安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ
酸化されうるシステイン残基を、酸化されないアミノ酸残基によって置換した、変異型の組換えアデノシン・デアミナーゼについて開示する。安定化させた組換えアデノシン・デアミナーゼ、ポリマー複合体、およびそれらを用いた治療方法についても開示する。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、２００７年４月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９１３，００９号の優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、安定性を高めるために変異させた組換えアデノシン・デアミナーゼを提供する。
【背景技術】
【０００３】
アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）は、かなりの期間、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）または「バブルボーイ（Bubble boy）」病と呼ばれる酵素欠損症の治療に使用されている。１５年以上にわたり、Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社は、ウシ起源のＡＤＡ酵素を用いて調製されるＰＥＧ化ＡＤＡの形態で患者に使用できる治療用のＡＤＡを製造している。
【０００４】
近年、ウシ起源の酵素を組換えによって得られる酵素（以後「ｒＡＤＡ」）に置き換える取り組みがなされている。組換えヒトＡＤＡ（「ｒｈＡＤＡ」）および組換えウシＡＤＡ（「ｒｂＡＤＡ」）の双方が、精製天然ウシＡＤＡの代替と考えられている。ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡ酵素は、現在使用されている精製天然ウシ酵素よりも幾分安定性に劣る。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡの両方が、システインの分解と一致する方法、すなわち、酸素の添加；ジチオールの形成；ｐＨの上昇に伴う分解の増大；沈殿、特にｐＨの上昇および試料の濃縮に伴う沈殿などで分解すると考えられている。還元状態では、システインは分解に関与する形態である、反応性の−ＳＨ基（スルフヒドリル基）を含む。
【０００５】
証拠は、たった１つの曝露されたシステインが、ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方に認められる分解に関与しうることを示唆している。ウシＡＤＡ（すなわち、ウシ起源から精製される天然ウシＡＤＡ）は、ｒｈＡＤＡと非常によく似た構造を有する。すなわち、ウシＡＤＡおよびｒＡＤＡの両方が、一次配列の同一の複数位置に同数のシステインを有する。現在得られる組換えヒトＡＤＡおよび組換えウシＡＤＡは、システインの反応性と一致する、分解生成物（degradants）／不純物（ジチオール）を含む。天然ウシＡＤＡは、ＡＤＡ各モルと結合した、単一モルのシステインを有する点で、ウシＡ組換えＤＡとは構造的に異なる。天然ウシＡＤＡはまた、高ｐＨに対して安定であり、このことは、ＡＤＡに結合したシステインが保護基としての機能を果たすことを示唆している。
【０００６】
組換えヒトおよび／またはウシＡＤＡを安定化させる方法の１つは、活性Ｃｙｓ残基（成熟ｒｂＡＤＡおよび成熟ｒｈＡＤＡの両方のＣｙｓ７４）を、酸化型グルタチオン、ヨードアセトアミド、シスチン、他のジチオール、およびそれらの混合物のいずれか１つでキャップ化することである。この方法は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する、本願と同一の出願人に譲渡された、「安定化タンパク質（Stabilized Proteins）」という発明の名称の特許文献１に説明されている。
【０００７】
前述の説明にもかかわらず、発現の際、すぐに先天的な安定性を提供するため、タンパク質構造を修飾することによるさらなる追加のキャップ化のステップの必要性を回避することが有利であろう。特許文献２は、突然変異によって、不安定なＣｙｓ残基をＳｅｒおよび他のアミノ酸残基で置換することによる、スブチリシンなどの原核生物のプロテアーゼ、および中性プロテアーゼの安定化について記載している。しかしながら、ＡＤＡにおける活性部位の変異解析は、Ｃｙｓ残基 （Ｃｙｓ２６２）の置換が結果的に酵素における顕著な活性の低下を生じることを示した（Ｂｈａｕｍｉｋらの非特許文献１）。したがって、本発明以前には、最適かつ有用な酵素活性を保持しつつ、活性な、曝露されたＣｙｓ残基を別のアミノ酸残基によって置換することによる、アデノシン・デアミナーゼ酵素を安定化することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第１１／７３８，０１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３４６，８２３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bhaumik et al. 1993, The J. of Biol Chem, 268. (8):5464-5470
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、酵素の最適なＰＥＧ化に有用なｐＨレベルで、安定な、すなわち保管および処理の間に顕著に分解することのない、ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方を提供することは有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、野生型の形態のＡＤＡ酵素について、任意の酸化されうるシステイン残基が酸化されないアミノ酸残基で置換された、組換えＡＤＡを提供する。変異型ＡＤＡには、天然Ｌ−アミノ酸の１つである酸化されないアミノ酸残基が含まれ、例えば、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン および／または当技術分野で既知の天然Ｌ−アミノ酸のバリエーションおよび誘導体、すなわち、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）などが挙げられる。メチオニンまたはトリプトファンは、潜在的に酸化されうることから、 これらは随意的に避けられる。
【００１２】
酸化されないアミノ酸残基は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンの中の１つであることがさらに好ましい。セリンが最も好ましい。特定の好ましい実施の形態では、酸化されうるシステインは、成熟ＡＤＡタンパク質の７４位に位置している。組換えＡＤＡは、例えば、配列番号：２または配列番号：４に従ったＤＮＡ分子から翻訳された組換えウシＡＤＡまたは組換えヒトＡＤＡであることが好ましく、配列番号：１または配列番号：３を含むことが好ましい。組換えＡＤＡが、配列番号：１に従った組換えウシＡＤＡである場合、ＡＤＡは、随意的に、Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ；Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ；およびＧｌｙ351に代わるＡｒｇのうちの１つ以上から選択される多型で表される。
【００１３】
本発明は、ポリアルキレンオキサイド−ＡＤＡ複合体も提供し、ここでポリアルキレンオキサイドはポリエチレングリコールであることが好ましい。随意的に、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、コハク酸スクシンイミジル、およびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカー化学を介して、ポリエチレングリコールを組換えアデノシン・デアミナーゼと結合させる。炭酸スクシンイミジルが好ましい。ポリエチレングリコールは、組換えアデノシン・デアミナーゼのＬｙｓのε−アミノ基に共有結合していることが好ましい。
【００１４】
ポリエチレングリコール−ＡＤＡ複合体は、ε−アミノ基に結合している少なくとも１つ（すなわち１つ以上） のポリエチレングリコール鎖を含み、ε−アミノ基に結合している少なくとも５（すなわち５つ以上）ポリエチレングリコール鎖が好ましく、あるいは、組換えＡＤＡのＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している、約１１〜約１８本のポリエチレングリコール鎖がさらに好ましい。
【００１５】
本発明の複合体のポリエチレングリコールは、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有し、約４，０００〜約４５，０００であることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の組換えアデノシン・デアミナーゼを精製する方法を提供する。例えば、組換えアデノシン・デアミナーゼは、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＣａｐｔｏ Ｑ、ＤＥＡＥおよびＳＰクロマトグラフィー）によって精製することが好ましく、配列番号：１の組換えアデノシン・デアミナーゼは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製することが好ましい。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の組換えＡＤＡを有効量で投与する、哺乳動物におけるＡＤＡ介在性の病状を治療する方法をも提供する。ＡＤＡ介在性の病状には、例えば、ＳＣＩＤ、癌などが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ酵素を提供する。本発明のアデノシン・デアミナーゼ酵素は、酵素が溶液内に存在する場合に、分解不安定性（breakdown instability）の原因を取り除きつつ、酸化プロセスに曝露されたシステイン残基を、酵素の活性、電荷、および三次構造を保護する、許容可能な別のアミノ酸残基と置換することによって提供される。
【００１９】
Ａ．定義
本発明についての明確な説明を提供することを目的として、いくつかの用語を下記のように定義する。
【００２０】
「組換え」という用語は、天然状態において、タンパク質を発現することのできるＤＮＡの内因性コピーを有していない細胞を使用して産生したタンパク質のことをいう。細胞は、適切に単離された核酸配列の導入によって遺伝子を変化させることにより、組換えタンパク質を産生する。この用語はまた、異種（外因性または異質な）核酸を導入すること、あるいは、天然の核酸をその細胞、またはそのように修飾された細胞から生じる細胞にとって天然ではない形態に変化させることによって修飾されている細胞、または核酸、またはベクターへの言及も含む。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態では認められない遺伝子を発現し、天然の形態では認められない遺伝子の突然変異体を発現し、あるいは、別の方法では異常に発現する、発現が不足している、または全く発現しない、天然の遺伝子を発現する。
【００２１】
本明細書では、「核酸」または「核酸配列」には、一本鎖または二本鎖のいずれの形態であるかにかかわらず、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーについての言及が含まれ、他に限定しない限り、天然のヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリッドする、天然の既知の類似体も包含される。他に示唆しない限り、特定の核酸配列には、その相補配列が含まれる。
【００２２】
特定の核酸に関する「コードする」という用語には、特定のタンパク質へと翻訳するための情報を含む核酸についての言及も含まれる。情報は、コドンを利用することによって特定される。
【００２３】
「宿主細胞」とは、発現ベクターの複製または発現を支える細胞である。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞であって差し支えなく、あるいは、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物の細胞などの真核細胞であってもよい。
【００２４】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーについての言及も含む。
【００２５】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（まとめて「ペプチド」）に取り込まれるアミノ酸についての言及を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸であって差し支えなく、他に限定しない限り、天然アミノ酸と同様の機能をすることができる、天然アミノ酸の既知の類似体も含む。
【００２６】
「トランスフェクション」は、任意のコードする配列が実際に発現されるか否かに関わらず、宿主による発現ベクターの取り込みのことをいう。当業者には、さまざまなトランスフェクションの方法が知られている。例えば、トランスフェクションは、発現ベクターおよび高濃度のＣａＰＯ4存在下、エレクトロポレーションによって、宿主細胞への挿入にファージまたはウイルスの発現ベクターを使用して、拡散の機械的挿入によって、および、パッケージされていない核酸断片の存在下で宿主細胞を培養することによっても、達成される。トランスフェクションの成功は、一般に、対象とするベクターの作用の兆候が
宿主細胞内に生じる際に認識される。
【００２７】
「形質転換」は、染色体外要素として、または宿主の染色体内に融合することによって、核酸が複製可能になるように、有機体に核酸を導入することを表す。用いられる宿主細胞に応じて、形質転換は、特定の宿主細胞に好適な当技術分野で既知の方法を使用して達成される。Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)およびMandel et al., J. Mol. Biol. 53:154 (1970)に記載されるように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、一般に、細胞壁（例えば、多くの細菌細胞および／または植物細胞）内に封入された原核生物または他の細胞に使用される。このような細胞壁を有しない哺乳動物細胞では、Graham, F. and van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1978)に記載されるリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主システムの形質転換の一般的な態様は、１９８３年８月１６日に発行された米国特許出願第４，３９９，２１６号明細書に記載されている。酵母への形質転換は、一般に、Van Solingen, P., et al., J. Bact., 130: 946 (1977)、およびHsiao, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979)の方法にしたがって行われる。しかしながら、例えばＤＮＡなどの核酸を、例えば核注入、リポフェクション、または原形質融合などによって、細胞内に導入するための他の当技術分野で既知の方法もまた使用して差し支えない。
【００２８】
本明細書では、核酸に関する「相補」という用語は、第１の核酸分子を鋳型として利用して、その核酸分子が複製され、新しい第２の核酸の鎖を形成する場合に産生される対向する鎖（ワトソン−クリックの塩基対を使用する）のことをいう。本発明の１つの態様では、２つの核酸分子は、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリッドまたは結合する場合に、それぞれ相補的であるとみなされる。
【００２９】
「機能的に結合した(operably linked)」とは、例えば調節領域およびオープン・リーディング・フレームなどの構成要素が、構成要素が正常に機能しうるように並置されることをいう。よって、制御配列に「機能的に結合した」オープン・リーディング・フレームとは、コード配列がこれらの配列の制御下で発現可能な配置のことをいう。
【００３０】
「制御配列」とは、特定の生物において、機能的に結合したコード配列の発現に必要な核酸配列のことをいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーターが含まれ、随意的に、オペレーター配列、リボソーム結合部位、および、可能性として、まだよく分かっていない配列などの他のものも挙げられる。真核細胞は、例えば、ほんの数例を挙げれば、プロモーター、ポリアデニル化信号およびエンハンサーなどとして、このような制御配列を利用することが知られている。
【００３１】
「発現系」または「発現ベクター」とは、所望のコード配列を有するように形質転換された宿主が、コードされるタンパク質を産生可能なように機能的に結合した状態で、所望のコード配列および制御配列を含む、核酸配列のことをいう。形質転換をもたらすため、発現系をベクターに含めてもよいが、しかしながら、その後に、関連する核酸分子を宿主染色体に組み込んでもよい。
【００３２】
本明細書では、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は同義的に用いられ、このような意味のすべてが、子孫を含む。よって、「形質転換された個体（transformants）」、または「形質転換細胞」は、転換の数にはこだわらず、主要な対象細胞、およびそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的な、または無作為の突然変異に起因して、ゲノム内容において正確に同一ではない場合があるものと解されたい。最初に形質転換された細胞について検査されたものと同一の機能を有する突然変異の子孫も含まれる。はっきりと識別可能な指示が意図されている箇所は、その文脈から明らかであろう。
【００３３】
本発明の目的では、「残基」という用語は、別の化合物との置換反応に供した後に残る、例えばＰＥＧ、ＡＤＡ、アミノ酸などのことを称する、化合物の部分を意味すると解されるべきものとする。
【００３４】
本発明の目的では、「ポリマー残基」、例えば「ＰＥＧ残基」という用語は、それぞれ、他の化合物、部分などとの反応に供した後に残るポリマーまたはＰＥＧの部分を意味すると解されるべきものとする。
【００３５】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環状のアルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素のことをいう。「アルキル」という用語は、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびＣ1-6アルキルカルボニルアルキル基も含む。アルキル基は、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。炭素数約１〜７の低級アルキルであることがさらに好ましく、炭素数約１〜４であることがさらになお好ましい。アルキル基は、飽和または不飽和でありうる。置換されている場合、その置換基としては、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が挙げられる。
【００３６】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「置換された」という用語は、官能基または化合物に含まれる１つ以上の原子を、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6アルキル、アリール、およびアミノ基からなる群に由来する部分の１つを加えるか、これらの部分の１つで置換することをいう。
【００３７】
本明細書では「アルケニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む基のことをいう。アルケニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルケニル基は炭素数約２〜７の低級アルケニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルケニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルアルキル、アリール、およびアミノ基が含まれる。
【００３８】
本明細書では「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基のことをいう。アルキニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルキニル基は炭素数約２〜７の低級アルキニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルキニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が含まれる。「アルキニル」の例としては、プロパギル、プロピン、および３−ヘキシンが挙げられる。
【００３９】
本発明の目的では、「アリール」という用語は、少なくとも１つの芳香族環を含む芳香族炭化水素環系のことをいう。芳香族環は、随意的に、他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。アリール基の例としては、例えば、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、およびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００４０】
本発明の目的では、「シクロアルキル」という用語は、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００４１】
本発明の目的では、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。
【００４２】
本発明の目的では、「シクロアルキルアルキル」という用語は、Ｃ3-8シクロアルキル基で置換されたアルキル基のことをいう。シクロアルキルアルキル基の例としては、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。
本発明の目的では、「アルコキシ」という用語は、酸素橋を通じて親分子部分に結合している、所望の炭素原子数のアルキル基のことをいう。アルコキシ基の例としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシが挙げられる。
【００４３】
本発明の目的では、「アルキルアリール」基とは、アルキル基で置換されたアリール基のことをいう。
【００４４】
本発明の目的では、「アラルキル」基とは、アリール基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００４５】
本発明の目的では、「アルコキシアルキル」基という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００４６】
本発明の目的では、「アルキル−チオ−アルキル」という用語は、例えばメチルチオメチルまたはメチルチオエチルなどのアルキル−Ｓ−アルキルチオエーテルのことをいう。
【００４７】
本発明の目的では、「アミノ」という用語は、有機ラジカルによって１つ以上の水素ラジカルが置換されることにより、アンモニアから誘導される、当技術分野で既知の窒素含有基のことをいう。例えば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」という用語は、それぞれ、アシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルのことをいう。
【００４８】
本発明の目的では、「アルキルカルボニル」という用語は、アルキル基で置換されたカルボニル基のことをいう。
【００４９】
本発明の目的では、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素のことをいう。
【００５０】
本発明の目的では、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、非芳香族環系のことをいう。ヘテロシクロアルキル環は、随意的に、他のヘテロシクロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロシクロアルキル基は、３〜７員環であることが好ましい。ヘテロシクロアルキル基の例として、例えば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、およびピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基として、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、およびピロリジニルが挙げられる。
【００５１】
本発明の目的では、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、芳香族環系のことをいう。ヘテロアリール環は、１つ以上のヘテロアリール環、芳香族または非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロアリール基の例として、例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン、およびピリミジンが挙げられる。ヘテロアリール基の好ましい例として、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００５２】
本発明の目的では、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、および硫黄のことをいう。
【００５３】
一部の実施の形態では、置換アルキルは、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル、およびメルカプトアルキルを含み、置換アルケニルは、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル、およびメルカプトアルケニルを含み、置換アルキニルは、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル、およびメルカプトアルキニルを含み、置換シクロアルキルは、４−クロロシクロヘキシルなどの部分を含み、アリールは、ナフチルなどの部分を含み、置換アリールは、３−ブロモフェニルなどの部分を含み、アラルキルは、トリルなどの部分を含み、へテロアルキルはエチルチオフェンなどの部分を含み、置換へテロアルキルは、３−メトキシ−チオフェンなどの部分を含み、アルコキシは、メトキシなどの部分を含み、フェノキシは、３−ニトロフェノキシなどの部分を含む。ハロは、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含むものと解されるべきものとする。
【００５４】
本発明の目的では、「正の整数」は、１以上の整数を含み、当業者には当然のことながら、当業者における合理的範囲内であると解されるべきものとする。
【００５５】
本発明の目的では、「結合した（linked）」という用語は、１つの基が別の基に共有的に付加すること（好ましい）または非共有的に付加することを含むと解されるべきものとする。
【００５６】
「有効量」および「十分量」という用語は、本発明の目的では、当業者に理解されるような効果として、所望の効果または治療効果を達成する量を意味するものとする。
【００５７】
本発明の目的では、「アデノシン」という用語は、ヌクレオシドである、アデノシンおよびデオキシアデノシンを含むと解されるべきものとする。アデノシンには、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰまたはｄＡＴＰの形態で存在するアデノシンおよびデオキシアデノシンも含まれる。
【００５８】
本発明の目的では、「アデノシン介在性の病状」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の病状」とは、投与経路に関わらず、ＡＤＡまたはその活性画分などの投与が有効である、任意の疾患、病状、または障害を幅広く含むものと解されるべきものとする。
【００５９】
本発明の目的では、ＳＣＩＤのような、「アデノシン介在性の病状の治療」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の病状の治療」とは、症状または病状が、ＡＤＡ治療をしない場合に観察される状態と比較した場合に、回避するか、最小限に抑えられるか、あるいは弱小化されることを意味すると解されるべきものとする。病状の治療は、例えば、アデノシンの減少によって確認することができる。
【００６０】
大まかに言えば、アデノシン介在性の病状の治療は、所望の臨床反応が得られた場合に、成功とみなされるべきものとする。あるいは、治療の成功は、ＡＤＡ治療をせずに観察されるものと比較した場合に、当分野における技術者によって意図される他の臨床的指標を含む、少なくとも２０％、または好ましくは３０％、さらに好ましくは４０％またはそれ以上（すなわち、５０％または８０％）のアデノシンの減少を得られることによって定義されうる。
【００６１】
さらには、記載の便宜上の単数形の語句の使用は、そのように限定されることを全く意図していない。よって、例えば、１つの酵素を含む１つの化合物についての言及は、その酵素の１つまたはそれ以上の分子のことをいう。本発明はまた、本明細書に開示される特定の構造、工程段階、および材料に限定されるのではなく、そのような構造、工程段階、および材料は幾分変化しうるものと解されるものとする。
【００６２】
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって限定されるであろうことから、本明細書で用いられる技術用語についても、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられるのであって、限定されることは意図していないと解されるものとする。
【００６３】
Ｂ．組換え産生させたＡＤＡ酵素
ヒトまたはウシに由来する遺伝子から発現させた酵素を含む、組換えＡＤＡ酵素を得るための最初の取り組みでは、ウシの腸に由来する天然ＡＤＡでは以前には見られなかった、保存不安定性が明らかとなった。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡの分解生成物の研究が行われ、システインの分解と一致する方法で両方のＡＤＡ酵素が分解することが確認された。例えば、ｒｈＡＤＡに対する酸素の付加は、ｒｈＡＤＡの質量よりも１６および３２大きい質量を有する、ｒｈＡＤＡよりもさらに疎水性の化合物を形成する結果となった。加えて、これは、結果的に、ジチオールの形成、ｐＨの上昇の際の分解の増大、沈殿（特にｐＨ上昇時）を生じ（ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）の添加によって、分解物の小集団の反転によって示される）、サンプルが濃縮され、分子間のジスルフィド結合の形成が不溶性の凝集体を生成することが示唆される。
【００６４】
我々は、単一の曝露されたシステインが、ｒｈＡＤＡに認められる分解に関与していることを究明した。ウシＡＤＡ（分解していない）は、 ｒｈＡＤＡの構造と非常によく似た構造を有しており、ウシＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方が、一次配列の同一位置に同数のシステインを有している。ｒｂＡＤＡはまた、システインの反応性と一致する分解物／不純物（ジチオール）も含んでいる。天然ウシＡＤＡは、ＡＤＡの各モルに結合する単一モルのシステインを有するという点でｒｂＡＤＡとは構造的に異なり、また、天然ウシＡＤＡは高いｐＨに対して安定であり、これらのことから、ＡＤＡに結合したシステインが保護基として機能していることが示唆される。天然ウシＡＤＡに結合したシステインは、メルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤で処理することにより除去することができる。理論または仮説に拘束されるものではないが、これは、システイン基が下記のようにジスルフィド基を介してＡＤＡに結合していることを示唆している：
ＡＤＡ−Ｓ−Ｓ−システイン
ここで、ＡＤＡの一次配列における１つのシステインは、１分子のシステインに結合している。このようなジスルフィド結合に関与しているシステインは、最初の段落で言及した酸化的分解の経路に対して安定である。システイン残基は、ヒトおよびウシの成熟ＡＤＡの７４、１５２、１５３、１６８、および２６１の位置に存在する。Ｘ線結晶学（Kinoshita et al., 2005, Biochemistry, 44:10562-10569）から得られるウシＡＤＡの３次元構造の検討は、７４、１５２、１５３、１６８、および２６１に位置するシステインが、分子内のジスルフィド結合に関与する機会がないことを示唆している。構造上の幾何学的制約が、一般的に、ジスルフィド結合に関与する、ＡＤＡの１５２および１５３の位置に生じるようなシステイン残基の隣接を抑制することが知られている。したがって、すべてのシステイン残基が還元状態である可能性があり、必然的に、酸化的分解反応のための潜在的候補部位である。しかしながら、上記引用したウシＡＤＡの３次元の外観検査は、システイン７４が、明らかに他の４つのシステインよりも溶媒に著しく曝露されていることを示唆しており、さらには、他の４つのシステインが、溶媒和された反応物質との顕著な相互作用を妨げるであろう酵素構造内に、ある程度、埋め込まれているように思われる。唯一反応性のシステイン残基の存在によって、翻訳後修飾の結果であると推定される、天然ウシ・アデノシン・デアミナーゼのモノ誘導体化（monoderivatization）が説明できよう。
【００６５】
上記事実は、７４位の反応性システインがｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡに認められる分解に関与する可能性があること、および、システインの反応性−Ｓ−Ｈ基のキャップ化が、組換え酵素に見られるような明らかな酸化的分解の経路からｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを保護していることを示唆した。以下の実験は、これがその事例であるか否かを決定するために行ったものである。約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えｈＡＤＡを、ｐＨ７．４、３７℃で１６時間、リン酸ナトリウム緩衝液中の１２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と反応させた。反応を開始して数分間以内の、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析検出法によるサンプルの分析は、約７０．９％のｒｈＡＤＡがＩＡＡでモノ誘導体化され、１７．２％が２つの部位で誘導体化された。２時間および１６時間のインキュベーションの後、クロマトグラフィープロファイルには顕著な変化はなく、誘導体がｒｈＡＤＡに特有の酸化的分解の経路に対して安定であることを示唆した。ｒｈＡＤＡの同様のサンプルを、ＩＡＡの不存在下で調製し、同様に分析した。ｐＨ７．４、３７℃で１６時間のインキュベーションの後、ｒｈＡＤＡタンパク質は３０％程度分解した（サンプルが最初に有していた分解を上回った）。この結果は、単一の顕著に曝露されたシステインを、ヨードアセトアミドでキャップ化することによって保護できることと一致している。これらの実験は、上記引用したように、参照することにより本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、「安定化タンパク質（Stabilized Proteins）」という発明の名称の米国特許出願第１１／７３８，０１２号明細書にさらに詳細に記載されている。
【００６６】
キャップ化がＡＤＡにおける反応性のシステインの酸化的分解の排除に有効であると同時に、このようなキャップ化された酵素は追加の製造工程を必要とする。よって、異なるアミノ酸で置換することによる、コードする遺伝子から得られる不安定なＣｙｓ残基の直接的な排除が検討された。適切な置換アミノ酸は、同タイプの酸化の影響を受けるものではなく、折り畳まれたＡＤＡタンパク質の三次構造を妨げず、また、本発明の典型的な実施の形態においては、複合体形成の間に活性化ポリアルキレンオキサイドに対して無作為に結合しないようなものが選択される。この基準を満たす、任意の当技術分野で既知の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体が、本発明にしたがった酸化されうるシステインと置換するのに適していることが意図されている。このようなアミノ酸の典型的なリストとして、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシンなどの天然Ｌ−アミノ酸が挙げられる。トリプトファンおよびメチオニンは比較的容易に酸化されうることから、特定の随意的な実施の形態では、あまり好ましくない。
【００６７】
宿主細胞における、非天然のＬ−アミノ酸を部位特異的に取り込んだ組換えタンパク質の産生方法は、例えば、Liu et al., 2007, Nat. Methods 4(3):239-44, Xie et al., 2006 Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7(10):775-82, Ryu et al., 2006, Nat. Methods 3(4):263-65, Deiters et al., 2004, Bioorg. Med. Chem Lett. 14(23):5743-5, Bogosian et al., 1989, J. Biol. Chem. 264(1):531-9, Tang et al., 2002, Biochemistry 41(34):10635-45, Budisa et al., 1995, Eur. J. Biochem. 230(2): 788-96, and Randhawa et al., 1994, Biochemistry, 33(14):4352-62などの文献に記載されている。よって、置換アミノ酸は、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２'−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）などの、修飾された、あまり典型的ではないアミノ酸をも含みうる。
【００６８】
組換えＡＤＡにおいて、随意的にシステインが置換された、さらに好ましい天然アミノ酸としては、例えば、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンが挙げられる。セリンが最も好ましく、下記に例証する。
【００６９】
結果的に、野生型のヒトおよびウシのアデノシン・デアミナーゼを発現するＤＮＡ分子が得られ、コドンをＥ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化し、各成熟タンパク質の７４位に天然のＣｙｓ残基に代わってそれぞれＳｅｒ残基を含む、変異型ｒｂＡＤＡおよび変異型ｒｈＡＤＡを発現するように突然変異させた。これらは、それぞれＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（配列番号：１）およびＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（配列番号：３）である。加えて、ウシの腸から単離された天然ウシＡＤＡは、翻訳後にＣ末端から除去される６残基も有していることは注目すべきである。本発明によるＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡは、６つのＣ末端残基なしで発現される（突然変異として）、あるいは、精製した天然ウシＡＤＡにおいて欠如している残基と同一のＣ末端残基を除去するために翻訳後に修飾されることは、本発明の随意的な特徴である。さらに注目すべきは、ウシの腸から単離された天然のウシＡＤＡが多型を有していることであり、配列番号：５に関しては、ウシＡＤＡの多型には、例えば、１９８位のリジンに代わるグルタミン、２４５位のトレオニンに代わるアラニン、３５１位のグリシンに代わるアルギニンが含まれる。 したがって、本発明による７４位の組換え変異型ウシＡＤＡは、１つまたはそれ以上の指摘された位置についてのさらなる置換体、またはそれらの位置類似体、すなわちＬｙｓ198に代わるＧｌｎ；Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ；Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇを有することが意図されている。
【００７０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される、配列番号：１または配列番号：３のアミノ酸配列を有する変異型ＡＤＡをコードする、単離されたＤＮＡを提供する。１つまたはそれ以上の置換、すなわちＬｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇを有する変異型ＡＤＡをコードする他のＤＮＡもまた、本発明の範囲にあることが意図されている。
【００７１】
適切な発現ベクターは、それぞれ、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡをコードするゲノムまたはｃＤＮＡから、言い換えれば、随意的に、適切な機能的に接続した誘導プロモーターの制御下で、調製することができる。ＤＮＡは、適当な宿主細胞用に最適化されたコドンであって、例えば、高効率のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（Olsen DB and Eckstein F, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1451-5; 1990）、重複する長鎖オリゴヌクレオチドを用いた全遺伝子合成（Vasantha N and Filpula D, Gene 76: 53-60; 1989）、ＰＣＲ法による遺伝子合成（Jayaraman K et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 4084-88; 1991）、または重複伸長ＰＣＲ法（overlap extension PCR）（Pogulis RJ et al., Methods Mol Biol 57: 167-76; 1996）など、任意の便利な当技術分野で既知の方法によって突然変異させることが好ましい。
【００７２】
一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニング、および本発明に有用なベクターの構築には、原核生物が好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１，４４６）が特に有用である。単なる例として、利用しうる他の微生物菌株には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１，５３７）などのＥ．ｃｏｌｉ株が含まれうる。前述の菌株、ならびに、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、原栄養菌株、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７，３２５）、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３，６３５）、およびＳＲ１０１、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバシラス属、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス（Serratia marcesans）、およびさまざまなシュードモナス種（pseudomonas species）などの他の腸内細菌科も使用して差し支えない。
【００７３】
一般には、レプリコンを含むプラスミドベクターおよび宿主細胞に適合する種に由来する制御配列が、これらの宿主と共に用いられる。従来のプラスミドベクターは、外因性のＤＮＡ配列を挿入するのに適した酵素認識部位で改変された二本鎖の環状ＤＮＡ分子、抗生物質選択遺伝子、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、および組換えインサートＤＮＡを含むクローンの識別または選択のための遺伝子である。Ｅ．ｃｏｌｉでの使用に好適なプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ３、ｐＥＴ９、ｐＥＴ１１および拡大ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログに記載）のｐＢＡＤ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、ｔｒｐ、およびＯL/R／ＰL/Rプラスミドが挙げられる。
【００７４】
単なる例であるが、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（例えば、Bolivar et al., 1977, Gene, 2: 95を参照）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、したがって、形質転換させた細胞を識別するための簡便な手段を提供する。同様に、ｐＵＣプラスミドは、選択および複製のためのＤＮＡ分子を用いて、便利なクローニング・ベクターを提供する（参照することによりその開示全体を本明細書に援用する、Yanisch-Perron, et al., 1985, Gene 33:103-119）。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージは、それ自体がコードされたタンパク質を発現させるため、微生物によって利用可能なプロモーターを含むか、または含むように修飾される必要がある。
【００７５】
組換えＤＮＡの構築に最も一般に用いられるそれらのプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーター系（Chang et al., 1978 Nature, 375: 615; Itakura et al., 1977, Science, 198: 1056; Goeddel et al., 1979, Nature, 281: 544）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res., 8: 4057; EPO Appl. Publ. No. 0036,776）が挙げられる。これらが最も一般に利用されると同時に、他の微生物プロモーターが見出され、活用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されて、技能者がそれらを、例えばプラスミドベクターなどの当技術分野で既知のベクターを用いて機能的に結合できるようになっている。
【００７６】
単なる例であるが、Ｅ．ｃｏｌｉにおける転写制御は、任意の次の誘導プロモーターを用いて達成して差し支えない：ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ａｒａＢＡＤ、Ｔ７、ｔｒｃ、 およびλＰLおよびＰRプロモーターの誘導体、ならびに当技術分野で周知の他のもの（例えば、参照することによりその開示を本明細書に援用する、Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60:512-538）。
随意的にベクターと適合する、適切な誘発因子の状態は、例えば、アラビノース、乳糖、または熱誘導、リン酸欠乏、トリプトファン欠乏などが挙げられる。誘発剤成分は、イソプロピルチオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）によって誘発可能な乳糖オペロンであることが好ましい。
【００７７】
適切なシグナル配列（シグナルペプチド）は、ｐｅｌＢ、ｆｄ ｐＩＩＩ、またはｏｍｐＡに由来しうる。
【００７８】
適切な抗生剤選択マーカーは、当技術分野で周知であり、例えば、数ある中でも、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、リファンピシン、またはテトラサイクリン耐性などが挙げられる。
【００７９】
複製配列の適切な起源には、次のプラスミドに見られるものが挙げられる：ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、およびｐＳＣ１０１。
【００８０】
適切な終止配列としては、例えば、ファージｆｄの主要なターミネーターＴΦおよびｒｒｎＢが挙げられる。
【００８１】
原核生物に加えて、酵母培養液などの真核微生物もまた使用して差し支えない。真核微生物の中でも、代表的なパン酵母であるサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）が最も一般的に用いられるが、多くの他の菌株も一般に入手可能である。サッカロミセス属（Saccharomyces）における発現では、例えばプラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282: 39; Kingsman et al., 1979, Gene, 7: 141; Tschemper et al., 1980, Gene, 10: 157）などが一般に用いられる。このプラスミドは、トリプトファンで増殖する能力が欠如した酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４，０７６またはＰＥＰ４−１（Jones, 1977, Genetics, 85: 12）のための選択的マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子をすでに含んでいる。酵母の宿主細胞ゲノムの特性としての ｔｒｐ１の損傷の存在は、次に、トリプトファンの不存在下で増殖することにより、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【００８２】
メタノール資化酵母（Pichia pastoris）系は、幾つかのタンパク質の高レベルでの産生を達成することが明らかになっており（参照することによりその開示の全体を援用する、Cregg, J.M. et al., 1993, Bio/Technology 11: 905-910）、メタノール資化酵母の細胞質に可溶性タンパクとしてＡＤＡを発現させてるために用いてもよい。
【００８３】
酵母ベクターにける適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J. 1980, Biol. Chem., 255: 2073）または他の糖分解酵素（Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 ; Holland et al., 1978, Biochemistry, 17: 4900）、例えば、エノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのためのプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドの構築では、これらの遺伝子に関連した終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および転写終結をもたらすために発現されることが所望される配列の発現ベクター３'内に結合される。増殖条件によって制御される翻訳のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２型、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関与している酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製起点、および終止配列を含む任意のプラスミドベクターが適している。
【００８４】
複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えばポリオーマ、腺、ＶＳＶ、ＢＰＶ）起源に由来しうる、または宿主細胞の染色体の複製メカニズムによってもたらされうる、外因性の起点を含むことを目的としたベクターの構築によって提供されて差し支えない。ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれる場合は、後者が採用される場合が多い。他の有用なプラスミド要素には、シャペロンタンパク質、プロリン異性化酵素タンパク質、またはジスルフィド・シャッフリング・タンパク質をコードした発現遺伝子が含まれうる。
【００８５】
Ｃ．ポリマー複合体
本発明の別の態様では、Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（配列番号：１）およびＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（配列番号：３）タンパク質などの変異型ＡＤＡは、ポリマー複合体を調製するために、適切なポリマーと結合する。
【００８６】
好ましい態様では、変異型ＡＤＡポリペプチドは、実質的に非抗原性のポリマー、好ましくはポリアルキレンオキサイド（「ＰＡＯ」）と結合する。
【００８７】
ＡＤＡポリマー複合体は、一般に式（Ｉ）：
（Ｉ） ［Ｒ−ＮＨ］z−（ＡＤＡ）
に対応し、ここで、
（ＡＤＡ）は組換え変異型アデノシン・デアミナーゼまたはそれらの活性断片を表し、
ＮＨ−は、ポリマーに結合するための変異型ＡＤＡに見られるアミノ酸のアミノ基であり、
（ｚ）は正の整数であり、約１〜約８０であることが好ましく、約５〜約８０であることがさらに好ましく、約１１〜約１８であることがさらになお好ましく、
Ｒは、放出可能な形態または放出できない形態でＡＤＡに結合する、実質的に非抗原性のポリマー残基を含む。
【００８８】
さらに好ましい態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、ここでＰＥＧは、直鎖、分岐鎖、またはマルチアームでありうる。一般に、ポリエチレングリコールは、式：
−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−
を有し、ここで、（ｎ）は正の整数であり、約１０〜約２３００であることが好ましく、約４０〜約２，３００であることがさらに好ましい。ポリマーの平均分子量は、約２，０００〜約１００，０００の範囲である。さらに好ましくは、ポリマーは、約４，０００〜約４５，０００の平均分子量を有し、さらになお好ましくは４，０００〜２０，０００である。最も好ましくは、ＰＥＧの分子量は約５，０００である。技術者のニーズに適合するように、他の分子量もまた予定されている。
【００８９】
あるいは、本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は、次の構造式によって表すことができ：
【化１】
【００９０】
ここで：
Ｙ11およびＹ13は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＲ13または結合であり、
Ｙ12は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ14であり、
Ｒ11-14は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6 置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から選択され、
（ａ１１）、（ａ１２）、および（ｂ１１）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは０〜６、さらに好ましくは０、１、または２であり、
（ｎ）は約１０〜約２，３００の整数である。
【００９１】
一例として、ＰＥＧは、以下の限定されない方法で官能化することができ：
【化２】
【００９２】
ここで
Ｒ11、Ｒ15およびＲ16は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、および置換Ｃ1-6アルキルの中から選択され、
（ｍ）は、０であるか、または正の整数であり、１または２であることが好ましく、
Ｙ14はＯまたはＳであり、
（ｎ）は、重合度を表す。
【００９３】
これらの態様では、ポリマー（Ｒ基）は、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端に見られる基を含む。キャッピング基は、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6 アルキルのいずれかから選択することができ、好ましくはメチルであり、そのような基は当業者に理解されている。
【００９４】
さらなる態様では、複合体のポリマー部分は、ＡＤＡに結合する複数の点を与えるものでありうる。あるいは、複数のＰＥＧはＡＤＡに結合することが可能である。
【００９５】
ＰＥＧ化ＡＤＡの薬物動態学および他の特性は、ＰＥＧ分子量、リンカー化学、およびＰＥＧ鎖の酵素に対する比率を操作することにより、所望の臨床適用における必要に応じて、調整することができる。
【００９６】
これらの態様では、ＡＤＡは、当技術分野で既知のさまざまなリンカーを介して、放出可能な形態または放出できない形態で、非抗原性のポリマーに結合させることができる。
【００９７】
放出可能なポリマー系は、ベンジル基の脱離またはトリメチルロックのラクトン化に基づくことができる。放出可能なポリマー系の活性化ポリマーリンカーは、参照することによりその内容を本明細書に援用する、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第６，１８０，０９５号、同第６，７２０，３０６号、同第５，９６５，１１９号、同第６，６２４，１４２号、および同第６，３０３，５６９号の各明細書にしたがって調製されうる。あるいは、ＡＤＡポリマー複合体は、参照することにより本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第７，１２２，１８９号および同第７，０８７，２２９号の各明細書、ならびに米国特許出願第１０／５５７，５２２号、同第１１／５０２，１０８号および同第１１／０１１，８１８の各明細書に記載されるものなど、特定のビシンポリマー残基を用いて調製される。これら特許出願のそれぞれの開示は、参照することにより本願に援用される。意図されている他の放出可能なポリマー系もまた、参照することによりその内容が本明細書に援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８６００号パンフレットに記載されている。
【００９８】
本明細書で意図されている放出可能な、または放出できないＡＤＡポリマー複合体の説明のための例は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、米国仮特許出願第６０／９１３，０３９号明細書に記載されている。
【００９９】
ポリマー複合体は、当業者に既知の反応など、ＰＥＧ化反応であることが好ましい。簡潔に述べると、変異型ｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡは、活性化ポリマーと反応してＡＤＡポリマー複合体を形成する。これに関連して、幅広い種類の活性化または官能化されたポリエチレングリコールを使用することができ、例えば、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第５，１２２，６１４号、同第５，３２４，８４４号、同第５，６１２，４６０号、および同第５，８０８，０９６号の各明細書（炭酸スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ） および関連する活性化ＰＥＧ）、米国特許第５，３４９，００１号明細書（環状イミドチオン活性化ＰＥＧ）、米国特許第５，６５０，２３４号明細書および当業者に既知の他のものに記載されるものなどが挙げられる。上記の開示のそれぞれは、参照することにより本明細書に援用される。Ｎｅｋｔａｒ社／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から市販される活性化ポリマーも参照のこと。当業者は、過度の実験をすることなく、結合のためのポリマーのさまざまな活性化の形態を使用することができる。
【０１００】
当業者には認識されるように、このような結合反応は、典型的には、数倍モル過剰の活性化ＰＥＧを使用して、適切な緩衝液中で行われる。上述のＳＣ−ＰＥＧのような直鎖ＰＥＧを用いて調製した一部の好ましい複合体は、ＡＤＡ酵素あたり平均して約１０〜約８０ＰＥＧ鎖を含むことができる。その結果として、これらのために、数百倍、例えば、２００〜１０００倍のモル過剰を用いることができる。分岐鎖ＰＥＧおよび酵素に結合したＰＥＧ用に用いられるモル過剰はもっと小さいと考えられ、本明細書で言及するものと同一のものについて記載する、特許および特許出願に記載される技術を使用して決定することができる。
【０１０１】
これらの態様では、ポリアルキレンオキサイドは、例えば、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、ウレタン、およびアミド系リンカーなどを含む、リンカー化学を介してタンパク質と結合する。
【０１０２】
ポリアルキレンオキサイドは、共有結合のための他の部位は当技術分野で周知であり、ＡＤＡ上のＬｙｓのε−アミノ基に共有結合することが好ましい。ＡＤＡポリマー複合体は、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に結合する、少なくとも５つのポリエチレングリコール鎖を含むことができ、あるいは、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に結合する約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を含みうる。
【０１０３】
ＡＤＡがリジンの結合を介して、酵素分子あたり約１１〜約１８のＰＥＧ分子と結合し、ＰＥＧのＡＤＡに対する比率を変化させて、任意の特定の臨床的症状に適合する、結合した複合体の物理的および力学的特性を改質することができる。
【０１０４】
本発明のさらなる態様が、本明細書に記載される治療方法に有用な複合体を提供することを目的として、市販の、または報告された活性化ＰＥＧまたは同様のポリマーを使用して、ＡＤＡ酵素またはそれらの断片を結合する工程を含むことは、前述より明らかであろう。例えば、参照することによりその全体が本明細書に援用される、Nektar Advanced Pegylation catalog of 2004（Nektar社（米国カリフォルニア州サンカルロス所在）を参照。
【０１０５】
活性化ＰＥＧは、米国特許第５，６８１，５６７号、同第５，７５６，５９３号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第６，１１３，９０６号、同第６，５６６，５０６号、同第６，１５３，６５５号、同第６，３９５，２６６号、同第６，６３８，４９９号、同第６，２５１，３８２号および同第６，８２４，７６６号の各明細書（参照することにより本明細書に援用される）に記載されるような直鎖、分岐鎖、またはＵ−ＰＥＧ誘導体を含みうる。
【０１０６】
このようなポリマーの限定されないリストは、下記構造を有するポリマー系（ｉ）〜（ｖｉｉ）に相当し：
【化３−１】
【化３−２】
【０１０７】
ここで、
Ｙ61-62は、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ61であり、
Ｙ63は、Ｏ、ＮＲ62、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2であり、
（ｗ６２）、（ｗ６３）および（ｗ６４）は、独立して、０または正の整数であり、約０〜約１０が好ましく、約１〜約６がさらに好ましく、
（ｗ６１）は０または１であり、
ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧであり、
ここでＰＥＧは先に定義され、ポリマー部分の総分子量は約２，０００〜約１００，０００であり、
Ｒ61およびＲ62は、独立して、Ｒ11に用いることができる部分と同一の部分である。
【０１０８】
ＰＥＧ系のポリマーに加えて、多くの他のポリアルキレンオキサイドを用いることができることもさらに理解されよう。例えば、本発明の複合体は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２００１年のカタログ「生物医学的応用のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application）」に記載されるものなど、マルチアームＰＥＧ−ＯＨおよび「スター型ＰＥＧ」製品を転換することを含む方法によって調製することができる。日油株式会社の薬物送達システムカタログ第８版（２００６年４月）も参照のこと。これらの各開示は、参照することにより本明細書に援用される。マルチアームポリマーは４つまたはそれ以上のポリマーアームを含み、４つまたは８つのポリマーアームが好ましい。説明を目的とするのであって限定はしないが、マルチアームのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は次式でありうる：
【化４】
【０１０９】
ここで、
（ｘ）は、０または正の整数、すなわち約０〜約２８であり、
（ｎ）は重合度である。
【０１１０】
本発明の１つの好ましい実施の形態では、マルチアームＰＥＧが書き構造を有し：
【化５】
【０１１１】
ここで（ｎ）は正の整数である。本発明の１つの好ましい実施の形態では、ポリマーは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有し、４，０００〜４５，０００であることが好ましい。
【０１１２】
別の特定の実施の形態では、マルチアームＰＥＧは下記構造を有し：
【化６】
【０１１３】
ここでｎは正の整数である。本発明の１つの好ましい実施の形態では、ポリマーは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有し、４，０００〜４５，０００であることが好ましい。
【０１１４】
ポリマーは、米国特許第５,１２２，６１４号または同第５，８０８，０９６号の各明細書に記載される活性化技術を使用して、適切な活性化ポリマーに転換することができる。具体的には、このようなＰＥＧは次式でありうる：
【化７】
【０１１５】
ここで、
（ｕ'）は約１０〜約５７０の整数であり、約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有するポリマーを提供することが好ましく、約４，０００〜約４５，０００であることが好ましく、残基の最大３つの末端部分がメチルまたは他の低級アルキルでキャップ化される。
【０１１６】
一部の好ましい実施の形態では、組換えタンパク質への付加を促進するため、ＰＥＧの４つのアームのすべてが、適切な官能基、すなわちＳＣなどに転換される。転換前のこの
ような化合物としては、下記のものが挙げられる：
【化８−１】
【化８−２】
【０１１７】
本発明のほとんどの好ましい態様では、活性化ポリエチレングリコールは、タンパク質とのウレタン結合またはアミド結合を提供するものである。
【０１１８】
さらに別の態様では、活性化ポリマーは、ヒンダードエステル系のリンカーを用いることができる。参照することによりその内容が本明細書に援用される、「ヒンダードエステル系の生体分解性リンカーを有するポリアルキレンオキサイド（Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers）」という発明の名称の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８５９３号パンフレットを参照のこと。例えば、このような化合物の限定されないリストとして、下記のものが挙げられる：
【化９】
【０１１９】
ここで、（ｕ）は、好ましくは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有するポリマーを提供する、整数である。
【０１２０】
１つの好ましい実施の形態では、ＰＥＧ複合体として下記のものが挙げられ：
【化１０】
【０１２１】
ここで、（ｕ）は、好ましくは約２，０００〜約１００，０００、好ましくは約４，０００〜約４５，０００、さらに好ましくは約５，０００の分子量を有するポリマー部分を提供する、整数である。
【０１２２】
適切なポリマーは、重量によって実質的に変化するであろう。本発明の目的では、通常は、約２，０００〜約１００，０００の数平均分子量を有するポリマーが、選択される。約４，０００〜約４５，０００の分子量が好ましく、約５，０００〜約１２，０００が特に好ましい。含まれるポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、それらの共重合体および、水溶性が保持されることを条件としたブロック共重合体が挙げられる。ｍＰＥＧに加えて、Ｃ1-4アルキル末端化ポリマーも有用である。
【０１２３】
高純度の末端カルボン酸を有するポリマーの調製方法は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されている。その方法は、最初に、ポリアルキレンオキサイドの第３級アルキルエステルを調製し、続いてそのカルボン酸誘導体へと転換する。その方法のＰＡＯカルボン酸の調製の最初の工程は、ポリアルキレンオキサイド・カルボン酸のｔ−ブチルエステルなどの中間体を形成する工程を有してなる。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下で、ＰＡＯをｔ−ブチルハロ酢酸と反応させることにより形成される。ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、９２％を超える純度で、好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％、最も好ましくは９９．５％を超える純度で、ポリアルキレンオキサイドのカルボン酸誘導体を容易に得ることができる。
【０１２４】
さらに別の態様では、第３級アミン基を有するポリマーを用いてＡＤＡ複合体を調製することができる。高純度の、第３級アミンを含むポリマーの調製方法は、参照することによりそれぞれの内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されている。例えば、アジドを有するポリマーは、トリフェニルホスフィンなどのホスフィン系の還元剤、またはＮａＢＨ4などのアルカリ金属ホウ化水素還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーを、メチル−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）などの保護化されたアミン塩と反応させて、その後、保護化アミン基を脱保護する。これらの方法で形成される第３級アミンを含むポリマーの純度は、約９５％よりも高く、９９％よりも高いことが好ましい。
【０１２５】
上述の米国特許第６，１５３，６５５号明細書のポリマーによってもたらされる分岐は、単一の結合点に由来する生物活性分子に結合（loading）するポリマーを増加させる手段として、第２または第３の分岐を可能にする。過度の実験をすることなく、必要に応じて、二官能性のリンカー基に結合するように、水溶性のポリマーを官能化できることは、理解されよう。
【０１２６】
本明細書に含まれるポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、それらの共重合体および、水溶性が保持されることを条件とした、それらのブロック共重合体が挙げられる。
【０１２７】
ＰＡＯ系ポリマーの代用として、効果的に、デキストラン、ポリビニル・ピロリドン、ＨＰＭＡ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）などのポリアクリルアミド、ポリビニル・アルコール、炭化水素系ポリマー、前述の共重合体などの非抗原性の材料を使用することができる。当業者は、前述のリストが単に説明のためであって、本明細書に記載される品質を有するすべてのポリマー材料が意図されていることを理解するであろう。
【０１２８】
Ｄ．実用性
技術者は、本発明の変異型ＡＤＡが、ＡＤＡ酵素に感受性の任意の疾患または障害を治療するための臨床症状に容易に用いられることを認識するであろう。このような疾患または障害は、影響を受けて、アデノシンまたはデオキシアデノシンの組織または血中濃度を低減させるものである。このような疾患または障害の例としては、ＳＣＩＤ、例えば喘息などの呼吸器疾患、および、影響を受けて、局所または全身のアデノシンまたはデオキシアデノシンの濃度が低減する癌などが挙げられる。腫瘍または癌の治療におけるＡＤＡの使用についての更なる詳細は、参照することによりその内容全体が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、本願と同日出願の、「酵素による抗癌治療（Enzymatic Anticancer Therapy）」という発明の名称の米国特許出願第１２／１０５，６８２号明細書（米国仮特許出願第６０／９１３，０３９号の優先権の利益を主張）によって提供されている。治療薬は、例えば、変異型ｒｈＡＤＡまたは変異型ｒｂＡＤＡ酵素である。治療用の変異型ｒＡＤＡは、上述のように、例えばＰＥＧ化など、ポリマー結合されていることが好ましい。ＡＤＡまたはポリマー結合ＡＤＡの用量は、動物であるかヒトであるかに関わらず、腫瘍の臨床反応および個々の患者の副作用プロフィールに応じて個別に行われる。本明細書で以下に提供する研究例では、最大用量は、許容される投与可能な最大用量である。
【０１２９】
例えば、アダジェン（Ａｄａｇｅｎ（登録商標））は、２５０ＵのウシＡＤＡ／ｍＬで市販されている。これは、０．２ｍｌの「Ａｄａｇｅｎ」を注射されたおよそ２５ｇのマウスにとって２０００Ｕ／ｋｇと表すことができる。当然ながら、技術者は、ポリマー結合ＡＤＡの用量が、具体的ポリマーの大きさ、リンカー化学、および価数によって調整されうることを認識するであろう。例えば、ポリマーあたり２つまたはそれ以上のＡＤＡ酵素を含むポリマー複合体の投与計画は、ＡＤＡの任意の具体的ポリマー複合体の溶液のｍｌあたりのＡＤＡ単位にしたがって調整されるであろう。
【０１３０】
注入によるＡＤＡまたはＡＤＡのＰＥＧ複合体の提供では、至適用量の範囲は血漿のモニターによって設定されることが好ましい。一般には、約１０〜１００μｍｏｌ／時間／ｍｌ、好ましくは約１５〜約３５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲で血漿ＡＤＡ活性（トラフレベル）が維持されるであろう投与量（３７℃でアッセイ）を服用者に提供し、赤血球アデノシンの減少、すなわち、パック内の赤血球におけるｄＡＴＰが約０．００１〜０．０５７μｍｏｌ／ｍｌ以下、好ましくは約０．００５〜約０．０１５μｍｏｌ／ｍｌであるか、または、注入前サンプルで測定して、正常アデノシンレベルでのｄＡＴＰが、総赤血球アデノシン（すなわち、ＡＴＰ＋ｄＡＴＰ含量）の約１％以下であることを実証することが望ましい。ｄＡＴＰの正常値は約０．００１μｍｏｌ／ｍｌ未満である。
【０１３１】
酵素の量に基づいた用量は、例えば、約０．１０Ｕ／ｋｇ〜約３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約２０Ｕ／ｋｇが好ましく、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約５Ｕ／ｋｇなど、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約１２Ｕ／ｋｇ（患者の体重のｋｇあたり）の範囲であることがさらに好ましい。１週間の総投与量は、服用者が許容できるように、最大４０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上でありうる。服用者が許容できるように、最大単回投与量の３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上に至るまで、５Ｕ／ｋｇ／週のさらなる増加が認められる。一般に、１５Ｕ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」を毎週注射した後の血漿におけるＡＤＡ活性の平均トラフレベルは２０〜２５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲である。
【０１３２】
１００Ｕ／ｋｇの用量は、子供における約１２Ｕ／ｋｇの臨床用量と等しい、マウスの投与量であることに注意すべきである。
【０１３３】
ＡＤＡの投薬情報の詳細は、参照することによりその内容が援用される、「Ａｄａｇｅｎ」（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．製）に挿入される処方箋に記載されるように、当技術分野で知られている。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例は、本発明のさらなる認識を提供する役割をすることであり、本発明の効力範囲を多少なりとも制限することを意味するものではない。
【０１３５】
実施例１
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えヒトＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ヒトのアデノシン・デアミナーゼの報告されているアミノ酸配列（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_００００１３）を、システインのコドンの存在について分析した。成熟（Ｎ−末端Ｍｅｔが開裂している）ポリペプチドの５つの位置が、システインをコードしている（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。ヒトＡＤＡを発現する設計され、修飾された遺伝子では、これら５箇所のシステインのコドン（システイン７４、ＴＧＣ）の１つだけが、セリンのコドン（ＴＣＣ）に変化していた（これは、翻訳されたタンパク質における７５位である）。重複するオリゴヌクレオチド部分の標準的化学合成を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成のため、確定したポリペプチド配列（配列番号：３参照）をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ワシントン州ボセル所在）に提供した。簡潔に言えば、配列を細菌の発現用に最適化し、続いて、Grantham R., et al.; 1981; "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、およびLathe, R.; 1985; "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12に記載されるコドンデータを利用して、標準的な細菌コドンを大腸菌Ｋ１２に用いた。
【０１３６】
報告されているヒトのアデノシン・デアミナーゼの３６３アミノ酸配列（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_００００１３）を、システイン・コドンの存在について解析した。成熟（Ｎ−末端のＭｅｔが開裂している）ポリペプチドにおける５つの位置でシステインがコードされていた（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。ヒトＡＤＡを発現する、設計および修飾された遺伝子では、これら５箇所のシステインのコドンのうちの１つ（システイン７４、ＴＧＣ）だけがセリンのコドン（ＴＣＣ）に変化していた（これは、翻訳されたタンパク質における７５位である）。確定されたポリペプチド配列（配列番号：３を参照）は、重複オリゴヌクレオチド部分の標準的な化学合成を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子を全合成するため、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ワシントン州ボセル所在）に提供された。簡潔に述べると、配列は、Grantham R. et al.; 1981, "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、および、Lathe, R. 1985, "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12に記載されるコドンデータを使用し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２用の標準的な細菌コドン使用にしたがって、細菌内での発現に最適化された。
【０１３７】
次に、対応するＲＮＡ配列をヘアピン構造の形成またはループ形成について分析し、自由エネルギーの計算を最小限に抑えるようにした。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−２８ａ／ＡＤＡｃｙｓＳｅｒ（ＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡのオープン・リーディング・フレーム（コード領域と疑われる）をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：４によるものである。
【０１３８】
単離したコロニーを塗沫し、参照することにより本明細書に援用されるＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法によって、ＬＢ培地においてイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を誘発可能な遺伝子の発現について分析することによって、さらに精製した。
【０１３９】
時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて試験した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でのＡＤＡの産生を可能にする好ましい条件は、２５℃で１２時間、５０μＭのＩＰＴＧを用いた誘発であった。発現させたＡＤＡタンパク質は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された（データ示さず）。
【０１４０】
実施例２
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えウシＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ウシの腸の処置から得られる精製された成熟ＡＤＡタンパク質は、Ｎ−末端のメチオニンが欠如し、ｃＤＮＡ配列から予想された最後の６つのＣ−末端の残基も欠如している、３５６アミノ酸タンパク質である（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_７７６３１２）。ウシＡＤＡアミノ酸配列を、システインのコドンの存在について分析した。成熟ポリペプチドの５つの位置がシステインをコードしている（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。設計および修飾されたウシＡＤＡ合成遺伝子では、これら５箇所のシステイン位置の１つ（システイン７４）だけが、セリン残基に変化していた。これは、成熟タンパク質の７４位（または翻訳生成物の７５位）における通常のシステインのコドンの代わりにセリンのコドン（ＴＣＣ）を挿入することによって実現した。遺伝子はまた、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンであった。
【０１４１】
簡潔に述べると、重複するオリゴヌクレオチド部分の化学合成を含む方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成を目的として、確定したポリペプチド配列（配列番号：１参照）をＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．に提供した。ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社の方法は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する、米国特許第６，３６６，８６０号明細書に詳細に記載されている。
【０１４２】
幾つかの発現系において、ウシＡＤＡの発現を研究した。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−９ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−９ｄ／ｂＡＤＡ（ｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。変異型ＡＤＡをコードするＤＮＡ分子は、配列番号：２によって示されている。
【０１４３】
単離したコロニーを塗沫し、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法により、ＬＢ培地においてＩＰＴＧの誘発が可能な遺伝子の発現について分析することによってさらに精製した。時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて研究した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でＡＤＡを産生させる好ましい条件は、３７℃で１２時間、０．３％の乳糖を用いた誘発であった。ＡＤＡ生成物は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された。
【０１４４】
実施例３
変異型ｒｈＡＤＡタンパク質の精製
変異型ｒｈＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。宿主細胞ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）におけるプラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）上の合成遺伝子からｒｈＡＤＡを発現するＥ．ｃｏｌｉについて、細菌発酵を行った。リファンピシン（２００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を、酵母エキス（３０ｇ／ｌ）を補充したグリセロールの最少培地に含めて、細胞を２８℃で１１ＯＤ600まで増殖させ、５ｍＭの最終濃度に至るまで、誘発因子ＩＰＴＧを加えた。４０時間後（ＯＤ600〜１１０）、遠心分離によって細胞を回収し、−２０℃で冷凍した。簡潔に言えば、解凍した細胞ペースト（５０ｇ）を１０ｍＭのトリス緩衝液［トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン］、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０の１８００ｍｌ緩衝液に再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで１０秒間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部のマイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパクを、４℃で４０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離することによって抽出した（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）社製のＲＣ ５Ｃ ｐｌｕｓ、ローターＳＬＡ−１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。ｐＨを８．０に調整し、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を加え、室温で２時間インキュベートした。次に１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを６．５に合わせた。２回目の遠心分離を上記のようにして行い、上清を回収し、２ｍＭのＥＤＴＡに応じて調整し、その後、ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））の９０ｍｍのフィルター・ユニットでろ過した。ろ過した上清の体積は５００ｍｌであり、ＢＣＡ法による総タンパク質濃度は８．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１４５】
細胞抽出液（１００ｍｌ）をｐＨ７．２および４．５ｍＳ／ｃｍに調整し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５でＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で溶出させた。ピーク画分を酵素アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4中の１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５に調整し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ｆｆカラムに負荷した。負荷する緩衝液の勾配、および２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、ｐＨ６．５を用いてタンパク質を溶出させた。ピーク画分（５５ｍｌ；０．４ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５に対し、ダイアフィルターを行ない（diafiltered）、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５で溶出させた。回収画分は、精製ＡＤＡタンパク質を含んでいた（７７ｍｌ；０．１ｍｇ．ｍｌ）。
【０１４６】
実施例４
組換えウシＡＤＡタンパク質の精製
実施例２のクローンによって発現させた変異型ｒｂＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。簡潔に言えば、−８０℃で保管された、２００ｇの解凍した細胞ペースト（それぞれ、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｅｏｎ社またはＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ社から入手）を、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液１８００ｍｌに再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで５分間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部マイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置一式を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパク質を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。
【０１４７】
この細胞抽出液中のヌクレオチドを除去するため、トリエチレンイミン（ＰＥＩ）を上記上清に加え（最終的には０．１５％、ｗｔ／ｖ）、１０分間攪拌することにより完全に混合させた。次に、この細胞抽出液を４℃で一晩放置した。この一晩放置したサンプルから得られた沈殿を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。同様に、無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。第１のカラムにＡＤＡが結合するのを補助するため、１０％のＰＥＧ４６００をこの細胞抽出液にゆっくりと加え、この細胞抽出液のｐＨを１ＮのＮａＯＨおよび１ＮのＨＣｌを用いてゆっくりと６．５に調整した。次のカラムに負荷する前に、この上清を再度、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離にかけた（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。
【０１４８】
細胞抽出液を、予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ番号１７−５３１６−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製、総容積３５０ｍｌ、ＸＫ−５０に予め充填済み）に、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５の緩衝液を用いて負荷した。ＡＤＡを、８０ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムから平衡化した緩衝液中に溶出させる前に、まず、６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌでの溶出を行い、不純物を除去した。溶出液の特性を、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロット、およびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて解析した。
【０１４９】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムにかけた後、２つの疎水性相互作用によるクロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）精製を１つずつ行い、タンパク質の純度をさらに高めた。最初のＨＩＣはオクチルセファロース（Octyl Sepharose）４ＦＦ（カタログ番号１７−０９４６−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）であった。Ｃａｐｔｏ Ｑカラムから得られたＡＤＡ画分の貯留液を、硫酸アンモニウム粉末を用いて直接、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ社（米国ニューヨーク州ロチェスター所在）製、カタログ番号５４０８８７、ＭＥＭＢ０．２ＰＥＳ）を、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第１のＨＩＣカラムに負荷した（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）。ＡＤＡタンパク質を硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出させ、この溶出液の純度特性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した。第１のＨＩＣカラムの画分のＡＤＡタンパク質を貯留し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第２のＨＩＣカラム（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、カタログ番号１７−１０８２−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）に直接負荷した。これらの画分のＡＤＡ純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。精製ｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡをさらに脱塩し、保存緩衝液（例えば、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）に対しＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ５（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在））で濃縮した。
【０１５０】
実施例５
ｒｂＡＤＡおよびＳｅｒ７４−ｒｂＡＤＡにおける安定性の研究
次の研究は、酸化的分解反応に対するｒｂＡＤＡの安定性が、実際に、ｃｙｓ７４をＳｅｒに突然変異させることによって改善されることを実証するために行なわれた。組換えウシＡＤＡ（ｒｂＡＤＡ）および、ｃｙｓ７４からｓｅｒ７４に突然変異させた組換えウシＡＤＡ（Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ）のサンプルを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、安定性の研究に使用した。安定性は、２２０ｎｍのＵＶ検出および質量分析検出法（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ電気スプレイ質量分析計）の両方を使用して、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである：
カラム： Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ−Ｃ８ （Ａｇｉｌｅｎｔ社製、２５０×４．６ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）
移動相Ａ： 水中、０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル／水中、０．１％のトリフルオロ酢酸（８０／２０；ｖ／ｖ）
勾配： 時間 移動相Ｂ（％）
０ ２０
５ ２０
４５ ８０
４６ ２０
６０ ２０
カラム温度： ４０℃
流量： １．０ｍｌ／分
注入量： ５０μｌ
化合物の純度は、安定性の研究を開始した時点、および、研究の開始後４、８、および１７日を含むさまざまな時点において、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。ｒｂＡＤＡ（非変異型）のサンプルは、本研究の開始時において、およそ生後２ヶ月であり、すでに 一部が分解されていたことに注意すべきである。Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡのサンプルは新たに調製され、比較的純粋であった。しかしながら、本研究の目的では、開始の時点と２５℃で１７日間インキュベート後の純度の差異は、検査のための関連パラメータである。
【０１５１】
表１に示すように、開始時のｒｂＡＤＡの純度は８３．７％であったが、 １７日後には６６．１％に減少しており、この期間に１７．６％のｒｂＡＤＡが分解されたことを示唆した。クロマトグラフィーで分離されたピークの質量分光分析法は、クロマトグラフィーの面積の３０．５％を占める、３１．８５１分に溶出する主要な分解物が、ｒｂＡＤＡの質量よりも３２Ｄａ大きい質量を有していることを示唆した。この質量変化は、ｒｂＡＤＡに２つの酸素が付加して、ｒｂＡＤＡの７４位の遊離のシステインのスルフェン酸分解物を形成することと一致している。３２．５３８分に溶出する、より小さい分解物ピークは、ｒｂＡＤＡに１つの酸素が付加して、ｒｂＡＤＡの７４位の遊離のシステインのスルフェン酸分解物を形成することと一致している。反応性システイン７４残基が置換されたセリン残基を有するＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡでは、開始時点（９７．２％）と１７日後（９７．９％）で実質的に同一の純度を有し、１７日間にわたり、ほとんど分解されないことを示している。これは、システイン７４が、実際に、ｒｂＡＤＡに生じる酸化的分解反応の原因であり、この残基を、酸化の影響を受けないセリンに突然変異させることで分解を排除することを証明している。
【表１】
【０１５２】
実施例６
ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤ患者の治療における変異型ＡＤＡタンパク質の利用
説明した変異型ＡＤＡ酵素は、現在ＡＤＡＧＥＮを採用している治療環境に用いられる。Ｓｅｒ74−ｒｂまたはｒｈＡＤＡは、例えば、ＡＤＡタンパク質あたり１１〜１７本のＰＥＧ、分子量５，０００のポリマーを用いて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させることによって修飾して差し支えない。変異型ＡＤＡのＰＥＧ化調製物は、ｐＨ７．２〜７．４、約２５０単位／ｍｌの濃度で、滅菌生理食塩水中で調剤される。ＰＥＧ化変異型ＡＤＡは、筋内投与などの非経口的投与によって、患者に投与される。このような治療の恩恵を受ける患者としては、不十分なＡＤＡ活性に起因する重症複合型免疫不全症を有する者が挙げられる。変異型ＰＥＧ−ＡＤＡの投与は、典型的には、１０Ｕ／ｋｇの初回投与量、および毎週２０Ｕ／ｋｇの維持投与量の投薬スケジュールを用いて、７日間ごとに行われる。Ｓｅｒ74−ｒｂまたはｒｈＡＤＡは、１．５ｍｌのバイアルあたり１回用量だけを含む水溶液中に、２〜８℃で保存される。投薬スケジュールは、１５〜３５μｍｏｌ／時間／ｍｌの血漿ＡＤＡ活性レベルを維持し（３７℃でアッセイした）、パックされた赤血球１ｍｌあたり０．００５〜０．０１５μｍｏｌ以下にまで、赤血球ｄＡＴＰを低減させるように設計される。
【０１５３】
実施例７
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＣ−ＰＥＧ（炭酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌した。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ（Centriprep）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて、必要に応じて引き続き行なった。
【０１５４】
実施例８
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡの調製
実施例７に記載される条件と同一の条件を用いて、ＳＣ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）をＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【０１５５】
実施例９
アミド結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＳ−ＰＥＧ（コハク酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌した。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて必要に応じて引き続き行なった。
【０１５６】
実施例１０
アミド結合を介した、ＰＥＧ化突然変異タンパク質ｒｈＡＤＡの調製
実施例９に記載された条件と同一条件を用いて、ＳＳ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）を、変異型タンパク質ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、２００７年４月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９１３，００９号の優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、安定性を高めるために変異させた組換えアデノシン・デアミナーゼを提供する。
【背景技術】
【０００３】
アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）は、かなりの期間、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）または「バブルボーイ（Bubble boy）」病と呼ばれる酵素欠損症の治療に使用されている。１５年以上にわたり、Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社は、ウシ起源のＡＤＡ酵素を用いて調製されるＰＥＧ化ＡＤＡの形態で患者に使用できる治療用のＡＤＡを製造している。
【０００４】
近年、ウシ起源の酵素を組換えによって得られる酵素（以後「ｒＡＤＡ」）に置き換える取り組みがなされている。組換えヒトＡＤＡ（「ｒｈＡＤＡ」）および組換えウシＡＤＡ（「ｒｂＡＤＡ」）の双方が、精製天然ウシＡＤＡの代替と考えられている。ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡ酵素は、現在使用されている精製天然ウシ酵素よりも幾分安定性に劣る。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡの両方が、システインの分解と一致する方法、すなわち、酸素の添加；ジチオールの形成；ｐＨの上昇に伴う分解の増大；沈殿、特にｐＨの上昇および試料の濃縮に伴う沈殿などで分解すると考えられている。還元状態では、システインは分解に関与する形態である、反応性の−ＳＨ基（スルフヒドリル基）を含む。
【０００５】
証拠は、たった１つの曝露されたシステインが、ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方に認められる分解に関与しうることを示唆している。ウシＡＤＡ（すなわち、ウシ起源から精製される天然ウシＡＤＡ）は、ｒｈＡＤＡと非常によく似た構造を有する。すなわち、ウシＡＤＡおよびｒＡＤＡの両方が、一次配列の同一の複数位置に同数のシステインを有する。現在得られる組換えヒトＡＤＡおよび組換えウシＡＤＡは、システインの反応性と一致する、分解生成物（degradants）／不純物（ジチオール）を含む。天然ウシＡＤＡは、ＡＤＡ各モルと結合した、単一モルのシステインを有する点で、ウシＡ組換えＤＡとは構造的に異なる。天然ウシＡＤＡはまた、高ｐＨに対して安定であり、このことは、ＡＤＡに結合したシステインが保護基としての機能を果たすことを示唆している。
【０００６】
組換えヒトおよび／またはウシＡＤＡを安定化させる方法の１つは、活性Ｃｙｓ残基（成熟ｒｂＡＤＡおよび成熟ｒｈＡＤＡの両方のＣｙｓ７４）を、酸化型グルタチオン、ヨードアセトアミド、シスチン、他のジチオール、およびそれらの混合物のいずれか１つでキャップ化することである。この方法は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する、本願と同一の出願人に譲渡された、「安定化タンパク質（Stabilized Proteins）」という発明の名称の特許文献１に説明されている。
【０００７】
前述の説明にもかかわらず、発現の際、すぐに先天的な安定性を提供するため、タンパク質構造を修飾することによるさらなる追加のキャップ化のステップの必要性を回避することが有利であろう。特許文献２は、突然変異によって、不安定なＣｙｓ残基をＳｅｒおよび他のアミノ酸残基で置換することによる、スブチリシンなどの原核生物のプロテアーゼ、および中性プロテアーゼの安定化について記載している。しかしながら、ＡＤＡにおける活性部位の変異解析は、Ｃｙｓ残基 （Ｃｙｓ２６２）の置換が結果的に酵素における顕著な活性の低下を生じることを示した（Ｂｈａｕｍｉｋらの非特許文献１）。したがって、本発明以前には、最適かつ有用な酵素活性を保持しつつ、活性な、曝露されたＣｙｓ残基を別のアミノ酸残基によって置換することによる、アデノシン・デアミナーゼ酵素を安定化することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第１１／７３８，０１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３４６，８２３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bhaumik et al. 1993, The J. of Biol Chem, 268. (8):5464-5470
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、酵素の最適なＰＥＧ化に有用なｐＨレベルで、安定な、すなわち保管および処理の間に顕著に分解することのない、ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方を提供することは有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、野生型の形態のＡＤＡ酵素について、任意の酸化されうるシステイン残基が酸化されないアミノ酸残基で置換された、組換えＡＤＡを提供する。変異型ＡＤＡには、天然Ｌ−アミノ酸の１つである酸化されないアミノ酸残基が含まれ、例えば、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン および／または当技術分野で既知の天然Ｌ−アミノ酸のバリエーションおよび誘導体、すなわち、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）などが挙げられる。メチオニンまたはトリプトファンは、潜在的に酸化されうることから、 これらは随意的に避けられる。
【００１２】
酸化されないアミノ酸残基は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンの中の１つであることがさらに好ましい。セリンが最も好ましい。特定の好ましい実施の形態では、酸化されうるシステインは、成熟ＡＤＡタンパク質の７４位に位置している。組換えＡＤＡは、例えば、配列番号：２または配列番号：４に従ったＤＮＡ分子から翻訳された組換えウシＡＤＡまたは組換えヒトＡＤＡであることが好ましく、配列番号：１または配列番号：３を含むことが好ましい。組換えＡＤＡが、配列番号：１に従った組換えウシＡＤＡである場合、ＡＤＡは、随意的に、Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ；Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ；およびＧｌｙ351に代わるＡｒｇのうちの１つ以上から選択される多型で表される。
【００１３】
本発明は、ポリアルキレンオキサイド−ＡＤＡ複合体も提供し、ここでポリアルキレンオキサイドはポリエチレングリコールであることが好ましい。随意的に、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、コハク酸スクシンイミジル、およびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカー化学を介して、ポリエチレングリコールを組換えアデノシン・デアミナーゼと結合させる。炭酸スクシンイミジルが好ましい。ポリエチレングリコールは、組換えアデノシン・デアミナーゼのＬｙｓのε−アミノ基に共有結合していることが好ましい。
【００１４】
ポリエチレングリコール−ＡＤＡ複合体は、ε−アミノ基に結合している少なくとも１つ（すなわち１つ以上） のポリエチレングリコール鎖を含み、ε−アミノ基に結合している少なくとも５（すなわち５つ以上）ポリエチレングリコール鎖が好ましく、あるいは、組換えＡＤＡのＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している、約１１〜約１８本のポリエチレングリコール鎖がさらに好ましい。
【００１５】
本発明の複合体のポリエチレングリコールは、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有し、約４，０００〜約４５，０００であることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の組換えアデノシン・デアミナーゼを精製する方法を提供する。例えば、組換えアデノシン・デアミナーゼは、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＣａｐｔｏ Ｑ、ＤＥＡＥおよびＳＰクロマトグラフィー）によって精製することが好ましく、配列番号：１の組換えアデノシン・デアミナーゼは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製することが好ましい。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の組換えＡＤＡを有効量で投与する、哺乳動物におけるＡＤＡ介在性の病状を治療する方法をも提供する。ＡＤＡ介在性の病状には、例えば、ＳＣＩＤ、癌などが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ酵素を提供する。本発明のアデノシン・デアミナーゼ酵素は、酵素が溶液内に存在する場合に、分解不安定性（breakdown instability）の原因を取り除きつつ、酸化プロセスに曝露されたシステイン残基を、酵素の活性、電荷、および三次構造を保護する、許容可能な別のアミノ酸残基と置換することによって提供される。
【００１９】
Ａ．定義
本発明についての明確な説明を提供することを目的として、いくつかの用語を下記のように定義する。
【００２０】
「組換え」という用語は、天然状態において、タンパク質を発現することのできるＤＮＡの内因性コピーを有していない細胞を使用して産生したタンパク質のことをいう。細胞は、適切に単離された核酸配列の導入によって遺伝子を変化させることにより、組換えタンパク質を産生する。この用語はまた、異種（外因性または異質な）核酸を導入すること、あるいは、天然の核酸をその細胞、またはそのように修飾された細胞から生じる細胞にとって天然ではない形態に変化させることによって修飾されている細胞、または核酸、またはベクターへの言及も含む。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態では認められない遺伝子を発現し、天然の形態では認められない遺伝子の突然変異体を発現し、あるいは、別の方法では異常に発現する、発現が不足している、または全く発現しない、天然の遺伝子を発現する。
【００２１】
本明細書では、「核酸」または「核酸配列」には、一本鎖または二本鎖のいずれの形態であるかにかかわらず、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーについての言及が含まれ、他に限定しない限り、天然のヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリッドする、天然の既知の類似体も包含される。他に示唆しない限り、特定の核酸配列には、その相補配列が含まれる。
【００２２】
特定の核酸に関する「コードする」という用語には、特定のタンパク質へと翻訳するための情報を含む核酸についての言及も含まれる。情報は、コドンを利用することによって特定される。
【００２３】
「宿主細胞」とは、発現ベクターの複製または発現を支える細胞である。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞であって差し支えなく、あるいは、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物の細胞などの真核細胞であってもよい。
【００２４】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーについての言及も含む。
【００２５】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（まとめて「ペプチド」）に取り込まれるアミノ酸についての言及を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸であって差し支えなく、他に限定しない限り、天然アミノ酸と同様の機能をすることができる、天然アミノ酸の既知の類似体も含む。
【００２６】
「トランスフェクション」は、任意のコードする配列が実際に発現されるか否かに関わらず、宿主による発現ベクターの取り込みのことをいう。当業者には、さまざまなトランスフェクションの方法が知られている。例えば、トランスフェクションは、発現ベクターおよび高濃度のＣａＰＯ4存在下、エレクトロポレーションによって、宿主細胞への挿入にファージまたはウイルスの発現ベクターを使用して、拡散の機械的挿入によって、および、パッケージされていない核酸断片の存在下で宿主細胞を培養することによっても、達成される。トランスフェクションの成功は、一般に、対象とするベクターの作用の兆候が
宿主細胞内に生じる際に認識される。
【００２７】
「形質転換」は、染色体外要素として、または宿主の染色体内に融合することによって、核酸が複製可能になるように、有機体に核酸を導入することを表す。用いられる宿主細胞に応じて、形質転換は、特定の宿主細胞に好適な当技術分野で既知の方法を使用して達成される。Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)およびMandel et al., J. Mol. Biol. 53:154 (1970)に記載されるように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、一般に、細胞壁（例えば、多くの細菌細胞および／または植物細胞）内に封入された原核生物または他の細胞に使用される。このような細胞壁を有しない哺乳動物細胞では、Graham, F. and van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1978)に記載されるリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主システムの形質転換の一般的な態様は、１９８３年８月１６日に発行された米国特許出願第４，３９９，２１６号明細書に記載されている。酵母への形質転換は、一般に、Van Solingen, P., et al., J. Bact., 130: 946 (1977)、およびHsiao, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979)の方法にしたがって行われる。しかしながら、例えばＤＮＡなどの核酸を、例えば核注入、リポフェクション、または原形質融合などによって、細胞内に導入するための他の当技術分野で既知の方法もまた使用して差し支えない。
【００２８】
本明細書では、核酸に関する「相補」という用語は、第１の核酸分子を鋳型として利用して、その核酸分子が複製され、新しい第２の核酸の鎖を形成する場合に産生される対向する鎖（ワトソン−クリックの塩基対を使用する）のことをいう。本発明の１つの態様では、２つの核酸分子は、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリッドまたは結合する場合に、それぞれ相補的であるとみなされる。
【００２９】
「機能的に結合した(operably linked)」とは、例えば調節領域およびオープン・リーディング・フレームなどの構成要素が、構成要素が正常に機能しうるように並置されることをいう。よって、制御配列に「機能的に結合した」オープン・リーディング・フレームとは、コード配列がこれらの配列の制御下で発現可能な配置のことをいう。
【００３０】
「制御配列」とは、特定の生物において、機能的に結合したコード配列の発現に必要な核酸配列のことをいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーターが含まれ、随意的に、オペレーター配列、リボソーム結合部位、および、可能性として、まだよく分かっていない配列などの他のものも挙げられる。真核細胞は、例えば、ほんの数例を挙げれば、プロモーター、ポリアデニル化信号およびエンハンサーなどとして、このような制御配列を利用することが知られている。
【００３１】
「発現系」または「発現ベクター」とは、所望のコード配列を有するように形質転換された宿主が、コードされるタンパク質を産生可能なように機能的に結合した状態で、所望のコード配列および制御配列を含む、核酸配列のことをいう。形質転換をもたらすため、発現系をベクターに含めてもよいが、しかしながら、その後に、関連する核酸分子を宿主染色体に組み込んでもよい。
【００３２】
本明細書では、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は同義的に用いられ、このような意味のすべてが、子孫を含む。よって、「形質転換された個体（transformants）」、または「形質転換細胞」は、転換の数にはこだわらず、主要な対象細胞、およびそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的な、または無作為の突然変異に起因して、ゲノム内容において正確に同一ではない場合があるものと解されたい。最初に形質転換された細胞について検査されたものと同一の機能を有する突然変異の子孫も含まれる。はっきりと識別可能な指示が意図されている箇所は、その文脈から明らかであろう。
【００３３】
本発明の目的では、「残基」という用語は、別の化合物との置換反応に供した後に残る、例えばＰＥＧ、ＡＤＡ、アミノ酸などのことを称する、化合物の部分を意味すると解されるべきものとする。
【００３４】
本発明の目的では、「ポリマー残基」、例えば「ＰＥＧ残基」という用語は、それぞれ、他の化合物、部分などとの反応に供した後に残るポリマーまたはＰＥＧの部分を意味すると解されるべきものとする。
【００３５】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環状のアルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素のことをいう。「アルキル」という用語は、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびＣ1-6アルキルカルボニルアルキル基も含む。アルキル基は、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。炭素数約１〜７の低級アルキルであることがさらに好ましく、炭素数約１〜４であることがさらになお好ましい。アルキル基は、飽和または不飽和でありうる。置換されている場合、その置換基としては、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が挙げられる。
【００３６】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「置換された」という用語は、官能基または化合物に含まれる１つ以上の原子を、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6アルキル、アリール、およびアミノ基からなる群に由来する部分の１つを加えるか、これらの部分の１つで置換することをいう。
【００３７】
本明細書では「アルケニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む基のことをいう。アルケニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルケニル基は炭素数約２〜７の低級アルケニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルケニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルアルキル、アリール、およびアミノ基が含まれる。
【００３８】
本明細書では「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基のことをいう。アルキニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルキニル基は炭素数約２〜７の低級アルキニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルキニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が含まれる。「アルキニル」の例としては、プロパギル、プロピン、および３−ヘキシンが挙げられる。
【００３９】
本発明の目的では、「アリール」という用語は、少なくとも１つの芳香族環を含む芳香族炭化水素環系のことをいう。芳香族環は、随意的に、他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。アリール基の例としては、例えば、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、およびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００４０】
本発明の目的では、「シクロアルキル」という用語は、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００４１】
本発明の目的では、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。
【００４２】
本発明の目的では、「シクロアルキルアルキル」という用語は、Ｃ3-8シクロアルキル基で置換されたアルキル基のことをいう。シクロアルキルアルキル基の例としては、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。
本発明の目的では、「アルコキシ」という用語は、酸素橋を通じて親分子部分に結合している、所望の炭素原子数のアルキル基のことをいう。アルコキシ基の例としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシが挙げられる。
【００４３】
本発明の目的では、「アルキルアリール」基とは、アルキル基で置換されたアリール基のことをいう。
【００４４】
本発明の目的では、「アラルキル」基とは、アリール基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００４５】
本発明の目的では、「アルコキシアルキル」基という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００４６】
本発明の目的では、「アルキル−チオ−アルキル」という用語は、例えばメチルチオメチルまたはメチルチオエチルなどのアルキル−Ｓ−アルキルチオエーテルのことをいう。
【００４７】
本発明の目的では、「アミノ」という用語は、有機ラジカルによって１つ以上の水素ラジカルが置換されることにより、アンモニアから誘導される、当技術分野で既知の窒素含有基のことをいう。例えば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」という用語は、それぞれ、アシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルのことをいう。
【００４８】
本発明の目的では、「アルキルカルボニル」という用語は、アルキル基で置換されたカルボニル基のことをいう。
【００４９】
本発明の目的では、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素のことをいう。
【００５０】
本発明の目的では、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、非芳香族環系のことをいう。ヘテロシクロアルキル環は、随意的に、他のヘテロシクロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロシクロアルキル基は、３〜７員環であることが好ましい。ヘテロシクロアルキル基の例として、例えば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、およびピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基として、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、およびピロリジニルが挙げられる。
【００５１】
本発明の目的では、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、芳香族環系のことをいう。ヘテロアリール環は、１つ以上のヘテロアリール環、芳香族または非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロアリール基の例として、例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン、およびピリミジンが挙げられる。ヘテロアリール基の好ましい例として、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００５２】
本発明の目的では、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、および硫黄のことをいう。
【００５３】
一部の実施の形態では、置換アルキルは、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル、およびメルカプトアルキルを含み、置換アルケニルは、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル、およびメルカプトアルケニルを含み、置換アルキニルは、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル、およびメルカプトアルキニルを含み、置換シクロアルキルは、４−クロロシクロヘキシルなどの部分を含み、アリールは、ナフチルなどの部分を含み、置換アリールは、３−ブロモフェニルなどの部分を含み、アラルキルは、トリルなどの部分を含み、へテロアルキルはエチルチオフェンなどの部分を含み、置換へテロアルキルは、３−メトキシ−チオフェンなどの部分を含み、アルコキシは、メトキシなどの部分を含み、フェノキシは、３−ニトロフェノキシなどの部分を含む。ハロは、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含むものと解されるべきものとする。
【００５４】
本発明の目的では、「正の整数」は、１以上の整数を含み、当業者には当然のことながら、当業者における合理的範囲内であると解されるべきものとする。
【００５５】
本発明の目的では、「結合した（linked）」という用語は、１つの基が別の基に共有的に付加すること（好ましい）または非共有的に付加することを含むと解されるべきものとする。
【００５６】
「有効量」および「十分量」という用語は、本発明の目的では、当業者に理解されるような効果として、所望の効果または治療効果を達成する量を意味するものとする。
【００５７】
本発明の目的では、「アデノシン」という用語は、ヌクレオシドである、アデノシンおよびデオキシアデノシンを含むと解されるべきものとする。アデノシンには、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰまたはｄＡＴＰの形態で存在するアデノシンおよびデオキシアデノシンも含まれる。
【００５８】
本発明の目的では、「アデノシン介在性の病状」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の病状」とは、投与経路に関わらず、ＡＤＡまたはその活性画分などの投与が有効である、任意の疾患、病状、または障害を幅広く含むものと解されるべきものとする。
【００５９】
本発明の目的では、ＳＣＩＤのような、「アデノシン介在性の病状の治療」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の病状の治療」とは、症状または病状が、ＡＤＡ治療をしない場合に観察される状態と比較した場合に、回避するか、最小限に抑えられるか、あるいは弱小化されることを意味すると解されるべきものとする。病状の治療は、例えば、アデノシンの減少によって確認することができる。
【００６０】
大まかに言えば、アデノシン介在性の病状の治療は、所望の臨床反応が得られた場合に、成功とみなされるべきものとする。あるいは、治療の成功は、ＡＤＡ治療をせずに観察されるものと比較した場合に、当分野における技術者によって意図される他の臨床的指標を含む、少なくとも２０％、または好ましくは３０％、さらに好ましくは４０％またはそれ以上（すなわち、５０％または８０％）のアデノシンの減少を得られることによって定義されうる。
【００６１】
さらには、記載の便宜上の単数形の語句の使用は、そのように限定されることを全く意図していない。よって、例えば、１つの酵素を含む１つの化合物についての言及は、その酵素の１つまたはそれ以上の分子のことをいう。本発明はまた、本明細書に開示される特定の構造、工程段階、および材料に限定されるのではなく、そのような構造、工程段階、および材料は幾分変化しうるものと解されるものとする。
【００６２】
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって限定されるであろうことから、本明細書で用いられる技術用語についても、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられるのであって、限定されることは意図していないと解されるものとする。
【００６３】
Ｂ．組換え産生させたＡＤＡ酵素
ヒトまたはウシに由来する遺伝子から発現させた酵素を含む、組換えＡＤＡ酵素を得るための最初の取り組みでは、ウシの腸に由来する天然ＡＤＡでは以前には見られなかった、保存不安定性が明らかとなった。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡの分解生成物の研究が行われ、システインの分解と一致する方法で両方のＡＤＡ酵素が分解することが確認された。例えば、ｒｈＡＤＡに対する酸素の付加は、ｒｈＡＤＡの質量よりも１６および３２大きい質量を有する、ｒｈＡＤＡよりもさらに疎水性の化合物を形成する結果となった。加えて、これは、結果的に、ジチオールの形成、ｐＨの上昇の際の分解の増大、沈殿（特にｐＨ上昇時）を生じ（ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）の添加によって、分解物の小集団の反転によって示される）、サンプルが濃縮され、分子間のジスルフィド結合の形成が不溶性の凝集体を生成することが示唆される。
【００６４】
我々は、単一の曝露されたシステインが、ｒｈＡＤＡに認められる分解に関与していることを究明した。ウシＡＤＡ（分解していない）は、 ｒｈＡＤＡの構造と非常によく似た構造を有しており、ウシＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方が、一次配列の同一位置に同数のシステインを有している。ｒｂＡＤＡはまた、システインの反応性と一致する分解物／不純物（ジチオール）も含んでいる。天然ウシＡＤＡは、ＡＤＡの各モルに結合する単一モルのシステインを有するという点でｒｂＡＤＡとは構造的に異なり、また、天然ウシＡＤＡは高いｐＨに対して安定であり、これらのことから、ＡＤＡに結合したシステインが保護基として機能していることが示唆される。天然ウシＡＤＡに結合したシステインは、メルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤で処理することにより除去することができる。理論または仮説に拘束されるものではないが、これは、システイン基が下記のようにジスルフィド基を介してＡＤＡに結合していることを示唆している：
ＡＤＡ−Ｓ−Ｓ−システイン
ここで、ＡＤＡの一次配列における１つのシステインは、１分子のシステインに結合している。このようなジスルフィド結合に関与しているシステインは、最初の段落で言及した酸化的分解の経路に対して安定である。システイン残基は、ヒトおよびウシの成熟ＡＤＡの７４、１５２、１５３、１６８、および２６１の位置に存在する。Ｘ線結晶学（Kinoshita et al., 2005, Biochemistry, 44:10562-10569）から得られるウシＡＤＡの３次元構造の検討は、７４、１５２、１５３、１６８、および２６１に位置するシステインが、分子内のジスルフィド結合に関与する機会がないことを示唆している。構造上の幾何学的制約が、一般的に、ジスルフィド結合に関与する、ＡＤＡの１５２および１５３の位置に生じるようなシステイン残基の隣接を抑制することが知られている。したがって、すべてのシステイン残基が還元状態である可能性があり、必然的に、酸化的分解反応のための潜在的候補部位である。しかしながら、上記引用したウシＡＤＡの３次元の外観検査は、システイン７４が、明らかに他の４つのシステインよりも溶媒に著しく曝露されていることを示唆しており、さらには、他の４つのシステインが、溶媒和された反応物質との顕著な相互作用を妨げるであろう酵素構造内に、ある程度、埋め込まれているように思われる。唯一反応性のシステイン残基の存在によって、翻訳後修飾の結果であると推定される、天然ウシ・アデノシン・デアミナーゼのモノ誘導体化（monoderivatization）が説明できよう。
【００６５】
上記事実は、７４位の反応性システインがｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡに認められる分解に関与する可能性があること、および、システインの反応性−Ｓ−Ｈ基のキャップ化が、組換え酵素に見られるような明らかな酸化的分解の経路からｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを保護していることを示唆した。以下の実験は、これがその事例であるか否かを決定するために行ったものである。約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えｈＡＤＡを、ｐＨ７．４、３７℃で１６時間、リン酸ナトリウム緩衝液中の１２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と反応させた。反応を開始して数分間以内の、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析検出法によるサンプルの分析は、約７０．９％のｒｈＡＤＡがＩＡＡでモノ誘導体化され、１７．２％が２つの部位で誘導体化された。２時間および１６時間のインキュベーションの後、クロマトグラフィープロファイルには顕著な変化はなく、誘導体がｒｈＡＤＡに特有の酸化的分解の経路に対して安定であることを示唆した。ｒｈＡＤＡの同様のサンプルを、ＩＡＡの不存在下で調製し、同様に分析した。ｐＨ７．４、３７℃で１６時間のインキュベーションの後、ｒｈＡＤＡタンパク質は３０％程度分解した（サンプルが最初に有していた分解を上回った）。この結果は、単一の顕著に曝露されたシステインを、ヨードアセトアミドでキャップ化することによって保護できることと一致している。これらの実験は、上記引用したように、参照することにより本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、「安定化タンパク質（Stabilized Proteins）」という発明の名称の米国特許出願第１１／７３８，０１２号明細書にさらに詳細に記載されている。
【００６６】
キャップ化がＡＤＡにおける反応性のシステインの酸化的分解の排除に有効であると同時に、このようなキャップ化された酵素は追加の製造工程を必要とする。よって、異なるアミノ酸で置換することによる、コードする遺伝子から得られる不安定なＣｙｓ残基の直接的な排除が検討された。適切な置換アミノ酸は、同タイプの酸化の影響を受けるものではなく、折り畳まれたＡＤＡタンパク質の三次構造を妨げず、また、本発明の典型的な実施の形態においては、複合体形成の間に活性化ポリアルキレンオキサイドに対して無作為に結合しないようなものが選択される。この基準を満たす、任意の当技術分野で既知の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体が、本発明にしたがった酸化されうるシステインと置換するのに適していることが意図されている。このようなアミノ酸の典型的なリストとして、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシンなどの天然Ｌ−アミノ酸が挙げられる。トリプトファンおよびメチオニンは比較的容易に酸化されうることから、特定の随意的な実施の形態では、あまり好ましくない。
【００６７】
宿主細胞における、非天然のＬ−アミノ酸を部位特異的に取り込んだ組換えタンパク質の産生方法は、例えば、Liu et al., 2007, Nat. Methods 4(3):239-44, Xie et al., 2006 Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7(10):775-82, Ryu et al., 2006, Nat. Methods 3(4):263-65, Deiters et al., 2004, Bioorg. Med. Chem Lett. 14(23):5743-5, Bogosian et al., 1989, J. Biol. Chem. 264(1):531-9, Tang et al., 2002, Biochemistry 41(34):10635-45, Budisa et al., 1995, Eur. J. Biochem. 230(2): 788-96, and Randhawa et al., 1994, Biochemistry, 33(14):4352-62などの文献に記載されている。よって、置換アミノ酸は、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２'−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）などの、修飾された、あまり典型的ではないアミノ酸をも含みうる。
【００６８】
組換えＡＤＡにおいて、随意的にシステインが置換された、さらに好ましい天然アミノ酸としては、例えば、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンが挙げられる。セリンが最も好ましく、下記に例証する。
【００６９】
結果的に、野生型のヒトおよびウシのアデノシン・デアミナーゼを発現するＤＮＡ分子が得られ、コドンをＥ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化し、各成熟タンパク質の７４位に天然のＣｙｓ残基に代わってそれぞれＳｅｒ残基を含む、変異型ｒｂＡＤＡおよび変異型ｒｈＡＤＡを発現するように突然変異させた。これらは、それぞれＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（配列番号：１）およびＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（配列番号：３）である。加えて、ウシの腸から単離された天然ウシＡＤＡは、翻訳後にＣ末端から除去される６残基も有していることは注目すべきである。本発明によるＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡは、６つのＣ末端残基なしで発現される（突然変異として）、あるいは、精製した天然ウシＡＤＡにおいて欠如している残基と同一のＣ末端残基を除去するために翻訳後に修飾されることは、本発明の随意的な特徴である。さらに注目すべきは、ウシの腸から単離された天然のウシＡＤＡが多型を有していることであり、配列番号：５に関しては、ウシＡＤＡの多型には、例えば、１９８位のリジンに代わるグルタミン、２４５位のトレオニンに代わるアラニン、３５１位のグリシンに代わるアルギニンが含まれる。 したがって、本発明による７４位の組換え変異型ウシＡＤＡは、１つまたはそれ以上の指摘された位置についてのさらなる置換体、またはそれらの位置類似体、すなわちＬｙｓ198に代わるＧｌｎ；Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ；Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇを有することが意図されている。
【００７０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される、配列番号：１または配列番号：３のアミノ酸配列を有する変異型ＡＤＡをコードする、単離されたＤＮＡを提供する。１つまたはそれ以上の置換、すなわちＬｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇを有する変異型ＡＤＡをコードする他のＤＮＡもまた、本発明の範囲にあることが意図されている。
【００７１】
適切な発現ベクターは、それぞれ、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡをコードするゲノムまたはｃＤＮＡから、言い換えれば、随意的に、適切な機能的に接続した誘導プロモーターの制御下で、調製することができる。ＤＮＡは、適当な宿主細胞用に最適化されたコドンであって、例えば、高効率のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（Olsen DB and Eckstein F, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1451-5; 1990）、重複する長鎖オリゴヌクレオチドを用いた全遺伝子合成（Vasantha N and Filpula D, Gene 76: 53-60; 1989）、ＰＣＲ法による遺伝子合成（Jayaraman K et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 4084-88; 1991）、または重複伸長ＰＣＲ法（overlap extension PCR）（Pogulis RJ et al., Methods Mol Biol 57: 167-76; 1996）など、任意の便利な当技術分野で既知の方法によって突然変異させることが好ましい。
【００７２】
一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニング、および本発明に有用なベクターの構築には、原核生物が好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１，４４６）が特に有用である。単なる例として、利用しうる他の微生物菌株には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１，５３７）などのＥ．ｃｏｌｉ株が含まれうる。前述の菌株、ならびに、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、原栄養菌株、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７，３２５）、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３，６３５）、およびＳＲ１０１、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバシラス属、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス（Serratia marcesans）、およびさまざまなシュードモナス種（pseudomonas species）などの他の腸内細菌科も使用して差し支えない。
【００７３】
一般には、レプリコンを含むプラスミドベクターおよび宿主細胞に適合する種に由来する制御配列が、これらの宿主と共に用いられる。従来のプラスミドベクターは、外因性のＤＮＡ配列を挿入するのに適した酵素認識部位で改変された二本鎖の環状ＤＮＡ分子、抗生物質選択遺伝子、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、および組換えインサートＤＮＡを含むクローンの識別または選択のための遺伝子である。Ｅ．ｃｏｌｉでの使用に好適なプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ３、ｐＥＴ９、ｐＥＴ１１および拡大ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログに記載）のｐＢＡＤ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、ｔｒｐ、およびＯL/R／ＰL/Rプラスミドが挙げられる。
【００７４】
単なる例であるが、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（例えば、Bolivar et al., 1977, Gene, 2: 95を参照）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、したがって、形質転換させた細胞を識別するための簡便な手段を提供する。同様に、ｐＵＣプラスミドは、選択および複製のためのＤＮＡ分子を用いて、便利なクローニング・ベクターを提供する（参照することによりその開示全体を本明細書に援用する、Yanisch-Perron, et al., 1985, Gene 33:103-119）。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージは、それ自体がコードされたタンパク質を発現させるため、微生物によって利用可能なプロモーターを含むか、または含むように修飾される必要がある。
【００７５】
組換えＤＮＡの構築に最も一般に用いられるそれらのプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーター系（Chang et al., 1978 Nature, 375: 615; Itakura et al., 1977, Science, 198: 1056; Goeddel et al., 1979, Nature, 281: 544）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res., 8: 4057; EPO Appl. Publ. No. 0036,776）が挙げられる。これらが最も一般に利用されると同時に、他の微生物プロモーターが見出され、活用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されて、技能者がそれらを、例えばプラスミドベクターなどの当技術分野で既知のベクターを用いて機能的に結合できるようになっている。
【００７６】
単なる例であるが、Ｅ．ｃｏｌｉにおける転写制御は、任意の次の誘導プロモーターを用いて達成して差し支えない：ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ａｒａＢＡＤ、Ｔ７、ｔｒｃ、 およびλＰLおよびＰRプロモーターの誘導体、ならびに当技術分野で周知の他のもの（例えば、参照することによりその開示を本明細書に援用する、Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60:512-538）。
随意的にベクターと適合する、適切な誘発因子の状態は、例えば、アラビノース、乳糖、または熱誘導、リン酸欠乏、トリプトファン欠乏などが挙げられる。誘発剤成分は、イソプロピルチオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）によって誘発可能な乳糖オペロンであることが好ましい。
【００７７】
適切なシグナル配列（シグナルペプチド）は、ｐｅｌＢ、ｆｄ ｐＩＩＩ、またはｏｍｐＡに由来しうる。
【００７８】
適切な抗生剤選択マーカーは、当技術分野で周知であり、例えば、数ある中でも、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、リファンピシン、またはテトラサイクリン耐性などが挙げられる。
【００７９】
複製配列の適切な起源には、次のプラスミドに見られるものが挙げられる：ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、およびｐＳＣ１０１。
【００８０】
適切な終止配列としては、例えば、ファージｆｄの主要なターミネーターＴΦおよびｒｒｎＢが挙げられる。
【００８１】
原核生物に加えて、酵母培養液などの真核微生物もまた使用して差し支えない。真核微生物の中でも、代表的なパン酵母であるサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）が最も一般的に用いられるが、多くの他の菌株も一般に入手可能である。サッカロミセス属（Saccharomyces）における発現では、例えばプラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282: 39; Kingsman et al., 1979, Gene, 7: 141; Tschemper et al., 1980, Gene, 10: 157）などが一般に用いられる。このプラスミドは、トリプトファンで増殖する能力が欠如した酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４，０７６またはＰＥＰ４−１（Jones, 1977, Genetics, 85: 12）のための選択的マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子をすでに含んでいる。酵母の宿主細胞ゲノムの特性としての ｔｒｐ１の損傷の存在は、次に、トリプトファンの不存在下で増殖することにより、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【００８２】
メタノール資化酵母（Pichia pastoris）系は、幾つかのタンパク質の高レベルでの産生を達成することが明らかになっており（参照することによりその開示の全体を援用する、Cregg, J.M. et al., 1993, Bio/Technology 11: 905-910）、メタノール資化酵母の細胞質に可溶性タンパクとしてＡＤＡを発現させてるために用いてもよい。
【００８３】
酵母ベクターにける適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J. 1980, Biol. Chem., 255: 2073）または他の糖分解酵素（Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 ; Holland et al., 1978, Biochemistry, 17: 4900）、例えば、エノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのためのプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドの構築では、これらの遺伝子に関連した終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および転写終結をもたらすために発現されることが所望される配列の発現ベクター３'内に結合される。増殖条件によって制御される翻訳のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２型、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関与している酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製起点、および終止配列を含む任意のプラスミドベクターが適している。
【００８４】
複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えばポリオーマ、腺、ＶＳＶ、ＢＰＶ）起源に由来しうる、または宿主細胞の染色体の複製メカニズムによってもたらされうる、外因性の起点を含むことを目的としたベクターの構築によって提供されて差し支えない。ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれる場合は、後者が採用される場合が多い。他の有用なプラスミド要素には、シャペロンタンパク質、プロリン異性化酵素タンパク質、またはジスルフィド・シャッフリング・タンパク質をコードした発現遺伝子が含まれうる。
【００８５】
Ｃ．ポリマー複合体
本発明の別の態様では、Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（配列番号：１）およびＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（配列番号：３）タンパク質などの変異型ＡＤＡは、ポリマー複合体を調製するために、適切なポリマーと結合する。
【００８６】
好ましい態様では、変異型ＡＤＡポリペプチドは、実質的に非抗原性のポリマー、好ましくはポリアルキレンオキサイド（「ＰＡＯ」）と結合する。
【００８７】
ＡＤＡポリマー複合体は、一般に式（Ｉ）：
（Ｉ） ［Ｒ−ＮＨ］z−（ＡＤＡ）
に対応し、ここで、
（ＡＤＡ）は組換え変異型アデノシン・デアミナーゼまたはそれらの活性断片を表し、
ＮＨ−は、ポリマーに結合するための変異型ＡＤＡに見られるアミノ酸のアミノ基であり、
（ｚ）は正の整数であり、約１〜約８０であることが好ましく、約５〜約８０であることがさらに好ましく、約１１〜約１８であることがさらになお好ましく、
Ｒは、放出可能な形態または放出できない形態でＡＤＡに結合する、実質的に非抗原性のポリマー残基を含む。
【００８８】
さらに好ましい態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、ここでＰＥＧは、直鎖、分岐鎖、またはマルチアームでありうる。一般に、ポリエチレングリコールは、式：
−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−
を有し、ここで、（ｎ）は正の整数であり、約１０〜約２３００であることが好ましく、約４０〜約２，３００であることがさらに好ましい。ポリマーの平均分子量は、約２，０００〜約１００，０００の範囲である。さらに好ましくは、ポリマーは、約４，０００〜約４５，０００の平均分子量を有し、さらになお好ましくは４，０００〜２０，０００である。最も好ましくは、ＰＥＧの分子量は約５，０００である。技術者のニーズに適合するように、他の分子量もまた予定されている。
【００８９】
あるいは、本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は、次の構造式によって表すことができ：
【化１】
【００９０】
ここで：
Ｙ11およびＹ13は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＲ13または結合であり、
Ｙ12は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ14であり、
Ｒ11-14は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6 置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から選択され、
（ａ１１）、（ａ１２）、および（ｂ１１）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは０〜６、さらに好ましくは０、１、または２であり、
（ｎ）は約１０〜約２，３００の整数である。
【００９１】
一例として、ＰＥＧは、以下の限定されない方法で官能化することができ：
【化２】
【００９２】
ここで
Ｒ11、Ｒ15およびＲ16は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、および置換Ｃ1-6アルキルの中から選択され、
（ｍ）は、０であるか、または正の整数であり、１または２であることが好ましく、
Ｙ14はＯまたはＳであり、
（ｎ）は、重合度を表す。
【００９３】
これらの態様では、ポリマー（Ｒ基）は、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端に見られる基を含む。キャッピング基は、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6 アルキルのいずれかから選択することができ、好ましくはメチルであり、そのような基は当業者に理解されている。
【００９４】
さらなる態様では、複合体のポリマー部分は、ＡＤＡに結合する複数の点を与えるものでありうる。あるいは、複数のＰＥＧはＡＤＡに結合することが可能である。
【００９５】
ＰＥＧ化ＡＤＡの薬物動態学および他の特性は、ＰＥＧ分子量、リンカー化学、およびＰＥＧ鎖の酵素に対する比率を操作することにより、所望の臨床適用における必要に応じて、調整することができる。
【００９６】
これらの態様では、ＡＤＡは、当技術分野で既知のさまざまなリンカーを介して、放出可能な形態または放出できない形態で、非抗原性のポリマーに結合させることができる。
【００９７】
放出可能なポリマー系は、ベンジル基の脱離またはトリメチルロックのラクトン化に基づくことができる。放出可能なポリマー系の活性化ポリマーリンカーは、参照することによりその内容を本明細書に援用する、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第６，１８０，０９５号、同第６，７２０，３０６号、同第５，９６５，１１９号、同第６，６２４，１４２号、および同第６，３０３，５６９号の各明細書にしたがって調製されうる。あるいは、ＡＤＡポリマー複合体は、参照することにより本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第７，１２２，１８９号および同第７，０８７，２２９号の各明細書、ならびに米国特許出願第１０／５５７，５２２号、同第１１／５０２，１０８号および同第１１／０１１，８１８の各明細書に記載されるものなど、特定のビシンポリマー残基を用いて調製される。これら特許出願のそれぞれの開示は、参照することにより本願に援用される。意図されている他の放出可能なポリマー系もまた、参照することによりその内容が本明細書に援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８６００号パンフレットに記載されている。
【００９８】
本明細書で意図されている放出可能な、または放出できないＡＤＡポリマー複合体の説明のための例は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、米国仮特許出願第６０／９１３，０３９号明細書に記載されている。
【００９９】
ポリマー複合体は、当業者に既知の反応など、ＰＥＧ化反応であることが好ましい。簡潔に述べると、変異型ｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡは、活性化ポリマーと反応してＡＤＡポリマー複合体を形成する。これに関連して、幅広い種類の活性化または官能化されたポリエチレングリコールを使用することができ、例えば、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第５，１２２，６１４号、同第５，３２４，８４４号、同第５，６１２，４６０号、および同第５，８０８，０９６号の各明細書（炭酸スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ） および関連する活性化ＰＥＧ）、米国特許第５，３４９，００１号明細書（環状イミドチオン活性化ＰＥＧ）、米国特許第５，６５０，２３４号明細書および当業者に既知の他のものに記載されるものなどが挙げられる。上記の開示のそれぞれは、参照することにより本明細書に援用される。Ｎｅｋｔａｒ社／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から市販される活性化ポリマーも参照のこと。当業者は、過度の実験をすることなく、結合のためのポリマーのさまざまな活性化の形態を使用することができる。
【０１００】
当業者には認識されるように、このような結合反応は、典型的には、数倍モル過剰の活性化ＰＥＧを使用して、適切な緩衝液中で行われる。上述のＳＣ−ＰＥＧのような直鎖ＰＥＧを用いて調製した一部の好ましい複合体は、ＡＤＡ酵素あたり平均して約１０〜約８０ＰＥＧ鎖を含むことができる。その結果として、これらのために、数百倍、例えば、２００〜１０００倍のモル過剰を用いることができる。分岐鎖ＰＥＧおよび酵素に結合したＰＥＧ用に用いられるモル過剰はもっと小さいと考えられ、本明細書で言及するものと同一のものについて記載する、特許および特許出願に記載される技術を使用して決定することができる。
【０１０１】
これらの態様では、ポリアルキレンオキサイドは、例えば、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、ウレタン、およびアミド系リンカーなどを含む、リンカー化学を介してタンパク質と結合する。
【０１０２】
ポリアルキレンオキサイドは、共有結合のための他の部位は当技術分野で周知であり、ＡＤＡ上のＬｙｓのε−アミノ基に共有結合することが好ましい。ＡＤＡポリマー複合体は、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に結合する、少なくとも５つのポリエチレングリコール鎖を含むことができ、あるいは、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に結合する約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を含みうる。
【０１０３】
ＡＤＡがリジンの結合を介して、酵素分子あたり約１１〜約１８のＰＥＧ分子と結合し、ＰＥＧのＡＤＡに対する比率を変化させて、任意の特定の臨床的症状に適合する、結合した複合体の物理的および力学的特性を改質することができる。
【０１０４】
本発明のさらなる態様が、本明細書に記載される治療方法に有用な複合体を提供することを目的として、市販の、または報告された活性化ＰＥＧまたは同様のポリマーを使用して、ＡＤＡ酵素またはそれらの断片を結合する工程を含むことは、前述より明らかであろう。例えば、参照することによりその全体が本明細書に援用される、Nektar Advanced Pegylation catalog of 2004（Nektar社（米国カリフォルニア州サンカルロス所在）を参照。
【０１０５】
活性化ＰＥＧは、米国特許第５，６８１，５６７号、同第５，７５６，５９３号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第６，１１３，９０６号、同第６，５６６，５０６号、同第６，１５３，６５５号、同第６，３９５，２６６号、同第６，６３８，４９９号、同第６，２５１，３８２号および同第６，８２４，７６６号の各明細書（参照することにより本明細書に援用される）に記載されるような直鎖、分岐鎖、またはＵ−ＰＥＧ誘導体を含みうる。
【０１０６】
このようなポリマーの限定されないリストは、下記構造を有するポリマー系（ｉ）〜（ｖｉｉ）に相当し：
【化３−１】
【化３−２】
【０１０７】
ここで、
Ｙ61-62は、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ61であり、
Ｙ63は、Ｏ、ＮＲ62、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2であり、
（ｗ６２）、（ｗ６３）および（ｗ６４）は、独立して、０または正の整数であり、約０〜約１０が好ましく、約１〜約６がさらに好ましく、
（ｗ６１）は０または１であり、
ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧであり、
ここでＰＥＧは先に定義され、ポリマー部分の総分子量は約２，０００〜約１００，０００であり、
Ｒ61およびＲ62は、独立して、Ｒ11に用いることができる部分と同一の部分である。
【０１０８】
ＰＥＧ系のポリマーに加えて、多くの他のポリアルキレンオキサイドを用いることができることもさらに理解されよう。例えば、本発明の複合体は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２００１年のカタログ「生物医学的応用のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application）」に記載されるものなど、マルチアームＰＥＧ−ＯＨおよび「スター型ＰＥＧ」製品を転換することを含む方法によって調製することができる。日油株式会社の薬物送達システムカタログ第８版（２００６年４月）も参照のこと。これらの各開示は、参照することにより本明細書に援用される。マルチアームポリマーは４つまたはそれ以上のポリマーアームを含み、４つまたは８つのポリマーアームが好ましい。説明を目的とするのであって限定はしないが、マルチアームのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は次式でありうる：
【化４】
【０１０９】
ここで、
（ｘ）は、０または正の整数、すなわち約０〜約２８であり、
（ｎ）は重合度である。
【０１１０】
本発明の１つの好ましい実施の形態では、マルチアームＰＥＧが書き構造を有し：
【化５】
【０１１１】
ここで（ｎ）は正の整数である。本発明の１つの好ましい実施の形態では、ポリマーは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有し、４，０００〜４５，０００であることが好ましい。
【０１１２】
別の特定の実施の形態では、マルチアームＰＥＧは下記構造を有し：
【化６】
【０１１３】
ここでｎは正の整数である。本発明の１つの好ましい実施の形態では、ポリマーは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有し、４，０００〜４５，０００であることが好ましい。
【０１１４】
ポリマーは、米国特許第５,１２２，６１４号または同第５，８０８，０９６号の各明細書に記載される活性化技術を使用して、適切な活性化ポリマーに転換することができる。具体的には、このようなＰＥＧは次式でありうる：
【化７】
【０１１５】
ここで、
（ｕ'）は約１０〜約５７０の整数であり、約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有するポリマーを提供することが好ましく、約４，０００〜約４５，０００であることが好ましく、残基の最大３つの末端部分がメチルまたは他の低級アルキルでキャップ化される。
【０１１６】
一部の好ましい実施の形態では、組換えタンパク質への付加を促進するため、ＰＥＧの４つのアームのすべてが、適切な官能基、すなわちＳＣなどに転換される。転換前のこの
ような化合物としては、下記のものが挙げられる：
【化８−１】
【化８−２】
【０１１７】
本発明のほとんどの好ましい態様では、活性化ポリエチレングリコールは、タンパク質とのウレタン結合またはアミド結合を提供するものである。
【０１１８】
さらに別の態様では、活性化ポリマーは、ヒンダードエステル系のリンカーを用いることができる。参照することによりその内容が本明細書に援用される、「ヒンダードエステル系の生体分解性リンカーを有するポリアルキレンオキサイド（Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers）」という発明の名称の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８５９３号パンフレットを参照のこと。例えば、このような化合物の限定されないリストとして、下記のものが挙げられる：
【化９】
【０１１９】
ここで、（ｕ）は、好ましくは約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有するポリマーを提供する、整数である。
【０１２０】
１つの好ましい実施の形態では、ＰＥＧ複合体として下記のものが挙げられ：
【化１０】
【０１２１】
ここで、（ｕ）は、好ましくは約２，０００〜約１００，０００、好ましくは約４，０００〜約４５，０００、さらに好ましくは約５，０００の分子量を有するポリマー部分を提供する、整数である。
【０１２２】
適切なポリマーは、重量によって実質的に変化するであろう。本発明の目的では、通常は、約２，０００〜約１００，０００の数平均分子量を有するポリマーが、選択される。約４，０００〜約４５，０００の分子量が好ましく、約５，０００〜約１２，０００が特に好ましい。含まれるポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、それらの共重合体および、水溶性が保持されることを条件としたブロック共重合体が挙げられる。ｍＰＥＧに加えて、Ｃ1-4アルキル末端化ポリマーも有用である。
【０１２３】
高純度の末端カルボン酸を有するポリマーの調製方法は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されている。その方法は、最初に、ポリアルキレンオキサイドの第３級アルキルエステルを調製し、続いてそのカルボン酸誘導体へと転換する。その方法のＰＡＯカルボン酸の調製の最初の工程は、ポリアルキレンオキサイド・カルボン酸のｔ−ブチルエステルなどの中間体を形成する工程を有してなる。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下で、ＰＡＯをｔ−ブチルハロ酢酸と反応させることにより形成される。ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、９２％を超える純度で、好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％、最も好ましくは９９．５％を超える純度で、ポリアルキレンオキサイドのカルボン酸誘導体を容易に得ることができる。
【０１２４】
さらに別の態様では、第３級アミン基を有するポリマーを用いてＡＤＡ複合体を調製することができる。高純度の、第３級アミンを含むポリマーの調製方法は、参照することによりそれぞれの内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されている。例えば、アジドを有するポリマーは、トリフェニルホスフィンなどのホスフィン系の還元剤、またはＮａＢＨ4などのアルカリ金属ホウ化水素還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーを、メチル−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）などの保護化されたアミン塩と反応させて、その後、保護化アミン基を脱保護する。これらの方法で形成される第３級アミンを含むポリマーの純度は、約９５％よりも高く、９９％よりも高いことが好ましい。
【０１２５】
上述の米国特許第６，１５３，６５５号明細書のポリマーによってもたらされる分岐は、単一の結合点に由来する生物活性分子に結合（loading）するポリマーを増加させる手段として、第２または第３の分岐を可能にする。過度の実験をすることなく、必要に応じて、二官能性のリンカー基に結合するように、水溶性のポリマーを官能化できることは、理解されよう。
【０１２６】
本明細書に含まれるポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、それらの共重合体および、水溶性が保持されることを条件とした、それらのブロック共重合体が挙げられる。
【０１２７】
ＰＡＯ系ポリマーの代用として、効果的に、デキストラン、ポリビニル・ピロリドン、ＨＰＭＡ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）などのポリアクリルアミド、ポリビニル・アルコール、炭化水素系ポリマー、前述の共重合体などの非抗原性の材料を使用することができる。当業者は、前述のリストが単に説明のためであって、本明細書に記載される品質を有するすべてのポリマー材料が意図されていることを理解するであろう。
【０１２８】
Ｄ．実用性
技術者は、本発明の変異型ＡＤＡが、ＡＤＡ酵素に感受性の任意の疾患または障害を治療するための臨床症状に容易に用いられることを認識するであろう。このような疾患または障害は、影響を受けて、アデノシンまたはデオキシアデノシンの組織または血中濃度を低減させるものである。このような疾患または障害の例としては、ＳＣＩＤ、例えば喘息などの呼吸器疾患、および、影響を受けて、局所または全身のアデノシンまたはデオキシアデノシンの濃度が低減する癌などが挙げられる。腫瘍または癌の治療におけるＡＤＡの使用についての更なる詳細は、参照することによりその内容全体が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、本願と同日出願の、「酵素による抗癌治療（Enzymatic Anticancer Therapy）」という発明の名称の米国特許出願第１２／１０５，６８２号明細書（米国仮特許出願第６０／９１３，０３９号の優先権の利益を主張）によって提供されている。治療薬は、例えば、変異型ｒｈＡＤＡまたは変異型ｒｂＡＤＡ酵素である。治療用の変異型ｒＡＤＡは、上述のように、例えばＰＥＧ化など、ポリマー結合されていることが好ましい。ＡＤＡまたはポリマー結合ＡＤＡの用量は、動物であるかヒトであるかに関わらず、腫瘍の臨床反応および個々の患者の副作用プロフィールに応じて個別に行われる。本明細書で以下に提供する研究例では、最大用量は、許容される投与可能な最大用量である。
【０１２９】
例えば、アダジェン（Ａｄａｇｅｎ（登録商標））は、２５０ＵのウシＡＤＡ／ｍＬで市販されている。これは、０．２ｍｌの「Ａｄａｇｅｎ」を注射されたおよそ２５ｇのマウスにとって２０００Ｕ／ｋｇと表すことができる。当然ながら、技術者は、ポリマー結合ＡＤＡの用量が、具体的ポリマーの大きさ、リンカー化学、および価数によって調整されうることを認識するであろう。例えば、ポリマーあたり２つまたはそれ以上のＡＤＡ酵素を含むポリマー複合体の投与計画は、ＡＤＡの任意の具体的ポリマー複合体の溶液のｍｌあたりのＡＤＡ単位にしたがって調整されるであろう。
【０１３０】
注入によるＡＤＡまたはＡＤＡのＰＥＧ複合体の提供では、至適用量の範囲は血漿のモニターによって設定されることが好ましい。一般には、約１０〜１００μｍｏｌ／時間／ｍｌ、好ましくは約１５〜約３５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲で血漿ＡＤＡ活性（トラフレベル）が維持されるであろう投与量（３７℃でアッセイ）を服用者に提供し、赤血球アデノシンの減少、すなわち、パック内の赤血球におけるｄＡＴＰが約０．００１〜０．０５７μｍｏｌ／ｍｌ以下、好ましくは約０．００５〜約０．０１５μｍｏｌ／ｍｌであるか、または、注入前サンプルで測定して、正常アデノシンレベルでのｄＡＴＰが、総赤血球アデノシン（すなわち、ＡＴＰ＋ｄＡＴＰ含量）の約１％以下であることを実証することが望ましい。ｄＡＴＰの正常値は約０．００１μｍｏｌ／ｍｌ未満である。
【０１３１】
酵素の量に基づいた用量は、例えば、約０．１０Ｕ／ｋｇ〜約３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約２０Ｕ／ｋｇが好ましく、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約５Ｕ／ｋｇなど、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約１２Ｕ／ｋｇ（患者の体重のｋｇあたり）の範囲であることがさらに好ましい。１週間の総投与量は、服用者が許容できるように、最大４０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上でありうる。服用者が許容できるように、最大単回投与量の３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上に至るまで、５Ｕ／ｋｇ／週のさらなる増加が認められる。一般に、１５Ｕ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」を毎週注射した後の血漿におけるＡＤＡ活性の平均トラフレベルは２０〜２５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲である。
【０１３２】
１００Ｕ／ｋｇの用量は、子供における約１２Ｕ／ｋｇの臨床用量と等しい、マウスの投与量であることに注意すべきである。
【０１３３】
ＡＤＡの投薬情報の詳細は、参照することによりその内容が援用される、「Ａｄａｇｅｎ」（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．製）に挿入される処方箋に記載されるように、当技術分野で知られている。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例は、本発明のさらなる認識を提供する役割をすることであり、本発明の効力範囲を多少なりとも制限することを意味するものではない。
【０１３５】
実施例１
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えヒトＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ヒトのアデノシン・デアミナーゼの報告されているアミノ酸配列（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_００００１３）を、システインのコドンの存在について分析した。成熟（Ｎ−末端Ｍｅｔが開裂している）ポリペプチドの５つの位置が、システインをコードしている（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。ヒトＡＤＡを発現する設計され、修飾された遺伝子では、これら５箇所のシステインのコドン（システイン７４、ＴＧＣ）の１つだけが、セリンのコドン（ＴＣＣ）に変化していた（これは、翻訳されたタンパク質における７５位である）。重複するオリゴヌクレオチド部分の標準的化学合成を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成のため、確定したポリペプチド配列（配列番号：３参照）をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ワシントン州ボセル所在）に提供した。簡潔に言えば、配列を細菌の発現用に最適化し、続いて、Grantham R., et al.; 1981; "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、およびLathe, R.; 1985; "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12に記載されるコドンデータを利用して、標準的な細菌コドンを大腸菌Ｋ１２に用いた。
【０１３６】
報告されているヒトのアデノシン・デアミナーゼの３６３アミノ酸配列（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_００００１３）を、システイン・コドンの存在について解析した。成熟（Ｎ−末端のＭｅｔが開裂している）ポリペプチドにおける５つの位置でシステインがコードされていた（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。ヒトＡＤＡを発現する、設計および修飾された遺伝子では、これら５箇所のシステインのコドンのうちの１つ（システイン７４、ＴＧＣ）だけがセリンのコドン（ＴＣＣ）に変化していた（これは、翻訳されたタンパク質における７５位である）。確定されたポリペプチド配列（配列番号：３を参照）は、重複オリゴヌクレオチド部分の標準的な化学合成を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子を全合成するため、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ワシントン州ボセル所在）に提供された。簡潔に述べると、配列は、Grantham R. et al.; 1981, "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、および、Lathe, R. 1985, "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12に記載されるコドンデータを使用し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２用の標準的な細菌コドン使用にしたがって、細菌内での発現に最適化された。
【０１３７】
次に、対応するＲＮＡ配列をヘアピン構造の形成またはループ形成について分析し、自由エネルギーの計算を最小限に抑えるようにした。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−２８ａ／ＡＤＡｃｙｓＳｅｒ（ＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡのオープン・リーディング・フレーム（コード領域と疑われる）をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：４によるものである。
【０１３８】
単離したコロニーを塗沫し、参照することにより本明細書に援用されるＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法によって、ＬＢ培地においてイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を誘発可能な遺伝子の発現について分析することによって、さらに精製した。
【０１３９】
時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて試験した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でのＡＤＡの産生を可能にする好ましい条件は、２５℃で１２時間、５０μＭのＩＰＴＧを用いた誘発であった。発現させたＡＤＡタンパク質は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された（データ示さず）。
【０１４０】
実施例２
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えウシＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ウシの腸の処置から得られる精製された成熟ＡＤＡタンパク質は、Ｎ−末端のメチオニンが欠如し、ｃＤＮＡ配列から予想された最後の６つのＣ−末端の残基も欠如している、３５６アミノ酸タンパク質である（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_７７６３１２）。ウシＡＤＡアミノ酸配列を、システインのコドンの存在について分析した。成熟ポリペプチドの５つの位置がシステインをコードしている（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。設計および修飾されたウシＡＤＡ合成遺伝子では、これら５箇所のシステイン位置の１つ（システイン７４）だけが、セリン残基に変化していた。これは、成熟タンパク質の７４位（または翻訳生成物の７５位）における通常のシステインのコドンの代わりにセリンのコドン（ＴＣＣ）を挿入することによって実現した。遺伝子はまた、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンであった。
【０１４１】
簡潔に述べると、重複するオリゴヌクレオチド部分の化学合成を含む方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成を目的として、確定したポリペプチド配列（配列番号：１参照）をＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．に提供した。ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社の方法は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する、米国特許第６，３６６，８６０号明細書に詳細に記載されている。
【０１４２】
幾つかの発現系において、ウシＡＤＡの発現を研究した。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−９ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−９ｄ／ｂＡＤＡ（ｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。変異型ＡＤＡをコードするＤＮＡ分子は、配列番号：２によって示されている。
【０１４３】
単離したコロニーを塗沫し、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法により、ＬＢ培地においてＩＰＴＧの誘発が可能な遺伝子の発現について分析することによってさらに精製した。時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて研究した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でＡＤＡを産生させる好ましい条件は、３７℃で１２時間、０．３％の乳糖を用いた誘発であった。ＡＤＡ生成物は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された。
【０１４４】
実施例３
変異型ｒｈＡＤＡタンパク質の精製
変異型ｒｈＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。宿主細胞ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）におけるプラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）上の合成遺伝子からｒｈＡＤＡを発現するＥ．ｃｏｌｉについて、細菌発酵を行った。リファンピシン（２００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を、酵母エキス（３０ｇ／ｌ）を補充したグリセロールの最少培地に含めて、細胞を２８℃で１１ＯＤ600まで増殖させ、５ｍＭの最終濃度に至るまで、誘発因子ＩＰＴＧを加えた。４０時間後（ＯＤ600〜１１０）、遠心分離によって細胞を回収し、−２０℃で冷凍した。簡潔に言えば、解凍した細胞ペースト（５０ｇ）を１０ｍＭのトリス緩衝液［トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン］、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０の１８００ｍｌ緩衝液に再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで１０秒間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部のマイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパクを、４℃で４０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離することによって抽出した（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）社製のＲＣ ５Ｃ ｐｌｕｓ、ローターＳＬＡ−１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。ｐＨを８．０に調整し、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を加え、室温で２時間インキュベートした。次に１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを６．５に合わせた。２回目の遠心分離を上記のようにして行い、上清を回収し、２ｍＭのＥＤＴＡに応じて調整し、その後、ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））の９０ｍｍのフィルター・ユニットでろ過した。ろ過した上清の体積は５００ｍｌであり、ＢＣＡ法による総タンパク質濃度は８．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１４５】
細胞抽出液（１００ｍｌ）をｐＨ７．２および４．５ｍＳ／ｃｍに調整し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５でＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で溶出させた。ピーク画分を酵素アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4中の１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５に調整し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ｆｆカラムに負荷した。負荷する緩衝液の勾配、および２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、ｐＨ６．５を用いてタンパク質を溶出させた。ピーク画分（５５ｍｌ；０．４ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５に対し、ダイアフィルターを行ない（diafiltered）、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５で溶出させた。回収画分は、精製ＡＤＡタンパク質を含んでいた（７７ｍｌ；０．１ｍｇ．ｍｌ）。
【０１４６】
実施例４
組換えウシＡＤＡタンパク質の精製
実施例２のクローンによって発現させた変異型ｒｂＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。簡潔に言えば、−８０℃で保管された、２００ｇの解凍した細胞ペースト（それぞれ、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｅｏｎ社またはＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ社から入手）を、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液１８００ｍｌに再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで５分間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部マイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置一式を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパク質を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。
【０１４７】
この細胞抽出液中のヌクレオチドを除去するため、トリエチレンイミン（ＰＥＩ）を上記上清に加え（最終的には０．１５％、ｗｔ／ｖ）、１０分間攪拌することにより完全に混合させた。次に、この細胞抽出液を４℃で一晩放置した。この一晩放置したサンプルから得られた沈殿を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。同様に、無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。第１のカラムにＡＤＡが結合するのを補助するため、１０％のＰＥＧ４６００をこの細胞抽出液にゆっくりと加え、この細胞抽出液のｐＨを１ＮのＮａＯＨおよび１ＮのＨＣｌを用いてゆっくりと６．５に調整した。次のカラムに負荷する前に、この上清を再度、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離にかけた（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。
【０１４８】
細胞抽出液を、予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ番号１７−５３１６−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製、総容積３５０ｍｌ、ＸＫ−５０に予め充填済み）に、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５の緩衝液を用いて負荷した。ＡＤＡを、８０ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムから平衡化した緩衝液中に溶出させる前に、まず、６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌでの溶出を行い、不純物を除去した。溶出液の特性を、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロット、およびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて解析した。
【０１４９】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムにかけた後、２つの疎水性相互作用によるクロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）精製を１つずつ行い、タンパク質の純度をさらに高めた。最初のＨＩＣはオクチルセファロース（Octyl Sepharose）４ＦＦ（カタログ番号１７−０９４６−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）であった。Ｃａｐｔｏ Ｑカラムから得られたＡＤＡ画分の貯留液を、硫酸アンモニウム粉末を用いて直接、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ社（米国ニューヨーク州ロチェスター所在）製、カタログ番号５４０８８７、ＭＥＭＢ０．２ＰＥＳ）を、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第１のＨＩＣカラムに負荷した（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）。ＡＤＡタンパク質を硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出させ、この溶出液の純度特性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した。第１のＨＩＣカラムの画分のＡＤＡタンパク質を貯留し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第２のＨＩＣカラム（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、カタログ番号１７−１０８２−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）に直接負荷した。これらの画分のＡＤＡ純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。精製ｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡをさらに脱塩し、保存緩衝液（例えば、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）に対しＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ５（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在））で濃縮した。
【０１５０】
実施例５
ｒｂＡＤＡおよびＳｅｒ７４−ｒｂＡＤＡにおける安定性の研究
次の研究は、酸化的分解反応に対するｒｂＡＤＡの安定性が、実際に、ｃｙｓ７４をＳｅｒに突然変異させることによって改善されることを実証するために行なわれた。組換えウシＡＤＡ（ｒｂＡＤＡ）および、ｃｙｓ７４からｓｅｒ７４に突然変異させた組換えウシＡＤＡ（Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ）のサンプルを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、安定性の研究に使用した。安定性は、２２０ｎｍのＵＶ検出および質量分析検出法（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ電気スプレイ質量分析計）の両方を使用して、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである：
カラム： Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ−Ｃ８ （Ａｇｉｌｅｎｔ社製、２５０×４．６ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）
移動相Ａ： 水中、０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル／水中、０．１％のトリフルオロ酢酸（８０／２０；ｖ／ｖ）
勾配： 時間 移動相Ｂ（％）
０ ２０
５ ２０
４５ ８０
４６ ２０
６０ ２０
カラム温度： ４０℃
流量： １．０ｍｌ／分
注入量： ５０μｌ
化合物の純度は、安定性の研究を開始した時点、および、研究の開始後４、８、および１７日を含むさまざまな時点において、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。ｒｂＡＤＡ（非変異型）のサンプルは、本研究の開始時において、およそ生後２ヶ月であり、すでに 一部が分解されていたことに注意すべきである。Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡのサンプルは新たに調製され、比較的純粋であった。しかしながら、本研究の目的では、開始の時点と２５℃で１７日間インキュベート後の純度の差異は、検査のための関連パラメータである。
【０１５１】
表１に示すように、開始時のｒｂＡＤＡの純度は８３．７％であったが、 １７日後には６６．１％に減少しており、この期間に１７．６％のｒｂＡＤＡが分解されたことを示唆した。クロマトグラフィーで分離されたピークの質量分光分析法は、クロマトグラフィーの面積の３０．５％を占める、３１．８５１分に溶出する主要な分解物が、ｒｂＡＤＡの質量よりも３２Ｄａ大きい質量を有していることを示唆した。この質量変化は、ｒｂＡＤＡに２つの酸素が付加して、ｒｂＡＤＡの７４位の遊離のシステインのスルフェン酸分解物を形成することと一致している。３２．５３８分に溶出する、より小さい分解物ピークは、ｒｂＡＤＡに１つの酸素が付加して、ｒｂＡＤＡの７４位の遊離のシステインのスルフェン酸分解物を形成することと一致している。反応性システイン７４残基が置換されたセリン残基を有するＳｅｒ74−ｒｂＡＤＡでは、開始時点（９７．２％）と１７日後（９７．９％）で実質的に同一の純度を有し、１７日間にわたり、ほとんど分解されないことを示している。これは、システイン７４が、実際に、ｒｂＡＤＡに生じる酸化的分解反応の原因であり、この残基を、酸化の影響を受けないセリンに突然変異させることで分解を排除することを証明している。
【表１】
【０１５２】
実施例６
ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤ患者の治療における変異型ＡＤＡタンパク質の利用
説明した変異型ＡＤＡ酵素は、現在ＡＤＡＧＥＮを採用している治療環境に用いられる。Ｓｅｒ74−ｒｂまたはｒｈＡＤＡは、例えば、ＡＤＡタンパク質あたり１１〜１７本のＰＥＧ、分子量５，０００のポリマーを用いて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させることによって修飾して差し支えない。変異型ＡＤＡのＰＥＧ化調製物は、ｐＨ７．２〜７．４、約２５０単位／ｍｌの濃度で、滅菌生理食塩水中で調剤される。ＰＥＧ化変異型ＡＤＡは、筋内投与などの非経口的投与によって、患者に投与される。このような治療の恩恵を受ける患者としては、不十分なＡＤＡ活性に起因する重症複合型免疫不全症を有する者が挙げられる。変異型ＰＥＧ−ＡＤＡの投与は、典型的には、１０Ｕ／ｋｇの初回投与量、および毎週２０Ｕ／ｋｇの維持投与量の投薬スケジュールを用いて、７日間ごとに行われる。Ｓｅｒ74−ｒｂまたはｒｈＡＤＡは、１．５ｍｌのバイアルあたり１回用量だけを含む水溶液中に、２〜８℃で保存される。投薬スケジュールは、１５〜３５μｍｏｌ／時間／ｍｌの血漿ＡＤＡ活性レベルを維持し（３７℃でアッセイした）、パックされた赤血球１ｍｌあたり０．００５〜０．０１５μｍｏｌ以下にまで、赤血球ｄＡＴＰを低減させるように設計される。
【０１５３】
実施例７
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＣ−ＰＥＧ（炭酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌した。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ（Centriprep）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて、必要に応じて引き続き行なった。
【０１５４】
実施例８
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡの調製
実施例７に記載される条件と同一の条件を用いて、ＳＣ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）をＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【０１５５】
実施例９
アミド結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＳ−ＰＥＧ（コハク酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌した。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて必要に応じて引き続き行なった。
【０１５６】
実施例１０
アミド結合を介した、ＰＥＧ化突然変異タンパク質ｒｈＡＤＡの調製
実施例９に記載された条件と同一条件を用いて、ＳＳ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）を、変異型タンパク質ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型のアデノシン・デアミナーゼにおいて発現された、酸化されうるアミノ酸残基が、酸化されないアミノ酸残基で置換された、組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２】
前記酸化されうるアミノ酸残基が、システイン、メチオニンまたはトリプトファンであり、前記酸化されないアミノ酸残基が、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、チロシン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項３】
前記酸化されないアミノ酸残基が、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項４】
前記酸化されないアミノ酸残基がセリンであることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項５】
前記酸化されうるシステインが、成熟タンパク質の約７４位に位置することを特徴とする請求項２記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項６】
組換えヒト・アデノシン・デアミナーゼ、または組換えウシ・アデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする請求項５記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項７】
配列番号：２または配列番号：４に従ったＤＮＡ分子から翻訳されることを特徴とする請求項６記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項８】
配列番号：１または配列番号：３を含むことを特徴とする請求項６記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項９】
Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇ、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号：１を含む、請求項８記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項１０】
アデノシン・デアミナーゼが、請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする、ポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキサイドがポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、ウレタン、およびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカーを介して、前記組換えアデノシン・デアミナーゼに結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼのＬｙｓのε−アミノ基に共有結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１４】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼの１つ以上のＬｙｓ残基のε−アミノ基に付加する、１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含むことを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１５】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼの１つ以上のＬｙｓ残基のε−アミノ基に付加する、約１１〜約１８本のポリエチレングリコール鎖を含むことを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１６】
前記ポリエチレングリコールが、炭酸スクシンイミジル・リンカーを介して前記組換えアデノシン・デアミナーゼに結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１７】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１９】
請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼを有効量で投与することを含む、哺乳動物におけるアデノシン・デアミナーゼ介在性の病状を治療する方法。
【請求項２０】
前記アデノシン・デアミナーゼ介在性の病状が、重症複合免疫不全症であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼを疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製する工程を有してなる、配列番号：１を含む請求項１０記載の組換えアデノシン・デアミナーゼの精製方法。
【請求項２２】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼをイオン交換クロマトグラフィーによって精製する工程を有してなる、請求項１０記載の組換えアデノシン・デアミナーゼの精製方法。
【請求項２３】
請求項２１の方法によって生産された組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２４】
請求項２２の方法によって生産された組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２５】
配列番号：１または配列番号：３のアミノ酸配列を有する組換えアデノシン・デアミナーゼをコードする、単離ＤＮＡ。
【請求項２６】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇ、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とする、請求項２５記載の単離ＤＮＡ。
【請求項１】
野生型のアデノシン・デアミナーゼにおいて発現された、酸化されうるアミノ酸残基が、酸化されないアミノ酸残基で置換された、組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２】
前記酸化されうるアミノ酸残基が、システイン、メチオニンまたはトリプトファンであり、前記酸化されないアミノ酸残基が、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、チロシン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ｎ−メチルグリシン、サルコシン、ｎ−メチルイソロイシン、６−ｎ−メチルリジン、ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチン（nithine）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項３】
前記酸化されないアミノ酸残基が、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項４】
前記酸化されないアミノ酸残基がセリンであることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項５】
前記酸化されうるシステインが、成熟タンパク質の約７４位に位置することを特徴とする請求項２記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項６】
組換えヒト・アデノシン・デアミナーゼ、または組換えウシ・アデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする請求項５記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項７】
配列番号：２または配列番号：４に従ったＤＮＡ分子から翻訳されることを特徴とする請求項６記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項８】
配列番号：１または配列番号：３を含むことを特徴とする請求項６記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項９】
Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇ、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号：１を含む、請求項８記載の組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項１０】
アデノシン・デアミナーゼが、請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする、ポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキサイドがポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが、炭酸スクシンイミジル、チアゾリジンチオン、ウレタン、およびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカーを介して、前記組換えアデノシン・デアミナーゼに結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼのＬｙｓのε−アミノ基に共有結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１４】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼの１つ以上のＬｙｓ残基のε−アミノ基に付加する、１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含むことを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１５】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、前記組換えアデノシン・デアミナーゼの１つ以上のＬｙｓ残基のε−アミノ基に付加する、約１１〜約１８本のポリエチレングリコール鎖を含むことを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１６】
前記ポリエチレングリコールが、炭酸スクシンイミジル・リンカーを介して前記組換えアデノシン・デアミナーゼに結合することを特徴とする、請求項１１記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１７】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリアルキレンオキサイド−アデノシン・デアミナーゼ複合体。
【請求項１９】
請求項１記載の組換えアデノシン・デアミナーゼを有効量で投与することを含む、哺乳動物におけるアデノシン・デアミナーゼ介在性の病状を治療する方法。
【請求項２０】
前記アデノシン・デアミナーゼ介在性の病状が、重症複合免疫不全症であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼを疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製する工程を有してなる、配列番号：１を含む請求項１０記載の組換えアデノシン・デアミナーゼの精製方法。
【請求項２２】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼをイオン交換クロマトグラフィーによって精製する工程を有してなる、請求項１０記載の組換えアデノシン・デアミナーゼの精製方法。
【請求項２３】
請求項２１の方法によって生産された組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２４】
請求項２２の方法によって生産された組換えアデノシン・デアミナーゼ。
【請求項２５】
配列番号：１または配列番号：３のアミノ酸配列を有する組換えアデノシン・デアミナーゼをコードする、単離ＤＮＡ。
【請求項２６】
前記組換えアデノシン・デアミナーゼが、Ｌｙｓ198に代わるＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代わるＡｌａ、Ｇｌｙ351に代わるＡｒｇ、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を有することを特徴とする、請求項２５記載の単離ＤＮＡ。
【公表番号】特表２０１０−５２４４７２（Ｐ２０１０−５２４４７２Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４２７０（Ｐ２０１０−５０４２７０）
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０８０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３１２０８
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０８０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３１２０８
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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