８ Ｌ１蛋白質の精製が可能であることを実験的に確認した。
【０１０６】
３．精製されたＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質の中和活性能
上記の方法で精製されたＨＰＶタイプ１６とタイプ１８のＬ１蛋白質をマウスに免疫し、中和抗体価を測定した。その結果、ヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＨＰＶタイプ１６のＬ１は、平均１／１８，０００希釈倍率まで中和抗体価を示した（図２０）。ＨＰＶタイプ１８のＬ１の場合、ヘパリンクロマトグラフィーで精製されたＬ１は、平均１／５，０００、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＬ１は、平均１／１７０，０００希釈倍率まで中和抗体価を示した（図２１）。この結果は、上記の方法で精製されたＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１蛋白質が高い水準で中和抗体を誘導することができることを示す。
【０１０７】
実施例２：新規免疫補助剤としての非常に短いリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ＣＩＡ０５の生産
本発明者らは、健康なヒトの腸に住んでいる大腸菌から、リポポリサッカライド糖鎖の長さが非常に短いＬＰＳを有する菌株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＧ００２１）を既に発掘して、この菌株を寄託機関の韓国微生物保存センターに２００２年５月２日付にて寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ １０３７４をもらった（参照:韓国登録特許第０４５６６８１号公報;ＷＯ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;ＷＯ２００６／１２１２３２）。前記菌株からのＬＰＳ精製は、韓国登録特許第０４５６６８１号公報;ＷＯ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって行った。精製されたＬＰＳの分子量をＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳ（Ｓｈｉｍａｄｚ社,Ａｘｉｍａ−ＬＮＲ Ｖ ２．３．５（Ｍｏｄｅ Ｌｉｎｅｒ、Ｐｏｗｅｒ：１０６））で測定し、測定結果、約３千５百Ｄａの分子量を有することを確認した。精製されたＬＰＳを韓国登録特許第０４５６６８１号公報; ＷＯ ２００４／０３９４１３;韓国登録特許第０７４０２３７号公報;及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって、開示されたプロトコールに従って脱毒素化した。簡単に、３ｍｇ／ｍＬの前記精製されたＬＰＳに２Ｎ ＮａＯＨを１：１のボリュームで混ぜた後、６０℃で１０分毎に一回ずつ振って、１４０分間脱アシル化させて、初期０．２Ｎ ＮａＯＨのボリュームの約１／５程度の１Ｎ酢酸を入れてｐＨ７．０に適正した。ｐＨ適正後、エタノール沈殿して、非毒性リポポリサッカライド（ＣＩＡ０５）を得た。
【０１０８】
実施例３：新規免疫補助剤であるＣＩＡ０５と従来の免疫補助剤ＭＰＬとの毒性比較実験
本発明の子宮頸がんワクチンにおいて免疫補助剤として利用される前記実施例で製造したＣＩＡ０５と、既存の子宮頸がんワクチンに使用しているＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）の毒性を比較分析した。健康なヒトの血液を提供してもらってＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）を分離し、これを２４ウェル培養ディッシュに５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で播種した。この際、培養液は、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を混合したものを使用して、一つのウェル当たりの容量は、１ｍＬに均等にした。用意されたディッシュに、下記のような条件でそれぞれ処理した:１）陰性対照群:ＢＳＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μＬ；２）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（ＣＩＡ０５） １０μｇ／１００μＬ；３）ＭＰＬ（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｆ５８３ ＭＰＬ）１０μｇ／１００μＬ。
【０１０９】
１２時間後、処理された培養液を集めて遠心分離し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して、ＴＨＰ−１（Ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）から分泌される炎症性蛋白質であるＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ２１０）を使用してそれぞれ測定した。実験結果、図２２から分かるように、既存の子宮頸がんワクチン補助剤として使用しているＭＰＬより約１／３程度毒性が小さいことを確認した。
【０１１０】
実施例４：本発明の子宮頸がんワクチンの効能探索
マウスを利用した免疫化
前記実験を通じて精製した蛋白質抗原と新規免疫補助剤ＣＩＡ０５を利用して、マウスにおいて免疫反応を誘導した。６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＬＣ、Ｊａｐａｎ）を利用して、実験群当たりマウスをランダムに５匹ずつ割り当てた。前記マウスに、ＣＩＡ０５単独、Ａｌｕｍ（アルミニウムヒドロキシド;Ｂｒｅｎｎｔａｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）単独、又はこの二つの混合物と共に、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ ２μｇ（図１２ａ〜１２ｃ）、ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ １μｇ又は４μｇ（各タイプ０．５μg又は２μg）（図１３ａ〜図１５）を２週間隔で３回筋肉内注射して免疫化させた。対照群マウスには、ＰＢＳを投与した。比較実験のために、既存の市販製品であるＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭを、ヒト基準１／１０容量でマウスに投与した。マウスの血清は、３次接種後、５週目に採取して、ａｎｔｉ−Ｌ１ ＶＬＰ ＩｇＧ力価をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１１１】
エンドポイントＥＬＩＳＡを利用した免疫効能の分析（ＩｇＧ力価分析）
１００μＬのコーティングバッファー（５０ｍＭカーボネート、ｐＨ９．６、４℃）に、前記実施例で製造されたＨＰＶタイプ１６又は１８ ＶＬＰ Ｌ１抗原を０．５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＳＡ）にコーティングした後、一晩中４℃でコーティングした。翌日、ウォッシングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０が溶解されているＰＢＳ）を利用して、各ウェルを３回洗浄して、ブロッキングバッファー（１％のＢＳＡが溶解されているＰＢＳ）を各ウェル当たり３００μＬずつ添加した後、３７℃で１時間ブロッキングした。その後、ウォッシングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０が溶解されているＰＢＳ）を利用して各ウェルを３回洗浄して、採取したマウス試料を、１／２段階希釈法を利用して希釈した後、コーティングされたマイクロプレートに１００μＬずつ入れて、３７℃で２時間反応した。反応が終わった後、マイクロプレートをウォッシングバッファーを利用して２回洗浄して、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されているヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ、８１−６５２０）又はヤギ抗−マウスＩｇＧ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ８１Ｐ）又はヤギ抗−マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ８２Ｐ）を、実験によって１００μＬずつマイクロプレートに入れて、３７℃で２時間反応した。その後、ウォッシングバッファーを利用して２回洗浄し、ＨＲＰと反応して発色する試薬であるＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＢＤ Ｂｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ、５５５５５２１４）を１００μＬずつマイクロプレートに入れて発色させた。常温、暗所で約１０分間発色させた後、発色反応終了のために１Ｎ Ｈ２ＳＯ４ １００μＬをすぐに添加し、このように反応の終わった９６ウェルマイクロプレートをマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）に入れて、４５０ｎｍの波長で各ウェルの発色程度（濃度）を測定した。エンドポイントタイターは、０．１のカット−オフ値を有する非免疫血清の２倍吸収光度を引き起こす最も高い血清希釈で定義されて、平均±ＳＤで示した。
【０１１２】
図２３及び図２４で確認できるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ抗原にＣＩＡ０５を追加した場合、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価のいずれも大きく増加して、特に、力価の増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）で示した図１２ｂからみると、このような増加パターンが明確である。また、Ａｌｕｍよりは、ＣＩＡ０５の免疫促進効果が更に優れていた。したがって、本発明のワクチンの基本的な組成であるＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ抗原とＣＩＡ０５とによりＨＰＶに対する免疫化が非常に優秀に達成できることが分かる。
【０１１３】
また、図２５及び図２６から分かるように、ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰ特異総ＩｇＧ力価は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループよりも著しい数値を示した。
【０１１４】
一方、ＩｇＧの亜型で分析した図２７及び図２８から分かるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ特異ＩｇＧ１は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループより少し高く表れた（図２７）。ＩｇＧ２ａの場合は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで免疫化したグループよりも著しい数値を示した（図２８）。
【０１１５】
マウス脾臓細胞を利用したインターフェロン−γ濃度分析
上記の方法で免疫化したマウスから最大限無菌的に脾臓を抽出して、ＰＢＳで洗浄した。培養液（５０μＭ β−メルカプトエタノール、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ ＦＢＳ、１×抗生剤が添加されたＲＰＭＩ１６４０）の中で５ｍＬ注射器を利用し、脾臓に１０個の孔を開けた。注射器に培養液を吸い込んだ後、強く吹き出すことを数回繰り返して脾臓細胞を分離し、このように分離された脾臓細胞を集めて、培養液と共に１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。培養液を除去し、１０％ ＦＢＳ １００μｇ／ｍＬストレプトマイシンと５０ｍＭ β−メルカプトエタノールが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して再懸濁した。次いで、脾臓細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分株して、１５μｇ／ｍＬの濃度でＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰを添加した後、３７℃で４８時間又は７２時間培養した。マウス脾臓細胞から分泌されたインターフェロン−γの濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）で測定した。
【０１１６】
図２５から分かるように、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ抗原にＣＩＡ０５を追加した場合、インターフェロン−γの濃度が大きく増加して、ＡｌｕｍよりはＣＩＡ０５の免疫促進効果が更に優れていた。したがって、本発明のワクチンの基本的な組成であるＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ抗原とＣＩＡ０５により、ＨＰＶに対する免疫化が非常に優秀に達成できることが分かる。
【０１１７】
また、図３０から分かるように、脾臓細胞により分泌されるインターフェロン−γの濃度は、ＣＩＡ０５免疫補助剤とＡｌｕｍとを複合投与した場合、Ａｌｕｍ単独投与より非常に高く表れて、従来のＣｅｒｖａｒｉｘＴＭとＧａｒｄａｓｉｌＴＭで処理されたグループよりも著しい数値を示した。
【０１１８】
一方、図２６、２７、２８及び２９において、本発明のワクチン組成物は、ＨＰＶタイプ１６及び１８のＬ１ ＶＬＰｓ、アルミニウムヒドロキシド及びＣＩＡ０５を含むが、これは、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘにおいて、ＭＰＬの代わりにＣＩＡ０５が代替されたと考えられる。即ち、本発明で利用するＣＩＡ０５は、ＭＰＬと比較し、毒性側面だけではなく、ＨＰＶに対する免疫促進能においても著しく優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
結論的に、前記実験結果から、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ及びＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの両方とも、本発明者らが開発した免疫補助剤のＣＩＡ０５を混合した実験群が、既存の子宮頸がんワクチンで免疫化した実験群より著しい免疫効果を示すことが分かる。これは、現在開発された子宮頸がんワクチンが、持続効果に対する難点があることに鑑みると、本発明の免疫補助剤の添加による免疫力強化は、この問題を解決できる独創的で且つ進歩した発明であるといえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びＨＰＶタイプ１８のＬ１ ＶＬＰの少なくともいずれかと、（ｉｉ）脱アシル化された非毒性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とするヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物。
【請求項２】
ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１ ＶＬＰが、（ｉ）ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１をコードするヌクレオチド配列を含む酵母を培養する工程と、（ｉｉ）培養された前記酵母を溶解する工程と、（ｉｉｉ）前記酵母の溶解物に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを行う工程と、を含む精製工程を通じて得られた請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非毒性ＬＯＳが、リポ多糖（ＬＰＳ）にアルカリ処理し、リピドＡを脱アシル化させて非毒性化された請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
非毒性ＬＯＳが、１，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非毒性ＬＯＳが、２，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａの分子量を有する請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
非毒性ＬＯＳが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のものである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
免疫補助剤を更に含み、前記免疫補助剤が、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素、若しくはアルミニウムの塩又はその水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の薬剤学的組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒト子宮頸がんの予防方法。
【請求項９】
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１−コーディングヌクレオチド配列を含む酵母を培養する工程と、
（ｉｉ）培養された前記酵母を溶解する工程と、
（ｉｉｉ）前記酵母の溶解物に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、
（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを行う工程と、を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法。
【請求項１０】
ＨＰＶが、ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、工程（ｉｉｉ−２）として、アンモニウムサルフェート沈殿を施して不純物の除去された結果物を、０．００１Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌで処理し、追加的に不純物を除去する工程を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、ホスフェート基を有する陽イオン交換剤を利用して行う請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸。
【請求項１４】
配列番号３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸。
【請求項１５】
請求項１３に記載のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換され、寄託番号ＫＣＣＭ１１０３６Ｐであることを特徴とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項１６】
請求項１４に記載のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換され、寄託番号ＫＣＣＭ１１０３７Ｐであることを特徴とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項１】
（ａ）（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びＨＰＶタイプ１８のＬ１ ＶＬＰの少なくともいずれかと、（ｉｉ）脱アシル化された非毒性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とするヒト子宮頸がんワクチン薬剤学的組成物。
【請求項２】
ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１ ＶＬＰが、（ｉ）ＨＰＶタイプ１６又は１８のＬ１をコードするヌクレオチド配列を含む酵母を培養する工程と、（ｉｉ）培養された前記酵母を溶解する工程と、（ｉｉｉ）前記酵母の溶解物に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを行う工程と、を含む精製工程を通じて得られた請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非毒性ＬＯＳが、リポ多糖（ＬＰＳ）にアルカリ処理し、リピドＡを脱アシル化させて非毒性化された請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
非毒性ＬＯＳが、１，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非毒性ＬＯＳが、２，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａの分子量を有する請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
非毒性ＬＯＳが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のものである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
免疫補助剤を更に含み、前記免疫補助剤が、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素、若しくはアルミニウムの塩又はその水和物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の薬剤学的組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒト子宮頸がんの予防方法。
【請求項９】
（ｉ）ＨＰＶ Ｌ１−コーディングヌクレオチド配列を含む酵母を培養する工程と、
（ｉｉ）培養された前記酵母を溶解する工程と、
（ｉｉｉ）前記酵母の溶解物に対してアンモニウムサルフェート沈殿を施して、不純物を除去する工程と、
（ｉｖ）前記不純物の除去された結果物に対してヘパリンクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを行う工程と、を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法。
【請求項１０】
ＨＰＶが、ＨＰＶタイプ１６又はＨＰＶタイプ１８である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、工程（ｉｉｉ−２）として、アンモニウムサルフェート沈殿を施して不純物の除去された結果物を、０．００１Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌで処理し、追加的に不純物を除去する工程を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、ホスフェート基を有する陽イオン交換剤を利用して行う請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸。
【請求項１４】
配列番号３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸。
【請求項１５】
請求項１３に記載のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換され、寄託番号ＫＣＣＭ１１０３６Ｐであることを特徴とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項１６】
請求項１４に記載のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１８のＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の核酸で形質転換され、寄託番号ＫＣＣＭ１１０３７Ｐであることを特徴とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公表番号】特表２０１２−５３０４８８（Ｐ２０１２−５３０４８８Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５９５７（Ｐ２０１２−５１５９５７）
【出願日】平成２１年１０月２０日（２００９．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７２６８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１１３００９７２）アイジェン インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２０日（２００９．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７２６８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１１３００９７２）アイジェン インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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