心不全を発生させる危険がある被検者を診断および／または処置するための手段および方法
本発明は、心不全を発生させる危険がある被検者を同定するための方法であって、（ａ）前記被検者の生物学的試料における１つ以上の生物学的マーカーのレベルを決定すること、（ｂ）前記生物学的マーカーのレベルを同じ生物学的マーカーの標準レベルと比較すること、および（ｃ）生物学的マーカーのレベルが心不全を発生させる危険を示すかどうかを決定することを含み、生物学的マーカーがクルッペル様因子１５（ＫＬＦ−１５）、リソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）、それらのフラグメント、および／もしくは、それらの変異体であり、ならびに／または、生物学的マーカーがＫＬＦ１５をコードスする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、それらのフラグメント、および／もしくは、それらの変異体である方法に関する。さらに本発明は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品用の医薬品を調合するための、ＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２タンパク質、および／またはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ２をコードする遺伝子、および／または前記遺伝子および／またはタンパク質のフラグメントおよび／または変異体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、医学の分野に関し、より具体的には、心臓病学の分野に関する。本発明は、特に、心不全を発生させる危険がある被検者を診断および／または処置するための手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたる高血圧、弁膜症または糖尿病のような他の慢性障害中に起こる慢性的な心負荷は、心不全の最も重要な危険因子の一つである心肥大を誘発することが一般に知られている。うっ血性心不全（ＨＦ）は一般的な症候群であるが、重症で複雑な臨床症候群でもあり、とりわけ高齢者にあっては、心収縮機能の低減および運動耐容能の低下に特徴づけられる。心不全の症状には、例えば肺水腫および末梢性浮腫、疲労および／または呼吸困難などが含まれる。重症心不全は、他の臓器が十分な血液を供給されていないので、それら他の臓器の機能低下にもつながり得る。
【０００３】
しかし全ての肥大心が最終的に不全を起こすわけではない。つまり、生命を脅かす合併症を発生させるまで進行する患者はかなりの数に上るものの、他の患者は長期間にわたって安定した状態を保ち得る。この肥大から心不全への移行に先行し、その前ぶれとなる分子変化は、今のところ完全にはわかっていない。
【０００４】
心不全などの高血圧性末端臓器損傷を発生させる危険がある患者の早期同定によって急速な進行を防止し得るので、心不全を起こしそうな患者を実際にそのようになる前に同定（診断）できることは好ましい。このようにして早期に診断された患者は、心不全の発症を防止するために、処置を受けることができる。また、重症合併症を発生させる危険がある心不全を患っている患者を同定できることも好ましい。
【０００５】
現在の方法は、現に存在する心不全を確実に排除することはできるものの、心不全の存在を確実に証明することはできず、これらの方法では、確立した心不全の転帰を予言することも、心不全の出現を予言することもできない。
【０００６】
したがって、心不全を発症する可能性を予言し、かつ／または既に確立した心不全の転帰を予言するための簡単で信頼できる方法が必要とされている。また、心不全を発生させる危険がある患者を心不全および／またはその合併症が出現する前に処置するための手段および方法の開発は、臨床上極めて重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、心不全を発生させる特別な危険がある患者および／または心不全の合併症を発生させる特別な危険がある患者を同定することができる診断方法を提供することである。心不全を発生させる危険がある患者および／または心不全の合併症を発生させる危険がある患者を処置するための手段および方法を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、心不全を発生させる危険がある被検者を診断するための方法であって、
（ａ）前記被検者の生物学的試料における１つ以上の生物学的マーカーのレベルを決定するステップ；
（ｂ）前記生物学的マーカーのレベルを同じ生物学的マーカーの標準レベルと比較するステップ、および
（ｃ）生物学的マーカーのレベルが心不全を発生させる危険を示すかどうかを決定するステップ、
を含み、生物学的マーカーがリソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）および／またはクルッペル様転写因子１５（ＫＬＦ１５）である方法を提供することによって、この目的を達成する。
【０００９】
本発明につながった研究では、心不全の発生に関与する遺伝子がいくつか同定された。同定された遺伝子を表２に列挙した。さらにまた、前記遺伝子によってコードされる特定のポリペプチドが実際に心不全と機構的に関連することも証明された。特に、表２の遺伝子によってコードされる特定のタンパク質は、心肥大から心不全への移行の原因となる分子機構に関与すること、したがって、心不全を発生させる危険がある患者を同定するための生物学的マーカーとして使用できることが証明された。また、これらのタンパク質、および／または前記タンパク質をコードする遺伝子、および／または前記タンパク質および／または遺伝子のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドフラグメントまたは変異体は、危険に曝されている患者を処置するためのターゲットとして使用することもできる。
【００１０】
特に、本発明によれば、特定の介在板コンポーネント、特にリソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）およびクルッペル様転写因子１５（ＫＬＦ１５）は、心肥大から心不全への移行を予言する分子機構に関与し、心不全を発生させる危険がある個体を同定するための生物学的マーカー（バイオマーカー）として、適切に使用できることが証明された。
【００１１】
このようにして、本発明によれば、心不全を発生させる危険がある被検者を、前記被検者の生物学的試料において、１つ以上の同定された生物学的マーカーのレベルを決定し、前記マーカーのレベルを標準レベルと比較することによって同定できることが見出された。前記標準レベルは健常な被検者から導き出される。すなわち標準レベルとは、健常な人（すなわち心疾患を持たない人）の前記生物学的試料における前記生物学的マーカーのレベルである。試験した生物学的マーカーのレベルが前記標準レベルと比較して変化している場合、例えば（当該特定の生物学的マーカーに依存して）上昇または下降している場合、その被検者はＨＦを発生させる危険および／または心不全の重症合併症を発生させる危険がある。
【００１２】
心不全の（好ましくは臨床症状が出現する前の）早期診断は、診断された患者の処置などによって、例えば基礎疾患への対処を成功させたり、かつ／またはさらなる心筋機能障害および臨床症状の悪化を防止したりするのに不可欠である。
【００１３】
本発明につながった研究では、高血圧による肥大を起こしていて、伝統的な技法（心エコー法）では十分に機能的であり代償性であるように見えたが、心不全を発生させることが後に判明した心臓から得られる数多くの遺伝子の遺伝子発現プロファイルが調べられた。この発現プロファイルは、やはり高血圧ゆえに肥大を起こしていて、伝統的な技法（心エコー法）では同様に十分に機能的で代償性であるように見えたが、心不全を発生させないことが後に判明し、安定した状態を保った心臓から得られる遺伝子発現プロファイルと比較された。この方法で、後に発生する心不全の出現を予言する遺伝子が同定され、これらは、本発明によれば、肥大および心不全への移行の新規で極めて重要なモジュレーターであることが明らかになった。これらの遺伝子を表２に列挙した。次に、特定の好ましい生物学的マーカー、特に特定の介在板関連生物学的マーカーが同定された。介在板（ＩＤ）は、心臓の心筋繊維を構成する心筋細胞間の結合部を形成する。すなわち介在板は、細胞間の機械的および電気的カップリングをもたらし、心臓組織の同期的収縮を支えている特殊な細胞間結合である。
【００１４】
このように本発明によれば、標準発現レベルと比較したＬＩＭＰ−２の心臓発現量の増加によって、顕性心不全に進行しやすい肥大心が同定されることが証明された。例えば、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける心臓発生は正常であるが（Ｇａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００３）、高血圧はこれらのマウスにおける拡張型心筋症を誘発した。ＬＩＭＰ−２は極めて重要な心臓アドヘレンスジャンクションタンパク質Ｎ−カドヘリンに結合し、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の適正な相互作用を確保するために不可欠であることが示された。さらにまた、心不全に進行する寸前の肥大ラット心臓ではＬＩＭＰ−２の発現量が増加することも見出されたので、心筋細胞によるＬＩＭＰ−２発現量の増加は、その心筋が機械的な力を正常化できないことを予告していると考えられる。したがって、ＬＩＭＰ−２発現量の増加は、悪化しつつある負荷に応答しようとする心筋の絶望的な試みであるとみることができ、切迫した不全を示し得る。そのうえ、ＬＩＭＰ−２発現量は、臨床的に重症な圧負荷を持つ患者では有意に増加することも示された。したがって、高血圧被検者におけるＬＩＭＰ−２タンパク質のレベルおよび／またはＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子の発現レベルを決定し、前記レベルを標準レベルと比較し、次に、そのレベルが心不全を発生させる危険を示すかどうかを決定することにより、今まさに圧力に屈しようとしている心筋を極めて初期の段階で同定することが可能である。特に、標準レベルと比較したＬＩＭＰ−２タンパク質レベルの増加および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子発現レベルの増加は、心不全および／または心不全関連合併症を発生させる危険を示す。
【００１５】
本発明につながった研究では、さらに、クルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）をコードする遺伝子が、心不全へと急速に進行する肥大心を特徴づけることも示された。これはリアルタイムＰＣＲによって確認され、このリアルタイムＰＣＲは、ＫＬＦ１５が代償性ＬＶＨにおいてダウンレギュレートされるが、不全へと急速に進行する肥大心ではＫＬＦ−１５が、より一層抑制されることを示した。さらに、ＫＬＦ１５は心筋細胞において心肥大の抑制因子としての役割を持つことが示された。したがって、ＫＬＦ１５タンパク質のレベルおよび／またはＫＬＦ１５をコードする遺伝子の発現レベルを決定し、前記レベルを標準レベルと比較することも、心不全を発生させそうな患者を極めて初期の段階で同定するのに役立つ。ＫＬＦ１５の場合は、標準レベルと比較した、生物学的試料におけるＫＬＦ１５タンパク質レベルの低下および／またはＫＬＦ１５遺伝子発現量の低下が、心不全の発生を示す。
【００１６】
本発明は、インビボ法、すなわち生物学的マーカーのレベルがインビボの生物学的試料において決定される方法にも、インビトロ法にも関係する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、生物学的マーカーのレベルが、個体から得られる生物学的試料において、インビトロで決定される。本発明の生物学的マーカーのレベルをインビトロで決定するには、この研究によって同定された生物学的マーカーを含み得る任意の体液の適切な生物学的試料をどれでも使用することができる。好ましくは、生物学的試料は、血液、血漿、血清、心臓組織からなる群より選択される。より好ましくは、生物学的試料は、末梢血試料、または末梢血から得られる血漿もしくは血清試料である。末梢血試料は、例えば、患者から容易に採取することができ、カテーテル挿入などの複雑な侵襲的手技を必要としない。生物学的試料は、試験用試料を調製するために、周知の技法に従って処理することができる。
【００１８】
本発明の生物学的マーカーのレベルを測定するには、当技術分野で知られる通常の方法を利用することができる。
【００１９】
生物学的マーカーがタンパク質および／またはそのフラグメントおよび／または変異体である場合は、特定のタンパク質および／またはそのフラグメントおよび／または変異体のレベルを決定するための、当業者に周知の、いくつかの通常の方法を使用することができる。マーカーのレベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的アッセイを使って測定することができ、したがって、簡単で再現性があり信頼できる方法が得られる。そのようなアッセイで使用するための抗体は入手可能であり、抗体を発生させるための周知の標準的技法を使って追加の（ポリクローナルおよびモノクローナル）抗体を発生させてもよい。生物学的タンパク質マーカーのレベルを測定するための他の方法として、例えば（免疫）組織化学、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ＲＩＡ、競合アッセイ、およびそれらの任意の組合せを、さらに挙げることができる。インビボでは、例えば非分泌タンパク質のレベルを、関心対象のタンパク質の一つに対する特異的抗体を標識およびタグ付けすることによって決定することができる。これにより、心臓中のタンパク質の量を、いわゆる「分子イメージング」技法によって可視化することができる。
【００２０】
生物学的マーカーが遺伝子、および／またはそのポリヌクレオチドフラグメントおよび／または変異体、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど、例えば特定のタンパク質をコードする遺伝子、または転写されたｍＲＮＡである場合は、例えば心臓生検材料における生物学的マーカーを、例えば周知の分子生物学的アッセイ、例えばその特定ポリヌクレオチドを指向するプローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーション技法などによって測定することができる。本発明に従って使用することができる、核酸に基づく他のアッセイには、例えばＲＴ−ＰＣＲ、核酸に基づくＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット法、およびそれらの任意の組合せが含まれる。
【００２１】
診断方法の特異性および／または感度を強化するために、本発明の方法は、１つ以上の他の（生物学的）マーカーのレベルの検出を含んでもよい。すなわち、本発明の生物学的マーカーの検出は、心不全の発生を示す他のマーカーの検出と適切に組み合わせることができる。
【００２２】
さらに本発明は、上述の診断方法を実施するためのキットに関する。特に本発明は、心不全を発生させる危険がある被検者を同定するためのそのような診断キットであって、前記被検者の１つ以上の生物学的試料を受け取るための手段、および前記被検者の前記生物学的試料における生物学的マーカーのレベルを決定するための手段を含むキットに関する。このようにして、信頼できる簡便な診断ツールとして使用することができるキットが提供される。生物学的試料を受け取るための手段は、例えば、標準的なマイクロタイタープレートのウェルを含み得る。前記被検者の前記生物学的試料における介在板関連生物学的マーカーのレベルを決定するための手段は、例えば、本発明によって同定された生物学的マーカーを検出するのに適した１つ以上の特異的抗体、ポリヌクレオチドプローブ、プライマーなどを含み得る。これらのキットはさらに較正手段および使用説明書も含み得る。
【００２３】
本発明は、心不全を防止および／または処置するための化合物を同定するためのスクリーニング方法における、本発明の生物学的マーカーおよび／またはそのフラグメントおよび／または機能的変異体の使用にも関係する。ある特定実施形態において、心不全を防止および／または処置するための化合物を同定するための方法は、
（ａ）１つ以上の化合物を、表２に列挙するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２）、および／またはそのフラグメントおよび／または変異体と接触させること；
（ｂ）前記ポリペプチドに対する化合物の結合アフィニティーを決定すること；
（ｃ）哺乳動物細胞の集団を、少なくとも１０μＭの結合アフィニティーを示す化合物と接触させること；および
（ｄ）心不全を防止および／または処置する能力を持つ化合物を同定すること、
を含む。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法で試験されるポリペプチドは、インビトロで、例えば溶液中に遊離した状態、固形支持体に固定された状態、細胞表面に担持された状態、もしくは細胞内に位置する状態で試験するか、またはインビボで試験することができる。
【００２５】
これらの方法を実施するには、複合体を非複合体型のポリペプチドから容易に分離できるように、そしてまたアッセイの自動化に適応させるために、本発明のポリペプチドまたは化合物のどちらか一方を固定化することができる。本発明のポリペプチドと化合物との相互作用（例えば結合）は、反応物を入れるのに適した任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および遠心分離管が含まれる。
【００２６】
化合物とポリペプチドとの結合アフィニティーは、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用するなどの当技術分野で知られる方法によって、標識化合物を使った飽和結合解析（例えばＳｃａｔｃｈａｒｄとＬｉｎｄｍｏの解析）によって、置換反応によって、示差ＵＶ分光測光器、蛍光偏光アッセイ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー移動、および生物発光共鳴エネルギー移動によって測定することができる。化合物の結合アフィニティーは、解離定数（Ｋｄ）またはＩＣ５０もしくはＥＣ５０で表すこともできる。ＩＣ５０は、そのポリペプチドへの別のリガンドの結合を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度を表す。ＥＣ５０は、インビトロで最大効果の５０％を得るのに必要な濃度を表す。解離定数Ｋｄは、リガンドがポリペプチドにどのくらいよく結合するかの尺度であり、ポリペプチド上の結合部位の正確に半分を飽和させるのに必要なリガンド濃度に等しい。高アフィニティー結合をする化合物は低い（すなわち１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲の）Ｋｄ、ＩＣ５０およびＥＣ５０値を持ち、中〜低アフィニティー結合は、高い（すなわちμＭ領域の）Ｋｄ、ＩＣ５０およびＥＣ５０値に関係づけられる。
【００２７】
本発明は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品用の医薬品を調合するための、表２に列挙する遺伝子および／またはタンパク質（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子および／またはタンパク質）の使用にも関係する。
【００２８】
好ましくは、本発明は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品を製造するための、表２に列挙する遺伝子および／またはタンパク質（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子および／またはタンパク質）のモジュレーターの使用に関する。
【００２９】
本願において、モジュレーターは、本発明によって減少することが見出された生物学的マーカーの１つ以上の発現を刺激し、かつ／またはそのレベルを増加させる任意の化合物（例えばアゴニスト）、または本発明によって増加することが見出された生物学的マーカーの１つ以上の発現を抑制し、かつ／またはそのレベルを低下させる任意の化合物（例えばアンタゴニスト）であることができる。
【００３０】
医薬品は、タンパク質に基づく分子、例えばタンパク質マーカーに対する抗体、および／またはそのフラグメントおよび／または変異体であることができる。本発明は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物、ＦｖフラグメントおよびＦｖ発現ライブラリーの産物も包含する。
【００３１】
もう一つの選択肢として、医薬品は、核酸に基づく分子であることもできる。例えば、遺伝子のダウンレギュレーションは、翻訳レベルまたは転写レベルで、アンチセンス核酸などを使って達成することができる。アンチセンス核酸は、あるタンパク質をコードする核酸および／または対応するｍＲＮＡの全部または一部と特異的にハイブリダイズする能力を持つ核酸である。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの製造は、当技術分野では知られている。医薬品は低分子干渉（ヘアピン）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も含み得る。ｓｉＲＮＡは、サイレンシングを受けるＲＮＡに配列が相同な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）による遺伝子サイレンシングの翻訳後プロセスを媒介する。ｓｉＲＮＡの製造は当技術分野では知られている。同様に、遺伝子のアップレギュレーション（または過剰発現）も、当技術分野で知られるいくつかの方法によって達成することができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、モジュレーターがＴＧＦβの阻害剤である。本発明によれば、ＫＬＦ−１５の抑制が不全易発型肥大の発生において、極めて重要なステップであること、およびＴＧＦβがＫＬＦ−１５を強く抑制することが示された。したがって、現在さまざまな分野で開発されているＴＧＦβの阻害剤は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品の開発に適切に使用し得る。本発明に従って使用することができるＴＧＦβの適切な阻害剤の例はＳｃｉｏｓ Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）が製造するＴＧＦβ受容体阻害剤であり、この会社はそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｏｓｉｎｃ．ｃｏｍ／ｓｃｉｏｓ／ｔｇｆ）に、「ＳｃｉｏｓはＴＧＦ−ベータのその受容体における作用を阻害するように設計された強力な新規小分子阻害剤を開発した。これらの小分子は、動物に経口投与した場合、瘢痕形成（線維症）を減少させるのに有効であることが明らかになった。Ｓｃｉｏｓは、異なる化合物クラスを代表する２つのリード分子を、未だ有効な治療方法がない医療ニーズを持つ患者における疾患状態を処置するために使用できる可能性を持つ前臨床開発へと推し進めるつもりである」と表示している。
【００３３】
さらに本発明は、本発明に従って同定されたタンパク質の使用であって、同定されたタンパク質の１つ以上のレベルを評価し、よって心不全を発生させる危険がある被検者を同定する目的で、同定されたタンパク質の１つ以上の（分子）イメージングに使用される診断手段を作製するための使用に関する。診断手段は、例えば、生物学的タンパク質マーカーに対する標識された抗体を含み得る。
【００３４】
以下の図面および実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｒｅｎ−２ラットにおけるＬＩＭＰ−２の発現量の増加である。図１Ａは、Ｒｅｎ−２ラットが同等の心肥大を示し、短縮率では心不全に進行するラットまたは代償性に留まるラットを識別することができない１０週齢時に、左室心臓生検材料を採取した。１５〜１８週齢時にＲｅｎ−２ラットの一部が心不全を発生させ、残りは２１週齢時に屠殺するまで代償性に留まった。*、Ｐ＜５ｅ-6。図１Ｂは、１０週齢肥大Ｒｅｎ−２ラットにおけるマイクロアレイ解析により、不全易発性ラット（ＨＦ易発性ＬＶＨ、ｎ＝４）では、代償性に留まった肥大ＬＶ（ｃｏｍｐ ＬＶＨ、ｎ＝６）および対照群（ｎ＝４）と比較して、ＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡが特異的に過剰発現されることが見出された。図１Ｃは、末期不全Ｒｅｎ−２ラット（ＨＦ、ｎ＝９）では、代償性Ｒｅｎ−２ラット（ｃｏｍｐ、ｎ＝６）と比較して、ＬＩＭＰ−２タンパク質がアップレギュレートされた。不全性および代償性Ｒｅｎ−２ラットはどちらも、ＬＩＭＰ−２タンパク質のレベルが、対照ラット（ｎ＝６）と比較して有意に上昇していた。*、対照に対してＰ＜０．０５；**、対照に対してＰ＜０．０１；＄、ｃｏｍｐに対してＰ＜０．０５；Ｍｗｍ、分子量マーカー；ａｕ、任意単位。
【図２】ＡｇｎＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯ（ＫＯ Ａｎｇ）マウスは拡張型心筋症を持つ。図２Ａは、ＷＴ Ａｎｇマウス（ｎ＝１４）がそのＬＶ重量を有意に増加させるのに対して、ＫＯ Ａｎｇ（ｎ＝１４）マウスはＬＶ重量を増加させなかった（*、ＷＴ（ｎ＝８）およびＫＯ Ａｎｇに対してＰ＜０．０１）。ＫＯ Ａｎｇマウスにおいて、個々の筋細胞はその体積を増加させることができなかった（ＷＴおよびＫＯ、ｎ＝４；ＷＴ ＡｎｇおよびＫＯ Ａｎｇ、ｎ＝５；筋細胞面積（ａｕ）：ＷＴ Ａｎｇにおける３０８±１４に対して、２６４±４２；*、Ｐ＜０．０１）。バーは５０μｍを表す。図２Ｂは、ＬＩＭＰ−２ ＫＯ（ｎ＝３）およびＷＴ（ｎ＝４）マウスは、ＡｎｇＩＩに対して同等の血圧応答を示した。図２Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置したＷＴ（ｎ＝８）およびＫＯ（ｎ＝８）はＢＮＰおよびＡＮＦ ｍＲＮＡ発現量に同等の増加を示したが（*、ベースライン（ｎ＝４）に対してＰ＜０．０５）、ａｓｋａ ｍＲＮＡ発現の誘導はＫＯ Ａｎｇマウスの方が、それらの減少した筋細胞体積と合致して、有意に少なかった（*、ＫＯ（ｎ＝４）に対してＰ＜０．０５；$、ＷＴ Ａｎｇに対してＰ＜０．０５）。図２Ｄは、ＷＴ（ｎ＝１０）マウスとＫＯ（ｎ＝１１）マウスとはベースライン心エコーパラメータが類似していた（０日目）。１４日間および２８日間のＡｎｇＩＩ後に、野生型ＬＶ壁は有意に肥大したのに対して、ノックアウトは肥大を示さず、それどころか拡張していた（*、ベースラインおよびＫＯ Ａｎｇに対してＰ＜０．００５；＄、ベースラインおよびＷＴ Ａｎｇに対してＰ＜０．００５）。図２Ｅは、ＫＯ Ａｎｇマウスでは、ドブタミンに対するベータ−アドレナリン作動性応答が減少した（ＷＴおよびＫＯ、ｎ＝４；ＷＴ Ａｎｇ、ｎ＝１４；ＫＯ Ａｎｇ、ｎ＝９；*、Ｐ＜０．００５）。ＬＶＷ／ＢＷ、体重に関して補正したＬＶ重量。
【図３】ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは広範な間質性線維症を持つ。ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウス（ｎ＝４）および野生型マウス（ｎ＝５）のＬＶのシリウスレッド染色はノックアウトマウスにおける著しい間質性線維症を示し（*、ＷＴ ＡｎｇおよびＫＯベースラインに対してＰ＜０．０２）、ＡｎｇＩＩで処置したノックアウトマウスおよび野生型マウスはどちらも同程度の血管周囲線維症を示す。バーは２５０μｍを表す。
【図４】ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは筋細胞の錯綜配列を示す。ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスのデスミン染色心筋細胞は、これらのマウスにおける、より多量で、より不規則なデスミン発現が示すように、錯綜配列を示し、乱された内部構造を持つ。バーは２５０μｍを表す。
【図５】ＬＩＭＰ−２発現は他の形態の心臓ストレスにおいてアップレギュレートされる。図５Ａは、新生仔ラット心筋細胞では、６時間伸展によってＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡ発現量が上昇した（各群ｎ＝４）。図５Ｂは、ＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡは、１０週間の運動訓練を受けたラット（週５日、ｎ＝６）から得られる肥大心筋でも、非肥大対照ラット（ｎ＝７）と比較してアップレギュレートされた。図５Ｃは、大動脈狭窄を患う患者（ＬＶＨ、ｎ＝２０）から得られる肥大心筋でも、非肥大対照患者（ｎ＝７）と比較してアップレギュレートされた。（*、対照に対してＰ＜０．０５；**、対照に対してＰ＜０．０１；ＬＶＨ；ＬＶ肥大）
【図６】ＬＩＭＰ−２は心筋細胞の形質膜に存在し、介在板機能にとって重要である。図６Ａは、抗ＬＩＭＰ−２で染色した圧過負荷マウスＬＶのパラフィン包埋組織切片は、細胞内コンパートメント（*）だけでなく、心筋細胞の形質膜（黒い三角形）上でも陽性染色を示す。スケールバーは２５０μｍを表す。図６Ｂは、圧過負荷ラットＬＶ組織切片における抗ＬＩＭＰ−２を使った免疫電子顕微鏡法も、形質膜におけるＬＩＭＰ−２の存在を示す（黒い三角形）。スケールバーは１μｍを表す。図６Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置した野生型マウスでは電子顕微鏡法が正常な介在板を示すのに対して、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスでは、介在板がより高度な屈曲およびより高濃度なアドへレンスジャンクション（右側のパネル中の濃い黒色スポットに注目）を持ち、それがこれらのマウスにおける拡張型心筋症と並行する。バーは２μｍを表す。Ｍ、ミトコンドリア；ＩＤ、介在板；ａ、アドへレンスジャンクション；ｄ、デスモソーム。
【図７】ＬＩＭＰ−２はカドヘリン分布を調節する。図７Ａは、ＬＩＭＰ−２は新生仔ラット心室筋細胞中のカドヘリンに結合する。ＬＩＭＰ−２を免疫沈降（ＩＰ）させ、総細胞溶解物（インプット）、上清（ｓｕｐ）および沈降したタンパク質溶解物（ＩＰ）中のカドヘリンを免疫ブロット（ＩＢ）した。心筋細胞中のカドヘリンタンパク質含有量の一部がＬＩＭＰ−２によって結合される。図７Ｂは、対照被検者および２人の心不全患者の組織切片を、抗パンカドヘリン（赤）および抗ＬＩＭＰ−２（緑）で免疫蛍光的に染色した。矢印（黒い三角形）は、心筋細胞のＩＤにおけるＬＩＭＰ−２とカドヘリンの共局在を示す。バーは５０μｍを表す。図７Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトＬＶおよび野生型ＬＶの組織切片を、抗パンカドヘリンで免疫染色した。野生型マウスではカドヘリン分布が介在板に限定されてカドヘリンの規則的な外観をもたらしているのに対して、ＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスではカドヘリンの局在が、厳密な介在板への配置によってもたらされる典型的パターンを失っている。バーは２５０μｍを表す。
【図８】ＬＩＭＰ−２は、リン酸化ベータ−カテニンのカドヘリンへの結合を調節することによって、介在板の完全性を調節する。図８Ａは、ＬＩＭＰ−２に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬＩＭＰ−２）または対照ｓｈＲＮＡのどちらか一方で処置した新生仔ラット心筋細胞の溶解物の免疫ブロット（ＩＢ）。１０日間の培養後に、心筋細胞はＬＩＭＰ−２タンパク質の９２％ノックダウンを示す。タンパク質負荷量が等しいことはＧＡＰＤＨによって確認した。図８Ｂは、免疫ブロット（ＩＢ）により、ｓｈＬＩＭＰ−２溶解物では、対照溶解物と比較して、抗パンカドヘリンによる免疫沈降（ＩＰ）後のＰ−ベータ−カテニンのレベルが低減することが示される。対照ＩＰ溶解物およびｓｈＬＩＭＰ−２ ＩＰ溶解物におけるカドヘリン負荷量は同等だった。総ｓｈＬＩＭＰ−２タンパク質溶解物および対照タンパク質溶解物におけるベータ−カテニンのリン酸化は同等だった。*、Ｐ＝Ｏ．０００６。図８Ｃは、抗パンカドヘリンによる免疫沈降の特異性を示す免疫ブロット。パンカドヘリン抗体の代わりにＩｇＧをタンパク質溶解物に加ると、Ｐ−ベータ−カテニンは結合されない。
【図９】図９Ａは、１０週齢時点のＲｅｎ−２ラットから得た左室生検材料におけるリアルタイムＣＲで評価したＫＬＦ１５発現。生検後はラットを回復させ、それらが不全に進行するか代償性のまま留まるかを決定するために追跡した。ＫＬＦ１５の発現は、代償性のまま留まった肥大心では有意にダウンレギュレートされるが、顕性不全に急速に進行した肥大心では、有意に、より一層抑制されることから、不全易発型の心肥大はＫＬＦ１５抑制のレベルによって同定されることが示される。図９Ｂは、肥大心筋と比較した、正常圧対照心臓における、ＫＬＦ１５に関するインサイチューハイブリダイゼーション。正常心臓における広範囲にわたる核染色が多数の心筋細胞では失われ、非筋細胞核には残存染色があることから、ＫＬＦ１５発現は心筋細胞で特異的に出現することが示される。図９Ｃは、低分子ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス導入によるＫＬＦ１５の安定ノックダウンは培養ＮＲＶＭにおけるＢＮＰの発現を誘導した。
【図１０】図１０Ａは、培養心筋細胞へのＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加はＫＬＦ１５ ｍＲＮＡ発現をほぼ完全に抑制した。低分子ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス導入によるＴＧＦβＩ型受容体の安定ノックダウンはこの効果を打ち消したことから、ＴＧＦβはそのＴＧＦβＩ型受容体を介してＫＬＦ１５発現を抑制する能力を持つことが証明された。図１０Ｂは、ＴｇｆβＩ型受容体に対して免疫ブロットした全心臓ホモジネートは、ＴｇｆβＩ型受容体の発現量の本質的かつ有意な低下を示すが、この受容体の完全な喪失は示さない。図１０Ｃは、ＷＴ心臓をＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスと比較すると、ｃｒｅの筋細胞特異的活性化は、心筋細胞からの明確でロバストなＴＧＦβＩ型受容体の喪失をもたらしたことが、免疫組織化学によって証明される。図１０Ｄは、アンギオテンシンＩＩ注入は、Ｗｔマウスにおいて有意な肥大応答を誘発し、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスではこれが弱められた。図１０Ｅは、アンギオテンシンＩＩ注入は、心機能の喪失の指標である短縮率の有意な低下を誘発し、これはＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβ受容体マウスでは弱められた。図１０Ｆは、アンギオテンシンＩＩ注入とそれに続く肥大はＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを誘発し、これはＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβ受容体マウスでは弱められた。
【図１１】上側の図は、緑色蛍光タンパク質（ＡＡＶ９−ＧＦＰ）注射と比較して、ＡＡＶ９−ＫＬＦ１５注射後のマウス心臓では、ＫＬＦ１５ ｍＲＮＡが有意にアップレギュレートされることを示す。**：ＧＦＰ群との比較でｐ＜０．０５。*：ＧＦＰ群との比較でｐ＜０．０５。＃：ＧＦＰ＋ＡｎｇＩＩ群との比較でｐ＜０．０５。下側の図は、ＡｎｇＩＩ刺激後のＡＡＶ９−ＧＦＰ群と比較して、ＡｎｇＩＩ刺激後のＡＡＶ９−ＫＬＦ１５群では、肥大が有意に少ないことを示す（＃：ｐ＜０．０５）。スチューデントのｔ検定による統計解析、ｎ＝３〜５匹／群。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（実施例１）
リソソーム内在性膜タンパク質２は介在板の新規コンポーネントであり、心筋症を防止する
（材料と方法）
Ｒｅｎ−２ラット、マイクロアレイ解析および免疫ブロッティング
１０週齢のＲｅｎ−２ラットおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｍｏｅｌｌｅｇａｒｄ、デンマーク国Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｌｄ）から、ＬＶの生検材料を、以前記述されたように採取した（Ｖａｎ Ｈａａｆｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ラットを１０、１２、１５、１６、１８、１９および２１週齢で一連の心エコー法によって追跡し、心不全の臨床徴候があった場合（心不全易発性／ＨＦ易発性ラット）は１５〜１８週で、また、不全の臨床徴候が現れなかった場合（代償性／ｃｏｍｐラット）は２１週齢で屠殺した。全ＲＮＡを、以前記述されたように、ＬＶ生検材料から単離、増幅し（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｅｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット２３０ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ５．０で解析した。ＬＶタンパク質抽出物（５０μｇ）をポリクローナルウサギ抗ＬＩＭＰ−２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏ，１：５００）およびポリクローナルウサギ抗ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；１：１０，０００）で免疫ブロットした。
【００３７】
ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウス、ＲＮＡ単離および定量ＰＣＲ解析
体重２０〜２５グラムの１０〜１２週齢雄ＬＩＭＰ−２ ＫＯおよびＷＴ Ｃ５７／Ｂ１６マウスを使用した。ＡｎｇＩＩの血圧効果を調べるために、毎分０．５、１．５、５、１５、および５０ｎｇという用量での静脈内注入中に、動脈圧を監視した。ＬＶ肥大の発生を調べるために、浸透圧ミニポンプ２００４（Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）により、２８日間にわたってＡｎｇＩＩ（１．５μｇ／ｇ／日）を皮下注入した。
【００３８】
心エコー法を０日目、１４日目および２８日目に行った。２８日目に、Ｍｉｌｌａｒ（登録商標）を使って、基礎条件下およびドブタミン刺激条件下で、マウスを血行動態学的に監視し（ｄＰ／ｄｔ）、その後にＬＶを摘出した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使って単離し、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒでＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ解析を行うことにより、ＢＮＰ、ＡＮＦおよびアルファ−骨格アクチン（ａｓｋａ）発現量を決定した（表１）。ＬＶ切片を、以前記述されたように、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）およびピクロシリアスレッド（Ｐｉｃｒｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｒｅｄ）（ＳＲ）で染色するか（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、モノクローナルマウス抗パンカドヘリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ；１：５００）およびモノクローナルマウス抗ヒトデスミン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ，１：５０）で免疫組織学的に染色した。超微細構造解析を、透過型電子顕微鏡法により、以前記述されたように行った（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【００３９】
大動脈狭窄および心不全患者におけるＬＩＭＰ−２
以前記述されたように（Ｈｅｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、２０人の大動脈狭窄患者および７人の非肥大対照患者から得た経壁生検材料からＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ解析を行うことにより、ＬＩＭＰ−２発現量を決定した（表１）。
【００４０】
ウサギ抗ＬＩＭＰ−２（１：２５０、Ｃｙ２）およびマウス抗パンカドヘリン（１：５００、Ｃｙ３）による二重免疫蛍光染色を、対照被検者１人および３５％未満の駆出率と定義される顕性心不全で死亡した患者２人の切片で行った。核対応物をＴｏｐｒｏ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で染色した。切片をレーザースキャン共焦点システム（Ｌｅｉｃａ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で画像化し、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、×１２６の最終倍率でデジタル化して解析した。この研究はＡｃａｄｅｍｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＭａａｓｔｒｉｃｈｔおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｅｕｖｅｎの各倫理委員会によって承認され、全ての患者からインフォームドコンセントを得た。
【００４１】
細胞培養およびレンチウイルスベクター
相補的なｓｈＬＩＭＰ−２オリゴヌクレオチド（表１）をアニールさせ、それらをＨｐａＩＸｈｏＩ消化したｐＬＬ３．７ｐｕｒｏベクターＤＮＡ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）のＬｕｋ ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓの厚意で提供されたものから改変）中にライゲートすることにより、ラット−ＬＩＭＰ−２ ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを作製した。３μｇのｓｈＬＩＭＰ−２／ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏまたは空のｐＬＬ３．７ｐｕｒｏとパッケージングベクターとを２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で同時トランスフェクトすることによってレンチウイルス産生を行い、ウイルス含有上清を４８時間後に収集した。以前記述されたように（Ｄｅ Ｗｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、１〜２日齢新生児ラットの酵素的解離によって、ラット心室心筋細胞（ＲＣＭ）を単離した。レンチウイルス感染のために、ゼラチン処理した６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０5細胞の密度でＲＣＭを入れ、１０％ウマ血清、５％新生仔ウシ血清、グルコース、ゲンタマイシンおよびＡｒａＣを補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中で一晩培養し、翌日、ｓｈＬＩＭＰ−２レンチウイルスまたは空レンチウイルスに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。ピューロマイシン選択（３μｇ／ｍｌ）後に、感染効率は８０％を上回った。１０日間の培養後に、細胞タンパク質を単離し、抗ＬＩＭＰ−２（１：１００）、モノクローナルマウス抗パンカドヘリン（Ｓｉｇｍａ、１：１００）またはＩｇＧによる免疫沈降（ＩＰ）に付した。ＩＰ溶解物を、モノクローナル抗パンカドヘリン（１：５０００）、ポリクローナル抗ホスホ−ベータ−カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ，１：１０００）およびモノクローナル抗ベータ−カテニン（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ，１：１０００）で免疫ブロットした。
【００４２】
伸展実験のために、ＲＣＭをコラーゲンＩ型被覆シラスティック膜（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上で培養し、６時間の間、静的等二軸伸展に付した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＲＮＡを単離し、ＬＩＭＰ−２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＲＴ−ＰＣＲを行った（表１）。動物実験を伴う試験プロトコルは全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔの動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理および使用に関するオランダ法に記載の公定規則（ＮＩＨの規則と極めてよく似たもの）に従って行われた。
【００４３】
（統計解析）
データを平均±ＳＥＭとして表す。適宜、マン−ホイットニー検定またはスチューデントのｔ検定を使って、各試験群についてのデータを比較した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【００４４】
（結果）
表２に、代償性Ｒｅｎ−２ラットと比較して不全易発性Ｒｅｎ−２ラットにおいて差次的に発現される遺伝子の一覧を示す。これは、全てのラットがまだ代償性肥大を持っている１０週齢で採取した心臓生検材料から導き出されたものであるから、これらの遺伝子の差次的発現は、Ｒｅｎ−２ラットにおける心不全の発生に先行して起こる。
【００４５】
表３に、ベースライン時ならびに１４日間および２８日間のＡｎｇＩＩ処置後のＬＩＭＰ−２ ＷＴおよびＫＯマウスの詳細な心エコーデータを示す。
【００４６】
（不全易発性ＬＶ肥大の遺伝子発現プロファイル）
１０匹のホモ接合Ｒｅｎ−２ラットにおいて、１０週齢時の代償性ＬＶ肥大段階で、心臓生検材料を得た。４匹のラットは、生検材料を採取した後、５週間以内に、心不全へと急速に進行し、残り６匹のラットは生検後１１週間にわたって代償性のままだった（図１Ａ）。これらの生検材料で、Ｔ７に基づく線形増幅と、それに続くＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ２３０ ２．０遺伝子発現解析を行うことにより（ＧＥＯ番号ＧＳＥ４２８６）、心不全へと急速に進行する肥大心でのみアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる１４３個の差次的発現遺伝子が同定された（表２）。リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ−２は、心不全易発性ラットにおいてアップレギュレートされるｍＲＮＡの一つであり（図１Ｂ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）１（Ｃｒｏｍｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびトロンボスポンジン２（データ未掲載）（後者は肥大から心不全への移行において極めて重要であることが先に示されている）と相互作用するというその能力を考えると、これは特に興味深い。図１Ｃは、ＬＩＭＰ−２タンパク質がＲｅｎ−２ラットにおける末期心不全でも役割を持つことを示している。
【００４７】
（アンギオテンシンＩＩはＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスにおける拡張型心筋症を誘発する）
リソソームタンパク質における機能喪失型突然変異は心不全と関連づけられているので（Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｔｙｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）誘発性高血圧のマウスモデルにおけるＬＩＭＰ−２の役割をさらに調べた。ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスおよび対照マウスに、４週間にわたってＡｎｇＩＩを皮下投与した。ＡｎｇＩＩ処置は、野生型マウスおいてＬＶ重量係数を３０％増加させたが、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスでは肥大応答が弱くなった（１４％のＬＶ重量係数増加；Ｐ＜０．０１）（図２ａ）。これは個々の心筋細胞面積の測定によって確認された。ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは、ＡｎｇＩＩ処置ＷＴ対照よりも、ＬＶ筋細胞面積が有意に小さかった（任意単位の筋細胞面積：ＡｎｇＩＩ処置野生型における３０８±１４に対して、ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは２６４±４２；Ｐ＜０．０１）。また、ＡｎｇＩＩが、ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、血管周囲線維症の同等な増加を誘発したのに対し（データ未掲載）、ＡｎｇＩＩは、野生型対照同腹仔とは対照的にＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスのＬＶにおいて広範な間質性線維症応答を誘発した（間質性線維症：ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスにおける１５．０±６．０％対ＡｎｇＩＩ処置対照における１．８±０．１％；Ｐ＜０．００２）（図３）。
【００４８】
デスミンに関する免疫組織化学的染色は、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける筋細胞錯綜配列を示した（図４）。
【００４９】
ＡｎｇＩＩは野生型マウスでもノックアウトマウスでも同じような血圧応答を誘発することが確認された（図２Ｂ）。ＬＶ肥大の減少にもかかわらず、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは、肥大に関する古典的マーカーである脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）および心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の通常の応答を示したことから（図２Ｃ）、肥大遺伝子発現プログラムはＡｎｇＩＩ処置時に正常に開始されることが示唆された。これとは対照的に、構造細胞肥大マーカーアルファ−骨格アクチンは、心筋細胞の肥大応答の減少（Ｓｔｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）を反映して、ＡｎｇＩＩ処置ＬＩＭＰ−２ノックアウトではＡｎｇＩＩ処置野生型と比較して、誘導される度合が有意に低かった（図２Ｃ）。一連の心エコー法により、ＡｎｇＩＩは、ＡｎｇＩＩ処置ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける有意な心拡張を誘発することが明らかになったのに対して、ＡｎｇＩＩ処置野生型は拡張を伴わない求心性ＬＶ肥大を示した（図２Ｄおよび表３）。また、ＡｎｇＩＩはＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける収縮予備能の喪失を誘発することが、ドブタミン注入に対する収縮応答の減少によって証明された（＋ｄＰ／ｄｔ ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは７９．８／秒±５．１、対してＡｎｇＩＩ処置対照では１００．０／秒±４．０；Ｐ＜０．００５）（図２ｅ）。
【００５０】
これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスでは、高血圧が通常の肥大応答を誘発せず、むしろ反応性間質性線維症および心機能の喪失を伴う拡張型心筋症を誘発した。
【００５１】
（ＬＩＭＰ−２発現は心臓ストレスによって調節される）
ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ヌルマウスが肥大応答を開始できなかったにもかかわらず、ＢＮＰおよびＡＮＦの発現は通常どおり誘導したという知見から、ＬＩＭＰ−２は機械的負荷に対する正常な応答の極めて重要な部分であることが示唆された。実際、ＬＩＭＰ−２発現はインビトロで心筋細胞伸展後に有意に増加し（Ｐ＝０．０２）、運動誘発性の生理的肥大でも増加する（Ｐ＝０．０４）ということも示された（図５Ａおよび５Ｂ）。ＬＩＭＰ−２が心圧負荷に対するヒトの適応にも関与することを確かめるために、顕性心肥大を持つ大動脈狭窄患者２０人および対照７人の心臓生検材料におけるＬＩＭＰ−２の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。この実験では、対照との比較で、大動脈狭窄患者の肥大心における有意なＬＩＭＰ−２アップレギュレーションが、マン・ホイットニー検定によって示された（１．２３倍；ｐ＝２．３ｅ-4）（図５Ｃ）。
【００５２】
（ＬＩＭＰ−２は心臓介在板に存在する）
次に、圧過負荷マウス心筋におけるＬＩＭＰ−２の発現パターンを、免疫組織化学によって解析した。このタンパク質は、予想どおり、心筋細胞および内皮細胞の液胞状細胞内区画に発現されるが、心筋細胞の形質膜上に非定型的に分布することも見出された（図６Ａ）。この知見は免疫電子顕微鏡法によって確認された（図６Ｂ）。目を引くことに、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトおよび対照左室切片の電子顕微鏡法では、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおけるＩＤの異常な形態が明らかになったことから、ＬＩＭＰ−２は正常なＩＤ生物学に関与し得ることが示唆される。細胞間接触部において、ＡｎｇＩＩ処置ＫＯ−ＩＤの膜は、より高濃度のアドへレンスジャンクションタンパク質を持つ、より高度な屈曲を示したことから（図６Ｃ）、ＩＤ構造の乱れが示唆された（Ｐｅｒｒｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＤの変化は拡張型心筋症の原因になることが示されているので（Ｐｅｒｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＬＩＭＰ−２はＩＤの適正な機能にとって極めて重要であり得ると推測された。
【００５３】
新生仔ラット心筋細胞タンパク質の免疫沈降により、ＬＩＭＰ−２はアドヘレンスジャンクションの極めて重要な構成要素であるＮ−カドヘリンと物理的に相互作用することが示された（図７Ａ）。この知見はヒトも当てはまった。というのも、対照ならびに不全ヒト心筋の共焦点顕微鏡法では、カドヘリンとＬＩＭＰ−２の間の相互作用が確認され、カドヘリンとＬＩＭＰ−２が共局在するＩＤ部位でこの相互作用が起こることが示されたからである（図７Ｂ）。このことから、ＬＩＭＰ−２は、カドヘリンの役割を媒介することで、適正なＩＤ機能にとって重要になり得ることが示唆された。実際、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスの心臓におけるカドヘリンの組織化学的解析は、異常なカドヘリン分布を示したが（図７Ｃ）、ＡｎｇＩＩ処置した野生型では分布は正常だった。ＡｎｇＩＩ処置した野生型マウスは２つの縦走心筋細胞の間の接触部位にカドヘリン発現を示すが、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスの心筋細胞におけるこの発現は、それほど組織化されておらず、より散漫である。これらのデータは、ＬＩＭＰ−２が介在板の適切な構造的組織化にとって極めて重要であることを立証している。
【００５４】
（ＬＩＭＰ−２は介在板の完全性を調節する）
どの調節機構がＬＩＭＰ−２に依存するかを同定するために、レンチウイルスを利用して導入される、ＬＩＭＰ−２に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＬＩＭＰ−２）を使って、新生仔ラット心筋細胞における別個のＬＩＭＰ−２不活化モデルを得た。１０日間の培養後に、ｓｈＬＩＭＰ−２処理心筋細胞では、対照処理心筋細胞と比較して、ＬＩＭＰ−２タンパク質発現量が９２％低減した（図８Ａ）。介在板の機能的完全性はＰ（Ｓｅｒ３７）−β−カテニンとカドヘリンの間の適正な相互作用に依存すると報告されている。そこで、ＬＩＭＰ−２の欠如がカドヘリンへのＰ−β−カテニンの結合に影響を及ぼすかどうかを調べた。
【００５５】
心筋細胞の溶解物におけるカドヘリンの免疫沈降により、ＬＩＭＰ−２のノックダウンは、Ｐ−β−カテニンとカドヘリンの間の相互作用を実際に減少させることが示された（図８Ｂ）。免疫沈降はカドヘリンに特異的だった（図８Ｃ）。
【００５６】
この研究では、リソソームタンパク質ＬＩＭＰ−２が、心筋細胞介在板、特にアドへレンスジャンクションの重要で新規なコンポーネントであることが証明された。本発明によれば、ＬＩＭＰ−２はＮ−カドヘリンに結合すること、およびＬＩＭＰ−２ヌルマウスはＡｎｇＩＩ誘発性高血圧時に拡張型心筋症を発生させ、心臓におけるＮ−カドヘリンの局在の乱れを伴うことが示された。これを裏付けるように、インビトロでは、培養筋細胞におけるＬＩＭＰ−２のノックダウンが、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の相互作用を乱すことが示された。これは、当初リソソームタンパク質として知られていたＬＩＭＰ−２が、介在板の重要な一部であることを示唆している。
【００５７】
（ＬＩＭＰ−２は圧過負荷時の心臓に役割を持つ）
ＬＩＭＰ−２はＩＤタンパク質の中でも際立っている。ＩＤの他の主要構成要素（カドヘリン、β−カテニン、プラコグロビン）の完全な喪失は致死的な発生的心臓障害をもたらすことから、ＩＤのこれらのコンポーネントは、正常な心臓発生にとって不可欠であることが示唆される。対照的に、本発明によれば、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは正常な心臓発生を持ち、その喪失は生後の心臓リモデリングに影響を及ぼすに過ぎないことが見出された。これは、ＬＩＭＰ−２が、主に負荷増加状態において不可欠な役割を持つ異なるタイプのＩＤタンパク質に相当することを示唆している。ＬＩＭＰ−２のこの特異的役割は、不全に進行する寸前の肥大ラット心ではＬＩＭＰ−２の発現量がさらに上昇する（これは負荷状態を正常化することができないと思われる心筋細胞ではＬＩＭＰ−２発現量が特に増加することを示唆している）という知見によって強調される。これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２はＩＤ機能の新規媒介物質であり、ＩＤおよび筋細胞が負荷増加状態に応答するのに不可欠な今までに同定されていなかったクラスの媒介物質に相当することが示唆された。
【００５８】
（ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは増加した負荷に対して異常な応答をする）
代償性のまま留まった肥大心と比較して、後に不全に進行する肥大心では、ＬＩＭＰ−２が特に増加した。これは、心臓ＬＩＭＰ−２発現が過剰負荷の早期分子サインであり得ることを示している。ＬＩＭＰ−２が過剰負荷に対する防御機構を構成することは、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスを長期アンギオテンシンＩＩ注入による圧力負荷にさらした場合に、それらは心拡張および心臓線維症を発生させたが、心筋細胞肥大は極めてわずかであったという知見によって示唆される。ナトリウム利尿ペプチドが正常に誘導されたことは、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスの心筋細胞が負荷増加状態を感知するにもかかわらず、アルファ−骨格アクチンの発現量の減少からも明らかなように、適当な肥大応答を開始することはできないことを示唆している。これは、ＬＩＭＰ−２が心負荷に対する正常な応答にとって不可欠であること、および負荷状態が代償機構の限度を超えた場合にＬＩＭＰ−２発現量が著しく増加することを示唆している。これらの知見はヒトにも当てはまり、ＬＩＭＰ−２は臨床的に重度の圧負荷を持つ患者でもロバストに増加することが示されている。これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２はＩＤの新規構成要素であり、正常な心機能というよりもむしろ負荷に対する応答にとって不可欠な、新規なタイプのＩＤタンパク質に相当するようである。
【００５９】
（負荷に対するＬＩＭＰ−２応答の機構）
圧負荷ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおいて、常態では隣接する筋細胞を組織化するように作用する心臓介在板の障害を特徴とする介在板異常が記録された。代償性ＬＶ肥大から心不全への移行時に起こる介在板のリモデリングが以前に示され、一方、介在板の構造の乱れは、ヒト、ハムスターおよびブタにおける拡張型心筋症に関連づけられている。ＬＩＭＰ−２はＮ−カドヘリンを結合することが示されたことから、このＩＤ構成要素を介したＬＩＭＰ−２の役割が示唆される。実際、圧過負荷ＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは電子顕微鏡法で異常な介在板を示し、そのＮ−カドヘリン分布が乱れていることから、アドヘレンスジャンクションの欠陥が示唆される。アドへレンスジャンクションの強さは、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の結合アフィニティーによって決定され（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、それはβ−カテニンのリン酸化によって調節される。ＬＩＭＰ−２の喪失はこのＮ−カドヘリン／β−カテニン複合体を乱すことが、培養筋細胞におけるＬＩＭＰ−２のノックダウンによって、インビトロで示された。筋原線維へのアドヘレンスジャンクションの結合を考えると、ＬＩＭＰ−２の喪失は形質膜をまたぐ力伝達の効率低下につながると予想される（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【００６０】
ＬＩＭＰ−２はβ−カテニンへのＮ−カドヘリンの適正な結合にとって不可欠であること、そして負荷状態ではこの役割が特に重要であることが示唆された。しかし、ＬＩＭＰ−２がβ−カテニンへのＮ−カドヘリンの結合を保証する正確な方法は、まだ解明されていない。ＬＩＭＰ−２は、２つの膜貫通ドメイン、細胞質ループおよび２つの内腔グリコシル化ドメインを含有する。リソソーム膜タンパク質はリソソームと形質膜の間を往復できることが知られ、形質膜においてＬＩＭＰ−２はＴＳＰ１およびＴＳＰ２に結合することができる（データ未掲載）。このうち後者は興味をそそる。というのは、ＴＳＰ２も心圧負荷に対する応答には不可欠であり、不全易発型のＬＶ肥大において増加することが、以前に記録されているからである（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これは、ＬＩＭＰ−２とＴＳＰ２がどちらも、心筋細胞が負荷に対する適応応答を開始するのに必要な複合体の一部であり得ることを示唆する。
【００６１】
（考察）
本発明によれば、心筋が負荷増加状態に直面した時のＩＤの重要な媒介物質としての、ＬＩＭＰ２の新規な役割が明らかになった。この新規な生物学的洞察とは別に、不全に進行する寸前の肥大ラット心においてＬＩＭＰ−２の発現量が上昇するという知見から、心筋細胞によるＬＩＭＰ−２発現量の増加はそれらが負荷状態を正常化できないことを示しているという推測が導き出される。したがって、ＬＩＭＰ−２発現量の増加は、切迫した不全の現れであり得る。ＬＩＭＰ−２発現量は臨床的に重症な圧負荷を持つ患者でもロバストに増加し、形質膜に位置することが示されているので、ＬＩＭＰ−２は、今まさに圧力に屈しようとしている心筋を極めて初期の段階でいち早く同定するための分子イメージングにとって魅力的なターゲットになり得る。
【００６２】
（実施例２）
ＴＧＦ−ベータは心肥大の新規阻害因子クルッペル様因子１５を抑制することによって心肥大を促進する
（材料と方法）
（トランスジェニックラット、左室生検材料および血行動態研究）
１８匹の雄ホモ接合Ｒｅｎ−２ラットおよび５匹の同齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）（Ｍｏｅｌｌｅｇａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｌｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を調べた。３匹のＲｅｎ−２ラットは、心不全の臨床徴候を認めて、１０〜１２週齢で屠殺し、この研究から除外した。残りの健常な１５匹のＲｅｎ−２ラットと５匹のＳＤ対照から、１０週齢時に、左室の生検材料を先に述べたように採取した。ラットを、上述のように、１０、１２、１５、１６、１８、１９および２１週齢における一連の心エコーによって追跡した。９匹のＲｅｎ−２ラットは、心不全の臨床徴候を認めて、１５〜１８週齢で屠殺し、これらを「心不全易発性」ラットと名付けた。残り６匹のＲｅｎ−２ラットを監視し、２１週時に屠殺したが、この時点で不全の臨床徴候は出現しておらず、これらを「代償性」ラットと名付けた。
【００６３】
（マイクロアレイ解析）
ＳＤ対照４匹、代償性のまま留まったラット６匹、および心不全易発性ラット４匹のＬＶ生検材料（１０週齢時に採取したもの）から、先に述べたように全ＲＮＡを単離し、増幅した。次に、増幅されたｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット２３０ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐにハイブリダイズさせた。ＳＤ対照、代償性ラットおよびＨＦラットの遺伝子転写物レベルを、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン５．０（ＭＡＳ５．０）で決定した。
【００６４】
（レンチウイルスｓｈＫＬＦ１５の作製）
相補的なｓｈＫＬＦ−１５オリゴヌクレオチド（センス５’−ＧＡＴＧＴＡＣＡＣＣＡ
ＡＧＡＧＣＡＧＣ−３’およびアンチセンス５’−ＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴ−３’）をアニーリングし、それらを、消化したｐＬＬ３．７ｐｕｒｏベクターＤＮＡ（Ｌｕｋ ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）の厚意で提供されたもの）にクローニングすることにより、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を使って、レンチウイルスベクターを作製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキットを使ってコンストラクトを精製した。１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔ、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質を添加したＤＭＥＭで、２９３ＦＴ細胞を培養した。レンチウイルス産生は、３μｇのｓｈＫＬＦＩ５またはｓｈＴｇｆｂｒ１／ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏまたは空ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏとパッケージングベクターとを２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で同時トランスフェクトすることによって行い、４８時間後にウイルス含有上清を収集し、濾過し、瞬間凍結した。
【００６５】
（新生仔ラット心室筋細胞実験）
以前記述されたように（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、１〜３日齢新生児ラット心臓の酵素的解離によって、新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を単離した。ゼラチン処理した６ウェルプレートで、１０％ウマ血清（ＨＳ）、５％新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、グルコース、ゲンタマイシンおよび２％抗生物質／抗真菌剤を補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中、１ウェルあたり５×１０5細胞の密度で、ＮＲＶＭを培養した。ｓｈＫＬＦ１５感染のために、ＮＲＶＭを一晩培養し、翌日、ｓｈＫＬＦ１５および空レンチウイルス対照ベクターに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。４８時間後に、細胞を洗浄してベクターを除き、さらに４８時間、ピューロマイシン選択下に置いた。次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）、グルコース、ゲンタマイシンおよび１０％抗生物質／抗真菌剤中で、一晩、静止条件下に保った。翌日、培地を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９、グルコース、ゲンタマイシン、５％抗生物質／抗真菌剤、インスリン、Ｌ−カルニチンおよびＢＳＡを含有する培地で置き換えた。１時間後にＴＧＦ−ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ培地）を１時間加え、その後、ＲＮｅａｓｙミニプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＲＮＡを単離し、それを、ＫＬＦ１５またはＢＮＰプライマー（Ｆ ５’−ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＡＧ Ａ−３’、Ｒ ５’−ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＡＡ ＡＡＣ Ａ−３’）によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲに供した。ｓｈＫＬＦ１５のノックダウン効率は、空レンチウイルスベクターに感染させたＮＲＶＭにおけるレベルと比較して、約８０％である。
【００６６】
（ＭＥＦ２ルシフェラーゼプロモーターアッセイ）
ＮＲＶＭを上述のように単離した。ゼラチン処理した６ウェルプレートで、１０％ウマ血清（ＨＳ）、５％新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、グルコース、ゲンタマイシンおよび２％抗生物質／抗真菌剤を補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中、１ウェルあたり５×１０5細胞の密度で、細胞を培養した。ｓｈＫＬＦ１５感染のために、ＮＲＶＭを一晩培養し、翌日、ｓｈＫＬＦ１５および空レンチウイルス対照ベクターに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。４８時間後に、細胞を洗浄してベクターを除き、さらに４８時間、ピューロマイシン選択下に置いた。Ｔａｔａボックスおよびルシフェラーゼの上流にクローニングされた３つのＭｅｆ２結合部位を含有するＭｅｆ２レポータープラスミド（ｐＧＬ２−３ｘＭＥＦ２−ルシフェラーゼ）を、一過性トランスフェクションによって、細胞に導入した。細胞を洗浄し、１ウェルあたり１．６μｇのＭＥＦコンストラクトをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、ならびに抗生物質非含有培地と一緒に加えた。翌朝、細胞を洗浄し、さらに２日間、通常の培養培地下に置いた。細胞を一晩、低血清条件（上記参照）下に保ち、翌朝、ＡｎｇＩＩ（ｘグラム／ｍｌ）を４日間加えた。ルシフェラーゼアッセイプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６７】
（二重トランスジェニックマウスの作出）
ＴＧＦβＲＩのエクソン３の側面にｌｏｘ−Ｐ部位を配置することによって作出されたＴＧＦβＲＩf/fマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド）（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、α−ＭＨＣプロモーターの制御下にあるｃｒｅ−リコンビナーゼを含有するマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６ ＦＶＢバックグラウンド）（ＭｅｒＣｒｅＭｅｒcre/wt（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．））と交雑させて、ＴＧＦβＲＩfl/wtcre遺伝子を含有するヘテロ接合二重トランスジェニックマウスを作出した。次に、これらのマウスを、ＴＧＦβＲ１f/fマウスと戻し交雑して、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＦＶＢとＣ５７ＢＬ／６の混合バックグラウンドにＴＧＦβＲＩf/creおよびＴＧＦβＲ１f/wcreを持つコロニーを得た。
【００６８】
（ＤＮＡ単離およびジェノタイピング）
ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って使用することにより、マウス尾からＤＮＡを単離した。本発明者らは、ＴβＲＩ ｆｌｏｘマウスの遺伝子型を評価するために、以前記述されたように（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、３つのプライマー、５−ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＴＴ、３’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＧＴ、および３’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣを用いるＰＣＲを使用した。ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ導入遺伝子を検出するために、本発明者らは、ｃｒｅから４００ｂｐフラグメントを増幅するプライマー５−ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＧおよび５−ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＡＡＴ ＣＣＣを使用した。
【００６９】
（Ｃｒｅ組換えプロトコル）
心筋細胞においてα−ＭＨＣ共役ｃｒｅリコンビナーゼを誘導するために、成体ＴＧＦβＲＩf/fcreおよびＴＧＦβＲ１f/wtcre二重トランスジェニックマウスを、ミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ、モデル２００ １）の皮下挿入により、用量が１日あたり２０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）で、７日間にわたって処置した。タモキシフェン自体が心臓の形態および機能に何らかの影響を持つかどうかをチェックするために、一群の野生型マウスをタモキシフェンで処置した。タモキシフェンは１０％エタノールおよび９０％ポリエチレングリコール−４００に溶解してから、短時間の超音波処理にかけた。マウスを２週間回復させてから、ＡｎｇＩＩまたはビヒクルによる処置を行った。
【００７０】
（ミニ浸透圧ポンプの皮下植込みおよびＡｎｇＩＩ注入）
体重２４〜３２ｇの両性のマウスを２．５％イソフルオランで麻酔した。滅菌条件下で、肩甲骨中央切開（ｍｉｄｓｃａｐｕｌａｒ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を施し、鈍的剥離によって皮下組織にポケットを作り、食塩水またはＡｎｇＩＩ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）を充填したミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴモデル２００４；ＡＬＺＡＣｏｒｐ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を挿入した。ミニ浸透圧ポンプの内容物は、４週間にわたって０．２５μｌ／時の速度で、局所皮下腔に送達された。各群において、７〜９匹のマウスを実験に動員し、各群から少なくとも５匹のマウスが実験を完了した。離脱したマウスは、ＬＶカテーテル挿入が成功しなかった３匹を除いて、いずれも麻酔が原因で死亡したためである。
【００７１】
（心エコー法）
野生型、ＴＧＦβＲＩ−／−およびＴＧＦβＲ１−／＋マウスにおいて、手術前および４週間のＡｎｇＩＩ注入後に、２．５％イソフルオラン麻酔下で、経胸壁心エコー法を行った。２Ｄ−心エコー法で標準像を得て、拡張末期内径および収縮末期内径を測定し、駆出率および短縮率を算出した。
【００７２】
（血行動態測定）
ウレタンの腹腔内注射によってマウスを麻酔した。ミラー（１．４Ｆ）カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を右総頚動脈に入れ、左心室内圧を測定するために左室内へと前進させた。体温は温度制御された手術台を使って３７℃に維持し、直腸プローブで監視した。次に、マウスを３０分間安定させてから、血行動態測定を行った。
【００７３】
（組織調達および心筋形態計測）
血行動態測定に続いて、心臓を素早く切除し、０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄し、心房を取り除き、心室を細断した。ＲＮＡおよびタンパク質単離のために、試料を液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。組織学的分析用に、左室をパラホルムアルデヒド（１％）で固定し、パラフィンに包埋した。総コラーゲンを可視化するために、以前記述されたように、ピクロシリウス染色を行った。抗Ｐ３８抗体を使った免疫染色を製造者の指示（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って行うことにより、Ｐ３８の位置を特定した。
【００７４】
（タンパク質単離およびウェスタンブロット法）
凍結した左室を破砕し、標準的プロトコルに従って（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ラジオイムノアッセイ緩衝液中でホモジナイズした。ウェスタンブロット法は、ＴβＲＩに対する特異的抗体（１：１０００）、総およびホスホ（Ｐ）−Ｓｍａｄ２、総およびＰ−Ｐ３８抗体（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｐ−Ｓｍａｄ３抗体（１：５０００，Ｅ．Ｌｅｏｆ教授およびＭ．Ｗｉｌｋｅｓ博士（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ））から厚意により供与されたもの）、コラーゲン１抗体（１：３０００）およびＩＩＩ抗体（１：５００）（Ａｂｃａｍ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使って行った。
【００７５】
（ＴＧＦβ１型受容体免疫組織化学）
心臓組織切片を脱パラフィンし、再水和抗原回復組織を一次抗体（ウサギ抗ＴＧＦβ受容体１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−３９８））と共に一晩インキュベートし、次に、二次抗体（ヤギ抗ウサギ−ビオチン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅ０４３２）と共にインキュベートした後、それらをストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ，Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット）で処理した。
【００７６】
動物実験を伴う上述の試験プロトコルは全て、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理および使用に関するオランダ法に記載の公定規則（ＮＩＨの規則と極めてよく似たもの）に従って行われた。
【００７７】
（統計解析）
データを平均±ＳＥＭとして表す。ＡｎｇＩＩ／ＴＧＦβ／ｓｈＫＬＦ１５およびビヒクル処置動物および細胞の平均間の相違を比較するために、対応のないｔ検定を行った。≦０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。
【００７８】
（結果）
非近交系ホモ接合高血圧ＴＧＲ（ｍＲｅｎ２）２７ラット（Ｒｅｎ−２）は、肥大から心不全への移行の研究を可能にすることが、以前に示されている（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。１０週齢の時点で得た心筋生検材料を使って、どのラットが後に心不全に進行するかを変化した遺伝子発現によって予言することができるかどうかを調べた。
【００７９】
これらの生検材料の発現プロファイリングにより、急速に不全へと進行する肥大心を特徴づけるクルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）をコードする遺伝子の抑制が明らかになった。このことは、代償性ＬＶＨではＫＬＦ１５がダウンレギュレートされるが、不全へと急速に進行する肥大心ではＫＬＦ１５が有意に、より一層抑制されることを示すリアルタイムＰＣＲによって確認された（図９Ａ）。インサイチューハイブリダイゼーションは、ＫＬＦ１５の発現が心筋細胞において特にダウンレギュレートされることを示した（図９Ｂ）。これらの知見は、心臓ではＫＬＦ１５が構成的に発現されるが、肥大においてはダウンレギュレートされるという、以前の観察結果を拡大するものである。心不全への移行に先だって起こるＫＬＦ１５のより著しい抑制は、ＫＬＦ１５が重要な防御特性を持つという示唆をもたらした。ＫＬＦ１５の機能的役割を探るために、ＫＬＦ１５に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を安定に導入した。肥大遺伝子プログラムの分子特徴であるＢＮＰの自発的発現は、培養心筋細胞では、ｓｈＲＮＡを媒体としたＫＬＦ１５の抑制時に、１０倍以上誘導された（図９Ｃ）。これは、ＫＬＦ１５の構成的存在が、肥大遺伝子プログラムの発現を防止するために重要であることを示唆している。
【００８０】
並行して行われた研究では、ＫＬＦ１５ヌルマウスが圧負荷時に肥大および心機能喪失を発生させることが示され、不適応型ＬＶＨからの防御にとって構成的に発現されるＫＬＦ１５は不可欠であることが強調された。
【００８１】
ＫＬＦ１５が肥大遺伝子プログラムを抑止できる機構を探るために、ＭＥＦ２の活性化におけるその役割を研究した。ＭＥＦ２は、カルシニューリンおよびＭＡＰＫ経路によって伝達される肥大シグナリングのターゲットであり、肥大遺伝子プログラムの極めて重要な転写活性化因子の一つであると認識されている。ＭＥＦ２レポーターコンストラクトを使って、ＫＬＦ１５レベルの変化が、心筋細胞におけるＭＥＦ２活性に影響を及ぼすかどうかを検討した。このレポーターは、ＭＥＦ２による刺激には弱くしか応答しない（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，Ｏｌｓｏｎ未公表データ）。実際、アンギオテンシンＩＩに呼応してＭＥＦ２活性のごくわずかな増加が観察されたにすぎない。しかし、ＫＬＦ１５のノックダウンはＭＥＦ２活性を有意に増加させたことから（図９Ｃ）、ＫＬＦ１５はＭＥＦ２のリプレッサーとして作用することが示唆される。
【００８２】
次に、心筋細胞においてどの機構がＫＬＦ１５を抑制するのかを探ろうと試みた。そこで、心肥大の既知の媒介物質を、心筋細胞におけるＫＬＦ１５発現を抑制するその能力についてスクリーニングした。培養心筋細胞では、ＴＧＦβが極めてロバストにＫＬＦ１５を抑制し、ＴＧＦβの添加後は、ＫＬＦ１５の発現がほとんど完全に消失するほどだった。阻害ＲＮＡによるＴＧＦβＩ型受容体のノックダウンはＴＧＦβによるＫＬＦ１５の抑制を防止したので（図１０Ａ）、そのＩ型受容体が関わる古典的なＴＧＦβシグナリングは、この効果にとっては不可欠であることが証明された。
【００８３】
そこで、インビボでのＴＧＦβＩ型受容体によるＫＬＦ１５の調節を検討するために、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）ＴＧＦβ受容体Ｉ型遺伝子をＭｅｒＣｒｅＭｅｒ対立遺伝子と組み合わせて保有するマウスを作出した（これにより、ｃｒｅをタモキシフェンの投与によって心筋細胞で特異的に活性化することが可能になる）（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これにより、胚におけるＴＧＦβＩ受容体の喪失が持つ発生上の影響を避けつつ、成体マウスの心筋細胞で特異的にＴＧＦβＩ型受容体を欠失させることが可能になった。肥大およびＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを惹起するために、上述のように長期アンギオテンシンＩＩ注入を行うことにより、これらのマウスにおいて高血圧を誘発した。全心臓ホモジネートのウェスタンブロット法により、ＴＧＦβＩ型受容体の有意なダウンレギュレーションが明らかになった（図１０Ｂ）。免疫組織化学により、ＴＧＦβＩ型受容体の筋細胞特異的なダウンレギュレーションが確認され、全心臓ホモジネート中に見出されるＴＧＦβＩ型受容体の残存シグナルを説明する他の細胞タイプにおけるこの受容体の発現が示された（図１０Ｃ）。アンギオテンシンＩＩは野生型マウスではＬＶＨを誘発したが、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスではＬＶＨの発生が防止された（図１０Ｆ）。ＷＴマウスではアンギオテンシンＩＩが短縮率を低下させたが、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスでは短縮率は保たれたままだった。これは、心筋細胞からのＴＧＦβＩ型受容体の喪失によって高血圧誘発性肥大および機能喪失が防止され得ることを示している。予想どおり、ＫＬＦＩ５の発現はＷＴマウスの肥大心では抑制されたが、この抑制はＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスの心臓には存在しなかった（図１０Ｇ）。これは、心筋細胞上のＴＧＦβＩ型受容体が高血圧性肥大の発生にとって重要であると同時に、ＫＬＦ１５の抑制にとっても重要であることを示している。
【００８４】
これらを総合すると、ＫＬＦ１５は、心筋細胞において心肥大の抑制因子としての役割を持つ初めてのクルッペル様因子である。ＫＬＦ１５はＭＥＦ２を阻害し、並行して行われた研究では、これがＧＡＴ４のような他の肥大促進性転写因子も同様に阻害することが示されている。したがって、ＫＬＦ１５の喪失は肥大遺伝子発現を極めてロバストに誘発し、有害な転帰に関係すると考えられる。したがってＫＬＦ１５の抑制は、不全易発型肥大の発生における新規で極めて重要なステップであり得る。ＴＧＦβは極めてロバストにＫＬＦ１５を抑制できることが示された。したがって、現在さまざまな分野で開発されているＴＧＦβの阻害剤は、心肥大が心不全へと進行するのを防止するというような予想外の治療的潜在能力を持ち得る。
【００８５】
（結論）
心臓は負荷および傷害に応答して肥大し、それはしばしば顕性心不全へと進行する。本発明によれば、サイトカインＴＧＦβが肥大の新規阻害因子クルッペル様因子１５（ＫＬＦ−１５）を抑制するという、この過程における新規な機構が明らかになる。ＴＧＦβＩ型受容体の喪失は、インビボおよびインビトロで、ＫＬＦ−１５の抑制ならびに心肥大および心不全の発生を防止する。心肥大を抑制するこの新規機構をＴＧＦβは妨害することができるという知見は、ＴＧＦβシグナリングの阻害によって有害な形態の心肥大を防止するという刺激に満ちた可能性を切り開くものである。
【００８６】
（実施例３）
心肥大の転写リプレッサー、クルッペル様因子１５
本発明によれば、ジンクフィンガー転写因子であるクルッペル様因子−１５（ＫＬＦ−１５）は、ＬＶ肥大の強力な転写リプレッサーであることが示された。遺伝子ターゲティング研究により、ＫＬＦ１５ヌルマウスは正常に発生するが、圧過負荷に応答して、心臓重量の増加、肥大遺伝子の発現量の増加、筋細胞サイズの増大を伴う左室内腔拡張、および左室収縮機能の低下を特徴とする過度の心肥大を発生させる。全体として、これらの研究は、インビボでのＬＶ肥大におけるＫＬＦ１５の役割を証明している。
【００８７】
興味深いことに、ＫＬＦ１５は、いくつかの形態の病的肥大ではダウンレギュレートされるが、生理的肥大ではダウンレギュレートされないことから、ＫＬＦ１５は病的肥大の調節物質ではあるが、生理的肥大の調節物質ではないことが示される。ＫＬＦ１５が肥大に対抗するという事実、ならびにＫＬＦ１５が病的肥大および心不全において有意にダウンレギュレートされるというもう一つの観察結果は、ＫＬＦ１５レベルの低下を防止することを狙った介入によって病的成長を防止し、さらには逆転させることさえできるかもしれないという刺激に満ちた可能性をもたらした。
【００８８】
（インビボ実験）
病的肥大時のＫＬＦ１５の喪失を防止することによって心臓の病的成長を制限し得るという魅力的な可能性を検証するために、心筋トロポニンＩプロモーターの制御下に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）による遺伝子送達を使って、ＫＬＦ１５をマウス心臓で特異的に過剰発現させた（Ｖａｎｄｅｄｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。特に、ｒＡＡＶ９ベクターは、静脈内投与後の数週間は心臓組織において導入遺伝子発現のロバストな増加を達成することが示されている。
【００８９】
マウスに１×１０10ｖｇのＡＡＶ９−ＫＬＦ１５またはＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した後、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）処置（４週間、浸透圧ポンプによる）によって肥大を誘発した。図１１（上側の図）に示すように、ＫＬＦ１５は心臓で過剰発現された。目を引くことに、ＡＡＶ９−ＫＬＦ１５遺伝子導入に割り当てられたマウスは、ＡｎｇＩＩ刺激時に、ＡＡＶ９−ＧＦＰを投与されたＡｎｇＩＩ処置マウスと比較して、有意に少ない肥大を発生させた。（図１１、下側の図を参照。）これらのデータは、全体として、心筋細胞におけるＫＬＦ−１５の強制的発現は、心肥大を減少させるのに十分であることを示している。
【００９０】
（結論）
ＫＬＦ１５の喪失は、肥大の発生および心不全への移行における極めて重要なステップである。心臓におけるＫＬＦ１５の過剰発現が病的肥大の発生を阻害するという観察結果は、肥大と続発する心不全とを防止するためにインビボでＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを防止するという戦略に関して刺激に満ちた可能性を切り開くものである。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【００９３】
【表３】
【００９４】
［文献］
Gamp et al., Hum. Mol. Genet. 12: 631-646, 2003.
Van Haaften et al., BMC Bioinformatics 7: onine, 2006-09-21.
Schroen et al., Circ. Res. 110: 3121-3128, 2004.
Heymans et al., Circulation 112: 1136-1144, 2005.
Junqueira et al., Histochem. J. 11: 447-455, 1979.
De Windt et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 2095-2106, 1997.
Crombie et al., J. Biol. Chem. 273: 4855-4863, 1998.
Eskelinen et al., Trends Cell. Biol. 13: 137-145, 2003.
Nishino et al., Nature 406: 906-910, 2000.
Stypmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 6234-6239,2002.
Stilli et al., Exp. Physiol. 2006.
Perriard et al., Trends Cardiovasc. Med. 13: 30-38, 2003.
Gumbiner, J. Cell. Biol. 148: 399-404, 2000.
Ferreira-Cornwell et al., J. Cell. Sci., 115: 1623-1634, 2002.
Sohal et al., Circ. Res. 89: 20-25, 2001.
Larsson et al., Embo J. 20: 1663-1673
Vandendriessche et al., J. Thromb. Haemost. 5(1): 16-24, 2007.
【００９５】
ＤＮＡ配列ＫＬＦ１５ホモサピエンス
出典：ＮＣＢＩ
ホモサピエンスクルッペル様因子１５、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：４５１１３ ＩＭＡＧＥ：５５２６６５７）、全ｃｄｓ。
アクセッション：ＢＣ０３６７３３
【化１】
【００９６】
アミノ酸配列ＫＬＦ１５ホモサピエンス
出典：ＮＣＢＩ
ホモサピエンスクルッペル様因子１５、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：４５１１３ ＩＭＡＧＥ：５５２６６５７）、全ｃｄｓ。
アクセッション：ＢＣ０３６７３３
【化２】
【００９７】
ＬＩＭＰ−２ゲノム配列
網かけおよび下線の部分：他のエクソンの位置
下線の部分：選択されたエクソンの位置
＞染色体：ＮＣＢＩ３６：４：７７２９８９１８：７７３５４０５９：−１
【化３Ａ】
【化３Ｂ】
【化３Ｃ】
【化３Ｄ】
【化３Ｅ】
【化３Ｆ】
【化３Ｇ】
【化３Ｈ】
【化３Ｉ】
【化３Ｊ】
【化３Ｋ】
【化３Ｌ】
【化３Ｍ】
【化３Ｎ】
【化３Ｏ】
【化３Ｐ】
【化３Ｑ】
【００９８】
ＬＩＭＰ−２転写物：
下線の部分：エクソン
【化４Ａ】
【化４Ｂ】
【００９９】
ＬＩＭＰ−２タンパク質配列
【化５】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、医学の分野に関し、より具体的には、心臓病学の分野に関する。本発明は、特に、心不全を発生させる危険がある被検者を診断および／または処置するための手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたる高血圧、弁膜症または糖尿病のような他の慢性障害中に起こる慢性的な心負荷は、心不全の最も重要な危険因子の一つである心肥大を誘発することが一般に知られている。うっ血性心不全（ＨＦ）は一般的な症候群であるが、重症で複雑な臨床症候群でもあり、とりわけ高齢者にあっては、心収縮機能の低減および運動耐容能の低下に特徴づけられる。心不全の症状には、例えば肺水腫および末梢性浮腫、疲労および／または呼吸困難などが含まれる。重症心不全は、他の臓器が十分な血液を供給されていないので、それら他の臓器の機能低下にもつながり得る。
【０００３】
しかし全ての肥大心が最終的に不全を起こすわけではない。つまり、生命を脅かす合併症を発生させるまで進行する患者はかなりの数に上るものの、他の患者は長期間にわたって安定した状態を保ち得る。この肥大から心不全への移行に先行し、その前ぶれとなる分子変化は、今のところ完全にはわかっていない。
【０００４】
心不全などの高血圧性末端臓器損傷を発生させる危険がある患者の早期同定によって急速な進行を防止し得るので、心不全を起こしそうな患者を実際にそのようになる前に同定（診断）できることは好ましい。このようにして早期に診断された患者は、心不全の発症を防止するために、処置を受けることができる。また、重症合併症を発生させる危険がある心不全を患っている患者を同定できることも好ましい。
【０００５】
現在の方法は、現に存在する心不全を確実に排除することはできるものの、心不全の存在を確実に証明することはできず、これらの方法では、確立した心不全の転帰を予言することも、心不全の出現を予言することもできない。
【０００６】
したがって、心不全を発症する可能性を予言し、かつ／または既に確立した心不全の転帰を予言するための簡単で信頼できる方法が必要とされている。また、心不全を発生させる危険がある患者を心不全および／またはその合併症が出現する前に処置するための手段および方法の開発は、臨床上極めて重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、心不全を発生させる特別な危険がある患者および／または心不全の合併症を発生させる特別な危険がある患者を同定することができる診断方法を提供することである。心不全を発生させる危険がある患者および／または心不全の合併症を発生させる危険がある患者を処置するための手段および方法を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、心不全を発生させる危険がある被検者を診断するための方法であって、
（ａ）前記被検者の生物学的試料における１つ以上の生物学的マーカーのレベルを決定するステップ；
（ｂ）前記生物学的マーカーのレベルを同じ生物学的マーカーの標準レベルと比較するステップ、および
（ｃ）生物学的マーカーのレベルが心不全を発生させる危険を示すかどうかを決定するステップ、
を含み、生物学的マーカーがリソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）および／またはクルッペル様転写因子１５（ＫＬＦ１５）である方法を提供することによって、この目的を達成する。
【０００９】
本発明につながった研究では、心不全の発生に関与する遺伝子がいくつか同定された。同定された遺伝子を表２に列挙した。さらにまた、前記遺伝子によってコードされる特定のポリペプチドが実際に心不全と機構的に関連することも証明された。特に、表２の遺伝子によってコードされる特定のタンパク質は、心肥大から心不全への移行の原因となる分子機構に関与すること、したがって、心不全を発生させる危険がある患者を同定するための生物学的マーカーとして使用できることが証明された。また、これらのタンパク質、および／または前記タンパク質をコードする遺伝子、および／または前記タンパク質および／または遺伝子のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドフラグメントまたは変異体は、危険に曝されている患者を処置するためのターゲットとして使用することもできる。
【００１０】
特に、本発明によれば、特定の介在板コンポーネント、特にリソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）およびクルッペル様転写因子１５（ＫＬＦ１５）は、心肥大から心不全への移行を予言する分子機構に関与し、心不全を発生させる危険がある個体を同定するための生物学的マーカー（バイオマーカー）として、適切に使用できることが証明された。
【００１１】
このようにして、本発明によれば、心不全を発生させる危険がある被検者を、前記被検者の生物学的試料において、１つ以上の同定された生物学的マーカーのレベルを決定し、前記マーカーのレベルを標準レベルと比較することによって同定できることが見出された。前記標準レベルは健常な被検者から導き出される。すなわち標準レベルとは、健常な人（すなわち心疾患を持たない人）の前記生物学的試料における前記生物学的マーカーのレベルである。試験した生物学的マーカーのレベルが前記標準レベルと比較して変化している場合、例えば（当該特定の生物学的マーカーに依存して）上昇または下降している場合、その被検者はＨＦを発生させる危険および／または心不全の重症合併症を発生させる危険がある。
【００１２】
心不全の（好ましくは臨床症状が出現する前の）早期診断は、診断された患者の処置などによって、例えば基礎疾患への対処を成功させたり、かつ／またはさらなる心筋機能障害および臨床症状の悪化を防止したりするのに不可欠である。
【００１３】
本発明につながった研究では、高血圧による肥大を起こしていて、伝統的な技法（心エコー法）では十分に機能的であり代償性であるように見えたが、心不全を発生させることが後に判明した心臓から得られる数多くの遺伝子の遺伝子発現プロファイルが調べられた。この発現プロファイルは、やはり高血圧ゆえに肥大を起こしていて、伝統的な技法（心エコー法）では同様に十分に機能的で代償性であるように見えたが、心不全を発生させないことが後に判明し、安定した状態を保った心臓から得られる遺伝子発現プロファイルと比較された。この方法で、後に発生する心不全の出現を予言する遺伝子が同定され、これらは、本発明によれば、肥大および心不全への移行の新規で極めて重要なモジュレーターであることが明らかになった。これらの遺伝子を表２に列挙した。次に、特定の好ましい生物学的マーカー、特に特定の介在板関連生物学的マーカーが同定された。介在板（ＩＤ）は、心臓の心筋繊維を構成する心筋細胞間の結合部を形成する。すなわち介在板は、細胞間の機械的および電気的カップリングをもたらし、心臓組織の同期的収縮を支えている特殊な細胞間結合である。
【００１４】
このように本発明によれば、標準発現レベルと比較したＬＩＭＰ−２の心臓発現量の増加によって、顕性心不全に進行しやすい肥大心が同定されることが証明された。例えば、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける心臓発生は正常であるが（Ｇａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００３）、高血圧はこれらのマウスにおける拡張型心筋症を誘発した。ＬＩＭＰ−２は極めて重要な心臓アドヘレンスジャンクションタンパク質Ｎ−カドヘリンに結合し、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の適正な相互作用を確保するために不可欠であることが示された。さらにまた、心不全に進行する寸前の肥大ラット心臓ではＬＩＭＰ−２の発現量が増加することも見出されたので、心筋細胞によるＬＩＭＰ−２発現量の増加は、その心筋が機械的な力を正常化できないことを予告していると考えられる。したがって、ＬＩＭＰ−２発現量の増加は、悪化しつつある負荷に応答しようとする心筋の絶望的な試みであるとみることができ、切迫した不全を示し得る。そのうえ、ＬＩＭＰ−２発現量は、臨床的に重症な圧負荷を持つ患者では有意に増加することも示された。したがって、高血圧被検者におけるＬＩＭＰ−２タンパク質のレベルおよび／またはＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子の発現レベルを決定し、前記レベルを標準レベルと比較し、次に、そのレベルが心不全を発生させる危険を示すかどうかを決定することにより、今まさに圧力に屈しようとしている心筋を極めて初期の段階で同定することが可能である。特に、標準レベルと比較したＬＩＭＰ−２タンパク質レベルの増加および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子発現レベルの増加は、心不全および／または心不全関連合併症を発生させる危険を示す。
【００１５】
本発明につながった研究では、さらに、クルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）をコードする遺伝子が、心不全へと急速に進行する肥大心を特徴づけることも示された。これはリアルタイムＰＣＲによって確認され、このリアルタイムＰＣＲは、ＫＬＦ１５が代償性ＬＶＨにおいてダウンレギュレートされるが、不全へと急速に進行する肥大心ではＫＬＦ−１５が、より一層抑制されることを示した。さらに、ＫＬＦ１５は心筋細胞において心肥大の抑制因子としての役割を持つことが示された。したがって、ＫＬＦ１５タンパク質のレベルおよび／またはＫＬＦ１５をコードする遺伝子の発現レベルを決定し、前記レベルを標準レベルと比較することも、心不全を発生させそうな患者を極めて初期の段階で同定するのに役立つ。ＫＬＦ１５の場合は、標準レベルと比較した、生物学的試料におけるＫＬＦ１５タンパク質レベルの低下および／またはＫＬＦ１５遺伝子発現量の低下が、心不全の発生を示す。
【００１６】
本発明は、インビボ法、すなわち生物学的マーカーのレベルがインビボの生物学的試料において決定される方法にも、インビトロ法にも関係する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、生物学的マーカーのレベルが、個体から得られる生物学的試料において、インビトロで決定される。本発明の生物学的マーカーのレベルをインビトロで決定するには、この研究によって同定された生物学的マーカーを含み得る任意の体液の適切な生物学的試料をどれでも使用することができる。好ましくは、生物学的試料は、血液、血漿、血清、心臓組織からなる群より選択される。より好ましくは、生物学的試料は、末梢血試料、または末梢血から得られる血漿もしくは血清試料である。末梢血試料は、例えば、患者から容易に採取することができ、カテーテル挿入などの複雑な侵襲的手技を必要としない。生物学的試料は、試験用試料を調製するために、周知の技法に従って処理することができる。
【００１８】
本発明の生物学的マーカーのレベルを測定するには、当技術分野で知られる通常の方法を利用することができる。
【００１９】
生物学的マーカーがタンパク質および／またはそのフラグメントおよび／または変異体である場合は、特定のタンパク質および／またはそのフラグメントおよび／または変異体のレベルを決定するための、当業者に周知の、いくつかの通常の方法を使用することができる。マーカーのレベルは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的アッセイを使って測定することができ、したがって、簡単で再現性があり信頼できる方法が得られる。そのようなアッセイで使用するための抗体は入手可能であり、抗体を発生させるための周知の標準的技法を使って追加の（ポリクローナルおよびモノクローナル）抗体を発生させてもよい。生物学的タンパク質マーカーのレベルを測定するための他の方法として、例えば（免疫）組織化学、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ＲＩＡ、競合アッセイ、およびそれらの任意の組合せを、さらに挙げることができる。インビボでは、例えば非分泌タンパク質のレベルを、関心対象のタンパク質の一つに対する特異的抗体を標識およびタグ付けすることによって決定することができる。これにより、心臓中のタンパク質の量を、いわゆる「分子イメージング」技法によって可視化することができる。
【００２０】
生物学的マーカーが遺伝子、および／またはそのポリヌクレオチドフラグメントおよび／または変異体、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど、例えば特定のタンパク質をコードする遺伝子、または転写されたｍＲＮＡである場合は、例えば心臓生検材料における生物学的マーカーを、例えば周知の分子生物学的アッセイ、例えばその特定ポリヌクレオチドを指向するプローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーション技法などによって測定することができる。本発明に従って使用することができる、核酸に基づく他のアッセイには、例えばＲＴ−ＰＣＲ、核酸に基づくＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット法、およびそれらの任意の組合せが含まれる。
【００２１】
診断方法の特異性および／または感度を強化するために、本発明の方法は、１つ以上の他の（生物学的）マーカーのレベルの検出を含んでもよい。すなわち、本発明の生物学的マーカーの検出は、心不全の発生を示す他のマーカーの検出と適切に組み合わせることができる。
【００２２】
さらに本発明は、上述の診断方法を実施するためのキットに関する。特に本発明は、心不全を発生させる危険がある被検者を同定するためのそのような診断キットであって、前記被検者の１つ以上の生物学的試料を受け取るための手段、および前記被検者の前記生物学的試料における生物学的マーカーのレベルを決定するための手段を含むキットに関する。このようにして、信頼できる簡便な診断ツールとして使用することができるキットが提供される。生物学的試料を受け取るための手段は、例えば、標準的なマイクロタイタープレートのウェルを含み得る。前記被検者の前記生物学的試料における介在板関連生物学的マーカーのレベルを決定するための手段は、例えば、本発明によって同定された生物学的マーカーを検出するのに適した１つ以上の特異的抗体、ポリヌクレオチドプローブ、プライマーなどを含み得る。これらのキットはさらに較正手段および使用説明書も含み得る。
【００２３】
本発明は、心不全を防止および／または処置するための化合物を同定するためのスクリーニング方法における、本発明の生物学的マーカーおよび／またはそのフラグメントおよび／または機能的変異体の使用にも関係する。ある特定実施形態において、心不全を防止および／または処置するための化合物を同定するための方法は、
（ａ）１つ以上の化合物を、表２に列挙するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２）、および／またはそのフラグメントおよび／または変異体と接触させること；
（ｂ）前記ポリペプチドに対する化合物の結合アフィニティーを決定すること；
（ｃ）哺乳動物細胞の集団を、少なくとも１０μＭの結合アフィニティーを示す化合物と接触させること；および
（ｄ）心不全を防止および／または処置する能力を持つ化合物を同定すること、
を含む。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法で試験されるポリペプチドは、インビトロで、例えば溶液中に遊離した状態、固形支持体に固定された状態、細胞表面に担持された状態、もしくは細胞内に位置する状態で試験するか、またはインビボで試験することができる。
【００２５】
これらの方法を実施するには、複合体を非複合体型のポリペプチドから容易に分離できるように、そしてまたアッセイの自動化に適応させるために、本発明のポリペプチドまたは化合物のどちらか一方を固定化することができる。本発明のポリペプチドと化合物との相互作用（例えば結合）は、反応物を入れるのに適した任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および遠心分離管が含まれる。
【００２６】
化合物とポリペプチドとの結合アフィニティーは、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用するなどの当技術分野で知られる方法によって、標識化合物を使った飽和結合解析（例えばＳｃａｔｃｈａｒｄとＬｉｎｄｍｏの解析）によって、置換反応によって、示差ＵＶ分光測光器、蛍光偏光アッセイ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー移動、および生物発光共鳴エネルギー移動によって測定することができる。化合物の結合アフィニティーは、解離定数（Ｋｄ）またはＩＣ５０もしくはＥＣ５０で表すこともできる。ＩＣ５０は、そのポリペプチドへの別のリガンドの結合を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度を表す。ＥＣ５０は、インビトロで最大効果の５０％を得るのに必要な濃度を表す。解離定数Ｋｄは、リガンドがポリペプチドにどのくらいよく結合するかの尺度であり、ポリペプチド上の結合部位の正確に半分を飽和させるのに必要なリガンド濃度に等しい。高アフィニティー結合をする化合物は低い（すなわち１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲の）Ｋｄ、ＩＣ５０およびＥＣ５０値を持ち、中〜低アフィニティー結合は、高い（すなわちμＭ領域の）Ｋｄ、ＩＣ５０およびＥＣ５０値に関係づけられる。
【００２７】
本発明は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品用の医薬品を調合するための、表２に列挙する遺伝子および／またはタンパク質（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子および／またはタンパク質）の使用にも関係する。
【００２８】
好ましくは、本発明は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品を製造するための、表２に列挙する遺伝子および／またはタンパク質（好ましくはＫＬＦ１５および／またはＬＩＭＰ−２遺伝子および／またはタンパク質）のモジュレーターの使用に関する。
【００２９】
本願において、モジュレーターは、本発明によって減少することが見出された生物学的マーカーの１つ以上の発現を刺激し、かつ／またはそのレベルを増加させる任意の化合物（例えばアゴニスト）、または本発明によって増加することが見出された生物学的マーカーの１つ以上の発現を抑制し、かつ／またはそのレベルを低下させる任意の化合物（例えばアンタゴニスト）であることができる。
【００３０】
医薬品は、タンパク質に基づく分子、例えばタンパク質マーカーに対する抗体、および／またはそのフラグメントおよび／または変異体であることができる。本発明は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物、ＦｖフラグメントおよびＦｖ発現ライブラリーの産物も包含する。
【００３１】
もう一つの選択肢として、医薬品は、核酸に基づく分子であることもできる。例えば、遺伝子のダウンレギュレーションは、翻訳レベルまたは転写レベルで、アンチセンス核酸などを使って達成することができる。アンチセンス核酸は、あるタンパク質をコードする核酸および／または対応するｍＲＮＡの全部または一部と特異的にハイブリダイズする能力を持つ核酸である。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの製造は、当技術分野では知られている。医薬品は低分子干渉（ヘアピン）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も含み得る。ｓｉＲＮＡは、サイレンシングを受けるＲＮＡに配列が相同な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）による遺伝子サイレンシングの翻訳後プロセスを媒介する。ｓｉＲＮＡの製造は当技術分野では知られている。同様に、遺伝子のアップレギュレーション（または過剰発現）も、当技術分野で知られるいくつかの方法によって達成することができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、モジュレーターがＴＧＦβの阻害剤である。本発明によれば、ＫＬＦ−１５の抑制が不全易発型肥大の発生において、極めて重要なステップであること、およびＴＧＦβがＫＬＦ−１５を強く抑制することが示された。したがって、現在さまざまな分野で開発されているＴＧＦβの阻害剤は、心不全を防止および／または処置するための予防および／または治療医薬品の開発に適切に使用し得る。本発明に従って使用することができるＴＧＦβの適切な阻害剤の例はＳｃｉｏｓ Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）が製造するＴＧＦβ受容体阻害剤であり、この会社はそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｏｓｉｎｃ．ｃｏｍ／ｓｃｉｏｓ／ｔｇｆ）に、「ＳｃｉｏｓはＴＧＦ−ベータのその受容体における作用を阻害するように設計された強力な新規小分子阻害剤を開発した。これらの小分子は、動物に経口投与した場合、瘢痕形成（線維症）を減少させるのに有効であることが明らかになった。Ｓｃｉｏｓは、異なる化合物クラスを代表する２つのリード分子を、未だ有効な治療方法がない医療ニーズを持つ患者における疾患状態を処置するために使用できる可能性を持つ前臨床開発へと推し進めるつもりである」と表示している。
【００３３】
さらに本発明は、本発明に従って同定されたタンパク質の使用であって、同定されたタンパク質の１つ以上のレベルを評価し、よって心不全を発生させる危険がある被検者を同定する目的で、同定されたタンパク質の１つ以上の（分子）イメージングに使用される診断手段を作製するための使用に関する。診断手段は、例えば、生物学的タンパク質マーカーに対する標識された抗体を含み得る。
【００３４】
以下の図面および実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｒｅｎ−２ラットにおけるＬＩＭＰ−２の発現量の増加である。図１Ａは、Ｒｅｎ−２ラットが同等の心肥大を示し、短縮率では心不全に進行するラットまたは代償性に留まるラットを識別することができない１０週齢時に、左室心臓生検材料を採取した。１５〜１８週齢時にＲｅｎ−２ラットの一部が心不全を発生させ、残りは２１週齢時に屠殺するまで代償性に留まった。*、Ｐ＜５ｅ-6。図１Ｂは、１０週齢肥大Ｒｅｎ−２ラットにおけるマイクロアレイ解析により、不全易発性ラット（ＨＦ易発性ＬＶＨ、ｎ＝４）では、代償性に留まった肥大ＬＶ（ｃｏｍｐ ＬＶＨ、ｎ＝６）および対照群（ｎ＝４）と比較して、ＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡが特異的に過剰発現されることが見出された。図１Ｃは、末期不全Ｒｅｎ−２ラット（ＨＦ、ｎ＝９）では、代償性Ｒｅｎ−２ラット（ｃｏｍｐ、ｎ＝６）と比較して、ＬＩＭＰ−２タンパク質がアップレギュレートされた。不全性および代償性Ｒｅｎ−２ラットはどちらも、ＬＩＭＰ−２タンパク質のレベルが、対照ラット（ｎ＝６）と比較して有意に上昇していた。*、対照に対してＰ＜０．０５；**、対照に対してＰ＜０．０１；＄、ｃｏｍｐに対してＰ＜０．０５；Ｍｗｍ、分子量マーカー；ａｕ、任意単位。
【図２】ＡｇｎＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯ（ＫＯ Ａｎｇ）マウスは拡張型心筋症を持つ。図２Ａは、ＷＴ Ａｎｇマウス（ｎ＝１４）がそのＬＶ重量を有意に増加させるのに対して、ＫＯ Ａｎｇ（ｎ＝１４）マウスはＬＶ重量を増加させなかった（*、ＷＴ（ｎ＝８）およびＫＯ Ａｎｇに対してＰ＜０．０１）。ＫＯ Ａｎｇマウスにおいて、個々の筋細胞はその体積を増加させることができなかった（ＷＴおよびＫＯ、ｎ＝４；ＷＴ ＡｎｇおよびＫＯ Ａｎｇ、ｎ＝５；筋細胞面積（ａｕ）：ＷＴ Ａｎｇにおける３０８±１４に対して、２６４±４２；*、Ｐ＜０．０１）。バーは５０μｍを表す。図２Ｂは、ＬＩＭＰ−２ ＫＯ（ｎ＝３）およびＷＴ（ｎ＝４）マウスは、ＡｎｇＩＩに対して同等の血圧応答を示した。図２Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置したＷＴ（ｎ＝８）およびＫＯ（ｎ＝８）はＢＮＰおよびＡＮＦ ｍＲＮＡ発現量に同等の増加を示したが（*、ベースライン（ｎ＝４）に対してＰ＜０．０５）、ａｓｋａ ｍＲＮＡ発現の誘導はＫＯ Ａｎｇマウスの方が、それらの減少した筋細胞体積と合致して、有意に少なかった（*、ＫＯ（ｎ＝４）に対してＰ＜０．０５；$、ＷＴ Ａｎｇに対してＰ＜０．０５）。図２Ｄは、ＷＴ（ｎ＝１０）マウスとＫＯ（ｎ＝１１）マウスとはベースライン心エコーパラメータが類似していた（０日目）。１４日間および２８日間のＡｎｇＩＩ後に、野生型ＬＶ壁は有意に肥大したのに対して、ノックアウトは肥大を示さず、それどころか拡張していた（*、ベースラインおよびＫＯ Ａｎｇに対してＰ＜０．００５；＄、ベースラインおよびＷＴ Ａｎｇに対してＰ＜０．００５）。図２Ｅは、ＫＯ Ａｎｇマウスでは、ドブタミンに対するベータ−アドレナリン作動性応答が減少した（ＷＴおよびＫＯ、ｎ＝４；ＷＴ Ａｎｇ、ｎ＝１４；ＫＯ Ａｎｇ、ｎ＝９；*、Ｐ＜０．００５）。ＬＶＷ／ＢＷ、体重に関して補正したＬＶ重量。
【図３】ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは広範な間質性線維症を持つ。ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウス（ｎ＝４）および野生型マウス（ｎ＝５）のＬＶのシリウスレッド染色はノックアウトマウスにおける著しい間質性線維症を示し（*、ＷＴ ＡｎｇおよびＫＯベースラインに対してＰ＜０．０２）、ＡｎｇＩＩで処置したノックアウトマウスおよび野生型マウスはどちらも同程度の血管周囲線維症を示す。バーは２５０μｍを表す。
【図４】ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは筋細胞の錯綜配列を示す。ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスのデスミン染色心筋細胞は、これらのマウスにおける、より多量で、より不規則なデスミン発現が示すように、錯綜配列を示し、乱された内部構造を持つ。バーは２５０μｍを表す。
【図５】ＬＩＭＰ−２発現は他の形態の心臓ストレスにおいてアップレギュレートされる。図５Ａは、新生仔ラット心筋細胞では、６時間伸展によってＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡ発現量が上昇した（各群ｎ＝４）。図５Ｂは、ＬＩＭＰ−２ ｍＲＮＡは、１０週間の運動訓練を受けたラット（週５日、ｎ＝６）から得られる肥大心筋でも、非肥大対照ラット（ｎ＝７）と比較してアップレギュレートされた。図５Ｃは、大動脈狭窄を患う患者（ＬＶＨ、ｎ＝２０）から得られる肥大心筋でも、非肥大対照患者（ｎ＝７）と比較してアップレギュレートされた。（*、対照に対してＰ＜０．０５；**、対照に対してＰ＜０．０１；ＬＶＨ；ＬＶ肥大）
【図６】ＬＩＭＰ−２は心筋細胞の形質膜に存在し、介在板機能にとって重要である。図６Ａは、抗ＬＩＭＰ−２で染色した圧過負荷マウスＬＶのパラフィン包埋組織切片は、細胞内コンパートメント（*）だけでなく、心筋細胞の形質膜（黒い三角形）上でも陽性染色を示す。スケールバーは２５０μｍを表す。図６Ｂは、圧過負荷ラットＬＶ組織切片における抗ＬＩＭＰ−２を使った免疫電子顕微鏡法も、形質膜におけるＬＩＭＰ−２の存在を示す（黒い三角形）。スケールバーは１μｍを表す。図６Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置した野生型マウスでは電子顕微鏡法が正常な介在板を示すのに対して、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスでは、介在板がより高度な屈曲およびより高濃度なアドへレンスジャンクション（右側のパネル中の濃い黒色スポットに注目）を持ち、それがこれらのマウスにおける拡張型心筋症と並行する。バーは２μｍを表す。Ｍ、ミトコンドリア；ＩＤ、介在板；ａ、アドへレンスジャンクション；ｄ、デスモソーム。
【図７】ＬＩＭＰ−２はカドヘリン分布を調節する。図７Ａは、ＬＩＭＰ−２は新生仔ラット心室筋細胞中のカドヘリンに結合する。ＬＩＭＰ−２を免疫沈降（ＩＰ）させ、総細胞溶解物（インプット）、上清（ｓｕｐ）および沈降したタンパク質溶解物（ＩＰ）中のカドヘリンを免疫ブロット（ＩＢ）した。心筋細胞中のカドヘリンタンパク質含有量の一部がＬＩＭＰ−２によって結合される。図７Ｂは、対照被検者および２人の心不全患者の組織切片を、抗パンカドヘリン（赤）および抗ＬＩＭＰ−２（緑）で免疫蛍光的に染色した。矢印（黒い三角形）は、心筋細胞のＩＤにおけるＬＩＭＰ−２とカドヘリンの共局在を示す。バーは５０μｍを表す。図７Ｃは、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトＬＶおよび野生型ＬＶの組織切片を、抗パンカドヘリンで免疫染色した。野生型マウスではカドヘリン分布が介在板に限定されてカドヘリンの規則的な外観をもたらしているのに対して、ＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスではカドヘリンの局在が、厳密な介在板への配置によってもたらされる典型的パターンを失っている。バーは２５０μｍを表す。
【図８】ＬＩＭＰ−２は、リン酸化ベータ−カテニンのカドヘリンへの結合を調節することによって、介在板の完全性を調節する。図８Ａは、ＬＩＭＰ−２に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬＩＭＰ−２）または対照ｓｈＲＮＡのどちらか一方で処置した新生仔ラット心筋細胞の溶解物の免疫ブロット（ＩＢ）。１０日間の培養後に、心筋細胞はＬＩＭＰ−２タンパク質の９２％ノックダウンを示す。タンパク質負荷量が等しいことはＧＡＰＤＨによって確認した。図８Ｂは、免疫ブロット（ＩＢ）により、ｓｈＬＩＭＰ−２溶解物では、対照溶解物と比較して、抗パンカドヘリンによる免疫沈降（ＩＰ）後のＰ−ベータ−カテニンのレベルが低減することが示される。対照ＩＰ溶解物およびｓｈＬＩＭＰ−２ ＩＰ溶解物におけるカドヘリン負荷量は同等だった。総ｓｈＬＩＭＰ−２タンパク質溶解物および対照タンパク質溶解物におけるベータ−カテニンのリン酸化は同等だった。*、Ｐ＝Ｏ．０００６。図８Ｃは、抗パンカドヘリンによる免疫沈降の特異性を示す免疫ブロット。パンカドヘリン抗体の代わりにＩｇＧをタンパク質溶解物に加ると、Ｐ−ベータ−カテニンは結合されない。
【図９】図９Ａは、１０週齢時点のＲｅｎ−２ラットから得た左室生検材料におけるリアルタイムＣＲで評価したＫＬＦ１５発現。生検後はラットを回復させ、それらが不全に進行するか代償性のまま留まるかを決定するために追跡した。ＫＬＦ１５の発現は、代償性のまま留まった肥大心では有意にダウンレギュレートされるが、顕性不全に急速に進行した肥大心では、有意に、より一層抑制されることから、不全易発型の心肥大はＫＬＦ１５抑制のレベルによって同定されることが示される。図９Ｂは、肥大心筋と比較した、正常圧対照心臓における、ＫＬＦ１５に関するインサイチューハイブリダイゼーション。正常心臓における広範囲にわたる核染色が多数の心筋細胞では失われ、非筋細胞核には残存染色があることから、ＫＬＦ１５発現は心筋細胞で特異的に出現することが示される。図９Ｃは、低分子ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス導入によるＫＬＦ１５の安定ノックダウンは培養ＮＲＶＭにおけるＢＮＰの発現を誘導した。
【図１０】図１０Ａは、培養心筋細胞へのＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加はＫＬＦ１５ ｍＲＮＡ発現をほぼ完全に抑制した。低分子ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス導入によるＴＧＦβＩ型受容体の安定ノックダウンはこの効果を打ち消したことから、ＴＧＦβはそのＴＧＦβＩ型受容体を介してＫＬＦ１５発現を抑制する能力を持つことが証明された。図１０Ｂは、ＴｇｆβＩ型受容体に対して免疫ブロットした全心臓ホモジネートは、ＴｇｆβＩ型受容体の発現量の本質的かつ有意な低下を示すが、この受容体の完全な喪失は示さない。図１０Ｃは、ＷＴ心臓をＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスと比較すると、ｃｒｅの筋細胞特異的活性化は、心筋細胞からの明確でロバストなＴＧＦβＩ型受容体の喪失をもたらしたことが、免疫組織化学によって証明される。図１０Ｄは、アンギオテンシンＩＩ注入は、Ｗｔマウスにおいて有意な肥大応答を誘発し、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスではこれが弱められた。図１０Ｅは、アンギオテンシンＩＩ注入は、心機能の喪失の指標である短縮率の有意な低下を誘発し、これはＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβ受容体マウスでは弱められた。図１０Ｆは、アンギオテンシンＩＩ注入とそれに続く肥大はＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを誘発し、これはＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβ受容体マウスでは弱められた。
【図１１】上側の図は、緑色蛍光タンパク質（ＡＡＶ９−ＧＦＰ）注射と比較して、ＡＡＶ９−ＫＬＦ１５注射後のマウス心臓では、ＫＬＦ１５ ｍＲＮＡが有意にアップレギュレートされることを示す。**：ＧＦＰ群との比較でｐ＜０．０５。*：ＧＦＰ群との比較でｐ＜０．０５。＃：ＧＦＰ＋ＡｎｇＩＩ群との比較でｐ＜０．０５。下側の図は、ＡｎｇＩＩ刺激後のＡＡＶ９−ＧＦＰ群と比較して、ＡｎｇＩＩ刺激後のＡＡＶ９−ＫＬＦ１５群では、肥大が有意に少ないことを示す（＃：ｐ＜０．０５）。スチューデントのｔ検定による統計解析、ｎ＝３〜５匹／群。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（実施例１）
リソソーム内在性膜タンパク質２は介在板の新規コンポーネントであり、心筋症を防止する
（材料と方法）
Ｒｅｎ−２ラット、マイクロアレイ解析および免疫ブロッティング
１０週齢のＲｅｎ−２ラットおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｍｏｅｌｌｅｇａｒｄ、デンマーク国Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｌｄ）から、ＬＶの生検材料を、以前記述されたように採取した（Ｖａｎ Ｈａａｆｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ラットを１０、１２、１５、１６、１８、１９および２１週齢で一連の心エコー法によって追跡し、心不全の臨床徴候があった場合（心不全易発性／ＨＦ易発性ラット）は１５〜１８週で、また、不全の臨床徴候が現れなかった場合（代償性／ｃｏｍｐラット）は２１週齢で屠殺した。全ＲＮＡを、以前記述されたように、ＬＶ生検材料から単離、増幅し（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｅｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット２３０ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ５．０で解析した。ＬＶタンパク質抽出物（５０μｇ）をポリクローナルウサギ抗ＬＩＭＰ−２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏ，１：５００）およびポリクローナルウサギ抗ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；１：１０，０００）で免疫ブロットした。
【００３７】
ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウス、ＲＮＡ単離および定量ＰＣＲ解析
体重２０〜２５グラムの１０〜１２週齢雄ＬＩＭＰ−２ ＫＯおよびＷＴ Ｃ５７／Ｂ１６マウスを使用した。ＡｎｇＩＩの血圧効果を調べるために、毎分０．５、１．５、５、１５、および５０ｎｇという用量での静脈内注入中に、動脈圧を監視した。ＬＶ肥大の発生を調べるために、浸透圧ミニポンプ２００４（Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）により、２８日間にわたってＡｎｇＩＩ（１．５μｇ／ｇ／日）を皮下注入した。
【００３８】
心エコー法を０日目、１４日目および２８日目に行った。２８日目に、Ｍｉｌｌａｒ（登録商標）を使って、基礎条件下およびドブタミン刺激条件下で、マウスを血行動態学的に監視し（ｄＰ／ｄｔ）、その後にＬＶを摘出した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使って単離し、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒでＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ解析を行うことにより、ＢＮＰ、ＡＮＦおよびアルファ−骨格アクチン（ａｓｋａ）発現量を決定した（表１）。ＬＶ切片を、以前記述されたように、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）およびピクロシリアスレッド（Ｐｉｃｒｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｒｅｄ）（ＳＲ）で染色するか（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、モノクローナルマウス抗パンカドヘリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ；１：５００）およびモノクローナルマウス抗ヒトデスミン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ，１：５０）で免疫組織学的に染色した。超微細構造解析を、透過型電子顕微鏡法により、以前記述されたように行った（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【００３９】
大動脈狭窄および心不全患者におけるＬＩＭＰ−２
以前記述されたように（Ｈｅｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）、２０人の大動脈狭窄患者および７人の非肥大対照患者から得た経壁生検材料からＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ解析を行うことにより、ＬＩＭＰ−２発現量を決定した（表１）。
【００４０】
ウサギ抗ＬＩＭＰ−２（１：２５０、Ｃｙ２）およびマウス抗パンカドヘリン（１：５００、Ｃｙ３）による二重免疫蛍光染色を、対照被検者１人および３５％未満の駆出率と定義される顕性心不全で死亡した患者２人の切片で行った。核対応物をＴｏｐｒｏ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で染色した。切片をレーザースキャン共焦点システム（Ｌｅｉｃａ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で画像化し、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、×１２６の最終倍率でデジタル化して解析した。この研究はＡｃａｄｅｍｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＭａａｓｔｒｉｃｈｔおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｅｕｖｅｎの各倫理委員会によって承認され、全ての患者からインフォームドコンセントを得た。
【００４１】
細胞培養およびレンチウイルスベクター
相補的なｓｈＬＩＭＰ−２オリゴヌクレオチド（表１）をアニールさせ、それらをＨｐａＩＸｈｏＩ消化したｐＬＬ３．７ｐｕｒｏベクターＤＮＡ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）のＬｕｋ ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓの厚意で提供されたものから改変）中にライゲートすることにより、ラット−ＬＩＭＰ−２ ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを作製した。３μｇのｓｈＬＩＭＰ−２／ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏまたは空のｐＬＬ３．７ｐｕｒｏとパッケージングベクターとを２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で同時トランスフェクトすることによってレンチウイルス産生を行い、ウイルス含有上清を４８時間後に収集した。以前記述されたように（Ｄｅ Ｗｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、１〜２日齢新生児ラットの酵素的解離によって、ラット心室心筋細胞（ＲＣＭ）を単離した。レンチウイルス感染のために、ゼラチン処理した６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０5細胞の密度でＲＣＭを入れ、１０％ウマ血清、５％新生仔ウシ血清、グルコース、ゲンタマイシンおよびＡｒａＣを補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中で一晩培養し、翌日、ｓｈＬＩＭＰ−２レンチウイルスまたは空レンチウイルスに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。ピューロマイシン選択（３μｇ／ｍｌ）後に、感染効率は８０％を上回った。１０日間の培養後に、細胞タンパク質を単離し、抗ＬＩＭＰ−２（１：１００）、モノクローナルマウス抗パンカドヘリン（Ｓｉｇｍａ、１：１００）またはＩｇＧによる免疫沈降（ＩＰ）に付した。ＩＰ溶解物を、モノクローナル抗パンカドヘリン（１：５０００）、ポリクローナル抗ホスホ−ベータ−カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ，１：１０００）およびモノクローナル抗ベータ−カテニン（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ，１：１０００）で免疫ブロットした。
【００４２】
伸展実験のために、ＲＣＭをコラーゲンＩ型被覆シラスティック膜（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上で培養し、６時間の間、静的等二軸伸展に付した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＲＮＡを単離し、ＬＩＭＰ−２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＲＴ−ＰＣＲを行った（表１）。動物実験を伴う試験プロトコルは全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔの動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理および使用に関するオランダ法に記載の公定規則（ＮＩＨの規則と極めてよく似たもの）に従って行われた。
【００４３】
（統計解析）
データを平均±ＳＥＭとして表す。適宜、マン−ホイットニー検定またはスチューデントのｔ検定を使って、各試験群についてのデータを比較した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【００４４】
（結果）
表２に、代償性Ｒｅｎ−２ラットと比較して不全易発性Ｒｅｎ−２ラットにおいて差次的に発現される遺伝子の一覧を示す。これは、全てのラットがまだ代償性肥大を持っている１０週齢で採取した心臓生検材料から導き出されたものであるから、これらの遺伝子の差次的発現は、Ｒｅｎ−２ラットにおける心不全の発生に先行して起こる。
【００４５】
表３に、ベースライン時ならびに１４日間および２８日間のＡｎｇＩＩ処置後のＬＩＭＰ−２ ＷＴおよびＫＯマウスの詳細な心エコーデータを示す。
【００４６】
（不全易発性ＬＶ肥大の遺伝子発現プロファイル）
１０匹のホモ接合Ｒｅｎ−２ラットにおいて、１０週齢時の代償性ＬＶ肥大段階で、心臓生検材料を得た。４匹のラットは、生検材料を採取した後、５週間以内に、心不全へと急速に進行し、残り６匹のラットは生検後１１週間にわたって代償性のままだった（図１Ａ）。これらの生検材料で、Ｔ７に基づく線形増幅と、それに続くＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ２３０ ２．０遺伝子発現解析を行うことにより（ＧＥＯ番号ＧＳＥ４２８６）、心不全へと急速に進行する肥大心でのみアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる１４３個の差次的発現遺伝子が同定された（表２）。リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ−２は、心不全易発性ラットにおいてアップレギュレートされるｍＲＮＡの一つであり（図１Ｂ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）１（Ｃｒｏｍｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびトロンボスポンジン２（データ未掲載）（後者は肥大から心不全への移行において極めて重要であることが先に示されている）と相互作用するというその能力を考えると、これは特に興味深い。図１Ｃは、ＬＩＭＰ−２タンパク質がＲｅｎ−２ラットにおける末期心不全でも役割を持つことを示している。
【００４７】
（アンギオテンシンＩＩはＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスにおける拡張型心筋症を誘発する）
リソソームタンパク質における機能喪失型突然変異は心不全と関連づけられているので（Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｔｙｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）誘発性高血圧のマウスモデルにおけるＬＩＭＰ−２の役割をさらに調べた。ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスおよび対照マウスに、４週間にわたってＡｎｇＩＩを皮下投与した。ＡｎｇＩＩ処置は、野生型マウスおいてＬＶ重量係数を３０％増加させたが、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスでは肥大応答が弱くなった（１４％のＬＶ重量係数増加；Ｐ＜０．０１）（図２ａ）。これは個々の心筋細胞面積の測定によって確認された。ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは、ＡｎｇＩＩ処置ＷＴ対照よりも、ＬＶ筋細胞面積が有意に小さかった（任意単位の筋細胞面積：ＡｎｇＩＩ処置野生型における３０８±１４に対して、ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは２６４±４２；Ｐ＜０．０１）。また、ＡｎｇＩＩが、ＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、血管周囲線維症の同等な増加を誘発したのに対し（データ未掲載）、ＡｎｇＩＩは、野生型対照同腹仔とは対照的にＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスのＬＶにおいて広範な間質性線維症応答を誘発した（間質性線維症：ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスにおける１５．０±６．０％対ＡｎｇＩＩ処置対照における１．８±０．１％；Ｐ＜０．００２）（図３）。
【００４８】
デスミンに関する免疫組織化学的染色は、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける筋細胞錯綜配列を示した（図４）。
【００４９】
ＡｎｇＩＩは野生型マウスでもノックアウトマウスでも同じような血圧応答を誘発することが確認された（図２Ｂ）。ＬＶ肥大の減少にもかかわらず、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは、肥大に関する古典的マーカーである脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）および心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の通常の応答を示したことから（図２Ｃ）、肥大遺伝子発現プログラムはＡｎｇＩＩ処置時に正常に開始されることが示唆された。これとは対照的に、構造細胞肥大マーカーアルファ−骨格アクチンは、心筋細胞の肥大応答の減少（Ｓｔｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）を反映して、ＡｎｇＩＩ処置ＬＩＭＰ−２ノックアウトではＡｎｇＩＩ処置野生型と比較して、誘導される度合が有意に低かった（図２Ｃ）。一連の心エコー法により、ＡｎｇＩＩは、ＡｎｇＩＩ処置ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける有意な心拡張を誘発することが明らかになったのに対して、ＡｎｇＩＩ処置野生型は拡張を伴わない求心性ＬＶ肥大を示した（図２Ｄおよび表３）。また、ＡｎｇＩＩはＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおける収縮予備能の喪失を誘発することが、ドブタミン注入に対する収縮応答の減少によって証明された（＋ｄＰ／ｄｔ ＡｎｇＩＩ処置ノックアウトマウスでは７９．８／秒±５．１、対してＡｎｇＩＩ処置対照では１００．０／秒±４．０；Ｐ＜０．００５）（図２ｅ）。
【００５０】
これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスでは、高血圧が通常の肥大応答を誘発せず、むしろ反応性間質性線維症および心機能の喪失を伴う拡張型心筋症を誘発した。
【００５１】
（ＬＩＭＰ−２発現は心臓ストレスによって調節される）
ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ヌルマウスが肥大応答を開始できなかったにもかかわらず、ＢＮＰおよびＡＮＦの発現は通常どおり誘導したという知見から、ＬＩＭＰ−２は機械的負荷に対する正常な応答の極めて重要な部分であることが示唆された。実際、ＬＩＭＰ−２発現はインビトロで心筋細胞伸展後に有意に増加し（Ｐ＝０．０２）、運動誘発性の生理的肥大でも増加する（Ｐ＝０．０４）ということも示された（図５Ａおよび５Ｂ）。ＬＩＭＰ−２が心圧負荷に対するヒトの適応にも関与することを確かめるために、顕性心肥大を持つ大動脈狭窄患者２０人および対照７人の心臓生検材料におけるＬＩＭＰ−２の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。この実験では、対照との比較で、大動脈狭窄患者の肥大心における有意なＬＩＭＰ−２アップレギュレーションが、マン・ホイットニー検定によって示された（１．２３倍；ｐ＝２．３ｅ-4）（図５Ｃ）。
【００５２】
（ＬＩＭＰ−２は心臓介在板に存在する）
次に、圧過負荷マウス心筋におけるＬＩＭＰ−２の発現パターンを、免疫組織化学によって解析した。このタンパク質は、予想どおり、心筋細胞および内皮細胞の液胞状細胞内区画に発現されるが、心筋細胞の形質膜上に非定型的に分布することも見出された（図６Ａ）。この知見は免疫電子顕微鏡法によって確認された（図６Ｂ）。目を引くことに、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトおよび対照左室切片の電子顕微鏡法では、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおけるＩＤの異常な形態が明らかになったことから、ＬＩＭＰ−２は正常なＩＤ生物学に関与し得ることが示唆される。細胞間接触部において、ＡｎｇＩＩ処置ＫＯ−ＩＤの膜は、より高濃度のアドへレンスジャンクションタンパク質を持つ、より高度な屈曲を示したことから（図６Ｃ）、ＩＤ構造の乱れが示唆された（Ｐｅｒｒｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＤの変化は拡張型心筋症の原因になることが示されているので（Ｐｅｒｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＬＩＭＰ−２はＩＤの適正な機能にとって極めて重要であり得ると推測された。
【００５３】
新生仔ラット心筋細胞タンパク質の免疫沈降により、ＬＩＭＰ−２はアドヘレンスジャンクションの極めて重要な構成要素であるＮ−カドヘリンと物理的に相互作用することが示された（図７Ａ）。この知見はヒトも当てはまった。というのも、対照ならびに不全ヒト心筋の共焦点顕微鏡法では、カドヘリンとＬＩＭＰ−２の間の相互作用が確認され、カドヘリンとＬＩＭＰ−２が共局在するＩＤ部位でこの相互作用が起こることが示されたからである（図７Ｂ）。このことから、ＬＩＭＰ−２は、カドヘリンの役割を媒介することで、適正なＩＤ機能にとって重要になり得ることが示唆された。実際、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスの心臓におけるカドヘリンの組織化学的解析は、異常なカドヘリン分布を示したが（図７Ｃ）、ＡｎｇＩＩ処置した野生型では分布は正常だった。ＡｎｇＩＩ処置した野生型マウスは２つの縦走心筋細胞の間の接触部位にカドヘリン発現を示すが、ＡｎｇＩＩ処置したＬＩＭＰ−２ノックアウトマウスの心筋細胞におけるこの発現は、それほど組織化されておらず、より散漫である。これらのデータは、ＬＩＭＰ−２が介在板の適切な構造的組織化にとって極めて重要であることを立証している。
【００５４】
（ＬＩＭＰ−２は介在板の完全性を調節する）
どの調節機構がＬＩＭＰ−２に依存するかを同定するために、レンチウイルスを利用して導入される、ＬＩＭＰ−２に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＬＩＭＰ−２）を使って、新生仔ラット心筋細胞における別個のＬＩＭＰ−２不活化モデルを得た。１０日間の培養後に、ｓｈＬＩＭＰ−２処理心筋細胞では、対照処理心筋細胞と比較して、ＬＩＭＰ−２タンパク質発現量が９２％低減した（図８Ａ）。介在板の機能的完全性はＰ（Ｓｅｒ３７）−β−カテニンとカドヘリンの間の適正な相互作用に依存すると報告されている。そこで、ＬＩＭＰ−２の欠如がカドヘリンへのＰ−β−カテニンの結合に影響を及ぼすかどうかを調べた。
【００５５】
心筋細胞の溶解物におけるカドヘリンの免疫沈降により、ＬＩＭＰ−２のノックダウンは、Ｐ−β−カテニンとカドヘリンの間の相互作用を実際に減少させることが示された（図８Ｂ）。免疫沈降はカドヘリンに特異的だった（図８Ｃ）。
【００５６】
この研究では、リソソームタンパク質ＬＩＭＰ−２が、心筋細胞介在板、特にアドへレンスジャンクションの重要で新規なコンポーネントであることが証明された。本発明によれば、ＬＩＭＰ−２はＮ−カドヘリンに結合すること、およびＬＩＭＰ−２ヌルマウスはＡｎｇＩＩ誘発性高血圧時に拡張型心筋症を発生させ、心臓におけるＮ−カドヘリンの局在の乱れを伴うことが示された。これを裏付けるように、インビトロでは、培養筋細胞におけるＬＩＭＰ−２のノックダウンが、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の相互作用を乱すことが示された。これは、当初リソソームタンパク質として知られていたＬＩＭＰ−２が、介在板の重要な一部であることを示唆している。
【００５７】
（ＬＩＭＰ−２は圧過負荷時の心臓に役割を持つ）
ＬＩＭＰ−２はＩＤタンパク質の中でも際立っている。ＩＤの他の主要構成要素（カドヘリン、β−カテニン、プラコグロビン）の完全な喪失は致死的な発生的心臓障害をもたらすことから、ＩＤのこれらのコンポーネントは、正常な心臓発生にとって不可欠であることが示唆される。対照的に、本発明によれば、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは正常な心臓発生を持ち、その喪失は生後の心臓リモデリングに影響を及ぼすに過ぎないことが見出された。これは、ＬＩＭＰ−２が、主に負荷増加状態において不可欠な役割を持つ異なるタイプのＩＤタンパク質に相当することを示唆している。ＬＩＭＰ−２のこの特異的役割は、不全に進行する寸前の肥大ラット心ではＬＩＭＰ−２の発現量がさらに上昇する（これは負荷状態を正常化することができないと思われる心筋細胞ではＬＩＭＰ−２発現量が特に増加することを示唆している）という知見によって強調される。これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２はＩＤ機能の新規媒介物質であり、ＩＤおよび筋細胞が負荷増加状態に応答するのに不可欠な今までに同定されていなかったクラスの媒介物質に相当することが示唆された。
【００５８】
（ＬＩＭＰ−２ヌルマウスは増加した負荷に対して異常な応答をする）
代償性のまま留まった肥大心と比較して、後に不全に進行する肥大心では、ＬＩＭＰ−２が特に増加した。これは、心臓ＬＩＭＰ−２発現が過剰負荷の早期分子サインであり得ることを示している。ＬＩＭＰ−２が過剰負荷に対する防御機構を構成することは、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスを長期アンギオテンシンＩＩ注入による圧力負荷にさらした場合に、それらは心拡張および心臓線維症を発生させたが、心筋細胞肥大は極めてわずかであったという知見によって示唆される。ナトリウム利尿ペプチドが正常に誘導されたことは、ＬＩＭＰ−２ヌルマウスの心筋細胞が負荷増加状態を感知するにもかかわらず、アルファ−骨格アクチンの発現量の減少からも明らかなように、適当な肥大応答を開始することはできないことを示唆している。これは、ＬＩＭＰ−２が心負荷に対する正常な応答にとって不可欠であること、および負荷状態が代償機構の限度を超えた場合にＬＩＭＰ−２発現量が著しく増加することを示唆している。これらの知見はヒトにも当てはまり、ＬＩＭＰ−２は臨床的に重度の圧負荷を持つ患者でもロバストに増加することが示されている。これらを総合すると、ＬＩＭＰ−２はＩＤの新規構成要素であり、正常な心機能というよりもむしろ負荷に対する応答にとって不可欠な、新規なタイプのＩＤタンパク質に相当するようである。
【００５９】
（負荷に対するＬＩＭＰ−２応答の機構）
圧負荷ＬＩＭＰ−２ヌルマウスにおいて、常態では隣接する筋細胞を組織化するように作用する心臓介在板の障害を特徴とする介在板異常が記録された。代償性ＬＶ肥大から心不全への移行時に起こる介在板のリモデリングが以前に示され、一方、介在板の構造の乱れは、ヒト、ハムスターおよびブタにおける拡張型心筋症に関連づけられている。ＬＩＭＰ−２はＮ−カドヘリンを結合することが示されたことから、このＩＤ構成要素を介したＬＩＭＰ−２の役割が示唆される。実際、圧過負荷ＬＩＭＰ−２ ＫＯマウスは電子顕微鏡法で異常な介在板を示し、そのＮ−カドヘリン分布が乱れていることから、アドヘレンスジャンクションの欠陥が示唆される。アドへレンスジャンクションの強さは、Ｎ−カドヘリンとβ−カテニンの間の結合アフィニティーによって決定され（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、それはβ−カテニンのリン酸化によって調節される。ＬＩＭＰ−２の喪失はこのＮ−カドヘリン／β−カテニン複合体を乱すことが、培養筋細胞におけるＬＩＭＰ−２のノックダウンによって、インビトロで示された。筋原線維へのアドヘレンスジャンクションの結合を考えると、ＬＩＭＰ−２の喪失は形質膜をまたぐ力伝達の効率低下につながると予想される（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【００６０】
ＬＩＭＰ−２はβ−カテニンへのＮ−カドヘリンの適正な結合にとって不可欠であること、そして負荷状態ではこの役割が特に重要であることが示唆された。しかし、ＬＩＭＰ−２がβ−カテニンへのＮ−カドヘリンの結合を保証する正確な方法は、まだ解明されていない。ＬＩＭＰ−２は、２つの膜貫通ドメイン、細胞質ループおよび２つの内腔グリコシル化ドメインを含有する。リソソーム膜タンパク質はリソソームと形質膜の間を往復できることが知られ、形質膜においてＬＩＭＰ−２はＴＳＰ１およびＴＳＰ２に結合することができる（データ未掲載）。このうち後者は興味をそそる。というのは、ＴＳＰ２も心圧負荷に対する応答には不可欠であり、不全易発型のＬＶ肥大において増加することが、以前に記録されているからである（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これは、ＬＩＭＰ−２とＴＳＰ２がどちらも、心筋細胞が負荷に対する適応応答を開始するのに必要な複合体の一部であり得ることを示唆する。
【００６１】
（考察）
本発明によれば、心筋が負荷増加状態に直面した時のＩＤの重要な媒介物質としての、ＬＩＭＰ２の新規な役割が明らかになった。この新規な生物学的洞察とは別に、不全に進行する寸前の肥大ラット心においてＬＩＭＰ−２の発現量が上昇するという知見から、心筋細胞によるＬＩＭＰ−２発現量の増加はそれらが負荷状態を正常化できないことを示しているという推測が導き出される。したがって、ＬＩＭＰ−２発現量の増加は、切迫した不全の現れであり得る。ＬＩＭＰ−２発現量は臨床的に重症な圧負荷を持つ患者でもロバストに増加し、形質膜に位置することが示されているので、ＬＩＭＰ−２は、今まさに圧力に屈しようとしている心筋を極めて初期の段階でいち早く同定するための分子イメージングにとって魅力的なターゲットになり得る。
【００６２】
（実施例２）
ＴＧＦ−ベータは心肥大の新規阻害因子クルッペル様因子１５を抑制することによって心肥大を促進する
（材料と方法）
（トランスジェニックラット、左室生検材料および血行動態研究）
１８匹の雄ホモ接合Ｒｅｎ−２ラットおよび５匹の同齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）（Ｍｏｅｌｌｅｇａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｌｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を調べた。３匹のＲｅｎ−２ラットは、心不全の臨床徴候を認めて、１０〜１２週齢で屠殺し、この研究から除外した。残りの健常な１５匹のＲｅｎ−２ラットと５匹のＳＤ対照から、１０週齢時に、左室の生検材料を先に述べたように採取した。ラットを、上述のように、１０、１２、１５、１６、１８、１９および２１週齢における一連の心エコーによって追跡した。９匹のＲｅｎ−２ラットは、心不全の臨床徴候を認めて、１５〜１８週齢で屠殺し、これらを「心不全易発性」ラットと名付けた。残り６匹のＲｅｎ−２ラットを監視し、２１週時に屠殺したが、この時点で不全の臨床徴候は出現しておらず、これらを「代償性」ラットと名付けた。
【００６３】
（マイクロアレイ解析）
ＳＤ対照４匹、代償性のまま留まったラット６匹、および心不全易発性ラット４匹のＬＶ生検材料（１０週齢時に採取したもの）から、先に述べたように全ＲＮＡを単離し、増幅した。次に、増幅されたｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット２３０ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐにハイブリダイズさせた。ＳＤ対照、代償性ラットおよびＨＦラットの遺伝子転写物レベルを、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン５．０（ＭＡＳ５．０）で決定した。
【００６４】
（レンチウイルスｓｈＫＬＦ１５の作製）
相補的なｓｈＫＬＦ−１５オリゴヌクレオチド（センス５’−ＧＡＴＧＴＡＣＡＣＣＡ
ＡＧＡＧＣＡＧＣ−３’およびアンチセンス５’−ＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴ−３’）をアニーリングし、それらを、消化したｐＬＬ３．７ｐｕｒｏベクターＤＮＡ（Ｌｕｋ ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）の厚意で提供されたもの）にクローニングすることにより、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を使って、レンチウイルスベクターを作製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキットを使ってコンストラクトを精製した。１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔ、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質を添加したＤＭＥＭで、２９３ＦＴ細胞を培養した。レンチウイルス産生は、３μｇのｓｈＫＬＦＩ５またはｓｈＴｇｆｂｒ１／ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏまたは空ｐＬＬ３．７ｐｕｒｏとパッケージングベクターとを２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で同時トランスフェクトすることによって行い、４８時間後にウイルス含有上清を収集し、濾過し、瞬間凍結した。
【００６５】
（新生仔ラット心室筋細胞実験）
以前記述されたように（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、１〜３日齢新生児ラット心臓の酵素的解離によって、新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を単離した。ゼラチン処理した６ウェルプレートで、１０％ウマ血清（ＨＳ）、５％新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、グルコース、ゲンタマイシンおよび２％抗生物質／抗真菌剤を補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中、１ウェルあたり５×１０5細胞の密度で、ＮＲＶＭを培養した。ｓｈＫＬＦ１５感染のために、ＮＲＶＭを一晩培養し、翌日、ｓｈＫＬＦ１５および空レンチウイルス対照ベクターに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。４８時間後に、細胞を洗浄してベクターを除き、さらに４８時間、ピューロマイシン選択下に置いた。次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）、グルコース、ゲンタマイシンおよび１０％抗生物質／抗真菌剤中で、一晩、静止条件下に保った。翌日、培地を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９、グルコース、ゲンタマイシン、５％抗生物質／抗真菌剤、インスリン、Ｌ−カルニチンおよびＢＳＡを含有する培地で置き換えた。１時間後にＴＧＦ−ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ培地）を１時間加え、その後、ＲＮｅａｓｙミニプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＲＮＡを単離し、それを、ＫＬＦ１５またはＢＮＰプライマー（Ｆ ５’−ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＡＧ Ａ−３’、Ｒ ５’−ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＡＡ ＡＡＣ Ａ−３’）によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲに供した。ｓｈＫＬＦ１５のノックダウン効率は、空レンチウイルスベクターに感染させたＮＲＶＭにおけるレベルと比較して、約８０％である。
【００６６】
（ＭＥＦ２ルシフェラーゼプロモーターアッセイ）
ＮＲＶＭを上述のように単離した。ゼラチン処理した６ウェルプレートで、１０％ウマ血清（ＨＳ）、５％新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、グルコース、ゲンタマイシンおよび２％抗生物質／抗真菌剤を補足したＤＭＥＭ／Ｍ１９９（４：１）培地中、１ウェルあたり５×１０5細胞の密度で、細胞を培養した。ｓｈＫＬＦ１５感染のために、ＮＲＶＭを一晩培養し、翌日、ｓｈＫＬＦ１５および空レンチウイルス対照ベクターに感染させ、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）で促進した。４８時間後に、細胞を洗浄してベクターを除き、さらに４８時間、ピューロマイシン選択下に置いた。Ｔａｔａボックスおよびルシフェラーゼの上流にクローニングされた３つのＭｅｆ２結合部位を含有するＭｅｆ２レポータープラスミド（ｐＧＬ２−３ｘＭＥＦ２−ルシフェラーゼ）を、一過性トランスフェクションによって、細胞に導入した。細胞を洗浄し、１ウェルあたり１．６μｇのＭＥＦコンストラクトをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、ならびに抗生物質非含有培地と一緒に加えた。翌朝、細胞を洗浄し、さらに２日間、通常の培養培地下に置いた。細胞を一晩、低血清条件（上記参照）下に保ち、翌朝、ＡｎｇＩＩ（ｘグラム／ｍｌ）を４日間加えた。ルシフェラーゼアッセイプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６７】
（二重トランスジェニックマウスの作出）
ＴＧＦβＲＩのエクソン３の側面にｌｏｘ−Ｐ部位を配置することによって作出されたＴＧＦβＲＩf/fマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド）（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、α−ＭＨＣプロモーターの制御下にあるｃｒｅ−リコンビナーゼを含有するマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６ ＦＶＢバックグラウンド）（ＭｅｒＣｒｅＭｅｒcre/wt（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．））と交雑させて、ＴＧＦβＲＩfl/wtcre遺伝子を含有するヘテロ接合二重トランスジェニックマウスを作出した。次に、これらのマウスを、ＴＧＦβＲ１f/fマウスと戻し交雑して、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＦＶＢとＣ５７ＢＬ／６の混合バックグラウンドにＴＧＦβＲＩf/creおよびＴＧＦβＲ１f/wcreを持つコロニーを得た。
【００６８】
（ＤＮＡ単離およびジェノタイピング）
ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って使用することにより、マウス尾からＤＮＡを単離した。本発明者らは、ＴβＲＩ ｆｌｏｘマウスの遺伝子型を評価するために、以前記述されたように（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、３つのプライマー、５−ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＴＴ、３’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＧＴ、および３’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣを用いるＰＣＲを使用した。ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ導入遺伝子を検出するために、本発明者らは、ｃｒｅから４００ｂｐフラグメントを増幅するプライマー５−ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＧおよび５−ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＡＡＴ ＣＣＣを使用した。
【００６９】
（Ｃｒｅ組換えプロトコル）
心筋細胞においてα−ＭＨＣ共役ｃｒｅリコンビナーゼを誘導するために、成体ＴＧＦβＲＩf/fcreおよびＴＧＦβＲ１f/wtcre二重トランスジェニックマウスを、ミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ、モデル２００ １）の皮下挿入により、用量が１日あたり２０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）で、７日間にわたって処置した。タモキシフェン自体が心臓の形態および機能に何らかの影響を持つかどうかをチェックするために、一群の野生型マウスをタモキシフェンで処置した。タモキシフェンは１０％エタノールおよび９０％ポリエチレングリコール−４００に溶解してから、短時間の超音波処理にかけた。マウスを２週間回復させてから、ＡｎｇＩＩまたはビヒクルによる処置を行った。
【００７０】
（ミニ浸透圧ポンプの皮下植込みおよびＡｎｇＩＩ注入）
体重２４〜３２ｇの両性のマウスを２．５％イソフルオランで麻酔した。滅菌条件下で、肩甲骨中央切開（ｍｉｄｓｃａｐｕｌａｒ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を施し、鈍的剥離によって皮下組織にポケットを作り、食塩水またはＡｎｇＩＩ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）を充填したミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴモデル２００４；ＡＬＺＡＣｏｒｐ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を挿入した。ミニ浸透圧ポンプの内容物は、４週間にわたって０．２５μｌ／時の速度で、局所皮下腔に送達された。各群において、７〜９匹のマウスを実験に動員し、各群から少なくとも５匹のマウスが実験を完了した。離脱したマウスは、ＬＶカテーテル挿入が成功しなかった３匹を除いて、いずれも麻酔が原因で死亡したためである。
【００７１】
（心エコー法）
野生型、ＴＧＦβＲＩ−／−およびＴＧＦβＲ１−／＋マウスにおいて、手術前および４週間のＡｎｇＩＩ注入後に、２．５％イソフルオラン麻酔下で、経胸壁心エコー法を行った。２Ｄ−心エコー法で標準像を得て、拡張末期内径および収縮末期内径を測定し、駆出率および短縮率を算出した。
【００７２】
（血行動態測定）
ウレタンの腹腔内注射によってマウスを麻酔した。ミラー（１．４Ｆ）カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を右総頚動脈に入れ、左心室内圧を測定するために左室内へと前進させた。体温は温度制御された手術台を使って３７℃に維持し、直腸プローブで監視した。次に、マウスを３０分間安定させてから、血行動態測定を行った。
【００７３】
（組織調達および心筋形態計測）
血行動態測定に続いて、心臓を素早く切除し、０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄し、心房を取り除き、心室を細断した。ＲＮＡおよびタンパク質単離のために、試料を液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。組織学的分析用に、左室をパラホルムアルデヒド（１％）で固定し、パラフィンに包埋した。総コラーゲンを可視化するために、以前記述されたように、ピクロシリウス染色を行った。抗Ｐ３８抗体を使った免疫染色を製造者の指示（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って行うことにより、Ｐ３８の位置を特定した。
【００７４】
（タンパク質単離およびウェスタンブロット法）
凍結した左室を破砕し、標準的プロトコルに従って（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ラジオイムノアッセイ緩衝液中でホモジナイズした。ウェスタンブロット法は、ＴβＲＩに対する特異的抗体（１：１０００）、総およびホスホ（Ｐ）−Ｓｍａｄ２、総およびＰ−Ｐ３８抗体（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｐ−Ｓｍａｄ３抗体（１：５０００，Ｅ．Ｌｅｏｆ教授およびＭ．Ｗｉｌｋｅｓ博士（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ））から厚意により供与されたもの）、コラーゲン１抗体（１：３０００）およびＩＩＩ抗体（１：５００）（Ａｂｃａｍ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使って行った。
【００７５】
（ＴＧＦβ１型受容体免疫組織化学）
心臓組織切片を脱パラフィンし、再水和抗原回復組織を一次抗体（ウサギ抗ＴＧＦβ受容体１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−３９８））と共に一晩インキュベートし、次に、二次抗体（ヤギ抗ウサギ−ビオチン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅ０４３２）と共にインキュベートした後、それらをストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ，Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット）で処理した。
【００７６】
動物実験を伴う上述の試験プロトコルは全て、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理および使用に関するオランダ法に記載の公定規則（ＮＩＨの規則と極めてよく似たもの）に従って行われた。
【００７７】
（統計解析）
データを平均±ＳＥＭとして表す。ＡｎｇＩＩ／ＴＧＦβ／ｓｈＫＬＦ１５およびビヒクル処置動物および細胞の平均間の相違を比較するために、対応のないｔ検定を行った。≦０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。
【００７８】
（結果）
非近交系ホモ接合高血圧ＴＧＲ（ｍＲｅｎ２）２７ラット（Ｒｅｎ−２）は、肥大から心不全への移行の研究を可能にすることが、以前に示されている（Ｓｃｈｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。１０週齢の時点で得た心筋生検材料を使って、どのラットが後に心不全に進行するかを変化した遺伝子発現によって予言することができるかどうかを調べた。
【００７９】
これらの生検材料の発現プロファイリングにより、急速に不全へと進行する肥大心を特徴づけるクルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）をコードする遺伝子の抑制が明らかになった。このことは、代償性ＬＶＨではＫＬＦ１５がダウンレギュレートされるが、不全へと急速に進行する肥大心ではＫＬＦ１５が有意に、より一層抑制されることを示すリアルタイムＰＣＲによって確認された（図９Ａ）。インサイチューハイブリダイゼーションは、ＫＬＦ１５の発現が心筋細胞において特にダウンレギュレートされることを示した（図９Ｂ）。これらの知見は、心臓ではＫＬＦ１５が構成的に発現されるが、肥大においてはダウンレギュレートされるという、以前の観察結果を拡大するものである。心不全への移行に先だって起こるＫＬＦ１５のより著しい抑制は、ＫＬＦ１５が重要な防御特性を持つという示唆をもたらした。ＫＬＦ１５の機能的役割を探るために、ＫＬＦ１５に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を安定に導入した。肥大遺伝子プログラムの分子特徴であるＢＮＰの自発的発現は、培養心筋細胞では、ｓｈＲＮＡを媒体としたＫＬＦ１５の抑制時に、１０倍以上誘導された（図９Ｃ）。これは、ＫＬＦ１５の構成的存在が、肥大遺伝子プログラムの発現を防止するために重要であることを示唆している。
【００８０】
並行して行われた研究では、ＫＬＦ１５ヌルマウスが圧負荷時に肥大および心機能喪失を発生させることが示され、不適応型ＬＶＨからの防御にとって構成的に発現されるＫＬＦ１５は不可欠であることが強調された。
【００８１】
ＫＬＦ１５が肥大遺伝子プログラムを抑止できる機構を探るために、ＭＥＦ２の活性化におけるその役割を研究した。ＭＥＦ２は、カルシニューリンおよびＭＡＰＫ経路によって伝達される肥大シグナリングのターゲットであり、肥大遺伝子プログラムの極めて重要な転写活性化因子の一つであると認識されている。ＭＥＦ２レポーターコンストラクトを使って、ＫＬＦ１５レベルの変化が、心筋細胞におけるＭＥＦ２活性に影響を及ぼすかどうかを検討した。このレポーターは、ＭＥＦ２による刺激には弱くしか応答しない（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，Ｏｌｓｏｎ未公表データ）。実際、アンギオテンシンＩＩに呼応してＭＥＦ２活性のごくわずかな増加が観察されたにすぎない。しかし、ＫＬＦ１５のノックダウンはＭＥＦ２活性を有意に増加させたことから（図９Ｃ）、ＫＬＦ１５はＭＥＦ２のリプレッサーとして作用することが示唆される。
【００８２】
次に、心筋細胞においてどの機構がＫＬＦ１５を抑制するのかを探ろうと試みた。そこで、心肥大の既知の媒介物質を、心筋細胞におけるＫＬＦ１５発現を抑制するその能力についてスクリーニングした。培養心筋細胞では、ＴＧＦβが極めてロバストにＫＬＦ１５を抑制し、ＴＧＦβの添加後は、ＫＬＦ１５の発現がほとんど完全に消失するほどだった。阻害ＲＮＡによるＴＧＦβＩ型受容体のノックダウンはＴＧＦβによるＫＬＦ１５の抑制を防止したので（図１０Ａ）、そのＩ型受容体が関わる古典的なＴＧＦβシグナリングは、この効果にとっては不可欠であることが証明された。
【００８３】
そこで、インビボでのＴＧＦβＩ型受容体によるＫＬＦ１５の調節を検討するために、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）ＴＧＦβ受容体Ｉ型遺伝子をＭｅｒＣｒｅＭｅｒ対立遺伝子と組み合わせて保有するマウスを作出した（これにより、ｃｒｅをタモキシフェンの投与によって心筋細胞で特異的に活性化することが可能になる）（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これにより、胚におけるＴＧＦβＩ受容体の喪失が持つ発生上の影響を避けつつ、成体マウスの心筋細胞で特異的にＴＧＦβＩ型受容体を欠失させることが可能になった。肥大およびＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを惹起するために、上述のように長期アンギオテンシンＩＩ注入を行うことにより、これらのマウスにおいて高血圧を誘発した。全心臓ホモジネートのウェスタンブロット法により、ＴＧＦβＩ型受容体の有意なダウンレギュレーションが明らかになった（図１０Ｂ）。免疫組織化学により、ＴＧＦβＩ型受容体の筋細胞特異的なダウンレギュレーションが確認され、全心臓ホモジネート中に見出されるＴＧＦβＩ型受容体の残存シグナルを説明する他の細胞タイプにおけるこの受容体の発現が示された（図１０Ｃ）。アンギオテンシンＩＩは野生型マウスではＬＶＨを誘発したが、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスではＬＶＨの発生が防止された（図１０Ｆ）。ＷＴマウスではアンギオテンシンＩＩが短縮率を低下させたが、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスでは短縮率は保たれたままだった。これは、心筋細胞からのＴＧＦβＩ型受容体の喪失によって高血圧誘発性肥大および機能喪失が防止され得ることを示している。予想どおり、ＫＬＦＩ５の発現はＷＴマウスの肥大心では抑制されたが、この抑制はＭｅｒＣｒｅＭｅｒ−ＴＧＦβＩ型マウスの心臓には存在しなかった（図１０Ｇ）。これは、心筋細胞上のＴＧＦβＩ型受容体が高血圧性肥大の発生にとって重要であると同時に、ＫＬＦ１５の抑制にとっても重要であることを示している。
【００８４】
これらを総合すると、ＫＬＦ１５は、心筋細胞において心肥大の抑制因子としての役割を持つ初めてのクルッペル様因子である。ＫＬＦ１５はＭＥＦ２を阻害し、並行して行われた研究では、これがＧＡＴ４のような他の肥大促進性転写因子も同様に阻害することが示されている。したがって、ＫＬＦ１５の喪失は肥大遺伝子発現を極めてロバストに誘発し、有害な転帰に関係すると考えられる。したがってＫＬＦ１５の抑制は、不全易発型肥大の発生における新規で極めて重要なステップであり得る。ＴＧＦβは極めてロバストにＫＬＦ１５を抑制できることが示された。したがって、現在さまざまな分野で開発されているＴＧＦβの阻害剤は、心肥大が心不全へと進行するのを防止するというような予想外の治療的潜在能力を持ち得る。
【００８５】
（結論）
心臓は負荷および傷害に応答して肥大し、それはしばしば顕性心不全へと進行する。本発明によれば、サイトカインＴＧＦβが肥大の新規阻害因子クルッペル様因子１５（ＫＬＦ−１５）を抑制するという、この過程における新規な機構が明らかになる。ＴＧＦβＩ型受容体の喪失は、インビボおよびインビトロで、ＫＬＦ−１５の抑制ならびに心肥大および心不全の発生を防止する。心肥大を抑制するこの新規機構をＴＧＦβは妨害することができるという知見は、ＴＧＦβシグナリングの阻害によって有害な形態の心肥大を防止するという刺激に満ちた可能性を切り開くものである。
【００８６】
（実施例３）
心肥大の転写リプレッサー、クルッペル様因子１５
本発明によれば、ジンクフィンガー転写因子であるクルッペル様因子−１５（ＫＬＦ−１５）は、ＬＶ肥大の強力な転写リプレッサーであることが示された。遺伝子ターゲティング研究により、ＫＬＦ１５ヌルマウスは正常に発生するが、圧過負荷に応答して、心臓重量の増加、肥大遺伝子の発現量の増加、筋細胞サイズの増大を伴う左室内腔拡張、および左室収縮機能の低下を特徴とする過度の心肥大を発生させる。全体として、これらの研究は、インビボでのＬＶ肥大におけるＫＬＦ１５の役割を証明している。
【００８７】
興味深いことに、ＫＬＦ１５は、いくつかの形態の病的肥大ではダウンレギュレートされるが、生理的肥大ではダウンレギュレートされないことから、ＫＬＦ１５は病的肥大の調節物質ではあるが、生理的肥大の調節物質ではないことが示される。ＫＬＦ１５が肥大に対抗するという事実、ならびにＫＬＦ１５が病的肥大および心不全において有意にダウンレギュレートされるというもう一つの観察結果は、ＫＬＦ１５レベルの低下を防止することを狙った介入によって病的成長を防止し、さらには逆転させることさえできるかもしれないという刺激に満ちた可能性をもたらした。
【００８８】
（インビボ実験）
病的肥大時のＫＬＦ１５の喪失を防止することによって心臓の病的成長を制限し得るという魅力的な可能性を検証するために、心筋トロポニンＩプロモーターの制御下に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）による遺伝子送達を使って、ＫＬＦ１５をマウス心臓で特異的に過剰発現させた（Ｖａｎｄｅｄｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。特に、ｒＡＡＶ９ベクターは、静脈内投与後の数週間は心臓組織において導入遺伝子発現のロバストな増加を達成することが示されている。
【００８９】
マウスに１×１０10ｖｇのＡＡＶ９−ＫＬＦ１５またはＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した後、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）処置（４週間、浸透圧ポンプによる）によって肥大を誘発した。図１１（上側の図）に示すように、ＫＬＦ１５は心臓で過剰発現された。目を引くことに、ＡＡＶ９−ＫＬＦ１５遺伝子導入に割り当てられたマウスは、ＡｎｇＩＩ刺激時に、ＡＡＶ９−ＧＦＰを投与されたＡｎｇＩＩ処置マウスと比較して、有意に少ない肥大を発生させた。（図１１、下側の図を参照。）これらのデータは、全体として、心筋細胞におけるＫＬＦ−１５の強制的発現は、心肥大を減少させるのに十分であることを示している。
【００９０】
（結論）
ＫＬＦ１５の喪失は、肥大の発生および心不全への移行における極めて重要なステップである。心臓におけるＫＬＦ１５の過剰発現が病的肥大の発生を阻害するという観察結果は、肥大と続発する心不全とを防止するためにインビボでＫＬＦ１５のダウンレギュレーションを防止するという戦略に関して刺激に満ちた可能性を切り開くものである。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【００９３】
【表３】
【００９４】
［文献］
Gamp et al., Hum. Mol. Genet. 12: 631-646, 2003.
Van Haaften et al., BMC Bioinformatics 7: onine, 2006-09-21.
Schroen et al., Circ. Res. 110: 3121-3128, 2004.
Heymans et al., Circulation 112: 1136-1144, 2005.
Junqueira et al., Histochem. J. 11: 447-455, 1979.
De Windt et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 2095-2106, 1997.
Crombie et al., J. Biol. Chem. 273: 4855-4863, 1998.
Eskelinen et al., Trends Cell. Biol. 13: 137-145, 2003.
Nishino et al., Nature 406: 906-910, 2000.
Stypmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 6234-6239,2002.
Stilli et al., Exp. Physiol. 2006.
Perriard et al., Trends Cardiovasc. Med. 13: 30-38, 2003.
Gumbiner, J. Cell. Biol. 148: 399-404, 2000.
Ferreira-Cornwell et al., J. Cell. Sci., 115: 1623-1634, 2002.
Sohal et al., Circ. Res. 89: 20-25, 2001.
Larsson et al., Embo J. 20: 1663-1673
Vandendriessche et al., J. Thromb. Haemost. 5(1): 16-24, 2007.
【００９５】
ＤＮＡ配列ＫＬＦ１５ホモサピエンス
出典：ＮＣＢＩ
ホモサピエンスクルッペル様因子１５、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：４５１１３ ＩＭＡＧＥ：５５２６６５７）、全ｃｄｓ。
アクセッション：ＢＣ０３６７３３
【化１】
【００９６】
アミノ酸配列ＫＬＦ１５ホモサピエンス
出典：ＮＣＢＩ
ホモサピエンスクルッペル様因子１５、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：４５１１３ ＩＭＡＧＥ：５５２６６５７）、全ｃｄｓ。
アクセッション：ＢＣ０３６７３３
【化２】
【００９７】
ＬＩＭＰ−２ゲノム配列
網かけおよび下線の部分：他のエクソンの位置
下線の部分：選択されたエクソンの位置
＞染色体：ＮＣＢＩ３６：４：７７２９８９１８：７７３５４０５９：−１
【化３Ａ】
【化３Ｂ】
【化３Ｃ】
【化３Ｄ】
【化３Ｅ】
【化３Ｆ】
【化３Ｇ】
【化３Ｈ】
【化３Ｉ】
【化３Ｊ】
【化３Ｋ】
【化３Ｌ】
【化３Ｍ】
【化３Ｎ】
【化３Ｏ】
【化３Ｐ】
【化３Ｑ】
【００９８】
ＬＩＭＰ−２転写物：
下線の部分：エクソン
【化４Ａ】
【化４Ｂ】
【００９９】
ＬＩＭＰ−２タンパク質配列
【化５】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全を発症させる危険がある被検者を同定するための方法であって、
（ａ）前記被検者の生物学的試料において、１つまたは複数の生物学的マーカーのレベルを測定すること、
（ｂ）前記生物学的マーカーのレベルを同じ生物学的マーカーの標準レベルと比較すること、および
（ｃ）前記マーカーのレベルが心不全を発症させる危険を示しているかどうかを決定すること
を含み、前記生物学的マーカーがクルッペル様因子１５（ＫＬＦ−１５）、リソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）、これらのフラグメント、および／もしくは、これらの変異体より選択され、ならびに／または、生物学的マーカーがＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、これらのフラグメント、および／もしくは、これらの変異体より選択される方法。
【請求項２】
前記方法がインビトロで実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が血液、血漿、血清、心臓組織からなる群より選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標準レベルと比較して、低下したＫＬＦ１５タンパク質レベルおよび／または低下したＫＬＦ１５遺伝子発現レベルが心不全の発症の危険を示す請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
標準レベルと比較して、増加したＬＩＭＰ−２タンパク質レベルおよび／または増加したＬＩＭＰ−２遺伝子発現レベルが心不全の発症の危険を示す請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項７】
被検者の１つまたは複数の生物学的試料を受け取るための手段、および前記生物学的試料における１つまたは複数の生物学的マーカーのレベルを測定するための手段を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
心不全を防止または処置するための予防化合物または治療化合物を同定するためのスクリーニング方法における、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体の使用。
【請求項９】
心不全を防止または処置するための予防医薬品用または治療医薬品用の医薬品を調合するための、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体の使用。
【請求項１０】
心不全を防止または処置するための予防医薬品用または治療医薬品用の医薬品を調合するための、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体のモジュレーターの使用。
【請求項１１】
前記モジュレーターがＴＧＦβの阻害剤である請求項１０に記載の使用。
【請求項１】
心不全を発症させる危険がある被検者を同定するための方法であって、
（ａ）前記被検者の生物学的試料において、１つまたは複数の生物学的マーカーのレベルを測定すること、
（ｂ）前記生物学的マーカーのレベルを同じ生物学的マーカーの標準レベルと比較すること、および
（ｃ）前記マーカーのレベルが心不全を発症させる危険を示しているかどうかを決定すること
を含み、前記生物学的マーカーがクルッペル様因子１５（ＫＬＦ−１５）、リソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ−２）、これらのフラグメント、および／もしくは、これらの変異体より選択され、ならびに／または、生物学的マーカーがＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、これらのフラグメント、および／もしくは、これらの変異体より選択される方法。
【請求項２】
前記方法がインビトロで実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が血液、血漿、血清、心臓組織からなる群より選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標準レベルと比較して、低下したＫＬＦ１５タンパク質レベルおよび／または低下したＫＬＦ１５遺伝子発現レベルが心不全の発症の危険を示す請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
標準レベルと比較して、増加したＬＩＭＰ−２タンパク質レベルおよび／または増加したＬＩＭＰ−２遺伝子発現レベルが心不全の発症の危険を示す請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項７】
被検者の１つまたは複数の生物学的試料を受け取るための手段、および前記生物学的試料における１つまたは複数の生物学的マーカーのレベルを測定するための手段を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
心不全を防止または処置するための予防化合物または治療化合物を同定するためのスクリーニング方法における、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体の使用。
【請求項９】
心不全を防止または処置するための予防医薬品用または治療医薬品用の医薬品を調合するための、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体の使用。
【請求項１０】
心不全を防止または処置するための予防医薬品用または治療医薬品用の医薬品を調合するための、ＫＬＦ１５タンパク質、ＬＩＭＰ−２タンパク質、ＫＬＦ１５をコードする遺伝子、ＬＩＭＰ−２をコードする遺伝子、前記タンパク質のフラグメント、前記タンパク質の変異体、前記遺伝子のフラグメント、および／または、前記遺伝子の変異体のモジュレーターの使用。
【請求項１１】
前記モジュレーターがＴＧＦβの阻害剤である請求項１０に記載の使用。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ．８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ．１０Ｂ】
【図１０Ｃ−１０Ｅ】
【図１０Ｇ】
【図１１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ．８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ．１０Ｂ】
【図１０Ｃ−１０Ｅ】
【図１０Ｇ】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５０４０８９（Ｐ２０１０−５０４０８９Ａ）
【公表日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８７４３（Ｐ２００９−５２８７４３）
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７７２０
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０６１１９１６５）ユニフェルジテイト・マーストリヒト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７７２０
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０６１１９１６５）ユニフェルジテイト・マーストリヒト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ
【Ｆターム（参考）】
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