小グリア細胞活性化および全身炎症性反応を抑制する方法
【課題】中枢神経系（ＣＮＳ）中の小グリア細胞の活性化を抑制する、または脳虚血や脳炎症の神経学的影響を緩和若しくは治療するペプチドの提供、該ペプチドにより敗血症などの末梢の炎症状態の治療、および小グリア細胞受容体に結合するか小グリア細胞の活性化を予防または軽減する該ペプチドの投与によってＣＮＳに影響を与える特異的疾患と戦う方法の提供。
【解決手段】ＡｐｏＥ受容体結合ペプチド、更に抗炎症性サイトカインおよびモノクローナル抗体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を含む。
【解決手段】ＡｐｏＥ受容体結合ペプチド、更に抗炎症性サイトカインおよびモノクローナル抗体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
本出願は、１９９８年３月１１日出願の米国特許仮出願第６０／０７７，５５１号（現在放棄されている）の利益を主張する、１９９９年３月１日出願の米国特許出願第０９／２６０，４３０号（現在放棄されている）の一部継続出願である、２００１年９月２１日出願の米国特許出願第０９／９５７，９０９号の一部継続出願である。これらの出願の開示全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府援助）
本発明は、ＮＩＨ助成金ＮＳ３６８０８７−０１Ａ２、Ｋ０８ＮＳ０１９４９、およびＲＯ３ ＡＧ１６５０７−０１の政府援助の下で行なわれた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）中の小グリア細胞の活性化を抑制する方法、グリア細胞または小グリア細胞の活性化を軽減または抑制する方法、脳虚血または脳炎症の神経学的影響を緩和または治療する方法、小グリア細胞受容体に結合して小グリア細胞の活性化を予防または軽減する化合物の投与によってＣＮＳに影響を与える特異的疾患と戦う方法、および小グリア細胞の活性化を予防または軽減する能力について化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、グルタミン酸興奮毒性およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）曝露に関する神経細胞死の抑制方法ならびに敗血症で認められるような全身炎症性反応の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
中枢神経系（ＣＮＳ）は、長い間、相対的免疫特権部位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ）であると考えられている。しかし、急性および慢性神経疾患におけるＣＮＳ組織損傷はＣＮＳ炎症反応によって媒介され得ると認識されつつある。ＣＮＳ炎症反応は、主に、炎症性サイトカインによって媒介される。
【０００５】
小グリア細胞は、中枢神経系における主な免疫担当細胞である。小グリア細胞は、単球／マクロファージ系統細胞と形態学的、免疫表現型的、および機能的に関連する（Ｇｅｈｒｍｅｎｎら、１９９５）。急性ＣＮＳ損傷ならびにＨＩＶ脳症、癲癇、およびアルツハイマー病（ＡＤ）などの慢性病態は、小グリア細胞活性と関連する（ＭｃＧｅｅｒら、１９９３；ＲｏｔｈｗｅｌｌおよびＲｅｌｔｏｎ、１９９３；Ｇｉｕｌｉａｎら、１９９６；Ｓｈｅｎｇら、１９９４）。小グリア細胞活性により、一酸化窒素（ＮＯ）および他のフリーラジカル種が産生され、プロテアーゼ、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαが含まれる）、およびＮＭＤＡ受容体を介して作用する神経毒素（Ｇｉｕｌｉａｎら、１９９６）が放出される。小グリア細胞の活性化を、亜硝酸塩（一酸化窒素形成の安定な産生物）産生の測定によって評価することができる（ＢａｒｇｅｒおよびＨａｒｍｏｎ、１９９７）。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、コレステロール代謝に関与し、免疫調整性を有することも報告されている。例えば、ＡｐｏＥは、リンパ球増殖の抑制およびマイトジェン攻撃誘発後の免疫グロブリン合成を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調整効果を有することが証明されている（Ａｖｉｌａら、１９８２；ＥｄｇｉｎｇｔｏｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ、１９８１）。末梢神経損傷後のマクロファージならびにＣＮＳ損傷後の星状細胞および乏突起膠細胞（グリア細胞）によってＡｐｏＥが大量に分泌される（Ｓｔｏｌｌら、１９８９；ＳｔｏｌｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ、１９８６）。しかし、ＡｐｏＥがグリア細胞活性化およびＣＮＳ損傷で作用する役割については、議論の余地がある。
【０００７】
ＡｐｏＥの大部分は肝臓で産生される。しかし、そのサイズが大きいために、ＡｐｏＥは容易に血液脳関門を通過しない。実際、肝臓移植後、末梢ＡｐｏＥ表現型はドナー肝臓のそれに変化するが、ＣＳＦ（脳脊髄液）のＡｐｏＥ表現型は変化しないままである（Ｌｉｎｔｏｎら、１９９１）。したがって、神経系内に局在するＡｐｏＥは、周囲で産生されたタンパク質から離れたプールを示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１、１月）。
【０００８】
ＡｐｏＥは、公知の配列を有する２９９アミノ酸脂質担持タンパク質である（Ｒａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、４１７４、１９８２；ＭｃＬｅａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９、６４９８、１９８４）。ヒトＡｐｏＥの完全な遺伝子も配列決定されている（Ｐａｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、３４４５、１９８５）。少なくとも１０種由来のＡｐｏＥ配列が決定されており、アミノ末端よびカルボキシ末端以外は種間で高い保存度を示す。Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４。
【０００９】
ヒトＡｐｏＥは、３つの主なイソ型（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４）が見出されており、これらのイソ型は、１１２位および１５８位でのアミノ酸置換によって異なる。最も一般的なイソ型は、残基１１２にシステイン、残基１５８にアルギニンを含むＡｐｏＥ３であり、ＡｐｏＥ２は最も少ないイソ型であって、残基１１２および１５８にシステインを含み、ＡｐｏＥ４は残基１１２および１５８にアルギニンを含む。ヒトＡｐｏＥのさらに稀な配列変異も公知である（例えば、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４、２６８〜２６９ページを参照のこと）。
【００１０】
ＡｐｏＥは、２つの異なる機能ドメイン（１０ｋＤａのカルボキシル末端および２２ｋＤａのアミノ末端）を有する（Ｗｅｔｔｅｒａｕら、１９８８）。カルボキシ末端は、脂質に高い親和性を示し、コレステロール輸送におけるＡｐｏＥの役割を媒介する。アミノ末端は、受容体結合領域を含む４つの逆平行αヘリックスから構成される（Ｗｅｉｓｂａｒｇｅｒら、１９８３；Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙら、１９８３）。ＡｐｏＥは、細胞表面受容体ファミリー（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＲＰ／α２Ｍ、ＥＲ−２、ＬＲ８受容体、ＡｐｏＥ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）、およびメガリン／ｇｐ３３０が含まれる）に結合することが公知である（Ｋｉｍら、１９９６；Ｎｏｖａｋら、１９９６；Ｖｅｉｎｂｅｒｇｓら、２００１）。アポリポタンパク質ＥとＬＤＬ受容体との相互作用は、リポタンパク質代謝において重要である。ＡｐｏＥのＬＤＬ受容体結合活性の研究では、典型的にはリン脂質と複合体化する。無脂質状態で本質的に不活性なタンパク質が記載されている（Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙら、１９７９）。
【００１１】
ＬＤＬ受容体との相互作用に重要なＡｐｏＥの１つの領域は、残基１４０と１６０との間に存在し（Ｍａｈｌｅｙ、１９８８）、この領域の部位特異的変異誘発研究により、電荷および立体配座に影響を与える変異により結合が欠如し得ることが証明されている（Ｌａｌａｚａｒ、１９８８）。ＡｐｏＥの受容体結合領域（すなわち、アミノ酸残基１３５〜１６０）は、アルギニンおよびリジンを含む塩基性アミノ酸に富む。ＡｐｏＥ−ＬＤＬ受容体結合に対する効果についてＡｐｏＥの受容体結合領域における種々のアミノ酸置換が研究されている。残基１３６、１４２、１４５、および１４６でのアルギニンまたはリジンの中性残基への置換により、正常なＡｐｏＥ結合活性が減少した（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、１９８８）。ＡｐｏＥの受容体結合領域内の塩基性残基置換により、ＬＤＬ受容体結合は完全に破壊されず、これにより、この相互作用には残基は重要でないことが示唆される。活性な結合立体配座中の受容体結合領域を維持するためにＬＤＬ結合領域外にＡｐｏＥ領域が必要であると仮定されている（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、１９９４）。Ｄｙｅｒら（１９９１）は、ＡｐｏＥの残基１４１〜１５５を含む無脂質合成ペプチドフラグメント（この配列の二量体ペプチド）を研究した。このペプチドの単量体では結合活性は認められなかったが、二量体では低レベルの結合が認められた（約１％のＬＤＬ活性）。
【００１２】
ＡｐｏＥに結合する受容体は、高配列類似性領域を有する。スカベンジャー受容体は、小グリア細胞上に存在し、アセチル化および酸化ＬＤＬに結合することが好ましいことが公知である。スカベンジャー受容体は、炎症（酸化）条件下で特に関連し得る。スカベンジャー受容体はまた、損傷後の小グリア細胞で上方制御されることが公知である（Ｂｅｌｌら、１９９４）。
【００１３】
ＬＲＰ受容体は、マクロファージ上に存在することが公知である。概要として、リポタンパク質リパーゼによる修飾およびアポリポタンパク質の結合後、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）およびキロミクロンが残存し、受容体媒介機構によって肝臓でクリアランスされる。低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体と異なることが認識されているにもかかわらず、レムナント受容体はまたＡｐｏＥに高い親和性を示し、組み込まれたＡｐｏＥ部分を介してレムナント粒子を認識する。１９８８年に、このレムナント受容体がクローン化され、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（すなわち、「ＬＲＰ」）と名づけられた。
【００１４】
ＬＲＰは巨大な受容体であり、４５２５アミノ酸一次配列を有し、ＬＤＬ受容体ファミリーの他のメンバーと多数の類似の構造を有する。ＬＤＬ受容体のように、ＬＲＰの細胞外ドメインには、受容体由来のリガンドの酸依存性解離に関与すると考えられているシステイン富化リガンド結合ドメインおよびＥＧＦ前駆体相同ドメインが含まれる。しかし、ＬＤＬ受容体と異なり、Ｏ並び（Ｏ−ｌｉｎｅｄ）の糖ドメインは、膜に隣接する細胞外部分に存在しない。ＬＤＬ受容体ファミリーの全メンバーと同様に、ＬＲＰは、膜貫通タンパク質であり、１つの膜貫通セグメントによって固定されている。タンパク質の細胞質テールは１００アミノ酸であり（ＬＤＬレセプターよりも約２倍長い）、ターゲティングコート−ピット媒介エンドサイトーシスに必要であると考えられているＮＰｘＹモチーフを含む（ＫｒｉｅｇｅｒおよびＨｅｒｚ、１９９４；Ｍｉｓｒａら、１９９４）。
【００１５】
脂質結合に加えて、ＡｐｏＥはまた、マクロファージ由来サイトカイン産生の誘導によってグラム陰性敗血症を媒介する内毒素であるリポ多糖類（ＬＰＳ）に結合する。これらのサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６が含まれる）は、最終的に疾患を誘導する代謝および生理学的変化を担う（Ｗａａｇｅら、１９８７；Ｃｈｅｎｓｕｅら、１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６）。ＡｐｏＥは、結合ＬＳＰをマクロファージから不活化された場合の胆汁への続くＬＰＳ分泌を媒介する肝臓実質細胞に再指向する（Ｈａｒｒｉｓら、１９９３；Ｈａｒｒｉｓら、１９９８）。したがって、マクロファージの活性化は減少し、炎症性メディエータ産生が低下する。
【００１６】
Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら（Ｊｕｎｅ、１９９７）は、ａｐｏＥ欠損マウス由来の混合神経−グリア細胞培養物をリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激した実験を記載していた。細胞培養物のａｐｏＥとのプレインキュベーションにより用量依存性様式でＴＮＦαのグリア細胞分泌が遮断されることが見出された。より最近では、Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎらは、ＡｐｏＥの致死量のＬＰＳとの同時投与によりＬＰＳ誘導死からマウスが保護されたことを証明した（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎら、２００１）。Ｒｅｎｓｅｎらは、ａｐｏＥのアルギニン残基に対する正電荷の選択的消滅によってＡｐｏＥへのＬＰＳの結合が大いに減少してｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳの挙動に対するＡｐｏＥの効果が消滅するので、おそらくアルギニン残基を含む露呈した親水性ドメインによって遊離ＡｐｏＥ分子はおそらく２分子のＬＰＳに結合することを証明した（Ｒｅｎｓｅｎら、１９９７）。興味深いことに、ラクトフェリンは、ＡｐｏＥの受容体結合部位（アミノ酸１４２〜１４８）に類似する２５〜３１位でアルギニン／リジン豊富な配列を有する糖タンパク質であり、ＬＰＳに結合することも示された（Ｈｕｅｔｔｉｎｇｅｒら、１９８８；Ｃｏｈｅｎら、１９９２；Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９１）。しかし、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚは、ＡｐｏＥの神経−グリア細胞培養物とのプレインキュベーションによりＬＰＳ誘導ＴＮＦαチオン（ｔｉｏｎ）が遮断されるが、ＡｐｏＥのＬＰＳとの同時投与では遮断されないことを示し、これにより、ＬＰＳ結合以外の他のいくつかの機構が関与することが示唆される（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊｕｎｅ、１９９７）。
【００１７】
コレステロール代謝および内毒素クリアランスにおけるその役割に加えて、ＡｐｏＥはまた、神経疾患において重要な役割を果たし得る。ＡｐｏＥ４の存在は、散発性および遅発性アルツハイマー病の発症リスクと関連している（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３）。ＢａｒｇｅｒおよびＨａｒｍｏｎ（Ａｕｇｕｓｔ、１９９７）は、βアミロイド前駆体タンパク質の分泌誘導体（ｓＡＰＰ−α）での小グリア細胞の治療により小グリア細胞が活性化され、小グリア細胞における炎症反応が誘導され、小グリア細胞による神経毒の産生が増強されることを報告した。ｓＡＰＰ−αの小グリア細胞を活性化する能力は、ｓＡＰＰ−αタンパク質のアポリポタンパク質Ｅ３とのプレインキュベーションによって遮断されたが、アポリポタンパク質Ｅ４では遮断されなかった。より最近では、何人かの研究者は、τリン酸化制御におけるＡｐｏＥの関与を提案しており、ＡｐｏＥはアルツハイマー病に関連する神経原線維の発達においていくつかの経路で関与することが示唆される（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、１９９９；Ｔｅｓｓｅｕｒら、２０００）。しかし、ＡｐｏＥとτとの間の関連には議論の余地が残されている（Ｌｏｖｅｓｔｏｎｅ、２００１）。
【００１８】
ＡｐｏＥが脳の急性損傷反応を改変することを示す多数の臨床および実験所見も存在している。例えば、臨床所見により、ＡｐｏＥ４対立遺伝子が、急性および慢性閉鎖性頭部損傷後の死亡率および機能欠損の増加に関連することが示唆される（Ｓｏｒｂｉら、１９９５；Ｔｅａｓｄａｌｅら、１９９７；Ｊｏｒｄａｎら、１９９７；Ｆｉｅｄｍａｎら、１９９９）。ＡｐｏＥ４対立遺伝子はまた、頭部損傷後のアミロイドβタンパク質沈着範囲に関与していた（Ｍａｙｅｕｘら、１９９５；Ｎｉｃｏｌｌら、１９９５）。
【００１９】
脳虚血に関連する種々の臨床的状況において神経学的予後に対するａｐｏＥ４イソ型の悪影響もまた認められた。これらには、脳卒中（Ｓｌｏｏｔｅｒら、１９９７）、頭蓋内出血（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９５；ＭｃＣａｒｒｏｎら、１９９８）、心肺バイパス後の認知力欠如（Ｔａｒｄｉｆｆら、１９９７）、および心停止蘇生後の低酸素脳損傷（Ｓｃｈｉｅｆｅｒｍｅｉｅｒら、２０００）が含まれる。局所虚血後のＡｐｏＥの役割はあまり明白ではないが、少なくとも１つの臨床研究では脳卒中後の機能的予後に対するａｐｏＥ遺伝型の効果を報告できなかった（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら、２００１）。
【００２０】
虚血に対する中枢神経系反応の改変におけるａｐｏＥの役割に関与する臨床所見を、最近、動物モデルに拡大した。ＡｐｏＥ欠損マウスは、局所虚血および再灌流後に年齢、性別、および遺伝的背景が適合するコントロール動物と比較してより大きな梗塞およびより悪い機能の予後を示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、１９９７年７月）。この結果は、脳血管流または脳血管の解剖学と独立している（Ｂａｒｔら、１９９８）。一過性前脳虚血モデルでは、ａｐｏＥ欠損動物はまた、海馬被殻尾部（ｃａｕｄｏｐｕｔａｍｅｎ）、および皮質を含む脳低灌流に対して選択的脆弱性を示す神経集団の損傷が増大する（Ｓｈｅｎｇら、１９９９；Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、１９９９）。虚血に対するこの感受性の増大を、ヒト組換えａｐｏＥの脳室内投与によって逆転することができる（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ、２０００）。さらに、臨床文献と一致して、ヒトａｐｏＥ３導入遺伝子を発現するマウスよりもヒトａｐｏＥ４導入遺伝子を発現するするａｐｏＥ欠損マウスの梗塞がより拡大し、機能的予後が悪化する（Ｓｈｅｎｇら、１９９８）。
【００２１】
ａｐｏＥ遺伝子型がイソ型特異的様式で神経の回復に影響を与えることを示す複数の臨床報告が存在するにもかかわらず、これが起こる機構の定義は不十分なままである。内因性ａｐｏＥは、酸化ストレス（ＭｉｙａｔａおよびＳｍｉｔｈ、１９９６）、直接神経栄養効果の発揮（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、１９９５）、ＣＮＳ炎症反応の下方制御（Ｌｙｎｃｈら、２００１）、または脳アミロイド沈着の促進による病理学的シャペロンとしての作用（ＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ、１９９２）によって損傷に対するＣＮＳ応答に影響を与え得ることが提案されている。しかし、より最近の研究では、インタクトなＡｐｏＥタンパク質由来のいかなる神経保護効果も証明できなかった（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。
【００２２】
さらに、いくつかの研究により、ＡｐｏＥ誘導性ペプチドフラグメントにより神経が損傷し得ることが示唆された。例えば、おそらく細胞内プロセシングの結果としてａｐｏＥのカルボキシル末端短縮形態がＡＤ患者の脳で発生することが最近証明された。これらのフラグメントは生物活性を示し、細胞骨格タンパク質と相互作用して、培養ニューロン中に神経原線維変化に類似する封入体を誘導することができる（Ｈｕａｎｇら、２００１）。Ｍｏｕｌｄｅｒらは、最近、ＡｐｏＥ由来ペプチド１４１〜１５５から構成される二量体が神経毒性効果を有することを報告し、著者らはＡｐｏＥ自体がアルツハイマー病脳における毒性の供給源であり得ることを示唆している（Ｍｏｕｌｄｅｒら、１９９９）。残基１４１〜１４９の縦列反復から構成されるペプチドを使用して、Ｔｏｌａｒらは、初代海馬ニューロンのこのペプチドへの曝露により神経細胞死を誘導する（ＭＫ−８０１（ＮＭＤＡアンタゴニスト）とのプレインキュベーションによって遮断される効果）ことを証明した（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。これらの結果により、この縦列反復ペプチドへの曝露は直接または間接的機構によってＮＭＤＡ誘導性興奮毒性が増幅されることが予想される。
【００２３】
まとめると、ＡｐｏＥは、異なる生物学的過程において役割が変化する。ＡｐｏＥはマクロファージからのＬＰＳの除去によって末梢で保護効果を示すようであるが、そのＣＮＳ損傷およびアルツハイマー病などの神経疾患で果たす役割は全く明確にされていない。どのようにしてＡｐｏＥがＣＮＳ炎症応答に寄与するのか、神経損傷および神経疾患の治療において使用するための試薬の処方において助けとなるのかをより深く理解することが必要である。
【発明の概要】
【００２４】
（発明の要旨）本発明は、アポリポタンパク質Ｅの受容体結合部位配列を含むペプチドを使用して小グリア細胞活性を軽減または抑制することができるという所見に基づく。したがって、本発明は、グリア細胞または小グリア細胞が活性化し、グリア細胞または小グリア細胞の活性化が特異的病態に関連する有害な徴候および／または症状に寄与するＣＮＳ病態を治療するための方法および組成物を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドがＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸曝露に関連する神経細胞死およびカルシウム流入を完全に抑制するという予期せぬ所見に基づく。この結果は、ＡｐｏＥがＮＭＤＡ誘導性興奮毒性を増強するという最近の文献報告と対照的であり、ＡｐｏＥベースの処方物およびＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体の活性化に関連する損傷および疾患の治療の基礎を提供する驚くべき結果である。
【００２６】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ敗血症モデルにおいてＴＮＦαおよびＩＬ−６のＬＰＳ誘導産生から保護するという予期せぬ所見および本発明の受容体結合フラグメントがインタクトなタンパク質の小部分のみを含むという事実に関する驚くべき所見に基づく。したがって、本発明は、本発明のペプチドを使用した敗血症を治療するための方法および組成物ならびに本発明のペプチドと同一の受容体に結合する本明細書中に開示の方法を使用して同定された任意の化合物を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、高親和性アポリポタンパク質Ｅ受容体としてのＬＲＰ／α２Ｍの同定および特徴づけ、本明細書中に開示のいくつかの診断アッセイおよびキットの基礎となる特徴づけに基づく。本発明のアッセイを任意のＡｐｏＥ受容体（ＬＲＰ／α２Ｍ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＥＲ−２、ＬＲ８、アポＥＲ２、およびメガリン／ｇｐ３３０の受容体が含まれるが、これらに限定されない）を使用して実施することができる。
【００２８】
上記を考慮して、本発明の１つの態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞または星状細胞などの他の効果細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは哺乳動物被験体でのグリア細胞または小グリア細胞活性化の抑制方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してグリア細胞または小グリア細胞の活性を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかグリア細胞または小グリア細胞の活性化の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、ＣＮＳ炎症に関連する症状を緩和する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較してＣＮＳ炎症を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかＣＮＳ炎症の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体で、または本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、被験体におけるＣＮＳまたは脳虚血に関連する症状を緩和する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してＣＮＳ虚血に関する症状を緩和する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかＣＮＳ虚血の緩和に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の被験体への投与による、哺乳動物被験体のグルタミン酸興奮毒性またはＮＭＤＡ曝露に関連する神経細胞死を軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる軽減と比較してグルタミン酸毒性に関する神経細胞死を軽減するする量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかグルタミン酸毒性の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体で、または本発明のペプチド（特に、配列番号３、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、哺乳動物被験体におけるマクロファージ活性化を抑制する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してマクロファージ活性化を抑制する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかマクロファージ活性化の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与を含む、アテローム性動脈硬化症を治療するかアテローム斑の形成を軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較してアテローム斑の形成を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかアテローム斑形成の軽減に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与を含む、細菌性敗血症に関連する炎症を治療または軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較して敗血症関連炎症を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むか敗血症治療に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、配列番号３の治療ペプチドまたは各ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６のペプチド、もしくは配列番号１０のペプチドおよびその医薬組成物を含む２つのペプチドの二量体である。本発明のペプチドによって結合された受容体に結合し、本明細書中に開示の機能効果を媒介する本発明に開示のアッセイを使用して同定した化合物も含まれる。一貫して、本発明はまた、本明細書中で考察した種々の疾患および障害を治療するための薬物の作製方法における開示のペプチドおよび化合物ならびにその官能性変異型の使用を含む。このような薬物は、本発明の主題であるペプチドおよび化合物を単独または他の公知の医薬品と組み合わせて含み得る。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、活性化グリア細胞または小グリア細胞培養物を化合物とインキュベーションし、その後一酸化窒素などの小グリア細胞活性化マーカーを測定することによってグリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について化合物をスクリーニングする方法である。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、グリア細胞または小グリア細胞培養物を化合物とプレインキュベーションし、細胞培養物を公知のグリア細胞または小グリア細胞のアクチベーターとインキュベーションし、その後グリア細胞または小グリア細胞活性化マーカーを測定することによってグリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について化合物をスクリーニングする方法である。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、化合物が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号１０のペプチドが結合する同一の受容体（例えば、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体）でグリア細胞または小グリア細胞に結合するかどうかの決定による、グリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】リポ多糖類（ＬＰＳ）への曝露後のＡｐｏＥ欠損マウス（ソリッドのバー）、ＡｐｏＥ３トランスジェニックマウス（斜線のバー）、およびコントロールマウス（白のバー）由来のグリア細胞培養による亜硝酸塩の産生を示すグラフである。ＬＰＳによる細胞培養物の刺激の２４時間および６０時間後に反応を測定した。
【図２】ＬＰＳでの刺激およびそれに続く配列番号３のペプチド（縦列反復ペプチド）の添加後のＡｐｏＥ欠損マウス由来の富化小グリア細胞初代培養物による亜硝酸塩の産生を示すグラフである。ペプチドを０μＭから１０００μＭの用量で添加し、亜硝酸塩産生の用量依存性減少が認められた。コントロールとして、配列番号２のペプチドを培養物に添加し（ソリッドのバー）、亜硝酸塩産生の減少は認められなかった。
【図３Ａ】ＡｐｏＥ３（四角形）またはＡｐｏＥ４（円形）への曝露後のマウス腹膜マクロファージにおける長期間の細胞内カルシウム含有量を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＡｐｏＥ３（四角形）またはＡｐｏＥ４（円形）のいずれかに曝露したマウス腹膜マクロファージにおけるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を示すグラフである。グラフは、賦形剤に曝露したがＡｐｏＥに曝露していないコントロール細胞と比較した処置細胞中のＩＰ３含有量の変化の割合を示す。
【図４】配列番号６のペプチドの添加後（四角形）、配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加後（円形）のＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞初代培養物によるＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）の産生を示すグラフである。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図５】細胞生存度の基準としての、細胞培養物の光学密度のグラフである。ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞培養物を、配列番号６のペプチド（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（円形）のいずれかに曝露した。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図６】配列番号６のペプチドの添加後（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加後（円形）ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞初代培養物によるＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）の産生を示すグラフである。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図７】細胞生存度の基準としての、細胞培養物の光学密度のグラフである。ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞培養物を、配列番号６のペプチド（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（円形）のいずれかに曝露した。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図８】ａｐｏＥで処置したマクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図である。パネルＡ：ａｐｏＥ（１００ｐＭ）での刺激に対する１つのＦｕｒａ−２／ＡＭ負荷腹腔マクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの変化。［Ｃａ２＋］ｉ測定の詳細を、実施例に記載する。示したグラフは、それぞれ２０〜３０細胞を使用した代表的な５つの各実験を示す。約７０〜８０％のマクロファージが、ａｐｏＥでの刺激時に［Ｃａ２＋］ｉの変化を示した。矢印は、ａｐｏＥの添加時間を示す。パネルＢ：［Ｃａ２＋］ｉの変化に対するａｐｏＥ濃度の効果。各細胞における［Ｃａ２＋］ｉの変化を、種々の濃度のａｐｏＥへの曝露前および曝露後に測定した。データを、平均（Ｓ．Ｅ．）として示し、データは代表的な２つの独立した実験であり、それぞれの場合、研究あたり２５〜３０細胞を分析した。
【図９】ａｐｏＥで処置したマクロファージのＩＰ３の変化を示す図である。パネルＡ：マクロファージにおけるＩＰ３合成および百日咳毒素による調整に対するａｐｏＥの効果。これらの結果は、二連で行った２つの独立した実験の代表であり、百日咳毒素の存在下（白円形）および非存在下（黒円形）でのａｐｏＥ（１００ｐＭ）で刺激したミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識細胞の異なる時間でのＩＰ３形成の変化を％で示す。パネルＢ：［３Ｈ］標識マクロファージにおけるＩＰ３形成に対するａｐｏＥ濃度の効果。細胞を、種々の濃度のａｐｏＥで６０秒間刺激し、ＩＰ３を決定した。結果を、平均（Ｓ．Ｅ．）で示し、これは、二連で行った２つの各実験の代表である。
【図１０Ａ】閉鎖性頭部外傷後のrotorod潜伏時間に対する処置および非処置のマウスの能力を示す図である。
【図１０Ｂ】閉鎖性頭部外傷後の処置および非処置のマウスの体重増加を示す図である。
【図１０Ｃ】閉鎖性頭部外傷後の水迷路（water maze）潜伏時間試験における処置および非処置のマウスの能力を示す図である。
【図１０Ｄ】閉鎖性頭部外傷後の処置および非処置のマウスの生存を示す図である。
【図１１】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するヒト組換えＡｐｏＥ３の用量反応効果を示す図である。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝６培養ウェル／病態。ＡｐｏＥ３を使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝Ｐ＜０．０５。ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷測定の詳細を、実施例に示す。
【図１２Ａ】全長ＡｐｏＥおよびＡｐｏＥ模倣ペプチドの図である。ＡｐｏＥを、白抜きのボックスで示す。１０ｋＤａの脂質結合ドメインはカルボキシル末端に存在し、影をつけた領域で示す。ＡｐｏＥ ＬＤＬ受容体結合ドメインに対応するおよその領域を、黒べたのボックスで示し（アミノ酸１３０〜１５０、配列番号１３）、その後にこれらの研究で使用した３つの短縮ａｐｏＥ模倣ペプチド配列を示す（配列番号１０〜１２）。
【図１２Ｂ】光路長０．１ｃｍのキュベットを使用したＡｖｉｖ Ｍｏｄｅｌ ２０２ＣＤ分光計によってＡｐｏＥペプチドの円偏光二色性スペクトルを記録した。３つのペプチドのＣＤスペクトルは、ヘリックスとランダムコイル構造との混合物と一致した。
【図１３】（Ａ）１００μＭ ＮＭＤＡまたは（Ｂ）３００μＭ ＮＭＤＡでの初代混合ニューロン−グリア細胞培養物のＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）（配列番号１０）の用量反応効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝６〜８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１４】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチドの短縮効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１５】初代混合ニューロン細胞−グリア細胞培養物によるＮＭＤＡ誘導性Ｃａ＋＋取り込みに対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１６】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）曝露タイミングの効果を示す図である。培養物を、６μＭのａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）で予備処置するか（２４時間前にペプチドを添加し、ＮＭＤＡ曝露直前に除去した）、同時に処置するか（直前にペプチドを添加し、ＮＭＤＡ曝露直後に除去した）、後処置した（ＮＭＤＡ曝露直後にペプチドを添加し、２４時間後に損傷細胞から放出されたＬＤＨの決定まで培地中に維持した）。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１７】ＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）によるＴＮＦα（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）のＬＰＳ誘導性血清レベルの抑制を示すグラフである。暗色のバーは賦形剤処置動物群を示し、淡色のバーはペプチド処置動物群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ａｐｏＥがＣＮＳ中のグリア細胞の活性化を調整することを決定し、小グリア細胞の活性化を抑制するいくつかのペプチドをさらに同定した。１つの理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、小グリア細胞受容体へのＡｐｏＥ結合は小グリア細胞の表現型に影響を与え、種々のアクチベーターに対する小グリア細胞の反応性を減少させ、それによりこのようなアクチベーターの存在下で起こる小グリア細胞からの炎症性化合物の放出を減少させると仮定した。ＡｐｏＥは活性化化合物によって結合されるのと同一の受容体に結合することができるか、アクチベーターと結合した化合物から独立して受容体に結合することができる。
【００４１】
リンパ球では、ＡｐｏＥは、種々の化合物（ＬＰＳ、レクチンＰＨＡ、および抗ＣＤ３抗体が含まれる）によって活性化が遮断されることが示されており、これらのアクチベーターはリンパ球上の異なる受容体に結合することが公知である。本発明の方法および化合物を、小グリア細胞の受容体媒介活性化を予防または抑制し、それにより活性化小グリア細胞に関連する有害な神経学的効果を予防または軽減するようにデザインする。本発明のペプチドおよび他の治療分子は、グリア細胞上の受容体に結合し、種々のアクチベーターに対する細胞の応答性を減少させることができる。この様式では、本発明の方法および化合物を使用して、急性および／または慢性ＣＮＳ損傷の一定の徴候、症状、および／または有害な神経学的効果を治療、緩和、または予防することができる。
【００４２】
グルタミン酸および関連興奮性アミノ酸が、哺乳動物脳のシナプスによって放出され、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ（α−アミノ−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネート）受容体、およびカイニン酸受容体を含むイオンチャネルグルタミン酸受容体を活性化する。イオンチャネル型グルタミン酸受容体（特に、ＮＭＤＡ受容体）の過剰刺激により、ニューロン変性が意図される。虚血前のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１などの非競合インヒビターの全身投与により、小グリア細胞活性化の予防およびニューロン死の遅延が認められ、グルタミン酸カスケードの初期遮断により虚血損傷に関与する小グリア細胞活性化が予防されることが示唆される（Ｓｔｒｅｉｔら、１９９２）。しかし、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチド（１４１〜１４９）を使用した最近の研究により、このようなペプチドによりＮＭＤＡ誘導性興奮毒性が増幅され、神経細胞死が誘導されることが示唆される（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。他の最近の研究では、インタクトなａｐｏＥタンパク質由来のＮＭＤＡ誘導性神経毒性に対するいかなる神経保護効果も証明できなかった（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｄｏｎら、２０００）。
【００４３】
文献での最近の報告と対照的に、本発明者らは、インタクトなＡｐｏＥはＮＭＤＡ誘導性細胞傷害性を最も穏やかに用量依存的に減少させることを見出した。比較すると、１７残基のＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号１０）は、驚いたことに、天然のＡｐｏＥと比較して有意により強力な神経保護を示し、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１ほど完全にＮＭＤＡ曝露に関するカルシウム流および細胞死を遮断した。アミノ末端ペプチドのさらなる短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性からの神経保護の喪失がさらに進行した。これらの結果により、ＡｐｏＥが脳傷害後の虚血損傷からのニューロン細胞の回復に影響を与える１つの方法はグルタミン酸毒性からの細胞の保護であることが示唆される。さらに、この結果は、脳虚血後の有益な治療ストラテジーとしてのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用を支持する。
【００４４】
ＡｐｏＥペプチドがＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸曝露に関連するニューロン細胞死およびカルシウム流入を完全に抑制するという予期せぬ所見により、本発明前に明らかではなかったグルタミン酸受容体活性化に関与する障害および疾患のためのＡｐｏＥベースの処方物および治療の基礎が得られる。この所見により、ＮＭＤＡ興奮毒性に関連する疾患の治療のための公知の試薬と組み合わせた１つまたは複数の本発明のペプチドまたはＮＭＤＡアンタゴニスト化合物を含む併用療法用組成物の基本も得られる。
【００４５】
例えば、ＮＭＤＡ興奮毒性は、ＨＩＶ痴呆および脳症（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐｙ）に関連していた（Ｐｅｒｅｚら、２００１；Ｈａｕｇｈｅｙら、２００１；Ｄｏｂｌｅ、１９９９）。ＡｐｏＥペプチドがＮＭＤＡアンタゴニストとして作用するという事実は、ａｐｏＥ遺伝子型に関してＨＩＶ痴呆またはＨＩＶ脳炎のリスク間で統計的に有意な相関が認められなかったので、特に驚くべき所見である（Ｄｕｎｌｏｐら、１９９７）。したがって、ＡｐｏＥがＮＭＤＡ興奮毒性を増強するという最近の報告なしで、ＡｐｏＥまたはそのフラグメントがＮＭＤＡ拮抗活性を示すことは予想されないだろう。
【００４６】
ＮＭＤＡ興奮毒性はまた、ヒトの神経ラチリスム、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｄｏｂｌｅ、１９９９；Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２）、精神分裂病、ハンティングトン舞踏病、パーキンソン病（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２；Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕら、１９９７；ＫｌｏｐｍａｎおよびＳｅｄｙｋｈ、２００２；ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、双極性障害（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）、多発性硬化症、および動物の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＰａｕｌおよびＢｏｌｔｏｎ、２００２）、アルツハイマー病（Ｂｉら、２００２；ＢｉおよびＳｚｅ、２００２）および外傷性脳損傷（Ｒａｏら、２００１；Ｒｅｇｎｅｒら、２００１；ＸｕおよびＬｕｏ、２００１）に加えて、うつ病、脳卒中（ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、癲癇、および遺伝性神経代謝疾患ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸酸性尿症（Ｋｏｌｋｅｒら、２００２）と関連していた。ＮＭＤＡアンタゴニストは、臨床麻酔でも使用されており（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）、動物モデルにおける慢性疼痛（ＭｃＫｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋ、２００１；ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、薬物耐性（Ｃａｄｙ、２００１）、およびアルコール依存症の阻害が認められている（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ、２００１）。
【００４７】
したがって、本発明は、任意の上記疾患または障害の治療のための方法および医薬処方物における開示のペプチドおよびＮＭＤＡアンタゴニスト化合物の使用ならびに種々の障害の治療に有用な他の公知の化合物を含む麻酔用処方物および併用療法用組成物中の成分としての使用を含む。例えば、本発明のペプチドおよび他の化合物を、ウイルス複製の阻害およびＨＩＶ痴呆の予防または治療にあわせた併用療法での治療計画において任意の公知のＨＩＶ薬（ＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼインヒビターが含まれる）と組み合わせることができるか、単独で投与するか補助的処方物において他のＮＭＤＡアンタゴニストと共に投与することができる。ある著者は、ＣＮＳの抗レトロウイルス療法がＡＩＤＳ痴呆複合を示す患者の機能および予後の改善が不可欠である場合でさえも、毒性の有意な部分が抗レトロウイルス治療時でさえも継続する間接的機構によって媒介されるようであるので、二次神経毒性機構を遮断するさらなる神経保護を得るために長期間を必要とし得るとコメントしていた（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ、２００２）。
【００４８】
リルゾールは、筋萎縮性側索硬化症の神経保護治療に使用され、ハンティングトン病およびパーキンソン病治療について現在臨床試験で試験されているグルタミン酸拮抗性を有する物質である（Ｓｃｈｉｅｆｅｒら、２００２；Ｄｏｂｌｅ、１９９９）。Ｓｃｈｉｅｆｅｒとその共同研究者は、最近、ハンティングトン病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、リルゾールが生存期間を延長し、核封入体形成を変化させることを証明した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物のＮＭＤＡのアンタゴニストとしての役割を仮定すると、これらのペプチドおよび化合物を、単独またはリルゾールなどの他のグルタミン酸アンタゴニストと組み合わせて、ＡＬＳ、ハンティングトン病、およびパーキンソン病の治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００４９】
Ｌ−デプレニールは、障害の出現ならびにパーキンソン病の徴候および症状の進行を遅延させ、グルタミン酸受容体の活性化由来の下流で起こる事象に対して保護効果を発揮すると予想されるモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ｂのインヒビターである（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕら、１９９７）。ＭＡＯ−Ｂインヒビター、レボドパなどのドーパミン受容体アンタゴニストおよびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは全て抗パーキンソン効果を示し、多剤組み合わせは、薬物の抗パーキンソン効果を相乗的に増強することが示されている（ＫｌｏｐｍａｎおよびＳｅｄｙｋｈ、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物のＮＭＤＡアンタゴニストの役割を与えられた場合、これらのペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｌ−デプレニールなどのＭＡＯ−Ｂインヒビターおよびレボドペラなどのドーパミン受容体アンタゴニスト）と組み合わせてパーキンソン病治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００５０】
グルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生は、神経分裂症の病因に関連していると見なされている（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２）。したがって、研究者らは、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびハンティングトン病などの他の神経疾患で使用された抗酸化剤での神経分裂症の治療を試験し始めた。本発明のＮＭＤＡ受容体拮抗ペプチドおよび化合物を使用してグルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生を阻害することができる場合、これらのペプチドおよび化合物を、単独または他の抗酸化剤と組み合わせて精神分裂症治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００５１】
ＮＭＤＡ受容体機能低下を阻害する抗痙攣薬、抗癲癇薬は、双極性障害で臨床的に有用であることが見出された（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）。このような薬剤には、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、ラモトリジン、リルゾール、テトロドトキシン、フェルバメート、ガバペンチン、およびエトスクシミドが含まれる。本発明の化合物のペプチドもまたＮＭＤＡ受容体関連神経毒性を阻害するならば、本発明のペプチドおよび化合物を双極性障害または癲癇の治療用医薬品及び方法中で単独または医薬品中での他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストまたはＮＭＤＡ受容体機能低下のインヒビターと組み合わせて使用することができる。
【００５２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、免疫療法に対する応答および動物モデルの存在（実験的自己免疫脳炎）の観察によって判断したところ、免疫学的に媒介された疾患である。インターフェロン（ＩＦＮ）β−１ｂ、ＩＦＮβ−１ａ、および酢酸ガラティラメル（再発または寛解を繰り返すＭＳに使用される現在の療法）は、ＭＳの免疫学的病態生理学に取り組む作用機構を有する（Ｄｈｉｂ−Ｊａｌｂｕｔ、２００２）。例えば、ＩＦＮは、細胞表面特異的受容体に結合し、抗ウイルス性、抗増殖性、および免疫調整性の遺伝子産物の分泌で終了するシグナル伝達経路のカスケードを開始する。酢酸ガラティラメル（合成分子）は、ミエリン塩基性タンパク質反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し、抗炎症効果によって特徴付けられるＴ細胞レパートリーを誘導する。いくつかの現在市販されている治療薬（ＩＶ免疫グロブリン、メトトレキセート、およびアザチオプリンが含まれる）は、承認された治療と組み合わせた再発と寛解を繰り返す多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の治療薬として評価されている（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ、２００２）。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンが血液脳関門を予防、破壊、および修復し、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＡＥの病因に関連する症状を軽減する（ＰａｕｌおよびＢｏｌｔｏｎ、２００２）ことが示されるならば、本発明のペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかヒトＭＳ治療用のインターフェロンまたは酢酸ガラティラメルに加えて使用することができる。
【００５３】
ヒトの持続痛の動物モデルを使用して、ＭｃＫｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋは、最近、疼痛挙動はＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＡＰ５での治療により有意に軽減されることを示した（ＭｃｋｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋ、２００１）。同様に、Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎと共同研究者は、最近、ＬＹ２９３５５８（競合性非Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸興奮性アミノ酸受容体アンタゴニスト）の髄腔内投与により、１８０分間ラットの感覚および運動応答が遮断され、翌日に完全な回復が認められることを証明した。ＬＹ２９３５５８の効果は、ブピバカインの効果より顕著かつ持続されるので、著者らは、グルタミン酸受容体を遮断するＬＹ２９３５５８のような薬物はヒトの脊髄麻酔用の局所麻酔薬の代替物であり得ると結論付けている（Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎら、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかヒトおよび動物の局所麻酔薬として他の麻酔化合物に加えて使用することができる。
【００５４】
ＮＭＤＡ受容体はまた、物質使用の病態生理学において主要な役割を果たすと考えられている（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ、２００１；Ｓｏｙｋａら、２０００）。例えば、Ｋｏｔｌｉｎｓｋａは、エタノール投与前に投与したＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンによりラットのエタノール依存症の発症が予防されたことを示した。Ｊｏｎｅｓと共同研究者は、モルヒネ離脱症候群の強度がＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＬＹ２３５９５９で前処置した幼若ラットで軽減されたことを証明した。ＬＹ２３５９５５９で前処置した子供において、頭部の揺れ（ｈｅａｄ ｍｏｖｅｓ）、足の揺れ、ローリング、および徘徊（ｗａｌｋｉｎｇ）などの脱離挙動が減少し、発声は完全に無くなった（Ｊｏｎｅｓら、２００２）。最近の概説によれば、基本的嗜癖機構のターゲティングを目的とするストラテジーは、嗜癖は中枢神経系の適応変化によって発症し、再発の主な原因である渇望はドーパミン作動機構に依存し、高い全身興奮性を必要とするという仮定に依存する。したがって、薬理学的アプローチは、電位型チャネル（例えば、ニモジピン）およびＮＭＤＡ受容体（例えば、メマンチン）の両方を介したニューロンへのカルシウム流入の阻害によってニューロン順応性を軽減させる薬物ならびに阻害性ＧＡＢＡ性系を刺激する薬物（γ−ビニル−ＧＡＢＡ、バクロフェン）を含んでいた。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトのアルコールおよび薬物嗜癖の予防および治療のための組成物および方法において単独またはメマンチンなどの他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかニモジピン、γ−ビニル−ＧＡＢＡ、およびバクロフェンなどの他の神経順応性化合物に加えて使用することができる。
【００５５】
ＡｐｏＥペプチドが小グリア細胞の活性化を阻害する１つの方法がグルタミン酸興奮毒性の阻害であるという本発明者らによる所見は、ＣＮＳ損傷治療のための本発明のこれらのペプチドおよび他のＮＭＤＡ受容体拮抗性化合物の価値をさらに支持する。例えば、Ｒａｏらは、ラットの外傷性脳損傷後のメマンチン（別のＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）による神経保護を報告した（Ｒａｏら、２００１）。他の著者は、最近、ＮＭＤＡ受容体の過剰な活性化は二次的脳障害を誘導する最も重要な因子の１つであり、ＡＰ５などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは脳損傷後の浮腫から脳を保護することができるとコメントした。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトおよび動物の脳損傷および関連する二次的脳障害の治療のための組成物および方法において単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。
【００５６】
本発明の方法および化合物は、急性ＣＮＳ損傷に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。本明細書中で使用される、「急性ＣＮＳ損傷」には、脳卒中（血栓症、塞栓症、または血管収縮によって発症する）、閉鎖性頭部外傷、全脳虚血（例えば、心筋梗塞、不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳損傷を含む任意の原因の全脳低血圧症による虚血）、局所性虚血、および頭蓋内出血が含まれるが、これらに限定されない。中枢神経系に対する虚血損傷は、全脳または局所的虚血条件のいずれかに起因し得る。一定期間（心停止中など）に脳全体への血流が停止した場合に全脳虚血が起こる。脳血管の血栓塞栓性閉塞、外傷性脳損傷、浮腫、および脳腫瘍などの間に脳の一部が正常な血流が枯渇した場合に局所的虚血が起こる。脳虚血によるＣＮＳ損傷の多くは、虚血状態から数時間または数日の間に起こり、損傷組織による細胞傷害性産生物の放出は二次的である。
【００５７】
本発明の方法および化合物はまた、慢性神経疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）およびＨＩＶ関連脳症が含まれるが、これらに限定されない）に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。ＡｐｏＥペプチドを使用してグリア細胞活性化を抑制することができるという本発明者らによる所見により、小グリア細胞活性化を含む任意の神経疾患治療における本発明のペプチドおよび化合物の役割が得られる。例えば、小グリア細胞はＡＤにおける活性化マーカーを発現し、これにより、ＡＤにおける重大な炎症に小グリア細胞が関与することが示唆される。これによりアミロイド斑付近の小グリア細胞クラスターが活性化された（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９９５）。癲癇においても小グリア細胞が活性化される（Ｓｈｅｎｇら、１９９４）。
【００５８】
アミロイドβペプチドの取り込みおよび病原的影響がＮＭＤＡ受容体アンタゴニストによって遮断されることが最近示されているので（Ｂｉら、２００２）、ＡｐｏＥペプチドがグリア細胞の活性化を阻害する１つの方法がグルタミン酸興奮毒性の阻害であるという本発明者らによる驚くべき所見は、ＡＤ治療のための本発明のペプチドおよび他の化合物の価値をさらに支持する。他の研究は、抗炎症薬は疾患の発症または進行を遅延させることができることを示す（Ｂｒｅｉｔｎｅｒら、１９９５；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９３）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトのＡＤ治療のための組成物および方法において単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストまたは他の公知の医薬品（特に、ＡＤ治療で使用されている抗炎症薬）と組み合わせて使用することができる。
【００５９】
本発明の方法および化合物はまた、ＣＮＳを含む神経系に影響を与える炎症病態（多発性硬化症、脈管炎、急性散在性脳脊髄炎、およびギヤン−バーレー症候群が含まれるが、これらに限定されない）に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。これに関して、本発明のＡｐｏＥペプチドおよび他の化合物を、単独またはＣＮＳ炎症病態の治療のための医薬組成物を処方するために他の公知の抗炎症薬またはサイトカインと組み合わせて使用することができる。
【００６０】
本発明の方法および化合物は、急性または慢性ＣＮＳ疾患の一部として発症するＣＮＳにおけるグリア細胞の活性化の予防、治療、または軽減に有用である。本発明の方法および化合物の効果を、細胞もしくは組織レベル（例えば、組織学的または体系測定的）または被験体の神経学的状態の評価によって評価することができる。グリア細胞活性化の抑制または軽減を、当業者に明らかである種々の方法によって評価することができ、このような１つの方法は、活性化グリア細胞によって産生されることが公知の化合物の産生または存在の測定およびコントロールにおけるこの化合物のレベルとこの測定値との比較である。あるいは、小グリア細胞活性化の抑制、軽減、または予防における本発明の方法および化合物の効果を、処置被験体およびコントロール被験体におけるＣＮＳ疾患の徴候および／または症状（このような徴候および／または症状は小グリア細胞の活性化に関連するか二次的に関連する）の比較によって評価することができる。
【００６１】
本発明はまた、ＡｐｏＥ受容体結合ペプチドが敗血症の末梢およびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいてサイトカインのＬＰＳ誘導性産生から保護するという本発明者の驚くべき所見に基づく。最近、インタクトなＡｐｏＥが細菌性ＬＰＳ誘導死からマウスを保護することが示されているにもかかわらず（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎら、２００１）、ＡｐｏＥがＬＰＳをマクロファージから肝臓実質細胞に向け直すことによって保護を媒介すると考えられるならば、ＡｐｏＥの受容体結合領域のみを含むペプチドにより保護が付与されることは驚くべきことである。敗血症の他の可能な治療は、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０が含まれる）、形質転換成長因子β、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦＮ−φ、マクロファージ遊走阻止因子、および高速移動性１群（high mobility group 1）タンパク質（Ｚａｎｏｔｔｉら、２００２）、およびモノクローナル抗体（抗内毒素抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、および抗ＣＤ１４抗体が含まれる）の投与を含む（Ｍａｔｓｕｂａｒａら、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、敗血症治療のための組成物および方法において単独または他の公知の抗炎症性サイトカインおよび抗体と組み合わせて使用することができる。
【００６２】
本明細書中で使用される、用語「戦う」、「治療する」、および「改善する」は、必ずしも治療を受ける被験体のＣＮＳまたは罹患している敗血症の基本となる疾患過程の逆転または停止を示すことを意味しない。このような用語は、治療なしと比較して治療される病態に関連する有害な徴候および／または症状が減少または軽減するか、進行度が減少することを示す。疾患の徴候または症状の変化を、被験体レベル（例えば、被験体の機能または病態を評価する）または組織もしくは細胞レベル（例えば、グリア細胞またはマクロファージ活性化マーカーの産生が減少または軽減する）で評価することができる。本発明の方法を使用して、慢性ＣＮＳ病態（アルツハイマー病など）を治療する場合、この方法は、痴呆などの症状の発症を遅くするか遅延することができるが、根底となる疾患の過程に必ずしも影響を与えることも逆転することもない。
【００６３】
本発明の方法を実施するための適切な被験体には、雄および雌の哺乳動物被験体（ヒト、非ヒト霊長類、および非霊長類哺乳動物が含まれる）が含まれる。被験体には、ペット（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）（コンパニオンアニマル）被験体ならびに家畜および外来種が含まれる。
【００６４】
本発明の方法で使用することができる活性な化合物には、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体または本発明のＡｐｏＥペプチドによって結合した任意の受容体に特異的および／または選択的に結合するリガンドまたはアゴニストが含まれる。このような化合物の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：１）α２マクログロブリン；２）シュードモナス外毒素；３）リポタンパク質リパーゼ；４）アポリポタンパク質Ｅ；５）酸化および／またはアセチル化ＬＤＬ；６）受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）；７）レムナント粒子；８）低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）；９）高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）；１０）ラクトフェリン；１１）組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）；１２）尿素プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）などおよびその受容体結合フラグメント。
【００６５】
本明細書中で使用される、「ＡｐｏＥペプチド」または「ＡｐｏＥのペプチド」は、ＡｐｏＥによって結合した受容体に結合し、且つ本明細書中に記載の機能的効果を媒介するＡｐｏＥの任意のペプチドまたはその機能的変異型をいう。ＡｐｏＥ分子の各イソ型のアミノ酸残基１００〜２００は、公知のＡｐｏＥ受容体結合領域を含む。より詳細には、ＡｐｏＥの受容体結合領域は、ＡｐｏＥ分子の各イソ型（配列番号４および配列番号５）のアミノ酸残基１３０〜１６０内に存在し、より詳細には、アミノ酸残基１４０〜１５５（ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬ）（配列番号１０）内に存在する。例えば、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、「アポリポタンパク質Ｅ：構造−機能の関係」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４を参照のこと。Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４イソ型を定義するアミノ酸交換は、アミノ酸残基１４０〜１５５の領域内で認められないが、アポリポタンパク質分子の構造全体に影響を与えない。ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３分子は、共有結合したホモ二量体を形成するが、ＡｐｏＥ４分子は形成しない。
【００６６】
本明細書中で使用される、用語「ホモ二量体」は、同一の化学組成の２つの分子から構成される分子をいい、用語「ヘテロ二量体」は、異なる化学組成の２つの分子から構成される分子をいう。
【００６７】
本発明者らは、アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号２）を有する九量体を使用した。この９つのアミノ酸配列は、上記で同定されたより大きなＡｐｏＥ受容体結合配列領域内で見出され、ＡｐｏＥのアミノ酸１４１〜１４９位で見出される。本発明者らは、配列番号２の二量体（すなわち、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するペプチド）を構築した。配列番号３のペプチドは、用量依存様式で小グリア細胞活性化を抑制した。単量体（配列番号２の単量体ペプチド）の使用では、小グリア細胞活性化を抑制されなかった（図２を参照のこと）。
【００６８】
本発明者らは、さらに、アミノ酸配列ＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳ ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号６）を有する２０量体を使用した。この２０個のアミノ酸配列は、ＡｐｏＥのアミノ酸１３０〜１４９位で見出され、配列番号２の九量体を含む。配列番号６のペプチドは、用量依存様式で小グリア細胞活性化を抑制した（図４〜７を参照のこと）。
【００６９】
本発明者らは、さらに、ＡｐｏＥのアミノ酸１３３〜１４９位由来のアミノ酸配列ＬＲＶＲＬＡＳ ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１０）を有する１７量体はマウス頭部損傷モデルおよびマウスＬＰＳ誘導性敗血症モデルで保護作用を示すことを示した。このペプチドはまた、初代ラットニューロン／グリア細胞培養物においてＮＭＤＡ興奮毒性を阻害することが示された。
【００７０】
対照的に、Ｃｌａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、１１１４２、１９９５は、アミノ酸１４１〜１５５または１４１〜１４９の二量体ペプチドは共に培養物においてＴリンパ球に対して細胞静止性および細胞傷害性を示すと報告している。Ｃａｒｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５４、７４１、１９９８は、ａｐｏＥ１４１〜１５５ペプチドによりリンパ球の増殖が阻害されると報告している。アミノ酸１４１〜１５５の縦列反復からなるペプチドおよび１４１〜１５５領域を含むより長い単量体ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幼鳥胚由来の神経突起の広範且つ特異的な変性を起こすことが見出された（Ｃｒｕｔｃｈｅｒら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３０、１２０、１９９４）。これらの著者らは、ａｐｏＥに関連するペプチド配列は神経変性過程に直接寄与し、それにより本発明のペプチドを使用して神経保護効果の予期せぬ性質が支持されると示唆した。
【００７１】
本発明のペプチドを、当該分野で公知の標準的技術によって産生することができる。本発明で有用なペプチドには、ＡｐｏＥ ＬＤＬ受容体結合配列（その複数の反復物を含み、二量体および三量体が含まれるがこれらに限定されない）、２つまたはそれ以上のペプチドの抱合体（それぞれ本明細書中に記載のペプチドまたはＬＤＬ受容体結合配列を含むペプチドを含む）を含むペプチドが含まれる。１つのＡｐｏＥ受容体結合配列を、配列番号１に示す。好ましいペプチドは、配列番号２の複数の反復（好ましくは、その二量体）を含むか、これからなる。したがって、本発明で有用な好ましいペプチドは、配列番号３（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬの縦列反復）または配列番号３を含むペプチドである。さらに好ましいペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号１０を含むか、これからなる。
【００７２】
これらのペプチドに関連する機能活性を増強するための本明細書中に開示のペプチドの修飾を、当業者は容易に実施することができる。例えば、アミノ酸１４１〜１５５の線状縦列反復（１４１〜１５５の二量体）のＬＤＬ受容体に結合する能力は、Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３６、８０、１９９５によって研究されていた。一連の修飾ペプチドを構築し、ＬＤＬ結合能について評価した。これらの著者らは、１４５〜１５５または１４４〜１５０の二量体における荷電アミノ末端残基の欠失（ａｒｇ１４２およびｌｙｓ１４３を含む）により、ペプチドのＬＤＬ受容体活性が消滅したと報告している。これらの著者らは、１４１〜１５５二量体のＬＤＬ−受容体結合活性は、１４１〜１５５、１４１〜１５０、１４１〜１５５（ｌｙｓ１４３→ａｌａ）、および１４１〜１５５（ａｒｇ１５０→ａｌａ）二量体ペプチドの両親媒性αヘリックスの親水性表面上に存在する塩基性アミノ酸の少なくとも２つのクラスターに依存すると結論付けている。Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、１５００９、１９９１は、ペプチド１４１〜１５５の自己抱合体および１４１〜１５５の縦列反復からなるペプチドはリンパ球増幅および卵巣アンドロゲン産生の両方を阻害することができると報告している。Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２２８０３、１９９１は、二量体１４１〜１５５縦列ペプチドおよび三量体１４１〜１５５ペプチドのＬＤＬ結合能力を調査した。Ｌｙｓ１４３→Ａｌａ、Ｌｅｕ１４４→Ｐｒｏ、およびＡｒｇ１５０→Ａｌａのアミノ酸置換によって結合が減少した。Ｌａｌａｚａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、３５４２、１９８８は、ＬＤＬ受容体の結合についてＡｐｏＥの変異型を調査した。１３６位、１４０位、１４３位、および１５０位で塩基性残基を中性アミノ酸に置換した場合、結合活性は減少した。ロイシン１４４またはアラニン１５２をプロリンに置換した場合、結合は減少した。しかし、セリン１３９をアルギニンに置換し、ロイシン１４９をアラニンに置換した変異型によって受容体結合がわずかに増強された。
【００７３】
本発明の方法で有用な活性化合物（または「有効成分」）には、小グリア細胞受容体または星状細胞などの周辺の効果細胞上の受容体への結合、それによる小グリア細胞を活性化する分子による小グリア細胞の活性化の予防または抑制における配列番号３のペプチド、および／または配列番号６のペプチド、および／または配列番号１０のペプチドと競合する化合物が含まれる。本発明の方法で有用な化合物には、配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体のアンタゴニストとして作用する化合物も含まれる。この受容体を選択的にターゲティングおよび結合する抗体を、本発明の小グリア細胞活性化のアンタゴニストとして使用することもできる。このような抗体は、配列番号３のペプチド、および／または配列番号６のペプチド、および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体に選択的または特異的に結合する。
【００７４】
配列番号３、配列番号６、配列番号１０のペプチド、またはその立体配座アナログは、本発明の態様である。このような化合物は、水溶液中でグリア細胞上の受容体分子と相互作用してグリア細胞の活性化を遮断するかさもなければ急性または慢性ＣＮＳ損傷またはＬＰＳなどの小グリア細胞の公知のアクチベーターへの曝露と同時に発生する立体配座を有するアミノ酸のコア配列を有するペプチドまたはペプチド模倣物である。別の言い方をすれば、このような化合物を、小グリア細胞の結合について配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドと競合する能力およびＬＰＳなどの公知のアクチベーターによって小グリア細胞の活性化を抑制する能力によって特徴付ける。
【００７５】
本発明の治療ペプチドの別の変形形態は、治療ペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸の１〜５アミノ酸またはアナログの結合である。本発明のペプチドのアナログを、活性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方への１から５個のさらなるアミノ酸の付加によって調製することもでき、このようなアミノ酸の付加は、ペプチドが配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した部位での小グリア細胞に結合する能力に悪影響を与えない。
【００７６】
電荷密度、疎水性、親水性、サイズ、および形状などの物理的性質におけるアミノ酸および他の分子または置換基の公知の類似性によって、ペプチドのアミノ酸配列を変化させることができる。例えば、アミノ酸Ｔｈｒを、Ｓｅｒに置換するかその逆を行うことができ、ＬｅｕをＩｌｅに置換するかその逆を行うことができる。さらに、当業者に公知の質量スクリーニング技術（例えば、配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体で小グリア細胞に結合する化合物のスクリーニング）によってアナログを選択することができる。好ましい交換は、ペプチドのアルギニン含有量を増加させるためのＳｅｒのＡｒｇへの置換であり、例には、配列番号７、配列番号８、または配列番号９からなるかこれらを含むペプチドが含まれる。さらに好ましい交換は、ロイシン１４９のアラニンへの置換である。
【００７７】
本発明のペプチドを、ペプチドが１８アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号３）または配列番号３のペプチドの受容体結合能力を保持するその変異型を含む場合、約２０アミノ酸、約２２アミノ酸、約２４アミノ酸、約２６アミノ酸、約２８アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、または約４０アミノ酸、約２２アミノ酸まで、約２４アミノ酸まで、約２６アミノ酸まで、約２８アミノ酸まで、約３０アミノ酸まで、約３５アミノ酸まで、約４０アミノ酸まで、約４５アミノ酸まで、約５０アミノ酸まで、またはそれ以上の短いペプチドとして特徴付けることもできる。本発明で有用な好ましいペプチドは、配列番号３からなるかこれを含むペプチドである。より長いペプチドを使用する場合、アミノ酸残基１４１〜１４９を直接取り囲むＡｐｏＥ配列由来のアミノ酸配列を組み込んだペプチドが好ましい。１８アミノ酸より長いペプチドを使用する場合、得られたペプチドが小グリア細胞に結合して急性および慢性ＣＮＳ炎症における小グリア細胞の活性化を抑制する能力を維持する限り、実質的に任意の他のアミノ酸配列を含むことができることが意図される。本発明は、ＬＤＬ受容体結合能力を保持することが公知の１４１〜１４９位のＡｐｏＥ配列の変形形態を含む。例えば、Ｌ型アミノ酸の代わりに１つまたは複数のＤ型アミノ酸を使用するか、アシル化またはアミノ化などによるＮ末端またはＣ末端への基の付加によって合成ペプチドをさらに使用することができる。
【００７８】
本発明のペプチドを、ペプチドが９アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号２）または配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドの受容体結合能力を保持するその変異型を含む場合、約１０アミノ酸、約１２アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２２アミノ酸、約２４アミノ酸、２６アミノ酸、２８アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸まで、または４０アミノ酸、約１５アミノ酸まで、約２２アミノ酸まで、約２４アミノ酸まで、約２６アミノ酸まで、約２８アミノ酸まで、約３０アミノ酸まで、約３５アミノ酸まで、約４０アミノ酸まで、約４５アミノ酸まで、約５０アミノ酸まで、またはそれ以上の短いペプチドとして特徴付けることもできる。本発明で有用な好ましいペプチドは、ａｐｏＥ受容体結合領域からなるかこれを含むペプチドであり、特に好ましいペプチドは、配列番号６および／または配列番号１０からなるかこれを含む。より長いペプチドを使用する場合、ａｐｏＥ受容体結合領域内に由来するアミノ酸配列またはａｐｏＥ受容体結合領域を直接取り囲むＡｐｏＥ配列を組み込んだペプチドが好ましいにもかかわらず、得られたペプチドが小グリア細胞に結合して急性および慢性ＣＮＳ炎症における小グリア細胞の活性化を抑制する能力を維持する限り、これらのペプチドは、実質的に任意の他のアミノ酸配列を含むことができることが意図される。本発明は、ＬＤＬ受容体結合能力を保持することが公知の１４１〜１４９位のＡｐｏＥ配列の変形形態を含む。例えば、Ｌ型アミノ酸の代わりに１つまたは複数のＤ型アミノ酸を使用するか、アシル化またはアミノ化などによるＮ末端またはＣ末端への基の付加によって合成ペプチドをさらに使用することができる。
【００７９】
本発明のペプチドには、天然のアミノ酸配列だけでなく、そのアナログ、化学的誘導体、または塩であるペプチドも含まれる。用語「アナログ」または「保存的変形形態」は、本明細書中で同定した治療ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、１つまたは複数のアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドをいう。例えば、グリシンまたはセリンなどの極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に置換することができるか、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換することができるか、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換することができるか、非極性アミノ酸を別の非極性アミノ酸に置換することができる。本明細書中で使用される、用語「アナログ」または「保存的変形形態」はまた、本発明のポリペプチドに１つまたは複数のアミノ酸置換または付加を有するが、ペプチドが本明細書中に記載の小グリア細胞活性化を抑制する能力を保持する場合に、実質的な配列類似性（少なくとも約８５％の配列類似性、好ましくは、少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、またはさらに９９％の配列類似性を有する）を保持するペプチドをいう。
【００８０】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ型立体配座またはＤ型立体配座のいずれかであり得る。本発明の治療ペプチドは、塩が薬学的に許容可能である場合、遊離形態でも塩形態でもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される、用語「被験体の脳に投与する」は、化合物を治療を受ける被験体の中枢神経系組織、特に脳に提供する当該分野で公知の治療経路の使用をいう。
【００８２】
好ましくは、本発明の化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて使用する。したがって、本発明はまた、哺乳動物被験体への投与に適切な医薬組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた有効量の本発明の化合物を含む。キャリアは、組成物が経口投与に適合するような液体または固体（すなわち、経口投与のために処方した錠剤または丸薬）であり得る。さらに、キャリアは、組成物を吸入用に適合させた噴霧可能な液体または固体の形態であり得る。非経口投与する場合、組成物は、発熱物質を含まず、且つ許容可能な非経口キャリア中に存在すべきである。あるいは、活性な化合物を、公知の方法を使用したリポソーム中へのカプセル化形態に処方することができる。さらに、ＣＮＳ病態の治療のためのペプチドの鼻腔内投与が当該分野で公知である（例えば、ＡＤ治療のためのペプチドＴの鼻腔内投与に関するＰｅｒｔに付与された米国特許第５，５６７，６８２号を参照のこと）。（本明細書中で参照された全ての特許書類全体が、本明細書中で参考として援用されることが意図される）。当該分野で公知の技術を使用して、鼻腔内投与のための本発明の化合物を調製することができる。
【００８３】
本発明の化合物の薬学的調製物は、任意選択的に、薬学的に許容可能な希釈剤または賦形剤を含み得る。本発明の敗血症に関連する実施形態のために、開示したペプチドを、当業者に公知の方法を使用して薬学的に許容可能なキャリアと抱合させて血清の半減期を延長することができる。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００８４】
本発明の化合物の有効量は、化合物の非存在下と比較して小グリア細胞の活性化を減少させる量、言い換えれば、化合物の非存在下と比較して小グリア細胞による神経毒性化合物の産生を減少させる量である。有効量（および投与様式）を、個体を基本として決定し、これは、使用される特異的治療分子、被験体の検討材料（サイズ、年齢、身体全体の健康）、治療される病態（ＡＤ、急性頭部外傷、脳炎など）、治療すべき症状の重症度、考えられる結果、使用される特定のキャリアまたは医薬処方物、投与経路、および当業者に明らかな他の要因に基づく。当該分野で公知の技術を使用して当業者が有効量を決定することができる。本明細書中に記載の化合物の治療有効量を、当該分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、動物モデル、または他の用量反応研究を使用して決定することができる。
【００８５】
本発明の化合物を、起こり得る症状の進行の軽減または緩和のために、緊急に（すなわち、脳炎または虚血を引き起こす事象の発生時または直後）投与するか、予防的に（例えば、計画手術前または神経の徴候または症状の発生前）投与するか、変性疾患の過程で投与することができる。投与のタイミングまたは間隔は、被験体の症状によって変化し、数時間から数日、数時間、数日、数週間、またはそれ以上にわたって投与することができ、これを当業者が決定する。
【００８６】
典型的な毎日の処方計画は、約０．０１μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０，０００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００，０００μｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【００８７】
血液脳関門は、血流から種々のＣＮＳ領域に物質を受動拡散する関門を提供する。しかし、一定の薬剤の能動輸送は、いずれかの方向で血液脳関門を通過することが公知である。血流から脳への通過を制限し得る物質を、脳脊髄液に直接注射することができる。脳虚血および炎症はまた、血液脳関門を改変し、血流中の物質の通過を増大させることが公知である。
【００８８】
化合物の脳への直接投与は、当該分野で公知である。髄腔内注射により、薬剤を脳室および脊髄液に直接投与する。薬剤の脊髄液への持続的直接投与を行うために外科的に移植可能な輸液ポンプを利用可能である。医薬化合物の脳脊髄液への注射（「脊髄注射」）を使用した腰椎穿刺は当該分野で公知であり、本発明の化合物の投与に適切である。
【００８９】
親水性化合物の液体可溶性薬物への変換を含む、血液脳関門の回避のための薬理学ベースの手順も当該分野で公知である。活性な薬剤を、脂質小胞またはリポソーム中にカプセル化することができる。
【００９０】
一過性に開いた血液脳関門への高張物質の動脈内注入および脳への親水性薬物の通過は、当該分野で公知である。Ｋｏｚａｒｉｃｈらに付与された米国特許第５，６８６，４１６号は、血液脳関門の透過性を増大させて脳への化合物の送達を増大させるための、受容体媒介透過剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）（ＲＭＰ）ペプチドと脳の間質液区画に送達すべき化合物との同時投与を開示している。静脈内投与または腹腔内投与を使用して、本発明の化合物を投与することもできる。
【００９１】
血液脳関門を通過する活性な薬剤の１つの輸送方法は、血液脳関門を透過して血液脳関門を通過して活性な薬剤を輸送する能力について選択したペプチドまたは非タンパク質部分である第２の分子（「キャリア」）への活性な薬剤の結合または抱合である。適切なキャリアの例には、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体が含まれる。キャリアは、脳内皮細胞中の特定の輸送系を介して脳に侵入する化合物であり得る。血液脳関門を介した受容体媒介トランスサイトーシスによる脳への神経薬理学的因子の送達に適合したキメラペプチドは、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅらに付与された米国特許第４，９０２，５０５号に開示されている。これらのキメラペプチドは、トランスサイトーシスによって血液脳関門を通過することができる輸送可能なペプチドに抱合した医薬品を含む。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅらによって開示された特異的輸送可能ペプチドには、ヒストン、インスリン、およびトランスフェリンなどが含まれる。血液脳関門を通過させるための化合物とキャリア分子との抱合体もまた、Ｐｏｄｕｓｌｏらに付与された米国特許第５，６０４，１９８号に開示されている。開示されている特異的キャリア分子には、ヘモグロビン、リゾチーム、シトクロムｃ、セルロプラスミン、カルモジュリン、ユビキチンおよび物質Ｐが含まれる。Ｂｏｄｏｒに付与された米国特許第５，０１７，５６６号も参照のこと。
【００９２】
本発明のペプチドの別の投与方法を、ペプチドが発現および分泌され、それにより小グリア細胞に利用可能となるように脳細胞に侵入することができる、ペプチドをコードする核酸配列を保有するベクターの被験体への投与によって実施する。適切なベクターは、典型的には、ウイルスベクター（ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およびレトロウイルスが含まれる）である。ベクター送達系を使用して遺伝子治療を行う技術は、当該分野で公知である。ヘルペスウイルスベクターは、本発明の化合物の投与に使用することができる特定のベクター型である。
【００９３】
（スクリーニング法）脳虚血または脳炎における小グリア細胞活性化を予防または軽減する能力について化合物をスクリーニングする方法もまた本明細書中に開示する。このような方法は、活性化小グリア細胞を試験化合物に接触させる工程と、試験化合物が配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドが結合する同一の受容体で小グリア細胞に結合するかどうかを検出する工程とを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞培養物中）で接触工程を行うことができる。競合結合アッセイを使用して、例えば、放射性同位体もしくは蛍光分子などの検出可能な標識または当該分野で公知であり且つ一般的に使用されている任意の他の検出可能な標識と抱合または結合する本発明のペプチドの受容体結合の阻害の検出によって、試験化合物が配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した同一の受容体に結合するかどうかを検出することができる。
【００９４】
小グリア細胞の活性化を抑制する能力についての試験化合物をスクリーニングするさらなる方法は、活性化した小グリア細胞培養物を試験化合物にインキュベーションさせる工程と、小グリア細胞活性化の少なくとも１つのマーカーを測定する工程とを含む。小グリア細胞活性化マーカーの減少（試験化合物の非存在下でのマーカーレベルと比較）は、試験化合物が小グリア細胞の活性化を抑制、予防、または軽減させることができることを示す。小グリア細胞活性化マーカーの例は、一酸化窒素の産生である。
【００９５】
小グリア細胞の活性化を抑制する能力についての試験化合物をスクリーニングするさらなる方法は、小グリア細胞培養物を試験化合物とプレインキュベーションする工程と、小グリア細胞培養物を小グリア細胞を活性化することが公知の化合物とインキュベーションする工程を含む。少なくとも１つの小グリア細胞活性化マーカーを測定し、活性化マーカーの減少（プレインキュベーション工程を行わない場合と比較）は、試験化合物が小グリア細胞の活性化に影響を与えることができることを示す。小グリア細胞活性化マーカーの例は、一酸化窒素の産生である。
【００９６】
（アテローム性動脈硬化症）炎症過程は、アテローム性動脈硬化症の過程の態様を媒介することが公知である。例えば、Ｈａｎｓｓｏｎ１９９４；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９９５；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７を参照のこと。ＡｐｏＥは、（個体のマクロファージによる分泌量は肝臓によって産生されるＡｐｏＥの量と比較してわずかであるにもかかわらず）局所的に血管壁でマクロファージによって分泌されることが公知である。古典的なアテローム性動脈硬化症モデルでは、ＡｐｏＥは、血流からコレステロールを除去し、これをマクロファージまたは肝臓に送達させるように機能する。しかし、血管壁でマクロファージによって分泌されるＡｐｏＥはいかなる脂質代謝効果からも独立してアテローム斑形成を減少させることが明らかとなりつつある。例えば、ＡｐｏＥ欠損マウスは、高コレステロール血症およびアテローム硬化性疾患のモデルとして認められている。このようなマウスへのＡｐｏＥ分泌マクロファージの投与により、アテローム斑形成が劇的に減少する。Ｌｉｎｔｏｎら、１９９５。対照的に、野生型マウスのマクロファージのＡｐｏＥ欠損マクロファージへの置換により、動物が肝臓によるＡｐｏＥの産生を継続していてもアテローム動脈硬化性への変化が加速される。Ｆａｚｉｏら、１９９７。
【００９７】
アテローム性動脈硬化症では、ＡｐｏＥは、受容体媒介事象を介して、血管壁周辺でのマクロファージ活性化を下方制御すると仮定される。マクロファージ活性化のこのような下方制御は、アテローム斑形成に関連する事象のカスケードを遮断または妨害し、それによりアテローム動脈硬化性病変の形成を軽減または遅延させる。アテローム性動脈硬化症に関連することが公知の事象のカスケードには、平滑筋細胞および内皮細胞増殖、および泡沫細胞形成が含まれる。ＡｐｏＥがこれらの各過程を下方制御する証拠が存在する。したがって、ＡｐｏＥは、その脂質に対する影響から独立してｉｎ ｖｉｖｏでのアテローム性動脈硬化症の存在および進行に影響を与える。アテローム性動脈硬化症の進行を、アテローム斑の量もしくはサイズまたはアテローム性動脈硬化症病変によって遮断された血管の割合、またはこのような斑の成長率の測定によって評価することができる。
【００９８】
本発明者らは、ＡｐｏＥはマクロファージにおけるカルシウム媒介シグナルを伝達する（Ｃａ２＋／イノシトール三リン酸シグナル伝達）ことをはじめて証明し、これはＡｐｏＥがマクロファージ活性化の下方制御によってマクロファージ機能を改変し、その後の炎症を改変することを示す。したがって、小グリア細胞およびＣＮＳ疾患に関して本明細書中に記載のペプチド、化合物、方法、および医薬処方物は、アテローム性動脈硬化症を抑制、予防、または遅延するためのマクロファージの活性化の抑制方法で有用である。
【００９９】
アテローム性動脈硬化症は、動脈内膜の肥厚およびアテローム斑中の脂質の蓄積をいう。アテローム性動脈硬化症を治療または予防するための本発明の化合物の投与を、本明細書中で考察した任意の手段および当該分野で公知の他の適切な方法によって行うことができる。アテローム性動脈硬化症の変化を予防、遅延、または治療するために本発明の化合物を使用した場合、血液脳関門を通過させるように化合物を処方する必要が無いことが明らかである。本発明の方法によって治療することができる病態には、冠状動脈、頚動脈などの中枢神経系に供給する動脈、末梢循環または内臓循環の動脈のアテローム性動脈硬化症、および腎動脈疾患が含まれる。非経口投与などの投与は、部位特異的であるか、全身血流への投与であり得る。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明の例示を目的とし、本発明を制限するとい解釈されない。
【実施例１】
【０１０１】
小グリア細胞の一酸化窒素産生：材料と方法
本研究は、小グリア細胞のリポ多糖類（ＬＰＳ）刺激後の亜硝酸塩蓄積によって測定した、小グリア細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生の調節における内因性ａｐｏＥの役割を試験した。
【０１０２】
（培養物の調製および特徴づけ）混合グリア細胞培養物を、以下から調整した：（ａ）野生型（Ｃ５７／Ｂ１６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）幼若マウス、（ｂ）ＡｐｏＥ欠損変異幼若マウス（ＡｐｏＥ欠損マウス）、および（ｃ）ヒトＡｐｏＥを発現するがマウスＡｐｏＥを発現しないトランスジェニック幼若マウス（ＡｐｏＥ３マウス）。トランスジェニックマウスの作製および特徴づけについては、Ｘｕら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、３、２２９、１９９６を参照のこと。混合グリア細胞培養物を、記載のように調製した。ＭｃＭｉｌｌｉａｎ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５８、１３０８、１９９２；Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７６、７０、１９９７を参照のこと。簡単に述べれば、２〜４日齢の幼若マウスから脳を取り出し、膜および血管を除去し、無Ｃａ＋２培地中に機械的に分散させ、遠心分離によって回収した。次いで、２５ｃｍのフラスコあたり１つの脳の細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇｂｃｏ番号１５０７０を含む）にプレートした。混合ニューロン／グリア細胞調製物を、加湿インキュベーターでコンフルエントまで成長させた（３〜５週間）。
【０１０３】
ＡｐｏＥ欠損マウスおよびＡｐｏＥ３マウスから調製した培養物が類似のグリア細胞集団を有することを証明するために小グリア細胞、星状細胞、およびニューロンの比率を定量した。星状細胞およびニューロンの数を評価するために神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；ＳＩＧＭＡ（登録商標）；５００倍希釈）およびτタンパク質（ＳＩＧＭＡ（登録商標）、５００倍希釈）に対する抗体を使用して免疫染色を行い、ペルオキシダーゼ結合Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｆｏｌｉｃａ Ｂ４イソレクチンおよび酢酸ナフチルエステラーゼ染色を使用して小グリア細胞を検出した。Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７６、７０、１９９７。正常なＣＮＳ環境および炎症カスケードに関連するグリア細胞−グリア細胞相互作用に最も密接に近づけるので、混合ニューロン−グリア細胞培養系を使用した。
【０１０４】
星状細胞（αＧＦＡＰ；ＳＩＧＭＡ（登録商標））、ニューロン（ατ；ＳＩＧＭＡ（登録商標））、および小グリア細胞（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｆｏｌｉｃａ Ｂ４イソレクチン；ＳＩＧＭＡ（登録商標））について実施した半定量的ウェスタンブロット分析を使用して類似のグリア細胞集団を確認した。実験終了時に細胞タンパク質を採取し、各サンプル由来の５０μｇタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、タンパク質をナイロンメンブレンに移した。抗血清およびレクチンの非特異的結合を、４％粉乳、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でのメンブレンのプレインキュベーションによってブロックした。メンブレンを、抗体または１μｇ／ｍｌＢ４イソレクチンと一晩インキュベーションした。リン酸緩衝化生理食塩水での強力な洗浄後、結合した抗体またはレクチンを、基質としてジアミノベンジジンを使用したＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって視覚化した。
【０１０５】
（培養物の刺激）この培地で１回細胞を洗浄した後、培養物を無血清培地にプレートし、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））で刺激した。亜硝酸塩アッセイの２４時間および６０時間後にアリコートを分注した。
【０１０６】
（亜硝酸塩の定量）グリース試薬（０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸、１％スルファニルアミド、および２．５％Ｈ３ＰＯ４）での比色反応を使用して定量した亜硝酸塩蓄積の測定によって、ＮＯ産生を評価した。分光測光法によって５７０ｎｍの吸光度を測定した。このアッセイの感度は、約０．５μＭである。
【０１０７】
（統計分析）データを、ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｃｈｅｒＬＳＤ多重範囲検定によって比較した。ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【実施例２】
【０１０８】
小グリア細胞の一酸化窒素産生：結果
（培養物の特徴づけ）ＡｐｏＥ欠損マウス、ＡｐｏＥ３マウス、および野生型マウスから調製した培養物のグリア細胞集団において有意差は認められなかった。培養物は、約７０％星状細胞、１５％小グリア細胞、および１５％ニューロンを含んでいた。野生型マウス、ＡｐｏＥ欠損マウス、およびＡｐｏＥ３マウス由来の細胞調製物の比較により、グリア細胞集団における差は認められなかった。特に、小グリア細胞レベル（ＮＯ産生についての初代効果細胞）は、レクチン結合で検出したところ、３つ全ての培養物集団で類似していた（データ示さず）。
【０１０９】
ＡｐｏＥ欠損マウス培養物は、ＬＰＳ曝露の最初の２４時間に強力な亜硝酸反応を示した。この増強された反応は、コントロール動物由来の小グリア細胞で認められた反応の６倍であった（ｐ＝０．０００１；図１）。マウスａｐｏＥをヒトＡｐｏＥ３に置換したトランスジェニックマウス由来の培養物は、ＬＰＳに対して弱い反応を示すが、野生型動物の反応と有意に異ならなかった（２４時間および６０時間でそれぞれｐ＝０．６４およびｐ＝０．２）。６０時間まで、野生型およびＡｐｏＥトランスジェニックマウス調製物中でＬＰＳの反応における亜硝酸塩の蓄積の増加が認められたが、コントロールと比較して、ａｐｏＥ欠損培養物中の亜硝酸塩の量は依然として有意に多かった（ｐ＝０．０４％；図１）。
【０１１０】
上記の研究は、ＡｐｏＥ欠損混合ニューロン−グリア細胞培養物は、天然のマウスＡｐｏＥ３を発現するマウスから調製したグリア細胞培養物またはヒトＡｐｏＥイソ型を発現する培養物よりもＬＰＳ刺激に異なって反応することを示す。これらの結果は、ＡｐｏＥが損傷に対するＣＮＳ反応の生物学的に関連するメディエーターであることと一致する。これらの研究は、内因性ＡｐｏＥはＬＰＳ刺激一酸化窒素産生のグリア細胞分泌を調整することを証明し、これにより、脳内で産生された内因性ＡｐｏＥの１つの機能は、小グリア細胞反応性を抑制し、それにより急性および慢性損傷に対するＣＮＳ反応を変化させることが示唆される。
【実施例３】
【０１１１】
配列番号３のペプチドによる小グリア細胞活性化の抑制
富化小グリア細胞初代培養物を、上記の実施例１に記載のａｐｏＥ欠損幼若マウスの脳から調製した。小グリア細胞を、リポ多糖類（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激して、実施例１に記載の小グリア細胞を活性化した。活性化小グリア細胞は、炎症性サイトカインおよび一酸化窒素を分泌し、一酸化窒素分泌を、小グリア細胞活性化のマーカーとして本実験で使用した。一酸化窒素産生を、実施例１に記載のように評価した。
【０１１２】
配列番号３のペプチドを、０μＭから１０００μＭの用量範囲で活性化小グリア細胞の培養物に添加した。４８時間後に一酸化窒素分泌の用量依存性減少が認められた（図２）。２ｍＭの用量での配列番号２のペプチドの投与により、一酸化窒素分泌のいかなる明らかな減少も認められなかった（図２）。認められた結果を確立するためのコントロールとして作用する配列番号２の単量体ペプチドは、いかなる非特異的ペプチド効果にも起因しない。
【実施例４】
【０１１３】
マクロファージに対するＡｐｏＥの効果
腹腔マクロファージを使用して、ＡｐｏＥの細胞内シグナル伝達経路を調査した。
【０１１４】
チオグリコール酸誘発腹腔マクロファージを、８週齢のＣ５７−ＢＬ６マウスから採取し、カバーガラス上に４×１０５細胞の密度でプレートし、２．５μＭＦｕｒａ−２／ＡＭで３０分間負荷し、７５μＭカルシウムを含むハンクス緩衝化溶液で洗浄した。５ｎＭヒト組換えａｐｏＥまたはＥ４への曝露後、Ｚｅｉｓｓデジタル顕微鏡によって細胞内カルシウムを測定した。図３Ａに示すように、ＡｐｏＥは、マクロファージ中の細胞内カルシウム動員を引き起こした。１００モル過剰の受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）とのプレインキュベーションにより、この効果は遮断されなかった；ＲＡＰは、ＬＲＰの生理学的アンタゴニストであり、ＬＲＰ機能を遮断する。
【０１１５】
マクロファージも２×１０６細胞／ウェルの密度でプレートし、３Ｈ−ミオイノシトール（８μＣ／ｍ）にて３７℃で１６時間標識し、ヒトＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４（５ｎＭ）に曝露した。コントロール細胞を賦形剤に曝露するが、ＡｐｏＥに曝露しなかった。結果を、図３Ｂに示し、値を、コントロール細胞と比較した処置細胞におけるイノシトール三リン酸の変化の割合として示す。
【０１１６】
腹腔マクロファージのＡｐｏＥへの曝露によって、イノシトール三リン酸の代謝回転に関連する細胞内カルシウムの増加を誘導した（図３Ａおよび３Ｂ）。この結果は、ＡｐｏＥがマクロファージ機能に影響を与えて改変するシグナル伝達経路を開始させることを示す。このデータにより、ＡｐｏＥはマクロファージ活性化および炎症を下方制御することが示唆される；マクロファージ活性化および炎症は、アテローム性動脈硬化症過程に寄与することが公知である。
【実施例５】
【０１１７】
配列番号６のペプチドを使用した小グリア細胞活性化の抑制
アミノ酸１３０〜１４９（配列番号６）を含むａｐｏＥの受容体結合領域由来の２０アミノ酸ペプチドを、当該分野で公知の方法に従って調製した。
【０１１８】
初代マウス小グリア細胞培養物を、実施例１に記載のようにａｐｏＥ欠損幼若マウスから調製した。いくつかの培養物では、小グリア細胞を、実施例１に記載のようにリポ多糖類（１００ｎｇ／ｍｌ）で活性化した。
【０１１９】
配列番号６のペプチドを、０μＭ（コントロール）、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの投薬量で活性化および非活性化小グリア細胞の培養物に添加した（図４）。ペプチドの各投薬量レベルを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；円形）と組み合わせて試験した。ＴＮＦαの産生を、ペプチド添加から２４時間後に測定した。各用量のペプチドの使用によって（コントロール培養物と比較して）活性化小グリア細胞によるＴＮＦα産生の減少が認められた（図４、円形）。図４のデータを、各用量で少なくとも三連で示し、エラーバーは、標準誤差を示す。
【０１２０】
これらの結果は、配列番号６のペプチドは活性化グリア細胞からのサイトカインの放出を抑制することを示す。
【実施例６】
【０１２１】
配列番号６のペプチドの細胞傷害性
配列番号６のペプチドの中毒作用を調査した。実施例５に記載の活性化（ＬＰＳ）および非活性化小グリア細胞の培養物を使用した。配列番号６を有するペプチドを、０μＭ（コントロール）、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの量で細胞培養物に添加し、各投薬量レベルのペプチドを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて試験した。次いで、ペプチド添加から２４時間後の光学密度によって、細胞生存度を測定した。
【０１２２】
図５に示すように、光学密度は、０μＭおよび１０μＭのペプチドを投与した培養物でほぼ同一であったが、１００μＭまたは１０００μＭを投与した培養物で減少した。実施例５の結果とあわせたこれらの結果は、非毒性濃度の配列番号６のペプチドはグリア細胞サイトカイン放出の抑制に十分であることを示す。
【実施例７】
【０１２３】
グリア細胞サイトカインの抑制および配列番号６のペプチドの細胞傷害性
０μＭ（コントロール）、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭのペプチド用量を使用して、実施例５および６に記載の実験を繰り返した。各投薬量レベルのペプチドを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；円形）と組み合わせて試験した。ペプチド投与から２４時間後にＴＮＦαの産生を測定し、結果を図６に示す。細胞生存度を評価するために、細胞培養物の光学密度も測定した（２４時間）；結果を図７に示す。
【０１２４】
これらの結果は、たった１μＭのペプチドを投与した細胞培養物で小グリア細胞のサイトカイン放出が抑制されるが、より用量の多いペプチドを投与した培養物のみで細胞傷害性が認められたことを示す。実施例５〜７の結果は、ａｐｏＥの受容体結合領域を含む非毒性濃度のペプチドは活性化小グリア細胞からのサイトカイン放出を抑制することができることを示す。
【実施例８】
【０１２５】
局所虚血のｉｎ ｖｉｖｏ処置
局所虚血再灌流のマウスモデルを使用して、ａｐｏＥ ＬＤＬ受容体領域を含む小治療ペプチド（３０アミノ酸長未満）の髄腔内、静脈内、または腹腔内投与の効果を評価する。１つのこのようなペプチドは、配列番号６を有する。
【０１２６】
当該分野で公知の技術にしたがって、野生型マウスを中大脳動脈閉塞および再灌流に供する（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）。１つのマウス群（野生型コントロール）には大脳動脈閉塞後に処置を施さず、類似の群（野生型処置群）では、各マウスに治療ペプチドを髄腔内、腹腔内、または静脈内に注射する。最初の指針として上記のｉｎ ｖｉｔｒｏデータを使用して、種々の用量で治療ペプチドを注射することができる。
【０１２７】
再灌流後の所定の時間で（例えば、再灌流の２４時間後）各動物を神経学的に評価する（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）。神経学的試験後、各マウスを麻酔し、屠殺し、脳を切り出して染色し、梗塞体積を測定する。神経学的予後および梗塞サイズを、コントロール群と処置群との間で比較する。
【０１２８】
ａｐｏＥ欠損マウスを使用して、上記試験を繰り返すことができる。
【実施例９】
【０１２９】
全脳虚血のｉｎ ｖｉｖｏ処置
全脳虚血の２匹の血管梗塞モデルから適合した全脳虚血のマウスモデルを使用して、ａｐｏＥ ＬＤＬ受容体領域を含む小治療ペプチド（３０アミノ酸長未満）の髄腔内投与の効果を評価する。１つのこのようなペプチドは、配列番号６のペプチドを有する。
【０１３０】
野生型マウス（２１±１ｇ）を一晩絶食させ、ハロタンまたは別の適切な麻酔薬で麻酔し、挿管し、機械的に通気する。右内頚静脈および大腿動脈にカニューレを挿入する。頭蓋骨膜温度を、３７．０℃に保持する。頚動脈を閉塞し、０．３ｍｇ動脈内トリメタファンおよび静脈貧血を使用して平均動脈圧を３５ｍｍＨｇに減少させる。１０分後、虚血を逆転させる。コントロールマウスにはさらなる処置を施さず、試験マウスには治療ペプチドを、髄腔内、静脈内、または腹腔内に注射する。指針として本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏデータを使用して、種々の用量のペプチドを注射することができる。
【０１３１】
公知の神経学的試験手順（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）を使用して、所定の時間で（例えば、再灌流後１、３、または５日）各動物を神経学的に評価する。神経学的評価後、各動物を麻酔し、屠殺し、当該分野で公知の方法を使用して脳損傷を評価する。例えば、脳は、ｉｎ ｓｉｔｕで灌流固定し、切り出し、染色し、例えば、海馬のＣＡ１領域の損傷を同定するために光学顕微鏡で試験し、視覚可能および視覚不可能なニューロンを計数し、比較する。
【０１３２】
神経学的予後および脳損傷を、コントロール群と治療群との間で比較する。
【実施例１０】
【０１３３】
アポリポタンパク質ＥおよびＡｐｏＥ模倣ペプチドは、マクロファージにおけるカルシウム依存性シグナル伝達反応を開始させる
この実施例は、ａｐｏＥにより、イノシトール三リン酸産生の増大後の細胞内Ｃａ２＋貯蔵物の動員に関連するマウスの腹腔マクロファージのシグナル伝達カスケードが開始されることを示す。受容体結合タンパク質およびＮｉ２＋との前処置によって、このカスケードを阻害した。百日咳毒素感受性Ｇタンパク質によって、シグナル伝達が媒介された。これらは、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体に結合するリガンドを介して誘導されるシグナル伝達の特性である。ａｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドにより、インタクトなタンパク質と同一の様式でシグナル伝達が開始された。交差脱感作の存在により、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドは、同一の結合部位で競合することが示唆される。放射性標識ａｐｏＥ模倣ペプチドはインタクトなタンパク質と受容体結合について競合するという本発明の所見によってこれを確認した。これらのデータは、ＡｐｏＥ依存性シグナル伝達がこのリポタンパク質の免疫調整特性を媒介することを示す。
【０１３４】
（材料と方法）（材料）醸造用のチオグリコール酸ブロスを、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から購入した。ＲＰＭＩ培地１６４０、ウシ胎児血清、ハンクス平衡塩溶液、および他の細胞培養試薬を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、百日咳毒素、およびＨＥＰＥＳを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｆｕｒａ−２ＡＭおよびＢＡＰＴＡ／ＡＭを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。Ｍｙｏ−［２−３Ｈ］イノシトール（比活性１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、Ａｍｅｒｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＲＡＰｃＤＮＡを含むプラスミドは、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｈｅｒｚ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ、Ｄａｌｌａｓ ＴＸ）から贈呈された。以前に記載のようにＲＡＰ産生のために使用した［２１］。ヒト組換えａｐｏＥ２を、Ｐａｎｖｅｒａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判断したところ、調製物は内毒度を含まず、均一であった。［３Ｈ］チミジン（比活性７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびヨウ素１２５（比活性４４０ｍＣｉ／ｍｇ）を、Ａｍｅｒｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。アミノ末端にチロシンを含むか含まない２０アミノ酸のＡｐｏＥ模倣ペプチド（Ａｃ−ＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミド）ならびに同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチドを、ＱＣＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ、ＭＡ）によって純度９５％に合成した。全アミノ末端をアセチル化し、全カルボキシ末端をアミド部分でブロックした。滅菌等張リン酸緩衝化生理食塩水中で、ペプチドを再構成した。同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチドも合成した。使用した全ての他の試薬は、市販されているもので最高の品質であった。
【０１３５】
（マクロファージ採取）動物を含む全実験を、所内動物実験委員会によって最初に承認を受けた。無病原体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび以前にＣ５７ＢＬ／６系統に１０回戻し交配しているＡｐｏＥ欠損マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から入手した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび３．５ｍＭ ＮａＨＣＯ３を含む１０ｍｌの氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＨＢＳＳ）（ｐＨ７．４）を使用した腹腔洗浄法によって、チオグリコール酸誘発腹腔マクロファージを採取した。４℃、約８００×ｇで１０分間の遠心分離によってマクロファージをペレット化し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２．５Ｕ／ｍｌペニシリン、６．５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。細胞生存度を、トリパンブルー排除法で決定し、これは一貫して９５％を超えていた。
【０１３６】
（受容体結合研究）マクロファージを、４８ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に２．５×１０５細胞／ウェルでプレートし、加湿した５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃で３時間インキュベーションした。次いで、プレートを４℃に冷却し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５％ＢＳＡを含む氷冷ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）（結合緩衝液）での３回連続リンスによって非結合細胞を除去した。１２５Ｉ−ａｐｏＥ模倣ペプチドの直接結合を定量するために、種々の量の放射性標識ペプチドを、２００倍モル過剰の非標識ペプチドの存在下および非存在下で各ウェルに添加した。過剰な非標識ペプチドの非存在下で結合した１２５Ｉ−ａｐｏＥペプチドの量（全結合）から過剰な非標識ペプチドの存在下で結合した１２５Ｉ−ａｐｏＥペプチドの量（非特異的結合）を引くことによって、細胞への特異的結合を同定した。競合研究のために、５０ｎＭの放射性標識ペプチドを、種々の量（３１．２５ｎＭ〜４Ｍ）の非標識ＡｐｏＥ２またはＲＡＰの存在下または非存在下で各ウェルに添加した。次いで、細胞を、４℃で１２〜１６時間インキュベーションした。非結合リガンドを、ウェルから除去し、細胞の単層を氷冷結合緩衝液で３回リンスした。次いで、細胞を、１Ｍ ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳと室温で５時間より多く可溶性にし、各ウェルの内容物を、ポリスチレンチューブに添加し、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、ＣｌｉｎｉＧａｍｍａ１２７２カウンタ（Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数した。
【０１３７】
（ａｐｏＥおよびペプチド処置マクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの測定）Ｆｕｒａ−２／ＡＭ処置単細胞の［Ｃａ２＋］ｉレベルの変化を、公知の技術にしたがってデジタル画像顕微鏡を使用して定量した。マクロファージを、３５ｍｍのペトリ皿中のカバーガラスに１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレートし、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２時間接着させた。非接着細胞を吸引し、単層をＨＨＢＳＳで２回洗浄した。４μＭのＦｕｒａ−２／ＡＭを、細胞と室温の暗所で３０分間インキュベーションし、その後、公知の技術にしたがってデジタル画像顕微鏡を使用して［Ｃａ２＋］ｉを測定した。５分間でベースラインを得た後、リガンド（ａｐｏＥ、ａｐｏＥ模倣ペプチド、またはスクランブルペプチド）を添加し、複数の［Ｃａ２＋］ｉ基準を得た。シグナル伝達がリガンドのＬＲＰへのライゲーションに起因するかどうかを決定するために、細胞を１０００倍モル過剰のＲＡＰまたは１０ｍＭ ＮｉＣｌ２（共にＬＲＰへのリガンド結合を阻害する）と共にａｐｏＥまたはペプチドでの刺激前に５分間プレインキュベーションを行った。Ｇタンパク質の関与を評価する実験で、単層を１μｇ／ｍｌの百日咳毒素と３７℃で１２時間インキュベートし、上記のようにＣａ２＋基準を得た。
【０１３８】
（ａｐｏＥ処置マクロファージにおけるＩＰ３の測定および百日咳毒素の効果）種々の実験条件下でのミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識マクロファージ中のＩＰ３の形成を、公知の技術にしたがって定量した。マクロファージを、６ウェルプレート（４×１０６細胞／ウェル）にプレートし、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２時間接着させた。単細胞から培地を吸引し、０．２５％ＢＳＡおよびミオ−［２−３Ｈ］イノシトール（比活性１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに添加した。細胞を、３７℃でさらに１６〜１８時間インキュベートした。単層を、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＬｉＣｌを含む２５ｍＭ ＨＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）で３回リンスした。体積０．５ｍｌのこの溶液を、各ウェルに添加し、細胞を、３７℃で３分間プレインキュベーションを行い、その後リガンドで刺激した。リガンドを含む培地の吸引および６．２５％過塩素酸の添加によって、反応を停止させた。細胞を、ウェルから掻き取り、１ｍｌのオクチルアミン／Ｆｒｅｏｎ（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含むチューブに移し、４℃、５６００×ｇで２０分間遠心分離した。上相の溶液を、１ｍｌＤｏｗｅｘ樹脂カラム（ＡＧ１−Ｘ８ギ酸；Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に適用し、０．１Ｍギ酸を含むＨ２Ｏ、５０、２００、４００、８００、および１２００ｍＭギ酸アンモニウムを使用したバッチで連続的に溶離した［２６］。放射能を測定するための液体シンチレーションカウンターにアリコートを配置することによって、放射能を測定した。Ｇタンパク共役受容体の活性化およびホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）加水分解の百日咳毒素感受性を評価するために、上記のように細胞をプレートし、４０ｍＭ ＤＴＴにて３０℃で２０分間予備活性化した１μｇ／ｍｌ百日咳毒素とインキュベートした。ＩＰ３形成に対する効果を、上記のように測定した。
【０１３９】
（受容体上の結合部位についてのａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの競合）これらのリガンドが同一の受容体に結合するかを決定するために、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドでの刺激時のマクロファージ［Ｃａ２＋］ｉの変化を研究した。Ｆｕｒａ−２／ＡＭ負荷マクロファージを一晩インキュベートし、カバーガラスにプレートし、第１のリガンドで刺激し、［Ｃａ２＋］ｉの変化を定量した。次いで、細胞を、第２のリガンドで刺激し、Ｃａ２＋測定を繰り返した。
【０１４０】
（結果）（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥの効果）遊離細胞質Ｃａ２＋濃度の調整は、遍在シグナル伝達反応である。多数の細胞型では、原形質膜受容体へのリガンドの結合は、膜結合ホスホリパーゼＣによってＰＩＰ２の加水分解が活性化されて、ＩＰ３を生成する。ＩＰ３は、Ｃａ２＋チャネルでもあるコグネイト受容体への結合によって小胞体からＣａ２＋を放出させる。非興奮性細胞では、［Ｃａ２＋］ｉシグナル伝達は、細胞内Ｃａ２＋貯蔵物からのＣａ２＋放出およびＣａ２＋流入の両方に関連する。ヒト組換えａｐｏＥでのマクロファージの処置により、緩衝液で処理したマクロファージと比較して、［Ｃａ２＋］ｉレベルが２〜４倍に増加した（図８Ａ）。非刺激細胞およびａｐｏＥ処置細胞における典型的な実験［Ｃａ２＋］ｉレベルは、それぞれ９５．３３±７．３７ｎＭおよび１８０．２５±１４．５７ｎＭであった。ＡｐｏＥでの刺激時の［Ｃａ２＋］ｉの増加が、試験した細胞の７０〜８０％で認められた。ａｐｏＥ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ増加は、外因性、非同期性且つ振動性または持続性であった。マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのＡｐｏＥ誘導増加は、用量依存性であった（図８Ｂ）。マクロファージによって分泌された天然のａｐｏＥにより外因性ヒト組換えａｐｏＥに対する応答が変化する可能性に取り組むために、ａｐｏＥ欠損マウスから調製したマクロファージを使用してこれらの実験を繰り返した。ａｐｏＥでの刺激後のカルシウム応答は、野生型マクロファージおよびａｐｏＥ欠損マウス由来のマクロファージで同一であった（データ示さず）。
【０１４１】
（ａｐｏＥ誘導性ＩＰ３合成に対する百日咳毒素の効果）ａｐｏＥへのミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識マクロファージの曝露によって、ＩＰ３レベルが１．５〜２．０倍に増加した（図９Ａ）。この効果は、用量依存性であった（図９Ｂ）。百日咳毒素でのマクロファージの前処置により、ＩＰ３のこの増加が完全に消滅した（図９Ａ）。これらの研究は、ａｐｏＥ刺激細胞における膜ＰＩＰ２のホスホリパーゼＣ触媒加水分解は百日咳感受性Ｇタンパク質と関連することを証明している。
【０１４２】
（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのＡｐｏＥ誘導増加は、Ｎｉ２＋およびＲＡＰによって減少する）以前の研究で、ＡｐｏＥがＬＲＰに結合して内在化することが証明された。さらに、ラクトフェリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、リポタンパク質リパーゼ、およびトロンボスポンジンのＬＲＰへの結合により、セカンドメッセンジャーの生成に関与するシグナル伝達カスケードを開始させる。ＬＲＰがａｐｏＥによって誘導されたシグナルカスケードに関与する可能性を調査するために、マクロファージをＲＡＰおよびＮｉ２＋とプレインキュベーションを行い、その後ａｐｏＥ２またはａｐｏＥ２模倣ペプチドで刺激した。ＲＡＰは、全ての公知のリガンドのＬＲＰへの結合を遮断する３９ｋＤａのタンパク質である。Ｎｉ２＋もまた、リガンドのＬＲＰとの相互作用を遮断する。ＲＡＰおよびＮｉ２＋の両方とのプレインキュベーションにより、その後のａｐｏＥへの曝露に関連する［Ｃａ２＋］ｉ増加が顕著に減少する（データ示さず）。これらの結果は、ａｐｏＥはＬＲＰとの特異的相互作用を介してシグナル伝達カスケードを誘導するという仮説と一致する。百日咳毒素でのマクロファージの前処置もまた、ＡｐｏＥ依存性Ｃａ２＋応答を顕著に減少させ、これは、ａｐｏＥによって誘導されたシグナル伝達が百日咳毒素感受性Ｇタンパク質に共役することを示す。これは、ＬＲＰ依存性シグナル伝達の公知の性質と一致する。
【０１４３】
（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥ模倣ペプチドの効果）ａｐｏＥ受容体結合領域の残基１３０〜１４９由来のペプチドでのマクロファージの刺激により、［Ｃａ２＋］ｉが２〜３倍に増加する一方で、同一のサイズおよび組成のスクランブルコントロールペプチドでは効果が無かった（データ示さず）。この［Ｃａ２＋］ｉの増加は、試験した細胞の約６０〜７０％で認められた。ａｐｏＥ応答と同様に、マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのペプチド誘導増加は、外因性且つ非同性であった。これらの結果は、インタクトなａｐｏＥおよびａｐｏＥ受容体結合領域由来のペプチドの両方により、シグナル伝達カスケードの開始と一致する［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘導することを証明する。しかし、モル濃度ベースでは、インタクトなａｐｏＥと比較して、［Ｃａ２＋］ｉ応答を得るためにより高濃度のペプチドが必要であった。この相違は、ペプチドとａｐｏＥとの間の受容体親和性の相違（インタクトなタンパク質の効果をペプチドリガンドの効果と比較した場合に一般的に認められる性質）に起因するようである。
【０１４４】
（［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの反復刺激効果）受容体ライゲーションに対する［Ｃａ２＋］ｉの結果の変化の定量による、ａｐｏＥとその模倣ペプチドの間の受容体上の結合部位についての競合の可能性を評価した。ａｐｏＥへの反復曝露後、［Ｃａ２＋］ｉが顕著に減少し、タキフィラキシーが示唆される（データ示さず）。ヒト組換えａｐｏＥへの最初の曝露に関連する［Ｃａ２＋］ｉの増加後、その後のペプチド曝露に対する［Ｃａ２＋］ｉ応答が顕著に減少した（データ示さず）。同様に、ペプチドへの最初の曝露後にａｐｏＥ添加に対する［Ｃａ２＋］ｉ応答が喪失した（データ示さず）。スクランブルペプチドの曝露によってカルシウム応答の脱感作は認められなかった（データ示さず）。この認められたタキフィラキシーにより、受容体リガンドに対する二次的な受容体脱感作が示唆され、これはインタクトなａｐｏＥタンパク質および２０残基のペプチドの両方が同一の受容体に結合するという仮説と一致する。
【０１４５】
（考察）本実施例の主な所見は、以下である：１）ヒト組換えａｐｏＥ（ｐＭからｎＭの濃度）のマクロファージ細胞表面上の受容体への結合により、［Ｃａ２＋］ｉおよびＩＰ３の増加に関連するシグナル伝達事象が開始されること、２）ａｐｏＥの受容体結合領域由来の２０残基ペプチドによりマクロファージ［Ｃａ２＋］ｉの変化は同一であるが、スクランブルコントロールペプチドでは異なること、３）［Ｃａ２＋］ｉおよびＩＰ３の変化は特異的且つ用量依存性であること、４）細胞ＩＰ３のａｐｏＥ誘導増加は百日咳毒素感受性であること、および５）［Ｃａ２＋］ｉの変化がＲＡＰおよびＮｉ２＋によって遮断されること。さらに、酵素脱感作の存在に基づいて、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドは同一の受容体に結合するようである。
【実施例１１】
【０１４６】
アポリポタンパク質Ｅ模倣ペプチドは、マウス頭部外傷モデルで保護性を示す
本実施例は、頭部外傷後の１７アミノ酸ａｐｏＥ模倣ペプチド（アミノ酸１３３〜１４９を含むＡｐｏＥのフラグメント）の静脈内投与の保護効果を証明する。
【０１４７】
マウスに気管内挿管し、酸素部分圧３０％での１．６％イソフルレンでその肺を機械的に通気した。マウスに、ニューマティックインパクターによって６．８ｍ／ｓのスピードで正中線に沿って閉鎖性頭部外傷を負わせた。閉塞性頭部外傷から３０分後、マウスを無作為に３つの群に分けた（ｎ＝１６マウス／群：高用量ペプチド群（４０６μｇ／ｋｇ）、低用量ペプチド群（２０３μｇ／ｋｇ）、および生理食塩水コントロール溶液群）。全てのペプチド溶液を、滅菌等張生理食塩水（１００μｌ）中で調製し、尾静脈注射によって静脈内投与した。外傷後５日間連続して回転棒時間（ｒｏｔｏｒｏｄ ｔｉｍｅ）および重量を測定した。２１日目に、モリス水迷路の隠されたプラットフォームを見出すための学習能力を試験した。
【０１４８】
外傷前は回転棒潜伏時間（ｌａｔｅｎｃｙ）および重量は、全ての動物で類似していた。外傷後、生理食塩水注射動物は回転棒試験で顕著な障害が認められ、これは体重減少に関連していた。高用量ペプチドおよびより狭い範囲の低用量ペプチドにより、この運動障害から動物が保護され（図１０Ａ）、体重減少が同時に起こっていた（図１０ｂ）。単回用量のペプチドのこの保護効果は、外傷後５日間持続した（ｐ＜０．０５、３回反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【０１４９】
さらに、ペプチドは、モリス水迷路における隠されたプラットフォーム（図１０ｃ）を見出すための学習障害を保護するようであった（ｐ＜０．０５、３回反復測定ＡＮＯＶＡ）。ペプチドでの治療により、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析で証明されるように、ペプチドでの処置により急性（ａｃｕｔｅ）生存率も有意に改善された（図１０ｄ）。
【０１５０】
前述の実施例は、本発明を例示するが、制限と解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲、本明細書中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって説明される。
【実施例１２】
【０１５１】
初代ラットニューロン／グリア細胞培養物におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸興奮毒性に対するアポリポタンパク質Ｅ模倣ペプチドの保護効果
本発明者らは、ａｐｏＥが虚血に対する脳の応答を改変する役割を果たす１つの機構がグルタミン酸興奮毒性からの保護によるという仮説を立てた。グルタミン酸は、虚血環境における神経損傷に寄与すると考えられている。異なるクラスのグルタミン酸活性化チャネルのうち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の特異的活性化は、主にカルシウム流入および種々のニューロン型におけるニューロン損傷の悪化の媒介を担うと考えられている（ＭｅｌｄｒｕｍおよびＧａｒｔｈｗａｉｔｅ、１９９０）。
【０１５２】
脳虚血の実験環境におけるＡｐｏＥのｉｎ ｖｉｖｏ効果をモデル化するために、ＮＭＤＡに曝露した初代ラット新皮質ニューロンおよびグリア細胞の細胞培養モデルにおける天然のヒトＡｐｏＥおよびＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドの生物学的に関連する濃度の効果を試験した。インタクトなＡｐｏＥは、ＮＭＤＡ誘導細胞傷害性を最も穏やかに用量依存性に減少させた。比較すると、１７残基のＡｐｏＥ模倣ペプチドでは天然のＡｐｏＥと比較して神経保護を増強し、ＮＭＤＡ曝露に関連するカルシウム流入および細胞死の両方を完全に遮断した。ペプチドのアミノ末端のさらなる短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性からの神経保護の喪失が進行した。これらの結果により、ＡｐｏＥは、グルタミン酸毒性からの細胞の保護による脳傷害後の虚血損傷からニューロン細胞の回復に影響を与えることが示唆される。さらに、脳虚血ならびにグルタミン酸毒性に関連する他の疾患および傷害後の治療ストラテジーとしてのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用が意図される。
【０１５３】
（実験手順）全動物の手順を、動物の不快感および数を最少にするようにデザインし、Ｄｕｋｅ大学の所内動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１５４】
（初代ニューロン−グリア細胞培養物の調製）初代ニューロン−グリア細胞培養物を、以前に記載のように（Ｐｅａｒｌｓｔｅｉｎら、１９９８）、妊娠１８日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎児の脳から調製した。１０〜１５匹の幼若ラットから脳を採取し、解剖学的目印（ｌａｎｄｍａｒｋ）を使用して、髄膜および皮質下組織から皮質を分離するように切り出した。皮質をプールし、０．２５％トリプシンを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を補足した緩衝化塩溶液中で２ｍｍ３に刻んだ。組織を、３７℃の５％ＣＯ２／９５％室温雰囲気下で２０分間インキュベートし、１５ｍＭグルコース、５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ）、および１％ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む氷冷無グルタミン最小必須培地（ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した。組織片を、火造り（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）の９インチパスツールピペット（直径０．７ｍｍ）での粉砕によって分散させた。得られた懸濁液を、５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を破棄し、ペレットを成長培地（１５ｍＭグルコース、５％ウシ胎児血清、および５％ウマ血清で補足したＭＥＭ）に再懸濁した。分散させた細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコートした２４ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）中のウェルあたり４×１０５細胞を使用して、コンフルエントな単層が得られるようにプレートした。培養物を、使用前に３７℃の加湿５％ＣＯ２／９５％室温雰囲気で１３〜１６日間静置したままにした。このプロトコールにしたがって調製した培養物は、ＮＦ−１６０および神経膠線維酸性タンパク質についての免疫組織学的染色によって同定したところ（Ｋｕｄｏら、２００１）、５４％のニューロンおよび４６％のグリア細胞を含むことが見出された。
【０１５５】
（ＡｐｏＥ−ペプチドの合成）ＱＣＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）に純度９５％のペプチドを合成させ、滅菌等張リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で再構成した。各ペプチドについて、アミノ末端をアセチル化し、カルボキシ末端をアミド部分でブロックした。１７残基親ペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）（配列番号１０）は、ａｐｏＥの受容体結合領域に由来した。同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチド（Ａｃ−ＬＡＲＫＬＲＳＲＬＶＨＬＲＬＫＬＲ−アミド）（配列番号１４）を、同様に作製した。親（１３３〜１４９）（配列番号１２）ペプチドのアミノ末端の漸増的短縮によって、１４残基の配列（１３６〜１４９）および１１残基の配列（１３９〜１４９）（配列番号１１）を作製した。
【０１５６】
（ＮＭＤＡへの曝露／細胞傷害性の評価）成熟培養物（ｉｎ ｖｉｔｒｏで１３〜１６日）を、ＮＭＤＡの添加前に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）および１．８ｍＭＣａＣｌ２を含む無Ｍｇ２＋緩衝化塩溶液（ＢＳＳ）で洗浄した。ＮＭＤＡ曝露後、培養物を、３７℃の５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で３０分間保持した。次いで、ＮＭＤＡを含む培地を除去し、２０ｍＭグルコースを補足したＭＥＭで置換した。培養物をインキュベーターに２４時間戻した。全ての実験において、下記のように培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定により、ＮＭＤＡへの曝露から２４時間後に細胞損傷を評価した。非競合性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＭＫ−８０１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ Ｉｎｓ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１０μＭの濃度で正のコントロールとして使用した。用量依存性予備研究を実施して、本研究で使用される最大付近のＬＤＨ放出（ＥＤ９０）に必要なＮＭＤＡ濃度（１００μＭ）を決定した。
【０１５７】
（ＮＭＤＡ毒性に対するａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの効果の評価）１００μＭ ＮＭＤＡ誘導性ＬＤＨ放出に対するヒト組換えａｐｏＥ（Ｐａｎｖｅｒｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の効果を評価し、用量反応曲線を得た（ａｐｏＥ：最終濃度０．１〜１０μＭ）。ＡｐｏＥ３（最も一般的なヒトイソ型）を、３０分前に培養物に添加し、ＮＭＤＡ曝露前に除去した。次いで、ＮＭＤＡ（１００Ｍまたは３００Ｍ）誘導性ＬＤＨ放出に対するａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の効果を評価し、以下の条件の１つの下で同時に処置した姉妹培養物の個別の組における用量反応曲線を得た：（１）ＮＭＤＡの曝露直前に培養物に種々の用量のペプチド（最終濃度０．３Ｍ、１μＭ、３μＭ、６μＭ、１０μＭ）を添加し、曝露終了後に除去した；（２）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露；（３）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露なし；（４）ペプチドなし、１０μＭのＭＫ−８０１で３０分間のＮＭＤＡ曝露。ＮＭＤＡ誘導ＬＤＨ放出に対するスクランブルコントロールペプチドの効果を、同様に評価した。
【０１５８】
ＮＭＤＡ誘導ＬＤＨ放出に対するａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の投与時間の効果を、以下の条件の１つの下で同時に処置した姉妹培養物の個別の組において評価した：（１）ＮＭＤＡ曝露の２４時間前に培養培地にペプチドを添加し、曝露直前に除去する；（２）ＮＭＤＡ曝露の直前にペプチドを添加し、曝露終了時に除去した；（３）３０分のＮＭＤＡ曝露の直後にペプチドを添加した；（４）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露；（５）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露なし。全ての場合において、ペプチド濃度は６μＭであり、培養物を、上記のように１００μＭのＮＭＤＡに３７℃で３０分間曝露し、処置／曝露効果をＮＭＤＡ曝露から２４時間後に試験した。
【０１５９】
（ＬＤＨ放出の測定）損傷細胞によって重複培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）量の測定によって、細胞傷害性ストレスの２４時間後に細胞損傷を定量的に評価した。以前に記載の方法（Ａｍａｄｏｒら、１９６３）の修正形態によってＬＤＨ活性を同定した。簡単に述べれば、２００μｌの培養培地サンプルを、２４℃で１０ｍＭ乳酸および５μｍｏｌのＮＡＤを２．７５ｍｌの５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．２）中に含むポリスチレンキュベットに添加した。キュベット由来の蛍光シグナル（３４０ｎｍ励起、４５０ｎｍ発光）の一時的変化の線形最小二乗法曲線フィットを使用して計算したＮＡＤの還元初速度からＬＤＨ活性を同定し、酵素活性単位（１分あたりに乳酸をピルビン酸に変換する量（ｎｍｏｌ））で示した。蛍光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＬＳ５０Ｂ；Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅａｋ ＧｍｂＨ、Ｕｂｅｒｌｉｎｇｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって分析を行った。
【０１６０】
（細胞カルシウム取り込みに対するペプチドの効果）細胞外空間からの細胞カルシウム取り込みを、４５ＣａＣｌ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して評価した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む無Ｍｇ２＋ＢＳＳでの培養物の洗浄後、６μＭペプチド、または１０μＭ ＭＫ−８０１を１００μＭ ＮＭＤＡ曝露前に各ウェルに添加し、曝露終了時に除去した。４５Ｃａ（０．２８μＣｉ／ｍｌ、０．９μＣｉ／ウェル）を、ＮＭＤＡ曝露の直前に各ウェルに添加した。培養物を、インキュベーターに戻し、３７℃で維持した。２０分後、曝露培地を除去し、各ウェルを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を含む氷冷無Ｍｇ２＋ＢＳＳで３回洗浄した。次いで、細胞を、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加によって溶菌した。各ウェル由来のアリコートを、１０ｍｌＣｙｔｏｓｃｉｎｔ（商標）（ＩＣＮ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ＣＡ）を含む液体シンチレーションバイアルに添加し、シンチレーションカウンティングによって放射能を同定し、細胞数を正規化した。
【０１６１】
（円偏光二色性）光路長１ｍｍの石英キュベットを使用したＡｖｉｖ Ｍｏｄｅｌ ２０２ＣＤ分光計によって円偏光二色性スペクトルを記録した。ＰＢＳ緩衝液中のペプチド濃度は、約５０μＭであった。２７３Ｋでスペクトルを取った。サンプルは、５０μＭのペプチドを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、４℃でスペクトルを記録した。以前に記載の式（Ｍｙｅｒｓら、１９９７）を使用して、２２２ｎｍでのシグナルかららせん度（ｈｅｌｉｃｉｔｙ）％を計算した。ロックフェラー（Ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ）大学のタンパク質／ＤＮＡテクノロジーセンターで行った定量的アミノ酸分析によって、ペプチドストック溶液の濃度を同定した。
【０１６２】
（結果）ＡｐｏＥの脳虚血の実験的組織培養モデルにおけるグルタミン酸興奮毒性から細胞を保護する能力を調査するために、初代ラットニューロン／グリア細胞培養物を、ＮＭＤＡへの細胞の曝露前にヒト組換えＡｐｏＥとプレインキュベーションを行った。本発明者らの研究所で以前に行った実験では、初代げっ歯類ニューロン／グリア培養物におけるＮＭＤＡ誘導興奮毒性に対するヒト組換えＡｐｏＥの効果に特異的なイソ型を検出できなかった（Ａｏｎｏら、２００２）。このために、ＡｐｏＥ３（最も一般的なイソ型）（Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３）を、本明細書中に記載の全ての実験で使用した。
【０１６３】
ＮＭＤＡ誘導細胞損傷に対するＡｐｏＥ３の用量反応を同定するために、初代培養物を、最初に、１００μＭ ＮＭＤＡでの曝露前に種々の濃度のａｐｏＥ３と３０分間プレインキュベーションを行った（図１１）。培地への損傷細胞によって放出されたＬＤＨ量の測定によって興奮毒性ストレスから２４時間後に細胞損傷を評価した（ＬＤＨ放出＝１分あたりに乳酸をピルビン酸に変換する量（ｎｍｏｌ）；実験手順を参照のこと）。培養物のＮＭＤＡのみへの曝露により、コントロール非処置細胞（１．０１＋／−０．０６；ｐ＜０．０５）と比較してＬＤＨ放出が有意に増加した（２．８２＋／−０．１９）。培養物のａｐｏＥとのプレインキュベーションにより、ＮＭＤＡのみと比較して１〜１０μＭの濃度のＡｐｏＥで有意である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定）、穏やかな用量依存性のＬＤＨ放出の減少が認められた。したがって、ＡｐｏＥ３は、初代ラットニューロン／グリア培地にグルタミン酸興奮毒性に対する穏やかであるが有意な神経保護を付与する。
【０１６４】
小ＡｐｏＥ模倣ペプチドが同様にＮＭＤＡ興奮毒性からニューロン／グリア細胞培養物を保護するという仮説を試験するために、ａｐｏＥの受容体結合領域由来の３つの短縮ａｐｏＥペプチドのパネルを作製した（図１２Ａ；ＡｐｏＥ１３３〜１４９、１３６〜１４９、１３９〜１４９）。ペプチドの構造特性およびヘリックス含有量を評価するために、最初に、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行った（図１２Ｂ）。３つのペプチドのＣＤスペクトルは、２２２ｎｍおよび２０８ｎｍでの有意な最小値によって証明される有機なヘリックス構造が証明された。これらのデータから、３つのペプチドが、類似のらせん度を有する（溶液中に１２〜１４％のヘリックス集団を含む）ことが計算された。本発明者らの研究所で行われた以前の沈降平衡実験では、これらのペプチドは溶液中で単量体として存在することが証明されており、これは、認められたヘリックス構造はヘリックスオリゴマーへのペプチドの自己会合に起因しないことを示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。
【０１６５】
初代ニューロン／グリア細胞培養物におけるＮＭＤＡ誘導細胞損傷に対するペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の効果を最初に調査した（図１３）。このペプチドは、以前に本発明者らのグループによって、マウス小グリア細胞機能を調整することができる生物活性を有することが示された（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。初代ラットニューロン／グリア細胞培養物を、最初に、ＮＭＤＡ曝露の３０分前にＡｐｏＥ（１３３〜１４９）とプレインキュベーションを行い、２４時間後にＬＤＨ放出を評価した。培養物のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の非存在下での１００μＭ ＮＭＤＡへの曝露により、非曝露コントロール細胞（０．８８＋／−０．１０；ｐ＜０．０５）と比較してＬＤＨ放出が２倍に増加した（１．７４＋／−０．０６）（図３Ａ）。穏やかにしか保護しないインタクトなＡｐｏＥと対照的に、１７残基のＡｐｏＥペプチドの添加により、１００μＭ ＮＭＤＡ毒性に対して強力な用量依存性保護を示した。
【０１６６】
６μＭ ａｐｏＥ（１３３〜１４９）で認められた最大保護（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定）を有する３μｍＡｐｏＥ（１３３〜１４９）ペプチド濃度を使用して、グルタミン酸毒性からの保護が最初に認められた。予想されるように、スクランブルコントロールペプチドの存在下では保護は認められなかった。驚いたことに、培養物を３００μＭ ＮＭＤＡに曝露した場合、ａｐｏＥ（１３３〜１４９）での培養物の処置では、いかなるペプチド濃度でも細胞を保護できなかった（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＡｐｏＥの受容体結合ドメイン由来の１７アミノ酸残基を含むＡｐｏＥ模倣ペプチドは、ＮＭＤＡ誘導興奮毒性後に神経保護性を示すことを証明する。さらに、このペプチドはインタクトホロタンパク質よりも培養物に保護を付与した。
【０１６７】
本発明者らの初代培養系における神経保護を必要とするペプチドドメインをさらに定義するために、ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対する短縮ＡｐｏＥペプチドの効果を比較した（図１４）。１７残基のペプチドからの３つのアミノ末端残基の除去により、ＡｐｏＥ（１３６〜１４９）（１４アミノ酸ペプチド）が得られた（図１２Ａ）。６μＭ ＡｐｏＥ（１３６〜１４９）での処置により、１００μＭ ＮＭＤＡ誘導性細胞死を完全に遮断する１７残基の親ペプチド（ＡｐｏＥ（１３３〜１４９））と比較してＮＭＤＡ毒性からの穏やかな保護が付与された（図１４）。対照的に、３つのさらなるアミノ末端残基の欠失により、検出可能な生物活性を保有しない１１残基のペプチド（ＡｐｏＥ（１３９〜１４９））が得られた（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。これらの結果は、１７残基のペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）のアミノ末端からの短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性に対する神経保護が段階的に喪失し、アミノ酸ドメインＡｐｏＥ（１３３〜１３６）は、ＡｐｏＥペプチドの生物活性の保持に必要であることを示す。
【０１６８】
親ＡｐｏＥ模倣ペプチドがＮＭＤＡ曝露に関するカルシウム流入の調整によってその保護効果を発揮するかどうかを調査するために、細胞のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）および１００μＭ ＮＭＤＡとのインキュベーション後のカルシウム取り込みを測定した（図１５）。培養物の４５Ｃａ＋＋への曝露から２０分後にカルシウム取り込みを測定した（実験手順を参照のこと）。ＮＭＤＡの非存在下での培養物の６μＭ ＡｐｏＥへの曝露をコントロールとして使用し、カルシウム流入に対する直接的効果は認められなかった（図１５）。ペプチドの非存在下での１００μＭ ＮＭＤＡへの培養物の曝露により、カルシウム流入が誘導され、これは、１０μＭ ＭＫ−８０１との前処置によって完全に逆になった（図１５）。６μＭ ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）での処置により、ＮＭＤＡのみと比較してカルシウム流入が有意に減少するが、６μＭスクランブルコントロールペプチドでの処置ではカルシウム流入に対する効果はなかった（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。したがって、ａｐｏＥの受容体結合ドメイン由来の１７残基のペプチドは、ＮＭＤＡ誘導興奮毒性に関連するカルシウム流入の副作用から細胞を保護することができる。
【０１６９】
次に、ＡｐｏＥ模倣ペプチドの投与とＮＭＤＡ曝露後の保護との間の一過性の関係を試験することを所望した。この目的のために、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）を、ＮＭＤＡ曝露の２４時間前、ＮＭＤＡと同時、またはＮＭＤＡ曝露後に細胞に添加した（図１６；実験手順を参照のこと）。既に述べたように、１００μＭ ＮＭＤＡと同時に６μＭ ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）を投与した場合に強い保護が認められた（図１６）。ＮＭＤＡ曝露の２４時間前の培養物のペプチドとの前処置により、穏やかであるが有意な保護が得られるが、ＮＭＤＡ曝露後のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の添加により保護は認められなかった。したがって、ＮＭＤＡ曝露の２４時間前に添加した場合にＡｐｏＥ（１３３〜１４９）は穏やかな保護が得られるにもかかわらず、ペプチドの同時投与により最良の保護が認められた（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。まとめると、これらの結果は、ＡｐｏＥ残基１３３〜１４９から構成される単量体ペプチドは脳虚血の実験的組織培養モデルにおいてグルタミン酸興奮毒性から細胞を保護することができることを証明する。
【０１７０】
（Ｃ．考察）本研究では、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチド配列が脳虚血の組織培養モデルにおいてＮＭＤＡ媒介ニューロン興奮毒性からの保護効果を発揮することが証明される。ＡｐｏＥペプチドのこの神経保護効果は、特異的且つ用量依存性であった。６μＭの濃度では、１７残基ペプチドであるＡｐｏＥ（１３３〜１４９）は、初代ニューロン−グリア細胞培養物の１００μＭ ＮＭＤＡの曝露に関連する神経毒性およびカルシウム流入を、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１ほど完全に遮断した。
【０１７１】
ａｐｏＥ遺伝子型がイソ型特異的様式で神経の回復に影響を与えることを示す複数の臨床報告が存在するにもかかわらず、これが起こる機構の定義は不十分なままである。内因性ａｐｏＥは、酸化ストレス（ＭｉｙａｔａおよびＳｍｉｔｈ、１９９６）、直接神経栄養効果の発揮（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、１９９５）、ＣＮＳ炎症反応の下方制御（Ｌｙｎｃｈら、２００１）、または脳アミロイド沈着の促進による病理学的シャペロンとしての作用（ＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ、１９９２）によって損傷に対するＣＮＳ応答に影響を与え得ることが提案されている。本報告では、インタクトなＡｐｏＥタンパク質もＮＭＤＡ誘導毒性に対して穏やかな程度の神経保護を付与することを見出した。これは、インタクトなＡｐｏＥタンパク質からいかなる神経保護効果も証明できなかった他の最近の研究と対照的である（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。これらの不一致の結果は、方法および実験デザインの相違に一部起因し得る。例えば、Ｌｅｎｄｏｎらは、５μｇ／ｍｌ濃度のＡｐｏＥでは、これ自体でＮＭＤＡ誘導神経毒性に対して穏やかな利点を付与するＨＤＬのみを超えるさらなる神経保護を証明できないことを見出した。不運なことに、この研究では、ＡｐｏＥのみでの結果を研究していなかった（Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。Ｊｏｒｄａｎらはまた、ＮＭＤＡ誘導神経毒性モデルにおいてＡｐｏＥからの保護を証明できなかった。しかし、これらの実験では、ヒト組換えＡｐｏＥよりもむしろならし培地由来のＡｐｏＥを使用し、本研究での３０分間と比較してＡｐｏＥをＮＭＤＡ曝露の５日前にプレインキュベーションしていることに注目すべきである。
【０１７２】
本発明者らの結果により、生物学的に関連する濃度のＡｐｏＥは、興奮毒性細胞死に対して穏やかな程度の神経保護を付与することが示唆される。興味深いことに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドはインタクトなホロタンパク質よりもさらにより強力な神経保護効果を発揮し、１００μＭ ＮＭＤＡへの新皮質ニューロンの曝露に関連する細胞死およびカルシウム流入を完全に遮断した。本発明者らの所見についての１つの説明は、ＡｐｏＥおよびペプチドフラグメントがＮＭＤＡ受容体に結合することである。ＮＭＤＡ受容体の競合性アンタゴニストがより高い興奮毒性負荷でのペプチドの神経保護の損失を説明することができるにもかかわらず、ＮＭＤＡ受容体での競合では、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ由来のペプチドフラグメントを決して証明されない。
【０１７３】
別のもっともらしい説明は、インタクトなＡｐｏＥホロタンパク質と同一の様式での特異的細胞表面受容体との相互作用によって、これらのペプチドが、ＮＭＤＡ毒性に対する生物活性を間接的に発揮するということである。ＡｐｏＥは、細胞表面受容体ファミリー（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＲＰ／α２Ｍ、ＥＲ−２、およびＬＲ８受容体が含まれる）に結合することが公知である（Ｋｉｍら、１９９６；Ｎｏｖａｋら、１９９６）。ＬＤＬ受容体との相互作用に重要なＡｐｏＥの１つの領域は、残基１４０と１６０との間に存在し（Ｍａｈｌｅｙ、１９８８）、この領域の部位特異的変異誘発研究により、電荷および立体配座に影響を与える変異により結合が欠如し得ることが証明されている（Ｌａｌａｚａｒ、１９８８）。本発明者らは、以前に、本研究で使用したものと同一の受容体結合領域由来のペプチドがＡｐｏＥと受容体結合を競合することを証明した（Ｍｉｓｒａら、２００１）。実際、ＡｐｏＥは、ニューロンおよびマクロファージの両方のシグナル伝達カスケードを開始させることが証明されている（Ｍｉｓｒａら、２００１；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。
【０１７４】
最近の報告で、ＬＲＰ受容体がＮＭＤＡ受容体によって媒介されるカルシウムシグナル伝達応答を開始することができることが証明されている（Ｂａｃｓｋａｉら、２０００）。これが起こる正確な機構は定義されないままであるにもかかわらず、著者らは、リガンド結合およびＬＲＰ受容体の二量体化後にＮＭＤＡ活性を調整するニューロン特異的細胞内アダプタータンパク質の存在を推測しており、これがＮＭＤＡ受容体から下流で保護応答を誘導することができると推測している。興味深いことに、最近の所見により、公知の全てのＬＲＰ相互作用を遮断する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の存在は、ＮＭＤＡ興奮毒性の細胞培養パラダイムにおいてＡｐｏＥの神経保護効果を逆転しないことが示唆されている（Ａｏｎｏら、２００２）。
【０１７５】
天然のホロタンパク質では、受容体結合領域は、αヘリックス立体配座で存在する。本発明者らの研究で使用したペプチドフラグメントがこの構造を選択することができることを確認するために、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行った。３つの各試験ペプチドは、溶液中で有意にヘリックス集団を有していた（約１２〜１４％）。さらに、これらのペプチドは、溶液中で単量体として振る舞い、任意のヘリックス構造はペプチド固有のものであり、ヘリックスオリゴマーへの自己会合に起因しない（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。本発明者らの結果は、遊離ペプチドが、受容体結合時に安定となり得るヘリックス立体配座をとることができるという可能性と一致する。
【０１７６】
明らかに、機能的（ａｐｏＥ１３３〜１４９；ａｐｏＥ１３６〜１４９）および非機能的（ａｐｏＥ１３９〜１４９）ペプチドは共に類似のらせん度を有するので、らせん度は生物活性の唯一の決定要因ではない。したがって、これらのＡｐｏＥ模倣ペプチドの神経保護効果はまた、特異的なアミノ酸配列およびサイズに依存するようである。特に、ａｐｏＥ受容体結合領域の残基１３３〜１４９由来の１７アミノ酸ペプチドはＮＭＤＡ曝露の毒性を完全に遮断するが、１４アミノペプチド（ａｐｏＥ１３６〜１４９）では有効性が減少し、１１アミノ酸配列（ａｐｅＥ１３９〜１４９）ではこれに関する生物活性は全て喪失していた。これにより、残基１３３〜１３９は生物活性に重要であることが示唆される。興味深いことに、このドメインは、グリア細胞活性化の下方制御に必要なドメインと同一である（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。
【０１７７】
本研究で使用したペプチドは受容体結合領域に由来し、異なるヒトａｐｏＥイソ型に関連する多型領域である残基１１２および１５８を含まないことは注目に値する。したがって、本研究はａｐｏＥイソ型とヒト疾患との間の関連に直接取り組んでいないが、受容体結合領域から離れたアミノ酸の置換がこの領域の立体配座およびその後のａｐｏＥ受容体相互作用に影響を与え得ることが確実なようである。例えば、１５８位のアルギニンのシステインの置換により、この多型が受容体結合領域の外側に存在している場合でさえも、ＡｐｏＥ２がＬＤＬ受容体に結合する能力が顕著に減少する（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら、１９８２）。
【０１７８】
本発明者らの結果は、ＡｐｏＥペプチドフラグメントが神経損傷を引き起こし得ることを最近示唆した他のグループの報告と対照的である。例えば、最近、ＡｐｏＥのカルボキシル末端短縮形態が、おそらく細胞内プロセシングの結果として、ＡＤ患者の脳内に存在することが証明されている。これらのフラグメントは、培養ニューロンにおいて生物活性を示し、細胞骨格タンパク質と相互作用して神経原線維変化に類似する封入体を誘導することができる（Ｈｕａｎｇら、２００１）。
【０１７９】
ＡｐｏＥタンパク質由来のペプチドがＮＭＤＡ誘導興奮毒性に対する神経保護を付与することができるという本発明者らの所見もまた、他の最近の所見と対照的である。これらの研究の大部分は、ａｐｏＥの受容体結合領域由来の縦列反復を使用していた。特に、残基１４１〜１４９の縦列反復から構成される１８アミノ酸ペプチドは、細胞内Ｃａ２＋を増加させ、２つの異なる機構（細胞表面Ｃａ２＋チャネルの活性化および百日咳毒素感受性経路を介した細胞内Ｃ２＋貯蔵物（ｓｔｏｒｅｓ）の放出）を介したτリン酸化を調節する（ＷａｎｇおよびＧｒｕｅｎｓｔｅｉｎ、１９９７）。残基１４１〜１４９の縦列反復から構成されるペプチドを使用して、Ｔｏｌａｒらは、初代海馬ニューロンのこのペプチドへの曝露によりニューロン細胞死（ＭＫ−８０１とのプレインキュベーションによって遮断される効果）が誘導されことを証明した（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。これらの結果により、縦列反復ペプチドへの曝露が、直接または間接的機構によってＮＭＤＡ誘導興奮毒性を増幅させるということが予想される。しかし、この縦列反復ペプチドは、本研究で使用したペプチドと実質的に異なることは価値のあることである。最近の報告（Ｍｏｕｌｄｅｒら、１９９９）で、この縦列反復によって誘導されたニューロン細胞死はホロタンパク質によって誘導されるニューロン細胞死と異なる機構を介して起こり得ることが認められ、この縦列反復はインタクトなＡｐｏＥタンパク質の生物学的に関連するモデルではないかもしれないと示唆される。
【０１８０】
まとめると、本発明者らは、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来の小ペプチドが初代新皮質培養物のＮＭＤＡへの曝露に関連するカルシウム流入および神経毒性を遮断することを報告する。これらの所見のｉｎ ｖｉｖｏでの妥当性は、ＡｐｏＥが虚血および出血性脳卒中ならびに心肺バイパスおよび心停止後蘇生に関連する全脳低灌流からの神経の回復を調整するようであるという臨床所見と一致する。これらのペプチドで認められる神経保護がインタクトなＡｐｏＥタンパク質への曝露後認められる穏やかな利点よりも高いにもかかわらず、これらの所見により、内因性ＡｐｏＥが虚血損傷の回復に影響を与えることができる１つの機構はグルタミン酸興奮毒性からの保護によることが示唆される。これらのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用は、治療と密接にかかわり、虚血または外傷を負った脳内のこのタンパク質の神経生物学にさらなる洞察を与える。
【実施例１３】
【０１８１】
ＡｐｏＥ模倣ペプチドによるＬＰＳ誘導ＴＮＦαおよびＩＬ−６産生の抑制
敗血症ショックは、集中治療室での最も一般的な死因であり、有意に対処されていない医学上の難問である。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性敗血症の主なメディエーターであり、ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインの上方制御は、敗血症に関連する全身性炎症反応の媒介で重要な役割を果たす。ＬＰＳの静脈内投与は、グラム陰性敗血症ショックの一般的な動物モデルであり、臨床的に関連する全身性炎症反応を複製する。特に、ＬＰＳの静脈内投与により、全身性炎症の媒介で重要な役割を果たすマクロファージ由来サイトカインであるＴＮＦαおよびＩＬ−６が初期に上方制御される。
【０１８２】
本発明者らは、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の注射によりＬＰＳ投与後ＴＮＦαおよびＩＬ−５の血清レベルが抑制されることを証明する。これらの方法では、１４〜１６週齢の雄Ｃ５７−ＢＬ６マウスに、尾静脈を介してＬＰＳ（１５０μｌ滅菌等張生理食塩水中１１．２５μ含まれる、すなわち３７５μｇ／ｋｇ）を注射し、その直後に賦形剤（等張滅菌生理食塩水）またはＡｐｏＥ（１３３〜１４９）（２００μｌ用量、１００μｌ、または６．６ｍｇ／ｋｇ（等張生理食塩水で調製））を注射した。ＬＰＳ＋賦形剤群およびＬＰＳ＋ペプチド群（ｎ＝１０動物／群）から以下の測定点における血清サンプルを得た：注射後０（注射前）、１時間、３時間、および２４時間。心臓を介した（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ）穿刺によって採血し、３０分間凝血させた。１６，０００ｇで５分間の遠心分離後に得た血清サンプルを、固相ＥＬＩＳＡによって、ＴＮＦαおよびＩＬ−６についてスクリーニングした。測定点あたり２０匹存在した。
【０１８３】
１時間の注射後、血清ＴＮＦαは、動物がＬＰＳ＋賦形剤またはＬＰＳ＋ａｐｏＥペプチドを投与されたかどうかの関数として有意に減少した（図１７Ａ）。３時間およびベースラインで、ＴＮＦαレベルは測定不可能であった。注射から１時間および３時間後で、血清ＩＬ−６レベルは、動物がＬＰＳ＋賦形剤またはＬＰＳ＋ａｐｏＥペプチドを投与されたかどうかの関数として有意に減少した（図１７Ｂ）。２４時間およびベースラインで、ＩＬ−６レベルは測定不可能であった。このデータにより、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）はＬＰＳの存在下でＴＮＦαおよびＩＬ−６産生を抑制することが明らかとなり、したがって、ＡｐｏＥ模倣ペプチドは初期敗血症患者の薬物使用状況で治療潜在性を有し得ることが示唆される。
【０１８４】
（参考文献）
本明細書中で引用された全ての引例および特許書類は、その全体が本明細書中で参考として援用され、以下の文献が含まれるが、これらに限定されない。
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【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
本出願は、１９９８年３月１１日出願の米国特許仮出願第６０／０７７，５５１号（現在放棄されている）の利益を主張する、１９９９年３月１日出願の米国特許出願第０９／２６０，４３０号（現在放棄されている）の一部継続出願である、２００１年９月２１日出願の米国特許出願第０９／９５７，９０９号の一部継続出願である。これらの出願の開示全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府援助）
本発明は、ＮＩＨ助成金ＮＳ３６８０８７−０１Ａ２、Ｋ０８ＮＳ０１９４９、およびＲＯ３ ＡＧ１６５０７−０１の政府援助の下で行なわれた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）中の小グリア細胞の活性化を抑制する方法、グリア細胞または小グリア細胞の活性化を軽減または抑制する方法、脳虚血または脳炎症の神経学的影響を緩和または治療する方法、小グリア細胞受容体に結合して小グリア細胞の活性化を予防または軽減する化合物の投与によってＣＮＳに影響を与える特異的疾患と戦う方法、および小グリア細胞の活性化を予防または軽減する能力について化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、グルタミン酸興奮毒性およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）曝露に関する神経細胞死の抑制方法ならびに敗血症で認められるような全身炎症性反応の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
中枢神経系（ＣＮＳ）は、長い間、相対的免疫特権部位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ）であると考えられている。しかし、急性および慢性神経疾患におけるＣＮＳ組織損傷はＣＮＳ炎症反応によって媒介され得ると認識されつつある。ＣＮＳ炎症反応は、主に、炎症性サイトカインによって媒介される。
【０００５】
小グリア細胞は、中枢神経系における主な免疫担当細胞である。小グリア細胞は、単球／マクロファージ系統細胞と形態学的、免疫表現型的、および機能的に関連する（Ｇｅｈｒｍｅｎｎら、１９９５）。急性ＣＮＳ損傷ならびにＨＩＶ脳症、癲癇、およびアルツハイマー病（ＡＤ）などの慢性病態は、小グリア細胞活性と関連する（ＭｃＧｅｅｒら、１９９３；ＲｏｔｈｗｅｌｌおよびＲｅｌｔｏｎ、１９９３；Ｇｉｕｌｉａｎら、１９９６；Ｓｈｅｎｇら、１９９４）。小グリア細胞活性により、一酸化窒素（ＮＯ）および他のフリーラジカル種が産生され、プロテアーゼ、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαが含まれる）、およびＮＭＤＡ受容体を介して作用する神経毒素（Ｇｉｕｌｉａｎら、１９９６）が放出される。小グリア細胞の活性化を、亜硝酸塩（一酸化窒素形成の安定な産生物）産生の測定によって評価することができる（ＢａｒｇｅｒおよびＨａｒｍｏｎ、１９９７）。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、コレステロール代謝に関与し、免疫調整性を有することも報告されている。例えば、ＡｐｏＥは、リンパ球増殖の抑制およびマイトジェン攻撃誘発後の免疫グロブリン合成を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調整効果を有することが証明されている（Ａｖｉｌａら、１９８２；ＥｄｇｉｎｇｔｏｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ、１９８１）。末梢神経損傷後のマクロファージならびにＣＮＳ損傷後の星状細胞および乏突起膠細胞（グリア細胞）によってＡｐｏＥが大量に分泌される（Ｓｔｏｌｌら、１９８９；ＳｔｏｌｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ、１９８６）。しかし、ＡｐｏＥがグリア細胞活性化およびＣＮＳ損傷で作用する役割については、議論の余地がある。
【０００７】
ＡｐｏＥの大部分は肝臓で産生される。しかし、そのサイズが大きいために、ＡｐｏＥは容易に血液脳関門を通過しない。実際、肝臓移植後、末梢ＡｐｏＥ表現型はドナー肝臓のそれに変化するが、ＣＳＦ（脳脊髄液）のＡｐｏＥ表現型は変化しないままである（Ｌｉｎｔｏｎら、１９９１）。したがって、神経系内に局在するＡｐｏＥは、周囲で産生されたタンパク質から離れたプールを示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１、１月）。
【０００８】
ＡｐｏＥは、公知の配列を有する２９９アミノ酸脂質担持タンパク質である（Ｒａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、４１７４、１９８２；ＭｃＬｅａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９、６４９８、１９８４）。ヒトＡｐｏＥの完全な遺伝子も配列決定されている（Ｐａｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、３４４５、１９８５）。少なくとも１０種由来のＡｐｏＥ配列が決定されており、アミノ末端よびカルボキシ末端以外は種間で高い保存度を示す。Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４。
【０００９】
ヒトＡｐｏＥは、３つの主なイソ型（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４）が見出されており、これらのイソ型は、１１２位および１５８位でのアミノ酸置換によって異なる。最も一般的なイソ型は、残基１１２にシステイン、残基１５８にアルギニンを含むＡｐｏＥ３であり、ＡｐｏＥ２は最も少ないイソ型であって、残基１１２および１５８にシステインを含み、ＡｐｏＥ４は残基１１２および１５８にアルギニンを含む。ヒトＡｐｏＥのさらに稀な配列変異も公知である（例えば、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４、２６８〜２６９ページを参照のこと）。
【００１０】
ＡｐｏＥは、２つの異なる機能ドメイン（１０ｋＤａのカルボキシル末端および２２ｋＤａのアミノ末端）を有する（Ｗｅｔｔｅｒａｕら、１９８８）。カルボキシ末端は、脂質に高い親和性を示し、コレステロール輸送におけるＡｐｏＥの役割を媒介する。アミノ末端は、受容体結合領域を含む４つの逆平行αヘリックスから構成される（Ｗｅｉｓｂａｒｇｅｒら、１９８３；Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙら、１９８３）。ＡｐｏＥは、細胞表面受容体ファミリー（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＲＰ／α２Ｍ、ＥＲ−２、ＬＲ８受容体、ＡｐｏＥ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）、およびメガリン／ｇｐ３３０が含まれる）に結合することが公知である（Ｋｉｍら、１９９６；Ｎｏｖａｋら、１９９６；Ｖｅｉｎｂｅｒｇｓら、２００１）。アポリポタンパク質ＥとＬＤＬ受容体との相互作用は、リポタンパク質代謝において重要である。ＡｐｏＥのＬＤＬ受容体結合活性の研究では、典型的にはリン脂質と複合体化する。無脂質状態で本質的に不活性なタンパク質が記載されている（Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙら、１９７９）。
【００１１】
ＬＤＬ受容体との相互作用に重要なＡｐｏＥの１つの領域は、残基１４０と１６０との間に存在し（Ｍａｈｌｅｙ、１９８８）、この領域の部位特異的変異誘発研究により、電荷および立体配座に影響を与える変異により結合が欠如し得ることが証明されている（Ｌａｌａｚａｒ、１９８８）。ＡｐｏＥの受容体結合領域（すなわち、アミノ酸残基１３５〜１６０）は、アルギニンおよびリジンを含む塩基性アミノ酸に富む。ＡｐｏＥ−ＬＤＬ受容体結合に対する効果についてＡｐｏＥの受容体結合領域における種々のアミノ酸置換が研究されている。残基１３６、１４２、１４５、および１４６でのアルギニンまたはリジンの中性残基への置換により、正常なＡｐｏＥ結合活性が減少した（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、１９８８）。ＡｐｏＥの受容体結合領域内の塩基性残基置換により、ＬＤＬ受容体結合は完全に破壊されず、これにより、この相互作用には残基は重要でないことが示唆される。活性な結合立体配座中の受容体結合領域を維持するためにＬＤＬ結合領域外にＡｐｏＥ領域が必要であると仮定されている（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、１９９４）。Ｄｙｅｒら（１９９１）は、ＡｐｏＥの残基１４１〜１５５を含む無脂質合成ペプチドフラグメント（この配列の二量体ペプチド）を研究した。このペプチドの単量体では結合活性は認められなかったが、二量体では低レベルの結合が認められた（約１％のＬＤＬ活性）。
【００１２】
ＡｐｏＥに結合する受容体は、高配列類似性領域を有する。スカベンジャー受容体は、小グリア細胞上に存在し、アセチル化および酸化ＬＤＬに結合することが好ましいことが公知である。スカベンジャー受容体は、炎症（酸化）条件下で特に関連し得る。スカベンジャー受容体はまた、損傷後の小グリア細胞で上方制御されることが公知である（Ｂｅｌｌら、１９９４）。
【００１３】
ＬＲＰ受容体は、マクロファージ上に存在することが公知である。概要として、リポタンパク質リパーゼによる修飾およびアポリポタンパク質の結合後、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）およびキロミクロンが残存し、受容体媒介機構によって肝臓でクリアランスされる。低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体と異なることが認識されているにもかかわらず、レムナント受容体はまたＡｐｏＥに高い親和性を示し、組み込まれたＡｐｏＥ部分を介してレムナント粒子を認識する。１９８８年に、このレムナント受容体がクローン化され、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（すなわち、「ＬＲＰ」）と名づけられた。
【００１４】
ＬＲＰは巨大な受容体であり、４５２５アミノ酸一次配列を有し、ＬＤＬ受容体ファミリーの他のメンバーと多数の類似の構造を有する。ＬＤＬ受容体のように、ＬＲＰの細胞外ドメインには、受容体由来のリガンドの酸依存性解離に関与すると考えられているシステイン富化リガンド結合ドメインおよびＥＧＦ前駆体相同ドメインが含まれる。しかし、ＬＤＬ受容体と異なり、Ｏ並び（Ｏ−ｌｉｎｅｄ）の糖ドメインは、膜に隣接する細胞外部分に存在しない。ＬＤＬ受容体ファミリーの全メンバーと同様に、ＬＲＰは、膜貫通タンパク質であり、１つの膜貫通セグメントによって固定されている。タンパク質の細胞質テールは１００アミノ酸であり（ＬＤＬレセプターよりも約２倍長い）、ターゲティングコート−ピット媒介エンドサイトーシスに必要であると考えられているＮＰｘＹモチーフを含む（ＫｒｉｅｇｅｒおよびＨｅｒｚ、１９９４；Ｍｉｓｒａら、１９９４）。
【００１５】
脂質結合に加えて、ＡｐｏＥはまた、マクロファージ由来サイトカイン産生の誘導によってグラム陰性敗血症を媒介する内毒素であるリポ多糖類（ＬＰＳ）に結合する。これらのサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６が含まれる）は、最終的に疾患を誘導する代謝および生理学的変化を担う（Ｗａａｇｅら、１９８７；Ｃｈｅｎｓｕｅら、１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６）。ＡｐｏＥは、結合ＬＳＰをマクロファージから不活化された場合の胆汁への続くＬＰＳ分泌を媒介する肝臓実質細胞に再指向する（Ｈａｒｒｉｓら、１９９３；Ｈａｒｒｉｓら、１９９８）。したがって、マクロファージの活性化は減少し、炎症性メディエータ産生が低下する。
【００１６】
Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら（Ｊｕｎｅ、１９９７）は、ａｐｏＥ欠損マウス由来の混合神経−グリア細胞培養物をリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激した実験を記載していた。細胞培養物のａｐｏＥとのプレインキュベーションにより用量依存性様式でＴＮＦαのグリア細胞分泌が遮断されることが見出された。より最近では、Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎらは、ＡｐｏＥの致死量のＬＰＳとの同時投与によりＬＰＳ誘導死からマウスが保護されたことを証明した（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎら、２００１）。Ｒｅｎｓｅｎらは、ａｐｏＥのアルギニン残基に対する正電荷の選択的消滅によってＡｐｏＥへのＬＰＳの結合が大いに減少してｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳの挙動に対するＡｐｏＥの効果が消滅するので、おそらくアルギニン残基を含む露呈した親水性ドメインによって遊離ＡｐｏＥ分子はおそらく２分子のＬＰＳに結合することを証明した（Ｒｅｎｓｅｎら、１９９７）。興味深いことに、ラクトフェリンは、ＡｐｏＥの受容体結合部位（アミノ酸１４２〜１４８）に類似する２５〜３１位でアルギニン／リジン豊富な配列を有する糖タンパク質であり、ＬＰＳに結合することも示された（Ｈｕｅｔｔｉｎｇｅｒら、１９８８；Ｃｏｈｅｎら、１９９２；Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９１）。しかし、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚは、ＡｐｏＥの神経−グリア細胞培養物とのプレインキュベーションによりＬＰＳ誘導ＴＮＦαチオン（ｔｉｏｎ）が遮断されるが、ＡｐｏＥのＬＰＳとの同時投与では遮断されないことを示し、これにより、ＬＰＳ結合以外の他のいくつかの機構が関与することが示唆される（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊｕｎｅ、１９９７）。
【００１７】
コレステロール代謝および内毒素クリアランスにおけるその役割に加えて、ＡｐｏＥはまた、神経疾患において重要な役割を果たし得る。ＡｐｏＥ４の存在は、散発性および遅発性アルツハイマー病の発症リスクと関連している（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３）。ＢａｒｇｅｒおよびＨａｒｍｏｎ（Ａｕｇｕｓｔ、１９９７）は、βアミロイド前駆体タンパク質の分泌誘導体（ｓＡＰＰ−α）での小グリア細胞の治療により小グリア細胞が活性化され、小グリア細胞における炎症反応が誘導され、小グリア細胞による神経毒の産生が増強されることを報告した。ｓＡＰＰ−αの小グリア細胞を活性化する能力は、ｓＡＰＰ−αタンパク質のアポリポタンパク質Ｅ３とのプレインキュベーションによって遮断されたが、アポリポタンパク質Ｅ４では遮断されなかった。より最近では、何人かの研究者は、τリン酸化制御におけるＡｐｏＥの関与を提案しており、ＡｐｏＥはアルツハイマー病に関連する神経原線維の発達においていくつかの経路で関与することが示唆される（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、１９９９；Ｔｅｓｓｅｕｒら、２０００）。しかし、ＡｐｏＥとτとの間の関連には議論の余地が残されている（Ｌｏｖｅｓｔｏｎｅ、２００１）。
【００１８】
ＡｐｏＥが脳の急性損傷反応を改変することを示す多数の臨床および実験所見も存在している。例えば、臨床所見により、ＡｐｏＥ４対立遺伝子が、急性および慢性閉鎖性頭部損傷後の死亡率および機能欠損の増加に関連することが示唆される（Ｓｏｒｂｉら、１９９５；Ｔｅａｓｄａｌｅら、１９９７；Ｊｏｒｄａｎら、１９９７；Ｆｉｅｄｍａｎら、１９９９）。ＡｐｏＥ４対立遺伝子はまた、頭部損傷後のアミロイドβタンパク質沈着範囲に関与していた（Ｍａｙｅｕｘら、１９９５；Ｎｉｃｏｌｌら、１９９５）。
【００１９】
脳虚血に関連する種々の臨床的状況において神経学的予後に対するａｐｏＥ４イソ型の悪影響もまた認められた。これらには、脳卒中（Ｓｌｏｏｔｅｒら、１９９７）、頭蓋内出血（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９５；ＭｃＣａｒｒｏｎら、１９９８）、心肺バイパス後の認知力欠如（Ｔａｒｄｉｆｆら、１９９７）、および心停止蘇生後の低酸素脳損傷（Ｓｃｈｉｅｆｅｒｍｅｉｅｒら、２０００）が含まれる。局所虚血後のＡｐｏＥの役割はあまり明白ではないが、少なくとも１つの臨床研究では脳卒中後の機能的予後に対するａｐｏＥ遺伝型の効果を報告できなかった（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら、２００１）。
【００２０】
虚血に対する中枢神経系反応の改変におけるａｐｏＥの役割に関与する臨床所見を、最近、動物モデルに拡大した。ＡｐｏＥ欠損マウスは、局所虚血および再灌流後に年齢、性別、および遺伝的背景が適合するコントロール動物と比較してより大きな梗塞およびより悪い機能の予後を示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、１９９７年７月）。この結果は、脳血管流または脳血管の解剖学と独立している（Ｂａｒｔら、１９９８）。一過性前脳虚血モデルでは、ａｐｏＥ欠損動物はまた、海馬被殻尾部（ｃａｕｄｏｐｕｔａｍｅｎ）、および皮質を含む脳低灌流に対して選択的脆弱性を示す神経集団の損傷が増大する（Ｓｈｅｎｇら、１９９９；Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、１９９９）。虚血に対するこの感受性の増大を、ヒト組換えａｐｏＥの脳室内投与によって逆転することができる（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ、２０００）。さらに、臨床文献と一致して、ヒトａｐｏＥ３導入遺伝子を発現するマウスよりもヒトａｐｏＥ４導入遺伝子を発現するするａｐｏＥ欠損マウスの梗塞がより拡大し、機能的予後が悪化する（Ｓｈｅｎｇら、１９９８）。
【００２１】
ａｐｏＥ遺伝子型がイソ型特異的様式で神経の回復に影響を与えることを示す複数の臨床報告が存在するにもかかわらず、これが起こる機構の定義は不十分なままである。内因性ａｐｏＥは、酸化ストレス（ＭｉｙａｔａおよびＳｍｉｔｈ、１９９６）、直接神経栄養効果の発揮（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、１９９５）、ＣＮＳ炎症反応の下方制御（Ｌｙｎｃｈら、２００１）、または脳アミロイド沈着の促進による病理学的シャペロンとしての作用（ＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ、１９９２）によって損傷に対するＣＮＳ応答に影響を与え得ることが提案されている。しかし、より最近の研究では、インタクトなＡｐｏＥタンパク質由来のいかなる神経保護効果も証明できなかった（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。
【００２２】
さらに、いくつかの研究により、ＡｐｏＥ誘導性ペプチドフラグメントにより神経が損傷し得ることが示唆された。例えば、おそらく細胞内プロセシングの結果としてａｐｏＥのカルボキシル末端短縮形態がＡＤ患者の脳で発生することが最近証明された。これらのフラグメントは生物活性を示し、細胞骨格タンパク質と相互作用して、培養ニューロン中に神経原線維変化に類似する封入体を誘導することができる（Ｈｕａｎｇら、２００１）。Ｍｏｕｌｄｅｒらは、最近、ＡｐｏＥ由来ペプチド１４１〜１５５から構成される二量体が神経毒性効果を有することを報告し、著者らはＡｐｏＥ自体がアルツハイマー病脳における毒性の供給源であり得ることを示唆している（Ｍｏｕｌｄｅｒら、１９９９）。残基１４１〜１４９の縦列反復から構成されるペプチドを使用して、Ｔｏｌａｒらは、初代海馬ニューロンのこのペプチドへの曝露により神経細胞死を誘導する（ＭＫ−８０１（ＮＭＤＡアンタゴニスト）とのプレインキュベーションによって遮断される効果）ことを証明した（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。これらの結果により、この縦列反復ペプチドへの曝露は直接または間接的機構によってＮＭＤＡ誘導性興奮毒性が増幅されることが予想される。
【００２３】
まとめると、ＡｐｏＥは、異なる生物学的過程において役割が変化する。ＡｐｏＥはマクロファージからのＬＰＳの除去によって末梢で保護効果を示すようであるが、そのＣＮＳ損傷およびアルツハイマー病などの神経疾患で果たす役割は全く明確にされていない。どのようにしてＡｐｏＥがＣＮＳ炎症応答に寄与するのか、神経損傷および神経疾患の治療において使用するための試薬の処方において助けとなるのかをより深く理解することが必要である。
【発明の概要】
【００２４】
（発明の要旨）本発明は、アポリポタンパク質Ｅの受容体結合部位配列を含むペプチドを使用して小グリア細胞活性を軽減または抑制することができるという所見に基づく。したがって、本発明は、グリア細胞または小グリア細胞が活性化し、グリア細胞または小グリア細胞の活性化が特異的病態に関連する有害な徴候および／または症状に寄与するＣＮＳ病態を治療するための方法および組成物を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドがＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸曝露に関連する神経細胞死およびカルシウム流入を完全に抑制するという予期せぬ所見に基づく。この結果は、ＡｐｏＥがＮＭＤＡ誘導性興奮毒性を増強するという最近の文献報告と対照的であり、ＡｐｏＥベースの処方物およびＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体の活性化に関連する損傷および疾患の治療の基礎を提供する驚くべき結果である。
【００２６】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ敗血症モデルにおいてＴＮＦαおよびＩＬ−６のＬＰＳ誘導産生から保護するという予期せぬ所見および本発明の受容体結合フラグメントがインタクトなタンパク質の小部分のみを含むという事実に関する驚くべき所見に基づく。したがって、本発明は、本発明のペプチドを使用した敗血症を治療するための方法および組成物ならびに本発明のペプチドと同一の受容体に結合する本明細書中に開示の方法を使用して同定された任意の化合物を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、高親和性アポリポタンパク質Ｅ受容体としてのＬＲＰ／α２Ｍの同定および特徴づけ、本明細書中に開示のいくつかの診断アッセイおよびキットの基礎となる特徴づけに基づく。本発明のアッセイを任意のＡｐｏＥ受容体（ＬＲＰ／α２Ｍ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＥＲ−２、ＬＲ８、アポＥＲ２、およびメガリン／ｇｐ３３０の受容体が含まれるが、これらに限定されない）を使用して実施することができる。
【００２８】
上記を考慮して、本発明の１つの態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞または星状細胞などの他の効果細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは哺乳動物被験体でのグリア細胞または小グリア細胞活性化の抑制方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してグリア細胞または小グリア細胞の活性を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかグリア細胞または小グリア細胞の活性化の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、ＣＮＳ炎症に関連する症状を緩和する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較してＣＮＳ炎症を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかＣＮＳ炎症の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体で、または本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、被験体におけるＣＮＳまたは脳虚血に関連する症状を緩和する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してＣＮＳ虚血に関する症状を緩和する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかＣＮＳ虚血の緩和に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でグリア細胞もしくは小グリア細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の被験体への投与による、哺乳動物被験体のグルタミン酸興奮毒性またはＮＭＤＡ曝露に関連する神経細胞死を軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる軽減と比較してグルタミン酸毒性に関する神経細胞死を軽減するする量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかグルタミン酸毒性の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体で、または本発明のペプチド（特に、配列番号３、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与による、哺乳動物被験体におけるマクロファージ活性化を抑制する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下で起こる活性化と比較してマクロファージ活性化を抑制する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかマクロファージ活性化の抑制に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与を含む、アテローム性動脈硬化症を治療するかアテローム斑の形成を軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較してアテローム斑の形成を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むかアテローム斑形成の軽減に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチド（特に、配列番号３、４、５、６、および１０のペプチド）によって結合した受容体でマクロファージ細胞に結合する化合物または化合物を含む組成物の投与を含む、細菌性敗血症に関連する炎症を治療または軽減する方法である。化合物または組成物を、化合物の非存在下と比較して敗血症関連炎症を軽減する量で投与する。適切な化合物には、１つまたは複数のペプチドのみを含むか敗血症治療に関連する他の医薬化合物と組み合わせた医薬組成物に処方することができる本発明のペプチドが含まれる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、配列番号３の治療ペプチドまたは各ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６のペプチド、もしくは配列番号１０のペプチドおよびその医薬組成物を含む２つのペプチドの二量体である。本発明のペプチドによって結合された受容体に結合し、本明細書中に開示の機能効果を媒介する本発明に開示のアッセイを使用して同定した化合物も含まれる。一貫して、本発明はまた、本明細書中で考察した種々の疾患および障害を治療するための薬物の作製方法における開示のペプチドおよび化合物ならびにその官能性変異型の使用を含む。このような薬物は、本発明の主題であるペプチドおよび化合物を単独または他の公知の医薬品と組み合わせて含み得る。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、活性化グリア細胞または小グリア細胞培養物を化合物とインキュベーションし、その後一酸化窒素などの小グリア細胞活性化マーカーを測定することによってグリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について化合物をスクリーニングする方法である。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、グリア細胞または小グリア細胞培養物を化合物とプレインキュベーションし、細胞培養物を公知のグリア細胞または小グリア細胞のアクチベーターとインキュベーションし、その後グリア細胞または小グリア細胞活性化マーカーを測定することによってグリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について化合物をスクリーニングする方法である。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、化合物が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号１０のペプチドが結合する同一の受容体（例えば、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体）でグリア細胞または小グリア細胞に結合するかどうかの決定による、グリア細胞または小グリア細胞の活性化を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】リポ多糖類（ＬＰＳ）への曝露後のＡｐｏＥ欠損マウス（ソリッドのバー）、ＡｐｏＥ３トランスジェニックマウス（斜線のバー）、およびコントロールマウス（白のバー）由来のグリア細胞培養による亜硝酸塩の産生を示すグラフである。ＬＰＳによる細胞培養物の刺激の２４時間および６０時間後に反応を測定した。
【図２】ＬＰＳでの刺激およびそれに続く配列番号３のペプチド（縦列反復ペプチド）の添加後のＡｐｏＥ欠損マウス由来の富化小グリア細胞初代培養物による亜硝酸塩の産生を示すグラフである。ペプチドを０μＭから１０００μＭの用量で添加し、亜硝酸塩産生の用量依存性減少が認められた。コントロールとして、配列番号２のペプチドを培養物に添加し（ソリッドのバー）、亜硝酸塩産生の減少は認められなかった。
【図３Ａ】ＡｐｏＥ３（四角形）またはＡｐｏＥ４（円形）への曝露後のマウス腹膜マクロファージにおける長期間の細胞内カルシウム含有量を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＡｐｏＥ３（四角形）またはＡｐｏＥ４（円形）のいずれかに曝露したマウス腹膜マクロファージにおけるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を示すグラフである。グラフは、賦形剤に曝露したがＡｐｏＥに曝露していないコントロール細胞と比較した処置細胞中のＩＰ３含有量の変化の割合を示す。
【図４】配列番号６のペプチドの添加後（四角形）、配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加後（円形）のＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞初代培養物によるＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）の産生を示すグラフである。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図５】細胞生存度の基準としての、細胞培養物の光学密度のグラフである。ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞培養物を、配列番号６のペプチド（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（円形）のいずれかに曝露した。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図６】配列番号６のペプチドの添加後（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加後（円形）ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞初代培養物によるＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）の産生を示すグラフである。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図７】細胞生存度の基準としての、細胞培養物の光学密度のグラフである。ＡｐｏＥ欠損マウス由来の小グリア細胞培養物を、配列番号６のペプチド（四角形）または配列番号６のペプチドおよびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（円形）のいずれかに曝露した。１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの用量でペプチドを添加した。
【図８】ａｐｏＥで処置したマクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図である。パネルＡ：ａｐｏＥ（１００ｐＭ）での刺激に対する１つのＦｕｒａ−２／ＡＭ負荷腹腔マクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの変化。［Ｃａ２＋］ｉ測定の詳細を、実施例に記載する。示したグラフは、それぞれ２０〜３０細胞を使用した代表的な５つの各実験を示す。約７０〜８０％のマクロファージが、ａｐｏＥでの刺激時に［Ｃａ２＋］ｉの変化を示した。矢印は、ａｐｏＥの添加時間を示す。パネルＢ：［Ｃａ２＋］ｉの変化に対するａｐｏＥ濃度の効果。各細胞における［Ｃａ２＋］ｉの変化を、種々の濃度のａｐｏＥへの曝露前および曝露後に測定した。データを、平均（Ｓ．Ｅ．）として示し、データは代表的な２つの独立した実験であり、それぞれの場合、研究あたり２５〜３０細胞を分析した。
【図９】ａｐｏＥで処置したマクロファージのＩＰ３の変化を示す図である。パネルＡ：マクロファージにおけるＩＰ３合成および百日咳毒素による調整に対するａｐｏＥの効果。これらの結果は、二連で行った２つの独立した実験の代表であり、百日咳毒素の存在下（白円形）および非存在下（黒円形）でのａｐｏＥ（１００ｐＭ）で刺激したミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識細胞の異なる時間でのＩＰ３形成の変化を％で示す。パネルＢ：［３Ｈ］標識マクロファージにおけるＩＰ３形成に対するａｐｏＥ濃度の効果。細胞を、種々の濃度のａｐｏＥで６０秒間刺激し、ＩＰ３を決定した。結果を、平均（Ｓ．Ｅ．）で示し、これは、二連で行った２つの各実験の代表である。
【図１０Ａ】閉鎖性頭部外傷後のrotorod潜伏時間に対する処置および非処置のマウスの能力を示す図である。
【図１０Ｂ】閉鎖性頭部外傷後の処置および非処置のマウスの体重増加を示す図である。
【図１０Ｃ】閉鎖性頭部外傷後の水迷路（water maze）潜伏時間試験における処置および非処置のマウスの能力を示す図である。
【図１０Ｄ】閉鎖性頭部外傷後の処置および非処置のマウスの生存を示す図である。
【図１１】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するヒト組換えＡｐｏＥ３の用量反応効果を示す図である。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝６培養ウェル／病態。ＡｐｏＥ３を使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝Ｐ＜０．０５。ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷測定の詳細を、実施例に示す。
【図１２Ａ】全長ＡｐｏＥおよびＡｐｏＥ模倣ペプチドの図である。ＡｐｏＥを、白抜きのボックスで示す。１０ｋＤａの脂質結合ドメインはカルボキシル末端に存在し、影をつけた領域で示す。ＡｐｏＥ ＬＤＬ受容体結合ドメインに対応するおよその領域を、黒べたのボックスで示し（アミノ酸１３０〜１５０、配列番号１３）、その後にこれらの研究で使用した３つの短縮ａｐｏＥ模倣ペプチド配列を示す（配列番号１０〜１２）。
【図１２Ｂ】光路長０．１ｃｍのキュベットを使用したＡｖｉｖ Ｍｏｄｅｌ ２０２ＣＤ分光計によってＡｐｏＥペプチドの円偏光二色性スペクトルを記録した。３つのペプチドのＣＤスペクトルは、ヘリックスとランダムコイル構造との混合物と一致した。
【図１３】（Ａ）１００μＭ ＮＭＤＡまたは（Ｂ）３００μＭ ＮＭＤＡでの初代混合ニューロン−グリア細胞培養物のＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）（配列番号１０）の用量反応効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝６〜８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１４】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチドの短縮効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１５】初代混合ニューロン細胞−グリア細胞培養物によるＮＭＤＡ誘導性Ｃａ＋＋取り込みに対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の効果を示すグラフである。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１６】ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対するＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）曝露タイミングの効果を示す図である。培養物を、６μＭのａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）で予備処置するか（２４時間前にペプチドを添加し、ＮＭＤＡ曝露直前に除去した）、同時に処置するか（直前にペプチドを添加し、ＮＭＤＡ曝露直後に除去した）、後処置した（ＮＭＤＡ曝露直後にペプチドを添加し、２４時間後に損傷細胞から放出されたＬＤＨの決定まで培地中に維持した）。値＝平均±ｓ．ｄ．、Ｎ＝８培養ウェル／病態。ペプチドを使用しないＮＭＤＡと比較して＊＝ｐ＜０．０５。
【図１７】ＡｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）によるＴＮＦα（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）のＬＰＳ誘導性血清レベルの抑制を示すグラフである。暗色のバーは賦形剤処置動物群を示し、淡色のバーはペプチド処置動物群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ａｐｏＥがＣＮＳ中のグリア細胞の活性化を調整することを決定し、小グリア細胞の活性化を抑制するいくつかのペプチドをさらに同定した。１つの理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、小グリア細胞受容体へのＡｐｏＥ結合は小グリア細胞の表現型に影響を与え、種々のアクチベーターに対する小グリア細胞の反応性を減少させ、それによりこのようなアクチベーターの存在下で起こる小グリア細胞からの炎症性化合物の放出を減少させると仮定した。ＡｐｏＥは活性化化合物によって結合されるのと同一の受容体に結合することができるか、アクチベーターと結合した化合物から独立して受容体に結合することができる。
【００４１】
リンパ球では、ＡｐｏＥは、種々の化合物（ＬＰＳ、レクチンＰＨＡ、および抗ＣＤ３抗体が含まれる）によって活性化が遮断されることが示されており、これらのアクチベーターはリンパ球上の異なる受容体に結合することが公知である。本発明の方法および化合物を、小グリア細胞の受容体媒介活性化を予防または抑制し、それにより活性化小グリア細胞に関連する有害な神経学的効果を予防または軽減するようにデザインする。本発明のペプチドおよび他の治療分子は、グリア細胞上の受容体に結合し、種々のアクチベーターに対する細胞の応答性を減少させることができる。この様式では、本発明の方法および化合物を使用して、急性および／または慢性ＣＮＳ損傷の一定の徴候、症状、および／または有害な神経学的効果を治療、緩和、または予防することができる。
【００４２】
グルタミン酸および関連興奮性アミノ酸が、哺乳動物脳のシナプスによって放出され、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ（α−アミノ−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネート）受容体、およびカイニン酸受容体を含むイオンチャネルグルタミン酸受容体を活性化する。イオンチャネル型グルタミン酸受容体（特に、ＮＭＤＡ受容体）の過剰刺激により、ニューロン変性が意図される。虚血前のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１などの非競合インヒビターの全身投与により、小グリア細胞活性化の予防およびニューロン死の遅延が認められ、グルタミン酸カスケードの初期遮断により虚血損傷に関与する小グリア細胞活性化が予防されることが示唆される（Ｓｔｒｅｉｔら、１９９２）。しかし、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチド（１４１〜１４９）を使用した最近の研究により、このようなペプチドによりＮＭＤＡ誘導性興奮毒性が増幅され、神経細胞死が誘導されることが示唆される（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。他の最近の研究では、インタクトなａｐｏＥタンパク質由来のＮＭＤＡ誘導性神経毒性に対するいかなる神経保護効果も証明できなかった（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｄｏｎら、２０００）。
【００４３】
文献での最近の報告と対照的に、本発明者らは、インタクトなＡｐｏＥはＮＭＤＡ誘導性細胞傷害性を最も穏やかに用量依存的に減少させることを見出した。比較すると、１７残基のＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号１０）は、驚いたことに、天然のＡｐｏＥと比較して有意により強力な神経保護を示し、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１ほど完全にＮＭＤＡ曝露に関するカルシウム流および細胞死を遮断した。アミノ末端ペプチドのさらなる短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性からの神経保護の喪失がさらに進行した。これらの結果により、ＡｐｏＥが脳傷害後の虚血損傷からのニューロン細胞の回復に影響を与える１つの方法はグルタミン酸毒性からの細胞の保護であることが示唆される。さらに、この結果は、脳虚血後の有益な治療ストラテジーとしてのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用を支持する。
【００４４】
ＡｐｏＥペプチドがＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸曝露に関連するニューロン細胞死およびカルシウム流入を完全に抑制するという予期せぬ所見により、本発明前に明らかではなかったグルタミン酸受容体活性化に関与する障害および疾患のためのＡｐｏＥベースの処方物および治療の基礎が得られる。この所見により、ＮＭＤＡ興奮毒性に関連する疾患の治療のための公知の試薬と組み合わせた１つまたは複数の本発明のペプチドまたはＮＭＤＡアンタゴニスト化合物を含む併用療法用組成物の基本も得られる。
【００４５】
例えば、ＮＭＤＡ興奮毒性は、ＨＩＶ痴呆および脳症（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐｙ）に関連していた（Ｐｅｒｅｚら、２００１；Ｈａｕｇｈｅｙら、２００１；Ｄｏｂｌｅ、１９９９）。ＡｐｏＥペプチドがＮＭＤＡアンタゴニストとして作用するという事実は、ａｐｏＥ遺伝子型に関してＨＩＶ痴呆またはＨＩＶ脳炎のリスク間で統計的に有意な相関が認められなかったので、特に驚くべき所見である（Ｄｕｎｌｏｐら、１９９７）。したがって、ＡｐｏＥがＮＭＤＡ興奮毒性を増強するという最近の報告なしで、ＡｐｏＥまたはそのフラグメントがＮＭＤＡ拮抗活性を示すことは予想されないだろう。
【００４６】
ＮＭＤＡ興奮毒性はまた、ヒトの神経ラチリスム、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｄｏｂｌｅ、１９９９；Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２）、精神分裂病、ハンティングトン舞踏病、パーキンソン病（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２；Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕら、１９９７；ＫｌｏｐｍａｎおよびＳｅｄｙｋｈ、２００２；ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、双極性障害（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）、多発性硬化症、および動物の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＰａｕｌおよびＢｏｌｔｏｎ、２００２）、アルツハイマー病（Ｂｉら、２００２；ＢｉおよびＳｚｅ、２００２）および外傷性脳損傷（Ｒａｏら、２００１；Ｒｅｇｎｅｒら、２００１；ＸｕおよびＬｕｏ、２００１）に加えて、うつ病、脳卒中（ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、癲癇、および遺伝性神経代謝疾患ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸酸性尿症（Ｋｏｌｋｅｒら、２００２）と関連していた。ＮＭＤＡアンタゴニストは、臨床麻酔でも使用されており（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）、動物モデルにおける慢性疼痛（ＭｃＫｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋ、２００１；ＬｅおよびＬｉｐｔｏｎ、２００１）、薬物耐性（Ｃａｄｙ、２００１）、およびアルコール依存症の阻害が認められている（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ、２００１）。
【００４７】
したがって、本発明は、任意の上記疾患または障害の治療のための方法および医薬処方物における開示のペプチドおよびＮＭＤＡアンタゴニスト化合物の使用ならびに種々の障害の治療に有用な他の公知の化合物を含む麻酔用処方物および併用療法用組成物中の成分としての使用を含む。例えば、本発明のペプチドおよび他の化合物を、ウイルス複製の阻害およびＨＩＶ痴呆の予防または治療にあわせた併用療法での治療計画において任意の公知のＨＩＶ薬（ＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼインヒビターが含まれる）と組み合わせることができるか、単独で投与するか補助的処方物において他のＮＭＤＡアンタゴニストと共に投与することができる。ある著者は、ＣＮＳの抗レトロウイルス療法がＡＩＤＳ痴呆複合を示す患者の機能および予後の改善が不可欠である場合でさえも、毒性の有意な部分が抗レトロウイルス治療時でさえも継続する間接的機構によって媒介されるようであるので、二次神経毒性機構を遮断するさらなる神経保護を得るために長期間を必要とし得るとコメントしていた（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ、２００２）。
【００４８】
リルゾールは、筋萎縮性側索硬化症の神経保護治療に使用され、ハンティングトン病およびパーキンソン病治療について現在臨床試験で試験されているグルタミン酸拮抗性を有する物質である（Ｓｃｈｉｅｆｅｒら、２００２；Ｄｏｂｌｅ、１９９９）。Ｓｃｈｉｅｆｅｒとその共同研究者は、最近、ハンティングトン病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、リルゾールが生存期間を延長し、核封入体形成を変化させることを証明した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物のＮＭＤＡのアンタゴニストとしての役割を仮定すると、これらのペプチドおよび化合物を、単独またはリルゾールなどの他のグルタミン酸アンタゴニストと組み合わせて、ＡＬＳ、ハンティングトン病、およびパーキンソン病の治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００４９】
Ｌ−デプレニールは、障害の出現ならびにパーキンソン病の徴候および症状の進行を遅延させ、グルタミン酸受容体の活性化由来の下流で起こる事象に対して保護効果を発揮すると予想されるモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ｂのインヒビターである（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕら、１９９７）。ＭＡＯ−Ｂインヒビター、レボドパなどのドーパミン受容体アンタゴニストおよびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは全て抗パーキンソン効果を示し、多剤組み合わせは、薬物の抗パーキンソン効果を相乗的に増強することが示されている（ＫｌｏｐｍａｎおよびＳｅｄｙｋｈ、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物のＮＭＤＡアンタゴニストの役割を与えられた場合、これらのペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｌ−デプレニールなどのＭＡＯ−Ｂインヒビターおよびレボドペラなどのドーパミン受容体アンタゴニスト）と組み合わせてパーキンソン病治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００５０】
グルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生は、神経分裂症の病因に関連していると見なされている（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、２００２）。したがって、研究者らは、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびハンティングトン病などの他の神経疾患で使用された抗酸化剤での神経分裂症の治療を試験し始めた。本発明のＮＭＤＡ受容体拮抗ペプチドおよび化合物を使用してグルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生を阻害することができる場合、これらのペプチドおよび化合物を、単独または他の抗酸化剤と組み合わせて精神分裂症治療のための医薬処方物で使用することができる。
【００５１】
ＮＭＤＡ受容体機能低下を阻害する抗痙攣薬、抗癲癇薬は、双極性障害で臨床的に有用であることが見出された（Ｆａｒｂｅｒら、２００２）。このような薬剤には、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、ラモトリジン、リルゾール、テトロドトキシン、フェルバメート、ガバペンチン、およびエトスクシミドが含まれる。本発明の化合物のペプチドもまたＮＭＤＡ受容体関連神経毒性を阻害するならば、本発明のペプチドおよび化合物を双極性障害または癲癇の治療用医薬品及び方法中で単独または医薬品中での他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストまたはＮＭＤＡ受容体機能低下のインヒビターと組み合わせて使用することができる。
【００５２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、免疫療法に対する応答および動物モデルの存在（実験的自己免疫脳炎）の観察によって判断したところ、免疫学的に媒介された疾患である。インターフェロン（ＩＦＮ）β−１ｂ、ＩＦＮβ−１ａ、および酢酸ガラティラメル（再発または寛解を繰り返すＭＳに使用される現在の療法）は、ＭＳの免疫学的病態生理学に取り組む作用機構を有する（Ｄｈｉｂ−Ｊａｌｂｕｔ、２００２）。例えば、ＩＦＮは、細胞表面特異的受容体に結合し、抗ウイルス性、抗増殖性、および免疫調整性の遺伝子産物の分泌で終了するシグナル伝達経路のカスケードを開始する。酢酸ガラティラメル（合成分子）は、ミエリン塩基性タンパク質反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し、抗炎症効果によって特徴付けられるＴ細胞レパートリーを誘導する。いくつかの現在市販されている治療薬（ＩＶ免疫グロブリン、メトトレキセート、およびアザチオプリンが含まれる）は、承認された治療と組み合わせた再発と寛解を繰り返す多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の治療薬として評価されている（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ、２００２）。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンが血液脳関門を予防、破壊、および修復し、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＡＥの病因に関連する症状を軽減する（ＰａｕｌおよびＢｏｌｔｏｎ、２００２）ことが示されるならば、本発明のペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかヒトＭＳ治療用のインターフェロンまたは酢酸ガラティラメルに加えて使用することができる。
【００５３】
ヒトの持続痛の動物モデルを使用して、ＭｃＫｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋは、最近、疼痛挙動はＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＡＰ５での治療により有意に軽減されることを示した（ＭｃｋｅｎｎａおよびＭｅｌｚａｃｋ、２００１）。同様に、Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎと共同研究者は、最近、ＬＹ２９３５５８（競合性非Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸興奮性アミノ酸受容体アンタゴニスト）の髄腔内投与により、１８０分間ラットの感覚および運動応答が遮断され、翌日に完全な回復が認められることを証明した。ＬＹ２９３５５８の効果は、ブピバカインの効果より顕著かつ持続されるので、著者らは、グルタミン酸受容体を遮断するＬＹ２９３５５８のような薬物はヒトの脊髄麻酔用の局所麻酔薬の代替物であり得ると結論付けている（Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎら、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかヒトおよび動物の局所麻酔薬として他の麻酔化合物に加えて使用することができる。
【００５４】
ＮＭＤＡ受容体はまた、物質使用の病態生理学において主要な役割を果たすと考えられている（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ、２００１；Ｓｏｙｋａら、２０００）。例えば、Ｋｏｔｌｉｎｓｋａは、エタノール投与前に投与したＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンによりラットのエタノール依存症の発症が予防されたことを示した。Ｊｏｎｅｓと共同研究者は、モルヒネ離脱症候群の強度がＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＬＹ２３５９５９で前処置した幼若ラットで軽減されたことを証明した。ＬＹ２３５９５５９で前処置した子供において、頭部の揺れ（ｈｅａｄ ｍｏｖｅｓ）、足の揺れ、ローリング、および徘徊（ｗａｌｋｉｎｇ）などの脱離挙動が減少し、発声は完全に無くなった（Ｊｏｎｅｓら、２００２）。最近の概説によれば、基本的嗜癖機構のターゲティングを目的とするストラテジーは、嗜癖は中枢神経系の適応変化によって発症し、再発の主な原因である渇望はドーパミン作動機構に依存し、高い全身興奮性を必要とするという仮定に依存する。したがって、薬理学的アプローチは、電位型チャネル（例えば、ニモジピン）およびＮＭＤＡ受容体（例えば、メマンチン）の両方を介したニューロンへのカルシウム流入の阻害によってニューロン順応性を軽減させる薬物ならびに阻害性ＧＡＢＡ性系を刺激する薬物（γ−ビニル−ＧＡＢＡ、バクロフェン）を含んでいた。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトのアルコールおよび薬物嗜癖の予防および治療のための組成物および方法において単独またはメマンチンなどの他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせるかニモジピン、γ−ビニル−ＧＡＢＡ、およびバクロフェンなどの他の神経順応性化合物に加えて使用することができる。
【００５５】
ＡｐｏＥペプチドが小グリア細胞の活性化を阻害する１つの方法がグルタミン酸興奮毒性の阻害であるという本発明者らによる所見は、ＣＮＳ損傷治療のための本発明のこれらのペプチドおよび他のＮＭＤＡ受容体拮抗性化合物の価値をさらに支持する。例えば、Ｒａｏらは、ラットの外傷性脳損傷後のメマンチン（別のＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）による神経保護を報告した（Ｒａｏら、２００１）。他の著者は、最近、ＮＭＤＡ受容体の過剰な活性化は二次的脳障害を誘導する最も重要な因子の１つであり、ＡＰ５などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは脳損傷後の浮腫から脳を保護することができるとコメントした。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトおよび動物の脳損傷および関連する二次的脳障害の治療のための組成物および方法において単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。
【００５６】
本発明の方法および化合物は、急性ＣＮＳ損傷に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。本明細書中で使用される、「急性ＣＮＳ損傷」には、脳卒中（血栓症、塞栓症、または血管収縮によって発症する）、閉鎖性頭部外傷、全脳虚血（例えば、心筋梗塞、不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳損傷を含む任意の原因の全脳低血圧症による虚血）、局所性虚血、および頭蓋内出血が含まれるが、これらに限定されない。中枢神経系に対する虚血損傷は、全脳または局所的虚血条件のいずれかに起因し得る。一定期間（心停止中など）に脳全体への血流が停止した場合に全脳虚血が起こる。脳血管の血栓塞栓性閉塞、外傷性脳損傷、浮腫、および脳腫瘍などの間に脳の一部が正常な血流が枯渇した場合に局所的虚血が起こる。脳虚血によるＣＮＳ損傷の多くは、虚血状態から数時間または数日の間に起こり、損傷組織による細胞傷害性産生物の放出は二次的である。
【００５７】
本発明の方法および化合物はまた、慢性神経疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）およびＨＩＶ関連脳症が含まれるが、これらに限定されない）に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。ＡｐｏＥペプチドを使用してグリア細胞活性化を抑制することができるという本発明者らによる所見により、小グリア細胞活性化を含む任意の神経疾患治療における本発明のペプチドおよび化合物の役割が得られる。例えば、小グリア細胞はＡＤにおける活性化マーカーを発現し、これにより、ＡＤにおける重大な炎症に小グリア細胞が関与することが示唆される。これによりアミロイド斑付近の小グリア細胞クラスターが活性化された（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９９５）。癲癇においても小グリア細胞が活性化される（Ｓｈｅｎｇら、１９９４）。
【００５８】
アミロイドβペプチドの取り込みおよび病原的影響がＮＭＤＡ受容体アンタゴニストによって遮断されることが最近示されているので（Ｂｉら、２００２）、ＡｐｏＥペプチドがグリア細胞の活性化を阻害する１つの方法がグルタミン酸興奮毒性の阻害であるという本発明者らによる驚くべき所見は、ＡＤ治療のための本発明のペプチドおよび他の化合物の価値をさらに支持する。他の研究は、抗炎症薬は疾患の発症または進行を遅延させることができることを示す（Ｂｒｅｉｔｎｅｒら、１９９５；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９３）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、ヒトのＡＤ治療のための組成物および方法において単独または他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストまたは他の公知の医薬品（特に、ＡＤ治療で使用されている抗炎症薬）と組み合わせて使用することができる。
【００５９】
本発明の方法および化合物はまた、ＣＮＳを含む神経系に影響を与える炎症病態（多発性硬化症、脈管炎、急性散在性脳脊髄炎、およびギヤン−バーレー症候群が含まれるが、これらに限定されない）に関連する神経学的徴候および症状の予防、治療、または緩和に有用である。これに関して、本発明のＡｐｏＥペプチドおよび他の化合物を、単独またはＣＮＳ炎症病態の治療のための医薬組成物を処方するために他の公知の抗炎症薬またはサイトカインと組み合わせて使用することができる。
【００６０】
本発明の方法および化合物は、急性または慢性ＣＮＳ疾患の一部として発症するＣＮＳにおけるグリア細胞の活性化の予防、治療、または軽減に有用である。本発明の方法および化合物の効果を、細胞もしくは組織レベル（例えば、組織学的または体系測定的）または被験体の神経学的状態の評価によって評価することができる。グリア細胞活性化の抑制または軽減を、当業者に明らかである種々の方法によって評価することができ、このような１つの方法は、活性化グリア細胞によって産生されることが公知の化合物の産生または存在の測定およびコントロールにおけるこの化合物のレベルとこの測定値との比較である。あるいは、小グリア細胞活性化の抑制、軽減、または予防における本発明の方法および化合物の効果を、処置被験体およびコントロール被験体におけるＣＮＳ疾患の徴候および／または症状（このような徴候および／または症状は小グリア細胞の活性化に関連するか二次的に関連する）の比較によって評価することができる。
【００６１】
本発明はまた、ＡｐｏＥ受容体結合ペプチドが敗血症の末梢およびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいてサイトカインのＬＰＳ誘導性産生から保護するという本発明者の驚くべき所見に基づく。最近、インタクトなＡｐｏＥが細菌性ＬＰＳ誘導死からマウスを保護することが示されているにもかかわらず（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎら、２００１）、ＡｐｏＥがＬＰＳをマクロファージから肝臓実質細胞に向け直すことによって保護を媒介すると考えられるならば、ＡｐｏＥの受容体結合領域のみを含むペプチドにより保護が付与されることは驚くべきことである。敗血症の他の可能な治療は、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０が含まれる）、形質転換成長因子β、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦＮ−φ、マクロファージ遊走阻止因子、および高速移動性１群（high mobility group 1）タンパク質（Ｚａｎｏｔｔｉら、２００２）、およびモノクローナル抗体（抗内毒素抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、および抗ＣＤ１４抗体が含まれる）の投与を含む（Ｍａｔｓｕｂａｒａら、２００２）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物を、敗血症治療のための組成物および方法において単独または他の公知の抗炎症性サイトカインおよび抗体と組み合わせて使用することができる。
【００６２】
本明細書中で使用される、用語「戦う」、「治療する」、および「改善する」は、必ずしも治療を受ける被験体のＣＮＳまたは罹患している敗血症の基本となる疾患過程の逆転または停止を示すことを意味しない。このような用語は、治療なしと比較して治療される病態に関連する有害な徴候および／または症状が減少または軽減するか、進行度が減少することを示す。疾患の徴候または症状の変化を、被験体レベル（例えば、被験体の機能または病態を評価する）または組織もしくは細胞レベル（例えば、グリア細胞またはマクロファージ活性化マーカーの産生が減少または軽減する）で評価することができる。本発明の方法を使用して、慢性ＣＮＳ病態（アルツハイマー病など）を治療する場合、この方法は、痴呆などの症状の発症を遅くするか遅延することができるが、根底となる疾患の過程に必ずしも影響を与えることも逆転することもない。
【００６３】
本発明の方法を実施するための適切な被験体には、雄および雌の哺乳動物被験体（ヒト、非ヒト霊長類、および非霊長類哺乳動物が含まれる）が含まれる。被験体には、ペット（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）（コンパニオンアニマル）被験体ならびに家畜および外来種が含まれる。
【００６４】
本発明の方法で使用することができる活性な化合物には、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体または本発明のＡｐｏＥペプチドによって結合した任意の受容体に特異的および／または選択的に結合するリガンドまたはアゴニストが含まれる。このような化合物の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：１）α２マクログロブリン；２）シュードモナス外毒素；３）リポタンパク質リパーゼ；４）アポリポタンパク質Ｅ；５）酸化および／またはアセチル化ＬＤＬ；６）受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）；７）レムナント粒子；８）低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）；９）高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）；１０）ラクトフェリン；１１）組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）；１２）尿素プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）などおよびその受容体結合フラグメント。
【００６５】
本明細書中で使用される、「ＡｐｏＥペプチド」または「ＡｐｏＥのペプチド」は、ＡｐｏＥによって結合した受容体に結合し、且つ本明細書中に記載の機能的効果を媒介するＡｐｏＥの任意のペプチドまたはその機能的変異型をいう。ＡｐｏＥ分子の各イソ型のアミノ酸残基１００〜２００は、公知のＡｐｏＥ受容体結合領域を含む。より詳細には、ＡｐｏＥの受容体結合領域は、ＡｐｏＥ分子の各イソ型（配列番号４および配列番号５）のアミノ酸残基１３０〜１６０内に存在し、より詳細には、アミノ酸残基１４０〜１５５（ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬ）（配列番号１０）内に存在する。例えば、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、「アポリポタンパク質Ｅ：構造−機能の関係」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、２４９、１９９４を参照のこと。Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４イソ型を定義するアミノ酸交換は、アミノ酸残基１４０〜１５５の領域内で認められないが、アポリポタンパク質分子の構造全体に影響を与えない。ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３分子は、共有結合したホモ二量体を形成するが、ＡｐｏＥ４分子は形成しない。
【００６６】
本明細書中で使用される、用語「ホモ二量体」は、同一の化学組成の２つの分子から構成される分子をいい、用語「ヘテロ二量体」は、異なる化学組成の２つの分子から構成される分子をいう。
【００６７】
本発明者らは、アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号２）を有する九量体を使用した。この９つのアミノ酸配列は、上記で同定されたより大きなＡｐｏＥ受容体結合配列領域内で見出され、ＡｐｏＥのアミノ酸１４１〜１４９位で見出される。本発明者らは、配列番号２の二量体（すなわち、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するペプチド）を構築した。配列番号３のペプチドは、用量依存様式で小グリア細胞活性化を抑制した。単量体（配列番号２の単量体ペプチド）の使用では、小グリア細胞活性化を抑制されなかった（図２を参照のこと）。
【００６８】
本発明者らは、さらに、アミノ酸配列ＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳ ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号６）を有する２０量体を使用した。この２０個のアミノ酸配列は、ＡｐｏＥのアミノ酸１３０〜１４９位で見出され、配列番号２の九量体を含む。配列番号６のペプチドは、用量依存様式で小グリア細胞活性化を抑制した（図４〜７を参照のこと）。
【００６９】
本発明者らは、さらに、ＡｐｏＥのアミノ酸１３３〜１４９位由来のアミノ酸配列ＬＲＶＲＬＡＳ ＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１０）を有する１７量体はマウス頭部損傷モデルおよびマウスＬＰＳ誘導性敗血症モデルで保護作用を示すことを示した。このペプチドはまた、初代ラットニューロン／グリア細胞培養物においてＮＭＤＡ興奮毒性を阻害することが示された。
【００７０】
対照的に、Ｃｌａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、１１１４２、１９９５は、アミノ酸１４１〜１５５または１４１〜１４９の二量体ペプチドは共に培養物においてＴリンパ球に対して細胞静止性および細胞傷害性を示すと報告している。Ｃａｒｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５４、７４１、１９９８は、ａｐｏＥ１４１〜１５５ペプチドによりリンパ球の増殖が阻害されると報告している。アミノ酸１４１〜１５５の縦列反復からなるペプチドおよび１４１〜１５５領域を含むより長い単量体ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幼鳥胚由来の神経突起の広範且つ特異的な変性を起こすことが見出された（Ｃｒｕｔｃｈｅｒら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３０、１２０、１９９４）。これらの著者らは、ａｐｏＥに関連するペプチド配列は神経変性過程に直接寄与し、それにより本発明のペプチドを使用して神経保護効果の予期せぬ性質が支持されると示唆した。
【００７１】
本発明のペプチドを、当該分野で公知の標準的技術によって産生することができる。本発明で有用なペプチドには、ＡｐｏＥ ＬＤＬ受容体結合配列（その複数の反復物を含み、二量体および三量体が含まれるがこれらに限定されない）、２つまたはそれ以上のペプチドの抱合体（それぞれ本明細書中に記載のペプチドまたはＬＤＬ受容体結合配列を含むペプチドを含む）を含むペプチドが含まれる。１つのＡｐｏＥ受容体結合配列を、配列番号１に示す。好ましいペプチドは、配列番号２の複数の反復（好ましくは、その二量体）を含むか、これからなる。したがって、本発明で有用な好ましいペプチドは、配列番号３（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬの縦列反復）または配列番号３を含むペプチドである。さらに好ましいペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号１０を含むか、これからなる。
【００７２】
これらのペプチドに関連する機能活性を増強するための本明細書中に開示のペプチドの修飾を、当業者は容易に実施することができる。例えば、アミノ酸１４１〜１５５の線状縦列反復（１４１〜１５５の二量体）のＬＤＬ受容体に結合する能力は、Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３６、８０、１９９５によって研究されていた。一連の修飾ペプチドを構築し、ＬＤＬ結合能について評価した。これらの著者らは、１４５〜１５５または１４４〜１５０の二量体における荷電アミノ末端残基の欠失（ａｒｇ１４２およびｌｙｓ１４３を含む）により、ペプチドのＬＤＬ受容体活性が消滅したと報告している。これらの著者らは、１４１〜１５５二量体のＬＤＬ−受容体結合活性は、１４１〜１５５、１４１〜１５０、１４１〜１５５（ｌｙｓ１４３→ａｌａ）、および１４１〜１５５（ａｒｇ１５０→ａｌａ）二量体ペプチドの両親媒性αヘリックスの親水性表面上に存在する塩基性アミノ酸の少なくとも２つのクラスターに依存すると結論付けている。Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、１５００９、１９９１は、ペプチド１４１〜１５５の自己抱合体および１４１〜１５５の縦列反復からなるペプチドはリンパ球増幅および卵巣アンドロゲン産生の両方を阻害することができると報告している。Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２２８０３、１９９１は、二量体１４１〜１５５縦列ペプチドおよび三量体１４１〜１５５ペプチドのＬＤＬ結合能力を調査した。Ｌｙｓ１４３→Ａｌａ、Ｌｅｕ１４４→Ｐｒｏ、およびＡｒｇ１５０→Ａｌａのアミノ酸置換によって結合が減少した。Ｌａｌａｚａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、３５４２、１９８８は、ＬＤＬ受容体の結合についてＡｐｏＥの変異型を調査した。１３６位、１４０位、１４３位、および１５０位で塩基性残基を中性アミノ酸に置換した場合、結合活性は減少した。ロイシン１４４またはアラニン１５２をプロリンに置換した場合、結合は減少した。しかし、セリン１３９をアルギニンに置換し、ロイシン１４９をアラニンに置換した変異型によって受容体結合がわずかに増強された。
【００７３】
本発明の方法で有用な活性化合物（または「有効成分」）には、小グリア細胞受容体または星状細胞などの周辺の効果細胞上の受容体への結合、それによる小グリア細胞を活性化する分子による小グリア細胞の活性化の予防または抑制における配列番号３のペプチド、および／または配列番号６のペプチド、および／または配列番号１０のペプチドと競合する化合物が含まれる。本発明の方法で有用な化合物には、配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体のアンタゴニストとして作用する化合物も含まれる。この受容体を選択的にターゲティングおよび結合する抗体を、本発明の小グリア細胞活性化のアンタゴニストとして使用することもできる。このような抗体は、配列番号３のペプチド、および／または配列番号６のペプチド、および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体に選択的または特異的に結合する。
【００７４】
配列番号３、配列番号６、配列番号１０のペプチド、またはその立体配座アナログは、本発明の態様である。このような化合物は、水溶液中でグリア細胞上の受容体分子と相互作用してグリア細胞の活性化を遮断するかさもなければ急性または慢性ＣＮＳ損傷またはＬＰＳなどの小グリア細胞の公知のアクチベーターへの曝露と同時に発生する立体配座を有するアミノ酸のコア配列を有するペプチドまたはペプチド模倣物である。別の言い方をすれば、このような化合物を、小グリア細胞の結合について配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドと競合する能力およびＬＰＳなどの公知のアクチベーターによって小グリア細胞の活性化を抑制する能力によって特徴付ける。
【００７５】
本発明の治療ペプチドの別の変形形態は、治療ペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸の１〜５アミノ酸またはアナログの結合である。本発明のペプチドのアナログを、活性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方への１から５個のさらなるアミノ酸の付加によって調製することもでき、このようなアミノ酸の付加は、ペプチドが配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した部位での小グリア細胞に結合する能力に悪影響を与えない。
【００７６】
電荷密度、疎水性、親水性、サイズ、および形状などの物理的性質におけるアミノ酸および他の分子または置換基の公知の類似性によって、ペプチドのアミノ酸配列を変化させることができる。例えば、アミノ酸Ｔｈｒを、Ｓｅｒに置換するかその逆を行うことができ、ＬｅｕをＩｌｅに置換するかその逆を行うことができる。さらに、当業者に公知の質量スクリーニング技術（例えば、配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した受容体で小グリア細胞に結合する化合物のスクリーニング）によってアナログを選択することができる。好ましい交換は、ペプチドのアルギニン含有量を増加させるためのＳｅｒのＡｒｇへの置換であり、例には、配列番号７、配列番号８、または配列番号９からなるかこれらを含むペプチドが含まれる。さらに好ましい交換は、ロイシン１４９のアラニンへの置換である。
【００７７】
本発明のペプチドを、ペプチドが１８アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号３）または配列番号３のペプチドの受容体結合能力を保持するその変異型を含む場合、約２０アミノ酸、約２２アミノ酸、約２４アミノ酸、約２６アミノ酸、約２８アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、または約４０アミノ酸、約２２アミノ酸まで、約２４アミノ酸まで、約２６アミノ酸まで、約２８アミノ酸まで、約３０アミノ酸まで、約３５アミノ酸まで、約４０アミノ酸まで、約４５アミノ酸まで、約５０アミノ酸まで、またはそれ以上の短いペプチドとして特徴付けることもできる。本発明で有用な好ましいペプチドは、配列番号３からなるかこれを含むペプチドである。より長いペプチドを使用する場合、アミノ酸残基１４１〜１４９を直接取り囲むＡｐｏＥ配列由来のアミノ酸配列を組み込んだペプチドが好ましい。１８アミノ酸より長いペプチドを使用する場合、得られたペプチドが小グリア細胞に結合して急性および慢性ＣＮＳ炎症における小グリア細胞の活性化を抑制する能力を維持する限り、実質的に任意の他のアミノ酸配列を含むことができることが意図される。本発明は、ＬＤＬ受容体結合能力を保持することが公知の１４１〜１４９位のＡｐｏＥ配列の変形形態を含む。例えば、Ｌ型アミノ酸の代わりに１つまたは複数のＤ型アミノ酸を使用するか、アシル化またはアミノ化などによるＮ末端またはＣ末端への基の付加によって合成ペプチドをさらに使用することができる。
【００７８】
本発明のペプチドを、ペプチドが９アミノ酸配列ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号２）または配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドの受容体結合能力を保持するその変異型を含む場合、約１０アミノ酸、約１２アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２２アミノ酸、約２４アミノ酸、２６アミノ酸、２８アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸まで、または４０アミノ酸、約１５アミノ酸まで、約２２アミノ酸まで、約２４アミノ酸まで、約２６アミノ酸まで、約２８アミノ酸まで、約３０アミノ酸まで、約３５アミノ酸まで、約４０アミノ酸まで、約４５アミノ酸まで、約５０アミノ酸まで、またはそれ以上の短いペプチドとして特徴付けることもできる。本発明で有用な好ましいペプチドは、ａｐｏＥ受容体結合領域からなるかこれを含むペプチドであり、特に好ましいペプチドは、配列番号６および／または配列番号１０からなるかこれを含む。より長いペプチドを使用する場合、ａｐｏＥ受容体結合領域内に由来するアミノ酸配列またはａｐｏＥ受容体結合領域を直接取り囲むＡｐｏＥ配列を組み込んだペプチドが好ましいにもかかわらず、得られたペプチドが小グリア細胞に結合して急性および慢性ＣＮＳ炎症における小グリア細胞の活性化を抑制する能力を維持する限り、これらのペプチドは、実質的に任意の他のアミノ酸配列を含むことができることが意図される。本発明は、ＬＤＬ受容体結合能力を保持することが公知の１４１〜１４９位のＡｐｏＥ配列の変形形態を含む。例えば、Ｌ型アミノ酸の代わりに１つまたは複数のＤ型アミノ酸を使用するか、アシル化またはアミノ化などによるＮ末端またはＣ末端への基の付加によって合成ペプチドをさらに使用することができる。
【００７９】
本発明のペプチドには、天然のアミノ酸配列だけでなく、そのアナログ、化学的誘導体、または塩であるペプチドも含まれる。用語「アナログ」または「保存的変形形態」は、本明細書中で同定した治療ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、１つまたは複数のアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドをいう。例えば、グリシンまたはセリンなどの極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に置換することができるか、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換することができるか、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換することができるか、非極性アミノ酸を別の非極性アミノ酸に置換することができる。本明細書中で使用される、用語「アナログ」または「保存的変形形態」はまた、本発明のポリペプチドに１つまたは複数のアミノ酸置換または付加を有するが、ペプチドが本明細書中に記載の小グリア細胞活性化を抑制する能力を保持する場合に、実質的な配列類似性（少なくとも約８５％の配列類似性、好ましくは、少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、またはさらに９９％の配列類似性を有する）を保持するペプチドをいう。
【００８０】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ型立体配座またはＤ型立体配座のいずれかであり得る。本発明の治療ペプチドは、塩が薬学的に許容可能である場合、遊離形態でも塩形態でもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される、用語「被験体の脳に投与する」は、化合物を治療を受ける被験体の中枢神経系組織、特に脳に提供する当該分野で公知の治療経路の使用をいう。
【００８２】
好ましくは、本発明の化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて使用する。したがって、本発明はまた、哺乳動物被験体への投与に適切な医薬組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた有効量の本発明の化合物を含む。キャリアは、組成物が経口投与に適合するような液体または固体（すなわち、経口投与のために処方した錠剤または丸薬）であり得る。さらに、キャリアは、組成物を吸入用に適合させた噴霧可能な液体または固体の形態であり得る。非経口投与する場合、組成物は、発熱物質を含まず、且つ許容可能な非経口キャリア中に存在すべきである。あるいは、活性な化合物を、公知の方法を使用したリポソーム中へのカプセル化形態に処方することができる。さらに、ＣＮＳ病態の治療のためのペプチドの鼻腔内投与が当該分野で公知である（例えば、ＡＤ治療のためのペプチドＴの鼻腔内投与に関するＰｅｒｔに付与された米国特許第５，５６７，６８２号を参照のこと）。（本明細書中で参照された全ての特許書類全体が、本明細書中で参考として援用されることが意図される）。当該分野で公知の技術を使用して、鼻腔内投与のための本発明の化合物を調製することができる。
【００８３】
本発明の化合物の薬学的調製物は、任意選択的に、薬学的に許容可能な希釈剤または賦形剤を含み得る。本発明の敗血症に関連する実施形態のために、開示したペプチドを、当業者に公知の方法を使用して薬学的に許容可能なキャリアと抱合させて血清の半減期を延長することができる。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００８４】
本発明の化合物の有効量は、化合物の非存在下と比較して小グリア細胞の活性化を減少させる量、言い換えれば、化合物の非存在下と比較して小グリア細胞による神経毒性化合物の産生を減少させる量である。有効量（および投与様式）を、個体を基本として決定し、これは、使用される特異的治療分子、被験体の検討材料（サイズ、年齢、身体全体の健康）、治療される病態（ＡＤ、急性頭部外傷、脳炎など）、治療すべき症状の重症度、考えられる結果、使用される特定のキャリアまたは医薬処方物、投与経路、および当業者に明らかな他の要因に基づく。当該分野で公知の技術を使用して当業者が有効量を決定することができる。本明細書中に記載の化合物の治療有効量を、当該分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、動物モデル、または他の用量反応研究を使用して決定することができる。
【００８５】
本発明の化合物を、起こり得る症状の進行の軽減または緩和のために、緊急に（すなわち、脳炎または虚血を引き起こす事象の発生時または直後）投与するか、予防的に（例えば、計画手術前または神経の徴候または症状の発生前）投与するか、変性疾患の過程で投与することができる。投与のタイミングまたは間隔は、被験体の症状によって変化し、数時間から数日、数時間、数日、数週間、またはそれ以上にわたって投与することができ、これを当業者が決定する。
【００８６】
典型的な毎日の処方計画は、約０．０１μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０，０００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００，０００μｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【００８７】
血液脳関門は、血流から種々のＣＮＳ領域に物質を受動拡散する関門を提供する。しかし、一定の薬剤の能動輸送は、いずれかの方向で血液脳関門を通過することが公知である。血流から脳への通過を制限し得る物質を、脳脊髄液に直接注射することができる。脳虚血および炎症はまた、血液脳関門を改変し、血流中の物質の通過を増大させることが公知である。
【００８８】
化合物の脳への直接投与は、当該分野で公知である。髄腔内注射により、薬剤を脳室および脊髄液に直接投与する。薬剤の脊髄液への持続的直接投与を行うために外科的に移植可能な輸液ポンプを利用可能である。医薬化合物の脳脊髄液への注射（「脊髄注射」）を使用した腰椎穿刺は当該分野で公知であり、本発明の化合物の投与に適切である。
【００８９】
親水性化合物の液体可溶性薬物への変換を含む、血液脳関門の回避のための薬理学ベースの手順も当該分野で公知である。活性な薬剤を、脂質小胞またはリポソーム中にカプセル化することができる。
【００９０】
一過性に開いた血液脳関門への高張物質の動脈内注入および脳への親水性薬物の通過は、当該分野で公知である。Ｋｏｚａｒｉｃｈらに付与された米国特許第５，６８６，４１６号は、血液脳関門の透過性を増大させて脳への化合物の送達を増大させるための、受容体媒介透過剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）（ＲＭＰ）ペプチドと脳の間質液区画に送達すべき化合物との同時投与を開示している。静脈内投与または腹腔内投与を使用して、本発明の化合物を投与することもできる。
【００９１】
血液脳関門を通過する活性な薬剤の１つの輸送方法は、血液脳関門を透過して血液脳関門を通過して活性な薬剤を輸送する能力について選択したペプチドまたは非タンパク質部分である第２の分子（「キャリア」）への活性な薬剤の結合または抱合である。適切なキャリアの例には、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体が含まれる。キャリアは、脳内皮細胞中の特定の輸送系を介して脳に侵入する化合物であり得る。血液脳関門を介した受容体媒介トランスサイトーシスによる脳への神経薬理学的因子の送達に適合したキメラペプチドは、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅらに付与された米国特許第４，９０２，５０５号に開示されている。これらのキメラペプチドは、トランスサイトーシスによって血液脳関門を通過することができる輸送可能なペプチドに抱合した医薬品を含む。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅらによって開示された特異的輸送可能ペプチドには、ヒストン、インスリン、およびトランスフェリンなどが含まれる。血液脳関門を通過させるための化合物とキャリア分子との抱合体もまた、Ｐｏｄｕｓｌｏらに付与された米国特許第５，６０４，１９８号に開示されている。開示されている特異的キャリア分子には、ヘモグロビン、リゾチーム、シトクロムｃ、セルロプラスミン、カルモジュリン、ユビキチンおよび物質Ｐが含まれる。Ｂｏｄｏｒに付与された米国特許第５，０１７，５６６号も参照のこと。
【００９２】
本発明のペプチドの別の投与方法を、ペプチドが発現および分泌され、それにより小グリア細胞に利用可能となるように脳細胞に侵入することができる、ペプチドをコードする核酸配列を保有するベクターの被験体への投与によって実施する。適切なベクターは、典型的には、ウイルスベクター（ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およびレトロウイルスが含まれる）である。ベクター送達系を使用して遺伝子治療を行う技術は、当該分野で公知である。ヘルペスウイルスベクターは、本発明の化合物の投与に使用することができる特定のベクター型である。
【００９３】
（スクリーニング法）脳虚血または脳炎における小グリア細胞活性化を予防または軽減する能力について化合物をスクリーニングする方法もまた本明細書中に開示する。このような方法は、活性化小グリア細胞を試験化合物に接触させる工程と、試験化合物が配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドが結合する同一の受容体で小グリア細胞に結合するかどうかを検出する工程とを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞培養物中）で接触工程を行うことができる。競合結合アッセイを使用して、例えば、放射性同位体もしくは蛍光分子などの検出可能な標識または当該分野で公知であり且つ一般的に使用されている任意の他の検出可能な標識と抱合または結合する本発明のペプチドの受容体結合の阻害の検出によって、試験化合物が配列番号３および／または配列番号６および／または配列番号１０のペプチドによって結合した同一の受容体に結合するかどうかを検出することができる。
【００９４】
小グリア細胞の活性化を抑制する能力についての試験化合物をスクリーニングするさらなる方法は、活性化した小グリア細胞培養物を試験化合物にインキュベーションさせる工程と、小グリア細胞活性化の少なくとも１つのマーカーを測定する工程とを含む。小グリア細胞活性化マーカーの減少（試験化合物の非存在下でのマーカーレベルと比較）は、試験化合物が小グリア細胞の活性化を抑制、予防、または軽減させることができることを示す。小グリア細胞活性化マーカーの例は、一酸化窒素の産生である。
【００９５】
小グリア細胞の活性化を抑制する能力についての試験化合物をスクリーニングするさらなる方法は、小グリア細胞培養物を試験化合物とプレインキュベーションする工程と、小グリア細胞培養物を小グリア細胞を活性化することが公知の化合物とインキュベーションする工程を含む。少なくとも１つの小グリア細胞活性化マーカーを測定し、活性化マーカーの減少（プレインキュベーション工程を行わない場合と比較）は、試験化合物が小グリア細胞の活性化に影響を与えることができることを示す。小グリア細胞活性化マーカーの例は、一酸化窒素の産生である。
【００９６】
（アテローム性動脈硬化症）炎症過程は、アテローム性動脈硬化症の過程の態様を媒介することが公知である。例えば、Ｈａｎｓｓｏｎ１９９４；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９９５；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７を参照のこと。ＡｐｏＥは、（個体のマクロファージによる分泌量は肝臓によって産生されるＡｐｏＥの量と比較してわずかであるにもかかわらず）局所的に血管壁でマクロファージによって分泌されることが公知である。古典的なアテローム性動脈硬化症モデルでは、ＡｐｏＥは、血流からコレステロールを除去し、これをマクロファージまたは肝臓に送達させるように機能する。しかし、血管壁でマクロファージによって分泌されるＡｐｏＥはいかなる脂質代謝効果からも独立してアテローム斑形成を減少させることが明らかとなりつつある。例えば、ＡｐｏＥ欠損マウスは、高コレステロール血症およびアテローム硬化性疾患のモデルとして認められている。このようなマウスへのＡｐｏＥ分泌マクロファージの投与により、アテローム斑形成が劇的に減少する。Ｌｉｎｔｏｎら、１９９５。対照的に、野生型マウスのマクロファージのＡｐｏＥ欠損マクロファージへの置換により、動物が肝臓によるＡｐｏＥの産生を継続していてもアテローム動脈硬化性への変化が加速される。Ｆａｚｉｏら、１９９７。
【００９７】
アテローム性動脈硬化症では、ＡｐｏＥは、受容体媒介事象を介して、血管壁周辺でのマクロファージ活性化を下方制御すると仮定される。マクロファージ活性化のこのような下方制御は、アテローム斑形成に関連する事象のカスケードを遮断または妨害し、それによりアテローム動脈硬化性病変の形成を軽減または遅延させる。アテローム性動脈硬化症に関連することが公知の事象のカスケードには、平滑筋細胞および内皮細胞増殖、および泡沫細胞形成が含まれる。ＡｐｏＥがこれらの各過程を下方制御する証拠が存在する。したがって、ＡｐｏＥは、その脂質に対する影響から独立してｉｎ ｖｉｖｏでのアテローム性動脈硬化症の存在および進行に影響を与える。アテローム性動脈硬化症の進行を、アテローム斑の量もしくはサイズまたはアテローム性動脈硬化症病変によって遮断された血管の割合、またはこのような斑の成長率の測定によって評価することができる。
【００９８】
本発明者らは、ＡｐｏＥはマクロファージにおけるカルシウム媒介シグナルを伝達する（Ｃａ２＋／イノシトール三リン酸シグナル伝達）ことをはじめて証明し、これはＡｐｏＥがマクロファージ活性化の下方制御によってマクロファージ機能を改変し、その後の炎症を改変することを示す。したがって、小グリア細胞およびＣＮＳ疾患に関して本明細書中に記載のペプチド、化合物、方法、および医薬処方物は、アテローム性動脈硬化症を抑制、予防、または遅延するためのマクロファージの活性化の抑制方法で有用である。
【００９９】
アテローム性動脈硬化症は、動脈内膜の肥厚およびアテローム斑中の脂質の蓄積をいう。アテローム性動脈硬化症を治療または予防するための本発明の化合物の投与を、本明細書中で考察した任意の手段および当該分野で公知の他の適切な方法によって行うことができる。アテローム性動脈硬化症の変化を予防、遅延、または治療するために本発明の化合物を使用した場合、血液脳関門を通過させるように化合物を処方する必要が無いことが明らかである。本発明の方法によって治療することができる病態には、冠状動脈、頚動脈などの中枢神経系に供給する動脈、末梢循環または内臓循環の動脈のアテローム性動脈硬化症、および腎動脈疾患が含まれる。非経口投与などの投与は、部位特異的であるか、全身血流への投与であり得る。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明の例示を目的とし、本発明を制限するとい解釈されない。
【実施例１】
【０１０１】
小グリア細胞の一酸化窒素産生：材料と方法
本研究は、小グリア細胞のリポ多糖類（ＬＰＳ）刺激後の亜硝酸塩蓄積によって測定した、小グリア細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生の調節における内因性ａｐｏＥの役割を試験した。
【０１０２】
（培養物の調製および特徴づけ）混合グリア細胞培養物を、以下から調整した：（ａ）野生型（Ｃ５７／Ｂ１６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）幼若マウス、（ｂ）ＡｐｏＥ欠損変異幼若マウス（ＡｐｏＥ欠損マウス）、および（ｃ）ヒトＡｐｏＥを発現するがマウスＡｐｏＥを発現しないトランスジェニック幼若マウス（ＡｐｏＥ３マウス）。トランスジェニックマウスの作製および特徴づけについては、Ｘｕら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、３、２２９、１９９６を参照のこと。混合グリア細胞培養物を、記載のように調製した。ＭｃＭｉｌｌｉａｎ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５８、１３０８、１９９２；Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７６、７０、１９９７を参照のこと。簡単に述べれば、２〜４日齢の幼若マウスから脳を取り出し、膜および血管を除去し、無Ｃａ＋２培地中に機械的に分散させ、遠心分離によって回収した。次いで、２５ｃｍのフラスコあたり１つの脳の細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇｂｃｏ番号１５０７０を含む）にプレートした。混合ニューロン／グリア細胞調製物を、加湿インキュベーターでコンフルエントまで成長させた（３〜５週間）。
【０１０３】
ＡｐｏＥ欠損マウスおよびＡｐｏＥ３マウスから調製した培養物が類似のグリア細胞集団を有することを証明するために小グリア細胞、星状細胞、およびニューロンの比率を定量した。星状細胞およびニューロンの数を評価するために神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；ＳＩＧＭＡ（登録商標）；５００倍希釈）およびτタンパク質（ＳＩＧＭＡ（登録商標）、５００倍希釈）に対する抗体を使用して免疫染色を行い、ペルオキシダーゼ結合Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｆｏｌｉｃａ Ｂ４イソレクチンおよび酢酸ナフチルエステラーゼ染色を使用して小グリア細胞を検出した。Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７６、７０、１９９７。正常なＣＮＳ環境および炎症カスケードに関連するグリア細胞−グリア細胞相互作用に最も密接に近づけるので、混合ニューロン−グリア細胞培養系を使用した。
【０１０４】
星状細胞（αＧＦＡＰ；ＳＩＧＭＡ（登録商標））、ニューロン（ατ；ＳＩＧＭＡ（登録商標））、および小グリア細胞（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｆｏｌｉｃａ Ｂ４イソレクチン；ＳＩＧＭＡ（登録商標））について実施した半定量的ウェスタンブロット分析を使用して類似のグリア細胞集団を確認した。実験終了時に細胞タンパク質を採取し、各サンプル由来の５０μｇタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、タンパク質をナイロンメンブレンに移した。抗血清およびレクチンの非特異的結合を、４％粉乳、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でのメンブレンのプレインキュベーションによってブロックした。メンブレンを、抗体または１μｇ／ｍｌＢ４イソレクチンと一晩インキュベーションした。リン酸緩衝化生理食塩水での強力な洗浄後、結合した抗体またはレクチンを、基質としてジアミノベンジジンを使用したＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって視覚化した。
【０１０５】
（培養物の刺激）この培地で１回細胞を洗浄した後、培養物を無血清培地にプレートし、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））で刺激した。亜硝酸塩アッセイの２４時間および６０時間後にアリコートを分注した。
【０１０６】
（亜硝酸塩の定量）グリース試薬（０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸、１％スルファニルアミド、および２．５％Ｈ３ＰＯ４）での比色反応を使用して定量した亜硝酸塩蓄積の測定によって、ＮＯ産生を評価した。分光測光法によって５７０ｎｍの吸光度を測定した。このアッセイの感度は、約０．５μＭである。
【０１０７】
（統計分析）データを、ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｃｈｅｒＬＳＤ多重範囲検定によって比較した。ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【実施例２】
【０１０８】
小グリア細胞の一酸化窒素産生：結果
（培養物の特徴づけ）ＡｐｏＥ欠損マウス、ＡｐｏＥ３マウス、および野生型マウスから調製した培養物のグリア細胞集団において有意差は認められなかった。培養物は、約７０％星状細胞、１５％小グリア細胞、および１５％ニューロンを含んでいた。野生型マウス、ＡｐｏＥ欠損マウス、およびＡｐｏＥ３マウス由来の細胞調製物の比較により、グリア細胞集団における差は認められなかった。特に、小グリア細胞レベル（ＮＯ産生についての初代効果細胞）は、レクチン結合で検出したところ、３つ全ての培養物集団で類似していた（データ示さず）。
【０１０９】
ＡｐｏＥ欠損マウス培養物は、ＬＰＳ曝露の最初の２４時間に強力な亜硝酸反応を示した。この増強された反応は、コントロール動物由来の小グリア細胞で認められた反応の６倍であった（ｐ＝０．０００１；図１）。マウスａｐｏＥをヒトＡｐｏＥ３に置換したトランスジェニックマウス由来の培養物は、ＬＰＳに対して弱い反応を示すが、野生型動物の反応と有意に異ならなかった（２４時間および６０時間でそれぞれｐ＝０．６４およびｐ＝０．２）。６０時間まで、野生型およびＡｐｏＥトランスジェニックマウス調製物中でＬＰＳの反応における亜硝酸塩の蓄積の増加が認められたが、コントロールと比較して、ａｐｏＥ欠損培養物中の亜硝酸塩の量は依然として有意に多かった（ｐ＝０．０４％；図１）。
【０１１０】
上記の研究は、ＡｐｏＥ欠損混合ニューロン−グリア細胞培養物は、天然のマウスＡｐｏＥ３を発現するマウスから調製したグリア細胞培養物またはヒトＡｐｏＥイソ型を発現する培養物よりもＬＰＳ刺激に異なって反応することを示す。これらの結果は、ＡｐｏＥが損傷に対するＣＮＳ反応の生物学的に関連するメディエーターであることと一致する。これらの研究は、内因性ＡｐｏＥはＬＰＳ刺激一酸化窒素産生のグリア細胞分泌を調整することを証明し、これにより、脳内で産生された内因性ＡｐｏＥの１つの機能は、小グリア細胞反応性を抑制し、それにより急性および慢性損傷に対するＣＮＳ反応を変化させることが示唆される。
【実施例３】
【０１１１】
配列番号３のペプチドによる小グリア細胞活性化の抑制
富化小グリア細胞初代培養物を、上記の実施例１に記載のａｐｏＥ欠損幼若マウスの脳から調製した。小グリア細胞を、リポ多糖類（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激して、実施例１に記載の小グリア細胞を活性化した。活性化小グリア細胞は、炎症性サイトカインおよび一酸化窒素を分泌し、一酸化窒素分泌を、小グリア細胞活性化のマーカーとして本実験で使用した。一酸化窒素産生を、実施例１に記載のように評価した。
【０１１２】
配列番号３のペプチドを、０μＭから１０００μＭの用量範囲で活性化小グリア細胞の培養物に添加した。４８時間後に一酸化窒素分泌の用量依存性減少が認められた（図２）。２ｍＭの用量での配列番号２のペプチドの投与により、一酸化窒素分泌のいかなる明らかな減少も認められなかった（図２）。認められた結果を確立するためのコントロールとして作用する配列番号２の単量体ペプチドは、いかなる非特異的ペプチド効果にも起因しない。
【実施例４】
【０１１３】
マクロファージに対するＡｐｏＥの効果
腹腔マクロファージを使用して、ＡｐｏＥの細胞内シグナル伝達経路を調査した。
【０１１４】
チオグリコール酸誘発腹腔マクロファージを、８週齢のＣ５７−ＢＬ６マウスから採取し、カバーガラス上に４×１０５細胞の密度でプレートし、２．５μＭＦｕｒａ−２／ＡＭで３０分間負荷し、７５μＭカルシウムを含むハンクス緩衝化溶液で洗浄した。５ｎＭヒト組換えａｐｏＥまたはＥ４への曝露後、Ｚｅｉｓｓデジタル顕微鏡によって細胞内カルシウムを測定した。図３Ａに示すように、ＡｐｏＥは、マクロファージ中の細胞内カルシウム動員を引き起こした。１００モル過剰の受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）とのプレインキュベーションにより、この効果は遮断されなかった；ＲＡＰは、ＬＲＰの生理学的アンタゴニストであり、ＬＲＰ機能を遮断する。
【０１１５】
マクロファージも２×１０６細胞／ウェルの密度でプレートし、３Ｈ−ミオイノシトール（８μＣ／ｍ）にて３７℃で１６時間標識し、ヒトＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４（５ｎＭ）に曝露した。コントロール細胞を賦形剤に曝露するが、ＡｐｏＥに曝露しなかった。結果を、図３Ｂに示し、値を、コントロール細胞と比較した処置細胞におけるイノシトール三リン酸の変化の割合として示す。
【０１１６】
腹腔マクロファージのＡｐｏＥへの曝露によって、イノシトール三リン酸の代謝回転に関連する細胞内カルシウムの増加を誘導した（図３Ａおよび３Ｂ）。この結果は、ＡｐｏＥがマクロファージ機能に影響を与えて改変するシグナル伝達経路を開始させることを示す。このデータにより、ＡｐｏＥはマクロファージ活性化および炎症を下方制御することが示唆される；マクロファージ活性化および炎症は、アテローム性動脈硬化症過程に寄与することが公知である。
【実施例５】
【０１１７】
配列番号６のペプチドを使用した小グリア細胞活性化の抑制
アミノ酸１３０〜１４９（配列番号６）を含むａｐｏＥの受容体結合領域由来の２０アミノ酸ペプチドを、当該分野で公知の方法に従って調製した。
【０１１８】
初代マウス小グリア細胞培養物を、実施例１に記載のようにａｐｏＥ欠損幼若マウスから調製した。いくつかの培養物では、小グリア細胞を、実施例１に記載のようにリポ多糖類（１００ｎｇ／ｍｌ）で活性化した。
【０１１９】
配列番号６のペプチドを、０μＭ（コントロール）、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの投薬量で活性化および非活性化小グリア細胞の培養物に添加した（図４）。ペプチドの各投薬量レベルを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；円形）と組み合わせて試験した。ＴＮＦαの産生を、ペプチド添加から２４時間後に測定した。各用量のペプチドの使用によって（コントロール培養物と比較して）活性化小グリア細胞によるＴＮＦα産生の減少が認められた（図４、円形）。図４のデータを、各用量で少なくとも三連で示し、エラーバーは、標準誤差を示す。
【０１２０】
これらの結果は、配列番号６のペプチドは活性化グリア細胞からのサイトカインの放出を抑制することを示す。
【実施例６】
【０１２１】
配列番号６のペプチドの細胞傷害性
配列番号６のペプチドの中毒作用を調査した。実施例５に記載の活性化（ＬＰＳ）および非活性化小グリア細胞の培養物を使用した。配列番号６を有するペプチドを、０μＭ（コントロール）、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭの量で細胞培養物に添加し、各投薬量レベルのペプチドを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて試験した。次いで、ペプチド添加から２４時間後の光学密度によって、細胞生存度を測定した。
【０１２２】
図５に示すように、光学密度は、０μＭおよび１０μＭのペプチドを投与した培養物でほぼ同一であったが、１００μＭまたは１０００μＭを投与した培養物で減少した。実施例５の結果とあわせたこれらの結果は、非毒性濃度の配列番号６のペプチドはグリア細胞サイトカイン放出の抑制に十分であることを示す。
【実施例７】
【０１２３】
グリア細胞サイトカインの抑制および配列番号６のペプチドの細胞傷害性
０μＭ（コントロール）、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、および１０００μＭのペプチド用量を使用して、実施例５および６に記載の実験を繰り返した。各投薬量レベルのペプチドを、単独（四角形）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；円形）と組み合わせて試験した。ペプチド投与から２４時間後にＴＮＦαの産生を測定し、結果を図６に示す。細胞生存度を評価するために、細胞培養物の光学密度も測定した（２４時間）；結果を図７に示す。
【０１２４】
これらの結果は、たった１μＭのペプチドを投与した細胞培養物で小グリア細胞のサイトカイン放出が抑制されるが、より用量の多いペプチドを投与した培養物のみで細胞傷害性が認められたことを示す。実施例５〜７の結果は、ａｐｏＥの受容体結合領域を含む非毒性濃度のペプチドは活性化小グリア細胞からのサイトカイン放出を抑制することができることを示す。
【実施例８】
【０１２５】
局所虚血のｉｎ ｖｉｖｏ処置
局所虚血再灌流のマウスモデルを使用して、ａｐｏＥ ＬＤＬ受容体領域を含む小治療ペプチド（３０アミノ酸長未満）の髄腔内、静脈内、または腹腔内投与の効果を評価する。１つのこのようなペプチドは、配列番号６を有する。
【０１２６】
当該分野で公知の技術にしたがって、野生型マウスを中大脳動脈閉塞および再灌流に供する（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）。１つのマウス群（野生型コントロール）には大脳動脈閉塞後に処置を施さず、類似の群（野生型処置群）では、各マウスに治療ペプチドを髄腔内、腹腔内、または静脈内に注射する。最初の指針として上記のｉｎ ｖｉｔｒｏデータを使用して、種々の用量で治療ペプチドを注射することができる。
【０１２７】
再灌流後の所定の時間で（例えば、再灌流の２４時間後）各動物を神経学的に評価する（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）。神経学的試験後、各マウスを麻酔し、屠殺し、脳を切り出して染色し、梗塞体積を測定する。神経学的予後および梗塞サイズを、コントロール群と処置群との間で比較する。
【０１２８】
ａｐｏＥ欠損マウスを使用して、上記試験を繰り返すことができる。
【実施例９】
【０１２９】
全脳虚血のｉｎ ｖｉｖｏ処置
全脳虚血の２匹の血管梗塞モデルから適合した全脳虚血のマウスモデルを使用して、ａｐｏＥ ＬＤＬ受容体領域を含む小治療ペプチド（３０アミノ酸長未満）の髄腔内投与の効果を評価する。１つのこのようなペプチドは、配列番号６のペプチドを有する。
【０１３０】
野生型マウス（２１±１ｇ）を一晩絶食させ、ハロタンまたは別の適切な麻酔薬で麻酔し、挿管し、機械的に通気する。右内頚静脈および大腿動脈にカニューレを挿入する。頭蓋骨膜温度を、３７．０℃に保持する。頚動脈を閉塞し、０．３ｍｇ動脈内トリメタファンおよび静脈貧血を使用して平均動脈圧を３５ｍｍＨｇに減少させる。１０分後、虚血を逆転させる。コントロールマウスにはさらなる処置を施さず、試験マウスには治療ペプチドを、髄腔内、静脈内、または腹腔内に注射する。指針として本明細書中に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏデータを使用して、種々の用量のペプチドを注射することができる。
【０１３１】
公知の神経学的試験手順（例えば、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１７、７５３、１９９７年７月を参照のこと）を使用して、所定の時間で（例えば、再灌流後１、３、または５日）各動物を神経学的に評価する。神経学的評価後、各動物を麻酔し、屠殺し、当該分野で公知の方法を使用して脳損傷を評価する。例えば、脳は、ｉｎ ｓｉｔｕで灌流固定し、切り出し、染色し、例えば、海馬のＣＡ１領域の損傷を同定するために光学顕微鏡で試験し、視覚可能および視覚不可能なニューロンを計数し、比較する。
【０１３２】
神経学的予後および脳損傷を、コントロール群と治療群との間で比較する。
【実施例１０】
【０１３３】
アポリポタンパク質ＥおよびＡｐｏＥ模倣ペプチドは、マクロファージにおけるカルシウム依存性シグナル伝達反応を開始させる
この実施例は、ａｐｏＥにより、イノシトール三リン酸産生の増大後の細胞内Ｃａ２＋貯蔵物の動員に関連するマウスの腹腔マクロファージのシグナル伝達カスケードが開始されることを示す。受容体結合タンパク質およびＮｉ２＋との前処置によって、このカスケードを阻害した。百日咳毒素感受性Ｇタンパク質によって、シグナル伝達が媒介された。これらは、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体に結合するリガンドを介して誘導されるシグナル伝達の特性である。ａｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドにより、インタクトなタンパク質と同一の様式でシグナル伝達が開始された。交差脱感作の存在により、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドは、同一の結合部位で競合することが示唆される。放射性標識ａｐｏＥ模倣ペプチドはインタクトなタンパク質と受容体結合について競合するという本発明の所見によってこれを確認した。これらのデータは、ＡｐｏＥ依存性シグナル伝達がこのリポタンパク質の免疫調整特性を媒介することを示す。
【０１３４】
（材料と方法）（材料）醸造用のチオグリコール酸ブロスを、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から購入した。ＲＰＭＩ培地１６４０、ウシ胎児血清、ハンクス平衡塩溶液、および他の細胞培養試薬を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、百日咳毒素、およびＨＥＰＥＳを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｆｕｒａ−２ＡＭおよびＢＡＰＴＡ／ＡＭを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。Ｍｙｏ−［２−３Ｈ］イノシトール（比活性１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、Ａｍｅｒｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＲＡＰｃＤＮＡを含むプラスミドは、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｈｅｒｚ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ、Ｄａｌｌａｓ ＴＸ）から贈呈された。以前に記載のようにＲＡＰ産生のために使用した［２１］。ヒト組換えａｐｏＥ２を、Ｐａｎｖｅｒａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判断したところ、調製物は内毒度を含まず、均一であった。［３Ｈ］チミジン（比活性７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびヨウ素１２５（比活性４４０ｍＣｉ／ｍｇ）を、Ａｍｅｒｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。アミノ末端にチロシンを含むか含まない２０アミノ酸のＡｐｏＥ模倣ペプチド（Ａｃ−ＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミド）ならびに同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチドを、ＱＣＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ、ＭＡ）によって純度９５％に合成した。全アミノ末端をアセチル化し、全カルボキシ末端をアミド部分でブロックした。滅菌等張リン酸緩衝化生理食塩水中で、ペプチドを再構成した。同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチドも合成した。使用した全ての他の試薬は、市販されているもので最高の品質であった。
【０１３５】
（マクロファージ採取）動物を含む全実験を、所内動物実験委員会によって最初に承認を受けた。無病原体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび以前にＣ５７ＢＬ／６系統に１０回戻し交配しているＡｐｏＥ欠損マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から入手した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび３．５ｍＭ ＮａＨＣＯ３を含む１０ｍｌの氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＨＢＳＳ）（ｐＨ７．４）を使用した腹腔洗浄法によって、チオグリコール酸誘発腹腔マクロファージを採取した。４℃、約８００×ｇで１０分間の遠心分離によってマクロファージをペレット化し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２．５Ｕ／ｍｌペニシリン、６．５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。細胞生存度を、トリパンブルー排除法で決定し、これは一貫して９５％を超えていた。
【０１３６】
（受容体結合研究）マクロファージを、４８ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に２．５×１０５細胞／ウェルでプレートし、加湿した５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃で３時間インキュベーションした。次いで、プレートを４℃に冷却し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５％ＢＳＡを含む氷冷ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）（結合緩衝液）での３回連続リンスによって非結合細胞を除去した。１２５Ｉ−ａｐｏＥ模倣ペプチドの直接結合を定量するために、種々の量の放射性標識ペプチドを、２００倍モル過剰の非標識ペプチドの存在下および非存在下で各ウェルに添加した。過剰な非標識ペプチドの非存在下で結合した１２５Ｉ−ａｐｏＥペプチドの量（全結合）から過剰な非標識ペプチドの存在下で結合した１２５Ｉ−ａｐｏＥペプチドの量（非特異的結合）を引くことによって、細胞への特異的結合を同定した。競合研究のために、５０ｎＭの放射性標識ペプチドを、種々の量（３１．２５ｎＭ〜４Ｍ）の非標識ＡｐｏＥ２またはＲＡＰの存在下または非存在下で各ウェルに添加した。次いで、細胞を、４℃で１２〜１６時間インキュベーションした。非結合リガンドを、ウェルから除去し、細胞の単層を氷冷結合緩衝液で３回リンスした。次いで、細胞を、１Ｍ ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳと室温で５時間より多く可溶性にし、各ウェルの内容物を、ポリスチレンチューブに添加し、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、ＣｌｉｎｉＧａｍｍａ１２７２カウンタ（Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数した。
【０１３７】
（ａｐｏＥおよびペプチド処置マクロファージの［Ｃａ２＋］ｉの測定）Ｆｕｒａ−２／ＡＭ処置単細胞の［Ｃａ２＋］ｉレベルの変化を、公知の技術にしたがってデジタル画像顕微鏡を使用して定量した。マクロファージを、３５ｍｍのペトリ皿中のカバーガラスに１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレートし、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２時間接着させた。非接着細胞を吸引し、単層をＨＨＢＳＳで２回洗浄した。４μＭのＦｕｒａ−２／ＡＭを、細胞と室温の暗所で３０分間インキュベーションし、その後、公知の技術にしたがってデジタル画像顕微鏡を使用して［Ｃａ２＋］ｉを測定した。５分間でベースラインを得た後、リガンド（ａｐｏＥ、ａｐｏＥ模倣ペプチド、またはスクランブルペプチド）を添加し、複数の［Ｃａ２＋］ｉ基準を得た。シグナル伝達がリガンドのＬＲＰへのライゲーションに起因するかどうかを決定するために、細胞を１０００倍モル過剰のＲＡＰまたは１０ｍＭ ＮｉＣｌ２（共にＬＲＰへのリガンド結合を阻害する）と共にａｐｏＥまたはペプチドでの刺激前に５分間プレインキュベーションを行った。Ｇタンパク質の関与を評価する実験で、単層を１μｇ／ｍｌの百日咳毒素と３７℃で１２時間インキュベートし、上記のようにＣａ２＋基準を得た。
【０１３８】
（ａｐｏＥ処置マクロファージにおけるＩＰ３の測定および百日咳毒素の効果）種々の実験条件下でのミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識マクロファージ中のＩＰ３の形成を、公知の技術にしたがって定量した。マクロファージを、６ウェルプレート（４×１０６細胞／ウェル）にプレートし、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２時間接着させた。単細胞から培地を吸引し、０．２５％ＢＳＡおよびミオ−［２−３Ｈ］イノシトール（比活性１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに添加した。細胞を、３７℃でさらに１６〜１８時間インキュベートした。単層を、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＬｉＣｌを含む２５ｍＭ ＨＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）で３回リンスした。体積０．５ｍｌのこの溶液を、各ウェルに添加し、細胞を、３７℃で３分間プレインキュベーションを行い、その後リガンドで刺激した。リガンドを含む培地の吸引および６．２５％過塩素酸の添加によって、反応を停止させた。細胞を、ウェルから掻き取り、１ｍｌのオクチルアミン／Ｆｒｅｏｎ（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含むチューブに移し、４℃、５６００×ｇで２０分間遠心分離した。上相の溶液を、１ｍｌＤｏｗｅｘ樹脂カラム（ＡＧ１−Ｘ８ギ酸；Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に適用し、０．１Ｍギ酸を含むＨ２Ｏ、５０、２００、４００、８００、および１２００ｍＭギ酸アンモニウムを使用したバッチで連続的に溶離した［２６］。放射能を測定するための液体シンチレーションカウンターにアリコートを配置することによって、放射能を測定した。Ｇタンパク共役受容体の活性化およびホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）加水分解の百日咳毒素感受性を評価するために、上記のように細胞をプレートし、４０ｍＭ ＤＴＴにて３０℃で２０分間予備活性化した１μｇ／ｍｌ百日咳毒素とインキュベートした。ＩＰ３形成に対する効果を、上記のように測定した。
【０１３９】
（受容体上の結合部位についてのａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの競合）これらのリガンドが同一の受容体に結合するかを決定するために、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドでの刺激時のマクロファージ［Ｃａ２＋］ｉの変化を研究した。Ｆｕｒａ−２／ＡＭ負荷マクロファージを一晩インキュベートし、カバーガラスにプレートし、第１のリガンドで刺激し、［Ｃａ２＋］ｉの変化を定量した。次いで、細胞を、第２のリガンドで刺激し、Ｃａ２＋測定を繰り返した。
【０１４０】
（結果）（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥの効果）遊離細胞質Ｃａ２＋濃度の調整は、遍在シグナル伝達反応である。多数の細胞型では、原形質膜受容体へのリガンドの結合は、膜結合ホスホリパーゼＣによってＰＩＰ２の加水分解が活性化されて、ＩＰ３を生成する。ＩＰ３は、Ｃａ２＋チャネルでもあるコグネイト受容体への結合によって小胞体からＣａ２＋を放出させる。非興奮性細胞では、［Ｃａ２＋］ｉシグナル伝達は、細胞内Ｃａ２＋貯蔵物からのＣａ２＋放出およびＣａ２＋流入の両方に関連する。ヒト組換えａｐｏＥでのマクロファージの処置により、緩衝液で処理したマクロファージと比較して、［Ｃａ２＋］ｉレベルが２〜４倍に増加した（図８Ａ）。非刺激細胞およびａｐｏＥ処置細胞における典型的な実験［Ｃａ２＋］ｉレベルは、それぞれ９５．３３±７．３７ｎＭおよび１８０．２５±１４．５７ｎＭであった。ＡｐｏＥでの刺激時の［Ｃａ２＋］ｉの増加が、試験した細胞の７０〜８０％で認められた。ａｐｏＥ誘導性［Ｃａ２＋］ｉ増加は、外因性、非同期性且つ振動性または持続性であった。マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのＡｐｏＥ誘導増加は、用量依存性であった（図８Ｂ）。マクロファージによって分泌された天然のａｐｏＥにより外因性ヒト組換えａｐｏＥに対する応答が変化する可能性に取り組むために、ａｐｏＥ欠損マウスから調製したマクロファージを使用してこれらの実験を繰り返した。ａｐｏＥでの刺激後のカルシウム応答は、野生型マクロファージおよびａｐｏＥ欠損マウス由来のマクロファージで同一であった（データ示さず）。
【０１４１】
（ａｐｏＥ誘導性ＩＰ３合成に対する百日咳毒素の効果）ａｐｏＥへのミオ−［２−３Ｈ］イノシトール標識マクロファージの曝露によって、ＩＰ３レベルが１．５〜２．０倍に増加した（図９Ａ）。この効果は、用量依存性であった（図９Ｂ）。百日咳毒素でのマクロファージの前処置により、ＩＰ３のこの増加が完全に消滅した（図９Ａ）。これらの研究は、ａｐｏＥ刺激細胞における膜ＰＩＰ２のホスホリパーゼＣ触媒加水分解は百日咳感受性Ｇタンパク質と関連することを証明している。
【０１４２】
（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのＡｐｏＥ誘導増加は、Ｎｉ２＋およびＲＡＰによって減少する）以前の研究で、ＡｐｏＥがＬＲＰに結合して内在化することが証明された。さらに、ラクトフェリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、リポタンパク質リパーゼ、およびトロンボスポンジンのＬＲＰへの結合により、セカンドメッセンジャーの生成に関与するシグナル伝達カスケードを開始させる。ＬＲＰがａｐｏＥによって誘導されたシグナルカスケードに関与する可能性を調査するために、マクロファージをＲＡＰおよびＮｉ２＋とプレインキュベーションを行い、その後ａｐｏＥ２またはａｐｏＥ２模倣ペプチドで刺激した。ＲＡＰは、全ての公知のリガンドのＬＲＰへの結合を遮断する３９ｋＤａのタンパク質である。Ｎｉ２＋もまた、リガンドのＬＲＰとの相互作用を遮断する。ＲＡＰおよびＮｉ２＋の両方とのプレインキュベーションにより、その後のａｐｏＥへの曝露に関連する［Ｃａ２＋］ｉ増加が顕著に減少する（データ示さず）。これらの結果は、ａｐｏＥはＬＲＰとの特異的相互作用を介してシグナル伝達カスケードを誘導するという仮説と一致する。百日咳毒素でのマクロファージの前処置もまた、ＡｐｏＥ依存性Ｃａ２＋応答を顕著に減少させ、これは、ａｐｏＥによって誘導されたシグナル伝達が百日咳毒素感受性Ｇタンパク質に共役することを示す。これは、ＬＲＰ依存性シグナル伝達の公知の性質と一致する。
【０１４３】
（マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥ模倣ペプチドの効果）ａｐｏＥ受容体結合領域の残基１３０〜１４９由来のペプチドでのマクロファージの刺激により、［Ｃａ２＋］ｉが２〜３倍に増加する一方で、同一のサイズおよび組成のスクランブルコントロールペプチドでは効果が無かった（データ示さず）。この［Ｃａ２＋］ｉの増加は、試験した細胞の約６０〜７０％で認められた。ａｐｏＥ応答と同様に、マクロファージ［Ｃａ２＋］ｉのペプチド誘導増加は、外因性且つ非同性であった。これらの結果は、インタクトなａｐｏＥおよびａｐｏＥ受容体結合領域由来のペプチドの両方により、シグナル伝達カスケードの開始と一致する［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘導することを証明する。しかし、モル濃度ベースでは、インタクトなａｐｏＥと比較して、［Ｃａ２＋］ｉ応答を得るためにより高濃度のペプチドが必要であった。この相違は、ペプチドとａｐｏＥとの間の受容体親和性の相違（インタクトなタンパク質の効果をペプチドリガンドの効果と比較した場合に一般的に認められる性質）に起因するようである。
【０１４４】
（［Ｃａ２＋］ｉに対するａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの反復刺激効果）受容体ライゲーションに対する［Ｃａ２＋］ｉの結果の変化の定量による、ａｐｏＥとその模倣ペプチドの間の受容体上の結合部位についての競合の可能性を評価した。ａｐｏＥへの反復曝露後、［Ｃａ２＋］ｉが顕著に減少し、タキフィラキシーが示唆される（データ示さず）。ヒト組換えａｐｏＥへの最初の曝露に関連する［Ｃａ２＋］ｉの増加後、その後のペプチド曝露に対する［Ｃａ２＋］ｉ応答が顕著に減少した（データ示さず）。同様に、ペプチドへの最初の曝露後にａｐｏＥ添加に対する［Ｃａ２＋］ｉ応答が喪失した（データ示さず）。スクランブルペプチドの曝露によってカルシウム応答の脱感作は認められなかった（データ示さず）。この認められたタキフィラキシーにより、受容体リガンドに対する二次的な受容体脱感作が示唆され、これはインタクトなａｐｏＥタンパク質および２０残基のペプチドの両方が同一の受容体に結合するという仮説と一致する。
【０１４５】
（考察）本実施例の主な所見は、以下である：１）ヒト組換えａｐｏＥ（ｐＭからｎＭの濃度）のマクロファージ細胞表面上の受容体への結合により、［Ｃａ２＋］ｉおよびＩＰ３の増加に関連するシグナル伝達事象が開始されること、２）ａｐｏＥの受容体結合領域由来の２０残基ペプチドによりマクロファージ［Ｃａ２＋］ｉの変化は同一であるが、スクランブルコントロールペプチドでは異なること、３）［Ｃａ２＋］ｉおよびＩＰ３の変化は特異的且つ用量依存性であること、４）細胞ＩＰ３のａｐｏＥ誘導増加は百日咳毒素感受性であること、および５）［Ｃａ２＋］ｉの変化がＲＡＰおよびＮｉ２＋によって遮断されること。さらに、酵素脱感作の存在に基づいて、ａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドは同一の受容体に結合するようである。
【実施例１１】
【０１４６】
アポリポタンパク質Ｅ模倣ペプチドは、マウス頭部外傷モデルで保護性を示す
本実施例は、頭部外傷後の１７アミノ酸ａｐｏＥ模倣ペプチド（アミノ酸１３３〜１４９を含むＡｐｏＥのフラグメント）の静脈内投与の保護効果を証明する。
【０１４７】
マウスに気管内挿管し、酸素部分圧３０％での１．６％イソフルレンでその肺を機械的に通気した。マウスに、ニューマティックインパクターによって６．８ｍ／ｓのスピードで正中線に沿って閉鎖性頭部外傷を負わせた。閉塞性頭部外傷から３０分後、マウスを無作為に３つの群に分けた（ｎ＝１６マウス／群：高用量ペプチド群（４０６μｇ／ｋｇ）、低用量ペプチド群（２０３μｇ／ｋｇ）、および生理食塩水コントロール溶液群）。全てのペプチド溶液を、滅菌等張生理食塩水（１００μｌ）中で調製し、尾静脈注射によって静脈内投与した。外傷後５日間連続して回転棒時間（ｒｏｔｏｒｏｄ ｔｉｍｅ）および重量を測定した。２１日目に、モリス水迷路の隠されたプラットフォームを見出すための学習能力を試験した。
【０１４８】
外傷前は回転棒潜伏時間（ｌａｔｅｎｃｙ）および重量は、全ての動物で類似していた。外傷後、生理食塩水注射動物は回転棒試験で顕著な障害が認められ、これは体重減少に関連していた。高用量ペプチドおよびより狭い範囲の低用量ペプチドにより、この運動障害から動物が保護され（図１０Ａ）、体重減少が同時に起こっていた（図１０ｂ）。単回用量のペプチドのこの保護効果は、外傷後５日間持続した（ｐ＜０．０５、３回反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【０１４９】
さらに、ペプチドは、モリス水迷路における隠されたプラットフォーム（図１０ｃ）を見出すための学習障害を保護するようであった（ｐ＜０．０５、３回反復測定ＡＮＯＶＡ）。ペプチドでの治療により、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析で証明されるように、ペプチドでの処置により急性（ａｃｕｔｅ）生存率も有意に改善された（図１０ｄ）。
【０１５０】
前述の実施例は、本発明を例示するが、制限と解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲、本明細書中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって説明される。
【実施例１２】
【０１５１】
初代ラットニューロン／グリア細胞培養物におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸興奮毒性に対するアポリポタンパク質Ｅ模倣ペプチドの保護効果
本発明者らは、ａｐｏＥが虚血に対する脳の応答を改変する役割を果たす１つの機構がグルタミン酸興奮毒性からの保護によるという仮説を立てた。グルタミン酸は、虚血環境における神経損傷に寄与すると考えられている。異なるクラスのグルタミン酸活性化チャネルのうち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の特異的活性化は、主にカルシウム流入および種々のニューロン型におけるニューロン損傷の悪化の媒介を担うと考えられている（ＭｅｌｄｒｕｍおよびＧａｒｔｈｗａｉｔｅ、１９９０）。
【０１５２】
脳虚血の実験環境におけるＡｐｏＥのｉｎ ｖｉｖｏ効果をモデル化するために、ＮＭＤＡに曝露した初代ラット新皮質ニューロンおよびグリア細胞の細胞培養モデルにおける天然のヒトＡｐｏＥおよびＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドの生物学的に関連する濃度の効果を試験した。インタクトなＡｐｏＥは、ＮＭＤＡ誘導細胞傷害性を最も穏やかに用量依存性に減少させた。比較すると、１７残基のＡｐｏＥ模倣ペプチドでは天然のＡｐｏＥと比較して神経保護を増強し、ＮＭＤＡ曝露に関連するカルシウム流入および細胞死の両方を完全に遮断した。ペプチドのアミノ末端のさらなる短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性からの神経保護の喪失が進行した。これらの結果により、ＡｐｏＥは、グルタミン酸毒性からの細胞の保護による脳傷害後の虚血損傷からニューロン細胞の回復に影響を与えることが示唆される。さらに、脳虚血ならびにグルタミン酸毒性に関連する他の疾患および傷害後の治療ストラテジーとしてのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用が意図される。
【０１５３】
（実験手順）全動物の手順を、動物の不快感および数を最少にするようにデザインし、Ｄｕｋｅ大学の所内動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１５４】
（初代ニューロン−グリア細胞培養物の調製）初代ニューロン−グリア細胞培養物を、以前に記載のように（Ｐｅａｒｌｓｔｅｉｎら、１９９８）、妊娠１８日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎児の脳から調製した。１０〜１５匹の幼若ラットから脳を採取し、解剖学的目印（ｌａｎｄｍａｒｋ）を使用して、髄膜および皮質下組織から皮質を分離するように切り出した。皮質をプールし、０．２５％トリプシンを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を補足した緩衝化塩溶液中で２ｍｍ３に刻んだ。組織を、３７℃の５％ＣＯ２／９５％室温雰囲気下で２０分間インキュベートし、１５ｍＭグルコース、５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ）、および１％ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む氷冷無グルタミン最小必須培地（ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した。組織片を、火造り（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）の９インチパスツールピペット（直径０．７ｍｍ）での粉砕によって分散させた。得られた懸濁液を、５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を破棄し、ペレットを成長培地（１５ｍＭグルコース、５％ウシ胎児血清、および５％ウマ血清で補足したＭＥＭ）に再懸濁した。分散させた細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコートした２４ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）中のウェルあたり４×１０５細胞を使用して、コンフルエントな単層が得られるようにプレートした。培養物を、使用前に３７℃の加湿５％ＣＯ２／９５％室温雰囲気で１３〜１６日間静置したままにした。このプロトコールにしたがって調製した培養物は、ＮＦ−１６０および神経膠線維酸性タンパク質についての免疫組織学的染色によって同定したところ（Ｋｕｄｏら、２００１）、５４％のニューロンおよび４６％のグリア細胞を含むことが見出された。
【０１５５】
（ＡｐｏＥ−ペプチドの合成）ＱＣＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）に純度９５％のペプチドを合成させ、滅菌等張リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で再構成した。各ペプチドについて、アミノ末端をアセチル化し、カルボキシ末端をアミド部分でブロックした。１７残基親ペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）（配列番号１０）は、ａｐｏＥの受容体結合領域に由来した。同一のサイズ、アミノ酸組成、および純度のスクランブルコントロールペプチド（Ａｃ−ＬＡＲＫＬＲＳＲＬＶＨＬＲＬＫＬＲ−アミド）（配列番号１４）を、同様に作製した。親（１３３〜１４９）（配列番号１２）ペプチドのアミノ末端の漸増的短縮によって、１４残基の配列（１３６〜１４９）および１１残基の配列（１３９〜１４９）（配列番号１１）を作製した。
【０１５６】
（ＮＭＤＡへの曝露／細胞傷害性の評価）成熟培養物（ｉｎ ｖｉｔｒｏで１３〜１６日）を、ＮＭＤＡの添加前に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）および１．８ｍＭＣａＣｌ２を含む無Ｍｇ２＋緩衝化塩溶液（ＢＳＳ）で洗浄した。ＮＭＤＡ曝露後、培養物を、３７℃の５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で３０分間保持した。次いで、ＮＭＤＡを含む培地を除去し、２０ｍＭグルコースを補足したＭＥＭで置換した。培養物をインキュベーターに２４時間戻した。全ての実験において、下記のように培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定により、ＮＭＤＡへの曝露から２４時間後に細胞損傷を評価した。非競合性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＭＫ−８０１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ Ｉｎｓ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１０μＭの濃度で正のコントロールとして使用した。用量依存性予備研究を実施して、本研究で使用される最大付近のＬＤＨ放出（ＥＤ９０）に必要なＮＭＤＡ濃度（１００μＭ）を決定した。
【０１５７】
（ＮＭＤＡ毒性に対するａｐｏＥおよびａｐｏＥ模倣ペプチドの効果の評価）１００μＭ ＮＭＤＡ誘導性ＬＤＨ放出に対するヒト組換えａｐｏＥ（Ｐａｎｖｅｒｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の効果を評価し、用量反応曲線を得た（ａｐｏＥ：最終濃度０．１〜１０μＭ）。ＡｐｏＥ３（最も一般的なヒトイソ型）を、３０分前に培養物に添加し、ＮＭＤＡ曝露前に除去した。次いで、ＮＭＤＡ（１００Ｍまたは３００Ｍ）誘導性ＬＤＨ放出に対するａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の効果を評価し、以下の条件の１つの下で同時に処置した姉妹培養物の個別の組における用量反応曲線を得た：（１）ＮＭＤＡの曝露直前に培養物に種々の用量のペプチド（最終濃度０．３Ｍ、１μＭ、３μＭ、６μＭ、１０μＭ）を添加し、曝露終了後に除去した；（２）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露；（３）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露なし；（４）ペプチドなし、１０μＭのＭＫ−８０１で３０分間のＮＭＤＡ曝露。ＮＭＤＡ誘導ＬＤＨ放出に対するスクランブルコントロールペプチドの効果を、同様に評価した。
【０１５８】
ＮＭＤＡ誘導ＬＤＨ放出に対するａｐｏＥペプチド（１３３〜１４９）の投与時間の効果を、以下の条件の１つの下で同時に処置した姉妹培養物の個別の組において評価した：（１）ＮＭＤＡ曝露の２４時間前に培養培地にペプチドを添加し、曝露直前に除去する；（２）ＮＭＤＡ曝露の直前にペプチドを添加し、曝露終了時に除去した；（３）３０分のＮＭＤＡ曝露の直後にペプチドを添加した；（４）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露；（５）ペプチドなし、ＮＭＤＡ曝露なし。全ての場合において、ペプチド濃度は６μＭであり、培養物を、上記のように１００μＭのＮＭＤＡに３７℃で３０分間曝露し、処置／曝露効果をＮＭＤＡ曝露から２４時間後に試験した。
【０１５９】
（ＬＤＨ放出の測定）損傷細胞によって重複培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）量の測定によって、細胞傷害性ストレスの２４時間後に細胞損傷を定量的に評価した。以前に記載の方法（Ａｍａｄｏｒら、１９６３）の修正形態によってＬＤＨ活性を同定した。簡単に述べれば、２００μｌの培養培地サンプルを、２４℃で１０ｍＭ乳酸および５μｍｏｌのＮＡＤを２．７５ｍｌの５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．２）中に含むポリスチレンキュベットに添加した。キュベット由来の蛍光シグナル（３４０ｎｍ励起、４５０ｎｍ発光）の一時的変化の線形最小二乗法曲線フィットを使用して計算したＮＡＤの還元初速度からＬＤＨ活性を同定し、酵素活性単位（１分あたりに乳酸をピルビン酸に変換する量（ｎｍｏｌ））で示した。蛍光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＬＳ５０Ｂ；Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅａｋ ＧｍｂＨ、Ｕｂｅｒｌｉｎｇｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって分析を行った。
【０１６０】
（細胞カルシウム取り込みに対するペプチドの効果）細胞外空間からの細胞カルシウム取り込みを、４５ＣａＣｌ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して評価した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む無Ｍｇ２＋ＢＳＳでの培養物の洗浄後、６μＭペプチド、または１０μＭ ＭＫ−８０１を１００μＭ ＮＭＤＡ曝露前に各ウェルに添加し、曝露終了時に除去した。４５Ｃａ（０．２８μＣｉ／ｍｌ、０．９μＣｉ／ウェル）を、ＮＭＤＡ曝露の直前に各ウェルに添加した。培養物を、インキュベーターに戻し、３７℃で維持した。２０分後、曝露培地を除去し、各ウェルを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を含む氷冷無Ｍｇ２＋ＢＳＳで３回洗浄した。次いで、細胞を、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加によって溶菌した。各ウェル由来のアリコートを、１０ｍｌＣｙｔｏｓｃｉｎｔ（商標）（ＩＣＮ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ＣＡ）を含む液体シンチレーションバイアルに添加し、シンチレーションカウンティングによって放射能を同定し、細胞数を正規化した。
【０１６１】
（円偏光二色性）光路長１ｍｍの石英キュベットを使用したＡｖｉｖ Ｍｏｄｅｌ ２０２ＣＤ分光計によって円偏光二色性スペクトルを記録した。ＰＢＳ緩衝液中のペプチド濃度は、約５０μＭであった。２７３Ｋでスペクトルを取った。サンプルは、５０μＭのペプチドを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、４℃でスペクトルを記録した。以前に記載の式（Ｍｙｅｒｓら、１９９７）を使用して、２２２ｎｍでのシグナルかららせん度（ｈｅｌｉｃｉｔｙ）％を計算した。ロックフェラー（Ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ）大学のタンパク質／ＤＮＡテクノロジーセンターで行った定量的アミノ酸分析によって、ペプチドストック溶液の濃度を同定した。
【０１６２】
（結果）ＡｐｏＥの脳虚血の実験的組織培養モデルにおけるグルタミン酸興奮毒性から細胞を保護する能力を調査するために、初代ラットニューロン／グリア細胞培養物を、ＮＭＤＡへの細胞の曝露前にヒト組換えＡｐｏＥとプレインキュベーションを行った。本発明者らの研究所で以前に行った実験では、初代げっ歯類ニューロン／グリア培養物におけるＮＭＤＡ誘導興奮毒性に対するヒト組換えＡｐｏＥの効果に特異的なイソ型を検出できなかった（Ａｏｎｏら、２００２）。このために、ＡｐｏＥ３（最も一般的なイソ型）（Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３）を、本明細書中に記載の全ての実験で使用した。
【０１６３】
ＮＭＤＡ誘導細胞損傷に対するＡｐｏＥ３の用量反応を同定するために、初代培養物を、最初に、１００μＭ ＮＭＤＡでの曝露前に種々の濃度のａｐｏＥ３と３０分間プレインキュベーションを行った（図１１）。培地への損傷細胞によって放出されたＬＤＨ量の測定によって興奮毒性ストレスから２４時間後に細胞損傷を評価した（ＬＤＨ放出＝１分あたりに乳酸をピルビン酸に変換する量（ｎｍｏｌ）；実験手順を参照のこと）。培養物のＮＭＤＡのみへの曝露により、コントロール非処置細胞（１．０１＋／−０．０６；ｐ＜０．０５）と比較してＬＤＨ放出が有意に増加した（２．８２＋／−０．１９）。培養物のａｐｏＥとのプレインキュベーションにより、ＮＭＤＡのみと比較して１〜１０μＭの濃度のＡｐｏＥで有意である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定）、穏やかな用量依存性のＬＤＨ放出の減少が認められた。したがって、ＡｐｏＥ３は、初代ラットニューロン／グリア培地にグルタミン酸興奮毒性に対する穏やかであるが有意な神経保護を付与する。
【０１６４】
小ＡｐｏＥ模倣ペプチドが同様にＮＭＤＡ興奮毒性からニューロン／グリア細胞培養物を保護するという仮説を試験するために、ａｐｏＥの受容体結合領域由来の３つの短縮ａｐｏＥペプチドのパネルを作製した（図１２Ａ；ＡｐｏＥ１３３〜１４９、１３６〜１４９、１３９〜１４９）。ペプチドの構造特性およびヘリックス含有量を評価するために、最初に、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行った（図１２Ｂ）。３つのペプチドのＣＤスペクトルは、２２２ｎｍおよび２０８ｎｍでの有意な最小値によって証明される有機なヘリックス構造が証明された。これらのデータから、３つのペプチドが、類似のらせん度を有する（溶液中に１２〜１４％のヘリックス集団を含む）ことが計算された。本発明者らの研究所で行われた以前の沈降平衡実験では、これらのペプチドは溶液中で単量体として存在することが証明されており、これは、認められたヘリックス構造はヘリックスオリゴマーへのペプチドの自己会合に起因しないことを示す（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。
【０１６５】
初代ニューロン／グリア細胞培養物におけるＮＭＤＡ誘導細胞損傷に対するペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の効果を最初に調査した（図１３）。このペプチドは、以前に本発明者らのグループによって、マウス小グリア細胞機能を調整することができる生物活性を有することが示された（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。初代ラットニューロン／グリア細胞培養物を、最初に、ＮＭＤＡ曝露の３０分前にＡｐｏＥ（１３３〜１４９）とプレインキュベーションを行い、２４時間後にＬＤＨ放出を評価した。培養物のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の非存在下での１００μＭ ＮＭＤＡへの曝露により、非曝露コントロール細胞（０．８８＋／−０．１０；ｐ＜０．０５）と比較してＬＤＨ放出が２倍に増加した（１．７４＋／−０．０６）（図３Ａ）。穏やかにしか保護しないインタクトなＡｐｏＥと対照的に、１７残基のＡｐｏＥペプチドの添加により、１００μＭ ＮＭＤＡ毒性に対して強力な用量依存性保護を示した。
【０１６６】
６μＭ ａｐｏＥ（１３３〜１４９）で認められた最大保護（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定）を有する３μｍＡｐｏＥ（１３３〜１４９）ペプチド濃度を使用して、グルタミン酸毒性からの保護が最初に認められた。予想されるように、スクランブルコントロールペプチドの存在下では保護は認められなかった。驚いたことに、培養物を３００μＭ ＮＭＤＡに曝露した場合、ａｐｏＥ（１３３〜１４９）での培養物の処置では、いかなるペプチド濃度でも細胞を保護できなかった（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＡｐｏＥの受容体結合ドメイン由来の１７アミノ酸残基を含むＡｐｏＥ模倣ペプチドは、ＮＭＤＡ誘導興奮毒性後に神経保護性を示すことを証明する。さらに、このペプチドはインタクトホロタンパク質よりも培養物に保護を付与した。
【０１６７】
本発明者らの初代培養系における神経保護を必要とするペプチドドメインをさらに定義するために、ＮＭＤＡ誘導性細胞損傷に対する短縮ＡｐｏＥペプチドの効果を比較した（図１４）。１７残基のペプチドからの３つのアミノ末端残基の除去により、ＡｐｏＥ（１３６〜１４９）（１４アミノ酸ペプチド）が得られた（図１２Ａ）。６μＭ ＡｐｏＥ（１３６〜１４９）での処置により、１００μＭ ＮＭＤＡ誘導性細胞死を完全に遮断する１７残基の親ペプチド（ＡｐｏＥ（１３３〜１４９））と比較してＮＭＤＡ毒性からの穏やかな保護が付与された（図１４）。対照的に、３つのさらなるアミノ末端残基の欠失により、検出可能な生物活性を保有しない１１残基のペプチド（ＡｐｏＥ（１３９〜１４９））が得られた（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。これらの結果は、１７残基のペプチドＡｐｏＥ（１３３〜１４９）のアミノ末端からの短縮により、ＮＭＤＡ興奮毒性に対する神経保護が段階的に喪失し、アミノ酸ドメインＡｐｏＥ（１３３〜１３６）は、ＡｐｏＥペプチドの生物活性の保持に必要であることを示す。
【０１６８】
親ＡｐｏＥ模倣ペプチドがＮＭＤＡ曝露に関するカルシウム流入の調整によってその保護効果を発揮するかどうかを調査するために、細胞のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）および１００μＭ ＮＭＤＡとのインキュベーション後のカルシウム取り込みを測定した（図１５）。培養物の４５Ｃａ＋＋への曝露から２０分後にカルシウム取り込みを測定した（実験手順を参照のこと）。ＮＭＤＡの非存在下での培養物の６μＭ ＡｐｏＥへの曝露をコントロールとして使用し、カルシウム流入に対する直接的効果は認められなかった（図１５）。ペプチドの非存在下での１００μＭ ＮＭＤＡへの培養物の曝露により、カルシウム流入が誘導され、これは、１０μＭ ＭＫ−８０１との前処置によって完全に逆になった（図１５）。６μＭ ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）での処置により、ＮＭＤＡのみと比較してカルシウム流入が有意に減少するが、６μＭスクランブルコントロールペプチドでの処置ではカルシウム流入に対する効果はなかった（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。したがって、ａｐｏＥの受容体結合ドメイン由来の１７残基のペプチドは、ＮＭＤＡ誘導興奮毒性に関連するカルシウム流入の副作用から細胞を保護することができる。
【０１６９】
次に、ＡｐｏＥ模倣ペプチドの投与とＮＭＤＡ曝露後の保護との間の一過性の関係を試験することを所望した。この目的のために、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）を、ＮＭＤＡ曝露の２４時間前、ＮＭＤＡと同時、またはＮＭＤＡ曝露後に細胞に添加した（図１６；実験手順を参照のこと）。既に述べたように、１００μＭ ＮＭＤＡと同時に６μＭ ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）を投与した場合に強い保護が認められた（図１６）。ＮＭＤＡ曝露の２４時間前の培養物のペプチドとの前処置により、穏やかであるが有意な保護が得られるが、ＮＭＤＡ曝露後のＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の添加により保護は認められなかった。したがって、ＮＭＤＡ曝露の２４時間前に添加した場合にＡｐｏＥ（１３３〜１４９）は穏やかな保護が得られるにもかかわらず、ペプチドの同時投与により最良の保護が認められた（ＡＮＯＶＡおよびその後のダネットの検定；ｐ＜０．０５）。まとめると、これらの結果は、ＡｐｏＥ残基１３３〜１４９から構成される単量体ペプチドは脳虚血の実験的組織培養モデルにおいてグルタミン酸興奮毒性から細胞を保護することができることを証明する。
【０１７０】
（Ｃ．考察）本研究では、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチド配列が脳虚血の組織培養モデルにおいてＮＭＤＡ媒介ニューロン興奮毒性からの保護効果を発揮することが証明される。ＡｐｏＥペプチドのこの神経保護効果は、特異的且つ用量依存性であった。６μＭの濃度では、１７残基ペプチドであるＡｐｏＥ（１３３〜１４９）は、初代ニューロン−グリア細胞培養物の１００μＭ ＮＭＤＡの曝露に関連する神経毒性およびカルシウム流入を、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１ほど完全に遮断した。
【０１７１】
ａｐｏＥ遺伝子型がイソ型特異的様式で神経の回復に影響を与えることを示す複数の臨床報告が存在するにもかかわらず、これが起こる機構の定義は不十分なままである。内因性ａｐｏＥは、酸化ストレス（ＭｉｙａｔａおよびＳｍｉｔｈ、１９９６）、直接神経栄養効果の発揮（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、１９９５）、ＣＮＳ炎症反応の下方制御（Ｌｙｎｃｈら、２００１）、または脳アミロイド沈着の促進による病理学的シャペロンとしての作用（ＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ、１９９２）によって損傷に対するＣＮＳ応答に影響を与え得ることが提案されている。本報告では、インタクトなＡｐｏＥタンパク質もＮＭＤＡ誘導毒性に対して穏やかな程度の神経保護を付与することを見出した。これは、インタクトなＡｐｏＥタンパク質からいかなる神経保護効果も証明できなかった他の最近の研究と対照的である（Ｊｏｒｄａｎら、１９９８；Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。これらの不一致の結果は、方法および実験デザインの相違に一部起因し得る。例えば、Ｌｅｎｄｏｎらは、５μｇ／ｍｌ濃度のＡｐｏＥでは、これ自体でＮＭＤＡ誘導神経毒性に対して穏やかな利点を付与するＨＤＬのみを超えるさらなる神経保護を証明できないことを見出した。不運なことに、この研究では、ＡｐｏＥのみでの結果を研究していなかった（Ｌｅｎｄｏｎら、２０００）。Ｊｏｒｄａｎらはまた、ＮＭＤＡ誘導神経毒性モデルにおいてＡｐｏＥからの保護を証明できなかった。しかし、これらの実験では、ヒト組換えＡｐｏＥよりもむしろならし培地由来のＡｐｏＥを使用し、本研究での３０分間と比較してＡｐｏＥをＮＭＤＡ曝露の５日前にプレインキュベーションしていることに注目すべきである。
【０１７２】
本発明者らの結果により、生物学的に関連する濃度のＡｐｏＥは、興奮毒性細胞死に対して穏やかな程度の神経保護を付与することが示唆される。興味深いことに、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来のペプチドはインタクトなホロタンパク質よりもさらにより強力な神経保護効果を発揮し、１００μＭ ＮＭＤＡへの新皮質ニューロンの曝露に関連する細胞死およびカルシウム流入を完全に遮断した。本発明者らの所見についての１つの説明は、ＡｐｏＥおよびペプチドフラグメントがＮＭＤＡ受容体に結合することである。ＮＭＤＡ受容体の競合性アンタゴニストがより高い興奮毒性負荷でのペプチドの神経保護の損失を説明することができるにもかかわらず、ＮＭＤＡ受容体での競合では、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ由来のペプチドフラグメントを決して証明されない。
【０１７３】
別のもっともらしい説明は、インタクトなＡｐｏＥホロタンパク質と同一の様式での特異的細胞表面受容体との相互作用によって、これらのペプチドが、ＮＭＤＡ毒性に対する生物活性を間接的に発揮するということである。ＡｐｏＥは、細胞表面受容体ファミリー（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＲＰ／α２Ｍ、ＥＲ−２、およびＬＲ８受容体が含まれる）に結合することが公知である（Ｋｉｍら、１９９６；Ｎｏｖａｋら、１９９６）。ＬＤＬ受容体との相互作用に重要なＡｐｏＥの１つの領域は、残基１４０と１６０との間に存在し（Ｍａｈｌｅｙ、１９８８）、この領域の部位特異的変異誘発研究により、電荷および立体配座に影響を与える変異により結合が欠如し得ることが証明されている（Ｌａｌａｚａｒ、１９８８）。本発明者らは、以前に、本研究で使用したものと同一の受容体結合領域由来のペプチドがＡｐｏＥと受容体結合を競合することを証明した（Ｍｉｓｒａら、２００１）。実際、ＡｐｏＥは、ニューロンおよびマクロファージの両方のシグナル伝達カスケードを開始させることが証明されている（Ｍｉｓｒａら、２００１；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。
【０１７４】
最近の報告で、ＬＲＰ受容体がＮＭＤＡ受容体によって媒介されるカルシウムシグナル伝達応答を開始することができることが証明されている（Ｂａｃｓｋａｉら、２０００）。これが起こる正確な機構は定義されないままであるにもかかわらず、著者らは、リガンド結合およびＬＲＰ受容体の二量体化後にＮＭＤＡ活性を調整するニューロン特異的細胞内アダプタータンパク質の存在を推測しており、これがＮＭＤＡ受容体から下流で保護応答を誘導することができると推測している。興味深いことに、最近の所見により、公知の全てのＬＲＰ相互作用を遮断する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の存在は、ＮＭＤＡ興奮毒性の細胞培養パラダイムにおいてＡｐｏＥの神経保護効果を逆転しないことが示唆されている（Ａｏｎｏら、２００２）。
【０１７５】
天然のホロタンパク質では、受容体結合領域は、αヘリックス立体配座で存在する。本発明者らの研究で使用したペプチドフラグメントがこの構造を選択することができることを確認するために、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行った。３つの各試験ペプチドは、溶液中で有意にヘリックス集団を有していた（約１２〜１４％）。さらに、これらのペプチドは、溶液中で単量体として振る舞い、任意のヘリックス構造はペプチド固有のものであり、ヘリックスオリゴマーへの自己会合に起因しない（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。本発明者らの結果は、遊離ペプチドが、受容体結合時に安定となり得るヘリックス立体配座をとることができるという可能性と一致する。
【０１７６】
明らかに、機能的（ａｐｏＥ１３３〜１４９；ａｐｏＥ１３６〜１４９）および非機能的（ａｐｏＥ１３９〜１４９）ペプチドは共に類似のらせん度を有するので、らせん度は生物活性の唯一の決定要因ではない。したがって、これらのＡｐｏＥ模倣ペプチドの神経保護効果はまた、特異的なアミノ酸配列およびサイズに依存するようである。特に、ａｐｏＥ受容体結合領域の残基１３３〜１４９由来の１７アミノ酸ペプチドはＮＭＤＡ曝露の毒性を完全に遮断するが、１４アミノペプチド（ａｐｏＥ１３６〜１４９）では有効性が減少し、１１アミノ酸配列（ａｐｅＥ１３９〜１４９）ではこれに関する生物活性は全て喪失していた。これにより、残基１３３〜１３９は生物活性に重要であることが示唆される。興味深いことに、このドメインは、グリア細胞活性化の下方制御に必要なドメインと同一である（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、２００１）。
【０１７７】
本研究で使用したペプチドは受容体結合領域に由来し、異なるヒトａｐｏＥイソ型に関連する多型領域である残基１１２および１５８を含まないことは注目に値する。したがって、本研究はａｐｏＥイソ型とヒト疾患との間の関連に直接取り組んでいないが、受容体結合領域から離れたアミノ酸の置換がこの領域の立体配座およびその後のａｐｏＥ受容体相互作用に影響を与え得ることが確実なようである。例えば、１５８位のアルギニンのシステインの置換により、この多型が受容体結合領域の外側に存在している場合でさえも、ＡｐｏＥ２がＬＤＬ受容体に結合する能力が顕著に減少する（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら、１９８２）。
【０１７８】
本発明者らの結果は、ＡｐｏＥペプチドフラグメントが神経損傷を引き起こし得ることを最近示唆した他のグループの報告と対照的である。例えば、最近、ＡｐｏＥのカルボキシル末端短縮形態が、おそらく細胞内プロセシングの結果として、ＡＤ患者の脳内に存在することが証明されている。これらのフラグメントは、培養ニューロンにおいて生物活性を示し、細胞骨格タンパク質と相互作用して神経原線維変化に類似する封入体を誘導することができる（Ｈｕａｎｇら、２００１）。
【０１７９】
ＡｐｏＥタンパク質由来のペプチドがＮＭＤＡ誘導興奮毒性に対する神経保護を付与することができるという本発明者らの所見もまた、他の最近の所見と対照的である。これらの研究の大部分は、ａｐｏＥの受容体結合領域由来の縦列反復を使用していた。特に、残基１４１〜１４９の縦列反復から構成される１８アミノ酸ペプチドは、細胞内Ｃａ２＋を増加させ、２つの異なる機構（細胞表面Ｃａ２＋チャネルの活性化および百日咳毒素感受性経路を介した細胞内Ｃ２＋貯蔵物（ｓｔｏｒｅｓ）の放出）を介したτリン酸化を調節する（ＷａｎｇおよびＧｒｕｅｎｓｔｅｉｎ、１９９７）。残基１４１〜１４９の縦列反復から構成されるペプチドを使用して、Ｔｏｌａｒらは、初代海馬ニューロンのこのペプチドへの曝露によりニューロン細胞死（ＭＫ−８０１とのプレインキュベーションによって遮断される効果）が誘導されことを証明した（Ｔｏｌａｒら、１９９９）。これらの結果により、縦列反復ペプチドへの曝露が、直接または間接的機構によってＮＭＤＡ誘導興奮毒性を増幅させるということが予想される。しかし、この縦列反復ペプチドは、本研究で使用したペプチドと実質的に異なることは価値のあることである。最近の報告（Ｍｏｕｌｄｅｒら、１９９９）で、この縦列反復によって誘導されたニューロン細胞死はホロタンパク質によって誘導されるニューロン細胞死と異なる機構を介して起こり得ることが認められ、この縦列反復はインタクトなＡｐｏＥタンパク質の生物学的に関連するモデルではないかもしれないと示唆される。
【０１８０】
まとめると、本発明者らは、ＡｐｏＥの受容体結合領域由来の小ペプチドが初代新皮質培養物のＮＭＤＡへの曝露に関連するカルシウム流入および神経毒性を遮断することを報告する。これらの所見のｉｎ ｖｉｖｏでの妥当性は、ＡｐｏＥが虚血および出血性脳卒中ならびに心肺バイパスおよび心停止後蘇生に関連する全脳低灌流からの神経の回復を調整するようであるという臨床所見と一致する。これらのペプチドで認められる神経保護がインタクトなＡｐｏＥタンパク質への曝露後認められる穏やかな利点よりも高いにもかかわらず、これらの所見により、内因性ＡｐｏＥが虚血損傷の回復に影響を与えることができる１つの機構はグルタミン酸興奮毒性からの保護によることが示唆される。これらのＡｐｏＥ模倣ペプチドの使用は、治療と密接にかかわり、虚血または外傷を負った脳内のこのタンパク質の神経生物学にさらなる洞察を与える。
【実施例１３】
【０１８１】
ＡｐｏＥ模倣ペプチドによるＬＰＳ誘導ＴＮＦαおよびＩＬ−６産生の抑制
敗血症ショックは、集中治療室での最も一般的な死因であり、有意に対処されていない医学上の難問である。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性敗血症の主なメディエーターであり、ＬＰＳによって誘導された炎症性サイトカインの上方制御は、敗血症に関連する全身性炎症反応の媒介で重要な役割を果たす。ＬＰＳの静脈内投与は、グラム陰性敗血症ショックの一般的な動物モデルであり、臨床的に関連する全身性炎症反応を複製する。特に、ＬＰＳの静脈内投与により、全身性炎症の媒介で重要な役割を果たすマクロファージ由来サイトカインであるＴＮＦαおよびＩＬ−６が初期に上方制御される。
【０１８２】
本発明者らは、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）の注射によりＬＰＳ投与後ＴＮＦαおよびＩＬ−５の血清レベルが抑制されることを証明する。これらの方法では、１４〜１６週齢の雄Ｃ５７−ＢＬ６マウスに、尾静脈を介してＬＰＳ（１５０μｌ滅菌等張生理食塩水中１１．２５μ含まれる、すなわち３７５μｇ／ｋｇ）を注射し、その直後に賦形剤（等張滅菌生理食塩水）またはＡｐｏＥ（１３３〜１４９）（２００μｌ用量、１００μｌ、または６．６ｍｇ／ｋｇ（等張生理食塩水で調製））を注射した。ＬＰＳ＋賦形剤群およびＬＰＳ＋ペプチド群（ｎ＝１０動物／群）から以下の測定点における血清サンプルを得た：注射後０（注射前）、１時間、３時間、および２４時間。心臓を介した（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ）穿刺によって採血し、３０分間凝血させた。１６，０００ｇで５分間の遠心分離後に得た血清サンプルを、固相ＥＬＩＳＡによって、ＴＮＦαおよびＩＬ−６についてスクリーニングした。測定点あたり２０匹存在した。
【０１８３】
１時間の注射後、血清ＴＮＦαは、動物がＬＰＳ＋賦形剤またはＬＰＳ＋ａｐｏＥペプチドを投与されたかどうかの関数として有意に減少した（図１７Ａ）。３時間およびベースラインで、ＴＮＦαレベルは測定不可能であった。注射から１時間および３時間後で、血清ＩＬ−６レベルは、動物がＬＰＳ＋賦形剤またはＬＰＳ＋ａｐｏＥペプチドを投与されたかどうかの関数として有意に減少した（図１７Ｂ）。２４時間およびベースラインで、ＩＬ−６レベルは測定不可能であった。このデータにより、ＡｐｏＥ（１３３〜１４９）はＬＰＳの存在下でＴＮＦαおよびＩＬ−６産生を抑制することが明らかとなり、したがって、ＡｐｏＥ模倣ペプチドは初期敗血症患者の薬物使用状況で治療潜在性を有し得ることが示唆される。
【０１８４】
（参考文献）
本明細書中で引用された全ての引例および特許書類は、その全体が本明細書中で参考として援用され、以下の文献が含まれるが、これらに限定されない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
麻酔組成物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項２】
前記ＡｐｏＥペプチドが、受容体結合ペプチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
慢性疼痛の緩和または軽減のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項５】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
薬物乱用の矯正または予防のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項８】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
敗血症に関連する炎症の治療または軽減のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項１１】
前記薬物の被験体への投与により、前記化合物の非存在下と比較して炎症性サイトカインが減少する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記炎症性サイトカインには、ＴＮＦ＊またはＩＬ−６が含まれる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬物が、抗炎症性サイトカインおよびモノクローナル抗体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物をさらに含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−１０、形質転換成長β因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦＮ−φ、マクロファージ遊走阻止因子、および高速移動性１群タンパク質からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、抗内毒素抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、および抗ＣＤ１４抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１】
麻酔組成物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項２】
前記ＡｐｏＥペプチドが、受容体結合ペプチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
慢性疼痛の緩和または軽減のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項５】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
薬物乱用の矯正または予防のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項８】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
敗血症に関連する炎症の治療または軽減のための薬物の製造のためのＡｐｏＥペプチドの使用。
【請求項１１】
前記薬物の被験体への投与により、前記化合物の非存在下と比較して炎症性サイトカインが減少する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記炎症性サイトカインには、ＴＮＦ＊またはＩＬ−６が含まれる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬物が、抗炎症性サイトカインおよびモノクローナル抗体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物をさらに含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−１０、形質転換成長β因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦＮ−φ、マクロファージ遊走阻止因子、および高速移動性１群タンパク質からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、抗内毒素抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、および抗ＣＤ１４抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＡｐｏＥペプチドが受容体結合ペプチドである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号１０からなる群から選択される配列を有する、請求項１６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−１６１５４８（Ｐ２００９−１６１５４８Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４９３９９（Ｐ２００９−４９３９９）
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【分割の表示】特願２００３−５３０１２５（Ｐ２００３−５３０１２５）の分割
【原出願日】平成１４年９月２３日（２００２．９．２３）
【出願人】（５０４１１１４６２）コグノッシ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【分割の表示】特願２００３−５３０１２５（Ｐ２００３−５３０１２５）の分割
【原出願日】平成１４年９月２３日（２００２．９．２３）
【出願人】（５０４１１１４６２）コグノッシ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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