安定性が増大した組換え型第ＶＩＩＩ因子
本発明は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の向上した安定性をもたらす１つ以上の突然変異を含む組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。組換え型第ＶＩＩＩ因子の作製法および使用法、ならびにこれを含む薬学的組成物も開示する。本発明はさらに、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子、ならびにこの単離された核酸分子を含むＤＮＡ発現システムおよび宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１１月１日に出願された米国特許仮出願第６０／９８４，５１８号、および２００７年１１月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／９９１，３０４号（各出願の内容の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ＨＬ７６２１３およびＨＬ３８１９９のもとで、政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血友病Ａは、重篤な遺伝性の出血性疾患の最も一般的なものであり、血漿タンパク質第ＶＩＩＩ因子の欠乏または欠陥が原因である。血友病Ａは不治であり、治療は、（精製）血漿または組換えタンパク質製剤を使用した補充療法からなる。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、非共有結合性金属イオン依存性ヘテロ二量体として循環する。このタンパク質のプロ補因子（ｐｒｏｃｏｆａｃｔｏｒ）形態は、Ａ１（ａ１）Ａ２（ａ２）Ｂドメインから構成される重鎖（ＨＣ）と、（ａ３）Ａ３Ｃ１Ｃ２ドメインから構成される軽鎖（ＬＣ）とを含有し、小文字ａは、酸性残基を豊富に含む短い（約３０〜４０残基）断片を表す（Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)を参照）。第ＶＩＩＩ因子は、トロンビンまたは第Ｘａ因子によって触媒される、Ａ１Ａ２、Ａ２ＢおよびＡ３Ａ３接合部でのタンパク分解による切断によって活性化される。この反応の生成物である第ＶＩＩＩａ因子は、チモーゲン第Ｘ因子のセリンプロテアーゼ、すなわち第Ｘａ因子への膜依存性変換においてセリンプロテアーゼ第ＩＸａ因子の補因子として機能するＡ１、Ａ２、およびＡ３Ｃ１Ｃ２と呼ばれるサブユニットで構成されるヘテロ三量体である（Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)を参照）。
【０００５】
再構成研究によって、第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体構造は、静電相互作用および疎水性相互作用の両方によって支持され（Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Ansongら, “Factor VIII A1 Domain Residues 97-105 Represent a Light Chain-interactive Site,” Biochemistry. 45:13140-13149 (2006)）、鎖間親和性は第ＶＩＩＩ因子結合フォンヴィレブランド因子によってさらに増強される（Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Kaufmanら, “Regulation of Factor VIII Expression and Activity by von Willebrand Factor,” Thromb Haemost. 82:201-208 (1999)）ことが示されている。金属イオンも、鎖間親和性および活性パラメータに貢献する（Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001)）。カルシウムは、活性な第ＶＩＩＩ因子立体構造を得るために必要とされる。突然変異誘発研究では、Ａ１ドメイン（残基１１０〜１２６）内で酸性残基を豊富に含む断片に対するカルシウム結合部位をマップし、イオンの配位において顕著なこの領域内の特異的残基を同定した（Wakabayashiら, “Residues 110-126 in the A1 Domain of Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Required for Cofactor Activity,” J Biol Chem. 279:12677-12684 (2004)）。最近の中間分解能Ｘ線構造（Shenら, “The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII,” Blood 111:1240-1247 (2008)）は、このカルシウム結合部位を確認し、またＡ２ドメイン内の第２の可能性のある部位を示唆した。この構造には、Ａ１およびＡ３ドメイン内の２つの１型銅イオン部位の占有も示された。以前の機能研究では、銅イオンが重鎖と軽鎖との結合を促進して、ヘテロ二量体を形成し、鎖間親和性を生理的ｐＨで数倍増加させることが明らかになった（Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Wakabayashiら, “pH-dependent Association of Factor VIII Chains: Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+,” Biochim Biophys Acta. 1764:1094-1101 (2006); Ansongら, “Factor VIII A3 Domain Residues 1954-1961 Represent an A1 Domain-Interactive Site,” Biochemistry 44:8850-8857 (2005)）。
【０００６】
第ＶＩＩＩａ因子の不安定性は、Ａ２サブユニットとＡ１／Ａ３Ｃ１Ｃ２二量体との間の弱い静電相互作用に起因し（Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Lollarら, “pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII,” J Biol Chem. 265:1688-1692 (1990)）、Ｘａｓｅ因子活性の抑制がもたらされる（Lollarら, “Coagulant Properties of Hybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules,” J Biol Chem. 267:23652-23657 (1992); Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）。第ＶＩＩＩａ因子におけるＡ２サブユニットの結合に関しては限られた情報しか得られず、Ａ１ドメインとＡ３ドメインとの両方における残基は、このサブユニットの維持に貢献すると思われる。いくつかの第ＶＩＩＩ因子点突然変異は、ＷＴに対してＡ２の解離を促進し、これらの残基はＡ１−Ａ２ドメイン境界面（Pipeら, “Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation: Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo,” Blood 93:176-183 (1999); Pipeら, “Hemophilia A Mutations Associated with 1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa,” Blood 97:685-691 (2001)）またはＡ２−Ａ３ドメイン境界面（Hakeosら, “Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3 Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy,” Thromb Haemost. 88:781-787 (2002)）のいずれかに局在化することが明らかにされている。これらの第ＶＩＩＩ因子変異体は、特徴的な一段階法／二段階法（One-stage/Two-stage assay）相違を示し（Duncanら, “Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII Methods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A,” Br J Haematol. 87:846-848 (1994); Rudzkiら, “Mutations in a Subgroup of Patients with Mild Haemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII:C Methods,” Br J Haematol. 94:400-406 (1996)）、Ａ２サブユニット解離速度の増加の結果として、後者の分析によって有意に減少した活性値が測定される。
【０００７】
第ＶＩＩＩ因子のＡドメインのセルロプラスミンに基づく相同性モデルの実験（Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）は、Ａ２ドメインと、Ａ１ドメインおよびＡ３ドメインのそれぞれとの間での境界面の拡張を示唆し、複数の接触の可能性は、結合相互作用に寄与する。
【０００８】
第ＶＩＩＩａ因子の安定化は非常に興味深い。その理由は、より安定なタンパク質の形態は血友病Ａの優れた治療薬であり、患者を治療するために潜在的に必要とする物質が少ないと考えられるからである（Fayら, “Mutating Factor VIII: Lessons from Structure to Function,” Blood Reviews 19:15-27 (2005)）。この目的のために、Ａ２ドメインと他の第ＶＩＩＩ因子ドメインとの間に新規共有結合を導入することによって、Ａ２サブユニットの解離を防止するために、組換えタンパク質において突然変異を生じさせる第ＶＩＩＩ因子の調製物が記載されている（Pipeら, “Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor VIIIa,” Proc Natl Acad Sci USA 94:11851-11856 (1997); Galeら, “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J. Thromb. Haemostasis 1:1966-1971 (2003)）。しかし、これらの種類の突然変異は、下方調節のための手段を実質的に排除するので、治療用第ＶＩＩＩ因子において望ましくない可能性があることが示唆されている。この状況は、血栓形成促進性の状態をもたらし、これは有害である可能性がある。したがって、血栓形成促進性の状態を促進する可能性を最小限にする方法で、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性を高めることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、当該技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす１つ以上の突然変異を含む組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００１１】
好ましくは、１つ以上の突然変異は、Ａ１Ａ２もしくはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれかまたは両方で、疎水性アミノ酸残基で１つ以上の荷電アミノ酸残基の置換を構成する。本発明の特に好ましい組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１２】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子を含む薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子に関する。本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡ発現システム、ならびにＤＮＡ分子および／または組換え発現システムを含有する組換え宿主細胞も、本発明のこの態様に含まれる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で、本発明の第３の態様の宿主細胞を増殖させる段階、および組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する段階を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法に関する。
【００１５】
本発明の第５の態様は、血友病Ａについて動物を治療する方法に関する。この治療法は、血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階を含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、Ａ１Ａ２およびＡ２Ａ３ドメイン境界面での多くの荷電残基は、水素結合に関与しないが、その代わりに第ＶＩＩＩ因子構造を不安定化させる可能性および／または第ＶＩＩＩ因子プロ補因子の活性化後にＡ２サブユニットの解離を促進する可能性があることを示す。埋没した疎水性部分を増大させ、埋没した親水性部分を減少させることを目的として、これらの荷電残基を疎水性残基と置換することによって、ドメイン間結合親和性が向上することを添付の実施例で明らかにした。安定性パラメータを、第ＶＩＩＩ因子変異体の高温での活性およびＡ２サブユニット解離により起こる第ＶＩＩＩａ因子活性の減衰の時間経過にしたがって評価した。これらの研究から得られる結果は、多くの突然変異の結果、Ａ２ドメイン境界面での埋没電荷による可能性が高い不安定化力の消失と一致して、安定性パラメータが増大することを証明した。第ＶＩＩＩ因子のこれらの安定化変異体および活性化第ＶＩＩＩａ補因子は、血友病Ａを治療するための改善された治療法を提供するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、凝固一段階法（黒棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（灰色棒）によって測定される、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の活性を示すグラフである。ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態の活性を、実施例に記載するのと同様にして測定した。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差の値を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、それぞれ、ＷＴならびに突然変異第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を示す。図２Ａにおいて、第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を５５℃でインキュベートし、指定の時間でアリコートを取り出し、実施例で記載するようにして、第Ｘａ因子生成法によって活性について分析した。結果を、ＷＴ（破線、白丸）、Ｒ２８２Ａ（白三角）、Ｓ５２４Ａ（白四角）、Ｎ６８４Ａ（白菱形）、Ｒ５３１Ａ（黒丸）、Ｓ６５０Ａ（黒三角）、Ｅ２８７Ａ（黒四角）、およびＤ３０２Ａ（黒菱形）について示す。図２Ｂにおいて、４０ｎＭの第ＩＸａ因子の存在下でのトロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子（４ｎＭ）を２３℃でインキュベートし、表示された時点でアリコートを取り出し、実施例に記載されるような第Ｘａ因子生成法によって、活性を測定した。結果を、ＷＴ（破線、白丸）、Ｒ２８２Ａ（白三角）、Ｓ５２４Ａ（白四角）、Ｙ１７９２Ｆ（白菱形）、Ｎ６８４Ａ（黒丸）、Ｙ１７８６Ｆ（黒三角）、Ｒ５３１Ａ（黒四角）、Ｅ２８７Ａ（黒菱形）、およびＤ３０２Ａ（灰色円）について示す。選択された高速減衰変異体についての結果を、図２Ｂの挿入図において拡大目盛りで示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、第ＶＩＩＩ因子突然変異体およびＷＴ第ＶＩＩＩ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す。図３Ａは、８％ポリアクリルアミドゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（０．７７μｇ）であり、ＧｅｌＣｏｄｅによって可視化したものを示す。図３Ｂは、８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜に移し、ビオチニルＲ８Ｂ１２抗体によってプローブした、精製ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（０．３４μｇ）を示す。バンドを添付の実施例に記載するような化学蛍光によって可視化した。ＷＴ（レーン１）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（レーン２）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（レーン３）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（レーン４）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（レーン５）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（レーン６）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（レーン７）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（レーン８）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（レーン９）。ＭＷ、分子量マーカー：ｓＦＶＩＩＩ、単鎖形態第ＶＩＩＩ因子：ＨＣ、重鎖：ＬＣ、軽鎖。単鎖形態の、ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態のヘテロ二量体に対する見かけの化学量論比は、０．９６（ＷＴ）、０．６４（Ｇｌｕ２７２Ａｌａ）、０．９２（Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ）、０．７４（Ａｓｐ５１９Ａｌａ）、０．８（Ａｓｐ５１９Ｖａｌ）、０．６４（Ｇｌｕ６６５Ａｌａ）、０．６３（Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ）、０．９１（Ｇｌｕｅ１９８４Ａｌａ）、および０．５（Ｇｌｕ１９８４Ｖａｌ）であった。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の比活性およびトロンビン生成法を示す。図４Ａは、添付の実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて測定した活性値を示す。図４Ｂ〜Ｃは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を示す。ＷＴ（破線）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）。図４Ｄは、トロンビン生成法から得られたパラメータ値を示す。トロンビン生成法を、添付の実施例に記載するようにして実施した。トロンボグラムは、３通りの試料の平均値を示す。パラメータ値をＷＴに対する値（％）で表した。ＷＴの実際の値は、７．５±０．５分（遅延時間）、１３．７±０．３分（ピーク時間）、１５７．３±１４．７ｎＭ（ピーク値）、９７９．８±３７．９ｎＭ／分（ＥＴＰ）であった。遅延時間（白色棒）、ピーク時間（灰色棒）、ピーク値（黒棒）、およびＥＴＰ（縞模様棒）を示す。エラーバーは、３回の別個の測定から平均した標準偏差値を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子の活性減衰を示す。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を様々な温度（５２〜６０℃）でインキュベートし、表示された時間でアリコートを取り出し、添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって活性について分析した。データを非線形最小二乗回帰により適合させ、減衰速度を得た。各点は、３回の独立した測定から平均した値を表す。結果を、ＷＴ（破線、×印）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、Ｇｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）、および完全長Ｋｏｇｅｎａｔｅ第ＶＩＩＩ因子（灰色円）について示す。図５Ａは、５５℃でインキュベーション後の代表的な第ＶＩＩＩ因子減衰曲線を示す。図５Ｂは、様々な温度での第ＶＩＩＩ因子減衰速度のプロットを示す。図５Ｂ中の挿入図は、５２〜５５℃の温度範囲にわたる減衰結果の拡大図である。
【図６】図６は、３７℃の血漿中の第ＶＩＩＩ因子の活性減衰を示すグラフである。第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を３７℃、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿中でインキュベートし、表示された時間にアリコートを取り出し、添付の実施例に記載するような凝固一段階法について分析した。結果をＷＴ（破線、×印）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）について示した。非線形最小二乗回帰に適合させ、各点は、３回の独立した測定からの平均値を表す。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、第ＩＸａ因子の非存在下または存在下でのＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を表すグラフである。図７Ａは、２３℃でインキュベートした、トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子（４ｎＭ）を示す。アリコートを表示された時点で取り出し、活性を添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって測定した。図７Ｂは、第ＩＸａ因子の存在下でのＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を示す。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を、４０ｎＭの第ＩＸａ因子の存在下、トロンビンで活性化した。アリコートを表示された時点で取り出し、活性を添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって測定した。結果を、ＷＴ（破線、×印）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）について示す。データを非線形最小二乗回帰に適合させ、各点は、３回の独立した測定から平均した値を表す。
【図８】図８は、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した、第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体の比活性を示すグラフである。実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて、活性値を測定した。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。
【図９】図９は、ＷＴならびに、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体についての第ＶＩＩＩ因子活性減衰速度を示すグラフである。第ＶＩＩＩ因子活性減衰実験を行い、減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。灰色棒は、最良の単一突然変異体（実施例５、図５Ａ参照）に対する速度を示し、最良（最低）値の速度で割った後に計算した。例えば、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ対合の最良の単一突然変異体に対する速度相対値は、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａの減衰速度をＤ５１９Ａの減衰速度で割ったものに等しい。黒棒は、実際の減衰速度パラメータ値を１０倍で表したもの示す。
【図１０】図１０は、ＷＴならびに、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰速度を示すグラフである。第ＩＸａ因子の非存在下で１．５ｎＭの第ＶＩＩＩａ因子をインキュベーションした後の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰測定を行い、減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。灰色棒は、最良の単一突然変異体に対する速度を示し（実施例７、図７Ａ参照）、図９の説明文に記載するようにして計算した。黒棒は、実際の減衰速度を１０倍で表したものを示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、複合突然変異体を用いたトロンビン生成法の結果を示す。図１１Ａは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のトロンボグラムを示す。トロンビン生成法を実施例に記載するようにしておこなった。試薬の最終濃度は、０．２ｎＭ（第ＶＩＩＩ因子）、０．５ｐＭ（ｒＴＦ）、４μＭ（ＰＳＰＣＰＥベシクル）、４３３μＭ（蛍光発生基質）、１３．３ｍＭのＣａｌＣｌ２、および１０５ｎＭ（トロンビンキャリブレーター）であった。結果を、ＷＴ（破線）、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ（白丸）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ（黒丸）、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ（白三角）、およびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ（黒三角）について示した。図１１Ｂは、トロンビン生成法から得られたパラメータ値を示す。トロンボグラムは、３通りの試料の平均値を示す。パラメータ値を、ＷＴに対する値（％）で表した。ＷＴについての実際の値は、８．５±０．４分（遅延時間）、２１．３±０．６分（ピーク時間）、５８．５±１５．６ｎＭ（ピーク値）、８８３．６±１９９．８ｎＭ／分（ＥＴＰ）であった。遅延時間（白色棒）、ピーク時間（灰色棒）、ピーク値（黒棒）、およびＥＴＰ（縞模様棒）。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、Ｇｌｕ１１３Ａｌａ突然変異と組み合わせた残基Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体についてのＷＴに対する第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の比活性および活性減衰速度を示す。図１２Ａは、実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて測定した、ＷＴに対する複合突然変異体の比活性を示す。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。図１２Ｂは、５５℃での第ＶＩＩＩ因子活性減衰分析結果を示し；減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。図１２Ｃは、第ＩＸａ因子の非存在下で１．５ｎＭの第ＶＩＩＩａ因子をインキュベーションした後の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰測定結果を示し；減衰速度を、実施例に記載するようにして非線形最小二乗回帰によって推定した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす、１つ以上の突然変異を有する組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００１９】
野生型第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子の他の特性、たとえば抗原性、循環半減期、タンパク質分泌、第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性、変更された第ＶＩＩＩ因子不活化切断部位、免疫原性、保存寿命などに影響を与えるように他の方法で修飾された突然変異型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を修飾することによって、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を調製することができる。
【００２０】
本発明にしたがって修飾できる適した野生型第ＶＩＩＩ因子は、限定はされないが、哺乳動物、たとえばヒト（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２４８４（アミノ酸）およびＫ０１７４０（ヌクレオチド）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＤ９７５６６（アミノ酸）およびＡＸ７４６３６０（ヌクレオチド）を参照）、ラット（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＱ２１５８０（アミノ酸）およびＡＹ３６２１９３（ヌクレオチド）を参照）、マウス（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３７３８５（アミノ酸）およびＬ０５５７３（ヌクレオチド）を参照）、モルモット、イヌ（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ８７４１２（アミノ酸）およびＡＦ０１６２３４（ヌクレオチド）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０５３８４（アミノ酸）およびＡＦ０４９４８９（ヌクレオチド）を参照）、ネコ、サル、チンパンジー（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５２９２１２（アミノ酸）およびＸＭ＿５２９２１２（ヌクレオチド）を参照）、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９９３３２（アミノ酸）およびＮＭ＿２１４１６７（ヌクレオチド）を参照）、ヤギ、ウサギ、ならびにニワトリを含む様々な動物由来であり得る。これらおよび他の配列はHaemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site（またはＨＡＭＳＴｅＲＳ）からも電子的に利用可能であり、このサイトはさらに、ヒト、ブタ、ネズミ、およびイヌ第ＶＩＩＩ因子タンパク質の整列化を提供する。このように、哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子タンパク質間の保存および相同性は周知である。
【００２１】
一例として、ヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列をそれぞれ下記配列番号１および２に示す。ヒト第ＶＩＩＩ因子を、「ドメイン」配列ＮＨ２−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨを規定する内部配列相同性を有する約３００ｋＤａの単鎖タンパク質として合成する。第ＶＩＩＩ因子分子中で、本明細書において用いられる「ドメイン」は、内部アミノ酸配列同一性およびトロンビンによるタンパク分解的切断部位によって規定されるアミノ酸の連続配列である。特に断りのない限り、配列をヒトアミノ酸配列（配列番号２）と整列化させる場合、第ＶＩＩＩ因子ドメインは以下のアミノ酸残基を含む：
Ａ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；
Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；
Ｂ、残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８；
Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；
Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；および
Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。
【００２２】
Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、つまり残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドと呼ばれる。第ＶＩＩＩ因子は、トロンビンまたは第Ｘａ因子によってタンパク質分解的に活性化され、これは第ＶＩＩＩ因子をフォンヴィレブランド因子から解離させ、第ＶＩＩＩａ因子を形成し、この第ＶＩＩＩａ因子は、凝結促進機能を有する。第ＶＩＩＩａ因子の生物学的機能は、第ＩＸａ因子の第Ｘ因子活性化に対する触媒効率を数桁増大させることである。トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子は、血小板または単球の表面上で第ＩＸａ因子および第Ｘ因子と複合体を形成する１６０ｋＤａのＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテロ三量体である。本明細書において用いられる「部分ドメイン」は、ドメインの一部を形成するアミノ酸の連続配列である。
【００２３】
野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子は、次のような配列番号１のヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
配列番号１によってコードされる野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子は、次のような配列番号２のアミノ酸配列を有する。
前記配列において、Ｇｌｕ２８７、Ａｓｐ３０２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４などのいくつかの荷電残基は太字体と下線によって識別される。
【００２５】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれか、または両方で、１つ以上の荷電アミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基と置換されていることを特徴とする。好ましくは、置換される荷電残基は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン間の水素結合に関与しない、ＧｌｕまたはＡｓｐ残基のいずれかである。荷電残基を置換する疎水性アミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐのいずれかであり得る。特に適した本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを包含する。Ｄ３０２Ａ、Ｅ２８７Ａ、Ｅ６６５Ａ、Ｅ６６５Ｖ、Ｄ５１９Ａ、Ｄ５１９Ｖ、Ｅ１９８４Ａ、およびＥ１９８４Ｖ置換は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の向上した安定性を有する組換え型第ＶＩＩＩ因子を得るために好ましい。これらの置換の好ましい組み合わせとしては、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、およびＤ５１９ＶＥ１９８４Ａ二重変異体、ならびにＤ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４ＡおよびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ三重変異体が挙げられるが、限定されない。これらの突然変異体の向上した安定性は、第ＶＩＩＩ因子におけるドメイン間境界面の安定化、ならびに野生型第ＶＩＩＩａ因子と比較して、Ａ１／Ａ３Ｃ１Ｃ２からのＡ２サブユニット解離を減少させることによって得ることができると考えられる。
【００２６】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子配列は、従来既知であるか、または後に同定される任意の突然変異型第ＶＩＩＩ因子配列も含むことができ、これらは、たとえば限定はされないが、抗原性、循環半減期、タンパク質分泌、第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性、変更された第ＶＩＩＩ因子不活化切断部位、第ＶＩＩＩａ因子の向上された比活性、免疫原性、および保存寿命などの様々な特質に関して修飾された特性を有する。
【００２７】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の一例は、好ましくは配列番号２の残基１１３で修飾されたカルシウム結合部位を有する第ＶＩＩＩ因子である。これによって、向上した比活性を有する第ＶＩＩＩａ因子が得られる。この種類の突然変異体の例は、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＦａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号に記載されている。好ましくは、残基１１３突然変異体も、前記の突然変異の１つ以上によって（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）修飾され、高安定性／高比活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を得る。高安定性／高比活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の例としては：複合Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、またはＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖ置換を有するものが挙げられるが、限定されない。
【００２８】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第２の例は、配列番号２のアミノ酸残基１〜７４０および１６９０〜２３３２を含有するＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＬｏｌｌａｒに対する米国特許第６，４５８，５６３号を参照）。
【００２９】
本発明のＢドメインのない組換え型第ＶＩＩＩ因子の一実施形態において、ＢドメインをＤＮＡリンカー断片によって置換し、少なくとも１つのコドンを、ブタ第ＶＩＩＩ因子の対応する残基と同じ電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンと置換する（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＨａｕｓｅｒらに対する米国特許出願公開第２００４／０１９７８７５号を参照）。
【００３０】
本発明のＢドメインのない組換え型第ＶＩＩＩ因子の別の実施形態において、修飾された突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、１つ以上の位置で挿入された切断型第ＩＸ因子イントロン１を有するヌクレオチド配列によってコードされる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｎｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，８００，４６１号およびＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，７８０，６１４号を参照）。この組換え型第ＶＩＩＩ因子を、組換え型第ＶＩＩＩ因子をインビトロでさらに高い生産性で得るため、ならびに遺伝子治療用のトランスファーベクターにおいて使用できる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，８００，４６１号を参照）。この実施形態の特定例では、２つの位置で挿入された切断型第ＩＸ因子イントロン１を有し、造血細胞株、および特に血小板において発現を行うために適したプロモーターを有するヌクレオチド配列によって、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードできる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，７８０，６１４号を参照）。
【００３１】
実施形態に関係なく、Ｂドメインのない第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。本明細書の実施例にしたがって調製される組換え型第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｂドメインがない。
【００３２】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第３の例は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原性の原因となるヒトアミノ酸残基の置換として１つ以上の動物アミノ酸残基を含有するキメラヒト／動物第ＶＩＩＩ因子である。特に、動物（たとえば、ブタ）残基置換としては、次の１つ以上を挙げることができるが限定されない：Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８８Ｇ、Ｐ４８５Ａ、Ｌ４８６Ｓ、Ｙ４８７Ｌ、Ｙ４８７Ａ、Ｓ４８８Ａ、Ｓ４８８Ｌ、Ｒ４８９Ａ、Ｒ４８９Ｓ、Ｒ４９０Ｇ、Ｌ４９１Ｓ、Ｐ４９２Ｌ、Ｐ４９２Ａ、Ｋ４９３Ａ、Ｇ４９４Ｓ、Ｖ４９５Ａ、Ｋ４９６Ｍ、Ｈ４９７Ｌ、Ｌ４９８Ｓ、Ｋ４９９Ｍ、Ｄ５００Ａ、Ｆ５０１Ａ、Ｐ５０２Ｌ、Ｉ５０３Ｍ、Ｌ５０４Ｍ、Ｐ５０５Ａ、Ｇ５０６Ａ、Ｅ５０７Ｇ、Ｉ５０８Ｍ、Ｉ５０８Ａ、Ｍ２１９９Ｉ、Ｆ２２００Ｌ、Ｌ２２５２Ｆ、Ｖ２２２３Ａ、Ｋ２２２７Ｅ、および／またはＬ２２５１（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，８５９，２０４号、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７７０，７４４号、およびＬｏｌｌａｒに対する米国特許出願公開第２００３／０１６６５３６号）。好ましくは、組換え型キメラ第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３３】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第４の例は、第ＩＸａ因子に対して向上した親和性を有する第ＶＩＩＩ因子（たとえば、それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Factor VIIIa A2 Subunit Residues 558-565 Represent a Factor IXa Interactive Site,” J. Biol. Chem. 269(32):20522-7 (1994); Bajajら, “Factor IXa: Factor VIIIa Interaction. Helix 330-338 of Factor IXa Interacts with Residues 558-565 and Spatially Adjacent Regions of the A2 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 276(19):16302-9 (2001);およびLentingら, “The Sequence Glu1811-Lys1818 of Human Blood Coagulation Factor VIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX,” J. Biol. Chem. 271(4):1935-40 (1996)を参照）および／または第Ｘ因子（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lapanら, “Localization of a Factor X Interactive Site in the A1 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 272:2082-88 (1997)を参照）である。好ましくは、向上した親和性の第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３４】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第５の例は、第ＶＩＩＩ因子の分泌を向上するために修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Swaroopら, “Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding Site Enhances Secretion of Coagulation Factor VIII,” J. Biol. Chem. 272(39):24121-4 (1997)を参照）。好ましくは、分泌が向上された突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記で同定された突然変異の１つ以上を含有する。
【００３５】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第６の例は、増大した循環半減期を有する第ＶＩＩＩ因子である。この修飾は、たとえば限定はされないが、ヘパラン硫酸（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Sarafanovら, “Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIII Catabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein,” J. Biol. Chem. 276(15):11970-9 (2001)）および／または低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質（「ＬＲＰ」）（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Saenkoら, “Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor in Mediation of Factor VIII Catabolism,” J. Biol. Chem. 274(53):37685-92 (1999);およびLentingら, “The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein,” J. Biol. Chem. 274(34):23734-9 (1999)を参照）との相互作用を低下させることによるなど、様々な方法を用いて行うことができる。好ましくは、半減期が向上した突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３６】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第７の例は、アスパラギン残基でグリコシル化の認識配列を産生するために、既知既存のエピトープ内のアミノ酸をコードするように修飾されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７５９，２１６号を参照）。この例の突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、既存の抑制抗体による検出を免れる修飾された第ＶＩＩＩ因子（低抗原性第ＶＩＩＩ因子）であって、抑制抗体（低免疫原性第ＶＩＩＩ因子）発生の可能性を減少させるものを提供するのに有用であり得る。この例の特定の一実施形態において、修飾された第ＶＩＩＩ因子は、Ｎ結合型グリコシル化のコンセンサスアミノ酸配列を有するように突然変異している。このようなコンセンサス配列の一例は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであり、ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔは、セリンまたはトレオニンを表す（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７５９，２１６号を参照）。好ましくは、グリコシル化部位修飾第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記で同定された突然変異の１つ以上を含有する。
【００３７】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第８の例は、様々な突然変異を有する凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子である、修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＫａｕｆｍａｎらに対する米国特許出願公開第２００４／００９２４４２号を参照）。この実施形態の一例は、（ｉ）フォンヴィレブランド因子結合部位を消失させ、（ｉｉ）Ａｒｇ７４０で突然変異を付加し、（ｉｉｉ）Ａ２ドメインとＡ３ドメインとの間にアミノ酸配列スペーサーを付加するように修飾された修飾第ＶＩＩＩ因子に関し、ここで、アミノ酸スペーサーは、活性化に際して、凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質がヘテロ二量体になるために十分な長さを有するものである（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＫａｕｆｍａｎらに対する米国特許出願公開第２００４／００９２４４２号を参照）。好ましくは、凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子はまた、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記のような突然変異の１つ以上を含有するようにも修飾される。
【００３８】
さらに、凝固因子一般に関する様々な進歩を利用するために、突然変異型第ＶＩＩＩ因子を修飾することができる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Saenkoら, “The Future of Recombinant Coagulation Factors,” J. Thrombosis and Haemostasis 1:922-930 (2003)を参照）。
【００３９】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン境界面（位置２８７、３０２、５１９、６６５、または１９８４を含む）を不安定化する任意の荷電残基で修飾することができ、また、Ｂドメインがないようになるか、キメラになるか、第ＶＩＩＩａ因子活性を向上させる修飾されたカルシウム結合部位を（たとえば、位置１１３において）有するか、変更された不活化切断部位を有するか、向上した第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子親和性を有するか、分泌が向上するか、循環半減期が増加するか、もしくは突然変異型グリコシル化部位を有するように、または荷電残基に対する１つ以上の修飾に加えて、組換え型第ＶＩＩＩ因子の活性を改善する修飾されたカルシウム結合部位を含むこのような修飾のいずれか１つ以上を有するように、修飾することができる。Ｂドメインがなく、比活性が向上された、高安定性組換え型第ＶＩＩＩ因子タンパク質の多くの例を実施例に記載する。
【００４０】
組換え型第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは実質的に純粋な形態で産生される。特定の実施形態において、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子は、少なくとも約８０％の純度であり、さらに好ましくは少なくとも９０％の純度であり、最も好ましくは少なくとも９５％の純度である。実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を、当該技術分野で周知の従来技術によって得ることができる。典型的には、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子が組換え宿主細胞の増殖培地中に分泌される。あるいは、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子が生成するが、増殖培地中に分泌されない。このような場合、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離するために、組換えプラスミドを保有する宿主細胞を増やし、超音波、熱、または化学的処理によって溶解させ、ホモジネートを遠心分離にかけて、細胞片を除去する。上清を次に連続硫酸アンモニウム沈殿に供する。実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を含有する画分を適切なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラム中でゲル濾過にかけて、組換え型第ＶＩＩＩ因子を分離する。必要ならば、タンパク質画分（実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を含有する）を高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）によってさらに精製することができる。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子に関する。組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。
【００４２】
一実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、１９８４、および／または３３２〜３４０において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、第ＶＩＩＩ因子比活性を向上させる位置１１３での突然変異をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４３】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、前記種類のＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４４】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、前記タイプのキメラヒト／ブタをコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４５】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、その不活化部位が、前記のように修飾され、前記のように修飾された第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４６】
さらに別の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、その第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性が向上された、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４７】
なおさらなる実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、様々な血清結合タンパク質がその循環半減期を増大させるように変更されている、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４８】
さらなる実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、培養物中での分泌が増大した第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４９】
さらなる実施形態において、単離された核酸分子は、荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、１つ以上の天然に存在しないグリコシル化部位を有する第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）有し得る。
【００５０】
さらに別の実施形態において、単離された核酸分子は、前記のような任意の１つ以上の荷電残基で修飾された組換え形第ＶＩＩＩ因子をコードし、次の２つ以上を有するようにも修飾される。Ｂドメインがないように修飾されること、キメラであるように修飾されること、変更された不活化切断部位を有するように修飾されること、向上した第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子親和性を有するように修飾されること、分泌が向上するように修飾されること、増大した循環半減期を有するように修飾されること、１つ以上の天然に存在しないグリコシル化部位を有するように修飾されること、ならびにカルシウム結合部位内（たとえば、位置１１３）で修飾され、組換え型第ＶＩＩＩ因子の比活性が改善されること。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ発現システムに関し、この発現システムは、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする。一実施形態において、ＤＮＡ分子は、プロモーターに対してセンス配向にある。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子を含む宿主細胞に関する。特定の実施形態において、宿主細胞は、安定なプラスミドとして、または宿主細胞ゲノム中への安定な挿入物もしくは組み込みのいずれかとしてＤＮＡ分子形態で単離された核酸分子を含有することができる。別の実施形態において、宿主細胞は、発現システム中にＤＮＡ分子を含有することができる。適した宿主細胞は、動物細胞（たとえば、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞）、細菌細胞（たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ９細胞）、真菌細胞、酵母細胞（たとえば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、植物細胞（たとえば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）もしくはタバコ細胞）、または藻類細胞であり得るが、限定されない。
【００５３】
組換えＤＮＡ発現システムおよび宿主細胞を、以下にさらに詳細に議論するような、当該技術分野で周知の様々な組換え技術を用いて産生することができる。
【００５４】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を、従来型の組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞中に組み入れることができる。一般的に、これは、ＤＮＡ分子を、このＤＮＡ分子が異種性である（すなわち、通常、存在しない）発現システム中に挿入することを含む。異種性ＤＮＡ分子を発現システムまたはベクター中にセンス配向および正しいリーディングフレームで挿入する。ベクターは、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する。したがって、本発明の一実施形態は、本発明の単離された核酸を含有するＤＮＡ構築物を提供し、これは、宿主細胞または宿主生物において本発明のコードされた組換え型第ＶＩＩＩ因子の転写および発現をすることができる５’プロモーターと３’調節領域（すなわち、転写ターミネーター）とに機能し得るように結合させる。
【００５５】
本発明の組換え発現システムに関して、当該技術分野で一般的な技術を用いて、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクターを作製することができる。本発明の核酸分子を、当該技術分野で周知の試薬を使用して、多くの入手可能な発現ベクターのいずれかの中に挿入することができる。発現用のＤＮＡベクターの調製において、様々なＤＮＡ配列を通常、細菌プラスミド中に挿入するか、または置換することができる。任意の都合のよいプラスミドを用いることができ、このプラスミドは、細菌複製システム、細菌における選択を可能にするマーカー、および一般的に１つ以上の独自で都合のよい位置にある制限部位を有することを特徴とする。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的宿主に依存する。
【００５６】
様々な宿主ベクターシステムを利用して、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする配列を発現することができる。第１に、ベクターシステムは、使用する宿主細胞と適合性でなければならない。宿主−ベクターシステムとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミッドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；ウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルスなど）に感染した哺乳動細胞システム；ウイルス（たとえば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；および細菌（たとえば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））に感染した植物細胞。これらのベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が異なる。用いられる宿主−ベクターシステムに応じて、多くの適した転写および翻訳エレメントのうちのいずれか１つを使用することができる。
【００５７】
組換えによって産生される場合、第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは変異体）は、組換え宿主細胞、これに限定されないが、典型的には真核生物において発現される。
【００５８】
本発明の実施に適したベクターとしては、これらに限定されないが、次のウイルスベクター、たとえばラムダベクターシステムｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、およびプラスミドベクター、たとえばｐＣＭＶ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／−またはＫＳ＋／−（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、“Stratagene Cloning Systems” Catalog (1993)を参照）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Studier et al, “Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes,” Methods in Enzymology 185:60-89 (1990)）、およびこれらの任意の誘導体が挙げられる。現在既知であるか、または遺伝子形質転換について後に記載される任意の適切なベクターが本発明に関する使用に適している。
【００５９】
組換え分子を形質転換、特に形質導入、結合、モビライゼーション（mobilization）、またはエレクトロポレーションによって細胞中に導入することができる。内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, N.Y.: Cold Springs Laboratory, (1982)に記載されているような、当該技術分野で標準的なクローニング手順を用いて、ＤＮＡ配列をベクター中にクローニングする。
【００６０】
内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒに発行された米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを使用した、組換えプラスミドの形態での発現システムの産生を記載している。これらの組換えプラスミドを次いで、形質転換を用いて導入し、組織培養中で増殖させた原核生物および真核細胞を含む単細胞培養物中で複製させる。
【００６１】
異なる遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象は、多くのレベルの遺伝子発現（たとえば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳）を制御する。
【００６２】
ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、これによってｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に依存する。真核性プロモーターのＤＮＡ配列は、原核性プロモーターのＤＮＡ配列とは異なる。さらに、真核性プロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは、原核システムにおいては認識されないか、または機能せず、さらに、原核性プロモーターは、真核細胞においては認識されないか、または機能しない。
【００６３】
同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる、適切な原核性シグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの有効な翻訳には、ｍＲＮＡ上のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、開始コドン、通常、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードするＡＵＧの前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は１６ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端に対して相補性であり、おそらくはｒＲＮＡで複製して、リボソームの正しい位置決めを可能にすることによって、ｍＲＮＡのリボソームに対する結合を促進する。遺伝子発現の最大化に関する論評については、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Roberts and Lauer, Methods in Enzymology 68:473 (1979)を参照。
【００６４】
プロモーターは、その「強度」（すなわち、その転写を促進する能力）が異なる。クローニングされた遺伝子を発現する目的で、高レベルの転写、したがって遺伝子の発現を得るためには、強力なプロモーターを使用することが一般的に望ましい。用いられる宿主細胞型に応じて、多くの適したプロモーターのいずれか１つを用いることができる。たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてクローニングする場合、そのバクテリオファージ、またはプラスミド、プロモーター、たとえばＴ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージラムダなどのＰＲおよびＰＬプロモーター、たとえばこれらに限定されないが、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどを使用して、隣接するＤＮＡ断片の高レベルの転写を行うことができる。さらに、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは組換えＤＮＡもしくは他の合成ＤＮＡ技術によって産生される他の大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写を提供することができる。
【００６５】
特異的に誘発されない限り、プロモーターの作用を阻害するために、細菌宿主細胞株および発現ベクターを選択することができる。ある操作において、特異的なインデューサーの添加が、挿入されたＤＮＡの有効な転写には必要である。例えば、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）の添加によって誘導される。様々な他のオペロン、たとえばｔｒｐ、ｐｒｏなどは異なる制御下にある。
【００６６】
特異的な開始シグナルも、原核性細胞における有効な遺伝子転写および翻訳に必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子特異的メッセンジャーＲＮＡおよび合成されたタンパク質の量によって測定される「強度」が異なり得る。プロモーターを含有するＤＮＡ発現ベクターは、様々な「強力な」転写および／または翻訳開始シグナルの組み合わせも含み得る。たとえば、大腸菌における有効な翻訳は、リボソーム結合部位を提供するために、開始コドン（「ＡＴＧ」）に対して５’の約７〜９塩基のＳＤ配列を必要とする。したがって、宿主細胞リボソームが利用できる任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを用いることができる。このような組み合わせは、これらに限定されないが、大腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子もしくはＮ遺伝子由来、または，大腸菌トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子由来のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを含む。さらに、組換えＤＮＡまたは合成ヌクレオチドの組み入れを含む他の技術によって産生される任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを用いることができる。
【００６７】
一実施形態において、オープンリーディングフレームが、最適のプロモーターの制御下で、コードされたタンパク質の発現に関して適切に配向するように、本発明の核酸分子を適切なベクター中に、センス方向で組み入れる。これには、適切な調節エレメントがＤＮＡ−ベクター構築物中に含まれることが関与する。これらは、ベクターの非翻訳領域、有用なプロモーター、ならびに宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う５’および３’未翻訳領域を包含する。このようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。使用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、任意の数の適した転写および翻訳エレメント、たとえば構成的および誘導性プロモーターを用いることができる。
【００６８】
構成的プロモーターは、生物の発生および生涯の全体にわたる遺伝子の発現を行うプロモーターである。
【００６９】
誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写をインデューサーに反応して直接的または間接的に活性化することができるプロモーターである。インデューサーの非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。
【００７０】
本発明のＤＮＡ構築物は、最適のタンパク質をコードするＤＮＡ分子と機能し得るように結合した、最適の宿主細胞における発現のためにｍＲＮＡの正しい転写終結およびポリアデニル化を提供できるものから選択される、機能可能な３’調節領域も含むことができる。
【００７１】
それぞれ、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)、およびAusubel, F. M.ら Current Protocols in Molecular Biology, New York, N.Y: John Wiley & Sons (1989) に記載されているような周知の分子クローニング技術を用いて、最適のベクター、プロモーター、および適切な３’調節領域を連結して、本発明のＤＮＡ構築物を産生することができる。
【００７２】
記載したように、原核宿主細胞の使用の１つの代替案は、真核宿主細胞、たとえば哺乳動物細胞の使用であり、これも、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を組換えによって産生するために使用できる。本発明の実施に適した哺乳動物細胞としては、とりわけ：ＣＯＳ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５７３）、ＣＨＯＰ、およびＮＳ−１細胞が挙げられる。
【００７３】
哺乳動物細胞における発現を行うために適した発現ベクターとしては、一般的に、プロモーター、ならびに当該技術分野で公知の他の転写および翻訳制御配列が挙げられる。一般的なプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、前初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられる。
【００７４】
本発明のＤＮＡ構築物はいったん調製されると、いつでも宿主細胞中に組み入れられる状態にある。したがって、本発明の別の態様は、組換え細胞を作製する方法に関する。基本的に、この方法は、宿主細胞におけるＤＮＡ分子の転写を行うために有効な条件下で、宿主細胞を本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することによって行われる。組換え分子を、形質転換、特に形質導入、結合、モビライゼーション、またはエレクトロポレーションによって細胞中に導入することができる。
【００７５】
本明細書において議論する組換え技術を考慮して、本発明の別の態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法に関する。この方法は、本発明の宿主細胞を、この宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で増殖させる段階を含む。組換え型第ＶＩＩＩ因子を次に単離する。一実施形態において、宿主細胞を増殖培地中、インビトロで増殖させる。特定の実施形態において、適した増殖培地としては、制限無く、フォンヴィレブランド因子（本明細書においては「ＶＷＦ」と称する）を含有する増殖培地を挙げることができる。この実施形態において、宿主細胞は、ＶＷＦをコードする導入遺伝子を含有することができるか、またはＶＷＦを増殖培地に補給物として導入することができる。増殖培地中のＶＷＦは、組換え型第ＶＩＩＩ因子のさらに高い発現レベルを可能にするであろう。一旦、組換え型第ＶＩＩＩ因子が増殖培地中に分泌されると、関連する組換えＤＮＡおよびタンパク質分野の通常の技術者に周知の技術（本明細書において記載するものを包含する）を用いて、増殖培地から単離することができる。その他の実施形態において、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法は、組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する前に、宿主細胞を破砕する段階をさらに含む。この実施形態において、組換え型第ＶＩＩＩ因子を細胞片から単離する。
【００７６】
位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４での修飾が特に好ましい。その理由は、修飾の結果、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の向上した安定性が得られるからである。この増大した安定性は、血液凝固中の第ＶＩＩＩ因子の循環半減期および第ＶＩＩＩａ因子の活性に関して重要である。さらに、この特性は、治療用に用いられるタンパク質の精製および調製中に使用可能な第ＶＩＩＩ因子の回収を向上させる点で重要である。
【００７７】
標的細胞において第ＶＩＩＩ因子発現を誘導するためのインビボ形質転換の目的で発現ベクターを使用する場合、様々な強度のプロモーターを、所望の向上の程度に応じて用いることができる。当業者は、適切な哺乳動物プロモーターを、これらのプロモーターとしての強度に基づいて容易に選択することができる。あるいは、第ＶＩＩＩ因子の発現もしくは抑制が望ましい場合、制御の目的で、誘導性プロモーターを用いることができる。当業者は、当該技術分野で公知のものから、適切な誘導哺乳動物プロモーターを容易に選択することができる。最後に、組織特異的哺乳動物プロモーターを、任意の遺伝子形質転換システムの有効性を特定の組織に限定するために選択することができる。組織特異的プロモーターは当該技術分野で公知であり、処理される組織もしくは細胞型に基づいて選択することができる。
【００７８】
本発明の別の態様は、動物の血液障害、たとえば血友病、特に、血友病Ａを治療する方法に関する。この方法は、血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階を含む。組換え型第ＶＩＩＩ因子の適した有効量としては、制限無く、動物の体重１ｋｇあたり約１０〜約５０単位までの間を挙げることができる。動物は、任意の哺乳動物であり得るが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはウサギである。
【００７９】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を用いて、抑制抗体を有する血友病患者および抑制抗体を有さない血友病患者、ならびに抑制抗体の発生による後天的第ＶＩＩＩ因子欠乏の患者における、第ＶＩＩＩ因子欠乏による制御できない出血（たとえば、関節内、頭蓋内、または消化管出血）を治療することができる。特定の実施形態において、組換え型第ＶＩＩＩ因子は、単独または薬学的組成物（すなわち、安定剤、送達ビヒクル、および／または担体との組み合わせ）の形態で、ヒトまたは動物第ＶＩＩＩ因子の注入のために使用される同じ手順に従って患者に静脈内注入される。
【００８０】
その代わりに、またはそれに加えて、組換え型第ＶＩＩＩ因子を、アデノ関連性ウイルスなどのウイルスベクターの投与（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Gnatenkoら, “Human Factor VIII Can Be Packaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated Virus Background: Applicability to Hemophilia A Gene Therapy”Br. J. Haematol. 104:27-36 (1999)）によって、または組換え型第ＶＩＩＩ因子を産生するために遺伝子操作された細胞の移植（典型的には、このような細胞を含有するデバイスの移植による）によって、投与することができる。このような移植は、典型的には、組換え皮膚線維芽細胞、非ウイルス法（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Rothら, “Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation Factor VIII in Patients with Sever Hemophilia”New Engl. J. Med. 344:1735-1742 (2001)）の使用を含む。
【００８１】
このような治療を必要とする患者へ投与すべき組換え型第ＶＩＩＩ因子の治療用量は、第ＶＩＩＩ因子欠乏の重症度に応じて変わる。一般的に、投与量レベルを、それぞれの患者の出血症状の重症度および期間に合った頻度、期間、および単位で調節する。このように、薬学的に許容される担体、送達ビヒクル、または安定剤中に、標準的凝固分析によって測定されるような、出血を停止させるための治療有効量のタンパク質を患者に送達するために十分な量で組換え型第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
【００８２】
第ＶＩＩＩ因子は、伝統的に、血友病Ａの個体由来の血漿中の凝固欠陥を補正する、正常な血漿中に存在する物質として定義される。第ＶＩＩＩ因子の精製および部分精製形態のインビトロ凝集活性を用いて、ヒト患者中へ注入するための組換え型第ＶＩＩＩ因子用量を計算し、患者血漿から回収される活性およびインビボの出血欠陥補正の信頼できるインジケーターである。それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lusherら, “Recombinant Factor VIlI for the Treatment of Previously Untreated Patients with Hemophilia A - Safety, Efficacy, and Development of Inhibitors”, New Engl. J. Med. 328:453-459 (1993); Pittmanら, “A2 Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required for Procoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage”, Blood 79:389-397 (1992); およびBrinkhousら, “Purified Human Factor VIlI Procoagulant Protein: Comparative Hemostatic Response After Infusions into Hemophilic and von Willebrand Disease Dogs”, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755 (1985)によると、インビトロの新規第ＶＩＩＩ因子分子の標準的分析と、イヌ注入モデルもしくはヒト患者におけるそれらの挙動との間の相違は報告されていない。
【００８３】
通常、組換え型第ＶＩＩＩ因子の投与によって患者で達成される望ましい血漿第ＶＩＩＩ因子活性レベルは、正常の３０〜１００％の範囲である。一実施形態において、治療的組換え型第ＶＩＩＩ因子の投与は、約５〜５０単位／体重ｋｇの範囲、特に１０〜５０単位／体重ｋｇ、さらに詳細には２０〜４０単位／体重ｋｇの範囲の好ましい投与量で静脈内投与され；投与間隔は約８〜２４時間（重度の血友病患者において）の範囲であり；治療期間の日数は、１〜１０日の範囲であるか、または出血症状が消散するまでである。たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Roberts and Jones, “Hemophilia and Related Conditions--Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII),” Ch. 153, 1453-1474, 1460, Hematology, Williams, W. J.,ら, ed. (1990)を参照。阻害物質を有する患者は、第ＶＩＩＩ因子の先の形態とは異なる量の組換え型第ＶＩＩＩ因子を必要とし得る。例えば、患者が必要とする組換え型第ＶＩＩＩ因子は少ない。その理由は、比活性が野生型ＶＩＩＩよりも高く、その抗体反応性が減少しているからである。ヒトまたは血漿由来の第ＶＩＩＩ因子を用いた治療においてと同様、注入される治療的組換え型第ＶＩＩＩ因子の量は、一段階第ＶＩＩＩ因子凝固分析によって定義され、選択された例では、インビボ回収率（ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は、注入後の患者の血漿中の第ＶＩＩＩ因子を測定することによって決定される。特定の患者について、特定の投与レジメンを長時間にわたって、個々の要求ならびに、組成物を投与するかまたは投与を監督する人物の専門的な判断にしたがって調節すべきであり、本明細書で前述した濃度範囲は単なる例示であり、特許請求される組換え型第ＶＩＩＩ因子の範囲または実施を制限することを意図するものではないと理解すべきである。
【００８４】
治療は、必要に応じて、組換え型第ＶＩＩＩ因子の１回の静脈内投与、または長時間にわたる周期的もしくは連続投与の形態をとることができる。あるいは、治療用組換え型第ＶＩＩＩ因子を、リポソームとともに１回もしくは複数回、様々な時間間隔で皮下または経口投与することができる。
【００８５】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を用いて、ヒト第ＶＩＩＩ因子に対する抗体が生じた血友病患者における、第ＶＩＩＩ因子欠乏が原因の制御できない出血を治療することができる。
【００８６】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子とは比活性が異なり得ることを本明細書において示した。野生型第ＶＩＩＩ因子由来の高い凝固促進活性を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、血友病の治療において有用である。その理由は、患者の第ＶＩＩＩ因子欠損を補正するために必要な投与量が少ないからである。このことによって、患者と保険会社との双方の医療費が軽減されるだけでなく、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応発生の可能性も軽減される（投与される抗原が少ないため）。
【００８７】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するためのものであり、その範囲を制限するものではない。
【００８８】
材料および方法
試薬
組換え型第ＶＩＩＩ因子（Ｋｏｇｅｎａｔｅ（商標））はＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州バークレー）のＬｉｓａ Ｒｅｇａｎ博士より贈与された。２０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、４０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、および４０％のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含有するリン脂質ベシクルを、すでに記載されたようにオクチルグルコシドを用いて調製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Mimmsら, “Phospholipid Vesicle Formation and Transmembrane Protein Incorporation Using Octyl Glucoside,” Biochemistry 20:833-840 (1981)）。試薬α−トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａβ因子、第Ｘ因子、および第Ｘａ因子（インディアナ州サウスベンドのＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヒルジンおよびリン脂質（オハイオ州ウェストチェスターのＤｉａＰｈａｒｍａ）、発色Ｘａ基質、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ Ｘａ（Ｐｅｆａ−５５２３、ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＡｃＯＨ；コネチカット州ノーウォークのＣｅｎｔｅｒｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）、組換えヒト組織因子（ｒＴＦ）、Ｉｎｎｏｖｉｎ（デラウェア州ニューアークのＤａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、蛍光発生基質、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（カリフォルニア州サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ならびにトロンビンキャリブレーター（ニュージャージー州パーシッパニーのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）を、指定の供給元から購入した。
【００８９】
ＷＴおよび変異型第ＶＩＩＩ因子の構築、発現および精製：
Ａｌａ突然変異体（Ｄ２７、Ｈ２８１、Ｒ２８２、Ｅ２８７、Ｄ３０２、Ｓ３１３、Ｈ３１７、Ｔ５２２、Ｓ５２４、Ｒ５３１、Ｎ５３８、Ｅ５４０、Ｓ６５０、Ｓ６５４、Ｄ６６６、Ｅ６８３、Ｎ６８４、Ｓ６９５、Ｄ６９６、Ｓ１７９１、Ｄ１７９５、Ｑ１８２０、Ｅ１８２９、Ｓ１９４９、Ｎ１９５０、およびＲ１９６６）；Ｐｈｅ突然変異体（Ｙ４７６、Ｙ６６４、Ｙ１７８６、およびＹ１７９２）；ＡｌａおよびＶａｌ突然変異体（荷電残基Ｅ２７２、Ｄ５１９、Ｅ６６５、およびＥ１９８４）；ならびにＷＴ第ＶＩＩＩ因子形態を、Ｂドメインで残基Ｇｌｎ７４４〜Ｓｅｒ１６３７が欠損したＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子として個々に構築した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Doeringら, “Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII,” Thromb Haemost. 88:450-458 (2002)）。クローニングおよび発現構築物は、Ｐｅｔｅ Ｌｏｌｌａｒ博士およびＪｏｈｎ Ｈｅａｌｅｙ博士から贈与された。組換えＷＴおよび変異型第ＶＩＩＩ因子形態は、ＢＨＫ細胞において安定して発現され、すでに記載されているようにして精製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Residues 110-126 in the A1 Domain of Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Required for Cofactor Activity,” J Biol Chem. 279:12677-12684 (2004)）。トランスフェクション後、変異体間で第ＶＩＩＩ因子分泌の量には有意な差はなかった。変異体のタンパク質収量は、２つの７５０ｃｍ２培養フラスコからは１０超〜約１００μｇの範囲であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定すると、純度は約８５％〜９５％超であった。第ＶＩＩＩ因子調製物中の主な汚染物質はアルブミンであり、第ＶＩＩＩ因子中に存在する濃度では、活性パラメータの安定性に対して影響をおよぼさなかった。第ＶＩＩＩ因子濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定し、第ＶＩＩＩ因子活性を以下に記載するような凝固一段階法および発色性第Ｘａ因子生成二段階法によって決定した。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ゲル染色については０．７７μｇ、ウェスタンブロットについては０．３４μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル上、一定電圧（１００Ｖ）で電気泳動させた。ゲルをＧｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（イリノイ州ロックフォードのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色するか、またはポリフッ化ビニリデン膜に移し、ビオチニル抗Ａ２抗体（Ｒ８Ｂ１２、バーモント州バーリントンのＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）でプローブし、続いてペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（カリフォルニア州サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともにインキュベートした。化学蛍光基質（ＥＣＦ基質、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を反応させ、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｓｔｏｒｍ８６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて蛍光シグナルをスキャンした。単鎖第ＶＩＩＩ因子形態（１７０ｋＤａ）および重鎖（ＨＣ、９０ｋＤａ）の密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量化し、量の比を計算した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡ
サンドウィッチＥＬＩＳＡを実施して、すでに記載されているようにして（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “A Glu113Ala Mutation within a Factor VIII Ca2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase,” Biochemistry 44:10298-10304 (2005)）、精製された市販の組換え型第ＶＩＩＩ因子（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を標準として使用して、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の濃度を測定した。抗Ｃ２抗体（ＥＳＨ−８、コネチカット州スタムフォードのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）およびビオチニルＲ８Ｂ１２抗体を使用した第ＶＩＩＩ因子捕捉を、第ＶＩＩＩ因子検出のために使用した。
【００９２】
凝固一段階法
凝固一段階法を、第ＶＩＩＩ因子を化学的に消耗させた基質血漿（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Over, “Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII (VIII:C),” Scand J Haematol Suppl. 41:13-24 (1984)）を用いて実施し、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ凝固装置を用いて分析した。血漿をＡＰＴＴ試薬（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とともに６分間、３７℃でインキュベートし、その後、第ＶＩＩＩ因子の希釈液をキュベットに添加した。１分後、混合物を再石灰化させ、凝固時間を測定し、プールされた正常血漿標準と比較した。
【００９３】
発色性第Ｘａ因子生成二段階法
第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換速度を、精製システム（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lollarら, “Factor VIII and Factor VIIIa,” Methods Enzymol. 222:128-143 (1993)）において、すでに記載されている方法（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001); Wakabayashiら, “Ca2+ Binding to Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for Cofactor Activity,” Biochemistry 41:8485-8492 (2002)）に従ってモニターした。２０ｍＭのＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．２）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％のＢＳＡ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および１０μＭのＰＳＰＣＰＥベシクル（緩衝液Ａ）を含有する緩衝液中第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を、２０ｎＭのα−トロンビンで１分間活性化した。ヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）を添加することによって反応を停止させ、結果として得られた第ＶＩＩＩａ因子を第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）と１分間反応させた。第Ｘ因子（３００ｎＭ）を添加して、反応を開始させ、５０ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって、１分後に停止させた。生成した第Ｘａ因子を、発色基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ Ｘａ（最終濃度０．４６ｍＭ）との反応後に決定した。すべての反応を２３℃で実施した。
【００９４】
トロンビン生成法
血漿中の生成したトロンビンの量を、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈｙ（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma,” Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4-15 (2003); Hemkerら, “Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential,” Thromb Haemost. 74:134-138 (1995)）によって測定した。９６穴プレート中、第ＶＩＩＩ因子阻害物質が欠損した重度血友病Ａ患者由来の第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿、８０μｌ（１％未満の残留活性、血小板不足）（カンザス州オーバーランド・パークのＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）を第ＶＩＩＩ因子試料（２０μｌ；６ｎＭ）と３ｐＭのｒＴＦ（ｒＴＦストックの濃度は、第Ｘａ因子生成法により、既知濃度の第ＶＩＩａ因子を用いて決定した）、ＰＳＰＣＰＥベシクル（２４μＭ）または２０μｌのトロンビンキャリブレーター（６３０ｎＭ）を含有するＨＥＰＥＳ−ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５、０．１５ＭのＮａＣｌ、６％のＢＳＡ）中で混合し、０．１ＭのＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ−ＢＳＡ緩衝液中で２０μｌの蛍光発生基質（２．５ｍＭ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）と混合することにより、反応を直ちに開始させた。全ての試薬を３７℃で予熱した。試薬の最終濃度は、１ｎＭの第ＶＩＩＩ因子（他の表示がある場合を除く）、０．５ｐＭのｒＴＦ、４μＭのＰＳＰＣＰＥベシクル、４３３μＭの蛍光発生基質、１３．３ｍＭのＣａｌＣｌ２、および１０５ｎＭのトロンビンキャリブレーターであった。３７℃での蛍光シグナルの発生を、８秒間隔で、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓｐｅｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ、カリフォルニア州サニーベールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（３５５ｎｍ（励起）／４６０ｎｍ（発光）フィルターセット）を用いてモニターした。蛍光シグナルをトロンビンキャリブレーター試料からの参考シグナルによって補正し（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma,” Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4-15 (2003)）、実際のトロンビン生成（ｎＭ）をすでに記載されているようにして計算した（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential,” Thromb Haemost. 74:134-138 (1995)）。
【００９５】
高温での第ＶＩＩＩ因子活性
緩衝液Ａ中のＷＴ第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子変異体（４ｎＭ）を５２〜６０℃でインキュベートした。アリコートを表示された時間で取り出し、残存する第ＶＩＩＩ因子活性を、発色性第Ｘａ因子生成二段階法を用いて測定した。
【００９６】
第ＶＩＩＩａ因子活性時間経過
１０μＭのＰＳＰＣＰＥベシクルを含有する緩衝液Ａ中のＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を、２０ｎＭのトロンビンによって１分間２３℃で活性化した。反応をヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）によって直ちに停止させ、アリコートを表示された時間で取り出し、第Ｘａ因子生成法を用い、続いて第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）および第Ｘ因子（３００ｎＭ）を添加して、活性を決定した。第ＩＸａ因子の存在下で減衰測定を実施するために、第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）をトロンビン添加の前に反応に添加した。
【００９７】
血漿中の第ＶＩＩＩ因子安定性
ＷＴまたは変異型第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を第ＶＩＩＩ因子阻害物質が欠損した重度の血友病Ａ患者（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）由来の第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（１％未満の残留活性）に添加した。血漿に０．０２％のＮａＮ３を添加して、微生物の増殖を防止し、試料を３７℃でインキュベートした。アリコートを表示された時間で取り出し、凝固一段階法によって残留活性を決定した。
【００９８】
データ分析
時間の関数としての第ＶＩＩＩａ因子活性値を、式
Ａ＝Ａ０×ｅ−ｋ・ｔ
（式中、Ａは残留第ＶＩＩＩａ因子活性（ｎＭ／分／ｎＭ第ＶＩＩＩ因子）であり、Ａ０は初期活性であり、ｋは見かけの速度定数であり、ｔは高温での第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子減衰実験について）またはトロンビン活性化を失活させた後（第ＶＩＩＩａ因子減衰測定について）のいずれかの反応時間（分）である）を用いて、非線形最小二乗回帰によって単一指数関数減衰曲線に適合させた。非線形最小二乗回帰分析をＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（ペンシルベニア州レディングのＳｙｎｅｒｇｙ）によって実施した。平均値の比較をスチューデントのｔ検定によって実施した。第ＶＩＩＩＡ因子ドメインモデル化構造（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）を、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて分析して、Ａ２ドメイン境界面に位置し、相補性ドメインの極性原子を隔てる２．８Å超の閾値に基づいて、水素結合相互作用の可能性をほとんど示さない荷電残基を同定した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Weinerら, “A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins,” J Am Chem Soc. 106:765-784 (1984)）。
【００９９】
実施例１：水素結合相互作用を標的とする第ＶＩＩＩ因子突然変異体の活性値
第ＶＩＩＩ因子中のＡ２ドメインに関与する結合相互作用は、まだ十分理解されていないが、補因子活性調節の主なメカニズムである。第ＶＩＩＩ因子相同性モデル（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）は、Ａ２ドメイン中の残基と、Ａ１もしくはＡ３ドメイン中の残基とを結合させる多くの水素結合の可能性を特定する。水素ドナーとアクセプター原子との間の２．８Å未満の空間的距離の基準を用いて（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Weinerら, “A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins,” J Am Chem Soc. 106:765-784 (1984)）、３０残基が相補性Ａドメインからの原子との水素結合に関与し得る側鎖原子を有すると確認された（下表1を参照）。同定された残基の約半分で、側鎖原子は骨格カルボニル酸素またはアミド水素原子のいずれかに隣接し、一方、残りは、隣接する側鎖間の可能な相互作用に相当していた。Ｔｙｒ残基がＰｈｅと置換される以外は、第ＶＩＩＩ因子Ａドメイン中の標的残基は、個々にＡｌａに変異され、点突然変異は、Ｂドメインのない第ＶＩＩＩ因子として安定して発現された。
【０１００】
第ＶＩＩＩ因子活性を、凝固一段階法および（二段階）第Ｘａ因子生成法を用いて、精製タンパク質について測定した。一段階分析からの結果（図１）から、３０の点突然変異体のうちの９が、活性ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対して５０％未満の活性を示すことがわかった。これらの変異体のうちの５つは、一段階／二段階分析の相違（１．５倍超の相違）を示し、３つの突然変異体（Ｓ５２４Ａ、Ｈ２８１Ａ、およびＥ２８７Ａ）は二段階分析においてのみ減少を示した。いくつかの標的残基における突然変異についての減少した活性値は、第ＶＩＩＩ因子および／または第ＶＩＩＩａ因子の構造安定性に対する側鎖の寄与と一致した。
【０１０１】
（表１）水素結合できるアミノ酸残基
ａ骨格カルボニル酸素原子
ｂ骨格アミド水素原子
【０１０２】
実施例２：第ＶＩＩＩ因子変異体の熱安定性
ＷＴプロ補因子および変異体の熱安定性を評価するために、以前の研究で記載されている第ＶＩＩＩ因子不活化結果（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ansongら, “Factor VIII A3 Domain Residues 1954-1961 Represent an A1 Domain-Interactive Site,” Biochemistry 44:8850-8857 (2005)）に基づいて、５５℃の温度を採用した。これらの反応に関して、第ＶＩＩＩ因子を表示された時間、高温でインキュベートし、その後、反応混合物を直ちに室温まで冷却し、第ＶＩＩＩ因子をトロンビンと反応させ、第Ｘａ因子生成法を用いて補因子活性について分析した。残留補因子機能によって判定されるような、第ＶＩＩＩ因子活性の熱処理に対する損失率を、方法に記載されるようにして決定した。図２Ａは、ＷＴと比較した、熱処理に対して最大および最低感受性を示す変異体についての結果を示す。
【０１０３】
表２（下記）に、３０の変異体についての第ＶＩＩＩ因子熱安定性分析から得られた結果をまとめる。全体的に、これらの活性データは、ほとんどの場合、０．９８を超える相関関数で単一指数関数減衰関数によく適合する。多くの突然変異はアミノ酸置換に対して良性であるが（２１が減衰速度において２倍未満の差を示す）、Ａｒｇ２８２（Ａ１ドメイン）、ならびにＡ２ドメイン残基Ｓｅｒ５２４、Ａｓｎ６８４およびＳｅｒ６５０などのいくつかの残基は、第ＶＩＩＩ因子減衰において約５〜約２０倍増加した速度を示し、このことは、第ＶＩＩＩ因子安定性の維持におけるこれらの残基の重要な役割を示唆する。さらに、Ｒ２８２ＡおよびＮ６８４Ａ変異体は、著しく減少した比活性値を示し、このことは、活性パラメータと安定性パラメータとの両方が、点突然変異によって影響を受けたことを示唆する。他方、Ｅ２８７およびＤ３０２のＡｌａとの置換によって、高温での第ＶＩＩＩ因子減衰に関して速度が減少した。このような、突然変異後のタンパク質安定性の見かけの増加は、ＷＴ補因子におけるドメイン間相互作用を不安定化するこれらの酸性側鎖と一致する。
【０１０４】
（表２）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度ならびに活性値
突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態は、第ＶＩＩＩ因子減衰の減少速度に基づいて並べられている。速度減衰値についての標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ第ＩＸａ因子の存在下で実施した減衰実験
ｂ第ＩＸａ因子の非存在下で実施した減衰実験
ｃ括弧内の値は、野生型に対する値である。
ｄ単位／μｇ
ｅ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）
【０１０５】
実施例３：第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
第ＶＩＩＩａ因子活性は、Ａ２サブユニット解離のために不安定である（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Lollarら, “pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII,” J Biol Chem. 265:1688-1692 (1990)）。従来の研究から得られた結果は、第ＩＸａ因子およびリン脂質ベシクルに第ＶＩＩＩａ因子を含めて、Ｘａｓｅ複合体を形成することにより、Ｘａｓｅ因子内のＡ２サブユニットが部分的に安定化されることによって（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）、補因子の不安定性が軽減されたことがわかる（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lollarら, “Stabilization of Thrombin-activated Porcine Factor VIII:C by Factor IXa Phospholipid,” Blood 63:1303-1308 (1984); Lamphearら, “Factor IXa Enhances Reconstitution of Factor VIIIa from Isolated A2 Subunit and A1/A3-C1-C2 Dimer,” J. Biol. Chem. 267:3725-3730 (1992)）。この方法は、近年、Ｅ１８２９Ａ第ＶＩＩＩａ因子突然変異体の減衰速度を調べるために用いられた（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “A3 Domain Residue Glu1829 Contributes to A2 Subunit Retention in Factor VIIIa,” J. Thromb. Haemost. 5:996-1001(2007)）。その理由は、第ＩＸａ因子および膜の非存在下で、この変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰は速すぎて、正確に測定できなかったからである。この方法は、この実施例に記載する変異体のパネルの第ＶＩＩＩａ因子減衰の速度を評価するためにも同様に用いられた。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を１モル過剰の第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）およびリン脂質ベシクルとともにインキュベートし、トロンビンで迅速に活性化し、その後のＸａｓｅ因子活性を２３℃で長時間にわたって測定した。Ｘａｓｅ因子活性の減衰速度は、Ａ２サブユニット解離に起因し、単一指数関数減衰を用いてデータを適合させた。第ＶＩＩＩａ因子（１４４ｎＭ）内のＡ２サブユニットの親和性について高いＫｄ値、および反応において使用される低い第ＶＩＩＩａ因子濃度（４ｎＭ）を考慮に入れると、解離したＡ２サブユニットの再会合の影響は無視でき、この回帰分析に適用した単純な単一指数関数の使用を支持する。
【０１０６】
結果を図２Ｂに示す。この図は、最も大きく影響を受けた変異体ならびに突然変異に対して正の応答を示す変異体についてのデータを示す。７つの変異体で、ＷＴと比較して、第ＶＩＩＩａ因子減衰速度において有意に（５倍超）増加した（表２）。これらの突然変異には、Ｒ２８２Ａ、Ｓ５２４Ａ、Ｎ６８４Ａ、Ｅ１８２９Ａ、Ｙ１７８６Ｆ、Ｄ６６６Ａ、およびＹ１７９２Ｆが含まれる。二段階分析によって測定されるこれらの変異体の第ＶＩＩＩ因子活性値は、一段階分析によって測定されるものよりも有意に低く（図１）、かなりの速度のＡ２サブユニット解離をもたらす突然変異と一致する。さらに、これらの突然変異のいくつか（Ｒ２８２Ａ、Ｎ６８４ＡおよびＹ１７９２Ｆを包含する）は、一段階分析において全体的に低い比活性を示した。この分析相違を有する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の場合と同様、一段階分析から決定される活性も減少し（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pipeら, “Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation: Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo,” Blood 93:176-183 (1999); Pipeら, “Hemophilia A Mutations Associated with 1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa,” Blood 97:685-691 (2001); Hakeosら, “Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3 Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy,” Thromb Haemost. 88:781-787 (2002)）、おそらくは、第ＶＩＩＩ因子活性の決定に対するＡ２解離速度の直接的影響を反映するものであろう。
【０１０７】
反対に、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子よりも高い熱安定性を有する変異型Ｅ２８７ＡおよびＤ３０２Ａによっても、トロンビンによる活性化後の補因子減衰の速度の減少によって判断される、第ＶＩＩＩａ因子の安定性が向上した。Ｄ３０２Ａ変異体に関する結果はさらに顕著であり、ＷＴ第ＶＩＩＩａ因子に対して補因子減衰の速度を約２倍減少させ、４０分後にその本来の活性の約９０％を保持していた。この観察結果は、プロ補因子におけるドメイン間境界面で立体構造を主に変更する突然変異と一致していた。
【０１０８】
あわせると、実施例１〜３におけるこれらの結果は、第ＶＩＩＩ因子のプロ補因子および補因子形態におけるＡ２（ドメイン）サブユニット間相互作用に対する複数の残基の寄与を特定し、選択された残基はタンパク質安定性に対して本質的に異なる寄与をする。標的残基での突然変異の観察される効果は、ほとんどの部分について良性であるか、または有害であるかのいずれかであるが、２つのＡ１ドメイン酸性残基であるＤ３０２およびＥ２８７での突然変異によって、プロ補因子形態と活性補因子形態との両方において、安定性が適度に向上した。Ｅ２８７の相対的活性は、ＷＴと比較して若干減少したが、Ｄ３０２変異体の活性値は、ＷＴタンパク質と区別できず、このことは、後者が機能獲得型突然変異であることを示唆する。これらの結果から、一部の不安定化は、（負の）電荷を境界面で埋没させること、および／または残基側鎖が疎水性である場合の安定性の増大に起因することがわかる。
【０１０９】
実施例４：さらなる標的残基の同定ならびにＧｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４での点突然変異体の生成
前記実施例の結果に基づき、他の荷電残基の置換を調査した。セルロプラスミンベースの相同性モデル（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）を第ＶＩＩＩ因子のＡドメインについて用いて、４つの荷電残基を同定した（Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４）。これらの４つの残基は、Ａ２ドメインと、Ａ１ドメイン（Ｇｌｕ２７２およびＡｓｐ５１９）またはＡ３ドメイン（Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４）との境界面で埋没しているようであるが、隣接基の結合可能性を有する２．８Åより大きい空間隔離に基づいて、Ｈ結合相互作用には寄与しなかったと思われる。これらの残基は、ＡｌａまたはＶａｌのいずれかに変異されて、電荷を除去し、また他の埋没残基由来の類似の側鎖との潜在的な疎水性相互作用を提供した。第ＶＩＩＩ因子変異体を安定に発現するＢＨＫ細胞株におけるＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子として調製した。
【０１１０】
第ＶＩＩＩ因子を、単鎖およびヘテロ二量体形態の混合物として発現させた。精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定すると、約８５％〜約９５％超の範囲であった（図３Ａ）。抗Ａ２ドメイン抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して、単鎖およびヘテロ二量体形態の化学量論を定量化した（図３Ｂ）。この値は、ＷＴについてはほぼ１つであり、第ＶＩＩＩ因子変異体については若干低く、可変的であった。
【０１１１】
精製タンパク質を、一段階分析と二段階分析との両方（図４Ａ）およびトロンビン生成パラメータ（図４Ｂ〜Ｄ）を使用して、比活性について評価した。Ｇｌｕ２７２Ａｌａ変異体を除いた全て、ＷＴの少なくとも８０％である比活性値をもたらし、このことは、残存する突然変異がたとえあったとしても少ししか第ＶＩＩＩ因子補因子機能に影響を及ぼさないことを示唆する。低いｒＴＦ濃度（０．５ｐＭ）および生理学的濃度（１ｎＭ）の第ＶＩＩＩ因子で実施したトロンビン生成によって、比活性値と類似した結果が得られた。図４Ｄに示されるパラメータ値から、Ｇｌｕ２７２Ａｌａのピーク値およびＥＴＰはＷＴと比較して減少し、一方、残りの変異体の他の全てのパラメータ値は、ＷＴ値の８０超〜１１０％の範囲であったことがわかった。
【０１１２】
実施例５：Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４第ＶＩＩＩ因子変異体の熱安定性
精製第ＶＩＩＩ因子突然変異体タンパク質を、活性損失速度によって判断される、高温での安定性について評価した。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を５２〜６０℃でインキュベートし、指定の時間でアリコートを取り出し、室温に冷却し、トロンビンと反応させ、材料および方法に記載されているような第Ｘａ因子生成法を使用して、残留補因子活性を測定した。図５Ａに示す結果は、第ＶＩＩＩ因子ＷＴおよび変異体の５５℃での活性減衰の時間経過を示す。この温度は、以前の研究（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ansongら, “Factor VIII A1 Domain Residues 97-105 Represent a Light Chain-interactive Site,” Biochemistry 45:13140-13149 (2006)）に基づいて選択され、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子について１時間以内でほぼ完全な活性損失を示した。ＷＴタンパク質は約１５分で５０％の活性を失った。Ｇｌｕ２７２ＡｌａおよびＧｌｕ２７２Ｖａｌ変異体は、若干速い活性減衰によって判断されるように、安定性の低下を示すことが観察され、この特性は、この部位での突然変異について観察される低下した比活性と関連する。他方、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４についてのＡｌａおよびＶａｌ置換はすべて、高温で改善された安定性を示し、２つの前者の部位での突然変異を有する変異体は約２０〜２５分にわたって５０％活性を保持し、一方、後者の部位での突然変異は、３０分超にわたってこの活性レベルを維持する変異体をもたらした。適合させた曲線から得られた減衰速度値の比較（下記表１）は、第ＶＩＩＩ因子熱安定性は、ＷＴと比較して、Ｇｌｕ１９８４変異体について約２倍改善されたことを示し、Ｖａｌへの突然変異は、Ａｌａより若干好ましいように見える。
【０１１３】
温度範囲を評価する結果（図５Ｂ）から、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４のＡｌａおよびＶａｌの両変異体は、試験した全ての温度で、ＷＴと比較して２倍までの減衰速度の減少を一貫して示したことがわかった。しかし、単鎖形態とヘテロ二量体形態との両方が様々な比で存在することによって、１つの形態がより高い安定性を示す場合、これらの減衰速度結果に影響を及ぼし得る。本質的に全てヘテロ二量体形態であるＫｏｇｅｎａｔｅ第ＶＩＩＩ因子を用いた対照実験（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001)）によって、ＷＴの約２倍である減衰速度が得られ（図５Ｂ）、単鎖第ＶＩＩＩ因子よりも高温に対して低い安定性を示すヘテロ二量体形態と一致した。したがって、測定された減衰速度は、明らかに、様々な第ＶＩＩＩ因子形態中の単鎖および２本鎖含有量の不均一性に起因する。しかし、すべての変異体がＷＴと比較して関連性の低い単鎖第ＶＩＩＩ因子を有する場合（図５Ｂを参照）、これらのデータは、これらの変異体の減衰速度値によって、突然変異体とＷＴとの間の安定性における増加が過小評価されることを示す。
【０１１４】
（表３）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
速度減衰値の標準偏差は最小二乗曲線適合に基づいて推定され、熱安定性および第ＶＩＩＩａ因子減衰測定値については平均値の約１０％以内であり、血漿安定性測定値については平均値の約１５％以内である。括弧内の値は、ＷＴ値に対する値である。一文字コードを用いてアミノ酸残基を表示する、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ａ（Ａｌａ）、およびＶ（Ｖａｌ）。
†測定せず。
‡ＷＴの速度と比較してｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
§ＷＴの速度と比較してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【０１１５】
実施例６：３７℃での血漿中の第ＶＩＩＩ因子安定性
より自然な条件下での第ＶＩＩＩ因子安定性に対する突然変異の影響を試験するために、生理学的濃度付近のタンパク質（１ｎＭ）を、第ＶＩＩＩ因子阻害物質欠損血友病Ａ患者由来の（抗凝固）第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿中、３７℃で４日間までインキュベートした。残留第ＶＩＩＩ因子を、凝固一段階法を用いて毎日分析した。ＷＴ第ＶＩＩＩ因子の活性は、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ変異体と同様に、２日後に約５０％まで減少し、一方、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ変異体は、活性減衰の速度において適度（約１５％）の減少を示した（図６および表３）。しかし、Ａｓｐ５１９Ａｌａ、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌおよび両Ｇｌｕ１９８４変異体についての活性値は、４日で初期値の≧５０％であった。血漿インキュベーションから得られた結果は、主に高温で実施したインキュベーションと類似し、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ変異体および２つのＧｌｕ１９８４変異体は、機能の保持によって判定されるように、２つの反応条件下で安定性において有意な増加を示した。両Ａｓｐ５１９変異体は高温で改善された安定性を示し、一方、Ａｌａ変異体だけが、血漿分析において改善を示した。
【０１１６】
実施例７：Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４変異体の第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
前記結果は、埋没荷電残基の疎水性残基との置換と一致した突然変異は、一般的に向上した安定性を示す第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生することを示す。これらの突然変異は、Ａ２ドメインとＡ１もしくはＡ３との境界面または境界面付近であるので、Ａ２サブユニットの解離速度を減少させることによって、第ＶＩＩＩａ因子の不安定性に正の影響を及ぼすことができると予想された。このメカニズムに起因する第ＶＩＩＩａ因子活性の損失率を、２つの条件下で評価した。第一の条件において、ＷＴおよび第ＶＩＩＩ因子変異体をトロンビンで活性化し、第ＩＸａ因子および第Ｘ因子を添加し、第Ｘａ因子生成速度をモニターした後に、指定の時間で残りの補因子活性を測定した。第二の方法では、前記分析を、第ＶＩＩＩ因子活性化前に第ＩＸａ因子の添加を加えて、Ｘａｓｅ因子を直ちに形成できるように変更した。第ＶＩＩＩａ因子をＸａｓｅ因子複合体中に組み入れると、Ａ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２サブユニットをＸａｓｅと結合させる第ＩＸａ因子に適合したメカニズムによって、その減衰速度を１０倍も減少させることにより、補因子活性が部分的に安定化されることが示されている（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）。
【０１１７】
添加された第ＩＸａ因子の非存在下または存在下で得られた結果を図７Ａおよび７Ｂにそれぞれ示す。第ＩＸａ因子の非存在下で、ＷＴ第ＶＩＩＩａ因子はその活性の５０％を約８分で失い（図７Ａ）、一方、この活性レベルは、第ＩＸａ因子が第ＶＩＩＩ因子活性化中に含められている場合、約４０分間持続した（図７Ｂ）。減衰速度値は、表３に示し、Ｘａｓｅ因子の形成によって補因子活性の５倍を超える安定化を示した。変異体の評価によって、Ｇｌｕ２７２ＡｌａおよびＶａｌ形態はどちらも、ＷＴ対照と比べて、第ＩＸａ因子の非存在下で、それぞれ２倍および３倍の減衰速度増加を有していることが明らかになった。これらの結果は、いずれかの突然変異とのサブユニット間親和性が弱くなったこと、おそらくは酸性側鎖が関与する、比較的弱い親和性結合相互作用の損失の結果を意味する。第ＩＸａ因子の存在下で、２つの変異体の減衰速度は、ＷＴの減衰速度と本質的に区別できず、このことは、第ＩＸａ因子が含まれることによって、この残基での突然変異によって生成した有害な相互作用が排除されたことを示す。
【０１１８】
他の３つの部位（Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４）での突然変異はすべて、第ＶＩＩＩａ因子減衰速度を減少させ、減少の程度は、変化した特定の残基および、一例においては置換残基に応じて変化する。Ａｓｐ５１９での突然変異によって、減衰速度が約３０％減少し、これは、第ＩＸａ因子が存在しない場合のＡｌａおよびＶａｌ変異体の両方と類似していた。これらの変異体の活性減衰速度は、第ＩＸａ因子の存在下で２倍を超えて減少し、このことは、突然変異と、酵素を結合する安定化効果との相乗効果を示唆する。Ｇｌｕ６６５Ａｌａ変異体は、２つのＡｓｐ５１９変異体と類似した値を示したが、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ変異体は、第ＩＸａ因子の非存在下および存在下で、それぞれ減衰速度の５倍および３倍の減少を示し、このことは、さらに大きな疎水性残基の置換によって、隣接する残基とのＡ２サブユニット保持のために、より有利な相互作用が得られたことを示唆する。最後に、両Ｇｌｕ１９８４変異体は、第ＩＸａ因子の非存在下で、ＷＴと比較して、第ＶＩＩＩａ因子減衰において約４倍の減少を示し、第ＩＸａ因子が存在する場合には５〜８倍の減少を示した。向上した安定性の有意性が図７Ｂで見られ、この図は、いずれかのＧｌｕ１９８４変異体から構成されるＸａｓｅ因子において４０分後に９０％超の第ＶＩＩＩａ因子活性が残存することを示す。Ｇｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌのいずれかとの反応の類似性は、両残基が十分耐性であることを示唆し、おそらくは、Ｖａｌの存在下で若干強いサブユニット間親和性が達成される。全体的に、これらの結果は、荷電残基の疎水性残基での選択的置換後の改善されたＡ２サブユニット保持に起因する。第ＶＩＩＩａ因子安定性の有意な向上を示す。
【０１１９】
実施例１〜７の考察
前記実施例は、選択された荷電残基の、疎水性置換基との、Ａ２ドメインを結合させることが予想される部位での置換の結果、可変的であるが、第ＶＩＩＩ因子の安定性において、可変的であるが、一般的な増加が得られたことを示す。この安定性を、高温での活性保持ならびに補因子におけるＡ２サブユニット解離速度の減少にしたがって評価した。
【０１２０】
実施例１〜３の初期分析において、第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメイン境界面に局在化する３０残基を、潜在的に水素結合パートナーを形成し得る２．８Å未満の空間的隔離に基づいた突然変異分析に関して選択した。３０の荷電／極性残基はＡｌａ（またはＴｙｒ残基についてはＰｈｅ）に変異され、組換えタンパク質が安定に発現され、活性の損失率を測定した。調べた３０残基のうちの１４は、５５℃で第ＶＩＩＩ因子減衰速度および／またはＷＴに対して第ＶＩＩＩａ因子減衰の速度において２倍超の増加を示し、このことは、Ａ１Ａ２およびＡ２Ａ３ドメイン境界面での複数の残基が第ＶＩＩＩ因子の安定化に寄与することを示唆している。興味深いことに、調べた２つの酸性残基、Ａｓｐ３０２およびＧｌｕ２８７では、プロ補因子および活性補因子形態の両方で、Ａｌａに変異された場合、安定性が適度に向上した（２倍未満）。これらの酸性残基はどちらも、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ウサギ、ラット、およびコウモリ第ＶＩＩＩ因子において保存されている。これらの初期結果は、これらの酸性側鎖が水素結合相互作用の安定化に寄与せず、むしろ、機能的安定性によって評価されるように、第ＶＩＩＩ因子構造に対して若干有害であったことを示唆していた。
【０１２１】
これらの初期研究に基づいて、さらなる疎水性相互作用の形成を、機能獲得について評価した。実施例４〜７で調べた４つの酸性残基は、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ウサギ、およびコウモリ第ＶＩＩＩ因子で保存され、一方、ラット因子においては、Ｇｌｕ６６５はＡｌａであり、Ｇｌｕ１９８４はＴｈｒである（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Swiss Institute of Bioinformatics, online analysis UniProtKB/Swiss-Prot Release 55.5 and UniProtKB/TrEMBL Release 38.5 (2008)を参照）。実施例４〜７の結果は、これらの残基のうちの３つ、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４は、Ａｌａおよび／またはＶａｌと置換される場合、タンパク質安定性が向上したことを示す。実施例４〜７で評価した１つの酸性残基のみが、変異された場合に、活性に有害である結果をもたらした。Ｇｌｕ２７２でのＡｌａへの突然変異は、トロンビン生成パラメータ値が減少した低比活性第ＶＩＩＩ因子形態をもたらし；ＡｌａおよびＶａｌ置換の両方は、中程度に減少した熱安定性および、ＷＴと比較して補因子において２〜３倍高いＡ２サブユニット解離速度を有していた。これらの観察結果から、Ｇｌｕ２７２は実際に隣接残基との結合相互作用に関与し、この部位でのその後の突然変異がこれらの相互作用を分断すると考えられる。この結論は、血友病Ａデータベース（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Kemball-Cookら, “The Factor VIII Structure and Mutation Resource Site: HAMSTeRS version 4,” Nucleic Acids Res. 26:216-219 (1998); Kemball-Cook (MRC Clinical Sciences Centre), Haemophilia A Mutation Database (accessed July 2, 2008)）の調査と一致し、これは、第ＶＩＩＩ因子が減少した中／軽度表現型として位置２７２でのＬｙｓ（電荷反転）またはＧｌｙ（小さな側鎖）を記載している。後者の観察は、増加した血漿不安定性をもたらす突然変異と一致する。しかし、この部位でのＡｌａまたはＶａｌへの突然変異後の細胞培養物中の発現レベルに対してこれらの突然変異の有意な影響はなかった。反対に、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４での突然変異はデータベースに記載されていない。
【０１２２】
タンパク質は折り重なって、荷電もしくは極性部分が溶媒にさらされた状態にあり、一方、疎水性基は埋没された状態にある傾向がある（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Paceら, “Forces Contributing to the Conformational Stability of Proteins,” FASEB J. 10:75-83 (1996)）。したがって、これらの残基が疎水性残基と置換される場合、Ｇｌｕ２８７、Ａｓｐ３０２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４で観察される機能獲得型突然変異に基づいて、これらの荷電残基は、Ａ２ドメイン境界面で埋没していると考えられる。さらに、これらの結果は、これらの酸性残基が静電結合相互作用に寄与せず、ＷＴタンパク質構造および／またはサブユニット相互作用を不安定化する可能性が高いことを示唆している。
【０１２３】
ＡｌａまたはＶａｌのいずれかを用いた突然変異誘発の結果、疎水性残基が得られる（荷電酸性残基を置換する）ので、ＡｌａまたはＶａｌ置換は、境界面での他の疎水性接触を安定化させる傾向がある。さらに、Ｖａｌ側鎖はＡｌａよりも大きく、したがって所与の部位での置換後の活性に対する影響を比較すると、この部位での残基充填および体積に対する洞察が得られる。例えば、Ｇｌｕ１９８４のいずれかの残基との置換によって、類似した結果が得られ、このことは、両者がこの部位で十分耐性があることを示唆し；一方、Ｇｌｕ６６５ＶａｌはＧｌｕ６６５Ａｌａと比較して３倍減少した第ＶＩＩＩａ因子減衰速度を示し、このことは、Ｖａｌの側鎖の体積が大きいほど、推定疎水性結合ポケットにおいてより良好に許容されることを示唆する。
【０１２４】
全体的に、実施例１〜７の結果は、以前はセルロプラスミンの高分解能構造との相同性に由来するモデルに限定され（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）、近年は、ヒトの第ＶＩＩＩ因子の中間分解能構造（３．７５Å）に限定される（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Shenら, “The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII,” Blood 111:1240-1247 (2008)）、第ＶＩＩＩ因子Ａドメイン構造の理解に著しく寄与する。後者の構造によって水素結合相互作用（２．８Å未満）の帰属が可能にはならないが、この論文の著者は、第ＶＩＩＩ因子のＡドメインを、セルロプラスミンのドメイン上に高度の正確性で重ね合わせることができることを示している。
【０１２５】
セルロプラスミンモデルは、Ａｓｐ３０２およびＧｌｕ２８７が水素結合相互作用に寄与できることを示唆するが、実施例１〜３の安定性研究は、これが起こる可能性が低いことを示している。その代わりに、これらの酸性側鎖は、疎水性環境中に埋没されていると考えられている。反対に、実施例４〜７から得られる結果は、Ｇｌｕ２７２が、Ａ２ドメイン境界面での水素結合相互作用に寄与する可能性が高いという考えを裏付ける。その理由は、この電荷の損失が、第ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩａ）因子安定性を減少させるからである。実施例４〜７で評価した残りの３つの酸性残基は、相補性ドメイン上の隣接する残基由来の極性原子が、これらの残基のカルボキシル基付近に局在化していないように見える点で、モデルによって予想されるように、境界面で埋没していると思われる。むしろ、これらの基は、疎水性基に近いようであることが知られている。例えば、このモデルは、Ａｓｐ５１９のカルボキシル酸素とＴｈｒ２７５のメチル炭素は約４．２Å離れ、Ｇｌｕ６６５のカルボキシル酸素とＶａｌ１９８２のメチル炭素は約８．１Å離れ、Ｇｌｕ１９８４のカルボキシル酸素とＶａｌ６６３のメチル炭素は約６．２Å離れていると予想する。
【０１２６】
安定性の向上と補因子活性減衰速度の減少を示す第ＶＩＩＩ因子変異体は、治療製剤の正の特質を示す。前者の特性は、その精製および形成中に活性タンパク質産生の増大を可能にし、その結果、全体的に高い比活性値が得られる。これらの試薬はまた、様々な細胞クリアランスメカニズムを除いて、ＷＴに対してより長い循環半減期を有する可能性もある（図６を参照）。２つのグループが第ＶＩＩＩ因子変異体に関してすでに報告しており、この報告では、補因子活性は、Ａ２サブユニット解離速度を減少／消去することによって安定化された。どちらの場合においても、突然変異を用いて、Ａ２ドメインを分子の他の領域と共有結合させた。一例において、Ａ３Ｃ１Ｃ２ドメインと接触し、プロ補因子活性化後のＡ２ドメインまたはＢドメインフラグメントのいずれかを放出するトロンビン切断部位が欠失したＢドメインの断片を、Ａ２ドメインと結合させることによって、不活化耐性第ＶＩＩＩ因子を調製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pipeら, “Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor VIIIa,” Proc Natl Acad Sci U S A 94:11851-11856 (1997),）。第二の場合において、近接近しているＡ３およびＡ２ドメイン中の選択された残基をＣｙｓ残基と置換して、２つのドメイン間でジスルフィド架橋を形成し、したがって、トロンビン活性化後にＡ２がＡ３と共有結合性のままであるようにした（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Galeら, “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J Thromb Haemost. 1:1966-1971 (2003); Radtkeら, “Disulfide Bond-stabilized Factor VIII has Prolonged Factor VIIIa Activity and Improved Potency in Whole Blood Clotting Assays,” J Thromb Haemost. 5:102-108 (2007)）。後者の突然変異体も、トロンビン生成法において活性化の増大を示すが、これらの研究で用いられた反応条件は、生理学的条件以下（０．５ｎＭ未満）の濃度の第ＶＩＩＩ因子を使用した。
【０１２７】
生理学的第ＶＩＩＩ因子レベル（１ｎＭ）を用いた実施例１〜７の結果は、ＷＴとさらに高い安定性を示す変異体との間でほとんど差を示さなかったが、Ｇｌｕ２７２Ａｌａでは、その低い比活性と一致して減少したトロンビン生成パラメータが得られた。高安定性変異体に関して有意な差が観察されなかったことは、反応条件における差および／またはこれらの突然変異がＡ２ドメインを共有結合しないこと、ならびに第ＶＩＩＩａ因子減衰速度が十分に減少しないことを反映する。
【０１２８】
実施例１〜７に示した結果は、酸性残基を疎水性残基に変換する１つの点突然変異後に達成できる補因子不活性の速度が数倍減少することを示す。これらの場合のそれぞれで、これらの突然変異は境界面で起こり、この場合、変更された残基が、埋没して、表面に露出しない可能性が高く、タンパク質内の相互作用を変更しない。事前の結果に基づいて、Ｇｌｕ１９８４ＶａｌおよびＧｌｕ１９８４Ａｌａ変異体の補因子形態ならびにＷＴ補因子は、Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ５６２での活性化タンパク質Ｃ触媒切断によって測定されるような類似した不活性化速度を示す（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Varfajら, “Residues Surrounding Arg336 and Arg562 Contribute to the Disparate Rates of Proteolysis of Factor VIIIa Catalyzed by Activated Protein C,” J. Biol. Chem. 282(28):20264-72 (2007)）。このことは、これらの高い安定性変異体の下方調節は、ＷＴ補因子とほぼ同じ方法で、タンパク質Ｃ経路によって進行するはずであるという考えを裏付ける。したがって、本発明の安定化した変異体は、前記の不活性化耐性突然変異体に関連する問題はないはずである。
【０１２９】
実施例８：二置換および三置換第ＶＩＩＩ因子変異体の安定性分析
付加的効果もしくは相乗的効果のいずれが第ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩａ）因子安定性のさらなる向上をもたらすかを決定するために、前記実施例で記載した点突然変異の組み合わせを、材料および方法で記載したのと同じ手順を用いて調製した。特に、残基Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４のＡｌａまたはＶａｌ置換を有する二重または三重複合突然変異体を調製した。これらの複合突然変異体（アミノ酸は一文字コードを用いて識別される）としては：Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ｖ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖが挙げられる。Ｄ５１９ＶＥ６６５Ａ第ＶＩＩＩ因子はこの分析から除外した。その理由は、この突然変異体がＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット結果において非定型の特性を示したからである。
【０１３０】
三重変異体を生成させるために、Ｄ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖを、Ｅ６６５ＶＥ１９８４ＡまたはＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖのいずれかと組み合わせた。他の組み合わせは除外した。その理由は、Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖ二重変異体は、各単一突然変異体と比較して、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性を向上させなかったからである。Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを用いた結果は、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ａについて観察される同じ理由から除外した。
【０１３１】
Ａｓｐ５１９での突然変異（ＡｌａもしくはＶａｌ）をＧｌｕ６６５またはＧｌｕ１９８４いずれかでの突然変異と結合させた新規突然変異体の第一群（グループＡ）は、比活性については正常値のままであった（８０％超野生型（ＷＴ）値、図８）。興味深いことに、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、およびＤ５１９ＶＥ１９８４Ｖは、凝固一段階法によって測定されるＷＴ第ＶＩＩＩ因子と比較して約１．８倍までの有意に増加した比活性値を示した（図８）。Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４での突然変異の組み合わせである突然変異体の第二群（グループＢ）の比活性は、意外にも、若干ＷＴ値よりも高かったＥ６６５ＶＥ１９８４Ａを除いては、ＷＴ第ＶＩＩＩ因と比較して約２倍までの比活性の減少を示した（図８）。第３群（グループＣ）は三重突然変異であり、一段階分析によって通常から中程度に増加した活性を示した（Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖ）。しかし、二段階分析によって測定されるＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖの活性は、有意に減少した。Ａｓｐ５１９はＡ１およびＡ２境界面に位置し、一方、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４はＡ２およびＡ３境界面に位置するので、グループＢと比較して上昇したグループＡ突然変異の比活性の傾向は、立体構造に影響を及ぼし、活性な補因子形態を保持するＡ１−Ａ２連結でのさらに有利な相互作用に起因すると考えられる。
【０１３２】
図９は、５５℃で実施された第ＶＩＩＩ因子熱安定性実験から得られた結果をまとめたものである、複合突然変異について得られた速度を、実施例５から得られた単一突然変異についてのデータを用いて、特定の組み合わせにおける最良の単一突然変異体の速度値と比較した（図５Ａ）。図９はまた、第ＶＩＩＩ因子減衰速度についての実際の値も示す（表４も参照）。相対的減衰速の減少の程度は、突然変異の組み合わせについて観察される向上に関連するようである。グループＡにおいて、突然変異体Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＡＤ６６５Ｖ、およびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖは、安定性において有意な向上（減衰速度の減少）を示し、突然変異体のほとんどはまた、ＷＴ値の約５０％である絶対的減衰速度を維持した。他方、グループＢ突然変異体の２つについての相対的速度は、より良好な単一突然変異と比較して、若干増加した（Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖ）。グループＣにおいて、突然変異体Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４ＡおよびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａは、速度において有意な変化を示さず、一方、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖについての速度値は若干増加した。
【０１３３】
興味深いことに、突然変異の組み合わせについて観察される安定性の向上は、第ＶＩＩＩａ因子形態についてより容易に観察された（図１０）。安定性が高い突然変異体についての第ＶＩＩＩａ因子減衰分析の感度を増大させるために、前記実施例におけるよりもインキュベーションにはより低濃度の第ＶＩＩＩａ因子（１．５ｎＭ）を使用した。単一突然変異体と比べて約４倍までの大きな安定性向上が、すべてのグループＡ突然変異体について観察された。Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶおよびＤ５１９ＶＥ１９８４Ａの第ＶＩＩＩａ因子減衰速度についての実際の値は、それぞれＷＴ第ＶＩＩＩ因子の１４％および１２％であった（図１０および表４）。グループＢ突然変異体は一般に、Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖとの対合でのより良好な個々の突然変異と比べた場合に、不十分な結果をもたらし、相対的減衰速度値において、それぞれ約２．２倍および約２．７倍の増加を示した。三重突然変異（グループＣ）は、最大の第ＶＩＩＩａ因子安定性向上を示し、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａについて最大の安定性が観察され、これは、ＷＴの約１０％の減衰速度を示した（図１０および表４）。
【０１３４】
（表４）複合突然変異体の第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の減衰速度ならびに活性値
減衰値の標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ括弧内の値は野生型に対する値である。
ｂ単位／μｇ．
ｃ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）。
ｄ前記表３から再現されたデータ。
【０１３５】
選択された突然変異体に関してトロンビン生成法を実施し、結果を図１１Ａ〜Ｂに示す。最終濃度１ｎＭの第ＶＩＩＩ因子を用いて単一突然変異体を試験した場合、トロンビン生成特性に著しい改善はなかった（前述の材料および方法、ならびに実施例４を参照）。より安定な第ＶＩＩＩ因子突然変異体をより良好に比較するために、低い第ＶＩＩＩ因子濃度（０．２ｎＭ）を使用した。この分析から得られた結果は、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子と比較して、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖが遅延時間およびピーク時間において約２０％の減少を有し、またピーク高さが約２．３倍増加し、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）が約１．５倍増加することを示した（図１１Ａ〜Ｂ）。Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、およびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａの遅延時間およびピーク時間値は、ＷＴに対して有意に変化しなかったが、ピーク高さおよびＥＴＰ値は、ＷＴよりも有意に大きかった（約２０％〜７０％）。全体的に、これらの結果から、選択された４つの複合突然変異体（すべて向上した第ＶＩＩＩａ因子安定性を有する）は、改善されたトロンビン生成特性を示したことがわかる。この観察から、これらの突然変異体は、生理学的状況で、単位濃度の第ＶＩＩＩ因子あたり増大したトロンビン生成の能力が高いことがわかる。
【０１３６】
実施例９：高比活性Ｇｌｕ１１３Ａｌａ（Ｅ１１３Ａ）突然変異と組み合わせた、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体
Ｅ１１３Ａ突然変異は、凝固一段階法によって判断されるように、第ＶＩＩＩ因子比活性を増大させることが知られている（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｆａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号；Wakabayashiら, “A Glu113Ala Mutation within a Factor VIII Ca(2+)-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase,” Biochemistry 44:10298-10304 (2005)）。高安定性と高比活性との両方を有する第ＶＩＩＩ因子の生成は、血友病の治療において有効な治療への応用のための唯一種の試薬であり、Ｅ１１３Ａと、先の実施例に記載した高安定性突然変異体との複合突然変異の効果を分析した。
【０１３７】
Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体を、Ｅ１１３Ａ突然変異と組み合わせて、材料および方法に記載した同じ手順を用いて調製した。これらの二重変異体（アミノ酸は、一文字コードを用いて識別する）としては：Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、およびＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖが挙げられる。
【０１３８】
複合突然変異体の一段階分析を用いて決定された比活性値は、二段階分析による活性の正常レベルを維持しつつ、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子よりも約２〜約３．３倍高かった。これらの結果から、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、またはＧｌｕ１９８４での突然変異が、Ｅ１１３Ａ突然変異について観察される活性向上に悪影響を及ぼさなかったことがわかった（図１２Ａ）。加えて、高安定性突然変異体と組み合わせたＥ１１３Ａの第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度は、本来の単一高安定性突然変異体のそれぞれの値と有意に異ならず（図５Ｂ〜Ｃ；表５を参照）、このことは、Ｅ１１３Ａ突然変異が、これらの突然変異体についての向上した安定性パラメータに影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【０１３９】
（表５）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度ならびに活性値
減衰値の標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ括弧内の値は、野生型に対する値である。
ｂ単位／μｇ。
ｃ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）。
ｄ前記表３から再現されたデータ。
【０１４０】
前記結果から、増大した比活性と、向上した第ＶＩＩＩ因子／第ＶＩＩＩａ因子安定性との両方によって特徴づけられる組換え型第ＶＩＩＩ因子を生成させる目的で、Ｅ１１３Ａの突然変異を、これまで記載した安定性が増大した突然変異のいずれかと組み合わせることができる。これは、Ｅ１１３Ａ（または、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｆａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号に記載されるような他の適したＥ１１３置換）と、本明細書に記載する種類の単一または複数の安定性が向上した突然変異体との組み合わせを包含する。
【０１４１】
好ましい実施形態を本明細書において表示し、詳細に記載したが、本発明の趣旨から逸脱しないで、様々な修正、付加、置換などが可能であり、これらはしたがって、以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に含まれると見なされることが、当業者には明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１１月１日に出願された米国特許仮出願第６０／９８４，５１８号、および２００７年１１月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／９９１，３０４号（各出願の内容の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ＨＬ７６２１３およびＨＬ３８１９９のもとで、政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血友病Ａは、重篤な遺伝性の出血性疾患の最も一般的なものであり、血漿タンパク質第ＶＩＩＩ因子の欠乏または欠陥が原因である。血友病Ａは不治であり、治療は、（精製）血漿または組換えタンパク質製剤を使用した補充療法からなる。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、非共有結合性金属イオン依存性ヘテロ二量体として循環する。このタンパク質のプロ補因子（ｐｒｏｃｏｆａｃｔｏｒ）形態は、Ａ１（ａ１）Ａ２（ａ２）Ｂドメインから構成される重鎖（ＨＣ）と、（ａ３）Ａ３Ｃ１Ｃ２ドメインから構成される軽鎖（ＬＣ）とを含有し、小文字ａは、酸性残基を豊富に含む短い（約３０〜４０残基）断片を表す（Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)を参照）。第ＶＩＩＩ因子は、トロンビンまたは第Ｘａ因子によって触媒される、Ａ１Ａ２、Ａ２ＢおよびＡ３Ａ３接合部でのタンパク分解による切断によって活性化される。この反応の生成物である第ＶＩＩＩａ因子は、チモーゲン第Ｘ因子のセリンプロテアーゼ、すなわち第Ｘａ因子への膜依存性変換においてセリンプロテアーゼ第ＩＸａ因子の補因子として機能するＡ１、Ａ２、およびＡ３Ｃ１Ｃ２と呼ばれるサブユニットで構成されるヘテロ三量体である（Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)を参照）。
【０００５】
再構成研究によって、第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体構造は、静電相互作用および疎水性相互作用の両方によって支持され（Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Ansongら, “Factor VIII A1 Domain Residues 97-105 Represent a Light Chain-interactive Site,” Biochemistry. 45:13140-13149 (2006)）、鎖間親和性は第ＶＩＩＩ因子結合フォンヴィレブランド因子によってさらに増強される（Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Kaufmanら, “Regulation of Factor VIII Expression and Activity by von Willebrand Factor,” Thromb Haemost. 82:201-208 (1999)）ことが示されている。金属イオンも、鎖間親和性および活性パラメータに貢献する（Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001)）。カルシウムは、活性な第ＶＩＩＩ因子立体構造を得るために必要とされる。突然変異誘発研究では、Ａ１ドメイン（残基１１０〜１２６）内で酸性残基を豊富に含む断片に対するカルシウム結合部位をマップし、イオンの配位において顕著なこの領域内の特異的残基を同定した（Wakabayashiら, “Residues 110-126 in the A1 Domain of Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Required for Cofactor Activity,” J Biol Chem. 279:12677-12684 (2004)）。最近の中間分解能Ｘ線構造（Shenら, “The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII,” Blood 111:1240-1247 (2008)）は、このカルシウム結合部位を確認し、またＡ２ドメイン内の第２の可能性のある部位を示唆した。この構造には、Ａ１およびＡ３ドメイン内の２つの１型銅イオン部位の占有も示された。以前の機能研究では、銅イオンが重鎖と軽鎖との結合を促進して、ヘテロ二量体を形成し、鎖間親和性を生理的ｐＨで数倍増加させることが明らかになった（Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Wakabayashiら, “pH-dependent Association of Factor VIII Chains: Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+,” Biochim Biophys Acta. 1764:1094-1101 (2006); Ansongら, “Factor VIII A3 Domain Residues 1954-1961 Represent an A1 Domain-Interactive Site,” Biochemistry 44:8850-8857 (2005)）。
【０００６】
第ＶＩＩＩａ因子の不安定性は、Ａ２サブユニットとＡ１／Ａ３Ｃ１Ｃ２二量体との間の弱い静電相互作用に起因し（Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Lollarら, “pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII,” J Biol Chem. 265:1688-1692 (1990)）、Ｘａｓｅ因子活性の抑制がもたらされる（Lollarら, “Coagulant Properties of Hybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules,” J Biol Chem. 267:23652-23657 (1992); Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）。第ＶＩＩＩａ因子におけるＡ２サブユニットの結合に関しては限られた情報しか得られず、Ａ１ドメインとＡ３ドメインとの両方における残基は、このサブユニットの維持に貢献すると思われる。いくつかの第ＶＩＩＩ因子点突然変異は、ＷＴに対してＡ２の解離を促進し、これらの残基はＡ１−Ａ２ドメイン境界面（Pipeら, “Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation: Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo,” Blood 93:176-183 (1999); Pipeら, “Hemophilia A Mutations Associated with 1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa,” Blood 97:685-691 (2001)）またはＡ２−Ａ３ドメイン境界面（Hakeosら, “Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3 Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy,” Thromb Haemost. 88:781-787 (2002)）のいずれかに局在化することが明らかにされている。これらの第ＶＩＩＩ因子変異体は、特徴的な一段階法／二段階法（One-stage/Two-stage assay）相違を示し（Duncanら, “Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII Methods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A,” Br J Haematol. 87:846-848 (1994); Rudzkiら, “Mutations in a Subgroup of Patients with Mild Haemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII:C Methods,” Br J Haematol. 94:400-406 (1996)）、Ａ２サブユニット解離速度の増加の結果として、後者の分析によって有意に減少した活性値が測定される。
【０００７】
第ＶＩＩＩ因子のＡドメインのセルロプラスミンに基づく相同性モデルの実験（Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）は、Ａ２ドメインと、Ａ１ドメインおよびＡ３ドメインのそれぞれとの間での境界面の拡張を示唆し、複数の接触の可能性は、結合相互作用に寄与する。
【０００８】
第ＶＩＩＩａ因子の安定化は非常に興味深い。その理由は、より安定なタンパク質の形態は血友病Ａの優れた治療薬であり、患者を治療するために潜在的に必要とする物質が少ないと考えられるからである（Fayら, “Mutating Factor VIII: Lessons from Structure to Function,” Blood Reviews 19:15-27 (2005)）。この目的のために、Ａ２ドメインと他の第ＶＩＩＩ因子ドメインとの間に新規共有結合を導入することによって、Ａ２サブユニットの解離を防止するために、組換えタンパク質において突然変異を生じさせる第ＶＩＩＩ因子の調製物が記載されている（Pipeら, “Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor VIIIa,” Proc Natl Acad Sci USA 94:11851-11856 (1997); Galeら, “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J. Thromb. Haemostasis 1:1966-1971 (2003)）。しかし、これらの種類の突然変異は、下方調節のための手段を実質的に排除するので、治療用第ＶＩＩＩ因子において望ましくない可能性があることが示唆されている。この状況は、血栓形成促進性の状態をもたらし、これは有害である可能性がある。したがって、血栓形成促進性の状態を促進する可能性を最小限にする方法で、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性を高めることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、当該技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす１つ以上の突然変異を含む組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００１１】
好ましくは、１つ以上の突然変異は、Ａ１Ａ２もしくはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれかまたは両方で、疎水性アミノ酸残基で１つ以上の荷電アミノ酸残基の置換を構成する。本発明の特に好ましい組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１２】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子を含む薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子に関する。本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡ発現システム、ならびにＤＮＡ分子および／または組換え発現システムを含有する組換え宿主細胞も、本発明のこの態様に含まれる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で、本発明の第３の態様の宿主細胞を増殖させる段階、および組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する段階を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法に関する。
【００１５】
本発明の第５の態様は、血友病Ａについて動物を治療する方法に関する。この治療法は、血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の本発明の第１の態様の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階を含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、Ａ１Ａ２およびＡ２Ａ３ドメイン境界面での多くの荷電残基は、水素結合に関与しないが、その代わりに第ＶＩＩＩ因子構造を不安定化させる可能性および／または第ＶＩＩＩ因子プロ補因子の活性化後にＡ２サブユニットの解離を促進する可能性があることを示す。埋没した疎水性部分を増大させ、埋没した親水性部分を減少させることを目的として、これらの荷電残基を疎水性残基と置換することによって、ドメイン間結合親和性が向上することを添付の実施例で明らかにした。安定性パラメータを、第ＶＩＩＩ因子変異体の高温での活性およびＡ２サブユニット解離により起こる第ＶＩＩＩａ因子活性の減衰の時間経過にしたがって評価した。これらの研究から得られる結果は、多くの突然変異の結果、Ａ２ドメイン境界面での埋没電荷による可能性が高い不安定化力の消失と一致して、安定性パラメータが増大することを証明した。第ＶＩＩＩ因子のこれらの安定化変異体および活性化第ＶＩＩＩａ補因子は、血友病Ａを治療するための改善された治療法を提供するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、凝固一段階法（黒棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（灰色棒）によって測定される、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の活性を示すグラフである。ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態の活性を、実施例に記載するのと同様にして測定した。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差の値を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、それぞれ、ＷＴならびに突然変異第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を示す。図２Ａにおいて、第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を５５℃でインキュベートし、指定の時間でアリコートを取り出し、実施例で記載するようにして、第Ｘａ因子生成法によって活性について分析した。結果を、ＷＴ（破線、白丸）、Ｒ２８２Ａ（白三角）、Ｓ５２４Ａ（白四角）、Ｎ６８４Ａ（白菱形）、Ｒ５３１Ａ（黒丸）、Ｓ６５０Ａ（黒三角）、Ｅ２８７Ａ（黒四角）、およびＤ３０２Ａ（黒菱形）について示す。図２Ｂにおいて、４０ｎＭの第ＩＸａ因子の存在下でのトロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子（４ｎＭ）を２３℃でインキュベートし、表示された時点でアリコートを取り出し、実施例に記載されるような第Ｘａ因子生成法によって、活性を測定した。結果を、ＷＴ（破線、白丸）、Ｒ２８２Ａ（白三角）、Ｓ５２４Ａ（白四角）、Ｙ１７９２Ｆ（白菱形）、Ｎ６８４Ａ（黒丸）、Ｙ１７８６Ｆ（黒三角）、Ｒ５３１Ａ（黒四角）、Ｅ２８７Ａ（黒菱形）、およびＤ３０２Ａ（灰色円）について示す。選択された高速減衰変異体についての結果を、図２Ｂの挿入図において拡大目盛りで示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、第ＶＩＩＩ因子突然変異体およびＷＴ第ＶＩＩＩ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す。図３Ａは、８％ポリアクリルアミドゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（０．７７μｇ）であり、ＧｅｌＣｏｄｅによって可視化したものを示す。図３Ｂは、８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜に移し、ビオチニルＲ８Ｂ１２抗体によってプローブした、精製ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（０．３４μｇ）を示す。バンドを添付の実施例に記載するような化学蛍光によって可視化した。ＷＴ（レーン１）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（レーン２）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（レーン３）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（レーン４）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（レーン５）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（レーン６）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（レーン７）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（レーン８）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（レーン９）。ＭＷ、分子量マーカー：ｓＦＶＩＩＩ、単鎖形態第ＶＩＩＩ因子：ＨＣ、重鎖：ＬＣ、軽鎖。単鎖形態の、ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態のヘテロ二量体に対する見かけの化学量論比は、０．９６（ＷＴ）、０．６４（Ｇｌｕ２７２Ａｌａ）、０．９２（Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ）、０．７４（Ａｓｐ５１９Ａｌａ）、０．８（Ａｓｐ５１９Ｖａｌ）、０．６４（Ｇｌｕ６６５Ａｌａ）、０．６３（Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ）、０．９１（Ｇｌｕｅ１９８４Ａｌａ）、および０．５（Ｇｌｕ１９８４Ｖａｌ）であった。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の比活性およびトロンビン生成法を示す。図４Ａは、添付の実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて測定した活性値を示す。図４Ｂ〜Ｃは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を示す。ＷＴ（破線）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）。図４Ｄは、トロンビン生成法から得られたパラメータ値を示す。トロンビン生成法を、添付の実施例に記載するようにして実施した。トロンボグラムは、３通りの試料の平均値を示す。パラメータ値をＷＴに対する値（％）で表した。ＷＴの実際の値は、７．５±０．５分（遅延時間）、１３．７±０．３分（ピーク時間）、１５７．３±１４．７ｎＭ（ピーク値）、９７９．８±３７．９ｎＭ／分（ＥＴＰ）であった。遅延時間（白色棒）、ピーク時間（灰色棒）、ピーク値（黒棒）、およびＥＴＰ（縞模様棒）を示す。エラーバーは、３回の別個の測定から平均した標準偏差値を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子の活性減衰を示す。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を様々な温度（５２〜６０℃）でインキュベートし、表示された時間でアリコートを取り出し、添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって活性について分析した。データを非線形最小二乗回帰により適合させ、減衰速度を得た。各点は、３回の独立した測定から平均した値を表す。結果を、ＷＴ（破線、×印）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、Ｇｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）、および完全長Ｋｏｇｅｎａｔｅ第ＶＩＩＩ因子（灰色円）について示す。図５Ａは、５５℃でインキュベーション後の代表的な第ＶＩＩＩ因子減衰曲線を示す。図５Ｂは、様々な温度での第ＶＩＩＩ因子減衰速度のプロットを示す。図５Ｂ中の挿入図は、５２〜５５℃の温度範囲にわたる減衰結果の拡大図である。
【図６】図６は、３７℃の血漿中の第ＶＩＩＩ因子の活性減衰を示すグラフである。第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を３７℃、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿中でインキュベートし、表示された時間にアリコートを取り出し、添付の実施例に記載するような凝固一段階法について分析した。結果をＷＴ（破線、×印）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）について示した。非線形最小二乗回帰に適合させ、各点は、３回の独立した測定からの平均値を表す。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、第ＩＸａ因子の非存在下または存在下でのＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を表すグラフである。図７Ａは、２３℃でインキュベートした、トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子（４ｎＭ）を示す。アリコートを表示された時点で取り出し、活性を添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって測定した。図７Ｂは、第ＩＸａ因子の存在下でのＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰を示す。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を、４０ｎＭの第ＩＸａ因子の存在下、トロンビンで活性化した。アリコートを表示された時点で取り出し、活性を添付の実施例に記載するような第Ｘａ因子生成法によって測定した。結果を、ＷＴ（破線、×印）、Ｇｌｕ２７２Ａｌａ（白四角）、Ｇｌｕ２７２Ｖａｌ（黒四角）、Ａｓｐ５１９Ａｌａ（白丸）、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ（黒丸）、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ（白三角）、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ（黒三角）、Ｇｌｕ１９８４Ａｌａ（白菱形）、およびＧｌｕ１９８４Ｖａｌ（黒菱形）について示す。データを非線形最小二乗回帰に適合させ、各点は、３回の独立した測定から平均した値を表す。
【図８】図８は、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した、第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体の比活性を示すグラフである。実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて、活性値を測定した。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。
【図９】図９は、ＷＴならびに、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体についての第ＶＩＩＩ因子活性減衰速度を示すグラフである。第ＶＩＩＩ因子活性減衰実験を行い、減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。灰色棒は、最良の単一突然変異体（実施例５、図５Ａ参照）に対する速度を示し、最良（最低）値の速度で割った後に計算した。例えば、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ対合の最良の単一突然変異体に対する速度相対値は、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａの減衰速度をＤ５１９Ａの減衰速度で割ったものに等しい。黒棒は、実際の減衰速度パラメータ値を１０倍で表したもの示す。
【図１０】図１０は、ＷＴならびに、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４残基がＡｌａまたはＶａｌに変化した第ＶＩＩＩ因子二重または三重複合突然変異体の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰速度を示すグラフである。第ＩＸａ因子の非存在下で１．５ｎＭの第ＶＩＩＩａ因子をインキュベーションした後の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰測定を行い、減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。灰色棒は、最良の単一突然変異体に対する速度を示し（実施例７、図７Ａ参照）、図９の説明文に記載するようにして計算した。黒棒は、実際の減衰速度を１０倍で表したものを示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、複合突然変異体を用いたトロンビン生成法の結果を示す。図１１Ａは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のトロンボグラムを示す。トロンビン生成法を実施例に記載するようにしておこなった。試薬の最終濃度は、０．２ｎＭ（第ＶＩＩＩ因子）、０．５ｐＭ（ｒＴＦ）、４μＭ（ＰＳＰＣＰＥベシクル）、４３３μＭ（蛍光発生基質）、１３．３ｍＭのＣａｌＣｌ２、および１０５ｎＭ（トロンビンキャリブレーター）であった。結果を、ＷＴ（破線）、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ（白丸）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ（黒丸）、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ（白三角）、およびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ（黒三角）について示した。図１１Ｂは、トロンビン生成法から得られたパラメータ値を示す。トロンボグラムは、３通りの試料の平均値を示す。パラメータ値を、ＷＴに対する値（％）で表した。ＷＴについての実際の値は、８．５±０．４分（遅延時間）、２１．３±０．６分（ピーク時間）、５８．５±１５．６ｎＭ（ピーク値）、８８３．６±１９９．８ｎＭ／分（ＥＴＰ）であった。遅延時間（白色棒）、ピーク時間（灰色棒）、ピーク値（黒棒）、およびＥＴＰ（縞模様棒）。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、Ｇｌｕ１１３Ａｌａ突然変異と組み合わせた残基Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、および／またはＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体についてのＷＴに対する第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の比活性および活性減衰速度を示す。図１２Ａは、実施例に記載するような凝固一段階法（灰色棒）および発色性第Ｘａ因子生成二段階法（黒棒）を用いて測定した、ＷＴに対する複合突然変異体の比活性を示す。エラーバーは、３回の独立した測定から平均した標準偏差を示す。図１２Ｂは、５５℃での第ＶＩＩＩ因子活性減衰分析結果を示し；減衰速度を実施例に記載するような非線形最小二乗回帰によって推定した。図１２Ｃは、第ＩＸａ因子の非存在下で１．５ｎＭの第ＶＩＩＩａ因子をインキュベーションした後の第ＶＩＩＩａ因子活性減衰測定結果を示し；減衰速度を、実施例に記載するようにして非線形最小二乗回帰によって推定した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす、１つ以上の突然変異を有する組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。
【００１９】
野生型第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子の他の特性、たとえば抗原性、循環半減期、タンパク質分泌、第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性、変更された第ＶＩＩＩ因子不活化切断部位、免疫原性、保存寿命などに影響を与えるように他の方法で修飾された突然変異型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を修飾することによって、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を調製することができる。
【００２０】
本発明にしたがって修飾できる適した野生型第ＶＩＩＩ因子は、限定はされないが、哺乳動物、たとえばヒト（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２４８４（アミノ酸）およびＫ０１７４０（ヌクレオチド）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＤ９７５６６（アミノ酸）およびＡＸ７４６３６０（ヌクレオチド）を参照）、ラット（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＱ２１５８０（アミノ酸）およびＡＹ３６２１９３（ヌクレオチド）を参照）、マウス（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３７３８５（アミノ酸）およびＬ０５５７３（ヌクレオチド）を参照）、モルモット、イヌ（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ８７４１２（アミノ酸）およびＡＦ０１６２３４（ヌクレオチド）；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０５３８４（アミノ酸）およびＡＦ０４９４８９（ヌクレオチド）を参照）、ネコ、サル、チンパンジー（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５２９２１２（アミノ酸）およびＸＭ＿５２９２１２（ヌクレオチド）を参照）、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９９３３２（アミノ酸）およびＮＭ＿２１４１６７（ヌクレオチド）を参照）、ヤギ、ウサギ、ならびにニワトリを含む様々な動物由来であり得る。これらおよび他の配列はHaemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site（またはＨＡＭＳＴｅＲＳ）からも電子的に利用可能であり、このサイトはさらに、ヒト、ブタ、ネズミ、およびイヌ第ＶＩＩＩ因子タンパク質の整列化を提供する。このように、哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子タンパク質間の保存および相同性は周知である。
【００２１】
一例として、ヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列をそれぞれ下記配列番号１および２に示す。ヒト第ＶＩＩＩ因子を、「ドメイン」配列ＮＨ２−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨを規定する内部配列相同性を有する約３００ｋＤａの単鎖タンパク質として合成する。第ＶＩＩＩ因子分子中で、本明細書において用いられる「ドメイン」は、内部アミノ酸配列同一性およびトロンビンによるタンパク分解的切断部位によって規定されるアミノ酸の連続配列である。特に断りのない限り、配列をヒトアミノ酸配列（配列番号２）と整列化させる場合、第ＶＩＩＩ因子ドメインは以下のアミノ酸残基を含む：
Ａ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；
Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；
Ｂ、残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８；
Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；
Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；および
Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。
【００２２】
Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、つまり残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドと呼ばれる。第ＶＩＩＩ因子は、トロンビンまたは第Ｘａ因子によってタンパク質分解的に活性化され、これは第ＶＩＩＩ因子をフォンヴィレブランド因子から解離させ、第ＶＩＩＩａ因子を形成し、この第ＶＩＩＩａ因子は、凝結促進機能を有する。第ＶＩＩＩａ因子の生物学的機能は、第ＩＸａ因子の第Ｘ因子活性化に対する触媒効率を数桁増大させることである。トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子は、血小板または単球の表面上で第ＩＸａ因子および第Ｘ因子と複合体を形成する１６０ｋＤａのＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテロ三量体である。本明細書において用いられる「部分ドメイン」は、ドメインの一部を形成するアミノ酸の連続配列である。
【００２３】
野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子は、次のような配列番号１のヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
配列番号１によってコードされる野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子は、次のような配列番号２のアミノ酸配列を有する。
前記配列において、Ｇｌｕ２８７、Ａｓｐ３０２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４などのいくつかの荷電残基は太字体と下線によって識別される。
【００２５】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれか、または両方で、１つ以上の荷電アミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基と置換されていることを特徴とする。好ましくは、置換される荷電残基は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン間の水素結合に関与しない、ＧｌｕまたはＡｓｐ残基のいずれかである。荷電残基を置換する疎水性アミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐのいずれかであり得る。特に適した本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを包含する。Ｄ３０２Ａ、Ｅ２８７Ａ、Ｅ６６５Ａ、Ｅ６６５Ｖ、Ｄ５１９Ａ、Ｄ５１９Ｖ、Ｅ１９８４Ａ、およびＥ１９８４Ｖ置換は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の向上した安定性を有する組換え型第ＶＩＩＩ因子を得るために好ましい。これらの置換の好ましい組み合わせとしては、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、およびＤ５１９ＶＥ１９８４Ａ二重変異体、ならびにＤ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４ＡおよびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ三重変異体が挙げられるが、限定されない。これらの突然変異体の向上した安定性は、第ＶＩＩＩ因子におけるドメイン間境界面の安定化、ならびに野生型第ＶＩＩＩａ因子と比較して、Ａ１／Ａ３Ｃ１Ｃ２からのＡ２サブユニット解離を減少させることによって得ることができると考えられる。
【００２６】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子配列は、従来既知であるか、または後に同定される任意の突然変異型第ＶＩＩＩ因子配列も含むことができ、これらは、たとえば限定はされないが、抗原性、循環半減期、タンパク質分泌、第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性、変更された第ＶＩＩＩ因子不活化切断部位、第ＶＩＩＩａ因子の向上された比活性、免疫原性、および保存寿命などの様々な特質に関して修飾された特性を有する。
【００２７】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の一例は、好ましくは配列番号２の残基１１３で修飾されたカルシウム結合部位を有する第ＶＩＩＩ因子である。これによって、向上した比活性を有する第ＶＩＩＩａ因子が得られる。この種類の突然変異体の例は、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＦａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号に記載されている。好ましくは、残基１１３突然変異体も、前記の突然変異の１つ以上によって（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）修飾され、高安定性／高比活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質を得る。高安定性／高比活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の例としては：複合Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、またはＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖ置換を有するものが挙げられるが、限定されない。
【００２８】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第２の例は、配列番号２のアミノ酸残基１〜７４０および１６９０〜２３３２を含有するＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＬｏｌｌａｒに対する米国特許第６，４５８，５６３号を参照）。
【００２９】
本発明のＢドメインのない組換え型第ＶＩＩＩ因子の一実施形態において、ＢドメインをＤＮＡリンカー断片によって置換し、少なくとも１つのコドンを、ブタ第ＶＩＩＩ因子の対応する残基と同じ電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンと置換する（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＨａｕｓｅｒらに対する米国特許出願公開第２００４／０１９７８７５号を参照）。
【００３０】
本発明のＢドメインのない組換え型第ＶＩＩＩ因子の別の実施形態において、修飾された突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、１つ以上の位置で挿入された切断型第ＩＸ因子イントロン１を有するヌクレオチド配列によってコードされる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｎｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，８００，４６１号およびＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，７８０，６１４号を参照）。この組換え型第ＶＩＩＩ因子を、組換え型第ＶＩＩＩ因子をインビトロでさらに高い生産性で得るため、ならびに遺伝子治療用のトランスファーベクターにおいて使用できる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，８００，４６１号を参照）。この実施形態の特定例では、２つの位置で挿入された切断型第ＩＸ因子イントロン１を有し、造血細胞株、および特に血小板において発現を行うために適したプロモーターを有するヌクレオチド配列によって、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードできる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＮｅｇｒｉｅｒに対する米国特許第６，７８０，６１４号を参照）。
【００３１】
実施形態に関係なく、Ｂドメインのない第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。本明細書の実施例にしたがって調製される組換え型第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｂドメインがない。
【００３２】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第３の例は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原性の原因となるヒトアミノ酸残基の置換として１つ以上の動物アミノ酸残基を含有するキメラヒト／動物第ＶＩＩＩ因子である。特に、動物（たとえば、ブタ）残基置換としては、次の１つ以上を挙げることができるが限定されない：Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８８Ｇ、Ｐ４８５Ａ、Ｌ４８６Ｓ、Ｙ４８７Ｌ、Ｙ４８７Ａ、Ｓ４８８Ａ、Ｓ４８８Ｌ、Ｒ４８９Ａ、Ｒ４８９Ｓ、Ｒ４９０Ｇ、Ｌ４９１Ｓ、Ｐ４９２Ｌ、Ｐ４９２Ａ、Ｋ４９３Ａ、Ｇ４９４Ｓ、Ｖ４９５Ａ、Ｋ４９６Ｍ、Ｈ４９７Ｌ、Ｌ４９８Ｓ、Ｋ４９９Ｍ、Ｄ５００Ａ、Ｆ５０１Ａ、Ｐ５０２Ｌ、Ｉ５０３Ｍ、Ｌ５０４Ｍ、Ｐ５０５Ａ、Ｇ５０６Ａ、Ｅ５０７Ｇ、Ｉ５０８Ｍ、Ｉ５０８Ａ、Ｍ２１９９Ｉ、Ｆ２２００Ｌ、Ｌ２２５２Ｆ、Ｖ２２２３Ａ、Ｋ２２２７Ｅ、および／またはＬ２２５１（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，８５９，２０４号、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７７０，７４４号、およびＬｏｌｌａｒに対する米国特許出願公開第２００３／０１６６５３６号）。好ましくは、組換え型キメラ第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３３】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第４の例は、第ＩＸａ因子に対して向上した親和性を有する第ＶＩＩＩ因子（たとえば、それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Factor VIIIa A2 Subunit Residues 558-565 Represent a Factor IXa Interactive Site,” J. Biol. Chem. 269(32):20522-7 (1994); Bajajら, “Factor IXa: Factor VIIIa Interaction. Helix 330-338 of Factor IXa Interacts with Residues 558-565 and Spatially Adjacent Regions of the A2 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 276(19):16302-9 (2001);およびLentingら, “The Sequence Glu1811-Lys1818 of Human Blood Coagulation Factor VIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX,” J. Biol. Chem. 271(4):1935-40 (1996)を参照）および／または第Ｘ因子（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lapanら, “Localization of a Factor X Interactive Site in the A1 Subunit of Factor VIIIa,” J. Biol. Chem. 272:2082-88 (1997)を参照）である。好ましくは、向上した親和性の第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３４】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第５の例は、第ＶＩＩＩ因子の分泌を向上するために修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Swaroopら, “Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding Site Enhances Secretion of Coagulation Factor VIII,” J. Biol. Chem. 272(39):24121-4 (1997)を参照）。好ましくは、分泌が向上された突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記で同定された突然変異の１つ以上を含有する。
【００３５】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第６の例は、増大した循環半減期を有する第ＶＩＩＩ因子である。この修飾は、たとえば限定はされないが、ヘパラン硫酸（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Sarafanovら, “Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIII Catabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein,” J. Biol. Chem. 276(15):11970-9 (2001)）および／または低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質（「ＬＲＰ」）（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Saenkoら, “Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor in Mediation of Factor VIII Catabolism,” J. Biol. Chem. 274(53):37685-92 (1999);およびLentingら, “The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein,” J. Biol. Chem. 274(34):23734-9 (1999)を参照）との相互作用を低下させることによるなど、様々な方法を用いて行うことができる。好ましくは、半減期が向上した突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記の突然変異の１つ以上を含有する。
【００３６】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第７の例は、アスパラギン残基でグリコシル化の認識配列を産生するために、既知既存のエピトープ内のアミノ酸をコードするように修飾されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７５９，２１６号を参照）。この例の突然変異型第ＶＩＩＩ因子は、既存の抑制抗体による検出を免れる修飾された第ＶＩＩＩ因子（低抗原性第ＶＩＩＩ因子）であって、抑制抗体（低免疫原性第ＶＩＩＩ因子）発生の可能性を減少させるものを提供するのに有用であり得る。この例の特定の一実施形態において、修飾された第ＶＩＩＩ因子は、Ｎ結合型グリコシル化のコンセンサスアミノ酸配列を有するように突然変異している。このようなコンセンサス配列の一例は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであり、ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔは、セリンまたはトレオニンを表す（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，７５９，２１６号を参照）。好ましくは、グリコシル化部位修飾第ＶＩＩＩ因子は、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記で同定された突然変異の１つ以上を含有する。
【００３７】
本発明にしたがって修飾できる適した突然変異型第ＶＩＩＩ因子の第８の例は、様々な突然変異を有する凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子である、修飾された第ＶＩＩＩ因子である（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＫａｕｆｍａｎらに対する米国特許出願公開第２００４／００９２４４２号を参照）。この実施形態の一例は、（ｉ）フォンヴィレブランド因子結合部位を消失させ、（ｉｉ）Ａｒｇ７４０で突然変異を付加し、（ｉｉｉ）Ａ２ドメインとＡ３ドメインとの間にアミノ酸配列スペーサーを付加するように修飾された修飾第ＶＩＩＩ因子に関し、ここで、アミノ酸スペーサーは、活性化に際して、凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質がヘテロ二量体になるために十分な長さを有するものである（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれるＫａｕｆｍａｎらに対する米国特許出願公開第２００４／００９２４４２号を参照）。好ましくは、凝結促進活性な第ＶＩＩＩ因子はまた、（たとえば、位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）前記のような突然変異の１つ以上を含有するようにも修飾される。
【００３８】
さらに、凝固因子一般に関する様々な進歩を利用するために、突然変異型第ＶＩＩＩ因子を修飾することができる（たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Saenkoら, “The Future of Recombinant Coagulation Factors,” J. Thrombosis and Haemostasis 1:922-930 (2003)を参照）。
【００３９】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１Ａ２またはＡ２Ａ３ドメイン境界面（位置２８７、３０２、５１９、６６５、または１９８４を含む）を不安定化する任意の荷電残基で修飾することができ、また、Ｂドメインがないようになるか、キメラになるか、第ＶＩＩＩａ因子活性を向上させる修飾されたカルシウム結合部位を（たとえば、位置１１３において）有するか、変更された不活化切断部位を有するか、向上した第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子親和性を有するか、分泌が向上するか、循環半減期が増加するか、もしくは突然変異型グリコシル化部位を有するように、または荷電残基に対する１つ以上の修飾に加えて、組換え型第ＶＩＩＩ因子の活性を改善する修飾されたカルシウム結合部位を含むこのような修飾のいずれか１つ以上を有するように、修飾することができる。Ｂドメインがなく、比活性が向上された、高安定性組換え型第ＶＩＩＩ因子タンパク質の多くの例を実施例に記載する。
【００４０】
組換え型第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは実質的に純粋な形態で産生される。特定の実施形態において、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子は、少なくとも約８０％の純度であり、さらに好ましくは少なくとも９０％の純度であり、最も好ましくは少なくとも９５％の純度である。実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を、当該技術分野で周知の従来技術によって得ることができる。典型的には、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子が組換え宿主細胞の増殖培地中に分泌される。あるいは、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子が生成するが、増殖培地中に分泌されない。このような場合、実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離するために、組換えプラスミドを保有する宿主細胞を増やし、超音波、熱、または化学的処理によって溶解させ、ホモジネートを遠心分離にかけて、細胞片を除去する。上清を次に連続硫酸アンモニウム沈殿に供する。実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を含有する画分を適切なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラム中でゲル濾過にかけて、組換え型第ＶＩＩＩ因子を分離する。必要ならば、タンパク質画分（実質的に純粋な組換え型第ＶＩＩＩ因子を含有する）を高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）によってさらに精製することができる。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子に関する。組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。
【００４２】
一実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、１９８４、および／または３３２〜３４０において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、第ＶＩＩＩ因子比活性を向上させる位置１１３での突然変異をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４３】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、前記種類のＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４４】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換で修飾されるような、前記タイプのキメラヒト／ブタをコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４５】
その他の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、その不活化部位が、前記のように修飾され、前記のように修飾された第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４６】
さらに別の実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、その第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子に対する親和性が向上された、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４７】
なおさらなる実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、様々な血清結合タンパク質がその循環半減期を増大させるように変更されている、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４８】
さらなる実施形態において、単離された核酸分子は、（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、培養物中での分泌が増大した第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【００４９】
さらなる実施形態において、単離された核酸分子は、荷電残基の１つ以上の置換でさらに修飾されるような、１つ以上の天然に存在しないグリコシル化部位を有する第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列を（たとえば、配列番号２の位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４において）有し得る。
【００５０】
さらに別の実施形態において、単離された核酸分子は、前記のような任意の１つ以上の荷電残基で修飾された組換え形第ＶＩＩＩ因子をコードし、次の２つ以上を有するようにも修飾される。Ｂドメインがないように修飾されること、キメラであるように修飾されること、変更された不活化切断部位を有するように修飾されること、向上した第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子親和性を有するように修飾されること、分泌が向上するように修飾されること、増大した循環半減期を有するように修飾されること、１つ以上の天然に存在しないグリコシル化部位を有するように修飾されること、ならびにカルシウム結合部位内（たとえば、位置１１３）で修飾され、組換え型第ＶＩＩＩ因子の比活性が改善されること。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ発現システムに関し、この発現システムは、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする。一実施形態において、ＤＮＡ分子は、プロモーターに対してセンス配向にある。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする単離された核酸分子を含む宿主細胞に関する。特定の実施形態において、宿主細胞は、安定なプラスミドとして、または宿主細胞ゲノム中への安定な挿入物もしくは組み込みのいずれかとしてＤＮＡ分子形態で単離された核酸分子を含有することができる。別の実施形態において、宿主細胞は、発現システム中にＤＮＡ分子を含有することができる。適した宿主細胞は、動物細胞（たとえば、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞）、細菌細胞（たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ９細胞）、真菌細胞、酵母細胞（たとえば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、植物細胞（たとえば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）もしくはタバコ細胞）、または藻類細胞であり得るが、限定されない。
【００５３】
組換えＤＮＡ発現システムおよび宿主細胞を、以下にさらに詳細に議論するような、当該技術分野で周知の様々な組換え技術を用いて産生することができる。
【００５４】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を、従来型の組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞中に組み入れることができる。一般的に、これは、ＤＮＡ分子を、このＤＮＡ分子が異種性である（すなわち、通常、存在しない）発現システム中に挿入することを含む。異種性ＤＮＡ分子を発現システムまたはベクター中にセンス配向および正しいリーディングフレームで挿入する。ベクターは、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する。したがって、本発明の一実施形態は、本発明の単離された核酸を含有するＤＮＡ構築物を提供し、これは、宿主細胞または宿主生物において本発明のコードされた組換え型第ＶＩＩＩ因子の転写および発現をすることができる５’プロモーターと３’調節領域（すなわち、転写ターミネーター）とに機能し得るように結合させる。
【００５５】
本発明の組換え発現システムに関して、当該技術分野で一般的な技術を用いて、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクターを作製することができる。本発明の核酸分子を、当該技術分野で周知の試薬を使用して、多くの入手可能な発現ベクターのいずれかの中に挿入することができる。発現用のＤＮＡベクターの調製において、様々なＤＮＡ配列を通常、細菌プラスミド中に挿入するか、または置換することができる。任意の都合のよいプラスミドを用いることができ、このプラスミドは、細菌複製システム、細菌における選択を可能にするマーカー、および一般的に１つ以上の独自で都合のよい位置にある制限部位を有することを特徴とする。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的宿主に依存する。
【００５６】
様々な宿主ベクターシステムを利用して、組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする配列を発現することができる。第１に、ベクターシステムは、使用する宿主細胞と適合性でなければならない。宿主−ベクターシステムとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミッドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；ウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルスなど）に感染した哺乳動細胞システム；ウイルス（たとえば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；および細菌（たとえば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））に感染した植物細胞。これらのベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が異なる。用いられる宿主−ベクターシステムに応じて、多くの適した転写および翻訳エレメントのうちのいずれか１つを使用することができる。
【００５７】
組換えによって産生される場合、第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは変異体）は、組換え宿主細胞、これに限定されないが、典型的には真核生物において発現される。
【００５８】
本発明の実施に適したベクターとしては、これらに限定されないが、次のウイルスベクター、たとえばラムダベクターシステムｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、およびプラスミドベクター、たとえばｐＣＭＶ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／−またはＫＳ＋／−（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、“Stratagene Cloning Systems” Catalog (1993)を参照）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Studier et al, “Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes,” Methods in Enzymology 185:60-89 (1990)）、およびこれらの任意の誘導体が挙げられる。現在既知であるか、または遺伝子形質転換について後に記載される任意の適切なベクターが本発明に関する使用に適している。
【００５９】
組換え分子を形質転換、特に形質導入、結合、モビライゼーション（mobilization）、またはエレクトロポレーションによって細胞中に導入することができる。内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, N.Y.: Cold Springs Laboratory, (1982)に記載されているような、当該技術分野で標準的なクローニング手順を用いて、ＤＮＡ配列をベクター中にクローニングする。
【００６０】
内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒに発行された米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを使用した、組換えプラスミドの形態での発現システムの産生を記載している。これらの組換えプラスミドを次いで、形質転換を用いて導入し、組織培養中で増殖させた原核生物および真核細胞を含む単細胞培養物中で複製させる。
【００６１】
異なる遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象は、多くのレベルの遺伝子発現（たとえば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳）を制御する。
【００６２】
ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、これによってｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に依存する。真核性プロモーターのＤＮＡ配列は、原核性プロモーターのＤＮＡ配列とは異なる。さらに、真核性プロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは、原核システムにおいては認識されないか、または機能せず、さらに、原核性プロモーターは、真核細胞においては認識されないか、または機能しない。
【００６３】
同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる、適切な原核性シグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの有効な翻訳には、ｍＲＮＡ上のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、開始コドン、通常、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードするＡＵＧの前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は１６ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端に対して相補性であり、おそらくはｒＲＮＡで複製して、リボソームの正しい位置決めを可能にすることによって、ｍＲＮＡのリボソームに対する結合を促進する。遺伝子発現の最大化に関する論評については、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Roberts and Lauer, Methods in Enzymology 68:473 (1979)を参照。
【００６４】
プロモーターは、その「強度」（すなわち、その転写を促進する能力）が異なる。クローニングされた遺伝子を発現する目的で、高レベルの転写、したがって遺伝子の発現を得るためには、強力なプロモーターを使用することが一般的に望ましい。用いられる宿主細胞型に応じて、多くの適したプロモーターのいずれか１つを用いることができる。たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてクローニングする場合、そのバクテリオファージ、またはプラスミド、プロモーター、たとえばＴ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージラムダなどのＰＲおよびＰＬプロモーター、たとえばこれらに限定されないが、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどを使用して、隣接するＤＮＡ断片の高レベルの転写を行うことができる。さらに、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは組換えＤＮＡもしくは他の合成ＤＮＡ技術によって産生される他の大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写を提供することができる。
【００６５】
特異的に誘発されない限り、プロモーターの作用を阻害するために、細菌宿主細胞株および発現ベクターを選択することができる。ある操作において、特異的なインデューサーの添加が、挿入されたＤＮＡの有効な転写には必要である。例えば、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）の添加によって誘導される。様々な他のオペロン、たとえばｔｒｐ、ｐｒｏなどは異なる制御下にある。
【００６６】
特異的な開始シグナルも、原核性細胞における有効な遺伝子転写および翻訳に必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子特異的メッセンジャーＲＮＡおよび合成されたタンパク質の量によって測定される「強度」が異なり得る。プロモーターを含有するＤＮＡ発現ベクターは、様々な「強力な」転写および／または翻訳開始シグナルの組み合わせも含み得る。たとえば、大腸菌における有効な翻訳は、リボソーム結合部位を提供するために、開始コドン（「ＡＴＧ」）に対して５’の約７〜９塩基のＳＤ配列を必要とする。したがって、宿主細胞リボソームが利用できる任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを用いることができる。このような組み合わせは、これらに限定されないが、大腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子もしくはＮ遺伝子由来、または，大腸菌トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子由来のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを含む。さらに、組換えＤＮＡまたは合成ヌクレオチドの組み入れを含む他の技術によって産生される任意のＳＤ−ＡＴＧ組み合わせを用いることができる。
【００６７】
一実施形態において、オープンリーディングフレームが、最適のプロモーターの制御下で、コードされたタンパク質の発現に関して適切に配向するように、本発明の核酸分子を適切なベクター中に、センス方向で組み入れる。これには、適切な調節エレメントがＤＮＡ−ベクター構築物中に含まれることが関与する。これらは、ベクターの非翻訳領域、有用なプロモーター、ならびに宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う５’および３’未翻訳領域を包含する。このようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。使用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、任意の数の適した転写および翻訳エレメント、たとえば構成的および誘導性プロモーターを用いることができる。
【００６８】
構成的プロモーターは、生物の発生および生涯の全体にわたる遺伝子の発現を行うプロモーターである。
【００６９】
誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写をインデューサーに反応して直接的または間接的に活性化することができるプロモーターである。インデューサーの非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。
【００７０】
本発明のＤＮＡ構築物は、最適のタンパク質をコードするＤＮＡ分子と機能し得るように結合した、最適の宿主細胞における発現のためにｍＲＮＡの正しい転写終結およびポリアデニル化を提供できるものから選択される、機能可能な３’調節領域も含むことができる。
【００７１】
それぞれ、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)、およびAusubel, F. M.ら Current Protocols in Molecular Biology, New York, N.Y: John Wiley & Sons (1989) に記載されているような周知の分子クローニング技術を用いて、最適のベクター、プロモーター、および適切な３’調節領域を連結して、本発明のＤＮＡ構築物を産生することができる。
【００７２】
記載したように、原核宿主細胞の使用の１つの代替案は、真核宿主細胞、たとえば哺乳動物細胞の使用であり、これも、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を組換えによって産生するために使用できる。本発明の実施に適した哺乳動物細胞としては、とりわけ：ＣＯＳ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（たとえば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５７３）、ＣＨＯＰ、およびＮＳ−１細胞が挙げられる。
【００７３】
哺乳動物細胞における発現を行うために適した発現ベクターとしては、一般的に、プロモーター、ならびに当該技術分野で公知の他の転写および翻訳制御配列が挙げられる。一般的なプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、前初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられる。
【００７４】
本発明のＤＮＡ構築物はいったん調製されると、いつでも宿主細胞中に組み入れられる状態にある。したがって、本発明の別の態様は、組換え細胞を作製する方法に関する。基本的に、この方法は、宿主細胞におけるＤＮＡ分子の転写を行うために有効な条件下で、宿主細胞を本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することによって行われる。組換え分子を、形質転換、特に形質導入、結合、モビライゼーション、またはエレクトロポレーションによって細胞中に導入することができる。
【００７５】
本明細書において議論する組換え技術を考慮して、本発明の別の態様は、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法に関する。この方法は、本発明の宿主細胞を、この宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で増殖させる段階を含む。組換え型第ＶＩＩＩ因子を次に単離する。一実施形態において、宿主細胞を増殖培地中、インビトロで増殖させる。特定の実施形態において、適した増殖培地としては、制限無く、フォンヴィレブランド因子（本明細書においては「ＶＷＦ」と称する）を含有する増殖培地を挙げることができる。この実施形態において、宿主細胞は、ＶＷＦをコードする導入遺伝子を含有することができるか、またはＶＷＦを増殖培地に補給物として導入することができる。増殖培地中のＶＷＦは、組換え型第ＶＩＩＩ因子のさらに高い発現レベルを可能にするであろう。一旦、組換え型第ＶＩＩＩ因子が増殖培地中に分泌されると、関連する組換えＤＮＡおよびタンパク質分野の通常の技術者に周知の技術（本明細書において記載するものを包含する）を用いて、増殖培地から単離することができる。その他の実施形態において、本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法は、組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する前に、宿主細胞を破砕する段階をさらに含む。この実施形態において、組換え型第ＶＩＩＩ因子を細胞片から単離する。
【００７６】
位置２８７、３０２、５１９、６６５、および／または１９８４での修飾が特に好ましい。その理由は、修飾の結果、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の向上した安定性が得られるからである。この増大した安定性は、血液凝固中の第ＶＩＩＩ因子の循環半減期および第ＶＩＩＩａ因子の活性に関して重要である。さらに、この特性は、治療用に用いられるタンパク質の精製および調製中に使用可能な第ＶＩＩＩ因子の回収を向上させる点で重要である。
【００７７】
標的細胞において第ＶＩＩＩ因子発現を誘導するためのインビボ形質転換の目的で発現ベクターを使用する場合、様々な強度のプロモーターを、所望の向上の程度に応じて用いることができる。当業者は、適切な哺乳動物プロモーターを、これらのプロモーターとしての強度に基づいて容易に選択することができる。あるいは、第ＶＩＩＩ因子の発現もしくは抑制が望ましい場合、制御の目的で、誘導性プロモーターを用いることができる。当業者は、当該技術分野で公知のものから、適切な誘導哺乳動物プロモーターを容易に選択することができる。最後に、組織特異的哺乳動物プロモーターを、任意の遺伝子形質転換システムの有効性を特定の組織に限定するために選択することができる。組織特異的プロモーターは当該技術分野で公知であり、処理される組織もしくは細胞型に基づいて選択することができる。
【００７８】
本発明の別の態様は、動物の血液障害、たとえば血友病、特に、血友病Ａを治療する方法に関する。この方法は、血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階を含む。組換え型第ＶＩＩＩ因子の適した有効量としては、制限無く、動物の体重１ｋｇあたり約１０〜約５０単位までの間を挙げることができる。動物は、任意の哺乳動物であり得るが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはウサギである。
【００７９】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子を用いて、抑制抗体を有する血友病患者および抑制抗体を有さない血友病患者、ならびに抑制抗体の発生による後天的第ＶＩＩＩ因子欠乏の患者における、第ＶＩＩＩ因子欠乏による制御できない出血（たとえば、関節内、頭蓋内、または消化管出血）を治療することができる。特定の実施形態において、組換え型第ＶＩＩＩ因子は、単独または薬学的組成物（すなわち、安定剤、送達ビヒクル、および／または担体との組み合わせ）の形態で、ヒトまたは動物第ＶＩＩＩ因子の注入のために使用される同じ手順に従って患者に静脈内注入される。
【００８０】
その代わりに、またはそれに加えて、組換え型第ＶＩＩＩ因子を、アデノ関連性ウイルスなどのウイルスベクターの投与（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Gnatenkoら, “Human Factor VIII Can Be Packaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated Virus Background: Applicability to Hemophilia A Gene Therapy”Br. J. Haematol. 104:27-36 (1999)）によって、または組換え型第ＶＩＩＩ因子を産生するために遺伝子操作された細胞の移植（典型的には、このような細胞を含有するデバイスの移植による）によって、投与することができる。このような移植は、典型的には、組換え皮膚線維芽細胞、非ウイルス法（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Rothら, “Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation Factor VIII in Patients with Sever Hemophilia”New Engl. J. Med. 344:1735-1742 (2001)）の使用を含む。
【００８１】
このような治療を必要とする患者へ投与すべき組換え型第ＶＩＩＩ因子の治療用量は、第ＶＩＩＩ因子欠乏の重症度に応じて変わる。一般的に、投与量レベルを、それぞれの患者の出血症状の重症度および期間に合った頻度、期間、および単位で調節する。このように、薬学的に許容される担体、送達ビヒクル、または安定剤中に、標準的凝固分析によって測定されるような、出血を停止させるための治療有効量のタンパク質を患者に送達するために十分な量で組換え型第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
【００８２】
第ＶＩＩＩ因子は、伝統的に、血友病Ａの個体由来の血漿中の凝固欠陥を補正する、正常な血漿中に存在する物質として定義される。第ＶＩＩＩ因子の精製および部分精製形態のインビトロ凝集活性を用いて、ヒト患者中へ注入するための組換え型第ＶＩＩＩ因子用量を計算し、患者血漿から回収される活性およびインビボの出血欠陥補正の信頼できるインジケーターである。それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lusherら, “Recombinant Factor VIlI for the Treatment of Previously Untreated Patients with Hemophilia A - Safety, Efficacy, and Development of Inhibitors”, New Engl. J. Med. 328:453-459 (1993); Pittmanら, “A2 Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required for Procoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage”, Blood 79:389-397 (1992); およびBrinkhousら, “Purified Human Factor VIlI Procoagulant Protein: Comparative Hemostatic Response After Infusions into Hemophilic and von Willebrand Disease Dogs”, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755 (1985)によると、インビトロの新規第ＶＩＩＩ因子分子の標準的分析と、イヌ注入モデルもしくはヒト患者におけるそれらの挙動との間の相違は報告されていない。
【００８３】
通常、組換え型第ＶＩＩＩ因子の投与によって患者で達成される望ましい血漿第ＶＩＩＩ因子活性レベルは、正常の３０〜１００％の範囲である。一実施形態において、治療的組換え型第ＶＩＩＩ因子の投与は、約５〜５０単位／体重ｋｇの範囲、特に１０〜５０単位／体重ｋｇ、さらに詳細には２０〜４０単位／体重ｋｇの範囲の好ましい投与量で静脈内投与され；投与間隔は約８〜２４時間（重度の血友病患者において）の範囲であり；治療期間の日数は、１〜１０日の範囲であるか、または出血症状が消散するまでである。たとえば、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Roberts and Jones, “Hemophilia and Related Conditions--Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII),” Ch. 153, 1453-1474, 1460, Hematology, Williams, W. J.,ら, ed. (1990)を参照。阻害物質を有する患者は、第ＶＩＩＩ因子の先の形態とは異なる量の組換え型第ＶＩＩＩ因子を必要とし得る。例えば、患者が必要とする組換え型第ＶＩＩＩ因子は少ない。その理由は、比活性が野生型ＶＩＩＩよりも高く、その抗体反応性が減少しているからである。ヒトまたは血漿由来の第ＶＩＩＩ因子を用いた治療においてと同様、注入される治療的組換え型第ＶＩＩＩ因子の量は、一段階第ＶＩＩＩ因子凝固分析によって定義され、選択された例では、インビボ回収率（ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は、注入後の患者の血漿中の第ＶＩＩＩ因子を測定することによって決定される。特定の患者について、特定の投与レジメンを長時間にわたって、個々の要求ならびに、組成物を投与するかまたは投与を監督する人物の専門的な判断にしたがって調節すべきであり、本明細書で前述した濃度範囲は単なる例示であり、特許請求される組換え型第ＶＩＩＩ因子の範囲または実施を制限することを意図するものではないと理解すべきである。
【００８４】
治療は、必要に応じて、組換え型第ＶＩＩＩ因子の１回の静脈内投与、または長時間にわたる周期的もしくは連続投与の形態をとることができる。あるいは、治療用組換え型第ＶＩＩＩ因子を、リポソームとともに１回もしくは複数回、様々な時間間隔で皮下または経口投与することができる。
【００８５】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を用いて、ヒト第ＶＩＩＩ因子に対する抗体が生じた血友病患者における、第ＶＩＩＩ因子欠乏が原因の制御できない出血を治療することができる。
【００８６】
本発明の組換え型第ＶＩＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩＩ因子とは比活性が異なり得ることを本明細書において示した。野生型第ＶＩＩＩ因子由来の高い凝固促進活性を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、血友病の治療において有用である。その理由は、患者の第ＶＩＩＩ因子欠損を補正するために必要な投与量が少ないからである。このことによって、患者と保険会社との双方の医療費が軽減されるだけでなく、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応発生の可能性も軽減される（投与される抗原が少ないため）。
【００８７】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するためのものであり、その範囲を制限するものではない。
【００８８】
材料および方法
試薬
組換え型第ＶＩＩＩ因子（Ｋｏｇｅｎａｔｅ（商標））はＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州バークレー）のＬｉｓａ Ｒｅｇａｎ博士より贈与された。２０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、４０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、および４０％のホスファチジルセリン（ＰＳ）を含有するリン脂質ベシクルを、すでに記載されたようにオクチルグルコシドを用いて調製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Mimmsら, “Phospholipid Vesicle Formation and Transmembrane Protein Incorporation Using Octyl Glucoside,” Biochemistry 20:833-840 (1981)）。試薬α−トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａβ因子、第Ｘ因子、および第Ｘａ因子（インディアナ州サウスベンドのＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヒルジンおよびリン脂質（オハイオ州ウェストチェスターのＤｉａＰｈａｒｍａ）、発色Ｘａ基質、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ Ｘａ（Ｐｅｆａ−５５２３、ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＡｃＯＨ；コネチカット州ノーウォークのＣｅｎｔｅｒｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）、組換えヒト組織因子（ｒＴＦ）、Ｉｎｎｏｖｉｎ（デラウェア州ニューアークのＤａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、蛍光発生基質、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（カリフォルニア州サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ならびにトロンビンキャリブレーター（ニュージャージー州パーシッパニーのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）を、指定の供給元から購入した。
【００８９】
ＷＴおよび変異型第ＶＩＩＩ因子の構築、発現および精製：
Ａｌａ突然変異体（Ｄ２７、Ｈ２８１、Ｒ２８２、Ｅ２８７、Ｄ３０２、Ｓ３１３、Ｈ３１７、Ｔ５２２、Ｓ５２４、Ｒ５３１、Ｎ５３８、Ｅ５４０、Ｓ６５０、Ｓ６５４、Ｄ６６６、Ｅ６８３、Ｎ６８４、Ｓ６９５、Ｄ６９６、Ｓ１７９１、Ｄ１７９５、Ｑ１８２０、Ｅ１８２９、Ｓ１９４９、Ｎ１９５０、およびＲ１９６６）；Ｐｈｅ突然変異体（Ｙ４７６、Ｙ６６４、Ｙ１７８６、およびＹ１７９２）；ＡｌａおよびＶａｌ突然変異体（荷電残基Ｅ２７２、Ｄ５１９、Ｅ６６５、およびＥ１９８４）；ならびにＷＴ第ＶＩＩＩ因子形態を、Ｂドメインで残基Ｇｌｎ７４４〜Ｓｅｒ１６３７が欠損したＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子として個々に構築した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Doeringら, “Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII,” Thromb Haemost. 88:450-458 (2002)）。クローニングおよび発現構築物は、Ｐｅｔｅ Ｌｏｌｌａｒ博士およびＪｏｈｎ Ｈｅａｌｅｙ博士から贈与された。組換えＷＴおよび変異型第ＶＩＩＩ因子形態は、ＢＨＫ細胞において安定して発現され、すでに記載されているようにして精製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Residues 110-126 in the A1 Domain of Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Required for Cofactor Activity,” J Biol Chem. 279:12677-12684 (2004)）。トランスフェクション後、変異体間で第ＶＩＩＩ因子分泌の量には有意な差はなかった。変異体のタンパク質収量は、２つの７５０ｃｍ２培養フラスコからは１０超〜約１００μｇの範囲であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定すると、純度は約８５％〜９５％超であった。第ＶＩＩＩ因子調製物中の主な汚染物質はアルブミンであり、第ＶＩＩＩ因子中に存在する濃度では、活性パラメータの安定性に対して影響をおよぼさなかった。第ＶＩＩＩ因子濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定し、第ＶＩＩＩ因子活性を以下に記載するような凝固一段階法および発色性第Ｘａ因子生成二段階法によって決定した。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ゲル染色については０．７７μｇ、ウェスタンブロットについては０．３４μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル上、一定電圧（１００Ｖ）で電気泳動させた。ゲルをＧｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（イリノイ州ロックフォードのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色するか、またはポリフッ化ビニリデン膜に移し、ビオチニル抗Ａ２抗体（Ｒ８Ｂ１２、バーモント州バーリントンのＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）でプローブし、続いてペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（カリフォルニア州サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともにインキュベートした。化学蛍光基質（ＥＣＦ基質、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を反応させ、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｓｔｏｒｍ８６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて蛍光シグナルをスキャンした。単鎖第ＶＩＩＩ因子形態（１７０ｋＤａ）および重鎖（ＨＣ、９０ｋＤａ）の密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量化し、量の比を計算した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡ
サンドウィッチＥＬＩＳＡを実施して、すでに記載されているようにして（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “A Glu113Ala Mutation within a Factor VIII Ca2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase,” Biochemistry 44:10298-10304 (2005)）、精製された市販の組換え型第ＶＩＩＩ因子（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を標準として使用して、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の濃度を測定した。抗Ｃ２抗体（ＥＳＨ−８、コネチカット州スタムフォードのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）およびビオチニルＲ８Ｂ１２抗体を使用した第ＶＩＩＩ因子捕捉を、第ＶＩＩＩ因子検出のために使用した。
【００９２】
凝固一段階法
凝固一段階法を、第ＶＩＩＩ因子を化学的に消耗させた基質血漿（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Over, “Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII (VIII:C),” Scand J Haematol Suppl. 41:13-24 (1984)）を用いて実施し、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ凝固装置を用いて分析した。血漿をＡＰＴＴ試薬（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とともに６分間、３７℃でインキュベートし、その後、第ＶＩＩＩ因子の希釈液をキュベットに添加した。１分後、混合物を再石灰化させ、凝固時間を測定し、プールされた正常血漿標準と比較した。
【００９３】
発色性第Ｘａ因子生成二段階法
第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換速度を、精製システム（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lollarら, “Factor VIII and Factor VIIIa,” Methods Enzymol. 222:128-143 (1993)）において、すでに記載されている方法（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001); Wakabayashiら, “Ca2+ Binding to Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for Cofactor Activity,” Biochemistry 41:8485-8492 (2002)）に従ってモニターした。２０ｍＭのＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．２）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％のＢＳＡ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および１０μＭのＰＳＰＣＰＥベシクル（緩衝液Ａ）を含有する緩衝液中第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を、２０ｎＭのα−トロンビンで１分間活性化した。ヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）を添加することによって反応を停止させ、結果として得られた第ＶＩＩＩａ因子を第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）と１分間反応させた。第Ｘ因子（３００ｎＭ）を添加して、反応を開始させ、５０ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって、１分後に停止させた。生成した第Ｘａ因子を、発色基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ Ｘａ（最終濃度０．４６ｍＭ）との反応後に決定した。すべての反応を２３℃で実施した。
【００９４】
トロンビン生成法
血漿中の生成したトロンビンの量を、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈｙ（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma,” Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4-15 (2003); Hemkerら, “Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential,” Thromb Haemost. 74:134-138 (1995)）によって測定した。９６穴プレート中、第ＶＩＩＩ因子阻害物質が欠損した重度血友病Ａ患者由来の第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿、８０μｌ（１％未満の残留活性、血小板不足）（カンザス州オーバーランド・パークのＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）を第ＶＩＩＩ因子試料（２０μｌ；６ｎＭ）と３ｐＭのｒＴＦ（ｒＴＦストックの濃度は、第Ｘａ因子生成法により、既知濃度の第ＶＩＩａ因子を用いて決定した）、ＰＳＰＣＰＥベシクル（２４μＭ）または２０μｌのトロンビンキャリブレーター（６３０ｎＭ）を含有するＨＥＰＥＳ−ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５、０．１５ＭのＮａＣｌ、６％のＢＳＡ）中で混合し、０．１ＭのＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ−ＢＳＡ緩衝液中で２０μｌの蛍光発生基質（２．５ｍＭ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）と混合することにより、反応を直ちに開始させた。全ての試薬を３７℃で予熱した。試薬の最終濃度は、１ｎＭの第ＶＩＩＩ因子（他の表示がある場合を除く）、０．５ｐＭのｒＴＦ、４μＭのＰＳＰＣＰＥベシクル、４３３μＭの蛍光発生基質、１３．３ｍＭのＣａｌＣｌ２、および１０５ｎＭのトロンビンキャリブレーターであった。３７℃での蛍光シグナルの発生を、８秒間隔で、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓｐｅｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ、カリフォルニア州サニーベールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（３５５ｎｍ（励起）／４６０ｎｍ（発光）フィルターセット）を用いてモニターした。蛍光シグナルをトロンビンキャリブレーター試料からの参考シグナルによって補正し（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma,” Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4-15 (2003)）、実際のトロンビン生成（ｎＭ）をすでに記載されているようにして計算した（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Hemkerら, “Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential,” Thromb Haemost. 74:134-138 (1995)）。
【００９５】
高温での第ＶＩＩＩ因子活性
緩衝液Ａ中のＷＴ第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子変異体（４ｎＭ）を５２〜６０℃でインキュベートした。アリコートを表示された時間で取り出し、残存する第ＶＩＩＩ因子活性を、発色性第Ｘａ因子生成二段階法を用いて測定した。
【００９６】
第ＶＩＩＩａ因子活性時間経過
１０μＭのＰＳＰＣＰＥベシクルを含有する緩衝液Ａ中のＷＴおよび突然変異型第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を、２０ｎＭのトロンビンによって１分間２３℃で活性化した。反応をヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）によって直ちに停止させ、アリコートを表示された時間で取り出し、第Ｘａ因子生成法を用い、続いて第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）および第Ｘ因子（３００ｎＭ）を添加して、活性を決定した。第ＩＸａ因子の存在下で減衰測定を実施するために、第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）をトロンビン添加の前に反応に添加した。
【００９７】
血漿中の第ＶＩＩＩ因子安定性
ＷＴまたは変異型第ＶＩＩＩ因子（１ｎＭ）を第ＶＩＩＩ因子阻害物質が欠損した重度の血友病Ａ患者（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）由来の第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（１％未満の残留活性）に添加した。血漿に０．０２％のＮａＮ３を添加して、微生物の増殖を防止し、試料を３７℃でインキュベートした。アリコートを表示された時間で取り出し、凝固一段階法によって残留活性を決定した。
【００９８】
データ分析
時間の関数としての第ＶＩＩＩａ因子活性値を、式
Ａ＝Ａ０×ｅ−ｋ・ｔ
（式中、Ａは残留第ＶＩＩＩａ因子活性（ｎＭ／分／ｎＭ第ＶＩＩＩ因子）であり、Ａ０は初期活性であり、ｋは見かけの速度定数であり、ｔは高温での第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子減衰実験について）またはトロンビン活性化を失活させた後（第ＶＩＩＩａ因子減衰測定について）のいずれかの反応時間（分）である）を用いて、非線形最小二乗回帰によって単一指数関数減衰曲線に適合させた。非線形最小二乗回帰分析をＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（ペンシルベニア州レディングのＳｙｎｅｒｇｙ）によって実施した。平均値の比較をスチューデントのｔ検定によって実施した。第ＶＩＩＩＡ因子ドメインモデル化構造（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）を、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて分析して、Ａ２ドメイン境界面に位置し、相補性ドメインの極性原子を隔てる２．８Å超の閾値に基づいて、水素結合相互作用の可能性をほとんど示さない荷電残基を同定した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Weinerら, “A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins,” J Am Chem Soc. 106:765-784 (1984)）。
【００９９】
実施例１：水素結合相互作用を標的とする第ＶＩＩＩ因子突然変異体の活性値
第ＶＩＩＩ因子中のＡ２ドメインに関与する結合相互作用は、まだ十分理解されていないが、補因子活性調節の主なメカニズムである。第ＶＩＩＩ因子相同性モデル（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）は、Ａ２ドメイン中の残基と、Ａ１もしくはＡ３ドメイン中の残基とを結合させる多くの水素結合の可能性を特定する。水素ドナーとアクセプター原子との間の２．８Å未満の空間的距離の基準を用いて（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Weinerら, “A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins,” J Am Chem Soc. 106:765-784 (1984)）、３０残基が相補性Ａドメインからの原子との水素結合に関与し得る側鎖原子を有すると確認された（下表1を参照）。同定された残基の約半分で、側鎖原子は骨格カルボニル酸素またはアミド水素原子のいずれかに隣接し、一方、残りは、隣接する側鎖間の可能な相互作用に相当していた。Ｔｙｒ残基がＰｈｅと置換される以外は、第ＶＩＩＩ因子Ａドメイン中の標的残基は、個々にＡｌａに変異され、点突然変異は、Ｂドメインのない第ＶＩＩＩ因子として安定して発現された。
【０１００】
第ＶＩＩＩ因子活性を、凝固一段階法および（二段階）第Ｘａ因子生成法を用いて、精製タンパク質について測定した。一段階分析からの結果（図１）から、３０の点突然変異体のうちの９が、活性ＷＴ第ＶＩＩＩ因子に対して５０％未満の活性を示すことがわかった。これらの変異体のうちの５つは、一段階／二段階分析の相違（１．５倍超の相違）を示し、３つの突然変異体（Ｓ５２４Ａ、Ｈ２８１Ａ、およびＥ２８７Ａ）は二段階分析においてのみ減少を示した。いくつかの標的残基における突然変異についての減少した活性値は、第ＶＩＩＩ因子および／または第ＶＩＩＩａ因子の構造安定性に対する側鎖の寄与と一致した。
【０１０１】
（表１）水素結合できるアミノ酸残基
ａ骨格カルボニル酸素原子
ｂ骨格アミド水素原子
【０１０２】
実施例２：第ＶＩＩＩ因子変異体の熱安定性
ＷＴプロ補因子および変異体の熱安定性を評価するために、以前の研究で記載されている第ＶＩＩＩ因子不活化結果（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ansongら, “Factor VIII A3 Domain Residues 1954-1961 Represent an A1 Domain-Interactive Site,” Biochemistry 44:8850-8857 (2005)）に基づいて、５５℃の温度を採用した。これらの反応に関して、第ＶＩＩＩ因子を表示された時間、高温でインキュベートし、その後、反応混合物を直ちに室温まで冷却し、第ＶＩＩＩ因子をトロンビンと反応させ、第Ｘａ因子生成法を用いて補因子活性について分析した。残留補因子機能によって判定されるような、第ＶＩＩＩ因子活性の熱処理に対する損失率を、方法に記載されるようにして決定した。図２Ａは、ＷＴと比較した、熱処理に対して最大および最低感受性を示す変異体についての結果を示す。
【０１０３】
表２（下記）に、３０の変異体についての第ＶＩＩＩ因子熱安定性分析から得られた結果をまとめる。全体的に、これらの活性データは、ほとんどの場合、０．９８を超える相関関数で単一指数関数減衰関数によく適合する。多くの突然変異はアミノ酸置換に対して良性であるが（２１が減衰速度において２倍未満の差を示す）、Ａｒｇ２８２（Ａ１ドメイン）、ならびにＡ２ドメイン残基Ｓｅｒ５２４、Ａｓｎ６８４およびＳｅｒ６５０などのいくつかの残基は、第ＶＩＩＩ因子減衰において約５〜約２０倍増加した速度を示し、このことは、第ＶＩＩＩ因子安定性の維持におけるこれらの残基の重要な役割を示唆する。さらに、Ｒ２８２ＡおよびＮ６８４Ａ変異体は、著しく減少した比活性値を示し、このことは、活性パラメータと安定性パラメータとの両方が、点突然変異によって影響を受けたことを示唆する。他方、Ｅ２８７およびＤ３０２のＡｌａとの置換によって、高温での第ＶＩＩＩ因子減衰に関して速度が減少した。このような、突然変異後のタンパク質安定性の見かけの増加は、ＷＴ補因子におけるドメイン間相互作用を不安定化するこれらの酸性側鎖と一致する。
【０１０４】
（表２）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度ならびに活性値
突然変異型第ＶＩＩＩ因子形態は、第ＶＩＩＩ因子減衰の減少速度に基づいて並べられている。速度減衰値についての標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ第ＩＸａ因子の存在下で実施した減衰実験
ｂ第ＩＸａ因子の非存在下で実施した減衰実験
ｃ括弧内の値は、野生型に対する値である。
ｄ単位／μｇ
ｅ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）
【０１０５】
実施例３：第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
第ＶＩＩＩａ因子活性は、Ａ２サブユニット解離のために不安定である（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Lollarら, “pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII,” J Biol Chem. 265:1688-1692 (1990)）。従来の研究から得られた結果は、第ＩＸａ因子およびリン脂質ベシクルに第ＶＩＩＩａ因子を含めて、Ｘａｓｅ複合体を形成することにより、Ｘａｓｅ因子内のＡ２サブユニットが部分的に安定化されることによって（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）、補因子の不安定性が軽減されたことがわかる（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Lollarら, “Stabilization of Thrombin-activated Porcine Factor VIII:C by Factor IXa Phospholipid,” Blood 63:1303-1308 (1984); Lamphearら, “Factor IXa Enhances Reconstitution of Factor VIIIa from Isolated A2 Subunit and A1/A3-C1-C2 Dimer,” J. Biol. Chem. 267:3725-3730 (1992)）。この方法は、近年、Ｅ１８２９Ａ第ＶＩＩＩａ因子突然変異体の減衰速度を調べるために用いられた（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “A3 Domain Residue Glu1829 Contributes to A2 Subunit Retention in Factor VIIIa,” J. Thromb. Haemost. 5:996-1001(2007)）。その理由は、第ＩＸａ因子および膜の非存在下で、この変異型第ＶＩＩＩａ因子の活性減衰は速すぎて、正確に測定できなかったからである。この方法は、この実施例に記載する変異体のパネルの第ＶＩＩＩａ因子減衰の速度を評価するためにも同様に用いられた。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を１モル過剰の第ＩＸａ因子（４０ｎＭ）およびリン脂質ベシクルとともにインキュベートし、トロンビンで迅速に活性化し、その後のＸａｓｅ因子活性を２３℃で長時間にわたって測定した。Ｘａｓｅ因子活性の減衰速度は、Ａ２サブユニット解離に起因し、単一指数関数減衰を用いてデータを適合させた。第ＶＩＩＩａ因子（１４４ｎＭ）内のＡ２サブユニットの親和性について高いＫｄ値、および反応において使用される低い第ＶＩＩＩａ因子濃度（４ｎＭ）を考慮に入れると、解離したＡ２サブユニットの再会合の影響は無視でき、この回帰分析に適用した単純な単一指数関数の使用を支持する。
【０１０６】
結果を図２Ｂに示す。この図は、最も大きく影響を受けた変異体ならびに突然変異に対して正の応答を示す変異体についてのデータを示す。７つの変異体で、ＷＴと比較して、第ＶＩＩＩａ因子減衰速度において有意に（５倍超）増加した（表２）。これらの突然変異には、Ｒ２８２Ａ、Ｓ５２４Ａ、Ｎ６８４Ａ、Ｅ１８２９Ａ、Ｙ１７８６Ｆ、Ｄ６６６Ａ、およびＹ１７９２Ｆが含まれる。二段階分析によって測定されるこれらの変異体の第ＶＩＩＩ因子活性値は、一段階分析によって測定されるものよりも有意に低く（図１）、かなりの速度のＡ２サブユニット解離をもたらす突然変異と一致する。さらに、これらの突然変異のいくつか（Ｒ２８２Ａ、Ｎ６８４ＡおよびＹ１７９２Ｆを包含する）は、一段階分析において全体的に低い比活性を示した。この分析相違を有する第ＶＩＩＩ因子突然変異体の場合と同様、一段階分析から決定される活性も減少し（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pipeら, “Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation: Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo,” Blood 93:176-183 (1999); Pipeら, “Hemophilia A Mutations Associated with 1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa,” Blood 97:685-691 (2001); Hakeosら, “Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3 Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy,” Thromb Haemost. 88:781-787 (2002)）、おそらくは、第ＶＩＩＩ因子活性の決定に対するＡ２解離速度の直接的影響を反映するものであろう。
【０１０７】
反対に、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子よりも高い熱安定性を有する変異型Ｅ２８７ＡおよびＤ３０２Ａによっても、トロンビンによる活性化後の補因子減衰の速度の減少によって判断される、第ＶＩＩＩａ因子の安定性が向上した。Ｄ３０２Ａ変異体に関する結果はさらに顕著であり、ＷＴ第ＶＩＩＩａ因子に対して補因子減衰の速度を約２倍減少させ、４０分後にその本来の活性の約９０％を保持していた。この観察結果は、プロ補因子におけるドメイン間境界面で立体構造を主に変更する突然変異と一致していた。
【０１０８】
あわせると、実施例１〜３におけるこれらの結果は、第ＶＩＩＩ因子のプロ補因子および補因子形態におけるＡ２（ドメイン）サブユニット間相互作用に対する複数の残基の寄与を特定し、選択された残基はタンパク質安定性に対して本質的に異なる寄与をする。標的残基での突然変異の観察される効果は、ほとんどの部分について良性であるか、または有害であるかのいずれかであるが、２つのＡ１ドメイン酸性残基であるＤ３０２およびＥ２８７での突然変異によって、プロ補因子形態と活性補因子形態との両方において、安定性が適度に向上した。Ｅ２８７の相対的活性は、ＷＴと比較して若干減少したが、Ｄ３０２変異体の活性値は、ＷＴタンパク質と区別できず、このことは、後者が機能獲得型突然変異であることを示唆する。これらの結果から、一部の不安定化は、（負の）電荷を境界面で埋没させること、および／または残基側鎖が疎水性である場合の安定性の増大に起因することがわかる。
【０１０９】
実施例４：さらなる標的残基の同定ならびにＧｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４での点突然変異体の生成
前記実施例の結果に基づき、他の荷電残基の置換を調査した。セルロプラスミンベースの相同性モデル（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）を第ＶＩＩＩ因子のＡドメインについて用いて、４つの荷電残基を同定した（Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４）。これらの４つの残基は、Ａ２ドメインと、Ａ１ドメイン（Ｇｌｕ２７２およびＡｓｐ５１９）またはＡ３ドメイン（Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４）との境界面で埋没しているようであるが、隣接基の結合可能性を有する２．８Åより大きい空間隔離に基づいて、Ｈ結合相互作用には寄与しなかったと思われる。これらの残基は、ＡｌａまたはＶａｌのいずれかに変異されて、電荷を除去し、また他の埋没残基由来の類似の側鎖との潜在的な疎水性相互作用を提供した。第ＶＩＩＩ因子変異体を安定に発現するＢＨＫ細胞株におけるＢドメインのない第ＶＩＩＩ因子として調製した。
【０１１０】
第ＶＩＩＩ因子を、単鎖およびヘテロ二量体形態の混合物として発現させた。精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定すると、約８５％〜約９５％超の範囲であった（図３Ａ）。抗Ａ２ドメイン抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して、単鎖およびヘテロ二量体形態の化学量論を定量化した（図３Ｂ）。この値は、ＷＴについてはほぼ１つであり、第ＶＩＩＩ因子変異体については若干低く、可変的であった。
【０１１１】
精製タンパク質を、一段階分析と二段階分析との両方（図４Ａ）およびトロンビン生成パラメータ（図４Ｂ〜Ｄ）を使用して、比活性について評価した。Ｇｌｕ２７２Ａｌａ変異体を除いた全て、ＷＴの少なくとも８０％である比活性値をもたらし、このことは、残存する突然変異がたとえあったとしても少ししか第ＶＩＩＩ因子補因子機能に影響を及ぼさないことを示唆する。低いｒＴＦ濃度（０．５ｐＭ）および生理学的濃度（１ｎＭ）の第ＶＩＩＩ因子で実施したトロンビン生成によって、比活性値と類似した結果が得られた。図４Ｄに示されるパラメータ値から、Ｇｌｕ２７２Ａｌａのピーク値およびＥＴＰはＷＴと比較して減少し、一方、残りの変異体の他の全てのパラメータ値は、ＷＴ値の８０超〜１１０％の範囲であったことがわかった。
【０１１２】
実施例５：Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４第ＶＩＩＩ因子変異体の熱安定性
精製第ＶＩＩＩ因子突然変異体タンパク質を、活性損失速度によって判断される、高温での安定性について評価した。第ＶＩＩＩ因子（４ｎＭ）を５２〜６０℃でインキュベートし、指定の時間でアリコートを取り出し、室温に冷却し、トロンビンと反応させ、材料および方法に記載されているような第Ｘａ因子生成法を使用して、残留補因子活性を測定した。図５Ａに示す結果は、第ＶＩＩＩ因子ＷＴおよび変異体の５５℃での活性減衰の時間経過を示す。この温度は、以前の研究（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ansongら, “Factor VIII A1 Domain Residues 97-105 Represent a Light Chain-interactive Site,” Biochemistry 45:13140-13149 (2006)）に基づいて選択され、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子について１時間以内でほぼ完全な活性損失を示した。ＷＴタンパク質は約１５分で５０％の活性を失った。Ｇｌｕ２７２ＡｌａおよびＧｌｕ２７２Ｖａｌ変異体は、若干速い活性減衰によって判断されるように、安定性の低下を示すことが観察され、この特性は、この部位での突然変異について観察される低下した比活性と関連する。他方、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４についてのＡｌａおよびＶａｌ置換はすべて、高温で改善された安定性を示し、２つの前者の部位での突然変異を有する変異体は約２０〜２５分にわたって５０％活性を保持し、一方、後者の部位での突然変異は、３０分超にわたってこの活性レベルを維持する変異体をもたらした。適合させた曲線から得られた減衰速度値の比較（下記表１）は、第ＶＩＩＩ因子熱安定性は、ＷＴと比較して、Ｇｌｕ１９８４変異体について約２倍改善されたことを示し、Ｖａｌへの突然変異は、Ａｌａより若干好ましいように見える。
【０１１３】
温度範囲を評価する結果（図５Ｂ）から、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４のＡｌａおよびＶａｌの両変異体は、試験した全ての温度で、ＷＴと比較して２倍までの減衰速度の減少を一貫して示したことがわかった。しかし、単鎖形態とヘテロ二量体形態との両方が様々な比で存在することによって、１つの形態がより高い安定性を示す場合、これらの減衰速度結果に影響を及ぼし得る。本質的に全てヘテロ二量体形態であるＫｏｇｅｎａｔｅ第ＶＩＩＩ因子を用いた対照実験（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Wakabayashiら, “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001)）によって、ＷＴの約２倍である減衰速度が得られ（図５Ｂ）、単鎖第ＶＩＩＩ因子よりも高温に対して低い安定性を示すヘテロ二量体形態と一致した。したがって、測定された減衰速度は、明らかに、様々な第ＶＩＩＩ因子形態中の単鎖および２本鎖含有量の不均一性に起因する。しかし、すべての変異体がＷＴと比較して関連性の低い単鎖第ＶＩＩＩ因子を有する場合（図５Ｂを参照）、これらのデータは、これらの変異体の減衰速度値によって、突然変異体とＷＴとの間の安定性における増加が過小評価されることを示す。
【０１１４】
（表３）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
速度減衰値の標準偏差は最小二乗曲線適合に基づいて推定され、熱安定性および第ＶＩＩＩａ因子減衰測定値については平均値の約１０％以内であり、血漿安定性測定値については平均値の約１５％以内である。括弧内の値は、ＷＴ値に対する値である。一文字コードを用いてアミノ酸残基を表示する、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ａ（Ａｌａ）、およびＶ（Ｖａｌ）。
†測定せず。
‡ＷＴの速度と比較してｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
§ＷＴの速度と比較してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【０１１５】
実施例６：３７℃での血漿中の第ＶＩＩＩ因子安定性
より自然な条件下での第ＶＩＩＩ因子安定性に対する突然変異の影響を試験するために、生理学的濃度付近のタンパク質（１ｎＭ）を、第ＶＩＩＩ因子阻害物質欠損血友病Ａ患者由来の（抗凝固）第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿中、３７℃で４日間までインキュベートした。残留第ＶＩＩＩ因子を、凝固一段階法を用いて毎日分析した。ＷＴ第ＶＩＩＩ因子の活性は、Ａｓｐ５１９Ｖａｌ変異体と同様に、２日後に約５０％まで減少し、一方、Ｇｌｕ６６５Ａｌａ変異体は、活性減衰の速度において適度（約１５％）の減少を示した（図６および表３）。しかし、Ａｓｐ５１９Ａｌａ、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌおよび両Ｇｌｕ１９８４変異体についての活性値は、４日で初期値の≧５０％であった。血漿インキュベーションから得られた結果は、主に高温で実施したインキュベーションと類似し、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ変異体および２つのＧｌｕ１９８４変異体は、機能の保持によって判定されるように、２つの反応条件下で安定性において有意な増加を示した。両Ａｓｐ５１９変異体は高温で改善された安定性を示し、一方、Ａｌａ変異体だけが、血漿分析において改善を示した。
【０１１６】
実施例７：Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４変異体の第ＶＩＩＩａ因子減衰速度
前記結果は、埋没荷電残基の疎水性残基との置換と一致した突然変異は、一般的に向上した安定性を示す第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生することを示す。これらの突然変異は、Ａ２ドメインとＡ１もしくはＡ３との境界面または境界面付近であるので、Ａ２サブユニットの解離速度を減少させることによって、第ＶＩＩＩａ因子の不安定性に正の影響を及ぼすことができると予想された。このメカニズムに起因する第ＶＩＩＩａ因子活性の損失率を、２つの条件下で評価した。第一の条件において、ＷＴおよび第ＶＩＩＩ因子変異体をトロンビンで活性化し、第ＩＸａ因子および第Ｘ因子を添加し、第Ｘａ因子生成速度をモニターした後に、指定の時間で残りの補因子活性を測定した。第二の方法では、前記分析を、第ＶＩＩＩ因子活性化前に第ＩＸａ因子の添加を加えて、Ｘａｓｅ因子を直ちに形成できるように変更した。第ＶＩＩＩａ因子をＸａｓｅ因子複合体中に組み入れると、Ａ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２サブユニットをＸａｓｅと結合させる第ＩＸａ因子に適合したメカニズムによって、その減衰速度を１０倍も減少させることにより、補因子活性が部分的に安定化されることが示されている（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Fayら, “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)）。
【０１１７】
添加された第ＩＸａ因子の非存在下または存在下で得られた結果を図７Ａおよび７Ｂにそれぞれ示す。第ＩＸａ因子の非存在下で、ＷＴ第ＶＩＩＩａ因子はその活性の５０％を約８分で失い（図７Ａ）、一方、この活性レベルは、第ＩＸａ因子が第ＶＩＩＩ因子活性化中に含められている場合、約４０分間持続した（図７Ｂ）。減衰速度値は、表３に示し、Ｘａｓｅ因子の形成によって補因子活性の５倍を超える安定化を示した。変異体の評価によって、Ｇｌｕ２７２ＡｌａおよびＶａｌ形態はどちらも、ＷＴ対照と比べて、第ＩＸａ因子の非存在下で、それぞれ２倍および３倍の減衰速度増加を有していることが明らかになった。これらの結果は、いずれかの突然変異とのサブユニット間親和性が弱くなったこと、おそらくは酸性側鎖が関与する、比較的弱い親和性結合相互作用の損失の結果を意味する。第ＩＸａ因子の存在下で、２つの変異体の減衰速度は、ＷＴの減衰速度と本質的に区別できず、このことは、第ＩＸａ因子が含まれることによって、この残基での突然変異によって生成した有害な相互作用が排除されたことを示す。
【０１１８】
他の３つの部位（Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４）での突然変異はすべて、第ＶＩＩＩａ因子減衰速度を減少させ、減少の程度は、変化した特定の残基および、一例においては置換残基に応じて変化する。Ａｓｐ５１９での突然変異によって、減衰速度が約３０％減少し、これは、第ＩＸａ因子が存在しない場合のＡｌａおよびＶａｌ変異体の両方と類似していた。これらの変異体の活性減衰速度は、第ＩＸａ因子の存在下で２倍を超えて減少し、このことは、突然変異と、酵素を結合する安定化効果との相乗効果を示唆する。Ｇｌｕ６６５Ａｌａ変異体は、２つのＡｓｐ５１９変異体と類似した値を示したが、Ｇｌｕ６６５Ｖａｌ変異体は、第ＩＸａ因子の非存在下および存在下で、それぞれ減衰速度の５倍および３倍の減少を示し、このことは、さらに大きな疎水性残基の置換によって、隣接する残基とのＡ２サブユニット保持のために、より有利な相互作用が得られたことを示唆する。最後に、両Ｇｌｕ１９８４変異体は、第ＩＸａ因子の非存在下で、ＷＴと比較して、第ＶＩＩＩａ因子減衰において約４倍の減少を示し、第ＩＸａ因子が存在する場合には５〜８倍の減少を示した。向上した安定性の有意性が図７Ｂで見られ、この図は、いずれかのＧｌｕ１９８４変異体から構成されるＸａｓｅ因子において４０分後に９０％超の第ＶＩＩＩａ因子活性が残存することを示す。Ｇｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌのいずれかとの反応の類似性は、両残基が十分耐性であることを示唆し、おそらくは、Ｖａｌの存在下で若干強いサブユニット間親和性が達成される。全体的に、これらの結果は、荷電残基の疎水性残基での選択的置換後の改善されたＡ２サブユニット保持に起因する。第ＶＩＩＩａ因子安定性の有意な向上を示す。
【０１１９】
実施例１〜７の考察
前記実施例は、選択された荷電残基の、疎水性置換基との、Ａ２ドメインを結合させることが予想される部位での置換の結果、可変的であるが、第ＶＩＩＩ因子の安定性において、可変的であるが、一般的な増加が得られたことを示す。この安定性を、高温での活性保持ならびに補因子におけるＡ２サブユニット解離速度の減少にしたがって評価した。
【０１２０】
実施例１〜３の初期分析において、第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメイン境界面に局在化する３０残基を、潜在的に水素結合パートナーを形成し得る２．８Å未満の空間的隔離に基づいた突然変異分析に関して選択した。３０の荷電／極性残基はＡｌａ（またはＴｙｒ残基についてはＰｈｅ）に変異され、組換えタンパク質が安定に発現され、活性の損失率を測定した。調べた３０残基のうちの１４は、５５℃で第ＶＩＩＩ因子減衰速度および／またはＷＴに対して第ＶＩＩＩａ因子減衰の速度において２倍超の増加を示し、このことは、Ａ１Ａ２およびＡ２Ａ３ドメイン境界面での複数の残基が第ＶＩＩＩ因子の安定化に寄与することを示唆している。興味深いことに、調べた２つの酸性残基、Ａｓｐ３０２およびＧｌｕ２８７では、プロ補因子および活性補因子形態の両方で、Ａｌａに変異された場合、安定性が適度に向上した（２倍未満）。これらの酸性残基はどちらも、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ウサギ、ラット、およびコウモリ第ＶＩＩＩ因子において保存されている。これらの初期結果は、これらの酸性側鎖が水素結合相互作用の安定化に寄与せず、むしろ、機能的安定性によって評価されるように、第ＶＩＩＩ因子構造に対して若干有害であったことを示唆していた。
【０１２１】
これらの初期研究に基づいて、さらなる疎水性相互作用の形成を、機能獲得について評価した。実施例４〜７で調べた４つの酸性残基は、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ウサギ、およびコウモリ第ＶＩＩＩ因子で保存され、一方、ラット因子においては、Ｇｌｕ６６５はＡｌａであり、Ｇｌｕ１９８４はＴｈｒである（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Swiss Institute of Bioinformatics, online analysis UniProtKB/Swiss-Prot Release 55.5 and UniProtKB/TrEMBL Release 38.5 (2008)を参照）。実施例４〜７の結果は、これらの残基のうちの３つ、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４は、Ａｌａおよび／またはＶａｌと置換される場合、タンパク質安定性が向上したことを示す。実施例４〜７で評価した１つの酸性残基のみが、変異された場合に、活性に有害である結果をもたらした。Ｇｌｕ２７２でのＡｌａへの突然変異は、トロンビン生成パラメータ値が減少した低比活性第ＶＩＩＩ因子形態をもたらし；ＡｌａおよびＶａｌ置換の両方は、中程度に減少した熱安定性および、ＷＴと比較して補因子において２〜３倍高いＡ２サブユニット解離速度を有していた。これらの観察結果から、Ｇｌｕ２７２は実際に隣接残基との結合相互作用に関与し、この部位でのその後の突然変異がこれらの相互作用を分断すると考えられる。この結論は、血友病Ａデータベース（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Kemball-Cookら, “The Factor VIII Structure and Mutation Resource Site: HAMSTeRS version 4,” Nucleic Acids Res. 26:216-219 (1998); Kemball-Cook (MRC Clinical Sciences Centre), Haemophilia A Mutation Database (accessed July 2, 2008)）の調査と一致し、これは、第ＶＩＩＩ因子が減少した中／軽度表現型として位置２７２でのＬｙｓ（電荷反転）またはＧｌｙ（小さな側鎖）を記載している。後者の観察は、増加した血漿不安定性をもたらす突然変異と一致する。しかし、この部位でのＡｌａまたはＶａｌへの突然変異後の細胞培養物中の発現レベルに対してこれらの突然変異の有意な影響はなかった。反対に、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４での突然変異はデータベースに記載されていない。
【０１２２】
タンパク質は折り重なって、荷電もしくは極性部分が溶媒にさらされた状態にあり、一方、疎水性基は埋没された状態にある傾向がある（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Paceら, “Forces Contributing to the Conformational Stability of Proteins,” FASEB J. 10:75-83 (1996)）。したがって、これらの残基が疎水性残基と置換される場合、Ｇｌｕ２８７、Ａｓｐ３０２、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４で観察される機能獲得型突然変異に基づいて、これらの荷電残基は、Ａ２ドメイン境界面で埋没していると考えられる。さらに、これらの結果は、これらの酸性残基が静電結合相互作用に寄与せず、ＷＴタンパク質構造および／またはサブユニット相互作用を不安定化する可能性が高いことを示唆している。
【０１２３】
ＡｌａまたはＶａｌのいずれかを用いた突然変異誘発の結果、疎水性残基が得られる（荷電酸性残基を置換する）ので、ＡｌａまたはＶａｌ置換は、境界面での他の疎水性接触を安定化させる傾向がある。さらに、Ｖａｌ側鎖はＡｌａよりも大きく、したがって所与の部位での置換後の活性に対する影響を比較すると、この部位での残基充填および体積に対する洞察が得られる。例えば、Ｇｌｕ１９８４のいずれかの残基との置換によって、類似した結果が得られ、このことは、両者がこの部位で十分耐性があることを示唆し；一方、Ｇｌｕ６６５ＶａｌはＧｌｕ６６５Ａｌａと比較して３倍減少した第ＶＩＩＩａ因子減衰速度を示し、このことは、Ｖａｌの側鎖の体積が大きいほど、推定疎水性結合ポケットにおいてより良好に許容されることを示唆する。
【０１２４】
全体的に、実施例１〜７の結果は、以前はセルロプラスミンの高分解能構造との相同性に由来するモデルに限定され（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pembertonら, “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)）、近年は、ヒトの第ＶＩＩＩ因子の中間分解能構造（３．７５Å）に限定される（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Shenら, “The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII,” Blood 111:1240-1247 (2008)）、第ＶＩＩＩ因子Ａドメイン構造の理解に著しく寄与する。後者の構造によって水素結合相互作用（２．８Å未満）の帰属が可能にはならないが、この論文の著者は、第ＶＩＩＩ因子のＡドメインを、セルロプラスミンのドメイン上に高度の正確性で重ね合わせることができることを示している。
【０１２５】
セルロプラスミンモデルは、Ａｓｐ３０２およびＧｌｕ２８７が水素結合相互作用に寄与できることを示唆するが、実施例１〜３の安定性研究は、これが起こる可能性が低いことを示している。その代わりに、これらの酸性側鎖は、疎水性環境中に埋没されていると考えられている。反対に、実施例４〜７から得られる結果は、Ｇｌｕ２７２が、Ａ２ドメイン境界面での水素結合相互作用に寄与する可能性が高いという考えを裏付ける。その理由は、この電荷の損失が、第ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩａ）因子安定性を減少させるからである。実施例４〜７で評価した残りの３つの酸性残基は、相補性ドメイン上の隣接する残基由来の極性原子が、これらの残基のカルボキシル基付近に局在化していないように見える点で、モデルによって予想されるように、境界面で埋没していると思われる。むしろ、これらの基は、疎水性基に近いようであることが知られている。例えば、このモデルは、Ａｓｐ５１９のカルボキシル酸素とＴｈｒ２７５のメチル炭素は約４．２Å離れ、Ｇｌｕ６６５のカルボキシル酸素とＶａｌ１９８２のメチル炭素は約８．１Å離れ、Ｇｌｕ１９８４のカルボキシル酸素とＶａｌ６６３のメチル炭素は約６．２Å離れていると予想する。
【０１２６】
安定性の向上と補因子活性減衰速度の減少を示す第ＶＩＩＩ因子変異体は、治療製剤の正の特質を示す。前者の特性は、その精製および形成中に活性タンパク質産生の増大を可能にし、その結果、全体的に高い比活性値が得られる。これらの試薬はまた、様々な細胞クリアランスメカニズムを除いて、ＷＴに対してより長い循環半減期を有する可能性もある（図６を参照）。２つのグループが第ＶＩＩＩ因子変異体に関してすでに報告しており、この報告では、補因子活性は、Ａ２サブユニット解離速度を減少／消去することによって安定化された。どちらの場合においても、突然変異を用いて、Ａ２ドメインを分子の他の領域と共有結合させた。一例において、Ａ３Ｃ１Ｃ２ドメインと接触し、プロ補因子活性化後のＡ２ドメインまたはＢドメインフラグメントのいずれかを放出するトロンビン切断部位が欠失したＢドメインの断片を、Ａ２ドメインと結合させることによって、不活化耐性第ＶＩＩＩ因子を調製した（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Pipeら, “Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor VIIIa,” Proc Natl Acad Sci U S A 94:11851-11856 (1997),）。第二の場合において、近接近しているＡ３およびＡ２ドメイン中の選択された残基をＣｙｓ残基と置換して、２つのドメイン間でジスルフィド架橋を形成し、したがって、トロンビン活性化後にＡ２がＡ３と共有結合性のままであるようにした（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Galeら, “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J Thromb Haemost. 1:1966-1971 (2003); Radtkeら, “Disulfide Bond-stabilized Factor VIII has Prolonged Factor VIIIa Activity and Improved Potency in Whole Blood Clotting Assays,” J Thromb Haemost. 5:102-108 (2007)）。後者の突然変異体も、トロンビン生成法において活性化の増大を示すが、これらの研究で用いられた反応条件は、生理学的条件以下（０．５ｎＭ未満）の濃度の第ＶＩＩＩ因子を使用した。
【０１２７】
生理学的第ＶＩＩＩ因子レベル（１ｎＭ）を用いた実施例１〜７の結果は、ＷＴとさらに高い安定性を示す変異体との間でほとんど差を示さなかったが、Ｇｌｕ２７２Ａｌａでは、その低い比活性と一致して減少したトロンビン生成パラメータが得られた。高安定性変異体に関して有意な差が観察されなかったことは、反応条件における差および／またはこれらの突然変異がＡ２ドメインを共有結合しないこと、ならびに第ＶＩＩＩａ因子減衰速度が十分に減少しないことを反映する。
【０１２８】
実施例１〜７に示した結果は、酸性残基を疎水性残基に変換する１つの点突然変異後に達成できる補因子不活性の速度が数倍減少することを示す。これらの場合のそれぞれで、これらの突然変異は境界面で起こり、この場合、変更された残基が、埋没して、表面に露出しない可能性が高く、タンパク質内の相互作用を変更しない。事前の結果に基づいて、Ｇｌｕ１９８４ＶａｌおよびＧｌｕ１９８４Ａｌａ変異体の補因子形態ならびにＷＴ補因子は、Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ５６２での活性化タンパク質Ｃ触媒切断によって測定されるような類似した不活性化速度を示す（内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Varfajら, “Residues Surrounding Arg336 and Arg562 Contribute to the Disparate Rates of Proteolysis of Factor VIIIa Catalyzed by Activated Protein C,” J. Biol. Chem. 282(28):20264-72 (2007)）。このことは、これらの高い安定性変異体の下方調節は、ＷＴ補因子とほぼ同じ方法で、タンパク質Ｃ経路によって進行するはずであるという考えを裏付ける。したがって、本発明の安定化した変異体は、前記の不活性化耐性突然変異体に関連する問題はないはずである。
【０１２９】
実施例８：二置換および三置換第ＶＩＩＩ因子変異体の安定性分析
付加的効果もしくは相乗的効果のいずれが第ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩａ）因子安定性のさらなる向上をもたらすかを決定するために、前記実施例で記載した点突然変異の組み合わせを、材料および方法で記載したのと同じ手順を用いて調製した。特に、残基Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４のＡｌａまたはＶａｌ置換を有する二重または三重複合突然変異体を調製した。これらの複合突然変異体（アミノ酸は一文字コードを用いて識別される）としては：Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ｖ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖが挙げられる。Ｄ５１９ＶＥ６６５Ａ第ＶＩＩＩ因子はこの分析から除外した。その理由は、この突然変異体がＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット結果において非定型の特性を示したからである。
【０１３０】
三重変異体を生成させるために、Ｄ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖを、Ｅ６６５ＶＥ１９８４ＡまたはＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖのいずれかと組み合わせた。他の組み合わせは除外した。その理由は、Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖ二重変異体は、各単一突然変異体と比較して、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性を向上させなかったからである。Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを用いた結果は、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ａについて観察される同じ理由から除外した。
【０１３１】
Ａｓｐ５１９での突然変異（ＡｌａもしくはＶａｌ）をＧｌｕ６６５またはＧｌｕ１９８４いずれかでの突然変異と結合させた新規突然変異体の第一群（グループＡ）は、比活性については正常値のままであった（８０％超野生型（ＷＴ）値、図８）。興味深いことに、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、およびＤ５１９ＶＥ１９８４Ｖは、凝固一段階法によって測定されるＷＴ第ＶＩＩＩ因子と比較して約１．８倍までの有意に増加した比活性値を示した（図８）。Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４での突然変異の組み合わせである突然変異体の第二群（グループＢ）の比活性は、意外にも、若干ＷＴ値よりも高かったＥ６６５ＶＥ１９８４Ａを除いては、ＷＴ第ＶＩＩＩ因と比較して約２倍までの比活性の減少を示した（図８）。第３群（グループＣ）は三重突然変異であり、一段階分析によって通常から中程度に増加した活性を示した（Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖ）。しかし、二段階分析によって測定されるＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖの活性は、有意に減少した。Ａｓｐ５１９はＡ１およびＡ２境界面に位置し、一方、Ｇｌｕ６６５およびＧｌｕ１９８４はＡ２およびＡ３境界面に位置するので、グループＢと比較して上昇したグループＡ突然変異の比活性の傾向は、立体構造に影響を及ぼし、活性な補因子形態を保持するＡ１−Ａ２連結でのさらに有利な相互作用に起因すると考えられる。
【０１３２】
図９は、５５℃で実施された第ＶＩＩＩ因子熱安定性実験から得られた結果をまとめたものである、複合突然変異について得られた速度を、実施例５から得られた単一突然変異についてのデータを用いて、特定の組み合わせにおける最良の単一突然変異体の速度値と比較した（図５Ａ）。図９はまた、第ＶＩＩＩ因子減衰速度についての実際の値も示す（表４も参照）。相対的減衰速の減少の程度は、突然変異の組み合わせについて観察される向上に関連するようである。グループＡにおいて、突然変異体Ｄ５１９ＡＥ６６５Ａ、Ｄ５１９ＡＤ６６５Ｖ、およびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖは、安定性において有意な向上（減衰速度の減少）を示し、突然変異体のほとんどはまた、ＷＴ値の約５０％である絶対的減衰速度を維持した。他方、グループＢ突然変異体の２つについての相対的速度は、より良好な単一突然変異と比較して、若干増加した（Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖ）。グループＣにおいて、突然変異体Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４ＡおよびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａは、速度において有意な変化を示さず、一方、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖについての速度値は若干増加した。
【０１３３】
興味深いことに、突然変異の組み合わせについて観察される安定性の向上は、第ＶＩＩＩａ因子形態についてより容易に観察された（図１０）。安定性が高い突然変異体についての第ＶＩＩＩａ因子減衰分析の感度を増大させるために、前記実施例におけるよりもインキュベーションにはより低濃度の第ＶＩＩＩａ因子（１．５ｎＭ）を使用した。単一突然変異体と比べて約４倍までの大きな安定性向上が、すべてのグループＡ突然変異体について観察された。Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶおよびＤ５１９ＶＥ１９８４Ａの第ＶＩＩＩａ因子減衰速度についての実際の値は、それぞれＷＴ第ＶＩＩＩ因子の１４％および１２％であった（図１０および表４）。グループＢ突然変異体は一般に、Ｅ６６５ＡＥ１９８４ＡおよびＥ６６５ＡＥ１９８４Ｖとの対合でのより良好な個々の突然変異と比べた場合に、不十分な結果をもたらし、相対的減衰速度値において、それぞれ約２．２倍および約２．７倍の増加を示した。三重突然変異（グループＣ）は、最大の第ＶＩＩＩａ因子安定性向上を示し、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａについて最大の安定性が観察され、これは、ＷＴの約１０％の減衰速度を示した（図１０および表４）。
【０１３４】
（表４）複合突然変異体の第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の減衰速度ならびに活性値
減衰値の標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ括弧内の値は野生型に対する値である。
ｂ単位／μｇ．
ｃ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）。
ｄ前記表３から再現されたデータ。
【０１３５】
選択された突然変異体に関してトロンビン生成法を実施し、結果を図１１Ａ〜Ｂに示す。最終濃度１ｎＭの第ＶＩＩＩ因子を用いて単一突然変異体を試験した場合、トロンビン生成特性に著しい改善はなかった（前述の材料および方法、ならびに実施例４を参照）。より安定な第ＶＩＩＩ因子突然変異体をより良好に比較するために、低い第ＶＩＩＩ因子濃度（０．２ｎＭ）を使用した。この分析から得られた結果は、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子と比較して、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖが遅延時間およびピーク時間において約２０％の減少を有し、またピーク高さが約２．３倍増加し、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）が約１．５倍増加することを示した（図１１Ａ〜Ｂ）。Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、およびＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａの遅延時間およびピーク時間値は、ＷＴに対して有意に変化しなかったが、ピーク高さおよびＥＴＰ値は、ＷＴよりも有意に大きかった（約２０％〜７０％）。全体的に、これらの結果から、選択された４つの複合突然変異体（すべて向上した第ＶＩＩＩａ因子安定性を有する）は、改善されたトロンビン生成特性を示したことがわかる。この観察から、これらの突然変異体は、生理学的状況で、単位濃度の第ＶＩＩＩ因子あたり増大したトロンビン生成の能力が高いことがわかる。
【０１３６】
実施例９：高比活性Ｇｌｕ１１３Ａｌａ（Ｅ１１３Ａ）突然変異と組み合わせた、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体
Ｅ１１３Ａ突然変異は、凝固一段階法によって判断されるように、第ＶＩＩＩ因子比活性を増大させることが知られている（それぞれの内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｆａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号；Wakabayashiら, “A Glu113Ala Mutation within a Factor VIII Ca(2+)-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase,” Biochemistry 44:10298-10304 (2005)）。高安定性と高比活性との両方を有する第ＶＩＩＩ因子の生成は、血友病の治療において有効な治療への応用のための唯一種の試薬であり、Ｅ１１３Ａと、先の実施例に記載した高安定性突然変異体との複合突然変異の効果を分析した。
【０１３７】
Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、およびＧｌｕ１９８４でのＡｌａまたはＶａｌ突然変異体を、Ｅ１１３Ａ突然変異と組み合わせて、材料および方法に記載した同じ手順を用いて調製した。これらの二重変異体（アミノ酸は、一文字コードを用いて識別する）としては：Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、およびＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖが挙げられる。
【０１３８】
複合突然変異体の一段階分析を用いて決定された比活性値は、二段階分析による活性の正常レベルを維持しつつ、ＷＴ第ＶＩＩＩ因子よりも約２〜約３．３倍高かった。これらの結果から、Ａｓｐ５１９、Ｇｌｕ６６５、またはＧｌｕ１９８４での突然変異が、Ｅ１１３Ａ突然変異について観察される活性向上に悪影響を及ぼさなかったことがわかった（図１２Ａ）。加えて、高安定性突然変異体と組み合わせたＥ１１３Ａの第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度は、本来の単一高安定性突然変異体のそれぞれの値と有意に異ならず（図５Ｂ〜Ｃ；表５を参照）、このことは、Ｅ１１３Ａ突然変異が、これらの突然変異体についての向上した安定性パラメータに影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【０１３９】
（表５）第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子減衰速度ならびに活性値
減衰値の標準偏差は、最小二乗曲線適合に基づいて推定され、平均値の約１０％以内である。
ａ括弧内の値は、野生型に対する値である。
ｂ単位／μｇ。
ｃ生成した第Ｘａ因子（ｎＭ）／分／第ＶＩＩＩ因子（ｎＭ）。
ｄ前記表３から再現されたデータ。
【０１４０】
前記結果から、増大した比活性と、向上した第ＶＩＩＩ因子／第ＶＩＩＩａ因子安定性との両方によって特徴づけられる組換え型第ＶＩＩＩ因子を生成させる目的で、Ｅ１１３Ａの突然変異を、これまで記載した安定性が増大した突然変異のいずれかと組み合わせることができる。これは、Ｅ１１３Ａ（または、内容の全てが、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｆａｙらに対する米国特許出願公開第１０／５８１，４７１号に記載されるような他の適したＥ１１３置換）と、本明細書に記載する種類の単一または複数の安定性が向上した突然変異体との組み合わせを包含する。
【０１４１】
好ましい実施形態を本明細書において表示し、詳細に記載したが、本発明の趣旨から逸脱しないで、様々な修正、付加、置換などが可能であり、これらはしたがって、以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に含まれると見なされることが、当業者には明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす１つ以上の突然変異を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子であって、
１つ以上の突然変異が、Ａ１Ａ２もしくはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれかまたは両方で、１つ以上の荷電アミノ酸残基の疎水性アミノ酸残基との置換を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項２】
前記荷電アミノ酸残基が、ＧｌｕまたはＡｓｐのいずれかであり、
前記疎水性アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐのうちの１つである、
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項３】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項４】
前記Ａｓｐ３０２残基の置換がＤ３０２Ａである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項５】
前記Ｇｌｕ２８７残基の置換がＥ２８７Ａである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項６】
前記Ｇｌｕ６６５残基の置換がＥ６６５ＡまたはＥ６６５Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項７】
前記Ａｓｐ５１９残基の置換がＤ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項８】
前記Ｇｌｕ１９８４残基の置換がＥ１９８４ＡまたはＥ１９８４Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項９】
前記１つ以上の突然変異が、Ｇｌｕ６６５残基、Ａｓｐ５１９残基、およびＧｌｕ１９８４残基から選択される２つ以上の置換を含む、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１０】
前記２つ以上の置換が、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、またはＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを含む、請求項９に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１１】
ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２、またはこれらの部分からなる、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１２】
ドメインＡ１およびＡ２が重鎖上に存在し、
ドメインＡ３、Ｃ１、およびＣ２が軽鎖上に存在する、
請求項１１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１３】
ヒト第ＶＩＩＩ因子由来の１つ以上のドメイン、またはその部分、および非ヒト哺乳動物第ＶＩＩＩ因子由来の１つ以上のドメイン、またはその部分を含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１４】
実質的に純粋である、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１５】
（ｉ）第ＩＸａ因子および第Ｘ因子の一方もしくは両方に対する組換え型第ＶＩＩＩ因子の親和性を向上させるように修飾された第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子結合ドメイン；
（ｉｉ）培養物中の分泌を向上させる修飾された部位；
（ｉｉｉ）その循環半減期を向上させる、修飾された血清タンパク質結合部位；
（ｉｖ）その抗原性および／または免疫原性を減少させるのに有効な少なくとも１つのグリコシル化認識配列；および
（ｖ）組換え型第ＶＩＩＩａ因子の比活性を改善する、修飾されたカルシウム結合部位
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１６】
Ｇｌｕ１１３残基の置換が、活性化された第ＶＩＩＩａ因子の活性を向上させる、野生型第ＶＩＩＩ因子の前記Ｇｌｕ１１３残基の置換
をさらに含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１７】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１８】
前記置換が、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、またはＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖを含む、請求項１７に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１９】
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
安定剤をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
送達ビヒクルをさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２４】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記Ａｓｐ３０２残基の置換がＤ３０２Ａである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
前記Ｇｌｕ２８７残基の置換がＥ２８７Ａである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
前記Ｇｌｕ６６５残基の置換が、Ｅ６６５ＡまたはＥ６６５Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
前記Ａｓｐ５１９残基の置換が、Ｄ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
前記Ｇｌｕ１９８４残基の置換が、Ｅ１９８４ＡまたはＥ１９８４Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
前記１つ以上の突然変異が、Ｇｌｕ６６５残基、Ａｓｐ５１９残基、およびＧｌｕ１９８４残基から選択される２つ以上の置換を含む、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
前記２つ以上の置換が、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、またはＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを含む、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
前記組換え型第ＶＩＩＩ因子が、
（ｉ）第ＩＸａ因子および第Ｘ因子の一方もしくは両方についての組換え型第ＶＩＩＩ因子の親和性を向上させるように修飾された第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子結合ドメイン；
（ｉｉ）培養物中の分泌を向上させる修飾された部位；
（ｉｉｉ）その循環半減期を向上させる、修飾された血清タンパク質結合部位；
（ｉｖ）その抗原性および／または免疫原性を減少させるのに有効な少なくとも１つのグリコシル化認識配列；ならびに
（ｖ）組換え型第ＶＩＩＩａ因子の活性を改善する、修飾されたカルシウム結合部位
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡ発現システム。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ分子が、プロモーターに対してセンス配向である、請求項３５に記載の組換えＤＮＡ発現システム。
【請求項３７】
請求項２３に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３４に記載のＤＮＡ分子を含む、宿主細胞。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ分子が発現システム中にある、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞が、動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または藻類細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法であって：
請求項３８に記載の宿主細胞を、宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で増殖させる段階；および
組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する段階
を含む方法。
【請求項４２】
前記増殖させる段階が、増殖培地中、インビトロで行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記増殖培地がフォンヴィレブランド因子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、フォンヴィレブランド因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組換え型第ＶＩＩＩ因子が増殖培地中に分泌され、
前記単離する段階が、組換え型第ＶＩＩＩ因子を増殖培地から単離する段階を含む、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を細胞片から単離する段階を含む前記単離する段階の前に、宿主細胞を破砕する段階
をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
血友病Ａについて動物を治療する方法であって：
血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階
を含む、方法。
【請求項４８】
前記有効量が、動物の体重１ｋｇあたり約１０単位から約５０単位までの間を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物が哺乳動物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、およびニワトリからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与する段階を周期的に繰り返す段階をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩａ因子との両方の安定性の向上をもたらす１つ以上の突然変異を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子であって、
１つ以上の突然変異が、Ａ１Ａ２もしくはＡ２Ａ３ドメイン境界面のいずれかまたは両方で、１つ以上の荷電アミノ酸残基の疎水性アミノ酸残基との置換を含む、組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項２】
前記荷電アミノ酸残基が、ＧｌｕまたはＡｓｐのいずれかであり、
前記疎水性アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐのうちの１つである、
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項３】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項４】
前記Ａｓｐ３０２残基の置換がＤ３０２Ａである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項５】
前記Ｇｌｕ２８７残基の置換がＥ２８７Ａである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項６】
前記Ｇｌｕ６６５残基の置換がＥ６６５ＡまたはＥ６６５Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項７】
前記Ａｓｐ５１９残基の置換がＤ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項８】
前記Ｇｌｕ１９８４残基の置換がＥ１９８４ＡまたはＥ１９８４Ｖである、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項９】
前記１つ以上の突然変異が、Ｇｌｕ６６５残基、Ａｓｐ５１９残基、およびＧｌｕ１９８４残基から選択される２つ以上の置換を含む、請求項３に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１０】
前記２つ以上の置換が、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、またはＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを含む、請求項９に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１１】
ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２、またはこれらの部分からなる、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１２】
ドメインＡ１およびＡ２が重鎖上に存在し、
ドメインＡ３、Ｃ１、およびＣ２が軽鎖上に存在する、
請求項１１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１３】
ヒト第ＶＩＩＩ因子由来の１つ以上のドメイン、またはその部分、および非ヒト哺乳動物第ＶＩＩＩ因子由来の１つ以上のドメイン、またはその部分を含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１４】
実質的に純粋である、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１５】
（ｉ）第ＩＸａ因子および第Ｘ因子の一方もしくは両方に対する組換え型第ＶＩＩＩ因子の親和性を向上させるように修飾された第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子結合ドメイン；
（ｉｉ）培養物中の分泌を向上させる修飾された部位；
（ｉｉｉ）その循環半減期を向上させる、修飾された血清タンパク質結合部位；
（ｉｖ）その抗原性および／または免疫原性を減少させるのに有効な少なくとも１つのグリコシル化認識配列；および
（ｖ）組換え型第ＶＩＩＩａ因子の比活性を改善する、修飾されたカルシウム結合部位
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１６】
Ｇｌｕ１１３残基の置換が、活性化された第ＶＩＩＩａ因子の活性を向上させる、野生型第ＶＩＩＩ因子の前記Ｇｌｕ１１３残基の置換
をさらに含む、請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１７】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１８】
前記置換が、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ａ、Ｅ１１３ＡＤ５１９Ｖ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ａ、Ｅ１１３ＡＥ６６５Ｖ、またはＥ１１３ＡＥ１９８４Ｖを含む、請求項１７に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子。
【請求項１９】
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
安定剤をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
送達ビヒクルをさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２４】
前記１つ以上の突然変異が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ２８７残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ３０２残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＡｓｐ５１９残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ６６５残基の置換、野生型第ＶＩＩＩ因子のＧｌｕ１９８４残基の置換、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記Ａｓｐ３０２残基の置換がＤ３０２Ａである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
前記Ｇｌｕ２８７残基の置換がＥ２８７Ａである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
前記Ｇｌｕ６６５残基の置換が、Ｅ６６５ＡまたはＥ６６５Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
前記Ａｓｐ５１９残基の置換が、Ｄ５１９ＡまたはＤ５１９Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
前記Ｇｌｕ１９８４残基の置換が、Ｅ１９８４ＡまたはＥ１９８４Ｖである、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
前記１つ以上の突然変異が、Ｇｌｕ６６５残基、Ａｓｐ５１９残基、およびＧｌｕ１９８４残基から選択される２つ以上の置換を含む、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
前記２つ以上の置換が、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５Ｖ、Ｄ５１９ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｅ６６５ＡＥ１９８４Ｖ、Ｄ５１９ＡＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ａ、またはＤ５１９ＶＥ６６５ＶＥ１９８４Ｖを含む、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
前記組換え型第ＶＩＩＩ因子が、
（ｉ）第ＩＸａ因子および第Ｘ因子の一方もしくは両方についての組換え型第ＶＩＩＩ因子の親和性を向上させるように修飾された第ＩＸａ因子および／または第Ｘ因子結合ドメイン；
（ｉｉ）培養物中の分泌を向上させる修飾された部位；
（ｉｉｉ）その循環半減期を向上させる、修飾された血清タンパク質結合部位；
（ｉｖ）その抗原性および／または免疫原性を減少させるのに有効な少なくとも１つのグリコシル化認識配列；ならびに
（ｖ）組換え型第ＶＩＩＩａ因子の活性を改善する、修飾されたカルシウム結合部位
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡ発現システム。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ分子が、プロモーターに対してセンス配向である、請求項３５に記載の組換えＤＮＡ発現システム。
【請求項３７】
請求項２３に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３４に記載のＤＮＡ分子を含む、宿主細胞。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ分子が発現システム中にある、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞が、動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または藻類細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を作製する方法であって：
請求項３８に記載の宿主細胞を、宿主細胞が組換え型第ＶＩＩＩ因子を発現する条件下で増殖させる段階；および
組換え型第ＶＩＩＩ因子を単離する段階
を含む方法。
【請求項４２】
前記増殖させる段階が、増殖培地中、インビトロで行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記増殖培地がフォンヴィレブランド因子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、フォンヴィレブランド因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組換え型第ＶＩＩＩ因子が増殖培地中に分泌され、
前記単離する段階が、組換え型第ＶＩＩＩ因子を増殖培地から単離する段階を含む、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
組換え型第ＶＩＩＩ因子を細胞片から単離する段階を含む前記単離する段階の前に、宿主細胞を破砕する段階
をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
血友病Ａについて動物を治療する方法であって：
血友病Ａを示す動物が血管損傷後に有効な血液凝固を示す、有効量の請求項１に記載の組換え型第ＶＩＩＩ因子をこの動物に投与する段階
を含む、方法。
【請求項４８】
前記有効量が、動物の体重１ｋｇあたり約１０単位から約５０単位までの間を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物が哺乳動物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、オランウータン、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、およびニワトリからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与する段階を周期的に繰り返す段階をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０２４７８（Ｐ２０１１−５０２４７８Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２０９２（Ｐ２０１０−５３２０９２）
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８４４６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０７２４５０２１）ユニバーシティー オブ ロチェスター (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８４４６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０７２４５０２１）ユニバーシティー オブ ロチェスター (9)
【Ｆターム（参考）】
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