幹細胞の簡易調製法およびそれに使用するフィーダー細胞
本発明は、従来技術では達成し得ない程度の効率で幹細胞（特に、霊長類のＥＳ細胞）を樹立することができる技術を提供することを課題とする。本発明は、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物を提供する。本発明はまた、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、幹細胞を調製するための方法を提供する。本発明はまた、臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法であって：Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物の上で培養する工程；およびＣ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、を包含する、方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の分野にある。より詳細には、本発明は、幹細胞（特に、霊長類の胚性幹細胞（本明細書において以下ＥＳ細胞ともいう））の簡易な調製および保存のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療による疾患治療が最近注目を浴びている。再生医療は、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用などに代わる治療法としての役割が期待されている。しかし、これを臓器または組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。
【０００３】
再生医療の中心にある幹細胞、特にＥＳ細胞は、その医療応用面での可能性から近年その重要性を増している（非特許文献１）。ヒトＥＳ細胞はその中でも特に重要であるがその樹立または安定した継代維持が難しく効率的な利用を阻害している。ヒトを含めた霊長類ＥＳ細胞は、その樹立必要とされる胚盤胞の供給がきわめて少なく、少数の胚盤胞から効率よくＥＳ細胞株の樹立を行う必要がある。従来の方法では胚盤胞からの樹立の効率は多くてもせいぜい１０から３０％程度であるといわれている。
【０００４】
トランスジェニック動物の作出が、ＥＳ細胞を使用することで可能となっている。ＥＳ細胞とは、通常胚盤胞と呼ばれる発生段階の胚に存在する将来動物個体となる未分化な細胞群である内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ＩＣＭ）の細胞を培養することによって得られた細胞株である。ＥＳ細胞は１９８１年にＭ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ とＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（非特許文献２）に続いて、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ（非特許文献３）によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。
【０００５】
ＥＳ細胞が、霊長類で樹立され、その応用に対する期待がますます高まる中、これらの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。
【０００６】
非特許文献４は、ヒトの皮膚の繊維芽細胞をフィーダーに利用する論文で樹立は１つの内部細胞塊から１株樹立しているが、その効率はまったく低いものである。非特許文献５は、ヒトＥＳ細胞の最初の論文であるが、その樹立効率は、５株／１４内部細胞塊である。非特許文献６ではＳＴＯ細胞を用いてヒトＥＳ細胞の樹立を行っているが、その樹立効率は、３株／１４内部細胞塊と、まったく低いものにとどまっているのが現状である。このように、樹立効率において、５０％はおろか、３０％を達成するのも覚束ないというのが現状の技術水準であるといえる。
【０００７】
本発明者らは、特許文献１において、培地の最適条件を検討した。しかし、培地を最適化するだけでは、樹立効率を上げるには限界があり、樹立されたＥＳ細胞には分化細胞が有意に存在する。
【０００８】
他のグループもまた、幹細胞の維持のための方法を開発している（例えば、特許文献２、非特許文献５および７）。しかし、これらの方法では、フィーダー細胞は単種類使用されるのみであり、常に分化細胞が混入する。特に、非特許文献７では、５０％ほどが部分的に分化した細胞集団となっている。
【０００９】
従って、より分化細胞の混入が低減し、未分化状態の維持がより亢進するために使用される技術に対する要望が強まっている。
【００１０】
（先行技術文献）
【特許文献１】特開２００３−１１６５２７号
【特許文献２】米国特許第６２００８０６号
【非特許文献１】幹細胞・クローン 研究プロトコール 中辻編、羊土社（２００１）
【非特許文献２】Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ ＆ Ｍ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ： Ｎａｔｕｒｅ， ２９２， １５４， １９８１
【非特許文献３】Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８， ７６３４， １９８１
【非特許文献４】Ｈｏｖａｔｔａ Ｏ．， ｅｔ ａｌ． ， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．７ ｐｐ． １４０４−１４０９， ２００３
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８２：１１４５−１１４７， １９９８．
【非特許文献６】Ｐａｒｋ Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ２００３ ｏｎｌｉｎｅ Ａｕｇ． ２０．
【非特許文献７】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ， Ｐｅｒａ ＭＦ， Ｆｏｎｇ ＣＹ， Ｔｒｏｕｎｓｏｎ Ａ， Ｂｏｎｇｓｏ Ａ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００ Ａｐｒ；１８（４）：３９９−４０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来技術では達成し得ない程度の効率（特に、分化細胞の混入を低減する）で幹細胞（特に、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞）を樹立することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、従来使用されている、フィーダー細胞を複数（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞、繊維芽細胞株など）を混合してフィーダー細胞として用いると、予想外に効率よく幹細胞を樹立することができることを見出したことによって上記課題を解決した。
【００１３】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１４】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物を提供する。
【００１５】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、初代培養細胞を含む。
【００１６】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、不死化していない細胞である。
【００１７】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、繊維芽細胞を含む。
【００１８】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である。
【００１９】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス由来である。
【００２０】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、胎児由来である。
【００２１】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、継代数が５回以下である。
【００２２】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である。
【００２３】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、継代数が５回以下の初代培養細胞である。
【００２４】
一つの実施形態において、上記細胞株は、不死化している。
【００２５】
一つの実施形態において、上記細胞株は、繊維芽細胞株である。
【００２６】
一つの実施形態において、上記細胞株は、継代された期間が２ヶ月以下である。
【００２７】
一つの実施形態において、上記細胞株は、継代された期間が１ヶ月以下である。
【００２８】
一つの実施形態において、上記細胞株は、マウス由来である。
【００２９】
一つの実施形態において、上記細胞株は、胎児由来である。
【００３０】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ＳＴＯ株である。
【００３１】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ｎｅｏ抵抗性である。
【００３２】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００３３】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、約１：１０〜１０：１である。
【００３４】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、約１：３〜３：１である。
【００３５】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、ほぼ等量で存在する。
【００３６】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、胚性幹細胞である。
【００３７】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
【００３８】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００３９】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、幹細胞を調製するための方法を提供する。
【００４０】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００４１】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされている。
【００４２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種される。
【００４３】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、混合して播種された後５日以内に使用される。
【００４４】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物中の上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００４５】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養される。
【００４６】
一つの実施形態において、上記方法は、さらに、継代する工程を包含し、上記継代工程において、コラゲナーゼが使用される。
【００４７】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、幹細胞調製物を提供する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、ＥＳ細胞調製物を提供する。
【００４９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、霊長類ＥＳ細胞調製物を提供する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、ヒトＥＳ細胞調製物を提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法であって：Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞の上で培養する工程；およびＣ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、を包含する、方法を提供する。
【００５２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００５３】
一つの実施形態において、前記所望の臓器、組織または細胞は、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛および皮膚からなる群より選択される。
【００５４】
一つの実施形態において、上記所望の臓器、組織または細胞と上記フィーダー細胞とは、同じ種である。
【００５５】
一つの実施形態において、上記所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、上記フィーダー細胞はマウス由来である。
【００５６】
一つの実施形態において、上記培養は、エキソビボで行われる。
【００５７】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものである。
【００５８】
一つの実施形態において、上記培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下で行われる。
【００５９】
一つの実施形態において、上記分化は、ＤＮＡ脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、核内レセプターリガンド、細胞増殖因子、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレンおよびセレンからなる群より選択される少なくとも１つの分化因子を含む培養液において行われる。
【００６０】
他の局面において、本発明は、本発明の臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法によって調製される、臓器、組織または細胞を提供する。
【００６１】
一つの局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するためのシステムであって：Ａ）容器；およびＢ）上記容器上に播種される、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞、を備える、システムを提供する。
【００６２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００６３】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と細胞株との混合物を提供する。
【００６４】
一つの実施形態において、この混合物は、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む。
【００６５】
一つの実施形態において、上記初代培養細胞は、マウス胎児初代培養繊維芽細胞である。
【００６６】
一つの実施形態において、上記繊維芽細胞株は、ＳＴＯ株である。
【００６７】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００６８】
一つの局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための方法であって： Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）上記幹細胞を、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞上で培養する工程；およびＣ）上記培養された上記幹細胞を上記被検体の処置されるべき部位に移植する工程、を包含する、方法を提供する。
【００６９】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７０】
一つの実施形態において、本発明は、Ｄ）上記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する。
【００７１】
一つの局面において、本発明は、フィーダー細胞としての、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７２】
一つの局面において、本発明は、フィーダー細胞を含む医薬を製造するための、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７３】
別の局面において、本発明は、フィーダー細胞調製物としての、正常細胞と、細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７４】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７５】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている。
【００７６】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている。
【００７７】
別の局面において、本発明は、幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の使用を提供する。
【００７８】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７９】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている。
【００８０】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている。
【００８１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００８２】
本発明によって、特に幹細胞を効率よく樹立する技術が提供される。特に、霊長類細胞では、本発明５０％以上（好ましくは８０％以上）という従来達成不可能であった高い効率で細胞株の樹立が可能となった。特に、本発明のフィーダー細胞を用いて調製された幹細胞調製物に含まれる分化細胞が５０％未満であり、１０％未満、あるいは約１％未満という低率も達成し得ることが明らかになった。従って、本発明は、従来達成できなかった高純度の多能性細胞の調製物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の方法により樹立したサルＥＳ細胞株の解説写真である。バーは１００μｍを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、この方法により樹立したサルＥＳ細胞株の解説写真である。バーは５０μｍを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＥＳ細胞の写真である。バーは、２７５μｍを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＥＳ細胞の写真である。バーは、７０μｍを示す。
【図３】図３は、未分化状態特異的マーカー発現である。
【図４】図４は、神経細胞への分化である。
【図５】図５は、テラトーマ形成による多分化能の証明である。
【図６】図６は、ＥＳ細胞樹立スキーム例を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００８５】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙し、必要な技術の説明を行い、本発明を説明する。
【００８６】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
本発明において使用されるフィーダー細胞として使用される細胞は、正常細胞と細胞株とが存在し、好ましくは、繊維芽細胞またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞（例えば、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞）が用いられてもよい。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。別の実施形態では、好ましくは、フィーダー細胞としては、げっ歯類細胞が用いられ、より好ましくは、マウス細胞がフィーダー細胞として用いられる。
【００８８】
本発明で用いられる幹細胞として使用される細胞は、幹細胞またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞（例えば、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞）が用いられてもよい。さらに好ましくは、幹細胞としては、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくは、幹細胞としてはヒト由来の細胞が用いられる。
【００８９】
本明細書において「対応物」とは、例えば、細胞について用いられる場合、ある種の生物中の細胞に関し、同様の性質および／または機能を有する別の種の細胞をいう。そのような同様の性質は、分泌するサイトカイン、増殖因子、発現する細胞マーカーなどによって同定することができる。
【００９０】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。
【００９１】
本明細書において「胚性幹細胞」および「ＥＳ細胞」は、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常ＥＳ細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。このＥＳ細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（ＥＳ細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。ＥＳ細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をしたＥＳ細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。ＥＳ細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、ＥＳ細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。
【００９２】
本明細書において「組織幹細胞」とは、ＥＳ細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞をいう。通常、組織幹細胞は、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞としては、好ましくはＥＳ細胞が使用され得るが組織幹細胞もまた維持の対象であり得る。
【００９３】
ＥＳ細胞株は、キメラマウス、ノックアウトマウスなどの作製において非常に重要であり、これらの技術により遺伝子機能の解析が飛躍的に進歩した。ＥＳ細胞から特定の組織を分化誘導する系の開発が進んでおり、移植医療への応用の現実味を帯びている。また、ヒトＥＳ細胞を利用した臨床応用を考えた場合、サルなどの適切なモデル動物のＥＳ細胞を利用して前臨床研究をすることは必須に近い程度に重要であると考えられ、その樹立もまた重要である。
【００９４】
ＥＳ細胞株の樹立は、フィーダー細胞を用いて行われる。通常、ＥＳ細胞は、胚盤胞から分離した内部細胞塊（ＩＣＭ）をフィーダー細胞上で培養することによって樹立される。ここで従来は、マウス胎仔繊維芽細胞あるいはそれ由来の細胞株ＳＴＯが単独で用いられてきた。しかし、これらの細胞では、樹立効率が低く、特に霊長類幹細胞では、１０％−３０％程度と顕著に低く、分化細胞が混入することが報告されている。また、この効率は、使用する胚盤胞のステージ、ＩＣＭの分離法などによっても変動する。従って、樹立効率が低い現在の系では、樹立に成功するまでには何回も試行錯誤が必要であった。本発明を用いると、効率は８０％以上となり、分化細胞の混入も激減し、そのような試行錯誤の必要はなくなる。
【００９５】
次に、本発明において用いることが可能なＥＳ細胞の一般的な樹立法を解説する。マウスで説明すると、通常、受精後３．５日で胚は胚盤胞に発生する。胚盤胞から胚本体を形成する未分化幹細胞である内部細胞塊を免疫手術により分離する。このＩＣＭは、胎盤などが作る細胞である栄養外胚葉への分化能を有する。このため、３．５日胚から直接ＩＣＭを分離するとＩＣＭが栄養外胚葉へと分化することから未分化細胞が喪失することがよくあるとされる。３．５日胚をさらに１日培養し、４．０〜４．５日胚とすると、胚盤胞は透明帯を脱出する。このステージではＩＣＭはもはや栄養外胚葉には分化しない。このような状態から、ＩＣＭを分離し、培養を開始すると、未分化細胞の割合を高めることができる。従って、本発明における幹細胞の樹立の際も、このような日数の未分化細胞を用いることができる。また、ヒトＥＳ細胞の場合は、この日数を参考にして、適宜変更して用いることができる。ヒトの場合は、受精後５〜８日のもの（凍結期間を除く）を使用することが多いが、それに限定されない。
【００９６】
ＥＳ細胞を樹立する際には、胚盤胞は、フィーダー細胞上に直接培養することもできるが、直接の場合は、胚盤胞が接着し栄養外胚葉が伸展してＩＣＭが露出することからあまり好ましくない。これを分離し培養したものを用いてもよいが、好ましくは免疫手術が用いられる。模式的なＥＳ細胞株樹立スキームを図６に示す。簡単に言うと、免疫手術で分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養し、継代を続けると分化した細胞に混じって、未分化幹細胞のコロニーが現れる。これを分離し、継代を行うことで、安定して維持することができるＥＳ細胞株を樹立することができる。本発明を用いると、樹立率が８０％を超えることから、安定して維持することができるＥＳ細胞を得る効率も格段に上がる。
【００９７】
ＥＳ細胞を樹立するためには、本発明のフィーダー細胞のほか、ＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ不含）、０．２５％トリプシン・１ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ、ＥＳ細胞用培地（ＤＭＥＭ（ハイグルコース）４００ｍｌ、ウシ胎仔血清 １００ｍｌ、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）４ｍｌ、ヌクレオシド溶液（ヌクレオシド、グアノシン、シチジン、ウリジン各３ｍＭ、チミジン１ｍＭ水溶液、４０℃に加熱して溶解し、濾過滅菌し、−２０℃で保存する）４ｍｌ、２−メルカプトエタノール４μｌ（０．１ｍＭ）、ＬＩＦ １００μｌ（２０００Ｕ／ｍｌ））、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、Ｍ１６培地（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、酸性タイロード液（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、抗マウス血清（マウス脾臓細胞またはリンパ球５×１０８細胞をウサギに２週間おきに３回静脈免疫し、最終免疫から２週間後に採血する。これを抗血清として非働化し−８０℃で保存する）、モルモット補体、流動パラフィン（軽質；ナカライテスクなどから入手可能）を用意することが必要である。実験器具としては、ＣＯ２インキュベータ、実体顕微鏡、キャピラリー、マルチウェルプレート（例えば、４ウェル、１２ウェル、ＮＵＮＣなどから入手可能）を用意するとよい。
【００９８】
以下にＥＳ細胞の樹立の例示的なプロトコール記載する。このプロトコールは、京都大学再生医科学研究所においてまとめられたヒトＥＳ細胞株樹立計画書に準じて記載されるが、本明細書では、この特定のプロトコールに限定されず、いずれのプロトコールであっても用いることができる。
【００９９】
（１）凍結胚の解凍と胚盤胞期までの培養
凍結保存されたヒト受精卵または胚盤胞期までの初期胚を順次解凍して培養を行う。個々の凍結胚容器からは提供者を同定できるものは除去されているため、各回の解凍・培養実験に使用されたヒト受精胚の出自は同定され得ない。しかしながら、各々のヒト受精胚の取扱がおろそかにならないように、凍結胚として受け入れた時点からひとつの凍結容器内に納められたヒト受精胚を樹立研究の過程で個々の存在として尊重し、どのような経過をたどったかを記録する。
【０１００】
（２）内部細胞塊の分離と細胞株の樹立
胚盤胞期まで到達した胚（受精後の発生期間が約１４日以内のもの）について、抗ヒト血清による免疫手術などの方法によって内部細胞塊を分離したのち、フィーダー細胞層の上で培養する。フィーダー細胞としては、本発明のフィーダー細胞を用いる。内部細胞塊を採取した後の残部についても、礼節をもって取扱う。フィーダー細胞の上で増殖した細胞を適時に解離して分割継代し、幹細胞と思われる細胞コロニーの選別培養などを行ないながら、ES 細胞と思われる細胞株を樹立する。この間に、培養維持方法や細胞凍結保存方法などの改良を目指した研究を行う。
【０１０１】
（３）幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定
ES 細胞であることを確認するために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ活性や特異的抗原）の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどうかを検定する。
【０１０２】
（４）分化能の検定
培養下での分化能を検定するために、培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の解析を行なう。また免疫不全マウスなどへの移植を行なってテラトーマ形成による組織分化能の解析を行なう。
【０１０３】
（５）安全性確保と事故防止
ヒト凍結胚の一時的保存は専用の液体窒素タンクを用いることによって、樹立計画に用いる以外の細胞や動物胚などに由来するウイルスと微生物による汚染を防ぐ。また細胞培養実験には専用の炭酸ガスインキュベーターを用いることによって、他種類の細胞との混合を防ぎ、ウイルスや微生物による汚染の可能性を小さくする。細胞培養に用いた培養液や培養器具は、実験室内で加圧高温滅菌処理を行なったのちに廃棄する。ヒト受精胚の保存および細胞株樹立を行なう実験室への入室者の管理を厳重に行う。
【０１０４】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。ＥＳ細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０５】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【０１０６】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。
【０１０７】
本明細書において「胎児」または「胎仔」とは、交換可能に用いられ、哺乳動物の子が各器官原基の分化を完了し，成長期に入ったときから出産までの期間にある生物体をいう。
【０１０８】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。樹立された分化細胞は、特定の確定した機能を有する。樹立された分化細胞は癌化していることが多いが、それに限定されない。
【０１０９】
本明細書において本明細書において「分化」とは、一般的には、１つの系が２つ以上の質的に異なる系に分離することをいい、細胞、組織または臓器について用いられるとき、機能および／または形態が特殊化することをいう。分化に伴い、通常、多能性は減少または消失する。
【０１１０】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明において用いられる場合、分化細胞は、集団または組織の形態であってもよい。分化細胞の幹細胞調製物への混入は、幹細胞の利用において有害であることが多く、そのような分化細胞の混入を減少させることは従来技術では困難であった。
【０１１１】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【０１１２】
本明細書において「正常細胞」とは、病理状態にない任意の細胞をいう。従って、そのような正常細胞は、分裂回数が有限であることが多い。そのような有限の分裂回数は、通常５０〜８０回であることが多い。
【０１１３】
本明細書において「不死化」とは、有限の分裂回数（例えば、５０〜８０回）を超えても細胞が死滅しないことをいう。
【０１１４】
本明細書において「細胞株」または「株化細胞」とは、上記有限の分裂回数を超えても生存する細胞をいう。そのような細胞株は、初代培養細胞などから得られた継代細胞を順次継代し、正常細胞が通常死滅する継代数を超えて細胞を継代した後も生存する細胞を選択することによって樹立することができる。そのような樹立方法は、当該分野において公知である。
【０１１５】
本明細書において「繊維芽細胞」とは、支持組織の繊維成分を供給し，繊維性結合組織の重要な成分をなす細胞をいう。組織切片図では、扁平で長目の外形をもち、不規則な突起を示すことが多い。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、小脂肪球などを含むが、そのほかに特殊な分化は示さない。核は楕円形をしており、しばしば膠原繊維に密接して存在する。
【０１１６】
本明細書において「フィーダー層」または「フィーダー細胞」（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒまたはｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）とは、互換可能に用いられ、培養基質に設けられる、単独では培養維持することのできない細胞種の増殖および／または分化形質発現を可能にするような、他の細胞種による支持細胞層をいう。組織細胞には、通常の細胞培養条件下では，分化形質発現はもとより増殖すらできない細胞種も多いといわれており、そのような細胞としては、例えば、幹細胞（特に、ＥＳ細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞など）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの細胞種は一般に、栄養要求性が高く特異的な増殖因子、分化誘導因子を必要とする。このような細胞種でも生体内でのその細胞種の支持細胞あるいはそれと類似の細胞が形成する特定の細胞の層を培養基質に活用することで、培養される細胞種が要求する因子および／または栄養源が供給されることによって、増殖および分化をするようになる。フィーダー細胞として用いる細胞種は、対象となる細胞種によって選択されるが、UV照射などの方法で細胞増殖を抑制して用いることが多い。生殖細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞などの培養が可能になったのは，フィーダー層の活用に負うところが大きい。従来は、フィーダー細胞として、マウス繊維芽細胞（初代培養細胞または細胞株）が使用されており、幹細胞樹立効率は１０％程度であるとされている。本明細書において、このようなフィーダー細胞を含む調製物は、「フィーダー細胞調製物」という。また、本発明において、二種以上の細胞を混合した細胞であって、フィーダー細胞として使用される場合は、「フィーダー細胞混合物」または「細胞混合物」ということがある。
【０１１７】
本明細書において「ＳＴＯ細胞」とは、樹立されたマウス繊維芽細胞株であって、ＡＴＣＣにおいてＣＲＬ−１５０３として寄託されている細胞を含む。ＳＴＯ細胞は、ＳＩＭ繊維芽細胞株に由来し、６−チオグアニンおよびウアバインに対して抵抗性を示し、ＨＧＰＲＴ−（ＨＰＲＴ−）であり、ＨＡＴに感受性を有するとされる。従来より、ＳＴＯ細胞は、フィーダー細胞として用いられており、その対象には、ＥＳ細胞のほか、テラトカルシノーマ、ハイブリドーマなどが含まれている。ＳＴＯ細胞の維持には、適切である限り任意の培養条件を用いることができるが、例えば、ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミンを加え、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌグルコース、およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％を加えたものを用いて培養することができる。ＳＴＯ細胞の継代には、培地を取り除き、０．２５％トリプシン、０．０３％ ＥＤＴＡ溶液を用いてリンスし、その溶液を除いて、さらに１−２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加える。その後、容器を室温（または３７℃）中に移動させて細胞を剥離させる。その後新鮮な培地を入れて、吸引し、その後新たな培養容器へと分配して継代を完成する。培養容器は、ゼラチンコーティングされていてもよい。継代は、１：３〜１：１０で行うことが推奨されるがそれに限定されない。ＳＴＯ細胞としては、上記ＡＴＣＣに寄託されたものを用いてもよいし、あるいは、照射されたＳＴＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣでは、５６−Ｘとして寄託されている）を用いてもよい。
【０１１８】
本明細書において「ＳＬ１０細胞」とは、ＳＴＯ細胞株からサブ樹立した細胞株であり、その樹立方法は、Ｋａｗａｓｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：３８５−３９０（１９９４）、フィーダー細胞の調製などについては、川瀬らの方法［川瀬ら、実験医学，Ｖｏｌ．１０．Ｎｏ．１３ （増刊），１５７５−１５８０，１９９２］に準じて実施できる。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅ．Ｊ． （ｅｄ）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｓｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載されており、本明細書においてその記載を参考として援用する。手短に述べると、ＳＴＯ細胞をｎｅｏｒ遺伝子を含むベクターでトランスフェクトする。その後、ネオマイシン抵抗性になったコロニーを増幅し、そしてフィーダー細胞としての適切性を確認する。この場合ＥＳ細胞株ＣＣＥを試験用に用いることができるがそれに限定されない。ＳＬ１０細胞は、ＣＣＥの未分化幹細胞コロニーをよく維持するものとして選択される。ＳＬ１０細胞は、ゼラチンへの接着性の良さからフィーダーとして適しているとされる。
【０１１９】
本明細書において「初代培養細胞」とは、体から分離した細胞、組織、器官などを植え込み，第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいうが、本明細書では、継代を５回程度まで行うものは本明細書において初代培養細胞の定義内に入ることが理解される。初代培養細胞は、通常何も改変を施されていない細胞を用いることが好ましいが、マイトマイシンＣまたはＸ線で不活化したものを用いることもできる。
【０１２０】
本明細書において継代された後の細胞は、「継代細胞」ともいう。
【０１２１】
本発明の細胞は、細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍ２、Ｍ１６、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）、Ｍ１９９、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１、Ｌ−１５などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。
【０１２２】
本明細書において「分化因子」とは、「分化促進因子」ともいい、分化細胞への分化を促進することが知られている因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２３】
具体的な分化因子としては、以下が挙げられる。
【０１２４】
Ａ）神経：ＮＧＦ、ＣＮＴＦ，ＥＧＦ、ＦＧＦ；
Ｂ）血液細胞：ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、インターロイキン類およびインターフェロン類（例えば、インターロイキン２など）；
Ｃ）肝臓：ＨＧＦ
Ｄ）骨・軟骨：ＢＭＰ。
【０１２５】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
【０１２６】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０１２７】
本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ ｖｉｖｏ）とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
【０１２８】
本明細書において自己または自家とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。本明細書において自己というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。
【０１２９】
本明細書において同種（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。遺伝的に異なることから、同種異系のものは、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような細胞などの例としては、親由来の細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３０】
本明細書において異種とは、異種個体から移植されるものをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植物は異種移植物という。
【０１３１】
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植される細胞などを受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植される細胞などを提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。レシピエントとドナーとは同じであっても異なっていてもよい。
【０１３２】
本発明で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。
【０１３３】
本明細書において「移植」とは、本発明の細胞、組成物、医薬などを、単独で、または他の治療剤と組み合わせて体内に移入することを意味する。本発明は、以下のような治療部位（例えば、骨などなど）への導入方法，導入形態および導入量が使用され得る：本発明の医薬などの障害部位への直接注入し、貼付後に縫合し、挿入する等の方法があげられる。本発明の脂肪幹細胞と、分化細胞との組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、分化促進因子）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与または移植は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる細胞、医薬、化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１３４】
本明細書において「維持」とは、細胞、組織または臓器について用いられるとき、その機能および／または形態を実質的に保持させることをいう。例えば、角膜の維持とは、被検体が通常有するべき角膜の機能および／または形態を実質的に損傷しないで有することをいい、機能としては、視力の維持、形態としては、外観の保持が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３５】
本明細書において使用される「再生」（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）とは，個体の組織または臓器の一部が失われた際に、欠如した組織が補填されて復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し，不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には，生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。あるいは、本発明の方法で樹立された幹細胞を用いれば、どのような組織の再生も原理的には行うことができ、そのようにして調製された本発明の臓器、組織および細胞が再生のための移植物として提供される。細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞およびその分化細胞、造血幹細胞およびその分化細胞ならびに間葉系幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞およびその分化細胞、膵幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。本明細書では、細胞はどのような胚葉由来でもよい。
【０１３６】
本発明において、幹細胞は遺伝子改変することができる。幹細胞は培養細胞であるので、他の培養細胞と全く同様に種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポゾーム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等）が利用できる。また、導入できる遺伝子も何ら制限されるものではなく、細菌、動物またはヒトの染色体に由来する遺伝子などを挙げることができるがそれに限定されない。同様に、ＥＳ細胞株を利用するジーンターゲッティングの方法として使用されるターゲッティングベクターを用いた内在遺伝子の相同遺伝子組換えによる改変も可能である。
【０１３７】
本発明の方法が対象とし得る疾患、障害、状態は、臓器または組織の再生が所望される任意の疾患、障害、状態を含む。本発明は特に、フィーダー細胞がなければ再生し得ない幹細胞などを必要とする臓器、組織または細胞に関連する疾患、障害、状態が対象として特に有利である。
【０１３８】
そのような本発明が対象とし得る疾患および障害としては、循環器系（血液細胞など）の疾患または障害；神経系の疾患または障害；免疫系の疾患または障害；運動器・骨格系の疾患または障害；皮膚系の疾患または障害；内分泌系の疾患または障害；呼吸器系の疾患または障害；消化器系の疾患または障害；泌尿器系の疾患または障害；生殖器系の疾患または障害などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３９】
本発明が対象とする動物は、幹細胞を有する動物であれば、どのような動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、カニクイサル、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒトが対象である。
【０１４０】
本発明が医薬として使用される場合、そのような医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１４１】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１４２】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４３】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。
【０１４４】
必要に応じて本発明の医薬は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１４５】
本発明の処置方法において使用される医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
【０１４６】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１４７】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査の結果または上記疾患（例えば、神経疾患、心臓疾患など）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、上記疾患（例えば、神経疾患、心臓疾患など）の再発により再開することができる。
【０１４８】
本発明はまた、本発明の医薬の１つ以上の成分（例えば、ＥＳ細胞のような幹細胞）を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
【０１４９】
本発明が研究用試薬として使用される場合、本発明の幹細胞は、当局の定める倫理規定に従って分配されることが望ましい。そのような規定としては、例えば、日本政府が定めるものが挙げられるがそれに限定されない。以下にその規定の例を記載する。
【０１５０】
樹立機関の業務および義務として政府指針などに定められているもの従い、ヒトES細胞の樹立および使用に関する指針に従って承認された研究計画をもつ使用機関からの要請を受けて、樹立後特性解析を行った細胞株を分配する。分配の開始の時期としては、多分化能と正常核型の検定と確認を行った細胞株を増殖させて、細胞株保存のために必要な数の凍結細胞サンプルが得られた時点から分配を始めることが企図される。
【０１５１】
樹立と分配を開始する時点では、分配機関が分配に責任を持って担当する。分配機関には細胞培養に必要なクリーンルームと機器および細胞凍結保存用液体窒素タンクが整備されるべきである。ヒトES細胞株の樹立チームが使用し、その人員構成は、例えば、研究者５名（内２名は医師免許保持者が好ましい）からなる。細胞の分配を開始する時点では、さらに実験補佐員２名程度と事務補佐員１名程度が実務を分担してもよい。細胞分配および研修の要請の増加に応じて、あらたに人員および施設を増加させることが好ましい。
【０１５２】
分配の方法および条件は例えば以下のようなものを挙げることができる：ES細胞株の維持および増殖の継続に必要な樹立機関における細胞ストックの確保が優先されるべきである。
【０１５３】
幹細胞の提供者がヒトである場合、通常インフォームド・コンセントを得る必要がある。
【０１５４】
ヒト受精胚の提供候補者については、ＥＳ細胞研究に凍結胚を提供依頼にあたってのインフォームド・コンセントによる同意が与えられるかどうかを、次のような手順に従って確認する。不妊治療の開始から凍結胚の廃棄決定に至る手続き、および関連文書、その後に始まるＥＳ細胞研究への提供に関するプロセスの例示的概要を示す。
【０１５５】
（１） 不妊治療の結果作られて凍結保存されているヒト受精胚が、子宮へ移植されることなく廃棄させることが決定するまでは、ＥＳ細胞研究とは全く無関係な不妊治療プロセスとして患者と不妊治療担当医師による臨床的問題である。
【０１５６】
（２） 廃棄させることが決定した凍結胚について、不妊治療担当医師が中立的立場を保ちながら、ＥＳ細胞の研究について説明を受けるかどうか提供候補者に質問する。
【０１５７】
（３） 説明を受けたいとの意思を示した提供候補者に対して、樹立機関の説明者（樹立責任者以外）がＥＳ細胞とはなにか、将来の医療への応用の可能性、研究内容の概要、ＥＳ細胞株樹立によって提供者は利益も不利益も受けないこと、提供者のプライバシーは保護されること、などについて十分に説明する。これらの説明は、全く中立の立場で行われる。
【０１５８】
（４） 提供候補者は説明を受けた後に、提供医療機関の長に対して提供に同意するかどうかを回答する。同意はインフォームド・コンセントの書類への署名を必要とし、その書類は提供医療機関が厳重に保管する。特定の提供候補者による同意あるいは不同意に関する結果は樹立関係者には伝えない。
【０１５９】
（５） 提供候補者による同意の署名から一ヶ月間以上の猶予期間をおいて、提供候補者の意思に変更がない場合は、凍結胚を樹立機関に移送する。その際、複数の提供者からの凍結胚を同時に引渡すとともに、凍結胚容器からは提供者を同定できるラベルなどを完全に除去しておく。従って、樹立機関の説明担当者が複数の提供候補者と面会はするが、その氏名などの個人情報は知ることがなく、またそれらの候補のうち誰が同意して提供者となったかも知ることがないので、提供者の匿名性は保証され得る。さらに、複数の提供者からの凍結胚を使ってその一部のみから細胞株が樹立されるので、どの提供者の胚から実際にＥＳ細胞株が樹立されたかは樹立機関と提供医療機関の両者ともに知ることができないようにする。
【０１６０】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６１】
（トランスジェニック生物）
本発明の幹細胞は、トランスジェニックマウスを作製するのに使用することができる。トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、国際公開ＷＯ０ｌ／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９ｌ号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａ１．）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示しており、これらの説明内容を本明細書において援用する。。
【０１６２】
このほかにもまた、トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１６３】
そのような中、最近１０年間ほどで、遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の解析が重要な手段となってきている。
【０１６４】
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
【０１６５】
このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
【０１６６】
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
【０１６７】
多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。
【０１６８】
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモータを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，ＥＳ細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＷＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：７５６−７６８（２００１））。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。
【０１６９】
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。
【０１７０】
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。
【０１７１】
本発明は、このように、種々のトランスジェニック生物の作製に利用することができる。
【０１７２】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed. (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Pub. AssociatES and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience;Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press;Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates;Sninsky, J. J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for FunctionalGenomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１７３】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A PracticalApproach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１７４】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１７５】
（フィーダー細胞調製物）
１つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物を提供する。このような複数の性質を有するフィーダー細胞の混合物をフィーダー細胞調製物として利用した例はこれまでなく、また、従来は、フィーダー細胞として使用可能な細胞種はいくつか知られていたが、それらの間に本質的な差違の存在は想定されておらず、従って細胞を組み合わせることによってフィーダー細胞機能が著しく向上することは予想されていなかった。本発明にあるような細胞の組み合わせにより幹細胞株の樹立 維持の効率が非常に向上する機作についてはフィーダー細胞の機能が分子レベルで解明されていないため明らかでないが、上に挙げたような因子の供給が単独の細胞の使用では完全に行われない為では無いかと思われる。よってフィーダー細胞を複数種組み合わせることにより予想外の効果が得られたと考えられる。従って、ある局面では、本発明は、任意の複数のフィーダー細胞の混合物を用いることができることが理解される。本明細書において使用されるフィーダー細胞は、従来フィーダー細胞として使用される細胞であれば、どのような細胞であっても使用され得ることが理解される。
【０１７６】
本明細書において使用される正常細胞は、フィーダー細胞として適切に使用されている細胞であれば、使用され得ることが理解される。そのような正常細胞としては、例えば、マウス初代培養繊維芽細胞、ラット初代培養繊維芽細胞、サル初代培養繊維芽細胞、ヒト初代培養繊維芽細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１７７】
そのような初代培養繊維芽細胞の調製方法としては、例えば、１１−１６日令胎児から、頭部、内臓等を取り除いたものを細断、酵素処理で主として繊維芽細胞を取り出すという方法を用いて行うことができる。
【０１７８】
具体的には、
１．受精後１２日目（１１〜１６日目が好ましい。）のマウスを準備する。
２．胎児を摘出し胎仔を傷つけないように羊膜・胎盤を取り除き、新しいペトリディッシュへ移す。
３．実体顕微鏡下で胎仔の頭部および腹部の肝臓、腸などの内臓をできるだけピンセットで取り除く。ＰＢＳ（−）で胎仔についた余分な臓器を洗い流し、新しいペトリディッシュへ移す。
４．クリーンベンチ内で１００ ｍｍ細胞培養ディッシュに培地を１０ ｍｌずつ分注する。２１Ｇ針とシリンジを準備する。シリンジの中に胎仔を１つ入れ、ディッシュ中の培地をゆっくりと吸い上げ、そのまま同じディッシュ中へゆっくりと培地をもどす。この操作を２〜３回繰り返す。
５．胎仔が細片になっていることを確認する。
６．３７℃、ＣＯ２インキュベータで一晩培養する。
という方法によって、繊維芽細胞を調製することができる。
【０１７９】
好ましくは、上記正常細胞は不死化していないことが有利である。理論に束縛されることは望まないが、不死化していないことによって、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８０】
本発明において使用される正常細胞は、繊維芽細胞であってもよいが、そうでなくてもよい。好ましくは、繊維芽細胞が使用される。理論に束縛されることを望まないが、繊維芽細胞は、フィーダー細胞としての適性を付与することが多く、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８１】
より好ましい実施形態では、本発明において用いられる正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である。より好ましくは、本発明において用いられる正常細胞は、マウス由来である。理論に束縛されることを望まないが、マウスであることが好ましい理由は、調製の容易さにある。従って、任意の哺乳動物が使用され、簡易な調製法が別の存在する場合は、他の哺乳動物の細胞を用いることによって好ましく使用され得る。理論に束縛されることは望まないが、経験的には、ウシおよびウサギのＥＳ樹立研究で同種の繊維芽細胞を使用しても、マウスより良い効果は見られないようであり、一般的にはマウスの細胞が良いと考えられている。
【０１８２】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる正常細胞は、胎児（胎仔）由来であり得る。理論に束縛されることを望まないが、胎児由来の細胞は、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部を提供し、フィーダー細胞としてより適切であると考えられるからである。また、本発明において使用される細胞株とは、細胞学的にみて、最も異なる性質を有すると考えられ、従って、細胞株が提供できない幹細胞の維持に必要な因子を供給する能力を有すると考えられるからである。
【０１８３】
従って、本発明では、フィーダー細胞としての能力を提供することができる限り、どのような継代数の細胞でも用いることができるが、好ましくは、初代培養細胞については継代数の少ないもの（４，５回程度）が推奨され、継代数が５回以下、４回以下、３回以下、２回以下、１回または継代なしの細胞が用いられる。
【０１８４】
ある好ましい実施形態では、本発明において使用される正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である。
【０１８５】
本明細書において使用される細胞株は、フィーダー細胞としての能力を有する限り、どのような細胞であっても使用することができることが理解される。そのような細胞株は、代表的には、不死化している。理論に束縛されることを望まないが、不死化した細胞を用いることによって、初代細胞株などの正常細胞では供給されないが、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の他の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８６】
好ましくは、本発明において使用される細胞株は、繊維芽細胞株である。
【０１８７】
本発明において使用される細胞株は、継代期間は、どのような期間であっても良いが、好ましくは、継代された期間が２ヶ月以下であり、より好ましくは、継代された期間が１ヶ月以下である細胞を用いることが有利であり得る。理論に束縛されることを望まないが、そのような継代期間が短い細胞株を用いることによって、初期の目的の因子を分泌する細胞を安定して供給することができ、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の他の一部が十分に供給されると考えられるからであるが、必ずしも継代期間が短くある必要はない。
【０１８８】
本発明において使用される細胞株は、マウス由来であり得るが、それに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、マウスであることが好ましい理由は、調製の容易さにある。従って、任意の哺乳動物が使用され、簡易な調製法が別の存在する場合は、他の哺乳動物の細胞を用いることによって好ましく使用され得る。理論に束縛されることは望まないが、経験的には、ウシおよびウサギのＥＳ樹立研究で同種の繊維芽細胞株を使用しても、マウスより良い効果は見られないようであり、一般的にはマウスの細胞が良いと考えられている。
【０１８９】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる細胞株は、胎児（胎仔）由来であり得る。理論に束縛されることを望まないが、胎児由来の細胞は、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部を提供し、フィーダー細胞としてより適切であると考えられるからである。また、本発明において使用される正常細胞とは、細胞学的にみて、最も異なる性質を有すると考えられ、従って、正常細胞が提供できない幹細胞の維持に必要な因子を供給する能力を有すると考えられるからである。
【０１９０】
好ましい実施形態では、使用される細胞株は、ＳＴＯ株である。この細胞株はネオマイシン耐性（ｎｅｏ抵抗性）の性質を持っていることが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞株は、ＳＬ１０株である。
【０１９１】
本発明のフィーダー細胞調製物において含まれる正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）とは、代表的に、約１：１０〜１０：１で存在し得る。理論に束縛されることを望まないが、１：１０〜１０：１の範囲外では、フィーダー細胞を複数種使用する効果がほとんど見られないが、１：１０〜１０：１の範囲内では、幹細胞の維持において効果が有意に見られているからである。
【０１９２】
好ましい実施形態では、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率は、約１：４〜４：１であり得る。理論に束縛されることを望まないが、複数種の細胞を含むフィーダー細胞調製物を利用することによって、幹細胞の維持および多分化能の維持の効果が顕著に改善されるからである。より好ましい細胞比率は、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率が約１：３〜約３：１であり得る。
【０１９３】
最も好ましい実施形態では、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率は、ほぼ等量である。理論に束縛されることを望まないが、ほぼ等量の複数種の細胞を用いることによって、相互に補完すべき幹細胞を維持するための成分が互いに十分含まれることになるからである。従って、当業者は、本明細書においてほぼ等量というとき、等量に近いがフィーダー細胞として最適な任意の比率を意味することを理解する。
【０１９４】
１つの実施形態では、本発明のフィーダー細胞調製物が目的とする細胞は、胚性幹細胞であり、より好ましくは、ヒト胚性幹細胞である。ヒト胚性幹細胞のような細胞が多能性を維持しながら増殖させることができ、しかも５０％未満の分化細胞混入率（好ましくは、３０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは１％未満）は、これまでの技術では達成できなかった格別の効果であるといえる。
【０１９５】
（幹細胞調製法）
１つの局面において、本発明は、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、幹細胞を調製するための方法を提供する。正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）および細胞株（例えば、繊維芽細胞株）は、おのおの正常細胞（例えば、初代培養細胞）であり、株化したものである限り、任意のものを使用することができる。フィーダー細胞としては、これらの２種の細胞を含んでいる限りどのような含まれ方であっても使用することができるが、好ましくは、均一に混合していることが有利である。そのような混合比率としては、好ましくは、約１０：１〜１：１０、約９：１〜１：９、約８：１〜１：８、約７：１〜１：７、約６：１〜１：６、約５：１〜１：５、約４：１〜１：４、約３：１〜１：３、約２：１〜１：２、約１：１（ほぼ等量を意味する）などが挙げられる。好ましくは、ほぼ等量混合されることが有利である。理論に束縛されないが、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とは、相互に相乗的な効果を有する因子（例えば、幹細胞維持に必要なもの）を相補的に分泌することによって、本発明の予想外の効果を達成しているものと考えられる。
【０１９６】
１つの実施形態において、本発明のフィーダー細胞において用いられる正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）は、マウス由来であることが有利であるがそれに限定されない。従って、本発明では、任意の動物を用いることができる。マウスは、技術的に充分に確立した実験動物であり、初代培養細胞などの正常細胞の入手方法もまた、当業者によく知られるところとなっているからである。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本発明において使用される正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）は、胎児由来であることが有利であるがそれに限定されない。従来、例えば、繊維芽細胞初代培養細胞は、フィーダー細胞として用いられているが、胎児由来のものが主に用いられている。胎児由来の繊維芽細胞初代培養細胞を単独で用いた場合でも、幹細胞の樹立効率は、それほど高いものではなく、せいぜい１０−３０％程度であった。翻って、本発明のフィーダー細胞調製物および細胞混合物では、その樹立効率は、５０％をはるかに超え、８０％程度の場合もある。従って、このような高率の樹立高率は、従来技術からは想像を超えるものであったといえる。ここで、正常細胞は、厳密な意味での初代培養細胞であることが好ましいが、継代培養した細胞であっても、継代数が少ないものであれば、初代培養細胞とほぼ類似する性質を有し得ることから、本発明において有利に使用することができる。そのような継代数としては、例えば、約５継代以下、４継代以下、３継代以下、２継代以下、１継代などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９８】
１つの好ましい実施形態において、本発明のフィーダー細胞に含まれる細胞株（例えば、繊維芽細胞株）は、ＳＴＯ株であることが有利である。従来ＳＴＯ株は、幹細胞のフィーダー細胞として用いられているが、幹細胞の樹立効率は、やはり３０％以下と低率にとどまっており、本発明の細胞混合物および細胞調製物をフィーダー細胞調製物として使用した場合では、幹細胞の樹立効率は、５０％をはるかに超え、８０％程度の場合もある。従って、このような高率の樹立高率は、従来技術からは想像を超えるものであったといえる。
【０１９９】
より好ましい実施形態では、ＳＴＯ細胞からのＥＳ細胞未分化状態支持能の高い細胞の分離法を用いてより好ましい細胞株を樹立することができる。そのような方法を簡単に説明すると、以下のようになる。
【０２００】
１．定法に従いＳＴＯ細胞を細胞一つ一つになるまで解離する。
【０２０１】
２．培養皿に１００−５００個程度の解離したＳＴＯ細胞を播種する。
【０２０２】
３．数日間培養すると播種した細胞一つ一つの細胞それぞれからコロニーが形成されるので十分な大きさのコロニーが形成されるまで培養を続ける。
【０２０３】
４．それぞれのコロニーから細胞を回収し、別々に培養して十分な量にまで増殖させ１００クローン程度のサブラインを確立する。
【０２０４】
５．それぞれのサブクローンの細胞を用いてフィーダー細胞とし、それを用いてＥＳ細胞の培養を行い、未分化状態の支持能の高いサブラインを選別する。
【０２０５】
ひとつの好ましい実施形態では、本発明において使用されるＳＴＯ株は、ｎｅｏ抵抗性であることが有利である。理論に束縛されないが、そのようなｎｅｏ抵抗性にして細胞株を選択すると、フィーダー効果の高いものが選択されやすくなるからである。ｎｅｏ抵抗性にするには、ｎｅｏｒ遺伝子を当該分野において公知の任意の遺伝子導入手法（例えば、形質転換、トランスフェクションなど）を用いて導入することによって達成することができる。
【０２０６】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞株は、ＳＬ１０株であることが有利である。ＳＬ１０株は、上記のような方法に基づいて分離された細胞株である。ＳＬ１０株は、明治乳業から入手可能であり、京都大学再生医科学研究所において分配されるものであり、第三者は容易に入手することができるものであることが理解される。
【０２０７】
本発明が支持する幹細胞は、任意の幹細胞が含まれ、例えば、ＥＳ細胞、組織幹細胞などが挙げられるがそれに限定されない。好ましい実施形態において、本発明が支持する幹細胞は、ＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は、樹立効率の高いフィーダー細胞がなく、本発明は、ＥＳ細胞に関し従来達成可能であった上限である３０％をはるかに超える８０％もの樹立効率を達成した点で注目されるべきである。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明が支持する幹細胞は、組織幹細胞である。そのような組織幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。組織幹細胞もまた、フィーダー細胞を必要とするものが多く、従来技術では、それほど満足がいくほどに樹立効率を高く達成した技術は存在していない。従って、本発明は、組織幹細胞にも応用可能であることが理解される。
【０２０９】
より好ましい実施形態では、本発明が支持する幹細胞は、霊長類の細胞であり、より好ましくはヒト幹細胞である。ヒトを含む霊長類の細胞は、ごく最近になってＥＳ細胞が樹立したばかりであるという事情もあり、そのフィーダー細胞に関する研究はまだまだ発展途上にある。特に、満足のいく樹立効率をもたらすフィーダー細胞は、霊長類幹細胞、より好ましくはヒト幹細胞に関してはまったく存在しないといっても過言ではないということにかんがみると、本発明における樹立効率の高さは、特に霊長類幹細胞、より好ましくはヒト幹細胞において意義は高い。
【０２１０】
本発明のフィーダー細胞が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされていることが好ましいが、それに限定されず、培養効率を高めるものであれば、どのようなコーティングがされていてもよい。そのようなコーティングとしては、例えば、任意の細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチンなど）が挙げられるがそれらに限定されない。培養ディッシュは、どのような材質のものであってもよく、例えば、容器の材質は、生体適合性のものが使用されることが望ましいが、生体に毒性を与えるものが使用されていない限り、どのようなものであっても使用することができることが理解される。そのような容器の材質としては、例えば、ガラス、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料、あるいは、シラン、ポリＬリジンコートなどでコーティングされたものが使用され得る。
【０２１１】
１つの好ましい実施形態において、本発明のフィーダー細胞は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種され、好ましくは、２〜５×１０５細胞／ｃｍ２で播種される。理論に束縛されないが、このような適度な細胞密度によって、分泌される細胞生理活性物質が最適な状態になるからであると考えられる。
【０２１２】
本発明の方法において、本発明のフィーダー細胞は、通常、混合して播種された後５日以内に使用され、好ましくは、３日以内、より好ましくは２日以内、さらに好ましくは１日以内に使用される。ただし、混合後一定時間を置くことが好ましい。理論に束縛されないが、混合した後、一定時間（例えば、１時間）を置くことによって、幹細胞の維持に必要な成分が出てくるに十分な条件が成立するからである。
【０２１３】
１つの実施形態において、本発明において使用される幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養されることが有利である。ＫＳＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから入手可能である。ＫＳＲを用いた場合、全般に細胞の増殖が遅くなる傾向が見られるが、本発明の目的にかなう限り特に限定して用いることができる。あるいは、本発明において使用される幹細胞は、ウシ胎仔血清を含む液体培地中で樹立することが好ましい。ウシ胎仔血清に関しては、ＥＳ細胞を長期間安定に維持できるものであれば、通常問題なく樹立にも使用することができることが理解される。
【０２１４】
本発明の方法では、継代する工程がさらに包含され、この継代工程において、コラゲナーゼが使用される。コラゲナーゼの使用により、細胞回収がスムーズに行われ、樹立効率を改善するのに寄与すると考えられる。
【０２１５】
（幹細胞）
別の局面において、本発明は、本発明の幹細胞調製法によって調製された幹細胞調製物を提供する。このような幹細胞は、従来の方法で得られる幹細胞よりも、より未分化な状態を保っているとか考えられるという点で従来方法によって調製される幹細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。この細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類ＥＳ細胞であり、なおさらに好ましくは、ヒトＥＳ細胞である。このようＥＳ細胞（特に、ヒトのような霊長類）は、より発生段階の初期にある未分化な状態を保っているという点で従来方法によって調製される幹細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。従って、本発明の幹細胞調製物は、１）従来の方法で得られる幹細胞よりも，より未分化な状態を保っている；２）より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができる；３）より正常な組織に近い性質を有しているなどの有利な点を持っていることがわかる。従来の方法（例えば、非特許文献５、７など）よりも、本発明の方法ではより簡便に安定して未分化状態を維持したまま培養できており、他の方法では常に分化細胞が混入するのに比較し、本発明の方法では分化細胞はほとんど現れないことが示されている。従来の報告では、具体的な数値での報告は少ないがPeraのグループ(NBt；非特許文献７）では５０％ほどが部分的に分化した細胞集団であるとしているのに対して、本発明では、実施例においても例証されるように、５０％未満どころか、１％程度以下という数値も達成できることが示されている。このような幹細胞調製物は、従来は調製できなかったことから、調製物自体が新規であることが理解される。
【０２１６】
（再生移植物の調製）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法を提供する。この方法は、Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物の上で培養する工程；およびＣ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、を包含する。ここで、フィーダー細胞としては、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」節で詳細に説明した任意の形態を用いることができる。幹細胞は、所望の臓器、組織または細胞に分化し得るものである限り、任意のものを使用することができる。所望の臓器、組織または細胞に分化し得るかどうかは、当該分野において公知の技術を用いて確認することができる。そのような手法としては、分化条件にその幹細胞を晒し、その後一定期間培養した後、所望の分化をしているかどうかを、例えば、肉眼でみたり、顕微鏡により観察したり、あるいは、分子生物学的に観察したり、細胞表面マーカーなどを同定することによるものなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１７】
本発明の再生移植物の調製において、分化工程は、当該分野において公知の任意の技術を用いることができる。一つの好ましい実施形態において、本発明の方法における培養のために、分化因子を加えることができる。そのような分化因子としては、例えば、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。神経への分化には、ＮＧＦ、ＦＧＦという分化因子を加えることができる。血液細胞への分化には、インターロイキン、ＥＰＯという分化因子を加えることができる。
【０２１８】
本発明の再生移植物の調製が目的とする所望の臓器、組織または細胞としては、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛、皮膚などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１９】
１つの実施形態において、上述の所望の臓器、組織または細胞と前記フィーダー細胞とは、同じ種である。同じ種であることによって、免疫反応を最低限に抑えることも可能であり、適合性という点で好ましい。
【０２２０】
別の実施形態において、上述の所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、フィーダー細胞はマウス由来であることが好ましい。この組み合わせで幹細胞の樹立効率が８０％以上であるという高率を達成することができることがわかったからである。しかし、この組み合わせ以外の種の組み合わせもまた、同様に本発明において好ましくあり得ることが理解されるべきである。従って、フィーダー細胞としてヒトなどの霊長類由来のものを使用してもよいことが理解される。
【０２２１】
別の実施形態において、本発明の培養は、エキソビボ（すなわち、自己へもどすことを目的とする）で行われる。
【０２２２】
１つの実施形態において、本発明の幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものであり得る。摘出されてすぐ使用することが好ましい。樹立効率が高いからである。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明の方法における培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下であることが好ましく、分化のために加えられる分化因子としては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどを１または複数を含んでいることが好ましい。
【０２２４】
（臓器など）
別の局面において、本発明は、本発明の再生移植物の調製法によって調製される、臓器、組織または細胞を提供する。このような臓器、組織または細胞は、より正常な組織に近い性質を有しているという点で従来方法によって調製される再生臓器、組織または細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。
【０２２５】
（臓器等再生システム）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するためのシステムを提供する。このシステムは、Ａ）容器；およびＢ）該容器上に播種される、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物、を備える。ここで、このフィーダー細胞調製物は、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。容器もまた、任意の物を利用することができ、例えば、「再生移植物の調製」節において説明される任意の形態をとることができることが理解される。
【０２２６】
（細胞混合物）
本発明は、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む混合物を提供する。この混合物は、本発明において実証されるように、幹細胞のフィーダー細胞として使用することができる。正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とは、「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明されるような任意の形態をとることができることが理解される。従って、実質的には、この細胞混合物は、フィーダー細胞調製物と同一のものであり得ることが理解され得る。
【０２２７】
好ましい実施形態において、本発明の混合物中の初代培養細胞は、マウス胎児初代培養繊維芽細胞であることが有利である。この形態が有利なのは、ＳＴＯ細胞など、他の細胞から得られない因子などが供給され、従来にない効率で幹細胞を樹立することができること、より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができることなどいう効果が考えられるからである。
【０２２８】
別の好ましい実施形態において、本発明の混合物中の繊維芽細胞株は、ＳＴＯ株であることが有利である。この形態が有利なのは、マウス胎仔繊維芽細胞から供給される因子が得られることにより、従来にない効率で幹細胞を樹立することができること、より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができることなどという効果が考えられるからである。
【０２２９】
（臓器等再生方法）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための方法を提供する。この方法は、Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物上で培養する工程；およびＣ）該培養された該幹細胞を被検体の処置されるべき部位に移植する工程、を包含する。ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。幹細胞もまた、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。移植技術もまた、当該分野において公知の任意の技術を用いて投与することができる。そのような技術としては、例えば、カテーテルを用いて心筋層への幹細胞移植などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｄ）前記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する。このような分化工程は、当該分野において公知の方法を適用することができる。このような分化条件は、分化の目的となる臓器、組織または細胞によって変動し得ることが理解される。そのような変動を考慮して、当業者は、適宜、適切な分化条件を決定し、選択することができることが理解される。
【０２３１】
（混合物のフィーダー細胞としての使用）
別の局面において、本発明は、フィーダー細胞調製物としての、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む細胞混合物の使用を提供する。あるいは、フィーダー細胞としての、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用が提供される。あるいは、幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の使用が提供される。
【０２３２】
ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。フィーダー細胞は、任意の細胞を支持することができるが、好ましくは幹細胞を支持することを目的とする。ここで、幹細胞もまた、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。
【０２３３】
他の局面において、本発明は、フィーダー細胞を含む医薬を製造するための、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む細胞混合物の使用を提供する。ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。フィーダー細胞は、任意の細胞を支持することができるが、好ましくは幹細胞を支持することを目的とする。ここで、幹細胞もまた、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。医薬を製造する技術は、当該分野において公知の技術を用いることができる。医薬には、適宜薬学的に受容可能なキャリアを加えることができる。
【０２３４】
好ましくは、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている（例えば、マイトマイシンＣによる）。このことにより、フィーダー細胞調製物は、パッケージに入れて販売することが可能になる。
【０２３５】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２３６】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Sigmaから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｏ． ８６−２３， １９８５，改訂）に遵って、京都大学および日本政府が規定する基準に遵い、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、厚生労働省または等価の政府当局の基準に従い、事前に同意を得た上で実験を行う。その同意方法は、本明細書において記載されるとおりである。
【０２３７】
（実施例１：マウス胎仔繊維芽細胞の初代培養細胞（ＭＥＦ）の調製）
マウス胎仔から繊維芽細胞の初代培養細胞（ＭＥＦともいう）を調製した。具体的には、以下のとおりである。
【０２３８】
妊娠したマウス（ＩＣＲ、日本クレア）から、胎仔の部分を取り出し、細胞を分離して、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）という培地中に播種した。取り出した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で維持した。
【０２３９】
（実施例２：ＭＥＦ細胞の前処理）
次に、フィーダー細胞としての効率を上げるために、実施例１で調製したＭＥＦ細胞を前処理した。前処理には、以下のものを使用した。
【０２４０】
培養液：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ不含）
０．０５％トリプシン＋１ｍＭ ＥＤＴＡ
２ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣ水溶液
０．１％ゼラチン水溶液。
【０２４１】
前処理は以下のとおり行った。
【０２４２】
（１）コンフルエントの細胞にマイトマイシンＣを10μg/mlになるよう培地に加え、1.5〜2時間培養した。
【０２４３】
（２）マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗った。培地を加え、数時間から一晩培養した。
【０２４４】
（３）培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除いた。
【０２４５】
（４）細胞を1ｘ105/mlの濃度に懸濁させた。
【０２４６】
このようにして調製したＭＥＦ細胞を、単独でまたは他の細胞と混合してフィーダー細胞として以下に実験に用いた。
【０２４７】
（実施例３：ＳＴＯ細胞の前処理）
ＳＴＯ細胞として、ＳＴＯ細胞のサブクローンＳＬ１０細胞を使用した。ＳＬ１０細胞は、明治乳業（東京、日本）から入手した。ＳＬ１０の場合、２週間がフィーダー細胞としての利用限度であり、７〜１０日で継代を行った。培地としてはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを使用した。
【０２４８】
このＳＴＯ細胞を、フィーダー細胞として使用するために前処理した。その手順は以下のとおりである。前処理には、以下のものを使用した。
【０２４９】
培養液：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ 不含）
０．０５％トリプシン＋１ｍＭ ＥＤＴＡ
２ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣ水溶液
０．１％ゼラチン水溶液。
【０２５０】
前処理は以下のとおり行った。
【０２５１】
（１）コンフルエントの細胞にマイトマイシンＣを１０μｇ／ｍｌになるよう培地に加え、１．５〜２時間培養した。
【０２５２】
（２）マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗った。培地を加え、数時間から一晩培養した。
【０２５３】
（３）培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除いた。
【０２５４】
（４）細胞を１．５×１０５／ｍｌの濃度に懸濁した。
【０２５５】
（実施例４：別のＳＴＯ細胞の調製）
別の実施例として、ＳＴＯ細胞から好適なクローンをサブクローニングする。その手順は以下のとおりである。
【０２５６】
マウスにおいてＥＳ細胞株の樹立・継代維持に用いられるＳＴＯ細胞は株細胞であり均一な集団と考えられていたが、その中に特にＥＳ細胞株の樹立・維持に優れた性質を持つ細胞集団を含むことが示されている。
【０２５７】
同様の性質を持つＳＴＯ細胞のサブラインは以下のように単離できる。
【０２５８】
（１）定法に従いＳＴＯ細胞を細胞一つ一つになるまで解離する。
【０２５９】
（２）培養皿に１００−５００個程度の解離したＳＴＯ細胞を播種する。
【０２６０】
（３）数日間培養すると播種した細胞一つ一つの細胞それぞれからコロニーが形成されるので十分な大きさのコロニーが形成されるまで培養を続ける。
【０２６１】
（４）それぞれのコロニーから細胞を回収し、別々に培養して十分な量にまで増殖させ１００クローン程度のサブラインを確立する。
【０２６２】
（５）それぞれのサブクローンの細胞を用いてフィーダー細胞とし、それを用いてＥＳ細胞の培養を行い、未分化状態の支持能の高いサブラインを選別する。
【０２６３】
このようにしてサブクローニングした細胞株もまた、フィーダー細胞として使用できる。このようなサブクローンを実施例３に記載のように前処理した。
【０２６４】
（実施例５：フィーダー細胞の調製）
本実施例では、フィーダー細胞を調製した。本発明のフィーダー細胞として、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを単独で使用した場合と、混合した場合とを調製した。フィーダー細胞の調製は、以下に示すように同様のプロトコールに従った。
【０２６５】
（１）フィーダーを作る培養皿を予めゼラチンコートしておいた。ゼラチンコートは培養皿の表面をゼラチン溶液で覆い３７℃で１時間以上インキュベートして行った。
【０２６６】
（２）前処理したＳＴＯ細胞、前処理したＭＥＦ細胞を単独でまたは懸濁液を１：１に混合して用いた。
【０２６７】
（３）ゼラチンコートした培養皿からゼラチン溶液を除き、細胞サンプルを加えた。３５ｍｍの培養皿に２ｍｌの細胞懸濁液を加えると培養皿の表面をフィーダー細胞が隙間なく覆った。細胞密度はおよそ２．５×１０４／ｃｍ２になった。
【０２６８】
調製したフィーダー細胞は４日以内に使用した。
【０２６９】
（実施例６：幹細胞の樹立）
次に、実施例５で調製したフィーダー細胞を用いて幹細胞を樹立した。使用した培養液は以下のとおりである。
【０２７０】
（ＥＳ細胞用培養液）
【０２７１】
（細胞解離液）
０．２５％ トリプシン（ＰＢＳ）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
２０％ＫＳＲ。
【０２７２】
（ディッシュ）
フィーダーをつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。０．１％ゼラチン溶液（ｓｗｉｎｅ ｓｋｉｎ、Ｔｙｐｅ Ａ：Ｓｉｇｍａ 社製）で覆い、３７℃で１ 時間以上インキュベートする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経てばフィーダー細胞として使用可能である。
【０２７３】
フィーダー細胞を用いたＥＳ細胞の樹立は、以下のように行った。
【０２７４】
１．フィーダー細胞の培養液をＥＳ細胞用の培養液に交換した。
【０２７５】
２．免疫手術法もしくは機械的操作により胚盤胞から内部細胞塊を分離した。免疫手術法は、簡単に述べると、以下のとおりである。
【０２７６】
酵素処理などにより透明帯を取り除き、マウス表面抗原に反応する抗体溶液内でインキュベートした。次に補体溶液内でインキュベートすることによって最外層の細胞である栄養外胚葉が取り除かれ、内部細胞塊が分離された。
【０２７７】
ヒトＥＳ細胞の場合は、ヒトの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行った。カニクイサル（（株）ケアリーから入手）の場合は、サルの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行った。
【０２７８】
３．分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養した。
【０２７９】
４．翌日内部細胞塊がフィーダー細胞に接着していることを確認して、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
【０２８０】
５．５〜１０日後に内部細胞塊から増殖してくるＥＳ細胞様の細胞が認められるようになった。細胞塊が１００から２００μｍになったら継代を行った。
【０２８１】
６．培養液をのぞき細胞解離液を入れた。
【０２８２】
７．５から１０分間処理するとＥＳ細胞様細胞が培養皿よりはがれてくるので、これを細く引いたガラス管で拾い上げ数回出し入れすることで細胞塊を数個に分けた。
【０２８３】
８．培養液中で細胞解離液を洗浄して除き、新しいフィーダー上に細胞塊を移した。
【０２８４】
９．翌日、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
【０２８５】
１０．フィーダー上で個々の細胞塊が１００−２００μｍ程度に増殖したら、同様の操作で継代を行った。
【０２８６】
１１．細胞が十分増殖するようになれば（３５mm培養皿１枚に増えるぐらい）サルＥＳ細胞の通常の継代操作と同様に継代ができるようになった。この段階に達すれば以後安定した培養が可能であることが確認される。
【０２８７】
この実施例で樹立された細胞を図１および２に示す（図１はサル、図２はヒトを示す）。
【０２８８】
本実施例では、基本培地にDMEM/F12を使用したが、DMEMまたは他の基本培地でも問題なく使用できることが示される。
【０２８９】
本実施例では、補填成分としてＫＳＲを使用したが、ＫＳＲのかわりに通常使用されているウシ胎仔血清でもよいようである。ただし、ＫＳＲのほうがウシ胎仔血清よりも良い結果が出るようであった。
【０２９０】
さらに必要に応じて１〜２mg/ml のコラゲナーゼを添加した。コラゲナーゼの添加により、若干樹立しやすくなるようである。
【０２９１】
（実施例７：マーカーによる染色）
次に、実施例６で樹立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。胚性幹細胞を、４％ ＰＦＡで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．， １９８５．Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ．１−１３．）に従い免疫染色を行った。ブロッキングは０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ／ＰＢＳ／２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを用い室温で一時間、洗いは０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳを用い室温で５分を４回行った。一次抗体はSSEA-4、TRA-1-60のモノクローナル抗体をそれぞれ２００ μｇ／ｍｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を１／１００希釈したものを、二次抗体はＦＩＴＣ標識ｇｏａｔ 抗−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ）を１／２００希釈したものを使用した。二次抗体の反応後はｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）の順に染色を行いシグナルを検出した。
【０２９２】
ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の組織化学的染色は、以下のように行った。培養ディッシュをダルベッコのＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、４℃の９５％冷エタノールで３０分以上固定し、次いで４ ℃の無水エタノールで３０分以脱水した。固定液を除き、ディッシュを室温で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０〜９．５）にて５ 分間３ 回洗浄した後、１．５〜２ｍｌの染色液（ナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ−２１２５）２．５ｍｇ と、ファースト赤ＴＲ塩（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｇ［またはファースト紫Ｂ 塩６ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）、ファースト青ＢＢ塩１２．５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）］とを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液２５ｍｌに加え、遮光下で３ 〜５ 分間撹拌して溶解し、次いで濾過する）を各ディッシュに加え、遮光下で室温にてＡＬＰ を１５〜３０分間染色した。ＰＢＳ（−）で２ 回洗浄した後グリセロールを加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まったＥＧ細胞コロニーを検鏡した。
【０２９３】
結果を図３に示す。図３は、左からALP、SSEA-4、TRA-1-60を示す。
【０２９４】
図３からも明らかなように、本発明のフィーダー細胞を用いて樹立した幹細胞は通常どおり多分化能を保持していることが確認された。
【０２９５】
（実施例８：複数の細胞での再現性）
実施例６および７で行った実験を、カニクイザルES細胞、ヒトES細胞について行い、MEFフィーダー単独、STO株フィーダー単独、および混合フィーダー単独で試験した。
【０２９６】
その結果を以下の表に表す。
【０２９７】
この表からも明らかなように、それぞれのフィーダー細胞を単独で用いた場合は、２５％以下の幹細胞樹立効率しか達成できなかったのに対して、混合フィーダー細胞では、８０％以上で、場合によっては１００％の幹細胞樹立効率を達成することができるという優れた効果が実証された。ヒトＥＳ細胞は、ＭＥＦ単独でもＳＴＯ単独でも従来ほとんど樹立することができなかったことから、本発明の効率は驚くべきものと考えられる。
【０２９８】
（実施例９：神経細胞への分化）
本発明の上記実施例において調製した上記ＥＳ細胞を、３回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除いた。ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）を含むＥＳ細胞培地を用いて、ＰＡ６フィーダー細胞上で未分化細胞を８−１１日間培養した（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｎ ２８； ３１−４０、Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２７； ５０４−５１０．参照）。これにより、神経細胞に分化させた。
【０２９９】
その結果を図４に示す。
【０３００】
図４の結果からも明らかなように、本発明の方法で樹立したＥＳ細胞は、神経への分化能を保持していたことが明らかになった。
【０３０１】
（実施例１０：テラトーマ形成）
次に、本発明のＥＳ細胞のテラトーマ形成能を確認した。ＳＣＩＤマウス（日本クレア、東京）の皮下および腹腔内に本発明のＥＳ細胞を約１０７個移植し、１〜３ヶ月様子を見た。
【０３０２】
１〜３ヵ月後に得られるテラトーマを回収し、組織学的解析を行った。その一例を図５に示す。図５から明らかなように、本発明のＥＳ細胞は、外胚葉、内胚葉、中胚葉などに由来する種々の組織が観察された。したがって、本発明で樹立されたＥＳ細胞は、多分化能を保持していることが実証された。
【０３０３】
（実施例１１：造血系細胞への分化）
次に、本発明のＥＳ細胞の造血系細胞への分化を観察する。分化誘導培養液として、αＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｔ＃１１９００−０１６）に１０％ウシ胎仔血清を加え、５×１０−５Ｍ メルカプトエタノールを加えた培養液を使用した。
【０３０４】
まず、ＥＳ細胞は、中胚葉細胞へと分化させた。未分化ＥＳ細胞を、上述の分化誘導培養液で懸濁し、ＩＶ型コラーゲンコート６プレートに１×１０４／ウェルの密度で播種する。これを３７℃、５％ ＣＯ２で４日間培養する。
【０３０５】
培養上清を回収し、ウェルをＰＢＳ（−）で一回洗う。次に細胞剥離液（Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，＃１３１５０−０１６）を入れて１０分間静置（３７℃、５％ＣＯ２）し、細胞を剥離して回収する。細胞塊をほぐし、ほぐれないものはメッシュで除き、細胞数を計数する。１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【０３０６】
次に、１０ｍｌのＨＢＳＳ／ＢＳＡで細胞を懸濁し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除いた。１×１０７細胞あたり０．１ｍｌの正常マウス血清に懸濁し、１０分間静置した。適切な量のＥ−カドヘリン抗体および抗ＦＬＫ１抗体を加え２０分間氷水上に配置した。ＨＢＳＳ／ＢＳＡで２回細胞を洗浄した後、ＦＬＫ１＋Ｅ−カドヘリン−中胚葉細胞をＦＡＣＳによりソートする。
【０３０７】
ここで選択した中胚葉細胞を、分化誘導用培養液で懸濁し、ＩＶ型コラーゲンコートプレートに３×１０５の密度で播種する。培養液は１ウェルあたり３ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養する。
【０３０８】
細胞の回収およびブロッキングを行う。回収およびブロッキングは、上述のように行う。適切な量のＶＥ−カドヘリン抗体を加え、２０分間氷温に静置する。細胞をＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した後、ＶＥ−カドヘリン＋血管内皮細胞をＦＡＣＳによりソートして血管内皮細胞を調製する。
【０３０９】
このようにして、本発明のＥＳ細胞が造血系細胞へも分化することが実証される。
【０３１０】
（実施例１２：心筋への分化誘導）
上述の実施例で調製されるＥＳ細胞を、ＫＳＲを含む基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）中で浮遊培養することによって胚様体を形成させる。胚様体形成後、４〜７日経過後に胚様体を集めゼラチンコート下培養皿に播種する。ＫＳＲを含む基本培地中で１〜３週間培養することによって心筋細胞が分化する。
【０３１１】
（実施例１３：他の幹細胞（例えば組織幹細胞）での実験）
組織幹細胞（神経幹細胞、間葉系幹細胞など）を含む組織を取り出し、混合フィーダー細胞上で培養する。増殖する幹細胞の集団を分離し、本発明上記実施例５のように調製されるフィーダー細胞を用いて培養することによって安定して継代維持することができる細胞株が樹立される。
【０３１２】
（実施例１４：サルでの再生治療）
次に、カニクイサルから、ＥＳ細胞を採取し、実施例９と同様の処置を行い、神経細胞に分化させる。この神経細胞の移植物を神経疾患を有するカニクイサル被検体に移植すると、移植物が機能できることがわかる。
【０３１３】
（実施例１５：ヒトでの再生治療）
次に、ヒトから、実施例６に記載されるように、同意を得た患者からＥＳ細胞を採取し、実施例１４に記載するように実施例９と同様の手順に基づいて処理する。この神経細胞の移植物を、神経疾患を有するヒト被検体に予め同意を得た後に移植すると、移植物が機能できることがわかる。
【０３１４】
（実施例１６：フィーダー効果の検討）
次に、実施例１で調製した初代培養細胞と、実施例３〜４で調製した細胞株とを適宜混合して、フィーダー細胞調製物を調製し、フィーダー効果に差異が現れるかどうか検証する。
【０３１５】
使用する比率を以下に示す。
【０３１６】
上記条件のうち、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３１７】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３１８】
（実施例１７：他の幹細胞での検討）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてカニクイサルを用いて行う。
【０３１９】
プロトコールは、実施例１６に準じる。
【０３２０】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２１】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３２２】
（実施例１８：ヒト細胞での検証）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてヒトの細胞を用いて行う。
【０３２３】
プロトコールは、実施例１６に準じる。ただし、ヒトのＥＳ細胞は、上記のように、提供者の同意の下で行う。
【０３２４】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２５】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３２６】
（実施例１９：他のフィーダー細胞での検証）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてヒトの細胞を用いて行い、フィーダー細胞として、初代培養細胞として、マウス繊維芽初代培養細胞およびヒト表皮繊維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ＵＳＡ；Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＵＳＡ）を用い、細胞株として、ＳＬ１０およびＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ｎｕｍｂｅｒ ＣＣＬ−１７１）を用いて行う。
【０３２７】
プロトコールは、実施例１６に準じる。ただし、ヒトのＥＳ細胞は、上記のように、提供者の同意の下で行う。
【０３２８】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２９】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３３０】
従って、フィーダー細胞として使用される他の正常細胞および他の細胞株を用いても、同様に混合した場合のフィーダー効果が顕著に増強されることが認められる。
【０３３１】
（実施例２０：フィーダー細胞調製物のパッケージング）
実施例５などで調製したフィーダー細胞調製物が販売可能なルートでも活性を保持することができるかどうかを以下に確認する。
【０３３２】
フィーダー細胞として使用する調製物にマイトマイシンＣ処理を行う。マイトマイシンＣは、Ｓｉｇｍａから入手可能である。マイトマイシンＣ処理をすることによって、フィーダー細胞が増殖しなくなり、長時間の保存が可能で、販売することが可能となる。このようなマイトマイシンＣ処理した細胞は、凍結保存して販売することができる。このような凍結保存は、従来の初代培養細胞で行われている方法と同じものを利用でき、例えば、そのような方法は、「ＥＳ細胞の遺伝子操作」分子生物学プロトコール（南江堂）ｐ４７１−４７９に記載されている（このほかに、非特許文献１を参照。）。
【０３３３】
具体的には以下のように処理することが可能である。
【０３３４】
本実施例において調製されるフィーダー細胞の販売時のパッケージは、例えば、凍結チューブの形態で提供する。その処理は以下の通りである。
【０３３５】
マイトマイシンＣ処理までは通常の調製時（実施例２および３を参照）と同様で、その後、以下の操作を行う。
【０３３６】
マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗い、培地を加え、数時間から一晩培養する。
【０３３７】
培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除く。
【０３３８】
細胞を細胞凍結培地（９０％ＦＣＳ＋１０％ＤＭＳＯ）にたとえば５×１０６／ｍｌに懸濁する。
【０３３９】
細胞懸濁液をクライオチューブ（ＮＵＮＣ ３７７２２４）に１ｍｌいれ、しっかりとふたをする。
【０３４０】
凍結チューブを細胞凍結用容器（Ｎｕｌｇｅｎｅ ５１００）へ入れ、容器を−８０℃フリーザーへ入れる。
【０３４１】
４時間から一晩したら、凍結チューブを液体窒素容器に移す。
【０３４２】
このように調製した販売用フィーダー細胞調製物は、好ましくは凍結状態で、販売先で提供される。提供先では、通常の凍結細胞と同様に解凍作業を行い、フィーダー細胞として使用することができる。
【０３４３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３４４】
本発明は、再生医療において、多大な有用性を有する。好ましい実施形態では特に、従来達成不可能であった高い樹立効率で幹細胞（特に、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞）を樹立することができたことから、その有用性は高い。したがって、本発明は、再生医療およびその治療用医薬などを製造する業において利用可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の分野にある。より詳細には、本発明は、幹細胞（特に、霊長類の胚性幹細胞（本明細書において以下ＥＳ細胞ともいう））の簡易な調製および保存のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療による疾患治療が最近注目を浴びている。再生医療は、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用などに代わる治療法としての役割が期待されている。しかし、これを臓器または組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。
【０００３】
再生医療の中心にある幹細胞、特にＥＳ細胞は、その医療応用面での可能性から近年その重要性を増している（非特許文献１）。ヒトＥＳ細胞はその中でも特に重要であるがその樹立または安定した継代維持が難しく効率的な利用を阻害している。ヒトを含めた霊長類ＥＳ細胞は、その樹立必要とされる胚盤胞の供給がきわめて少なく、少数の胚盤胞から効率よくＥＳ細胞株の樹立を行う必要がある。従来の方法では胚盤胞からの樹立の効率は多くてもせいぜい１０から３０％程度であるといわれている。
【０００４】
トランスジェニック動物の作出が、ＥＳ細胞を使用することで可能となっている。ＥＳ細胞とは、通常胚盤胞と呼ばれる発生段階の胚に存在する将来動物個体となる未分化な細胞群である内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ＩＣＭ）の細胞を培養することによって得られた細胞株である。ＥＳ細胞は１９８１年にＭ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ とＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（非特許文献２）に続いて、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ（非特許文献３）によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。
【０００５】
ＥＳ細胞が、霊長類で樹立され、その応用に対する期待がますます高まる中、これらの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。
【０００６】
非特許文献４は、ヒトの皮膚の繊維芽細胞をフィーダーに利用する論文で樹立は１つの内部細胞塊から１株樹立しているが、その効率はまったく低いものである。非特許文献５は、ヒトＥＳ細胞の最初の論文であるが、その樹立効率は、５株／１４内部細胞塊である。非特許文献６ではＳＴＯ細胞を用いてヒトＥＳ細胞の樹立を行っているが、その樹立効率は、３株／１４内部細胞塊と、まったく低いものにとどまっているのが現状である。このように、樹立効率において、５０％はおろか、３０％を達成するのも覚束ないというのが現状の技術水準であるといえる。
【０００７】
本発明者らは、特許文献１において、培地の最適条件を検討した。しかし、培地を最適化するだけでは、樹立効率を上げるには限界があり、樹立されたＥＳ細胞には分化細胞が有意に存在する。
【０００８】
他のグループもまた、幹細胞の維持のための方法を開発している（例えば、特許文献２、非特許文献５および７）。しかし、これらの方法では、フィーダー細胞は単種類使用されるのみであり、常に分化細胞が混入する。特に、非特許文献７では、５０％ほどが部分的に分化した細胞集団となっている。
【０００９】
従って、より分化細胞の混入が低減し、未分化状態の維持がより亢進するために使用される技術に対する要望が強まっている。
【００１０】
（先行技術文献）
【特許文献１】特開２００３−１１６５２７号
【特許文献２】米国特許第６２００８０６号
【非特許文献１】幹細胞・クローン 研究プロトコール 中辻編、羊土社（２００１）
【非特許文献２】Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ ＆ Ｍ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ： Ｎａｔｕｒｅ， ２９２， １５４， １９８１
【非特許文献３】Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８， ７６３４， １９８１
【非特許文献４】Ｈｏｖａｔｔａ Ｏ．， ｅｔ ａｌ． ， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．７ ｐｐ． １４０４−１４０９， ２００３
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８２：１１４５−１１４７， １９９８．
【非特許文献６】Ｐａｒｋ Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ２００３ ｏｎｌｉｎｅ Ａｕｇ． ２０．
【非特許文献７】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ， Ｐｅｒａ ＭＦ， Ｆｏｎｇ ＣＹ， Ｔｒｏｕｎｓｏｎ Ａ， Ｂｏｎｇｓｏ Ａ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００ Ａｐｒ；１８（４）：３９９−４０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来技術では達成し得ない程度の効率（特に、分化細胞の混入を低減する）で幹細胞（特に、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞）を樹立することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、従来使用されている、フィーダー細胞を複数（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞、繊維芽細胞株など）を混合してフィーダー細胞として用いると、予想外に効率よく幹細胞を樹立することができることを見出したことによって上記課題を解決した。
【００１３】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１４】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物を提供する。
【００１５】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、初代培養細胞を含む。
【００１６】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、不死化していない細胞である。
【００１７】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、繊維芽細胞を含む。
【００１８】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である。
【００１９】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス由来である。
【００２０】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、胎児由来である。
【００２１】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、継代数が５回以下である。
【００２２】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である。
【００２３】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、継代数が５回以下の初代培養細胞である。
【００２４】
一つの実施形態において、上記細胞株は、不死化している。
【００２５】
一つの実施形態において、上記細胞株は、繊維芽細胞株である。
【００２６】
一つの実施形態において、上記細胞株は、継代された期間が２ヶ月以下である。
【００２７】
一つの実施形態において、上記細胞株は、継代された期間が１ヶ月以下である。
【００２８】
一つの実施形態において、上記細胞株は、マウス由来である。
【００２９】
一つの実施形態において、上記細胞株は、胎児由来である。
【００３０】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ＳＴＯ株である。
【００３１】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ｎｅｏ抵抗性である。
【００３２】
一つの実施形態において、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００３３】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、約１：１０〜１０：１である。
【００３４】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、約１：３〜３：１である。
【００３５】
一つの実施形態において、上記正常細胞と、上記細胞株とは、ほぼ等量で存在する。
【００３６】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、胚性幹細胞である。
【００３７】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
【００３８】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００３９】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、幹細胞を調製するための方法を提供する。
【００４０】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００４１】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされている。
【００４２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種される。
【００４３】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、混合して播種された後５日以内に使用される。
【００４４】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物中の上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００４５】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養される。
【００４６】
一つの実施形態において、上記方法は、さらに、継代する工程を包含し、上記継代工程において、コラゲナーゼが使用される。
【００４７】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、幹細胞調製物を提供する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、ＥＳ細胞調製物を提供する。
【００４９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、霊長類ＥＳ細胞調製物を提供する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、ヒトＥＳ細胞調製物を提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法であって：Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞の上で培養する工程；およびＣ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、を包含する、方法を提供する。
【００５２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００５３】
一つの実施形態において、前記所望の臓器、組織または細胞は、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛および皮膚からなる群より選択される。
【００５４】
一つの実施形態において、上記所望の臓器、組織または細胞と上記フィーダー細胞とは、同じ種である。
【００５５】
一つの実施形態において、上記所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、上記フィーダー細胞はマウス由来である。
【００５６】
一つの実施形態において、上記培養は、エキソビボで行われる。
【００５７】
一つの実施形態において、上記幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものである。
【００５８】
一つの実施形態において、上記培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下で行われる。
【００５９】
一つの実施形態において、上記分化は、ＤＮＡ脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、核内レセプターリガンド、細胞増殖因子、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレンおよびセレンからなる群より選択される少なくとも１つの分化因子を含む培養液において行われる。
【００６０】
他の局面において、本発明は、本発明の臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法によって調製される、臓器、組織または細胞を提供する。
【００６１】
一つの局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するためのシステムであって：Ａ）容器；およびＢ）上記容器上に播種される、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞、を備える、システムを提供する。
【００６２】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００６３】
一つの局面において、本発明は、正常細胞と細胞株との混合物を提供する。
【００６４】
一つの実施形態において、この混合物は、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む。
【００６５】
一つの実施形態において、上記初代培養細胞は、マウス胎児初代培養繊維芽細胞である。
【００６６】
一つの実施形態において、上記繊維芽細胞株は、ＳＴＯ株である。
【００６７】
一つの実施形態において、上記正常細胞は、マウス繊維芽細胞初代培養細胞であり、上記細胞株は、ＳＬ１０株である。
【００６８】
一つの局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための方法であって： Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）上記幹細胞を、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞上で培養する工程；およびＣ）上記培養された上記幹細胞を上記被検体の処置されるべき部位に移植する工程、を包含する、方法を提供する。
【００６９】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７０】
一つの実施形態において、本発明は、Ｄ）上記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する。
【００７１】
一つの局面において、本発明は、フィーダー細胞としての、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７２】
一つの局面において、本発明は、フィーダー細胞を含む医薬を製造するための、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７３】
別の局面において、本発明は、フィーダー細胞調製物としての、正常細胞と、細胞株とを含む細胞混合物の使用を提供する。
【００７４】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７５】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている。
【００７６】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている。
【００７７】
別の局面において、本発明は、幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の使用を提供する。
【００７８】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、上記フィーダー細胞調製物記載の実施形態の任意の形態を採り得る。
【００７９】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている。
【００８０】
一つの実施形態において、上記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている。
【００８１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００８２】
本発明によって、特に幹細胞を効率よく樹立する技術が提供される。特に、霊長類細胞では、本発明５０％以上（好ましくは８０％以上）という従来達成不可能であった高い効率で細胞株の樹立が可能となった。特に、本発明のフィーダー細胞を用いて調製された幹細胞調製物に含まれる分化細胞が５０％未満であり、１０％未満、あるいは約１％未満という低率も達成し得ることが明らかになった。従って、本発明は、従来達成できなかった高純度の多能性細胞の調製物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の方法により樹立したサルＥＳ細胞株の解説写真である。バーは１００μｍを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、この方法により樹立したサルＥＳ細胞株の解説写真である。バーは５０μｍを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＥＳ細胞の写真である。バーは、２７５μｍを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＥＳ細胞の写真である。バーは、７０μｍを示す。
【図３】図３は、未分化状態特異的マーカー発現である。
【図４】図４は、神経細胞への分化である。
【図５】図５は、テラトーマ形成による多分化能の証明である。
【図６】図６は、ＥＳ細胞樹立スキーム例を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００８５】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙し、必要な技術の説明を行い、本発明を説明する。
【００８６】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
本発明において使用されるフィーダー細胞として使用される細胞は、正常細胞と細胞株とが存在し、好ましくは、繊維芽細胞またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞（例えば、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞）が用いられてもよい。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。別の実施形態では、好ましくは、フィーダー細胞としては、げっ歯類細胞が用いられ、より好ましくは、マウス細胞がフィーダー細胞として用いられる。
【００８８】
本発明で用いられる幹細胞として使用される細胞は、幹細胞またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞（例えば、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞）が用いられてもよい。さらに好ましくは、幹細胞としては、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくは、幹細胞としてはヒト由来の細胞が用いられる。
【００８９】
本明細書において「対応物」とは、例えば、細胞について用いられる場合、ある種の生物中の細胞に関し、同様の性質および／または機能を有する別の種の細胞をいう。そのような同様の性質は、分泌するサイトカイン、増殖因子、発現する細胞マーカーなどによって同定することができる。
【００９０】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。
【００９１】
本明細書において「胚性幹細胞」および「ＥＳ細胞」は、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常ＥＳ細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。このＥＳ細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（ＥＳ細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。ＥＳ細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をしたＥＳ細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。ＥＳ細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、ＥＳ細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。
【００９２】
本明細書において「組織幹細胞」とは、ＥＳ細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞をいう。通常、組織幹細胞は、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞としては、好ましくはＥＳ細胞が使用され得るが組織幹細胞もまた維持の対象であり得る。
【００９３】
ＥＳ細胞株は、キメラマウス、ノックアウトマウスなどの作製において非常に重要であり、これらの技術により遺伝子機能の解析が飛躍的に進歩した。ＥＳ細胞から特定の組織を分化誘導する系の開発が進んでおり、移植医療への応用の現実味を帯びている。また、ヒトＥＳ細胞を利用した臨床応用を考えた場合、サルなどの適切なモデル動物のＥＳ細胞を利用して前臨床研究をすることは必須に近い程度に重要であると考えられ、その樹立もまた重要である。
【００９４】
ＥＳ細胞株の樹立は、フィーダー細胞を用いて行われる。通常、ＥＳ細胞は、胚盤胞から分離した内部細胞塊（ＩＣＭ）をフィーダー細胞上で培養することによって樹立される。ここで従来は、マウス胎仔繊維芽細胞あるいはそれ由来の細胞株ＳＴＯが単独で用いられてきた。しかし、これらの細胞では、樹立効率が低く、特に霊長類幹細胞では、１０％−３０％程度と顕著に低く、分化細胞が混入することが報告されている。また、この効率は、使用する胚盤胞のステージ、ＩＣＭの分離法などによっても変動する。従って、樹立効率が低い現在の系では、樹立に成功するまでには何回も試行錯誤が必要であった。本発明を用いると、効率は８０％以上となり、分化細胞の混入も激減し、そのような試行錯誤の必要はなくなる。
【００９５】
次に、本発明において用いることが可能なＥＳ細胞の一般的な樹立法を解説する。マウスで説明すると、通常、受精後３．５日で胚は胚盤胞に発生する。胚盤胞から胚本体を形成する未分化幹細胞である内部細胞塊を免疫手術により分離する。このＩＣＭは、胎盤などが作る細胞である栄養外胚葉への分化能を有する。このため、３．５日胚から直接ＩＣＭを分離するとＩＣＭが栄養外胚葉へと分化することから未分化細胞が喪失することがよくあるとされる。３．５日胚をさらに１日培養し、４．０〜４．５日胚とすると、胚盤胞は透明帯を脱出する。このステージではＩＣＭはもはや栄養外胚葉には分化しない。このような状態から、ＩＣＭを分離し、培養を開始すると、未分化細胞の割合を高めることができる。従って、本発明における幹細胞の樹立の際も、このような日数の未分化細胞を用いることができる。また、ヒトＥＳ細胞の場合は、この日数を参考にして、適宜変更して用いることができる。ヒトの場合は、受精後５〜８日のもの（凍結期間を除く）を使用することが多いが、それに限定されない。
【００９６】
ＥＳ細胞を樹立する際には、胚盤胞は、フィーダー細胞上に直接培養することもできるが、直接の場合は、胚盤胞が接着し栄養外胚葉が伸展してＩＣＭが露出することからあまり好ましくない。これを分離し培養したものを用いてもよいが、好ましくは免疫手術が用いられる。模式的なＥＳ細胞株樹立スキームを図６に示す。簡単に言うと、免疫手術で分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養し、継代を続けると分化した細胞に混じって、未分化幹細胞のコロニーが現れる。これを分離し、継代を行うことで、安定して維持することができるＥＳ細胞株を樹立することができる。本発明を用いると、樹立率が８０％を超えることから、安定して維持することができるＥＳ細胞を得る効率も格段に上がる。
【００９７】
ＥＳ細胞を樹立するためには、本発明のフィーダー細胞のほか、ＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ不含）、０．２５％トリプシン・１ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ、ＥＳ細胞用培地（ＤＭＥＭ（ハイグルコース）４００ｍｌ、ウシ胎仔血清 １００ｍｌ、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）４ｍｌ、ヌクレオシド溶液（ヌクレオシド、グアノシン、シチジン、ウリジン各３ｍＭ、チミジン１ｍＭ水溶液、４０℃に加熱して溶解し、濾過滅菌し、−２０℃で保存する）４ｍｌ、２−メルカプトエタノール４μｌ（０．１ｍＭ）、ＬＩＦ １００μｌ（２０００Ｕ／ｍｌ））、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、Ｍ１６培地（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、酸性タイロード液（Ｓｉｇｍａなどから入手可能）、抗マウス血清（マウス脾臓細胞またはリンパ球５×１０８細胞をウサギに２週間おきに３回静脈免疫し、最終免疫から２週間後に採血する。これを抗血清として非働化し−８０℃で保存する）、モルモット補体、流動パラフィン（軽質；ナカライテスクなどから入手可能）を用意することが必要である。実験器具としては、ＣＯ２インキュベータ、実体顕微鏡、キャピラリー、マルチウェルプレート（例えば、４ウェル、１２ウェル、ＮＵＮＣなどから入手可能）を用意するとよい。
【００９８】
以下にＥＳ細胞の樹立の例示的なプロトコール記載する。このプロトコールは、京都大学再生医科学研究所においてまとめられたヒトＥＳ細胞株樹立計画書に準じて記載されるが、本明細書では、この特定のプロトコールに限定されず、いずれのプロトコールであっても用いることができる。
【００９９】
（１）凍結胚の解凍と胚盤胞期までの培養
凍結保存されたヒト受精卵または胚盤胞期までの初期胚を順次解凍して培養を行う。個々の凍結胚容器からは提供者を同定できるものは除去されているため、各回の解凍・培養実験に使用されたヒト受精胚の出自は同定され得ない。しかしながら、各々のヒト受精胚の取扱がおろそかにならないように、凍結胚として受け入れた時点からひとつの凍結容器内に納められたヒト受精胚を樹立研究の過程で個々の存在として尊重し、どのような経過をたどったかを記録する。
【０１００】
（２）内部細胞塊の分離と細胞株の樹立
胚盤胞期まで到達した胚（受精後の発生期間が約１４日以内のもの）について、抗ヒト血清による免疫手術などの方法によって内部細胞塊を分離したのち、フィーダー細胞層の上で培養する。フィーダー細胞としては、本発明のフィーダー細胞を用いる。内部細胞塊を採取した後の残部についても、礼節をもって取扱う。フィーダー細胞の上で増殖した細胞を適時に解離して分割継代し、幹細胞と思われる細胞コロニーの選別培養などを行ないながら、ES 細胞と思われる細胞株を樹立する。この間に、培養維持方法や細胞凍結保存方法などの改良を目指した研究を行う。
【０１０１】
（３）幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定
ES 細胞であることを確認するために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ活性や特異的抗原）の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどうかを検定する。
【０１０２】
（４）分化能の検定
培養下での分化能を検定するために、培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の解析を行なう。また免疫不全マウスなどへの移植を行なってテラトーマ形成による組織分化能の解析を行なう。
【０１０３】
（５）安全性確保と事故防止
ヒト凍結胚の一時的保存は専用の液体窒素タンクを用いることによって、樹立計画に用いる以外の細胞や動物胚などに由来するウイルスと微生物による汚染を防ぐ。また細胞培養実験には専用の炭酸ガスインキュベーターを用いることによって、他種類の細胞との混合を防ぎ、ウイルスや微生物による汚染の可能性を小さくする。細胞培養に用いた培養液や培養器具は、実験室内で加圧高温滅菌処理を行なったのちに廃棄する。ヒト受精胚の保存および細胞株樹立を行なう実験室への入室者の管理を厳重に行う。
【０１０４】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。ＥＳ細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０５】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【０１０６】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。
【０１０７】
本明細書において「胎児」または「胎仔」とは、交換可能に用いられ、哺乳動物の子が各器官原基の分化を完了し，成長期に入ったときから出産までの期間にある生物体をいう。
【０１０８】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。樹立された分化細胞は、特定の確定した機能を有する。樹立された分化細胞は癌化していることが多いが、それに限定されない。
【０１０９】
本明細書において本明細書において「分化」とは、一般的には、１つの系が２つ以上の質的に異なる系に分離することをいい、細胞、組織または臓器について用いられるとき、機能および／または形態が特殊化することをいう。分化に伴い、通常、多能性は減少または消失する。
【０１１０】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明において用いられる場合、分化細胞は、集団または組織の形態であってもよい。分化細胞の幹細胞調製物への混入は、幹細胞の利用において有害であることが多く、そのような分化細胞の混入を減少させることは従来技術では困難であった。
【０１１１】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【０１１２】
本明細書において「正常細胞」とは、病理状態にない任意の細胞をいう。従って、そのような正常細胞は、分裂回数が有限であることが多い。そのような有限の分裂回数は、通常５０〜８０回であることが多い。
【０１１３】
本明細書において「不死化」とは、有限の分裂回数（例えば、５０〜８０回）を超えても細胞が死滅しないことをいう。
【０１１４】
本明細書において「細胞株」または「株化細胞」とは、上記有限の分裂回数を超えても生存する細胞をいう。そのような細胞株は、初代培養細胞などから得られた継代細胞を順次継代し、正常細胞が通常死滅する継代数を超えて細胞を継代した後も生存する細胞を選択することによって樹立することができる。そのような樹立方法は、当該分野において公知である。
【０１１５】
本明細書において「繊維芽細胞」とは、支持組織の繊維成分を供給し，繊維性結合組織の重要な成分をなす細胞をいう。組織切片図では、扁平で長目の外形をもち、不規則な突起を示すことが多い。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、小脂肪球などを含むが、そのほかに特殊な分化は示さない。核は楕円形をしており、しばしば膠原繊維に密接して存在する。
【０１１６】
本明細書において「フィーダー層」または「フィーダー細胞」（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒまたはｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）とは、互換可能に用いられ、培養基質に設けられる、単独では培養維持することのできない細胞種の増殖および／または分化形質発現を可能にするような、他の細胞種による支持細胞層をいう。組織細胞には、通常の細胞培養条件下では，分化形質発現はもとより増殖すらできない細胞種も多いといわれており、そのような細胞としては、例えば、幹細胞（特に、ＥＳ細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞など）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの細胞種は一般に、栄養要求性が高く特異的な増殖因子、分化誘導因子を必要とする。このような細胞種でも生体内でのその細胞種の支持細胞あるいはそれと類似の細胞が形成する特定の細胞の層を培養基質に活用することで、培養される細胞種が要求する因子および／または栄養源が供給されることによって、増殖および分化をするようになる。フィーダー細胞として用いる細胞種は、対象となる細胞種によって選択されるが、UV照射などの方法で細胞増殖を抑制して用いることが多い。生殖細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞などの培養が可能になったのは，フィーダー層の活用に負うところが大きい。従来は、フィーダー細胞として、マウス繊維芽細胞（初代培養細胞または細胞株）が使用されており、幹細胞樹立効率は１０％程度であるとされている。本明細書において、このようなフィーダー細胞を含む調製物は、「フィーダー細胞調製物」という。また、本発明において、二種以上の細胞を混合した細胞であって、フィーダー細胞として使用される場合は、「フィーダー細胞混合物」または「細胞混合物」ということがある。
【０１１７】
本明細書において「ＳＴＯ細胞」とは、樹立されたマウス繊維芽細胞株であって、ＡＴＣＣにおいてＣＲＬ−１５０３として寄託されている細胞を含む。ＳＴＯ細胞は、ＳＩＭ繊維芽細胞株に由来し、６−チオグアニンおよびウアバインに対して抵抗性を示し、ＨＧＰＲＴ−（ＨＰＲＴ−）であり、ＨＡＴに感受性を有するとされる。従来より、ＳＴＯ細胞は、フィーダー細胞として用いられており、その対象には、ＥＳ細胞のほか、テラトカルシノーマ、ハイブリドーマなどが含まれている。ＳＴＯ細胞の維持には、適切である限り任意の培養条件を用いることができるが、例えば、ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミンを加え、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌグルコース、およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％を加えたものを用いて培養することができる。ＳＴＯ細胞の継代には、培地を取り除き、０．２５％トリプシン、０．０３％ ＥＤＴＡ溶液を用いてリンスし、その溶液を除いて、さらに１−２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加える。その後、容器を室温（または３７℃）中に移動させて細胞を剥離させる。その後新鮮な培地を入れて、吸引し、その後新たな培養容器へと分配して継代を完成する。培養容器は、ゼラチンコーティングされていてもよい。継代は、１：３〜１：１０で行うことが推奨されるがそれに限定されない。ＳＴＯ細胞としては、上記ＡＴＣＣに寄託されたものを用いてもよいし、あるいは、照射されたＳＴＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣでは、５６−Ｘとして寄託されている）を用いてもよい。
【０１１８】
本明細書において「ＳＬ１０細胞」とは、ＳＴＯ細胞株からサブ樹立した細胞株であり、その樹立方法は、Ｋａｗａｓｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：３８５−３９０（１９９４）、フィーダー細胞の調製などについては、川瀬らの方法［川瀬ら、実験医学，Ｖｏｌ．１０．Ｎｏ．１３ （増刊），１５７５−１５８０，１９９２］に準じて実施できる。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅ．Ｊ． （ｅｄ）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｓｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載されており、本明細書においてその記載を参考として援用する。手短に述べると、ＳＴＯ細胞をｎｅｏｒ遺伝子を含むベクターでトランスフェクトする。その後、ネオマイシン抵抗性になったコロニーを増幅し、そしてフィーダー細胞としての適切性を確認する。この場合ＥＳ細胞株ＣＣＥを試験用に用いることができるがそれに限定されない。ＳＬ１０細胞は、ＣＣＥの未分化幹細胞コロニーをよく維持するものとして選択される。ＳＬ１０細胞は、ゼラチンへの接着性の良さからフィーダーとして適しているとされる。
【０１１９】
本明細書において「初代培養細胞」とは、体から分離した細胞、組織、器官などを植え込み，第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいうが、本明細書では、継代を５回程度まで行うものは本明細書において初代培養細胞の定義内に入ることが理解される。初代培養細胞は、通常何も改変を施されていない細胞を用いることが好ましいが、マイトマイシンＣまたはＸ線で不活化したものを用いることもできる。
【０１２０】
本明細書において継代された後の細胞は、「継代細胞」ともいう。
【０１２１】
本発明の細胞は、細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍ２、Ｍ１６、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）、Ｍ１９９、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１、Ｌ−１５などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。
【０１２２】
本明細書において「分化因子」とは、「分化促進因子」ともいい、分化細胞への分化を促進することが知られている因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２３】
具体的な分化因子としては、以下が挙げられる。
【０１２４】
Ａ）神経：ＮＧＦ、ＣＮＴＦ，ＥＧＦ、ＦＧＦ；
Ｂ）血液細胞：ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、インターロイキン類およびインターフェロン類（例えば、インターロイキン２など）；
Ｃ）肝臓：ＨＧＦ
Ｄ）骨・軟骨：ＢＭＰ。
【０１２５】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
【０１２６】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０１２７】
本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ ｖｉｖｏ）とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
【０１２８】
本明細書において自己または自家とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。本明細書において自己というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。
【０１２９】
本明細書において同種（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。遺伝的に異なることから、同種異系のものは、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような細胞などの例としては、親由来の細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３０】
本明細書において異種とは、異種個体から移植されるものをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植物は異種移植物という。
【０１３１】
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植される細胞などを受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植される細胞などを提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。レシピエントとドナーとは同じであっても異なっていてもよい。
【０１３２】
本発明で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。
【０１３３】
本明細書において「移植」とは、本発明の細胞、組成物、医薬などを、単独で、または他の治療剤と組み合わせて体内に移入することを意味する。本発明は、以下のような治療部位（例えば、骨などなど）への導入方法，導入形態および導入量が使用され得る：本発明の医薬などの障害部位への直接注入し、貼付後に縫合し、挿入する等の方法があげられる。本発明の脂肪幹細胞と、分化細胞との組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、分化促進因子）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与または移植は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる細胞、医薬、化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１３４】
本明細書において「維持」とは、細胞、組織または臓器について用いられるとき、その機能および／または形態を実質的に保持させることをいう。例えば、角膜の維持とは、被検体が通常有するべき角膜の機能および／または形態を実質的に損傷しないで有することをいい、機能としては、視力の維持、形態としては、外観の保持が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３５】
本明細書において使用される「再生」（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）とは，個体の組織または臓器の一部が失われた際に、欠如した組織が補填されて復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し，不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には，生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。あるいは、本発明の方法で樹立された幹細胞を用いれば、どのような組織の再生も原理的には行うことができ、そのようにして調製された本発明の臓器、組織および細胞が再生のための移植物として提供される。細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞およびその分化細胞、造血幹細胞およびその分化細胞ならびに間葉系幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞およびその分化細胞、膵幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。本明細書では、細胞はどのような胚葉由来でもよい。
【０１３６】
本発明において、幹細胞は遺伝子改変することができる。幹細胞は培養細胞であるので、他の培養細胞と全く同様に種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポゾーム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等）が利用できる。また、導入できる遺伝子も何ら制限されるものではなく、細菌、動物またはヒトの染色体に由来する遺伝子などを挙げることができるがそれに限定されない。同様に、ＥＳ細胞株を利用するジーンターゲッティングの方法として使用されるターゲッティングベクターを用いた内在遺伝子の相同遺伝子組換えによる改変も可能である。
【０１３７】
本発明の方法が対象とし得る疾患、障害、状態は、臓器または組織の再生が所望される任意の疾患、障害、状態を含む。本発明は特に、フィーダー細胞がなければ再生し得ない幹細胞などを必要とする臓器、組織または細胞に関連する疾患、障害、状態が対象として特に有利である。
【０１３８】
そのような本発明が対象とし得る疾患および障害としては、循環器系（血液細胞など）の疾患または障害；神経系の疾患または障害；免疫系の疾患または障害；運動器・骨格系の疾患または障害；皮膚系の疾患または障害；内分泌系の疾患または障害；呼吸器系の疾患または障害；消化器系の疾患または障害；泌尿器系の疾患または障害；生殖器系の疾患または障害などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３９】
本発明が対象とする動物は、幹細胞を有する動物であれば、どのような動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、カニクイサル、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒトが対象である。
【０１４０】
本発明が医薬として使用される場合、そのような医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１４１】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１４２】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４３】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。
【０１４４】
必要に応じて本発明の医薬は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１４５】
本発明の処置方法において使用される医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
【０１４６】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１４７】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査の結果または上記疾患（例えば、神経疾患、心臓疾患など）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、上記疾患（例えば、神経疾患、心臓疾患など）の再発により再開することができる。
【０１４８】
本発明はまた、本発明の医薬の１つ以上の成分（例えば、ＥＳ細胞のような幹細胞）を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
【０１４９】
本発明が研究用試薬として使用される場合、本発明の幹細胞は、当局の定める倫理規定に従って分配されることが望ましい。そのような規定としては、例えば、日本政府が定めるものが挙げられるがそれに限定されない。以下にその規定の例を記載する。
【０１５０】
樹立機関の業務および義務として政府指針などに定められているもの従い、ヒトES細胞の樹立および使用に関する指針に従って承認された研究計画をもつ使用機関からの要請を受けて、樹立後特性解析を行った細胞株を分配する。分配の開始の時期としては、多分化能と正常核型の検定と確認を行った細胞株を増殖させて、細胞株保存のために必要な数の凍結細胞サンプルが得られた時点から分配を始めることが企図される。
【０１５１】
樹立と分配を開始する時点では、分配機関が分配に責任を持って担当する。分配機関には細胞培養に必要なクリーンルームと機器および細胞凍結保存用液体窒素タンクが整備されるべきである。ヒトES細胞株の樹立チームが使用し、その人員構成は、例えば、研究者５名（内２名は医師免許保持者が好ましい）からなる。細胞の分配を開始する時点では、さらに実験補佐員２名程度と事務補佐員１名程度が実務を分担してもよい。細胞分配および研修の要請の増加に応じて、あらたに人員および施設を増加させることが好ましい。
【０１５２】
分配の方法および条件は例えば以下のようなものを挙げることができる：ES細胞株の維持および増殖の継続に必要な樹立機関における細胞ストックの確保が優先されるべきである。
【０１５３】
幹細胞の提供者がヒトである場合、通常インフォームド・コンセントを得る必要がある。
【０１５４】
ヒト受精胚の提供候補者については、ＥＳ細胞研究に凍結胚を提供依頼にあたってのインフォームド・コンセントによる同意が与えられるかどうかを、次のような手順に従って確認する。不妊治療の開始から凍結胚の廃棄決定に至る手続き、および関連文書、その後に始まるＥＳ細胞研究への提供に関するプロセスの例示的概要を示す。
【０１５５】
（１） 不妊治療の結果作られて凍結保存されているヒト受精胚が、子宮へ移植されることなく廃棄させることが決定するまでは、ＥＳ細胞研究とは全く無関係な不妊治療プロセスとして患者と不妊治療担当医師による臨床的問題である。
【０１５６】
（２） 廃棄させることが決定した凍結胚について、不妊治療担当医師が中立的立場を保ちながら、ＥＳ細胞の研究について説明を受けるかどうか提供候補者に質問する。
【０１５７】
（３） 説明を受けたいとの意思を示した提供候補者に対して、樹立機関の説明者（樹立責任者以外）がＥＳ細胞とはなにか、将来の医療への応用の可能性、研究内容の概要、ＥＳ細胞株樹立によって提供者は利益も不利益も受けないこと、提供者のプライバシーは保護されること、などについて十分に説明する。これらの説明は、全く中立の立場で行われる。
【０１５８】
（４） 提供候補者は説明を受けた後に、提供医療機関の長に対して提供に同意するかどうかを回答する。同意はインフォームド・コンセントの書類への署名を必要とし、その書類は提供医療機関が厳重に保管する。特定の提供候補者による同意あるいは不同意に関する結果は樹立関係者には伝えない。
【０１５９】
（５） 提供候補者による同意の署名から一ヶ月間以上の猶予期間をおいて、提供候補者の意思に変更がない場合は、凍結胚を樹立機関に移送する。その際、複数の提供者からの凍結胚を同時に引渡すとともに、凍結胚容器からは提供者を同定できるラベルなどを完全に除去しておく。従って、樹立機関の説明担当者が複数の提供候補者と面会はするが、その氏名などの個人情報は知ることがなく、またそれらの候補のうち誰が同意して提供者となったかも知ることがないので、提供者の匿名性は保証され得る。さらに、複数の提供者からの凍結胚を使ってその一部のみから細胞株が樹立されるので、どの提供者の胚から実際にＥＳ細胞株が樹立されたかは樹立機関と提供医療機関の両者ともに知ることができないようにする。
【０１６０】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６１】
（トランスジェニック生物）
本発明の幹細胞は、トランスジェニックマウスを作製するのに使用することができる。トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、国際公開ＷＯ０ｌ／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９ｌ号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａ１．）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示しており、これらの説明内容を本明細書において援用する。。
【０１６２】
このほかにもまた、トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１６３】
そのような中、最近１０年間ほどで、遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の解析が重要な手段となってきている。
【０１６４】
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
【０１６５】
このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
【０１６６】
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
【０１６７】
多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。
【０１６８】
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモータを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，ＥＳ細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＷＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：７５６−７６８（２００１））。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。
【０１６９】
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。
【０１７０】
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。
【０１７１】
本発明は、このように、種々のトランスジェニック生物の作製に利用することができる。
【０１７２】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed. (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Pub. AssociatES and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience;Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press;Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates;Sninsky, J. J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for FunctionalGenomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１７３】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A PracticalApproach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１７４】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１７５】
（フィーダー細胞調製物）
１つの局面において、本発明は、正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物を提供する。このような複数の性質を有するフィーダー細胞の混合物をフィーダー細胞調製物として利用した例はこれまでなく、また、従来は、フィーダー細胞として使用可能な細胞種はいくつか知られていたが、それらの間に本質的な差違の存在は想定されておらず、従って細胞を組み合わせることによってフィーダー細胞機能が著しく向上することは予想されていなかった。本発明にあるような細胞の組み合わせにより幹細胞株の樹立 維持の効率が非常に向上する機作についてはフィーダー細胞の機能が分子レベルで解明されていないため明らかでないが、上に挙げたような因子の供給が単独の細胞の使用では完全に行われない為では無いかと思われる。よってフィーダー細胞を複数種組み合わせることにより予想外の効果が得られたと考えられる。従って、ある局面では、本発明は、任意の複数のフィーダー細胞の混合物を用いることができることが理解される。本明細書において使用されるフィーダー細胞は、従来フィーダー細胞として使用される細胞であれば、どのような細胞であっても使用され得ることが理解される。
【０１７６】
本明細書において使用される正常細胞は、フィーダー細胞として適切に使用されている細胞であれば、使用され得ることが理解される。そのような正常細胞としては、例えば、マウス初代培養繊維芽細胞、ラット初代培養繊維芽細胞、サル初代培養繊維芽細胞、ヒト初代培養繊維芽細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１７７】
そのような初代培養繊維芽細胞の調製方法としては、例えば、１１−１６日令胎児から、頭部、内臓等を取り除いたものを細断、酵素処理で主として繊維芽細胞を取り出すという方法を用いて行うことができる。
【０１７８】
具体的には、
１．受精後１２日目（１１〜１６日目が好ましい。）のマウスを準備する。
２．胎児を摘出し胎仔を傷つけないように羊膜・胎盤を取り除き、新しいペトリディッシュへ移す。
３．実体顕微鏡下で胎仔の頭部および腹部の肝臓、腸などの内臓をできるだけピンセットで取り除く。ＰＢＳ（−）で胎仔についた余分な臓器を洗い流し、新しいペトリディッシュへ移す。
４．クリーンベンチ内で１００ ｍｍ細胞培養ディッシュに培地を１０ ｍｌずつ分注する。２１Ｇ針とシリンジを準備する。シリンジの中に胎仔を１つ入れ、ディッシュ中の培地をゆっくりと吸い上げ、そのまま同じディッシュ中へゆっくりと培地をもどす。この操作を２〜３回繰り返す。
５．胎仔が細片になっていることを確認する。
６．３７℃、ＣＯ２インキュベータで一晩培養する。
という方法によって、繊維芽細胞を調製することができる。
【０１７９】
好ましくは、上記正常細胞は不死化していないことが有利である。理論に束縛されることは望まないが、不死化していないことによって、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８０】
本発明において使用される正常細胞は、繊維芽細胞であってもよいが、そうでなくてもよい。好ましくは、繊維芽細胞が使用される。理論に束縛されることを望まないが、繊維芽細胞は、フィーダー細胞としての適性を付与することが多く、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８１】
より好ましい実施形態では、本発明において用いられる正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である。より好ましくは、本発明において用いられる正常細胞は、マウス由来である。理論に束縛されることを望まないが、マウスであることが好ましい理由は、調製の容易さにある。従って、任意の哺乳動物が使用され、簡易な調製法が別の存在する場合は、他の哺乳動物の細胞を用いることによって好ましく使用され得る。理論に束縛されることは望まないが、経験的には、ウシおよびウサギのＥＳ樹立研究で同種の繊維芽細胞を使用しても、マウスより良い効果は見られないようであり、一般的にはマウスの細胞が良いと考えられている。
【０１８２】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる正常細胞は、胎児（胎仔）由来であり得る。理論に束縛されることを望まないが、胎児由来の細胞は、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部を提供し、フィーダー細胞としてより適切であると考えられるからである。また、本発明において使用される細胞株とは、細胞学的にみて、最も異なる性質を有すると考えられ、従って、細胞株が提供できない幹細胞の維持に必要な因子を供給する能力を有すると考えられるからである。
【０１８３】
従って、本発明では、フィーダー細胞としての能力を提供することができる限り、どのような継代数の細胞でも用いることができるが、好ましくは、初代培養細胞については継代数の少ないもの（４，５回程度）が推奨され、継代数が５回以下、４回以下、３回以下、２回以下、１回または継代なしの細胞が用いられる。
【０１８４】
ある好ましい実施形態では、本発明において使用される正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である。
【０１８５】
本明細書において使用される細胞株は、フィーダー細胞としての能力を有する限り、どのような細胞であっても使用することができることが理解される。そのような細胞株は、代表的には、不死化している。理論に束縛されることを望まないが、不死化した細胞を用いることによって、初代細胞株などの正常細胞では供給されないが、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の他の一部が供給されると考えられるからである。
【０１８６】
好ましくは、本発明において使用される細胞株は、繊維芽細胞株である。
【０１８７】
本発明において使用される細胞株は、継代期間は、どのような期間であっても良いが、好ましくは、継代された期間が２ヶ月以下であり、より好ましくは、継代された期間が１ヶ月以下である細胞を用いることが有利であり得る。理論に束縛されることを望まないが、そのような継代期間が短い細胞株を用いることによって、初期の目的の因子を分泌する細胞を安定して供給することができ、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の他の一部が十分に供給されると考えられるからであるが、必ずしも継代期間が短くある必要はない。
【０１８８】
本発明において使用される細胞株は、マウス由来であり得るが、それに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、マウスであることが好ましい理由は、調製の容易さにある。従って、任意の哺乳動物が使用され、簡易な調製法が別の存在する場合は、他の哺乳動物の細胞を用いることによって好ましく使用され得る。理論に束縛されることは望まないが、経験的には、ウシおよびウサギのＥＳ樹立研究で同種の繊維芽細胞株を使用しても、マウスより良い効果は見られないようであり、一般的にはマウスの細胞が良いと考えられている。
【０１８９】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる細胞株は、胎児（胎仔）由来であり得る。理論に束縛されることを望まないが、胎児由来の細胞は、分化させずに幹細胞を維持するために必要な因子の一部を提供し、フィーダー細胞としてより適切であると考えられるからである。また、本発明において使用される正常細胞とは、細胞学的にみて、最も異なる性質を有すると考えられ、従って、正常細胞が提供できない幹細胞の維持に必要な因子を供給する能力を有すると考えられるからである。
【０１９０】
好ましい実施形態では、使用される細胞株は、ＳＴＯ株である。この細胞株はネオマイシン耐性（ｎｅｏ抵抗性）の性質を持っていることが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞株は、ＳＬ１０株である。
【０１９１】
本発明のフィーダー細胞調製物において含まれる正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）とは、代表的に、約１：１０〜１０：１で存在し得る。理論に束縛されることを望まないが、１：１０〜１０：１の範囲外では、フィーダー細胞を複数種使用する効果がほとんど見られないが、１：１０〜１０：１の範囲内では、幹細胞の維持において効果が有意に見られているからである。
【０１９２】
好ましい実施形態では、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率は、約１：４〜４：１であり得る。理論に束縛されることを望まないが、複数種の細胞を含むフィーダー細胞調製物を利用することによって、幹細胞の維持および多分化能の維持の効果が顕著に改善されるからである。より好ましい細胞比率は、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率が約１：３〜約３：１であり得る。
【０１９３】
最も好ましい実施形態では、正常細胞（たとえば、繊維芽細胞初代培養細胞）と細胞株（たとえば、繊維芽細胞株）との比率は、ほぼ等量である。理論に束縛されることを望まないが、ほぼ等量の複数種の細胞を用いることによって、相互に補完すべき幹細胞を維持するための成分が互いに十分含まれることになるからである。従って、当業者は、本明細書においてほぼ等量というとき、等量に近いがフィーダー細胞として最適な任意の比率を意味することを理解する。
【０１９４】
１つの実施形態では、本発明のフィーダー細胞調製物が目的とする細胞は、胚性幹細胞であり、より好ましくは、ヒト胚性幹細胞である。ヒト胚性幹細胞のような細胞が多能性を維持しながら増殖させることができ、しかも５０％未満の分化細胞混入率（好ましくは、３０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは１％未満）は、これまでの技術では達成できなかった格別の効果であるといえる。
【０１９５】
（幹細胞調製法）
１つの局面において、本発明は、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、幹細胞を調製するための方法を提供する。正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）および細胞株（例えば、繊維芽細胞株）は、おのおの正常細胞（例えば、初代培養細胞）であり、株化したものである限り、任意のものを使用することができる。フィーダー細胞としては、これらの２種の細胞を含んでいる限りどのような含まれ方であっても使用することができるが、好ましくは、均一に混合していることが有利である。そのような混合比率としては、好ましくは、約１０：１〜１：１０、約９：１〜１：９、約８：１〜１：８、約７：１〜１：７、約６：１〜１：６、約５：１〜１：５、約４：１〜１：４、約３：１〜１：３、約２：１〜１：２、約１：１（ほぼ等量を意味する）などが挙げられる。好ましくは、ほぼ等量混合されることが有利である。理論に束縛されないが、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とは、相互に相乗的な効果を有する因子（例えば、幹細胞維持に必要なもの）を相補的に分泌することによって、本発明の予想外の効果を達成しているものと考えられる。
【０１９６】
１つの実施形態において、本発明のフィーダー細胞において用いられる正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）は、マウス由来であることが有利であるがそれに限定されない。従って、本発明では、任意の動物を用いることができる。マウスは、技術的に充分に確立した実験動物であり、初代培養細胞などの正常細胞の入手方法もまた、当業者によく知られるところとなっているからである。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本発明において使用される正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）は、胎児由来であることが有利であるがそれに限定されない。従来、例えば、繊維芽細胞初代培養細胞は、フィーダー細胞として用いられているが、胎児由来のものが主に用いられている。胎児由来の繊維芽細胞初代培養細胞を単独で用いた場合でも、幹細胞の樹立効率は、それほど高いものではなく、せいぜい１０−３０％程度であった。翻って、本発明のフィーダー細胞調製物および細胞混合物では、その樹立効率は、５０％をはるかに超え、８０％程度の場合もある。従って、このような高率の樹立高率は、従来技術からは想像を超えるものであったといえる。ここで、正常細胞は、厳密な意味での初代培養細胞であることが好ましいが、継代培養した細胞であっても、継代数が少ないものであれば、初代培養細胞とほぼ類似する性質を有し得ることから、本発明において有利に使用することができる。そのような継代数としては、例えば、約５継代以下、４継代以下、３継代以下、２継代以下、１継代などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９８】
１つの好ましい実施形態において、本発明のフィーダー細胞に含まれる細胞株（例えば、繊維芽細胞株）は、ＳＴＯ株であることが有利である。従来ＳＴＯ株は、幹細胞のフィーダー細胞として用いられているが、幹細胞の樹立効率は、やはり３０％以下と低率にとどまっており、本発明の細胞混合物および細胞調製物をフィーダー細胞調製物として使用した場合では、幹細胞の樹立効率は、５０％をはるかに超え、８０％程度の場合もある。従って、このような高率の樹立高率は、従来技術からは想像を超えるものであったといえる。
【０１９９】
より好ましい実施形態では、ＳＴＯ細胞からのＥＳ細胞未分化状態支持能の高い細胞の分離法を用いてより好ましい細胞株を樹立することができる。そのような方法を簡単に説明すると、以下のようになる。
【０２００】
１．定法に従いＳＴＯ細胞を細胞一つ一つになるまで解離する。
【０２０１】
２．培養皿に１００−５００個程度の解離したＳＴＯ細胞を播種する。
【０２０２】
３．数日間培養すると播種した細胞一つ一つの細胞それぞれからコロニーが形成されるので十分な大きさのコロニーが形成されるまで培養を続ける。
【０２０３】
４．それぞれのコロニーから細胞を回収し、別々に培養して十分な量にまで増殖させ１００クローン程度のサブラインを確立する。
【０２０４】
５．それぞれのサブクローンの細胞を用いてフィーダー細胞とし、それを用いてＥＳ細胞の培養を行い、未分化状態の支持能の高いサブラインを選別する。
【０２０５】
ひとつの好ましい実施形態では、本発明において使用されるＳＴＯ株は、ｎｅｏ抵抗性であることが有利である。理論に束縛されないが、そのようなｎｅｏ抵抗性にして細胞株を選択すると、フィーダー効果の高いものが選択されやすくなるからである。ｎｅｏ抵抗性にするには、ｎｅｏｒ遺伝子を当該分野において公知の任意の遺伝子導入手法（例えば、形質転換、トランスフェクションなど）を用いて導入することによって達成することができる。
【０２０６】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞株は、ＳＬ１０株であることが有利である。ＳＬ１０株は、上記のような方法に基づいて分離された細胞株である。ＳＬ１０株は、明治乳業から入手可能であり、京都大学再生医科学研究所において分配されるものであり、第三者は容易に入手することができるものであることが理解される。
【０２０７】
本発明が支持する幹細胞は、任意の幹細胞が含まれ、例えば、ＥＳ細胞、組織幹細胞などが挙げられるがそれに限定されない。好ましい実施形態において、本発明が支持する幹細胞は、ＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は、樹立効率の高いフィーダー細胞がなく、本発明は、ＥＳ細胞に関し従来達成可能であった上限である３０％をはるかに超える８０％もの樹立効率を達成した点で注目されるべきである。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明が支持する幹細胞は、組織幹細胞である。そのような組織幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。組織幹細胞もまた、フィーダー細胞を必要とするものが多く、従来技術では、それほど満足がいくほどに樹立効率を高く達成した技術は存在していない。従って、本発明は、組織幹細胞にも応用可能であることが理解される。
【０２０９】
より好ましい実施形態では、本発明が支持する幹細胞は、霊長類の細胞であり、より好ましくはヒト幹細胞である。ヒトを含む霊長類の細胞は、ごく最近になってＥＳ細胞が樹立したばかりであるという事情もあり、そのフィーダー細胞に関する研究はまだまだ発展途上にある。特に、満足のいく樹立効率をもたらすフィーダー細胞は、霊長類幹細胞、より好ましくはヒト幹細胞に関してはまったく存在しないといっても過言ではないということにかんがみると、本発明における樹立効率の高さは、特に霊長類幹細胞、より好ましくはヒト幹細胞において意義は高い。
【０２１０】
本発明のフィーダー細胞が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされていることが好ましいが、それに限定されず、培養効率を高めるものであれば、どのようなコーティングがされていてもよい。そのようなコーティングとしては、例えば、任意の細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチンなど）が挙げられるがそれらに限定されない。培養ディッシュは、どのような材質のものであってもよく、例えば、容器の材質は、生体適合性のものが使用されることが望ましいが、生体に毒性を与えるものが使用されていない限り、どのようなものであっても使用することができることが理解される。そのような容器の材質としては、例えば、ガラス、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料、あるいは、シラン、ポリＬリジンコートなどでコーティングされたものが使用され得る。
【０２１１】
１つの好ましい実施形態において、本発明のフィーダー細胞は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種され、好ましくは、２〜５×１０５細胞／ｃｍ２で播種される。理論に束縛されないが、このような適度な細胞密度によって、分泌される細胞生理活性物質が最適な状態になるからであると考えられる。
【０２１２】
本発明の方法において、本発明のフィーダー細胞は、通常、混合して播種された後５日以内に使用され、好ましくは、３日以内、より好ましくは２日以内、さらに好ましくは１日以内に使用される。ただし、混合後一定時間を置くことが好ましい。理論に束縛されないが、混合した後、一定時間（例えば、１時間）を置くことによって、幹細胞の維持に必要な成分が出てくるに十分な条件が成立するからである。
【０２１３】
１つの実施形態において、本発明において使用される幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養されることが有利である。ＫＳＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから入手可能である。ＫＳＲを用いた場合、全般に細胞の増殖が遅くなる傾向が見られるが、本発明の目的にかなう限り特に限定して用いることができる。あるいは、本発明において使用される幹細胞は、ウシ胎仔血清を含む液体培地中で樹立することが好ましい。ウシ胎仔血清に関しては、ＥＳ細胞を長期間安定に維持できるものであれば、通常問題なく樹立にも使用することができることが理解される。
【０２１４】
本発明の方法では、継代する工程がさらに包含され、この継代工程において、コラゲナーゼが使用される。コラゲナーゼの使用により、細胞回収がスムーズに行われ、樹立効率を改善するのに寄与すると考えられる。
【０２１５】
（幹細胞）
別の局面において、本発明は、本発明の幹細胞調製法によって調製された幹細胞調製物を提供する。このような幹細胞は、従来の方法で得られる幹細胞よりも、より未分化な状態を保っているとか考えられるという点で従来方法によって調製される幹細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。この細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類ＥＳ細胞であり、なおさらに好ましくは、ヒトＥＳ細胞である。このようＥＳ細胞（特に、ヒトのような霊長類）は、より発生段階の初期にある未分化な状態を保っているという点で従来方法によって調製される幹細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。従って、本発明の幹細胞調製物は、１）従来の方法で得られる幹細胞よりも，より未分化な状態を保っている；２）より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができる；３）より正常な組織に近い性質を有しているなどの有利な点を持っていることがわかる。従来の方法（例えば、非特許文献５、７など）よりも、本発明の方法ではより簡便に安定して未分化状態を維持したまま培養できており、他の方法では常に分化細胞が混入するのに比較し、本発明の方法では分化細胞はほとんど現れないことが示されている。従来の報告では、具体的な数値での報告は少ないがPeraのグループ(NBt；非特許文献７）では５０％ほどが部分的に分化した細胞集団であるとしているのに対して、本発明では、実施例においても例証されるように、５０％未満どころか、１％程度以下という数値も達成できることが示されている。このような幹細胞調製物は、従来は調製できなかったことから、調製物自体が新規であることが理解される。
【０２１６】
（再生移植物の調製）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法を提供する。この方法は、Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物の上で培養する工程；およびＣ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、を包含する。ここで、フィーダー細胞としては、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」節で詳細に説明した任意の形態を用いることができる。幹細胞は、所望の臓器、組織または細胞に分化し得るものである限り、任意のものを使用することができる。所望の臓器、組織または細胞に分化し得るかどうかは、当該分野において公知の技術を用いて確認することができる。そのような手法としては、分化条件にその幹細胞を晒し、その後一定期間培養した後、所望の分化をしているかどうかを、例えば、肉眼でみたり、顕微鏡により観察したり、あるいは、分子生物学的に観察したり、細胞表面マーカーなどを同定することによるものなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１７】
本発明の再生移植物の調製において、分化工程は、当該分野において公知の任意の技術を用いることができる。一つの好ましい実施形態において、本発明の方法における培養のために、分化因子を加えることができる。そのような分化因子としては、例えば、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。神経への分化には、ＮＧＦ、ＦＧＦという分化因子を加えることができる。血液細胞への分化には、インターロイキン、ＥＰＯという分化因子を加えることができる。
【０２１８】
本発明の再生移植物の調製が目的とする所望の臓器、組織または細胞としては、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛、皮膚などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１９】
１つの実施形態において、上述の所望の臓器、組織または細胞と前記フィーダー細胞とは、同じ種である。同じ種であることによって、免疫反応を最低限に抑えることも可能であり、適合性という点で好ましい。
【０２２０】
別の実施形態において、上述の所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、フィーダー細胞はマウス由来であることが好ましい。この組み合わせで幹細胞の樹立効率が８０％以上であるという高率を達成することができることがわかったからである。しかし、この組み合わせ以外の種の組み合わせもまた、同様に本発明において好ましくあり得ることが理解されるべきである。従って、フィーダー細胞としてヒトなどの霊長類由来のものを使用してもよいことが理解される。
【０２２１】
別の実施形態において、本発明の培養は、エキソビボ（すなわち、自己へもどすことを目的とする）で行われる。
【０２２２】
１つの実施形態において、本発明の幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものであり得る。摘出されてすぐ使用することが好ましい。樹立効率が高いからである。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明の方法における培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下であることが好ましく、分化のために加えられる分化因子としては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどを１または複数を含んでいることが好ましい。
【０２２４】
（臓器など）
別の局面において、本発明は、本発明の再生移植物の調製法によって調製される、臓器、組織または細胞を提供する。このような臓器、組織または細胞は、より正常な組織に近い性質を有しているという点で従来方法によって調製される再生臓器、組織または細胞とは異なる有利な効果を有すると考えられる。
【０２２５】
（臓器等再生システム）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するためのシステムを提供する。このシステムは、Ａ）容器；およびＢ）該容器上に播種される、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物、を備える。ここで、このフィーダー細胞調製物は、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。容器もまた、任意の物を利用することができ、例えば、「再生移植物の調製」節において説明される任意の形態をとることができることが理解される。
【０２２６】
（細胞混合物）
本発明は、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む混合物を提供する。この混合物は、本発明において実証されるように、幹細胞のフィーダー細胞として使用することができる。正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とは、「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明されるような任意の形態をとることができることが理解される。従って、実質的には、この細胞混合物は、フィーダー細胞調製物と同一のものであり得ることが理解され得る。
【０２２７】
好ましい実施形態において、本発明の混合物中の初代培養細胞は、マウス胎児初代培養繊維芽細胞であることが有利である。この形態が有利なのは、ＳＴＯ細胞など、他の細胞から得られない因子などが供給され、従来にない効率で幹細胞を樹立することができること、より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができることなどいう効果が考えられるからである。
【０２２８】
別の好ましい実施形態において、本発明の混合物中の繊維芽細胞株は、ＳＴＯ株であることが有利である。この形態が有利なのは、マウス胎仔繊維芽細胞から供給される因子が得られることにより、従来にない効率で幹細胞を樹立することができること、より正常に近い組織を支持する幹細胞を樹立することができることなどという効果が考えられるからである。
【０２２９】
（臓器等再生方法）
別の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞を再生するための方法を提供する。この方法は、Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞を、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含むフィーダー細胞調製物上で培養する工程；およびＣ）該培養された該幹細胞を被検体の処置されるべき部位に移植する工程、を包含する。ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。幹細胞もまた、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。移植技術もまた、当該分野において公知の任意の技術を用いて投与することができる。そのような技術としては、例えば、カテーテルを用いて心筋層への幹細胞移植などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｄ）前記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する。このような分化工程は、当該分野において公知の方法を適用することができる。このような分化条件は、分化の目的となる臓器、組織または細胞によって変動し得ることが理解される。そのような変動を考慮して、当業者は、適宜、適切な分化条件を決定し、選択することができることが理解される。
【０２３１】
（混合物のフィーダー細胞としての使用）
別の局面において、本発明は、フィーダー細胞調製物としての、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む細胞混合物の使用を提供する。あるいは、フィーダー細胞としての、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含む細胞混合物の使用が提供される。あるいは、幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の使用が提供される。
【０２３２】
ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。フィーダー細胞は、任意の細胞を支持することができるが、好ましくは幹細胞を支持することを目的とする。ここで、幹細胞もまた、上記「フィーダー細胞調製物」および「幹細胞調製法」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。
【０２３３】
他の局面において、本発明は、フィーダー細胞を含む医薬を製造するための、正常細胞（例えば、繊維芽細胞初代培養細胞）と、細胞株（例えば、繊維芽細胞株）とを含む細胞混合物の使用を提供する。ここで使用されるフィーダー細胞は、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。フィーダー細胞は、任意の細胞を支持することができるが、好ましくは幹細胞を支持することを目的とする。ここで、幹細胞もまた、上記「幹細胞調製法」および「フィーダー細胞調製物」において説明される任意の形態をとることができることが理解される。医薬を製造する技術は、当該分野において公知の技術を用いることができる。医薬には、適宜薬学的に受容可能なキャリアを加えることができる。
【０２３４】
好ましくは、上記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている（例えば、マイトマイシンＣによる）。このことにより、フィーダー細胞調製物は、パッケージに入れて販売することが可能になる。
【０２３５】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２３６】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Sigmaから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｏ． ８６−２３， １９８５，改訂）に遵って、京都大学および日本政府が規定する基準に遵い、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、厚生労働省または等価の政府当局の基準に従い、事前に同意を得た上で実験を行う。その同意方法は、本明細書において記載されるとおりである。
【０２３７】
（実施例１：マウス胎仔繊維芽細胞の初代培養細胞（ＭＥＦ）の調製）
マウス胎仔から繊維芽細胞の初代培養細胞（ＭＥＦともいう）を調製した。具体的には、以下のとおりである。
【０２３８】
妊娠したマウス（ＩＣＲ、日本クレア）から、胎仔の部分を取り出し、細胞を分離して、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）という培地中に播種した。取り出した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で維持した。
【０２３９】
（実施例２：ＭＥＦ細胞の前処理）
次に、フィーダー細胞としての効率を上げるために、実施例１で調製したＭＥＦ細胞を前処理した。前処理には、以下のものを使用した。
【０２４０】
培養液：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ不含）
０．０５％トリプシン＋１ｍＭ ＥＤＴＡ
２ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣ水溶液
０．１％ゼラチン水溶液。
【０２４１】
前処理は以下のとおり行った。
【０２４２】
（１）コンフルエントの細胞にマイトマイシンＣを10μg/mlになるよう培地に加え、1.5〜2時間培養した。
【０２４３】
（２）マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗った。培地を加え、数時間から一晩培養した。
【０２４４】
（３）培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除いた。
【０２４５】
（４）細胞を1ｘ105/mlの濃度に懸濁させた。
【０２４６】
このようにして調製したＭＥＦ細胞を、単独でまたは他の細胞と混合してフィーダー細胞として以下に実験に用いた。
【０２４７】
（実施例３：ＳＴＯ細胞の前処理）
ＳＴＯ細胞として、ＳＴＯ細胞のサブクローンＳＬ１０細胞を使用した。ＳＬ１０細胞は、明治乳業（東京、日本）から入手した。ＳＬ１０の場合、２週間がフィーダー細胞としての利用限度であり、７〜１０日で継代を行った。培地としてはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを使用した。
【０２４８】
このＳＴＯ細胞を、フィーダー細胞として使用するために前処理した。その手順は以下のとおりである。前処理には、以下のものを使用した。
【０２４９】
培養液：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ 不含）
０．０５％トリプシン＋１ｍＭ ＥＤＴＡ
２ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣ水溶液
０．１％ゼラチン水溶液。
【０２５０】
前処理は以下のとおり行った。
【０２５１】
（１）コンフルエントの細胞にマイトマイシンＣを１０μｇ／ｍｌになるよう培地に加え、１．５〜２時間培養した。
【０２５２】
（２）マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗った。培地を加え、数時間から一晩培養した。
【０２５３】
（３）培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除いた。
【０２５４】
（４）細胞を１．５×１０５／ｍｌの濃度に懸濁した。
【０２５５】
（実施例４：別のＳＴＯ細胞の調製）
別の実施例として、ＳＴＯ細胞から好適なクローンをサブクローニングする。その手順は以下のとおりである。
【０２５６】
マウスにおいてＥＳ細胞株の樹立・継代維持に用いられるＳＴＯ細胞は株細胞であり均一な集団と考えられていたが、その中に特にＥＳ細胞株の樹立・維持に優れた性質を持つ細胞集団を含むことが示されている。
【０２５７】
同様の性質を持つＳＴＯ細胞のサブラインは以下のように単離できる。
【０２５８】
（１）定法に従いＳＴＯ細胞を細胞一つ一つになるまで解離する。
【０２５９】
（２）培養皿に１００−５００個程度の解離したＳＴＯ細胞を播種する。
【０２６０】
（３）数日間培養すると播種した細胞一つ一つの細胞それぞれからコロニーが形成されるので十分な大きさのコロニーが形成されるまで培養を続ける。
【０２６１】
（４）それぞれのコロニーから細胞を回収し、別々に培養して十分な量にまで増殖させ１００クローン程度のサブラインを確立する。
【０２６２】
（５）それぞれのサブクローンの細胞を用いてフィーダー細胞とし、それを用いてＥＳ細胞の培養を行い、未分化状態の支持能の高いサブラインを選別する。
【０２６３】
このようにしてサブクローニングした細胞株もまた、フィーダー細胞として使用できる。このようなサブクローンを実施例３に記載のように前処理した。
【０２６４】
（実施例５：フィーダー細胞の調製）
本実施例では、フィーダー細胞を調製した。本発明のフィーダー細胞として、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを単独で使用した場合と、混合した場合とを調製した。フィーダー細胞の調製は、以下に示すように同様のプロトコールに従った。
【０２６５】
（１）フィーダーを作る培養皿を予めゼラチンコートしておいた。ゼラチンコートは培養皿の表面をゼラチン溶液で覆い３７℃で１時間以上インキュベートして行った。
【０２６６】
（２）前処理したＳＴＯ細胞、前処理したＭＥＦ細胞を単独でまたは懸濁液を１：１に混合して用いた。
【０２６７】
（３）ゼラチンコートした培養皿からゼラチン溶液を除き、細胞サンプルを加えた。３５ｍｍの培養皿に２ｍｌの細胞懸濁液を加えると培養皿の表面をフィーダー細胞が隙間なく覆った。細胞密度はおよそ２．５×１０４／ｃｍ２になった。
【０２６８】
調製したフィーダー細胞は４日以内に使用した。
【０２６９】
（実施例６：幹細胞の樹立）
次に、実施例５で調製したフィーダー細胞を用いて幹細胞を樹立した。使用した培養液は以下のとおりである。
【０２７０】
（ＥＳ細胞用培養液）
【０２７１】
（細胞解離液）
０．２５％ トリプシン（ＰＢＳ）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
２０％ＫＳＲ。
【０２７２】
（ディッシュ）
フィーダーをつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。０．１％ゼラチン溶液（ｓｗｉｎｅ ｓｋｉｎ、Ｔｙｐｅ Ａ：Ｓｉｇｍａ 社製）で覆い、３７℃で１ 時間以上インキュベートする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経てばフィーダー細胞として使用可能である。
【０２７３】
フィーダー細胞を用いたＥＳ細胞の樹立は、以下のように行った。
【０２７４】
１．フィーダー細胞の培養液をＥＳ細胞用の培養液に交換した。
【０２７５】
２．免疫手術法もしくは機械的操作により胚盤胞から内部細胞塊を分離した。免疫手術法は、簡単に述べると、以下のとおりである。
【０２７６】
酵素処理などにより透明帯を取り除き、マウス表面抗原に反応する抗体溶液内でインキュベートした。次に補体溶液内でインキュベートすることによって最外層の細胞である栄養外胚葉が取り除かれ、内部細胞塊が分離された。
【０２７７】
ヒトＥＳ細胞の場合は、ヒトの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行った。カニクイサル（（株）ケアリーから入手）の場合は、サルの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行った。
【０２７８】
３．分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養した。
【０２７９】
４．翌日内部細胞塊がフィーダー細胞に接着していることを確認して、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
【０２８０】
５．５〜１０日後に内部細胞塊から増殖してくるＥＳ細胞様の細胞が認められるようになった。細胞塊が１００から２００μｍになったら継代を行った。
【０２８１】
６．培養液をのぞき細胞解離液を入れた。
【０２８２】
７．５から１０分間処理するとＥＳ細胞様細胞が培養皿よりはがれてくるので、これを細く引いたガラス管で拾い上げ数回出し入れすることで細胞塊を数個に分けた。
【０２８３】
８．培養液中で細胞解離液を洗浄して除き、新しいフィーダー上に細胞塊を移した。
【０２８４】
９．翌日、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
【０２８５】
１０．フィーダー上で個々の細胞塊が１００−２００μｍ程度に増殖したら、同様の操作で継代を行った。
【０２８６】
１１．細胞が十分増殖するようになれば（３５mm培養皿１枚に増えるぐらい）サルＥＳ細胞の通常の継代操作と同様に継代ができるようになった。この段階に達すれば以後安定した培養が可能であることが確認される。
【０２８７】
この実施例で樹立された細胞を図１および２に示す（図１はサル、図２はヒトを示す）。
【０２８８】
本実施例では、基本培地にDMEM/F12を使用したが、DMEMまたは他の基本培地でも問題なく使用できることが示される。
【０２８９】
本実施例では、補填成分としてＫＳＲを使用したが、ＫＳＲのかわりに通常使用されているウシ胎仔血清でもよいようである。ただし、ＫＳＲのほうがウシ胎仔血清よりも良い結果が出るようであった。
【０２９０】
さらに必要に応じて１〜２mg/ml のコラゲナーゼを添加した。コラゲナーゼの添加により、若干樹立しやすくなるようである。
【０２９１】
（実施例７：マーカーによる染色）
次に、実施例６で樹立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。胚性幹細胞を、４％ ＰＦＡで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．， １９８５．Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｐ．１−１３．）に従い免疫染色を行った。ブロッキングは０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ／ＰＢＳ／２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを用い室温で一時間、洗いは０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳを用い室温で５分を４回行った。一次抗体はSSEA-4、TRA-1-60のモノクローナル抗体をそれぞれ２００ μｇ／ｍｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を１／１００希釈したものを、二次抗体はＦＩＴＣ標識ｇｏａｔ 抗−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ）を１／２００希釈したものを使用した。二次抗体の反応後はｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）の順に染色を行いシグナルを検出した。
【０２９２】
ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の組織化学的染色は、以下のように行った。培養ディッシュをダルベッコのＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、４℃の９５％冷エタノールで３０分以上固定し、次いで４ ℃の無水エタノールで３０分以脱水した。固定液を除き、ディッシュを室温で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０〜９．５）にて５ 分間３ 回洗浄した後、１．５〜２ｍｌの染色液（ナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ−２１２５）２．５ｍｇ と、ファースト赤ＴＲ塩（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｇ［またはファースト紫Ｂ 塩６ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）、ファースト青ＢＢ塩１２．５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）］とを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液２５ｍｌに加え、遮光下で３ 〜５ 分間撹拌して溶解し、次いで濾過する）を各ディッシュに加え、遮光下で室温にてＡＬＰ を１５〜３０分間染色した。ＰＢＳ（−）で２ 回洗浄した後グリセロールを加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まったＥＧ細胞コロニーを検鏡した。
【０２９３】
結果を図３に示す。図３は、左からALP、SSEA-4、TRA-1-60を示す。
【０２９４】
図３からも明らかなように、本発明のフィーダー細胞を用いて樹立した幹細胞は通常どおり多分化能を保持していることが確認された。
【０２９５】
（実施例８：複数の細胞での再現性）
実施例６および７で行った実験を、カニクイザルES細胞、ヒトES細胞について行い、MEFフィーダー単独、STO株フィーダー単独、および混合フィーダー単独で試験した。
【０２９６】
その結果を以下の表に表す。
【０２９７】
この表からも明らかなように、それぞれのフィーダー細胞を単独で用いた場合は、２５％以下の幹細胞樹立効率しか達成できなかったのに対して、混合フィーダー細胞では、８０％以上で、場合によっては１００％の幹細胞樹立効率を達成することができるという優れた効果が実証された。ヒトＥＳ細胞は、ＭＥＦ単独でもＳＴＯ単独でも従来ほとんど樹立することができなかったことから、本発明の効率は驚くべきものと考えられる。
【０２９８】
（実施例９：神経細胞への分化）
本発明の上記実施例において調製した上記ＥＳ細胞を、３回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除いた。ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）を含むＥＳ細胞培地を用いて、ＰＡ６フィーダー細胞上で未分化細胞を８−１１日間培養した（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｎ ２８； ３１−４０、Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２７； ５０４−５１０．参照）。これにより、神経細胞に分化させた。
【０２９９】
その結果を図４に示す。
【０３００】
図４の結果からも明らかなように、本発明の方法で樹立したＥＳ細胞は、神経への分化能を保持していたことが明らかになった。
【０３０１】
（実施例１０：テラトーマ形成）
次に、本発明のＥＳ細胞のテラトーマ形成能を確認した。ＳＣＩＤマウス（日本クレア、東京）の皮下および腹腔内に本発明のＥＳ細胞を約１０７個移植し、１〜３ヶ月様子を見た。
【０３０２】
１〜３ヵ月後に得られるテラトーマを回収し、組織学的解析を行った。その一例を図５に示す。図５から明らかなように、本発明のＥＳ細胞は、外胚葉、内胚葉、中胚葉などに由来する種々の組織が観察された。したがって、本発明で樹立されたＥＳ細胞は、多分化能を保持していることが実証された。
【０３０３】
（実施例１１：造血系細胞への分化）
次に、本発明のＥＳ細胞の造血系細胞への分化を観察する。分化誘導培養液として、αＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｔ＃１１９００−０１６）に１０％ウシ胎仔血清を加え、５×１０−５Ｍ メルカプトエタノールを加えた培養液を使用した。
【０３０４】
まず、ＥＳ細胞は、中胚葉細胞へと分化させた。未分化ＥＳ細胞を、上述の分化誘導培養液で懸濁し、ＩＶ型コラーゲンコート６プレートに１×１０４／ウェルの密度で播種する。これを３７℃、５％ ＣＯ２で４日間培養する。
【０３０５】
培養上清を回収し、ウェルをＰＢＳ（−）で一回洗う。次に細胞剥離液（Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，＃１３１５０−０１６）を入れて１０分間静置（３７℃、５％ＣＯ２）し、細胞を剥離して回収する。細胞塊をほぐし、ほぐれないものはメッシュで除き、細胞数を計数する。１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【０３０６】
次に、１０ｍｌのＨＢＳＳ／ＢＳＡで細胞を懸濁し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除いた。１×１０７細胞あたり０．１ｍｌの正常マウス血清に懸濁し、１０分間静置した。適切な量のＥ−カドヘリン抗体および抗ＦＬＫ１抗体を加え２０分間氷水上に配置した。ＨＢＳＳ／ＢＳＡで２回細胞を洗浄した後、ＦＬＫ１＋Ｅ−カドヘリン−中胚葉細胞をＦＡＣＳによりソートする。
【０３０７】
ここで選択した中胚葉細胞を、分化誘導用培養液で懸濁し、ＩＶ型コラーゲンコートプレートに３×１０５の密度で播種する。培養液は１ウェルあたり３ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養する。
【０３０８】
細胞の回収およびブロッキングを行う。回収およびブロッキングは、上述のように行う。適切な量のＶＥ−カドヘリン抗体を加え、２０分間氷温に静置する。細胞をＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した後、ＶＥ−カドヘリン＋血管内皮細胞をＦＡＣＳによりソートして血管内皮細胞を調製する。
【０３０９】
このようにして、本発明のＥＳ細胞が造血系細胞へも分化することが実証される。
【０３１０】
（実施例１２：心筋への分化誘導）
上述の実施例で調製されるＥＳ細胞を、ＫＳＲを含む基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）中で浮遊培養することによって胚様体を形成させる。胚様体形成後、４〜７日経過後に胚様体を集めゼラチンコート下培養皿に播種する。ＫＳＲを含む基本培地中で１〜３週間培養することによって心筋細胞が分化する。
【０３１１】
（実施例１３：他の幹細胞（例えば組織幹細胞）での実験）
組織幹細胞（神経幹細胞、間葉系幹細胞など）を含む組織を取り出し、混合フィーダー細胞上で培養する。増殖する幹細胞の集団を分離し、本発明上記実施例５のように調製されるフィーダー細胞を用いて培養することによって安定して継代維持することができる細胞株が樹立される。
【０３１２】
（実施例１４：サルでの再生治療）
次に、カニクイサルから、ＥＳ細胞を採取し、実施例９と同様の処置を行い、神経細胞に分化させる。この神経細胞の移植物を神経疾患を有するカニクイサル被検体に移植すると、移植物が機能できることがわかる。
【０３１３】
（実施例１５：ヒトでの再生治療）
次に、ヒトから、実施例６に記載されるように、同意を得た患者からＥＳ細胞を採取し、実施例１４に記載するように実施例９と同様の手順に基づいて処理する。この神経細胞の移植物を、神経疾患を有するヒト被検体に予め同意を得た後に移植すると、移植物が機能できることがわかる。
【０３１４】
（実施例１６：フィーダー効果の検討）
次に、実施例１で調製した初代培養細胞と、実施例３〜４で調製した細胞株とを適宜混合して、フィーダー細胞調製物を調製し、フィーダー効果に差異が現れるかどうか検証する。
【０３１５】
使用する比率を以下に示す。
【０３１６】
上記条件のうち、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３１７】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３１８】
（実施例１７：他の幹細胞での検討）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてカニクイサルを用いて行う。
【０３１９】
プロトコールは、実施例１６に準じる。
【０３２０】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２１】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３２２】
（実施例１８：ヒト細胞での検証）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてヒトの細胞を用いて行う。
【０３２３】
プロトコールは、実施例１６に準じる。ただし、ヒトのＥＳ細胞は、上記のように、提供者の同意の下で行う。
【０３２４】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２５】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３２６】
（実施例１９：他のフィーダー細胞での検証）
次に、実施例１６と同様の実験を、幹細胞としてヒトの細胞を用いて行い、フィーダー細胞として、初代培養細胞として、マウス繊維芽初代培養細胞およびヒト表皮繊維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ＵＳＡ；Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＵＳＡ）を用い、細胞株として、ＳＬ１０およびＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ｎｕｍｂｅｒ ＣＣＬ−１７１）を用いて行う。
【０３２７】
プロトコールは、実施例１６に準じる。ただし、ヒトのＥＳ細胞は、上記のように、提供者の同意の下で行う。
【０３２８】
その結果、実施例１６と同様に、１０：９０〜９０：１０まででは、フィーダー細胞として単独で用いたときよりも改善された効果が示される。５：９５および９５：５では、単独使用と同じ程度の効果が観察される。特に、２０：８０〜８０：２０では、混入する分化細胞が３０％未満程度に低減され、ほぼ等量で観察すると、混入する分化細胞が１％程度に低減することが観察される。
【０３２９】
従って、好ましい比率としては、例えば、１：４〜４：１、あるいは１：３〜３：１を使用することが有利であり、より好ましくは、ほぼ等量（例えば、３：７〜７：３、６：４〜４：６など）を使用することが有利であり得る。
【０３３０】
従って、フィーダー細胞として使用される他の正常細胞および他の細胞株を用いても、同様に混合した場合のフィーダー効果が顕著に増強されることが認められる。
【０３３１】
（実施例２０：フィーダー細胞調製物のパッケージング）
実施例５などで調製したフィーダー細胞調製物が販売可能なルートでも活性を保持することができるかどうかを以下に確認する。
【０３３２】
フィーダー細胞として使用する調製物にマイトマイシンＣ処理を行う。マイトマイシンＣは、Ｓｉｇｍａから入手可能である。マイトマイシンＣ処理をすることによって、フィーダー細胞が増殖しなくなり、長時間の保存が可能で、販売することが可能となる。このようなマイトマイシンＣ処理した細胞は、凍結保存して販売することができる。このような凍結保存は、従来の初代培養細胞で行われている方法と同じものを利用でき、例えば、そのような方法は、「ＥＳ細胞の遺伝子操作」分子生物学プロトコール（南江堂）ｐ４７１−４７９に記載されている（このほかに、非特許文献１を参照。）。
【０３３３】
具体的には以下のように処理することが可能である。
【０３３４】
本実施例において調製されるフィーダー細胞の販売時のパッケージは、例えば、凍結チューブの形態で提供する。その処理は以下の通りである。
【０３３５】
マイトマイシンＣ処理までは通常の調製時（実施例２および３を参照）と同様で、その後、以下の操作を行う。
【０３３６】
マイトマイシンＣ処理した培養皿から培地を除きＰＢＳで３回洗い、培地を加え、数時間から一晩培養する。
【０３３７】
培地を除きＰＢＳで３回洗い、トリプシン処理により細胞を解離し、培地を加え細胞をよく懸濁した後、遠心して上清を除く。
【０３３８】
細胞を細胞凍結培地（９０％ＦＣＳ＋１０％ＤＭＳＯ）にたとえば５×１０６／ｍｌに懸濁する。
【０３３９】
細胞懸濁液をクライオチューブ（ＮＵＮＣ ３７７２２４）に１ｍｌいれ、しっかりとふたをする。
【０３４０】
凍結チューブを細胞凍結用容器（Ｎｕｌｇｅｎｅ ５１００）へ入れ、容器を−８０℃フリーザーへ入れる。
【０３４１】
４時間から一晩したら、凍結チューブを液体窒素容器に移す。
【０３４２】
このように調製した販売用フィーダー細胞調製物は、好ましくは凍結状態で、販売先で提供される。提供先では、通常の凍結細胞と同様に解凍作業を行い、フィーダー細胞として使用することができる。
【０３４３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３４４】
本発明は、再生医療において、多大な有用性を有する。好ましい実施形態では特に、従来達成不可能であった高い樹立効率で幹細胞（特に、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞）を樹立することができたことから、その有用性は高い。したがって、本発明は、再生医療およびその治療用医薬などを製造する業において利用可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物。
【請求項２】
前記正常細胞は、初代培養細胞を含む、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項３】
前記正常細胞は、不死化していない細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項４】
前記正常細胞は、繊維芽細胞を含む、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項５】
前記正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項６】
前記正常細胞は、マウス由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項７】
前記正常細胞は、胎児由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項８】
前記正常細胞は、継代数が５回以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項９】
前記正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１０】
前記正常細胞は、継代数が５回以下の初代培養細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１１】
前記細胞株は、不死化している、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１２】
前記細胞株は、繊維芽細胞株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１３】
前記細胞株は、継代された期間が２ヶ月以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１４】
前記細胞株は、継代された期間が１ヶ月以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１５】
前記細胞株は、マウス由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１６】
前記細胞株は、胎児由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１７】
前記細胞株は、ＳＴＯ株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１８】
前記細胞株は、ｎｅｏ抵抗性である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１９】
前記細胞株は、ＳＬ１０株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２０】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、約１：１０〜１０：１である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２１】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、約１：３〜３：１である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２２】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、ほぼ等量で存在する、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２３】
前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２４】
前記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２５】
正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、
幹細胞を調製するための方法。
【請求項２６】
前記フィーダー細胞調製物は、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のフィーダー細胞調製物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記フィーダー細胞が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィーダー細胞調製物は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記フィーダー細胞調製物は、混合して播種された後５日以内に使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法は、さらに、前記幹細胞を継代する工程を包含し、該継代工程において、コラゲナーゼが使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２５に記載の方法によって調製される、幹細胞調製物。
【請求項３３】
請求項２５に記載の方法によって調製される、胚性幹細胞調製物。
【請求項３４】
請求項２５に記載の方法によって調製される、霊長類胚性幹細胞調製物。
【請求項３５】
請求項２５に記載の方法によって調製される、ヒト胚性幹細胞調製物。
【請求項３６】
臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法であって：
Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該幹細胞を、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物とともに培養する工程；および
Ｃ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記所望の臓器、組織または細胞は、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛および皮膚からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記所望の臓器、組織または細胞と前記フィーダー細胞調製物とは、同じ種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、前記フィーダー細胞調製物はマウス由来である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養は、エキソビボで行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記分化は、ＤＮＡ脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、核内レセプターリガンド、細胞増殖因子、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレンおよびセレンからなる群より選択される少なくとも１つの分化因子を含む培養液において行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３６に記載の方法によって調製される、臓器、組織または細胞。
【請求項４５】
臓器、組織または細胞を再生するためのシステムであって：
Ａ）容器；および
Ｂ）該容器上に播種される、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含むフィーダー細胞調製物、
を備える、システム。
【請求項４６】
臓器、組織または細胞を再生するための方法であって：
Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該幹細胞を、請求項１に記載されるフィーダー細胞調製物とともに培養する工程；および
Ｃ）該培養された該幹細胞を被検体の処置されるべき部位に移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
Ｄ）前記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
フィーダー細胞調製物としての、正常細胞と、細胞株とを含む細胞調製物の使用。
【請求項４９】
前記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、請求項１に記載されるフィーダー細胞調製物の使用。
【請求項５２】
前記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている、請求項５１に記載の使用。
【請求項１】
正常細胞と、細胞株とを含む、幹細胞を調製するためのフィーダー細胞調製物。
【請求項２】
前記正常細胞は、初代培養細胞を含む、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項３】
前記正常細胞は、不死化していない細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項４】
前記正常細胞は、繊維芽細胞を含む、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項５】
前記正常細胞は、繊維芽細胞初代培養細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項６】
前記正常細胞は、マウス由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項７】
前記正常細胞は、胎児由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項８】
前記正常細胞は、継代数が５回以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項９】
前記正常細胞は、マウス１１〜１６日齢胎児から酵素処理により得られた繊維芽細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１０】
前記正常細胞は、継代数が５回以下の初代培養細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１１】
前記細胞株は、不死化している、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１２】
前記細胞株は、繊維芽細胞株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１３】
前記細胞株は、継代された期間が２ヶ月以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１４】
前記細胞株は、継代された期間が１ヶ月以下である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１５】
前記細胞株は、マウス由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１６】
前記細胞株は、胎児由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１７】
前記細胞株は、ＳＴＯ株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１８】
前記細胞株は、ｎｅｏ抵抗性である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項１９】
前記細胞株は、ＳＬ１０株である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２０】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、約１：１０〜１０：１である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２１】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、約１：３〜３：１である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２２】
前記正常細胞と、前記細胞株とは、ほぼ等量で存在する、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２３】
前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２４】
前記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物。
【請求項２５】
正常細胞と、細胞株とを含むフィーダー細胞調製物の上で、幹細胞を培養する工程を包含する、
幹細胞を調製するための方法。
【請求項２６】
前記フィーダー細胞調製物は、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のフィーダー細胞調製物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記フィーダー細胞が配置される培養ディッシュはゼラチンコーティングされている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィーダー細胞調製物は、約１×１０４細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２で播種される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記フィーダー細胞調製物は、混合して播種された後５日以内に使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）を含む培地中で培養される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法は、さらに、前記幹細胞を継代する工程を包含し、該継代工程において、コラゲナーゼが使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２５に記載の方法によって調製される、幹細胞調製物。
【請求項３３】
請求項２５に記載の方法によって調製される、胚性幹細胞調製物。
【請求項３４】
請求項２５に記載の方法によって調製される、霊長類胚性幹細胞調製物。
【請求項３５】
請求項２５に記載の方法によって調製される、ヒト胚性幹細胞調製物。
【請求項３６】
臓器、組織または細胞を再生するための移植物を調製するための方法であって：
Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該幹細胞を、請求項１に記載のフィーダー細胞調製物とともに培養する工程；および
Ｃ）該幹細胞を所望の臓器、組織または細胞を再生するための移植物へと分化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記所望の臓器、組織または細胞は、神経、血球、骨、軟骨、心臓、心膜、血管、筋肉、眼、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、気管、毛および皮膚からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記所望の臓器、組織または細胞と前記フィーダー細胞調製物とは、同じ種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記所望の臓器、組織または細胞は霊長類のものであり、前記フィーダー細胞調製物はマウス由来である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養は、エキソビボで行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞は、被検体から摘出されてすぐのものであるか、または凍結保存されたものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養は、３７℃、飽和湿度中で５％ＣＯ２下で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記分化は、ＤＮＡ脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、核内レセプターリガンド、細胞増殖因子、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレンおよびセレンからなる群より選択される少なくとも１つの分化因子を含む培養液において行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３６に記載の方法によって調製される、臓器、組織または細胞。
【請求項４５】
臓器、組織または細胞を再生するためのシステムであって：
Ａ）容器；および
Ｂ）該容器上に播種される、繊維芽細胞初代培養細胞と、繊維芽細胞株とを含むフィーダー細胞調製物、
を備える、システム。
【請求項４６】
臓器、組織または細胞を再生するための方法であって：
Ａ）所望の臓器、組織または細胞に分化し得る幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該幹細胞を、請求項１に記載されるフィーダー細胞調製物とともに培養する工程；および
Ｃ）該培養された該幹細胞を被検体の処置されるべき部位に移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
Ｄ）前記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
フィーダー細胞調製物としての、正常細胞と、細胞株とを含む細胞調製物の使用。
【請求項４９】
前記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
幹細胞の使用が適切である疾患、障害または状態の処置または予防のための、幹細胞を含む医薬の製造における、請求項１に記載されるフィーダー細胞調製物の使用。
【請求項５２】
前記フィーダー細胞調製物は、増殖しないように処理されている、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記フィーダー細胞調製物は、マイトマイシンＣにより処理されている、請求項５１に記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０３６１
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【発行日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５００６（Ｐ２００５−５１５００６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５８５４
【国際出願日】平成１６年１０月２６日（２００４．１０．２６）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【発行日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５８５４
【国際出願日】平成１６年１０月２６日（２００４．１０．２６）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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