安定化された骨移植片
内在する分解性酵素（例えば、プロテアーゼなど）の活性を低下させるために、組成物のｐＨを低下させること、水分含量を低減させること、水代替物を添加することおよび／または組成物中に存在する重水の量を増加させることにより安定化された脱灰骨基質（ＤＢＭ）または他の基質組成物を提供する。水和された形態の安定化されたＤＢＭ組成物は、酸性ｐＨで室温で１年まで安定であり得る。酸性化したＤＢＭ組成物は、安定化剤、例えば、重水、水代替物、ポリマー、プロテアーゼインヒビター、グリセロール、ヒドロゲルなどの添加によって、さらに安定化され得る。本発明はまた、本発明の安定化された骨誘導性基質組成物の調製方法、試験方法および使用方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年１月２７日に出願された米国特許仮出願番号６０／５３９，５５５号（これは、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる）に３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
傷害、疾患、創傷、手術などによって引き起こされる骨欠損の迅速かつ有効な修復は、長い間、整形外科手術の目標とされている。この目的に対し、いくつかの組成物および材料が、骨欠損の修復における使用のために使用または提案されている。このような組成物および材料の生物学的、物理的および機械的特性は特に、種々の整形外科適用用途におけるその適合性および性能に影響する主な要因である。
【０００３】
自己海綿質（「ＡＣＢ」）は、骨移植片のゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）と考えられている。ＡＣＢは、骨誘導性で非免疫原性であり、定義上、特定のレシピエントに適した適切な構造的および機能的特徴のすべてを有する。残念ながら、ＡＣＢは、限定された状況においてしか得られ得ない。一部の個体は、移植に適切な大きさおよび質のＡＣＢを欠く。その上、ドナーサイトモービィディティ（ｄｏｎｏｒ ｓｉｔｅ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）は、患者およびその医師にとって深刻な問題を課し得る。
【０００４】
代替骨移植材料の同定または開発における多大な取り組みがなされている。脱灰骨基質（「ＤＢＭ」）インプラントは、特に有用であることが報告されている（例えば、米国特許第４，３９４，３７０号（特許文献１）；同第４，４４０，７５０号（特許文献２）；同第４，４８５，０９７号（特許文献３）；同第４，６７８，４７０号（特許文献４）および；同第４，７４３，２５９号（特許文献５）；Ｍｕｌｌｉｋｅｎら，Ｃａｌｃｉｆ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．３３：７１，１９８１（非特許文献１）；Ｎｅｉｇｅｌら，Ｏｐｔｈａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２：１０８，１９９６（非特許文献２）；Ｗｈｉｔｅｍａｎら，Ｊ．Ｈａｎｄ．Ｓｕｒｇ．１８Ｂ：４８７，１９９３（非特許文献３）；Ｘｉａｏｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２９３：３６０，１９９３（非特許文献４）（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）参照のこと）。脱灰骨基質は、典型的には、解剖用死体から得る。骨を、無菌的に取り出す、および／または処理してあらゆる感染性因子を死滅させる。次いで、骨を、ミリングまたは磨砕することにより微粒子状にし、次いで、無機成分を抽出する（例えば、骨を酸性溶液中に浸漬させることにより）。残留した基質は、展性（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）であり、レシピエントの特定部位内への移植のために、さらに処理および／または整形および成形し得る。このようにして作製された脱灰骨は、さまざまな成分（タンパク質、糖タンパク質、成長因子およびプロテオグリカンが挙げられる）を含有する。移植後、ＤＢＭの存在が、傷害部位に対して細胞漸増を誘導する。漸増された細胞は、最終的に、骨形成性細胞に分化し得る。細胞のかかる漸増は、創傷治癒速度の増加をもたらし、したがって、より速い患者の回復をもたらす。ＤＢＭ内の活性因子の存在に加え、ＤＢＭインプラントの全体構造もまた、インプラントの骨治癒能力に寄与すると考えられている。
【０００５】
現在のＤＢＭ製剤は、種々の欠点を有する。第１に、ＤＢＭのコラーゲン系基質は比較的安定しているが、ＤＢＭ基質内の活性因子が急速に分解される。ＤＢＭの骨形成活性は、移植後２４時間以内にかなり分解され得、場合によっては、骨形成活性が６時間以内に不活化され得る。したがって、ＤＢＭと会合する因子は、移植後、短時間の間でしか傷害部位への細胞の漸増に利用可能でない。治癒プロセス（数週間から数ヶ月かかり得る）の多くでは、インプラントされた材料は、細胞の漸増を全くまたは殆ど補助し得ない。第２に、現在のＤＢＭ製剤は、ＤＢＭ製剤内に存在する分解性酵素のため、貯蔵寿命が限定されている。
【特許文献１】米国特許第４，３９４，３７０号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４４０，７５０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，４８５，０９７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６７８，４７０号明細書
【特許文献５】米国特許第４，７４３，２５９号明細書
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｋｅｎら，Ｃａｌｃｉｆ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．３３：７１，１９８１
【非特許文献２】Ｎｅｉｇｅｌら，Ｏｐｔｈａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２：１０８，１９９６
【非特許文献３】Ｗｈｉｔｅｍａｎら，Ｊ．Ｈａｎｄ．Ｓｕｒｇ．１８Ｂ：４８７，１９９３
【非特許文献４】Ｘｉａｏｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２９３：３６０，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より大きな、および／またはより長期の骨誘導活性を有する改善された骨移植材料を開発する必要性がある。このような改善された製剤はまた、現在の製剤よりも長期の貯蔵寿命を有するはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(発明の概要)
本発明は、安定化された脱灰骨基質（「ＤＢＭ」）組成物、本発明の組成物を調製および使用するための関連する方法、および本発明の組成物を含むキットを提供する。ＤＢＭに内在する酵素（例えば、プロテアーゼ）による骨誘導剤の分解に鑑み、本発明は、骨誘導剤に対する内在酵素の活性を、（１）ＤＢＭ組成物のｐＨを低減させること；（２）ＤＢＭ組成物から水分を除去し、任意選択で、脱水されたＤＢＭ粒子をコートして水分が再水和しないようにすること；（３）ＤＢＭ組成物中の重水の濃度を増加させること；（４）プロテアーゼインヒビターをＤＢＭ組成物に添加すること；（５）水代替物をＤＢＭ組成物を添加すること；および／または（６）ＤＢＭ内の骨誘導性因子を共有結合により修飾することにより低下させたＤＢＭ組成物を提供する。安定化されたＤＢＭ組成物のＤＢＭは、任意の形態、例えば、繊維、平板、粒子（例えば、立方形、球形、円錐形、くさび形、不定形粒子など）、糸、ゲルなどで提供され得る。これらの上記のストラテジーの１つ以上を用いて、所望の貯蔵寿命を有する、例えば、室温で１年後、最初の骨誘導活性の少なくとも９０％が残存するＤＢＭ組成物が調製され得る。
【０００８】
１つの態様において、本発明のＤＢＭ組成物のｐＨを低下させ、本発明のＤＢＭ組成物の酸性環境は、ＤＢＭ組成物内の骨誘導性因子のタンパク質分解を減速させ、より長期の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物がもたらされる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２、３、４、５または６）を有するＤＢＭ組成物は、生理的ｐＨのＤＢＭ組成物と比べた場合、増大した安定性を有する。ある特定の好ましい実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、室温での保存の６ヶ月または１年後、その最初の骨誘導性の７５％より多くを保持している。この延長された貯蔵寿命は、ＤＢＭ組成物をより低温（例えば、４℃など）で保存することにより、さらに延長され得る。酸性化したＤＢＭ組成物の生物学的活性は、組成物へのプロテアーゼインヒビターの添加（米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）および／または水代替物、例えば、重水（Ｄ２Ｏ）、ＤＭＳＯおよびポリオール（例えば、グリセロール）の添加によってさらに安定化され得る。加えて、酸性化したＤＢＭ組成物は、安定化剤、例えば、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものなど（例えば、タンパク質、ポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、糖類、アミノ酸、脂質など）の添加によってさらに安定化され得る。
【０００９】
骨誘導性を担うＤＢＭ内の因子は、特に、水和されたＤＢＭ組成物では、ＤＢＭ内に見られる内在酵素による分解を受けやすい。したがって、ＤＢＭ組成物は、凍結乾燥することにより、部分的または完全に脱水された形態で保存するのがよい。凍結乾燥された形態では、ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、該組成物を室温で保存した場合であっても安定である。この安定化効果は、ＤＢＭ組成物より低温で保存することによりさらに増大され得る。ＤＢＭ組成物の凍結乾燥は、酸性化したＤＢＭ組成物ならびに糖類、ポリマー、脂質、水代替物（例えば、ポリオールおよび重水など）を有するが、またはプロテアーゼインヒビターが添加されたＤＢＭ組成物において行われ得る。
【００１０】
重水（Ｄ２Ｏ）、グリセロール、流動性ポリマー、流動性脂質またはポリオールなどの水代替物もまた、その生物学的活性を担うＤＢＭ内の因子の分解を低減するために使用され得る。例えば、重水（Ｄ２Ｏ）の添加は、ＤＢＭ組成物内に見られる骨誘導因子の分解に関与する酵素を抑制することがわかっている。ＤＢＭ組成物内のＤ２Ｏ含量を増加させることにより、酵素の分化が抑制され、ＤＢＭ組成物は、より長期の貯蔵寿命を有する。本発明のＤＢＭ組成物内のＤ２Ｏの濃度は、５％〜９８％まで、好ましくは、１０％〜８０％、より好ましくは、２０％〜７５％の範囲であり得る。Ｄ２Ｏの安定化効果は、ＤＢＭ組成物の酸性化、該組成物の脱水、プロテアーゼインヒビターの添加、ポリマーの添加、脂質の添加および／または他の水代替物の添加と組合せ得る。
【００１１】
本発明のＤＢＭ組成物は、ＤＢＭを安定化剤（例えば、タンパク質、ポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、糖類、アミノ酸、脂質など）でカプセル化することにより、さらに安定化させ得る。水和の前、水和間または水和後でのＤＢＭのカプセル化または流動性担体のＤＢＭへの添加は、ＤＢＭ組成物内の骨誘導性因子のタンパク質分解を減速させ、より長期の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物をもたらす。乾燥ＤＢＭ内の粒子は、コート、カプセル化、あるいは脂質または他の薬剤（例えば、ポリマー）と会合させ、骨誘導剤が水分の存在下で分解させるのを保護する。例えば、ＤＢＭを脱水し、次いで、脂質またはポリマーでコートして水分がＤＢＭに再水和するのを防止し得る。これにより、水または別の担体をＤＢＭ組成物に、安定性を低下させることなく補助（ｂａｃｋ）添加することが可能になる。所望の粘稠度および取り扱い特性を有する組成物を生成させるために、水性担体または水を添加してもよい。ＤＢＭ内の粒子（これは、脂質またはポリマーで処理する）の割合は、１０％〜１００％までの範囲である。該薬剤の安定化効果は、ＤＢＭ組成物の酸性化、プロテアーゼインヒビターの添加および／または水代替物（例えば、重水（Ｄ２Ｏ））の添加によってさらに増強させ得る。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の安定化されたＤＢＭ組成物の調製方法を提供する。例えば、本発明は、６ヶ月、１年、２年、３年、５年または１０年の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物の配合方法を提供する。１つの実施形態では、本発明のＤＢＭ組成物のｐＨを、ＤＢＭを、所望の酸性ｐＨの溶液中ですすぐか、または浸すことにより低下させる。任意選択で、酸性化したＤＢＭ組成物を、凍結乾燥し、該組成物中の水分含量を低下させてもよい。重水、他の水代替物、または脂質およびポリマーなどの薬剤を、調製プロセス中に本発明のＤＢＭ組成物に添加し、さらに安定化させ、骨誘導剤の分解を防止し得る。ある特定の実施形態では、該組成物を流動性にするため、担体を用いて調製する。
【００１３】
本発明はまた、本発明のＤＢＭ組成物を調製および使用するためのキットを提供する。該キットは、本発明のＤＢＭ組成物を用いて骨欠損を処置するために使用され得る。例えば、ＤＢＭ組成物は、ペーストとして、臨床設定における使用のための送達用デバイス（例えば、シリンジなど）にて提供され得る。ＤＢＭ組成物は、好ましくは、該組成物の使用を容易にするために流動性である。好ましくは、ＤＢＭ組成物は、滅菌または無菌条件下（例えば、手術室内）で適用され得るように、滅菌されており、パッケージングされる。
【００１４】
本発明は、さらに、ＤＢＭ組成物を特徴付けるため、および改善された特性を有するＤＢＭ含有組成物を同定および調製するためのシステムを提供する。例えば、本発明は、ＤＢＭ組成物の骨誘導性を評価する方法を提供する。本発明はまた、ＤＢＭ組成物の貯蔵寿命の測定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（定義）
酸性または酸性化：酸性または酸性化したＤＢＭまたはＤＢＭ組成物は、該基質のｐＨを生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）未満に低減させた任意の組成物である。酸性化は、当該技術分野で知られた任意の方法（例えば、ＤＢＭを酸性溶液（例えば、ＨＣｌ、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、カルボン酸などの溶液）中での浸漬またはすすぎ）を用いて成され得る。他の実施形態では、緩衝溶液をＤＢＭの酸性化に使用してもよい。好ましくは、浸漬またはすすぎは、ＤＢＭ粒子内部、好ましくは実質的に粒子全体で所望の低ｐＨを達成するため、充分に行う。ある特定の好ましい実施形態では、ｐＨは、２〜６に低下させる。より好ましくは、ＤＢＭのｐＨは、３〜４である。他の実施形態では、所望の低ｐＨは、およそ６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５または１である。
【００１６】
と会合している：安定化剤、標的化剤または他の化学的存在物（ｅｎｔｉｔｙ）は、インプラントの骨誘導性、安定性または他の特性に有意に影響する（例えば、組成物の骨誘導性スコアが増加する）のに充分長期間、インプラントによって保持されている場合、本発明によるＤＢＭまたは他の骨形成基質と会合している。具体例としては、１）体液でシミュレーションしたインビトロ拡散アッセイで測定したとき、ＤＢＭから自由に拡散可能でないこと；および／または２）溶液中に遊離している場合と比べ、延長されたＤＢＭの半減期を有すること（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％長い）が挙げられる。一部の実施形態では、会合は、共有結合性であり、他の実施形態では、非共有結合性である。非共有結合性相互作用の例としては、物理的包埋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、π−πスタッキングおよびファン・デル・ワールス相互作用が挙げられる。例えば、生物活性剤を、該基質からの生物活性剤の拡散を制限するポリマー系安定化剤によって、ＤＢＭまたは他の本発明の基質と会合させてもよい。あるいはまたさらに、生物活性剤を、自身がＤＢＭと会合した１種類以上の存在物との物理的相互作用によって、ＤＢＭ会合させてもよい。
【００１７】
生体適合性：生体適合性という用語は、本発明で用いる場合、インビボでの投与時、長期間の望ましくない効果を誘導しない材料を示すことが意図される。
【００１８】
生分解性：本明細書で使用する場合、生分解性材料は、生理学的条件下で分解され、器官に損傷を与えることなく代謝または排泄され得る生成物を形成する材料である。生分解性材料は、必ずしも加水分解により分解可能なものではなく、完全に分解するのに酵素的作用を必要とし得る。また、生分解性材料には、細胞内で分解される材料も含まれる。
【００１９】
脱灰骨活性は、脱灰骨の骨誘導性および／または骨伝導性活性をいう。
【００２０】
脱灰骨基質は、本発明で用いる場合、骨生組織から無機成分物質を除去して作製した任意の材料をいう。好ましい実施形態では、ＤＢＭ組成物は、本発明で用いる場合、重量基準で、５％未満のカルシウム、好ましくは１％カルシウム未満を含有する調製物を含む。部分脱灰骨（例えば、重量基準で５％より多いカルシウムを有するが、最初の当初の量の１００％未満のカルシウムを含有する調製物）もまた、本発明の範囲内とみなす。
【００２１】
拡散バリアは、バリアの一方の側面から他方の側面へ、より具体的には、外側から内側へ（またはその逆）の物質の拡散速度を低減させる任意の材料、コーティング、皮膜または物質をいう。ある特定の実施形態の拡散バリアは、活性化剤（例えば、水、酵素など）および／または分解性酵素のＤＢＭ組成物内への拡散を防止するポリマーであり得、タンパク質、多糖類、セルロース、人工ポリマー、ＰＬＧＡなどが挙げられる。拡散バリアはまた、骨誘導性因子がＤＢＭ組成物の外部に移動するのを防止し得る。ある特定の実施形態では、拡散バリアは生分解性であり、長期間にわたって骨誘導性因子の分解、活性化または放出をもたらす。他の実施形態では、拡散バリアは、断片的および／または局部的に分解し、該組成物のある特定の領域内で放出速度を制御するものであり得る。ＤＢＭ組成物を安定化するのに有用な拡散バリアのより詳細な記述については、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願）；米国特許出願第６０／３９２，４６２号（２００２年６月２７日に出願）；および米国特許出願第６０／３２９，１５６号（２００１年１０月１２日に出願）（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００２２】
基質は、本発明で用いる場合、インプラント部位への送達のために少なくとも１種類の成長因子と会合することができる天然または合成の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）をいう。基質は、完全に不溶性であってもよく、移植後、ゆっくりと可溶化されるものであってもよい。移植後、好ましい基質は、ゆっくりと再吸収または分解され、少なくとも１〜７日間、最も好ましくは２ないし４週間またはより長期間、しばしば６０日間より長期間、実質的に元の状態が続く。成長因子は、ほとんどの脱灰骨がそうであるように、基質内に内因的に存在するものであってもよく、基質に外添されてもよい。また、基質は、内在成長因子と外来成長因子の組合せも含み得る。基質は、微粒子状または繊維状の形態であり得、またはモノリシックであり得る。基質は、いくつかの材料を含んでいてもよく、繊維と粒子などの組合せの形態であってもよい。好ましい１つの実施形態では、基質は熱圧縮脱灰骨繊維から構成される。他の実施形態では、基質は、再吸収性可塑性ポリマー、例えば、拡散バリアとしての使用に好適であるとして以下に記載するものを含む。ある特定の実施形態では、該ポリマーは、剛性を本発明の組成物に付与する。他の好ましい実施形態では、微粒子状の非晶質リン酸カルシウムを、吸着された成長因子、例えば、ＢＭＰ（より具体的には、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその誘導体）と会合した基質として使用する。外来成長因子の添加を必要とするさらに他の基質の実施形態としては、限定されないが、微粒子状セラミックス、好ましくは、硫酸カルシウムまたはリン酸カルシウムが挙げられる。最も好ましい基質はリン酸カルシウムであり、その調製は、当該技術分野において実務担当者によく知られている（例えば、Ｄｒｉｅｓｓｅｎｓら“Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｏｎｅ ｃｅｍｅｎｔｓ”Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｌ．編．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ；Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐａｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９４（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。また、好都合なのは、沈降性リン酸カルシウム調製物、例えば、α−ＢＳＭ（ＥＴＥＸ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）である。リン酸カルシウム基質としては、限定されないが、リン酸二カルシウム二水和物、モネタイト、リン酸三カルシウム，リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ナノ結晶性ヒドロキシアパタイト、（ｐｏｏｒｌｙ）微結晶性ヒドロキシアパタイト、置換ヒドロキシアパタイトおよびカルシウム欠損ヒドロキシアパタイトが挙げられる。
【００２３】
骨誘導性は、本発明で用いる場合、骨形成を促進することができる特質をいう。動物の軟組織内に胃所性の骨の形成を誘導し得る任意の材料を骨誘導性とみなす。例えば、ほとんどの骨誘導性材料は、Ｅｄｗａｒｄｓらの方法（“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐｅａｄｉｃｓ ＆ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，３５７：２１９−２２８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８（引用により本明細書に組み込まれる））に従ってアッセイした場合、胸腺欠損ラットにおいて骨形成を誘導する。場合によっては、骨誘導性は、細胞漸増および漸増した細胞の骨形成表現型への誘導を介して起こると考えられる。また、骨誘導性は、組織培養物において、培養細胞（初代、二次または外植片）に骨形成表現型を誘導する能力として測定され得る。組織培養方法を、Ｚｈａｎｇら“Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ” Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６８（１１）：１０７６−８４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９７（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようなインビボの胃所性の骨形成アッセイで較正することが推奨される。証明されたインビボ胃所性骨形成モデルに対するインビトロアッセイの較正は、化合物が組織培養物において明白な「骨形成」表現型を誘導する能力が、新しい骨形成のインビボ誘導と常に相関し得ないため、必須である。ＢＭＰ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および血管由来因子は、細胞を髄または血管周囲腔から傷害部位に漸増させ、次いで、これらの漸増した細胞の、骨形成を担う細胞株への分化を引き起こすことわかっている骨誘導性因子のほんの一部である。骨または象牙質のいずれかから単離されたＤＢＭは、ともに、骨誘導性材料であることがわかっている（Ｒａｙら，“Ｂｏｎｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ”Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ３９Ａ：１１１９，１９５７；Ｕｒｉｓｔ， “Ｂｏｎｅ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０：８９３， １９６５（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））。
【００２４】
骨誘導性スコアは、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９８）の方法または同等の較正された試験にしたがって測定したときの０〜４の範囲のスコアをいう。Ｅｄｗａｒｄｓらの方法では、スコア「０」は、新しい骨形成なしを表し、「１」は、インプラントの１％〜２５％が新しい骨形成に関与していることを表し、「２」は、インプラントの２６〜５０％が新しい骨形成に関与していることを表し、「３」は、インプラント５１％〜７５％が新しい骨形成に関与していることを表し、「４」は、インプラントの＞７５％が新しい骨形成に関与していることを表す。ほとんどの場合において、スコアは、移植の２８日後に評価する。しかしながら、改善された本発明の製剤、特に、ＢＭＰに匹敵する骨誘導性を有するものでは、骨誘導性スコアを、より早い時点、例えば、移植の７、１４または２１日後などに得てもよい。このような場合では、通常のＤＢＭ対照（例えば、担体を有しないＤＢＭ粉末）、可能であれば、陽性対照（例えば、ＢＭＰなど）を含めることが重要である。ときには、骨誘導性はまた、もっと後の時点、例えば、移植の４０、６０日後など、または１００日後にさえスコアリングされ得る。骨誘導性の割合は、所与の時点での骨誘導性スコアであって、特定の参照スコアの活性の割合で示されるものをいう。あるいはまた、脱灰骨基質の骨誘導活性のための定量的で感度のよいインビトロアッセイを、脱灰骨基質（ＤＢＭ）の骨形成潜在性を確認するために使用する。ＤＢＭ内に存在する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の骨誘導性は、多能性筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞株を用い、インビトロで測定され得る。ＤＢＭのＣ２Ｃ１２細胞とのコインキュベーションによって誘導されるアルカリホスファターゼ活性は、用量応答性であり、ＤＢＭ内の活性なＢＭＰの量に相当する。骨形成潜在性を、ヌードラットにＤＢＭを筋肉内にインプラントすることにより、インビボで同時に試験した。Ｃ２Ｃ１２細胞内に誘導されたアルカリホスファターゼ活性は、インビボ骨形成（ｒ＝０．８８、アルカリホスファターゼ活性によって測定）、石灰化密度およびＤＢＭ外植片の組織形態と相関した。ＤＢＭバッチ（５つの確立された骨バンク由来）の結果は、インビトロアッセイとインビボアッセイ間の充分な一致を示した。しかしながら、ＤＢＭ活性は、バンク間および同じバンク内のバッチ間で大きく異なった（Ｈａｎら Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２１（４）：６４８−５４（２００３年７月）（引用により本明細書に組み込まれる））。
【００２５】
粒子または繊維は、ミリング、磨砕、粉砕、あるいは縮分して微粒子状形態にしたＤＢＭ、ＤＢＭ組成物または骨試料の調製物をいう。粒子または繊維の大きさは、典型的には、５０ミクロンより大きく、好ましくは７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、最も好ましくは１５０ミクロンより大きい。これらの大きさは、より球形状粒子については平均粒径を指し、他の形状の粒子では、特に記載のない限り、粒子の最小断面の寸法を指す。ある特定の実施形態では、組成物は、さらに大きい粒子、好ましくは、その最大寸法が１ｍｍより大きい、１．５ｍｍより大きい、または最も好ましくは２ｍｍより大きい粒子を含み得る。粒子または繊維は、任意の形状であり得、くさび形、桿形、球形、立方形、円板形、長円形、コイル状、二重らせん状、不定形状などが挙げられる。例えば、ある特定の実施形態では、粒子は、楔形形状であり得、その最大寸法がおよそ２ｍｍであり得、別の寸法では、１００ミクロン以下であり得る。粒子または繊維は、特定の大きさの粒子を回収するために篩分けするか、または分取してもよい。これらの粒子または繊維は、溶液、スラリー、変形可能な固体または液体と混合し、ＤＢＭ、本発明のＤＢＭ組成物または骨試料の移植片の投与または適用において使用されるペーストを形成してもよい。粒子または繊維の調製の好ましい方法は、発行済みの米国特許第５，６０７，２６９号；同第５，２３６，４５６号；同第５，２８４，６５５号；同第５，３１４，４７６号；および同第５，５０７，８１３号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００２６】
ポリオールは、繰り返し単位１つあたり少なくとも１個のヒドロキシル基を有する任意のポリマーをいう。場合によっては、ポリオールは、繰り返し単位１つあたり２個、３個、４個またはそれ以上のヒドロキシル基を有する。ポリオールは、天然または非天然のポリマーであり得る。天然ポリオールとしては、多糖類が挙げられる。非天然ポリオールとしては、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。ポリオールの例としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エリスリトール、水添デンプン加水分解物（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリオールは、ＤＢＭ組成物において水代替物として使用される。
【００２７】
多糖は、本発明で用いる場合、炭水化物残基の任意のポリマーまたはオリゴマーをいう。ポリマーは、２つから数百〜数千の糖単位のいずれの場合からなるものであり得る。多糖類は、天然供給源（例えば、植物など）から精製したものであってもよく、研究室で新たに合成したものであってもよい。天然供給源から単離された多糖類は、化学的に改質してその化学的または物理的特性を変化させてもよい（例えば、リン酸化、架橋）。多糖類はまた、直鎖または分枝鎖のいずれかであり得る。これらは、いずれも、天然および／または非天然の炭水化物残基を含有し得る。残基間の結合は、典型的には、天然に見られる結合、または合成化学者によってのみ得られ得る結合のいずれかであり得る。多糖類の例としては、セルロース、マルチン（ｍａｌｔｉｎ）、マルトース、デンプン、改質デンプン、デキストランおよびフルクトースが挙げられる。グリコサミノグリカンもまた多糖類とみなす。糖アルコールは、本発明で用いる場合、任意のポリオール、例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ガラクチトール、エリスリトール、イノシトール、リビトール、ズルシトール、アドニトール、アラビトール、ジチオエリスリトール、ジチオトレイトール、グリセロール、イソマルトおよび水添デンプン加水分解物などをいう。
【００２８】
プロテアーゼインヒビターは、本発明で用いる場合、タンパク質を切断する酵素（すなわち、プロテアーゼ）の酵素的活性を阻害することができる化合物である。このような化合物によって阻害されるプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（いくつかのマトリックスメタロプロテアーゼインヒビターの例を図６に示す）、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼなどが挙げられる。プロテアーゼインヒビターは、特定のプロテアーゼまたは特定のクラスのプロテアーゼのみを阻害するために特異的に作用するものであってもよく、またはすべてではないがほとんどのプロテアーゼを阻害することにより、より一般的に作用するものであってもよい。好ましいプロテアーゼインヒビターは、タンパク質系またはペプチド系であり、化学薬品会社（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなど）から市販されている。ＤＢＭ（またはリン酸カルシウムまたはセラミックス担体）に付着するタンパク質系またはペプチド系インヒビターは、自由に拡散可能なインヒビターよりもより長期間、基質と会合して安定化効果を提供する状態が続くため特に好ましい。プロテアーゼインヒビターの例としては、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチン（ｄｉｐｒｏｔｉｎ）Ａ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン（ｆｏｒｏｘｙｍｉｔｈｉｎｅ）、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン（ｐｈｅｂｅｓｔｉｎ）、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＧＴＡナトリウムおよびＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。
【００２９】
ペプチドまたはタンパク質は、本発明によれば、互いにペプチド結合で連結された一連の少なくとも２個のアミノ酸を含む。本発明のペプチドは、好ましくは、天然アミノ酸のみを含有するが、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物）および／または当該技術分野で知られたアミノ酸アナログを、代替的に用いてもよい。また、本発明のペプチド内のアミノ酸の１種類以上を、例えば、化学的存在物、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの付加によって修飾してもよい。
【００３０】
安定化剤は、ＤＢＭおよび／または成長因子を含む本発明の組成物中に含めると、特定の参照試料と対照させて測定した場合、該組成物の骨誘導活性の寿命を保持または延長する任意の化学的存在物である。ほとんどの場合、参照試料は、安定化剤を含有しないが、すべての他の点で、安定化剤を含有する組成物と同じである。また、安定化剤は、一般的に、自身として骨誘導性をほとんどまたは全く持たず、安定化剤を欠く以外は同一組成物と比べ、本発明の組成物内の活性存在物の１種類以上の半減期を増大させるかのいずれかにより功を奏する。他の実施形態では、安定化剤は、内在プロテアーゼまたは糖分解性酵素の活性を阻害する化合物であり得る。好ましい実施形態では、安定化剤は、１種類以上の活性因子を分解することが知られた酵素の１種類以上の接近を遅滞させる。半減期は、基質に付着しているか、または基質から抽出されたいずれかの特定の因子の免疫学的または酵素的アッセイによって測定され得る。あるいはまた、骨誘導性の半減期の増大の測定、または骨誘導性プロセスの生成物（例えば、骨、軟骨または骨形成原細胞、軟骨形成と関連する生成物またはその指標（例えば、遺伝子発現レベルなど））の出現の増強の測定は、増強された骨誘導性基質組成物に対する安定化効果の有用な指標となる。延長または増強された骨誘導性応答の測定は、一般的に、因子の安定性の増大を示す。ＤＢＭ組成物の安定化に有用な安定化剤のより詳細な記述については、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願）；米国特許出願第６０／３９２，４６２号（２００２年６月２７日に出願）；および米国特許出願第６０／３２９，１５６号（２００１年１０月１２日に出願（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００３１】
安定化手段は、室温または加速条件下のいずれかで測定したとき、その貯蔵寿命安定性を改善する製剤化の任意の操作をいう。本発明のＤＢＭ組成物に好ましい安定化手段としては、保存中、生物学的活性の分解を促進する水分の利用可能性の制限、低減または削減、熱力学的安定化剤（例えば、ポリオール）の添加、およびプロテアーゼインヒビターの使用が挙げられる。
【００３２】
水代替物は、ＤＢＭ組成物において水分の代替物としての機能を果たし得る任意の液状または流動性の化学的存在物である。典型的には、これは、所望の取り扱い性をＤＢＭ組成物に提供することを意味する。ある特定の実施形態では、水代替物は、液体または半固体であり得る。水代替物は、典型的には、水分子を模擬するヒドロキシル部分を有する。好ましくは、水代替物は、多数のヒドロキシル基を有する。水代替物の例としては、グリセロール、炭水化物、多糖類，ポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、糖タンパク質、重水（Ｄ２Ｏ）、液状ポリマー、液状脂質などが挙げられる。水代替物は、ＤＢＭ組成物などの水性混合物の粘度を増加させるために添加され得る。水代替物は、ＤＢＭ組成物の水成分の粘度を増加させることにより、または該組成物中に存在する水の活性を減少させることにより、ＤＢＭ組成物を安定化させるために該組成物に添加され得る。
【００３３】
（ある特定の好ましい実施形態の記載）
本明細書に記載するように、本発明は、改善されたＤＢＭ組成物に関する組成物および方法を提供する。以下に、本発明の好ましい実施形態のある特定の態様を、より詳細に、図面の図を参照しながら記載する。当業者には、本発明のさまざまな実施形態または変形型が、以下に具体的に記載しないが、それでも添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内に含まれることが認識されよう。
【００３４】
ＤＢＭは、主に、タンパク質および糖タンパク質から構成され、コラーゲンは、ＤＢＭの主なタンパク質代替物である。コラーゲンは、比較的安定であり、比較的稀なコラーゲナーゼ酵素によってのみ分解されるが、ＤＢＭ内に存在するその他のタンパク質および活性因子は、比較的不安定で、ＤＢＭに内在する酵素または他の不活性化プロセスによる分解を受けやすい。本発明は、ＤＢＭ組成物の骨誘導性を、ＤＢＭ内に存在する骨誘導性因子の分解を遅延させることにより安定化する。本発明はまた、ＤＢＭ組成物内の活性因子のタンパク質溶解性分解を低減することにより、ＤＢＭ組成物の有効な骨誘導性を増大させ得る。
【００３５】
本発明は、宿主由来または内在性のいずれかの酵素による活性因子を分解から保護する数種類のアプローチを提供する。保護される因子は、ＤＢＭ調製物に内在にするもの、またはＤＢＭまたは合成の基質組成物のいずれかに添加された因子であり得る。保護は、ＤＢＭ組成物のｐＨを低下させ、それにより、内在酵素の分解活性を阻害すること；および／またはＤＢＭ調製物においてＤＢＭ内の活性因子を不活化するのに利用され得る水分の量を、化学的または酵素的プロセスによって低減、最小化または削減することによりによりもたらされる。利用可能な水分は、Ｄ２Ｏの濃度を増大させて内在する分解性酵素を阻害すること；および／または水代替物（例えば、グリコール、ポリオール、ヒアルロン酸など）を添加すること；および／または水分拡散バリア添加することにより低減される。加水分解および内在酵素の分解活性を抑制する化学的および／または酵素的インヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター）の添加もまた、本発明の一部とみなされる。水分を本発明の安定化されたＤＢＭ組成物から除去し、該組成物をさらに安定化させてもよい。骨誘導性を長引かせる、または安定化させる他の方法を、本発明の方法と組み合わせて使用してもよい。好ましくは、ＤＢＭ組成物内の活性因子の分解を抑制し、保存後の所望の骨誘導性スコアを得る。ＤＢＭ組成物を安定化させるためのこのようなストラテジーは、室温で１年後、最初の試料の骨誘導性の５０％より多く、一般的には７５％より多く、しばしば９０％より多くが残るようにＤＢＭ組成物の貯蔵寿命を延長するために使用する。
【００３６】
脱灰骨基質
ＤＢＭ調製物は、長年にわたって、骨の形成を促進するための整形外科用医薬において使用されている。例えば、ＤＢＭは、骨折の修復、椎骨の融合、関節置換手術、歯科手術および原因疾患（例えば、慢性関節リウマチなど）による骨破壊の処置における有用性がわかっている。ＤＢＭは、骨誘導プロセスおよび骨誘導プロセスによって、骨形成をインビボで促進すると考えられている。骨伝導は、インプラントされた材料が新しい骨成長の支持体のための骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としての機能を果たす場合に起こる。骨誘導は、骨成長が、大きなまたは「危機的大きさ」の欠損したところ全体、骨治癒が遅々としてしか進行し得ないか、全く進行し得ないところ全体に所望される場合、特に重要である。一般的に、ＤＢＭ調製物の骨伝導性は、インプラントの実際の形状および密着力によってもたらされると考えられる。したがって、絡み合った繊維を含むＤＢＭ組成物は、繊維性が低く、粒状性の高い調製物と比べ、卓越した骨伝導性を有する傾向にある。ＤＢＭ代替物の形状および／または密着力を保存する傾向にある薬剤、担体または賦形剤は、より良好な骨形成特性をもたらし得る。
【００３７】
インプラントされたＤＢＭ組成物の骨誘導性効果は、単離されたコラーゲン系基質上に存在する活性な成長因子の存在に由来すると考えられる。このような因子としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦおよびＢＭＰタンパク質ファミリーに属するものが挙げられる。骨誘導性因子の具体例としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および血管由来因子が挙げられる。他の骨誘導性因子（例えば、オステオカルシンおよびオステオポンチンなど）もまた、同様に、ＤＢＭ調製物中に存在する可能性が高い。また、他の無名または未知の骨誘導性因子も、ＤＢＭ中に固有に存在する可能性が高く、これらは、本明細書に記載する本発明により保護され得る。
【００３８】
任意のさまざまな脱灰骨基質調製物が、本発明の実施において利用され得る。任意の方法によって調製されるＤＢＭが使用され得、微粒子状または繊維系調製物、繊維と微粒子状調製物の混合物， 完全または部分的に脱灰した調製物、完全および部分的に脱灰した調製物の混合物、例えば表面脱灰調製物（Ｇｅｒｔｚｍａｎら（米国特許第６，３２６，０１８号（２００１年１２月４日に発行）（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものなど）が挙げられる。好ましいＤＢＭ組成物は、Ｄｏｗｄら、米国特許第５，５０７，８１３号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、例えば、グリセロール、ポリヒドロキシル化合物、ポリオール、多糖類、グリコサミノグリカンタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、核酸、ポリマー、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、樹脂、クレイ、カルシウム塩および／またはその誘導体などの添加剤または担体を含むＤＢＭ調製物も有用である。ある特定の実施形態では、担体は非グリセロール担体である。他の実施形態では、担体はグリセロールである。脱灰骨基質に添加される担体は、該組成物を安定化し、骨形成因子の分解を防止し得る。例えば、担体は、拡散バリアまたは水代替物としての機能を果たし得る。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物を製剤化するために利用されるＤＢＭ材料は、リン酸カルシウムの５０％より多く、好ましくは７５％より多く、より好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％より多く、最も好ましくは９８％より多くが除去されている。ＤＢＭを作出するのに使用される骨は、生組織または死組織の任意の供給源から得られたものであり得る。多くの場合、骨の供給源は、本発明の組成物の最終的なレシピエントに適合していることが好ましい。少なくとも、ドナーとレシピエントが同じ種であることが多くの場合、望ましいが、異種供給源もなお、許容され得る。
【００４０】
骨試料が得られたら、これを、ミリング、磨砕、粉砕、あるいは縮分して微粒子状形態にする。好ましい実施形態では、粒子は、その最小寸法が７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、より好ましくは１５０ミクロンより大きい。ある特定の実施形態では、該粒子は、最大寸法のところが少なくとも２００ミクロンである。該粒子は、任意の形状であり得、長円形、球形、立方形、円錐形、錐体形、くさび形、コイル状、二重らせん状などが挙げられる。ある特定の実施形態では、該粒子は、その最長寸法のところが２００ミクロンであるくさび形、錐体形または円錐形である。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物には、数種類の異なる大きさおよび／または形状の粒子の混合物が含まれ得る。
【００４１】
微粒子化の後、ＤＢＭを処理し、無機成分を骨から除去する。塩酸は、当該業界で認められた最適な脱灰剤であるが、文献にはＤＢＭ調製のための方法が数多く報告されている（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本発明の目的のため、活性な骨誘導性因子を含有する骨格を提供する任意の材料がＤＢＭとみなされる。ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または当業者が必要以上に実験することなく開発し得る他の方法によって調製され得る。場合によっては、大きな断片または骨全体でさえ脱灰し得、次いで、脱灰後に微粒子状にする。このようにして調製されるＤＢＭは本発明の範囲内である。
【００４２】
改善されたＤＢＭ組成物の調製において、ＤＢＭ成分を、脱灰の前または後に、磨砕あるいは処理して適切な大きさの粒子にしてもよい。ある特定の実施形態では、該粒径は７５ミクロンより大きく、より好ましくは約１００〜約３０００ミクロンの範囲であり、最も好ましくは約２００〜約２０００ミクロンである。ＤＢＭ成分を所望の大きさに磨砕した後、混合物を篩分けし、所望の大きさの粒子を選択してもよい。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ粒子を、５０ミクロン篩、より好ましくは７５ミクロン篩、最も好ましくは１００ミクロン篩で篩分けし得る。
【００４３】
ＤＢＭへの水分の接近を制限するのに特に有用な方法の１つは、ＤＢＭをモノリシック生体吸収性基質内に包埋し、次いで、粒子含有モノリシック基質を、その最小寸法が７０ミクロンより大きい、好ましくは１００ミクロンより大きい、最も好ましくは１５０ミクロンより大きい粒径に細分化することである。小さいＤＢＭ粒子を包埋するために好ましい基質としては、生体適合性ポリマーおよび硬化性リン酸カルシウムセメントが挙げられる。一般的に、微粒子状ＤＢＭ／ポリマーの重量比は、約１：５〜約１：３の範囲である。リン酸カルシウムの場合、ＤＢＭは、２５％〜９０重量％まで、好ましくは５０％〜８０％、より好ましくは６０％〜８０％、最も好ましくはおよそ７５％存在する。モノリスの微粒子化は、慣用のミリングまたは磨砕によって、または低温ミリング（ｃｒｙｏｍｉｌｌｉｎｇ）もしくはミリング後の凍結の使用によりなされ得る。好ましい１つの実施形態では、凍結乾燥された、または脱水されたＤＢＭを、再吸収性ポリマー内に包埋する。第２の好ましい実施形態では、凍結乾燥された、または脱水されたＤＢＭを、当該技術分野で知られた硬化性リン酸カルシウムのうちの１つに包埋する。微粒子化の後、調製物を、さらに凍結乾燥および／または担体と混合してもよい。
【００４４】
脱灰骨組成物の安定化のためのストラテジー
脱灰骨基質を調製した後、以下に記載するストラテジーのいずれかを用いてＤＢＭの骨誘導性活性または骨伝導性活性を安定化し得る。ストラテジーとしては、酸性化、脱水、水代替物の使用、プロテアーゼインヒビターの使用および拡散バリアの使用が挙げられる。これらのストラテジーは、単独または組合せで使用され得る。当業者には認識されようが、ＤＢＭ組成物を安定化するために使用される１つのストラテジーまたは複数のストラテジーは、該組成物の使用、例えば、移植部位、必要とされる骨誘導性または骨伝導性の経過時間、取り扱い要件、修復対象の傷害などに依存する。
【００４５】
脱水。ＤＢＭまたは本発明のＤＢＭ組成物の調製後、該組成物は、水和された形態、または内在する水分が除去された凍結乾燥もしくは脱水された形態で保存され得る。ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、水和された形態では不安定であることが示されており、ｐＨ７．４で３７℃にて急速に分解されることが示されている（Ｕｒｉｓｔら Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．３８：１５５，１９７３（引用により本明細書に組み込まれる））。したがって、貯蔵寿命を改善するためには、水分を基質から除去するのがよい。凍結乾燥または脱水された組成物は、５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、または９８％より多くの水分が最初の試料から除去されたものであり得る。ＤＢＭ中の水分は真空にて除去され得、例えば、ＤＢＭを凍結し、減圧下で凍結乾燥機内に入れ、所望のレベルの脱水が達成されるまで内在する水分を除去し得る。他の実施形態では、ＤＢＭを、有機溶媒（例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、ブタノールなど）で抽出し、水分をＤＢＭから除去する。有機溶媒での抽出は、所望の量の水分を基質から除去するために反復してもよい。基質はまた、脱水剤（例えば、シリカゲル、ＤＲＩ−ＲＩＴＥ、Ｐ２Ｏ５、炭酸カルシウムなど）を伴う密閉環境内に基質を置くことにより脱水してもよい。凍結乾燥または脱水された形態では、本発明のＤＢＭ組成物の骨誘導性または骨伝導性活性は、室温またはそれ以下で数ヶ月から数年保存した場合であっても実質的により安定である。ある特定の好ましい実施形態では、脱水または凍結乾燥されたＤＢＭ組成物は、３７℃で１週間まで、３週間まで、５週間まで、１年まで、２年まで、または３年まで保存した後、その最初の活性の少なくとも９９％、９５％、９０％または８０％を保持している。他の実施形態では、凍結乾燥または脱水されたＤＢＭ組成物は、室温または４℃で６ヶ月、１年または２年後、最初の組成物の生物学的活性の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持している。好ましくは、凍結乾燥または脱水されたＤＢＭ組成物は、４℃で１年後、その最初の生物学的活性の少なくとも９０％を保持している。
【００４６】
酸性化。内在タンパク質分解酵素は、生理的ｐＨにおけるＤＢＭの不安定性の原因に関係するとされている。（Ｕｒｉｓｔら Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２：８８−１０３，１９７４（引用により本明細書に組み込まれる））。このような内在プロテアーゼのタンパク質分解活性は、ＤＢＭ組成物のｐＨを低下させることにより低減させ得る。２〜６の間、好ましくは３〜５の間、より好ましくは３〜４の間のｐＨでは、本発明のＤＢＭ組成物は、凍結乾燥または脱水された形態であろうとなかろうと、増大した安定性を有する。ある特定の好ましい実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、３７℃で１週間まで、３週間まで、５週間まで、１年まで、２年まで、または３年まで保存した後、その最初の生物学的活性の少なくとも９９％、９５％、９０％または８０％を保持している。他の実施形態では、酸性化および／または脱水されたＤＢＭ組成物は、室温または４℃で６ヶ月、１年または２年後、最初の組成物の骨誘導性または骨伝導性活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持している。
【００４７】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物のｐＨは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）未満に低下させる。本発明のＤＢＭ組成物は、所望のまたは低いｐＨ、好ましくは＜７、より好ましくはおよそ２〜およそ５の間、最も好ましくはおよそ３〜およそ４の間のｐＨを有する酸性溶液または緩衝溶液中でＤＢＭをリンスすること、および／または該溶液中にＤＢＭを浸漬させることによってＤＢＭ組成物を酸性化することにより調製され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＭを、所望のｐＨが達成されるまでリンスおよび／または浸漬させ得る。他の実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、脱灰工程（これは、通常、ＨＣｌなどの酸を用いて行われる）後、脱灰されたＤＢＭを水でリンスすることにより得られ得る。水または緩衝溶液でのリンス処理は、脱灰工程後、ＤＢＭの所望のｐＨが達成されるまで継続してもよい。酸性化工程は、追加の安定化剤（以下に記載する拡散バリア；プロテアーゼインヒビターもしくは他の酵素インヒビター；Ｄ２Ｏ；共有結合性修飾化学薬品；担体；ポリオール、ソルビトール；または水代替物など）の添加前、添加中または添加後に行い得る。
【００４８】
ＤＢＭの酸性環境の結果、内在プロテアーゼのタンパク質分解活性が低減され、ＤＢＭ内に存在する骨誘導性因子の安定性の増大がもたらされる。酸性化したＤＢＭ組成物の安定性の増大は、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、ＤＢＭ組成物をラットの筋肉間にインプラントし、規定した期間後、骨形成を調べることにより試験し得る（Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、４℃、２５℃、室温または３７℃で１週間、３週間、５週間、６ヶ月、１年、１．５年、２年、３年および１０年後、ＤＢＭの最初の骨誘導性の＞５０％、＞７５％、＞８０％、＞９０％、＞９５％または＞９８％を保持している。
【００４９】
安定化剤が添加された、または添加されていない本発明の酸性化したＤＢＭ組成物は、水和された、または脱水／凍結乾燥された形態で保存し得る。該組成物は、重量基準で約１０％〜約９９％の水分を含有し得る。ある特定の好ましい実施形態では、水分含量は＞１０重量％である。該組成物は、本発明のＤＢＭ組成物の貯蔵寿命をさらに増大させるため、室温またはそれ以下で保存してもよい。当業者には認識されようが、温度を低下させると、本発明のＤＢＭ組成物の生物学的活性の半減期が増大する。
【００５０】
重水。重水は、生物学的組成物において安定化剤としての機能を果たすことが示されている。例えば、Ｄ２Ｏは、有機系分子、巨大分子、ウイルスおよびワクチンの安定性を増大させることが示されている（Ｋａｔｚ，“Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｗａｔｅｒ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｕｌｙ １９６０，１０６−１１５；Ｋａｔｚ“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ”３９ｔｈ Ｐｒｉｅｓｔｌｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１−１１０；Ｊａｉｎら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８６０：４４８，１９８６（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））。ＣｒａｉｎｉｃおよびＳｉｍｐｓｏｎは、ある特定の巨大分子の増大した熱的および微生物学的安定性ならびに解離の減速について記載した（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９４／２１２９８（引用により本明細書に組み込まれる））。９５％Ｄ２Ｏの存在は、ワクチンの場合では、Ｈ２Ｏと比べ、保存温度の４〜５℃低下に相当することがわかっている。加えて、７〜２５％Ｄ２Ｏは、タンパク質変性の防止を補助する（Ｗｅｎｚｅｌ，ＤＥ２２５３０８６；Ｈａｍａｙａ ａｎｄ Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，ＪＰ０１１７９６８９；Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．ＥＰ ３３２８２６（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本発明は、ＤＢＭへの重水の添加または重水中へのＤＢＭの浸漬もしくは重水中でのリンス処理が、ＤＢＭ組成物の骨誘導性の安定化をもたらすことを実証する。ある特定の実施形態では、ＤＢＭを脱水してＨ２Ｏを除去し、次いでＤ２Ｏで再水和する。好ましくは、Ｄ２Ｏの割合は５０％より多く、より好ましくは７５％より多く、さらにより好ましくは９０％より多い。ある特定の実施形態では、Ｄ２Ｏの割合は９５％より多い。しかしながら、一部の実施形態では、Ｄ２Ｏの割合は、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％または４０〜５０％であり得る。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物を調製するために使用されるＤ２Ｏ溶液またはバッファーのｐＤは、７．０未満、好ましくは２〜５の間、より好ましくは３〜４の間である。Ｄ２Ｏ溶液またはバッファーのｐＤを低下させることによって、上記のように内在プロテアーゼの活性が低減され、骨誘導性がさらに安定化される。また、水代替物としてのＤ２Ｏの使用を、ＤＢＭ組成物を安定化させるための上記の他のストラテジー（例えば、糖などの安定化剤の添加、プロテアーゼインヒビター（１種類または複数種類）の添加および他の水代替物の添加など）と組み合わせてもよい。
【００５１】
他の水代替物。水代替物はまた、水が関与するか、または水が必要とされる媒体である化学反応も抑制し得る。水代替物としては、ポリオール、例えばグリセロール、液状ポリマー、流動性ポリマー、成形用ポリマー、ポリエチレングリコール、ヒドロゲル、ヒアルロン酸、液状脂質、流動性脂質、成形用脂質、ヒドロキシル化低分子、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、油類、油と水のエマルジョン、油と脱気水のエマルジョンなどが挙げられ得る。好ましくは、水代替物は、生体適合性である。水代替物は、水分が関与する化学反応（例えば、Ｄ２Ｏによる同位体効果）、例えば、生物学的に活性な因子の酵素的分解およびタンパク質構造の熱力学的不安定化など、または水が反応に必要とされる媒体である化学反応を抑制する。したがって、室温であっても、得られる水代替物含有ＤＢＭ組成物は、水代替物無含有ＤＢＭ組成物よりも増大した貯蔵寿命を有する。水代替物の効果は、ＤＢＭ組成物をより低温で保存することにより、さらに増大され得る。また、他の安定化剤および／またはＤＢＭ組成物の他の安定化方法（例えば、ｐＨの低下）を水代替物と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
好ましくは、水代替物は液体である。しかしながら、半固体の物質も水代替物として使用され得る。ある特定の実施形態では、水代替物として、ヒドロキシル基または他の極性官能基を有する化合物、例えば、アミン、チオール、カルボニルなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、水代替物の極性基は水素結合を形成することができる。水代替物は、極性であり、かつ水と混和しやすいものであり得る。他の実施形態では、水代替物は、非極性（例えば、油、脂質）であり、水と混和しやすくないものであり得る。水代替物の例としては、硬化ヒマシ油、骨髄脂質、硬化牛脂、硬化ラード油、カカオバター、多糖類、ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、脂肪酸グリセロールエステル、例えば、グリセロールモノラウレート、グリセロールモノミリステート、グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート、グリセロールジラウレート、グリセロールジミリステート、グリセロールジパルミテート、グリセロールジステアレート、グリセロールトリミリステート、グリセロールトリパルミテートおよびグリセロールトリステアレートが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、グリセロールを含んでいない。
【００５３】
水代替物として使用され得るワックス状材料の例としては、蜜蝋、カルナウバワックス、木蝋、鯨蝋、炭化水素、例えばパラフィン、微晶質ワックス、および脂肪族アルコール、例えば、セチルアルコールおよびステアリルアルコールならびに高級脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸およびアラキジン酸が挙げられる。
【００５４】
組成物への水代替物の添加はまた、組成物を流動性で成形可能にするという利点を有する。
【００５５】
安定化剤の添加。本発明の製剤への安定化剤の組込みは、一般的に、目的の１つの分子または複数の分子を適切に適合し得るバッファー（当業者に知られている）中に懸濁することによりなされる。次いで、このバッファーを基質と、比較的低い液体／固体容量比で混合し、スラリーを形成する。好ましくは、バッファーのｐＨは、およそｐＨ７．４である。組成物が酸性化された実施形態では、バッファーのｐＨは、生理学的ｐＨ未満であり、ほぼ、最終ＤＢＭ組成物において所望されるｐＨである。ある特定の実施形態では、安定化剤（１種類または複数種類）を含むバッファーを、凍結乾燥された基質と混合する。そのスラリーを、次いで、凍結乾燥し、所望のＤＢＭ製剤の調製に使用し得る。
【００５６】
本発明の特徴の１つは、拡散バリア、酵素インヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター）、競合性基質、マスキング剤または他の安定化剤を組み込むことが、多くの場合、基質内に存在する活性因子に対して内在的に存在する分解性酵素が接近するのを防止することにより、ＤＢＭ製剤の貯蔵寿命をさらに改善するという付加的な特徴を有することである。これは、調製されるＤＢＭ製剤が水を含有する場合（例えば、ヒドロゲル担体、例えば、ヒアルロン酸もしくはコラーゲンまたは水和されたデンプン担体を含むＤＢＭ調製物）は、特にそうである。
【００５７】
拡散バリアは、本発明の製剤内の活性部分への分解性酵素および／または水の拡散を遅滞させる。内包されるＤＢＭ内での拡散を遅滞させた酵素は、基質からの活性因子の放出および／または活性因子を分解もしくは不活性化を行い得る。これらはまた、インプラント部位からの活性因子の拡散を遅滞させることにより作用し得る。このようにして、バリアは、インプラント部位における活性因子のより長期の滞留時間をもたらす。これは、骨形成が活性因子の存在をより長期間必要とすると思われる高等種（例えば、ヒトなど）における骨の形成に特に有用である。
【００５８】
一般的に、拡散バリアとしての機能を果たすのに最も適した材料は、ＤＢＭまたは最適な合成基質と容易に混合され、ゲル、ペーストまたはパテ状粘稠物を形成するが、一部の実施形態では、バリア／基質製剤は、比較的非変形性の固体として調整される（例えば、後外側脊椎固定に使用される基質調製物の場合）。好ましい実施形態では、拡散バリア自体が予測可能な様式で分解し、通常、拡散バリアの非存在下で起こり得るよりも後の時点で活性因子をアンマスキングする。既知の加水分解速度を有する再吸収性ポリマーは、拡散バリアとして、ならびに酵素的に分解されるポリマーとして有用である。特に有用なものは、リパーゼ感受性脂質系担体、例えば、脂肪酸およびリン脂質であり、これらはＤＢＭと良好に混合される。ある特定のＤＢＭの実施形態では、該組成物は、ホスファチジルコリンを含まない。一部の特に効果的な調製物は、骨誘導性因子のアンマスキングを制御することにより延長された安定性を提供する。このような調製物は、一般的に、異なる分解時間を有して同じ活性因子の少なくとも２つの異なるアンマスキング速度をもたらす２種類以上の拡散バリアの使用を伴う。
【００５９】
本発明の安定化された基質／成長因子組成物の調製に有用な生分解性ポリマーとしては、天然ポリマー、例えば、タンパク質（例えば、コラーゲン）および多糖類（例えば、デンプン、改質デンプン、マルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ））ならびに人工再吸収性ポリマー、例えば、ポリオルトエステルが挙げられる。これらのポリマーは、本発明の成長因子含有組成物と混合すると、組成物内に含有された活性因子への宿主の分解性酵素および／または水の拡散を遅滞させ、それにより、内包された活性因子の放出および／または分解を遅滞させる。
【００６０】
本発明の組成物に包含され得るポリマーとしては、例えば、天然ポリマー（脂質、多糖類、プロテオグリカンおよびタンパク質など）が挙げられる。好ましい多糖類としては、デンプン、デキストランおよびセルロースが挙げられ、好ましいタンパク質としては、コラーゲンが挙げられる。多糖類（例えば、デンプン、デキストランおよびセルロースなど）は、改質されていないものであってもよく、その特性（例えば、その水和された状態での特徴、その溶解性、その易分解性またはそのインビボ半減期）の１つ以上に影響を与えるために物理的または化学的に改質されたものであってもよい。多糖類（例えば、デンプンおよびセルロースなど）はまた、既知分解速度を有するため、魅力的である。一般的に、セルロースは、体内では、より低速で分解され、数週間または数ヶ月の単位で分解されるが、多くのデンプン調製物および脂質調製物は、急速に（数時間または数日間の単位で）分解される。天然状態のデンプンは、２種類の多糖類、アミロースおよびアミロペクチンの混合物である。特定のデンプンのデンプン分解性酵素（例えば、アミラーゼ、ペクチナーゼおよびβ−グルコシダーゼなど）に対する感受性は、本発明の製剤の設計における重要な考慮事項である。当業者は、種々の植物供給源から調製されるデンプンには、さまざまなアミラーゼ感受性があることを承知しており、この知識を、所望の安定性時間を有する製剤の作製に適用し得る。好ましいデンプンは、１日あたり１０％程度、好ましくは、１日あたり５０％程度、最も好ましくは、１日あたり９０％より多くが分解する。ペクチナーゼおよび／またはアミラーゼによってあまり分解されにくいデンプン（アミラーゼ抵抗性デンプン；Ｓｔａｒｃｈ Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、インビボ骨誘導性半減期を、より酵素感受性のデンプンから調製される改善されたＤＢＭまたは合成成長因子／基質製剤よりもはるかに高程度まで最大限に延長し得る。一部の改質デンプンは、アミラーゼによってあまり分解されず、したがって、改質デンプンを含む改善されたＤＢＭは、おそらく、非改質デンプンを含む改善されたＤＢＭと比べ、より長期のインビボ半減期を有し得る。デンプンのアミラーゼ感受性に影響を与える好ましい方法の１つは、デンプンと脂質の組合せの使用によるものである。アミラーゼ感受性に影響を与えるための脂質とデンプンの組合せに関する手引きは、Ｃｒｏｗｅら“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０（８）：２００６−２００８，２０００年８月（引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。同様の考慮事項が、脂質とその分解性酵素リパーゼに適用される。リパーゼ分解に対する種々の感受性を有する多種多様なモノ−、ジ−およびトリグリセリドが、市販品供給源から入手可能である。実施形態の一部は、１種類以上のポリマー系材料（好ましくは、生分解性）、例えば、チロシンポリカーボネート、ポリフマレート、チロシンポリアクリレートおよびポリオルトエステル（ポリラクチド、ポリガラクチド（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉｄｅ）など）、ならびにそのコポリマーなどを含むものである。これらのポリマーは生分解性であり、その特性は、ポリマーの鎖長もしくは架橋度および／またはモノマーの化学的構造を変更することにより改質され得る。さらに、コポリマーは、再吸収性ポリマーの組合せを用いて調製され得る。
【００６１】
本発明の実施に有用な酵素インヒビターとしては、例えば、酸プロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら“Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ １７ （１）：３−１４（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、システインプロテアーゼインヒビター、グリコナーゼ（ｇｌｙｃｏｎａｓｅ）インヒビターおよびグリコシダーゼインヒビターが挙げられ得る。本発明の実施に有用な具体的なプロテアーゼインヒビターとしては、例えば、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチンＡ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびメタロプロテアーゼインヒビターのＴＩＭＰクラスのものが挙げられる。特に有用なものは、酸性条件下で安定であり、酸性条件で有効なものである。
【００６２】
宿主の分解性または活性化酵素に対する競合性基質の使用もまた、ＤＢＭの骨誘導性因子または外添される成長因子を安定化させるために用いられ得る。競合性基質の例としては、ジ−およびポリ−リシンが挙げられる。二糖類および多糖類をグリコシダーゼ、アミラーゼおよび／またはペクチナーゼの競合性基質として用いてもよい。特に有用なものは、立体異性体の競合性基質である。
【００６３】
一般的に、単一の存在物または一類型の存在物を酵素的分解から特異的に阻止されるように、特異的なマスキング用存在物を用いる。阻止対象の分解性または活性化酵素は、内在または外来の基質であり得る。マスキング用存在物は、一般的に、基質上に存在するリガンド（活性因子自体であってもそうでなくてもよい）に結合する。結合したら、マスキング用存在物は、１種類以上の活性因子の分解および／または放出を立体的に障害する。経時的に、マスキング用存在物は、離脱するか、または自身が分解され、リガンドおよびまたは成長因子を分解されやすくする。拡散バリアは、基質と会合した成長因子の多くまたはすべてに分解性または活性化酵素が接近するのを抑制することにより、マスキング用存在物の全般性形態を表す。
【００６４】
ＤＢＭの共有結合性修飾。ＤＢＭは、ポリエチレングリコールの添加またはシリル化によって共有結合により修飾され得る。
【００６５】
例示的な安定化されたＤＢＭ組成物。ＤＢＭ組成物を安定化させるための上記のストラテジーおよび他の出願書類に記載されたストラテジー（引用により本明細書に組み込まれる）に基づくと、以下のＤＢＭ組成物が特に有用である。
【００６６】
ある特定のＤＢＭ組成物は、グリセロールを含まない。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、ＤＢＭおよび非グリセロール安定化手段を含む。安定化手段としては、水代替物（例えば、重水、ポリオール、脂質、油類、ワックス、多糖類など）；プロテアーゼインヒビター；酸；拡散バリア；競合性基質；マスキング剤；および共有結合性修飾体が挙げられ得る。ある特定の特別な実施形態では、安定化手段は、水代替物、プロテアーゼインヒビター、酸または拡散バリアである。特に有用な水代替物はＤ２Ｏおよび非グリセロールポリオールである。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は酸性化されており、水代替物が添加されている。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物は酸性化されており、プロテアーゼインヒビターが添加されている。さらに他の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、水代替物とプロテアーゼインヒビターを含む。ＤＢＭ組成物由来の水分は、凍結乾燥または本明細書に記載の他の手段によって任意選択で、除去し得る。ＤＢＭ組成物は、好ましくは、室温で１年後、その最初の骨誘導活性の少なくとも９５％を保持しているのがよい。
【００６７】
本発明のＤＢＭ組成物は、非グリセロール担体をさらに含み得る。ＤＢＭ組成物に含めるのに（ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｄｅ）有用な非グリセロール担体としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマーおよび水が挙げられる。担体をＤＢＭ組成物に添加し、該組成物を、より流動性， 易成形性および／または易取り扱い性とし得る。好ましくは、担体の添加は、ＤＢＭ組成物の安定性または半減期に実質的に影響を与えない。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、グリセロールを水代替物として含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、ＤＢＭ、グリセロールおよび安定化手段を含む。安定化手段は、水代替物、酸性化，拡散バリアまたはプロテアーゼインヒビターであり得る。特に有用な安定化手段の例としては、ヒアルロン酸、デンプンおよび脂質が挙げられる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭを、外来の不安定化存在物と混合する。例えば、ＤＢＭは、プロテアーゼまたは他の分解性酵素を含有する組織と混合され得る。ＤＢＭ内の活性因子を分解から保護するため、先に概要を示した種々のストラテジーを用い、そうしないと不安定化される組成物を安定化し得る。例えば、外来の不安定化存在物の効果を少なくとも部分的に打ち消すために、プロテアーゼインヒビターを該組成物に添加し得る。
【００７０】
安定化の試験
本発明はまた、好適な安定化剤をスクリーニングするためのインビトロ試験を提供する。本明細書に記載のようにして調製されるＤＢＭ組成物を、模擬的な生理条件（例えば、ｐＨ７．４、生理食塩水）下で、ＤＢＭの構成成分タンパク質の一部または全部を分解できることが知られた酵素または酵素の組合せに曝露する。ほとんどの場合、これは、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、ペプシン、パパイン、ペプチダーゼなどである。基質または基質成分の分解の証拠を２つの調製物間で比較する。分解プロセスを遅滞させる物質を、さらなる試験に充分な候補とみなす。分解の好ましいインジケーターとしては、ＴＧＦ−βの免疫学的検出および／またはＩＧＦ分解が挙げられる。上記に示した酵素に加え、他の酵素、例えばコラーゲナーゼまたは酵素の組合せおよびグリコシダーゼもまた、使用され得る。これに関して特に有用なものは、血清または組織抽出物の自然な分解活性である。このような条件下では、ＤＢＭ内に存在する特異的マーカータンパク質を、免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロットを用いたラジオイムノアッセイもしくはゲル電気泳動）、または当該技術分野で知られた他の解析方法によって追跡し得る。例えば、特定のタンパク質の分解がモニターされ得、または分解産物（例えば、ペプチド断片など）のレベルの増加がモニターされ得る。
【００７１】
上記アッセイでの候補安定化剤の同定後、候補安定化剤を含有するＤＢＭ製剤を、本明細書において別途記載した骨誘導性アッセイで試験する。
【００７２】
加速安定性の試験
本発明はまた、加速安定性の試験のためのインビトロ試験を提供する。各ＤＢＭ製剤の数連の試料を耐湿性容器（アルミニウムホイル）内にパッケージングし、高温温度（例えば、４０℃）で数ヶ月間置く。種々の時点（例えば、インキュベーションの０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間後）、パッケージを開封し、内容物の骨誘導活性を測定する。任意の試料の加速安定性は、各ＤＢＭ製剤の骨誘導活性（初期骨誘導活性に対する割合に標準化したもの）を時間に対してプロットすることにより得られるベストフィット直線の傾きから決定され得る。該材料の室温安定性は、Ｒｅｉｃｋら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ １０（３）：３４−３９，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載された酵素反応速度論のファント・ホッフの法則を用いて外挿され得る。
【００７３】
以下に実施例に記載する本発明者らの試験では、ＤＢＭ組成物の酸性化または水和されたＤＢＭ製剤へのグリセロールの添加は、ＤＢＭの骨誘導安定性を有意に増大させる。
【００７４】
骨誘導活性の測定
骨誘導性活性は、目的のＤＢＭ製剤を胸腺欠損ラットの非骨格部位内にインプラントし、インプラント部位で誘導された新しい骨、軟骨および骨髄の量を評価することにより測定する。骨誘導活性の測定手順は、以前に詳細に報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＴ，Ｄｉｅｇｍａｎｎ ＭＨ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ＮＬ．“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１９９８ Ｄｅｃ；（３５７）：２１９−２８（引用により本明細書に組み込まれる））。
【００７５】
骨誘導物質
ＤＢＭ組成物には、他の骨誘導剤を添加してもよい。このような薬剤は、活性化形態または非活性化形態で添加され得る。このような薬剤は、本発明の材料の調製時の任意の時点で添加され得る。例えば、骨誘導剤は、添加された骨誘導剤が、いったんインプラントされた外来の分解性酵素から保護されるように、脱灰工程後、安定化剤の添加前に添加され得る。一部の実施形態では、ＤＢＭを、骨誘導剤を含有する溶液の状態で凍結乾燥する。ある特定の他の好ましい実施形態では、骨誘導剤は水和された脱灰骨基質上に付着しており、解け易くない。他の場合では、骨誘導剤を改善されたＤＢＭに、ＤＢＭを移植したらすぐに骨誘導剤が利用可能となるように、安定化剤の添加後に添加する。
【００７６】
骨誘導剤には、骨の形成をもたらすか、またはこれを増強する任意の薬剤が含まれる。骨誘導剤は、これを任意の様式で行い得、例えば、該薬剤は、骨形成を担う細胞の漸増をもたらすものであり得る；該薬剤は、後で石灰化作用を受け得る基質の分泌をもたらすものであり得る；該薬剤は、骨の吸収の低減をもたらすものであり得る、などである。特に好ましい骨誘導剤としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスホーミング成長因子 （ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）など）、および血管由来因子（例えば、ＶＥＧＦなど）が挙げられる。好ましい１つの実施形態（実施例１２）では、該誘導剤は、ＤＢＭまたは担体に対する該誘導剤の結合を促進するアミノ酸配列を含むように遺伝子操作されたものである。ＳｅｂａｌｄらのＰＣＴ／ＥＰ００／００６３７（引用により本明細書に組み込まれる）には、ＤＢＭとの使用に適した例示的な操作された成長因子の産生が記載されている。
【００７７】
製剤化
本発明の改善された骨形成組成物は、特定の用途のために製剤化され得る。製剤化は、ＤＢＭ調製物の物理的、生物学的または化学的特性を改変するために用いられ得る。医師ならば、傷害の型、傷害部位、患者の健康、感染の危険などの要素を考慮して、特定の適用に必要とされる製剤化を容易に決定することができよう。
【００７８】
本発明の組成物は、したがって、選択した吸収速度／骨誘導速度の低下を有するように、またはインプラントの異なる部分において異なる速度を有するようにさえ調製され得る。例えば、製剤化プロセスとしては、特定の大きさまたは組成のＤＢＭ粒子の選択を、特定の１種類の安定化剤または複数種類の安定化剤およびかかる薬剤の量の選択と組合せることが挙げられる。一例にすぎないが、その骨誘導性因子が比較的一定量で所与の期間、活性である組成物を提供することが望ましかろう。より長期の半減期を有する因子を含むＤＢＭ組成物は、生分解性の低いポリマーまたは大量の（例えば、コーティング厚の大きい）ポリマー系化合物を用いて調製され得る。また、所望の半減期を有するＤＢＭ組成物を提供するために、プロテアーゼインヒビターの量または型を調整し得る。あるいはまたさらに、粒径は、本発明のＤＢＭ組成物の半減期の決定において重要であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の製剤化としては、各々が異なる半減期を有する粒子の混合が挙げられ得る。かかる混合物は、傷害の必要性に応じて数日間から数週間や数ヶ月の範囲の長期間、一様な、または可能な限りの骨誘導性因子のアンマスキングを提供し得る。このような組成物の製剤化は、ヒト患者において、コラーゲンスポンジにて１０μｇのｒｈＢＭＰでの処置によって誘導される骨成長匹敵する、好ましくは１００μｇ、最も好ましくは１〜１０ｍｇのｒｈＢＭＰでの処置に匹敵する骨成長を刺激し得る。
【００７９】
また、ＤＢＭの変形可能性および粘度などの物理的特性は、具体的な臨床適用に応じて選択され得る。改善されたＤＢＭの粒子を他の材料および因子と混合し、インプラントの他の特徴を改善し得る。例えば、改善されたＤＢＭ材料を他の薬剤と混合し、創傷治癒を改善し得る。このような薬剤としては、薬物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、溶媒、化合物、生物学的分子などが挙げられ得る。
【００８０】
ＤＢＭ（または本発明のＤＢＭ材料）の粒子は、種々の形状および立体構造に形成され得る。該粒子は、桿形、糸状、シート形、波型、固形、円錐形、円板形、繊維、くさび形、コイル状、二重らせん状などに形成され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物内の粒子の形状および大きさは、骨誘導性の経時変化に影響を及ぼす。例えば、円錐形またはくさび形の形状では、先細りした末端が、ＤＢＭ組成物を移植した後、短時間で骨誘導性をもたらし、一方、厚みのある末端は、治癒プロセスにおいて、後から（例えば、数時間から数日間や数週間後に）骨誘導性をもたらす。ある特定の実施形態では、粒子は、その最も広い幅の寸法のところが、２ｍｍより大きい、１．５ｍｍより大きい、１ｍｍより大きい、好ましくは５００ミクロンより大きい、最も好ましくは２００ミクロンより大きい長さを有する。また、大きい粒径ほど、小さい粒子よりも長期間にわたって骨形成の誘導を有する。異なる特性（例えば、組成物、大きさ、形状）の粒子を、このような異なる形状および立体構造の形成に使用し得る。例えば、シート状のＤＢＭでは、半減期の長い粒子の層を、半減期の短い粒子の層間に交互に配置し得る（米国特許第５，８９９，９３９号（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。織物状のものでは、半減期の短い粒子から構成された糸を、半減期がより長い糸と一緒に織り込み得る。
【００８１】
本発明の好ましい１つの実施形態では、繊維状ＤＢＭを、米国特許第５，５０７，８１３号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載の基質形態に成形する。次いで、成形したＤＢＭを、基質の一部分が基質材料にない露出した状態になるように、拡散バリア型基質内に包埋する。特に好ましいブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基質は、デンプン、ホスファチジルコリン、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアクリレート、ポリラクチド、ポリガラクチドまたは他の再吸収性ポリマーもしくはコポリマーである。このようにしてこれらの基質から調製されたデバイスは、即時かつより長期持続性が両立した骨誘導特性を有し、ヒト脊椎後側方固定適応における骨塊形成の促進に特に有用である。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、予め選択した三次元形状を有する本発明のＤＢＭ組成物は、例えば、Ｃｉｍａらの米国特許第５，４９０，９６２号；および同第５，５１８，６８０号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）；ならびにＳａｃｈｓらの米国特許第５，８０７，４３７号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているような３−Ｄプリンティングによる、ＤＢＭの個々の層の適用の反復により調製される。異なる層が、個別の安定化されたＤＢＭ調製物を含むものであってもよく、あるいはまた、多数の層を堆積した後、安定化剤で処理されたＤＢＭ層を含むものであってもよい。
【００８３】
改善された本発明のＤＢＭ材料の調製方法では、該材料は、あらゆる感染性因子（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎など）が排除されるように、完全に無菌的に作製され得るか、または滅菌され得る。滅菌は、任意の方法または方法の組合せ、例えば、１種類以上の抗生物質、放射線照射、化学的滅菌（例えば、エチレンオキシド）または加熱滅菌を用いてなされ得る。当該技術分野で知られた他のＤＢＭの調製方法、例えば、脱脂、超音波処理および凍結乾燥などもまた、改善されたＤＢＭの調製において使用され得る。脱灰骨の生物学的活性は、ほとんどの加熱滅菌プロセスによって有害な影響を受けることが知られているため、本発明の組成物を滅菌する際は、注意しなければならない。好ましい実施形態では、本明細書に記載するＤＢＭ組成物は、無菌的に調製するか、または実施例６に記載のようにして滅菌する。
【００８４】
適用
本発明の改善された骨形成組成物は、骨の傷害の治癒を促進するために使用され得る。該組成物は、身体の任意の骨において、任意の型の傷害に対して使用され得る。この改善されたＤＢＭ組成物は、コラーゲンスポンジでの１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２００μｇ〜１ｍｇのｒｈＢＭＰと同様のタイミングで同様のレベルで、ヒト患者において骨を生成させるために設計した。例えば、本発明の材料を用いて修復され得る具体的な骨としては、篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、きぬた骨、あぶみ骨、つち骨、頚椎骨、胸部の椎骨、腰椎骨、仙骨、胸骨、肋骨、鎖骨、肩甲骨、上腕骨、尺骨、橈骨、手根骨、中手骨、指趾節骨、回腸、坐骨、恥骨、骨盤、大腿、膝蓋骨、脛骨、腓骨、踵骨、距骨、および中足骨が挙げられる。改善されたＤＢＭで処置されやすい傷害の型としては、傷害により生じた骨欠損、手術、感染症、悪性疾患の過程で引き起こされた骨欠損、または先天性発育異常が挙げられる。本発明の材料は、整形外科、神経外科、美容術ならびに口腔および顎顔面外科手術、例えば、単純骨折および複雑骨折ならびに癒着不能の修復、外固定および内固定、関節再構成、例えば、関節固定術、一般的な関節形成術、腰部のカップ関節形成術、大腿および上腕頭置換、大腿骨頭表面置換および関節全置換、脊柱の修復、例えば、脊椎固定術および内固定、腫瘍手術（例えば、欠損部の充填）、椎間板切除術、椎弓切除術、脊髄腫瘍の切除、前頚および胸部の手術、脊椎傷害の修復、脊柱側弯症、脊柱前弯症および脊柱後弯の処置、骨折の上顎骨間固定、おとがい形成術、顎関節症の関節置換、歯槽突起増加および再構成、インレー骨移植片、インプラント設置および修正、サイナスリフトなどに有用であり得る。
【００８５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の実施例を考慮すると、さらに認識されよう。以下の実施例は、本発明のある特定の特別な実施形態を説明することを意図するものであって、特許請求の範囲に規定されたその範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：脱灰骨基質（ＤＢＭ）の調製
ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または手法（Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて調製され得る。以下は、Ｇｌｏｗａｃｋｉら“Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ Ｉｍｐｌａｎｔｓ”Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ １２（２）：２３３−２４１，１９８５年４月（これは、引用により本明細書に組み込まれる）から得られる脱灰骨を調製するための例示的な手順である。ドナーからの骨または骨断片を、きれいにしてあらゆる付着骨膜、筋肉、結合組織、腱、靱帯および軟骨を除去する。海綿質骨を、密な皮質骨から分離し、大きな骨片として処理してもよい。後続の洗浄および抽出の効率を向上させるため、皮質骨を小片に切断してもよい。より大きな動物からのより蜜な骨は、１ｃｍ未満のチップを作製するために、凍結させ、ハンマーで砕く必要があり得る。得られた骨片を冷脱イオン水で充分洗浄し、髄および軟組織を除去する。
【００８７】
きれいにした骨を、次いで、絶対エタノール（頻繁に交換する）で少なくとも１時間抽出する。典型的には、合計４リットルのエタノールを、１００ｇの骨に対して使用する。次いで、骨を、ドラフト内にて、無水ジエチルエーテル（頻繁に交換する）で１時間抽出する。典型的には、２リットルのエーテルを１００ｇの骨に対して使用する。骨は、これらのエタノールとエーテルの抽出によって脱水し、室温で保存し得る。
【００８８】
脱水した骨を、次いで凍結し、次いで、液体窒素中で衝撃式製粉機にて粉砕する。粉砕した骨を、次いで、篩分けし、７５〜２５０、２５０〜４５０および４５０ミクロンより大きい画分に分ける。骨粒子画分を、次いで、０．５Ｍ塩酸（５０ｍＬ／グラム）を用い、３時間、室温または４℃で、過熱を防止するために断熱したマグネチックスターラーにて脱灰する。大きな骨チップおよびブロックを、４℃にて０．５Ｍ塩酸（頻繁に交換する）で完全に抽出する。脱灰プロセスは、灰化により、または非脱灰組織学的手法（ホン・コッサ染色）によりＸ線写真上にてモニターし得る。酸および遊離した無機成分を冷脱イオン水で、洗浄液のｐＨが水のｐＨと一致するまで洗い流す。水での洗浄は、大粒子および骨チップからのデカンテーションでもよい；しかしながら、洗浄液は、遠心分離によって、より微細な粒子から除去されなければならない。洗浄工程では、およそ５００ｍＬの水が当初の骨粒子１グラムに対して必要とされる。
【００８９】
脱灰骨粉末は、絶対エタノール（交換する）で１時間抽出し、２００ｍＬのエタノールを当初の骨粒子１グラムに対して使用する。この材料を、ドラフト内にて無水エチルエーテル（交換する）で１時間抽出し、１００ｍＬのエーテルを当初の骨粒子１グラムに対して使用する。最後に交換したエーテルを除去した後、脱灰骨粉末を、すべての残留エーテル が蒸発するまで一晩フード内に放置する。この粒子は、無臭で真っ白であり、離散（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）しているはずである。脱灰骨材料を滅菌するため、冷エチレンオキシドで処理するか、または放射線を照射し得る。
【００９０】
調製したＤＢＭの生物活性を試験するため、２５ｍｇのこの材料を、剃毛し麻酔した２８日齢雄Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＣＤラットの２つの胸部の皮下ポケットの各々にインプラントする。インプラントされた試験片を、次いで、移植の数日後に回収し、検査し得る。誘導された組織の組成を、組織形態計測解析および生化学的手法によって定量し得る。
【００９１】
実施例２：ＤＢＭの別の調製方法
ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または手法（Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて調製され得る。
【００９２】
脱灰骨基質を、長骨から調製した。
骨幹領域を、あらゆる接着性軟組織がない状態にし、次いで、ミル内で磨砕した。磨砕された材料を篩分けし、直径がおよそ１００μｍ〜５００μｍの粒子を有する粉末を得た。微粒子状の骨を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．６Ｎ ＨＣｌの溶液を室温で用いた後、新たな０．６Ｎ ＨＣｌの溶液を用い、約１％（重量基準）未満の残留カルシウムに脱灰した。この粉末材料を脱イオン水で、ｐＨが３．０より大きくなるまでリンスした。次いで、７０％エタノール中に浸漬し、凍結乾燥して残留湿分を５％未満とした。
【００９３】
実施例３：ｐＨ安定化したＤＢＭのインビトロ評価
安定化剤（または種々の濃度および／または配合の安定化剤）を含むか、または含まないｐＨ安定化したＤＢＭの試料を調製し、血清または個々の酵素（例えば、パパイン）を含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）とともにインキュベートし、３７℃で０．５、１、２、４、８および２４時間インキュベートする。次いで、試料を抽出し、Ｕｅｌａｎｄら（“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９９ Ｊａｎ；８４（１）：１２３−７（引用により本明細書に組み込まれる））に概要を示したようにして、成長因子および他の基質タンパク質の濃度を測定する。ネイティブまたは変性ＳＤＳゲル電気泳動のための試料を調製した後、ウェスタンブロット解析またはＵｅｌａｎｄら（１９９９）に記載され、引用により本明細書に組み込まれるウェスタンリガンドブロッティング（Ｕｅｌａｎｄら“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９９ Ｊａｎ；８４（１）：１２３−７；およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（編）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第２版 ２００２年，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））を行う。
【００９４】
次いで、試料を、７、１４、２１、２８、３０、６０または９０日間での骨誘導性に関して、胸腺欠損ラットアッセイまたは他の適切な種において試験し得る。また、抽出物試料は、Ｚｈａｎｇら（１９９７）に記載のような組織培養物アッセイにおいて、生物学的活性に関して速やかに試験し得る。
【００９５】
実施例４： 筋肉内インプラントによる骨成長の誘導の経時変化測定
この実施例は、本発明の材料を用いた筋肉内部位における骨成長の誘導の経時変化の特徴を示し、ＤＢＭ系粉末（実施例１と同様）と、第７、１４、２８および３５日の時点で比較する。この実施例は、Ｅｄｗａｒｄｓら“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８年１２月（引用により本明細書に組み込まれる）に示されたＤＢＭの骨誘導の評価のためのラットモデルと類似する。
【００９６】
本研究は、ヒト組織インプラントに対する異種間応答不適合の可能性を最小限に抑えるため、胸腺欠損（ヌード）ラットにおいて行う。自然な状態では骨を含まない部位であるため、後肢筋肉内部位を、異所的骨誘導特性の初期測定に使用する。
【００９７】
雌ホモ接合性ｒｎｕ／ｒｎｕラット（５０〜７５ｇの範囲）を、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手する。手術前、ラットを１週間、馴化の目的で収容する。本研究調査を通して滅菌マイクロアイソレーターケージを使用し、滅菌水および齧歯類試料を随意に摂取させる。
【００９８】
インプラントの設置：３０匹のラットの各後肢において、単一の筋肉内（ＩＭ）部位を使用する。すべての動物に対して共通の陽性対照を提供するため、ラットＤＢＭ粉末の単一の４０ｍｇ試料を各ラットの左胸筋（ＬＰ）筋の筋肉内に配置する。外科手術後、動物には通常の活動を行わせる。
【００９９】
インプラント材料：ＤＢＭおよび試験材料を室温で維持する。試料を、７、１４および２８日間の移植時間で試験する。ＤＢＭ粉末の試料を１００μＬの滅菌ＡＬＬＯＰＲＥＰＴＭ（Ｏｓｔｅｔｏｔｅｃｈ，Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ，ＮＪ）で再水和する。試料の各々を、１ｍＬ容ブラントカット（ｂｌｕｎｔ ｃｕｔ）シリンジ内に封入する。移植は、１匹の動物が２つの同じインプラントを受容しないように無作為化する。
【０１００】
麻酔：ラットは、ケタミン（２００ｍｇ）、キシラジン（４００ｍｇ）および生理食塩水（１０ｍＬ）の混合物で麻酔する。投薬量は３．５ｍＬ／ｋｇ体重であり、腹腔内に投与する。
【０１０１】
手順：無菌的外科手術を、層流フード内で行う。１ｃｍの皮膚切開部を、側方アプローチを用いて各上後肢上に作製し、皮膚を筋肉から鈍的切開により分離する。表在切開部が筋肉面に沿って並んでいることにより、はさみの先端の挿入が可能である。鈍的切開を、このラインから筋肉深部内へと行い、インプラントされた材料を保持するためのポケットを作出する。一針の縫合を加え、筋肉のポケットを閉じ、皮膚を金属クリップで閉じる。
【０１０２】
左胸筋筋肉内への試験片の移植は、胸部上の１ｃｍの皮膚切開部の作製、ポケット作出のための筋肉の鈍的切開、およびブラントシリンジを用いたラットＤＢＭ粉末の配置を伴う。一針の縫合を加え、筋肉のポケットを閉じ、皮膚を金属クリップで閉じる。
【０１０３】
ラットを、所定の移植時間後ＣＯ２で安楽死させる。インプラント材料は、触知（ｐａｌｐｉｔａｔｉｏｎ）によって位置確認し、鈍的切開によって取り出し、注意深いトリミングによって周囲組織を除く。インプラントの型を知らない観察者が、インプラント材料の肉眼評価を行った。色、血管分布像、硬度および統合性を、以下の表に概要示すスキームに従ってスコアリングする。（最も強い応答の最高スコアは４であり得、一方、骨誘導性潜在性をほとんど、または全く示さない試験片は０とスコアリングされ得る）。このモデルを用いた実験（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ）は、測定目盛りの両末端でのみ、インプラント性能の目視観察と組織学的観察との間の高度な相関性を示した。
【０１０４】
【表１】
組織学検査：取り出した材料を、中性緩衝ホルマリン中に固定する。ホルマリン中に固定後、試料を１０％ギ酸中で石灰質除去し、等級品アルコール中で脱水し、ＪＢ−４（グリコールメタクリレート、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）内に包埋し、細分する。５ミクロンの切片を、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡使用により評価する。
【０１０５】
これらの外植片を、半定量的方法を用いて組織学的に評価する。簡単には、５段階の基準に基づく数値スコアを、各切片の小塊に対して割り当てる。４＝７５％より多くが新しい骨形成に関与；３＝５１〜７５％が新しい骨形成に関与；２＝２６〜５０％が新しい骨形成に関与；１＝外植片の１〜２５％が新しい骨形成に関与；および０＝軟骨内骨形成のプロセス（例えば、軟骨または軟骨細胞、活性な骨芽細胞、類骨、新しく形成および石灰化された骨、および／または髄および関連する脂肪細胞の存在）の痕跡なし。
【０１０６】
【表２】
組織学的解析後、各材料型の平均スコアを計算する。この動物モデルでの以前の実験に基づき、各群を、平均組織学的スコアによって骨誘導性潜在性を評価する。
【０１０７】
実施例５：ウサギモデルにおける骨誘導
５５匹の雄Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギを３つの処置群に割り当てる。被験物質は、本明細書に記載のようにして調製した。低用量処置群群（ｎ＝２０）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの試験物質を、右傍脊椎筋内に、プロトコルに指定された手順に従って与える。高用量処置群（ｎ＝２０）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの試験物質を右傍脊椎筋内に、および７．０ｍＬの試験物質を胸部背面領域の両側の皮下組織に与える。対照処置群（ｎ＝１５）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの対照物質（再水和されたＤＢＭ粉末）を右傍脊椎筋内にインプラントする。移植の７、１４および２８日後、低用量処置群および高用量処置群から４匹の動物、対照群から３匹の動物を、人道的に致死させる。移植６０日後、残りの動物を致死させる（低用量処置群および高用量処置群から８匹の動物および対照処置群から６匹）。インプラント部位を各ウサギから回収し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に固定する。移植試験後６０日の間をあけた試験インプラント部位および対照インプラント部位を、充分なホルマリン固定後、石灰質除去溶液中に３日間入れる。すべての組織試料は、標準的な組織学的手法を用いて処理し、５μｍの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【０１０８】
実施例６：最終滅菌
この実施例では、本発明の調製物の骨誘導性低下を最小限にする最終滅菌方法を記載する。
【０１０９】
本発明のＤＢＭ調製物は、無菌室環境内で、ヒト組織から作製する。完成品インプラントは、個別のトレイパッケージ内に入れる。
【０１１０】
各トレイを、Ａｕｄｉｏｎｖａｃ密封装置（Ａｕｄｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｂ．Ｖ．，Ｗｅｅｓｐ−Ｈｏｌｌａｎｄ）内に入れ、この装置には、５０／５０水素／アルゴンガスからなるシリンダーを設ける。トレイパッケージを密封し、空気を抜き、再度、ガス混合物を２回充填する。密封後、ガス混合物をトレイパッケージ内に残留させる。
【０１１１】
パッケージングされたインプラントを、次いで、パッケージ密封し、次いで、コバルト６０供給源から１５ ＫＧｙのγ放射線で処理し、インプラント内部の生育微生物数（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を所望のレベルに低下させる。
【０１１２】
実施例７：室温での酸性ＤＢＭの保存
実際の時間での酸性ＤＢＭの安定性を測定するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約５．０）を調製し、室温での保存に供した。１６個の試料をその都度調製し、次いで、ＤＢＭ試料の半数を水和された形態で保存し、一方、他の半数からは、内在する水を凍結乾燥により除去した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、周囲温度および周囲湿度で、移植まで０、５．３、１０．６、２１．３および３１．８週間保存した。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った。組織学的検討の結果、水和状態または凍結乾燥状態で３１．８週間まで保存したＤＢＭ試料の骨誘導性の有意な減少はないことが示された（図７）。このデータは、酸性ＤＢＭが、水和された形態または凍結乾燥された形態のいずれの場合も少なくとも３１．８週間、室温で安定であることを示す。
【０１１３】
【表３】
実施例８：４０℃での酸性ＤＢＭの保存
酸性ＤＢＭの長期安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約５．０）を調製し、加速熟成に供した。１６個の試料をその都度調製した。次いで、ＤＢＭ試料の半数を水和された形態で保存し、一方、他の半数は、内在する水を除去することにより凍結乾燥した状態で保存した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存した。温度の１０℃の上昇が化学反応速度のおよそ２倍の変化をもたらす（Ｑ１０＝２）ことを示すアレニウス反応速度式を適用すると、４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で３年まで保存することに相当し得る。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、凍結乾燥された状態で３年までに相当する間保存したＤＢＭ試料の組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った（加速熟成に基づく）。対照的に、水和された形態で保存したＤＢＭ試料は、同じ時間枠内で、その骨誘導性が約５０％低下した（加速熟成に基づく）（図８）。このデータは、両方の保存方法、すなわち、水和された状態または凍結乾燥された状態では、酸性ＤＢＭの骨誘導性は保持されるが、凍結乾燥した酸性ＤＢＭのほうが、より安定であり、３年まででその骨誘導性を少なくとも７５％保持していることを示す。
【０１１４】
【表４】
実施例９：４０℃での酸性ＤＢＭ＋デンプン担体の保存
デンプン担体を含有する酸性ＤＢＭの安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）および担体（マルトデキストリン、改質デンプンおよび水）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約４．３）を作製し、４０℃の加速熟成に供した。試料をパッケージングし、ホイルパッケージ内に密封した。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行った。８個の試料をその都度調製し、水和された形態で保存した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存した。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。各加速熟成試料は、室温での０、６、１２、２４および３６ヶ月の熟成後にパラレルで解析した実際の時間の試料を有した。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った。組織学的検討の結果、実際の時間で試験した試料と、実際の時間に相当する加速熟成条件との間にはわずかな差があることが示された。このデータは、デンプン担体を含有する酸性ＤＢＭは、３年後、その骨誘導性の７５％より多くで約８０％を保持していることを示す。これはまた、ＤＢＭの実際の時間の熟成との間に相関性があることを実証する。
【０１１５】
【表５】
実施例１０：４０℃での酸性対中性でのＤＢＭの保存
長期安定性を酸性ｐＨのＤＢＭと中性ｐＨのＤＢＭとで比較するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物を作製し、ｐＨを調整し、加速熟成に供する。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行う。各ｐＨの試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存する。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、酸性ＤＢＭが、骨誘導安定性を少なくとも３年間維持しているが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すはずである。
【０１１６】
実施例１１：中性ＤＢＭのヒアルロン酸担体での安定化
ヒアルロン酸担体でｐＨを安定化させた中性ＤＢＭの安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）をヒアルロン酸担体とともに含むか、またはこれを含まない中性ｐＨのＤＢＭを作製し、加速熟成に供する。ヒアルロン酸担体を含む、または含まない８個の試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、２および５．３週間保存する。アレニウス反応速度式を適用すると、４０℃で５．３週間保存することは、室温で、実際の時間でおよそ１年まで保存することに相当する。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、ｐＨが中性のＤＢＭへのヒアルロン酸担体の添加により骨誘導安定性が少なくとも１年またはそれ以上維持されるが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すことが期待される。
【０１１７】
結果：加速温度で５週間後、両方の非安定化ヒアルロン酸含有試料は、その当初の５０％未満の骨誘導性を有した（図３参照）。２つの安定化した試料は、その当初の５０％より多くの活性を有した。すべての試料について、分析回帰解析を行った。この解析から決定された傾き（分解速度）を、以下の表に示す。先の試験で測定した、凍結乾燥状態または水分の存在下のＤＢＭに関する傾きを、比較の目的で表に含める
【０１１８】
【表６】
実施例１２：中性ＤＢＭのコラーゲン担体での安定化
コラーゲン担体の添加によりｐＨを安定化させた中性ＤＢＭ組成物の安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）をコラーゲン担体とともに含むか、またはこれを含まない中性ｐＨのＤＢＭを作製し、加速熟成に供する。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行う。コラーゲン担体を含む、または含まない試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存する。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、ｐＨが中性のＤＢＭへのコラーゲン担体の添加により骨誘導安定性が少なくとも３年またはそれ以上維持されるが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すはずである。
【０１１９】
実施例１３：脂質で安定化されたＤＢＭＳの調製
既知量のレシチンを、既知容量の７０％または１００％エタノール中で可溶化する。例えば、４．５ｇ、２．２５ｇまたは１．１２５ｇのレシチンを、１３．５ｍＬのエタノールに溶解する。得られたレシチン含有エタノール混合物は、任意選択で、０．２ミクロンフィルターで濾過してもよい。レシチン／アルコール混合物を、次いで、ＤＢＭ（４．５ ｇ）に添加し、この物質を基質に３０分間浸透させる。この物質を、次いで、凍結および凍結乾燥する。次いで、レシチン／ＤＢＭ組成物を、骨置換材料の製剤化に使用し得る。脂質安定化ＤＢＭは、例えば、改善された外観および感触、活性の増強、改善された安定性および貯蔵寿命の延長などの利点を提供し得る。
【０１２０】
実施例１４：ＤＢＭ製剤
ＤＢＭ製剤の調製。ＤＢＭ製剤は、以下の表に記載のようにして調製される。疎水性の脂質をＤＢＭに、適切な溶媒（アセトン、クロロホルムなど）中で添加し、この物質を、水和された担体を添加する前に凍結乾燥する。組織を不可逆なプロテアーゼインヒビターで処理する場合、該プロテアーゼインヒビターは、一般的に、組織の移植前に洗い流すのがよい。デンプンは、ＤＢＭと混合する前に火を通す（水分の存在下でオートクレーブする）のがよい。
【０１２１】
【表７】
安定性試験。試料を耐湿性容器（アルミニウムホイル）内にパッケージングし、３年を超える期間、室温に置く。種々の期間（例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年など）で、パッケージを開封し、試料の骨誘導性を、適切な動物モデル（例えば、胸腺欠損ラット）において測定する。任意の試料の骨誘導安定性は、任意の試料の骨誘導安定性は、試料の骨誘導活性を時間に対してプロットすることにより得られるベストフィット直線の傾きから決定され得る。加速安定性試験は、高温温度（例えば、３７℃または４５℃）で行うのがよく、結果を室温安定性に外挿する。
【０１２２】
骨誘導活性の測定。
骨誘導性活性は、目的のＤＢＭ製剤を胸腺欠損ラットの非骨格部位内にインプラントし、インプラント部位で誘導された新しい骨、軟骨および骨髄の量を評価することにより測定する。骨誘導活性の測定手順は、以前に詳細に報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＴ，Ｄｉｅｇｍａｎｎ ＭＨ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ＮＬ．“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１９９８ Ｄｅｃ；（３５７）：２１９−２８（引用により本明細書に組み込まれる））。
【０１２３】
（他の実施形態）
前述のことは、本発明のある特定の非限定的な好ましい実施形態の説明である。当業者には、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が本記載内容に対して行われ得ることが認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、水和された（湿潤）ＤＢＭおよび乾燥（凍結乾燥された）ＤＢＭ組成物の室温での骨誘導性の比較である。
【図２】図２は、４０℃で熟成を加速した、水和された（湿潤）ＤＢＭ組成物および乾燥（凍結乾燥）ＤＢＭ組成物の骨誘導性の比較である。
【図３】図３は、５週間温度加速すると、両方の非安定化ヒアルロン酸含有試料は、その最初の骨誘導性の５０％以下を有した。この２種類の安定化試料は、その最初の活性の５０％より大きかった。すべての試料について、分析回帰解析を行った。この解析から決定された傾き（分解速度）を、実施例１１の表に示す。先の試験で測定した、凍結乾燥状態または水分の存在下のＤＢＭに関する傾きを、比較の目的で表に含める。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年１月２７日に出願された米国特許仮出願番号６０／５３９，５５５号（これは、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる）に３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
傷害、疾患、創傷、手術などによって引き起こされる骨欠損の迅速かつ有効な修復は、長い間、整形外科手術の目標とされている。この目的に対し、いくつかの組成物および材料が、骨欠損の修復における使用のために使用または提案されている。このような組成物および材料の生物学的、物理的および機械的特性は特に、種々の整形外科適用用途におけるその適合性および性能に影響する主な要因である。
【０００３】
自己海綿質（「ＡＣＢ」）は、骨移植片のゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）と考えられている。ＡＣＢは、骨誘導性で非免疫原性であり、定義上、特定のレシピエントに適した適切な構造的および機能的特徴のすべてを有する。残念ながら、ＡＣＢは、限定された状況においてしか得られ得ない。一部の個体は、移植に適切な大きさおよび質のＡＣＢを欠く。その上、ドナーサイトモービィディティ（ｄｏｎｏｒ ｓｉｔｅ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）は、患者およびその医師にとって深刻な問題を課し得る。
【０００４】
代替骨移植材料の同定または開発における多大な取り組みがなされている。脱灰骨基質（「ＤＢＭ」）インプラントは、特に有用であることが報告されている（例えば、米国特許第４，３９４，３７０号（特許文献１）；同第４，４４０，７５０号（特許文献２）；同第４，４８５，０９７号（特許文献３）；同第４，６７８，４７０号（特許文献４）および；同第４，７４３，２５９号（特許文献５）；Ｍｕｌｌｉｋｅｎら，Ｃａｌｃｉｆ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．３３：７１，１９８１（非特許文献１）；Ｎｅｉｇｅｌら，Ｏｐｔｈａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２：１０８，１９９６（非特許文献２）；Ｗｈｉｔｅｍａｎら，Ｊ．Ｈａｎｄ．Ｓｕｒｇ．１８Ｂ：４８７，１９９３（非特許文献３）；Ｘｉａｏｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２９３：３６０，１９９３（非特許文献４）（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）参照のこと）。脱灰骨基質は、典型的には、解剖用死体から得る。骨を、無菌的に取り出す、および／または処理してあらゆる感染性因子を死滅させる。次いで、骨を、ミリングまたは磨砕することにより微粒子状にし、次いで、無機成分を抽出する（例えば、骨を酸性溶液中に浸漬させることにより）。残留した基質は、展性（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）であり、レシピエントの特定部位内への移植のために、さらに処理および／または整形および成形し得る。このようにして作製された脱灰骨は、さまざまな成分（タンパク質、糖タンパク質、成長因子およびプロテオグリカンが挙げられる）を含有する。移植後、ＤＢＭの存在が、傷害部位に対して細胞漸増を誘導する。漸増された細胞は、最終的に、骨形成性細胞に分化し得る。細胞のかかる漸増は、創傷治癒速度の増加をもたらし、したがって、より速い患者の回復をもたらす。ＤＢＭ内の活性因子の存在に加え、ＤＢＭインプラントの全体構造もまた、インプラントの骨治癒能力に寄与すると考えられている。
【０００５】
現在のＤＢＭ製剤は、種々の欠点を有する。第１に、ＤＢＭのコラーゲン系基質は比較的安定しているが、ＤＢＭ基質内の活性因子が急速に分解される。ＤＢＭの骨形成活性は、移植後２４時間以内にかなり分解され得、場合によっては、骨形成活性が６時間以内に不活化され得る。したがって、ＤＢＭと会合する因子は、移植後、短時間の間でしか傷害部位への細胞の漸増に利用可能でない。治癒プロセス（数週間から数ヶ月かかり得る）の多くでは、インプラントされた材料は、細胞の漸増を全くまたは殆ど補助し得ない。第２に、現在のＤＢＭ製剤は、ＤＢＭ製剤内に存在する分解性酵素のため、貯蔵寿命が限定されている。
【特許文献１】米国特許第４，３９４，３７０号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４４０，７５０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，４８５，０９７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６７８，４７０号明細書
【特許文献５】米国特許第４，７４３，２５９号明細書
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｋｅｎら，Ｃａｌｃｉｆ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．３３：７１，１９８１
【非特許文献２】Ｎｅｉｇｅｌら，Ｏｐｔｈａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２：１０８，１９９６
【非特許文献３】Ｗｈｉｔｅｍａｎら，Ｊ．Ｈａｎｄ．Ｓｕｒｇ．１８Ｂ：４８７，１９９３
【非特許文献４】Ｘｉａｏｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２９３：３６０，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より大きな、および／またはより長期の骨誘導活性を有する改善された骨移植材料を開発する必要性がある。このような改善された製剤はまた、現在の製剤よりも長期の貯蔵寿命を有するはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(発明の概要)
本発明は、安定化された脱灰骨基質（「ＤＢＭ」）組成物、本発明の組成物を調製および使用するための関連する方法、および本発明の組成物を含むキットを提供する。ＤＢＭに内在する酵素（例えば、プロテアーゼ）による骨誘導剤の分解に鑑み、本発明は、骨誘導剤に対する内在酵素の活性を、（１）ＤＢＭ組成物のｐＨを低減させること；（２）ＤＢＭ組成物から水分を除去し、任意選択で、脱水されたＤＢＭ粒子をコートして水分が再水和しないようにすること；（３）ＤＢＭ組成物中の重水の濃度を増加させること；（４）プロテアーゼインヒビターをＤＢＭ組成物に添加すること；（５）水代替物をＤＢＭ組成物を添加すること；および／または（６）ＤＢＭ内の骨誘導性因子を共有結合により修飾することにより低下させたＤＢＭ組成物を提供する。安定化されたＤＢＭ組成物のＤＢＭは、任意の形態、例えば、繊維、平板、粒子（例えば、立方形、球形、円錐形、くさび形、不定形粒子など）、糸、ゲルなどで提供され得る。これらの上記のストラテジーの１つ以上を用いて、所望の貯蔵寿命を有する、例えば、室温で１年後、最初の骨誘導活性の少なくとも９０％が残存するＤＢＭ組成物が調製され得る。
【０００８】
１つの態様において、本発明のＤＢＭ組成物のｐＨを低下させ、本発明のＤＢＭ組成物の酸性環境は、ＤＢＭ組成物内の骨誘導性因子のタンパク質分解を減速させ、より長期の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物がもたらされる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２、３、４、５または６）を有するＤＢＭ組成物は、生理的ｐＨのＤＢＭ組成物と比べた場合、増大した安定性を有する。ある特定の好ましい実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、室温での保存の６ヶ月または１年後、その最初の骨誘導性の７５％より多くを保持している。この延長された貯蔵寿命は、ＤＢＭ組成物をより低温（例えば、４℃など）で保存することにより、さらに延長され得る。酸性化したＤＢＭ組成物の生物学的活性は、組成物へのプロテアーゼインヒビターの添加（米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）および／または水代替物、例えば、重水（Ｄ２Ｏ）、ＤＭＳＯおよびポリオール（例えば、グリセロール）の添加によってさらに安定化され得る。加えて、酸性化したＤＢＭ組成物は、安定化剤、例えば、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものなど（例えば、タンパク質、ポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、糖類、アミノ酸、脂質など）の添加によってさらに安定化され得る。
【０００９】
骨誘導性を担うＤＢＭ内の因子は、特に、水和されたＤＢＭ組成物では、ＤＢＭ内に見られる内在酵素による分解を受けやすい。したがって、ＤＢＭ組成物は、凍結乾燥することにより、部分的または完全に脱水された形態で保存するのがよい。凍結乾燥された形態では、ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、該組成物を室温で保存した場合であっても安定である。この安定化効果は、ＤＢＭ組成物より低温で保存することによりさらに増大され得る。ＤＢＭ組成物の凍結乾燥は、酸性化したＤＢＭ組成物ならびに糖類、ポリマー、脂質、水代替物（例えば、ポリオールおよび重水など）を有するが、またはプロテアーゼインヒビターが添加されたＤＢＭ組成物において行われ得る。
【００１０】
重水（Ｄ２Ｏ）、グリセロール、流動性ポリマー、流動性脂質またはポリオールなどの水代替物もまた、その生物学的活性を担うＤＢＭ内の因子の分解を低減するために使用され得る。例えば、重水（Ｄ２Ｏ）の添加は、ＤＢＭ組成物内に見られる骨誘導因子の分解に関与する酵素を抑制することがわかっている。ＤＢＭ組成物内のＤ２Ｏ含量を増加させることにより、酵素の分化が抑制され、ＤＢＭ組成物は、より長期の貯蔵寿命を有する。本発明のＤＢＭ組成物内のＤ２Ｏの濃度は、５％〜９８％まで、好ましくは、１０％〜８０％、より好ましくは、２０％〜７５％の範囲であり得る。Ｄ２Ｏの安定化効果は、ＤＢＭ組成物の酸性化、該組成物の脱水、プロテアーゼインヒビターの添加、ポリマーの添加、脂質の添加および／または他の水代替物の添加と組合せ得る。
【００１１】
本発明のＤＢＭ組成物は、ＤＢＭを安定化剤（例えば、タンパク質、ポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、糖類、アミノ酸、脂質など）でカプセル化することにより、さらに安定化させ得る。水和の前、水和間または水和後でのＤＢＭのカプセル化または流動性担体のＤＢＭへの添加は、ＤＢＭ組成物内の骨誘導性因子のタンパク質分解を減速させ、より長期の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物をもたらす。乾燥ＤＢＭ内の粒子は、コート、カプセル化、あるいは脂質または他の薬剤（例えば、ポリマー）と会合させ、骨誘導剤が水分の存在下で分解させるのを保護する。例えば、ＤＢＭを脱水し、次いで、脂質またはポリマーでコートして水分がＤＢＭに再水和するのを防止し得る。これにより、水または別の担体をＤＢＭ組成物に、安定性を低下させることなく補助（ｂａｃｋ）添加することが可能になる。所望の粘稠度および取り扱い特性を有する組成物を生成させるために、水性担体または水を添加してもよい。ＤＢＭ内の粒子（これは、脂質またはポリマーで処理する）の割合は、１０％〜１００％までの範囲である。該薬剤の安定化効果は、ＤＢＭ組成物の酸性化、プロテアーゼインヒビターの添加および／または水代替物（例えば、重水（Ｄ２Ｏ））の添加によってさらに増強させ得る。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の安定化されたＤＢＭ組成物の調製方法を提供する。例えば、本発明は、６ヶ月、１年、２年、３年、５年または１０年の貯蔵寿命を有するＤＢＭ組成物の配合方法を提供する。１つの実施形態では、本発明のＤＢＭ組成物のｐＨを、ＤＢＭを、所望の酸性ｐＨの溶液中ですすぐか、または浸すことにより低下させる。任意選択で、酸性化したＤＢＭ組成物を、凍結乾燥し、該組成物中の水分含量を低下させてもよい。重水、他の水代替物、または脂質およびポリマーなどの薬剤を、調製プロセス中に本発明のＤＢＭ組成物に添加し、さらに安定化させ、骨誘導剤の分解を防止し得る。ある特定の実施形態では、該組成物を流動性にするため、担体を用いて調製する。
【００１３】
本発明はまた、本発明のＤＢＭ組成物を調製および使用するためのキットを提供する。該キットは、本発明のＤＢＭ組成物を用いて骨欠損を処置するために使用され得る。例えば、ＤＢＭ組成物は、ペーストとして、臨床設定における使用のための送達用デバイス（例えば、シリンジなど）にて提供され得る。ＤＢＭ組成物は、好ましくは、該組成物の使用を容易にするために流動性である。好ましくは、ＤＢＭ組成物は、滅菌または無菌条件下（例えば、手術室内）で適用され得るように、滅菌されており、パッケージングされる。
【００１４】
本発明は、さらに、ＤＢＭ組成物を特徴付けるため、および改善された特性を有するＤＢＭ含有組成物を同定および調製するためのシステムを提供する。例えば、本発明は、ＤＢＭ組成物の骨誘導性を評価する方法を提供する。本発明はまた、ＤＢＭ組成物の貯蔵寿命の測定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（定義）
酸性または酸性化：酸性または酸性化したＤＢＭまたはＤＢＭ組成物は、該基質のｐＨを生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）未満に低減させた任意の組成物である。酸性化は、当該技術分野で知られた任意の方法（例えば、ＤＢＭを酸性溶液（例えば、ＨＣｌ、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、カルボン酸などの溶液）中での浸漬またはすすぎ）を用いて成され得る。他の実施形態では、緩衝溶液をＤＢＭの酸性化に使用してもよい。好ましくは、浸漬またはすすぎは、ＤＢＭ粒子内部、好ましくは実質的に粒子全体で所望の低ｐＨを達成するため、充分に行う。ある特定の好ましい実施形態では、ｐＨは、２〜６に低下させる。より好ましくは、ＤＢＭのｐＨは、３〜４である。他の実施形態では、所望の低ｐＨは、およそ６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５または１である。
【００１６】
と会合している：安定化剤、標的化剤または他の化学的存在物（ｅｎｔｉｔｙ）は、インプラントの骨誘導性、安定性または他の特性に有意に影響する（例えば、組成物の骨誘導性スコアが増加する）のに充分長期間、インプラントによって保持されている場合、本発明によるＤＢＭまたは他の骨形成基質と会合している。具体例としては、１）体液でシミュレーションしたインビトロ拡散アッセイで測定したとき、ＤＢＭから自由に拡散可能でないこと；および／または２）溶液中に遊離している場合と比べ、延長されたＤＢＭの半減期を有すること（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％長い）が挙げられる。一部の実施形態では、会合は、共有結合性であり、他の実施形態では、非共有結合性である。非共有結合性相互作用の例としては、物理的包埋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、π−πスタッキングおよびファン・デル・ワールス相互作用が挙げられる。例えば、生物活性剤を、該基質からの生物活性剤の拡散を制限するポリマー系安定化剤によって、ＤＢＭまたは他の本発明の基質と会合させてもよい。あるいはまたさらに、生物活性剤を、自身がＤＢＭと会合した１種類以上の存在物との物理的相互作用によって、ＤＢＭ会合させてもよい。
【００１７】
生体適合性：生体適合性という用語は、本発明で用いる場合、インビボでの投与時、長期間の望ましくない効果を誘導しない材料を示すことが意図される。
【００１８】
生分解性：本明細書で使用する場合、生分解性材料は、生理学的条件下で分解され、器官に損傷を与えることなく代謝または排泄され得る生成物を形成する材料である。生分解性材料は、必ずしも加水分解により分解可能なものではなく、完全に分解するのに酵素的作用を必要とし得る。また、生分解性材料には、細胞内で分解される材料も含まれる。
【００１９】
脱灰骨活性は、脱灰骨の骨誘導性および／または骨伝導性活性をいう。
【００２０】
脱灰骨基質は、本発明で用いる場合、骨生組織から無機成分物質を除去して作製した任意の材料をいう。好ましい実施形態では、ＤＢＭ組成物は、本発明で用いる場合、重量基準で、５％未満のカルシウム、好ましくは１％カルシウム未満を含有する調製物を含む。部分脱灰骨（例えば、重量基準で５％より多いカルシウムを有するが、最初の当初の量の１００％未満のカルシウムを含有する調製物）もまた、本発明の範囲内とみなす。
【００２１】
拡散バリアは、バリアの一方の側面から他方の側面へ、より具体的には、外側から内側へ（またはその逆）の物質の拡散速度を低減させる任意の材料、コーティング、皮膜または物質をいう。ある特定の実施形態の拡散バリアは、活性化剤（例えば、水、酵素など）および／または分解性酵素のＤＢＭ組成物内への拡散を防止するポリマーであり得、タンパク質、多糖類、セルロース、人工ポリマー、ＰＬＧＡなどが挙げられる。拡散バリアはまた、骨誘導性因子がＤＢＭ組成物の外部に移動するのを防止し得る。ある特定の実施形態では、拡散バリアは生分解性であり、長期間にわたって骨誘導性因子の分解、活性化または放出をもたらす。他の実施形態では、拡散バリアは、断片的および／または局部的に分解し、該組成物のある特定の領域内で放出速度を制御するものであり得る。ＤＢＭ組成物を安定化するのに有用な拡散バリアのより詳細な記述については、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願）；米国特許出願第６０／３９２，４６２号（２００２年６月２７日に出願）；および米国特許出願第６０／３２９，１５６号（２００１年１０月１２日に出願）（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００２２】
基質は、本発明で用いる場合、インプラント部位への送達のために少なくとも１種類の成長因子と会合することができる天然または合成の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）をいう。基質は、完全に不溶性であってもよく、移植後、ゆっくりと可溶化されるものであってもよい。移植後、好ましい基質は、ゆっくりと再吸収または分解され、少なくとも１〜７日間、最も好ましくは２ないし４週間またはより長期間、しばしば６０日間より長期間、実質的に元の状態が続く。成長因子は、ほとんどの脱灰骨がそうであるように、基質内に内因的に存在するものであってもよく、基質に外添されてもよい。また、基質は、内在成長因子と外来成長因子の組合せも含み得る。基質は、微粒子状または繊維状の形態であり得、またはモノリシックであり得る。基質は、いくつかの材料を含んでいてもよく、繊維と粒子などの組合せの形態であってもよい。好ましい１つの実施形態では、基質は熱圧縮脱灰骨繊維から構成される。他の実施形態では、基質は、再吸収性可塑性ポリマー、例えば、拡散バリアとしての使用に好適であるとして以下に記載するものを含む。ある特定の実施形態では、該ポリマーは、剛性を本発明の組成物に付与する。他の好ましい実施形態では、微粒子状の非晶質リン酸カルシウムを、吸着された成長因子、例えば、ＢＭＰ（より具体的には、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその誘導体）と会合した基質として使用する。外来成長因子の添加を必要とするさらに他の基質の実施形態としては、限定されないが、微粒子状セラミックス、好ましくは、硫酸カルシウムまたはリン酸カルシウムが挙げられる。最も好ましい基質はリン酸カルシウムであり、その調製は、当該技術分野において実務担当者によく知られている（例えば、Ｄｒｉｅｓｓｅｎｓら“Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｏｎｅ ｃｅｍｅｎｔｓ”Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｌ．編．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ；Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐａｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９４（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。また、好都合なのは、沈降性リン酸カルシウム調製物、例えば、α−ＢＳＭ（ＥＴＥＸ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）である。リン酸カルシウム基質としては、限定されないが、リン酸二カルシウム二水和物、モネタイト、リン酸三カルシウム，リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ナノ結晶性ヒドロキシアパタイト、（ｐｏｏｒｌｙ）微結晶性ヒドロキシアパタイト、置換ヒドロキシアパタイトおよびカルシウム欠損ヒドロキシアパタイトが挙げられる。
【００２３】
骨誘導性は、本発明で用いる場合、骨形成を促進することができる特質をいう。動物の軟組織内に胃所性の骨の形成を誘導し得る任意の材料を骨誘導性とみなす。例えば、ほとんどの骨誘導性材料は、Ｅｄｗａｒｄｓらの方法（“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐｅａｄｉｃｓ ＆ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，３５７：２１９−２２８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８（引用により本明細書に組み込まれる））に従ってアッセイした場合、胸腺欠損ラットにおいて骨形成を誘導する。場合によっては、骨誘導性は、細胞漸増および漸増した細胞の骨形成表現型への誘導を介して起こると考えられる。また、骨誘導性は、組織培養物において、培養細胞（初代、二次または外植片）に骨形成表現型を誘導する能力として測定され得る。組織培養方法を、Ｚｈａｎｇら“Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ” Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６８（１１）：１０７６−８４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９７（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようなインビボの胃所性の骨形成アッセイで較正することが推奨される。証明されたインビボ胃所性骨形成モデルに対するインビトロアッセイの較正は、化合物が組織培養物において明白な「骨形成」表現型を誘導する能力が、新しい骨形成のインビボ誘導と常に相関し得ないため、必須である。ＢＭＰ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および血管由来因子は、細胞を髄または血管周囲腔から傷害部位に漸増させ、次いで、これらの漸増した細胞の、骨形成を担う細胞株への分化を引き起こすことわかっている骨誘導性因子のほんの一部である。骨または象牙質のいずれかから単離されたＤＢＭは、ともに、骨誘導性材料であることがわかっている（Ｒａｙら，“Ｂｏｎｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ”Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ３９Ａ：１１１９，１９５７；Ｕｒｉｓｔ， “Ｂｏｎｅ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０：８９３， １９６５（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））。
【００２４】
骨誘導性スコアは、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９８）の方法または同等の較正された試験にしたがって測定したときの０〜４の範囲のスコアをいう。Ｅｄｗａｒｄｓらの方法では、スコア「０」は、新しい骨形成なしを表し、「１」は、インプラントの１％〜２５％が新しい骨形成に関与していることを表し、「２」は、インプラントの２６〜５０％が新しい骨形成に関与していることを表し、「３」は、インプラント５１％〜７５％が新しい骨形成に関与していることを表し、「４」は、インプラントの＞７５％が新しい骨形成に関与していることを表す。ほとんどの場合において、スコアは、移植の２８日後に評価する。しかしながら、改善された本発明の製剤、特に、ＢＭＰに匹敵する骨誘導性を有するものでは、骨誘導性スコアを、より早い時点、例えば、移植の７、１４または２１日後などに得てもよい。このような場合では、通常のＤＢＭ対照（例えば、担体を有しないＤＢＭ粉末）、可能であれば、陽性対照（例えば、ＢＭＰなど）を含めることが重要である。ときには、骨誘導性はまた、もっと後の時点、例えば、移植の４０、６０日後など、または１００日後にさえスコアリングされ得る。骨誘導性の割合は、所与の時点での骨誘導性スコアであって、特定の参照スコアの活性の割合で示されるものをいう。あるいはまた、脱灰骨基質の骨誘導活性のための定量的で感度のよいインビトロアッセイを、脱灰骨基質（ＤＢＭ）の骨形成潜在性を確認するために使用する。ＤＢＭ内に存在する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の骨誘導性は、多能性筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞株を用い、インビトロで測定され得る。ＤＢＭのＣ２Ｃ１２細胞とのコインキュベーションによって誘導されるアルカリホスファターゼ活性は、用量応答性であり、ＤＢＭ内の活性なＢＭＰの量に相当する。骨形成潜在性を、ヌードラットにＤＢＭを筋肉内にインプラントすることにより、インビボで同時に試験した。Ｃ２Ｃ１２細胞内に誘導されたアルカリホスファターゼ活性は、インビボ骨形成（ｒ＝０．８８、アルカリホスファターゼ活性によって測定）、石灰化密度およびＤＢＭ外植片の組織形態と相関した。ＤＢＭバッチ（５つの確立された骨バンク由来）の結果は、インビトロアッセイとインビボアッセイ間の充分な一致を示した。しかしながら、ＤＢＭ活性は、バンク間および同じバンク内のバッチ間で大きく異なった（Ｈａｎら Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２１（４）：６４８−５４（２００３年７月）（引用により本明細書に組み込まれる））。
【００２５】
粒子または繊維は、ミリング、磨砕、粉砕、あるいは縮分して微粒子状形態にしたＤＢＭ、ＤＢＭ組成物または骨試料の調製物をいう。粒子または繊維の大きさは、典型的には、５０ミクロンより大きく、好ましくは７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、最も好ましくは１５０ミクロンより大きい。これらの大きさは、より球形状粒子については平均粒径を指し、他の形状の粒子では、特に記載のない限り、粒子の最小断面の寸法を指す。ある特定の実施形態では、組成物は、さらに大きい粒子、好ましくは、その最大寸法が１ｍｍより大きい、１．５ｍｍより大きい、または最も好ましくは２ｍｍより大きい粒子を含み得る。粒子または繊維は、任意の形状であり得、くさび形、桿形、球形、立方形、円板形、長円形、コイル状、二重らせん状、不定形状などが挙げられる。例えば、ある特定の実施形態では、粒子は、楔形形状であり得、その最大寸法がおよそ２ｍｍであり得、別の寸法では、１００ミクロン以下であり得る。粒子または繊維は、特定の大きさの粒子を回収するために篩分けするか、または分取してもよい。これらの粒子または繊維は、溶液、スラリー、変形可能な固体または液体と混合し、ＤＢＭ、本発明のＤＢＭ組成物または骨試料の移植片の投与または適用において使用されるペーストを形成してもよい。粒子または繊維の調製の好ましい方法は、発行済みの米国特許第５，６０７，２６９号；同第５，２３６，４５６号；同第５，２８４，６５５号；同第５，３１４，４７６号；および同第５，５０７，８１３号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００２６】
ポリオールは、繰り返し単位１つあたり少なくとも１個のヒドロキシル基を有する任意のポリマーをいう。場合によっては、ポリオールは、繰り返し単位１つあたり２個、３個、４個またはそれ以上のヒドロキシル基を有する。ポリオールは、天然または非天然のポリマーであり得る。天然ポリオールとしては、多糖類が挙げられる。非天然ポリオールとしては、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。ポリオールの例としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エリスリトール、水添デンプン加水分解物（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリオールは、ＤＢＭ組成物において水代替物として使用される。
【００２７】
多糖は、本発明で用いる場合、炭水化物残基の任意のポリマーまたはオリゴマーをいう。ポリマーは、２つから数百〜数千の糖単位のいずれの場合からなるものであり得る。多糖類は、天然供給源（例えば、植物など）から精製したものであってもよく、研究室で新たに合成したものであってもよい。天然供給源から単離された多糖類は、化学的に改質してその化学的または物理的特性を変化させてもよい（例えば、リン酸化、架橋）。多糖類はまた、直鎖または分枝鎖のいずれかであり得る。これらは、いずれも、天然および／または非天然の炭水化物残基を含有し得る。残基間の結合は、典型的には、天然に見られる結合、または合成化学者によってのみ得られ得る結合のいずれかであり得る。多糖類の例としては、セルロース、マルチン（ｍａｌｔｉｎ）、マルトース、デンプン、改質デンプン、デキストランおよびフルクトースが挙げられる。グリコサミノグリカンもまた多糖類とみなす。糖アルコールは、本発明で用いる場合、任意のポリオール、例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ガラクチトール、エリスリトール、イノシトール、リビトール、ズルシトール、アドニトール、アラビトール、ジチオエリスリトール、ジチオトレイトール、グリセロール、イソマルトおよび水添デンプン加水分解物などをいう。
【００２８】
プロテアーゼインヒビターは、本発明で用いる場合、タンパク質を切断する酵素（すなわち、プロテアーゼ）の酵素的活性を阻害することができる化合物である。このような化合物によって阻害されるプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（いくつかのマトリックスメタロプロテアーゼインヒビターの例を図６に示す）、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼなどが挙げられる。プロテアーゼインヒビターは、特定のプロテアーゼまたは特定のクラスのプロテアーゼのみを阻害するために特異的に作用するものであってもよく、またはすべてではないがほとんどのプロテアーゼを阻害することにより、より一般的に作用するものであってもよい。好ましいプロテアーゼインヒビターは、タンパク質系またはペプチド系であり、化学薬品会社（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなど）から市販されている。ＤＢＭ（またはリン酸カルシウムまたはセラミックス担体）に付着するタンパク質系またはペプチド系インヒビターは、自由に拡散可能なインヒビターよりもより長期間、基質と会合して安定化効果を提供する状態が続くため特に好ましい。プロテアーゼインヒビターの例としては、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチン（ｄｉｐｒｏｔｉｎ）Ａ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン（ｆｏｒｏｘｙｍｉｔｈｉｎｅ）、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン（ｐｈｅｂｅｓｔｉｎ）、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＧＴＡナトリウムおよびＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。
【００２９】
ペプチドまたはタンパク質は、本発明によれば、互いにペプチド結合で連結された一連の少なくとも２個のアミノ酸を含む。本発明のペプチドは、好ましくは、天然アミノ酸のみを含有するが、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物）および／または当該技術分野で知られたアミノ酸アナログを、代替的に用いてもよい。また、本発明のペプチド内のアミノ酸の１種類以上を、例えば、化学的存在物、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの付加によって修飾してもよい。
【００３０】
安定化剤は、ＤＢＭおよび／または成長因子を含む本発明の組成物中に含めると、特定の参照試料と対照させて測定した場合、該組成物の骨誘導活性の寿命を保持または延長する任意の化学的存在物である。ほとんどの場合、参照試料は、安定化剤を含有しないが、すべての他の点で、安定化剤を含有する組成物と同じである。また、安定化剤は、一般的に、自身として骨誘導性をほとんどまたは全く持たず、安定化剤を欠く以外は同一組成物と比べ、本発明の組成物内の活性存在物の１種類以上の半減期を増大させるかのいずれかにより功を奏する。他の実施形態では、安定化剤は、内在プロテアーゼまたは糖分解性酵素の活性を阻害する化合物であり得る。好ましい実施形態では、安定化剤は、１種類以上の活性因子を分解することが知られた酵素の１種類以上の接近を遅滞させる。半減期は、基質に付着しているか、または基質から抽出されたいずれかの特定の因子の免疫学的または酵素的アッセイによって測定され得る。あるいはまた、骨誘導性の半減期の増大の測定、または骨誘導性プロセスの生成物（例えば、骨、軟骨または骨形成原細胞、軟骨形成と関連する生成物またはその指標（例えば、遺伝子発現レベルなど））の出現の増強の測定は、増強された骨誘導性基質組成物に対する安定化効果の有用な指標となる。延長または増強された骨誘導性応答の測定は、一般的に、因子の安定性の増大を示す。ＤＢＭ組成物の安定化に有用な安定化剤のより詳細な記述については、米国特許出願第１０／２７１，１４０号（２００２年１０月１５日に出願）；米国特許出願第６０／３９２，４６２号（２００２年６月２７日に出願）；および米国特許出願第６０／３２９，１５６号（２００１年１０月１２日に出願（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００３１】
安定化手段は、室温または加速条件下のいずれかで測定したとき、その貯蔵寿命安定性を改善する製剤化の任意の操作をいう。本発明のＤＢＭ組成物に好ましい安定化手段としては、保存中、生物学的活性の分解を促進する水分の利用可能性の制限、低減または削減、熱力学的安定化剤（例えば、ポリオール）の添加、およびプロテアーゼインヒビターの使用が挙げられる。
【００３２】
水代替物は、ＤＢＭ組成物において水分の代替物としての機能を果たし得る任意の液状または流動性の化学的存在物である。典型的には、これは、所望の取り扱い性をＤＢＭ組成物に提供することを意味する。ある特定の実施形態では、水代替物は、液体または半固体であり得る。水代替物は、典型的には、水分子を模擬するヒドロキシル部分を有する。好ましくは、水代替物は、多数のヒドロキシル基を有する。水代替物の例としては、グリセロール、炭水化物、多糖類，ポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、糖タンパク質、重水（Ｄ２Ｏ）、液状ポリマー、液状脂質などが挙げられる。水代替物は、ＤＢＭ組成物などの水性混合物の粘度を増加させるために添加され得る。水代替物は、ＤＢＭ組成物の水成分の粘度を増加させることにより、または該組成物中に存在する水の活性を減少させることにより、ＤＢＭ組成物を安定化させるために該組成物に添加され得る。
【００３３】
（ある特定の好ましい実施形態の記載）
本明細書に記載するように、本発明は、改善されたＤＢＭ組成物に関する組成物および方法を提供する。以下に、本発明の好ましい実施形態のある特定の態様を、より詳細に、図面の図を参照しながら記載する。当業者には、本発明のさまざまな実施形態または変形型が、以下に具体的に記載しないが、それでも添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内に含まれることが認識されよう。
【００３４】
ＤＢＭは、主に、タンパク質および糖タンパク質から構成され、コラーゲンは、ＤＢＭの主なタンパク質代替物である。コラーゲンは、比較的安定であり、比較的稀なコラーゲナーゼ酵素によってのみ分解されるが、ＤＢＭ内に存在するその他のタンパク質および活性因子は、比較的不安定で、ＤＢＭに内在する酵素または他の不活性化プロセスによる分解を受けやすい。本発明は、ＤＢＭ組成物の骨誘導性を、ＤＢＭ内に存在する骨誘導性因子の分解を遅延させることにより安定化する。本発明はまた、ＤＢＭ組成物内の活性因子のタンパク質溶解性分解を低減することにより、ＤＢＭ組成物の有効な骨誘導性を増大させ得る。
【００３５】
本発明は、宿主由来または内在性のいずれかの酵素による活性因子を分解から保護する数種類のアプローチを提供する。保護される因子は、ＤＢＭ調製物に内在にするもの、またはＤＢＭまたは合成の基質組成物のいずれかに添加された因子であり得る。保護は、ＤＢＭ組成物のｐＨを低下させ、それにより、内在酵素の分解活性を阻害すること；および／またはＤＢＭ調製物においてＤＢＭ内の活性因子を不活化するのに利用され得る水分の量を、化学的または酵素的プロセスによって低減、最小化または削減することによりによりもたらされる。利用可能な水分は、Ｄ２Ｏの濃度を増大させて内在する分解性酵素を阻害すること；および／または水代替物（例えば、グリコール、ポリオール、ヒアルロン酸など）を添加すること；および／または水分拡散バリア添加することにより低減される。加水分解および内在酵素の分解活性を抑制する化学的および／または酵素的インヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター）の添加もまた、本発明の一部とみなされる。水分を本発明の安定化されたＤＢＭ組成物から除去し、該組成物をさらに安定化させてもよい。骨誘導性を長引かせる、または安定化させる他の方法を、本発明の方法と組み合わせて使用してもよい。好ましくは、ＤＢＭ組成物内の活性因子の分解を抑制し、保存後の所望の骨誘導性スコアを得る。ＤＢＭ組成物を安定化させるためのこのようなストラテジーは、室温で１年後、最初の試料の骨誘導性の５０％より多く、一般的には７５％より多く、しばしば９０％より多くが残るようにＤＢＭ組成物の貯蔵寿命を延長するために使用する。
【００３６】
脱灰骨基質
ＤＢＭ調製物は、長年にわたって、骨の形成を促進するための整形外科用医薬において使用されている。例えば、ＤＢＭは、骨折の修復、椎骨の融合、関節置換手術、歯科手術および原因疾患（例えば、慢性関節リウマチなど）による骨破壊の処置における有用性がわかっている。ＤＢＭは、骨誘導プロセスおよび骨誘導プロセスによって、骨形成をインビボで促進すると考えられている。骨伝導は、インプラントされた材料が新しい骨成長の支持体のための骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としての機能を果たす場合に起こる。骨誘導は、骨成長が、大きなまたは「危機的大きさ」の欠損したところ全体、骨治癒が遅々としてしか進行し得ないか、全く進行し得ないところ全体に所望される場合、特に重要である。一般的に、ＤＢＭ調製物の骨伝導性は、インプラントの実際の形状および密着力によってもたらされると考えられる。したがって、絡み合った繊維を含むＤＢＭ組成物は、繊維性が低く、粒状性の高い調製物と比べ、卓越した骨伝導性を有する傾向にある。ＤＢＭ代替物の形状および／または密着力を保存する傾向にある薬剤、担体または賦形剤は、より良好な骨形成特性をもたらし得る。
【００３７】
インプラントされたＤＢＭ組成物の骨誘導性効果は、単離されたコラーゲン系基質上に存在する活性な成長因子の存在に由来すると考えられる。このような因子としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦおよびＢＭＰタンパク質ファミリーに属するものが挙げられる。骨誘導性因子の具体例としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および血管由来因子が挙げられる。他の骨誘導性因子（例えば、オステオカルシンおよびオステオポンチンなど）もまた、同様に、ＤＢＭ調製物中に存在する可能性が高い。また、他の無名または未知の骨誘導性因子も、ＤＢＭ中に固有に存在する可能性が高く、これらは、本明細書に記載する本発明により保護され得る。
【００３８】
任意のさまざまな脱灰骨基質調製物が、本発明の実施において利用され得る。任意の方法によって調製されるＤＢＭが使用され得、微粒子状または繊維系調製物、繊維と微粒子状調製物の混合物， 完全または部分的に脱灰した調製物、完全および部分的に脱灰した調製物の混合物、例えば表面脱灰調製物（Ｇｅｒｔｚｍａｎら（米国特許第６，３２６，０１８号（２００１年１２月４日に発行）（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものなど）が挙げられる。好ましいＤＢＭ組成物は、Ｄｏｗｄら、米国特許第５，５０７，８１３号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、例えば、グリセロール、ポリヒドロキシル化合物、ポリオール、多糖類、グリコサミノグリカンタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、核酸、ポリマー、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、樹脂、クレイ、カルシウム塩および／またはその誘導体などの添加剤または担体を含むＤＢＭ調製物も有用である。ある特定の実施形態では、担体は非グリセロール担体である。他の実施形態では、担体はグリセロールである。脱灰骨基質に添加される担体は、該組成物を安定化し、骨形成因子の分解を防止し得る。例えば、担体は、拡散バリアまたは水代替物としての機能を果たし得る。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物を製剤化するために利用されるＤＢＭ材料は、リン酸カルシウムの５０％より多く、好ましくは７５％より多く、より好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％より多く、最も好ましくは９８％より多くが除去されている。ＤＢＭを作出するのに使用される骨は、生組織または死組織の任意の供給源から得られたものであり得る。多くの場合、骨の供給源は、本発明の組成物の最終的なレシピエントに適合していることが好ましい。少なくとも、ドナーとレシピエントが同じ種であることが多くの場合、望ましいが、異種供給源もなお、許容され得る。
【００４０】
骨試料が得られたら、これを、ミリング、磨砕、粉砕、あるいは縮分して微粒子状形態にする。好ましい実施形態では、粒子は、その最小寸法が７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、より好ましくは１５０ミクロンより大きい。ある特定の実施形態では、該粒子は、最大寸法のところが少なくとも２００ミクロンである。該粒子は、任意の形状であり得、長円形、球形、立方形、円錐形、錐体形、くさび形、コイル状、二重らせん状などが挙げられる。ある特定の実施形態では、該粒子は、その最長寸法のところが２００ミクロンであるくさび形、錐体形または円錐形である。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物には、数種類の異なる大きさおよび／または形状の粒子の混合物が含まれ得る。
【００４１】
微粒子化の後、ＤＢＭを処理し、無機成分を骨から除去する。塩酸は、当該業界で認められた最適な脱灰剤であるが、文献にはＤＢＭ調製のための方法が数多く報告されている（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本発明の目的のため、活性な骨誘導性因子を含有する骨格を提供する任意の材料がＤＢＭとみなされる。ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または当業者が必要以上に実験することなく開発し得る他の方法によって調製され得る。場合によっては、大きな断片または骨全体でさえ脱灰し得、次いで、脱灰後に微粒子状にする。このようにして調製されるＤＢＭは本発明の範囲内である。
【００４２】
改善されたＤＢＭ組成物の調製において、ＤＢＭ成分を、脱灰の前または後に、磨砕あるいは処理して適切な大きさの粒子にしてもよい。ある特定の実施形態では、該粒径は７５ミクロンより大きく、より好ましくは約１００〜約３０００ミクロンの範囲であり、最も好ましくは約２００〜約２０００ミクロンである。ＤＢＭ成分を所望の大きさに磨砕した後、混合物を篩分けし、所望の大きさの粒子を選択してもよい。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ粒子を、５０ミクロン篩、より好ましくは７５ミクロン篩、最も好ましくは１００ミクロン篩で篩分けし得る。
【００４３】
ＤＢＭへの水分の接近を制限するのに特に有用な方法の１つは、ＤＢＭをモノリシック生体吸収性基質内に包埋し、次いで、粒子含有モノリシック基質を、その最小寸法が７０ミクロンより大きい、好ましくは１００ミクロンより大きい、最も好ましくは１５０ミクロンより大きい粒径に細分化することである。小さいＤＢＭ粒子を包埋するために好ましい基質としては、生体適合性ポリマーおよび硬化性リン酸カルシウムセメントが挙げられる。一般的に、微粒子状ＤＢＭ／ポリマーの重量比は、約１：５〜約１：３の範囲である。リン酸カルシウムの場合、ＤＢＭは、２５％〜９０重量％まで、好ましくは５０％〜８０％、より好ましくは６０％〜８０％、最も好ましくはおよそ７５％存在する。モノリスの微粒子化は、慣用のミリングまたは磨砕によって、または低温ミリング（ｃｒｙｏｍｉｌｌｉｎｇ）もしくはミリング後の凍結の使用によりなされ得る。好ましい１つの実施形態では、凍結乾燥された、または脱水されたＤＢＭを、再吸収性ポリマー内に包埋する。第２の好ましい実施形態では、凍結乾燥された、または脱水されたＤＢＭを、当該技術分野で知られた硬化性リン酸カルシウムのうちの１つに包埋する。微粒子化の後、調製物を、さらに凍結乾燥および／または担体と混合してもよい。
【００４４】
脱灰骨組成物の安定化のためのストラテジー
脱灰骨基質を調製した後、以下に記載するストラテジーのいずれかを用いてＤＢＭの骨誘導性活性または骨伝導性活性を安定化し得る。ストラテジーとしては、酸性化、脱水、水代替物の使用、プロテアーゼインヒビターの使用および拡散バリアの使用が挙げられる。これらのストラテジーは、単独または組合せで使用され得る。当業者には認識されようが、ＤＢＭ組成物を安定化するために使用される１つのストラテジーまたは複数のストラテジーは、該組成物の使用、例えば、移植部位、必要とされる骨誘導性または骨伝導性の経過時間、取り扱い要件、修復対象の傷害などに依存する。
【００４５】
脱水。ＤＢＭまたは本発明のＤＢＭ組成物の調製後、該組成物は、水和された形態、または内在する水分が除去された凍結乾燥もしくは脱水された形態で保存され得る。ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、水和された形態では不安定であることが示されており、ｐＨ７．４で３７℃にて急速に分解されることが示されている（Ｕｒｉｓｔら Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．３８：１５５，１９７３（引用により本明細書に組み込まれる））。したがって、貯蔵寿命を改善するためには、水分を基質から除去するのがよい。凍結乾燥または脱水された組成物は、５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、または９８％より多くの水分が最初の試料から除去されたものであり得る。ＤＢＭ中の水分は真空にて除去され得、例えば、ＤＢＭを凍結し、減圧下で凍結乾燥機内に入れ、所望のレベルの脱水が達成されるまで内在する水分を除去し得る。他の実施形態では、ＤＢＭを、有機溶媒（例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、ブタノールなど）で抽出し、水分をＤＢＭから除去する。有機溶媒での抽出は、所望の量の水分を基質から除去するために反復してもよい。基質はまた、脱水剤（例えば、シリカゲル、ＤＲＩ−ＲＩＴＥ、Ｐ２Ｏ５、炭酸カルシウムなど）を伴う密閉環境内に基質を置くことにより脱水してもよい。凍結乾燥または脱水された形態では、本発明のＤＢＭ組成物の骨誘導性または骨伝導性活性は、室温またはそれ以下で数ヶ月から数年保存した場合であっても実質的により安定である。ある特定の好ましい実施形態では、脱水または凍結乾燥されたＤＢＭ組成物は、３７℃で１週間まで、３週間まで、５週間まで、１年まで、２年まで、または３年まで保存した後、その最初の活性の少なくとも９９％、９５％、９０％または８０％を保持している。他の実施形態では、凍結乾燥または脱水されたＤＢＭ組成物は、室温または４℃で６ヶ月、１年または２年後、最初の組成物の生物学的活性の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持している。好ましくは、凍結乾燥または脱水されたＤＢＭ組成物は、４℃で１年後、その最初の生物学的活性の少なくとも９０％を保持している。
【００４６】
酸性化。内在タンパク質分解酵素は、生理的ｐＨにおけるＤＢＭの不安定性の原因に関係するとされている。（Ｕｒｉｓｔら Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２：８８−１０３，１９７４（引用により本明細書に組み込まれる））。このような内在プロテアーゼのタンパク質分解活性は、ＤＢＭ組成物のｐＨを低下させることにより低減させ得る。２〜６の間、好ましくは３〜５の間、より好ましくは３〜４の間のｐＨでは、本発明のＤＢＭ組成物は、凍結乾燥または脱水された形態であろうとなかろうと、増大した安定性を有する。ある特定の好ましい実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、３７℃で１週間まで、３週間まで、５週間まで、１年まで、２年まで、または３年まで保存した後、その最初の生物学的活性の少なくとも９９％、９５％、９０％または８０％を保持している。他の実施形態では、酸性化および／または脱水されたＤＢＭ組成物は、室温または４℃で６ヶ月、１年または２年後、最初の組成物の骨誘導性または骨伝導性活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持している。
【００４７】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物のｐＨは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）未満に低下させる。本発明のＤＢＭ組成物は、所望のまたは低いｐＨ、好ましくは＜７、より好ましくはおよそ２〜およそ５の間、最も好ましくはおよそ３〜およそ４の間のｐＨを有する酸性溶液または緩衝溶液中でＤＢＭをリンスすること、および／または該溶液中にＤＢＭを浸漬させることによってＤＢＭ組成物を酸性化することにより調製され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＭを、所望のｐＨが達成されるまでリンスおよび／または浸漬させ得る。他の実施形態では、酸性化したＤＢＭ組成物は、脱灰工程（これは、通常、ＨＣｌなどの酸を用いて行われる）後、脱灰されたＤＢＭを水でリンスすることにより得られ得る。水または緩衝溶液でのリンス処理は、脱灰工程後、ＤＢＭの所望のｐＨが達成されるまで継続してもよい。酸性化工程は、追加の安定化剤（以下に記載する拡散バリア；プロテアーゼインヒビターもしくは他の酵素インヒビター；Ｄ２Ｏ；共有結合性修飾化学薬品；担体；ポリオール、ソルビトール；または水代替物など）の添加前、添加中または添加後に行い得る。
【００４８】
ＤＢＭの酸性環境の結果、内在プロテアーゼのタンパク質分解活性が低減され、ＤＢＭ内に存在する骨誘導性因子の安定性の増大がもたらされる。酸性化したＤＢＭ組成物の安定性の増大は、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、ＤＢＭ組成物をラットの筋肉間にインプラントし、規定した期間後、骨形成を調べることにより試験し得る（Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、４℃、２５℃、室温または３７℃で１週間、３週間、５週間、６ヶ月、１年、１．５年、２年、３年および１０年後、ＤＢＭの最初の骨誘導性の＞５０％、＞７５％、＞８０％、＞９０％、＞９５％または＞９８％を保持している。
【００４９】
安定化剤が添加された、または添加されていない本発明の酸性化したＤＢＭ組成物は、水和された、または脱水／凍結乾燥された形態で保存し得る。該組成物は、重量基準で約１０％〜約９９％の水分を含有し得る。ある特定の好ましい実施形態では、水分含量は＞１０重量％である。該組成物は、本発明のＤＢＭ組成物の貯蔵寿命をさらに増大させるため、室温またはそれ以下で保存してもよい。当業者には認識されようが、温度を低下させると、本発明のＤＢＭ組成物の生物学的活性の半減期が増大する。
【００５０】
重水。重水は、生物学的組成物において安定化剤としての機能を果たすことが示されている。例えば、Ｄ２Ｏは、有機系分子、巨大分子、ウイルスおよびワクチンの安定性を増大させることが示されている（Ｋａｔｚ，“Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｗａｔｅｒ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｕｌｙ １９６０，１０６−１１５；Ｋａｔｚ“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ”３９ｔｈ Ｐｒｉｅｓｔｌｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１−１１０；Ｊａｉｎら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８６０：４４８，１９８６（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））。ＣｒａｉｎｉｃおよびＳｉｍｐｓｏｎは、ある特定の巨大分子の増大した熱的および微生物学的安定性ならびに解離の減速について記載した（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９４／２１２９８（引用により本明細書に組み込まれる））。９５％Ｄ２Ｏの存在は、ワクチンの場合では、Ｈ２Ｏと比べ、保存温度の４〜５℃低下に相当することがわかっている。加えて、７〜２５％Ｄ２Ｏは、タンパク質変性の防止を補助する（Ｗｅｎｚｅｌ，ＤＥ２２５３０８６；Ｈａｍａｙａ ａｎｄ Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，ＪＰ０１１７９６８９；Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．ＥＰ ３３２８２６（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本発明は、ＤＢＭへの重水の添加または重水中へのＤＢＭの浸漬もしくは重水中でのリンス処理が、ＤＢＭ組成物の骨誘導性の安定化をもたらすことを実証する。ある特定の実施形態では、ＤＢＭを脱水してＨ２Ｏを除去し、次いでＤ２Ｏで再水和する。好ましくは、Ｄ２Ｏの割合は５０％より多く、より好ましくは７５％より多く、さらにより好ましくは９０％より多い。ある特定の実施形態では、Ｄ２Ｏの割合は９５％より多い。しかしながら、一部の実施形態では、Ｄ２Ｏの割合は、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％または４０〜５０％であり得る。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物を調製するために使用されるＤ２Ｏ溶液またはバッファーのｐＤは、７．０未満、好ましくは２〜５の間、より好ましくは３〜４の間である。Ｄ２Ｏ溶液またはバッファーのｐＤを低下させることによって、上記のように内在プロテアーゼの活性が低減され、骨誘導性がさらに安定化される。また、水代替物としてのＤ２Ｏの使用を、ＤＢＭ組成物を安定化させるための上記の他のストラテジー（例えば、糖などの安定化剤の添加、プロテアーゼインヒビター（１種類または複数種類）の添加および他の水代替物の添加など）と組み合わせてもよい。
【００５１】
他の水代替物。水代替物はまた、水が関与するか、または水が必要とされる媒体である化学反応も抑制し得る。水代替物としては、ポリオール、例えばグリセロール、液状ポリマー、流動性ポリマー、成形用ポリマー、ポリエチレングリコール、ヒドロゲル、ヒアルロン酸、液状脂質、流動性脂質、成形用脂質、ヒドロキシル化低分子、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、油類、油と水のエマルジョン、油と脱気水のエマルジョンなどが挙げられ得る。好ましくは、水代替物は、生体適合性である。水代替物は、水分が関与する化学反応（例えば、Ｄ２Ｏによる同位体効果）、例えば、生物学的に活性な因子の酵素的分解およびタンパク質構造の熱力学的不安定化など、または水が反応に必要とされる媒体である化学反応を抑制する。したがって、室温であっても、得られる水代替物含有ＤＢＭ組成物は、水代替物無含有ＤＢＭ組成物よりも増大した貯蔵寿命を有する。水代替物の効果は、ＤＢＭ組成物をより低温で保存することにより、さらに増大され得る。また、他の安定化剤および／またはＤＢＭ組成物の他の安定化方法（例えば、ｐＨの低下）を水代替物と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
好ましくは、水代替物は液体である。しかしながら、半固体の物質も水代替物として使用され得る。ある特定の実施形態では、水代替物として、ヒドロキシル基または他の極性官能基を有する化合物、例えば、アミン、チオール、カルボニルなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、水代替物の極性基は水素結合を形成することができる。水代替物は、極性であり、かつ水と混和しやすいものであり得る。他の実施形態では、水代替物は、非極性（例えば、油、脂質）であり、水と混和しやすくないものであり得る。水代替物の例としては、硬化ヒマシ油、骨髄脂質、硬化牛脂、硬化ラード油、カカオバター、多糖類、ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、脂肪酸グリセロールエステル、例えば、グリセロールモノラウレート、グリセロールモノミリステート、グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート、グリセロールジラウレート、グリセロールジミリステート、グリセロールジパルミテート、グリセロールジステアレート、グリセロールトリミリステート、グリセロールトリパルミテートおよびグリセロールトリステアレートが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、グリセロールを含んでいない。
【００５３】
水代替物として使用され得るワックス状材料の例としては、蜜蝋、カルナウバワックス、木蝋、鯨蝋、炭化水素、例えばパラフィン、微晶質ワックス、および脂肪族アルコール、例えば、セチルアルコールおよびステアリルアルコールならびに高級脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸およびアラキジン酸が挙げられる。
【００５４】
組成物への水代替物の添加はまた、組成物を流動性で成形可能にするという利点を有する。
【００５５】
安定化剤の添加。本発明の製剤への安定化剤の組込みは、一般的に、目的の１つの分子または複数の分子を適切に適合し得るバッファー（当業者に知られている）中に懸濁することによりなされる。次いで、このバッファーを基質と、比較的低い液体／固体容量比で混合し、スラリーを形成する。好ましくは、バッファーのｐＨは、およそｐＨ７．４である。組成物が酸性化された実施形態では、バッファーのｐＨは、生理学的ｐＨ未満であり、ほぼ、最終ＤＢＭ組成物において所望されるｐＨである。ある特定の実施形態では、安定化剤（１種類または複数種類）を含むバッファーを、凍結乾燥された基質と混合する。そのスラリーを、次いで、凍結乾燥し、所望のＤＢＭ製剤の調製に使用し得る。
【００５６】
本発明の特徴の１つは、拡散バリア、酵素インヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター）、競合性基質、マスキング剤または他の安定化剤を組み込むことが、多くの場合、基質内に存在する活性因子に対して内在的に存在する分解性酵素が接近するのを防止することにより、ＤＢＭ製剤の貯蔵寿命をさらに改善するという付加的な特徴を有することである。これは、調製されるＤＢＭ製剤が水を含有する場合（例えば、ヒドロゲル担体、例えば、ヒアルロン酸もしくはコラーゲンまたは水和されたデンプン担体を含むＤＢＭ調製物）は、特にそうである。
【００５７】
拡散バリアは、本発明の製剤内の活性部分への分解性酵素および／または水の拡散を遅滞させる。内包されるＤＢＭ内での拡散を遅滞させた酵素は、基質からの活性因子の放出および／または活性因子を分解もしくは不活性化を行い得る。これらはまた、インプラント部位からの活性因子の拡散を遅滞させることにより作用し得る。このようにして、バリアは、インプラント部位における活性因子のより長期の滞留時間をもたらす。これは、骨形成が活性因子の存在をより長期間必要とすると思われる高等種（例えば、ヒトなど）における骨の形成に特に有用である。
【００５８】
一般的に、拡散バリアとしての機能を果たすのに最も適した材料は、ＤＢＭまたは最適な合成基質と容易に混合され、ゲル、ペーストまたはパテ状粘稠物を形成するが、一部の実施形態では、バリア／基質製剤は、比較的非変形性の固体として調整される（例えば、後外側脊椎固定に使用される基質調製物の場合）。好ましい実施形態では、拡散バリア自体が予測可能な様式で分解し、通常、拡散バリアの非存在下で起こり得るよりも後の時点で活性因子をアンマスキングする。既知の加水分解速度を有する再吸収性ポリマーは、拡散バリアとして、ならびに酵素的に分解されるポリマーとして有用である。特に有用なものは、リパーゼ感受性脂質系担体、例えば、脂肪酸およびリン脂質であり、これらはＤＢＭと良好に混合される。ある特定のＤＢＭの実施形態では、該組成物は、ホスファチジルコリンを含まない。一部の特に効果的な調製物は、骨誘導性因子のアンマスキングを制御することにより延長された安定性を提供する。このような調製物は、一般的に、異なる分解時間を有して同じ活性因子の少なくとも２つの異なるアンマスキング速度をもたらす２種類以上の拡散バリアの使用を伴う。
【００５９】
本発明の安定化された基質／成長因子組成物の調製に有用な生分解性ポリマーとしては、天然ポリマー、例えば、タンパク質（例えば、コラーゲン）および多糖類（例えば、デンプン、改質デンプン、マルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ））ならびに人工再吸収性ポリマー、例えば、ポリオルトエステルが挙げられる。これらのポリマーは、本発明の成長因子含有組成物と混合すると、組成物内に含有された活性因子への宿主の分解性酵素および／または水の拡散を遅滞させ、それにより、内包された活性因子の放出および／または分解を遅滞させる。
【００６０】
本発明の組成物に包含され得るポリマーとしては、例えば、天然ポリマー（脂質、多糖類、プロテオグリカンおよびタンパク質など）が挙げられる。好ましい多糖類としては、デンプン、デキストランおよびセルロースが挙げられ、好ましいタンパク質としては、コラーゲンが挙げられる。多糖類（例えば、デンプン、デキストランおよびセルロースなど）は、改質されていないものであってもよく、その特性（例えば、その水和された状態での特徴、その溶解性、その易分解性またはそのインビボ半減期）の１つ以上に影響を与えるために物理的または化学的に改質されたものであってもよい。多糖類（例えば、デンプンおよびセルロースなど）はまた、既知分解速度を有するため、魅力的である。一般的に、セルロースは、体内では、より低速で分解され、数週間または数ヶ月の単位で分解されるが、多くのデンプン調製物および脂質調製物は、急速に（数時間または数日間の単位で）分解される。天然状態のデンプンは、２種類の多糖類、アミロースおよびアミロペクチンの混合物である。特定のデンプンのデンプン分解性酵素（例えば、アミラーゼ、ペクチナーゼおよびβ−グルコシダーゼなど）に対する感受性は、本発明の製剤の設計における重要な考慮事項である。当業者は、種々の植物供給源から調製されるデンプンには、さまざまなアミラーゼ感受性があることを承知しており、この知識を、所望の安定性時間を有する製剤の作製に適用し得る。好ましいデンプンは、１日あたり１０％程度、好ましくは、１日あたり５０％程度、最も好ましくは、１日あたり９０％より多くが分解する。ペクチナーゼおよび／またはアミラーゼによってあまり分解されにくいデンプン（アミラーゼ抵抗性デンプン；Ｓｔａｒｃｈ Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、インビボ骨誘導性半減期を、より酵素感受性のデンプンから調製される改善されたＤＢＭまたは合成成長因子／基質製剤よりもはるかに高程度まで最大限に延長し得る。一部の改質デンプンは、アミラーゼによってあまり分解されず、したがって、改質デンプンを含む改善されたＤＢＭは、おそらく、非改質デンプンを含む改善されたＤＢＭと比べ、より長期のインビボ半減期を有し得る。デンプンのアミラーゼ感受性に影響を与える好ましい方法の１つは、デンプンと脂質の組合せの使用によるものである。アミラーゼ感受性に影響を与えるための脂質とデンプンの組合せに関する手引きは、Ｃｒｏｗｅら“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０（８）：２００６−２００８，２０００年８月（引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。同様の考慮事項が、脂質とその分解性酵素リパーゼに適用される。リパーゼ分解に対する種々の感受性を有する多種多様なモノ−、ジ−およびトリグリセリドが、市販品供給源から入手可能である。実施形態の一部は、１種類以上のポリマー系材料（好ましくは、生分解性）、例えば、チロシンポリカーボネート、ポリフマレート、チロシンポリアクリレートおよびポリオルトエステル（ポリラクチド、ポリガラクチド（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉｄｅ）など）、ならびにそのコポリマーなどを含むものである。これらのポリマーは生分解性であり、その特性は、ポリマーの鎖長もしくは架橋度および／またはモノマーの化学的構造を変更することにより改質され得る。さらに、コポリマーは、再吸収性ポリマーの組合せを用いて調製され得る。
【００６１】
本発明の実施に有用な酵素インヒビターとしては、例えば、酸プロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら“Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ １７ （１）：３−１４（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、システインプロテアーゼインヒビター、グリコナーゼ（ｇｌｙｃｏｎａｓｅ）インヒビターおよびグリコシダーゼインヒビターが挙げられ得る。本発明の実施に有用な具体的なプロテアーゼインヒビターとしては、例えば、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチンＡ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびメタロプロテアーゼインヒビターのＴＩＭＰクラスのものが挙げられる。特に有用なものは、酸性条件下で安定であり、酸性条件で有効なものである。
【００６２】
宿主の分解性または活性化酵素に対する競合性基質の使用もまた、ＤＢＭの骨誘導性因子または外添される成長因子を安定化させるために用いられ得る。競合性基質の例としては、ジ−およびポリ−リシンが挙げられる。二糖類および多糖類をグリコシダーゼ、アミラーゼおよび／またはペクチナーゼの競合性基質として用いてもよい。特に有用なものは、立体異性体の競合性基質である。
【００６３】
一般的に、単一の存在物または一類型の存在物を酵素的分解から特異的に阻止されるように、特異的なマスキング用存在物を用いる。阻止対象の分解性または活性化酵素は、内在または外来の基質であり得る。マスキング用存在物は、一般的に、基質上に存在するリガンド（活性因子自体であってもそうでなくてもよい）に結合する。結合したら、マスキング用存在物は、１種類以上の活性因子の分解および／または放出を立体的に障害する。経時的に、マスキング用存在物は、離脱するか、または自身が分解され、リガンドおよびまたは成長因子を分解されやすくする。拡散バリアは、基質と会合した成長因子の多くまたはすべてに分解性または活性化酵素が接近するのを抑制することにより、マスキング用存在物の全般性形態を表す。
【００６４】
ＤＢＭの共有結合性修飾。ＤＢＭは、ポリエチレングリコールの添加またはシリル化によって共有結合により修飾され得る。
【００６５】
例示的な安定化されたＤＢＭ組成物。ＤＢＭ組成物を安定化させるための上記のストラテジーおよび他の出願書類に記載されたストラテジー（引用により本明細書に組み込まれる）に基づくと、以下のＤＢＭ組成物が特に有用である。
【００６６】
ある特定のＤＢＭ組成物は、グリセロールを含まない。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、ＤＢＭおよび非グリセロール安定化手段を含む。安定化手段としては、水代替物（例えば、重水、ポリオール、脂質、油類、ワックス、多糖類など）；プロテアーゼインヒビター；酸；拡散バリア；競合性基質；マスキング剤；および共有結合性修飾体が挙げられ得る。ある特定の特別な実施形態では、安定化手段は、水代替物、プロテアーゼインヒビター、酸または拡散バリアである。特に有用な水代替物はＤ２Ｏおよび非グリセロールポリオールである。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は酸性化されており、水代替物が添加されている。他の実施形態では、ＤＢＭ組成物は酸性化されており、プロテアーゼインヒビターが添加されている。さらに他の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、水代替物とプロテアーゼインヒビターを含む。ＤＢＭ組成物由来の水分は、凍結乾燥または本明細書に記載の他の手段によって任意選択で、除去し得る。ＤＢＭ組成物は、好ましくは、室温で１年後、その最初の骨誘導活性の少なくとも９５％を保持しているのがよい。
【００６７】
本発明のＤＢＭ組成物は、非グリセロール担体をさらに含み得る。ＤＢＭ組成物に含めるのに（ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｄｅ）有用な非グリセロール担体としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマーおよび水が挙げられる。担体をＤＢＭ組成物に添加し、該組成物を、より流動性， 易成形性および／または易取り扱い性とし得る。好ましくは、担体の添加は、ＤＢＭ組成物の安定性または半減期に実質的に影響を与えない。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、グリセロールを水代替物として含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物は、ＤＢＭ、グリセロールおよび安定化手段を含む。安定化手段は、水代替物、酸性化，拡散バリアまたはプロテアーゼインヒビターであり得る。特に有用な安定化手段の例としては、ヒアルロン酸、デンプンおよび脂質が挙げられる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、ＤＢＭを、外来の不安定化存在物と混合する。例えば、ＤＢＭは、プロテアーゼまたは他の分解性酵素を含有する組織と混合され得る。ＤＢＭ内の活性因子を分解から保護するため、先に概要を示した種々のストラテジーを用い、そうしないと不安定化される組成物を安定化し得る。例えば、外来の不安定化存在物の効果を少なくとも部分的に打ち消すために、プロテアーゼインヒビターを該組成物に添加し得る。
【００７０】
安定化の試験
本発明はまた、好適な安定化剤をスクリーニングするためのインビトロ試験を提供する。本明細書に記載のようにして調製されるＤＢＭ組成物を、模擬的な生理条件（例えば、ｐＨ７．４、生理食塩水）下で、ＤＢＭの構成成分タンパク質の一部または全部を分解できることが知られた酵素または酵素の組合せに曝露する。ほとんどの場合、これは、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、ペプシン、パパイン、ペプチダーゼなどである。基質または基質成分の分解の証拠を２つの調製物間で比較する。分解プロセスを遅滞させる物質を、さらなる試験に充分な候補とみなす。分解の好ましいインジケーターとしては、ＴＧＦ−βの免疫学的検出および／またはＩＧＦ分解が挙げられる。上記に示した酵素に加え、他の酵素、例えばコラーゲナーゼまたは酵素の組合せおよびグリコシダーゼもまた、使用され得る。これに関して特に有用なものは、血清または組織抽出物の自然な分解活性である。このような条件下では、ＤＢＭ内に存在する特異的マーカータンパク質を、免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロットを用いたラジオイムノアッセイもしくはゲル電気泳動）、または当該技術分野で知られた他の解析方法によって追跡し得る。例えば、特定のタンパク質の分解がモニターされ得、または分解産物（例えば、ペプチド断片など）のレベルの増加がモニターされ得る。
【００７１】
上記アッセイでの候補安定化剤の同定後、候補安定化剤を含有するＤＢＭ製剤を、本明細書において別途記載した骨誘導性アッセイで試験する。
【００７２】
加速安定性の試験
本発明はまた、加速安定性の試験のためのインビトロ試験を提供する。各ＤＢＭ製剤の数連の試料を耐湿性容器（アルミニウムホイル）内にパッケージングし、高温温度（例えば、４０℃）で数ヶ月間置く。種々の時点（例えば、インキュベーションの０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間後）、パッケージを開封し、内容物の骨誘導活性を測定する。任意の試料の加速安定性は、各ＤＢＭ製剤の骨誘導活性（初期骨誘導活性に対する割合に標準化したもの）を時間に対してプロットすることにより得られるベストフィット直線の傾きから決定され得る。該材料の室温安定性は、Ｒｅｉｃｋら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ １０（３）：３４−３９，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載された酵素反応速度論のファント・ホッフの法則を用いて外挿され得る。
【００７３】
以下に実施例に記載する本発明者らの試験では、ＤＢＭ組成物の酸性化または水和されたＤＢＭ製剤へのグリセロールの添加は、ＤＢＭの骨誘導安定性を有意に増大させる。
【００７４】
骨誘導活性の測定
骨誘導性活性は、目的のＤＢＭ製剤を胸腺欠損ラットの非骨格部位内にインプラントし、インプラント部位で誘導された新しい骨、軟骨および骨髄の量を評価することにより測定する。骨誘導活性の測定手順は、以前に詳細に報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＴ，Ｄｉｅｇｍａｎｎ ＭＨ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ＮＬ．“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１９９８ Ｄｅｃ；（３５７）：２１９−２８（引用により本明細書に組み込まれる））。
【００７５】
骨誘導物質
ＤＢＭ組成物には、他の骨誘導剤を添加してもよい。このような薬剤は、活性化形態または非活性化形態で添加され得る。このような薬剤は、本発明の材料の調製時の任意の時点で添加され得る。例えば、骨誘導剤は、添加された骨誘導剤が、いったんインプラントされた外来の分解性酵素から保護されるように、脱灰工程後、安定化剤の添加前に添加され得る。一部の実施形態では、ＤＢＭを、骨誘導剤を含有する溶液の状態で凍結乾燥する。ある特定の他の好ましい実施形態では、骨誘導剤は水和された脱灰骨基質上に付着しており、解け易くない。他の場合では、骨誘導剤を改善されたＤＢＭに、ＤＢＭを移植したらすぐに骨誘導剤が利用可能となるように、安定化剤の添加後に添加する。
【００７６】
骨誘導剤には、骨の形成をもたらすか、またはこれを増強する任意の薬剤が含まれる。骨誘導剤は、これを任意の様式で行い得、例えば、該薬剤は、骨形成を担う細胞の漸増をもたらすものであり得る；該薬剤は、後で石灰化作用を受け得る基質の分泌をもたらすものであり得る；該薬剤は、骨の吸収の低減をもたらすものであり得る、などである。特に好ましい骨誘導剤としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスホーミング成長因子 （ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）など）、および血管由来因子（例えば、ＶＥＧＦなど）が挙げられる。好ましい１つの実施形態（実施例１２）では、該誘導剤は、ＤＢＭまたは担体に対する該誘導剤の結合を促進するアミノ酸配列を含むように遺伝子操作されたものである。ＳｅｂａｌｄらのＰＣＴ／ＥＰ００／００６３７（引用により本明細書に組み込まれる）には、ＤＢＭとの使用に適した例示的な操作された成長因子の産生が記載されている。
【００７７】
製剤化
本発明の改善された骨形成組成物は、特定の用途のために製剤化され得る。製剤化は、ＤＢＭ調製物の物理的、生物学的または化学的特性を改変するために用いられ得る。医師ならば、傷害の型、傷害部位、患者の健康、感染の危険などの要素を考慮して、特定の適用に必要とされる製剤化を容易に決定することができよう。
【００７８】
本発明の組成物は、したがって、選択した吸収速度／骨誘導速度の低下を有するように、またはインプラントの異なる部分において異なる速度を有するようにさえ調製され得る。例えば、製剤化プロセスとしては、特定の大きさまたは組成のＤＢＭ粒子の選択を、特定の１種類の安定化剤または複数種類の安定化剤およびかかる薬剤の量の選択と組合せることが挙げられる。一例にすぎないが、その骨誘導性因子が比較的一定量で所与の期間、活性である組成物を提供することが望ましかろう。より長期の半減期を有する因子を含むＤＢＭ組成物は、生分解性の低いポリマーまたは大量の（例えば、コーティング厚の大きい）ポリマー系化合物を用いて調製され得る。また、所望の半減期を有するＤＢＭ組成物を提供するために、プロテアーゼインヒビターの量または型を調整し得る。あるいはまたさらに、粒径は、本発明のＤＢＭ組成物の半減期の決定において重要であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の製剤化としては、各々が異なる半減期を有する粒子の混合が挙げられ得る。かかる混合物は、傷害の必要性に応じて数日間から数週間や数ヶ月の範囲の長期間、一様な、または可能な限りの骨誘導性因子のアンマスキングを提供し得る。このような組成物の製剤化は、ヒト患者において、コラーゲンスポンジにて１０μｇのｒｈＢＭＰでの処置によって誘導される骨成長匹敵する、好ましくは１００μｇ、最も好ましくは１〜１０ｍｇのｒｈＢＭＰでの処置に匹敵する骨成長を刺激し得る。
【００７９】
また、ＤＢＭの変形可能性および粘度などの物理的特性は、具体的な臨床適用に応じて選択され得る。改善されたＤＢＭの粒子を他の材料および因子と混合し、インプラントの他の特徴を改善し得る。例えば、改善されたＤＢＭ材料を他の薬剤と混合し、創傷治癒を改善し得る。このような薬剤としては、薬物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、溶媒、化合物、生物学的分子などが挙げられ得る。
【００８０】
ＤＢＭ（または本発明のＤＢＭ材料）の粒子は、種々の形状および立体構造に形成され得る。該粒子は、桿形、糸状、シート形、波型、固形、円錐形、円板形、繊維、くさび形、コイル状、二重らせん状などに形成され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＭ組成物内の粒子の形状および大きさは、骨誘導性の経時変化に影響を及ぼす。例えば、円錐形またはくさび形の形状では、先細りした末端が、ＤＢＭ組成物を移植した後、短時間で骨誘導性をもたらし、一方、厚みのある末端は、治癒プロセスにおいて、後から（例えば、数時間から数日間や数週間後に）骨誘導性をもたらす。ある特定の実施形態では、粒子は、その最も広い幅の寸法のところが、２ｍｍより大きい、１．５ｍｍより大きい、１ｍｍより大きい、好ましくは５００ミクロンより大きい、最も好ましくは２００ミクロンより大きい長さを有する。また、大きい粒径ほど、小さい粒子よりも長期間にわたって骨形成の誘導を有する。異なる特性（例えば、組成物、大きさ、形状）の粒子を、このような異なる形状および立体構造の形成に使用し得る。例えば、シート状のＤＢＭでは、半減期の長い粒子の層を、半減期の短い粒子の層間に交互に配置し得る（米国特許第５，８９９，９３９号（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。織物状のものでは、半減期の短い粒子から構成された糸を、半減期がより長い糸と一緒に織り込み得る。
【００８１】
本発明の好ましい１つの実施形態では、繊維状ＤＢＭを、米国特許第５，５０７，８１３号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載の基質形態に成形する。次いで、成形したＤＢＭを、基質の一部分が基質材料にない露出した状態になるように、拡散バリア型基質内に包埋する。特に好ましいブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基質は、デンプン、ホスファチジルコリン、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアクリレート、ポリラクチド、ポリガラクチドまたは他の再吸収性ポリマーもしくはコポリマーである。このようにしてこれらの基質から調製されたデバイスは、即時かつより長期持続性が両立した骨誘導特性を有し、ヒト脊椎後側方固定適応における骨塊形成の促進に特に有用である。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、予め選択した三次元形状を有する本発明のＤＢＭ組成物は、例えば、Ｃｉｍａらの米国特許第５，４９０，９６２号；および同第５，５１８，６８０号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）；ならびにＳａｃｈｓらの米国特許第５，８０７，４３７号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているような３−Ｄプリンティングによる、ＤＢＭの個々の層の適用の反復により調製される。異なる層が、個別の安定化されたＤＢＭ調製物を含むものであってもよく、あるいはまた、多数の層を堆積した後、安定化剤で処理されたＤＢＭ層を含むものであってもよい。
【００８３】
改善された本発明のＤＢＭ材料の調製方法では、該材料は、あらゆる感染性因子（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎など）が排除されるように、完全に無菌的に作製され得るか、または滅菌され得る。滅菌は、任意の方法または方法の組合せ、例えば、１種類以上の抗生物質、放射線照射、化学的滅菌（例えば、エチレンオキシド）または加熱滅菌を用いてなされ得る。当該技術分野で知られた他のＤＢＭの調製方法、例えば、脱脂、超音波処理および凍結乾燥などもまた、改善されたＤＢＭの調製において使用され得る。脱灰骨の生物学的活性は、ほとんどの加熱滅菌プロセスによって有害な影響を受けることが知られているため、本発明の組成物を滅菌する際は、注意しなければならない。好ましい実施形態では、本明細書に記載するＤＢＭ組成物は、無菌的に調製するか、または実施例６に記載のようにして滅菌する。
【００８４】
適用
本発明の改善された骨形成組成物は、骨の傷害の治癒を促進するために使用され得る。該組成物は、身体の任意の骨において、任意の型の傷害に対して使用され得る。この改善されたＤＢＭ組成物は、コラーゲンスポンジでの１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２００μｇ〜１ｍｇのｒｈＢＭＰと同様のタイミングで同様のレベルで、ヒト患者において骨を生成させるために設計した。例えば、本発明の材料を用いて修復され得る具体的な骨としては、篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、きぬた骨、あぶみ骨、つち骨、頚椎骨、胸部の椎骨、腰椎骨、仙骨、胸骨、肋骨、鎖骨、肩甲骨、上腕骨、尺骨、橈骨、手根骨、中手骨、指趾節骨、回腸、坐骨、恥骨、骨盤、大腿、膝蓋骨、脛骨、腓骨、踵骨、距骨、および中足骨が挙げられる。改善されたＤＢＭで処置されやすい傷害の型としては、傷害により生じた骨欠損、手術、感染症、悪性疾患の過程で引き起こされた骨欠損、または先天性発育異常が挙げられる。本発明の材料は、整形外科、神経外科、美容術ならびに口腔および顎顔面外科手術、例えば、単純骨折および複雑骨折ならびに癒着不能の修復、外固定および内固定、関節再構成、例えば、関節固定術、一般的な関節形成術、腰部のカップ関節形成術、大腿および上腕頭置換、大腿骨頭表面置換および関節全置換、脊柱の修復、例えば、脊椎固定術および内固定、腫瘍手術（例えば、欠損部の充填）、椎間板切除術、椎弓切除術、脊髄腫瘍の切除、前頚および胸部の手術、脊椎傷害の修復、脊柱側弯症、脊柱前弯症および脊柱後弯の処置、骨折の上顎骨間固定、おとがい形成術、顎関節症の関節置換、歯槽突起増加および再構成、インレー骨移植片、インプラント設置および修正、サイナスリフトなどに有用であり得る。
【００８５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の実施例を考慮すると、さらに認識されよう。以下の実施例は、本発明のある特定の特別な実施形態を説明することを意図するものであって、特許請求の範囲に規定されたその範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：脱灰骨基質（ＤＢＭ）の調製
ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または手法（Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて調製され得る。以下は、Ｇｌｏｗａｃｋｉら“Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ Ｉｍｐｌａｎｔｓ”Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ １２（２）：２３３−２４１，１９８５年４月（これは、引用により本明細書に組み込まれる）から得られる脱灰骨を調製するための例示的な手順である。ドナーからの骨または骨断片を、きれいにしてあらゆる付着骨膜、筋肉、結合組織、腱、靱帯および軟骨を除去する。海綿質骨を、密な皮質骨から分離し、大きな骨片として処理してもよい。後続の洗浄および抽出の効率を向上させるため、皮質骨を小片に切断してもよい。より大きな動物からのより蜜な骨は、１ｃｍ未満のチップを作製するために、凍結させ、ハンマーで砕く必要があり得る。得られた骨片を冷脱イオン水で充分洗浄し、髄および軟組織を除去する。
【００８７】
きれいにした骨を、次いで、絶対エタノール（頻繁に交換する）で少なくとも１時間抽出する。典型的には、合計４リットルのエタノールを、１００ｇの骨に対して使用する。次いで、骨を、ドラフト内にて、無水ジエチルエーテル（頻繁に交換する）で１時間抽出する。典型的には、２リットルのエーテルを１００ｇの骨に対して使用する。骨は、これらのエタノールとエーテルの抽出によって脱水し、室温で保存し得る。
【００８８】
脱水した骨を、次いで凍結し、次いで、液体窒素中で衝撃式製粉機にて粉砕する。粉砕した骨を、次いで、篩分けし、７５〜２５０、２５０〜４５０および４５０ミクロンより大きい画分に分ける。骨粒子画分を、次いで、０．５Ｍ塩酸（５０ｍＬ／グラム）を用い、３時間、室温または４℃で、過熱を防止するために断熱したマグネチックスターラーにて脱灰する。大きな骨チップおよびブロックを、４℃にて０．５Ｍ塩酸（頻繁に交換する）で完全に抽出する。脱灰プロセスは、灰化により、または非脱灰組織学的手法（ホン・コッサ染色）によりＸ線写真上にてモニターし得る。酸および遊離した無機成分を冷脱イオン水で、洗浄液のｐＨが水のｐＨと一致するまで洗い流す。水での洗浄は、大粒子および骨チップからのデカンテーションでもよい；しかしながら、洗浄液は、遠心分離によって、より微細な粒子から除去されなければならない。洗浄工程では、およそ５００ｍＬの水が当初の骨粒子１グラムに対して必要とされる。
【００８９】
脱灰骨粉末は、絶対エタノール（交換する）で１時間抽出し、２００ｍＬのエタノールを当初の骨粒子１グラムに対して使用する。この材料を、ドラフト内にて無水エチルエーテル（交換する）で１時間抽出し、１００ｍＬのエーテルを当初の骨粒子１グラムに対して使用する。最後に交換したエーテルを除去した後、脱灰骨粉末を、すべての残留エーテル が蒸発するまで一晩フード内に放置する。この粒子は、無臭で真っ白であり、離散（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）しているはずである。脱灰骨材料を滅菌するため、冷エチレンオキシドで処理するか、または放射線を照射し得る。
【００９０】
調製したＤＢＭの生物活性を試験するため、２５ｍｇのこの材料を、剃毛し麻酔した２８日齢雄Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＣＤラットの２つの胸部の皮下ポケットの各々にインプラントする。インプラントされた試験片を、次いで、移植の数日後に回収し、検査し得る。誘導された組織の組成を、組織形態計測解析および生化学的手法によって定量し得る。
【００９１】
実施例２：ＤＢＭの別の調製方法
ＤＢＭは、当該技術分野で知られた任意の方法または手法（Ｒｕｓｓｅｌｌら Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ２２（５）：５２４−５３１，１９９９年５月（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて調製され得る。
【００９２】
脱灰骨基質を、長骨から調製した。
骨幹領域を、あらゆる接着性軟組織がない状態にし、次いで、ミル内で磨砕した。磨砕された材料を篩分けし、直径がおよそ１００μｍ〜５００μｍの粒子を有する粉末を得た。微粒子状の骨を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．６Ｎ ＨＣｌの溶液を室温で用いた後、新たな０．６Ｎ ＨＣｌの溶液を用い、約１％（重量基準）未満の残留カルシウムに脱灰した。この粉末材料を脱イオン水で、ｐＨが３．０より大きくなるまでリンスした。次いで、７０％エタノール中に浸漬し、凍結乾燥して残留湿分を５％未満とした。
【００９３】
実施例３：ｐＨ安定化したＤＢＭのインビトロ評価
安定化剤（または種々の濃度および／または配合の安定化剤）を含むか、または含まないｐＨ安定化したＤＢＭの試料を調製し、血清または個々の酵素（例えば、パパイン）を含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）とともにインキュベートし、３７℃で０．５、１、２、４、８および２４時間インキュベートする。次いで、試料を抽出し、Ｕｅｌａｎｄら（“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９９ Ｊａｎ；８４（１）：１２３−７（引用により本明細書に組み込まれる））に概要を示したようにして、成長因子および他の基質タンパク質の濃度を測定する。ネイティブまたは変性ＳＤＳゲル電気泳動のための試料を調製した後、ウェスタンブロット解析またはＵｅｌａｎｄら（１９９９）に記載され、引用により本明細書に組み込まれるウェスタンリガンドブロッティング（Ｕｅｌａｎｄら“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９９ Ｊａｎ；８４（１）：１２３−７；およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（編）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第２版 ２００２年，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる））を行う。
【００９４】
次いで、試料を、７、１４、２１、２８、３０、６０または９０日間での骨誘導性に関して、胸腺欠損ラットアッセイまたは他の適切な種において試験し得る。また、抽出物試料は、Ｚｈａｎｇら（１９９７）に記載のような組織培養物アッセイにおいて、生物学的活性に関して速やかに試験し得る。
【００９５】
実施例４： 筋肉内インプラントによる骨成長の誘導の経時変化測定
この実施例は、本発明の材料を用いた筋肉内部位における骨成長の誘導の経時変化の特徴を示し、ＤＢＭ系粉末（実施例１と同様）と、第７、１４、２８および３５日の時点で比較する。この実施例は、Ｅｄｗａｒｄｓら“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８年１２月（引用により本明細書に組み込まれる）に示されたＤＢＭの骨誘導の評価のためのラットモデルと類似する。
【００９６】
本研究は、ヒト組織インプラントに対する異種間応答不適合の可能性を最小限に抑えるため、胸腺欠損（ヌード）ラットにおいて行う。自然な状態では骨を含まない部位であるため、後肢筋肉内部位を、異所的骨誘導特性の初期測定に使用する。
【００９７】
雌ホモ接合性ｒｎｕ／ｒｎｕラット（５０〜７５ｇの範囲）を、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手する。手術前、ラットを１週間、馴化の目的で収容する。本研究調査を通して滅菌マイクロアイソレーターケージを使用し、滅菌水および齧歯類試料を随意に摂取させる。
【００９８】
インプラントの設置：３０匹のラットの各後肢において、単一の筋肉内（ＩＭ）部位を使用する。すべての動物に対して共通の陽性対照を提供するため、ラットＤＢＭ粉末の単一の４０ｍｇ試料を各ラットの左胸筋（ＬＰ）筋の筋肉内に配置する。外科手術後、動物には通常の活動を行わせる。
【００９９】
インプラント材料：ＤＢＭおよび試験材料を室温で維持する。試料を、７、１４および２８日間の移植時間で試験する。ＤＢＭ粉末の試料を１００μＬの滅菌ＡＬＬＯＰＲＥＰＴＭ（Ｏｓｔｅｔｏｔｅｃｈ，Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ，ＮＪ）で再水和する。試料の各々を、１ｍＬ容ブラントカット（ｂｌｕｎｔ ｃｕｔ）シリンジ内に封入する。移植は、１匹の動物が２つの同じインプラントを受容しないように無作為化する。
【０１００】
麻酔：ラットは、ケタミン（２００ｍｇ）、キシラジン（４００ｍｇ）および生理食塩水（１０ｍＬ）の混合物で麻酔する。投薬量は３．５ｍＬ／ｋｇ体重であり、腹腔内に投与する。
【０１０１】
手順：無菌的外科手術を、層流フード内で行う。１ｃｍの皮膚切開部を、側方アプローチを用いて各上後肢上に作製し、皮膚を筋肉から鈍的切開により分離する。表在切開部が筋肉面に沿って並んでいることにより、はさみの先端の挿入が可能である。鈍的切開を、このラインから筋肉深部内へと行い、インプラントされた材料を保持するためのポケットを作出する。一針の縫合を加え、筋肉のポケットを閉じ、皮膚を金属クリップで閉じる。
【０１０２】
左胸筋筋肉内への試験片の移植は、胸部上の１ｃｍの皮膚切開部の作製、ポケット作出のための筋肉の鈍的切開、およびブラントシリンジを用いたラットＤＢＭ粉末の配置を伴う。一針の縫合を加え、筋肉のポケットを閉じ、皮膚を金属クリップで閉じる。
【０１０３】
ラットを、所定の移植時間後ＣＯ２で安楽死させる。インプラント材料は、触知（ｐａｌｐｉｔａｔｉｏｎ）によって位置確認し、鈍的切開によって取り出し、注意深いトリミングによって周囲組織を除く。インプラントの型を知らない観察者が、インプラント材料の肉眼評価を行った。色、血管分布像、硬度および統合性を、以下の表に概要示すスキームに従ってスコアリングする。（最も強い応答の最高スコアは４であり得、一方、骨誘導性潜在性をほとんど、または全く示さない試験片は０とスコアリングされ得る）。このモデルを用いた実験（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ）は、測定目盛りの両末端でのみ、インプラント性能の目視観察と組織学的観察との間の高度な相関性を示した。
【０１０４】
【表１】
組織学検査：取り出した材料を、中性緩衝ホルマリン中に固定する。ホルマリン中に固定後、試料を１０％ギ酸中で石灰質除去し、等級品アルコール中で脱水し、ＪＢ−４（グリコールメタクリレート、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）内に包埋し、細分する。５ミクロンの切片を、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡使用により評価する。
【０１０５】
これらの外植片を、半定量的方法を用いて組織学的に評価する。簡単には、５段階の基準に基づく数値スコアを、各切片の小塊に対して割り当てる。４＝７５％より多くが新しい骨形成に関与；３＝５１〜７５％が新しい骨形成に関与；２＝２６〜５０％が新しい骨形成に関与；１＝外植片の１〜２５％が新しい骨形成に関与；および０＝軟骨内骨形成のプロセス（例えば、軟骨または軟骨細胞、活性な骨芽細胞、類骨、新しく形成および石灰化された骨、および／または髄および関連する脂肪細胞の存在）の痕跡なし。
【０１０６】
【表２】
組織学的解析後、各材料型の平均スコアを計算する。この動物モデルでの以前の実験に基づき、各群を、平均組織学的スコアによって骨誘導性潜在性を評価する。
【０１０７】
実施例５：ウサギモデルにおける骨誘導
５５匹の雄Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギを３つの処置群に割り当てる。被験物質は、本明細書に記載のようにして調製した。低用量処置群群（ｎ＝２０）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの試験物質を、右傍脊椎筋内に、プロトコルに指定された手順に従って与える。高用量処置群（ｎ＝２０）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの試験物質を右傍脊椎筋内に、および７．０ｍＬの試験物質を胸部背面領域の両側の皮下組織に与える。対照処置群（ｎ＝１５）に割り当てた動物には、３．５ｍＬの対照物質（再水和されたＤＢＭ粉末）を右傍脊椎筋内にインプラントする。移植の７、１４および２８日後、低用量処置群および高用量処置群から４匹の動物、対照群から３匹の動物を、人道的に致死させる。移植６０日後、残りの動物を致死させる（低用量処置群および高用量処置群から８匹の動物および対照処置群から６匹）。インプラント部位を各ウサギから回収し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に固定する。移植試験後６０日の間をあけた試験インプラント部位および対照インプラント部位を、充分なホルマリン固定後、石灰質除去溶液中に３日間入れる。すべての組織試料は、標準的な組織学的手法を用いて処理し、５μｍの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【０１０８】
実施例６：最終滅菌
この実施例では、本発明の調製物の骨誘導性低下を最小限にする最終滅菌方法を記載する。
【０１０９】
本発明のＤＢＭ調製物は、無菌室環境内で、ヒト組織から作製する。完成品インプラントは、個別のトレイパッケージ内に入れる。
【０１１０】
各トレイを、Ａｕｄｉｏｎｖａｃ密封装置（Ａｕｄｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｂ．Ｖ．，Ｗｅｅｓｐ−Ｈｏｌｌａｎｄ）内に入れ、この装置には、５０／５０水素／アルゴンガスからなるシリンダーを設ける。トレイパッケージを密封し、空気を抜き、再度、ガス混合物を２回充填する。密封後、ガス混合物をトレイパッケージ内に残留させる。
【０１１１】
パッケージングされたインプラントを、次いで、パッケージ密封し、次いで、コバルト６０供給源から１５ ＫＧｙのγ放射線で処理し、インプラント内部の生育微生物数（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を所望のレベルに低下させる。
【０１１２】
実施例７：室温での酸性ＤＢＭの保存
実際の時間での酸性ＤＢＭの安定性を測定するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約５．０）を調製し、室温での保存に供した。１６個の試料をその都度調製し、次いで、ＤＢＭ試料の半数を水和された形態で保存し、一方、他の半数からは、内在する水を凍結乾燥により除去した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、周囲温度および周囲湿度で、移植まで０、５．３、１０．６、２１．３および３１．８週間保存した。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った。組織学的検討の結果、水和状態または凍結乾燥状態で３１．８週間まで保存したＤＢＭ試料の骨誘導性の有意な減少はないことが示された（図７）。このデータは、酸性ＤＢＭが、水和された形態または凍結乾燥された形態のいずれの場合も少なくとも３１．８週間、室温で安定であることを示す。
【０１１３】
【表３】
実施例８：４０℃での酸性ＤＢＭの保存
酸性ＤＢＭの長期安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約５．０）を調製し、加速熟成に供した。１６個の試料をその都度調製した。次いで、ＤＢＭ試料の半数を水和された形態で保存し、一方、他の半数は、内在する水を除去することにより凍結乾燥した状態で保存した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存した。温度の１０℃の上昇が化学反応速度のおよそ２倍の変化をもたらす（Ｑ１０＝２）ことを示すアレニウス反応速度式を適用すると、４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で３年まで保存することに相当し得る。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、凍結乾燥された状態で３年までに相当する間保存したＤＢＭ試料の組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った（加速熟成に基づく）。対照的に、水和された形態で保存したＤＢＭ試料は、同じ時間枠内で、その骨誘導性が約５０％低下した（加速熟成に基づく）（図８）。このデータは、両方の保存方法、すなわち、水和された状態または凍結乾燥された状態では、酸性ＤＢＭの骨誘導性は保持されるが、凍結乾燥した酸性ＤＢＭのほうが、より安定であり、３年まででその骨誘導性を少なくとも７５％保持していることを示す。
【０１１４】
【表４】
実施例９：４０℃での酸性ＤＢＭ＋デンプン担体の保存
デンプン担体を含有する酸性ＤＢＭの安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）および担体（マルトデキストリン、改質デンプンおよび水）を含むＤＢＭ組成物（ｐＨ約４．３）を作製し、４０℃の加速熟成に供した。試料をパッケージングし、ホイルパッケージ内に密封した。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行った。８個の試料をその都度調製し、水和された形態で保存した。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存した。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。各加速熟成試料は、室温での０、６、１２、２４および３６ヶ月の熟成後にパラレルで解析した実際の時間の試料を有した。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントした。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行った。組織学的検討の結果、実際の時間で試験した試料と、実際の時間に相当する加速熟成条件との間にはわずかな差があることが示された。このデータは、デンプン担体を含有する酸性ＤＢＭは、３年後、その骨誘導性の７５％より多くで約８０％を保持していることを示す。これはまた、ＤＢＭの実際の時間の熟成との間に相関性があることを実証する。
【０１１５】
【表５】
実施例１０：４０℃での酸性対中性でのＤＢＭの保存
長期安定性を酸性ｐＨのＤＢＭと中性ｐＨのＤＢＭとで比較するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）を含むＤＢＭ組成物を作製し、ｐＨを調整し、加速熟成に供する。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行う。各ｐＨの試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存する。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、酸性ＤＢＭが、骨誘導安定性を少なくとも３年間維持しているが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すはずである。
【０１１６】
実施例１１：中性ＤＢＭのヒアルロン酸担体での安定化
ヒアルロン酸担体でｐＨを安定化させた中性ＤＢＭの安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）をヒアルロン酸担体とともに含むか、またはこれを含まない中性ｐＨのＤＢＭを作製し、加速熟成に供する。ヒアルロン酸担体を含む、または含まない８個の試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、２および５．３週間保存する。アレニウス反応速度式を適用すると、４０℃で５．３週間保存することは、室温で、実際の時間でおよそ１年まで保存することに相当する。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、ｐＨが中性のＤＢＭへのヒアルロン酸担体の添加により骨誘導安定性が少なくとも１年またはそれ以上維持されるが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すことが期待される。
【０１１７】
結果：加速温度で５週間後、両方の非安定化ヒアルロン酸含有試料は、その当初の５０％未満の骨誘導性を有した（図３参照）。２つの安定化した試料は、その当初の５０％より多くの活性を有した。すべての試料について、分析回帰解析を行った。この解析から決定された傾き（分解速度）を、以下の表に示す。先の試験で測定した、凍結乾燥状態または水分の存在下のＤＢＭに関する傾きを、比較の目的で表に含める
【０１１８】
【表６】
実施例１２：中性ＤＢＭのコラーゲン担体での安定化
コラーゲン担体の添加によりｐＨを安定化させた中性ＤＢＭ組成物の安定性を評価するため、プールしたヒト脱灰骨粉末（１００〜５００ミクロン粒径）をコラーゲン担体とともに含むか、またはこれを含まない中性ｐＨのＤＢＭを作製し、加速熟成に供する。加速熟成試験は、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で行う。コラーゲン担体を含む、または含まない試料をその都度調製し、水和された形態で保存する。試験試料をホイルパウチ内に封入し、密封し、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度で、インプラントするまで０、５．３、１０．６、２１．２および３１．８週間保存する。４０℃で表示した時間保存することは、室温で、実際の時間で、それぞれ０、６、１２、２４および３６ヶ月まで保存することに相当する（Ｑ１０＝２に基づく）。試料は、Ｅｄｗａｒｄｓら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３５７：２１９−２２８，１９９８（引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、雌ヌードラットの大腿上方内の筋肉間にインプラントする。続いて、ＤＢＭを、手術の２８日後に外植し、上記の参考文献に記載のようにして組織学的評価および骨誘導性のスコアリングを行う。組織学的検討の結果は、ｐＨが中性のＤＢＭへのコラーゲン担体の添加により骨誘導安定性が少なくとも３年またはそれ以上維持されるが、ｐＨが中性のＤＢＭの骨誘導性は安定が低いことを示すはずである。
【０１１９】
実施例１３：脂質で安定化されたＤＢＭＳの調製
既知量のレシチンを、既知容量の７０％または１００％エタノール中で可溶化する。例えば、４．５ｇ、２．２５ｇまたは１．１２５ｇのレシチンを、１３．５ｍＬのエタノールに溶解する。得られたレシチン含有エタノール混合物は、任意選択で、０．２ミクロンフィルターで濾過してもよい。レシチン／アルコール混合物を、次いで、ＤＢＭ（４．５ ｇ）に添加し、この物質を基質に３０分間浸透させる。この物質を、次いで、凍結および凍結乾燥する。次いで、レシチン／ＤＢＭ組成物を、骨置換材料の製剤化に使用し得る。脂質安定化ＤＢＭは、例えば、改善された外観および感触、活性の増強、改善された安定性および貯蔵寿命の延長などの利点を提供し得る。
【０１２０】
実施例１４：ＤＢＭ製剤
ＤＢＭ製剤の調製。ＤＢＭ製剤は、以下の表に記載のようにして調製される。疎水性の脂質をＤＢＭに、適切な溶媒（アセトン、クロロホルムなど）中で添加し、この物質を、水和された担体を添加する前に凍結乾燥する。組織を不可逆なプロテアーゼインヒビターで処理する場合、該プロテアーゼインヒビターは、一般的に、組織の移植前に洗い流すのがよい。デンプンは、ＤＢＭと混合する前に火を通す（水分の存在下でオートクレーブする）のがよい。
【０１２１】
【表７】
安定性試験。試料を耐湿性容器（アルミニウムホイル）内にパッケージングし、３年を超える期間、室温に置く。種々の期間（例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年など）で、パッケージを開封し、試料の骨誘導性を、適切な動物モデル（例えば、胸腺欠損ラット）において測定する。任意の試料の骨誘導安定性は、任意の試料の骨誘導安定性は、試料の骨誘導活性を時間に対してプロットすることにより得られるベストフィット直線の傾きから決定され得る。加速安定性試験は、高温温度（例えば、３７℃または４５℃）で行うのがよく、結果を室温安定性に外挿する。
【０１２２】
骨誘導活性の測定。
骨誘導性活性は、目的のＤＢＭ製剤を胸腺欠損ラットの非骨格部位内にインプラントし、インプラント部位で誘導された新しい骨、軟骨および骨髄の量を評価することにより測定する。骨誘導活性の測定手順は、以前に詳細に報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＴ，Ｄｉｅｇｍａｎｎ ＭＨ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ＮＬ．“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ”Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１９９８ Ｄｅｃ；（３５７）：２１９−２８（引用により本明細書に組み込まれる））。
【０１２３】
（他の実施形態）
前述のことは、本発明のある特定の非限定的な好ましい実施形態の説明である。当業者には、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が本記載内容に対して行われ得ることが認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、水和された（湿潤）ＤＢＭおよび乾燥（凍結乾燥された）ＤＢＭ組成物の室温での骨誘導性の比較である。
【図２】図２は、４０℃で熟成を加速した、水和された（湿潤）ＤＢＭ組成物および乾燥（凍結乾燥）ＤＢＭ組成物の骨誘導性の比較である。
【図３】図３は、５週間温度加速すると、両方の非安定化ヒアルロン酸含有試料は、その最初の骨誘導性の５０％以下を有した。この２種類の安定化試料は、その最初の活性の５０％より大きかった。すべての試料について、分析回帰解析を行った。この解析から決定された傾き（分解速度）を、実施例１１の表に示す。先の試験で測定した、凍結乾燥状態または水分の存在下のＤＢＭに関する傾きを、比較の目的で表に含める。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱灰骨基質；
少なくとも１種類の非グリセロール安定化手段
を含み、
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２】
グリセロールを含んでいない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脱灰骨基質が、繊維、平板、粒子、糸およびゲルからなる群より選択される形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記非グリセロール安定化手段が、重水（Ｄ２Ｏ）、プロテアーゼインヒビター、非グリセロールポリオール、多糖類および酸からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
水をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記非グリセロール安定化手段が、プロテアーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記プロテアーゼインヒビターが、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチンＡ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびその組合せからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記非グリセロールポリオールが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エリスリトール、水添デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
ｐＨが７未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐＨが５未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ｐＨが４未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｐＨが２未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ｐＨがおよそ３〜４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ｐＨがおよそ４〜５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも７５％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
室温で２年後、その最初の骨誘導性の少なくとも７５％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
室温で２年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも１種類の外来の骨誘導剤または骨形成剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
脱灰骨基質；
非グリセロール担体；および
安定化手段
を含み、
１年後、少なくとも９０％生物学的活性を保持している、
脱灰骨組成物。
【請求項２２】
前記脱灰骨基質が、繊維、平板、粒子、糸およびゲルからなる群より選択される形態である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記担体が、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマー、タンパク質および水からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記担体が、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマーおよび水からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記安定化手段が、重水（Ｄ２Ｏ）、プロテアーゼインヒビター、非グリセロールポリオール、ソルビトールおよび酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
脱灰骨基質；
グリセロール；および
ヒアルロン酸、デンプン、脂質および水からなる群より選択される因子
を含み、
１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２７】
脱灰骨基質；
外来不安定化剤；および
安定化手段
を含み、
１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２８】
前記外来不安定化剤がプロテアーゼである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記外来不安定化剤が、プロテアーゼを含む組織である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
脱灰骨基質；
ヒアルロン酸；および
グリセロール
を含み、
４０℃で５週間後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項３１】
脱灰骨基質；および
ヒアルロン酸
を含み、
ｐＨが７未満であり、
４０℃で５週間後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項３２】
臨床用途のために簡便にパッケージングされた、請求項１に記載の脱灰骨基質組成物を含む、キット。
【請求項３３】
前記脱灰骨基質が滅菌形態でパッケージングされた、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記脱灰骨基質がシリンジ内にパッケージングされた、請求項３２に記載のキット。
【請求項１】
脱灰骨基質；
少なくとも１種類の非グリセロール安定化手段
を含み、
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２】
グリセロールを含んでいない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脱灰骨基質が、繊維、平板、粒子、糸およびゲルからなる群より選択される形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記非グリセロール安定化手段が、重水（Ｄ２Ｏ）、プロテアーゼインヒビター、非グリセロールポリオール、多糖類および酸からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
水をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記非グリセロール安定化手段が、プロテアーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記プロテアーゼインヒビターが、アプロチニン、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、フッ化４−アミノフェニルメタンスルホニル（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチンＡ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、ホルオキシミチン、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、ｌ−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびその組合せからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記非グリセロールポリオールが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エリスリトール、水添デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
ｐＨが７未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐＨが５未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ｐＨが４未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｐＨが２未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ｐＨがおよそ３〜４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ｐＨがおよそ４〜５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも７５％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
室温で１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
室温で２年後、その最初の骨誘導性の少なくとも７５％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
室温で２年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも１種類の外来の骨誘導剤または骨形成剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
脱灰骨基質；
非グリセロール担体；および
安定化手段
を含み、
１年後、少なくとも９０％生物学的活性を保持している、
脱灰骨組成物。
【請求項２２】
前記脱灰骨基質が、繊維、平板、粒子、糸およびゲルからなる群より選択される形態である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記担体が、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマー、タンパク質および水からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記担体が、ヒアルロン酸、コラーゲン、脂質、ポリマーおよび水からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記安定化手段が、重水（Ｄ２Ｏ）、プロテアーゼインヒビター、非グリセロールポリオール、ソルビトールおよび酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
脱灰骨基質；
グリセロール；および
ヒアルロン酸、デンプン、脂質および水からなる群より選択される因子
を含み、
１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２７】
脱灰骨基質；
外来不安定化剤；および
安定化手段
を含み、
１年後、その最初の骨誘導性の少なくとも９０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項２８】
前記外来不安定化剤がプロテアーゼである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記外来不安定化剤が、プロテアーゼを含む組織である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
脱灰骨基質；
ヒアルロン酸；および
グリセロール
を含み、
４０℃で５週間後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項３１】
脱灰骨基質；および
ヒアルロン酸
を含み、
ｐＨが７未満であり、
４０℃で５週間後、その最初の骨誘導性の少なくとも５０％を保持している、
脱灰骨基質組成物。
【請求項３２】
臨床用途のために簡便にパッケージングされた、請求項１に記載の脱灰骨基質組成物を含む、キット。
【請求項３３】
前記脱灰骨基質が滅菌形態でパッケージングされた、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記脱灰骨基質がシリンジ内にパッケージングされた、請求項３２に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５１９４９６（Ｐ２００７−５１９４９６Ａ）
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１５６５（Ｐ２００６−５５１５６５）
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３０９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２６５６
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０５０５２２７２）オステオテック，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３０９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２６５６
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０５０５２２７２）オステオテック，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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