尿酸オキシダーゼ
【課題】尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）タンパク質およびそれをコード化している核酸分子及び有用なその断片、該核酸分子を含んでいるベクター、該ベクターを含んでいる宿主細胞及びウリカーゼタンパク質及び核酸分子を使用し作製する方法を提供する。
【解決手段】特に減少した免疫原性および増加した生物利用能を持つ改良された修飾ウリカーゼタンパク質を作るための中間体として特に有用であるウリカーゼタンパク質。
【解決手段】特に減少した免疫原性および増加した生物利用能を持つ改良された修飾ウリカーゼタンパク質を作るための中間体として特に有用であるウリカーゼタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９８年８月６日に出願された米国特許仮出願第６０／０９５，４８９号（全内容が本明細書において援用される）の利益を請求する。本明細書に開示されている本発明は、米国国立保健研究所から与えられた補助金番号ＤＫ４８５２９により、米国政府の支援のもとで行われた。政府は本発明にある種の権利を持っている。
【０００２】
本発明は、一般に尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）タンパク質およびそれをコード化している核酸分子に関している。特に、本発明は例えば、減少した免疫原性および増加した生物利用能を持つ改良された修飾ウリカーゼタンパク質を作るための中間体として特に有用であるウリカーゼタンパク質に関している。本発明の好適な修飾ウリカーゼタンパク質には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド）へ共有結合で結合されたウリカーゼタンパク質が含まれる。従って、本発明はウリカーゼタンパク質、該タンパク質へ特異的に結合する抗体、ウリカーゼタンパク質をコード化している核酸分子および有用なその断片、該核酸分子を含んでいるベクター、該ベクターを含んでいる宿主細胞およびウリカーゼタンパク質および核酸分子を使用するおよび作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
痛風は４０歳以上の男の人における最も普通な炎症性関節疾患である（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ １９９０）。疼痛性痛風性関節炎は、尿酸の血中レベルが上昇し（高尿酸血症）、尿酸一ナトリウム 一水和物の顕微鏡的結晶の挿間的形成が関節で起こった場合に生じる。時間が経過すると、慢性高尿酸血症はまた関節周囲、軟組織中およびいくつかの器官での破壊的結晶性尿酸沈着（痛風結節）を起こす（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９６）。尿酸は尿への溶解度が限られており、過剰に分泌されると（高尿酸尿）腎結石（尿酸結石）を起こす。ある種の悪性腫瘍の患者において（特に白血病およびリンパ腫）、著しい高尿酸血症および高尿酸尿症（促進された腫瘍細胞代謝回転および化学療法の間の溶解による）は急性、閉塞性腎疾患に対する容易ならない危険性を生じさせる（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９５６；Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ １９５７；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８０；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９０）。重度の高尿酸血症および痛風は、器官同種移植片拒否反応を防ぐためのシクロスポリン治療を含む種々の原因による腎機能不全に関連している（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．１９８７；Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９９０；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｌ １９９５）。
【０００４】
高尿酸血症は尿酸の過剰産生および排出不足の両方で起こりうる（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ １９７６；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｒｏｅｓｓｌｅｒ １９９５）。軽度の場合、高尿酸血症は食餌療法で制御できるが、宣告されおよび重度の臨床的結果が付随する場合は、尿酸排出を促進する尿酸排泄薬（もし腎機能が低下していると有効ではない）または尿酸形成を阻止するキサンチンオキシダーゼ阻害薬アロプリノールの様な薬剤による処置を必要とする。アロプリノールは結節性痛風、腎不全、白血病およびいくつかの遺伝性障害を持つ患者における治療の頼みの綱である。高尿酸血症での処置は一般的に有効であり十分に許容されている。しかしながら、変質した、不適格になった結節性痛風を患っている患者はすべての通常の治療では治りにくい（Ｂｅｃｋｅｒ １９８８；Ｆａｍ １９９０；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｒｙａｎ １９９５）。さらに、アロプリノールで処置された患者の２％にはアレルギー反応が発生し、約０．４％で重度の過敏性症候群が起こる（Ｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ １９８６；Ａｒｅｌｌａｎｏ ａｎｄ Ｓａｃｒｉｓｔａｎ １９９３）。このしばしば生命を脅かす症候群は急性腎および肝不全および重度の皮膚障害（中毒性表皮壊死、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群）を起こすことができる。アロプリノールはまた、白血病の処置におよび器官同種移植片拒絶反応の防止に使用される薬剤であるアザチオプリンおよび６−メルカプトプリンの代謝を妨害し、その状態では著しい高尿酸血症が起こり、重度の痛風を起こすか、または腎機能を脅かすであろう。
【０００５】
究極的には、高尿酸血症は進化の間における尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）ヒト遺伝子の突然変異的不活性化の結果である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。ほとんどの非ヒト霊長類および他の哺乳類の肝臓ペルオキシソーム中の活性なウリカーゼは尿酸をアラントイン（＋ＣＯ２およびＨ２Ｏ２）に変換し、それは尿酸よりも８０−１００倍可溶性であり、腎臓でより効率的に処理される。アスペルギルス フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）から調製された非経口的ウリカーゼ（ＵｒｉｃｏｚｙｍｅＲ，Ｃｌｉｎ−Ｍｉｄｙ，Ｐａｒｉｓ）がフランスおよびイタリアで２０年以上にわたって白血病化学療法に関連した重度の高尿酸血症を治療するために使用されており（Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ １９５７；Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９６８；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７２；Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９７２；Ｐｏｔａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９７５；Ｚｉｔｔｏｕｎ ｅｔ ａｌ．１９７６；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８；Ｍａｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９８２）、米国において白血病患者の最近の臨床試験でも使用されている（Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ウリカーゼはアロプリノールよりも迅速に作用を示す（Ｍａｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９８２；Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。痛風患者において、ウリカーゼ注入は急性発作を中断させ、痛風結節の大きさを減少させることができる（Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９６８；Ｐｏｔａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９７５；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８）。
【０００６】
化学療法の短期間の間の急性高尿酸血症を治療するには有効であるが、Ａ．フラーブス ウリカーゼの毎日の注入は再発または結節性痛風を治療するには重大な欠点がある。加えて、Ａ．フラーブス ウリカーゼの効力は抗ウリカーゼ抗体を発生する患者では急速に減弱する（Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ． １９６８；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８；Ｅｓｃｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｍｏｕｒａｄ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｓｉｂｏｎｙ ｅｔ ａｌ．１９８４）。アナフィラキシーを含む重度のアレルギー反応が起こっている（Ｄｏｎａｄｉｏ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｍｏｎｔａｇｎａｃ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ １９９０；Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。長い時間働き、免疫原性がより少ないウリカーゼ製剤が長期的治療で明らかに必要とされている。
【０００７】
プロテアーゼおよび免疫系から外因性酵素を隔離する一つの方法は、不活性で、無毒のポリマー、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質の表面へ共有結合で結合させることである（Ｈａｍｓ ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ １９９７）。Ｍｒ〜１．０００から＞１０，０００のＰＥＧの使用は、動物においていくつかの外来タンパク質の循環寿命を延長させ、免疫原性を減少させることを最初に示している（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９７７ａ；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９７７ｂ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８１ａ；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９１）。１９９０年、Ｍｒ５０００のＰＥＧで修飾されたウシアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）（ＰＥＧ−ＡＤＡ、ＡＤＡＧＥＮＲ、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．により製造された）がＡＤＡ欠乏による重度の複合免疫不全症の処置（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９８７）に米国食品薬品局により認証された最初のＰＥＧ化タンパク質になった。過去１２年以上にわたる経験は、ＰＥＧ−ＡＤＡによる長期的処置の間に、ほとんどの患者で高感度ＥＬＩＳＡを用いると抗ＡＤＡ抗体は検出できるが、アレルギーまたは過敏性反応は起こっておらず；少数の抗ＡＤＡ抗体産生患者でＰＥＧ−ＡＤＡの加速されたクリアランスが起こっているが、これは通常一時的な効果であったことを示している（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９７）。ＡＤＡ欠損患者の免疫機能は通常、ＰＥＧ−ＡＤＡによる処置の間に正常にはならないことを理解すべきである（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９５；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ １９９５）。従って、正常な免疫機能を持つ患者の長期的処置のためのＰＥＧ化タンパク質の開発において、免疫原性がより重大な問題であろう。
【０００８】
免疫原性とは、抗原製剤（ＰＲＧ修飾タンパク質または非修飾タンパク質のような）の注射による免疫応答誘導に関連しており、一方、抗原性とは抗原と前から存在している抗体との反応を意味していることを当業者は理解するであろう。集合的に、抗原性および免疫原性が免疫反応性と称される。ＰＥＧ−ウリカーゼの従来の研究において、免疫反応性は：インビトロでのＰＥＧ−ウリカーゼと前もって形成された抗体との反応；誘導された抗体合成の測定；および反復注射後の促進されたクリアランス速度を含む種々の方法により評価されてきた。
【０００９】
ＰＥＧ化は免疫原性を減少させ、動物において真菌およびブタウリカーゼの循環寿命を延長することが示されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｓａｖｏｃａ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ＰＥＧ修飾カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ウリカーゼは５人の正常尿酸血を持つボランティアにおいて血清尿酸を検出できないレベルまで急速に低下させた（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８１ｂ）。Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．で製造されたＰＥＧ化アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ウリカーゼが、腎不全および著しい高尿酸血症を示していたリンパ腫を持つアロプリノール過敏性患者を処置するために実験的に使用された（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｌ９８９）。約２週間に４回、筋肉内注射で投与された。この短期間の間に、高尿酸血症が制御され、患者の血清中の抗ウリカーゼ抗体はＥＬＩＳＡでは検出できなかった。この製剤のさらなる使用および臨床開発は続行されていない。
【００１０】
現在まで、長期的治療において安全におよび信頼できるように、適当に長い循環寿命を持ちおよび十分に免疫原性が低められたウリカーゼまたはＰＥＧ−ウリカーゼの形は開発されていない。本発明の目的は、ＰＥＧ化と組み合わせて、これらの要求を満たすことができるウリカーゼの改良形を提供することである。本発明は、潜在的免疫原性エピトープを覆い隠すため、ＰＥＧ化の能力を促進することが示されている様式で突然変異により修飾された、哺乳動物由来の独特な組換え体ウリカーゼである。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約
新規ウリカーゼタンパク質およびそれをコード化している核酸を提供するのが本発明の一般的目的である。
【００１２】
本明細書に記載されているような、組換え的に産生されたウリカーゼタンパク質を精製する方法を提供するのも本発明の別の目的である。
本発明のウリカーゼタンパク質を含んでいる組成物を哺乳動物に投与することにより体液中の尿酸量を減少させる方法を提供するのが本発明のさらなる目的である。
【００１３】
本明細書に記載したウリカーゼタンパク質に対する抗体を提供するのも本発明のさらに別の目的である。
本明細書に記載されている核酸配列を含んでいるベクターおよび宿主細胞、およびそれによりコードされているウリカーゼタンパク質を産生するためにそれらを使用する方法を提供するのも本発明の別の目的である。
【００１４】
本発明は、非修飾酵素の尿酸分解活性のほとんどすべてを保持し、実質的に非免疫原性であるＰＥＧ−ウリカーゼを生成するために使用されるウリカーゼタンパク質を提供する。尿酸分解活性は本明細書ではｍｇタンパク質当たりの国際単位（ＩＵ）で表現されており、ここでウリカーゼ活性のＩＵは分当たり１マイクロモルの尿酸を消費する酵素量として定義されている。
【００１５】
本発明は一つまたはそれ以上のリジン残基を挿入するように修飾されている哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、組換え体タンパク質とは人工的に生成されたタンパク質であり、天然に生成されるタンパク質（即ち、問題とする特異的タンパク質の天然の遺伝子のみを所有する動物の組織で生成されたもの）とは区別される。タンパク質はペプチドおよびアミノ酸配列を含んでいる。本発明の組換え体ウリカーゼタンパク質は、二つまたはそれ以上の哺乳動物タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列のキメラまたはハイブリッドであろう。一つの態様において、本発明は哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を製造するために使用でき、そのタンパク質は、組換え体ウリカーゼタンパク質のＰＥＧ化後のＰＥＧ化ウリカーゼ生成物が実質的に非修飾ウリカーゼと同様に酵素的に活性であり、およびＰＥＧ化ウリカーゼ生成物が受容可能な免疫原性である点までリジンの数を増加するように修飾されている。本発明の端が切断されたウリカーゼもまた考慮されており、ウリカーゼのアミノおよび／またはカルボキシ末端は存在していないであろう。好適には、該ウリカーゼはリジンが除去されない程度に端が切断されているであろう。
【００１６】
対になったウリカーゼ−担体複合体は、ウリカーゼの酵素活性を実質的に減少させるほど多くの結合を、または受容不可能な免疫原性が残存するほど少ない結合を含んでいてはならないことを当業者は理解するであろう。好適には、複合体は非修飾ウリカーゼタンパク質の尿酸分解活性の少なくとも約７０％から約９０％を保持し、一方、非修飾ウリカーゼタンパク質と比較して貯蔵で、哺乳動物血漿および／または血清中、生理学的温度でその酵素的活性を保持するようにより安定であろう。尿酸分解活性の約８０％から約８５％の保持が受容可能であろう。さらに、好適な態様において、該複合体は非修飾ウリカーゼタンパク質よりも実質的に減少した免疫原性および／または免疫反応性を提供する。一つの態様において、本発明は、ウリカーゼタンパク質に含まれているリジンの少なくとも一つに共有結合で結合された、ＰＥＧのような無毒で、非免疫原性で、医薬として受容可能な担体の結合により修飾できるウリカーゼタンパク質を提供する。もしくは、ウリカーゼタンパク質はそのアミノ酸配列の約１０未満のリジンを通した、担体への共有結合での結合により修飾されている。２、３、４、５、６、７、８または９つの任意のリジンへの結合が別の態様で考慮されている。
【００１７】
本発明のウリカーゼタンパク質はブタおよびヒヒ肝臓ウリカーゼタンパク質のセグメントを含む組換え分子である。修飾ヒヒ配列もまた提供される。一つの態様において、本発明はブタウリカーゼのアミノ酸（ａａ）１−２２５（配列ＩＤ番号：７）およびヒヒウリカーゼのａａ２２６−３０４（配列ＩＤ番号：６）を含むキメラのブタ−ヒヒウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ（配列ＩＤ番号：２））を提供する（図５の配列も参照されたい）。別の態様において、本発明はブタウリカーゼのアミノ酸（ａａ）１−２２８およびヒヒウリカーゼのａａ２２９−３０４を含むキメラのブタ−ヒヒウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）を提供する（配列ＩＤ番号：４）。ＰＢＣおよびＰＫＳの端が切り取られた誘導体もまた考慮される。好適な端切断誘導体形は、６アミノ末端アミノ酸または３カルボキシ末端アミノ酸またはその両方が欠失するように切断されたＰＢＣおよびＰＫＳタンパク質である。代表的配列は配列ＩＤ番号：８（ＰＢＣアミノ切断）、９（ＰＢＣカルボキシ切断）、１０（ＰＫＳアミノ切断）および１１（ＰＫＳカルボキシ切断）に示されている。ＰＢＣウリカーゼ、ＰＫＳウリカーゼおよびそれらの端切断形の各々は、クローン化されている他の哺乳動物ウリカーゼに観察されるよりも１つから４つ以上多いリジン残基を持っている。
【００１８】
本発明は本明細書に記載したようなウリカーゼタンパク質および端が切断されたタンパク質をコードしている、単離され、精製されたおよび／またはクローン化された形の核酸分子を含む核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）分子（配列）を提供する。好適な具体例は配列ＩＤ番号：１（ＰＢＣウリカーゼ）および配列ＩＤ番号：３（ＰＫＳウリカーゼ）に示されている。
【００１９】
これらの核酸分子を含んでいるベクター（発現およびクローニング）もまた本発明により提供される。
さらに、本発明はこれらのベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
【００２０】
本発明のウリカーゼタンパク質に特異的に結合する抗体も提供される。ブタウリカーゼのアミノ部分に対する抗体およびヒヒウリカーゼのカルボキシ部分に対する抗体は、協同して使用された場合、ＰＢＣまたは他の類似のキメラタンパク質の検出に有用であろう。好適には、キメラウリカーゼのアミノ部分に対する抗体はヒヒウリカーゼのアミノ部分を認識できないに違いないし、同様に、キメラウリカーゼのカルボキシ部分に対する抗体はブタウリカーゼのカルボキシ部分を認識できないに違いない。より好適には、抗体はＰＢＣまたはＰＫＳを特異的に結合するが、ブタおよび／またはヒヒウリカーゼのような天然のタンパク質には結合しない。
【００２１】
別の態様において、本発明は尿および／または血清または血漿のような体液中の尿酸量を減少させるための医薬組成物の製造に使用でき、それは本明細書に記載した少なくとも一つのウリカーゼタンパク質またはウリカーゼ複合体および医薬として受容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含んでいる。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物の体液中の尿酸量を減少させるための方法にも使用できる。該方法は尿酸を減少させるのに有効な量の、本発明のウリカーゼまたはウリカーゼ複合体および希釈剤、担体または賦形剤（好適には医薬として受容可能な担体、希釈剤または賦形剤である）を哺乳動物に投与することを含んでいる。処置されるべき哺乳動物は好適にはヒトである。
【００２３】
投与工程は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内経路による注射であろう。上昇した尿酸レベルは血液または尿中であり、痛風、痛風結節、腎不全、器官移植または悪性腫瘍疾患に関連したものであろう。
【００２４】
別の態様において、本発明は、例えば、組換え製造法からの例えば細胞または細胞内破片を含んでいるウリカーゼ溶液から、ウリカーゼを単離および／または精製するための方法を提供する。好適には、精製方法は、約７から約８．５のｐＨで可溶性である大多数のタンパク質を除くためにこの低いｐＨ範囲で粗組換え体抽出物を洗浄し、その後、活性なウリカーゼを約１０から約１１のｐＨ（好適には約１０．２）で緩衝液（好適には炭酸ナトリウム緩衝液）に可溶化する。可溶化活性ウリカーゼは次にＱセファロースカラムのようなアニオン交換カラムにかけ、約ｐＨ８．５の緩衝液での低塩濃度から高塩濃度への濃度勾配で洗浄し、その後、約１０から約１１のｐＨの炭酸ナトリウム緩衝液での塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させることにより精製されたウリカーゼが得られる。酵素は約１０から約１１のｐＨでのゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製される。この段階で、選択的にウリカーゼを沈殿させるために（しかしより可溶性の夾雑物は沈殿しない）約８．５またはそれ未満へｐＨを低下させることにより本酵素はさらに精製される。低ｐＨ（７−８）で洗浄後、ウリカーゼを約１０．２のｐＨで可溶化する。ウリカーゼ調製試料は次に、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他のクロマトグラフィー法、光散乱、遠心分離および／または電気泳動のような医薬製造の分野で知られている方法により分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥ（１２％ゲル）分析。
【図２】天然およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼの循環寿命。
【図３】尿酸の血清および尿濃度と血清ウリカーゼ活性の関係。
【図４】反復注射後におけるウリカーゼ活性の循環寿命（血清で測定された）の維持。
【図５】図５はブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）（配列番号：２）および突然変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含んでいるブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）（配列番号：４）の演繹されたアミノ酸配列を示しており、ブタ（配列番号：７）およびヒヒ（配列番号：６）配列と比較されている。
【図６】ＰＫＳ（配列番号：４）およびブタ（配列番号：７）ウリカーゼのアミノ酸配列比較。
【図７】ＰＢＣ（配列番号：２）およびＰＫＳ（配列番号：４）のアミノ酸配列比較。
【図８】ＰＢＣ（配列番号：２）およびブタ（配列番号：７）ウリカーゼのアミノ酸配列比較。
【図９】ブタウリカーゼ（配列番号：７）およびＤ３Ｈ（配列番号：５）のアミノ酸配列比較。
【図１０】ＰＢＣ（配列番号：２）およびＤ３Ｈ（配列番号：５）のアミノ酸配列比較。
【図１１−１】ＰＫＳ（配列番号：３）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１１−２】ＰＫＳ（配列番号：３）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１２−１】ＰＫＳ（配列番号：３）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１２−２】ＰＫＳ（配列番号：３）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１３−１】ＰＢＣ（配列番号：１）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１３−２】ＰＢＣ（配列番号：１）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１４−１】ＰＢＣ（配列番号：１）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１４−２】ＰＢＣ（配列番号：１）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、水溶性ポリマー（好適には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド））とウリカーゼの改良されたウリカーゼ複合体のために有用な中間体であるウリカーゼタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、特に示さない限りウリカーゼとは個々のサブユニットならびに天然のテトラマーを含んでいる。
【００２７】
ヒトは活性酵素を作ることはできないが、ウリカーゼｍＲＮＡ転写体はヒト肝臓ＲＮＡから増幅されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。いくらかのヒトウリカーゼ転写体が翻訳されるのは理論的には可能である；ペプチド生成物が完全長でなく、または不安定であっても、それらは抗原提示細胞により処理され、処置に使用された外因性ウリカーゼに対する免疫応答の決定に役割を果たすことができる。理論的には、二つのナンセンス変異を除去することによりヒトウリカーゼｃＤＮＡを再構築および発現することが可能であろう。しかしながら、選択的圧力がない場合、最初のナンセンス変異が導入されてから数百万年の間にヒト遺伝子に有害なミスセンス変異が蓄積されてきたことは非常にありそうである（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。最大の触媒活性およびタンパク質安定性を得るためにすべての突然変異を同定および”訂正”することは非常に困難であろう。
【００２８】
本発明者は、ヒトウリカーゼの演繹されたアミノ酸配列とブタ（約８６％）およびヒヒ（約９２％）の配列間には高い度合いの相同性（類似性）が存在するが（類似の尺度の例として図６−１４を参照されたい）、一方、ヒトおよびＡ．フラーブス ウリカーゼ間は＜４０％であることを認めた（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｌｅｇｏｕｘ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。本発明は、より遠い関係の真菌または細菌酵素よりヒトに対して免疫原性が少ないように設計されている二つの異なった哺乳動物から組換え的に生成されたキメラウリカーゼタンパク質を提供する。哺乳動物ウリカーゼ誘導体の使用は患者および医者に対しより受容可能であることが期待される。
【００２９】
ＰＥＧ−ＡＤＡの作製および他のタンパク質の修飾に使用されてきた活性化ＰＥＧはアミノ末端残基の一級アミノ基（存在し、ブロックされていない場合）およびリジンのイプシロン−アミノ基を攻撃することが経験により示されている。この方法は温和な反応条件が使用できること、および陽性に荷電したリジンはタンパク質の表面に位置する傾向があることなどのため有用である。後の点は、治療的タンパク質にとって、ＰＥＧ化の望ましい効果はＰＥＧポリマーの特性（例えば、質量、分岐または非分岐構造など）、ならびにエピトープに関連するタンパク質のＰＥＧ結合部位の数および分布およびタンパク質の機能およびクリアランスを決定する構造要素に一部依存するであろうから重要である。ＰＥＧ付加のために半選択的に新規リジン残基を導入することにより、エピトープを覆いおよび免疫原性を減少させるＰＥＧ化の能力を促進させる方法が考案されている（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９１）。この方法は選択されたアルギニンコドンをリジンコドンへ置き換える突然変異発生を用いており、置換は陽性荷電を保ちおよびコンピューター予測の表面確立および抗原性に対して最少の影響しか及ばさない（アミノ酸配列が既知である場合のみ有用である）。
【００３０】
この方法の試験的実験として、組換え体大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＰＮＰ）（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９１）が使用された。３つの部位でＡｒｇからＬｙｓへの置換が導入され、触媒活性を変えることなくサブユニット当たりのリジン数が１４から１７へ増加された。過剰のジスクシニル−ＰＥＧ５０００による接近可能なＮＨ２基の約７０％の修飾後、精製３重突然変異体は完全な活性を保持していた。ＰＥＧ化前および後の反応性アミノ基の滴定は、３重突然変異体はサブユニット当たり野生型よりも一つ多いＰＥＧ鎖に接近できたことを示唆している。ＰＥＧ化はマウスにおいて野生型および突然変異体ＥＰＮＰ酵素両方の循環寿命を〜４時間から＞６日へ増加させた。１週／２週間隔での一連の注射後、両方の非修飾ＥＰＮＰ酵素で処置されたすべてのマウス、およびＰＥＧ化野生型ＥＰＮＰを注射した１６匹のうちの１０匹（６０％）が高レベルの抗ＥＰＮＰ抗体を発生し、循環寿命を著しく減少させた。対照的に、突然変異体ＰＥＧ−ＡＤＡで処置したマウスは１２匹の内２匹（１７％）が急速なクリアランスを発生した；これらのマウスにおける低レベルの抗体は循環寿命とは相関していない。従って、活性化ＰＥＧでの処理後に３つの新しいリジンの内のただ１つが修飾されただけであるが、この方法は実質的に免疫原性を減少させることに成功した。
【００３１】
ヒヒおよびブタウリカーゼサブユニットは各々３０４のアミノ酸から成っており、その２９（即ち、約１０残基に１つ）はリジンである。最初にヒヒウリカーゼのクローン化ｃＤＮＡ内の２つのＡｒｇからＬｙｓへの置換、および２０８位（ヒトウリカーゼ遺伝子でＬｙｓであることが知られている）のＧｌｕコドンをＬｙｓへ置換する試みは、非常に減少したウリカーゼ触媒活性を持つ突然変異体ヒヒタンパク質を発現する結果を与えた。哺乳動物ＤＮＡにおけるアルギニンからリジンへの突然変異後、ウリカーゼ酵素活性を維持する能力は予測できないことがこの実験から明らかにされた。
【００３２】
その後、ヒヒウリカーゼ中のアミノ酸残基２９１はリジンであるが、ブタの対応する残基はアルギニンであることが認められた。両方のｃＤＮＡ中に存在しているＡｐａＩ制限部位が、最初の２２５アミノ酸がブタｃＤＮＡから誘導され、カルボキシ末端７９がヒヒｃＤＮＡから誘導されるキメラウリカーゼを構築するために利用された。生じたブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼ（配列ＩＤ番号：２）は３０のリジンを持っており、両方の”親”酵素より１つ多い。ＰＢＣウリカーゼのさらなる特色は、その”ヒヒ”部分がヒトウリカーゼと７９残基の内の４つしか異なっていないことであり、一方、ブタおよびヒトウリカーゼは同じ領域で１０残基が異なっている。ＰＢＣの修飾体が次に構築され、それは２９１位の特別なリジンを維持し、ブタウリカーゼとは残基３０１のスレオニンがセリンに置換されていることが異なっている（”ＰｉｇＫＳ”ウリカーゼ（配列ＩＤ番号：４））。リジンのいくつかの他の挿入は活性に有害であったという前の段落に記載した結果を考慮すると、ＰＢＣおよびＰＫＳキメラウリカーゼは突然変異を生じてない天然のブタウリカーゼと比較して同じように十分に活性であることは期待されなかったが、突然変異を生じていない天然のヒヒウリカーゼよりは約４倍以上活性であった。
【００３３】
本発明は、ブタおよびヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の一部から組み立てられた組換え体ブタ−ヒヒキメラウリカーゼを提供する。そのようなキメラウリカーゼの１つの例はブタウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：７）からの最初の２２５アミノ酸およびヒヒウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：６）からの最後の７９アミノ酸を含んでいる（ブタ−ヒヒウリカーゼ、またはＰＢＣウリカーゼ；図６および配列ＩＤ番号：２）。そのようなキメラウリカーゼの別の例はブタウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：７）からの最初の２８８アミノ酸およびヒヒウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：６）からの最後の１６アミノ酸を含んでいる。後者の配列はブタ配列と２つの位置でしか異なっておらず（残基２９１にアルギニンの代わりにリジン（Ｋ）および残基３０１のスレオニンの代わりにセリン（Ｓ）を持っている）、この突然変異体はブタ−ＫＳまたはＰＫＳウリカーゼと称される。
【００３４】
本発明のタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいるベクター（発現およびクローニング）もまた提供される。好適なベクターは本明細書で例示したようなものを含んでいる。当業者はプラスミドのような発現ベクター内へ、発現のために適切な配向でおよび正しい読み枠に核酸が挿入されることを認識するであろう。必要に応じ、核酸（ＤＮＡ）は所望の宿主により認識される適当な転写および翻訳制御ヌクレオチド配列へ連結されるであろうが、そのような制御要素は一般的に本分野で使用されおよび既知である発現ベクターで入手可能である。ベクターは続いて標準技術により宿主細胞内へ導入される。一般に、宿主細胞のすべてがベクターにより形質転換されるわけではないであろう。従って、形質転換される宿主細胞を選択する必要がある。本分野で知られている一つのそのような選択法は、抗生物質耐性のような形質転換された細胞中での選択可能なマーカー特性をコードしている必須な制御要素とともにＤＮＡ配列を発現ベクター内へ取り込ませることを含んでいる。もしくは、そのような選択可能特性のための遺伝子は、所望の宿主細胞の同時形質転換に使用される別のベクターに存在してもよい。ベクターはまた、適当なプロモーターを含むことができる（それらとともに形質転換される大腸菌のような細菌宿主細胞中のＤＮＡの発現（転写および翻訳）が可能な原核生物プロモーター）。細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス セレビジエ）、糸状菌（例えば、アスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が本分野で知られており、利用可能である。
【００３５】
適したベクターには、例えば、原核生物での増殖にはＣｏｌＥ１ ｏｒｉのような原核生物レプリコンが含まれる。典型的な原核生物ベクタープラスミドとしてＢｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ３２２およびｐＢＲ３２９、およびＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＴｃｒ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３がある。典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはクローン化遺伝子の発現を駆動するのにＳＶ４０後期プロモーターを使っており、ＣＯＳ−１のようなＴ抗原産生細胞で最も高いレベルの発現が観察されている。誘導可能哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。このベクターはクローン化遺伝子の発現を駆動するのにマウス乳腺腫瘍ウイルスロングターミナルレピートのグルココルチコイド−誘導可能プロモーターを使っている。有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込み型プラスミド（Ｙｉｐ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
【００３６】
さらに、本発明はこれらのベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞には本明細書で例示および記載しているものが含まれる。
本発明のウリカーゼタンパク質は、タンパク質の生物学的半減期および溶解性を改良するためおよびその免疫反応性を減少させるために比較的少数のＰＥＧ鎖へ、生物学的に安定で、無毒の共有結合を通して複合体形成されているであろう。そのような結合にはウレタン（カーバメート）結合、二級アミン結合およびアミド結合が含まれる。そのような複合体化に適した種々の活性化ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ．から入手可能である。
【００３７】
本発明はまた、複合体としてのウリカーゼタンパク質の医薬組成物を製造するために使用される。これらの複合体は実質的に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７０％、好適には８０％およびより好適には少なくとも約９０％またはそれ以上を保持している。本発明での使用に適した水溶性ポリマーには、直線状および分岐ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド）が含まれる（すべて通常ＰＥＧとして知られている）。分岐鎖ＰＥＧの一つの例は米国特許第５，６４３，５７５号の主題である。
【００３８】
本発明の一つの態様において、ウリカーゼサブユニット当たりに挿入されているリジンの平均数は１から１０の間である。好適な態様において、ウリカーゼサブユニット当たりの追加のリジン数は２から８の間である。追加のリジンの数はウリカーゼの触媒活性に有害であるほど多くあるべきではないことは理解されている。複合体のＰＥＧ分子は好適にはウリカーゼタンパク質のリジンを通して、より好適には、天然には存在しないリジンまたは天然にはその位置に含まれていないが設計されたタンパク質の一部へ導入されたリジンを通して結合されている。
【００３９】
本発明は利用可能で無害なウリカーゼタンパク質へのＰＥＧ結合部位を増加させる方法を提供し、ここで天然のウリカーゼタンパク質は少なくとも一つのリジン残基が導入されるような様式で突然変異される。好適には、本方法はアルギニンをリジンで置き換えることを含んでいる。
【００４０】
本発明を利用するＰＥＧ−ウリカーゼ複合体は哺乳動物（好適にはヒト）の血液および／または尿中の尿酸濃度を低下させる（即ち、量を減少させる）ために有用であり、従って、痛風、痛風結節、腎不全、器官移植および悪性腫瘍疾患を含む状態に関連して上昇した尿酸レベルの処置に使用できる。
【００４１】
ＰＥＧ−ウリカーゼ複合体は、経口、浣腸剤または座剤により、静脈内、皮下、皮内、筋肉内および腹腔内経路を含む多くの経路により、過剰の尿酸レベルを持っている哺乳動物内へ導入される。Ｐａｔｔｏｎ，ＪＳ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ８：１７９−２２８。
【００４２】
ＰＥＧ−ウリカーゼの有効量は、尿酸のレベルおよび個体の大きさに依存するであろう。本発明のこの態様の一つの実施例において、ＰＥＧ−ウリカーゼは約１０μｇから約１ｇの量範囲で、医薬として受容可能な賦形剤または希釈剤とともに投与される。好適な態様において、投与される量は約１００μｇから５００ｍｇの間である。より好適には、複合体化ウリカーゼは１ｍｇから１００ｍｇの間の量（例えば、５ｍｇ、２０ｍｇまたは５０ｍｇ）で投与される。実施態様の用量で与えられた量は複合体中のタンパク質量を意味している。
【００４３】
ＰＥＧ−ウリカーゼを含んでいる医薬処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９８５）Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏ．、に記載されているような通常の技術により製造できる。注射可能溶液製造のために適した賦形剤には、例えば、リン酸緩衝液、乳酸リンゲル液、水、ポリオールおよびグリセロールが含まれる。非経口注射のための医薬組成物は、医薬として受容可能な滅菌した水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳液、ならびに使用直前に滅菌注射可能溶液または分散液で再構築するための滅菌粉末から成っている。これらの製剤は例えば、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、抗酸化剤および希釈剤のような追加の化合物を含むことができる。
【００４４】
ＰＥＧ−ウリカーゼはまた、血液および尿中の上昇した尿酸レベルを連続的に制御するため、個体内への埋め込みのための制御放出組成物としても提供される。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、再生コラーゲン、ポリＬ−リジン、アルギン酸ナトリウム、ゲランゴム、キトサン、アガロース、多重膜リポソームおよび生物学的に活性な組成物を処方できる生物腐食性または生分解性物質を含む多くの他の通常のデポー剤処方。これらの物質は移植または注入された場合、徐々に分解し、活性物質を周囲の組織に放出する。例えば、ＰＥＧ−ウリカーゼをカプセル化する一つの方法は米国特許第５，６５３，９７４号（本明細書において援用される）に開示されている方法である。生物腐食性、生分解性物質および他のデポー剤処方は本発明において特別に企図されている。ＰＥＧ−ウリカーゼ送達のための注入ポンプおよびマトリックスエントラップメント系の使用もまた本発明の範囲内である。ＰＥＧ−ウリカーゼはまた都合良くミセルまたはリポソーム中に閉じこめるられる。リポソームカプセル化技術は本分野でよく知られている。例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、を参照されたい。
【００４５】
ここに記載されたＰＥＧ−ウリカーゼ医薬組成物は、尿酸誘発腎不全の危険性が高い患者、例えば、器官移植受容者（Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ，ＶＳ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｅｐｈｒｏｎ ５６：３１７−３２１を参照されたい）、およびいくつかの悪性腫瘍疾患を持つ患者における血液透析の必要性を減少させるであろう。結晶性尿酸の多くの蓄積を持つ患者（痛風結石）において、そのような医薬組成物は、現在利用可能な処置よりも迅速に生活の質を向上させるであろう。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は上に開示した種々の態様を例示しているが、どの点も本発明を制限していると解釈してはならない。
実施例１
Ａ．ＰＢＣ、ＰＫＳおよび関連したウリカーゼｃＤＮＡの構築
標準法、および試薬の製造元により供給されている適用可能な使用説明書が尿酸オキシダーゼｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のための（米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２、４，９６５，１８８＆５，０７５，２１６号）、およびこれらのｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定のための（Ｅｒｌｉｃｈ １９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ １９９８）総細胞ＲＮＡの調製に使用された。ブタおよびヒヒ尿酸オキシダーゼのＰＣＲプライマー（表１）は報告されているコード配列（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９）およびＰＲＩＭＥソフトウェアープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）に基づいて設計された。
【００４７】
【表１】
【００４８】
プライマーの末端に導入された制限酵素配列（小文字）はセンス（ブタおよびヒヒ）ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ；アンチセンス（ブタ）ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ；アンチセンス（ヒヒ）ＮｃｏＩである。ヒヒセンスプライマーにおいて、ヒヒ尿酸オキシダーゼ中に存在する第三のコドンＧＡＣ（アスパラギン酸）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）は、ヒト尿酸オキシダーゼ偽遺伝子コード配列のこの位置に存在しているコドンであるＣＡＣ（ヒスチジン）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）に置き換えられている。このため、これらのプライマーの使用により発生された組換え体ヒヒ尿酸オキシダーゼはＤ３Ｈヒヒ尿酸オキシダーゼと名付けられている。
【００４９】
ブタおよびヒヒ肝臓からの総細胞ＲＮＡは１ｓｔ ｓｔｒａｎｄキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して逆転写された。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用するＰＣＲ増幅は、熱サイクラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中、［３０秒、９５℃；３０秒、５５℃；６０秒、７０℃］２０サイクル続いて［３０秒、９５℃；６０秒、７０℃］１０サイクルのプログラムで実施された。尿酸オキシダーゼＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してｐＵＣ１８（ブタ）内へクローン化され、およびまたＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して直接的にクローン化された（ブタおよびＤ３Ｈヒヒ）。ｃＤＮＡクローンで大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換させた。クローン化ウリカーゼｃＤＮＡを含んでいるプラスミドが調製され、ｃＤＮＡ挿入配列は標準ジデオキシ技術により分析された。報告されている尿酸オキシダーゼＤＮＡコード配列（表１で説明したヒヒ尿酸オキシダーゼ中のＤ３Ｈ置換を除いて）を持っていたクローンが構築され、標準組換えＤＮＡ方法論による一連の続いての工程により確認された。
【００５０】
完全長コード配列を含んでいるブタおよびＤ３ＨヒヒｃＤＮＡは以下のようにｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内へ導入された。Ｄ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素でＴＡプラスミドから切り出され、次に発現プラスミドｐＥＴ３ｄおよびｐＥＴ９ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位内へサブクローン化された。完全長ブタウリカーゼｃＤＮＡはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でｐＵＣプラスミドクローンから切り出され、ｐＥＴ２８ｄのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位内へサブクローン化された。ブタｃＤＮＡコード領域もまたｐＥＴ２８ｄのＮｃｏＩおよびＢｌｐＩ部位から切り出した後、発現プラスミドｐＥＴ９ｄのＮｃｏＩおよびＢｌｐＩ部位内へ導入された。
【００５１】
ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ｃＤＮＡはｐＥＴ３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンからＤ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡの６２４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＡｐａＩ制限断片を切り出し、次にこのＤ３Ｈヒヒセグメントを対応するブタｃＤＮＡの６２４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＡｐａＩ制限断片で置き換えることにより構築した。得られたＰＢＣ尿酸オキシダーゼｃＤＮＡは読み枠内でヒヒ尿酸オキシダーゼのコドン２２６−３０４へ連結されたブタ尿酸オキシダーゼコドン１−２２５から成っている。
【００５２】
ブタ−ＫＳ尿酸オキシダーゼ（ＰｉｇＫＳ）ｃＤＮＡはｐＥＴ３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンからのＤ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡの８６４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ制限断片を切り出し、次にこのＤ３Ｈヒヒセグメントを対応するブタｃＤＮＡの８６４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ制限断片で置き換えることにより構築した。得られたＰＫＳ尿酸オキシダーゼｃＤＮＡは読み枠内でヒヒ尿酸オキシダーゼのコドン２８９−３０４へ連結されたブタ尿酸オキシダーゼコドン１−２８８から成っている。
【００５３】
Ｄ３Ｈヒヒ、ブタ、ＰＢＣおよびＰＫＳ尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列は図５および配列表に示されている。これらの形質転換体の各々の１５％グリセロール保存液の調製には標準技術が使用され、これらは−７０℃で保存された。これらの化学種が発現されおよび組換え酵素が単離された場合（表２）、ブタ、ＰＢＣキメラおよびＰｉｇＫＳウリカーゼは非常に類似した比活性を持っており、それは組み換えヒヒウリカーゼの比活性よりも約４−５倍高かった。この順序はいくつかの他の実験で確認された。いくつかの異なった方法で調製されたＰＢＣウリカーゼの比活性は２−２．５倍の範囲にわたって変動した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
＊タンパク質はローリー法により決定された。ウリカーゼ活性は分光学的に決定された（Ｐｒｉｅｓｔ ａｎｄ Ｐｉｔｔｓ １９７２）。アッセイは１ｍｌの反応混合物（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．６、０．１ｍＭ尿酸）を含んでいる１ｃｍの石英キュベット中、２３−２５℃で実施された。尿酸の消失は２９２ｎｍでの吸光度の減少によりモニターされた。ウリカーゼの１国際単位（ＩＵ）は分当たり１マイクロモルの尿酸消失を触媒する。
【００５６】
表２に示されている４つのウリカーゼｃＤＮＡ−ｐＥＴ構築物の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体は、ｐＥＴシステムマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）に示されているように選択抗生物質（ｐＥＴ３ｄ（ｐｉｇＫＳ）に対してカルベニシリンおよびクロラムフェニコール；ｐＥＴ９ｄ（ＰＢＣ、ブタ、ヒヒ）に対してカナマイシンおよびクロラムフェニコール）を含んでいるＬＢ寒天に播種した。５ｍｌの培養液（ＬＢ＋抗生物質）を単一形質転換コロニーに加え、３７℃で３時間増殖させた。次に、その０．１ｍｌを、選択抗生物質および０．１％ラクトースを含んでいる１００ｍｌのＬＢ培地に移した（ウリカーゼ発現を誘導するため）。３７°で一夜増殖させ、培養液０．５ｍｌからの細菌細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液内に抽出し、ＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥにより分析した；このことにより４つの培養物の各々で同等のレベルのウリカーゼタンパク質が発現されていたことが確立された（データは示されていない）。各々の１００ｍｌ培養液の残りの細胞は遠心分離により集め、ＰＢＳで洗浄した。細胞は次に１ｍＭ ＡＥＢＳＦプロテアーゼインヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含んでいる２５ｍｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）、に再び懸濁し、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）中、氷上で溶菌させた。不溶性物質（ウリカーゼを含んでいる）を遠心分離（２０，１９０ｘｇ、４°、１５分）によりペレット化した。ペレットは１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、により４°で一夜抽出した。抽出物は１０ｍｌの水で希釈して遠心分離した（２０，１９０ｘｇ、４°、１５分）。ウリカーゼ活性およびタンパク質濃度が続いて決定された。
実施例２
組換え体ＰＢＣウリカーゼの発現および単離（４リットル発酵器法）
Ｎｏｖａｇｅｎ ｐＥＴシステムマニュアルに示されているように、ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣウリカーゼ形質転換体がグリセロール保存液からカルベニシリンおよびクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天プレートへ播種された。ｐＥＴプラスミド保持を最大にするためにｐＥＴシステムマニュアルで推薦されている方法を用いて、単一コロニーから出発した２００ｍｌ接種物が３７°で回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上のＬＢ−抗生物質液体培地に調製された。ＯＤ５２５が２．４で、この２００ｍｌ培養物から細胞を遠心分離により集め、５０ｍｌの新鮮培地に再懸濁した。この懸濁液を、４リットルのカルベニシリンおよびクロラムフェニコール含有ＳＬＢＨ培地（ＳＬＢＨ培地の組成、および発酵器の設計および操作はＳａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７４、に説明されている）を含んでいる高密度発酵器に移した。Ｏ２下、３２°で２０時間増殖させた後（ＯＤ５２５＝１９）、ウリカーゼ生成を誘導するためにイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭまで加えた。さらに６時間後（ＯＤ５２５＝３７）、細菌細胞を遠心分離により集め（１０，４１０ｘｇ、１０分、４℃）、ＰＢＳで一度洗浄し、−２０℃で凍結保存した。
【００５７】
細菌細胞（１８９ｇ）を２００ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷／塩浴で冷却しながら超音波処理（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ ＸＬ、プローブモデルＣＬ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）により（１００％強度で４ｘ４０秒バースト、バースト間に１分の休止）溶菌した。ＰＢＳ不溶性物質（ウリカーゼを含む）を遠心分離（１０，４１０ｘｇ、１０分、４℃）によりペレット化し、２００ｍｌのＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ不溶性ペレット中のウリカーゼは１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１３０μｇ／ｍｌアプロチニンを含んでいる８０ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に抽出した。不溶性細胞破片は遠心分離（２０，１９０ｘｇ、２時間、４℃）により除去した。以下のすべての精製工程は４℃で実施された（結果は表３に要約されている）。
【００５８】
ｐＨ１０．２抽出物は１ｍＭ ＰＭＳＦで１８００ｍｌまで希釈した（Ｎａ２ＣＯ３を０．０７５Ｍに減少させる）。これは、０．０７５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、で平衡化されている新しいＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカラム（２．６ｘ９ｃｍ）に加えた。負荷した後、カラムを１）溶出液のＡ２８０での吸光度がバックグラウンドに到達するまで０．０７５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、；２）溶出液のｐＨが８．５へ落ちるまで１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５；３）５０ｍｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ；４）１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５中、０．１５Ｍから１．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で１００ｍｌ；５）１５０ｍｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ；６）１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５；７）溶出液のｐＨが１１に上昇するまで０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１で連続的に洗浄した。最後に、ウリカーゼを０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１中、０から０．６ＭのＮａＣｌの５００ｍｌ濃度勾配液で溶出させた。活性は二つのＡ２８０吸収ピークに溶出し、それらは別々にプールされた（分画Ａおよび分画Ｂ、表３）。これらのプール各々のウリカーゼは、１Ｍ酢酸を徐々に加えてｐＨを７．１に低下させ、続いての遠心分離（７０００ｘｇ、１０分）により沈殿させた。得られたペレットは５０ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に溶解し、４℃で保存した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
実施例３
組換え体ＰＢＣウリカーゼの小規模製造およびＰＥＧ化
この実施例は精製組換え体ＰＢＣウリカーゼがＰＥＧ化ウリカーゼを製造するために使用できることを示している。この反応において、すべてのウリカーゼサブユニットは修飾されており（図１、レーン７）、触媒活性の約６０％を保持していた（表４）。
Ａ．PＢＣウリカーゼの小規模発現および単離（表４、図１）。
【００６１】
ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの４リットル培養液を回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上、３７°でインキュベートした。０．７ＯＤ５２５の時点で、培養物はＩＰＴＧにより誘導された（０．４ｍＭ、６時間）。細胞を集め、−２０℃で凍結させた。細胞（１５．３ｇ）は凍結および融解により破壊し、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、１Ｍ ＰＭＳＦで抽出した。遠心分離後（１２，０００ｘｇ、１０分、４℃）、上清（８５ｍｌ）を水で１：１０に希釈し、実施例１で説明した方法と同じ様式でＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでクロマトグラフィーを行った。この工程でプールされたウリカーゼ活性はＰＭ３０膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用した加圧限外濾過により濃縮した。濃縮液は０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２で平衡化および溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカラム（２．５ｘ１００ｃｍ）でクロマトグラフィーを行った。ウリカーゼ活性を含んでいる分画をプールし、上記のような加圧限外濾過により濃縮した。
Ｂ．ＰＥＧ化
１００ｍｇの濃縮Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＰＢＣウリカーゼ（５ｍｇ／ｍｌ、２．９マイクロモル酵素；８４．１マイクロモルリジン）の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、溶液を２倍過剰（ＰＥＧのモル：ウリカーゼリジンのモル）のＰＥＧの活性化形と、４°で６０分間反応させた。ＰＥＧ化ウリカーゼは接線方向流ディアフィルトレーションにより未反応または加水分解ＰＥＧを除いた。この工程において、反応液は０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、溶液に１：１０で希釈され、３．５容量の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に対して、続いて３．５容量の０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、に対してディアフィルトレーションされた濾過滅菌酵素は、４°で少なくとも１ヶ月は安定であった。
【００６２】
【表４】
【００６３】
図１は組換え体ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼの精製およびＰＥＧ化の間に得られた分画のＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥ（１２％ゲル）分析を示している。レーン１＝ＭＷマーカー；２＝非誘導ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡ−形質転換細胞のＳＤＳ抽出物；３＝ＩＰＴＧ誘導ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡ−形質転換細胞のＳＤＳ抽出物；４＝粗抽出物（表５参照）；５＝濃縮Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅウリカーゼプール；６＝濃縮Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ウリカーゼプール；７＝ＰＥＧ化Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００組換え体ＰＢＣウリカーゼ。
【００６４】
表４に示した結果は精製ＰＢＣウリカーゼが触媒活性の約６０％を保持して修飾できたことを示している。このＰＥＧ化反応において、すべてのウリカーゼサブユニットが修飾されていた（図１、レーン７）。ここには示されていない研究において、ＰＥＧ化酵素は非修飾ＰＢＣウリカーゼと類似の動力学的特性を持っていた（ＫＭ１０−２０μＭ）。重要なことには、修飾酵素は生理学的ｐＨにおいて非修飾酵素よりもさらに可溶性であった（ＰＢＳ中、＞５ｍｇ／ｍｌに対して＜１ｍｇ／ｍｌ）。ＰＥＧ化酵素はまた、ほとんど活性を損失することなく凍結乾燥でき、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で再構築できた。別の実験において、ＰＥＧ−ＰＢＣウリカーゼのこの調製試料とＡ．フラーブス ウリカーゼ臨床製剤の活性を比較した。ホウ酸緩衝液中、ｐＨ８．６で、Ａ．フラーブス酵素は１０−１４倍高いＶｍａｘおよび２倍高いＫＭを持っていた。しかしながら、ＰＢＳ、ｐＨ７．２、において、ＰＥＧ−ＰＢＣおよび非修飾真菌酵素はウリカーゼ活性において＜２倍の相違であった。
実施例４
非修飾およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼのマウスにおける循環寿命
図２は天然およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼの循環寿命を示している。一群のマウス（時点当たり３匹）に１単位の天然（丸）またはＰＥＧ修飾（四角）組換え体ＰＢＣウリカーゼ（実施例３に説明したように調製）がＩＰで注射された。示されている時間に、血清ウリカーゼ活性を測定するために３匹のマウスの組から血液を得た。ＰＥＧ化ウリカーゼ（実施例３に説明したような）は約４８時間の循環寿命を持っていたのに対し、非修飾酵素は＜２時間であった（図２）。
実施例５
本発明のＰＥＧ化ウリカーゼの有効性
図３は尿酸の血清および尿濃度に対する血清ウリカーゼ活性の関係を示している。この実験において、ホモ接合性ウリカーゼ欠損ノックアウトマウス（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９４）に、すでにＰＥＧ化されている０．４ＩＵの組換え体ＰＢＣウリカーゼが０および７２時間目に２回注射された。ウリカーゼ欠損ノックアウトマウスがこの実験で使用された。なぜならウリカーゼを持っている正常マウスと異なり、これらのノックアウトマウスは（ヒトのように）その血液および体液に高レベルの尿酸を持っており、尿に高レベルの尿酸を排泄するからである。これらの高レベルの尿酸はこれらのマウスに重度の障害を起こし、それはしばしば致死的である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９４）。
【００６５】
図３に示された実験は、組換え体ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ化製剤の腹腔内注射が血清ウリカーゼ活性を増加させたことを示しており、それはウリカーゼ欠損マウスにおいて、尿酸の血清および尿濃度の著しい減少を伴った。
実施例６
構築物−担体複合体の非免疫原性
ＰＥＧ化組換え体ＰＢＣウリカーゼがホモ接合性ウリカーゼ欠損マウスに反復して注射されたが、促進されたクリアランスを誘導することはなく、有意な免疫原性が存在しないことと矛盾しない。このことはＥＬＩＳＡにより確認された。図４は反復注射後のウリカーゼ活性（血清で測定された）の循環寿命の維持を示している。ＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼは６−１０日間隔で腹腔内注射により投与された。血清ウリカーゼ活性は注射２４時間後に決定された。
実施例７
突然変異的に導入されたリジンへの共有結合
精製組換え体ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ化は新規リジン（残基２９１）へのＰＥＧの結合を生じなければならない。この実験において、ＰＢＣウリカーゼ調製試料はＰＥＧ化により修飾できた。新規リジン（残基２９１）を含んでいるペプチドがＰＥＧ化により修飾されたかどうかは本分野では既知の手段により決定できた。
参考文献
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【表８】
【００７０】
【表９】
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
上に引用したすべての論文は、全体が本明細書において援用される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９８年８月６日に出願された米国特許仮出願第６０／０９５，４８９号（全内容が本明細書において援用される）の利益を請求する。本明細書に開示されている本発明は、米国国立保健研究所から与えられた補助金番号ＤＫ４８５２９により、米国政府の支援のもとで行われた。政府は本発明にある種の権利を持っている。
【０００２】
本発明は、一般に尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）タンパク質およびそれをコード化している核酸分子に関している。特に、本発明は例えば、減少した免疫原性および増加した生物利用能を持つ改良された修飾ウリカーゼタンパク質を作るための中間体として特に有用であるウリカーゼタンパク質に関している。本発明の好適な修飾ウリカーゼタンパク質には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド）へ共有結合で結合されたウリカーゼタンパク質が含まれる。従って、本発明はウリカーゼタンパク質、該タンパク質へ特異的に結合する抗体、ウリカーゼタンパク質をコード化している核酸分子および有用なその断片、該核酸分子を含んでいるベクター、該ベクターを含んでいる宿主細胞およびウリカーゼタンパク質および核酸分子を使用するおよび作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
痛風は４０歳以上の男の人における最も普通な炎症性関節疾患である（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ １９９０）。疼痛性痛風性関節炎は、尿酸の血中レベルが上昇し（高尿酸血症）、尿酸一ナトリウム 一水和物の顕微鏡的結晶の挿間的形成が関節で起こった場合に生じる。時間が経過すると、慢性高尿酸血症はまた関節周囲、軟組織中およびいくつかの器官での破壊的結晶性尿酸沈着（痛風結節）を起こす（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９６）。尿酸は尿への溶解度が限られており、過剰に分泌されると（高尿酸尿）腎結石（尿酸結石）を起こす。ある種の悪性腫瘍の患者において（特に白血病およびリンパ腫）、著しい高尿酸血症および高尿酸尿症（促進された腫瘍細胞代謝回転および化学療法の間の溶解による）は急性、閉塞性腎疾患に対する容易ならない危険性を生じさせる（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９５６；Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ １９５７；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８０；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９０）。重度の高尿酸血症および痛風は、器官同種移植片拒否反応を防ぐためのシクロスポリン治療を含む種々の原因による腎機能不全に関連している（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．１９８７；Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９９０；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｌ １９９５）。
【０００４】
高尿酸血症は尿酸の過剰産生および排出不足の両方で起こりうる（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ １９７６；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｒｏｅｓｓｌｅｒ １９９５）。軽度の場合、高尿酸血症は食餌療法で制御できるが、宣告されおよび重度の臨床的結果が付随する場合は、尿酸排出を促進する尿酸排泄薬（もし腎機能が低下していると有効ではない）または尿酸形成を阻止するキサンチンオキシダーゼ阻害薬アロプリノールの様な薬剤による処置を必要とする。アロプリノールは結節性痛風、腎不全、白血病およびいくつかの遺伝性障害を持つ患者における治療の頼みの綱である。高尿酸血症での処置は一般的に有効であり十分に許容されている。しかしながら、変質した、不適格になった結節性痛風を患っている患者はすべての通常の治療では治りにくい（Ｂｅｃｋｅｒ １９８８；Ｆａｍ １９９０；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｒｙａｎ １９９５）。さらに、アロプリノールで処置された患者の２％にはアレルギー反応が発生し、約０．４％で重度の過敏性症候群が起こる（Ｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ １９８６；Ａｒｅｌｌａｎｏ ａｎｄ Ｓａｃｒｉｓｔａｎ １９９３）。このしばしば生命を脅かす症候群は急性腎および肝不全および重度の皮膚障害（中毒性表皮壊死、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群）を起こすことができる。アロプリノールはまた、白血病の処置におよび器官同種移植片拒絶反応の防止に使用される薬剤であるアザチオプリンおよび６−メルカプトプリンの代謝を妨害し、その状態では著しい高尿酸血症が起こり、重度の痛風を起こすか、または腎機能を脅かすであろう。
【０００５】
究極的には、高尿酸血症は進化の間における尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）ヒト遺伝子の突然変異的不活性化の結果である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。ほとんどの非ヒト霊長類および他の哺乳類の肝臓ペルオキシソーム中の活性なウリカーゼは尿酸をアラントイン（＋ＣＯ２およびＨ２Ｏ２）に変換し、それは尿酸よりも８０−１００倍可溶性であり、腎臓でより効率的に処理される。アスペルギルス フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）から調製された非経口的ウリカーゼ（ＵｒｉｃｏｚｙｍｅＲ，Ｃｌｉｎ−Ｍｉｄｙ，Ｐａｒｉｓ）がフランスおよびイタリアで２０年以上にわたって白血病化学療法に関連した重度の高尿酸血症を治療するために使用されており（Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ １９５７；Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９６８；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７２；Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９７２；Ｐｏｔａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９７５；Ｚｉｔｔｏｕｎ ｅｔ ａｌ．１９７６；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８；Ｍａｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９８２）、米国において白血病患者の最近の臨床試験でも使用されている（Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ウリカーゼはアロプリノールよりも迅速に作用を示す（Ｍａｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９８２；Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。痛風患者において、ウリカーゼ注入は急性発作を中断させ、痛風結節の大きさを減少させることができる（Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．１９６８；Ｐｏｔａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９７５；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８）。
【０００６】
化学療法の短期間の間の急性高尿酸血症を治療するには有効であるが、Ａ．フラーブス ウリカーゼの毎日の注入は再発または結節性痛風を治療するには重大な欠点がある。加えて、Ａ．フラーブス ウリカーゼの効力は抗ウリカーゼ抗体を発生する患者では急速に減弱する（Ｋｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ． １９６８；Ｂｒｏｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７８；Ｅｓｃｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｍｏｕｒａｄ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｓｉｂｏｎｙ ｅｔ ａｌ．１９８４）。アナフィラキシーを含む重度のアレルギー反応が起こっている（Ｄｏｎａｄｉｏ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｍｏｎｔａｇｎａｃ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ １９９０；Ｐｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。長い時間働き、免疫原性がより少ないウリカーゼ製剤が長期的治療で明らかに必要とされている。
【０００７】
プロテアーゼおよび免疫系から外因性酵素を隔離する一つの方法は、不活性で、無毒のポリマー、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質の表面へ共有結合で結合させることである（Ｈａｍｓ ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ １９９７）。Ｍｒ〜１．０００から＞１０，０００のＰＥＧの使用は、動物においていくつかの外来タンパク質の循環寿命を延長させ、免疫原性を減少させることを最初に示している（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９７７ａ；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９７７ｂ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８１ａ；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９１）。１９９０年、Ｍｒ５０００のＰＥＧで修飾されたウシアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）（ＰＥＧ−ＡＤＡ、ＡＤＡＧＥＮＲ、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．により製造された）がＡＤＡ欠乏による重度の複合免疫不全症の処置（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９８７）に米国食品薬品局により認証された最初のＰＥＧ化タンパク質になった。過去１２年以上にわたる経験は、ＰＥＧ−ＡＤＡによる長期的処置の間に、ほとんどの患者で高感度ＥＬＩＳＡを用いると抗ＡＤＡ抗体は検出できるが、アレルギーまたは過敏性反応は起こっておらず；少数の抗ＡＤＡ抗体産生患者でＰＥＧ−ＡＤＡの加速されたクリアランスが起こっているが、これは通常一時的な効果であったことを示している（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９７）。ＡＤＡ欠損患者の免疫機能は通常、ＰＥＧ−ＡＤＡによる処置の間に正常にはならないことを理解すべきである（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ １９９５；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ １９９５）。従って、正常な免疫機能を持つ患者の長期的処置のためのＰＥＧ化タンパク質の開発において、免疫原性がより重大な問題であろう。
【０００８】
免疫原性とは、抗原製剤（ＰＲＧ修飾タンパク質または非修飾タンパク質のような）の注射による免疫応答誘導に関連しており、一方、抗原性とは抗原と前から存在している抗体との反応を意味していることを当業者は理解するであろう。集合的に、抗原性および免疫原性が免疫反応性と称される。ＰＥＧ−ウリカーゼの従来の研究において、免疫反応性は：インビトロでのＰＥＧ−ウリカーゼと前もって形成された抗体との反応；誘導された抗体合成の測定；および反復注射後の促進されたクリアランス速度を含む種々の方法により評価されてきた。
【０００９】
ＰＥＧ化は免疫原性を減少させ、動物において真菌およびブタウリカーゼの循環寿命を延長することが示されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｓａｖｏｃａ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ＰＥＧ修飾カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ウリカーゼは５人の正常尿酸血を持つボランティアにおいて血清尿酸を検出できないレベルまで急速に低下させた（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８１ｂ）。Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．で製造されたＰＥＧ化アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ウリカーゼが、腎不全および著しい高尿酸血症を示していたリンパ腫を持つアロプリノール過敏性患者を処置するために実験的に使用された（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｌ９８９）。約２週間に４回、筋肉内注射で投与された。この短期間の間に、高尿酸血症が制御され、患者の血清中の抗ウリカーゼ抗体はＥＬＩＳＡでは検出できなかった。この製剤のさらなる使用および臨床開発は続行されていない。
【００１０】
現在まで、長期的治療において安全におよび信頼できるように、適当に長い循環寿命を持ちおよび十分に免疫原性が低められたウリカーゼまたはＰＥＧ−ウリカーゼの形は開発されていない。本発明の目的は、ＰＥＧ化と組み合わせて、これらの要求を満たすことができるウリカーゼの改良形を提供することである。本発明は、潜在的免疫原性エピトープを覆い隠すため、ＰＥＧ化の能力を促進することが示されている様式で突然変異により修飾された、哺乳動物由来の独特な組換え体ウリカーゼである。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約
新規ウリカーゼタンパク質およびそれをコード化している核酸を提供するのが本発明の一般的目的である。
【００１２】
本明細書に記載されているような、組換え的に産生されたウリカーゼタンパク質を精製する方法を提供するのも本発明の別の目的である。
本発明のウリカーゼタンパク質を含んでいる組成物を哺乳動物に投与することにより体液中の尿酸量を減少させる方法を提供するのが本発明のさらなる目的である。
【００１３】
本明細書に記載したウリカーゼタンパク質に対する抗体を提供するのも本発明のさらに別の目的である。
本明細書に記載されている核酸配列を含んでいるベクターおよび宿主細胞、およびそれによりコードされているウリカーゼタンパク質を産生するためにそれらを使用する方法を提供するのも本発明の別の目的である。
【００１４】
本発明は、非修飾酵素の尿酸分解活性のほとんどすべてを保持し、実質的に非免疫原性であるＰＥＧ−ウリカーゼを生成するために使用されるウリカーゼタンパク質を提供する。尿酸分解活性は本明細書ではｍｇタンパク質当たりの国際単位（ＩＵ）で表現されており、ここでウリカーゼ活性のＩＵは分当たり１マイクロモルの尿酸を消費する酵素量として定義されている。
【００１５】
本発明は一つまたはそれ以上のリジン残基を挿入するように修飾されている哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、組換え体タンパク質とは人工的に生成されたタンパク質であり、天然に生成されるタンパク質（即ち、問題とする特異的タンパク質の天然の遺伝子のみを所有する動物の組織で生成されたもの）とは区別される。タンパク質はペプチドおよびアミノ酸配列を含んでいる。本発明の組換え体ウリカーゼタンパク質は、二つまたはそれ以上の哺乳動物タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列のキメラまたはハイブリッドであろう。一つの態様において、本発明は哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を製造するために使用でき、そのタンパク質は、組換え体ウリカーゼタンパク質のＰＥＧ化後のＰＥＧ化ウリカーゼ生成物が実質的に非修飾ウリカーゼと同様に酵素的に活性であり、およびＰＥＧ化ウリカーゼ生成物が受容可能な免疫原性である点までリジンの数を増加するように修飾されている。本発明の端が切断されたウリカーゼもまた考慮されており、ウリカーゼのアミノおよび／またはカルボキシ末端は存在していないであろう。好適には、該ウリカーゼはリジンが除去されない程度に端が切断されているであろう。
【００１６】
対になったウリカーゼ−担体複合体は、ウリカーゼの酵素活性を実質的に減少させるほど多くの結合を、または受容不可能な免疫原性が残存するほど少ない結合を含んでいてはならないことを当業者は理解するであろう。好適には、複合体は非修飾ウリカーゼタンパク質の尿酸分解活性の少なくとも約７０％から約９０％を保持し、一方、非修飾ウリカーゼタンパク質と比較して貯蔵で、哺乳動物血漿および／または血清中、生理学的温度でその酵素的活性を保持するようにより安定であろう。尿酸分解活性の約８０％から約８５％の保持が受容可能であろう。さらに、好適な態様において、該複合体は非修飾ウリカーゼタンパク質よりも実質的に減少した免疫原性および／または免疫反応性を提供する。一つの態様において、本発明は、ウリカーゼタンパク質に含まれているリジンの少なくとも一つに共有結合で結合された、ＰＥＧのような無毒で、非免疫原性で、医薬として受容可能な担体の結合により修飾できるウリカーゼタンパク質を提供する。もしくは、ウリカーゼタンパク質はそのアミノ酸配列の約１０未満のリジンを通した、担体への共有結合での結合により修飾されている。２、３、４、５、６、７、８または９つの任意のリジンへの結合が別の態様で考慮されている。
【００１７】
本発明のウリカーゼタンパク質はブタおよびヒヒ肝臓ウリカーゼタンパク質のセグメントを含む組換え分子である。修飾ヒヒ配列もまた提供される。一つの態様において、本発明はブタウリカーゼのアミノ酸（ａａ）１−２２５（配列ＩＤ番号：７）およびヒヒウリカーゼのａａ２２６−３０４（配列ＩＤ番号：６）を含むキメラのブタ−ヒヒウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ（配列ＩＤ番号：２））を提供する（図５の配列も参照されたい）。別の態様において、本発明はブタウリカーゼのアミノ酸（ａａ）１−２２８およびヒヒウリカーゼのａａ２２９−３０４を含むキメラのブタ−ヒヒウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）を提供する（配列ＩＤ番号：４）。ＰＢＣおよびＰＫＳの端が切り取られた誘導体もまた考慮される。好適な端切断誘導体形は、６アミノ末端アミノ酸または３カルボキシ末端アミノ酸またはその両方が欠失するように切断されたＰＢＣおよびＰＫＳタンパク質である。代表的配列は配列ＩＤ番号：８（ＰＢＣアミノ切断）、９（ＰＢＣカルボキシ切断）、１０（ＰＫＳアミノ切断）および１１（ＰＫＳカルボキシ切断）に示されている。ＰＢＣウリカーゼ、ＰＫＳウリカーゼおよびそれらの端切断形の各々は、クローン化されている他の哺乳動物ウリカーゼに観察されるよりも１つから４つ以上多いリジン残基を持っている。
【００１８】
本発明は本明細書に記載したようなウリカーゼタンパク質および端が切断されたタンパク質をコードしている、単離され、精製されたおよび／またはクローン化された形の核酸分子を含む核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）分子（配列）を提供する。好適な具体例は配列ＩＤ番号：１（ＰＢＣウリカーゼ）および配列ＩＤ番号：３（ＰＫＳウリカーゼ）に示されている。
【００１９】
これらの核酸分子を含んでいるベクター（発現およびクローニング）もまた本発明により提供される。
さらに、本発明はこれらのベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
【００２０】
本発明のウリカーゼタンパク質に特異的に結合する抗体も提供される。ブタウリカーゼのアミノ部分に対する抗体およびヒヒウリカーゼのカルボキシ部分に対する抗体は、協同して使用された場合、ＰＢＣまたは他の類似のキメラタンパク質の検出に有用であろう。好適には、キメラウリカーゼのアミノ部分に対する抗体はヒヒウリカーゼのアミノ部分を認識できないに違いないし、同様に、キメラウリカーゼのカルボキシ部分に対する抗体はブタウリカーゼのカルボキシ部分を認識できないに違いない。より好適には、抗体はＰＢＣまたはＰＫＳを特異的に結合するが、ブタおよび／またはヒヒウリカーゼのような天然のタンパク質には結合しない。
【００２１】
別の態様において、本発明は尿および／または血清または血漿のような体液中の尿酸量を減少させるための医薬組成物の製造に使用でき、それは本明細書に記載した少なくとも一つのウリカーゼタンパク質またはウリカーゼ複合体および医薬として受容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含んでいる。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物の体液中の尿酸量を減少させるための方法にも使用できる。該方法は尿酸を減少させるのに有効な量の、本発明のウリカーゼまたはウリカーゼ複合体および希釈剤、担体または賦形剤（好適には医薬として受容可能な担体、希釈剤または賦形剤である）を哺乳動物に投与することを含んでいる。処置されるべき哺乳動物は好適にはヒトである。
【００２３】
投与工程は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内経路による注射であろう。上昇した尿酸レベルは血液または尿中であり、痛風、痛風結節、腎不全、器官移植または悪性腫瘍疾患に関連したものであろう。
【００２４】
別の態様において、本発明は、例えば、組換え製造法からの例えば細胞または細胞内破片を含んでいるウリカーゼ溶液から、ウリカーゼを単離および／または精製するための方法を提供する。好適には、精製方法は、約７から約８．５のｐＨで可溶性である大多数のタンパク質を除くためにこの低いｐＨ範囲で粗組換え体抽出物を洗浄し、その後、活性なウリカーゼを約１０から約１１のｐＨ（好適には約１０．２）で緩衝液（好適には炭酸ナトリウム緩衝液）に可溶化する。可溶化活性ウリカーゼは次にＱセファロースカラムのようなアニオン交換カラムにかけ、約ｐＨ８．５の緩衝液での低塩濃度から高塩濃度への濃度勾配で洗浄し、その後、約１０から約１１のｐＨの炭酸ナトリウム緩衝液での塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させることにより精製されたウリカーゼが得られる。酵素は約１０から約１１のｐＨでのゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製される。この段階で、選択的にウリカーゼを沈殿させるために（しかしより可溶性の夾雑物は沈殿しない）約８．５またはそれ未満へｐＨを低下させることにより本酵素はさらに精製される。低ｐＨ（７−８）で洗浄後、ウリカーゼを約１０．２のｐＨで可溶化する。ウリカーゼ調製試料は次に、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他のクロマトグラフィー法、光散乱、遠心分離および／または電気泳動のような医薬製造の分野で知られている方法により分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥ（１２％ゲル）分析。
【図２】天然およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼの循環寿命。
【図３】尿酸の血清および尿濃度と血清ウリカーゼ活性の関係。
【図４】反復注射後におけるウリカーゼ活性の循環寿命（血清で測定された）の維持。
【図５】図５はブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）（配列番号：２）および突然変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含んでいるブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）（配列番号：４）の演繹されたアミノ酸配列を示しており、ブタ（配列番号：７）およびヒヒ（配列番号：６）配列と比較されている。
【図６】ＰＫＳ（配列番号：４）およびブタ（配列番号：７）ウリカーゼのアミノ酸配列比較。
【図７】ＰＢＣ（配列番号：２）およびＰＫＳ（配列番号：４）のアミノ酸配列比較。
【図８】ＰＢＣ（配列番号：２）およびブタ（配列番号：７）ウリカーゼのアミノ酸配列比較。
【図９】ブタウリカーゼ（配列番号：７）およびＤ３Ｈ（配列番号：５）のアミノ酸配列比較。
【図１０】ＰＢＣ（配列番号：２）およびＤ３Ｈ（配列番号：５）のアミノ酸配列比較。
【図１１−１】ＰＫＳ（配列番号：３）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１１−２】ＰＫＳ（配列番号：３）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１２−１】ＰＫＳ（配列番号：３）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１２−２】ＰＫＳ（配列番号：３）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１３−１】ＰＢＣ（配列番号：１）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１３−２】ＰＢＣ（配列番号：１）およびブタ（配列番号：１２）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１４−１】ＰＢＣ（配列番号：１）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【図１４−２】ＰＢＣ（配列番号：１）およびヒヒ（配列番号：１３）ウリカーゼｃＤＮＡのコード配列のベストフィット（ＧＣＧソフトウェアー）比較。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、水溶性ポリマー（好適には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド））とウリカーゼの改良されたウリカーゼ複合体のために有用な中間体であるウリカーゼタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、特に示さない限りウリカーゼとは個々のサブユニットならびに天然のテトラマーを含んでいる。
【００２７】
ヒトは活性酵素を作ることはできないが、ウリカーゼｍＲＮＡ転写体はヒト肝臓ＲＮＡから増幅されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。いくらかのヒトウリカーゼ転写体が翻訳されるのは理論的には可能である；ペプチド生成物が完全長でなく、または不安定であっても、それらは抗原提示細胞により処理され、処置に使用された外因性ウリカーゼに対する免疫応答の決定に役割を果たすことができる。理論的には、二つのナンセンス変異を除去することによりヒトウリカーゼｃＤＮＡを再構築および発現することが可能であろう。しかしながら、選択的圧力がない場合、最初のナンセンス変異が導入されてから数百万年の間にヒト遺伝子に有害なミスセンス変異が蓄積されてきたことは非常にありそうである（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。最大の触媒活性およびタンパク質安定性を得るためにすべての突然変異を同定および”訂正”することは非常に困難であろう。
【００２８】
本発明者は、ヒトウリカーゼの演繹されたアミノ酸配列とブタ（約８６％）およびヒヒ（約９２％）の配列間には高い度合いの相同性（類似性）が存在するが（類似の尺度の例として図６−１４を参照されたい）、一方、ヒトおよびＡ．フラーブス ウリカーゼ間は＜４０％であることを認めた（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｌｅｇｏｕｘ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）。本発明は、より遠い関係の真菌または細菌酵素よりヒトに対して免疫原性が少ないように設計されている二つの異なった哺乳動物から組換え的に生成されたキメラウリカーゼタンパク質を提供する。哺乳動物ウリカーゼ誘導体の使用は患者および医者に対しより受容可能であることが期待される。
【００２９】
ＰＥＧ−ＡＤＡの作製および他のタンパク質の修飾に使用されてきた活性化ＰＥＧはアミノ末端残基の一級アミノ基（存在し、ブロックされていない場合）およびリジンのイプシロン−アミノ基を攻撃することが経験により示されている。この方法は温和な反応条件が使用できること、および陽性に荷電したリジンはタンパク質の表面に位置する傾向があることなどのため有用である。後の点は、治療的タンパク質にとって、ＰＥＧ化の望ましい効果はＰＥＧポリマーの特性（例えば、質量、分岐または非分岐構造など）、ならびにエピトープに関連するタンパク質のＰＥＧ結合部位の数および分布およびタンパク質の機能およびクリアランスを決定する構造要素に一部依存するであろうから重要である。ＰＥＧ付加のために半選択的に新規リジン残基を導入することにより、エピトープを覆いおよび免疫原性を減少させるＰＥＧ化の能力を促進させる方法が考案されている（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９１）。この方法は選択されたアルギニンコドンをリジンコドンへ置き換える突然変異発生を用いており、置換は陽性荷電を保ちおよびコンピューター予測の表面確立および抗原性に対して最少の影響しか及ばさない（アミノ酸配列が既知である場合のみ有用である）。
【００３０】
この方法の試験的実験として、組換え体大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＰＮＰ）（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９１）が使用された。３つの部位でＡｒｇからＬｙｓへの置換が導入され、触媒活性を変えることなくサブユニット当たりのリジン数が１４から１７へ増加された。過剰のジスクシニル−ＰＥＧ５０００による接近可能なＮＨ２基の約７０％の修飾後、精製３重突然変異体は完全な活性を保持していた。ＰＥＧ化前および後の反応性アミノ基の滴定は、３重突然変異体はサブユニット当たり野生型よりも一つ多いＰＥＧ鎖に接近できたことを示唆している。ＰＥＧ化はマウスにおいて野生型および突然変異体ＥＰＮＰ酵素両方の循環寿命を〜４時間から＞６日へ増加させた。１週／２週間隔での一連の注射後、両方の非修飾ＥＰＮＰ酵素で処置されたすべてのマウス、およびＰＥＧ化野生型ＥＰＮＰを注射した１６匹のうちの１０匹（６０％）が高レベルの抗ＥＰＮＰ抗体を発生し、循環寿命を著しく減少させた。対照的に、突然変異体ＰＥＧ−ＡＤＡで処置したマウスは１２匹の内２匹（１７％）が急速なクリアランスを発生した；これらのマウスにおける低レベルの抗体は循環寿命とは相関していない。従って、活性化ＰＥＧでの処理後に３つの新しいリジンの内のただ１つが修飾されただけであるが、この方法は実質的に免疫原性を減少させることに成功した。
【００３１】
ヒヒおよびブタウリカーゼサブユニットは各々３０４のアミノ酸から成っており、その２９（即ち、約１０残基に１つ）はリジンである。最初にヒヒウリカーゼのクローン化ｃＤＮＡ内の２つのＡｒｇからＬｙｓへの置換、および２０８位（ヒトウリカーゼ遺伝子でＬｙｓであることが知られている）のＧｌｕコドンをＬｙｓへ置換する試みは、非常に減少したウリカーゼ触媒活性を持つ突然変異体ヒヒタンパク質を発現する結果を与えた。哺乳動物ＤＮＡにおけるアルギニンからリジンへの突然変異後、ウリカーゼ酵素活性を維持する能力は予測できないことがこの実験から明らかにされた。
【００３２】
その後、ヒヒウリカーゼ中のアミノ酸残基２９１はリジンであるが、ブタの対応する残基はアルギニンであることが認められた。両方のｃＤＮＡ中に存在しているＡｐａＩ制限部位が、最初の２２５アミノ酸がブタｃＤＮＡから誘導され、カルボキシ末端７９がヒヒｃＤＮＡから誘導されるキメラウリカーゼを構築するために利用された。生じたブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼ（配列ＩＤ番号：２）は３０のリジンを持っており、両方の”親”酵素より１つ多い。ＰＢＣウリカーゼのさらなる特色は、その”ヒヒ”部分がヒトウリカーゼと７９残基の内の４つしか異なっていないことであり、一方、ブタおよびヒトウリカーゼは同じ領域で１０残基が異なっている。ＰＢＣの修飾体が次に構築され、それは２９１位の特別なリジンを維持し、ブタウリカーゼとは残基３０１のスレオニンがセリンに置換されていることが異なっている（”ＰｉｇＫＳ”ウリカーゼ（配列ＩＤ番号：４））。リジンのいくつかの他の挿入は活性に有害であったという前の段落に記載した結果を考慮すると、ＰＢＣおよびＰＫＳキメラウリカーゼは突然変異を生じてない天然のブタウリカーゼと比較して同じように十分に活性であることは期待されなかったが、突然変異を生じていない天然のヒヒウリカーゼよりは約４倍以上活性であった。
【００３３】
本発明は、ブタおよびヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の一部から組み立てられた組換え体ブタ−ヒヒキメラウリカーゼを提供する。そのようなキメラウリカーゼの１つの例はブタウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：７）からの最初の２２５アミノ酸およびヒヒウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：６）からの最後の７９アミノ酸を含んでいる（ブタ−ヒヒウリカーゼ、またはＰＢＣウリカーゼ；図６および配列ＩＤ番号：２）。そのようなキメラウリカーゼの別の例はブタウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：７）からの最初の２８８アミノ酸およびヒヒウリカーゼ配列（配列ＩＤ番号：６）からの最後の１６アミノ酸を含んでいる。後者の配列はブタ配列と２つの位置でしか異なっておらず（残基２９１にアルギニンの代わりにリジン（Ｋ）および残基３０１のスレオニンの代わりにセリン（Ｓ）を持っている）、この突然変異体はブタ−ＫＳまたはＰＫＳウリカーゼと称される。
【００３４】
本発明のタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいるベクター（発現およびクローニング）もまた提供される。好適なベクターは本明細書で例示したようなものを含んでいる。当業者はプラスミドのような発現ベクター内へ、発現のために適切な配向でおよび正しい読み枠に核酸が挿入されることを認識するであろう。必要に応じ、核酸（ＤＮＡ）は所望の宿主により認識される適当な転写および翻訳制御ヌクレオチド配列へ連結されるであろうが、そのような制御要素は一般的に本分野で使用されおよび既知である発現ベクターで入手可能である。ベクターは続いて標準技術により宿主細胞内へ導入される。一般に、宿主細胞のすべてがベクターにより形質転換されるわけではないであろう。従って、形質転換される宿主細胞を選択する必要がある。本分野で知られている一つのそのような選択法は、抗生物質耐性のような形質転換された細胞中での選択可能なマーカー特性をコードしている必須な制御要素とともにＤＮＡ配列を発現ベクター内へ取り込ませることを含んでいる。もしくは、そのような選択可能特性のための遺伝子は、所望の宿主細胞の同時形質転換に使用される別のベクターに存在してもよい。ベクターはまた、適当なプロモーターを含むことができる（それらとともに形質転換される大腸菌のような細菌宿主細胞中のＤＮＡの発現（転写および翻訳）が可能な原核生物プロモーター）。細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス セレビジエ）、糸状菌（例えば、アスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が本分野で知られており、利用可能である。
【００３５】
適したベクターには、例えば、原核生物での増殖にはＣｏｌＥ１ ｏｒｉのような原核生物レプリコンが含まれる。典型的な原核生物ベクタープラスミドとしてＢｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ３２２およびｐＢＲ３２９、およびＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＴｃｒ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３がある。典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはクローン化遺伝子の発現を駆動するのにＳＶ４０後期プロモーターを使っており、ＣＯＳ−１のようなＴ抗原産生細胞で最も高いレベルの発現が観察されている。誘導可能哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。このベクターはクローン化遺伝子の発現を駆動するのにマウス乳腺腫瘍ウイルスロングターミナルレピートのグルココルチコイド−誘導可能プロモーターを使っている。有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込み型プラスミド（Ｙｉｐ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
【００３６】
さらに、本発明はこれらのベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞には本明細書で例示および記載しているものが含まれる。
本発明のウリカーゼタンパク質は、タンパク質の生物学的半減期および溶解性を改良するためおよびその免疫反応性を減少させるために比較的少数のＰＥＧ鎖へ、生物学的に安定で、無毒の共有結合を通して複合体形成されているであろう。そのような結合にはウレタン（カーバメート）結合、二級アミン結合およびアミド結合が含まれる。そのような複合体化に適した種々の活性化ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ．から入手可能である。
【００３７】
本発明はまた、複合体としてのウリカーゼタンパク質の医薬組成物を製造するために使用される。これらの複合体は実質的に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７０％、好適には８０％およびより好適には少なくとも約９０％またはそれ以上を保持している。本発明での使用に適した水溶性ポリマーには、直線状および分岐ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキサイド）が含まれる（すべて通常ＰＥＧとして知られている）。分岐鎖ＰＥＧの一つの例は米国特許第５，６４３，５７５号の主題である。
【００３８】
本発明の一つの態様において、ウリカーゼサブユニット当たりに挿入されているリジンの平均数は１から１０の間である。好適な態様において、ウリカーゼサブユニット当たりの追加のリジン数は２から８の間である。追加のリジンの数はウリカーゼの触媒活性に有害であるほど多くあるべきではないことは理解されている。複合体のＰＥＧ分子は好適にはウリカーゼタンパク質のリジンを通して、より好適には、天然には存在しないリジンまたは天然にはその位置に含まれていないが設計されたタンパク質の一部へ導入されたリジンを通して結合されている。
【００３９】
本発明は利用可能で無害なウリカーゼタンパク質へのＰＥＧ結合部位を増加させる方法を提供し、ここで天然のウリカーゼタンパク質は少なくとも一つのリジン残基が導入されるような様式で突然変異される。好適には、本方法はアルギニンをリジンで置き換えることを含んでいる。
【００４０】
本発明を利用するＰＥＧ−ウリカーゼ複合体は哺乳動物（好適にはヒト）の血液および／または尿中の尿酸濃度を低下させる（即ち、量を減少させる）ために有用であり、従って、痛風、痛風結節、腎不全、器官移植および悪性腫瘍疾患を含む状態に関連して上昇した尿酸レベルの処置に使用できる。
【００４１】
ＰＥＧ−ウリカーゼ複合体は、経口、浣腸剤または座剤により、静脈内、皮下、皮内、筋肉内および腹腔内経路を含む多くの経路により、過剰の尿酸レベルを持っている哺乳動物内へ導入される。Ｐａｔｔｏｎ，ＪＳ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ８：１７９−２２８。
【００４２】
ＰＥＧ−ウリカーゼの有効量は、尿酸のレベルおよび個体の大きさに依存するであろう。本発明のこの態様の一つの実施例において、ＰＥＧ−ウリカーゼは約１０μｇから約１ｇの量範囲で、医薬として受容可能な賦形剤または希釈剤とともに投与される。好適な態様において、投与される量は約１００μｇから５００ｍｇの間である。より好適には、複合体化ウリカーゼは１ｍｇから１００ｍｇの間の量（例えば、５ｍｇ、２０ｍｇまたは５０ｍｇ）で投与される。実施態様の用量で与えられた量は複合体中のタンパク質量を意味している。
【００４３】
ＰＥＧ−ウリカーゼを含んでいる医薬処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９８５）Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏ．、に記載されているような通常の技術により製造できる。注射可能溶液製造のために適した賦形剤には、例えば、リン酸緩衝液、乳酸リンゲル液、水、ポリオールおよびグリセロールが含まれる。非経口注射のための医薬組成物は、医薬として受容可能な滅菌した水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳液、ならびに使用直前に滅菌注射可能溶液または分散液で再構築するための滅菌粉末から成っている。これらの製剤は例えば、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、抗酸化剤および希釈剤のような追加の化合物を含むことができる。
【００４４】
ＰＥＧ−ウリカーゼはまた、血液および尿中の上昇した尿酸レベルを連続的に制御するため、個体内への埋め込みのための制御放出組成物としても提供される。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、再生コラーゲン、ポリＬ−リジン、アルギン酸ナトリウム、ゲランゴム、キトサン、アガロース、多重膜リポソームおよび生物学的に活性な組成物を処方できる生物腐食性または生分解性物質を含む多くの他の通常のデポー剤処方。これらの物質は移植または注入された場合、徐々に分解し、活性物質を周囲の組織に放出する。例えば、ＰＥＧ−ウリカーゼをカプセル化する一つの方法は米国特許第５，６５３，９７４号（本明細書において援用される）に開示されている方法である。生物腐食性、生分解性物質および他のデポー剤処方は本発明において特別に企図されている。ＰＥＧ−ウリカーゼ送達のための注入ポンプおよびマトリックスエントラップメント系の使用もまた本発明の範囲内である。ＰＥＧ−ウリカーゼはまた都合良くミセルまたはリポソーム中に閉じこめるられる。リポソームカプセル化技術は本分野でよく知られている。例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、を参照されたい。
【００４５】
ここに記載されたＰＥＧ−ウリカーゼ医薬組成物は、尿酸誘発腎不全の危険性が高い患者、例えば、器官移植受容者（Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ，ＶＳ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｅｐｈｒｏｎ ５６：３１７−３２１を参照されたい）、およびいくつかの悪性腫瘍疾患を持つ患者における血液透析の必要性を減少させるであろう。結晶性尿酸の多くの蓄積を持つ患者（痛風結石）において、そのような医薬組成物は、現在利用可能な処置よりも迅速に生活の質を向上させるであろう。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は上に開示した種々の態様を例示しているが、どの点も本発明を制限していると解釈してはならない。
実施例１
Ａ．ＰＢＣ、ＰＫＳおよび関連したウリカーゼｃＤＮＡの構築
標準法、および試薬の製造元により供給されている適用可能な使用説明書が尿酸オキシダーゼｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のための（米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２、４，９６５，１８８＆５，０７５，２１６号）、およびこれらのｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定のための（Ｅｒｌｉｃｈ １９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ １９９８）総細胞ＲＮＡの調製に使用された。ブタおよびヒヒ尿酸オキシダーゼのＰＣＲプライマー（表１）は報告されているコード配列（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８９）およびＰＲＩＭＥソフトウェアープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）に基づいて設計された。
【００４７】
【表１】
【００４８】
プライマーの末端に導入された制限酵素配列（小文字）はセンス（ブタおよびヒヒ）ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ；アンチセンス（ブタ）ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ；アンチセンス（ヒヒ）ＮｃｏＩである。ヒヒセンスプライマーにおいて、ヒヒ尿酸オキシダーゼ中に存在する第三のコドンＧＡＣ（アスパラギン酸）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）は、ヒト尿酸オキシダーゼ偽遺伝子コード配列のこの位置に存在しているコドンであるＣＡＣ（ヒスチジン）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９２）に置き換えられている。このため、これらのプライマーの使用により発生された組換え体ヒヒ尿酸オキシダーゼはＤ３Ｈヒヒ尿酸オキシダーゼと名付けられている。
【００４９】
ブタおよびヒヒ肝臓からの総細胞ＲＮＡは１ｓｔ ｓｔｒａｎｄキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して逆転写された。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用するＰＣＲ増幅は、熱サイクラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中、［３０秒、９５℃；３０秒、５５℃；６０秒、７０℃］２０サイクル続いて［３０秒、９５℃；６０秒、７０℃］１０サイクルのプログラムで実施された。尿酸オキシダーゼＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してｐＵＣ１８（ブタ）内へクローン化され、およびまたＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して直接的にクローン化された（ブタおよびＤ３Ｈヒヒ）。ｃＤＮＡクローンで大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換させた。クローン化ウリカーゼｃＤＮＡを含んでいるプラスミドが調製され、ｃＤＮＡ挿入配列は標準ジデオキシ技術により分析された。報告されている尿酸オキシダーゼＤＮＡコード配列（表１で説明したヒヒ尿酸オキシダーゼ中のＤ３Ｈ置換を除いて）を持っていたクローンが構築され、標準組換えＤＮＡ方法論による一連の続いての工程により確認された。
【００５０】
完全長コード配列を含んでいるブタおよびＤ３ＨヒヒｃＤＮＡは以下のようにｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内へ導入された。Ｄ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素でＴＡプラスミドから切り出され、次に発現プラスミドｐＥＴ３ｄおよびｐＥＴ９ｄのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位内へサブクローン化された。完全長ブタウリカーゼｃＤＮＡはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でｐＵＣプラスミドクローンから切り出され、ｐＥＴ２８ｄのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位内へサブクローン化された。ブタｃＤＮＡコード領域もまたｐＥＴ２８ｄのＮｃｏＩおよびＢｌｐＩ部位から切り出した後、発現プラスミドｐＥＴ９ｄのＮｃｏＩおよびＢｌｐＩ部位内へ導入された。
【００５１】
ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ｃＤＮＡはｐＥＴ３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンからＤ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡの６２４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＡｐａＩ制限断片を切り出し、次にこのＤ３Ｈヒヒセグメントを対応するブタｃＤＮＡの６２４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＡｐａＩ制限断片で置き換えることにより構築した。得られたＰＢＣ尿酸オキシダーゼｃＤＮＡは読み枠内でヒヒ尿酸オキシダーゼのコドン２２６−３０４へ連結されたブタ尿酸オキシダーゼコドン１−２２５から成っている。
【００５２】
ブタ−ＫＳ尿酸オキシダーゼ（ＰｉｇＫＳ）ｃＤＮＡはｐＥＴ３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンからのＤ３ＨヒヒウリカーゼｃＤＮＡの８６４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ制限断片を切り出し、次にこのＤ３Ｈヒヒセグメントを対応するブタｃＤＮＡの８６４ｂｐ ＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ制限断片で置き換えることにより構築した。得られたＰＫＳ尿酸オキシダーゼｃＤＮＡは読み枠内でヒヒ尿酸オキシダーゼのコドン２８９−３０４へ連結されたブタ尿酸オキシダーゼコドン１−２８８から成っている。
【００５３】
Ｄ３Ｈヒヒ、ブタ、ＰＢＣおよびＰＫＳ尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列は図５および配列表に示されている。これらの形質転換体の各々の１５％グリセロール保存液の調製には標準技術が使用され、これらは−７０℃で保存された。これらの化学種が発現されおよび組換え酵素が単離された場合（表２）、ブタ、ＰＢＣキメラおよびＰｉｇＫＳウリカーゼは非常に類似した比活性を持っており、それは組み換えヒヒウリカーゼの比活性よりも約４−５倍高かった。この順序はいくつかの他の実験で確認された。いくつかの異なった方法で調製されたＰＢＣウリカーゼの比活性は２−２．５倍の範囲にわたって変動した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
＊タンパク質はローリー法により決定された。ウリカーゼ活性は分光学的に決定された（Ｐｒｉｅｓｔ ａｎｄ Ｐｉｔｔｓ １９７２）。アッセイは１ｍｌの反応混合物（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．６、０．１ｍＭ尿酸）を含んでいる１ｃｍの石英キュベット中、２３−２５℃で実施された。尿酸の消失は２９２ｎｍでの吸光度の減少によりモニターされた。ウリカーゼの１国際単位（ＩＵ）は分当たり１マイクロモルの尿酸消失を触媒する。
【００５６】
表２に示されている４つのウリカーゼｃＤＮＡ−ｐＥＴ構築物の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体は、ｐＥＴシステムマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）に示されているように選択抗生物質（ｐＥＴ３ｄ（ｐｉｇＫＳ）に対してカルベニシリンおよびクロラムフェニコール；ｐＥＴ９ｄ（ＰＢＣ、ブタ、ヒヒ）に対してカナマイシンおよびクロラムフェニコール）を含んでいるＬＢ寒天に播種した。５ｍｌの培養液（ＬＢ＋抗生物質）を単一形質転換コロニーに加え、３７℃で３時間増殖させた。次に、その０．１ｍｌを、選択抗生物質および０．１％ラクトースを含んでいる１００ｍｌのＬＢ培地に移した（ウリカーゼ発現を誘導するため）。３７°で一夜増殖させ、培養液０．５ｍｌからの細菌細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液内に抽出し、ＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥにより分析した；このことにより４つの培養物の各々で同等のレベルのウリカーゼタンパク質が発現されていたことが確立された（データは示されていない）。各々の１００ｍｌ培養液の残りの細胞は遠心分離により集め、ＰＢＳで洗浄した。細胞は次に１ｍＭ ＡＥＢＳＦプロテアーゼインヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含んでいる２５ｍｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）、に再び懸濁し、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）中、氷上で溶菌させた。不溶性物質（ウリカーゼを含んでいる）を遠心分離（２０，１９０ｘｇ、４°、１５分）によりペレット化した。ペレットは１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、により４°で一夜抽出した。抽出物は１０ｍｌの水で希釈して遠心分離した（２０，１９０ｘｇ、４°、１５分）。ウリカーゼ活性およびタンパク質濃度が続いて決定された。
実施例２
組換え体ＰＢＣウリカーゼの発現および単離（４リットル発酵器法）
Ｎｏｖａｇｅｎ ｐＥＴシステムマニュアルに示されているように、ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣウリカーゼ形質転換体がグリセロール保存液からカルベニシリンおよびクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天プレートへ播種された。ｐＥＴプラスミド保持を最大にするためにｐＥＴシステムマニュアルで推薦されている方法を用いて、単一コロニーから出発した２００ｍｌ接種物が３７°で回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上のＬＢ−抗生物質液体培地に調製された。ＯＤ５２５が２．４で、この２００ｍｌ培養物から細胞を遠心分離により集め、５０ｍｌの新鮮培地に再懸濁した。この懸濁液を、４リットルのカルベニシリンおよびクロラムフェニコール含有ＳＬＢＨ培地（ＳＬＢＨ培地の組成、および発酵器の設計および操作はＳａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７４、に説明されている）を含んでいる高密度発酵器に移した。Ｏ２下、３２°で２０時間増殖させた後（ＯＤ５２５＝１９）、ウリカーゼ生成を誘導するためにイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭまで加えた。さらに６時間後（ＯＤ５２５＝３７）、細菌細胞を遠心分離により集め（１０，４１０ｘｇ、１０分、４℃）、ＰＢＳで一度洗浄し、−２０℃で凍結保存した。
【００５７】
細菌細胞（１８９ｇ）を２００ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷／塩浴で冷却しながら超音波処理（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ ＸＬ、プローブモデルＣＬ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）により（１００％強度で４ｘ４０秒バースト、バースト間に１分の休止）溶菌した。ＰＢＳ不溶性物質（ウリカーゼを含む）を遠心分離（１０，４１０ｘｇ、１０分、４℃）によりペレット化し、２００ｍｌのＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ不溶性ペレット中のウリカーゼは１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１３０μｇ／ｍｌアプロチニンを含んでいる８０ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に抽出した。不溶性細胞破片は遠心分離（２０，１９０ｘｇ、２時間、４℃）により除去した。以下のすべての精製工程は４℃で実施された（結果は表３に要約されている）。
【００５８】
ｐＨ１０．２抽出物は１ｍＭ ＰＭＳＦで１８００ｍｌまで希釈した（Ｎａ２ＣＯ３を０．０７５Ｍに減少させる）。これは、０．０７５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、で平衡化されている新しいＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカラム（２．６ｘ９ｃｍ）に加えた。負荷した後、カラムを１）溶出液のＡ２８０での吸光度がバックグラウンドに到達するまで０．０７５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、；２）溶出液のｐＨが８．５へ落ちるまで１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５；３）５０ｍｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ；４）１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５中、０．１５Ｍから１．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で１００ｍｌ；５）１５０ｍｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ；６）１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５；７）溶出液のｐＨが１１に上昇するまで０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１で連続的に洗浄した。最後に、ウリカーゼを０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１中、０から０．６ＭのＮａＣｌの５００ｍｌ濃度勾配液で溶出させた。活性は二つのＡ２８０吸収ピークに溶出し、それらは別々にプールされた（分画Ａおよび分画Ｂ、表３）。これらのプール各々のウリカーゼは、１Ｍ酢酸を徐々に加えてｐＨを７．１に低下させ、続いての遠心分離（７０００ｘｇ、１０分）により沈殿させた。得られたペレットは５０ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に溶解し、４℃で保存した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
実施例３
組換え体ＰＢＣウリカーゼの小規模製造およびＰＥＧ化
この実施例は精製組換え体ＰＢＣウリカーゼがＰＥＧ化ウリカーゼを製造するために使用できることを示している。この反応において、すべてのウリカーゼサブユニットは修飾されており（図１、レーン７）、触媒活性の約６０％を保持していた（表４）。
Ａ．PＢＣウリカーゼの小規模発現および単離（表４、図１）。
【００６１】
ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの４リットル培養液を回転振盪機（２５０ｒｐｍ）上、３７°でインキュベートした。０．７ＯＤ５２５の時点で、培養物はＩＰＴＧにより誘導された（０．４ｍＭ、６時間）。細胞を集め、−２０℃で凍結させた。細胞（１５．３ｇ）は凍結および融解により破壊し、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、１Ｍ ＰＭＳＦで抽出した。遠心分離後（１２，０００ｘｇ、１０分、４℃）、上清（８５ｍｌ）を水で１：１０に希釈し、実施例１で説明した方法と同じ様式でＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでクロマトグラフィーを行った。この工程でプールされたウリカーゼ活性はＰＭ３０膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用した加圧限外濾過により濃縮した。濃縮液は０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２で平衡化および溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカラム（２．５ｘ１００ｃｍ）でクロマトグラフィーを行った。ウリカーゼ活性を含んでいる分画をプールし、上記のような加圧限外濾過により濃縮した。
Ｂ．ＰＥＧ化
１００ｍｇの濃縮Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＰＢＣウリカーゼ（５ｍｇ／ｍｌ、２．９マイクロモル酵素；８４．１マイクロモルリジン）の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、溶液を２倍過剰（ＰＥＧのモル：ウリカーゼリジンのモル）のＰＥＧの活性化形と、４°で６０分間反応させた。ＰＥＧ化ウリカーゼは接線方向流ディアフィルトレーションにより未反応または加水分解ＰＥＧを除いた。この工程において、反応液は０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、溶液に１：１０で希釈され、３．５容量の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２、に対して、続いて３．５容量の０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、に対してディアフィルトレーションされた濾過滅菌酵素は、４°で少なくとも１ヶ月は安定であった。
【００６２】
【表４】
【００６３】
図１は組換え体ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼの精製およびＰＥＧ化の間に得られた分画のＳＤＳ−メルカプトエタノールＰＡＧＥ（１２％ゲル）分析を示している。レーン１＝ＭＷマーカー；２＝非誘導ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡ−形質転換細胞のＳＤＳ抽出物；３＝ＩＰＴＧ誘導ｐＥＴ３ｄ−ＰＢＣ ｃＤＮＡ−形質転換細胞のＳＤＳ抽出物；４＝粗抽出物（表５参照）；５＝濃縮Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅウリカーゼプール；６＝濃縮Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ウリカーゼプール；７＝ＰＥＧ化Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００組換え体ＰＢＣウリカーゼ。
【００６４】
表４に示した結果は精製ＰＢＣウリカーゼが触媒活性の約６０％を保持して修飾できたことを示している。このＰＥＧ化反応において、すべてのウリカーゼサブユニットが修飾されていた（図１、レーン７）。ここには示されていない研究において、ＰＥＧ化酵素は非修飾ＰＢＣウリカーゼと類似の動力学的特性を持っていた（ＫＭ１０−２０μＭ）。重要なことには、修飾酵素は生理学的ｐＨにおいて非修飾酵素よりもさらに可溶性であった（ＰＢＳ中、＞５ｍｇ／ｍｌに対して＜１ｍｇ／ｍｌ）。ＰＥＧ化酵素はまた、ほとんど活性を損失することなく凍結乾燥でき、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で再構築できた。別の実験において、ＰＥＧ−ＰＢＣウリカーゼのこの調製試料とＡ．フラーブス ウリカーゼ臨床製剤の活性を比較した。ホウ酸緩衝液中、ｐＨ８．６で、Ａ．フラーブス酵素は１０−１４倍高いＶｍａｘおよび２倍高いＫＭを持っていた。しかしながら、ＰＢＳ、ｐＨ７．２、において、ＰＥＧ−ＰＢＣおよび非修飾真菌酵素はウリカーゼ活性において＜２倍の相違であった。
実施例４
非修飾およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼのマウスにおける循環寿命
図２は天然およびＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼの循環寿命を示している。一群のマウス（時点当たり３匹）に１単位の天然（丸）またはＰＥＧ修飾（四角）組換え体ＰＢＣウリカーゼ（実施例３に説明したように調製）がＩＰで注射された。示されている時間に、血清ウリカーゼ活性を測定するために３匹のマウスの組から血液を得た。ＰＥＧ化ウリカーゼ（実施例３に説明したような）は約４８時間の循環寿命を持っていたのに対し、非修飾酵素は＜２時間であった（図２）。
実施例５
本発明のＰＥＧ化ウリカーゼの有効性
図３は尿酸の血清および尿濃度に対する血清ウリカーゼ活性の関係を示している。この実験において、ホモ接合性ウリカーゼ欠損ノックアウトマウス（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９４）に、すでにＰＥＧ化されている０．４ＩＵの組換え体ＰＢＣウリカーゼが０および７２時間目に２回注射された。ウリカーゼ欠損ノックアウトマウスがこの実験で使用された。なぜならウリカーゼを持っている正常マウスと異なり、これらのノックアウトマウスは（ヒトのように）その血液および体液に高レベルの尿酸を持っており、尿に高レベルの尿酸を排泄するからである。これらの高レベルの尿酸はこれらのマウスに重度の障害を起こし、それはしばしば致死的である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９４）。
【００６５】
図３に示された実験は、組換え体ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ化製剤の腹腔内注射が血清ウリカーゼ活性を増加させたことを示しており、それはウリカーゼ欠損マウスにおいて、尿酸の血清および尿濃度の著しい減少を伴った。
実施例６
構築物−担体複合体の非免疫原性
ＰＥＧ化組換え体ＰＢＣウリカーゼがホモ接合性ウリカーゼ欠損マウスに反復して注射されたが、促進されたクリアランスを誘導することはなく、有意な免疫原性が存在しないことと矛盾しない。このことはＥＬＩＳＡにより確認された。図４は反復注射後のウリカーゼ活性（血清で測定された）の循環寿命の維持を示している。ＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼは６−１０日間隔で腹腔内注射により投与された。血清ウリカーゼ活性は注射２４時間後に決定された。
実施例７
突然変異的に導入されたリジンへの共有結合
精製組換え体ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ化は新規リジン（残基２９１）へのＰＥＧの結合を生じなければならない。この実験において、ＰＢＣウリカーゼ調製試料はＰＥＧ化により修飾できた。新規リジン（残基２９１）を含んでいるペプチドがＰＥＧ化により修飾されたかどうかは本分野では既知の手段により決定できた。
参考文献
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【表８】
【００７０】
【表９】
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
上に引用したすべての論文は、全体が本明細書において援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つまたはそれ以上のリジン残基を挿入するように修飾されている哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を含むタンパク質。
【請求項２】
該組換え体タンパク質が二つまたはそれ以上の哺乳動物アミノ酸配列のキメラタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
該組換え体ウリカーゼキメラタンパク質が３０４のアミノ酸を含み、該３０４のアミノ酸の最初の２２５のＮ末端部分がブタウリカーゼのアミノ酸１−２２５であり、該３０４のアミノ酸の残りの７９のアミノ酸がヒヒウリカーゼのアミノ酸２２６−３０４である請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
該組換え体ウリカーゼキメラタンパク質が３０４のアミノ酸を含み、該３０４のアミノ酸の最初の２８８のＮ末端部分がブタウリカーゼのアミノ酸１−２８８であり、該３０４のアミノ酸の残りの１６のアミノ酸がヒヒウリカーゼのアミノ酸２８９−３０４である請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列ＩＤ番号：２、４、８、９、１０および１１から成る群より選択される組換え体ウリカーゼタンパク質。
【請求項６】
請求項１の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項７】
請求項３の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項８】
請求項４の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項９】
請求項５の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項１０】
配列ＩＤ番号：１の塩基配列を持っている請求項９の単離され、精製された核酸分子。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号：３の塩基配列を持っている請求項９の単離され、精製された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１の核酸分子を含んでいるベクター。
【請求項１３】
請求項９の核酸分子を含んでいるベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１６】
ウリカーゼタンパク質を突然変異させることを含む、利用可能な無毒性ＰＥＧ結合部位を増加させる方法であって、それにより少なくとも一つのリジン残基が導入される。
【請求項１７】
ウリカーゼタンパク質を突然変異させることを含む、利用可能な無毒性ＰＥＧ結合部位を増加させる方法であって、それによりアルギニンの場所に少なくとも一つのリジン残基が導入される。
【請求項１】
一つまたはそれ以上のリジン残基を挿入するように修飾されている哺乳動物種の組換え体ウリカーゼタンパク質を含むタンパク質。
【請求項２】
該組換え体タンパク質が二つまたはそれ以上の哺乳動物アミノ酸配列のキメラタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
該組換え体ウリカーゼキメラタンパク質が３０４のアミノ酸を含み、該３０４のアミノ酸の最初の２２５のＮ末端部分がブタウリカーゼのアミノ酸１−２２５であり、該３０４のアミノ酸の残りの７９のアミノ酸がヒヒウリカーゼのアミノ酸２２６−３０４である請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
該組換え体ウリカーゼキメラタンパク質が３０４のアミノ酸を含み、該３０４のアミノ酸の最初の２８８のＮ末端部分がブタウリカーゼのアミノ酸１−２８８であり、該３０４のアミノ酸の残りの１６のアミノ酸がヒヒウリカーゼのアミノ酸２８９−３０４である請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列ＩＤ番号：２、４、８、９、１０および１１から成る群より選択される組換え体ウリカーゼタンパク質。
【請求項６】
請求項１の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項７】
請求項３の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項８】
請求項４の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項９】
請求項５の組換え体ウリカーゼをコードしている、単離され、精製された核酸分子。
【請求項１０】
配列ＩＤ番号：１の塩基配列を持っている請求項９の単離され、精製された核酸分子。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号：３の塩基配列を持っている請求項９の単離され、精製された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１の核酸分子を含んでいるベクター。
【請求項１３】
請求項９の核酸分子を含んでいるベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１６】
ウリカーゼタンパク質を突然変異させることを含む、利用可能な無毒性ＰＥＧ結合部位を増加させる方法であって、それにより少なくとも一つのリジン残基が導入される。
【請求項１７】
ウリカーゼタンパク質を突然変異させることを含む、利用可能な無毒性ＰＥＧ結合部位を増加させる方法であって、それによりアルギニンの場所に少なくとも一つのリジン残基が導入される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【公開番号】特開２０１０−１５８２４４（Ｐ２０１０−１５８２４４Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１５２０（Ｐ２０１０−２１５２０）
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【分割の表示】特願２０００−５６３８１９（Ｐ２０００−５６３８１９）の分割
【原出願日】平成１１年８月５日（１９９９．８．５）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【分割の表示】特願２０００−５６３８１９（Ｐ２０００−５６３８１９）の分割
【原出願日】平成１１年８月５日（１９９９．８．５）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【Ｆターム（参考）】
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