定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法
【課題】蛍光プローブ法およびインターカレーター法に対応した定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法において、検出感度を飛躍的に向上させる。
【解決手段】金属粒子２０、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２およびプローブ２３が結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５を含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５の結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが分離されるように構成したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を含む定量ＰＣＲ用試薬１を用いてＰＣＲを行い、金属粒子２０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより増幅された蛍光レポーター２１の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出する。
【解決手段】金属粒子２０、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２およびプローブ２３が結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５を含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５の結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが分離されるように構成したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を含む定量ＰＣＲ用試薬１を用いてＰＣＲを行い、金属粒子２０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより増幅された蛍光レポーター２１の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来よりＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅技術が知られている。また、これにより増幅された遺伝子を定量化する方法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、インターカレーター法が知られている。これらの中で蛍光プローブ法およびインターカレーター法は、検出精度が高く、またリアルタイムに結果を出せることから、高精度の測定が必要な場合によく用いられる。
【０００３】
例えば特許文献１に記載されているように、蛍光プローブ法は、被検出遺伝子の所定領域に相補的に結合する蛍光プローブを定量ＰＣＲ用試薬として用いる。蛍光プローブには、蛍光レポーターおよびその近傍に配されたクエンチャーが設けられており、初期状態で蛍光レポーターに対して励起光を照射しても蛍光エネルギーはクエンチャーに吸収され蛍光レポーターから蛍光は生じないが、プライマーと被検出遺伝子とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進み、被検出遺伝子と結合した蛍光プローブが分解されると、蛍光レポーターとクエンチャーとの距離が離れ、蛍光レポーターから蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【０００４】
また、インターカレーター法は、遺伝子結合蛍光色素(ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標）等)を定量ＰＣＲ用試薬として用いる。遺伝子結合蛍光色素は、遺伝子と結合した際にのみ蛍光を生じるため、この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１４４１９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような蛍光プローブ法およびインターカレーター法に対応した定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法において、検出感度を飛躍的に向上させた定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬であって、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能としたことを特徴とするものである。
【０００８】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬は、蛍光プローブ法の中でもＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応した試薬として、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとしてもよい。
【０００９】
また、蛍光プローブ法の中でもモレキュラービーコン法に対応した試薬として、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がモレキュラービーコンに対して行われた段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとしてもよい。
【００１０】
これらの場合にクエンチャーは、クエンチャーと蛍光粒子との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質としてもよい。
【００１１】
また、インターカレーター法に対応した試薬として、蛍光粒子と、プライマーおよび金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されたものとしてもよい。
【００１２】
上記の定量ＰＣＲ用試薬において、金属粒子は、直径１０〜１００ｎｍの球状体としてもよいし、長さ１０〜１００ｎｍの棒状体としてもよい。
【００１３】
また、金属粒子は、Ａｇを主成分とするものであることが好ましい。
【００１４】
ここで、「Ａｇを主成分とする」とは、金属粒子中におけるＡｇの質量パーセント濃度が最も高いことを意味する。
【００１５】
また、金属粒子は、光透過材料により被覆されていることが好ましい。
【００１６】
本発明の定量ＰＣＲ方法は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法であって、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えてＰＣＲを行い、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出することを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬によれば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬において、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能なものとし、遺伝子増幅の進度を表す蛍光粒子の蛍光強度をプラズモン増強効果を利用して１０〜１００倍程度と飛躍的に増強したので、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００１８】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬において、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとすれば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応した試薬とすることができる。
【００１９】
また、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がモレキュラービーコンに対して行われた段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとすれば、モレキュラービーコン法に対応した試薬とすることができる。
【００２０】
また、蛍光粒子と、プライマーおよび金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されたものとすれば、インターカレーター法に対応した試薬とすることができる。
【００２１】
また、金属粒子を、Ａｇを主成分とするものとすれば、プラズモン増強効果を効率的に発生させられるため、より検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
また、金属粒子を、光透過材料により被覆することにより、金属消光を防止することができる。また金属粒子の主成分をＡｇ等の酸化しやすい物質とした場合には、さらに金属粒子の酸化も防止することができる
本発明の定量ＰＣＲ方法によれば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法において、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えてＰＣＲを行い、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出するようにして、遺伝子増幅の進度を表す蛍光粒子の蛍光強度をプラズモン増強効果を利用して１０〜１００倍程度と飛躍的に増強したので、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図２】上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離前の状態を示す図
【図３】上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離後の状態を示す図
【図４】本発明の第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図５】本発明の第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図６】本発明の第４の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図７】本発明の第５の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図８】本発明の第６の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して本発明の第１の実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００２５】
図１に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬１は、蛍光プローブ法の中でもＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応したものであり、金属粒子２０の表面に複数のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５が修飾されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を含むものである。
【００２６】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５は、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２および被検出遺伝子１２の所定領域に相補的に結合するプローブ２３からなり、蛍光レポーター２１と金属粒子２０とがＰＥＧリンカー２４により結合され、プローブ２３と金属粒子２０とがＰＥＧリンカー２４により結合され、クエンチャー２２とプローブ２３とは直接結合されている。このうち、特に蛍光レポーター２１と金属粒子２０とを結合させるＰＥＧリンカー２４の長さは、金属粒子２０において発生させるプラズモン増強場Ｐの影響範囲（金属粒子２０を中心に周囲数１０ｎｍ程度）内に蛍光レポーター２１を位置させることが可能な長さにする必要がある。
【００２７】
金属粒子２０は、球状体であり、その直径は１０〜１００ｎｍ程度、好ましくは４０〜５０ｎｍ程度とするのがよい。また材質については、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ等の種々の金属を用いることができるが、プラズモン増強効果を効率的に発生させられるという観点から、Ａｇを用いることが好ましい。
【００２８】
蛍光レポーター２１としては、Ｃｙ５（登録商標）等の蛍光色素や、Ｑｄｏｔ（登録商標）等の蛍光物質を用いることができる。
【００２９】
クエンチャー２２としては、Ｃｙ７Ｑ（登録商標）等を用いることができる。また、クエンチャーと蛍光レポーター２１との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質としてもよい。例えば、蛍光レポーター２１としてＣｙ５（登録商標）を用いた場合、クエンチャー２２としてＣｙ５．５（登録商標）を用いれば、両者間でＦＲＥＴを生じさせることができる。
【００３０】
次に、上記定量ＰＣＲ用試薬１の作用について説明する。図２は上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離前の状態を示す図、図３は上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離後の状態を示す図である。なお、図２、３ともに、分かりやすくするために金属粒子表面のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブは一つのみ表示し、それ以外は省略している。
【００３１】
図２に示すように、プライマー１１や被検出遺伝子１２等に定量ＰＣＲ用試薬１を加えてＰＣＲを行った場合、被検出遺伝子１２の所定領域にプローブ２３が相補的に結合する。また、被検出遺伝子１２の別の領域にはプライマー１１が相補的に結合する。そして、図３に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進むと、プローブ２３が分解され、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を全体として見れば蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが分離され、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが離間する。
【００３２】
図２に示すような初期状態で蛍光レポーター２１に対して励起光を照射しても励起エネルギーはクエンチャー２２に吸収され蛍光レポーター２１から蛍光は生じないが、図３に示すように、プライマー１１と被検出遺伝子１２とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進むと蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが離間して、蛍光レポーター２１から蛍光が生じるようになる。なお、厳密には蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが完全に別体とならなくても、両者が離間すれば蛍光レポーター２１から蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。なお、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との間でＦＲＥＴを生じさせるように構成している場合には、蛍光色の変化を測定すればよい。
【００３３】
本実施の形態では、蛍光レポーター２１の近傍に金属粒子２０が結合されており、金属粒子２０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光レポーター２１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。図４は本発明の第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００３５】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、金属粒子２０を、光透過材料２５により被覆した点が異なり、それ以外の点は上記第１の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００３６】
図４に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ａの金属粒子２０は、光透過材料２５により被覆されている。この光透過材料２５としては、ＳｉＯ２膜等を用いることができる。
【００３７】
本発明のように、プラズモン増強場を生じる金属粒子２０を蛍光レポーター２１の近傍に配した場合、金属粒子２０と蛍光レポーター２１との距離があまりに近すぎると、蛍光レポーター２１内で励起されたエネルギーが蛍光を生じさせる前に金属粒子２０に遷移してしまい、蛍光を生じなくなるという現象（金属消光）が起こり得る。従って、金属粒子２０を、１０ｎｍ程度の厚さの光透過材料２５により被覆することにより、金属粒子２０と蛍光レポーター２１とが近接しすぎないようにすることができるため、金属消光を防止することが可能となる。
【００３８】
また、金属粒子の主成分をＡｇ等の酸化しやすい物質とした場合には、金属粒子２０を光透過材料２５により被覆することにより、さらに金属粒子２０の酸化も防止することができる。
【００３９】
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。図５は本発明の第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００４０】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５の構成が異なり、それ以外の点は上記第２の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００４１】
図５に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ｂのＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２および被検出遺伝子１２の所定領域に相補的に結合するプローブ２３からなり、蛍光レポーター２１は２つの結合其を備え、一方の結合其はＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合されるとともに、他方の結合其はプローブ２３と結合される。クエンチャー２２はプローブ２３と直接結合されている。
【００４２】
上記第１および第２の実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５では、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが互いに結合されておらず、両者共に両者の対向位置の反対側において他の部材と結合している。蛍光レポーター２１はＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合しており、クエンチャー２２とプローブ２３はプローブ２３中のＤＮＡ断片を介して直接結合している。また、プローブ２３は、ＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合している。ＰＥＧリンカー２４は可撓性を有するため、上記のように構成された上記第１および第２の実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５では、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との距離（位置関係）が変化しやすく、クエンチャー２２の効能を安定的に発揮させることが難しくなることが懸念される。
【００４３】
これに対して本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、蛍光レポーター２１にプローブ２３を直接結合するとともに、このプローブ２３にクエンチャー２２が直接結合しているので、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との距離（位置関係）が変化しにくくなり、クエンチャー２２の効能を安定的に発揮させることができる。
【００４４】
次に、本発明の第４の実施の形態について説明する。図６は本発明の第４の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００４５】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、金属粒子２０の形状を棒状体にした点および金属粒子２０を光透過材料２５により被覆していない点が異なり、それ以外の点は上記第３の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００４６】
図６に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ｃの金属粒子２０´は、棒状体であり、その長さは１０〜１００ｎｍ程度とするのがよい。例えば長さ８０ｎｍ、直径１３ｎｍのＡｕナノロッドとすることができる。
【００４７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、棒状の金属粒子２０の両端部に修飾される。
【００４８】
金属粒子２０´を棒状体とした場合、プラズモン増強場Ｐは棒の両端部にしか発現しないが、球状体の場合と比較して強いプラズモン増強場が発現するため、より検出感度を向上させることができる。
【００４９】
なお、本実施の形態においても、金属粒子２０´を光透過材料２５により被覆してもよい。
【００５０】
次に、本発明の第５の実施の形態について説明する。図７は本発明の第５の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。なお、上記実施の形態と同様の点についての説明は省略する。
【００５１】
図７に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬２は、インターカレーター法に対応したものであり、金属粒子４０の表面に複数のプライマー４１がＰＥＧリンカー４２を介して修飾されたプライマーユニット３０を含むものである。
【００５２】
被検出遺伝子３２や蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１等に定量ＰＣＲ用試薬２を加えてＰＣＲを行った場合、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１は、遺伝子と結合した際にのみ蛍光を生じるため、この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【００５３】
本実施の形態では、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１を取り込むプライマー４１の近傍に金属粒子４０が結合されており、金属粒子４０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００５４】
なお、本実施の形態においても、金属粒子４０を光透過材料により被覆してもよい。
【００５５】
次に、本発明の第６の実施の形態について説明する。図８は本発明の第６の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。なお、上記実施の形態と同様の点についての説明は省略する。
【００５６】
図８に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬３は、蛍光プローブ法の中でもモレキュラービーコン法に対応したものであり、金属粒子６０の表面に複数のモレキュラービーコン６３が修飾されたモレキュラービーコンユニット５０を含むものである。
【００５７】
モレキュラービーコン６３の両端には各々蛍光レポーター６１およびクエンチャー６２が結合されており、蛍光レポーター６１と金属粒子６０とがＰＥＧリンカー６４により結合されている。
【００５８】
被検出遺伝子５２等に定量ＰＣＲ用試薬３を加えてＰＣＲを行った場合、初期状態で蛍光レポーター６１に対して励起光を照射しても蛍光エネルギーはクエンチャー６２に吸収され蛍光レポーター６１から蛍光は生じないが、モレキュラービーコン６３と被検出遺伝子５２とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進むと、蛍光レポーター６１とクエンチャー６２との距離が離れ、蛍光レポーター６１から蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【００５９】
本実施の形態では、蛍光レポーター６１の近傍に金属粒子６０が結合されており、金属粒子６０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光レポーター６１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００６０】
なお、本実施の形態においても、金属粒子６０を光透過材料により被覆してもよい。
【００６１】
以上、本発明の好ましい実施の形態について説明したが、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変形を行なってもよいのは勿論である。例えば、ＰＥＧリンカーの代わりに、ポリメタクリレート、ポリアクリレート等のポリマーリンカーを用いても良いし、シランカップリングによる結合でも良い。
【符号の説明】
【００６２】
１、２、３ 定量ＰＣＲ用試薬
１０ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット
１１ プライマー
１２ 被検出遺伝子
１５ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
２０ 金属粒子
２１ 蛍光レポーター
２２ クエンチャー
２３ プローブ
２４ ＰＥＧリンカー
２５ 光透過材料
３０ プライマーユニット
３１ 蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））
３２ 被検出遺伝子
４０ 金属粒子
４１ プライマー
４２ ＰＥＧリンカー
４３ 光透過材料
５０ モレキュラービーコンユニット
５２ 被検出遺伝子
６０ 金属粒子
６１ 蛍光レポーター
６２ クエンチャー
６３ モレキュラービーコン
６４ ＰＥＧリンカー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来よりＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅技術が知られている。また、これにより増幅された遺伝子を定量化する方法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、インターカレーター法が知られている。これらの中で蛍光プローブ法およびインターカレーター法は、検出精度が高く、またリアルタイムに結果を出せることから、高精度の測定が必要な場合によく用いられる。
【０００３】
例えば特許文献１に記載されているように、蛍光プローブ法は、被検出遺伝子の所定領域に相補的に結合する蛍光プローブを定量ＰＣＲ用試薬として用いる。蛍光プローブには、蛍光レポーターおよびその近傍に配されたクエンチャーが設けられており、初期状態で蛍光レポーターに対して励起光を照射しても蛍光エネルギーはクエンチャーに吸収され蛍光レポーターから蛍光は生じないが、プライマーと被検出遺伝子とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進み、被検出遺伝子と結合した蛍光プローブが分解されると、蛍光レポーターとクエンチャーとの距離が離れ、蛍光レポーターから蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【０００４】
また、インターカレーター法は、遺伝子結合蛍光色素(ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標）等)を定量ＰＣＲ用試薬として用いる。遺伝子結合蛍光色素は、遺伝子と結合した際にのみ蛍光を生じるため、この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１４４１９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような蛍光プローブ法およびインターカレーター法に対応した定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法において、検出感度を飛躍的に向上させた定量ＰＣＲ用試薬および定量ＰＣＲ方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬であって、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能としたことを特徴とするものである。
【０００８】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬は、蛍光プローブ法の中でもＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応した試薬として、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとしてもよい。
【０００９】
また、蛍光プローブ法の中でもモレキュラービーコン法に対応した試薬として、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がモレキュラービーコンに対して行われた段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとしてもよい。
【００１０】
これらの場合にクエンチャーは、クエンチャーと蛍光粒子との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質としてもよい。
【００１１】
また、インターカレーター法に対応した試薬として、蛍光粒子と、プライマーおよび金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されたものとしてもよい。
【００１２】
上記の定量ＰＣＲ用試薬において、金属粒子は、直径１０〜１００ｎｍの球状体としてもよいし、長さ１０〜１００ｎｍの棒状体としてもよい。
【００１３】
また、金属粒子は、Ａｇを主成分とするものであることが好ましい。
【００１４】
ここで、「Ａｇを主成分とする」とは、金属粒子中におけるＡｇの質量パーセント濃度が最も高いことを意味する。
【００１５】
また、金属粒子は、光透過材料により被覆されていることが好ましい。
【００１６】
本発明の定量ＰＣＲ方法は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法であって、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えてＰＣＲを行い、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出することを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬によれば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬において、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能なものとし、遺伝子増幅の進度を表す蛍光粒子の蛍光強度をプラズモン増強効果を利用して１０〜１００倍程度と飛躍的に増強したので、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００１８】
本発明の定量ＰＣＲ用試薬において、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとすれば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応した試薬とすることができる。
【００１９】
また、金属粒子、蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応がモレキュラービーコンに対して行われた段階で蛍光粒子とクエンチャーとが離間するように構成されたものとすれば、モレキュラービーコン法に対応した試薬とすることができる。
【００２０】
また、蛍光粒子と、プライマーおよび金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されたものとすれば、インターカレーター法に対応した試薬とすることができる。
【００２１】
また、金属粒子を、Ａｇを主成分とするものとすれば、プラズモン増強効果を効率的に発生させられるため、より検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
また、金属粒子を、光透過材料により被覆することにより、金属消光を防止することができる。また金属粒子の主成分をＡｇ等の酸化しやすい物質とした場合には、さらに金属粒子の酸化も防止することができる
本発明の定量ＰＣＲ方法によれば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法において、多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えてＰＣＲを行い、金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出するようにして、遺伝子増幅の進度を表す蛍光粒子の蛍光強度をプラズモン増強効果を利用して１０〜１００倍程度と飛躍的に増強したので、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図２】上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離前の状態を示す図
【図３】上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離後の状態を示す図
【図４】本発明の第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図５】本発明の第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図６】本発明の第４の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図７】本発明の第５の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【図８】本発明の第６の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して本発明の第１の実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００２５】
図１に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬１は、蛍光プローブ法の中でもＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法に対応したものであり、金属粒子２０の表面に複数のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５が修飾されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を含むものである。
【００２６】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５は、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２および被検出遺伝子１２の所定領域に相補的に結合するプローブ２３からなり、蛍光レポーター２１と金属粒子２０とがＰＥＧリンカー２４により結合され、プローブ２３と金属粒子２０とがＰＥＧリンカー２４により結合され、クエンチャー２２とプローブ２３とは直接結合されている。このうち、特に蛍光レポーター２１と金属粒子２０とを結合させるＰＥＧリンカー２４の長さは、金属粒子２０において発生させるプラズモン増強場Ｐの影響範囲（金属粒子２０を中心に周囲数１０ｎｍ程度）内に蛍光レポーター２１を位置させることが可能な長さにする必要がある。
【００２７】
金属粒子２０は、球状体であり、その直径は１０〜１００ｎｍ程度、好ましくは４０〜５０ｎｍ程度とするのがよい。また材質については、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ等の種々の金属を用いることができるが、プラズモン増強効果を効率的に発生させられるという観点から、Ａｇを用いることが好ましい。
【００２８】
蛍光レポーター２１としては、Ｃｙ５（登録商標）等の蛍光色素や、Ｑｄｏｔ（登録商標）等の蛍光物質を用いることができる。
【００２９】
クエンチャー２２としては、Ｃｙ７Ｑ（登録商標）等を用いることができる。また、クエンチャーと蛍光レポーター２１との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質としてもよい。例えば、蛍光レポーター２１としてＣｙ５（登録商標）を用いた場合、クエンチャー２２としてＣｙ５．５（登録商標）を用いれば、両者間でＦＲＥＴを生じさせることができる。
【００３０】
次に、上記定量ＰＣＲ用試薬１の作用について説明する。図２は上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離前の状態を示す図、図３は上記定量ＰＣＲ用試薬におけるクエンチャー分離後の状態を示す図である。なお、図２、３ともに、分かりやすくするために金属粒子表面のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブは一つのみ表示し、それ以外は省略している。
【００３１】
図２に示すように、プライマー１１や被検出遺伝子１２等に定量ＰＣＲ用試薬１を加えてＰＣＲを行った場合、被検出遺伝子１２の所定領域にプローブ２３が相補的に結合する。また、被検出遺伝子１２の別の領域にはプライマー１１が相補的に結合する。そして、図３に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進むと、プローブ２３が分解され、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０を全体として見れば蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが分離され、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが離間する。
【００３２】
図２に示すような初期状態で蛍光レポーター２１に対して励起光を照射しても励起エネルギーはクエンチャー２２に吸収され蛍光レポーター２１から蛍光は生じないが、図３に示すように、プライマー１１と被検出遺伝子１２とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進むと蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが離間して、蛍光レポーター２１から蛍光が生じるようになる。なお、厳密には蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが完全に別体とならなくても、両者が離間すれば蛍光レポーター２１から蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。なお、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との間でＦＲＥＴを生じさせるように構成している場合には、蛍光色の変化を測定すればよい。
【００３３】
本実施の形態では、蛍光レポーター２１の近傍に金属粒子２０が結合されており、金属粒子２０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光レポーター２１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。図４は本発明の第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００３５】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第１の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、金属粒子２０を、光透過材料２５により被覆した点が異なり、それ以外の点は上記第１の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００３６】
図４に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ａの金属粒子２０は、光透過材料２５により被覆されている。この光透過材料２５としては、ＳｉＯ２膜等を用いることができる。
【００３７】
本発明のように、プラズモン増強場を生じる金属粒子２０を蛍光レポーター２１の近傍に配した場合、金属粒子２０と蛍光レポーター２１との距離があまりに近すぎると、蛍光レポーター２１内で励起されたエネルギーが蛍光を生じさせる前に金属粒子２０に遷移してしまい、蛍光を生じなくなるという現象（金属消光）が起こり得る。従って、金属粒子２０を、１０ｎｍ程度の厚さの光透過材料２５により被覆することにより、金属粒子２０と蛍光レポーター２１とが近接しすぎないようにすることができるため、金属消光を防止することが可能となる。
【００３８】
また、金属粒子の主成分をＡｇ等の酸化しやすい物質とした場合には、金属粒子２０を光透過材料２５により被覆することにより、さらに金属粒子２０の酸化も防止することができる。
【００３９】
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。図５は本発明の第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００４０】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第２の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５の構成が異なり、それ以外の点は上記第２の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００４１】
図５に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ｂのＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、蛍光レポーター２１、クエンチャー２２および被検出遺伝子１２の所定領域に相補的に結合するプローブ２３からなり、蛍光レポーター２１は２つの結合其を備え、一方の結合其はＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合されるとともに、他方の結合其はプローブ２３と結合される。クエンチャー２２はプローブ２３と直接結合されている。
【００４２】
上記第１および第２の実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５では、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２とが互いに結合されておらず、両者共に両者の対向位置の反対側において他の部材と結合している。蛍光レポーター２１はＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合しており、クエンチャー２２とプローブ２３はプローブ２３中のＤＮＡ断片を介して直接結合している。また、プローブ２３は、ＰＥＧリンカー２４を介して金属粒子２０と結合している。ＰＥＧリンカー２４は可撓性を有するため、上記のように構成された上記第１および第２の実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５では、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との距離（位置関係）が変化しやすく、クエンチャー２２の効能を安定的に発揮させることが難しくなることが懸念される。
【００４３】
これに対して本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、蛍光レポーター２１にプローブ２３を直接結合するとともに、このプローブ２３にクエンチャー２２が直接結合しているので、蛍光レポーター２１とクエンチャー２２との距離（位置関係）が変化しにくくなり、クエンチャー２２の効能を安定的に発揮させることができる。
【００４４】
次に、本発明の第４の実施の形態について説明する。図６は本発明の第４の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。
【００４５】
本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬は、上記第３の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬と比較して、金属粒子２０の形状を棒状体にした点および金属粒子２０を光透過材料２５により被覆していない点が異なり、それ以外の点は上記第３の実施の形態と同様であるため、同様の点についての説明は省略する。
【００４６】
図６に示すように、本実施の形態のＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット１０ｃの金属粒子２０´は、棒状体であり、その長さは１０〜１００ｎｍ程度とするのがよい。例えば長さ８０ｎｍ、直径１３ｎｍのＡｕナノロッドとすることができる。
【００４７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ１５´は、棒状の金属粒子２０の両端部に修飾される。
【００４８】
金属粒子２０´を棒状体とした場合、プラズモン増強場Ｐは棒の両端部にしか発現しないが、球状体の場合と比較して強いプラズモン増強場が発現するため、より検出感度を向上させることができる。
【００４９】
なお、本実施の形態においても、金属粒子２０´を光透過材料２５により被覆してもよい。
【００５０】
次に、本発明の第５の実施の形態について説明する。図７は本発明の第５の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。なお、上記実施の形態と同様の点についての説明は省略する。
【００５１】
図７に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬２は、インターカレーター法に対応したものであり、金属粒子４０の表面に複数のプライマー４１がＰＥＧリンカー４２を介して修飾されたプライマーユニット３０を含むものである。
【００５２】
被検出遺伝子３２や蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１等に定量ＰＣＲ用試薬２を加えてＰＣＲを行った場合、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１は、遺伝子と結合した際にのみ蛍光を生じるため、この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【００５３】
本実施の形態では、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１を取り込むプライマー４１の近傍に金属粒子４０が結合されており、金属粒子４０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））３１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００５４】
なお、本実施の形態においても、金属粒子４０を光透過材料により被覆してもよい。
【００５５】
次に、本発明の第６の実施の形態について説明する。図８は本発明の第６の実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬の概略構成図である。なお、上記実施の形態と同様の点についての説明は省略する。
【００５６】
図８に示すように、本実施の形態の定量ＰＣＲ用試薬３は、蛍光プローブ法の中でもモレキュラービーコン法に対応したものであり、金属粒子６０の表面に複数のモレキュラービーコン６３が修飾されたモレキュラービーコンユニット５０を含むものである。
【００５７】
モレキュラービーコン６３の両端には各々蛍光レポーター６１およびクエンチャー６２が結合されており、蛍光レポーター６１と金属粒子６０とがＰＥＧリンカー６４により結合されている。
【００５８】
被検出遺伝子５２等に定量ＰＣＲ用試薬３を加えてＰＣＲを行った場合、初期状態で蛍光レポーター６１に対して励起光を照射しても蛍光エネルギーはクエンチャー６２に吸収され蛍光レポーター６１から蛍光は生じないが、モレキュラービーコン６３と被検出遺伝子５２とのＤＮＡポリメラーゼ反応が進むと、蛍光レポーター６１とクエンチャー６２との距離が離れ、蛍光レポーター６１から蛍光が生じるようになる。この蛍光の強度を測定することにより、遺伝子増幅の進度を検出することが可能である。
【００５９】
本実施の形態では、蛍光レポーター６１の近傍に金属粒子６０が結合されており、金属粒子６０に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場Ｐにより、蛍光レポーター６１の蛍光強度が１０〜１００倍程度と飛躍的に増強されるため、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
【００６０】
なお、本実施の形態においても、金属粒子６０を光透過材料により被覆してもよい。
【００６１】
以上、本発明の好ましい実施の形態について説明したが、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変形を行なってもよいのは勿論である。例えば、ＰＥＧリンカーの代わりに、ポリメタクリレート、ポリアクリレート等のポリマーリンカーを用いても良いし、シランカップリングによる結合でも良い。
【符号の説明】
【００６２】
１、２、３ 定量ＰＣＲ用試薬
１０ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブユニット
１１ プライマー
１２ 被検出遺伝子
１５ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
２０ 金属粒子
２１ 蛍光レポーター
２２ クエンチャー
２３ プローブ
２４ ＰＥＧリンカー
２５ 光透過材料
３０ プライマーユニット
３１ 蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標））
３２ 被検出遺伝子
４０ 金属粒子
４１ プライマー
４２ ＰＥＧリンカー
４３ 光透過材料
５０ モレキュラービーコンユニット
５２ 被検出遺伝子
６０ 金属粒子
６１ 蛍光レポーター
６２ クエンチャー
６３ モレキュラービーコン
６４ ＰＥＧリンカー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬であって、
多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、
前記金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された前記蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能としたことを特徴とする定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項２】
前記金属粒子、前記蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が前記Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で前記蛍光粒子と前記クエンチャーとが離間するように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項３】
前記金属粒子、前記蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が前記モレキュラービーコンに対して行われた段階で前記蛍光粒子と前記クエンチャーとが離間するように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項４】
前記クエンチャーが、該クエンチャーと前記蛍光粒子との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質であることを特徴とする請求項２または３記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項５】
前記蛍光粒子と、
前記プライマーおよび前記金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて前記蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項６】
前記金属粒子が、直径１０〜１００ｎｍの球状体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項７】
前記金属粒子が、長さ１０〜１００ｎｍの棒状体であることを特徴とする請求項１から
５のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項８】
前記金属粒子が、Ａｇを主成分とするものであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項９】
前記金属粒子が、光透過材料により被覆されていることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項１０】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法であって、
多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えて前記ＰＣＲを行い、
前記金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された前記蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出することを特徴とする定量ＰＣＲ方法。
【請求項１】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ用試薬であって、
多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを混在させて含み、
前記金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された前記蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出可能としたことを特徴とする定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項２】
前記金属粒子、前記蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が前記Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの結合領域まで進んだ段階で前記蛍光粒子と前記クエンチャーとが離間するように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項３】
前記金属粒子、前記蛍光粒子およびクエンチャーが結合されたモレキュラービーコンを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が前記モレキュラービーコンに対して行われた段階で前記蛍光粒子と前記クエンチャーとが離間するように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項４】
前記クエンチャーが、該クエンチャーと前記蛍光粒子との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるＦＲＥＴ用蛍光物質であることを特徴とする請求項２または３記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項５】
前記蛍光粒子と、
前記プライマーおよび前記金属粒子が結合されたプライマーユニットとを含み、
ＤＮＡポリメラーゼ反応が進むにつれて前記蛍光粒子がＤＮＡ内にインターカレーションされるように構成されていることを特徴とする請求項１記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項６】
前記金属粒子が、直径１０〜１００ｎｍの球状体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項７】
前記金属粒子が、長さ１０〜１００ｎｍの棒状体であることを特徴とする請求項１から
５のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項８】
前記金属粒子が、Ａｇを主成分とするものであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項９】
前記金属粒子が、光透過材料により被覆されていることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の定量ＰＣＲ用試薬。
【請求項１０】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した遺伝子増幅における遺伝子増幅の進度を検出するための定量ＰＣＲ方法であって、
多数の金属粒子と、励起光の照射を受けて蛍光を生じる多数の蛍光粒子とを加えて前記ＰＣＲを行い、
前記金属粒子に励起光を照射することにより生じるプラズモン増強場により増幅された前記蛍光粒子の蛍光強度を測定することにより遺伝子増幅の進度を検出することを特徴とする定量ＰＣＲ方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１４７６７９（Ｐ２０１２−１４７６７９Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６４２５（Ｐ２０１１−６４２５）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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