微生物の処理方法
【課題】微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理における従来の欠点を解決することができる微生物の処理方法を提供する。
【解決手段】微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、目的処理工程を行う前に、微生物の試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行う。
【解決手段】微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、目的処理工程を行う前に、微生物の試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の処理方法に係り、特に微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う前の前処理技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物に関する処理の中には、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理があり、従来は以下のように行われていた。
【０００３】
〈微生物数のカウント処理〉
微生物数をカウント処理する場合には、計数板を用いて微生物試料液を観測することが一般的に行われている(非特許文献１)。しかし、この方法は、微生物が一つ一つばらばらになっている状態であれば問題ないが、微生物が凝集している場合には、微生物が重なり合うことによって、容易には数をカウントできないことが多い。また、凝集していることにより複数の微生物から構成された試料液の場合には個別の種ごとに微生物数をカウントすることもできなかった。
【０００４】
そこで、試料液を超音波処理することによって、微生物の凝集体をばらばらにする方法が採用されている（例えば特許文献１）。しかし、この方法は、核酸を切断する際に、超音波処理を行うことでもわかるとおり、超音波条件によっては、微生物の細胞壁を傷つけてしまったりする等により、微生物そのものを死滅してしまう問題点があった。また、微生物の種類によって細胞壁の固さが異なり、微生物の種類に合わせて細胞壁を傷つけないための超音波条件を見つけることは、作業者にとって極めて煩雑で非能率である。
【０００５】
別の微生物数のカウント方法として、微生物の濁度から微生物濃度を測定することも可能であるが、予め微生物数と濁度との関係を求めておく必要がある。したがって、この場合にも、微生物数をカウントすることが必要であることから、凝集した微生物を忍耐強くカウントするしか方法はなかった。さらに、凝集した微生物を濁度で計数する場合には、光の乱反射が起こりやすく、積分球のような特殊な装置が必要であった。
【０００６】
また、微生物、特に、クロロフィルを持つ光合成微生物の場合、クロロフィルの定量から微生物数を測定することも行われてきた。しかし、この方法でも、予めクロロフィル量と微生物数の数との相関を予め求めておく必要性があり、その困難さは、前記と同様である。また、微生物中のクロロフィル量は、微生物の培養条件や、微生物の増殖ステージによって異なることがあり、そのたびに、クロロフィル量と微生物数との相関を求める必要性があり煩雑であった。
【０００７】
更に別の微生物数のカウント方法として、フローサイトメトリーを用いる方法もあるが、この装置の場合、1つの微生物の大きさとほぼ同程度の直径を持つ細管内を通過させる必要性があることや、いくつかの微生物が集合した集合物が細管を通過した場合、微生物数は1つとして認識してしまう点から、微生物の集合物に対して使用することは困難であった。
【０００８】
〈微生物の増殖処理〉
大腸菌などの原核生物は、数十分で1回分裂することから非常に増殖速度が速いが、真核生物、例えば、藻類などは、一回分裂する時間が非常に長い。例えば、バイオマス燃料として注目されているオイルを蓄積する藻類の１種で地球温暖化を解決する有力な微生物と考えられているBotryococcus Brauniiは、１回の分裂に要する日数が数日から数週間と非常に増殖速度が遅いことで知られている。このことが原因のひとつとなって、Botryococcus Brauniiを用いたオイル生産は、商業レベルの生産に至っていないのが実情である。
【０００９】
従来は、微生物の培養条件を工夫することで、その増殖速度を向上させることが検討され、増殖速度を向上させる方法が種々報告されてきたが、現状での増殖速度は満足できるものではない。
【００１０】
〈微生物の純菌化処理〉
従来の微生物を純菌化する方法は、採取してきた微生物を含む溶液を希釈し、寒天培地上に塗布することによって行われてきた。しかし、一般的には、一回の純菌化工程で、単菌が得られることは稀であり、通常は数回の純菌化工程を繰り返すことによって、単菌を得ている。凝集体を形成する微生物や一般的に複数の微生物から構成されているバイオフィルム中の微生物などは、希釈する程度では数種類の微生物が混合された状態で純菌化を行うことになる。これにより、純菌化工程の繰り返し回数も極めて多くなってしまい、結果的に純菌化が非常に難しくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】藻類研究法、西澤一俊、千原光雄編、共立出版、1979年、p275
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平７−２９８８６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、従来の微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理にはそれぞれ欠点があり、いずれも満足できるものではなかった。
【００１４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理における従来の欠点を解決することができる微生物の処理方法を提供することを目的とする。
【００１５】
即ち、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントする処理方法を提供することにある。
【００１６】
また、微生物の増殖処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる処理方法を提供することにある。
【００１７】
また、微生物の純菌化処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化工程の繰り返し数を従来よりも顕著に低減でき、純菌化時間を大幅に短縮できる処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の請求項１は前記目的を達成するために、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、前記目的処理工程を行う前に、前記微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行うことを特徴とする微生物の処理方法を提供する。
【００１９】
本発明の微生物の処理方法によれば、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の前処理工程として、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させるようにした。
【００２０】
本発明では、従来の超音波振動のように微生物自体に直接振動を当てるのではなく、密閉容器を高速振幅運動させて微生物の凝集体の塊を試料液中に分散させることで、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができる。
【００２１】
かかる凝集体の分散効率の観点から、密閉容器に充填する試料液の所定量は、密閉容器の内容積に対する試料液の容積比率が１５〜７５容積％の範囲であることが好ましい。
【００２２】
これは、微生物を含む試料液を密閉容器に充填したときに、密閉容器内に一定以上の容積のヘッドスペースを形成しないと、密閉容器を高速振幅運動したときに微生物凝集体（以下単に、凝集体という場合もある）の分散効率が顕著に低下するためである。また、密閉容器内の試料液が少な過ぎると、高速振幅運動したときに微生物凝集体の分散効率が顕著に低下するためである。これは、試料液の重量が軽過ぎて高速振幅運動時における密閉容器内壁への衝突力が小さいため、凝集体を分散させるに足るエネルギーを十分に発揮できないためと推察される。
【００２３】
また、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができる高速振幅運動としては、密閉容器を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることが好ましい。この振幅数と振幅時間との組み合わせであれば、各種の微生物について、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるからである。
【００２４】
これにより、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００２５】
また、微生物の増殖処理では、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、個々の微生物が栄養源等の増殖に必要な要素に接触し易くなり、要素を十分に取り込むことができる。これにより、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【００２６】
また、微生物の純菌化処理では、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化する微生物を雑菌と区別させた状態で取り出し易くなる。これにより、純菌化工程の繰り返し回数を従来よりも顕著に低減できるので、純菌化時間（工程数）を大幅に短縮できる。
【００２７】
これらの場合、凝集体の分散効果が所望程度まで達しない場合に、微生物の破砕を抑制可能な範囲で樹脂粒子等のビーズを密閉容器内に充填することは可能であるが、基本的にはビーズは充填せずに振幅数と振幅時間との組み合わせで調整することが良い。
【００２８】
本発明の微生物の処理方法においては、前記密閉容器の振幅形態は、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であることが好ましい。この場合、上下方向、左右方向、前後方向の２形態以上を組み合わせた高速振幅運動が一層好ましい。
【００２９】
本発明の微生物の処理方法においては、前処理工程では、前記試料液が充填された密閉容器内に消泡剤を添加することが好ましい。
【００３０】
試料液中の微生物が高濃度の場合や、種々の代謝物を菌体外に放出する微生物の場合には、前処理工程によって密閉容器内に気泡が発生し、この気泡により微生物凝集体の分散効率が低下するからである。
【００３１】
本発明の微生物の処理方法においては、前記前処理工程を複数回に分けて行うことが好ましい。これは、前処理工程の高速振幅運動により、試料液が温度上昇して微生物が死滅する等の好ましくない結果になることを防止するためである。特に、熱に弱い微生物の前処理工程では重要になる。
【００３２】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物は凝集性を有する微生物であることが好ましい。
【００３３】
これは、凝集性を有する微生物の処理において、本発明が一層有効だからであり、例えば凝集性を有する微生物として付着性微生物を挙げることができる。
【００３４】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物は複数種の微生物から構成された集合体も使用可能である。
【００３５】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物がバイオマスを産生する微生物であることが好ましい。
【００３６】
本発明の微生物の処理方法は、バイオマスを産生する微生物、例えばオイルを含有するBotryococcus属を利用したバイオマス燃料等の工業化のための技術として極めて有効だからである。
【００３７】
本発明の微生物の処理方法においては、前記目的処理工程が前記微生物の増殖処理の場合には、前記前処理工程と前記目的処理工程とを複数回繰り返すことが好ましい。
【００３８】
これは、増殖処理工程で微生物が再び凝集する傾向にあるため、前処理工程と増殖処理工程とを繰り返すことにより、増殖速度を一層向上できるからである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の微生物の処理方法によれば、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の従来の欠点を解決することができる。
【００４０】
即ち、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００４１】
また、微生物の増殖処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【００４２】
また、微生物の純菌化処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化工程の繰り返し数を従来よりも顕著に低減でき、純菌化時間（工程数）を大幅に短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の微生物の処理方法で使用する前処理装置の一例を示した外観図
【図２】図１の前処理装置の容器ホルダーと駆動部とを示した斜視図
【図３】前処理装置に使用する密閉容器に微生物を充填する様子を示した斜視図
【図４】前処理工程における密閉容器の各種の振幅形態を示した説明図
【図５】実施例Ａにおいて前処理工程を行う前の微細藻類の顕微鏡写真図
【図６】実施例Ａにおいて前処理工程を行った後の微細藻類の顕微鏡写真図
【図７】実施例Ａにおいて従来の超音波照射を行った後の微細藻類の顕微鏡写真図
【図８】実施例Ａにおいて従来の超音波照射を行った後の微細藻類の細胞破壊を示す顕微鏡写真図
【図９】実施例Ａにおいて密閉容器に微生物と一緒にビーズを入れて高速振幅運動させた後の微細藻類の細胞破壊を示す顕微鏡写真図
【図１０】実施例Ｂにおいて密閉容器の内容積に対する試料液の容積比率と微生物凝集体の分散効果との関係を説明する説明図
【図１１】実施例Ｃにおいて前処理工程を行う前のBotryocuccosの顕微鏡写真図
【図１２】実施例Ｃにおいて前処理工程における密閉容器の振動数と分散効果との関係を説明する説明図
【図１３】実施例Ｃにおいて前処理工程での密閉容器の振幅数×振幅時間と分散効果との関係を説明する説明図
【図１４】実施例Ｄにおいて前処理工程の有り無しが微細藻類の増殖に及ぼす影響を説明する説明図
【図１５】実施例Ｅにおいて前処理工程における密閉容器の振幅数×振幅時間と微細藻類の増殖効果との関係を説明する説明図
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明の微生物の処理方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
【００４５】
本発明は、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う目的処理工程と、該目的処理工程を行う前に、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程と、で構成される。
【００４６】
［微生物］
本発明で言うところの微生物とは、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な生物を指し、原核生物、真核生物のいずれで良い。原核生物とは、細胞核を持たない生物のことを言い、真性細菌と古細菌の2つの生物を含めることができるものとする。真核生物としては、藻類、原生生物、菌類、粘菌やワムシなどの小型の動物をも含む。
【００４７】
また、微生物の中でも、個々の微生物がお互いに集合することによって、人の肉眼でその集合体が識別可能になる場合もある。しかし、その様な場合でも、集合体構造を崩して個々の微生物にすることによって、人の肉眼では識別することができない場合は、本発明では微生物と定義する。また、個々の微生物の状態にはあるが、菌体数（例えば微細藻類の藻体数）が増加することによって、色の変化でその存在を知ることが可能となるものもある。しかし、そのような場合でも、個々の微生物を人の肉眼によって観察することはできないことから、本発明で言うところの微生物に含むものとする。
【００４８】
本発明における藻類とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上で生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものを言い、原核生物であるシアノバクテリアから、真核生物で単細胞生物、多細胞生物の海藻類など、異なるグループの総称を言う。
【００４９】
本発明における微細藻類とは、本発明で定義した上記微生物の中から、本発明で定義した上記藻類を選択した生物群のことを言う。例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などから構成されている生物のことを言う。
【００５０】
本発明で使用される微生物としては、バイオマスを産生する微生物であることが一層好ましい。ここでバイオマスとは、生物由来の資源のことを言い、化石資源を除いた、再生可能な生物由来の有機性資源のことであり、生物由来の物質、食料や資材、燃料、資源などのことを言う。バイオマスには、生物が産生する、多糖、オイル(炭化水素化合物、トリグリセリドなど)を含む。特に、バイオマスを産生する微生物としては、オイルを含有するBotryococcus属があり、本発明はBotryococcus属を利用したバイオマス燃料等の工業化のための技術として特に有効である。
【００５１】
［前処理工程］
本発明における前処理工程とは、微生物が含まれている試料液を密閉容器内に入れ、高速振幅運動を行うことによって、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体をバラバラにして個々（単一）の微生物に分散させる工程を言う。
【００５２】
図１〜図３は前処理工程を行う前処理装置の一例である。
【００５３】
図１に示すように、前処理装置１０は、装置本体１２と蓋部材１４とで構成される。図２に示すように、装置本体１２の内部には、高速振幅運動を行う円板状の密閉容器ホルダー１６が配置され、駆動軸１８を介して振幅駆動部２０に支持される。密閉容器ホルダー１６の周縁部には、蓋２２Ａ付き密閉容器２２（図３参照）を着脱自在に保持する複数のチャック部２４が設けられる。
【００５４】
図３に示すように、蓋１２Ａ付き密閉容器２２は、試験管形状に形成され、微生物２４及びその微生物を分散させるための分散液２５（例えば純水や培養液）で構成される試料液２６が充填された後、蓋２２Ａにより密閉できるように構成されている。
【００５５】
また、図１に示すように、装置本体１２の正面には、ＯＮ−ＯＦＦスイッチ２８、密閉容器ホルダー１６を介して密閉容器２２を高速振幅運動する際の振幅数を設定する振幅数ダイヤル３０及び振幅時間を設定するタイマーダイヤル３２が設けられる。更には密閉容器２２を高速振幅運動させる振幅方向の形態設定を行う切り換えスイッチ３４等が設けられる。
【００５６】
図４に示すように、密閉容器２２を高速振幅運動させる振幅形態としては、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であるが、例えば図４（Ａ）に示すように、上下方向と左右方向との組み合わせ、図４（Ｂ）に示すように、左右方向と前後方向との組み合わせを採用することが好ましい。また、上下しながら８の字を描くように密閉容器２２が振幅する特殊な振幅形態を一層好適に採用することができる。
【００５７】
このように、本発明における前処理工程は、従来のように超音波振動で微生物自体を振動させるのではなく、微生物が入った密閉容器２２を高速振幅運動させて密閉容器２２内の微生物の凝集体の塊を試料液中に分散させる。これにより、微生物の破砕を抑制しつつ微生物の凝集体を効果的に分散させることができる。
【００５８】
本発明で言うところの微生物の破砕とは、微生物の外側の膜が破壊され、微生物内部の物質が微生物外に溶出してくる現象のことを言う。この様な破砕が発生すると、後記する微生物数のカウント処理において正確な数を数えることができなくなる。また、破砕により微生物の培養に悪影響が生じる等の不都合が起こる。
【００５９】
しかし、本発明の前処理工程によっても微生物の破砕を完全に防ぐことは難しく、本発明において「破砕を抑制する」とは微生物の７０％以上が少なくとも破砕されないことを言う。破砕の抑制レベルは８０％以上であることが一層好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。
【００６０】
また、密閉容器内に分散液を入れることにより、分散液を入れない状態で密閉容器２２を高速振幅運動させる場合に比べて、微生物の分散効率が向上するのみならず微生物の破砕を確実に抑制できる。また、分散液を密閉容器２２に入れることで微生物の温度上昇による微生物の失活や死滅を防止できる。微生物が失活したり死滅したりすると、後記する目的処理工程において細胞数をカウントすることができなくなったり、以後の増殖処理に対して悪影響を及ぼす。
【００６１】
前処理工程において微生物の破砕を抑制し且つ分散効率を向上するための密閉容器２２の高速振幅運動の好ましい条件は、振幅数と振幅時間との組み合わせで決まる。振幅数と振幅時間との関係としては、振幅数が高目（例えば５０００ｒｐｍ）の場合には、短時間（例えば５秒）の振幅時間で十分な分散効率を得ることができる。このときの振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は１００００になる。しかし、振幅数が低目（例えば３５００ｒｐｍ）の場合には、振幅時間を長め（例えば２０秒以上）にすることが好ましい。このときの振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は７００００になる。
【００６２】
一方、振幅数が高過ぎる（例えば１００００ｒｐｍ超え）と、前処理装置１０からの発熱が大きく、発熱による温度上昇は、耐熱性菌を除く一般的な微生物の活性にとっては好ましくない。また、振幅時間としては微生物の破砕を考慮すると５分（３００秒）以内であることが好ましく、より好ましくは１分（６０秒）以内である。そして、振幅数１００００ｒｐｍで振幅時間が３００秒での振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は３００００００になる。
【００６３】
これらのことから、高速振幅運動としては、密閉容器２２を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることが好ましい。より好ましい振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）としては、後記する実施例の結果から７００００〜３３００００の範囲である。この振幅数と振幅時間との組み合わせであれば、各種の微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるからである。
【００６４】
また、密閉容器２２の内容積に対する試料液２６の容積比率が１５〜７５容積％になるように充填し、試料液２６の上方にヘッドスペース３６（図４参照）が形成されるようにすることが好ましい。これは、試料液２６で密閉容器２２を完全に満たした場合には、高速振幅運動による前処理において、凝集体の分散効率が大幅に低下するためである。より好ましい容積比率の範囲は２０〜６０容積％の範囲である。また、容積比率が小さ過ぎても分散効率が大幅に低下し、容積比率の下限は１５容積％であることが好ましい。
【００６５】
上述した前処理装置１０の高速振幅運動を市販の装置で代用する場合には、株式会社トミー精工(東京都)のビーズ式細胞破砕装置、MS-１００あるいはBioSpec Product社のビーズ式ホモジナイザーBSP-3110BXを使用することが可能である。
【００６６】
しかし、これらの装置は、元々、微生物を破砕し、微生物から核酸を抽出したりするための装置であり、微生物と一緒に充填したビーズを微生物に衝突させることで細胞を破壊する。したがって、そのまま使用すると、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させる本発明における前処理工程を達成できない。その場合、密閉容器２２に充填するビーズの粒径や添加量と、高速振幅運動の条件（振幅数、振幅時間）と、微生物の破砕状態と、を予備試験等により把握しておくことが必要である。したがって、本発明における前処理工程では、基本的にビーズは密閉容器２２に充填しないで使用する。
【００６７】
但し、微生物によっては凝集体の凝集力が強く、分散効果を十分に達成できない場合には、微生物の破砕を抑制可能な範囲で樹脂粒子等のビーズを密閉容器２２内に充填することは可能である。しかし、前述の通り、基本的にはビーズは充填せずに高速振幅運動の振幅数と振幅時間とで調整することが良い。
【００６８】
さらに、前処理工程を行う際に、１回の前処理工程を行うのではなく、複数回の前処理工程を行うことが好ましい。これは、前処理工程を複数回に分けることによって、密閉容器２２中の試料液２６の温度上昇を防ぐためである。温度上昇は、微生物を死滅させる等、好ましくない影響を与える。
【００６９】
本発明では、前処理工程を行う際に、微生物の溶液に消泡剤を添加することが好ましい。これは、試料液２６中の微生物が高濃度の場合や、種々の代謝物を菌体外に放出する微生物の場合には、前処理工程によって密閉容器２２内に気泡が発生する場合がある。密閉容器２２内に気泡が発生すると、微生物凝集体の分散効率が著しく低下する。この様な場合に、消泡剤を試料液２６に添加してから前処理工程を行うことが好ましい。
【００７０】
なお、前処理工程を微生物のカウント処理、増殖処理、純菌化処理の前処理として使用する際には、前処理工程で分散させた微生物を直ちに使用することが好ましい。これは、微生物が再凝集する可能性があるからである。もし、再凝集した場合には、上記した前処理装置１０を使用して再分散させることができる。
【００７１】
［目的処理工程（微生物数のカウント処理）］
微生物数のカウント処理とは、微生物の数を数えることを言う。カウントする方法は、特に、限定されず、前処理工程によって得られた試料液２６を血球計数盤上で、顕微鏡を用いて数を数えることも可能であるし、フローサイトメーターを用いて微生物数を自動的に数えることも可能である。また、光学顕微鏡を用いて微生物を直接カウントする場合には、微生物を染色することで、より明瞭に微生物数をカウントすることができる。更に、明視野の光学顕微鏡の代わりに、偏光や微分緩衝顕微鏡を用いた方法も使用することもできる。即ち、本発明における前処理工程を行った試料液２６は、微生物の形状を観察する手段を用いる限りにおいて、いかなる方法を用いてもかまわない。
【００７２】
また、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておけば、吸光光度計を用いて、その吸光度から微生物数を算出することも可能である。また、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておけば、濁度計を用いて、その濁度から細胞数を算出することも可能である。さらに、予め蛍光光度計によって、クロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておけば、クロロフィルの蛍光量から細胞数を算出することも可能である。
【００７３】
吸光度、濁度、及びクロロフィルの蛍光量のいずれを利用して微生物のカウントを行う場合にも、予備試験を行って微生物との相関関係を予め求めておく必要があり、その予備試験に本発明における前処理工程を好適に使用することができる。
【００７４】
また、本発明における前処理工程を行うことにより、微生物数のカウントに、画像認識ソフトウェアを使用することが可能となる。凝集した微生物に対して画像認識ソフトを用いた場合、各微生物の認識能力は人間の目と比較して極めて精度が悪い。したがって、従来は使用に耐えるものではないのが実情であった。
【００７５】
しかし、本発明における前処理工程を行うことによって、凝集した微生物群を個別の微生物に分離することができることから、画像認識ソフトウェアの認識能力を最大限に生かすことができる。しかも、人間自身が手動で細胞数を数えるのではなく、自動で数えることができることから、実験者の負担を大幅に減らすことができるとともに、細胞の大きさの分布などの情報も同時に得ることが可能となる。
【００７６】
本発明で言うところの凝集とは、複数個の微生物が集合した構造体のことをいい、その微生物の構造体は、複数の種類から構成されていても、単一の種類から構成されていてもよい。さらに、微生物同士が直接隣接していてもよいし、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して凝集していてもよい。また、群体と言われているものも、本発明では、凝集のことを意味するものとする。
【００７７】
したがって、従来の微生物数のカウント方法では、凝集した微生物の数を数えることは非常に困難であったが、本発明を用いることで、凝集した微生物がバラバラの状態、もしくは凝集物が小さくなっていることから、容易に微生物数をカウントすることができるようになった。例えば、藻体内外にオイルを蓄積することで知られているBotryococcus Brauniiは、凝集したコロニーを形成することで知られているが、従来は、クロロフィルに由来する吸収を用いる方法や重量測定が行われてきた。しかし、本発明では、前処理工程を行うだけで、容易にその数をカウントすることができる。また従来の凝集体の分散のように、超音波による微生物の分散を行った場合には、微生物中の核酸などの構造物への影響から、微生物が破裂するなどの悪影響があった。しかし、本発明における前処理工程ではそのようなことはない。
【００７８】
したがって、微生物数のカウント処理を行う前に前処理工程を行えば、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００７９】
［目的処理工程（微生物の増殖処理）］
本発明で言うところの微生物の増殖処理とは、微生物を培養する際に、ある一定時間が経過した時に培養液中に存在している微生物の単位培養液体積中の微生物の数のことを言う。培養開始からある一定時間が経過するまでの時間から増殖速度を算出することができるが、本発明による前処理工程の効果を、増殖速度の向上という表現で言い換えることも可能な場合がある。
【００８０】
また、本発明における前処理工程を行った微生物を用いて増殖を行った場合、分散した微生物の増殖が進展するに伴って、再び凝集体を形成する様になる場合もある。そのような場合に、再び凝集体を前処理工程で処理して、再び増殖を行うことが好ましい。この前処理工程と増殖工程を何度繰り返してもかまわない。
【００８１】
したがって、本発明における前処理工程を行うことによって、増殖工程での増殖速度を向上できるので、微生物の濃度を増加させることも可能となる。この前処理工程の効果は、凝集性の高い微生物ほど効果的である。即ち、微生物の凝集体のうち培地と接触している凝集体表面に存在する微生物は栄養分が豊富であり、光合成微生物の場合には、豊富に光量を得ることが可能である。さらに、増殖するための空間も存在することから、活発に増殖することができると考えられる。一方、凝集体内部に存在する微生物は、培地との間に多数の微生物が存在することから、栄養分の拡散性が悪い。もしくは、より培地に近い微生物によって栄養分を消費されることによって、栄養分を獲得する機会が少なくなり栄養分を得にくくなる。さらに、増殖を行えるだけの空間も少なく、光合成微生物の場合には、光も届きにくい。このため、凝集体内部の増殖は抑えられてしまうという問題がある。
【００８２】
そこで、本発明における前処理工程を行うことによって、微生物の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、より小さな凝集体もしくは単体の微生物にすることができるので、前記の問題点を回避することができる。その結果、微生物の増殖速度を向上させることが可能となる。
【００８３】
本発明における前処理工程を用いることによって、バイオマスを産生する微細藻類の培養液中での濃度を向上させることも可能である。バイオマスを産生する微細藻類、例えば、重油相当のオイルを微生物体内外に蓄積することで知られているBotryococcus Brauniiの場合には、その増殖速度が数日から数週間と非常に長い。このことが原因で、世界的には非常に注目度が高いものの商業レベルでの生産には至っていない。
【００８４】
従来、その増殖速度を向上させるために、光量を最適化したり、光の照射間隔を最適なものにしたり、培地の組成を詳細に検討したりすることで、増殖速度を向上させることが検討されてきたが、まだ現状では不十分である。これは、Botryococcus Brauniiは、細胞間マトリックスによって凝集体を形成することが知られており、前記に示したことが原因で、増殖速度が遅くなっていると考えられる。
【００８５】
そこで、本発明における前処理工程を用いれば、微生物の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、凝集体をバラバラの状態にし、凝集性に起因する前記問題点をなくすことができるので、より多くの微生物固体を増殖に関与させることができる。これにより、Botryococcus Brauniiの増殖速度を顕著に向上できるので、商業レベルでの生産が可能になるかもしれない。
【００８６】
［目的処理工程（微生物の純菌化処理）］
本発明で言うところの、純菌化処理とは、複数種の微生物集合体から単一種の微生物集合体を得る手法のことを言い、一般的には、以下の工程によって行われる。先ず、自然界から採取してきた微生物集合体を寒天ゲル上に展開し、増殖培養後、得られたコロニーを採取し、採取したコロニーが単菌から構成されているかどうかを確認する。ここで、得られたコロニーが複数の微生物から構成されている場合には、もう一度寒天培地上で展開する。この純菌化工程を単菌が得られるまで繰り返す。
【００８７】
凝集体を形成しない微生物の場合には、従来法と同じように、微生物濃度を適切に希釈することによって良好なコロニー形成を経て、微生物を純菌化させることができる。
【００８８】
しかし、自然界から採取した凝集体を形成する微生物の多くは、凝集体内部に多種類の微生物の混合物であることが多い。そして、この様な場合、従来法と同様の方法で純菌化を行うと、コロニー形成が見られたとしても、コロニー内には数種の微生物が混入されている可能性が高く、純菌化工程を何度も繰り返さなければ、微生物を純菌化することはできなかった。
【００８９】
しかし、本発明における前処理工程を用いると、微生物の凝集体を前処理工程で破壊し、単独の微生物にすることで、単独の微生物から構成されているコロニーを形成することが可能となる。これにより、より少ない純菌化工程で単独微生物から構成されたコロニーを得やすくなる。
【００９０】
例えば、Botryococcus Brauniiなどの凝集性を示す微細藻類の場合、お互いが細胞間マトリックスによって結合しあうことによって凝集体を形成している。しかし、この細胞間マトリックスの中にバクテリアなどが入り込み、このことが原因で、この様な微細藻類の純菌化は非常に難しいといわれている。
【００９１】
しかし、本発明における前処理工程を行うことによって、微細藻類の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、単体に近い状態にまでバラバラにすることができる。この結果、微細藻類とバクテリアとが離れて存在するようになる。これにより、微細藻類の純菌化を容易化することができる。純菌化処理に際して、試料液の前処理工程を行った後に、更に遠心分離処理や多孔質膜による濾過処理を行ってもよい。例えば、微細藻類とバクテリアとでは大きさが異なるため、前処理工程の後に多孔質膜の使用によって分離したり、遠心により比重差を利用して分離したりすることが一層好ましい。このようにすることで、純菌化処理が一層容易となる。
【００９２】
また、共存するバクテリアを殺菌するために、殺菌剤を使用することで純菌化を行うこともあるが、細胞間マトリックス内に存在するバクテリアに対しては、殺菌剤が浸透しづらく、その効果はかなり限定されたものとなる。
【００９３】
このような場合にも、本発明における前処理工程を行うことで、細胞間マトリックスもバラバラにされるか、もしくは細胞間マトリックスがより断片化される。これにより、殺菌剤の浸透性が良くなり、その効果を向上させることができる。
【００９４】
また、上記の方法を用いると、純菌化する場合に、純菌化対象の微生物群の状態で、純菌化がある程度進行していることから、本発明における前処理工程による効果（即ち各微生物の単独状態での存在）を考え合わせると、純菌化工程の回数を削減することができ、純菌化処理の時間を大幅に短縮化することができる。したがって、本発明の方法を用いることによって、微生物の純菌化工程がより簡便になるとともに、純菌化のための時間を大幅に短縮できる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９６】
［実施例Ａ］
実施例Ａでは、微生物を含む試料液を充填した密閉容器を高速振幅運動させる本発明の前処理工程と、微生物を含む試料液を充填した密閉容器に超音波を照射する従来の超音波処理工程とにおける微生物凝集体の分散効果及び微生物の破砕状態を対比した。合わせて、試料液を充填した密閉容器にビーズを入れて高速振幅運動させた場合の微生物の破砕状態を調べた。
【００９７】
（サンプルの調製）
５００ｍＬの三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れ、この培地上に天然海水から採取した微細藻類（珪藻の一種）を播種した。そして、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS-20RL）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。得られた微細藻類（珪藻）を含む試料液を顕微鏡（倍率：４倍）で観察した結果が図５である。本実施例で使用した珪藻は凝集性が高く、図５のように凝集体を形成するため、顕微鏡で観察しても個々（単一）の微細藻類をカウントすることはできなかった。
【００９８】
そして、この図５に示す微細藻類の凝集体を試験サンプルとし、本発明の前処理工程（実施例１）と、従来の超音波処理（比較例１）とで次のように処理した。
【００９９】
（実施例１）
上記の如く培養した微細藻類の試料液を０．５ｍＬ採取し、図３で示した２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れて前処理装置１０にセットした。このときの密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率は２５容積％になる。また、前処理装置１０として、上下方向と８の字を描くように高速振幅運動を行うビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００ (株式会社トミー精工)を用いるとともに密閉容器２２にはビーズは入れなかった。そして、５５００ｒｐｍの振幅数で２０秒間の前処理工程を行った。前処理工程後の微細藻類について顕微鏡（倍率：１０倍）で観察した結果を図６に示す。
【０１００】
図６から分かるように、微細藻類の凝集体は単一の微細藻類に分散されており、それぞれの微細藻類を顕微鏡で容易にカウントすることができた。また、顕微鏡（倍率：１０倍 ）で前処理工程後の微細藻類が破砕されているかどうかを観察したが、採取した試料（１０μＬ）をスライドガラスに滴下し、カバーガラス（２２ｍｍ×２２ｍｍ）の範囲内では、微細藻類の破砕は観察できなかった。
【０１０１】
（比較例１）
上記の如く培養した試料液を０．５ｍＬ採取し、図３で示した２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れ、超音波洗浄機ＵＳＤ−４Ｒ (アズワン株式会社)にセットした。そして、試料液に対して２８ｋＨｚで５分間超音波を印加した後、微細藻類について顕微鏡で観察した。
【０１０２】
その結果を図７及び図８に示す。図７（倍率１０倍）を見ると、微細藻類の凝集体の分散状態は超音波を印加しない前の状態に近く、超音波の印加による分散化の程度は実施例１（図６）に比べて明らかに悪かった。また、顕微鏡（倍率：４０倍）で超音波処理後の微細藻類が破砕されているかどうかを観察したが、細胞が部分的に壊れていた。このように、超音波処理を行うことによって、分散がうまくいかず、しかも部分的に細胞が壊れたものも存在した（図８）。
【０１０３】
実施例１と比較例１との対比から分かるように、従来の超音波処理は分散効率が悪く、且つ部分的に細胞が壊れたのに対し、試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器２２を前処理装置１０で高速振幅運動させた実施例１は、高い分散効率を示すとともに、微細藻類の破砕を効果的に抑制することができた。
【０１０４】
（比較例２）
上記の如く培養した試料液を０．５ｍＬ採取し、２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れるとともに、直径２ｍｍのジルコニアビーズ２０個を密閉容器２２に入れた。そして、密閉容器２２を実施例１と同様に前処理装置１０にセットし、実施例１と同じ５５００ｒｐｍで２０秒間の高速振幅運動を行った。
【０１０５】
その結果を図９（倍率１０倍）に示す。図９から分かるように、密閉容器２２内にジルコニアビーズを入れることによって、微細藻類の細胞が破砕されており、微細藻類数を正確にカウントすることができなかった。
【０１０６】
実施例１と比較例２との試験結果から分かるように、本発明のおける前処理工程は、基本的に密閉容器２２内にジルコニアビーズ等のビーズを入れることは、微生物の破砕を抑制しながら凝集体の分散効果を得る上で好ましくない。したがって、密閉容器２２の振幅数と振幅時間との組み合わせを変えることで高速振幅運動を行うことが好ましい。しかし、微生物によっては凝集性が極めて高く十分な分散効果が得られない場合が想定されるので、予め予備試験等により微生物を破砕しない条件（ビーズ径、ビーズ数）を把握した上でビーズを使用することは可能である。要は、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができればよい。
【０１０７】
［実施例Ｂ］
実施例Ｂでは、前処理工程において密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率の好ましい範囲について調べた。
【０１０８】
２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２を１０本用意し、実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を、それぞれ０．１ｍＬ（容積比率５％）、０．２ｍＬ（容積比率１０％）、０．３ｍＬ（容積比率１５％）、０．４ｍＬ（容積比率２０％）、０．５ｍＬ（容積比率２５％）、１．０ｍＬ（容積比率５０％）、１．２ｍＬ（容積比率６０％）、１．５ｍＬ（容積比率７５％）、１．８ｍＬ（容積比率９０％）、２．０ｍＬ（容積比率１００％）充填した。但しビーズは使用していない。そして、実施例Ａで使用したと同じ前処理装置１０に１０本の密閉容器２２をセットし、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った。
【０１０９】
その結果を図１０の表に示す。なお、分散効果の評価判定は次のように行った。
【０１１０】
○…図６と同程度まで分散されて顕微鏡で容易に微細藻類数をカウントできる
△…図１１に示すように凝集体は存在するがその大きさが小さく微細藻類をカウント可能
×…図５及び図７に示すように凝集体の大きさが大きく微細藻類数をカウントすることが困難
図１０の表の結果から分かるように、密閉容器２２への充填量が０．１ｍＬ（容積比率５％）及び０．２ｍＬ（容積比率１０％）の場合には×の評価であり、分散効果が悪く微細藻類数のカウントが困難であった。充填量を０．３ｍＬ（容積比率１５％）まで多くすると、△の評価になり、０．４ｍＬ（容積比率２０％）〜１．２ｍＬ（容積比率６０％）までは○の評価であった。更に、充填量を上げて１．５ｍＬ（容積比率７５％）にすると△の評価になり、１．８ｍＬ（容積比率９０％）以上では×の評価となった。
【０１１１】
このように、密閉容器２２に充填する試料液の充填量が少な過ぎても多過ぎても凝集体を良好に分散させることができなかった。このことは、高速振幅運動したときの密閉容器２２内のヘッドスペースが凝集体の分散効率に大きく影響していることが推察される。また、充填量が少な過ぎても分散性が悪くなる理由は、試料液の重量が軽過ぎて高速振幅運動時における密閉容器内壁への衝突力が小さいため、凝集体を分散させるに足るエネルギーを十分に発揮できないためと推察される。
【０１１２】
密閉容器２２に試料液をどの程度充填することが好ましいかを、密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率でみた場合、図１０の試験結果から１５容積％〜７５容積％の範囲であることが好ましく、２０容積％〜６０容積％であることが特に好ましい。
【０１１３】
［実施例Ｃ］
実施例Ｃは、前処理工程における高速振幅運動の好ましい振幅数と振幅時間について調べたものである。
【０１１４】
２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２を９本用意し、実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を０．５ｍＬ充填した。但しビーズは使用しなかた。そして、９本の密閉容器２２を実施例Ａで使用したと同じ前処理装置１０に試験ロットごとにセットし、前処理工程を行った。即ち、２０００ｒｐｍ、２５００ｒｐｍ、３０００ｒｐｍ、３５００ｒｐｍ、４０００ｒｐｍ、４５００ｒｐｍ、５０００ｒｐｍ、５５００ｒｐｍの振幅数で振幅時間２０秒間の高速振幅運動を行った。
【０１１５】
その結果を図１２の表に示す。また、分散効果の評価判定は実施例Ｂと同様である。
【０１１６】
図１２から分かるように、振幅数が０（高速振幅運動なしの状態）〜３０００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が０〜６００００）までは×の評価であったが、３５００〜４０００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が７００００〜８００００）で△の評価まで良くなり、４５００〜５５００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が９００００〜１１００００）で○の評価となった。この結果から、振幅時間が２０秒と比較的短い場合には、振幅数は３５００ｒｐｍ以上が必要であり、４５００ｒｐｍ以上にすることが一層好ましことが分かる。
【０１１７】
このことから、試験を行った０〜５５００ｒｐｍの振幅数範囲のうち、△の評価を得た３５００ｒｐｍと、○の評価を得た５５００ｒｐｍの２水準について振幅時間を５秒から６０秒まで検討したときに評価がどうなるかを調べた。
【０１１８】
その結果を図１３の表に示す。図１３から分かるように、振幅数３５００ｒｐｍでは、振幅時間１０秒間（振幅数×振幅時間が３５０００）までは×の評価であったが、２０秒間（振幅数×振幅時間が７００００）で△の評価になり、６０秒間（振幅数×振幅時間が２１００００）で○の評価になった。一方、振幅数５５００ｒｐｍでは、５秒間（振幅数×振幅時間が２７５００）の振幅時間で既に○の評価になり６０秒間（振幅数×振幅時間が３３００００）まで○の評価であった。
【０１１９】
上記図１２の表及び図１３の表の試験結果から、微細藻類の場合には、破砕に対する影響を考慮すると、振幅時間６０秒以内で高速振幅運動を行うことが好ましく、そのためには振幅数は少なくとも３５００ｒｐｍ以上で行うことが好ましく、５５００ｒｐｍ〜１００００ｒｐｍの範囲で行うことが一層好ましい。振幅数の上限を１００００ｒｐｍとしたのは、１００００ｒｐｍを超えると前処理装置１０からの発熱が大きく、発熱による温度上昇は一般的な微生物の活性にとって好ましくないためである。
【０１２０】
したがって、上記結果をまとめると、高速振幅運動としては、密閉容器２２を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が７００００〜３３００００の範囲であることが好ましい。
【０１２１】
［実施例Ｄ］
実施例Ｄでは、本発明の微生物の処理方法の効果を調べたものであり、前処理工程を目的処理工程の一態様である増殖処理に組み込んだときの増殖効果を調べた。
【０１２２】
実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２に１ｍＬ充填（容積比率５０容積％）し、５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理工程を行って微細藻類を分散させた。前処理工程後の試料液を、５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種し、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。その結果、培地中には茶色の凝集した微細藻類の凝集体が形成された。
【０１２３】
このようにして得られた茶色の凝集体を試験サンプルとして取り出して半分に分け、そのうちの一方の凝集体（試験サンプル１）を２ｍＬの蓋つき密閉容器２２に１ｍＬ充填し、５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理工程を再び行うことで凝集体をバラバラに壊した。そして、前処理工程を行った後の試験サンプル１を、５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種した。
【０１２４】
また、半分に分けたうちの他方の凝集体（試験サンプル２）は、前処理工程を行わずに５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種した。なお、試験サンプル１と試験サンプル２の両方ともに、播種量は２．５×１０４個／ｍＬの藻体濃度である。播種量の確認は、試験サンプル１及び２を前処理装置１０でそれぞれ５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理した試料を、血球計数盤を用いてカウントすることにより行った。
【０１２５】
次に、試験サンプル１と試験サンプル２のそれぞれの三角フラスコを、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）にセットし、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで１７日間培養した。そして、培養後、３日目、５日目、１０日目、１７日目に、試験サンプル１及び試験サンプル２のそれぞれの三角フラスコから培養溶液を取り出し、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２に０．５ｍＬ入れ、前処理装置１０にセット後、５５００ｒｐｍ２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理を行った後、血球計数盤を用いて微細藻類数をカウントした。
【０１２６】
図１４のグラフに、培養日数に対する藻体濃度の関係を示した。
【０１２７】
図１４の結果から分かるように、培養日数が５日目までは、前処理工程を行ってから培養工程を行った試験サンプル１も、前処理工程を行わずに培養工程を行った試験サンプル２も藻体濃度はほぼ同一であった。
【０１２８】
しかしながら、培養日数が５日目以降になると、試験サンプル１は藻体濃度曲線は上昇する傾向にあるのに対して、試験サンプル２は藻体濃度曲線が寝る傾向にある。具体的には、培養日数１７日目における試験サンプル１の藻体濃度は６３×１０５個／ｍＬまで高くなったのに対して、試験サンプル２の藻体濃度は３９×１０５個／ｍＬであった。
【０１２９】
［実施例Ｅ］
実施例Ｅでは、実施例Ｄにおける前処理工程の条件（振幅数及び振幅時間）を変えたときに、培養速度がどのようになるかを調べた。
【０１３０】
実施例Ｄと同様の操作により微細藻類の凝集体を有する試験サンプルを調製した。次に、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２を４本用意し、試験サンプルを５つに分け（試験サンプル１、２、３、４）、これらの試験サンプル１〜４をそれぞれの密閉容器２２に０．５ｍＬ充填した。
【０１３１】
そして、試験サンプル１〜４を次の条件で前処理工程を行った。
【０１３２】
・試験サンプル１…振幅数０ｒｐｍ、振幅時間０秒（前処理工程なし）
・試験サンプル２…振幅数２０００ｒｐｍ、振幅時間５秒（振幅数×振幅時間が１００００）
・試験サンプル３…振幅数２０００ｒｐｍ、振幅時間２０秒（振幅数×振幅時間が４００００）
・試験サンプル４…振幅数５５００ｒｐｍ、振幅時間２０秒（振幅数×振幅時間が１１００００）
このように作成した試験サンプル１〜４のそれぞれを、１００ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの滅菌したＩＭＫ培地を入れた培地上に播種し、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。
【０１３３】
そして、培養開始から１０日目に培養を停止して、それぞれの三角フラスコから試料（試験サンプル１〜４）をそれぞれ０．５ｍＬ採取した。採取した試料を、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２にそれぞれ充填して前処理装置１０にセットし、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行って分散した後、血球計数盤を用いて藻体数をカウントした。
【０１３４】
その結果を図１５の表に示す。なお、培養開始時の１００ｍＬ三角フラスコ中の藻体濃度は１．６×１０５個／ｍＬであった。
【０１３５】
図１５の結果から分かるように、前処理工程を行わないで培養処理を行った試験サンプル１の微細藻類濃度は４．１×１０５個／ｍＬであった。
【０１３６】
これに対して、２０００ｒｐｍで５秒間前処理工程を行った後で培養処理を行った試験サンプル２の微細藻類濃度は５．２×１０５個／ｍＬであり、２０００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った試験サンプル３の微細藻類濃度は５．８×１０５個／ｍＬであった。また、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った後で培養処理を行った試験サンプル４の微細藻類濃度は６．０×１０５個／ｍＬであった。
【０１３７】
試験サンプル２と３との対比から分かるように、同じ振幅数であれば、振幅時間が長いほど、即ち微生物凝集体の分散程度が大きいほど、培養処理での培養速度は向上する。また、試験サンプル３と４との対比から分かるように、振幅時間が同じあれば、振幅数が大きいほど、即ち微生物凝集体の分散程度が大きいほど、培養処理での培養速度は向上する。
【０１３８】
上記した実施例Ｄ及びＥの結果から分かるように、目的処理工程の一態様である培養処理を行う前に、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器２２を高速振幅運動させる前処理工程を行うことで培養速度を向上させることができる。これは、微生物の増殖処理に前処理工程を組み合わせることで、微生物の破砕を抑制しつつ微生物凝集体を効果的に分散させることができるので、個々の微生物が栄養源等の増殖に必要な要素に接触し易くなり、要素を十分に取り込むことができるためと考察される。これにより、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【０１３９】
なお、培養速度を示す藻体濃度と、（振幅数×振幅時間）との関係をみると、振幅数×振幅時間が１００００以上で効果が発揮されており、実施例Ｃ（図１２、図１３）の分散効率を調べた試験での振幅数×振幅時間の下限値７００００よりも低い値で良い結果がでている。
【符号の説明】
【０１４０】
１０…前処理装置、１２…装置本体、１４…蓋部材、１６…容器ホルダー、１８…駆動軸、２０…駆動部、２２…密閉容器、２４…チャック部、２６…試料液、２８…ＯＮ−ＯＦＦスイッチ、３０…振幅数ダイヤル、３２…タイマーダイヤル、３４…切り換えスイッチ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の処理方法に係り、特に微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う前の前処理技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物に関する処理の中には、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理があり、従来は以下のように行われていた。
【０００３】
〈微生物数のカウント処理〉
微生物数をカウント処理する場合には、計数板を用いて微生物試料液を観測することが一般的に行われている(非特許文献１)。しかし、この方法は、微生物が一つ一つばらばらになっている状態であれば問題ないが、微生物が凝集している場合には、微生物が重なり合うことによって、容易には数をカウントできないことが多い。また、凝集していることにより複数の微生物から構成された試料液の場合には個別の種ごとに微生物数をカウントすることもできなかった。
【０００４】
そこで、試料液を超音波処理することによって、微生物の凝集体をばらばらにする方法が採用されている（例えば特許文献１）。しかし、この方法は、核酸を切断する際に、超音波処理を行うことでもわかるとおり、超音波条件によっては、微生物の細胞壁を傷つけてしまったりする等により、微生物そのものを死滅してしまう問題点があった。また、微生物の種類によって細胞壁の固さが異なり、微生物の種類に合わせて細胞壁を傷つけないための超音波条件を見つけることは、作業者にとって極めて煩雑で非能率である。
【０００５】
別の微生物数のカウント方法として、微生物の濁度から微生物濃度を測定することも可能であるが、予め微生物数と濁度との関係を求めておく必要がある。したがって、この場合にも、微生物数をカウントすることが必要であることから、凝集した微生物を忍耐強くカウントするしか方法はなかった。さらに、凝集した微生物を濁度で計数する場合には、光の乱反射が起こりやすく、積分球のような特殊な装置が必要であった。
【０００６】
また、微生物、特に、クロロフィルを持つ光合成微生物の場合、クロロフィルの定量から微生物数を測定することも行われてきた。しかし、この方法でも、予めクロロフィル量と微生物数の数との相関を予め求めておく必要性があり、その困難さは、前記と同様である。また、微生物中のクロロフィル量は、微生物の培養条件や、微生物の増殖ステージによって異なることがあり、そのたびに、クロロフィル量と微生物数との相関を求める必要性があり煩雑であった。
【０００７】
更に別の微生物数のカウント方法として、フローサイトメトリーを用いる方法もあるが、この装置の場合、1つの微生物の大きさとほぼ同程度の直径を持つ細管内を通過させる必要性があることや、いくつかの微生物が集合した集合物が細管を通過した場合、微生物数は1つとして認識してしまう点から、微生物の集合物に対して使用することは困難であった。
【０００８】
〈微生物の増殖処理〉
大腸菌などの原核生物は、数十分で1回分裂することから非常に増殖速度が速いが、真核生物、例えば、藻類などは、一回分裂する時間が非常に長い。例えば、バイオマス燃料として注目されているオイルを蓄積する藻類の１種で地球温暖化を解決する有力な微生物と考えられているBotryococcus Brauniiは、１回の分裂に要する日数が数日から数週間と非常に増殖速度が遅いことで知られている。このことが原因のひとつとなって、Botryococcus Brauniiを用いたオイル生産は、商業レベルの生産に至っていないのが実情である。
【０００９】
従来は、微生物の培養条件を工夫することで、その増殖速度を向上させることが検討され、増殖速度を向上させる方法が種々報告されてきたが、現状での増殖速度は満足できるものではない。
【００１０】
〈微生物の純菌化処理〉
従来の微生物を純菌化する方法は、採取してきた微生物を含む溶液を希釈し、寒天培地上に塗布することによって行われてきた。しかし、一般的には、一回の純菌化工程で、単菌が得られることは稀であり、通常は数回の純菌化工程を繰り返すことによって、単菌を得ている。凝集体を形成する微生物や一般的に複数の微生物から構成されているバイオフィルム中の微生物などは、希釈する程度では数種類の微生物が混合された状態で純菌化を行うことになる。これにより、純菌化工程の繰り返し回数も極めて多くなってしまい、結果的に純菌化が非常に難しくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】藻類研究法、西澤一俊、千原光雄編、共立出版、1979年、p275
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平７−２９８８６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、従来の微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理にはそれぞれ欠点があり、いずれも満足できるものではなかった。
【００１４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理における従来の欠点を解決することができる微生物の処理方法を提供することを目的とする。
【００１５】
即ち、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントする処理方法を提供することにある。
【００１６】
また、微生物の増殖処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる処理方法を提供することにある。
【００１７】
また、微生物の純菌化処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化工程の繰り返し数を従来よりも顕著に低減でき、純菌化時間を大幅に短縮できる処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の請求項１は前記目的を達成するために、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、前記目的処理工程を行う前に、前記微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行うことを特徴とする微生物の処理方法を提供する。
【００１９】
本発明の微生物の処理方法によれば、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の前処理工程として、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させるようにした。
【００２０】
本発明では、従来の超音波振動のように微生物自体に直接振動を当てるのではなく、密閉容器を高速振幅運動させて微生物の凝集体の塊を試料液中に分散させることで、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができる。
【００２１】
かかる凝集体の分散効率の観点から、密閉容器に充填する試料液の所定量は、密閉容器の内容積に対する試料液の容積比率が１５〜７５容積％の範囲であることが好ましい。
【００２２】
これは、微生物を含む試料液を密閉容器に充填したときに、密閉容器内に一定以上の容積のヘッドスペースを形成しないと、密閉容器を高速振幅運動したときに微生物凝集体（以下単に、凝集体という場合もある）の分散効率が顕著に低下するためである。また、密閉容器内の試料液が少な過ぎると、高速振幅運動したときに微生物凝集体の分散効率が顕著に低下するためである。これは、試料液の重量が軽過ぎて高速振幅運動時における密閉容器内壁への衝突力が小さいため、凝集体を分散させるに足るエネルギーを十分に発揮できないためと推察される。
【００２３】
また、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができる高速振幅運動としては、密閉容器を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることが好ましい。この振幅数と振幅時間との組み合わせであれば、各種の微生物について、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるからである。
【００２４】
これにより、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００２５】
また、微生物の増殖処理では、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、個々の微生物が栄養源等の増殖に必要な要素に接触し易くなり、要素を十分に取り込むことができる。これにより、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【００２６】
また、微生物の純菌化処理では、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化する微生物を雑菌と区別させた状態で取り出し易くなる。これにより、純菌化工程の繰り返し回数を従来よりも顕著に低減できるので、純菌化時間（工程数）を大幅に短縮できる。
【００２７】
これらの場合、凝集体の分散効果が所望程度まで達しない場合に、微生物の破砕を抑制可能な範囲で樹脂粒子等のビーズを密閉容器内に充填することは可能であるが、基本的にはビーズは充填せずに振幅数と振幅時間との組み合わせで調整することが良い。
【００２８】
本発明の微生物の処理方法においては、前記密閉容器の振幅形態は、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であることが好ましい。この場合、上下方向、左右方向、前後方向の２形態以上を組み合わせた高速振幅運動が一層好ましい。
【００２９】
本発明の微生物の処理方法においては、前処理工程では、前記試料液が充填された密閉容器内に消泡剤を添加することが好ましい。
【００３０】
試料液中の微生物が高濃度の場合や、種々の代謝物を菌体外に放出する微生物の場合には、前処理工程によって密閉容器内に気泡が発生し、この気泡により微生物凝集体の分散効率が低下するからである。
【００３１】
本発明の微生物の処理方法においては、前記前処理工程を複数回に分けて行うことが好ましい。これは、前処理工程の高速振幅運動により、試料液が温度上昇して微生物が死滅する等の好ましくない結果になることを防止するためである。特に、熱に弱い微生物の前処理工程では重要になる。
【００３２】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物は凝集性を有する微生物であることが好ましい。
【００３３】
これは、凝集性を有する微生物の処理において、本発明が一層有効だからであり、例えば凝集性を有する微生物として付着性微生物を挙げることができる。
【００３４】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物は複数種の微生物から構成された集合体も使用可能である。
【００３５】
本発明の微生物の処理方法においては、前記微生物がバイオマスを産生する微生物であることが好ましい。
【００３６】
本発明の微生物の処理方法は、バイオマスを産生する微生物、例えばオイルを含有するBotryococcus属を利用したバイオマス燃料等の工業化のための技術として極めて有効だからである。
【００３７】
本発明の微生物の処理方法においては、前記目的処理工程が前記微生物の増殖処理の場合には、前記前処理工程と前記目的処理工程とを複数回繰り返すことが好ましい。
【００３８】
これは、増殖処理工程で微生物が再び凝集する傾向にあるため、前処理工程と増殖処理工程とを繰り返すことにより、増殖速度を一層向上できるからである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の微生物の処理方法によれば、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の従来の欠点を解決することができる。
【００４０】
即ち、微生物数のカウント処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００４１】
また、微生物の増殖処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【００４２】
また、微生物の純菌化処理では、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるので、純菌化工程の繰り返し数を従来よりも顕著に低減でき、純菌化時間（工程数）を大幅に短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の微生物の処理方法で使用する前処理装置の一例を示した外観図
【図２】図１の前処理装置の容器ホルダーと駆動部とを示した斜視図
【図３】前処理装置に使用する密閉容器に微生物を充填する様子を示した斜視図
【図４】前処理工程における密閉容器の各種の振幅形態を示した説明図
【図５】実施例Ａにおいて前処理工程を行う前の微細藻類の顕微鏡写真図
【図６】実施例Ａにおいて前処理工程を行った後の微細藻類の顕微鏡写真図
【図７】実施例Ａにおいて従来の超音波照射を行った後の微細藻類の顕微鏡写真図
【図８】実施例Ａにおいて従来の超音波照射を行った後の微細藻類の細胞破壊を示す顕微鏡写真図
【図９】実施例Ａにおいて密閉容器に微生物と一緒にビーズを入れて高速振幅運動させた後の微細藻類の細胞破壊を示す顕微鏡写真図
【図１０】実施例Ｂにおいて密閉容器の内容積に対する試料液の容積比率と微生物凝集体の分散効果との関係を説明する説明図
【図１１】実施例Ｃにおいて前処理工程を行う前のBotryocuccosの顕微鏡写真図
【図１２】実施例Ｃにおいて前処理工程における密閉容器の振動数と分散効果との関係を説明する説明図
【図１３】実施例Ｃにおいて前処理工程での密閉容器の振幅数×振幅時間と分散効果との関係を説明する説明図
【図１４】実施例Ｄにおいて前処理工程の有り無しが微細藻類の増殖に及ぼす影響を説明する説明図
【図１５】実施例Ｅにおいて前処理工程における密閉容器の振幅数×振幅時間と微細藻類の増殖効果との関係を説明する説明図
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明の微生物の処理方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
【００４５】
本発明は、微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う目的処理工程と、該目的処理工程を行う前に、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程と、で構成される。
【００４６】
［微生物］
本発明で言うところの微生物とは、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な生物を指し、原核生物、真核生物のいずれで良い。原核生物とは、細胞核を持たない生物のことを言い、真性細菌と古細菌の2つの生物を含めることができるものとする。真核生物としては、藻類、原生生物、菌類、粘菌やワムシなどの小型の動物をも含む。
【００４７】
また、微生物の中でも、個々の微生物がお互いに集合することによって、人の肉眼でその集合体が識別可能になる場合もある。しかし、その様な場合でも、集合体構造を崩して個々の微生物にすることによって、人の肉眼では識別することができない場合は、本発明では微生物と定義する。また、個々の微生物の状態にはあるが、菌体数（例えば微細藻類の藻体数）が増加することによって、色の変化でその存在を知ることが可能となるものもある。しかし、そのような場合でも、個々の微生物を人の肉眼によって観察することはできないことから、本発明で言うところの微生物に含むものとする。
【００４８】
本発明における藻類とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上で生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものを言い、原核生物であるシアノバクテリアから、真核生物で単細胞生物、多細胞生物の海藻類など、異なるグループの総称を言う。
【００４９】
本発明における微細藻類とは、本発明で定義した上記微生物の中から、本発明で定義した上記藻類を選択した生物群のことを言う。例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などから構成されている生物のことを言う。
【００５０】
本発明で使用される微生物としては、バイオマスを産生する微生物であることが一層好ましい。ここでバイオマスとは、生物由来の資源のことを言い、化石資源を除いた、再生可能な生物由来の有機性資源のことであり、生物由来の物質、食料や資材、燃料、資源などのことを言う。バイオマスには、生物が産生する、多糖、オイル(炭化水素化合物、トリグリセリドなど)を含む。特に、バイオマスを産生する微生物としては、オイルを含有するBotryococcus属があり、本発明はBotryococcus属を利用したバイオマス燃料等の工業化のための技術として特に有効である。
【００５１】
［前処理工程］
本発明における前処理工程とは、微生物が含まれている試料液を密閉容器内に入れ、高速振幅運動を行うことによって、試料液中に微生物の凝集体が存在していても、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体をバラバラにして個々（単一）の微生物に分散させる工程を言う。
【００５２】
図１〜図３は前処理工程を行う前処理装置の一例である。
【００５３】
図１に示すように、前処理装置１０は、装置本体１２と蓋部材１４とで構成される。図２に示すように、装置本体１２の内部には、高速振幅運動を行う円板状の密閉容器ホルダー１６が配置され、駆動軸１８を介して振幅駆動部２０に支持される。密閉容器ホルダー１６の周縁部には、蓋２２Ａ付き密閉容器２２（図３参照）を着脱自在に保持する複数のチャック部２４が設けられる。
【００５４】
図３に示すように、蓋１２Ａ付き密閉容器２２は、試験管形状に形成され、微生物２４及びその微生物を分散させるための分散液２５（例えば純水や培養液）で構成される試料液２６が充填された後、蓋２２Ａにより密閉できるように構成されている。
【００５５】
また、図１に示すように、装置本体１２の正面には、ＯＮ−ＯＦＦスイッチ２８、密閉容器ホルダー１６を介して密閉容器２２を高速振幅運動する際の振幅数を設定する振幅数ダイヤル３０及び振幅時間を設定するタイマーダイヤル３２が設けられる。更には密閉容器２２を高速振幅運動させる振幅方向の形態設定を行う切り換えスイッチ３４等が設けられる。
【００５６】
図４に示すように、密閉容器２２を高速振幅運動させる振幅形態としては、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であるが、例えば図４（Ａ）に示すように、上下方向と左右方向との組み合わせ、図４（Ｂ）に示すように、左右方向と前後方向との組み合わせを採用することが好ましい。また、上下しながら８の字を描くように密閉容器２２が振幅する特殊な振幅形態を一層好適に採用することができる。
【００５７】
このように、本発明における前処理工程は、従来のように超音波振動で微生物自体を振動させるのではなく、微生物が入った密閉容器２２を高速振幅運動させて密閉容器２２内の微生物の凝集体の塊を試料液中に分散させる。これにより、微生物の破砕を抑制しつつ微生物の凝集体を効果的に分散させることができる。
【００５８】
本発明で言うところの微生物の破砕とは、微生物の外側の膜が破壊され、微生物内部の物質が微生物外に溶出してくる現象のことを言う。この様な破砕が発生すると、後記する微生物数のカウント処理において正確な数を数えることができなくなる。また、破砕により微生物の培養に悪影響が生じる等の不都合が起こる。
【００５９】
しかし、本発明の前処理工程によっても微生物の破砕を完全に防ぐことは難しく、本発明において「破砕を抑制する」とは微生物の７０％以上が少なくとも破砕されないことを言う。破砕の抑制レベルは８０％以上であることが一層好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。
【００６０】
また、密閉容器内に分散液を入れることにより、分散液を入れない状態で密閉容器２２を高速振幅運動させる場合に比べて、微生物の分散効率が向上するのみならず微生物の破砕を確実に抑制できる。また、分散液を密閉容器２２に入れることで微生物の温度上昇による微生物の失活や死滅を防止できる。微生物が失活したり死滅したりすると、後記する目的処理工程において細胞数をカウントすることができなくなったり、以後の増殖処理に対して悪影響を及ぼす。
【００６１】
前処理工程において微生物の破砕を抑制し且つ分散効率を向上するための密閉容器２２の高速振幅運動の好ましい条件は、振幅数と振幅時間との組み合わせで決まる。振幅数と振幅時間との関係としては、振幅数が高目（例えば５０００ｒｐｍ）の場合には、短時間（例えば５秒）の振幅時間で十分な分散効率を得ることができる。このときの振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は１００００になる。しかし、振幅数が低目（例えば３５００ｒｐｍ）の場合には、振幅時間を長め（例えば２０秒以上）にすることが好ましい。このときの振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は７００００になる。
【００６２】
一方、振幅数が高過ぎる（例えば１００００ｒｐｍ超え）と、前処理装置１０からの発熱が大きく、発熱による温度上昇は、耐熱性菌を除く一般的な微生物の活性にとっては好ましくない。また、振幅時間としては微生物の破砕を考慮すると５分（３００秒）以内であることが好ましく、より好ましくは１分（６０秒）以内である。そして、振幅数１００００ｒｐｍで振幅時間が３００秒での振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）は３００００００になる。
【００６３】
これらのことから、高速振幅運動としては、密閉容器２２を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることが好ましい。より好ましい振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）としては、後記する実施例の結果から７００００〜３３００００の範囲である。この振幅数と振幅時間との組み合わせであれば、各種の微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができるからである。
【００６４】
また、密閉容器２２の内容積に対する試料液２６の容積比率が１５〜７５容積％になるように充填し、試料液２６の上方にヘッドスペース３６（図４参照）が形成されるようにすることが好ましい。これは、試料液２６で密閉容器２２を完全に満たした場合には、高速振幅運動による前処理において、凝集体の分散効率が大幅に低下するためである。より好ましい容積比率の範囲は２０〜６０容積％の範囲である。また、容積比率が小さ過ぎても分散効率が大幅に低下し、容積比率の下限は１５容積％であることが好ましい。
【００６５】
上述した前処理装置１０の高速振幅運動を市販の装置で代用する場合には、株式会社トミー精工(東京都)のビーズ式細胞破砕装置、MS-１００あるいはBioSpec Product社のビーズ式ホモジナイザーBSP-3110BXを使用することが可能である。
【００６６】
しかし、これらの装置は、元々、微生物を破砕し、微生物から核酸を抽出したりするための装置であり、微生物と一緒に充填したビーズを微生物に衝突させることで細胞を破壊する。したがって、そのまま使用すると、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させる本発明における前処理工程を達成できない。その場合、密閉容器２２に充填するビーズの粒径や添加量と、高速振幅運動の条件（振幅数、振幅時間）と、微生物の破砕状態と、を予備試験等により把握しておくことが必要である。したがって、本発明における前処理工程では、基本的にビーズは密閉容器２２に充填しないで使用する。
【００６７】
但し、微生物によっては凝集体の凝集力が強く、分散効果を十分に達成できない場合には、微生物の破砕を抑制可能な範囲で樹脂粒子等のビーズを密閉容器２２内に充填することは可能である。しかし、前述の通り、基本的にはビーズは充填せずに高速振幅運動の振幅数と振幅時間とで調整することが良い。
【００６８】
さらに、前処理工程を行う際に、１回の前処理工程を行うのではなく、複数回の前処理工程を行うことが好ましい。これは、前処理工程を複数回に分けることによって、密閉容器２２中の試料液２６の温度上昇を防ぐためである。温度上昇は、微生物を死滅させる等、好ましくない影響を与える。
【００６９】
本発明では、前処理工程を行う際に、微生物の溶液に消泡剤を添加することが好ましい。これは、試料液２６中の微生物が高濃度の場合や、種々の代謝物を菌体外に放出する微生物の場合には、前処理工程によって密閉容器２２内に気泡が発生する場合がある。密閉容器２２内に気泡が発生すると、微生物凝集体の分散効率が著しく低下する。この様な場合に、消泡剤を試料液２６に添加してから前処理工程を行うことが好ましい。
【００７０】
なお、前処理工程を微生物のカウント処理、増殖処理、純菌化処理の前処理として使用する際には、前処理工程で分散させた微生物を直ちに使用することが好ましい。これは、微生物が再凝集する可能性があるからである。もし、再凝集した場合には、上記した前処理装置１０を使用して再分散させることができる。
【００７１】
［目的処理工程（微生物数のカウント処理）］
微生物数のカウント処理とは、微生物の数を数えることを言う。カウントする方法は、特に、限定されず、前処理工程によって得られた試料液２６を血球計数盤上で、顕微鏡を用いて数を数えることも可能であるし、フローサイトメーターを用いて微生物数を自動的に数えることも可能である。また、光学顕微鏡を用いて微生物を直接カウントする場合には、微生物を染色することで、より明瞭に微生物数をカウントすることができる。更に、明視野の光学顕微鏡の代わりに、偏光や微分緩衝顕微鏡を用いた方法も使用することもできる。即ち、本発明における前処理工程を行った試料液２６は、微生物の形状を観察する手段を用いる限りにおいて、いかなる方法を用いてもかまわない。
【００７２】
また、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておけば、吸光光度計を用いて、その吸光度から微生物数を算出することも可能である。また、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておけば、濁度計を用いて、その濁度から細胞数を算出することも可能である。さらに、予め蛍光光度計によって、クロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておけば、クロロフィルの蛍光量から細胞数を算出することも可能である。
【００７３】
吸光度、濁度、及びクロロフィルの蛍光量のいずれを利用して微生物のカウントを行う場合にも、予備試験を行って微生物との相関関係を予め求めておく必要があり、その予備試験に本発明における前処理工程を好適に使用することができる。
【００７４】
また、本発明における前処理工程を行うことにより、微生物数のカウントに、画像認識ソフトウェアを使用することが可能となる。凝集した微生物に対して画像認識ソフトを用いた場合、各微生物の認識能力は人間の目と比較して極めて精度が悪い。したがって、従来は使用に耐えるものではないのが実情であった。
【００７５】
しかし、本発明における前処理工程を行うことによって、凝集した微生物群を個別の微生物に分離することができることから、画像認識ソフトウェアの認識能力を最大限に生かすことができる。しかも、人間自身が手動で細胞数を数えるのではなく、自動で数えることができることから、実験者の負担を大幅に減らすことができるとともに、細胞の大きさの分布などの情報も同時に得ることが可能となる。
【００７６】
本発明で言うところの凝集とは、複数個の微生物が集合した構造体のことをいい、その微生物の構造体は、複数の種類から構成されていても、単一の種類から構成されていてもよい。さらに、微生物同士が直接隣接していてもよいし、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して凝集していてもよい。また、群体と言われているものも、本発明では、凝集のことを意味するものとする。
【００７７】
したがって、従来の微生物数のカウント方法では、凝集した微生物の数を数えることは非常に困難であったが、本発明を用いることで、凝集した微生物がバラバラの状態、もしくは凝集物が小さくなっていることから、容易に微生物数をカウントすることができるようになった。例えば、藻体内外にオイルを蓄積することで知られているBotryococcus Brauniiは、凝集したコロニーを形成することで知られているが、従来は、クロロフィルに由来する吸収を用いる方法や重量測定が行われてきた。しかし、本発明では、前処理工程を行うだけで、容易にその数をカウントすることができる。また従来の凝集体の分散のように、超音波による微生物の分散を行った場合には、微生物中の核酸などの構造物への影響から、微生物が破裂するなどの悪影響があった。しかし、本発明における前処理工程ではそのようなことはない。
【００７８】
したがって、微生物数のカウント処理を行う前に前処理工程を行えば、微生物数を容易且つ正確にカウントすることができる。
【００７９】
［目的処理工程（微生物の増殖処理）］
本発明で言うところの微生物の増殖処理とは、微生物を培養する際に、ある一定時間が経過した時に培養液中に存在している微生物の単位培養液体積中の微生物の数のことを言う。培養開始からある一定時間が経過するまでの時間から増殖速度を算出することができるが、本発明による前処理工程の効果を、増殖速度の向上という表現で言い換えることも可能な場合がある。
【００８０】
また、本発明における前処理工程を行った微生物を用いて増殖を行った場合、分散した微生物の増殖が進展するに伴って、再び凝集体を形成する様になる場合もある。そのような場合に、再び凝集体を前処理工程で処理して、再び増殖を行うことが好ましい。この前処理工程と増殖工程を何度繰り返してもかまわない。
【００８１】
したがって、本発明における前処理工程を行うことによって、増殖工程での増殖速度を向上できるので、微生物の濃度を増加させることも可能となる。この前処理工程の効果は、凝集性の高い微生物ほど効果的である。即ち、微生物の凝集体のうち培地と接触している凝集体表面に存在する微生物は栄養分が豊富であり、光合成微生物の場合には、豊富に光量を得ることが可能である。さらに、増殖するための空間も存在することから、活発に増殖することができると考えられる。一方、凝集体内部に存在する微生物は、培地との間に多数の微生物が存在することから、栄養分の拡散性が悪い。もしくは、より培地に近い微生物によって栄養分を消費されることによって、栄養分を獲得する機会が少なくなり栄養分を得にくくなる。さらに、増殖を行えるだけの空間も少なく、光合成微生物の場合には、光も届きにくい。このため、凝集体内部の増殖は抑えられてしまうという問題がある。
【００８２】
そこで、本発明における前処理工程を行うことによって、微生物の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、より小さな凝集体もしくは単体の微生物にすることができるので、前記の問題点を回避することができる。その結果、微生物の増殖速度を向上させることが可能となる。
【００８３】
本発明における前処理工程を用いることによって、バイオマスを産生する微細藻類の培養液中での濃度を向上させることも可能である。バイオマスを産生する微細藻類、例えば、重油相当のオイルを微生物体内外に蓄積することで知られているBotryococcus Brauniiの場合には、その増殖速度が数日から数週間と非常に長い。このことが原因で、世界的には非常に注目度が高いものの商業レベルでの生産には至っていない。
【００８４】
従来、その増殖速度を向上させるために、光量を最適化したり、光の照射間隔を最適なものにしたり、培地の組成を詳細に検討したりすることで、増殖速度を向上させることが検討されてきたが、まだ現状では不十分である。これは、Botryococcus Brauniiは、細胞間マトリックスによって凝集体を形成することが知られており、前記に示したことが原因で、増殖速度が遅くなっていると考えられる。
【００８５】
そこで、本発明における前処理工程を用いれば、微生物の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、凝集体をバラバラの状態にし、凝集性に起因する前記問題点をなくすことができるので、より多くの微生物固体を増殖に関与させることができる。これにより、Botryococcus Brauniiの増殖速度を顕著に向上できるので、商業レベルでの生産が可能になるかもしれない。
【００８６】
［目的処理工程（微生物の純菌化処理）］
本発明で言うところの、純菌化処理とは、複数種の微生物集合体から単一種の微生物集合体を得る手法のことを言い、一般的には、以下の工程によって行われる。先ず、自然界から採取してきた微生物集合体を寒天ゲル上に展開し、増殖培養後、得られたコロニーを採取し、採取したコロニーが単菌から構成されているかどうかを確認する。ここで、得られたコロニーが複数の微生物から構成されている場合には、もう一度寒天培地上で展開する。この純菌化工程を単菌が得られるまで繰り返す。
【００８７】
凝集体を形成しない微生物の場合には、従来法と同じように、微生物濃度を適切に希釈することによって良好なコロニー形成を経て、微生物を純菌化させることができる。
【００８８】
しかし、自然界から採取した凝集体を形成する微生物の多くは、凝集体内部に多種類の微生物の混合物であることが多い。そして、この様な場合、従来法と同様の方法で純菌化を行うと、コロニー形成が見られたとしても、コロニー内には数種の微生物が混入されている可能性が高く、純菌化工程を何度も繰り返さなければ、微生物を純菌化することはできなかった。
【００８９】
しかし、本発明における前処理工程を用いると、微生物の凝集体を前処理工程で破壊し、単独の微生物にすることで、単独の微生物から構成されているコロニーを形成することが可能となる。これにより、より少ない純菌化工程で単独微生物から構成されたコロニーを得やすくなる。
【００９０】
例えば、Botryococcus Brauniiなどの凝集性を示す微細藻類の場合、お互いが細胞間マトリックスによって結合しあうことによって凝集体を形成している。しかし、この細胞間マトリックスの中にバクテリアなどが入り込み、このことが原因で、この様な微細藻類の純菌化は非常に難しいといわれている。
【００９１】
しかし、本発明における前処理工程を行うことによって、微細藻類の破砕を抑制しながら凝集体を分散させて、単体に近い状態にまでバラバラにすることができる。この結果、微細藻類とバクテリアとが離れて存在するようになる。これにより、微細藻類の純菌化を容易化することができる。純菌化処理に際して、試料液の前処理工程を行った後に、更に遠心分離処理や多孔質膜による濾過処理を行ってもよい。例えば、微細藻類とバクテリアとでは大きさが異なるため、前処理工程の後に多孔質膜の使用によって分離したり、遠心により比重差を利用して分離したりすることが一層好ましい。このようにすることで、純菌化処理が一層容易となる。
【００９２】
また、共存するバクテリアを殺菌するために、殺菌剤を使用することで純菌化を行うこともあるが、細胞間マトリックス内に存在するバクテリアに対しては、殺菌剤が浸透しづらく、その効果はかなり限定されたものとなる。
【００９３】
このような場合にも、本発明における前処理工程を行うことで、細胞間マトリックスもバラバラにされるか、もしくは細胞間マトリックスがより断片化される。これにより、殺菌剤の浸透性が良くなり、その効果を向上させることができる。
【００９４】
また、上記の方法を用いると、純菌化する場合に、純菌化対象の微生物群の状態で、純菌化がある程度進行していることから、本発明における前処理工程による効果（即ち各微生物の単独状態での存在）を考え合わせると、純菌化工程の回数を削減することができ、純菌化処理の時間を大幅に短縮化することができる。したがって、本発明の方法を用いることによって、微生物の純菌化工程がより簡便になるとともに、純菌化のための時間を大幅に短縮できる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９６】
［実施例Ａ］
実施例Ａでは、微生物を含む試料液を充填した密閉容器を高速振幅運動させる本発明の前処理工程と、微生物を含む試料液を充填した密閉容器に超音波を照射する従来の超音波処理工程とにおける微生物凝集体の分散効果及び微生物の破砕状態を対比した。合わせて、試料液を充填した密閉容器にビーズを入れて高速振幅運動させた場合の微生物の破砕状態を調べた。
【００９７】
（サンプルの調製）
５００ｍＬの三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れ、この培地上に天然海水から採取した微細藻類（珪藻の一種）を播種した。そして、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS-20RL）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。得られた微細藻類（珪藻）を含む試料液を顕微鏡（倍率：４倍）で観察した結果が図５である。本実施例で使用した珪藻は凝集性が高く、図５のように凝集体を形成するため、顕微鏡で観察しても個々（単一）の微細藻類をカウントすることはできなかった。
【００９８】
そして、この図５に示す微細藻類の凝集体を試験サンプルとし、本発明の前処理工程（実施例１）と、従来の超音波処理（比較例１）とで次のように処理した。
【００９９】
（実施例１）
上記の如く培養した微細藻類の試料液を０．５ｍＬ採取し、図３で示した２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れて前処理装置１０にセットした。このときの密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率は２５容積％になる。また、前処理装置１０として、上下方向と８の字を描くように高速振幅運動を行うビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００ (株式会社トミー精工)を用いるとともに密閉容器２２にはビーズは入れなかった。そして、５５００ｒｐｍの振幅数で２０秒間の前処理工程を行った。前処理工程後の微細藻類について顕微鏡（倍率：１０倍）で観察した結果を図６に示す。
【０１００】
図６から分かるように、微細藻類の凝集体は単一の微細藻類に分散されており、それぞれの微細藻類を顕微鏡で容易にカウントすることができた。また、顕微鏡（倍率：１０倍 ）で前処理工程後の微細藻類が破砕されているかどうかを観察したが、採取した試料（１０μＬ）をスライドガラスに滴下し、カバーガラス（２２ｍｍ×２２ｍｍ）の範囲内では、微細藻類の破砕は観察できなかった。
【０１０１】
（比較例１）
上記の如く培養した試料液を０．５ｍＬ採取し、図３で示した２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れ、超音波洗浄機ＵＳＤ−４Ｒ (アズワン株式会社)にセットした。そして、試料液に対して２８ｋＨｚで５分間超音波を印加した後、微細藻類について顕微鏡で観察した。
【０１０２】
その結果を図７及び図８に示す。図７（倍率１０倍）を見ると、微細藻類の凝集体の分散状態は超音波を印加しない前の状態に近く、超音波の印加による分散化の程度は実施例１（図６）に比べて明らかに悪かった。また、顕微鏡（倍率：４０倍）で超音波処理後の微細藻類が破砕されているかどうかを観察したが、細胞が部分的に壊れていた。このように、超音波処理を行うことによって、分散がうまくいかず、しかも部分的に細胞が壊れたものも存在した（図８）。
【０１０３】
実施例１と比較例１との対比から分かるように、従来の超音波処理は分散効率が悪く、且つ部分的に細胞が壊れたのに対し、試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器２２を前処理装置１０で高速振幅運動させた実施例１は、高い分散効率を示すとともに、微細藻類の破砕を効果的に抑制することができた。
【０１０４】
（比較例２）
上記の如く培養した試料液を０．５ｍＬ採取し、２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２に入れるとともに、直径２ｍｍのジルコニアビーズ２０個を密閉容器２２に入れた。そして、密閉容器２２を実施例１と同様に前処理装置１０にセットし、実施例１と同じ５５００ｒｐｍで２０秒間の高速振幅運動を行った。
【０１０５】
その結果を図９（倍率１０倍）に示す。図９から分かるように、密閉容器２２内にジルコニアビーズを入れることによって、微細藻類の細胞が破砕されており、微細藻類数を正確にカウントすることができなかった。
【０１０６】
実施例１と比較例２との試験結果から分かるように、本発明のおける前処理工程は、基本的に密閉容器２２内にジルコニアビーズ等のビーズを入れることは、微生物の破砕を抑制しながら凝集体の分散効果を得る上で好ましくない。したがって、密閉容器２２の振幅数と振幅時間との組み合わせを変えることで高速振幅運動を行うことが好ましい。しかし、微生物によっては凝集性が極めて高く十分な分散効果が得られない場合が想定されるので、予め予備試験等により微生物を破砕しない条件（ビーズ径、ビーズ数）を把握した上でビーズを使用することは可能である。要は、微生物の破砕を抑制しつつ凝集体を効果的に分散させることができればよい。
【０１０７】
［実施例Ｂ］
実施例Ｂでは、前処理工程において密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率の好ましい範囲について調べた。
【０１０８】
２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２を１０本用意し、実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を、それぞれ０．１ｍＬ（容積比率５％）、０．２ｍＬ（容積比率１０％）、０．３ｍＬ（容積比率１５％）、０．４ｍＬ（容積比率２０％）、０．５ｍＬ（容積比率２５％）、１．０ｍＬ（容積比率５０％）、１．２ｍＬ（容積比率６０％）、１．５ｍＬ（容積比率７５％）、１．８ｍＬ（容積比率９０％）、２．０ｍＬ（容積比率１００％）充填した。但しビーズは使用していない。そして、実施例Ａで使用したと同じ前処理装置１０に１０本の密閉容器２２をセットし、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った。
【０１０９】
その結果を図１０の表に示す。なお、分散効果の評価判定は次のように行った。
【０１１０】
○…図６と同程度まで分散されて顕微鏡で容易に微細藻類数をカウントできる
△…図１１に示すように凝集体は存在するがその大きさが小さく微細藻類をカウント可能
×…図５及び図７に示すように凝集体の大きさが大きく微細藻類数をカウントすることが困難
図１０の表の結果から分かるように、密閉容器２２への充填量が０．１ｍＬ（容積比率５％）及び０．２ｍＬ（容積比率１０％）の場合には×の評価であり、分散効果が悪く微細藻類数のカウントが困難であった。充填量を０．３ｍＬ（容積比率１５％）まで多くすると、△の評価になり、０．４ｍＬ（容積比率２０％）〜１．２ｍＬ（容積比率６０％）までは○の評価であった。更に、充填量を上げて１．５ｍＬ（容積比率７５％）にすると△の評価になり、１．８ｍＬ（容積比率９０％）以上では×の評価となった。
【０１１１】
このように、密閉容器２２に充填する試料液の充填量が少な過ぎても多過ぎても凝集体を良好に分散させることができなかった。このことは、高速振幅運動したときの密閉容器２２内のヘッドスペースが凝集体の分散効率に大きく影響していることが推察される。また、充填量が少な過ぎても分散性が悪くなる理由は、試料液の重量が軽過ぎて高速振幅運動時における密閉容器内壁への衝突力が小さいため、凝集体を分散させるに足るエネルギーを十分に発揮できないためと推察される。
【０１１２】
密閉容器２２に試料液をどの程度充填することが好ましいかを、密閉容器２２の内容積に対する試料液の容積比率でみた場合、図１０の試験結果から１５容積％〜７５容積％の範囲であることが好ましく、２０容積％〜６０容積％であることが特に好ましい。
【０１１３】
［実施例Ｃ］
実施例Ｃは、前処理工程における高速振幅運動の好ましい振幅数と振幅時間について調べたものである。
【０１１４】
２ｍＬの蓋２２Ａ付き密閉容器２２を９本用意し、実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を０．５ｍＬ充填した。但しビーズは使用しなかた。そして、９本の密閉容器２２を実施例Ａで使用したと同じ前処理装置１０に試験ロットごとにセットし、前処理工程を行った。即ち、２０００ｒｐｍ、２５００ｒｐｍ、３０００ｒｐｍ、３５００ｒｐｍ、４０００ｒｐｍ、４５００ｒｐｍ、５０００ｒｐｍ、５５００ｒｐｍの振幅数で振幅時間２０秒間の高速振幅運動を行った。
【０１１５】
その結果を図１２の表に示す。また、分散効果の評価判定は実施例Ｂと同様である。
【０１１６】
図１２から分かるように、振幅数が０（高速振幅運動なしの状態）〜３０００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が０〜６００００）までは×の評価であったが、３５００〜４０００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が７００００〜８００００）で△の評価まで良くなり、４５００〜５５００ｒｐｍ（振幅数×振幅時間が９００００〜１１００００）で○の評価となった。この結果から、振幅時間が２０秒と比較的短い場合には、振幅数は３５００ｒｐｍ以上が必要であり、４５００ｒｐｍ以上にすることが一層好ましことが分かる。
【０１１７】
このことから、試験を行った０〜５５００ｒｐｍの振幅数範囲のうち、△の評価を得た３５００ｒｐｍと、○の評価を得た５５００ｒｐｍの２水準について振幅時間を５秒から６０秒まで検討したときに評価がどうなるかを調べた。
【０１１８】
その結果を図１３の表に示す。図１３から分かるように、振幅数３５００ｒｐｍでは、振幅時間１０秒間（振幅数×振幅時間が３５０００）までは×の評価であったが、２０秒間（振幅数×振幅時間が７００００）で△の評価になり、６０秒間（振幅数×振幅時間が２１００００）で○の評価になった。一方、振幅数５５００ｒｐｍでは、５秒間（振幅数×振幅時間が２７５００）の振幅時間で既に○の評価になり６０秒間（振幅数×振幅時間が３３００００）まで○の評価であった。
【０１１９】
上記図１２の表及び図１３の表の試験結果から、微細藻類の場合には、破砕に対する影響を考慮すると、振幅時間６０秒以内で高速振幅運動を行うことが好ましく、そのためには振幅数は少なくとも３５００ｒｐｍ以上で行うことが好ましく、５５００ｒｐｍ〜１００００ｒｐｍの範囲で行うことが一層好ましい。振幅数の上限を１００００ｒｐｍとしたのは、１００００ｒｐｍを超えると前処理装置１０からの発熱が大きく、発熱による温度上昇は一般的な微生物の活性にとって好ましくないためである。
【０１２０】
したがって、上記結果をまとめると、高速振幅運動としては、密閉容器２２を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が７００００〜３３００００の範囲であることが好ましい。
【０１２１】
［実施例Ｄ］
実施例Ｄでは、本発明の微生物の処理方法の効果を調べたものであり、前処理工程を目的処理工程の一態様である増殖処理に組み込んだときの増殖効果を調べた。
【０１２２】
実施例Ａと同様に培養した微細藻類の試料液を、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２に１ｍＬ充填（容積比率５０容積％）し、５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理工程を行って微細藻類を分散させた。前処理工程後の試料液を、５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種し、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。その結果、培地中には茶色の凝集した微細藻類の凝集体が形成された。
【０１２３】
このようにして得られた茶色の凝集体を試験サンプルとして取り出して半分に分け、そのうちの一方の凝集体（試験サンプル１）を２ｍＬの蓋つき密閉容器２２に１ｍＬ充填し、５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理工程を再び行うことで凝集体をバラバラに壊した。そして、前処理工程を行った後の試験サンプル１を、５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種した。
【０１２４】
また、半分に分けたうちの他方の凝集体（試験サンプル２）は、前処理工程を行わずに５００ｍＬ三角フラスコに滅菌したＩＭＫ培地を２００ｍＬ入れた培地上に播種した。なお、試験サンプル１と試験サンプル２の両方ともに、播種量は２．５×１０４個／ｍＬの藻体濃度である。播種量の確認は、試験サンプル１及び２を前処理装置１０でそれぞれ５５００ｒｐｍで２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理した試料を、血球計数盤を用いてカウントすることにより行った。
【０１２５】
次に、試験サンプル１と試験サンプル２のそれぞれの三角フラスコを、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）にセットし、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで１７日間培養した。そして、培養後、３日目、５日目、１０日目、１７日目に、試験サンプル１及び試験サンプル２のそれぞれの三角フラスコから培養溶液を取り出し、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２に０．５ｍＬ入れ、前処理装置１０にセット後、５５００ｒｐｍ２０秒間（振幅数×振幅時間が１１００００）前処理を行った後、血球計数盤を用いて微細藻類数をカウントした。
【０１２６】
図１４のグラフに、培養日数に対する藻体濃度の関係を示した。
【０１２７】
図１４の結果から分かるように、培養日数が５日目までは、前処理工程を行ってから培養工程を行った試験サンプル１も、前処理工程を行わずに培養工程を行った試験サンプル２も藻体濃度はほぼ同一であった。
【０１２８】
しかしながら、培養日数が５日目以降になると、試験サンプル１は藻体濃度曲線は上昇する傾向にあるのに対して、試験サンプル２は藻体濃度曲線が寝る傾向にある。具体的には、培養日数１７日目における試験サンプル１の藻体濃度は６３×１０５個／ｍＬまで高くなったのに対して、試験サンプル２の藻体濃度は３９×１０５個／ｍＬであった。
【０１２９】
［実施例Ｅ］
実施例Ｅでは、実施例Ｄにおける前処理工程の条件（振幅数及び振幅時間）を変えたときに、培養速度がどのようになるかを調べた。
【０１３０】
実施例Ｄと同様の操作により微細藻類の凝集体を有する試験サンプルを調製した。次に、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２を４本用意し、試験サンプルを５つに分け（試験サンプル１、２、３、４）、これらの試験サンプル１〜４をそれぞれの密閉容器２２に０．５ｍＬ充填した。
【０１３１】
そして、試験サンプル１〜４を次の条件で前処理工程を行った。
【０１３２】
・試験サンプル１…振幅数０ｒｐｍ、振幅時間０秒（前処理工程なし）
・試験サンプル２…振幅数２０００ｒｐｍ、振幅時間５秒（振幅数×振幅時間が１００００）
・試験サンプル３…振幅数２０００ｒｐｍ、振幅時間２０秒（振幅数×振幅時間が４００００）
・試験サンプル４…振幅数５５００ｒｐｍ、振幅時間２０秒（振幅数×振幅時間が１１００００）
このように作成した試験サンプル１〜４のそれぞれを、１００ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの滅菌したＩＭＫ培地を入れた培地上に播種し、振盪培養機（ＲＧＳ−２０ＲＬ）を用いて、照度２０００ＬＵＸの下、温度２０℃、振盪数１００ｒｐｍで培養した。
【０１３３】
そして、培養開始から１０日目に培養を停止して、それぞれの三角フラスコから試料（試験サンプル１〜４）をそれぞれ０．５ｍＬ採取した。採取した試料を、２ｍＬの蓋付き密閉容器２２にそれぞれ充填して前処理装置１０にセットし、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行って分散した後、血球計数盤を用いて藻体数をカウントした。
【０１３４】
その結果を図１５の表に示す。なお、培養開始時の１００ｍＬ三角フラスコ中の藻体濃度は１．６×１０５個／ｍＬであった。
【０１３５】
図１５の結果から分かるように、前処理工程を行わないで培養処理を行った試験サンプル１の微細藻類濃度は４．１×１０５個／ｍＬであった。
【０１３６】
これに対して、２０００ｒｐｍで５秒間前処理工程を行った後で培養処理を行った試験サンプル２の微細藻類濃度は５．２×１０５個／ｍＬであり、２０００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った試験サンプル３の微細藻類濃度は５．８×１０５個／ｍＬであった。また、５５００ｒｐｍで２０秒間前処理工程を行った後で培養処理を行った試験サンプル４の微細藻類濃度は６．０×１０５個／ｍＬであった。
【０１３７】
試験サンプル２と３との対比から分かるように、同じ振幅数であれば、振幅時間が長いほど、即ち微生物凝集体の分散程度が大きいほど、培養処理での培養速度は向上する。また、試験サンプル３と４との対比から分かるように、振幅時間が同じあれば、振幅数が大きいほど、即ち微生物凝集体の分散程度が大きいほど、培養処理での培養速度は向上する。
【０１３８】
上記した実施例Ｄ及びＥの結果から分かるように、目的処理工程の一態様である培養処理を行う前に、微生物を含む試料液の所定量を密閉容器２２に充填し、該密閉容器２２を高速振幅運動させる前処理工程を行うことで培養速度を向上させることができる。これは、微生物の増殖処理に前処理工程を組み合わせることで、微生物の破砕を抑制しつつ微生物凝集体を効果的に分散させることができるので、個々の微生物が栄養源等の増殖に必要な要素に接触し易くなり、要素を十分に取り込むことができるためと考察される。これにより、増殖速度の遅い微生物であっても従来に比べて顕著に増殖速度を向上させることができる。
【０１３９】
なお、培養速度を示す藻体濃度と、（振幅数×振幅時間）との関係をみると、振幅数×振幅時間が１００００以上で効果が発揮されており、実施例Ｃ（図１２、図１３）の分散効率を調べた試験での振幅数×振幅時間の下限値７００００よりも低い値で良い結果がでている。
【符号の説明】
【０１４０】
１０…前処理装置、１２…装置本体、１４…蓋部材、１６…容器ホルダー、１８…駆動軸、２０…駆動部、２２…密閉容器、２４…チャック部、２６…試料液、２８…ＯＮ−ＯＦＦスイッチ、３０…振幅数ダイヤル、３２…タイマーダイヤル、３４…切り換えスイッチ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、
前記目的処理工程を行う前に、前記微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行うことを特徴とする微生物の処理方法。
【請求項２】
前記所定量は、前記密閉容器の内容積に対する前記試料液の容積比率が１５〜７５容積％の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の微生物の処理方法。
【請求項３】
前記高速振幅運動は、前記密閉容器を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物の処理方法。
【請求項４】
前記密閉容器の振幅形態は、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項５】
前記前処理工程では、前記試料液が充填された密閉容器内に消泡剤を添加することを特徴とする請求項１〜４の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項６】
前記前処理工程を複数回に分けて行うことを特徴とする請求項１〜５の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項７】
前記微生物は凝集性を有する微生物であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項８】
前記凝集性を有する微生物が微細藻類であることを特徴とする請求項７に記載の微生物の処理方法。
【請求項９】
前記微生物は複数種の微生物から構成された集合体であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項１０】
前記微生物がバイオマスを産生する微生物であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項１１】
前記バイオマスを産生する微生物がBotryococcus属であることを特徴とする請求項１０の微生物の処理方法。
【請求項１２】
前記目的処理工程が前記微生物の増殖処理の場合には、前記前処理工程と前記目的処理工程とを複数回繰り返すことを特徴とする請求項１〜１１の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項１】
微生物数のカウント処理、微生物の増殖処理、微生物の純菌化処理の何れか１の目的処理を行う微生物の処理方法において、
前記目的処理工程を行う前に、前記微生物を含む試料液の所定量を密閉容器に充填し、該密閉容器を高速振幅運動させる前処理工程を行うことを特徴とする微生物の処理方法。
【請求項２】
前記所定量は、前記密閉容器の内容積に対する前記試料液の容積比率が１５〜７５容積％の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の微生物の処理方法。
【請求項３】
前記高速振幅運動は、前記密閉容器を振幅数（ｒｐｍ）×振幅時間（秒）が１００００〜３００００００の範囲になるように振幅させることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物の処理方法。
【請求項４】
前記密閉容器の振幅形態は、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項５】
前記前処理工程では、前記試料液が充填された密閉容器内に消泡剤を添加することを特徴とする請求項１〜４の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項６】
前記前処理工程を複数回に分けて行うことを特徴とする請求項１〜５の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項７】
前記微生物は凝集性を有する微生物であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項８】
前記凝集性を有する微生物が微細藻類であることを特徴とする請求項７に記載の微生物の処理方法。
【請求項９】
前記微生物は複数種の微生物から構成された集合体であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項１０】
前記微生物がバイオマスを産生する微生物であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【請求項１１】
前記バイオマスを産生する微生物がBotryococcus属であることを特徴とする請求項１０の微生物の処理方法。
【請求項１２】
前記目的処理工程が前記微生物の増殖処理の場合には、前記前処理工程と前記目的処理工程とを複数回繰り返すことを特徴とする請求項１〜１１の何れか１に記載の微生物の処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−８７４７７（Ｐ２０１１−８７４７７Ａ）
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４１６６３（Ｐ２００９−２４１６６３）
【出願日】平成２１年１０月２０日（２００９．１０．２０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２０日（２００９．１０．２０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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